POTENTIAL ROLE OF FETO-PLACENTAL MOSAICISM IN FALSE POSITIVE AND FALSE NEGATIVE NON-INVASIVE PRENATAL SCREENING (NIPS) FOR COMMON ANEUPLOIDIES: EVALUATION FROM AN EXPERIENCE OF 52673

FIRST TRIMESTER CYTOGENETIC PRENATAL DIAGNOSES.

RUOLO POTENZIALE DEI MOSAICISMI FETO-PLACENTARI NEL FALSO POSITIVO E FALSO NEGATIVO NEGLI SCREENING PRENATALI NON INVASIVI (NIPS) PER LA TRISOMIA 21, 18 E 13: VALUTAZIONE DA UNA ESPERIENZA DI 52.673 DIAGNOSI

PRENATALI CITOGENETICHE DEL PRIMO TRIMESTRE

1 Research & Development, Cytogenetics, Molecular Cytogenetics and Molecular Biology, TOMA Advanced Biomedical Assays, S.p.A., Busto Arsizio (VA)

2 Albert Einstein University, Bronx, NY, United States

3 Columbia University Medical Center, New York, NY, United States

While the non invasive prenatal screening (NIPS) test is described as ‘fetal’ screening test and authors will refer to cell free

fetal DNA (cffDNA)1,2, over 99% of the cffDNA circulating in maternal plasma, originates from apoptosis of cytotrophoblasts

and syncytiotrophoblasts3,4,5 , cells which are placental in origin. Therefore, NIPS discordant findings may result from placental

mosaicism. False-positive (FP) and false negative (FN) results are emerging and concern regarding the paucity of scientific data,

performance characteristics and clinical utility of NIPS are now being raised6,7.

The aim of this study is to calculate the contribution of feto-placental mosaicism to the FP and FN rates of NIPS using a retrospective audit of 52,673 CVS samples in which

cytogenetic analysis of the cytotrophoblast and villus mesenchyme has been routinely performed.

After approval of the TOMA laboratory Institutional Review Board (IRB), a retrospective cytogenetic audit of

52,673 consecutive prenatal diagnoses of CVS analysed by the TOMA laboratory in a 13 year period (May 2000-

May 2013) was performed. Cases underwent similar procedures using homogeneous evaluation criteria and

procedures in agreement with the Italian and European guidelines as previously reported.8,9,10 In mosaic cases,

a confirmatory amniocentesis was always recommended. After a follow-up amniocentesis, mosaic cases were

classified according to the distribution of the abnormal cell line. Categorization details are available in Table 1.

To calculate the potential contribution of mosaic conditions to the FP and FN rates of NIPS we only conside-

red mosaics in which cytotrophoblast was cytogenetically discrepant from fetus: CPM1 and 3 can be potential

sources of FP while TFM5 can be a potential source of FN results (see Table 1).

FP and FN rates for each chromosome abnormality was calculated by applying the following formulas (95%CI

was also calculated):

FP rate= (number of FP(CPM1+CPM3))/(true negatives+FP(CPM1+CPM3)) (FP rate was calculated stratifying by percent of mosaicism);

FN rate= (number of FN(TFM5))/(true positive cases+FN(TFM5)).

Only mosaics involving those chromosome imbalances specifically targeted or potentially identifiable by actual NIPS were considered: trisomies 13, 18, 21, monosomy X, 47,+i(13q),

47,+i(21q), 47,XXX/XXY/XYY, 46,X,del(Xq), 46,X,i(Xq), mos 45,X/47,XXX, and 47,+i(18p). In this calculation 47,+i(13q) and 47,+i(21q) were counted as T13 and T21, respectively.

Counseling issues

As this screening test is being utilized on a more frequent basis in a larger population, providers must be able to inform

patients regarding its limitations, including the risk of a false positive or false negative screen result. Patients undergoing CVS are

still counseled that the tissue being sampled is not fetal and mosaic conditions can occur. As a result, patients are made aware

that there is a small chance of a discrepancy that may require further confirmation through amniocentesis. Likewise, NIPS on

ccfDNA analysis is actually a ‘placental assay’.

Comparable to CVS counselling, a ‘positive’ NIPS test may only reflect the cytotrophoblast and not fetal karyotype and

therefore must always be confirmed by invasive testing (Table 1). Likewise, physicians must include in NIPS counseling that the

outer placental cellular layer may be normal but the fetus still affected and therefore a negative NIPS may be relatively reassuring

due to a generally high negative predictive value (NPV), but NIPS cannot completely rule out an abnormal fetal karyotype, even

for the limited disorders being tested.

