prácticas bioquímica universidad de málaga

Tratamiento de sueros lcteos mediante

un biorreactor con -galactosidasa

inmovilizada.

Mara Garca Atencia.

Asignatura: Ingeniera Bioqumica.

Facultad de Ciencias, UMA.

Ingeniera Bioqumica Pgina 2

ndice

Resumen ........3

Objetivo..4

Antecedentes 4-5

Materiales y mtodos ...5-7

Resultados y discusiones .8-32

Conclusin33

Referencias .36


Resumen

En este guin se han llevado a cabo una serie de experimentos en torno a la enzima -galactosidasa que nos han permitido conocer los mejores parmetros de operacin en la hidrlisis de lactosa de esta enzima.

Primero estudiamos cmo le afecta el pH y la temperatura, encontrndose que el pH ptimo posee un valor de 4, aunque se puede decir que trabaja bien en un rango de 3 a 6 pH. Respecto a la temperatura podemos decir que la ms adecuada es 40C, ya que posee la mayor vida media de los tres experimentos llevados a cabo, siendo de 277 minutos.

Luego determinamos las constantes cinticas de nuestra enzima usando como sustrato dos componentes, ONPG y lactosa. Se midieron valores de Vm, Km, Ki, Kcat y especificidad (Kcat/Km), resultando que la lactosa era el sustrato que mejores conversiones proporcionaba, siendo mayor su especificidad. Los resultados de las constantes fueron:

ONPG sin inhibidor

Vm= 8,41 U/mg Km= 2,3 mM

Kcat = 22,08 !! Kcat/Km= 9,596 !! !! ONPG con inhibidor Vm = 8,9 Km = 12,8 Ki = 6,6

Vm= 8,91 U/mg Km= 12,81 mM Ki= 6,57 mM

Kcat = 23,39 !! Kcat/Km= 1,83 !! !! Lactosa Vm = 1,12 Km = 2,89 Ki = 3,6

Vm= 0,374 U/mg Km= 2,89 mM Ki= 3,59 mM

Kcat = 39,23 !! Kcat/Km= 13,57 !! !! A continuacin, gracias a la ayuda de amberlita inmovilizamos la enzima -galactosidasa obtenindose un alto porcentaje de enzima inmovilizada, concretamente de un 84,42%. Una vez inmovilizada la enzima llevaramos a cabo la reaccin de hidrlisis de lactosa en una columna, haciendo pasar distintos caudales de suero lactosado a distintas concentraciones iniciales de lactosa. As es como creamos un biorreactor a escala laboratorio, en el que los resultados obtenidos de conversin a glucosa fueron de un 99% para el procedimiento experimental y de un 84% para la simulacin de un biorreactor con el software Berkeley-Madonna, con caudal de 2,96 mL/min y concentracin inicial de lactosa de 5mM.


Objetivo

Proporcionar las condiciones ptimas de trabajo de la enzima -galactosidasa, proveniente del hongo Aspergillus Oryzae, para la hidrlisis de lactosa en un biorreactor, inmovilizando previamente la enzima en Amberlita IRC-50.

Antecedentes

La lactosa es el disacrido cuyo metabolismo ha sido ms extensamente estudiado en bacterias lcticas, debido a la gran importancia econmica de las fermentaciones lcteas que hacen posible la produccin de quesos y yogures.

La lactosa est formada por la unin, mediante un enlace O-glucosdico, de glucosa y galactosa. Estos monosacridos son fcilmente absorbidos en el intestino, mientras que la molcula de lactosa no. Gran parte de la poblacin tiene problemas para hidrolizar esta molcula, debido a la insuficiencia de la enzima que produce esta hidrlisis, a la que llamamos -galactosidasa, o comnmente conocida como lactasa. Esto es lo que se conoce como intolerancia a la lactosa. [1]

Fig.1 Hidrlisis de lactosa (izquierda) en sus dos componentes, galactosa (1) y glucosa (2). Reaccin catalizada por la enzima lactasa.

Otra apreciacin de la lactosa es que no es muy buen edulcorante. Sin embargo si se hidroliza se consigue un poder edulcorante combinado de aproximadamente un 80% del que posee la sacarosa (edulcorante nutritivo ms representativo). [2]

Adentrndonos en problemas de contaminacin nos encontramos con que en la produccin de quesos, casenas, caseinatos y mantequilla se obtiene entre un 80% y 90% de subproducto, en este caso, es lactosuero. Se suele optar por desecharlo como efluente a ros y lagos, produciendo graves consecuencias en el medio ambiente debido a la gran demanda bioqumica de oxgeno de este suero. Esto se traduce en que los microorganismos que degradan el suero consumen ingentes cantidades de oxgeno, haciendo que la fauna de los ros y lagos muera y se produzcan malos olores y


putrefacciones. Si el suero es vertido al suelo, puede llegar a acuferos a travs de filtraciones, implicando la salud de animales y humanos. [3]

En el ao 2012 en Espaa se produjeron 173.000 toneladas entre mantequillas y quesos. Esto supone una enorme cantidad de suero como subproducto que se debera aprovechar, aunque la mayor parte se desecha.[4] Este lactosuero contiene aproximadamente el 50% de los nutrientes de la leche original: protenas, lactosa, vitaminas y sales minerales. Por lo que se investiga posibles aplicaciones de este subproducto en la misma industria alimenticia, como en la elaboracin de productos crnicos (carnes procesadas, embutidos), panificados, y bebidas para deportistas entre otros productos.[5] Esta ltima opcin ha sido investigada por una universidad de colombia, en cuya investigacin aprovechan la glucosa de la lactosa del suero como edulcorante para la bebida isotnica, glucosa que hidrolizan con lactasa.[6]

