POLIFENOLI V SMREKOVI KRESILAČI (Fomitopsis pinicola)

Raziskovalna naloga

biologija, kemija

Avtorici: Manca NOVAK

Zala SERIANZ

Mentorca: Katarina TRONTELJ, univ. dipl. biol. Somentor: dr. Andrej GREGORI

Jesenice, 2016

II

KAZALO VSEBINE

KAZALO VSEBINE ........................................................................................................................... II

KAZALO SLIK .................................................................................................................................. III

KAZALO GRAFOV .......................................................................................................................... III

KAZALO TABEL .............................................................................................................................. III

POVZETEK ................................................................................................................................................ V

ABSTRACT ................................................................................................................................................ V

1. UVOD ............................................................................................................................................... 1

2. TEORETIČNI DEL ............................................................................................................................... 2

2.1 GLIVE ..................................................................................................................................... 2

2.1.1 Delitev gliv ............................................................................................................................ 2

2.1.2 Razmnoževanje višjih gliv ........................................................................................... 3

2.1.3 Uporaba gliv................................................................................................................... 3

2.1.4 Gobe v Sloveniji ............................................................................................................ 3

2.2 SMREKOVA KRESILAČA ........................................................................................................ 4

2.2.1 Taksonomska uvrstitev ...................................................................................................... 4

2.2.2 Opis smrekove kresilače ................................................................................................... 4

2.2.3 Rastišče ................................................................................................................................ 4

2.2.4 Uporaba smrekove kresilače ............................................................................................ 4

2.3 UČINKOVINE IZ GOB ............................................................................................................... 5

2.4 SEKUNDARNI METABOLITI ................................................................................................... 5

2.4.1 Fenoli .................................................................................................................................... 5

3. EKSPERIMENTALNI DEL ................................................................................................................... 7

3.1 METODOLOGIJA....................................................................................................................... 7

3.1.1 Opis vzorca raziskave ........................................................................................................ 7

3.1.2 Ekstrakcija polifenolov ....................................................................................................... 8

3.1.2 Spektrofotometrija ............................................................................................................... 8

3.1.3 Opis postopka zbiranja podatkov .................................................................................... 9

3.2 REZULTATI ................................................................................................................................... 10

4. RAZPRAVA ..................................................................................................................................... 13

5. ZAKLJUČEK ..................................................................................................................................... 14

6. VIRI IN LITERATURA ....................................................................................................................... 16

III

KAZALO SLIK Slika 1. Razvoj prostotrosnic z neseptiranim bazidijem, ki jo tvorijo plodišča [12] ................. 2

Slika 2. Smrekova kresilača [22] ................................................................................................ 4

Slika 3. Sintetske poti fenolnih spojin. [16] ............................................................................... 6

Slika 4. Plast trosnjaka smrekove kresilače, (Lastni vir) ......................................................................... 7

Slika 5. Tehtanje prahu (Lastni vir) ......................................................................................................... 8

Slika 6. Filtracija (Lastni vir) ..................................................................................................... 8 Slika 7. Ekstrakti (Lastni vir) ..................................................................................................... 8 Slika 8. Rotavapor, izparevanje metanola .................................................................................. 8 1. Slika 9. Vzorci za spektrofotomerjo (Lastni vir) ................................................................ 8

KAZALO GRAFOV Grafikon 1. Umeritvena krivulja z galno kislino .....................................................................10

Grafikon 2. Smrekova kresilača vzorec 1................................ Error! Bookmark not defined. Grafikon 3. Smrekova kresilača vzorec 2..............................................................................13

KAZALO TABEL Tabela 1. Taksonomska klasifikacija ..................................................................................... 4

Tabela 2. Lestvica absorbanc galne kisline ..........................................................................10

Tabela 3. Lestvica absorbanc in koncentratov prvega trosnjaka ...........................................11

Tabela 4. Lestvica absorbanc in koncentratov drugega trosnjaka ........................................12

IV

ZAHVALA Najlepše se zahvaljujeva mentorici Katarini Trontelj, univ.dipl.biol., za pripravljenost in navdušenje, za spodbudo, potrpežljivost in pomoč ter za neprecenljivo podporo in pomoč v napornih in poznih urah v laboratoriju. Še posebno bi se radi zahvalili dr. Andreju Gregoriju, ki nama je omogočil delo v laboratoriju podjetja MycoMedica d.o.o., naju vpeljal v svet biokemije in nudil strokovno podporo in pomoč. Hvala tudi za potrpežljivo čiščenje razbite steklovine in odpravljanje vseh ostalih spodrsljajev neizkušenih novink. Predvsem pa za deljenje navdušenja! Hvala tudi vsem profesorjem in ostalemu osebju Gimnazije Jesenice za razumevanje in podporo.

V

POVZETEK

Glive imajo v ekosistemu in tudi v človekovem življenju številne pomembne vloge. Veliko manj pa so poznani njihovi zdravilni učinki, čeprav se nekatere snovi, ki izvirajo iz gliv, že dolgo uporabljajo v farmacevtski industriji. Glive namreč vsebujejo mnoge sekundarne metabolite, med katere spadajo tudi fenoli z antioksidativnim delovanjem, ki imajo verjetno kompleksno zaščitno vlogo, za človeka pa imajo dokazano vrsto zdravilnih učinkov. V raziskovalni nalogi smo se osredotočili na drevesno gobo smrekovo kresilačo (Fomitopsis pinicola), ki pogosto raste tudi v naših gozdovih. Določili smo vsebnost skupnih fenolov v metanolnih ekstraktih posušenih trosnjakov, nabranih z debel v gozdu rastočih smrek. Vsebnost fenolov smo določali po Folin – Ciocalteu-jevi metodi. Naredili smo primerjalno analizo vsebnosti polifenolov glede na starost trosnjaka in oddaljenost od drevesa. Rezultate smo primerjali tudi z vsebnostjo fenolov v znani in dobro raziskani zdravilni glivi svetlikavi pološčenki (Ganoderma lucidum). Ugotovili smo, da največ fenolov vsebuje skorja trosnjaka, ter da so vsebnosti fenolov v smrekovi kresilači nekoliko manjše kot v zdravilni glivi svetlikavi pološčenki. Ključne besede: smrekova kresilača, svetlikava pološčenka, vsebnost fenolov

