2015 BIOENSAYODE

TOXICIDADCON

SEMILLAS DELECHUGA[ BIOQUIMICA ]

Calderon Chipayo, Anthony Camargo Zamora, Claudia Manrique Tito, Anderson Vasquez Cabrera, Andy

DEDICATORIA

Este trabajo está dedicado a todas aquellas personas que buscan mecanismos para remediar aquellos lugares contaminados por hidrocarburos y metales.

INTRODUCCION

Las diversas actividades del hombre ha constituido el frecuente uso de metales pesados los cuales han sido de gran ayuda en la fabricación de productos pero hoy en dia han dejado grandes problemas ecológicos en el ambiente y los seres vivos. El gran poder de contaminación que estos elementos posee un alto riesgo de enfermedades muy dañinas para nuestro sistema.

La técnica del bioensayo busca evaluar y determinar el efecto de agentes físicos y químicos sobre organismos de prueba bajo condiciones experimentales específicas y controladas. Esta técnica la usaremos para evaluar al Plomo a través del crecimiento de las lechugas en su medio.

Esta técnica también puede ser aplicado para la evaluación de la toxicidad de compuestos puros solubles, de aguas superficiales (lagos, ríos), aguas subterráneas, aguas para consumo humano, aguas residuales domésticas e industriales, además de lixiviados de suelos, sedimentos, lodos u otras matrices sólidas.

OBJETIVOS:

Evaluar el comportamiento de la semilla de lechuga para ser utilizada como indicador biológico de contaminación ambiental de plomo en relación a las variables (tiempo, cantidad de contaminante. Agua).

Evaluar el efecto tóxico potencial del plomo como contaminante sobre el crecimiento de la raíz de las semillas de lechuga no permitiendo un óptimo crecimiento, notándose en el momento de la medición de las semillas con diferentes concentraciones de plomo y otras con agua.

Establecer criterios o patrones de calidad de aguas superficiales o efluentes y así poder hacer una mejor evaluación del impacto ambiental y del riesgo ecológico y el monitoreo de las condiciones de un cuerpo de agua.

PRINCIPIO DE LA PRUEBA

“Bioensayo de Toxicidad con semillas de lechuga”

El bioensayo de toxicidad con semillas de lechuga (Lactuca sativa) es una prueba estática de toxicidad aguda (120 horas de exposición) en el que se pueden evaluar los efectos fitotóxicos de compuestos puros o de mezclas complejas en el proceso de germinación de las semillas y en el desarrollo de las plántulas durante los primeros días de crecimiento. Como puntos finales para la evaluación de los efectos fitotóxicos, se determina la inhibición en la germinación y la inhibición en la elongación de la radícula y del hipocotilo.

Es importante destacar que durante el período de germinación y los primeros días 56 Ensayos para agua dulce de desarrollo de la plántula ocurren numerosos procesos fisiológicos en los que la presencia de una sustancia tóxica puede interferir alterando la supervivencia y el desarrollo normal de la planta, siendo por lo tanto una etapa de gran sensibilidad frente a factores externos adversos. Por otra parte, muchas de las reacciones y procesos involucrados son generales para la gran mayoría de las semillas, por lo que la respuesta de esta especie y los datos obtenidos a partir de la aplicación de esta prueba son en gran medida representativos de los efectos en semillas o plántulas en general. El éxito o aptitud de una plántula para establecerse en un ambiente determinado es de gran importancia para garantizar la supervivencia de la especie. La evaluación del desarrollo de la radícula y del hipocotilo constituyen indicadores representativos para determinar la capacidad de establecimiento y desarrollo de la planta.

A diferencia de la prueba tradicional de germinación de semillas, la evaluación del efecto en la elongación de la radícula y del hipocotilo de las plántulas permite ponderar el efecto tóxico de compuestos solubles presentes en niveles de concentración tan bajos que no son suficientes para inhibir la germinación, pero que sin embargo pueden retardar o inhibir completamente los procesos de elongación de la radícula o del hipocotilo, dependiendo ello del modo y sitio de acción del compuesto.