Profundizando en lo que se refiere a la lactasa, podemos decir que puede obtenerse de diferentes fuentes, pero que su produccin a nivel industrial para procesos alimenticios, debe realizarse a travs de cultivos de microorganismos considerados seguros internacionalmente. Estos microorganismos pueden ser las levaduras Kluyveromyces fragilis y lactis o los hongos Aspergillus niger y oryzae. [7]

Hablando de procesos industriales, lo que prioriza en ellos es el hacer bien con el menor coste posible, de ah que se hayan estudiado tcnicas de reutilizacin de biocatalizadores y de utilizacin continua de ellos. Una de estas tcnicas que todava se estudia para conseguirlo es la inmovilizacin de la enzima catalizadora. Estas tcnicas siguen luchando contra la reduccin de actividad, as como limitacin difusional que puede proporcionar los soportes sobre los que se inmoviliza la enzima. Estos soportes pueden ser orgnicos o inorgnicos. [8]

Recopilando un poco tenemos que tanto la intolerancia a la lactosa, la reutilizacin como edulcorante y la elaboracin de quesos y productos lcteos, como el aprovechamiento del subproducto que deja dicha elaboracin, hace que sea muy importante el estudio de la hidrlisis de la lactosa. En este manuscrito nos centraremos en que esta hidrlisis sea llevada a cabo en un biorreactor por la enzima -galactosidasa proveniente del hongo Aspergillus Oryzae y veremos qu condiciones (pH, temperatura, influencia de distintos sustratos) son las idneas para la descomposicin en glucosa y galactosa. Adems inmovilizaremos la enzima en una resina orgnica de intercambio inico, Amberlita IRC-50.


Materiales y mtodos.

Materiales

Empleamos -galactosidasa 100 g/mL, junto con o-nitrofenil -D-Galactopiransido 4mM, tambin llamado ONPG y ONP 2mM. Tambin trabajamos con tampn fosfato-citrato 40mM, pH 4.5, tampn borato 200mM, pH 9.8, amberlita IRC-50, glucosa 0,2mM, adems de agua destilada. Nos ayudamos de una mezcla enzimtica que contiene un exceso de las enzimas glucosa oxidasa y peroxidasa junto con el sustrato de la peroxidasa, en tampn fosfato-tris pH 7.3.

Para la utilizacin de todos estos componentes nos servimos de un amplio material de laboratorio como pipetas, tubos eppendorf, tubos de ensayo, cronmetros, etc.

Mtodos

Ensayo estndar de actividad -galactosidasa.

Se realiz una medida de la actividad de esta enzima para lo que se llev a cabo el siguiente procedimiento:

Se realiz una mezcla de cuatro componentes: 200L de tampn fosfato-citrato 40mM con un pH de 4.5, 500 L de ONPG 4mM, 100 L de -galactosidasa 100 g/mL y hasta que se consigan 1000 L se rellena con agua destilada.

Se utilizaron 10 tubos de ensayo de 10 mL. Es importante aadir la enzima cuando hayamos aadido los dems componentes, ya que la enzima es la que da comienzo a la reaccin. Se agit por inversin y se puso el cronmetro dejando incubar 10 min. Para parar la reaccin se ech 3mL de tampn borato 200mM, pH 9.8.

Tras esto me midi la absorbancia a 410nm frente al blanco.

Protocolo de medida de glucosa mediante el mtodo de glucosa oxidasa-peroxidasa.

Es un mtodo basado en la oxidacin de la glucosa mediante dos simples reacciones:

Glucosa + ! cido glucnico + !! Por glucosa oxidasa ABTSred + !! ABTSoxid + 2!! Por peroxidasa Este perxido de hidrgeno junto con el sustrato de la peroxidasa, y la enzima peroxidasa, produce un compuesto coloreado por la oxidacin de la glucosa. Preparamos una recta patrn para la que tomamos 0.4 mL de muestra y les aadimos 1mL de mezcla enzimtica, que contienen un exceso de enzimas glucosas oxidasa y peroxidasa junto con el sustrato de la peroxidasa (ABTS), en tampn fosfato, pH 4. Dejamos incubar 30 minutos a temperatura ambiente y medimos su absorbancia a 740nm.


Protocolo de preactivacin de la Amberlita.

Lo llev a cabo nuestro tcnico de laboratorio pero explicaremos cmo se lleva a cabo:

Pesamos 12 gramos de Amberlita en un tubo de ensayo de rosca, lavamos dos veces con agua destilada, aadimos 20 mL de polietilamina 100mg/mL y dejamos en agitacin durante dos horas. Luego lavamos de nuevo con agua y aadimos otros 30 mL pero esta vez de glutaraldehido al 2.5% y dejamos 30 min agitndose . Por ltimo lavamos con tampn fosfato 50mM, pH 7.


Resultados y discusiones.

Prctica 1. Efecto del pH y la temperatura.

1.1 Efecto del pH sobre la actividad -galactosidasa de Aspergillus oryzae.

Para determinar la actividad de la enzima a diferentes pH se sigui el ensayo estndar de actividad de -galactosidasa, mencionado en el apartado Mtodos.

Se utilizaron tampones fosfato-citrato a diferentes pH, concretamente fueron pH 3, 4 ,5, 6, 7, 8, 9 y 10, utilizando un blanco comn a pH 7.

Ayudndonos de la ley de Lambert-Beer, que es una ecuacin emprica que relaciona linealmente la absorcin de la luz de una sustancia con la concentracin de la misma, podemos calcular la concentracin, en este caso, de ONP. La ley dice que:

=

Donde C es concentracin de ONP, A es absorbancia, es el coeficiente de extincin molar del ONP, que a 410nm posee un valor de 4600 !!!!. Por ltimo d es la longitud que atraviesa la luz, que en la mayora de los casos suele estar normalizada a 1cm.