Counseling pre-test

Dato che questi test di screening sono proposti ed utilizzati di fatto su una popolazione ampia, coloro che propongono il test devono

essere in grado di informare le pazienti riguardo ai suoi limiti, tra cui il rischio di un risultato falso positivo o falso negativo. Analogamente

a quanto avviene per le pazienti che optano per l’analisi citogenetica del villo coriale, alle quali viene specificato che il tessuto che viene

analizzato non è fetale, che si possono riscontrare condizioni di mosaicismo e che in tali casi potrebbe essere necessaria un’ulteriore con-

ferma attraverso l’amniocentesi, anche per i test NIPS dovrebbe essere spiegato alla gestante che essi sono in realtà analisi della placenta.

Analogamente alla consulenza per l’analisi citogenetica dei villi coriali, un test NIPS “positivo” può riflettere solo la costituzione del

citotrofoblasto e non il cariotipo fetale e pertanto il risultato deve essere sempre confermato da un test invasivo (tabella 1). In aggiunta, si

dovrebbe anche includere nella spiegazione pre-test che lo strato cellulare placentare esterno può essere normale, ma il feto essere affetto

e quindi che un test NIPS negativo può essere relativamente rassicurante grazie all’elevato valore predittivo negativo (VPN), tuttavia non è

possibile escludere con certezza che il feto abbia un cariotipo anormale, anche per il limitato numero di anomalie cromosomiche indagate

dal test NIPS.

The potential contribution to FP from CPM type 1 or 3 with trisomic cell lines ≥10%, ≥20%, ≥30%,…,=100% is reported in Table

2. The FP rate for common trisomies (13,18,21) in cytotrophoblast ranged from 1/443 to 1/1695 cases reported as normal at

10% and 100% mosaicism respectively.

FN cases, related to TFM type 5 involving T13,18 and 21, are projected to occur in 1/107 cases reported as abnormal (95% CI

1/65-1/176); for T13,18,21 and MX in 1/68 abnormal cases (95% CI 1/46-1/99); for all targeted or potentially identifiable chromo-

some abnormalities in 1/61 abnormal cases (95% CI 1/43-1/87). The rate of FN, stratified by type of aneuploidy is: for T13 1/136

(95% CI 1/25-1/770), for T18 1/64 (95% CI 1/30-1/139), for T21 1/135 (95% CI 1/69-1/266) and for MX 1/14 (95% CI 1/8-1/26)

(Table 2).

While the false positive results are mainly dependent on the percentage of mosaicism, on the fetal fraction of the maternal

plasma and on the type of NIPS technology (SNP-based or counting based), the estimated false negative rate due to TFM type

5, with normal cytotrophoblasts, can be considered a reliable estimation, since it is independent from the technical and physio-

logical variants. In the future, deeper sequencing might enable the identification of lower level mosaics and our data provides a

projection of the increase in the false positive rate attri buted to CPM, as the sensitivity of NIPS technologies increases.

CPM1 and 3 contribute to a substantial proportion of the overall FP rate of NIPS; TFM5 may be a major contributor to the

sub-optimal sensitivity. While we can expect further technological and bioinformatic breakthroughs in the future, underlying

placental-fetal genetic mechanisms will never allow 100% sensitivity.

Mentre la frequenza dei risultati falsi positivi sono prevalentemente dipendenti dalla percentuale dei mosaicismo presente nel cito-

trofoblasto, dalla cosiddetta “frazione fetale” nel plasma materno e dal tipo di tecnologia NIPS (SNP-based o counting), la frequenza dei

risultati falsi negativi dovuta TFM tipo 5, con un cititrofoblasto normale, può essere considerato una stima affidabile, poiché è indipen-

dente da altre varianti tecniche e fisiologiche. In futuro, tecnologie di sequenziamento più “profonde” potrebbero consentire l’identifica-

zione di mosaici sempre più bassi e i nostri dati forniscono una proiezione dell’aumento della frequenza dei risultati falsi positivi dovuti

ai CPM all’aumentare della sensibilità delle tecnologie NIPS.

I CPM1 e 3 contribuiscono per una parte sostanziale alla determinazione della frequenza generale dei risultati FP associata ai NIPS; i

TFM5 possono essere considerati un importante contributo alla sensibilità sub-ottimale associata a questi test. Mentre possiamo aspet-

tarci in futuro ulteriori innovazioni tecnologiche e di bioinformatica, i meccanismi fisiologici genetici feto-placentari non permetteranno

comunque di ottenere una sensibilità pari al 100%.

Nonostante lo screening prenatale non invasivo (NIPS) sia descritto come test ‘fetale’ di screening e gli autori si riferiscano a DNA fetale

libero (cffDNA)1,2, oltre il 99% del cffDNA circolante nel plasma materno deriva dalla apoptosi del citotrofoblasto e del sinciziotrofo-

blasto3,4,5, e non proviene direttamente dal feto ma deriva dalla placenta. Pertanto, risultati NIPS discordanti possono originare dalla

presenza di mosaicismi feto-placentari. Risultati falsi negativi (FN) e falsi positivi (FP) iniziano ad essere descritti ed iniziano ad emergere

preoccupazioni per la scarsità di dati scientifici sulle caratteristiche di prestazione degli NIPS e sulla loro utilità clinica6,7.