De esta manera, la inhibición en la elongación de la radícula e hipocotilo constituyen indicadores subletales muy sensibles para la evaluación de efectos biológicos en vegetales, aportando información complementaria a la proporcionada al estudiar el efecto en la germinación.

Morfología de la semilla y la plántula de lechuga Lactuca sativa L.

Ensayos de toxicidad aguda con semillas de lechuga 57 ensayo puede ser aplicado para la evaluación de la toxicidad de compuestos puros solubles, de aguas superficiales (lagos, ríos), aguas subterráneas, aguas para consumo humano, aguas residuales domésticas e industriales, además de lixiviados de suelos, sedimentos, lodos u otras matrices sólidas (Bowers et al, 1997; Cheung et al, 1989; Dutka, 1989). A diferencia de otras pruebas en las que se consideran algas o plantas acuáticas sumergidas como organismo de diagnóstico, el bioensayo con semillas permite evaluar la fitotoxicidad de muestras coloreadas o con elevada turbiedad de manera directa y sin necesidad de filtración previa, reduciéndose así las interferencias debidas al pretratamiento y simplificando el procedimiento de prueba. Si bien L. sativa no es una especie representativa de ecosistemas acuáticos, la información generada a partir de esta prueba de toxicidad proporciona datos acerca del posible efecto de los contaminantes en las comunidades vegetales cercanas a las márgenes de cuerpos de agua contaminados, siendo también una especie interesante de considerar por su importancia desde el punto de vista hortícola. Por otra parte, es de fácil y rápida germinación por lo que es posible desarrollar la prueba en pocos días. Este bioensayo de toxicidad ha sido recomendado y aplicado por diferentes organismos de protección ambiental para la evaluación ecotoxicológica de muestras ambientales y compuestos puros, además de la evaluación del efecto fitotóxico de plaguicidas sobre especies no blanco, necesarios para el registro de estos compuestos (OECD, 1984; Wang, 1987; USEPA, 1989). En la incorporación de esta prueba en una batería de bioensayos es importante considerar el compromiso entre la sensibilidad de la especie L. sativa, el reducido tiempo de exposición de la prueba con semillas, los bajos costos asociados y que no requiere equipamiento sofisticado, en particular en la aplicación a muestras ambientales o en el monitoreo de procesos de detoxificación, saneamiento, control de efluentes o reuso de biosólidos.

CONDICIONES RECOMENDADAS PARA LAS PRUEBAS DE TOXICIDAD AGUDA CON LACTUCA SATIVA L.

Tipo de ensayo Estatico Temperatura 20+- 2 °C Calidad de luz Oscuridad Volumen de la solucion de prueba 4 mL Agua de dilucion Agua dura reconstituida Numero de semillas por replica 20 Numero de replicas 3 Duracion de la prueba 120 horas Efecto medido Inhibicion en la elongacion

. de la radicula e hipocotilo.

. Inhibicion en la germinacion Resultado final CE50 o CI50 o % inhibicion Aceptabilidad de los resultados Germinacion > 90%

Control positivo y negativo . de acuerdo con los valores . admitidos en las cartas . control

Control positivo Zn (II) a partir de ZnSO4

METALES PESADOS

Son aquellos cuya densidad es por lo menos cinco veces mayor que la del agua. El término de metal pesado refiere a cualquier elemento químico metálico que tenga una relativa alta densidad y sea tóxico o venenoso en concentraciones

bajas. Los ejemplos de metales pesados o algunos metaloides, incluyen el mercurio (Hg), cadmio (Cd), arsénico (As), cromo (Cr), talio (Tl), y plomo (Pb), entre otros (Lucho et al., 2005a).Los metales pesados se encuentran generalmente como componentes naturales de la corteza terrestre, en forma de minerales, sales u otros compuestos. No pueden ser degradados o destruidos fácilmente de forma natural o biológica ya que no tienen funciones metabólicas específicas para los seres vivos (Abollino et al., 2002).