ABSTRACT Fungi present an important role in the ecosystem and human life. Eventhough, they have been used in pharmaceutical industry, not all medical effects they possess are well researched. Fungi contain many secondary metabolites, including phenolics with antioxidant effects, which probably have complex, protective role and possess an important range of healing properties. In our research project we focused on Fomitopsis pinicola, which grows in our woods. We determined content of total phenolics in methanol extracts of dried fruiting bodies, harvested from spruce trees trunks. Total phenols content was determined using Folin – Ciocalteu´s method. Also comparative analysis of phenolics content was performed, based on fruiting body age and distance from observed tree trunk. Results were compared with the content of phenols in well known and researched medical fungus Ganoderma lucidum. We have come to the conclusion that Fomitopsis pinicola does not contain the same amount of phenolics as well known Ganoderma lucidum, however the highest phenol proportion was determined in the cortex of the Fomitopsis pinicola fruiting body. Key words: Fomitopsis pinicola, Ganoderma lucidum, phenol content, phenolics

1

1. UVOD Že v antičnih časih so bile gobe cenjene kot hrana in tudi kot zdravilo. Zgodnje civilizacije so s poskušanjem začele ločevati gobe na užitne, strupene in celo psihotropne. Predvsem v Evropi jih zaradi njihove ugodne hranilne sestave uživamo kot samostojno jed ter kot prilogo. Gobe so zelo bogat vir beljakovin, vsebujejo jih celo več kot beljakovinsko bogata zelenjava. Poleg tega vsebujejo tudi vlaknine, vitamine, minerale ter malo maščob [15]. V širši javnosti je danes manj poznano njihovo zdravilno delovanje, čeprav so verjetno ljudje uporabljali glive enako daleč v zgodovino kot zdravilne rastline. Najbolje dokumentirano zgodovino uporabe imajo azijske države. Verjetno sta najbolj znani zdravilni gobi shiitake (užitni nazobčanec, Lentinula edodes) in svetlikava pološčenka (Ganoderma lucidum), ki se tradicionalno uporabljata predvsem na Japonskem in Kitajskem, v zadnjem času pa tudi v Evropi. Veliko vlogo pa so različne gobe odigrale tudi v evropskih državah, kjer so njihove vodne ekstrakte, koncentrate, raztopine in prah tradicionalno uporabljali za zdravljenje trebušno-črevesnih bolezni, bronhialno astmo in pri zdravljenju različnih vrstah raka. To je med drugimi znano za vrste čaga Inonotus obliquus, lekarniška kresilača Fomitopsis officinalis, brezova odpadljivka Piptoporus betulinus in bukova kresilka Fomes fomentarius. Danes se zdravilne gobe uživajo kot prehranski dodatki ali kot zdravilni pripravki v obliki tekočih koncentratov ali zdrobljenih posušenih gob v prahu ali kapsulah. Imajo velik potencial pri zdravljenju različnih bolezni, krepitvi imunskega sistema in pri lajšanju stranskih učinkov močnih zdravil. [15] V raziskovalni nalogi smo se posvetili zdravilnim drevesnim gobam, ki so pogoste v naših gozdovih. Tudi te imajo velik zdravilni potencial in so ljudem lažje dostopne, a so njihove učinkovine slabše raziskane kot pri azijskih vrstah. Podobno kot pri rastlinah, lahko tudi pri glivah največ zdravilnih učinkov pripišemo sekundarnim metabolitom. Sekundarni metaboliti so organske spojine, ki jih najdemo pri glivah in rastlinah, kjer imajo vlogo obrambnih in signalnih molekul ali zagotavljajo druge selekcijske prednosti, niso pa neposredno vpleteni v rast, razvoj in razmnoževanje organizma. [5] Največkrat sodelujejo v obrambi pred rastlinojedi, mikrobi, virusi ali drugimi rastlinami. Mednje spadajo tudi polifenoli, ki imajo pomembno vlogo v rastlinski fiziologiji kot antibiotiki, naravni pesticidi, signalne molekule, zaščitna sredstva proti UV žarkom in kot strukturne molekule, pripisujejo pa jim tudi vrsto zdravilnih učinkov na človekov organizem. [16]. Rastline jih v večji meri sintetizirajo pod vplivom stresnih dejavnikov okolja, kot so UV sevanje, povišana temperatura in napad mikroorganizmov.[1] [2] Ti dejavniki sprožijo vrsto encimskih reakcij, ki omogočajo sintezo fenolnih spojin. [1] Polifenole so ugotovili tudi pri zdravilnih glivah. [1] Domnevamo lahko, da imajo vsaj deloma podoben pomen tudi pri njih, ni pa še popolnoma jasno, ali jih glive izdelujejo same ali jih pridobijo iz rastlin, s katerimi so v prehranskem odnosu parazitizma ali simbioze. Na tej osnovi smo si zastavili raziskovalno vprašanje, ali pri nas pogosta gliva smrekova kresilača (Fomitopsis pinicola) v svojih trosnjakih vsebuje primerjivo količino polifenolov, kot znana in dobro raziskana zdravilna gliva svetlikava pološčenka (Ganoderma lucidum). Zanimalo nas je tudi, v katerih delih trosnjaka glede na starost in oddaljenost od debla drevesa je vsebnost polifenolov najvišja. V nobeni literaturi nismo zasledili raziskav na drevesnih gobah, ki bi se lotili raziskovanja vsebnosti polifenolov v trosnjaku po starostnih plasteh (»letnicah«) ter glede na oddaljevanje od debla drevesa, zato je bila naša naloga še posebno zanimiva in bi lahko služila tudi kot osnova za bodoče raziskovanje od kod glivi polifenoli. Hipoteze:

1. Vsebnost fenolov v smrekovi kresilači je primerljiva z vsebnostjo pri glivi Ganoderma lucidum z znanstveno dokazanim zdravilnim učinkom,.

2. Večja vsebnost fenolov je v zunanjih in starejših delih trosnjakov, ker so bolj oziroma dlje časa izpostavljeni vplivom okolja.

Namen raziskovalne naloge je primerjalno raziskati koncentracije celokupnih fenolov glede na oddaljenost od drevesa in starostno plast trosnjaka smrekove kresilače in tako potrditi ali ovreči hipotezi.

