Zentrum für Hygiene und Medizinische Mikrobiologie

Universitätsklinikum Gießen und Marburg Standort Marburg

Praktikum der Medizinischen Mikrobiologie

für Studierende der Zahnmedizin

Altes Hygieneinstitut am Pilgrimstein

Wintersemester 2019/ 2020

Kursleitung: Dr. Claudia Nonnenmacher

Kursorganisation: Claudia Trier (trierc@staff.uni-marburg.de)

Nadine Buschmann (nadine.buschmann@staff.uni-marburg.de)

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Inhaltsverzeichnis

Seite

Kursplan 3

Verhaltensregeln 4

Händedesinfektion 5

Abschnitt I: Bakteriologie

A. Mikroskopieren, Kultivieren Färben und Identifizieren von Bakterien

Übung 1: Mikroskopie (Lebendbeobachtung) von Bakterien 6

Übung 2: Kultivierung von Bakterien 8

Übung 3: Färben und Differenzieren von Bakterien 10

B. Bakterienflora der Umwelt

Übung 4: Anzucht von Bakterien aus dem direkten Umfeld 16

Übung 5: Anzucht von Bakterien des Erdbodens 18

C. Normale Bakterienflora des Menschen/Testung von Antibiotika

Übung 6: Keimzahlbestimmung im Speichel 20

Übung 7: Anzucht von Bakterien aus dentaler Plaque 22

Übung 8: Anzucht von Bakterien aus dem Rachen 24

Übung 9: Abgrenzung von S. aureus gegenüber anderen Mikrokokken 26

Übung 10: Technik der Neisser-Färbung 28

Übung 11: Technik der Kinyoun-Färbung 29

Übung 12: Antibiotika-Resistenzbestimmung I (Agardiffusionstest) 30

Übung 13: Antibiotika-Resistenzbestimmung II (MHK) 32

Abschnitt II: Hygiene

Übung 14: Temperaturempfindlichkeit verschiedener Bakterientypen 32

Übung 15: Nachweis von Keimen im Wasser 34

Übung 16: Mikrobiologische Besiedlung der Hände 38

Übung 17: Übertragbarkeit von Mikroorganismen 40

Abschnitt III: Mykologie

Übung 18: Auseinandersetzung mit Sprosspilzen 41

Übung 19: Auseinandersetzung mit Schimmelpilzen 43

Abschnitt IV: Parasitologie

Übung 20: Mikroskopieren von parasitologischen Fertigpräparaten 48

Anhang 50

Sicherheitsbelehrung nach UVV Biotechnologie, Arbeitssicherheit, Unfallverhütung

und Hygieneunterweisung

Der/die Beschäftigte bestätigt mit seiner/ihrer Unterschrift auf der Anwesenheitsliste die

Teilnahme an der Unterweisung

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Kursplan/Übersicht

Kursteil 1:

Abschnitt I: Bakteriologie

Händedesinfektion

Übung 1: Lebendbeobachtung von Bakterien

Übung 2: Kultivierung von Bakterien (Testkeim)

Kursteil 2:

Übung 3: Färben und Differenzieren von Bakterien

Übung 4: Anzucht von Bakterien aus dem direkten Umfeld

Übung 5: Anzucht von Bakterien aus dem Erdboden

Kursteil 3:

Übung 3: Auswertung Differenzierung + Identifizierung des Testkeims

Übung 4: Auswertung von Bakterien aus dem direkten Umfeld

Übung 5: Auswertung von Bakterien aus dem Erdboden

Kursteil 4:

Übung 6: Keimzahlbestimmung im Speichel

Übung 7: Anzucht von Bakterien aus dentaler Plaque

Übung 8: Anzucht von Bakterien aus dem Rachen

Kursteil 5:

Übung 6: Auswertung Keimzahlbestimmung im Speichel

Übung 7: Auswertung von Bakterien aus dentaler Plaque

Übung 8: Auswertung von Bakterien aus dem Rachen

Übung 9: Abgrenzung von S. aureus von anderen Micrococcaceae

Kursteil 6:

Übung 8: evtl. weitere Auswertungen von Bakterien aus dem Rachen

Übung 10: Neisser-Färbung

Übung 11: Kinyoun-Färbung

Übung 12: Resistenzbestimmung I (Antibiogramm)

Übung 13: Resistenzbestimmung II (MHK mit Penicillin)

Kursteil 7:

Übung 12: Auswertung Resistenzbestimmung I (Antibiogramm)

Übung 13: Auswertung Resistenzbestimmung II (MHK mit Penicillin)

Abschnitt II: Hygiene

Übung 14: Temperaturempfindlichkeit verschiedener Bakterien

Übung 15: Nachweis von Keimen im Wasser

Übung 16: Mikrobiologische Besiedlung der Hände

Übung 17: Übertragbarkeit von Mikroorganismen

Kursteil 8:

Übung 14: Auswertung Temperaturempfindlichkeit verschiedener Bakterientypen

Übung 15: Auswertung Nachweis von Keimen im Wasser

Übung 16: Auswertung Mikrobiologische Besiedlung der Hände

Abschnitt III: Mykologie

Übung 18: Auseinandersetzung mit Sprosspilzen

Übung 19: Auseinandersetzung mit Schimmelpilzen

Kursteil 9:

Abschnitt IV: Parasitologie

Übung 20: Mikroskopieren von parasitologischen Fertigpräparaten

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Verhaltensregeln zum Schutz vor Infektionen

Während des Kurses besteht eine nicht vollständig vermeidbare, geringe Infektionsge-

fahr. Um ein unnötiges Risiko zu vermeiden ist deshalb jeder zu peinlichster Sauberkeit

und Ordnung am Arbeitsplatz verpflichtet. (Es bestehen gesetzliche Vorschriften über das

Arbeiten mit Krankheitserregern; siehe Infektionsschutzgesetz vom Juli 2000).

Während der Kursstunde ist ein Kittel zu tragen. Für die Oberkleidung stehen Spinde zur

Verfügung. Hautwunden an den Fingern sind durch einen Verband (Pflaster) zu

schützen.

Essen, Trinken und Rauchen sind im Kurssaal zu unterlassen. Lebensmittel sollen

nicht mit in den Kurssaal genommen werden.

Vor und unmittelbar nach Gebrauch ist die Öse abzuflammen. Verunreinigte und infi-

zierte Objektträger, Pipetten und sonstige Materialien sind ohne Verzug in die Glasbehäl-

ter mit Desinfektionsmittel zu legen.

Verunreinigungen der Hände, Kleidung oder des Arbeitsplatzes mit Erregern müssen so-

fort einem(r) Kursassistenten(in) zur Einleitung der Desinfektion gemeldet werden. Be-

sondere Desinfektionsmaßnahmen sind unverzüglich einzuleiten, wenn Erreger in

Hautwunden, den Mund oder das Auge eingebracht wurden.

Vor Verlassen des Kurssaales muss eine sorgfältige Händedesinfektion erfolgen: Die

Hände sind 2-3 min mit 5-8 ml Schnelldesinfektionsmittel aus den Wandspendern bis zur

Trocknung einzureiben (Nagelspalte nicht vergessen), danach unter steter Zufuhr von

warmen Wasser einzuschäumen und abzuspülen.

Die Teilnahme am Mikrobiologischen Praktikum, zu dem auch die theoretische Ein-

führung gehört, wird durch Anwesenheitskontrolle überprüft. Bei unentschuldig-

tem Fehlen ist die Scheinvergabe in Frage gestellt.

Technische Hinweise

Die Grundausstattung jedes Arbeitsplatzes umfasst ein Mikroskop mit Okular (8-10x)

und mehreren Objektiven, darunter ein schwächeres (10x) und ein stärkeres (45x) Tro-

ckensystem sowie ein Immersionsobjektiv (90-100x), ferner eine Flasche mit Immersi-

onsöl, einen Halter mit Platinöse, Platinnadel und Pinzette, plane und Hohlgeschliffene

Objektträger sowie Deckgläser (18 x 18mm2), einen Bunsenbrenner, ein Glasgefäß mit

Desinfektionslösung, ein Färbegestell über dem Abguss sowie Farblösungen, einem Re-

agenzglasständer und einem Filzstift. Für besondere Übungen werden die jeweils erfor-

derlichen Geräte und Materialien ausgegeben.

Jeder Kursteilnehmer ist für das ihm an seinem Arbeitsplatz überlassene Arbeitsgerät

verantwortlich; dessen Verlust oder Beschädigung ist sofort der Kursleitung zu melden.

Präparate und Kulturen dürfen auf keinen Fall aus dem Kurssaal entfernt werden.

Die Kittel sind für die Kursdauer im BMFZ zu belassen; Wertgegenstände sind heraus-

zunehmen. Im Erd-/ Untergeschoß stehen zu diesem Zweck Spinde zur Verfügung, diese

werden am Ende des Semesters geöffnet und der Inhalt nicht länger als 3 Monate aufbe-

wahrt.

Es ist darauf zu achten, dass die Bunsenflamme zum Gebrauch entleuchtet wird. Nach

Gebrauch ist sofort auf Sparflamme umzustellen. Der Hahn muss rasch geschlossen

werden, da sonst ein Rückschlag der Flamme eintritt. Achte auf die offene Flamme (La-

bormäntel, offenes Haar)!

Ein Verschütten von Farblösungen ist tunlichst zu vermeiden. Farbflecke an den Händen

lassen sich mit Desinfektionslösung entfernen.

Nach Beendigung der Kursstunde sind die Arbeitsplätze wieder aufzuräumen. Das

Immersionsobjektiv ist mit einem Papierhandtuch vom Immersionsöl zu säubern, Farb-

stoff-Flaschen und Schalen sind zu schließen. Abfälle, wie Streichhölzer, Papierschnip-

sel, Glasscherben usw. gehören nicht in die Färbebecken, sondern in die Abfalleimer.

Vor Verlassen der Arbeitsplätze müssen Bunsenbrenner, Mikroskoplampen und Wasser-

hähne ausgestellt werden.

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Händedesinfektion Begriffserklärung:

Ziel der Klinikhygiene ist die Verhinderung nosokomialer Infektionen. Dies sind Infektionen, die

im Rahmen der stationären oder auch ambulanten Behandlung im Krankenhaus selbst erworben

werden.

Unter Desinfektion versteht man die Abtötung bzw. irreversible Inaktivierung von Krankheitserre-

genden Mikroorganismen (DIN 58 949) an und in kontaminierten Objekten. Erfasst werden vege-

tative Keime einschließlich Mykobakterien sowie Pilze (Wirkbereich A), Viren (Wirkbereich B)

und Milzbrandsporen (Wirkbereich C). In der Regel wird eine Keimreduktion um 3-5 Log-Stufen

(99,9 – 99,999%) erreicht.

Zur Abtötung von Sporen der Erreger von Gasbrand oder Wundstarrkrampf (Wirkbereich D)

müssen Sterilisationsverfahren angewandt werden.

Sterilisation bedeutet das Abtöten bzw. das irreversible Inaktivieren aller vermehrungsfähigen

Mikroorganismen (DIN 58 900). Bei der Sterilisation werden auch Bakteriensporen erfasst.

Dies ist nicht gleichbedeutend mit Keimfreiheit, da tote Keime bzw. Bestandteile von Keimen vor-

handen sein können:

Toxine

Polysaccharide

Lipopolysaccharide (LPS)

Bakterielle DNA

Die hygienische Händedesinfektion dient der Keimverminderung und soll das Personal vor

Infektionen schützen, sowie eine Weiterverbreitung von Krankheitserregern entgegenwirken.

Erfasst wird die transiente Flora.

Um die Keimverbreitung kontaminierter Hände zu verhindern, wird vor dem Waschen desinfiziert.

Vorschrift Händedesinfektion:

Entnahme des Desinfektionsmittels aus dem Spender durch Betätigung des Hebels mit dem Ell-

bogen, um Kontamination des Spenders zu vermeiden.

- Nur trockene Hände desinfizieren! (Verdünnungseffekt)

- Mindestens 3 ml (1-2 Hübe) Desinfektionsmittel bis zur Antrocknung in die Hände einreiben.

- Hände waschen, abtrocknen (Einmalhandtuch), eincremen (Hautschutz)

Die chirurgische Händedesinfektion soll Keime der Hautoberfläche und solche, die in der Haut

angesiedelt sind, abtöten. Nicht kontaminierte Hände werden nach dem Waschen desinfiziert.

Nicht selten kommt es bei Handschuhen zu Mikroperforationen, deshalb ist nach dem Tragen der

Handschuhe eine Händedesinfektion sinnvoll.

Händedesinfektion muss im mikrobiologischen Labor immer durchgeführt werden!

Aufgabe:

Kontrolle der hygienischen Händedesinfektion

- Durchführung der hygienischen Händedesinfektion mit einem speziell präparierten Mittel

- Betrachtung und Beurteilung der Verbreitung des Desinfektionsmittels unter einer

Fluoreszenzlampe

- Abwaschen der Farbstoffreste mit Seife und Wasser

- Eincremen der Hände

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Abschnitt I: Bakteriologie A. Mikroskopie, Kultivierung, Färben und Identifizierung von Bakterien

Kursteil 1 Übung 1: Mikroskopieren von Bakterien im ungefärbten Präparat Die lichtmikroskopische Untersuchung steht am Anfang jeder bakteriologischen Untersuchung,

sie ist, auch für Reinheitskontrollen, unentbehrlich. Form und Größe sowie Eigenbeweglichkeit

der Bakterien können einfach beurteilt werden. Die Größe der Bakterien bewegt sich im Bereich

des Auflösungsvermögens eines Lichtmikroskops, deshalb ist immer zur exakten Beurteilung die

Ölimmersionstechnik notwendig.

Die direkte Mikroskopie lebender, unfixierter Keime hat vor allem die Kontrastarmut der Objekte

(Bakterien) zu überwinden. Dies kann durch spezielle Beleuchtungstechniken (Phasenkontrast,

Dunkelfeldmikroskopie) erreicht werden. Aber auch im normalen Durchlichtmikroskop können

ungefärbte Objekte beurteilt werden.

Dazu stehen zwei Methoden zur Verfügung:

Deckglaspräparat

„Hängender Tropfen“.

Ungefärbte Lebendpräparate werden bei gesenktem Kondensor und geschlossener Kondensor-

blende beobachtet. Zuerst wird mit einer schwachen Vergrößerung (10er Objektiv) der Tropfen-

rand gesucht und scharf eingestellt. Danach schwenkt man das 40er Objektiv ein.

Den hängenden Tropfen betrachtet man mit dem 100er Ölimmersionsobjektiv und mit geschlosse-

ner Blende.

5 µm

Erythrozyt

Hefezellen

Kokken

in Haufen

in Ketten

Diplokokken

Stäbchen

Keulen

Schrauben

Stäbchen mit zentraler Endospore

Form und Größe

7

Technische Durchführung

Sterile Materialentnahme aus einem Kulturröhrchen

Durchführung:

Vor Entnahme der Probe das Kulturröhrchen aufschütteln!