BIOACUMULACION

Los metales pesados son peligrosos porque tienden a bioacumularse en diferentes cultivos. La bioacumulación significa un aumento en la concentración de un producto químico en un organismo vivo en un cierto plazo de tiempo, comparada a la concentración de dicho producto químico en el ambiente (Angelova et al., 2004).

En el caso de las plantas se incorpora a ellas a través del agua, aire y/o suelo.La absorción de metales pesados por las plantas es generalmente el primer paso para la entrada de éstos en la cadena alimentaria. La absorción y posterioracumulación dependen en primera instancia del movimiento (movilidad de las especies) de los metales desde la solución en el suelo a la raíz de la planta. En plantas, el concepto de bioacumulación se refiere a la agregación de contaminantes; algunos de ellos son más susceptibles a ser fitodisponibles que otros (Kabata-Pendias, 2000).

TOXICIDAD

Los metales pesados pueden clasificarse en dos grupos: Al que pertenecen elementos como Cu, Zn y Cr+3, incluyen aquellos

requeridos por el organismo en dosis moderada, pero que pasan a ser toxicos al superar cierta concentración.

El segundo grupo esta constituido por aquellos metales que no tienen un rol biológico conocido, pero si una clara toxicidad. Ejm: As, Cd, Hg y Pb, y el Cr+6.

La toxicidad del metal depende de su vía de administración y del compuesto químico al que está ligado. La combinación de un metal con un compuesto orgánico puede aumentar o disminuir sus efectos tóxicos sobre las células.

METALES PESADOS EN EL AMBIENTE

Las actividades geológicas naturales, como desgastes de cerros y volcanes, constituyen una fuente de aportaciones importante de metales pesados al suelo.

También las actividades antropogénicas como la industria minera, que está catalogada como una de las actividades industriales más generadora de metales pesados. En el suelo, los metales pesados, pueden estar presentes como iones libres o disponibles, compuestos de sales metálicas solubles o bien, compuestos insolubles o parcialmente solubilizables como óxidos, carbonatos e hidróxidos.

Cuando el contenido de metales pesados en el suelo alcanzan niveles que rebasan los límites máximos permitidos causan efectos inmediatos como inhibición del crecimiento normal y el desarrollo de las plantas, y un disturbio funcional en otros componentes del ambiente así como la disminución de las poblaciones microbianas del suelo, el término que se usa o se empleaes “polución de suelos” (Martín, 2000).

Vía de contaminaciónAguas procedentes de desechos de minas, aguas residuales contaminadas de parques industriales y municipales, filtraciones de presas de jales, etc.

Los factores que influyen en la movilización de metales pesados :

Son características del suelo: pH Potencial redox Composición

iónica de la solución del suelo y lugares acuaticos

Capacidad de intercambio

(catiónico y/o aniónico)

Presencia de carbonatos

Materia orgánica Textura Entre otras

La naturaleza de la contaminación y el origen de los metales y formas de deposición y condiciones medio ambientales producen acidificación, cambios en las condiciones redox, variación de temperatura y humedad en los suelos (Sauquillo et al., 2003).

Vía de los metales pesados en el suelo:

La Primera, quedar retenidos en el suelo, ya sea disueltos en la fase acuosa del suelo u ocupando sitios de intercambio

Segunda, específicamente adsorbidos sobre constituyentes inorgánicos del suelo

Tercera, asociados con la materia orgánica del suelo Cuarta, precipitados como sólidos puros o mixtos.

También pueden ser: Absorbidos por las plantas y así incorporarse a las

cadenas tróficas Pasar a la atmósfera por volatilización Ser movilizados a las aguas superficiales o subterráneas

Consecuencias

La inactivación enzimática por la formación de enlaces entre el metal y los grupos –SH (sulfhidrilos) de las proteínas, causando daños irreversibles en los diferentes organismos.