2

2. TEORETIČNI DEL

2.1 GLIVE

Glive so heterotrofni organizmi, kar pomeni, da potrebujejo za rast in razvoj organske snovi, v čemer se razlikujejo od rastlin, ki so avtotrofni organizmi in lahko organske snovi proizvajajo v procesu fotosinteze. Ker razkrajajo odmrle organske snovi v naravi, so zelo pomembne pri kroženju snovi v ekosistemih. Sposobne so razgraditi celulozo in lignin, glavni snovi, ki gradita les. Lotijo pa se tudi lesa, ki ga uporablja človek, če ni ustrezno zaščiten. Pri večini gliv celice obdaja celična stena, preko katere prehajajo vse hranilne snovi v topni obliki – v tem se razlikujejo od živali, ki nimajo celičnih sten. Telo gliv je preprosto zgrajeno, ni deferencirano v tkiva in organe, ampak so si celice celotnega organizma med seboj zelo podobne. Celice vegetativnega stadija pravih gliv obdaja celična stena, zgrajena večinoma iz hitina. Kemično je hitin nerazvejan nitast polisharid, ki vsebuje dušik. Pri večini vrst je steljka mnogojedrna ali pa mnogocelična v obliki dolgih nitk – glivnih hif. Preplet hif tvori pogobje (micelij). [9]

Slika 1. Razvoj prostotrosnic z neseptiranim bazidijem, ki jo tvorijo plodišča [12]

2.1.1 Delitev gliv Prave glive delimo glede na zgradbo steljke in načine razmnoževanja na nižje in višje glive. Ta delitev pa ni filogenetska, temveč morfološka: zgradba višjih gliv je popolnejša kot zgradba nižjih, številne višje glive tvorijo tudi posebne razmnoževalne strukture – plodišča ali trosnjake. [9] Glede na način življenja razdelimo glive na gniloživke ( saprofite), zajedalke (parazite) in soživke (simbionte), glede na obliko rasti pa na kvasovke, plesni in gobe. Kvasovke rastejo v obliki nepovezanih kroglastih celic, pri plesnih in gobah pa je organizem sestavljen iz posebnih nitastih struktur, ki jih imenujemo hife. Hife se z rastjo podaljšujejo in prepletajo ter tvorijo micelije. Nekatere vrste oblikujejo iz micelija kompleksne preplete hif, plodišča ali trosnjake, ki se dvignejo nad podlago in jih poznamo kot gobe[15] . Med gobe uvrščamo vse glive, ki tvorijo s prostim očesom vidno plodišče in jih lahko naberemo, plodišče pa lahko nastane podzemno ali nadzemno. Plodišča različnih oblik in barv imajo nalogo razvoja in sproščanja spor. Gobe vključujejo vrste iz dveh taksonomsko različnih skupin: prostotrosnic ( Basidiomycetes) in zaprtotrosnic (Ascomycetes). Hife obojih so sepatirane, kar pomeni večcelične. [14] Za zaprtotrosnice (Ascomycetes) je značilen sporangij, imenovan ask. V njegovi notranjosti – zato ga imenujemo endosporangij – se z

3

mejotsko delitvijo razvijejo nebičkaste askospore. Prostotrosnice sistematsko delimo glede na zgradbo bazidija. Pri skupini, v katero spadajo sneti in rje, je zrel bazidij večceličen (septiran), pri skupini, v katero med drugimi uvrščamo lisičke, mušnice, gobane in prašnice, pa je enoceličen (neseptiran). Prostotrosnice z neseptiranim bazidijem razvijejo plodišča (trosnjake), ki jih laično imenujemo gobe. Del plodišča, kjer se razvijejo spore, imenujemo trosovnica. [12]

2.1.2 Razmnoževanje višjih gliv Spolno razmnoževanje višjih gliv - gob se začne, ko se iz spor razvije gost preplet hif, ki ga imenujemo micelij. Vsaka celica hife vsebuje po eno jedro. Ko se srečata dva kompatibilna micelija, se hife spojijo in izmenjajo jedra. Tak dvojedrni micelij se nato razraste po podlagi in v primernih razmerah temperature, svetlobe in vlage se razvije plodišče, ki ga laično imenujemo goba in v katerem nastanejo sporangiji (askusi pri zaprtotrosnicah in bazdiji pri odprtotrosnicah). V hifah plodišča se jedra združijo, zaradi česar vsebuje posamezna hifa eno diploidno jedro, ki se nato začne mejotsko deliti. Nastanejo štiri haploidna jedra, ki se pomaknejo v posebne strukture – bazidije pri prostotrosnicah in askuse pri zaprtotrosnicah. V bazdijih in askusih se nato razvijejo spolne spore (bazidiospore pri prostotrosnicah in askospore pri zaprtotrosnicah) . Spore raznaša predvsem veter. Razvojni krog se sklene, ko te spore pristanejo na primerni podlagi in znova zrastejo v micelij. Poleg opisanega spolnega razmnoževanja je za nekatere veste zaprtotrosnic in prostotrosnic značilno tudi nespolno razmnoževanje s konidiji na zračnih hifah micelija. Nekatere vrste zaprtotrosnic v neugodnih razmerah tvorijo sklerocij, to je trden in gost preplet hif, ki predstavlja zalogo hrane in jim omogoči preživeti. V ustreznih razmerah iz njega zraste plodišče ali micelij. [15]

2.1.3 Uporaba gliv Glive se najpogosteje uporabljajo v farmacevtski industriji. Nekatere glive izdelujejo antibiotike, ki zavirajo ali preprečujejo razvoj nekaterih vrst bakterij. Z odkritjem in uporabo antibiotikov pri zdravljenju ljudi in živali se je močno zmanjšala smrtnost zaradi nekaterih bolezni, ki jih povzročajo bakterije. Iz rženih rožičkov pridobivajo alkaloide ergotamin in druge, ki vplivajo na krčenje žil in maternice. Glive izdelujejo tudi druge snovi, ki jih lahko uporabljamo v medicini in veterini. V zadnjem času potekajo intenzivne raziskave zdravilnih učinkovin iz višjih gliv. [12]

