1

Sveučilište u SplituPrirodoslovno-matematički fakultet

Odjel za kemijuOdjel za kemiju

prof. dr. sc. Maja Pavela-Vrančič

broj mogućih konformacija: 10110

Protein od 100 aminokiselinskih ostataka

može ispitati 1023 konformacija u sekundi

vrijeme potrebno da pronađe optimalnu konformaciju: 1087 s

1 000 000 godina =~ 3,2 x 1013 s

2

model energijskog lijevka: uvijanje proteina ne odvija se jednim jedinim

Konformacije iste energije(visoka entropija, visoka slobodna energija)

Proteini se spontano uvijaju utermodinamski najpovoljniju konformaciju

p j j jmehanizmom - protein se može uvijati različitim putovima i pri tome prolaziti kroz različita međustanja

pravilno uvijanje proteina određuju unutrašnji aminokiselinski ostaci

uvijanje proteina pokreće se putem hidrofobnih interakcija

3D struktura određuje funkciju proteina

slobodnaenergija

entropija

nativni

nativno stanje – biološki aktivni oblik proteina

Energijski lijevakUvijanje proteina u nativno stanje

nativniprotein

Šaperoni: proteini, zvani molekulski pratioci

Neki proteini se ne mogu uvitibez pomoći “šaperona”

sprječavaju asocijaciju proteina u nakupine i taloženje proteina u stanici

pomažu pri savijanju i uvijanju polipeptidnog lanca dostavljaju proteine u odgovarajuće stanične odjeljke dostavljaju oštećene proteine na razgradnju

stresni “heat shock” proteini (Hsp70) u eukariota i prokariota induciraju se u stresnim uvjetima: toplina, hladnoća, manjak

kisika b ć k ji d ij j i iš i obrću procese koji se odvijaju pri povišenim

temperaturama (renaturacija proteina)

šaperonini u prokariota

Hsp60 (GroEL u E. coli) i Hsp10 (GroES u E. coli)

3

Heat-shock proteini (Hsp) stabiliziraju stanične proteine isprječavaju njihovo ireverzibilno oštećenje

b

heat-shock proteini štite novonastali protein od interakcija s okolnim

citoplazmatskim molekulama

od oštećenja

u šaperoninu je protein zaštićen od vanjskih utjecaja do potpunog

mRNA

Hsp70

utjecaja do potpunog uvijanja u nativnu strukturuGroES

GroEL

nativniprotein

djelomično uvijenišaperonin GroEL: dvoslojni disk (2x7

podjedinica) bačvaste strukture s unutrašnjim

Uvijanje proteina pomoću šaperonina(GroEL/GroES)

protein

uvijeniprotein

strukture s unutrašnjim hidrofobnim skupinama

svaka podjedinica vezuje jednu molekulu ATP

hidroliza ATP

nativni protein

Šaperonin pokreće pravilno strukturiranje proteina hidrofobnim interakcijamaIzvor energije: hiroliza ATP

GroES je kapa koja zatvara unutrašnju šupljinu GroEL

4

modifikacija tijekom ili nakon sinteze polipeptidnog lanca

Posttranslacijska modifikacija

modifikacija tijekom ili nakon sinteze polipeptidnog lanca

mijenjaju se fizikalna i kemijska svojstva, konformacija, stabilnost i aktivnost proteina, a samim time i funkcija proteina

150 vrsta posttranslacijskih modifikacija proteolitičko cijepanje proteolitičko cijepanje kovalentna modifikacija glikozilacija metilacija itd.

Proteolitičkim izrezivanjem dijela polipeptidnog lanca, iz neaktivne preteče nastaje aktivni protein

Proinzulin sadrži spojni peptid od 30

aminokiselinskih ostataka

proinzulin(neaktivna preteča)

aminokiselinskih ostataka(C-peptid, engl. connecting)

nastaje od perproinzulina u luminalnom prostoru ER

prenosi se u Golgijev aparat proteoliza spojnog peptida

(veza Arg-Arg na N-kraju i Lys-Arg na C-kraju cijepa se enzimom sličnim tripsinu)

zreli protein: inzulin

proteaza izrezujespojni peptid C

CA B

p )

C

5

Specifični aminokiselinski ostaci u polipeptidnom lancu mogu se kovalentno modificirati fosforilacijom

Ser14 je mjestomodifikacije glikogenfosforilaze, enzimakoji katalizirarazgradnju glikogena

glikogen fosforilaza Ser14-O

O-Ser14

Ser14-OH

Pi

Pi

kinaza

fosfataza

fosforilacijom Ser14, glikogen fosforilaza prelazi iz neaktivnog u aktivni oblik

HO-Ser14

Proteini koji Proteini koji Proteini koji

Razvrstavanje i prijenos proteina

se prenose krozmembranu organela

se prenose krozjezgrine pore

se prenose umješinicama

kloroplast

j

ER

mitohondrij jezgra

Golgi

6

O vrsti sintetiziranog proteina ovisi hoće li ribosom ostati slobodan u citosolu, ili se vezati na membranu ER