EL PLOMO

Según Nriagu, (1978) el plomo ha sido el veneno de la antigüedad porque reside en el suelo y, debido a su baja solubilidad, resiste la degradación microbiana; en suma, permanece biodisponible para el futuro. Este se caracteriza por:

Es un miembro del Grupo IVB de la tabla periódica de los elementos.

Tiene dos estados de oxidación, Pb (II) y Pb (IV) Es un elemento estable Para la química ambiental del elemento es dominada por

el ion plumboso (Pb2+). El Pb elemental es un denso metal azul grisáceo (11.3

g/cm3 ) Punto de fusión a 327 °C y de ebullición a 1744 °C. El bajo punto de fusión permitió fundirlo y trabajarlo en las

sociedades primitivas. El metal es muy blando y tiende a deslizarse, por ello,

puede cortar y moldear y durante mucho tiempo ha sido usado sobre tejados o para la fabricación de cañerías.

El plomo metálico es relativamente opaco a la radiación ionizante

Forma un escudo de defensa al trabajar con rayos X y radioisótopos.

CONTAMINACION POR PLOMO

FUENTES NATURALES

El plomo es un elemento relativamente abundante que se encuentra en aire, agua, suelo, plantas y animales. Sus fuentes naturales son:

Erosion del suelo

Desgaste de los depósitos de los minerales de plomo

Emanaciones volcánicas

Su proporción en la corteza terrestre es de aprox. 15ppm (mg/kg) y la cantidad total se estima en 3.8x10´14 toneladas.

FUENTES ANTROPOGENICAS

La principal fuente de difusión del plomo en el ambiente son las actividades antropogénicas. La contaminación por plomo originariamente es debida a la extracción de minerales de plomo del suelo utilizando el calor en los afloramientos naturales. El agua transportada por percolación, lixiviación o escorrentía, es decir, por procesos propios del ciclo hidrológico transporta plomo en pequeñas partículas provenientes de las minas (Laxen y Harrison, 1977).

Las principales fuentes de contaminación por plomo son: Deposición aérea en minas explotadas Gases contaminantes urbanos Partículas de combustible no quemado Deposición de residuos sólidos urbanos Fundición de minerales Efluentes de plantas de reciclaje de baterías industriales Chimeneas de fábricas Aditivos para pinturas y gasolina Uso de municiones militares Procesos de plateado y terminación de metales Uso de fertilizantes

CONSECUENCIAS DEL PLOMO

En la salud humana

El plomo es uno de los cuatro metales que tienen un mayor efecto dañino sobre la salud humana. Este puede entrar en el cuerpo humano por medio de la comida (65%), agua (20%) y aire (15%). Es un veneno bien conocido para los mamíferos y en humanos se teme a los síndromes clínicos de la toxicidad por plomo.

El plomo afecta:

El sistema nervioso humano

La producción de células sanguíneas

Los riñones El sistema

reproductivo La conducta.

La intoxicación producida por el plomo se denomina saturnismo y sus síntomas se manifiestan como la aparición de fatiga, dolores de cabeza, dolores musculares y de estómago, anorexia, estreñimiento y, en su fase más crítica, "cólico del plomo", es decir, calambres abdominales intensos, acompañados de náuseas, vómitos y presión arterial elevada.

El plomo tras entrar al cuerpo humano, circula por la sangre depositándose inicialmente en tejidos blandos, en los huesos (94%) y en otros tejidos (6%), incluido el cerebro, al mismo tiempo en los glóbulos rojos. La exposición humana al plomo por períodos prolongados, mayores o iguales a un año, tiene incidencia en la salud de las personas, pudiendo producir efectos crónicos.

Los efectos en salud del plomo inhalado dependen, entre otros, del tamaño de las partículas.

Particulas con un tamaño menor a 2.5 micrómetros, se depositan en la parte más profunda del sistema respiratorio, alvéolos, desde donde el plomo difunde casi en un 100% al torrente sanguíneo.