2.1.4 Gobe v Sloveniji V Sloveniji raste približno 3000 vrst gob, pri čemer so identificirali in popisali 2500 vrst. 650 vrst gob je užitnih in 85 strupenih, od teh pa nekaj smrtno nevarnih. Nekatere zdravilne gobe, ki jih najdemo v Sloveniji so brezova odpadljivka (Piptoporus betulinus), bukova kresilka (Fomes fomentarius), pisana ploskocevka (Trametes versicolor), svetlikava pološčenka (Ganoderma lucidum) in druge. [9][15]

4

2.2 SMREKOVA KRESILAČA

2.2.1 Taksonomska uvrstitev

Tabela 1. Taksonomska klasifikacija

2.2.2 Opis smrekove kresilače Oblika trosnjakov je zelo spremenljiva. Običajno so kopitasti, plutasti in trdi, večletni, široki 10-60 cm in na osnovi, kjer so pritrjeni na les, debeli 5-20 cm. Lahko pa so tanki kot polica, ali resupinatni in sploščeni, v kolikor rastejo na spodnji strani ležečega debla. Skorja na zgornji strani trosnjaka je trda, gladka in pri mladih trosnjakih rumena, nato svetleče rdeča do temno rdeča, kasneje siva do črna, z izrazitimi koncentričnimi gubami. Na trosovnici in na robu mladega in intenzivno razvijajočega se trosnjaka so pogosto kapljice prozorne tekočine. Vzdolž svetlega zunanjega roba trosnjaka je širok ali tanek oranžno do rdeče obarvani pas skorje, ki je pri večini starih in temnih trosnjakih značilno znamenje za to glivo. Drugo značilno znamenje je lastnost skorje, da se stopi in zavre, če jo segrejemo z vžigalico. Trosovnica je iz cevk dolgih do 10 mm, cevke so pri starih trosnjakih razporejene v več plasteh, ki se ločijo med sabo v kolikor trosnjak razlomimo. Površina trosovnice je najprej bela, nato svetlo rumenorjava, stara je svetlo rjava. Pore cevk so okrogle, na milimeter površine trosovnice so 3-4 pore. [10]

2.2.3 Rastišče Raste kot saprofit na lesu iglavcev in listavcev. [11]

2.2.4 Uporaba smrekove kresilače Smrekova kresilača kot živilo ni primerna za uživanje, se jo pa uporablja v tradicionalni medicini, pri čemer trosnjake posušijo, zmeljejo in iz njih pripravijo čaj ali druge pripravke. Te se uporablja za krepitev splošne odpornosti in proti rakavim obolenjem, pri glavobolih in bolečinah v živcih (nevralgije), proti vnetju prebavil, slabosti, pri kronični diareji in griži, zaprtju, kot bljuvalo (emetik), pri težavah z jetri, proti zlatenici, vročini in mrzlici, pri prekomernem uriniranju, proti oblogam na jeziku in kot sredstvo za ustavljanje krvavitev. [9] V raziskavah je ekstrakt smrekove kresilače kazal potencialne protitumorne učinke in učinke proti sladkorni bolezni, triterpeni iz te gobe so delovali protivnetno, antioksidativno in protimikrobno oziroma antibiotično, medtem ko so polisaharidi kazali blagodejne učinke na jetra . [9]

Kraljestvo Fungi

Deblo Basidiomycota

Razred Agaricomycetes

Red Polyporales

Družina Fomitopsidaceae Slika 2. Smrekova kresilača [22]

5

2.3 UČINKOVINE IZ GOB Gobe imajo ugodno hranilno sestavo, predvsem zaradi velike vsebnosti beljakovin in vlaknin in majhne vsebnosti maščob. Sveže gobe vsebujejo od 3 do 21% ogljikovih hidratov, velik delež ogljikovih hidratov pa predstavljajo vlaknine, (3 do 35 % *), ki niso prebavljive, gobe pa so vseeno bogat vir prebavljivih beljakovin, kar (10-40 % *), kar je malo manj kot v mesnih in mlečnih izdelkih. Gobe vsebujejo vse esencialne aminokisline (omejena vsebnost aminokislin z žveplom) in večino mineralov, ki so prisotni v substratu, na katerem rastejo. Prav tako vsebujejo znatne količine fosforja in kalija ter manjše količine kalcija in železa. So odličen vir vitaminov, predvsem kompleksa B ter prekurzorjev vitaminov, kot sta β-karoten in ergosterol. Vsebnost maščob je precej nizka, le 2 do 8% *, predstavljajo pa jih maščobne kisline, mono-, di-, trigliceridi, steroli, sterolni estri in fosfolipidi. Poleg naštetih sestavin najdemo v gobah tudi snovi, ki delujejo zdravilno. Največ jih spada med visoko molekulske polisaharide, manjši delež pa so produkti sekundarnega metabolizma, terpenoli, fenoli in proteini. [14] (*podatki v suhi masi)

2.4 SEKUNDARNI METABOLITI Primarni metaboliti so ogljikovi hidrati, beljakovine, maščobe, nukleinske kisline in vitamini.Ti omogočajo potek kemijskih reakcij, ki so osnova za življenjske procese. V nasprotju s primarnimi metaboliti izostanek sekundarnih metabolitov ne pomeni takojšnje smrti, temveč zgolj dolgoročno oslabitev preživetja, plodnosti in estetike, ali pa ta izostanek morda celo nima opaznega vpliva na organizem. Ljudje rastlinske sekundarne metabolite uporabljajo kot zdravila, arome, začimbe in prehranske dodatke. Digoksin, morfij in kinin so znani rastlinski sekundarni metaboliti, β-laktami (penicilini, cefalosporini), makrolidi (curvularin, zearalenon) in statini (lovastatin, pravastatin) pa so enako dobro poznani glivni sekundarni metaboliti. Čeprav so kemijsko zelo raznoliki, nastanejo vsi sekundarni metaboliti po maloštevilnih biosintetskih poteh, pogosto sočasno z morfološkim razvojem. [5] Sem spadajo flavonoidi, izoprenoidi, stilbeni, tanini, lignin in še nekatere druge. Nekateri pa sodelujejo v obrambnem sistemu glive - ko jo napadejo mikroorganizmi, začne tvoriti obrambne snovi. Sekundarni metaboliti so številne substance z različnimi strukturami. Sekundarni metaboliti delujejo tudi kot antioksidanti in imajo zaščitno vlogo pred premočnim UV sevanjem. [16] Sekundarne metabolite delimo na tri večje razrede: alkaloidi, terpeni in fenoli.