Öse schräg halten, in der Gasflamme ausglühen, erkalten lassen

Verschluss des Röhrchens mit dem kleinen Finger der rechten Hand

abnehmen, nicht in offenes Röhrchen atmen!

Röhrchenrand abflammen

Mit der Öse Material entnehmen

Röhrchenrand abflammen

Röhrchen verschließen

Das in der Öse enthaltene Material auf Objektträger aufbringen

Öse ausglühen

Herstellung eines "Deckglaspräparates" für Nativ- oder Lebendpräparate:

Durchführung:

Mit der Öse aus dem Kulturröhrchen die Probe entnehmen und auf den Objektträger

bringen

Tropfen mit einem Deckglas bedecken

Mikroskopie: 40er Objektiv, Blende schließen

Aufgabe Übung 1:

Mikroskopieren (Lebendbeobachtung) von Bakterien

1. Herstellen eines Deckglaspräparates aus den Bouillonkulturen:

Röhrchen a = Hefezellen

Röhrchen b = Erythrozyten

Röhrchen c = Pseudomonas fluorescens (gramneg. Stäbchen)

Röhrchen d = Staphylococcus epidermidis (grampos. Kokken)

Testkeim = X

Mikroskopie: 10er und 40er Objektiv

Protokoll Übung 1: Lebendbeobachtung von Bakterien

Form, Größe

Deckglaspräparat von a

Deckglaspräparat von b

Deckglaspräparat von c

Deckglaspräparat von d

Deckglaspräparat vom Testkeim

Ausglühen der

Impföse

8

Übung 2: Kultivieren von Bakterien Bakterien können in Flüssigkulturen und in semisoliden Agarnährmedien kultiviert werden. Die

Anzüchtung auf Agarnährmedien bietet den Vorteil, einzelne Kolonien zu erhalten. Damit kann

eine Keimisolierung aus einem Keimgemisch erreicht werden. Man unterscheidet Optimal-, Se-

lektiv- und Differentialnährmedien. Ein Optimalnährboden bietet für sehr viele unterschiedliche

Bakterien gute Wachstumsbedingungen (Beispiel: Blutagar). Ein Selektivnährboden lässt auf-

grund von Zusätzen nur das Wachstum einiger Bakterienspezies zu (z.B. McConkey Agar zum

selektiven Wachstum von gram-negativen Enterobacteriaceae). Ein Differentialnährboden macht

bestimmte Stoffwechselleistungen oder Produkte von Bakterien sichtbar (z.B. Hämolyse auf Blut-

agar, Laktoseverstoffwechslung auf McConkey Agar). Darüber hinaus sind viele Bakter ien durch

ihre typische Koloniemorphologie erkennbar (z.B. schleimiges Wachstum von Klebsiella,

schwärmendes Wachstum von Proteus, raues Wachstum von Bazillus).

Technische Durchführung

Beimpfung von Flüssigkulturen

Durchführung:

Mit ausgeglühter und wieder erkalteter Öse die Bakterien

aufnehmen

Durch Schräghalten der Flüssigkulturen werden die Bakterien

in den oberen

Bereich der Flüssigkeit gebracht und dort verteilt

Öse wieder ausglühen.

Fraktionierte Beimpfung der Nährbodenoberfläche mit der Öse Durchführung:

Nach dem Ausglühen und Abkühlen der Öse wird ein Tropfen aus einem flüssigen Nähr-

medium, bzw. eine Kolonie von einer Bakterienkultur entnommen und auf der Hälfte der

Agaroberfläche in engen, serpentinenartigen Impfstrichen verteilt. Anschließend wird die Öse

wieder ausgeglüht. Mit der ausgeglühten und wieder abgekühlten Öse berührt man das

bereits vorher beimpfte Feld und streicht dann ein Viertel der Agaroberfläche aus. Das

gleiche wird noch ein zweites Mal durchgeführt.

Beim Beimpfen der Agaroberfläche ist zu beachten, dass die Öse nur ganz leicht und locker

auf dem geleeartigen Nährboden gleiten und die Agaroberfläche nicht verletzen wird. Die be-

impften Agarplatten sind mit dem Deckel nach unten auf den Arbeitsplatz abzulegen.

Durch diese sog. „fraktionierte Aussaat“ erreicht man verschiedene Bakterienkonzentrationen

auf der Agaroberfläche und damit auch unterschiedlich dichtes Bakterienwachstum, was die

Voraussetzung für das Anlegen von Reinkulturen ist.

Aufgabe Übung 2:

Kultivieren von Bakterien

Ausstreichen des Testkeims auf:

- Blutagar

- MacConkey-Agar

- Peptonagar

Kulturen mit der Platznummer beschriften!

Kulturen werden 16 - 24 h bei 37°C bebrütet, am nächsten Kurstag weiter bearbeitet

an der W and

einreiben

A

Beim pfen flüssiger

Medien

1 . A u s s tr ic h -

Ö s e w e c h s e ln

2 . A u s s tr ic h -

Ö s e w e c h s e ln

3 . A u s s tr ic h S c h rä g h a lte n d e r A g a rp la tte

B e s c h r iftu n g a u f d e r

N ä h rb o d e n s e ite !

3 Ö s e n a u s s tr ic h

9

Kursteil 2

Übung 3: Färben und Identifizieren von Bakterien Färben von Bakterien Die Anfertigung und Beurteilung gefärbter Präparate gehört zu den wichtigsten Fertigkeiten, die

in diesem Kurs vermittelt werden sollen. Ein Präparat ist die schnellste und kostengünstigste Me-

thode eines Keimnachweises. Die Unterscheidung von grampositiv und gramnegativ hat nicht nur

systematische Bedeutung, sondern ist auch ganz entscheidend für die Auswahl von Antibiotika

für eine initiale Therapie.

Bakteriologische Färbungen:

Für Färbungen stehen unterschiedliche Methoden zur Verfügung. Man unterscheidet Einfachfär-

bungen, die zur Kontrastverstärkung dienen, von Differentialfärbungen, die besondere Eigen-

schaften von Bakterien nachweisen.

Beispiel von Einfachfärbungen ist die Methylenblaufärbung, für Differentialfärbungen die Gram-

Färbung, die Kinyoun-Färbung (Ziehl-Neelsen-Färbung) und die Neisserfärbung.

Beim Mikroskopieren von gefärbtem Untersuchungsmaterial sind ggf. weitere Punkte zu berück-

sichtigen wie z. B.: sonstige Gebilde (Zellkerne, Epithelien, Leukozyten, Zelldetritus), die Lage-

rung von Bakterien und Körperzellen zueinander, die ungefähre Menge der Bakterien pro Blick-

feld (vereinzelt, mäßig viel, reichlich, massenhaft).

Technische Durchführung

Herstellen eines Färbepräparates

Durchführung:

Von Bakterienkolonien auf der Agarplatte:

Auf einem sauberen Objektträger mit der ausgeglühten und wieder abgekühlten Öse ein

Wassertröpfchen bringen.

Mit einer in gleicher Weise sterilisierten Öse sehr wenig Bakterienmasse aus einer

Kolonie aufnehmen. Die Bakterienmasse an den Rand des Wassertröpfchens

aufbringen und von dort in dieses homogen einreiben und das Tröpfchen ausbreiten.

Von Suspensionskultur (Flüssigkultur):

Flüssigkultur aufschütteln, auf einen sauberen Objektträger mit der ausgeglühten und

wieder abgekühlten Öse einen Tropfen Kulturmaterial bringen und verteilen.

Präparat lufttrocknen lassen (Keine Trocknung in der Flamme!)

Hitzefixierung:

Objektträger (Schichtseite nach oben) 3x durch die blaue Flamme des Brenners ziehen

Gramfärbung (Differenzialfärbung)

Durchführung:

Präparat Hitzefixieren

Karbol-Gentianaviolett-Lösung 3 Minuten

Lugolsche Lösung 2 Minuten

Entfärben mit 96%igem Alkohol einige Sekunden

Abspülen mit Leitungswasser

Gegenfärbung Safraninlösung 1 - 2 Minuten

Abspülen mit Leitungswasser

Trocknen zwischen Filterpapier

Mikrokopie: 100er Objektiv, Ölimmersion

Beurteilung: Grampositive Bakterien = blauschwarz, Gramnegative Bakterien = rot

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Identifizieren von Bakterien Identifizierung von Bakterien durch Bestimmung biochemischer Merkmale

Biochemische Leistungen von Enzymen des Kohlehydrat- (Zuckerspaltung) und Aminosäu-

restoffwechsels (z.B. Decarboxylasen, Desaminasen) können durch Farbumschläge spezieller

Indikatoren in sichtbar gemacht werden. Indikatoren sind entweder bereits in den Wachstums-

medien enthalten oder werden nachträglich zugegeben. Einige Teste können auch direkt mit iso-

lierten Bakterienkolonien durchgeführt werden:

Technische Durchführungen und Beurteilung der Reaktionen

Beurteilung der Primärkulturen:

Beschreibung des Wachstums auf den Kulturen von Pepton-, Blut-, MacConkey-Agar

(Vorschläge dazu im Protokoll „Ergebnisse der kulturellen und biochemischen Prüfung“)

Oxidase-Reaktion (Nadi-Oxidase):

Die Chromoxidase ist ein Enzym der Atmungskette. Die positive Oxidase-Reaktion korreliert mit

einem relativ hohen Gehalt an c-typischen Cytochromen.

Durchführung:

Eine Kolonie wird mit der Öse auf einem farblosen Oxidase-Testfeld verrieben.

Positiv: Intensive Blaufärbung nach wenigen Sekunden.

Katalase-Reaktion:

Katalasebildende Bakterien spalten Wasserstoff, wobei der freiwerdende Sauerstoff zu einer

Bläschenbildung führt. Katalase-positive Keime besitzen stets auch andere Hämenzyme, insbe-

sondere ein Cytochrom-System, katalase-negative Keime sind meist cytochromlos.

Durchführung:

Einige Kolonien werden auf einen Objektträger übertragen, anschl. 2-3 Tropfen Katalase-

Reagenz (3%ige H2O2) dazugeben.

Positiv: Sofortige Bläschenbildung

Glucose-Medium: Säurebildung nach Kohlehydratabbau

Es wird geprüft, ob Glucose unter aeroben Bedingungen, wie sie im flüssigen Glucosemedium

herrschen (oxydativ), abgebaut werden kann. Der Indikator Bromthymolblau zeigt im positiven

Fall einen Farbumschlag an. Das Glucosemedium enthält ferner ein DURHAM-Röhrchen zum

Auffangen von Gas, das während des fermentativen Kohlenhydratabbaues entstehen kann.

Durchführung:

Glucose-Medium beimpfen und für 16-24h bei 37°C bebrüten.

Beurteilung:

Säurebildung positiv: Umschlagen des Indikators von blau nach gelb

Gasbildung positiv: Gasblase im Durhamröhrchen

Zitrat Verwertung:

Das Substrat enthält als alleinige Kohlenstoffquelle Zitrat und als alleinige Stickstoffquelle ein Am-

moniumsalz. Keime, die mit beiden Substanzen ihren Stoffwechsel bestreiten können, wachsen in

diesem Medium. Die entstehende Alkalisierung führt zur Trübung des Mediums.

Durchführung:

Zitrat-Medium beimpfen und für 16-24h bei 37°C bebrüten

Positiv: Wachstum und Indikatorfarbumschlag nach blau

11

Nitratreduktionstest:

Bei Vorhandensein des Enzyms Nitratreduktase wird Nitrat zu Nitrit und ggf. weiter zu Ammoniak

oder molekularem Stickstoff reduziert. Entstandenes Nitrit kann durch das Griess-Reagenz (Sul-

fanilsäure + Alpha-Naphthalin) nachgewiesen werden.

Wird Nitrat nur bis Nitrit reduziert, wird die Reaktion mit dem Griess-Reagenz positiv (Rotfär-

bung). Erfolgt eine weitergehende Reduktion, wird Nitrit vollständig zu Ammoniak und N2 redu-

ziert, als Folge wird die Griess-Reaktion negativ. Eine negative Griess-Reaktion kann daher durch

ein Fehlen der Nitratreduktase (keine Nitratreduktion) oder durch eine vollständige Reduktion von

Nitrat zu Ammoniak oder elementaren Stickstoff verursacht werden. Um zwischen diesen Mög-

lichkeiten zu unterscheiden, wird Zinkstaub zu der Reaktion hinzu gegeben. Zinkstaub reduziert

Nitrat ebenfalls zu Nitrit. Tritt nach Zugabe von Zinkstaub eine Rotfärbung auf heißt dies, dass

Nitrat noch vorhanden war, als keine bakterielle Nitratreduktase vorlag (Negative Reaktion). Erfolgt

nach Zinkstaubzugabe keine Rotverfärbung, bedeutet dies, dass das Nitrat vollständig reduziert

wurde (Positive Reaktion).

Prinzip: Nitratreduktase

Nitrat → Nitrit → Ammoniak, Stickstoff

Zinkstaub

↑

Nachweis durch Griess-Reagenz

Durchführung:

Nitrat-Medium beimpfen und für 16-24h bei 37°C bebrüten

Beurteilung Nitratreduktionstest:

Gasbildung: Gasblase im Durham-Röhrchen

Griess-Reagenz: ca. 5 Tropfen hinzufügen, einige Minuten warten

Rotfärbung: Ergebnis positiv

Farblos: → Zugabe von etwas Zinkstaub

Farblosigkeit bleibt nach Zugabe von Zinkstaub: Ergebnis positiv

Rotfärbung nach Zugabe von Zinkstaub: Ergebnis negativ

Kligler-Agar (Zwei-Zucker-Eisen-Agar):

Durch den Gehalt an Glukose (0,1%), Laktose (1%), Phenolrot und Eisen-II-Sulfat ermöglicht der

Kligler-Agar die gleichzeitige Erkennung mehrerer biochemischer Leistungen. Bei alleinigem

Abbau der in limitierten Mengen vorhandenen Glukose kommt es nach 6 Stunden zur Säuerung

(fermantativ) und zum Indikatorfarbumschlag (von rot nach gelb) der Agarschrägfläche und der

Hochschicht. Durch aeroben Abbau von Proteinen wird bei weiterer Bebrütung im Schräganteil

eine Realkalisierung bewirkt, in deren Folge der Indikator wieder umschlägt (von gelb nach rot).

Bei Abbau der in großen Mengen vorhandenen Laktose findet die Realkalisierung nicht statt.

Durchführung:

- Impfnadel ausglühen und erkalten lassen

- Mit Impfnadel Bakterienkolonie aufnehmen

- Impfnadel tief in den Agar einstechen

- Impfnadel aus der tiefen Agarschicht ziehen und dabei

zickzackförmig auf der Agarschrägfläche ausstreichen

- Impfnadel ausglühen

16-24h bei 37°C bebrüten.

