Hromatografiia- 161-Praktikum iz biohemiie

Jonoizmjenjivaka hromatografijaPod jonoizmjenjivakom hromatografijom podrazumjeva se metoda razdvajanja koja koristi nerastvorljivi matriks sa labilnim jonskim grupama, koje se mogu razmjenjivati sa jonima okolne sredineU zadnje vrijeme jonoizmjenjivaki materijal je zasnovan na sintetikim smolama aromatskog karaktera i oni zadovoljavaju u razdvajanju neorganskih jona i malih molekula. Meutim, oni se ne mogu koristiti za razdvajanje velikih molekula kao to su proteini koji ne mogu penetrirati u jako umreenu strukturu smola a takode imaju tendenciju denaturacije u hidrofobnom matriksu.Jonoizmjenjivake smole su ili anjonske ili katjonske, to se odreuje prema afinitetu za negativne odnosno pozitivne jone.pozitivno nabijene estice proteina vezane za negativno nabijen nosanegativno nabijene estice proteina koje prolazeNa primjer: katjonski izmjenjiva izmjenjuje pozitivne jone, a anjonski negativne jone (slika 8.4.). Prema tome , naziv jonoizmjenjivake smole zavisi od mobilnog jona koji se razmjenjuje, a ne od fiksnih jona koje matriks sadri.

Slika 8.4. Odvajanje proteina jonoizmjenjivakom hromatografijom na bazi ukupnog naboja proteinaTa dva tipa se mogu dalje podijeliti u materijale koji sadre jako jonizovane grupe kao to su -SO3H i N+R3 i slabo jonizovane (odnosno djelomino jonizovane)grupe kao to su -COOH, -OH, -NH2.Jonoizmjenjivake smole sa jako jonizovanim grupama su kompletno jonizovani i egzistiraju u nabijenoj formi izuzev u ekstremnim pH vrijednostima:-SO3H ss -SOj- + H+-NRjOH ss -N+R3 + OH"S druge strane slabi jonoizmjenjivaki materijali sadre grupe ija jonizacija zavisi od pH, i oni se mogu koristiti sa maksimalnim kapacitetom samo u odreenom pH opsegu.-COOH si -COO" + H+ -NH3+ s -NH2 + H+Grubo uzevi, jonoizmjenjivake smole koje sadre karboksilnu grupu imaju maksimalni kapacitet na oko pH 6, dok one koje imaju amino grupu su najefikasnije ispod pH 6.-160 -HromatografiiaPraktikum iz biohemiieTabela: 8.1. Tipovi jonoizmjenjivakih smola koje se najee koristeVrsta smoleNaziv smole

Slabo kiseleCeokarb 226, Amberlit IRC 50, Bioreks 70

Jako kiseleDowex 50, Ceokarb 225, Amberlit IR, Biorad AG-50

Slabo bazneAmberlit IR45, Deacidit H, Deacidit G, Biorad Ag-3

Jako bazneDowex 1, Dowex 2, Biorad AG i AG2

Postizanje ravnotee u toku razmjene jonaSve jonoizmjenjivake smole dobro bubre u vodenim rastvorima, a njihove estice obrazuju reetkastu strukturu. Smole sa velikim brojem poprenih veza obrazuju matrice u koje mogu prodirati samo male molekule. Velike molekule i makromolekule ne ulaze u pore estica ovakvih smola. Velike molekule prodiru u pore estica jonoizmjenjivakih smola iji matriks ima manji broj poprenih veza. Jonska razmjena vri se veoma brzo. Brzinu ove vrste hromatografije odreuje brzina difuzije jona kroz smolu. Ukoliko smola ima manji broj poprenih veza, utoliko joni bre difunduju u granule smole i stiu do jonoizmjenjivakih mjesta. Proces jonske izmjene sastoji se iz nekoliko faza:a) difundovanje jona ka povrini smole, i ovaj proces je veoma brz u homogenim rastvorima

b) difuzija jona u granule smole i uspostavljanje kontakta sa jonoizmjenjivakim dijelom. Ovaj korak odreuje brzinu cijelog procesa. Brzina njenog odvijanja zavisi od broja poprenih veza i od koncentracije rastvora

c) razmjena jona je trenutan proces i vodi uspostavljanju ravnotee

za katjonske smole:R-SOjNa+ + N+-R' ^ R-SO-fN+H3-R' +Na+ - za anjonske smole:R(CH3)N+ + OOC-R' ss R(CH3)N+OOCR' + Ukoliko molekula koja se razmjenjuje ima vie naboja, utoliko e se vre vezati za smolu i tee eluirati iz nje.d) difundovanje razmijenjenih jona na povrinu jonoizmjenjivake smole

e) skidanje jona eluensom i difundovanje u okolnu sredinu

Vana karakteristika jonoizmjenjivaa je kapacitet jonoizmjenjivaa koji predstavlja kvantitativnu mjeru njegove sposobnosti da vee na sebe suprotne jone koji se izmjenjuju. Kapacitet se moe izraziti kao ukupni kapacitet i kao korisni kapacitet. Ukupni kapacitet jonoizmjenjivaa je ukupan broj naelektrisanih aktivnih grupa po gramu suvog jonoizmjenjivaa.Korisni kapacitet je kapacitet jonoizmjenjivaa dobijen pod specifinim eksperimentalnim uslovima, to zavisi od pristupanosti funkcionalnih grupa, koncentracije eluenta i jonske jaine , prirode suprotnih jona i selektivnosti funkcionalnih grupa prema njima. Najvei broj jonoizmjenjivakih smola, pored kapaciteta razmjene jona, ispoljava i efekat prosijavanja, kao i adsorpcione fenomene. Iako je adsorpcija slaba, ponekad se moe koristiti za odvajanje veoma srodnih jedinjenja.Mehanizam eluacijeZa skidanje vezanih jona sa stuba smole koriste se razliiti fiziko-hemijski momenti. Mogu se skidati promjenom pH pufera, koristei smanjenja naboja proteina u blizini izoelektrine take. Pri izoelektrinoj taki smanjuje se jonizacija molekula, zbog ega se vie ne veu za smolu samo one molekule ija je izoelektrina taka blizu pH pufera, dok ostali ostaju vezani. Osim toga, joni se mogu odvojiti od smole poveanjem jonske snage rastvora to poveava kompeticiju za jonske grupe smole. Oba eluaciona faktora, promjenu pH ili jonske snage, mogue je mijenjati naglo (diskontinualno) ili postepeno, pomou kontinualnih gradijenata.Vezanje jona na smolu uslovljeno je ravnoteom koja se uspostavlja izmeu jona vezanih za smolu i onih u rastvoru. Vezanje zavisi od izmjenjivakih kvaliteta smole, od stepena njene jonizacije, od temperature, jonske snage i od kvaliteta rastvaraa. Slabe baze i kiseline grade nestabilne soli sa slabim izmjenjivakim smolama, a stabilne soli sa jako baznim ili kiselim smolama. Oba sluaja su nepoeljna u praksi.Ispitivano jedinjenje treba da se vee za smolu, ali tako da se moe eluirati po potrebi. Visokovalentni joni se brzo veu za smolu, a teko skidaju.Redosljed je: H+