2.4.1 Fenoli Strukturno fenolne spojine sestavljajo en ali več aromatskih obročev, na katere je vezana najmanj ena hidroksilna skupina in se pojavljajo kot preproste fenolne molekule do visoko polimerizirane spojine. [4]. Kljub strukturni raznolikosti se je zanje uveljavilo tudi ime polifenoli, saj so v naravi to običajno spojine z več hidroksilnimi spojinami. Znano je veliko polifenolnih skupin, njihova struktura in sintetska pot s ključnimi encimi je prikazana na sliki.

6

Slika 3. Sintetske poti fenolnih spojin. [16]

Polifenoli so značilni za rastline, ščitijo jih pred rastlinojedci in patogenimi mikroorganizmi. Imajo tudi pomembno vlogo kot antioksidanti, ki nevtralizirajo novonastale proste radikale in jim preprečujejo , da bi vstopali v nadaljne reakcije ter tvorili nove proste radikale. [16] Prosti radikali so atomi, ioni in molekule, ki so zelo nestabilni in nevarni, saj povzročijo neželene kemijske reakcije ter bolezenske spremembe v celicah in tkivih. Fenolne spojine so daleč najbogatejši vir antioksidantov z veliko antioksidativno sposobnostjo. [3] Fenoli imajo pomembno vlogo tudi v človeškem telesu, kot zaščita pred boleznimi, pomagajo pri vnetjih, krepijo imunski sistem, zavirajo alergije in igrajo pomembno vlogo kot antioksidanti. Zmanjšujejo tveganje za razvoj raka, začetni razvoj ateroskleroze, zamotnitev očesne leče, bolezni ki so povezane s kajenjem in druge. [7] Poleg tega zmanjšujejo vidne znake staranja kože, izboljšujejo pretok krvi, krepijo stene žil in ščitijo pred izgubo vida. [17] Z raziskavami v zadnjih letih so ugotovili, da tudi glive kopičijo različne fenolne spojine z imunodulatornimi, kardiovaskularnimi, protidiabetičnimi, protivirusnimi in protitumorskimi lastnostmi. [3] Za določanje fenolnih skupin se največkrat uporablja Folin – Ciocalteaujeva metoda (FC), ki smo jo uporabili tudi mi. Polifenoli v ekstraktih reagirajo s FC reagentom in tvorijo moder kompleks, kateremu lahko s spektrofotomerijo določimo kvaliteto. V večini raziskav uporabljajo to metodo za določanje celokupnih fenolov v rastlinskem ali glivnem materialu. [18,15]

7

3. EKSPERIMENTALNI DEL

3.1 METODOLOGIJA

STEKLOVINA IN PRIBOR

čaše

steklena palčka

lij

epruvete

bučke z ravnim dnom (250mL)

kovinska palčka, žlička

merilni valj (100 mL)

filtrirni papir

steklenice

PRIPOMOČKI PROIZVAJALEC

kavni mlinček

stresalnik

filtriranje s podtlakom

pipeta-avtomatska

tehtnica

spektrofotometer Beckman DU640

uparjalnik (rotavapor)

KEMIKALIJE PROIZVAJALEC

metanol

natrijev karbonat

Folin-Ciocalteau-jev reagent

3.1.1 Opis vzorca raziskave Z debla poškodovane, a še vitalne smreke smo odluščili dve smrekovi kresilači, ki sta bili dovolj veliki, da smo pridobili potrebno število vzorcev. Trosnjake smo razdelili na posamezne plasti (»letnice«), ki jih je gliva ustvarila s postopno rastjo trosnjaka. Te plasti smo nato razdelili še na dva dela glede na oddaljenost od debla drevesa. Nato smo jih posušili na pladnjih na sobni temperaturi. Pred postopkom ekstrakcije smo jih zmleli s kavnim mlinčkom. Ker ima robni del trosnjaka izrazito temno obarvano in trdo »skorjo«, ki se vizualno in na otip razlikuje od preostalega tkiva, smo jo iz dela trosnjaka odluščili in posebej analizirali vsebnost celokupnih fenolov.

Slika 4. Plast trosnjaka smrekove kresilače, (Lastni vir)

8

3.1.2 Ekstrakcija polifenolov Kot topilo za ekstrakcijo smo uporabili metanol. Zatehtali smo 5 g zmletega materiala in ga ekstrahirali s 100 ml metanola. Ekstrakcijo smo izvajali v zaprti 500 ml steklenici, ter zmes 3h stresali s stresalnikom (500 / minuto) pri sobni temperaturi. Po končani ekstrakciji smo ekstrakcijsko zmes odfiltrirali s podtlakom preko filtrirnega papirja. Ekstrakt smo posušili do suhega pri znižanem tlaku in temperaturi 50 °C.

Slika 5. Tehtanje prahu (Lastni vir)

Slika 6. Filtracija (Lastni vir)

Slika 7. Ekstrakti (Lastni vir) Slika 8. Rotavapor, izparevanje metanola

(Lastni vir)

3.1.2 Spektrofotometrija Absorbance vzorcev smo merili pri valovni dolžini 760 nm. Za slepi vzorec smo uporabili metanol.

1. Slika 9. Vzorci za spektrofotomerjo (Lastni vir)

9

3.1.3 Opis postopka zbiranja podatkov Umeritvena krivulja Najprej smo pripravili umeritveno krivuljo z osnovno raztopino galne kisline (GA) v metanolu s koncentracijo 0,4 mg/ml (10 mg GA smo zatehtali v 25 ml merilno bučko in razredčili z metanolom do oznake). Nato smo v 10 ml merilne bučke odpipetirali sledeče volumne osnovne raztopine GA: 2,5 ml, 1,75 ml, 1,00 ml, 0,75 ml, 0,50 ml, 0,25 ml, 0,10 ml ter razredčili do oznake z metanolom. Raztopino smo dobro premešali. V stekleničke smo odpipetirali 0,5 ml razredčene GA, dodali 2,5 ml raztopine Folin- Ciocalteu reagenta ter 2 ml raztopine Na2CO3, raztopino premešali in termostatirali v vodni kopeli 5 min pri temperaturi 50 °C. Nato smo raztopine ohladili in izmerili absorbanco pri 760 nm. Hkrati smo pripravili slepi vzorec, kjer smo namesto raztopine GA uporabili metanol. Na osnovi izmerjenih absorbanc smo narisali diagram odvisnosti absorbance (Abs) od koncentracije GA (γGA) v raztopinah (Abs = f (γGA)), ki je prikazan na grafikonu 1. [8]

