Praktikum der Mikrobiologie

3. KursstundeUntersuchungsmethoden zur

Chemoresistenz (Antibiotikaresistenz)

3. KursstundeUntersuchungsmethoden zur

Chemoresistenz (Antibiotikaresistenz)

• Untersuchungsmethoden zur Chemoresistenz

• ZNS-Infektionen

• Sepsis-Diagnostik

Praktikumsaufgaben I- Auswertungen -

• O / F / B -Test

• Bunte Reihe zur biochemischen Differenzierung

• Agardiffusionstest

Praktikumsaufgaben II- Neue Aufgaben -

• Auswertung der MHK – Bestimmung von Penicillin G für einen Stamm von Staphylococcus aureus

• Bestimmung der MHK mittels E-Test • Quantitativer Nachweis von Gentamicin im

Serum• Mikroskopische Beurteilung typischer

bakterieller Meningitis-Erreger

Demonstrationen

• Kommerzielle Bunte Reihe–Systeme• Unbeimpfte und beimpfte API-Systeme• beimpfte Phoenix-Panels

• Optochinempfindlichkeit von Streptococcus pneumoniae

• Verschiedene Blutkultursysteme

Oxidations - Fermentations –Test- Aufgabe 1 -

Beweglichkeitstest- Aufgabe 1 -

Positive Reaktion nach Bebrütung:

Schwärmzone im halbfesten Agar(Vorhandensein von Geißeln)

O / F / B – Ergebnisse- Aufgabe 1 -

Keimart O F B

Pseudomonasaeruginosa

+ - +

Escherichia coli + + +

Acinetobacter sp. - - -

Auswertung Bunte Reihe- Aufgabe 2-

• Beachten Sie hierzu die Anmerkungen im Skript aus der 2. Kursstunde (S. 18 ff)

• Zugabe von Zusatzreagenzien:• Tryptonbouillon• Voges-Proskauer-Bouillon

• Kligler-Agar:• Hoch-/ Schrägschicht, H2S- und Gasbildung

bewerten

Zweizucker-Eisen-Agar nach Kligler

Bestandteile Laktose, Glukose (10:1)Pepton, Thiosulfat, Fe3+-Citrat

Schrägschicht Laktoseverwertung (gelb)

Hochschicht Glukoseverwertung (gelb)

Gesamt Gasbildung

Gesamt 3H2S + 2Fe3+ Fe2S3 + 6H+

(Eisensulfid; Schwarzfärbung)

1 = Pseudomonas aeruginosa (Nonfermenter)2 = Salmonella enteritidis (Fermenter)3 = Escherichia coli (Fermenter)

1 2 3

Auswertung Bunte Reihe- Aufgabe 2-

Stamm Ergebnis

1 Escherichia coli

2 Klebsiella pneumoniae

3 Proteus mirabilis

Auswertung Antibiogramm (Aufgabe 3)

Diskutieren Siedie Ergebnisse

mit Ihrem Kursassistenten !

Bestimmung der MHK mittels E-Test- Aufgabe 4 -

Prinzip:• Ein Papierstreifen, der ein Konzentra-

tionsgefälle eines Antibiotikums enthält, wird auf eine beimpfte Agarplatte aufgelegt.

• Die MHK kann nach Inkubation direkt an der Schnittstelle des birnenförmigen Hemmhofes abgelesen werden.

Bestimmung der MHK mittels E-Test- Beispiele I -

Bestimmung der MHK mittels E-Test- Beispiele II -

0,190 mg/l

Bestimmung der MHK mittels E-Test- Aufgabe 4 -

Lesen Sie folgende MHK-Werte ab:• Streptococcus pyogenes

• MHK für Penicillin G

• Müller-Hinton-Agar mit Blut

• Enterococcus faecalis• MHK für Vancomycin• Müller-Hinton-Agar ohne Blut

MHK – Bestimmung von Penicillin G für Staphylococcus aureus (Aufgabe 5)

(MHK [mg/l] )

(MBK [mg /l] )