Sinteza proteina započinje u citosolu citoplazma na slobodnim ribosomima

sintetiziraju se proteini jezgre i proteini koji se prenose kroz membranu organela

ribosomi vezani za ER sintetiziraju proteine koji se prenose u mješinicama

citoplazma

jezgra

mitohondrij

peroksisom

kloroplast

endoplazmatskiretikulum

Golgijevo tijelo

lizosom sekretornemješinice

endosom

plazma membrana

Ribosomi vezani za ER

Na ribosomima vezanim za endoplazmatski retikulum (ER) sintetiziraju se

proteini ER sekretorni proteini transmembranski proteini proteini organela (lizosoma)

protein

ER

ostaci

proteini organela (lizosoma)

plazmamembrana

lizosomsekretornemješinice

7

Signalni slijed Mjesto izrezivanjasignala peptidazom

Signalni sljedovi omogućuju proteinimaprolaz kroz membranu ER

g jsignala peptidazom

Goveđi hormon rasta

Goveđi proalbumin

Humani proinzulin

Humani -interferon

Humani -fibrinogen

Humani IgG teški lanac

Amilaza štakora

Mišji -fetoprotein

K k šji li i

Sekretorni proteini sadrže amino-terminalne produžetkeod 13-36 pretežno hidrofobnih aminokiselinskih ostataka

Kokošji lizozim

Usmjeravanje proteina u ER

SRP – čestica za prepoznavanje signalnog slijeda(eng. signal recognition particle)

signalnislijed

SRP

(eng. signal recognition particle)

receptorza ribosom

SRP

membranaER

SRP

signalnislijed

GTP

GTP

GTP

GDP+Pi

citosol

SRP je ribonukleoprotein (protein-RNA kompleks)koji u eukariota prepoznaje i prenosi specifične proteine do ER

proteintranslokator(zatvoren)

translokator(otvoren)

SRPreceptor

signalnaproteaza

lumen ER

8

Pravilno uvijeni proteini prenose se u mješinicama

nakupine šaperona s lumen ER

p pnepravilno uvijenimproteinima izlučuju se u citosol

neispravni proteini se obilježavaju ubikvitinom i proteolitički razgrađuju

proteinšaperoni

asocijacijai uvijanje

disocijacijašaperona

neispravnouvijeniprotein

ispravnouvijeniprotein

razgradnjaprijenos u

mješinicama

protein od 76

Ubikvitin obilježava proteine predodređeneza razgradnju

protein od 76 aminokiselinskih ostataka

konzerviran u svim oblicima života

veže se na krajnju amino-skupinu lizinskog ostatka ciljnog proteina ciljnog proteina

9

protein se razmota ATPaznom aktivnošću regulatorne čestice (RP) koristeći energiju

Ubikvitinom obilježeni proteini proteolitički serazgrađuju u proteasomu

regulatorne čestice (RP) koristeći energiju ATP

proteasom razgrađuje endogene proteine:

transkripcijske faktore

proteine virusa i drugih unutarstaničnih parazita

nepravilno uvijene proteine, kao posljedica

ubikvitin

protein

peptidi od ~8

RPj

greške u transkripciji

neispravnosti gena

oštećenja drugim molekulama u citosolu

26S ptoteasom

peptidi od ~8aminokiselinskih

ostatakaATP

AMP + PPi

RP

ugljikohidratni

Tijekom translokacije, na mnoge proteine se ulumenu ER-a kovalentno vežu ugljikohidratni ostaci

glikozilacija povećava hidrofilnost proteina

omogućuje vezanje na receptore

omogućuje šaperoninima prepoznavanje nepravilno uvijenih proteina

ugljikohidratniostaci

glikoprotein

proteina

smanjuje dostupnost proteazama

10

Jedinice ugljikohidrata vezane

N- i O-vezani glikoproteini

N-glikozilacija se odvija u ER

O NH

Asn

za asparagin (Asn) imaju zajedničku unutrašnju strukturu

O-glikozilacija se odvija u Golgijevom tijelu

O

HH

NHH

H

O

CH2OH

C O

CH3

OHH

NH C

O

CH2 CH

NH

C O

CH OH

O

Ser

O-glikozilacija se odvija preko Ser ili Thr

O H

H

NHH

OH

CH2OH

C O

CH3

OHH

H O CH2 CH

NH

C O

Lumen ER

Dolikol pirofosfat: donor ugljikohidratakod N-glikozilacije

dolikol

oligo-saharid

pirofosfatna veza osiguravaenergiju za glikozilaciju

izoprenska zasićenajedinica - izoprenska jedinica

dolikol

Dolikol sadrži dvadesetak izoprenskih podjedinica koje čine hidrofobno sidro

izopren

11

Sinteza oligosaharidne preteče odvija sena lipidnom nosaču

citosol

3. stupanj

okret

1. stupanj: postupno dodavanjeugljikohidratnih podjedinisana citosolnoj strani membrane ER