Ekstrakcija polifenolov

V merilne bučke V= 1ml smo nato zatehtali 2 mg ekstrakta in dopolnili do oznake z metanolom. 0,5 ml raztopine ekstrakta smo odpipetirali v stekleničko, dodali 2,5 ml raztopine Folin- Ciocalteu reagenta (razredčenega z vodo v razmerju 1:10) ter 2 ml raztopine Na2CO3 (75 g/L). Čas za pripravo vzorca ne sme biti daljši od 2 min. Tako pripravljene vzorce smo termostatirali v vodni kopeli 5 min pri temperaturi 50 °C. Raztopine smo nato ohladili in izmerili absorbanco pri 760 nm. Za pripravo kontrolnega vzorca smo namesto raztopine ekstrakta odpipetirali metanol. Kontrolni vzorec smo uporabili za umerjenje spektrofotometra. Koncentracijo totalnih fenolov smo v ekstraktih izračunali s pomočjo umeritvene krivulje GA po sledeči enačbi:

𝐴𝑏𝑠 = a × 𝛾𝐺𝐴 + 𝑏 Kjer je: Abs – absorbanca raztopine vzorca izmerjena pri 760 nm b – odsek premice umeritvene krivulje GA na osi absorbance a – naklon premice umeritvene krivulje GA (ml/mg) γGA – koncentracija GA v raztopini ekstrakta (mg/ml) Rezultate vsebnosti totalnih fenolov izrazimo v mg GA na g ekstrakta (WGA ekstrakta) oz. mg GA na g materiala (WGA materiala) po sledečih enačbah: 𝑊𝐺𝐴 𝑒𝑘𝑠𝑡𝑟𝑎𝑘𝑡 = 𝛾𝐺𝐴 / 𝛾𝑒𝑘𝑠𝑡𝑟𝑎kt × 1000 𝑊𝐺𝐴 Kjer je: γGA – koncentracija GA v raztopini ekstrakta (mg/ml) γekstrakta – koncentracija ekstrakt v raztopini vzorca (mg/ml), ki se izračuna na osnovi mase zatehte ekstrakta (m ekstrakta, v mg), ki smo ga pripravili za analizo γekstrakta [8] [9]

10

3.2 REZULTATI Rezultate izračunanih absorbanc in koncentracij galne kisline smo vpisali v tabelo ter iz nje izpeljali umeritveno krivuljo.

Lestvica absorbanc galne kisline

št. epruvete absorbanca koncentracija [g/mL]

1 0,9585 0,1

2 0,7273 0,07

3 0,3487 0,04

4 0,2584 0,03

5 0,1448 0,02

6 0,0341 0,01

7 0,0048 0,004 Tabela 2. Lestvica absorbanc galne kisline (POLIFENOLI V SMREKOVI KRESILAČI)

Grafikon 1. Umeritvena krivulja z galno kislino (POLIFENOLI V SMREKOVI KRESILAČI)

11

Z izmerjenimi absorbancami smo izračunali koncentracijo polifenolov v vzorcih, po naslednji enačbi: y = k x + n Kjer je: y = absorbanca x = koncentracija k = 10,22 k = - 0,04474

Smrekova kresilača 1. vzorec

Št. epruvete absorbanca Koncentracija [g/mL] WGA ekstrakt [mg/g]

1 1,10707 0,11270 56,35

2 0,5745 0,06059 30,29

3 0,5272 0,05596 27,98

4 0,7217 0,07499 37,49

5 0,6747 0,07040 35,20

povprečje 0,721034 0,074928 37,462 Tabela 3. Lestvica absorbanc in koncentratov prvega trosnjaka (POLIFENOLI V SMREKOVI KRESILAČI)

Grafikon 2. Smrekova kresilača 1. Vzorec (POLIFENOLI V SMREKOVI KRESILAČI)

legenda

1 ..… Najnižja plast (najmlajši del trosnjaka)

5.. Najvišja plast (najstarejši

0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

1 2 3 4 5

Vseb

no

sti

sku

pn

ih f

en

olo

v W

GA

ekstr

akt

[mg

GA

/g e

kstr

akta

]

št. vzorca

Smrekova kresilača 1. vzorec

12

del trosnjaka)

Tabela 4. Lestvica absorbanc in koncentratov drugega trosnjaka (POLIFENOLI V SMREKOVI KRESILAČI)

Smrekova kresilača 2. vzorec

Št. epruvete

absorbanca Koncentracija [g/mL] WGA ekstrakt [mg/g]

1A 0,98107 0,100373 50,19

1B 0,91323 0,09373 46,87

2A 0,5263 0,055875 27,94

2B 0,62248 0,065286 32,64

3 0,6999 0,07286 36,43

4A 0,74273 0,07705 38,53

4B 0,54627 0,05783 28,92

5A 0,5065 0,05394 26,97

5B 0,2445 0,02830 14,15

6A 0,63797 0,06680 33,40

6B 0,6323 0,06624 33,12

7A 0,6342 0,06643 32,15

7B 0,5649 0,05963 29,82

8 0,63373 0,06649 33,24

8S 1,45897 0,14713 73,66

1S 1,44427 0,14554 72,77

povprečje 0,736833 0,076469 38,175

13

Grafikon 3. Smrekova kresilača 2. Vzorec (POLIFENOLI V SMREKOVI KRESILAČI)

legenda A…………. Del trosnjaka bližje deblu drevesa B………… Del trosnjaka stran od debla drevesa 1………… Najnižja plast (najmlajši del trosnjaka) 8………… Najvišja plast (najstarejši del trosnjaka) S................