Wachstum und Indikatorumschlag

Sensibel, mäßig sensibel oder resistent ?

empfind-lich

resistent

Routinetestung im Antibiogramm:verschiedene Antibiotika in definierter Konzentration Vergleich

MHK-Bestimmung/Resistogramm:ein Antibiotikum in aufsteigender Konzentration

Bestimmung des Gentamicinspiegels im Serum mittels Bioassay (Aufgabe 6)

Gegeben:• Gentamicinlösung mit 20µg/ml

Benötigt:• 3 weitere Verdünnungen

(10µg/ml, 1µg/ml, 0,1 µg/ml)

Gentamicinspiegel-Bestimmung II- Verdünnungsreihe -

Rö 1 Rö 2 Rö 3

Gentamicin[20 µg/ml]

0,5 ml - -

NaCl 0,9 % 0,5 ml 0,9 ml 0,9 ml

überpipet-tieren

0,1 ml 0,1 ml

Gentamicin-

Endkonz.10 µg/ml 1 µg/ml 0,1 µg/ml

Gentamicinspiegel-Bestimmung III

• Platte und Vertiefungen zuerst beschriften !• Einfüllen der Verdünnungen in die Platten-

vertiefungen mit einer Pasteurpipette (randvoll), mit der niedrigsten Konzentration beginnen!

• Serum mit bekannter Konzentration in die mittlere Vertiefung einfüllen

• Platten jeweils mit der Agarfläche nach oben stehen lassen!

Falldarstellung

Ein 10-jähriges Kind wird stationär in der Kinderklinik aufgenommen.

Im Laufe des Tages klagt es über zunehmende Kopfschmerzen und Übelkeit. Es wird zunehmend somnolent, bei Aufnahme ist es nicht mehr ansprechbar.

Bei einer Untersuchung zeigt sich eine Nackensteifigkeit. Bei Aufnahme bietet das Kind stark erhöhte Temperaturen von 39,5°C.

• An welche Erkrankung denken Sie ?• Wie ist Ihr diagnostisches Vorgehen ?

Meningitis - Erregerspektrum

• Neugeborene• Streptococcus agalactiae• Listeria monocytogenes• Escherichia coli K1

• Kinder• Streptococcus

pneumoniae• Neisseria meninigitidis• Haemophilus influenzae

(heute selten)

• junge Erwachsene• Neisseria meningitidis• Streptococcus pneumoniae

• Erwachsene• Streptococcus pneumoniae• Neisseria meningitidis• Listeria monocytogenes

Streptococcus pneumoniae

• Weltweit einer der wichtigsten bakteriellen Infektionserreger

• Altersgruppen mit höchstem Infektionsrisiko:

• Kinder: < 5 Jahre

• Erwachsene: > 60 Jahre

Wkly Epidemiol Rec. 1999;74:177-184.

Kapselpolysaccharid von S. pneumoniae

Pneumokokken-Impfstoffe

Pneumokokken-Konjugatstoffe ermöglichen den Impfschutz gegen invasive Erkrankungen im Säuglingsalter !

Impfbedingter Rückgang der invasiven Pneumokokkenerkrankungen in den USA

Whitney et al. NEJM 2003

Neisseria meningitidis

• gramnegative Diplokokken• nur beim Menschen• normaler Bewohner des Nasen-Rachenraumes (10 - 30%) • Virulenzfaktoren

• Polysaccharidkapsel (12 Typen: u.a. A, B, C, W135, Y)• IgA-Protease• Opc-Protein (Eindringen in die

Schleimhaut)• Lipopolysaccharide (schwere Symptomatik)

Neisseria meningitidis

• Wichtigste Komplikation• Waterhouse-Friedrichsen-Syndrom (WFS)

• Verteilung der Kapseltypen• gemäßigte Klimate: sporadische Form: überw. Typ B

• BRD: 2/3 Serogruppe B, 1/4 Serogruppe C• USA: 1/3 Serogruppe B, 1/3 Serogruppe C, 1/3 Serogruppe Y

• tropische Länder: epidemische Form: Typ A und C

• Polysaccharid des Kapseltyps B • aus Polyneuraminsäure • kaum Antikörperproduktion, da dieser Zucker auch auf

menschlichen Zellen zu finden ist

Neisseria meningitidis

• Z. Zt. ca. 600 Fälle pro Jahr in Deutschland

• Ca. 20-30 % durch Serotyp C

• In England und Wales Rückgang der Serotyp C-Fälle nach Impfprogramm 1999 ff.

