Universidad VeracruzanaFacultad de Qumica Farmacutica Biolgica

Experiencia EducativaLABORATORIO DE TOXICOLOGA

Prctica propuesta:Ensayo de microncleos en eritrocitos de mamfero in vivo; evaluacin genotxica del levonorgestrol

DocenteDra. Rosa Virginia Garca Rodrguez

EQUIPO No. 6Contreras de la Cruz Jessica Ivonne Martnez Martnez NancyResndiz Fernndez DavidRos Hernndez Karla Gabriela Snchez Santos Ana Karem Fundamento:El ensayo in vivo de microncleos en mamferos se emplea para detectar lesiones provocadas por la sustancia de ensayo en los cromosomas o el aparato mittico de eritroblastos mediante el anlisis de eritrocitos tomados de la mdula sea y/o la sangre perifrica de animales (por lo general roedores). El ensayo de microncleos tiene por objeto determinar las sustancias que ocasionan lesiones citogenticas que dan lugar a la formacin de microncleos con fragmentos de cromosomas o cromosomas enteros retardados. La deteccin de eritrocitos inmaduros (policromticos) micronucleados en la sangre perifrica puede llevarse a cabo en otras especies en las que se haya demostrado que el bazo no es capaz de eliminar los eritrocitos micronucleados o que son suficientemente sensibles para detectar agentes que provocan aberraciones cromosmicas numricas o estructurales. Entre los diversos criterios para distinguir los microncleos figura la determinacin de la presencia o la ausencia de centrmero o de ADN centromrico en los mismos. El parmetro principal es la frecuencia de eritrocitos inmaduros (policromticos) micronucleados. Si los animales se tratan de forma continua durante cuatro semanas o ms, tambin puede emplearse como parmetro en el ensayo el nmero de eritrocitos maduros (normocromticos) con microncleos en la sangre perifrica respecto a un nmero determinado de eritrocitos maduros. Este ensayo est especialmente indicado para evaluar el riesgo mutagnico, ya que permite tomar en consideracin factores del metabolismo in vivo, de la farmacocintica y de los procesos de reparacin del ADN, si bien dichos factores pueden variar segn la especie, el tejido y el aspecto gentico considerado. En el mbito internacional, la evaluacin genotxica de medicamentos sintticos es un requisito de carcter obligatorio y, aunque no existe un consenso generalizado sobre qu tipos y qu cantidad de ensayos de genotoxicidad deben realizarse, existen criterios coincidentes para clasificar en genotxicos o no, a los productos qumicos, de acuerdo a los resultados obtenidos mediante dichos ensayos.Objetivo: Detectar el efecto genotxico del Levonorgestrol a travs del ensayo de microncleos en eritrocitos de ratones. Analizar la consecuencia por el consumo de este anticonceptivo a nivel citogenotxico. El presente mtodo reproduce las directrices del documento OCDE TG 474 sobre el ensayo de microncleos en eritrocitos de mamfero (1997).

Materiales: Levonorgestrol. 0.75 mg. 8 ratones de la cepa rabe de ambos sexos, con un peso aproximado entre 20-30 gramos, con edad de 9 semanas Agua destilada Isfosfamida Cnula para administracin oral Portaobjetos Pipeta Pasteur Colorante Giemsa o Naranja de acridinaMtodo:1. Asignar los animales en 3 grupos experimentales; control positivo (inyectar una sola vez por va intraperitoneal Ifosfamida en dosis de 200 ug), control negativo (agua destilada) y el grupo experimental.Preparacin de la sustancia de ensayo:2. Disolver en 100 ml de agua una pldora de carcter solido (0.75 mg de Levonorgestrol).Dosificacin:3. Tomar 0.06 ml (0.45 ug/kg de peso), aplicar tres veces en forma oral a cada roedor cada 24 horas por 2 das. Prueba de microncleos:4. Transcurridas 36 48 hrs despus de la ltima administracin, obtener sangre perifrica por medio de una puncin en la zona caudal, e inmediatamente realizar un frotis sanguneo y teirlo por tincin de Giemsa o con naranja de acridina.5. Para cada animal, se determina la relacin entre los eritrocitos inmaduros y el total de eritrocitos en un recuento de al menos 1000 eritrocitos. Antes de analizarlos al microscopio, se codifican independientemente todos los portaobjetos, incluidos los controles positivos y negativos. 6. Calcular el porcentaje de toxicidad mediante la relacin de microncleos presentes en eritrocitos y los eritrocitos normocrmicos.