Para pasar de concentraciones a actividades, basta con multiplicar las concentraciones por el volumen que corresponde a la medida de absorbancia y dividir entre el tiempo de reaccin y la masa de la enzima. De esta manera se obtienen las unidades propias de la actividad enzimtica, U/mg. Donde U = mol / min.

La masa de la enzima sera 0,01 mg

El volumen sera 4 mL y el tiempo de reaccin 10 min.


Enfrentando la actividad de -galactosidasa frente a pH obtenemos un grfico donde podemos analizar qu pH es ms adecuado para trabajar con nuestra enzima.

Fig.1 Efecto de pH sobre la enzima -galactosidasa.

Como podemos ver, el pH ms o menos adecuado para trabajar con la enzima en cuestin se encuentra en el rango de 3 a 6 de pH, siendo 4 el valor de pH ptimo. Mientras ms aumentamos la basicidad a partir de pH 6 la enzima cada vez tiene menor actividad, es decir, se va desnaturalizando y hacindose inservible, por lo que descartamos estos pH como pH de trabajo para hidrolizar la lactosa.

1.2 Medida de la estabilidad trmica de la enzima.

Para analizar cmo le afecta la temperatura a nuestra enzima, preparamos 4 tubos eppendorf, tres de los cuales se repartieron en baos a distintas temperaturas, de 40, 60 y 70, cada uno con 1 mL de una disolucin de -galactosidasa a 100g/mL. Estas muestras fueron incubadas 5, 10, 20, 40 y 60 min, extrayndose 120L en cada tiempo. El ltimo eppendorf se reserv para tomar una medida de la enzima sin preincubar.

Para medir la actividad enzimtica se ha seguido el mismo procedimiento que para el efecto del pH, siendo los datos de masa, volumen y tiempo iguales tambin y obtenindose la siguiente grfica.

0

1

2

3

4

5

0 2 4 6 8 10 12

ac#v

idad

(U/m

g)

pH

Efecto pH


Representamos actividad de -galactosidasa frente al tiempo de incubacin a las distintas temperaturas a las que hemos realizado el experimento:

Fig.2 Efecto de la temperatura con el tiempo de incubacin, sobre la enzima -galactosidasa, a temperatura de 40, 60 y 70..

Podemos observar que a 70C la enzima se desnaturaliza rpidamente, mientras que 60C la actividad se mantiene en un valor ms alto conforme pasa el tiempo. De las tres temperaturas a las que sometimos la enzima vemos que la ms ptima es 40C ya que posee una actividad bastante alta respecto de sus compaeras.

Para confirmar nuestro anlisis del grfico es mejor proporcionar el tiempo de vida media de la enzima a cada temperatura. Para ello nos valemos de la ecuacin de cintica de desactivacin de primer orden: = !!!! Linealizamos, = !

Donde si representamos Ln(v), o lo que es lo mismo Ln(actividad enzimtica), frente a tiempo, queda que ! es igual a menos la pendiente de la recta.

0 0,5 1

1,5 2

2,5 3

3,5 4

0 10 20 30 40 50 60 70

ac#v

idad

(U/m

g)

Tiempo (min)

Efecto de la temperatura

40C

60C

70C


Una vez calculado el valor de Kd, gracias a la siguiente ecuacin averiguamos el tiempo de vida media de la enzima segn la temperatura:

!/! = ln (2)!

Kd (!) /(min) 40C 0,0025 277,258872 60C 0,0199 34,8315166 70C 0,0792 8,75185834 Tabla 1. Tiempo de vida media de la enzima -galactosidasa a diferentes temperaturas, junto con el dato de la constante Kd.

Se corrobora pues que 40 es la temperatura ptima de trabajo de esta enzima, ya que el tiempo que transcurre hasta que empieza a desnaturalizarse, 277 min, es muy alto en comparacin con las otras temperaturas.


Prctica 2. Determinacin de las constantes cinticas con ONPG como sustrato.

Para determinar las constantes cinticas teniendo ONPG como sustrato medimos la actividad de nuestra enzima a diferentes concentraciones finales de ONPG. Las concentraciones que usamos fueron 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 1, 5, 10 y 20 mM. Este experimento fue repetido dos veces, una en presencia de inhibidor y otra en ausencia de este. Como inhibidor se us galactosa 30 mM.

Para la medida de la actividad enzimtica se utiliz el mismo procedimiento que para el efecto del pH, es decir, se hizo uso del ensayo estndar -galactosidasa (dicho ensayo se detalla en el apartado Mtodos), la ley de Lambert-Beer para calcular la concentracin de ONP y la conversin de unidades de mol/mL a U/mg. Los datos de masa, volumen y tiempo de reaccin siguen siendo los mismos que antes para este experimento.

Una vez hecho todo lo anterior representamos actividad de la enzima frente a la concentracin de ONPG y obtenemos el siguiente grfico:

Fig.3 Variacin de la actividad enzimtica con la concentracin de ONPG, tanto en presencia de inhibidor, como sin ella.

Se puede observar que la actividad es considerablemente mayor sin presencia de inhibidor que con este. Y que a medida que elevamos la cantidad de ONPG, aumentamos la actividad enzimtica, lo cual siempre es favorable.

Pasamos a calcular las constantes cinticas utilizando una regresin no lineal. Ajustaremos la nube de puntos a la ecuacin cintica de Michaelis-Menten, gracias al programa Mystat. Esta ecuacin cintica es la siguiente:

= !"# []! []

0

1

2

3

4

5

6

7

8

0 5 10 15 20 25

ac#v

idad

(U/m

g)

[ONPG] (mM)

Con inhibidor

Sin inhibidor


Siendo V la actividad enzimtica y [S] la concentracin de ONPG.

Se obtuvieron los siguientes resultados:

Sin inhibidor:

Fig. 4 Variacin de la actividad enzimtica frente a la concentracin de ONPG, sin presencia de inhibidor.