• BRD: • MenC-Konjugatimpfung für alle Kdr. >1 J. seit

07 / 2006 als Standardimpfung empfohlen (STIKO)

• Polysaccharid-Impfstoff (ACW135Y oder A/C) ab vollendetem 2. LJ. (Indikations- /Reiseimpfung)

Invasive Meningokokken-Erkrankungen in Deutschland 2001-2006

Erkrankungen und Todesfälle

Anzahl der Todesfälle in Klammern

Epid. Bull. (2007)32:297-306

Invasive Meningokokken-Erkrankungen in Deutschland 2001-2006

Serogruppen B und C

Epid. Bull. (2007)32:297-306

Serogruppe B

Serogruppe C

Neisseria meningitidisKrankheitsverlauf Typ B versus Typ C

(BRD 2006)

• Allgemein:• 70 % Meningitis, 37 % Sepsis (ca. 30 % mit WFS), 6 % mit

beiden Diagnosen

• Sepsis: • Typ C > Typ B (43 % vs. 34 %)

• Letalität:• Gesamt: 9,6 % • Typ C > Typ B (14 % vs. 8 %)• Höhere Letalität für Typ C in allen Altersgruppen,

v.a. < 5-Jährige sowie dann wieder mit zunehmendem Alter ab dem Jugendalter (BRD 2001–2006)

Epid. Bull. (2007)32:297-306

Haemophilus influenzae

• gramnegative Stäbchen (pleomorph)• Kapseltypen a-f; Wichtigster Kapseltyp: Typ b• Kommensale • H. influenzae benötigt besondere

Wachstumsbedingungen• Hämin (Faktor X) • NAD (Faktor V) • S. aureus 'Amme'

Quelle: Schmitt, H.J.: 40th ICAAC Toronto, 2000, Abstract 411In den Jahren 1996 und 1997 erfolgte keine Erfassung von Hib-Erkrankungen durch die ESPED.

Die Einführung der Hib-Konjugatimpfstoffe führte zu

einer Reduktion invasiver Hib-Erkrankungen !

Systemische Haemophilus influenzae Erkrankungen (ESPED 1993-1999 klinisch)

Mikroskopie von Meningitis-Erregern- Aufgabe 7 -

Präparate:• Neisseria meningitidis (Liquor, Gram)• Neisseria meningitidis (Liquor, Methylenblau)• Streptococcus pneumoniae (Liquor, Gram)• Streptococcus pneumoniae (Tuschepräparat)• Haemophilus influenzae (Liquor, Gram)

Achten Sie auf die typische Morphologie der Erreger und skizzieren Sie diese !

Beurteilen Sie auch die zelluläre Lagerungsform (intra- und / oder extrazellulär).

Tuschepräparat:• Negativdarstellung der Kapsel von Streptococcus pneumoniae• Angefärbte Zellkörper (Diplokokken)

Streptococcus pneumoniaeGrampräparat

Streptococcus pneumoniae

DEMO: Optochin-Test

positivnegativ

Streptococcuspneumoniae

Streptococcusoralis u.a.

Med. Mikrobiologie Ruhr-Universität Bochum

Neisseria meningitidisGrampräparat

Meningitis-Befundkonstellationen

DEMO Blutkulturflaschen

• BK-Paare aerob / anaerob:• unbeimpft vs. beimpft / bewachsen• mit / ohne Kohlezusatz

• PEDS-Flaschen

Beachten Sie auch den Indikator-umschlag bewachsener Flaschen am Boden der Flaschen !