Lo scopo di questo studio è quello di calcolare il contributo del mosaicismo feto-placentare ai tassi di FP e FN associati a NIPS utilizzando una revisione retrospettiva di 52.673

diagnosi prenatali su villo coriale (CVS) in cui è stata eseguita di routine l’analisi citogenetica del citotrofoblasto in combinazione con quella del mesenchima.

Dopo l’approvazione del comitato etico del laboratorio è stata eseguita una revisione retrospettiva di

52.673 diagnosi prenatali citogenetiche consecutive su CVS analizzati dal laboratorio TOMA in un pe-

riodo di 13 anni (maggio 2000-maggio 2013). I casi sono stati sottoposti a procedure simili utilizzando

i criteri di valutazione omogenei e procedure in accordo con le linee guida italiane ed europee come

riportato precedentemente.8,9,10 Nei casi di mosaico, è stata sempre consigliata un’amniocentesi di

conferma. Dopo l’amniocentesi, i casi di mosaicismo sono stati classificati in base alla distribuzione

della linea cellulare anormale. I dettagli di classificazione sono riportati nella tabella 1.

Per calcolare il potenziale contributo delle condizioni di mosaico alle percentuali di errore FP e FN

nei NIPS abbiamo considerato solo mosaici in cui citotrofoblasto era citogeneticamente discrepante

dal feto: CPM1 e 3 possono essere potenziali fonti di FP, mentre TFM5 può essere una potenziale

fonte di risultati FN (vedere tabella 1).

Le percentuali di errore FP e FN per ogni anomalia cromosomica sono stati calcolati applicando le seguenti formule (è stato anche calcolato il 95% CI):

tasso di FP=1-specificità=(numero di FP (CPM1 + CPM3)) / (veri negativi + FP (CPM1 + CPM3)) (il tasso di FP è stato calcolato stratificando per percentuali di mosaicismo);

tasso di FN=1-sensibilità=(numero di FN (TFM5)) / (veri positivi + FN (TFM5)).

Sono stati considerati solo i mosaici che coinvolgono quegli sbilanciamenti cromosomici specificamente ricercati o potenzialmente identificabili da NIPS: trisomie 13, 18, 21, mo-

nosomia X, 47, + i (13q), 47, + i (21q), 47, XXX / XXY / XYY , 46, X, del (Xq), 46, X, i (Xq), mos 45, X/47, XXX, e 47, + i (18p). In questo calcolo 47, + i (13q) e 47, + i (21q) sono

stati contati come T13 e T21, rispettivamente.

Il potenziale contributo al tasso FP dei CPM tipo 1 e 3 con linee cellulari trisomiche ≥ 10%, ≥ 20%, ≥ 30%, ..., = 100% è riportato in

Tabella 2. La frequenza di errore FP per le trisomie 13,18,21 varia da 1/443 (quando la linea trisomica è presente nel citotrofoblasto con

una percentuale ≥10%) a 1/1695 (quando il citotrofoblasto è completamente anormale, 100%) casi riportati come normali.

La frequenza di errore FN, per T13, 18 e 21 è pari a 1/107 casi anomali (95% CI 1/65-1/176), per T13, 18,21 e MX in 1/68 casi anormali

(95% CI 1/46-1/99), per tutte le anomalie cromosomiche indagate o potenzialmente identificabili in 1/61 casi anormali (95% CI 1/43-

1/87). Il tasso di FN, stratificato per tipo di aneuploidia è: per T13 1/136 (95% CI 1/25-1/770), per T18 1/64 (95% CI 1/30-1/139), per T21

1/135 (95% CI 1/69-1/266) e per MX 1/14 casi anormali (95% CI 1/8-1/26) (Tabella 2).

BACKGROUND

AIM

METHODS

DISCUSSION

CONCLUSIONS CONCLUSIONI

DISCUSSIONE

REFERENCES

RESULTS

INTRODUZIONE

SCOPO

METODI

RISULTATI

Via F. Ferrer 25/27 • 21052 Busto Arsizio (VA) Italy • Tel +39 0331 652911 • Fax +39 0331 652919 • www.tomalab.com

FRANCESCA ROMANA GRATI1, FRANCESCA MALVESTITI1, JOSE CARLOS PINTO B. FERREIRA2, BEATRICE GRIMI1, ELISA GAETANI1, CRISTINA AGRATI1, KOMAL BAJAJ2,

SILVIA MILANI1, FRANCESCA DULCETTI1, SIMONA DE TOFFOL1, VALENTINA ZANATTA1, FEDERICO MAGGI1, RON WAPNER3,

SUSAN GROSS2, GIUSEPPE SIMONI1,DENISE MOLINA GOMES2, FRANÇOIS VIALARD2

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