Beurteilung:

Schrägfläche rot, Hochschicht gelb: Abbau von Glukose

Schrägfläche gelb, Hochschicht gelb: Abbau von Glukose und Laktose

Schrägfläche rot, Hochschicht rot: kein Abbau von Glukose und Laktose

Schwarzfärbung der Hochschicht: Bildung von H2S (Eisensulfid)

Blasen- und Rissbildung: Gasbildung beim Glukoseabbau

C

Beim pfen Schräg-

Stichagarm edien

(Kligler)

1.

2.

3.

12

SIM-Agar (Schwefelwasserstoffbildung-Indol-Motilität):

Beim SIM-Agar handelt sich es um einen komplexen Agar, der mehrere Leistungen überprüft. Die

Agarkonzentration ist so gewählt, dass gerade keine Verflüssigung eintritt.

Bewegliche Bakterien beschwärmen diesen Leicht-Agar vollständig, während unbewegliche Bak-

terien nur am Impfstrich wachsen.

Außerdem wird Bildung von H2S und Indol nachgewiesen.

Durchführung:

- Impfnadel ausglühen und erkalten lassen

- Mit Impfnadel eine Bakterienkolonie aufnehmen

- Impfnadel tief in den Agar einstechen

- Impfnadel rausziehen und ausglühen

16-24h bei 37°C bebrüten

Beurteilung:

Schwefelwasserstoffbildung (H2S):

Positiv: Schwarzfärbung

Indol-Bildung: Einige Tropfen Indol-Reagenz (Kovacs Reagenz) zusetzen

Positiv: Roter Ring

Motilität:

Positiv: Homogenes Wachstum = beweglich

Negativ: Wachstum nur am Impfstrich = unbeweglich

Aufgabe Übung 3:

Färben und Identifizieren von Bakterien

Färben:

1. Von der Bakterienkultur 1 Färbepräparate herstellen, lufttrocknen, hitzefixieren

2. Präparat nach Gram färben

3. Protokollieren im Protokollblatt Übungen 1-3

Mikroskopie: Objektiv 100er, Blende geöffnet, ohne Deckglas, mit Immersionsöl

Identifizieren:

1. Beurteilung der Kulturen und Durchführung der biochemischen Tests (siehe Protokoll)

2. Protokollieren im Protokollblatt Übungen 1-3:

3. Beimpfen einer „Bunten Reihe“

Die Kulturen werden 16-24 h bei 37°C bebrütet, am nächsten Kurstag ausgewertet und der

Keim identifiziert.

1.

2.

B

Beimpfen

Stichagarmedium

13

Protokoll Übungen 1-3:

Ergebnisse der mikroskopischen, kulturellen und biochemischen Prüfungen

Gramverhalten:

positiv / negativ

Morphologie:

Kokken / Stäbchen

Kolonieform: (auf Blutagar)

Größe:

Kontur:

Profil:

Oberfläche:

mm im Durchmesser……….

rund / unregelmäßig / gekerbt / rhizoid /….

flach / erhaben / konvex / hochkonvex /….

glatt / glänzend / matt / rau / gestreift/….

Konsistenz (Prüfung mit der Öse):

salbenartig / membranös / schleimig

Pigmentierung (auf Peptonagar):

Bildung löslicher Farbstoffe:

positiv / negativ

positiv / negativ

Katalase (auf Objektträger):

positiv / negativ

Oxidase (auf Oxidase Testfeld):

positiv / negativ

Hämolyse (auf Blutagar):

positiv / negativ

Wachstum auf MacConkey-Agar:

positiv / negativ

Laktosespaltung (auf MacConkey-Agar)

positiv / negativ

Kligler-Medium: (Anaerobe Säurebildung)

Glukose:

Gasbildung:

positiv / negativ

positiv / negativ

Dextrose-Medium: (Aerobe Säurebildung)

Glukose:

Gasbildung:

positiv / negativ

positiv / negativ

Nitrat-Medium: (Nitrit aus Nitrat)

Gasbildung:

Alkalisierung:

Nitritreduktion:

positiv / negativ

positiv / negativ

positiv / negativ

SIM-Agar:

Schwefelwasserstoffbildung: (H2S)

Indol-Bildung:

Motilität:

positiv / negativ

positiv / negativ

positiv / negativ

Zitrat-Medium:

positiv / negativ

14

Identifizierungsschlüssel für grampositive und gramnegative Bakterien:

Wahrscheinlichste taxonomische Gruppe

Biochemische

Leistungen

Mic

roco

ccu

s

Sta

ph

ylo

co

ccu

s

Str

ep

toco

ccu

s

En

tero

co

ccu

s

Bacil

lus

sp

.

Vib

rio

, A

ero

mo

nas

Pseu

do

mo

nas

Esch

eri

ch

ia c

oli

Serr

ati

a

marc

escen

s

Kle

bsie

lla p

neu

-m

on

iae

Pro

teu

s v

ulg

ari

s

Neis

seri

a

Bacte

roid

aceae

Gramverhalten + + + + + - - - - - - - -

Morphologie 1 1 1 1 2 2,4,5 2 2 2 2 2 1 1,2,3,4

Sporenbildung - - - - + - - - - - - - +

Aerobes

Wachstum + + + + + + + + + + + + -

Wachstum auf

MacConkey - - - - - - + + + + + + (+)

Laktosespaltung

(auf MacConkey) - - - - (+) + - + - + - -

Pigmentierung gelb weiß - - - - - - rot - - gelb schwarz

Oxidase v - - - v + + - - - - + v

Katalase + + - - + + + + + + + v

Kligler/Säure - - - + V + - + + + + - +

Kligler/Gas - - - - - - + - + -

Dextrose/Säure V - + + V + V + + + + V -

Dextrose/Gas - - - - - V - + V + -

Nitrat-Medium V - + - V - + + + + + V -

SIM-Agar/H2S - - - - V - - V V V + - V

SIM-Agar/Indol - - - V - - - V V V + - V

SIM-Agar/ Motilität - - - - - V + V V V + - V

Zitrat-Medium - - - - V V + - + + V

Zeichenerklärung:

+ = positiv

- = negativ

v = variabel

1 = Kokken

2 = Stäbchen

3 = Keulenform

4 = Fadenform

5 = Schraubenform

Schlussfolgerung aus den Ergebnissen der Übungen 1 und 2:

Welcher der in der Tabelle aufgeführten taxonomischen Gruppe ist der untersuchte Keim

zuzuordnen? ................................................. ...............................

15

Kursteil 3

B. Bakterienflora der Umwelt

Übung 4: Anzucht von Bakterien aus dem direkten Umfeld Die atmosphärische Luft hat im Gegensatz zum Erdboden und Wasser keine endogene Bakteri-

enflora. Bakterielle Luftkontaminanten sind an schwebende Staubpartikel oder Flüssigkeitströpf-

chen gebundene Keime des Erdbodens oder stammen aus der endogenen physiologischen oder

pathologischen tierischen Flora (Raumluft). Entsprechendes gilt für die meisten Gebrauchsge-

genstände und mit Einschränkung für die äußere Haut des Menschen. Von primären Reservoirs

über das Vehikel Luft (aerogene Infektion) oder durch kontaminierte Gegenstände (Schmierinfek-

tion) übertragene Krankheitserreger, spielen in der medizinischen Praxis eine erhebliche Rolle.

Die Anzahl der übertragenen Keime steht dabei in der Regel in einem direkten Verhältnis zu der

Wahrscheinlichkeit einer Infektion.

Es gibt eine große Anzahl von Verfahren zur Luftkeimzahlbestimmung nebst unzähligen Modif ika-

tionen, die insbesondere von Krankenhaushygienikern verwendet werden (Operationssäle). Eine

100%ige Keimerfassung gibt es nicht. Dagegen lässt sich natürlich eine praktisch 100%ige Ent-

fernung von Luftkeimen z.B. durch Luftfilter erreichen.

Bei Luftkeimbestimmungen müssen theoretisch folgende 2 Vorraussetzungen gegeben sein:

Schonender und umfassender Keimeinfang

Optimale Kulturbedingungen

Einige der gebräuchlichsten Verfahren sind:

A: Keimeinfang (über Druck- oder Saugluft)

B: Kultivierung

1. Wasserlöslicher Filter

(Algen-, Gelatinetrockenfilter u.a.)

nach Auflösung der Filter in Nährflüssigkeit

→ Membranfiltrierung wie A-2

2. Membran-Filter(Cellulose-Acetat)

nach Auflegen der Filter auf Agarplatten

3. Schlitzsammler auf Agarplatten

der Keimeinfangagarplatten

4. Porensammler

(z.B. 6-Stufensammler auf Agarplatten)

wie A-3

5. Waschflaschen (mit Phosphatpuffer)

a) als Luftdurchperler (geringer Durchfluss)

b) als sog. Impinger (Flüssigkeitszerstäuber;

to impinge = aufprallen)

siehe unter A-1

siehe unter A-1

6. Als grobquantitativer Sedimentationsver-

fahren

auf Agarplatten

16

Aufgabe Übung 4:

Anzucht von Bakterien aus dem direkten Umfeld

1 = Raumluft

2 = Fußboden

3 = Arbeitstisch

4 = Gegenstand nach Wahl

5 = Gegenstand nach Wahl

6 = Gegenstand nach Wahl

7 = Gegenstand nach Wahl

8 = Gegenstand nach Wahl

- für die Raumluftuntersuchung wird die Agarplatte für die Dauer von 1 Stunde

offen auf dem Arbeitstisch gelegt und anschließend mit dem Deckel verschlossen

- zur Untersuchung des Fußbodens und des Arbeitstisches (2 und 3) wird mit einem an-

gefeuchteten Watteträger ein Abstrich genommen und das Material auf Agarplatte

ausgestrichen

- Platten mit der Platz-Nr. und zusätzlich mit dem Buchstaben oder der Zahl des gewählten

Untersuchungsmaterials beschriften

- Die Kulturen werden eingesammelt und 16 – 24 h bei 37°C bebrütet

Aufgabe Übung 4 am nächsten Kurstag:

Auswertung der Kulturen „Bakterien aus dem direkten Umfeld“

- Makroskopische Beschreibung von je 3 unterschiedlichen Kolonien auf den Agarplatten

(Morphologie, Nährbodenveränderung)

- Präparate herstellen

- Präparate nach Gram färben

- Protokollieren in nachfolgender Tabelle

Protokoll Übung 4: Anzucht von Bakterien aus dem direkten Umfeld:

Keim

Nr.

Kolonie-

morphologie

a. d. Nährboden

Nährboden-

veränderung

Gramreaktion/

Morphologie

Vermutete

Gattung

1

2

3

Welche Bakteriengattungen bzw. -spezies werden typischerweise nachgewiesen?

in der Raum-

luft:...................................................... ..........................................................................

auf dem Fußbo-

den:........................................................................................................ ..................

auf dem Arbeits-

tisch:........................................................................................................................

auf den Gegenständen nach

Wahl……………………………………………………………………….

17

Übung 5: Anzucht von Bakterien des Erdbodens Abbildung und Tabelle geben einige Hinweise auf die ökologische Bedeutung und die Gattungen

der im Erdboden vorkommenden Bakterien. Einige Vertreter mit medizinischer Bedeutung sind in

der Tabelle unterstrichen.

Ungefähre Zusammensetzung der Mikroorganismen im Erdboden

Biomasse des Erdbodens (Bakterien-Gattungen mit med. Bedeutung sind fett gedruckt)

Symbiotische

Frei lebende

Bakterien Algen Hefen

Rhizobium sp.

Klebsiella sp.

Actinomyceten

und

Pilze

Azotobacter sp.

Azotomonas sp.

Spirillum sp.

Bacillus sp.

Enterobacter sp.

Nocardia sp.

Pseudomonas sp.

Clostridium sp.

etc.

Anabaena

Calothrix

Nostoc

Stigonema

Chlorogloea

etc.

Pullularia

Rhodotorula

18

Aufgabe Übung 5:

Anzucht von Bakterien des Erdbodens

- Eine Suspension von Gartenerde wird auf einem Blutagar fraktioniert ausgestrichen

- Platten mit ungeraden Platznummern werden 16 – 24 h bei 37°C aerob bebrütet

- Platten mit geraden Platznummern werden 16 – 24 h bei 37°C anaerob bebrütet

Auswertung der Kulturen „Bakterien des Erdbodens“ am Kurstag 3:

Aerobe Platte: Beschreibung von Morphologie und Nährbodenveränderung (Hämolyse)

3 verschiedener Kolonien

Präparate herstellen und nach Gram färben

Anaerobe Platte: Beschreibung von Morphologie und Nährbodenveränderung (Hämolyse)

3 verschiedener Kolonien

Präparate herstellen und nach Gram färben

Protokollieren in nachfolgender Tabelle

Aerobe

Keime

Wachstum a. d. Nährboden:

(Form, Größe, Hämolyse)

Gramfärbung:

(Morphologie, Gramverhalten)

Vermutete

Gattung

1.

2.

3.

Anaerobe

Keime

Wachstum a. d. Nährboden:

(Form, Größe, Hämolyse)

Gramfärbung:

(Morphologie, Gramverhalten)

Vermutete

Gattung

1.

2.

3.

19

Kursteil 4

C. Normale Bakterienflora des Menschen

Übung 6: Keimzahlbestimmung im Speichel Die Mundhöhle des Erwachsenen beherbergt im Vergleich zu anderen Körperarealen eine große

Zahl und Vielfalt an aeroben und anaeroben Mikroorganismen (ca. 30-50% sind Anaerobier). Die

folgenden Tabellen geben Aufschluss über Zahl, Verteilung und Art der Mikroorganismen.

Aufgabe Übung 6:

Keimzahlbestimmung im Speichel

1. Verdünnungsreihe nach Pipettierschema herstellen:

- 10,0ml Glucosebouillon in die Reagenzgläser 1 - 3 pipettieren

- 4,5ml Glucosebouillon in die Reagenzgläser 4 - 7 pipettieren (s. Schema)

- 0,1ml eigener Speichel mit der Glucosebouillon in Reagenzglas 1 vermischen, bitte hier nach

jedem Pipettierschritt die Glaspipette wechseln!!