Las partículas en un rango de tamaño de 2.5 a 10 micrómetros, se depositan preferentemente en la región traqueobronquial y nasofaríngea.

En el ambiente

Las partículas grandes precipitarán en el suelo o la superficie de aguas, las pequeñas partículas viajarán largas distancias a través del aire y permanecerán en la atmósfera.

Animales:El Plomo se acumula en los cuerpos de los organismos acuáticos y terrestres. Estos experimentarán efectos en su salud por envenenamiento con Plomo.

Los crustáceos son altamente vulnerables al plomo, pues incluso cuando sólo hay pequeñas concentraciones de Plomo presente pueden presentar grandes daños en su salud.

Las funciones en el fitoplancton pueden ser perturbados tras interferir con el Plomo. El fitoplancton es una fuente muy importante de

producción de oxígeno en los océanos y es el alimento de muchas especies marinas.

Suelo:Las funciones del suelo son alteradas por la intervención del Plomo, especialmente en zonas cercanas de las autopistas y tierras de cultivos, donde concentraciones extremas pueden estar presentes. Los organismos del suelo también sufren envenenamiento por Plomo, tras la propagación de las partículas.

Plantas:En la vegetación el plomo se acumula primariamente en las hojas por deposición atmosférica. El plomo presente en la hoja rompe la cutícula y pasa al interior de la misma, se acumula en las vesículas y puede originar efectos como Inhibición de la mitosis y por tanto del crecimiento de la planta. Inhibición de la síntesis del ATP y del rendimiento energético. Disminución de la viabilidad de las semillas

CICLO BIOGEOQUIMICO DEL PLOMO

El plomo, al igual que el mercurio, se encuentra distribuido por todo el planeta con el agravante de ser mucho más abundante. Así, aunque el plomo es algo menos tóxico que el mercurio de forma absoluta, al final la intoxicación por plomo es mucho más probable. Desde 1750, su aumento ha sido gradual y ha ido paralelo al progreso de la revolución industrial,

sufriendo un importante aumento a finales de la segunda guerra mundial como consecuencia de la introducción del plomo en las gasolinas como agente antidetonante. Afortunadamente, la retirada del plomo de las gasolinas permitirá depurar en unas décadas gran parte del plomo presente, pero es necesario considerarlo aún en su ciclo biogeoquímico para entender su distribución actual en el medio ambiente.

FITORREMEDIACIÓN

La fitorremediación (phyto = planta y remediación = mal por corregir), es un proceso que utiliza plantas para remover, transferir, estabilizar, concentrar y/o destruir contaminantes (orgánicos e inorgánicos) en suelos, lodos y sedimentos, y puede aplicarse tanto in situ como ex situ. Los mecanismos de fitorremediación incluyen la rizodegradación, la fitoextracción, la fitodegradación y la fitoestabilización.

La rizodegradación se lleva a cabo en el suelo que rodea a las raíces. Las sustancias excretadas naturalmente por éstas, suministran nutrientes para los microorganismos, mejorando así su actividad biológica.

Durante la fitoextracción, los contaminantes son captados por las raíces (fitoacumulación), y posteriormente éstos son traslocados y/o acumulados hacia los tallos y hojas (fitoextracción).

En la fitoestabilización, las plantas limitan la movilidad y biodisponibilidad de los contaminantes en el suelo, debido a la producción en las raíces de compuestos químicos, que pueden adsorber y/o formar complejos con los contaminantes, inmovilizándolos así en la interfase raíces:suelo.

La fitodegradación consiste en el metabolismo de contaminantes dentro de los tejidos de la planta, a través de enzimas que catalizan su degradación.