»Skorja« trosnjaka

4. RAZPRAVA Na prvem grafu rezultatov (Grafikon 2) so vidni rezultati iz petih plasti prvega trosnjaka, ki smo jih ločili na začetku postopka. Na drugem grafu (Grafikon 3) so vidni rezultati osmih plasti drugega, večjega trosnjaka. V drugem trosnjaku smo vsako plast razdelili na dva vzorca glede na oddaljenost od debla drevesa. Izkazalo se je, da je pri obeh trosnjakih vsebnost polifenolov največja v prvi, torej najmlajši (spodnji) plasti. Pri drugem trosnjaku v tej plasti tudi nismo opazili bistvenih razlik med delom bližje deblu in bliže zunanjem robu trosnjaka. Izmerili smo tudi vsebnost polifenolov v »skorji« - izrazito temnejšem robnem delu trosnjaka, ki smo ga odluščili posebej (delčki skorje so bili vzeti iz plasti 1 in iz plasti 8). Meritve so pokazale, da je vsebnost polifenolov v skorji skoraj trikrat večja kot v povprečju tkiva posameznih plasti. Rezultat te meritve nam je pomagal, da smo ugotovili, zakaj je vsebnost fenolov v posameznih plasteh različna. Vzorci posameznih plasti so namreč vsebovali tudi pripadajočo skorjo trosnjaka v različnem deležu, njen delež pa je glede na sorazmerno visoko vsebnost fenolov lahko pomembno vplival na rezultat. Za primerjavo z rezultati drugih raziskav, objavljenih v literaturi, smo izračunali povprečno vrednost vsebnosti fenolov v trosnjakih, ki znaša 37,82 mg GA/g ekstrakta. Podobna raziskava vsebnosti fenolov v več različnih vrstah gob, med njimi tudi smrekove kresilače (Fomitopsis pinicola), je bila opravljena na Poljskem. Vsebnost fenolov v preiskovanih vrstah gob se je gibala med 2,79 in 53,13 mg GA in je bila pri zdravilnih drevesnih gobah precej višja od rezultatov, pridobljenih iz užitnih gob. [20] Poleg te raziskave so na Poljskem naredili enako, vendar ne na povsem istih vrstah gob, oboji pa so vključili tudi smrekovo kresilačo (Fomitopsis pinicola). V obeh raziskavah je bila vsebnost fenolov v smrekovi kresilači

0

10

20

30

40

50

60

70

80

1A 1B 2A 2B 3 4A 4B 5A 5B 6A 6B 7A 7B 8 8S 1S

Vse

bn

ost

i sku

pn

ih f

en

olo

v W

GA

eks

trak

t [m

g G

A/g

e

kstr

akta

]

št. vzorca

Smrekova kresilača 2. vzorec

14

podobna: Pri prvi raziskavi je bila vsebnost fenolov 20.71mg/g, pri drugi pa 21.88 mg/g. [20, 21] V raziskavah so dokazali tudi močan antoksidativni potencial s fenoli bogatih ekstraktov iz trosnjakov gliv. [19]. V naši raziskavi smo torej ugotovili znatno višji delež fenolov v smrekovi kresilači kot v raziskavah poljskih znanstvenikov. Ne vemo, ali je temu vzrok rastišče (višja nadmorska višina), vrsta drevesa, na katerem gliva raste ali morda večji delež skorje trosnjaka v našem vzorcu. Če primerjamo vsebnosti celokupnih fenolov v smrekovi kresilači (Fomitopsis pinicola) in znani zdravilni drevesni gobi svetlikavi pološčenki (Ganoderma lucidum) ugotovimo, da jo slednja znatno prekaša. Podatek iz literature za Ganodermo lucidum navaja, vsebnost polifenolov 52,11 mg GA/g ekstrakta (pridobljen z enakim postopkom hladne ekstrakcije ob uporabi metanola).[8] Naša smrekova kresilača torej vsebuje 27,7% manj fenolov kot svetlikava pološčenka. Zanimivo pa je, da skorja smrekove kresilače vsebuje kar 73,21 mg GA/g ekstrakta, kar je za 40,5 % več kot ekstrakt svetlikave pološčenke. Prvo hipotezo lahko deloma potrdimo: smrekova kresilača vsebuje dovolj fenolov, da jo lahko uvrstimo med zdravilne gobe, vendar pa svetlikave pološčenke ne dosega in le–ta upravičeno slovi kot ena najbolj zdravilnih gob. Na naše drugo vprašanje, ali na vsebnost polifenolov v smrekovi kresilači vpliva starost in oddaljenost dela trosnjaka od drevesa, na podlagi naše raziskovalne naloge ne moremo pritrdilno odgovoriti. Za vpliv oddaljenosti od drevesa, bi morali raziskovalno nalogo še enkrat opraviti z več vzorci in tokrat iz plasti izločiti vse koščke, ki vsebujejo skorjo. Predvidevamo, da bi nam rezultati takšnih izboljšanih meritev pokazali, ali oddaljenost od drevesa vpliva na vsebnost polifenolov. Večja vsebnost fenolov bliže drevesa, (ki se nakazuje v naših rezultatih, vendar ne dovolj zanesljivo) bi lahko pomenila, da gliva sprejema polifenole iz drevesa in jih kasneje nakopiči v svoji skorji. Fenole bi tako gliva kopičila v skorji, ki ima le obrambno in zaščitno vlogo (kot streha pri hiši) za del trosnjaka, kjer se razvijajo spore. Drevo verjetno proizvaja polifenole prav za obrambo pred glivami in mikroorganizmi, saj je zanje značilno, da rastejo na oslabljenih drevesih. Da bi ta razmišljanja potrdili, bi morali raziskati tudi vsebnost fenolov v skorji dreves z glivami in tistih brez ter ugotavljati, katera vsebujejo več fenolov. Zanimivo bi bilo tudi ugotavljati razlike v odzivu drevesa pri zajedavskih in simbiontskih glivah. Po drugi strani pa bi kopičenje fenolov na strani bližje drevesa lahko pojasnili tudi s tem, da se trosnjak ščiti pred razgrajevanjem, zajedavci, bakterijami, mikroorganizmi in drugimi glivami, ki so v razpadajočem lesu. Brez dvomov pa se polifenoli kopičijo v skorji trosnjaka. Verjetno se tako gliva podobno kot rastline ščiti pred izpostavljenostjo dejavnikom okolja in oksidativnim stresom. Oksidativni stres je povezan s povečano verjetnostjo tvorjenja prostih radikalov, ki neugodno vplivajo na celice in tkiva, polifenoli pa so antioksidanti, ki nevtralizirajo proste radikale in jim preprečujejo, da bi vstopali v nadaljne reakcije. [16] Raziskovalna naloga torej odpira zanimiva nadaljnja vprašanja o biokemijski povezanosti dveh pripadnikov različnih kraljestev – glive in drevesa: Ali gliva sama sintetizira fenole, ali jih črpa iz drevesa? Ali ima možnost premeščati polifenole po svojem trosnjaku? Ali je vsebnost fenolov v tkivu glive odvisna tudi od vrste in stanja drevesa, na katerem raste? Glede na vsebnost fenolov bi smrekovo kresilačo priporočili kot domače zdravilo proti vnetju