Con inhibidor:

Fig. 5 Variacin de la actividad enzimtica respecto de la concentracin de ONPG, en presencia de inhibidor.

Parameter Estimates Parameter Estimate

Vm (U/mg) 8,412 Km (mM) 2,301


Vm (U/mg) 8,910 Km (mM) 12,806


Como Vm sin inhibidor y Vm con inhibidor tiene un valor relativamente parecido y en cambio, Km vara considerablemente, podemos suponer que se trata de un cintica de inhibicin competitiva. A partir de ahora utilizaremos ecuaciones apropiadas a esta cintica.

Al tener un inhibidor, debemos calcular la constante de inhibicin, para calcularla nos ayudamos despejando de la siguiente expresin:

= 1+ []! Donde [I] es la concentracin de inhibidor (galactosa), [I]=30mM.

La constante se calcula despejando de: !(!"!#$%&$) = ! Donde !(!"!#$%&$) se corresponde con el valor de la constante ! con inhibicin y ! al valor de la constante sin inhibicin. De esta manera se obtiene que Ki = 6,57mM.

Puede ser de inters obtener el valor de la constante Kcat, ya que el cociente de esta y Km nos da el valor de la constante de especificidad. Esta constante nos indica la eficiencia de nuestra enzima. A mayor valor de Kcat/Km, mayor ser la eficiencia de la enzima, lo cual es conveniente conocer.

El valor de Kcat viene determinado por la siguiente ecuacin.

!"# = !"#[] Sabiendo que el peso molecular de la enzima es de 105.000 g/mol y que se encontraba con una concentracin de 100 g/ml, podemos conocer la concentracin de enzima en mol/mL.

[enzima ]= 100/105.000 = 9,53 10!! mol/mL Como tenemos dos valores de Vmax, uno para la inhibicin y otro para la ausencia de esta, tendremos dos valores de Kcat.

Con presencia de inhibidor,

Como tenemos [enzima] en mol/mL, Vmax debemos tenerlo en mol/mLmin. Nos valemos de los datos de masa de enzima y volumen para la conversin.

Vmax = (8,91 0,01)/ 4 = 0,0223 mol/mLmin

Teniendo Vmax en las unidades adecuadas, Kcat sera:

Kcat = 0,0223 / 9,53 10!! = 23,39 !!


Kcat / Km = 23,39 / 12,81 = 1,83 !! !! En ausencia de inhibidor,

Vmax = (8,412 0,01)/ 4 = 0,021 mol/mLmin

Kcat = 0,021 / 9,53 10!! = 22,08 !! Kcat / Km = 22,08 / 2,301 = 9,596 !! !!

Recogiendo resultados en un tabla quedara:

Vmax (U/mg)

Km (mM)

Ki (mM)

Kcat (!) Kcat/Km (! !)

Sin inhibidor 8,412 2,301 22,08 9,596 Con inhibidor 8,91 12,806 6,57 23,39 1,83 Tabla 2. Constantes cinticas en presencia y en ausencia de inhibidor (galactosa).

El valor de especificidad nos confirma lo ya visto en el grfico anteriormente. Al ser mayor la constante de especificidad en el caso sin inhibicin podemos concluir que la enzima es ms eficiente en ausencia de inhibidor.


Prctica 3. Determinacin de las constantes cinticas con lactosa como sustrato.

El objetivo de este experimento es, al igual que en el experimento anterior, determinar las constantes cinticas de la enzima -galactosidasa, aunque en este caso empleando lactosa como sustrato. Para ello se dispuso de 4 tubos de ensayo, en los que hubo 2,8 mL de disolucin de lactosa a distintas concentraciones (concretamente 100, 70, 40 y 20 mM).

La reaccin se activ al aadir la enzima, tras lo cual se tomaron muestras de 200 L a los 5, 10, 20, 40 y 60 min. Estas muestras fueron sumergidas en un bao a 70C para parar la reaccin y poder medir la conversin de glucosa. Para medir la conversin alcanzada se siguieron los pasos especificados en el protocolo de medida de glucosa mediante el mtodo de glucosa oxidasa-peroxidasa, el cual se recoge en el apartado Mtodos.

Una vez seguidos los pasos de este protocolo pasamos a representar la absorbancia de la muestra frente a concentracin de glucosa, obteniendo as nuestra recta patrn:

Fig.6 Recta patrn.

De la ecuacin de esta recta podemos calcular el valor de concentracin a distintas absorbancias. Esta concentracin se encuentra diluida, por lo que se multiplica por su dilucin. De esta manera se puede hallar la conversin de glucosa alcanzada.

abs = 8,7688*C + 0,0402 R = 0,9996

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1

1,2 1,4 1,6 1,8 2

0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25

absorban

cia

Concentracin nal de glucosa (mM)

Recta patrn


Todo ello para las cuatro concentraciones distintas de lactosa, 100, 70, 40, 20. Nos queda la siguiente tabla de conversiones (siendo X la conversin):

100mM 70mM 40mM 20mM Tiempo (min)

X X X X

5 0,05119367 0,07497708 0,12648386 0,23296333 10 0,10407895 0,14498341 0,23849263 0,41537176 20 0,19779947 0,2701108 0,42283299 0,66362612 40 0,359291 0,47140654 0,6740284 0,89475754 60 0,49063208 0,62074256 0,82034125 0,97433659 Tabla 3. Conversiones respecto al tiempo a diferentes concentraciones de lactosa.

De la tabla ya podemos observar que conforme la concentracin de lactosa es menor, mayor rendimiento se produce, llegndose a alcanzar hasta un 97% de conversin a 20mM de concentracin a los 60 min. Para visualizarlo mejor representamos la conversin frente al tiempo en la siguiente grfica:

Una vez obtenidas las conversiones realizamos una regresin no lineal, con el fin de obtener los parmetros A y B, que ahora definiremos.