2. stupanj: flip-flop okret u membrani na luminalnu stranu ER Endoplazmatski retikulum

lumen

okret

okret

1. stupanj

2. stupanj3. stupanj: dodavanje

ugljikohidratnih podjedinica na luminalnoj strani membrane ER dolikol

okret

glukoza

N-acetilglukozamin

manoza

/\/\/\/\/-P dolikol fosfat

Oligosaharil-transferaza prenosi oligosaharidna specifični ostatak Asn u rastućem polipeptidnom lancu

citosolribosom ribosom

dolikol fosfat

oligosahariltransferaza

citosolribosom ribosom

membranaER

membranaER

Asn može primiti oligosaharid samo akoje dio slijeda Asn-X-Ser/Thr

N-acetilglukozamin

lumen ER

manoza

glukoza

oligosahariltransferaza

12

Krajnji oblik glikoproteini poprimaju uGolgijevu tijelu

hrapavi ER

Golgijevo tijelocis

mješinice

N-acetilglukozaminmanoza

mješinice

mješinice

medial

trans

manozagalaktozaglukozasialinska kiselinaL-fukoza

mješinice

Proteini se sortiraju u trans Golgijevom tijelu

trans Golgijevo Proteini s različitim

odredištem obilježavaju se različitim ugljikohidratnim biljezima

trans Golgijevotijelo

prenose sedo organele xxx

povrat u ER prenose se doplazma membrane

do organele

xxx

13

Sekretorni proteini prenose se iz Golgijevog tijela u mješinicama obloženim klatrinom

dinamin

ligand

hrapavi ER

Golgijevo tijelo

cis

Sekretorni proteini:

klatrin

dinaminadaptin

trans

plazma membranasekretorni

protein

Sekretorni proteini:hormonienzimitoksini

antibakterijski peptidi

Topljivi proteini ER-a sadrže C-terminalni KDEL ili MDEL slijed

sekretorni protein

proteini ER-a

receptor zaproteine ER-a

odbjegli proteini ER-a, vraćaju se iz Golgijevog tijela u ER vezanjem na KDEL receptor

povrat cis-Golgi trans-GolgiGolgijevo tijeloi

14

Transmembranski proteini sadržesignalni slijed koji zaustavlja translokaciju u ER

“stop-transfer”slijed prekid

CITOSOL

TIP II

TIP I“ER signalni slijed” i “stop-transfer” slijedza prekid prijenosa u ERC-terminalni kraj proteina ostaje u citosolu,a N-terminalni dio proteina u lumenu ER

j

signalnislijed za ER

Lumen ERpeptidaza

prijenosa

TIP IIunutrašnji “start-transfer” slijedkoji započinje prijenos u ER i koji setrajno usidri u membranu ER-a

unutrašnji“start-transfer”

slijed

Antigenske determinante krvnih gruparazlikuju se po ugljikohidratnim ostacima

fukoza

galaktoza

N-acetil-galaktozamin

N-acetil-glukozamin

eritrocit

15

mješinica

Prijenos integralnih membranskih proteina

1. ER: translacija i početna glikozilacija

2. Golgijevo tijelo: nastavak glikozilacije

3. stapanje s membranom

l

ugljikohidrat

mješinica

1.

2.

3.

Golgijevotijelo

ER

Unutrašnja strana membrane ER i ostalih organelaodgovara vanjskoj površini plazma membrane

zreli protein

plazmamembrana

odvija se tako da se očuva pravilna usmjerenost integralnih proteina

vanjska površina

citosol

Stapanje mješinice s membranom

integralnih proteina

luminalna površina mješinice postaje vanjska strana plazma membrane

ugljikohidratne skupine glikoproteina u plazma membrani uvijek se nalaze na njezinoj vanjskoj površini

plazmamembrana

ugljikohidrati

citosolproteini

Glikoproteini na površini stanice

16

Proteini se kovalentno vežu na lipide preko

Proteini usidreni u membranu

proteincitosol izvanstanični

prostor

t ilipide preko izoprenoidne skupine:

farnezil ili geranilgeranil vezani na Cys

masne kiseline: miristoil vezan amidnom vezom na Gly ili palmitoil vezan na Cys

glikoinozitol fosfolipida

manoza

manoza

manoza

manoza

N-acetilglukozamin

N-acetilglukozamin

protein

protein

farnezil sidro

miristoil sidro

S-farnezil

S-geranilgeranil

GPI sidro

Na slobodnim ribosomimasintetiziraju se proteini

jezgre proteinjezgre mitohondrija peroksisoma kloroplasta

protein se otpušta u citosol i zatim prolazi kroz membranu organele

ostaje ucitosolu dostavlja se

u organele

preko jezgrinihporaorganele

jezgra

mitohondrij kloroplast

peroksisom

17

1.signalni slijed

1. odmatanje prekursor

Usmjeravanje proteina u mitohondrij

2.

receptor

j pproteina

2. razmotani protein veže se na receptor i prenosi kroz obje membrane

zreliprotein

proteaza

djelonmično uvijeniprotein

3.

4.

3. uvijanje proteina

4. izrezivanje signalnog slijeda

citoplazma proteini

Oktamerne jezgrine pore

ovojnicajezgre

jezgrajezgrina

pora

molekulska masa < 65 000 Da

Omogućuju ulazak proteina namijenjenih jezgri