Kulturen werden 16 - 24 h bei 37°C bebrütet

Auswertung: es wird beurteilt bis zu welcher Verdünnungsstufe Wachstum vorhanden ist

Protokoll: siehe Kursteil 5

2. Bestimmung der Anzahl aerober Keime pro ml:

- aus Reagenzglas 5, 6, 7 je 1,0 ml auf je einen Peptonagar geben, mit einem Spatel verteilen

- Platten mit Platznummer und Verdünnungsstufe beschriften

Kulturen werden 16 - 24 h bei 37°C bebrütet

Auswertung: es werden auf jeder Agarplatte alle Kolonien gezählt

Protokoll: siehe Kursteil 5

20

Pipettierschema:

Protokoll Übung 6: Keimzahlbestimmung des Speichels

1. Verdünnungsreihe:

Verdünnungsstufen: 10-2 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9 10-10

Wachstum:

(=Trübung)

Protokoll Übung 6: Keimzahlbestimmung des Speichels

2. Bestimmung der Anzahl aerober Keime pro ml Speichel mit Hilfe des arithmetischen

Mittels:

Beispiel:

Anzahl gezählter Kolonien:

Bei einer Verdünnung von 10-8 ml: 150 Kolonien →150 Kolonien

Bei einer Verdünnung von 10-9 ml: 10 Kolonien →100 Kolonien

Bei einer Verdünnung von 10-10 ml: 5 Kolonien → 500 Kolonien

Summe =750 Kolonien

750 : 3 = 250 Kolonien pro 10-8 ml Speichel (oder pro 1 ml Speichel: 2,5 x 10-10)

Errechnen der ungefähren Keimzahl des eigenen Speichels:

Anzahl gezählter Kolonien:

Bei einer Verdünnung von 10-8 ml: ……. Kolonien → ……. Kolonien

Bei einer Verdünnung von 10-9 ml: ……. Kolonien → ……. Kolonien

Bei einer Verdünnung von 10-10 ml: ……. Kolonien →……. Kolonien

Summe = Kolonien

……. : 3 = ……. Kolonien pro 10-8 ml Speichel (oder pro 1 ml Speichel: 2,5 x 10-10)

21

Übung 7: Anzucht von Bakterien aus dentaler Plaque Der als "Plaque" bezeichnete Zahnbelag, der eine Vielzahl aerober und anaerober Bakterien

enthält (s. Tabelle), soll in dieser Übung mikrobiologisch untersucht werden.

(Tabelle aus: Sauerwein, Kariologie)

Aufgabe Übung 7:

Anzucht von Bakterien aus dentaler Plaque

1. Herstellen eines Direktpräparates von Plaque

- Mit Hilfe eines sterilen Zahnstochers wird vom Zahnbelag vorsichtig

Material abgeschabt und in einem winzigenTropfen Wasser auf einem Objektträger

suspendiert

- lufttrocknen, nach Gram färben

2. Aerobe und anaerobe Kultivierung von Plaque

- Identisch entnommene Proben des Plaquematerials werden zur Anzucht auf zwei

getrennte Blutplatten geimpft und fraktioniert ausgestrichen

- eine Kultur wird aerob, die andere wird anaerob 16 – 24 h bei 37°C bebrütet

Kurstag 5:

- von je 3 unterschiedlichen Kolonien auf den Agarplatten (aerobe und anaerobe Platte)

die Morphologie und Nährbodenveränderung (Hämolyse) beschrieben

- Von diesen Kolonien Präparate herstellen und nach Gram färben

Protokollieren in nachfolgender Tabelle

Protokoll Übung 7: Skizze vom Direktpräparat „dentale Plaque“ (Gramfärbung)

22

Protokoll Übung 7: Zahnbelag, aerobe und anaerobe Kultivierung

Aerobe

Keime

Wachstum a. d. Nährboden:

(Form, Größe, Hämolyse)

Gramfärbung:

(Morphologie, Gramverhalten)

Vermutete

Gattung

1.

2.

3.

Anaerobe

Keime

Wachstum a. d. Nährboden:

(Form, Größe, Hämolyse)

Gramfärbung:

(Morphologie, Gramverhalten

Vermutete

Gattung

1.

2.

3.

23

Übung 8: Anzucht von Bakterien aus dem Rachen Identifizierung des Trägerstatus für potentielle pathogene Keime:

Die nachfolgenden Tabellen geben einige Hinweise auf die Beteiligung der Gattung Streptococ-

cus an zahnmedizinisch relevanten Krankheitsprozessen in der Mundhöhle.

Normale Rachenflora (durchschnittliche Häufigkeit in der aufgeführten Reihenfolge

abnehmend)

Pathologische Rachenflora (im Erkrankungsfall und bei sog. Gesunden Trägern)

Vergrünende Streptokokken (~80%) Staphylococcus aureus (Koagulase positiv)

Anhämolysierende Streptokokken (~5%) Streptococcus pyogenes

Neisseria spp. (~5%) Streptococcus pneumoniae

Koagulase-neg. Mikrokokken (~5%) Neisseria meningitidis

Laktobakterien (~1%) Haemophilus influenzae (Kapseltyp b)

Corynebacterium sp. (~1%) Opportunistische Enterobacteriaceae

Candida sp. (~1%) Candida albicans

Borrelia sp. (~1%)

Fusobacterium sp. (~1%)

Aufgabe Übung 8:

Anzucht von Bakterien aus dem Rachen

Herstellen eines Grampräparates und einer Kultur von der eigenen Rachenflora

- Jeder Kursteilnehmer entnimmt bei seinem Nachbarn mit den Wattetupfern 2 Rachen-

abstriche

- Mit dem 1. Wattetupfer ein Objektträger-Präparat herstellen, dabei den Tupfer kräftig

auf dem Objektträger ausdrücken (kein Wasser zufügen!)

- Objektträger lufttrocknen, Hitzefixieren und nach Gram färben

- der 2. Rachenabstrich auf dem ersten Drittel einer Blutplatte ausstreichen,

die beiden anderen Drittel mit der Öse ausstreichen

- Kultur 16 – 24 h bei 37°C bebrüten

Mikroskopie:

- Zeichnen der verschiedenartig aussehenden Keime des Direktpräparates

(Neben Plattenepithelien, Schleimfäden, gelegentlich Nahrungsresten sieht man in der

Regel eine Vielzahl, z. T. sehr unterschiedlicher Bakterienformen)

24

Nächster Kurstag:

Beurteilung der Kultur von der eigenen Rachenflora

Ziel der Übung ist, in der Gruppe der Kursteilnehmerinnen die gesunden und kranken "Träger"

dieser Infektionserreger zu identifizieren (Trägerstatus, Durchseuchung)

- mit dem Filzstift verdächtige Kolonien markieren (auf dem Plattenboden) und deren Eigenart

protokollieren

- anlegen von Reinkulturen potentiell pathogener Erreger, insbesondere:

S. aureus, S. pyogene, S. pneumoniae, gramnegative Stäbchen = "Opportunisten"

- Kultur 16 – 24 h bei 37°C bebrüten

Übernächster Kurstag:

- Die Kultur wird beurteilt und falls erforderlich, eine weitere Keimdifferenzierung vorgenommen

(z. B. Plasmakoagulase, Streptex-Test Bacitracin-, Optochin-Test)

- herstellen von Grampräparat(en)

Protokoll Übung 8: Grampräparat vom Rachenabstrich

Protokoll Übung 8: Kultur der eigenen Rachenflora

Keim Wachstum a. d. Nährboden:

(Form, Größe, Hämolyse)

Gramfärbung

(Morphologie, Gramverhalten)

Vermutete Gattung

1

2

3

Protokoll Übung 8: Trägerstatus bei KursteilnehmerInnen

Keime

Anzahl potenziell

pathogener Keime

im Kurs

Gesamtzahl der

Rachenabstriche

Trägerstatus

(% positiv)

Positiv für S.aureus

Positiv für S.pyogenes

Positiv für S.pneumoniae

Sonstiges

25

Kursteil 5

Übung 9: Abgrenzung von S.aureus gegenüber anderen Micrococcaceae Grampositive Haufenkokken gehören zur Familie der Micrococcaceae mit den beiden wichtigsten

Genera Staphylococcus und Micrococcus. Bei letzteren handelt es sich meist um so genannte

Luftkokken.

Staphylococcus aureus ist einer der häufigsten Eiter- und Entzündungserreger beim Menschen.

Er bildet invitro u.a. Plasmakoagulase, deren Nachweis neben dem einer DNase seine sichere

Identifizierung ermöglicht. Dieses Enzym vermag Menschen- oder Kaninchenplasma (Citrat-,

Oxalat- oder Heparinplasma) auf nicht ganz geklärte Weise zu koagulieren (Ausfällung von Fib-

rin). (Herstellung von Citratplasma: Mischen von Vollblut mit 3,8% Na-Citrat (4 Teile + 1 Teil) zent-

rifugieren, Überstand = Plasma). S. aureus-Stämme bilden meist gelbes oder gelbweißliches

Pigment und auf Blutagar meist beta-Hämolyse.

S.epidermidis und S.saprophyticus sind normale Haut- und Schleimhautkeime, kommen aber

auch als opportunistische Infektions-Erreger (bei Abwehrschwäche, z.B. bei Immunsuppression

u. postoperativ) vor. Sie sind wie alle Micrococcaceae (mit Ausnahme von S. aureus) Plasmako-

agulase negativ.

Koagulase-Reaktion:

Durch das Enzym Koagulase wird das Fibrinogen im Zitratplasma von Menschen und Kaninchen

in Fibrin überführt. Die Koagulase ist ein Pathogenitätsfaktor von Staphylococcus aureus. Sus-

pendiert man Staphylococcus aureus in einen auf einem Objektträger befindlichen Zitratplas-

matropfen, so kommt es zur Ausfällung von Fibrin, in dessen Netzwerk die Staphylokokken ein-

gebettet sind. Makroskopisch erkennt man die Bildung kleiner Klümpchen in klarer Flüssigkeit

(positives Ergebnis), die eine Agglutination erkennen lassen. Im Gegensatz zu anderen Staphylo-

kokken besitzen fast alle Staphylococcus aureus-Stämme diesen "Clumping factor" an ihrer Zell-

oberfläche.

Durchführung:

Das verdächtige Keimmaterial wird mit einem sehr kleinen Wassertropfen auf einem Objektträger

bis zur Homogenität verrieben. Dann wird mit der Pasteurpipette ein Tropfen Zitratplasma mit dem

Keimmaterial vermischt.

Positiv: Plasma koaguliert (Flockenbildung)

Aufgabe Übung 9:

Abgrenzung von S. aureus gegenüber sonstigen Mikrokokken

- Betrachtung der Blutagarkulturen (bei Auflicht sowie gegen das Licht) auf erkennbare

Unterschiede, z.B. Hämolyse etc.

- Herstellen von Gram-Präparaten (von allen 3 Kulturen auf einem Objektträger)

- Nachweis des Clumping-Faktors (Koagulase-Reaktion) im Objektträgertest

- Protokolliere die in der nachfolgenden Tabelle aufgeführten Kriterien für die

Keime A, B und C zur Identifizierung von S. aureus

26

Protokoll Übung 9: Abgrenzung von S. aureus gegenüber sonstigen Mikrokokken

Kriterien:

Keim A

Keim B

Keim C

Koloniefarbe

Hämolyse (Blutagar)

Gramfärbung

Kokkenform

(Zeichnung)

Clumping-Faktor

Mutmaßliche

Beweglichkeit

Mutmaßliches

Wachstum auf

MacConkey-Agar

Diagnose:

27

Kursteil 6

Übung 10: Neisser-Färbung zum Nachweis von Corynebacterium Energiereiche Phosphatbindungen werden von zahlreichen Bakterienarten in Form von haupt-

sächlich aus Polyphosphat bestehenden Plasmaeinschlüssen als Reservestoffe gespeichert, z.B.

von Spirillum volutans ("Volutin"), Lactobacillus- u. Corynebacterium-Arten. Die Darstellung von

Polyphosphat (dunkelbraun bis schwarz bei gelbem Cytoplasma) mit Hilfe der Neisser-Färbung ist

keineswegs für Diphtheriebakterien spezifisch, aber als positives Merkmal zur Charakterisierung

von Diphtheriebakterien unerlässlich als frühester und schnellster diagnostischer Hinweis bei der

Untersuchung von Rachen- bzw. Wundsekret in Diphtherie-Verdachtsfällen.

(Endgültige Diagnose: Nachweis der Toxinbildung (z.B. Agardiffusionstest nach ELEK bei ver-

dächtigen Reinkulturen).

Neisser-Färbung (Differenzialfärbung)

- Präparat hitzefixieren

- Lösung "Neisser I", 30 Sekunden, abgießen, nicht mit Wasser abspülen!

- Lösung "Neisser II", 15 Sekunden, abgießen, nicht mit Wasser abspülen!

- zwischen Filterpapier trocknen

Mikroskopie: 100er Objektiv, Immersionsöl

Aufgabe Übung 10:

Mikroskopie der ausliegenden Dauerpräparate:

mit 100er Objektiv, Immersionsöl

Protokollieren der Neisserfärbung: Reaktion von C. diphteriae oben und von C. pseudodipht

unten einzeichnen.

Protokoll Übung 10: (Farbskizzen!)

28

Übung 11: Kinyoun-Färbung zum Nachweis von Mykobakterien

Die Kinyoun-Färbung ist eine modifizierte Ziehl-Neelsen-Färbung.

Die Mykobakterien sind „säurefest“. Freie Mykolsäuren in der Zellwand gehen mit Karbolfuchsin

(Fuchsin + Phenol) eine Komplexbildung ein, die einer Entfärbung mit HCL-Alkohol standhält,

während die nicht-säurefesten Bakterienarten dadurch entfärbt werden.

Kinyoun-Färbung: (Differenzialfärbung)

- Präparat hitzefixieren (ist bereits geschehen)

- Karbolfuchsin → 4 Min.

- kurz mit Leitungswasser abspülen

- Salzsäurealkohol → 3-5 Sekunden

- kurz mit Leitungswasser abspülen

- Methylenblau → 30 Sekunden

- kurz mit Leitungswasser abspülen

- trocknen zwischen Filterpapier

Mikroskopie: 100er Objektiv, Immersionsöl

Aufgabe Übung 11:

Mikroskopie der ausliegenden Dauerpräparate:

mit 100er Objektiv, Immersionsöl

Da Mykobakterien in klinischen Materialien in geringer Konzentration vorhanden sein können,

müssen zahlreiche Gesichtsfelder durchmustert werden, wobei das Objektiv die Ausstrich-

fläche auf mäanderförmiger Bahn durchläuft.

Protokollieren

Protokoll Übung 11: Säurefeste Stäbchen (farbige Skizze!)

29

Übung 12: Antibiotika-Resistenzbestimmung I (Agardiffusionstest) Die Resistenztestung von Bakterien gegenüber Antibiotika wird entweder mit dem Agardiffusions-

test auf festen Nährböden oder mit dem Reihenverdünnungstest in flüssigen Medien durchgeführt.

Mit dem Agardiffusionstest wird der Hemmhof ermittelt und mit dem Reihenverdünnungstest die

minimale Hemmstoffkonzentrationen.

Aufgabe Übung 12:

Antibiotika-Resistenzbestimmung I (Agardiffusionstest)

- Auf den Boden der beiden Müller-Hinton-Agarplatte wird die Platz-Nr. und der Name des zu

prüfenden Stammes geschrieben. (S .aureus, E. coli oder häm. Streptokokken)

- Mit der Öse wird von der zu testenden Kultur Material entnommen und in der Mineralbasis

zu einer deutlich trüben Suspension aufgeschwemmt.