La ecuacin cintica que emplearemos estar basada en la cintica de Michaelis-Menten, (modelo de inhibicin competitiva): 1 = Donde,

= (1 !! ) !! = (1 !!) !!

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0 10 20 30 40 50 60 70

Conv

ersin

Tiempo (min)

100mM

70mM

40mM

20mM


Introducimos la ecuacin basada en la cintica de Michaelis-Menten en el programa Mystat, realizando una regresin no lineal y representamos tiempo frente a la conversin, obtenindose los siguientes resultados:

Para 100mM

Fig. 7 Variacin de la conversin respecto al tiempo transcurrido, a 100mM.


A (min) 11,421 B (min) 80,632


Para 70mM


Para 40mM



A (min) 7,637 B (min) 57,016


A (min) 4,999 B (min) 32,588


Para 20mM


Una vez calculados los valores A y B, se representa A+B frente a concentracin inicial de lactosa. La ecuacin que rige la linealizacin de estos puntos nos ayudar a calcular las constantes cinticas.

Fig. 11 A+B frente a concentracin inicial de lactosa.

Tenemos que + = ! !!! + !!!! por lo que !!! es la pendiente de la recta y !!!! es la ordenada en el origen.

y = 0,8912x + 2,577 R = 0,99966

0

20

40

60

80

100

0 20 40 60 80 100 120

A+B (m

in)

So (mM)

(A+B) frente a So


A (min) 6,121 B (min) 14,876


Segn la ecuacin usada Vmax tiene las unidades de mM/min, que habr que pasar a U/mg con el fin de poder comparar todos los resultados en la conclusin final. As que nos ayudamos del valor de concentracin de -galactosidasa, que es de 3000 mg/L, para la conversin.

Vmax = 1 / 0,8912 = 1,1221 mM/min. = 1122,1 mol / (Lmin)

Vmax = 1122,1 / 3000 = 0,374 U/mg

Km = 2,577 1,1221 = 2,891 mM.

Calculamos Kcat de la misma manera que cuando tenamos ONPG como sustrato, con la salvedad de que en este caso tenemos una concentracin de enzima de 3mg/mL. Con el peso molecular de la enzima obtenemos las unidades deseadas para poder calcular Kcat.

[enzima] = 3 mg/mL / 105.000 mg/mmol = 0,0000286 mmol/mL = 0,0286 mmol / L

Teniendo [enzima] y Vmax,

Kcat = 1,1221 mmol /(Lmin) / 0,0286 mmol / L = 39,23 !! Tambin sabemos que = (1 !!!! ) !!!! de donde podemos despejar Ki, de esta manera obtenemos las constantes cinticas, que recogemos en la siguiente tabla:

100mM 70mM 40mM 20mM Vm (U/mg) 0,374 Km (mM) 2,891 Ki (mM) 3,294 3,316 3,363 4,404 Ki media (mM) 3,595 Kcat (!) 39,23 Kcat / Km (!!) 13,57 Tabla 4. Constantes cinticas para distintas concentraciones iniciales de lactosa.


Prctica 4. Inmovilizacin de la enzima en Amberlita IRC-50.

En la siguiente prctica veremos qu porcentaje de enzima es capaz de inmovilizar un lecho de amberlita. Para ello se tiene un tubo de 50 mL donde se encuentra la resina, previamente preactivada por el tcnico de laboratorio, al que se aaden 30 mL de una solucin de -galactosidasa (3mg/mL en tampn fosfato 50mM, pH 7). Para una mejor inmovilizacin este tubo se tiene en continua agitacin durante 80 min.

Se van recogiendo muestras de 100 L a los 5, 10, 20, 40, 60 y 80 minutos. A cada muestra se le realiz el ensayo estndar de actividad -galactosidasa, recogido en el apartado Mtodos. Esto se hizo con el fin de conocer la absorbancia, con la que, a partir de la ley de Lambert-Beer, podemos conocer datos de concentracin y con ello datos de actividad.

Se sigue, por tanto, el mismo procedimiento que para la prctica 1 y 2, con los mismos datos para la conversin en U/mg, con la salvedad de que la masa de la enzima a tiempo cero, en este caso, es de 0,04 mg. Este dato se conoce sabiendo la concentracin inicial de la enzima (3mg/mL) y su dilucin (1/7,5).

La tabla de datos y resultados sera:

Absorbancia C (M) U(mol/min) Act (U/mg) 1,509 328,043478 0,13121739 3,28043478 0,676 146,956522 0,05878261 1,46956522 0,268 58,2608696 0,02330435 0,5826087 0,180 39,1304348 0,01565217 0,39130435 0,206 44,7826087 0,01791304 0,44782609 0,199 43,2608696 0,01730435 0,4326087 0,235 51,0869565 0,02043478 0,51086957 Tabla 5. Datos de absorbancia, concentraciones y actividades.


Representamos la actividad frente al tiempo para una mejor visualizacin de los datos de la tabla:

Fig.10 Variacin de la actividad enzimtica con el paso del tiempo.

Vemos cmo el paso del tiempo hace que disminuya considerablemente la actividad, lo que nos dice que la enzima est cada vez ms inmovilizada en el lecho de amberlita.

El porcentaje de enzima inmovilizada lo obtenemos de la siguiente ecuacin:

%!"#$%& !"#$%!&!'()( = !"!#!$% !"#$%!"!#!$% 100

Nos queda una tabla con todas las conversiones respecto al tiempo que transcurre:

Tiempo (min) % enzima inmovilizada 0 0 5 55,2021206 10 82,239894 20 88,0715706 40 86,3485752 60 86,8124586 80 84,4267727 Tabla 6. Porcentaje de enzima inmovilizada.