prebavil, slabosti, pri kronični diareji in griži, zaprtju, pri težavah z jetri, proti zlatenici, vročini

in mrzlici, težavah s sečili in pri prekomernem uriniranju, in kot sredstvo za ustavljanje

krvavitev, pri glavobolih in bolečinah v živcih (nevralgije), za krepitev splošne odpornosti in

proti rakavim obolenjem [9]

5. ZAKLJUČEK

V raziskovalni nalogi smo raziskovali vsebnost celokupnih fenolov v metanolnih ekstraktih posušenih trosnjakov smrekove kresilače (Fomitopsis pinicola). Naša hipoteza je deloma potrjena, saj je vsebnost fenolov dovolj visoka, da jo lahko uvrstimo med zdravilne gobe, je pa povprečna vsebnost polifenolov v trosnjaku smrekove kresilače za 27,74 % manjša kot v gobi z znanstveno dokazanim zdravilnim učinkom svetlikavi pološčenki Ganodermi lucidum.

15

Ugotovili smo tudi, da je vsebnost fenolov v temno obarvanem robnem delu trosnjaka – »skorji« bistveno višja kot v preostalem tkivu in celo presega vrednosti pri svetlikavi pološčenki. Hipoteze o vplivu starosti plasti trosnjaka in oddaljenosti od drevesa na vsebnost polifenolov pa nismo mogli potrditi, ker smo šele na podlagi rezultatov analiz ugotovili, da delež skorje v vzorcu zmletega trosnjaka pomembno vpliva na vsebnost polifenolov. Za potrditev drugega dela hipoteze bi morali ponoviti raziskavo na statistično dovolj velikem vzorcu trosnjakov, z vzorcev pa bi morali tudi odstraniti skorjo in jo posebej analizirati.

16

6. VIRI IN LITERATURA [1] Cannac, M. et. al. Characterization od Phenolic Compounds in Pinus larcio Needles and Their Responses to Perscribed Burnings. Molekules, 2007. ISSN 1420-3049 [2] Maimoona, A. et. al. Analysis of total flavonoids and phenolics in different fractions od bark and needle exctracts of Pinus roxburghii and Pinus wallichiana. Academic Journals, 2011.ISSN 1996-0875 [3] Hasant A., Pervin M., Lim B. O. Acerylcholinesterase Inhibition and in Vitro and in Vivo Antioxidant Activities of Ganoderma lucidum Grown on Germinated Brown Rice. Molecules, 18, 6663-6678, 2013 [4] Gorgiev M. Antioksidativna učinkovitost ekstraktov fenolnih spojin iz pogač oljne ogrščice in lanu. Diplomsko delo. Biotehniška fakulteta. Univerza v Ljubljani, Ljubljana 2009 [5] http://www.gozdis.si/zbgl/2013/asetl-100-3.pdf dostop: 12.2.2016, 13.23 [6] http://botanika.biologija.org/predmeti/BIO-1L-0506-POU_Zbornik.pdf dostop: 12.2.2016, 13.35 [7] http://www.ezdravje.com/zdravje-in-dobro-pocutje/vitamini-in-minerali/vitamini/prosti-radikali/ dostop: 12.2.2016, 13.48 [8] Turk D., Ekstrakcija biološko aktivnih spojin iz Ganoderme lucidum ob uporabi organskih topil. Magistrsko delo. Univerza v Mariboru, Maribor, 2014 [9] Pohleven J., Korošec T., Gregori A., Zdravilne gobe. Mycomedica d.o.o., Podkoren, 2015. [10]file:///C:/Users/user/Downloads/URN-NBN-SI-doc-VGS2QFZ4.pdf dostop: 3.3.2016, 13:57 [11]http://www.gobenabovskem.si/index.php?goba=113&slika=slika1&uredi=parazitske dostop: 3.3.2016, 14:05 [12] Podobnik A. et. al. Biologija: učbenik za splošne gimnazije. Raznolikost živih bitij. 2 izd., Ljubljana, DZS, 2005 [13] https://sl.wikipedia.org/wiki/Penicilini [15] Kreft, S. et. al. Sodobna fitoterapija. Ljubljana, Slovensko farmacevtsko društvo, 2013. ISBN 978-961-92900-5-7 [16] Hedt, W. Plant Biochemistry and Molecular Biology. Oxford, 1997 [17] Pregelj T.. Določanje antioksidantov v zdravilnih zeliščih. Dostopno na naslovu. http://www.digitalna-knjiznica.bf.uni-lj/dn_pregelj_tadeja.pdf [18] Soukupova, J. et. al. Histochemical and biochemical approaches to the study of phenolic compounds and peroxidases in needles in Norway spruce (Picea abies). New phytol, 2001 [19] Chen Y., Wang G., Wang H., Cheng C., Zang G., Guo X., et al. (2014) Phytochemical Profiles and Antioxidant Activities in Six Species of Ramie Leaves. PLoS ONE 9(9): e108140 doi:10.1371/journal.pone.0108140 [PMC free article] [PubMed] [20] Nowacka N., Nowak R., Drozd M., Olech M., Los R., Malm A. (2014) Analysis of phenolic constituents, antiradical and antimicrobial activity of edible mushrooms growing wild in Poland. LWT-Food Sci Technol59: 689–694. [21] Sułkowska-Ziaja K., Muszyńska B., Motyl P., Pasko P., Ekiert H. (2012) Phenolic compounds and antioxidant activity in some species of polyporoid mushrooms from Poland. Int J Med Mushrooms 14: 385–393. [PubMed]

Vir slike na naslovnici: [22] http://www.marn.at/slikovni-arhiv/smrekova-kresilacha.html