Informe del ensayo:

El informe del ensayo incluir la informacin siguiente:Disolvente o vehculo: motivacin de la eleccin del vehculo; solubilidad y estabilidad de la sustancia de ensayo en el disolvente o vehculo, si se conocen.Animales de ensayo: especie y cepa utilizadas; nmero, edad y sexo de los animales; procedencia, condiciones de alojamiento, alimentacin, etc.; peso de cada animal al principio del ensayo, incluido el intervalo del peso corporal, media y desviacin estndar de cada lote.Condiciones del ensayo: datos de los controles positivos y negativos (vehculo o disolvente); datos relativos al estudio de determinacin del intervalo de dosis, si se ha llevado a cabo; fundamento de la seleccin de la dosis; preparacin de la sustancia de ensayo; administracin de la sustancia de ensayo; fundamento de la eleccin de la va de administracin; mtodos de comprobacin de que la sustancia de ensayo llega al torrente circulatorio o al tejido diana, en su caso; conversin de la concentracin de la sustancia de ensayo en el agua ingerida y/o la dieta (ppm) en la dosis real (mg/kg de peso corporal/da), si procede; calidad de los alimentos y el agua; descripcin detallada de las pautas de tratamiento y toma de muestras; mtodos de preparacin de los portaobjetos; mtodos de determinacin de la toxicidad; criterios de recuento de los eritrocitos inmaduros micronucleados; nmero de clulas analizadas por animal; criterios empleados para considerar que los resultados de los estudios son positivos, negativos o dudosos.Resultados: signos de toxicidad; proporcin de eritrocitos inmaduros respecto al total de eritrocitos; nmero de eritrocitos inmaduros micronucleados observados en cada animal; media + desviacin estndar de eritrocitos inmaduros micronucleados de cada lote; relacin dosis-respuesta, cuando sea posible; anlisis estadsticos y mtodos aplicados; datos de los controles histricos negativos y los realizados en paralelo al ensayo; datos de los controles positivos realizados en paralelo.

Bibliografa: The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (1992). Micronucleus Test with Mouse Peripheral Blood Erythrocytes by Acridine Orange Supravital Staining: The Summary Report of the 5th Collaborative Study by CSGMT/JEMMS. MMS. Mutation Res., 278, 83-98. MacGregor, J.T., Heddle, J.A. Hite, M., Margolin, G.H., Ramel, C., Salamone, M.F., Tice, R.R. y Wild, D. (1987) Guidelines for the Conduct of Micronucleus Assays in Mammalian Bone Marrow Erytrocytes. Mutation Res. 189: 103-112. Mac Gregor, J.T., Wehr, C.M., Henika, P.R. y Shelby, M.E. (1990). The in vivo Erythrocyte Micronucleus Test: Measurement at Steady State Increases Assay Efficiency and Permits Integration with Toxicity Studies. Fund. Appl. Toxicol. 14: 513-522. Hayashi, M., Morita, T., Kodama, Y., Sofuni, T. y Ishidate, M. Jr. (1990). The Micronucleus Assay with Mouse Peripheral Blood Reticulocytes Using Acridine Orange-Coated Slides. Mutation Res., 245, 245-249. Mavournin, K.H., Blakey, D.H., Cimino, M.C., Salamone, M.F. y Heddle, J.A. (1990). The In Vivo Micronucleus Assay in Mammalian Bone Marrow and Peripheral Blood. A report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program, Mutation Res., 239, 29-80. MacGregor, J.T., Schlegel, R. Choy, W.N. y Wehr, C.M. (1983). Micronuclei in Circulating Erythrocytes: A Rapid Screen for Chromosomal Damage During Routine Toxicity Testing in Mice. En: Developments in Science and Practice of Toxicology, ed. A.W. Hayes, R.C. Schnell y T.S. Miya, Elsevier, Amsterdam, 555-558. Schmid, W. (1975). The Micronucleus Test, Mutation Res., 31, 9-15.