Vemos cmo el transcurso del tiempo ha ido incrementando el porcentaje de enzima inmovilizada, llegando a un porcentaje de enzima inmovilizada final de 84,42 %.

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

ac#v

idad

(U/m

g)

#empo (min)


Para ver los gramos totales de enzima inmovilizada, le aplicamos el porcentaje final a los gramos totales que haba de enzima en un principio: !"#$%& !"!#$ = 3 30 = 90 !"#$%& !"#$%!&!'()( = 90 0,84 = 75,89 !"#$%& !"#$%!&!'()(!"#$%&'(! = 75,89 120 = 3,79 !"#$%&!"#$%&'(!

Determinacin de la porosidad de la amberlita.

Sabiendo que,

Absorbancia inicial * V inicial = Absorbancia final * Vfinal

Obtenemos,

Vfinal = (0,422*2)/ 0,288 = 2,93 mL

Como la porosidad es igual a (Vfinal Vinicial)/ Vinicial = (2,93 2)/ 2 = 0,46


Prctica 5. Hidrlisis de lactosa en el biorreactor.

El objetivo de la siguiente prctica es llevar a cabo la hidrlisis de lactosa, con -galactosidasa inmovilizada sobre un lecho de amberlita y conocer la conversin de glucosa alcanzada. Para ello se virti el gel, formado por la enzima inmovilizada en la resina que preparamos en la prctica 4, en una columna de 20mL y 1,3cm de dimetro. A esta columna se le fue aadiendo tampn fosfato pH 4,5 para que no se secara el gel.

La columna, que har de biorreactor, operar a caudales de 2, 4, 8 y 12 mL/min utilizando un suero lactosado de concentraciones 50, 20, 10 y 5 mM. Se recogieron muestras a la salida de la columna las cuales se diluyeron y posteriormente analizaron mediante el mtodo de glucosa oxidasa-peroxidasa, recogido en el apartado Mtodos, para conocer la glucosa obtenida.

Una vez seguidos los pasos del mtodo oxidasa-peroxidasa se obtienen una serie de absorbancias que representamos frente a concentracin de glucosa y obtenemos nuestra recta patrn:

Fig.11 Recta patrn.

Al igual que en la prctica 3, de la ecuacin de esta recta podemos calcular el valor de concentracin de glucosa para distintas absorbancias; concentracin que se encuentra diluda, por lo que se multiplica por su dilucin. De esta manera se puede hallar la conversin de glucosa alcanzada.

abs = 8,6134*[G] + 0,0393 R = 0,9987

0,000

0,500

1,000

1,500

2,000

0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25

absorban

cia

[Glucosa] (mM)

Recta patrn


Todo ello para las cuatro concentraciones distintas de lactosa, 50, 20, 10, 5. Nos queda la siguiente tabla de conversiones (siendo X la conversin):

50mM 20mM 10mM 5mM Caudal (ml/min)

X X X X

13,3 0,32501509 9,1 0,43902039 4,5 0,69303218 2,3 0,90104184 12,9 0,51502392 9,4 0,6310293 4,3 0,89304147 3,7 0,92504296 14,7 0,57802684 8 0,79803706 4,1 0,95704444 3 0,98604579 13 0,69503228 7,7 0,86604022 4,9 0,95804449 2,9 0,99504621 Tabla 7 Conversiones respecto al tiempo a diferentes concentraciones de lactosa.

De la tabla ya podemos observar que conforme la concentracin de lactosa es menor, mayor rendimiento se produce, llegndose a alcanzar un valor mximo de 99% de conversin a 5mM de concentracin.

Ahora procedemos a realizar una simulacin del biorreactor mediante el software Berkeley-Madonna.

Para utilizar dicho programa necesitamos conocer los valores de las constantes cinticas. Los calculamos igual que en la prctica 3, averiguando valores de A y B de la ecuacin cintica de Michaelis-Menten (mediante regresin no lineal, ayudndonos del software Mystat) y luego representando A+B frente a la concentracin de lactosa.

Para utilizar Mystat necesitamos la variable tiempo, en este caso sera tiempo de residencia calculado como,

= !"#$%&'! Donde Q es el caudal y Vexclusin es el volumen de exclusin de la columna, cuya frmula se define como, !"#$%&'! = !"!#$ !"#$%&'! = 9,3


Nos queda la siguiente tabla de resultados:

50mM 20mM Caudal (mL/min) Tiempo (min) Caudal (mL/min) Tiempo (min) 13,3 0,7015507 12,9 0,71997961 9,1 1,0265667 9,4 0,98778501 4,5 2,07014512 4,3 2,1866288 2,3 3,99344014 3,7 2,52844222

10mM 5mM Caudal (mL/min) Tiempo (min) Caudal (mL/min) Tiempo (min) 14,7 0,63469869 13 0,71958475 8 1,16942025 7,7 1,21387245 4,1 2,28422115 4,9 1,90912585 3 3,09053039 2,9 3,18275632 Tabla 8 Tiempos de residencia para distintos caudales y concentraciones de lactosa.

Con todo esto y la misma ecuacin que para la prctica 3, Mystat nos proporciona lo siguiente:

Para 50mM



A (min) 0,134 B (min) 1,674


Para 20 mM


Para 10mM



A (min) 0,054 B (min) 0,957


A (min) 0,028 B (min) 0,717


Para 5 mM:


Representamos la suma de los valores de A y B obtenidos, frente a la concentracin de lactosa:

Fig. 15 Representacin de A+B frente a la concentracin de lactosa, 50, 20, 10 y 5.

y = 0,0265x + 0,4803 R = 1

0

0,5

1

1,5

2

0 10 20 30 40 50 60

A+B (m

in)

So (mM)

A+B frente a So


A (min) 0,017 B (min) 0,597


Tras repetir el mismo proceso que en la prctica 3 nos queda la siguiente tabla:

100mM 70mM 40mM 20mM Vm (mM/min) 37,7358491 Vm (U/mg) 4,62436342 Km (mM) 18,1245283 Ki (mM) 20,16372796 20,1806723 20,2658228 20,7922078 Ki media (mM) 20,3506077 Tabla 9 Constantes cinticas Vm, Km y Ki para distintas concentraciones iniciales de lactosa.