- Die gesamte Oberfläche der beiden Müller-Hinton-Agarplatte wird unter Verwendung eines

Wattetupfers mit der Bakteriensuspension bestrichen.

- Anschließend werden mit den beiden Dispenser die Antibiotika-Plättchen auf den Agar

aufgebracht. Getestet werden 12 verschiedene Antibiotika (6 pro Platte)

- Kulturen (mit der Agarschicht nach oben) 16 - 24 h bei 37oC bebrüten

Am nächsten Kurstag:

Auswertung und Protokollierung nach folgendem Bewertungsmaßstab:

Hofdurchmesser von 14 mm und größer = empfindlich = ++

Hofdurchmesser von <11-13 mm = schwach empfindlich = +

kein Hemmhof <11 mm = resistent = -

Zur Therapie im Erkrankungsfall werden nur doppelt-wirksame (++) Antibiotika verwendet.

Protokoll Übung 12: Agardiffusionstest

Wirkstoffe S. aureus E. coli Häm. Streptokokken

Dispenser Code Wildtyp

in mm

Isolat

in

mm

Wildtyp

in mm

Isolat

in

mm

Wildtyp

in mm

Isolat

in

mm

Penicillin P 14 14 14

Ampicillin AM 14 14 14

Ampicillin/Sulbactam SAM 14 14 14

Piperacillin PIP 14 14 14

Cefazolin CZ 14 14 14

Cefotaxim CTX 14 14 14

Dispenser II Code Wildtyp

in mm

Isolat

in

mm

Wildtyp

in mm

Isolat

in

mm

Wildtyp

in mm

Isolat

in

mm

Imipenem IPM 14 14 14

Erythromycin E 14 Wird nicht

beurteilt 14

Ciprofloxacin CIP 14 14 14

Gentamicin GM 14 14 14

Co-Trimoxazol SXT 14 14 < 11

Tetracyclin TE 14 14 14

30

Protokoll Übung 12: Der Vergleich aller im Kurs untersuchten Kulturen ergibt:

Stämme Anzahl untersuchter

Stämme

Anzahl sekundär-

resistenter Stämme

Anzahl mehrfach-

resistenter Stämme

S. aureus

E. coli

Häm. Streptokokken

Hinweis auf Sekundärresistenz durch chromosomale Mutation oder plasmidgebundene

Resistenzfaktoren:

Streptococcus pyogenes (Gruppe A), Streptococcus pneumoniae, Neisseria gonorrhoeae,

Treponema pallidum neigen nicht oder selten zur Ausbildung einer Resistenz gegen Penicillin.

Für die entsprechenden Krankheiten stellt Penicillin das Antibiotikum der Wahl dar. Bei beste-

hender Penicillin-Allergie muss allerdings ein anderes Antibiotikum genommen werden (Erythro-

mycin).

31

Übung 13: Antibiotika-Resistenzbestimmung II (MHK)

Aufgabe Übung 13:

Antibiotika-Resistenzbestimmung II (Minimale Hemmkonzentration, MHK)

Je 3 Kursteilnehmer bearbeiten einen Testkeim (Keim A, B oder C, auf Peptonagar)

1. Herstellen einer Testkeim-Suspension:

3-5 Kolonien des Testkeims in ein Röhrchen mit Mineralbasis suspendieren (leichte Trübung)

2. Beschriften der sterilen Glukosebouillonröhrchen mit:

Platznummer, 100 I.E., 10 I.E., 1 I.E., Kontrolle (I.E. = Internationale Einheiten Penicillin/ml)

In dem Glukosebouillonröhrchen das bereits 1000 I.E. beschriftet ist, befinden sich schon

1000 I.E. Penicillin

3. Herstellen einer Penicillin-Verdünnungsreihe nach unterem Schema

Verdünnungsreihe 16-24h bei 37°C bebrüten

Pipettierschema für die MHK

Beschriftung der Röhrchen 1000 I.E. 100 I.E. 10 I.E. 1 I.E. Kontrolle

Volumen im Röhrchen (ml) 5,0 4,5 4,5 4,5 4,5

Penicillin Konzentration I.E./ml 1000 0 0 0 0

Überpipettieren verwerfen

Überpipettiertes Volumen (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0

Endvolumen im Röhrchen (ml) 4,5 4,5 4,5 4,5 4,5

Endpenicillin-Konzentration I.E./ml 1000 100 10 1 0

Beimpfung mit der Testkeim-Suspension 1 Öse 1 Öse 1 Öse 1 Öse 1 Öse

Protokoll Übung 13: MHK

Internationale Einheiten Penicillin / ml (I.E. Pen.)

(Trübung = Bakterienwachstum)

Gattung od. Gruppe

1000 IE/ml

100 IE/ml

10 IE/ml

1 IE/ml

Kontrolle

A = Bacillus sp.

B = E. coli

C = S. aureus

Schlussfolgerung:

Hinsichtlich der wildtypischen Empfindlichkeit gegenüber Penicillin unterscheiden sich die unter-

suchten Spezies wie folgt:

………………………………………………………………………………………………………

32

Abschnitt III: Hygiene

Kursteil 7

Temperaturresistenz

Nachweis von Keimen im Trinkwasser

Abklatschuntersuchung der Hände

Mikrobielle Besiedlung der Hände

Temperaturresistenz Theoretischer Hintergrund:

Im Unterschied zur Desinfektion dient die Sterilisation der Abtötung aller auf einem Gegenstand

oder in einer Zubereitung befindlicher Mikroorganismen. Hierzu zählen auch Sporen von Bakte-

rien, die eine besondere Resistenz gegenüber thermischen oder chemischen Einflüssen aufwei-

sen. Dies begründet die meist aggressiveren Verfahren der Sterilisation im Unterschied zur Des-

infektion, die eine Teilentkeimung zur Sicherstellung der Unterbrechung von Infektketten als Auf-

gabe hat. Die Grenzen der heute angewendeten Sterilisationsverfahren (meist Dampfsterilisation

für thermostabile Medizinprodukte, Niedrig-Temperatur-Plasmasterilisation für beispielsweise

thermolabile Instrumente) werden beim Versuch der Zerstörung von Prionen erreicht. Hier sind in

Zukunft neue oder geänderte Verfahren zu erwarten. Im heutigen Versuch sollen die Resistenzen

einzelner Bakteriengruppen gegenüber ausgewählten Entkeimungsmaßnahmen geprüft werden

Aufgabe Übung 14:

Testen der Temperaturempfindlichkeit verschiedener Bakterien

Es sollen 2 verschiedene Bakteriensuspensionen und 3 unterschiedlich vorbehandelte Sporen-

streifen bearbeitet werden, um anschl. zu beurteilen wie sich Hitze auf das Wachstum von

Bakterien auswirken.

Untersuchungsmaterial:

1. A = S. aureus 30 Min. bei 60°C vorbehandelt

2. B = E. coli 30 Min. bei 60°C vorbehandelt

3. C = Sporenstreifen unbehandelt

4. D = Sporenstreifen bei 120°C sterilisiert

5. E = Sporenstreifen bei 160°C 2, Stunden im Heißluftsterilisator sterilisiert

Reagenzien und Werkzeug:

6 sterile Glukosebouillons

Sterile Pipetten (in den Metalldosen)

Holzklammern

Pipettierschema:

Die Suspensionen A + B gut aufschütteln! (Achtung: Deckel sind nicht dicht)

1. Suspension A → 1Tropfen in ein steriles Bouillonröhrchen, beschriften mit A1

2. Suspension A, aufkochen → 1Tropfen in ein steriles Bouillonröhrchen, beschriften mit A2

3. Suspension B → 1Tropfen in ein steriles Bouillonröhrchen, beschriften mit B

4. Sporenstreifen C → ca. 2ml Leitungswasser zugeben, aufkochen,

anschl. den Inhalt eines sterilen Bouillonröhrchens zugeben

5. Sporenstreifen D → den Inhalt eines sterilen Bouillonröhrchens zugeben

6. Sporenstreifen E → den Inhalt eines sterilen Bouillonröhrchens zugeben

Die 6 Bouillonkulturen werden 16-24 h bei 37°C bebrütet und am nächsten Kurstag

ausgewertet und protokolliert.

33

Protokoll Übung 14: Temperaturempfindlichkeit verschiedener Bakterien

Untersuchungsmaterial Behandlung Wachstum (+/-)

A1 = Staphylokokken-Bouillon

bereits 30 Min. bei 60°C vorbehandelt

A2 = Staphylokokken-Bouillon bereits 30 Min. bei 60°C vorbehandelt und

anschl. aufgekocht

B = E. coli-Bouillon bereits 30 Min. bei 60°C vorbehandelt

C = Sporenstreifen Aufgekocht mit Leitungswasser

(ca. 100°C)

D = Sporenstreifen bei 120°C, 2 bar Wasserdampf

autoklaviert

E = Sporenstreifen 2 Stunden bei 160°C

im Heißluftsterilisator sterilisiert

Schlussfolgerung:

34

Nachweis von Keimen im Trinkwasser Theoretischer Hintergrund:

Trinkwasser ist das wichtigste Lebensmittel, da es durch nichts anderes ersetzt werden kann.

Daher sind der Schutz des Wassers und der sparsame Umgang mit Trinkwasser eine der wich-

tigsten Aufgaben des Menschen.

Eine wichtige Grundlage zur Sicherung der Ressource Wasser ist die hygienische Überwachung

des Trinkwassers, gesichert im Infektionsschutzgesetz und darauf basierend, der Trinkwas-

serverordnung (TrinkwV oder auch TVO). Ziel dieser Verordnungen ist die Sicherstellung von

sauberem und hygienisch kontrolliertem Trinkwasser, das eine Gefährdung der menschlichen

Gesundheit ausschließt. Dieses wird vor allem durch die Einführung von Grenzwerten für ge-

sundheitsschädliche biologische und chemische Parameter erreicht.

Von zentraler Bedeutung ist dabei die mikrobiologische Überwachung des Wassers (Anlage 1

der TrinkwV) sind die sicherstellen soll, dass keine potenziell gesundheitsschädlichen Darmkeime

wie z.B. Escherichia coli und andere Enterobakterien im Wasser nachweisbar sind.

Krankheitserreger im Trinkwasser

Grundwasser aus ausreichender Tiefe enthält normalerweise nur wenige, unproblematische Kei-

me.Mikrobielle Verunreinigungen entstehen durch:

Unzureichende Filterwirkung des Bodens, v. a. bei Flachbrunnen

Undichtigkeiten des Brunnens (Regenwasser, Hochwasser)

Sekundärverkeimungen durch die Versorgungssysteme

Unzureichende Aufbereitung (Desinfektion)

Bildung von stabilen Biofilmen in Stagnationsbereichen

Infektionen durch Trinkwasser Beispiele: Bakterien:

- Salmonellen

- Kolibakterien: (E. coli: meist Enteritis)

- Shigellen, Campylobacter, Yersinia enterocolitica (Enteritis)

- Vibrio cholerae

- Chlamydien (C. trachomatis: Trachom, evtl. Erblindung)

- Staphylokokken (S. aureus: Wundinfektionen, Lebensmittelvergiftung)

- Clostridium perfringens (Lebensmittelvergifter)

- Pseudomonaden (P. aeruginosa: über Kontakt: Wundinfektionen, Ohrinfektionen, Pneumonie)

- Legionellen (L. pneumophila u.a.: indirekt über Aerosole: Pneumonie, Pontiac-Fieber),

Viren: z.B.

- Poliovirus (Polio: Kinderlähmung)

- Echovirus, Astroviren, Rotaviren, Noroviren

- Hepatitisvirus A und E (Hepatitis)

Protozoen:

- Entamoeba histolytica (Amöbenruhr)

- Giardia lamblia (Lambliasis: Enteritis)

Wurmkrankheiten:

- V. a. in den Tropen und häufig indirekte Infektionen über das Wasser

(z.B. Eindringen der Würmer oder Larven über die Haut: Schistosoma, Necator, Ancy-

lostoma,

Dracunculus, Strongyloides u.a.)

- Ascaris lumbricoides (Spulwurm: Aufnahme der Eier aus Abwasserkontaminationen)

- Enterobius vermicularis (v. a. bei Kindern. Infektion durch Wasser ist eine Ausnahme)

35

Der Infektionsweg ist normalerweise fäkaloral, aber auch aerogene Infektionen (z.B. Legionellen

über Aerosole) sowie Infektionen der Haut (Wunden, äußerer Gehörgang: Pseudomonas aerugi-

nosa) oder der Augen (Konjunktiva: Chlamydia trachomatis) sind möglich.

Einige Erreger verursachen Explosivepidemien (z.B. Cholera).

Die kritische Infektionsdosis ist äußerst unterschiedlich:

Vibrio cholerae 108 KBE

E. coli, Salmonella enteritidis 106 KBE

Salmonella typhi, Shigella dysenteriae 103 KBE

Legionella pneumophila, Yersinia enterocolitica 10 KBE

Enteroviren 1 - 10 PFU (plaque forming unit)

Giardia 1 Oozyste

Probleme der mikrobiologischen Überwachung des Trink- und Badewassers mittels bakte-

rieller Indikatoren:

Einige Mikroorganismen erreichen im Wasser und im Boden lange Überlebenszeiten (Tenazi-

tät),

die weit über 50 Tage („50-Tages-Linie“: Grundlage von Schutzmaßnahmen gegen mikrobielle

Beeinträchtigung der Wassers) hinausreichen können.

Der Indikator für mögliche fäkale Infektionserreger im Trinkwasser Escherichia coli und

Coliforme Keime nach der Trinkwasserverordnung ist nicht für alle Erreger anwendbar.

Auch im gechlorten Wasser ist der Indikatorwert von E. coli nur eingeschränkt anwendbar,

da E. coli im Vergleich zu einigen Krankheitserregern sehr chlorempfindlich ist.

Für Mikroorganismen, die nicht fäkal-oral übertragen werden (Pseudomonas aeruginosa,

Legionella pneumophila) sind die enterobakteriellen Indikatoren ebenfalls nicht sinnvoll.

Die bakteriellen Indikatoren gelten auch für Viren und Protozoen, die teilweise auch gegen

Desinfektionsmaßnahmen völlig anders reagieren.

Im Trinkwasser werden regelmäßig Bakterien mit unterschiedlicher Signifikanz nachge-

wiesen:

Potentielle Pathogene, d.h. Keime, die vor allem opportunistische Infektionen

z.B. im Krankenhaus oder bei Immungeschwächten verursachen können.

Weiterhin Bakterien, die Korrosionen, Färbungen oder Gerüche verursachen aber meist

unproblematisch sind (Umweltkeime).