Ahora estamos en disposicin de utilizar la herramienta informtica Berkeley-Madonna, la cual simula el comportamiento del reactor y nos proporciona directamente los valores de concentracin de glucosa tras la hidrlisis. A modo de ejemplo expondremos 2 grficas de este programa a concentracin inicial de lactosa de 50mM y a distintos caudales de ml/min. Decir que se ha realizado una media de los caudales por simplicidad de clculos, viendo que el error cometido es bastante pequeo ya que los caudales varan su valor en poca medida, haciendo que la media de todos ellos sea un valor bastante acertado.

Para caudal de 13,48 ml/min:

Fig.16 Caudal de 13,48 ml/min y concentracin inicial de lactosa 50mM. La lnea de color rojo representa la concentracin de lactosa y la de color negro la concentracin de glucosa. Siendo P la concentracin de glucosa y S la de lactosa, TIME es el tiempo de reaccin.

Nosotros nicamente nos hemos fijado en la concentracin de glucosa, es decir, en la lnea negra.


Para caudal de 8,54 ml/min:

Fig.17 Caudal de 8,54 ml/min y concentracin inicial de lactosa 50mM. La lnea de color rojo representa la concentracin de lactosa y la de color negro la concentracin de glucosa. Siendo P la concentracin de glucosa y S la de lactosa, TIME es el tiempo de reaccin.

Los parmetros que se han utilizado para el programa Berkeley-Madonna son los siguientes:

METHOD RK4 STARTTIME = 0 STOPTIME=50 DT =0.1 init P = 0 init S =10 Vm =38.61 Km =18.79 Ki = 20.49 S0=10 F=13.47 V=9.3 P'=-(F/V)*(S0-S)+((Vm*S)/(Km+S+Km*P/Ki)) S' = -P'

Siendo init S y S0 la concentracin inicial de lactosa e init P la concentracin inicial de glucosa, que es en todo momento cero. Vm, Km, Ki son las constantes cinticas calculadas anteriormente, F es el caudal y V es el volumen de exclusin.


Obtenemos la siguiente tabla:

Caudal(ml/min) 50mM 20mM 10mM 5mM 2,96 32,26 15,32 8,12 4,19 4,5 27,36 13,59 7,37 3,87 8,54 19,22 10,48 6 3,23 13,48 13,97 8,21 4,85 2,68 Tabla 10 Concentracin de glucosa a distintas concentraciones iniciales de lactosa y para distintos caudales.

Ahora bien, para obtener la conversin de glucosa realizamos una simple divisin entre la concentracin de glucosa obtenida y la concentracin inicial de lactosa y nos queda:

Caudal(ml/min) 50mM 20mM 10mM 5mM 2,96 0,6452 0,766 0,812 0,838 4,5 0,5472 0,6795 0,737 0,774 8,54 0,3844 0,524 0,6 0,646 13,48 0,2794 0,4105 0,485 0,536 Tabla 11 Porcentaje convertido en glucosa.


Conclusin

Tras este exhaustivo estudio sobre la enzima -galactosidasa para la hidrlisis de lactosa, podemos mostrar cuales son los parmetros ms adecuados para trabajar con ella. Pasando por influencia de pH, temperatura, variacin de sustrato e inmovilizacin de la enzima.

Hemos podido ver cmo en nuestro experimento el rango adecuado de trabajo para la enzima se encuentra entre 3-6, siendo 4 el pH ptimo. Al aumentar la basicidad por encima de 6, la enzima se va desnaturalizando cada vez ms y hacindose inservible como catalizador.

As mismo hemos visto que la enzima se desnaturaliza muy rpido a temperaturas elevadas, como los 70C. Si bajamos 10C, la actividad enzimtica se mantiene en valores altos durante cierto periodo corto de tiempo, y se desnaturaliza en periodos largos. Si volvemos a bajar 20C, estando en 40C, comprobamos que la actividad se mantiene en valores muy aceptables durante ms tiempo que para las otras dos temperaturas, teniendo un tiempo de vida medio 8 veces superior al tiempo de vida medio de 60C. Esto nos dice que la temperatura ms adecuada de trabajo de la enzima es de 40C.

Investigando en bibliografas hemos encontrado resultados de pH y temperatura adecuados para nuestro mismo experimento, encontrndose que nuestros resultados son satisfactorios, ya que nos dice que el pH que se debe utilizar est entre 3,5 y 8, siendo el ptimo pH 5. En cuanto a temperatura, 55C es la temperatura adecuada. Decir que los resultados varan un poco, lo que es lgico ya que varan los mtodos utilizados, laboratorio, instrumental y seguramente ciertos parmetros que nosotros hemos tenido en cuenta y los dems no y viceversa. Pero dentro de la lgica los resultados concuerdan [9].

Respecto a la variacin de sustrato, decir que se realizaron dos experimentos para calcular las constantes cinticas de la lactasa. El primero fue con ONPG como sustrato, y el segundo con lactosa.

Analizando primero los resultados con ONPG, vemos que son coherentes, ya que la actividad de la enzima es mayor sin presencia de inhibidor que con este. Esto lo corroboramos con los datos de eficiencia (Kcat/Km), que en el caso de inhibicin es de 1,83 y en el caso con inhibicin es 9,596. Esto nos dice que la eficiencia cataltica de nuestra enzima es mucho mayor cuando no hay inhibidor.

Otro conclusin que se puede tener observando los resultado es que el valor de Vmax a penas vara con o sin inhibidor, sin embargo, el valor de de Km s que vara considerablemente. Esto nos dice que la inhibicin que se est dando es competitiva.