Grenzwerte nach der Trinkwasserverordnung

Parameter (Anl.1) Grenzwert

Escherichia. coli 0/100ml

Enterokokken 0/100ml

Indikatorparameter (Anl. 3)

Clostridium perfringens: 0/100ml

Koloniezahl bei 22°C 100/ml am Zapfhahn

20/ml nach Abschluss der Aufbereitung

1000/ml bei Anlagen bis 1000m3/Jahr

Coliforme 0/100ml

Koloniezahl bei 36°C 100/ml Bei Koloniezahl „Grenzwert“:

Keine wesentlichen Änderungen

Legionellen (Anl. 3.2) Maßnahmewert: 100/100ml

Pseudomonas aeruginosa 0/100ml (Auf Anordnung des Gesundheitsamtes in „hy-

gienerelevanten“ Bereichen)

0/250ml in „abgepacktem Wasser in Behältern.

36

Nachweis von Mikroorganismen nach der Trinkwasserverordnung: Koloniezahl:

Als Koloniezahl (KBE: Koloniebildende Einheiten) wird die Zahl sichtbaren Kolonien def iniert, die

aus 1ml Wasser auf nährstoffreichen Agarnährböden bei einer Bebrütungstemperatur von 20°C

+ 2°C und 36°C + 1°C nach 44 + 4 Stunden gewachsen sind.

Nach der neuen TrinkwV von 2001 wird die Koloniezahl nach Membranfiltration bestimmt. Über

den Indikatorparameter KBE wird nur ein geringer Teil der tatsächlichen bakteriellen Belastung

des Wassers erfasst.

Der Nachweis von Escherichia coli und eingeschränkt coliformen Keimen gilt als Indikator

einer fäkalen Verunreinigung des Wassers.

Coliforme Bakterien sind häufig „Umweltkeime“ und nur teilweise fäkalen Ursprungs. Neben der

Gattung Escherichia sind dies z.B. Citrobacter, Enterobacter, Serratia, Klebsiella u.a.

Als weiterer Indikator für Darmkeime wurden in die TrinkwV die so genannten Enterokokken

eingeführt. In der alten TrinkwV von 1990 wurden sie als Fäkal-Streptokokken (D-Streptokokken)

bezeichnet. Der Parameter „Enterokokken“ zielt im Wesentlichen auf humane Fäkalindikatoren

wie Enterococcus faecalis, E. durans, E. faecium, aber auch Umweltkeime, die z.B. auf pflanzli-

chen Rückständen leben, werden erfasst.

Enterokokken sind wesentlich resistenter als coliforme Keime gegen chemische Desinfektionsmit-

tel wie Chlor.

Der Nachweis von Clostridium perfringens (früher nach der alten TrinkwV von 1990: Sulfit

reduzierende, sporenbildende Anaerobier) erfolgt über Membranfiltration (aus 100ml). Es ist ein

Indikatorparameter, der die möglich Beeinträchtigung des Trinkwassers durch Oberflächenwas-

ser anzeigen soll. Wegen der hohen Stabilität dieser Keime gegen Desinfektionsmaßnahmen

(Sporenbildner!) gilt Clostridium perfringens auch als Indikator für Chlor-resistente Organismen

wie beispielsweise Oozysten von Cryptosporidium parvum.

Die TrinkwV schreibt für spezielle Wasserversorgungssysteme und Anwendungen weitere bakte-

rielle Untersuchungen vor wie zum Beispiel Legionellen (z. B. L. pneumophila) in Warmwasser-

systemen und aerosolbildenden Einheiten) und Pseudomonas aeruginosa im Badewasser und

in Behälter abgefülltem Wasser, sowie auf Anordnung des Gesundheitsamtes in „Hygieneberei-

chen“. Seit der letzten Änderung der TrinkwV (seit 01. 2012 in Kraft) müssen Legionellen auch in

größeren Mietshäusern (mehr als 2 Parteien) mit entsprechenden Warmwasserspeichern (ab

4000 Liter) untersucht werden

Im Verdachtsfall kann das Gesundheitsamt zusätzliche Untersuchungen fordern, so zum Bei-

spiel: Darmpathogene Keime wie Salmonellen, Shigellen, Campylobacter, Yersinien, Parasiten

wie Cryptosporidien oder Lamblien oder Viren.

Nachweis und Differenzierung von E. coli, coliformen Keimen und Pseudomonaden

„Einfache“ Differenzierungsmöglichkeiten:

E. coli und Coliformen-Nachweis erfolgte früher in Laktosebouillon, heute (nach neuer TrinkwV)

über Membranfilterung und Auszählung

1. Blutagar:

Optimalnährboden, Hämolyse Nachweis

2. MacConkey-Agar:

Selektivnährboden für gramnegative Bakterien.

Laktoseverwertung-positiv: Bakterien bilden rötlich bis rötlich-violette Kolonien.

Laktoseverwertung-negativ: Bakterien bilden helle Kolonien.

3. Cytochromoxidase-Reaktion:

Cytochromoxidase ist ein Enzym der Atmungskette.

Oxidase-Reagenz wird im Bereich verdächtiger Kolonien aufgetropft.

Positive Reaktion: blauviolette Färbung der Kolonien nach 10-15 Sekunden

4. Laktose-Pepton-Bouillon (Vergärung von Laktose):

a) enthält einen Indikator zum Nachweis von Säurebildung.

Positiv: Farbumschlag von purpur nach gelb nach 24-44 h bei 36°C und 44°C

b) enthält ein Durham-Röhrchen zum Nachweis von Gasbildung:

Positiv: Deutlich sichtbare Gasblase im Durham-Röhrchen nach 24-44 h bei 36°C und 44°C

5. Weitere Differenzierungen:

„Bunte Reihe“, standardisierte Mikromethoden

37

Einige Merkmale von E. coli, coliformen Keimen und Pseudomonaden

Nachweis: Wie: E. coli Coliforme

Keime

Pseudo-

monaden

Hämolyse:

auf Blutagar +/- +/- +/-

Laktoseverwertung:

auf MacConkey-Agar + + -

Gas- und Säurebildung bei

36°C:

in Laktose-Pepton-

Bouillon

+ + -

Cytochromoxidase-Reaktion Test - - +

Aufgabe Übung 15: (3er Gruppe pro Tisch)

Nachweis und Differenzierung von Keimen im Wasser nach TrinkwV u.a.

Es werden folgende Wasserproben aus Wassersystemen untersucht:

- Trinkwasser aus Wasserhahn

- Wasser aus dem Duschschlauch einer Patientendusche

- Wasser aus einer lange nicht benutzten Augendusche

1.Von jeder Wasserprobe werden jeweils 0,5ml Wasser mit einer Pipette auf 2 Agarplatten

getropft

und mit einem Wattetupfer ausgestrichen:

- Blutagar = Optimalnährboden (hämolysierende Mikroorganismen)

- MacConkey-Agar = Selektivnährboden für gramnegative, insbesondere coliforme Keime in

Wasser und Lebensmittel

2. von jeder Wasserprobe werden jeweils 1ml Wasser in eine 1, 5-fach konzentrierter Laktose-

Pepton - Bouillon zum Nachweis Laktose-Abbauender Bakterien überführt.

Platten und Reagenzgläser mit Platznummer und Ort der Entnahmestelle beschriften,

Inkubation: über Nacht bei 36°C

Auswertung und Protokollierung am nächsten Kurstag.

Protokoll Übung 15: Nachweis von coliformen Keimen und Pseudomonaden

Entnahmestellen

Nachweis: Wie:

Augendusche

(Labor)

Duschschlauch

(Patientenzimmer)

Trinkwasser

(Wasserhahn)

Keimzahl

Hämolyse:

auf Blutagar

Laktoseverwertung:

auf MacConkey-

Agar

Gas- und Säurebildung

bei 36°C:

in Laktose-Pepton-

Bouillon

Gas:

Säure:

Gas:

Säure:

Gas:

Säure:

Oxidase-Reaktion Siehe Anleitung

Seite 10

Beurteilung:

38

Mikrobielle Besiedlung der Hände Theoretischer Hintergrund:

Die Übertragung von Mikroorganismen über die Hände der Mitarbeiter auf Patienten und die dar-

aus resultierenden infektiösen Komplikationen sind seit vielen Jahren bekannt (Semmelweis)

Auch heute werden die meisten nosokomialen Infektionen über die Hände übertragen, obwohl die

Maßnahmen zur Unterbrechung der Infektionskette bekannt sind. Ursache ist meist die niedrige

Compliance in der Händehygiene, seltener die Wirksamkeit der verwendeten Desinfektionsmittel.

Es mag aber auch an der (Re)Kontamination der Hände von unbelebten Flächen liegen.

Hände von Mitarbeitern im Gesundheitswesen tragen häufig Gram-positive, aber auch bisweilen

Gram-negative Bakterien als transiente Flora. In zahlreichen Ausbrüchen sind die Hände direkt

oder indirekt als Überträger von Bakterien auf die Patienten beschrieben. Bei Clostridium difficile

Erkrankungen sind bis zu 60% der Hände der Mitarbeiter mit diesem Erreger kontaminiert. Die

Übertragung von C. difficile auf bis zu 20% der Patienten über die Hände ist belegt. Die Über-

tragbarkeit verschiedener Viren über die Hände ist in verschiedenen Studien belegt. Hier stehen

vor allem die behüllten Viren (z.B. Hepatitis) im Vordergrund. Die Übertragung unbehüllter Viren

stellt nur in besonderen Bereichen ein Risiko dar.

Nosokomiale Infektionen lassen sich in endogene und exogene Infektionen unterscheiden. Exo-

gene Infektionen gehen von anderen Patienten, Mitarbeitern oder der unbelebten Umgebung aus.

Hier spielen die Hände der Mitarbeiter eine maßgebliche Rolle bei der Übertragung von der Quel-

le zum Patienten. Endogene Infektionen gehen von der patienteneigenen Flora aus. So ist die

Besiedlung eines Patienten mit Staphylococcus aureus im Nasen-Rachen-Bereich, bzw. der

Hand ein prädisponierender Faktor für eine postoperative Wundinfektion.

Um eine erfolgreiche Desinfektion der Hände zu gewährleisten wurden klare Vorgaben auf der

Basis von Studien entwickelt, die sowohl die Methode der „Hygienischen Händedesinfektion“ zur

Hospitalismus-Prophylaxe, als auch die „Chirurgische Händedesinfektion“ vor der OP regeln:

Ausschnitt aus den Hygieneplänen des Marburger Klinikums

Hygienische Händedesinfektion

Die Hände des Personals sind das wichtigste Übertragungsvehikel von Krankheitserregern. Des-

halb gehört die Händehygiene zu den wichtigsten Maßnahmen zur Verhütung von Krankenhaus-

infektionen.

Bei tatsächlicher wie auch fraglicher mikrobielle Kontamination der Hände muss eine hygienische

Händedesinfektion durchgeführt werden (Kategorie I A).

Bei mutmaßlicher oder wahrscheinlicher Viruskontamination muss ein gegen die entsprechenden

Viren wirksames Präparat, sofern dafür valide Prüfergebnisse vorliegen, verwendet werden (z.B.

Isoliereinheit, Kinderstation, Verdacht oder gesicherte übertragbare Virusinfektion; Kategorie I

B).

Die hygienische Händedesinfektion ist so durchzuführen, dass die Kontaminationsflora noch auf

den Händen weitgehend abgetötet wird (Kategorie I A)

Durchführung:

Desinfektionsmittel in die hohlen, trockenen Hände geben. Nach dem unten aufgeführten Verfah-

ren das Produkt 30 Sek. in die Hände bis zu den Handgelenken kräftig einreiben. Die Bewegun-

gen jedes Schrittes fünfmal durchführen. Nach Beendigung des 6. Schrittes werden einzelne

Schritte bis zur angegebenen Einreibedauer wiederholt. Im Bedarfsfall erneut Hände-

Desinfektionsmittel entnehmen. Darauf achten, dass die Hände die gesamte Einreibezeit feucht

bleiben.

1. Handfläche auf Handfläche

2. Rechte Handfläche über linkem Handrücken und linke Handfläche über rechten Handrücken.

3. Handfläche auf Handfläche mit verschränkten, gespreizten Fingern.

4. Außenseite der Finger auf gegenüberliegende Handflächen mit verschränkten Fingern.

5. Kreisendes Reiben des rechten Daumens in der geschlossenen li. Handfläche und umgekehrt.

6. Kreisendes Reiben hin und her mit geschlossenen Fingerkuppen der rechten Hand in der lin-

ken Handfläche und umgekehrt.

39

Wann ist eine hygienische Händedesinfektion vorgeschrieben?

vor invasiven Maßnahmen, auch wenn dabei Handschuhe getragen werden, z.B. Legen

eines Venen- oder Blasenkatheters, vor Endoskopie, Injektionen, Punktionen

vor Kontakt mit Patienten, die im besonderen Maße infektionsgefährdet sind, z.B.

Leukämie-, Verbrennungs-, polytraumatisierte, bestrahlte oder sonstige schwer

erkrankte Patienten

vor Tätigkeiten mit Kontaminationsgefahr, z.B. Bereitstellung von Infusionen, Aufziehen

von Medikamenten

vor und nach jeglichem Kontakt mit Wunden

vor und nach Kontakt mit dem Bereich der Einstichstellen von Kathetern,

Drainagen u. ä.

nach Kontakt mit potentiell oder definitiv infektiösem Material (Blut, Sekret oder

Exkremente) oder infizierte Körperregionen

nach Kontakt mit potentiell kontaminierten Gegenständen, Flüssigkeiten oder Flächen

(Urinsammelgefäße, Absaug-, Beatmungsgeräte u. -masken, Trachealtuben,

Drainagen, Schmutzwäsche, Abfälle u. ä.)

nach Kontakt mit Patienten, von denen Infektionen ausgehen können oder die mit Erre-

gern von besonderer krankenhaushygienischer Bedeutung besiedelt sind (z.B. MRSA)

nach Ablegen von Schutzhandschuhen

nach Toilettenbenutzung

nach Naseputzen

Aufgabe Übung 16:

Abklatschuntersuchung der Hände

Wir überprüfen die mikrobielle Kontamination der desinfizierten und nicht desinfizierten Hand.

Hierzu werden Kontaktproben sowohl von der desinfizierten als auch von der nicht

desinfizierten Hand genommen.

1. Jede/r Kursteilnehmer/in überprüft seine nicht desinfizierte Hand durch Aufdrücken und

leichtes Schieben des Kontakt-Nährbodens auf Handinnenfläche auf Keime.

2. Jede/r Kursteilnehmer/in überprüft seine desinfizierte Hand auf Keime durch Aufdrücken

und leichtes Schieben des Kontakt-Nährbodens auf Handinnenfläche.

3. Die Kontaktproben beschriften, sie werden eingesammelt und bei 36°C über Nacht bebrütet.

Auswertung am nächsten Kurstag!

Protokoll: Abklatschuntersuchung der Hände

Beurteilung: Keimzahl

desinfizierte Hand

Keimzahl

nicht desinfizierte Hand

40

Aufgabe Übung 17:

Übertragbarkeit von Mikroorganismen

Um die Übertragbarkeit von Erregern und damit das daraus resultierende Infektionsrisiko,

gerade bei nosokomialen Infektionen, abschätzen zu können, werden die Hände mit einem

Fluoreszenzfarbstoff als Simulation einer bakteriellen, bzw. viralen Kontamination markiert.