En segundo lugar analizando el resultado con lactosa como sustrato, se aprecia que se alcanza un mayor rendimiento a bajas concentraciones de lactosa, obtenindose hasta un


97% de conversin con 20 mM y un 0,49% con 50 mM en el mismo tiempo de reaccin, una hora.

Realizando una comparativa de ONPG y lactosa como sustrato, quedara la siguiente tabla:

Sustrato Vmax (U/mg)

Km (mM)

Ki (mM)

Kcat (!) Kcat/Km (! !)

ONPG Sin inhibidor 8,412 2,301 22,08 9,596 Con inhibidor 8,91 12,806 6,57 23,39 1,83

Lactosa 0,374 2,891 3,595 39,23 13,57 Tabla 12. Constantes cinticas de la enzima -galactosidasa con diferentes sustratos, lactosa y ONPG.

Como vemos en la tabla, la especificidad es ms alta cuando tenemos lactosa como sustrato, que ONPG sin inhibidor. Por lo que si queremos una eficiencia cataltica lo ms alta posible y tenemos ONPG y lactosa, la eleccin debe ser lactosa, ya que conseguiremos mejores resultados. Tambin se observa que la constante de inhibicin es ms alta para ONPG, hecho que se puede explicar sabiendo que aadimos inhibidor a una concentracin de 30mM para la reaccin con ONPG, mientras que para la lactosa, el inhibidor que hay es el que se va creando conforme la reaccin tiene lugar.

Seguidamente analizamos las caractersticas de la enzima cuando se encuentra inmovilizada sobre un lecho de amberlita y observamos cmo la enzima pierde un poco de actividad enzimtica. Por otra parte, como cabe esperar, el porcentaje de enzima inmovilizada cada vez es mayor al aumentar el tiempo de inmovilizacin, llegando a ser de un 86,8% pasada una hora. La masa de enzima inmovilizada fue de 75,89 gramos respecto a un total de 90 gramos de enzima.

Por ltimo se realiz la hidrlisis de lactosa en un biorreactor a escala de laboratorio y se determinaron las conversiones de glucosa. Estas se determinaron experimentalmente y a travs de un software que simula el comportamiento de un reactor. Tanto de una manera como de la otra se observa la misma tendencia, la de aumentar la conversin a glucosa conforme el caudal es menor. Esto es algo muy coherente ya que al disminuir el caudal aumenta el tiempo de residencia y por tanto, la lactosa permanece ms tiempo en el reactor y puede reaccionar ms. Tambin se observa que favorece la disminucin de concentracin inicial de lactosa.

Los resultado obtenidos del software Berkeley-Madonna difieren de los obtenidos experimentalmente, siendo la mayor conversin de aproximadamente un 84% con un caudal de 2,96 mL/min, mientras que para el procedimiento experimental ha sido de un 99% para un caudal de 2,9 mL/min. Esta diferencia puede deberse a errores experimentales en laboratorio junto con la inexactitud con que se miran las conversiones en el software, sumado a haber realizado una media de los caudales para introducirlo en el Berkeley-Madonna.


Habiendo llegado finalmente a todas estas conclusiones, realizando consultas bibliogrficas y analizando los resultados podemos concluir que la enzima -galactosidasa es un buen catalizador para la reaccin de hidrlisis de la lactosa, si se utiliza adecuadamente, a un pH que ronde el valor de 4, una temperatura no muy alta, cerca de los 40C. Preferiblemente con lactosa como sustrato, con la enzima inmovilizada y llevndose a cabo la reaccin a caudales de lactosa bajos y concentraciones iniciales de lactosa bajas.

Esto sera las condiciones ms adecuadas para la hidrlisis de lactosa a escala laboratorio, para emplearlo a escala industrial se tendran que cambiar los caudales y concentraciones iniciales de lactosa por valores mayores, por lo que la conversin a glucosa bajar respecto a la nuestra. Se deberan hacer nuevos ajustes, clculos y experimentos para ver qu parmetros se ajustan mejor para un volumen mayor de suero lactosado.


Bibliografa

[1] M. de, A. Stegelmann, B. Richter, S. Fenselau, C. Laue & J. Schrezenmeir. 2001. Probioticscompensation for lactase insufficiency. Am J Clin Nutr 73:421S-9S. [2] Diabetes y uso de edulcorantes. Sociedad mexicana de nutricin y endocrinologa. [3] Jos Luis Carrillo Aguado. Tratamiento y reutilizacin del suero de leche. [4] Mercasa ediciones. Leche y productos lcteos. Ao 2012. [5] Tc. Magali Parzanese. Tecnologias para la industria alimentaria. Procesamiento de lactosuero. [6] Isabel Castro, Zulma Liliana Daza. Profesor Jorge Castaeda. Utilizacin de suero lcteo (subproducto de la industria lctea), en la elaboracin de una bebida isotnica. Universidad incca de Colombia, proyecto de investigacin. Bogot 2011. Martha [7] Silvina Andrea Regenhardt. Estudio de la inmovilizacin de la -galactosidasa para la reutilizacin de la lactosa del suero de quesera. Ao 2010. Universidad nacional del litoral, facultad de ingeniera qumica. Apartado 1.8. Enzimas para la hidrlisis de la lactosa. [8] Silvina Andrea Regenhardt. Estudio de la inmovilizacin de la -galactosidasa para la reutilizacin de la lactosa del suero de quesera. Ao 2010. Universidad nacional del litoral, facultad de ingeniera qumica. Apartado 1.4. Inmovilizacin de las enzimas. [9] Park YK, De Santi MSS, Pastore M.(2006). Producion and characterization of - galactosidase from Aspergillus Oryzae.

prácticas bioquímica universidad de málaga

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