Tischreihe 1-10:

- Die erste Person der Tischreihe reibt sich die Hände mit dem Fluoreszenzfarbstoff ein.

- Schütteln Sie den anderen Kursteilnehmern in der Tischreihe die Hand.

- Im Anschluss können Sie unter der bereit gestellten UV-Lampe feststellen, ob eine

Kontaktübertragung stattgefunden hat.

- Abwaschen der Farbstoffreste mit Wasser und Seife.

- Eincremen der Hände

Im Falle einer Übertragung, z. B. von MRSA, bleibt ohne anschließende Händedesinfektion

ein unerkannt bleibender Vektor für die Verbreitung von MRSA im Krankenhaus bestehen.

41

Abschnitt III: Mykologie

Kursteil 8

Mykologie:

Sprosspilze

Schimmelpilze Einführung:

Pilze sind heterotrophe, eine Zellwand ausbildende Eukaryonten, die auf oder in organischem

Material einen Thallus ausbilden können und sich asexuell oder sexuell fortpflanzen. Sie kommen

in Form von Einzelzellen (z.B. Bäckerhefe) und Zellverbänden (z.B. Hutpilze) vor. Sie besitzen

kein Chlorophyll und sind somit nicht zur Photosynthese befähigt. Sie benötigen daher organi-

sche Kohlenstoff-Quellen (C-heterotroph) und können auch unter Lichtabschluss leben. Pilze sind

als Einzeller aufzufassen. Bei manchen Pilzarten können sich einzelne Zellen aber unterschied-

lich spezialisieren. Die einfachste, einzellige Form ist der Sprosspilz, heute als Hefe bezeichnet.

Um die lediglich durch Sprossung sich fortpflanzenden Hefen von den echten (perfekten) Hefen,

die zur Sexualsporenbildung befähigt sind (z.B. Ascomyceten) abzugrenzen, werden die Spross-

pilze auch als nicht sporenbildende Hefen bezeichnet.

Komplexere Strukturen kommen ebenfalls vor. Eine Pilzzelle kann sich verlängern, ohne sich zu

teilen. Es resultiert eine fadenförmige Hyphe. Verschachteln sich mehrere Hyphen, entsteht ein

Myzel. Bei einem Myzel dessen Hyphen alle von einer einzigen Zelle abstammen, handelt es sich

um einen Thallus. Ist ein derartiges Hyphengeflecht lose strukturiert, liegt eine Kolonie vor.

Bei einem Drittel der bislang bekannten Pilzarten ist der Entwicklungsgang der Hauptformen mit

sexueller Reproduktion, meist unter Sporenbildung nicht bekannt. Diese Pilze werden als Fungi

imperfecti (Deuteromycetes) zusammengefasst. Bei diesen Pilzen ist, da sich Haupt- und Neben-

fruchtformen an ganz unterschiedlichen Standorten entwickeln und zudem morphologisch sehr

unterschiedlich ausfallen, entweder die Zuordnung beider Formen nicht gelungen, oder die Pilze

haben die Möglichkeit zur Ausbildung einer sexuellen Fruktifikation verloren.

Die Gesamtzahl der Pilzarten wird auf 100.000 bis 250.000 geschätzt, lediglich ca. 180 Arten

stehen mit Erkrankungen von Mensch und Tier in Zusammenhang. Hier findet man häufig imper-

fekte Pilzarten, sowohl in der Hefeform als auch in Form von Schimmelpilzen. Bei den letzteren

spielen in der medizinischen Mykologie die charakteristischen Nebenfruchtformen, die asexuell

gebildeten Sporen (Konidien) und deren besondere Fruchtkörper, für die Identifizierung eine

wichtige Rolle.

Neben Pilzinfektionen sind Mykoallergien, Mykotoxikosen durch sekundäre Stoffwechselprodukte

und Myzetismus, die Pilzvergiftung durch Aufnahme von Strukturelementen von Pilzen, meist

Basidiomyzeten (Hut- und Ständerpilze), in der Humanmedizin von Bedeutung.

Im Kursabschnitt Mykologie werden an Hefen und Schimmelpilzen die wichtigsten klassischen

Untersuchungsmethoden aus der Routinediagnostik vorgestellt. Andere Verfahren wie Serologie,

Immunfluoreszenz, PCR etc. können nicht behandelt werden.

Begriffe:

Hyphe:

Pilzfaden, Myzel – Hyphengeflecht

Pseudomyzel:Ketten von Hefezellen, die hyphenartig verlängert sind

Vegetative Sporen:

Konidien = frei an Hyphen gebildete vegetative Ektosporen (Mikrokonidien sind einzellig, Mak-

rokonidien sind mehrzellig, gewöhnlich septiert)

Blastospore = Sprosszelle, Hefe im engeren Sinn, keine echte Spore im Sinne von Dauerfor-

men!

Chlamydospore = Hyphenabschnitte mit verdickter Zellwand

Arthrospore = Quader- oder walzenförmiges Hyphenfragment

Sexuelle Sporen:Ascosporen, Zygosporen, Basidiosporen = sexuelle Sporen, die in speziel-

len Sporenbehältern reifen.

42

In der medizinischen Mikrobiologie werden die Pilze ohne Rücksicht auf Klassenzugehörigkeit

nach praktischen und klinischen Gesichtspunkten in folgende Gruppen, dem DHSD-System, ein-

geteilt:

Dermatophyten

Hefen

Schimmelpilze

Dimorphe Pilze ( =DHSD-System) Von den Vertretern der anderen Gruppen unterscheiden sich die Dermatophyten, die Erreger

der Dermatophytosen dadurch, dass sie nur oberflächliche Mykosen verursachen. Sie befinden

sich auf der Haut und deren Anhangsgebilden und breiten sich gewöhnlich nicht über das Stra-

tum basale hinweg in die Tiefe aus.

Hefen lassen sich schon makroskopisch von den luftmyzelbildenden Schimmelpilzen unterschei-

den. Sie wachsen auf Nährmedien meist in weißlichen, glatten Kolonien, ähnlich Bakter ienkolo-

nien.

Für die Gruppe der dimorphen Pilze ist charakteristisch, dass sie im Organismus in der Hefe-

phase, aber in der freien Natur luftmyzelbildend (wie Schimmelpilze) vorkommen.

Orte, an denen Pilze Infektionen verursachen:

Lunge Cryptococcus, Pneumocystis jirovecii, Aspergillus,

Candida, Mucorales, (Blastomyces, Coccidioides,

Paracoccidioides, Histoplasma)*

Blut Candida, Cryptococcus, Fusarien, (Histoplasma)*

Schleimhäute Candida, Cryptococcus, Fusarien, (Blastomyces)*

Liquor Cryptococcus

Harnwege Cryptococcus, Candida,

(Blastomyces, Coccidioides, Histoplasma)*

Nasennebenhöhlen Aspergillus, Mucorales, Fusarien (Sporothrix)*

Subkutanes Gewebe (Mycetoma-Erreger, Sporothrix, Chromoblastomyko-

se-Erreger)*

Haut Dermatophyten, Fusarien,

(Sporothrix, Chromoblastomykose-Erreger,

Coccidioides, Paracoccidioides, Blastomyces)*

Haare, Nägel Dermatophyten, Trichosporon*, Scopulariopsis

Verschiedene (Disseminierte Infektionen) Candida, Cryptococcus, Aspergillus

(Coccidioides, Paracoccidioides)*

*in Mitteleuropa nicht endemisch

43

Sprosspilze 1. Candida albicans:

Mit mehr als 150 Arten sind die Arten der Gattung Candida in der Umwelt weit verbreitet, 17 Arten

wurden bislang als Infektionserreger beschrieben. Die am häufigsten mit Hefemykosen assoziier-

te Art Candida albicans hat ihren natürlichen Standort am Menschen bzw. Warmblüter, aber nicht

in der Natur. Andere Arten wie Candida glabrata, Candida krusei, Candida tropicalis, Candida

parapsilosis lassen sich auch aus der Umwelt isolieren und spielen somit bisweilen auch eine

Rolle als Erreger von exogen übertragenen Hospitalinfektionen.

Etwa 30% der Gesunden sind oral oder gastrointestinal mit Candida besiedelt, wobei die Keim-

zahl meist gering ist. Bei hospitalisierten Patienten steigt die Kolonisierungsrate proportional zur

Aufenthaltsdauer im Krankenhaus an. Candida zählt zu den sog. opportunistischen Erregern.

Eine Infektion entwickelt sich erst dann, wenn lokale oder systemische Faktoren dafür disponie-

ren. So spielt die chronische Mazeration der Haut bei der Windeldermatitis des Säuglings oder

der Intertrigo bei Fettleibigen eine Rolle. Ist die zelluläre Immunabwehr kompromittiert, kann es

zur Ausbildung einer systemischen Organmykose mit anschließendem Multiorganversagen oder

einer Pilzsepsis kommen. Beispielhafte Risikofaktoren für invasive Mykosen sind: extreme Alters-

gruppen (Neugeborene, sehr alte Menschen), chronisches Nierenversagen, Diabetes, Neutrope-

nie, lymphoide Malignome, AIDS, Transplantation, Kortikosteroidtherapie, Polytraumata, Ver-

brennungen.

Diagnostik:

Die Anfertigung eines Nativ-, Methylenblau-, oder Grampräparates direkt vom Untersuchungsma-

terial ist eine sehr schnelle und hilfreiche orientierende Methode, die vor allem bei Haut- oder

Schleimhautinfektionen eine unmittelbare Erregerdiagnose ermöglicht. Mit der mikroskopischen

Untersuchung von Punktaten kann man sofort wichtige morphologische und quantitative Informa-

tionen über die Pilz-Ätiologie einer Infektion erhalten und somit unverzüglich mit einer unter Um-

ständen lebensrettenden antimykotischen Therapie beginnen.

Der Nachweis einer systemischen Candida-Infektion dagegen ist schwer. Ein Nachweis von Pilze

mittels Blutkulturflaschen ist nicht immer möglich. Der serologische Nachweis von Antikörpern

gegen Candida ist mit Hämagglutinationstests, Immunfluoreszenz und ELISA-Techniken möglich,

kann aber oft kaum zwischen einer Besiedlung und Infektion unterscheiden. Bei einer systemi-

schen Infektion ist zwar mit einem Titeranstieg beim immunkompetenten Patienten zu rechnen,

jedoch sind in der Regel die Betroffenen meist immunsupprimiert.

Die klassische Diagnostik setzt immer noch die Kultur voraus, wobei heute durch den

sog. CHROM-Agar eine Kultivierung mit gleichzeitiger Differenzierung durch verschiedene

Farben der Kolonien realisiert wurde.

44

Schimmelpilze Schimmelpilze sind in vielen Gattungen in der Natur verbreitet. Meist leben sie als Saprophyten

auf abgestorbener organischer Substanz (Topfpflanzen und Essensreste in Kliniken!). Da ihre

Bestandteile (Hyphenfragmente, Konidien) auch ständig in der Luft anzutreffen sind, werden sie

somit ständig inhaliert. Unter bestimmten Umständen können einige Arten humanmedizinische

Relevanz erlangen als:

Erreger opportunistischer Infektionen

Mykotoxinbildner

Allergene

Mit Zunahme der abwehrgeschwächten Patienten ist insbesondere die Häufigkeit von Aspergillus-

Infektionen kontinuierlich angestiegen. Neben dem häufigsten Erreger aus dieser Gattung, As-

pergillus fumigatus, werden auch andere Arten, wie Aspergillus niger nachgewiesen. Diese In-

fektionen sind immer lebensbedrohlich, da sie fast ausschließlich bei Patienten mit schweren

Grunderkrankungen auftreten. Betroffen sind Patienten mit hämatologischen Neoplasien, mit

Knochenmark- oder anderen Organtransplantationen. Gelegentlich finden sich auch beim immun-

kompetenten Patienten Aspergillus-Infektionen, die aber meist lokalisiert sind und in der Regel

vorgeschädigtes Gewebe betreffen.

Diagnostik:

Für den Therapieerfolg ist eine frühzeitige Diagnosestellung essentiell. Der mikroskopische

Nachweis von verzweigten Pilzfäden, z.B. im Sputum von Risikopatienten, ist diagnostisch hinwei-

send. Der negative mikroskopische Befund schließt eine Aspergillose nicht aus. Der kulturelle

Nachweis ist zuverlässiger, kann aber einige Tage in Anspruch nehmen. Generell ist für den mik-

roskopischen oder kulturellen Nachweis Material aus Biopsie- oder Punktionsmaterial aus

sterilen Körperregionen anzustreben. Bei der Interpretation der Befunde von Sputumproben von

nicht abwehrgeschwächten oder bei fehlender klinischer Symptomatik kann die Abgrenzung

einer Kolonisation von einer invasiven Infektion problematisch sein. Aus Blut, Liquor und Kno-

chenmark lassen sich Aspergillen nur selten isolieren. Der Nachweis von Aspergillus aus der

bronchoalveolären Lavage (BAL) ist zwar spezifisch, hat jedoch nur eine geringe Sensitivität.

Serologische Tests zum Nachweis von Antikörpern finden Anwendung bei der allergischen pul-

monalen Aspergillose und beim Aspergillom. Ihre Wertigkeit in der Diagnostik der invasiven As-

pergillose ist unsicher. Aufgrund der fehlenden Immunantwort bei den meist erheblich abwehrge-

schwächten Patienten fallen die Tests in der Regel negativ aus und erweisen sich daher als wenig

brauchbar. Durch Nachweis zirkulierender Antigene konnte eine wesentliche Verbesserung der

Frühdiagnostik erreicht werden, obwohl die Sensitivität der momentan zur Verfügung stehenden

Tests häufig nicht ausreichend ist.

Grundsätzlich basiert die Diagnostik der Schimmelpilze heute in der Medizinischen Mykologie

und auch der Hygiene auf kulturellen und mikroskopischen Methoden. Wesentliche Merkmale

sind neben der Koloniemorphologie insbesondere die charakteristischen Nebenfruchtformen der

verschiedenen Spezies.

Die charakteristischen Nebenfruchtformen von Schimmelpilzen der Gattungen Absidia, Aspergil-

lus, Fusarium, Mucor, Penicillium, Rhizopus, Scopulariopsis werden vorgestellt. Zusätzlich zu den

vorgelegten mikroskopischen Fertigpräparaten werden die zugehörigen Pilzkulturen als Demonst-

ration aufgestellt.

Herstellung mikroskopischer Präparate von luftmyzelbildenden Pilzen:

Die Nebenfruchtformen luftmyzelbildender Pilze sind berührungsempfindlich und daher gelingt die

Darstellung intakter Nebenfruchtformen im mikroskopischen Präparat häufig erst nach mehrfa-

chem Versuch!

Eine einfache Technik zur Herstellung von Präparaten ist das Tesafilmpräparat

Tesafilmpräparat:

Durchführung:

- 1 Tropfen Lactophenolblau auf einen Objektträger geben

- einen ca. 6 cm langer Klebestreifen (an beiden Enden anfassen) auf den Pilzrasen der

unbekannten Pilzkultur leicht andrücken

- Klebestreifen auf den Objektträger mit dem Tropfen Lactophenolblau kleben

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Aufgabe Übung 19:

Auseinandersetzung mit Schimmelpilzen

1. Makroskopische Betrachtung, Beschreibung und Skizzierung einer unbekannten

Schimmelpilzkultur

2. Herstellen eines Tesafilm-Präparates von einer unbekannten Schimmelpilzkultur,-

mikroskopieren und skizzieren,

3. Bestimmung der Gattung durch Vergleich mit den ausgestellten Schimmelpilzkulturen

und der mikroskopischen Bilder im Skript

Mikroskopie: 10er – 40er Objektiv, ohne Öl !

Protokoll: Unbekannte Schimmelpilzkultur

Beschreibung der Kultur: Skizze von der Kultur: Skizze des Tesafilmpräparates:

Höhe des Mycels:

Kontur:

Pigment:

Oberfläche:

Sonstiges:

Identifizierung:

Bei der unbekannten Schimmelpilzkultur handelt es sich um: ………………………………………

Skizzen einiger Schimmelpilze:

Rhizopus Alternaria Aspergillus fumigatus

Penicillium Cladosporium Scopulariopsis

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Bilder einiger Schimmelpilze:

Aspergillus niger (Elektronenmikroskopie) Kultur von Aspergillus niger

Abbildung 1: Alternaria sp. Abbildung 2: Aspergillus sp.

Abbildung 3: Cladosporium sp. Abbildung 4: Fusarium sp.

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Abbildung 5: Geotrichum candidum Abbildung 6: Mucor sp.

Abbildung 7: Penicillium sp. Abbildung 8: Scopular iopsis sp.

Abbildung 9: Rhizopus sp.

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Abschnitt IV: Parasitologie

Kursteil 9

Übersicht über die wichtigsten humanpathogenen Parasiten

A. Protozoen: B. Vermes:

1. Apicomplexa: 1. Plathelminthes (Plattwürmer)

Toxoplasma gondii a) Trematoda (Saugwürmer)

Plasmodium sp. Fasciolopsis

Isospora Faciola hepatica

Pneumocystis carinii Opistorchis

Schistosoma mansoni

2. Mastigophora: b) Cestoda: (Bandwürmer)

Trichomonas vaginalis Taenia solium, saginata

Giardia lamblia Echinococcus multilocularis

Trypanosoma cruzi Diphyllobothrium latum

T. gambiense Hymenolepsis nana

Leishmania donovani

3. Rhizopoda: 2. Nemathelminthes (Fadenwürmer)

Entamöba histolytica Nematoda:

Trichuris trichiura

Ascaris lumbricoides

4. Ciliaten: Wuchereria bancrofti

Balantidium coli Trichinella spiralis

C. ARTHROPODEN

Krätzmilbe (Sarcoptes scabiei)

Insekten als Überträger und Zwischenwirte.

Aufgabe Übung 20:

Mikroskopie von parasitologischen Fertigpräparaten

1. Malaria

Die Diagnose einer akuten Malaria beruht auf dem mikroskopischen Nachweis der Plasmodien

(vivax, malariae, falciparum) und Gameten im Blut (Ausstrich und Dicker Tropen), am besten kurz

vor dem Schüttelfrost, gestellt. Die Entwicklungsformen liegen in Erythrozyten. Der Nachweis

erfolgt meist nach Giemsa-Färbung (Plasma blau, Chromatin rot) der Präparate.

Mikroskopieren Sie die bereits gefärbten Malariapräparate vom Menschen, fertigen Sie Zeich-

nungen verschiedener Parasitenformen an und stellen Sie eine Verdachtsdiagnose.

Die Präparate bitte auf dem Tisch liegen lassen, nicht in die Desinfektionslösung geben!

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2. Trypanosoma brucei

Anstelle des Erregers der Schlafkrankheit Trypanosoma gambiense bzw. rhodesiense (15 -

30m) verteilen wir Tr. brucei, den für den Menschen ungefährlichen Erreger der Nagana (Tier-

seuche), der in Form und Bewegungsmodus dem Erreger der menschlichen Schlafkrankheit

gleicht und ebenfalls durch den Stich der Glossinen übertragen wird.

Mikroskopieren Sie die bereits gefärbten Präparate von Trypanosoma brucei und fertigen Sie

Zeichnungen an.

Präparate auf dem Tisch liegen lassen, nicht in die Desinfektionslösung geben!

Vermes:

Wichtig: Wurmeier-Präparate mit den Trockensystemen (10er und 40er Objektiv) und ohne Öl

mikroskopieren, Blende schließen.

Fertigen Sie Zeichnungen von Ascaris-, Trichuris- und Taenia-Eiern (Spul-, Peitschen- und

Bandwurm) an.

Präparate auf dem Tisch liegen lassen, nicht in die Desinfektionslösung!

Ascaris (Nematoda) Trichuris (Nematoda)

Taenia (Cestoda)

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Anhang:

Zusammensetzung von Kulturmedien, Reagenzien und Farblösungen

Kulturmedien: 1. Flüssiges Thioglykolatmedium:

Universelles Anzüchtungsmedium für aerobe und anaerobe Bakterien

Tryptisch verdautes Casein 15,0(g/l)

1-Cystin 0,5

Dextrose 5,0

Hefeextrakt 5,0

NaCl 2,5

Natrium-Thioglycolat 0,5

Resazurin (Redoxindikator) 0,001

Agar 0,75

End-pH 7,1

in 8 ml-Mengen in Kulturröhrchen abfüllen, 15 min bei 120 oC sterilisieren, bei Zimmer-

temperatur lagern (Haltbarkeit etwa 6 Wochen, danach muss durch Erhitzen auf 100oC

erneut entgast werden).

2. Trypticase Soy Agar (Peptonagar für Anzüchtung und Stammhaltung):

Trypticase (Casein-Digest) 15,0(g/l)

Phytone (Soya-Pepton) 5,0

NaCl 5,0

Agar 15,0

In 200 ml-Portionen 20 min bei 120oC sterilisieren, auf 50oC abkühlen,

in Petrischalen gießen.

3. Blutagar:

Universelles Anzüchtungsmedium und Medium zum Nachweis von Veränderungen des

Erythrozytenstroma bzw. des Hämoglobins durch den bakteriellen Stoffwechsel.

Herstellung: durch Zusatz von 6 Vol% sterilen, defibrinierten Hammelbluts zu

dem sterilisierten und auf 50oC abgekühlten Peptonagar.

4. Kochblutagar:

Hochwertiges Anzüchtungsmedium, insbesondere für Neisseria und Haemophilus.

Herstellung: durch Zusatz von 5-10% sterilen defibrinierten Hammelbluts zu

dem sterilisierten und auf 80oC abgekühlten Peptonagar, Inkubation des

Gemisches für 15 min bei 80oC, Abkühlung auf 50oC und gießen.

5. Endo-Agar (Fuchsin-Laktoseagar):

Selektivmedium für gramnegative Bakterien und Indikatormedium für Laktosefermentation

Herstellung:

Pepton "Witte" 10,0(g/l)

Na2HPO4 2,0

NaCl 6,0

Hefeextrakt 1,0

Fleischextrakt 3,0

Agar 20,0

NaOH q.s. pH 7,4-7,6

Für 15 min bei 120oC sterilisieren, auf 100oC abkühlen.

Hitzeempfindliche Komponenten zusetzen:

Lactose 10,0(g/l)

gesättigte alkoholische Fuchsin Lösung (filtriert)

5 ml Natriumsulfitlösung, 10%ig, so viel, dass der in heißem Zustand rosa gefärbte Nähr-

boden nach dem Erkalten farblos wird (Probeplatte gießen!).

Da die grampositiven Kontaminanten aus der Luft durch Fuchsin gehemmt werden, erfordert

die Herstellung des Endoagars nicht die strengsten Sterilitätskautelen.

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6. Polytropes Medium nach KLIGLER:

Indikatormedium für Glukose- und Laktose Fermentation einschl. Gasbildung,

H2S-Bildung sowie oxydativen Aminosäureabbau

Herstellung:

Pepton 15,0(g/l)

Fleischextrakt 3,0

Hefeextrakt 3,0

Proteose-Pepton 5,0

Lactose 10,0

Dextrose 1,0

FeSO4 0,2

NaCl 5,0

Na-Thiosulfat 0,3

Agar 12,0

Phenolrot, atoxische Charge 0,024

pH = 7,0

In 5 ml-Portionen in Kulturröhrchen abfüllen, 15 min bei 120oC sterilisieren, in Schräglage

erstarren lassen (Schrägfläche und Stichteil sollen etwa gleich groß sein)

7. Medium zum Nachweis der Säurebildung aus Kohlenhydraten,

Zuckeralkoholen und Glykosiden:

Herstellung:

Peptonwasser-Basis:

Liebigs Fleischextrakt 5,0 (g/l)

Pepton "Witte" 10,0

NaCl 3,0

Na2HPO4 x 12 H2O 2,0

Indikator-Stammlösung:

Bromthymolblau 1,0g

0,1 N NaOH 25,0ml

A. dest. Ad 500,0ml

12 ml der Bromthymolblau-Stammlösung/Liter Peptonwasserbasis zusetzen, 100 ml Portionen

abfüllen und mit 0,5 Gew. % der Substrate versetzen. Die zu 5 ml Portionen in entsprechend

gekennzeichnete Kulturröhrchen abgefüllten Medien werden fraktioniert sterilisiert, indem man

sie an drei aufeinander folgenden Tagen für jeweils 15 min im Koch‘schen Dampftopf auf

90-100°C erhitzt. Alternativ: Sterilisation durch Filtration.

8. Medium zum Nachweis der Nitratreduktion:

Herstellung:

KNO3(nitritfrei!) 0,2(g/l)

Pepton "Witte" 5,0

pH 7,4

DURHAM-Röhrchen zum Nachweis von Gas sind vor der Sterilisation blasenfrei

einzulegen

5 ml Portionen in Kulturröhrchen abfüllen und 15 min auf 120°C erhitzen

9. Trypsin Bouillon, Medium zum Nachweis der Indolbildung:

Herstellung:

Pepton "Witte" 10,0 (g/l)

Liebigs Fleischextrakt 5,0

Na2HPO4 2,0

NaCl 5,0

NaOH, qs., pH 7,2

Trypsin 0,2

Chloroform 10,0 ml

Gut durchschütteln, 24 Std. bei 37°C bebrüten, filtrieren, mit 2 Volumina physiologischer

Kochsalzlösung verdünnen, in Röhrchen abfüllen, im Koch'schen Dampftopf sterilisieren

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10. Medium zum Nachweis von Urease:

Herstellung:

Pepton "Witte" 1,0 (g/l)

NaCl 5,0

KH2PO4 2,0

Phenolrot, 1:500 6,0 ml/l

pH: 6,8-6,9

Für 15 min bei 120oC sterilisieren

Glucose 1,0

Harnstoff 20,0

Durch Filtration sterilisieren und dem auf 60°C abgekühltem Medium zusetzen

Steril in 5 ml Portionen abfüllen und bei 4oC lagern

11. Definiertes Medium zum Nachweis der Utilisation einer einzigen organischen

Energie- und Kohlenstoffquelle

Herstellung:

Mineralbasis

NaCl 5,0(g/l)

MgSO4 x 7 H2O 0,2

(NH4)H2PO4

K2HPO4 1,0

pH 6,9

15min bei 120oC sterilisieren

Substrate (z.B. Monosaccaride, Natriumsalze, organischer Säuren) steril filtriert

zu einer Endkonzentration von 0,5Gew. % zusetzen. Steril in 0,5 ml Portionen abfüllen

Als pH-Indikator kann Bromphenolblau (12 ml/l der oben unter Nr. 7angegebenen

Stammlösung) vor der Hitzesterilisation zugesetzt werden.

Farblösungen 1. Alkalische Methylenblaulösung nach LÖFFLER:

Gesättigte alkohol. Lösung von Methylenblau 30 ml

KOH 0,01 % in Wasser 100 ml

2. Reagenzien für die Gram-Färbung:

a) Karbol-Gentianaviolettlösung:

Gesättigte alkohol. Lösung von Gentianaviolett 10 ml

Phenol 2,5 Gew. % in Wasser (frisch bereitet) 90 ml

Vor Gebrauch filtrieren!

b) Verdünnte LUGOLsche Lösung:

Jod 1 g

Kaliumjodid 2 g

im Mörser mit wenig Wasser lösen, mit Wasser auf 300 ml auffüllen

c) Safraninlösung:

5 Gew.% Safranin in 96% Äthanol 10 ml

H2O 90 ml

3. Reagenzien für die ZIEHL-NEELSEN-Färbung:

a) Karbol-Fuchsin Lösung:

gesättigte alkohol. Fuchsin Lösung 10,0 ml

Phenol 5,0 Gew. % in Wasser 90,0 ml

b) Salzsäure-Alkohol:

HCl 25% 3,0ml

Ethylalkohol 100,0ml

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6. Reagenzien für die Polkörperchenfärbung nach Neisser:

a) Lösung A:

Methylenblau 1,0g

Äthanol 96% 20,0ml

Lösen

Eisessig 50,0ml

H2O 1000,0ml

b) Lösung B:

Kristallviolett 1,0g

Äthanol 10,0ml

Lösen

H2O 200,0ml

Gebrauchslösung:

2 Teile Lösung A + 1 Teil Lösung B = Neisser I

(Die Gebrauchslösung ist nur wenige Tage haltbar)

c) Lösung C: (für die Gegenfärbung):

Chrysoidin 1,0 g

Lösen in: 300,0 ml heißem Wasser = Neisser II

Reagenzien 1. TMPD-Oxydase Reagenz:

N,N,N',N'-Tetramethyl-1,4-phenylen-diamin-dihydrochlorid,

1 Gew. %, wässrig, mit Ascorbinsäure partiell reduziert,

wöchentlich frisch hergestellt.

2. Indolreagenz (Mod. KOVACS-HOFFMANN):

p-Dimethyl-aminobenzaldehyd 5,0g

n-Butanol 75,0ml

HCl spez. Gew. 1,19 25,0ml

3. Nitritreagenz (GRIESS-ILOSVAY):

Lösung A: Sulfanilsäure 0,8 Gew.% in 5 N Essigsäure

Lösung B: alpha-Naphthylamin, 0,5 Gew.% in 5 N Essigsäure

Gebrauchslösung: Lösung A und B unmittelbar vor Gebrauch zu gleichen Teilen mischen.