La fitorremediación puede aplicarse eficientemente para tratar suelos contaminados con compuestos orgánicos como benceno, tolueno, etilbenceno y xilenos (BTEX); solventes clorados; HAPs; desechos de nitrotolueno; agroquímicos clorados y órganofosforados; además de compuestos inorgánicos como Cd, Cr(VI), Co, Cu, Pb, Ni, Se y Zn. Se ha demostrado también su eficiencia en la remoción de metales radioactivos y tóxicos de suelos y agua. Existen varias limitaciones que deben considerarse para su aplicación:

El tipo de plantas utilizado: determina la profundidad a tratar. Altas concentraciones de contaminantes pueden resultar tóxicas. Puede depender de la estación del año. La toxicidad y biodisponibilidad de los productos de la degradación

no siempre se conocen y pueden movilizarse o bioacumularse en animales.

Cuando las plantas han absorbido los contaminantes acumulados, pueden ser cosechadas y ser desechadas. Si los contaminantes químicos orgánicos se degradan en las moléculas como el dióxido de carbono, las plantas pueden no requerir ningún método especial de disposición. La incineración controlada es el método más común para disponer las plantas

que han absorbido cantidades grandes de contaminantes. Este proceso produce cenizas, que se pueden desechar en los sitios destinados para tal fin. Para las plantas que han absorbido los metales, la incineración controlada produce las cenizas con altos contenidos de metales.

VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE LA FITORREMEDIACIÓN:

En el siguiente cuadro se muestra las principales ventajas que ofrece la fitorremediación, en comparación con otras tecnologías convencionales.

VIAS DE ENTRADA DE LOS NUTRIENTES EN LA RAÍZ

En función de las características estructurales de la raíz, el agua y las sales minerales, una vez que ya han entrado en su interior, pueden seguir dos vías diferentes: la vía A, o vía simplástica, y la vía B , o vía apoplástica.

Vía A o vía simplástica . Vía B o vía apoplásticaUna parte del agua y la mayoría de las sales minerales circulan por el interior de la raíz, hasta los vasos leñosos, a través del citoplasma de las células que forman el parénquima cortical.

La mayor parte del agua y una parte de las sales minerales circulan por el interior de la raíz a través de las paredes celulares y de los espacios intercelulares, hasta llegar a la endodermis.

De una a otra célula pasan a través de las membranas plasmáticas y de los plasmodesmos;las sales minerales lo hacen mediante transporte activo y el agua lo hace por ósmosis.

A partir de aquí, el agua atraviesa la membrana y el citoplasma de las células de la banda de Caspari por ósmosis, mientras que las sales minerales penetran en las células de la endodermis por transporte activo

El conjunto de agua y sales minerales que han llegado hasta el xilema se denomina sabia bruta y será transportada por los vasos leñosos hasta las hojas, donde se utilizará en la fotosíntesis.

FITORREMEDIACION DE MICORRIZAS:

Los HMA son un componente natural de los suelos en la mayoría de los ecosistemas terrestres. Se sabe que más del 80 % de las plantas terrestres son capaces de presentar una asociación simbiótica con ellos y pueden ser considerados como una extensión de las raíces de las plantas ya que amplían

considerablemente el volumen de suelo que puede ser explorado y por ende se incrementa la cantidad de nutrientes que pueden ser obtenidos por la planta (Harrison 1999). El incremento de nutrimentos es más evidente cuando las plantas micorrizadas se encuentran en condiciones adversas para su crecimiento, como es el caso de suelos contaminados con plomo. Bajo esta condición, se ha reportado que en algunos casos las plantas micorrizadas pueden mostrar mayor captación de metales pesados por la raíz y aumentar el transporte de estos a la parte aérea de la planta (fitoextracción) (Rabie 2005), mientras que en otros casos el uso de HMA contribuye a la inmovilización del metal en las raíces de las plantas (Gaur y Andholeya 2004) o en el suelo (González–Chávez et al. 2004) (fitoestabilización). Esto muestra que el resultado de la micorrización de plantas con fines de fitorremediación de suelos contaminados depende de la combinación planta–hongo–metal y está influenciado por las condiciones del suelo.

Las esporas de los HMA normalmente tienen diferente nivel de sensibilidad a la presencia de metales pesados en ausencia de las plantas dependiendo de la especie del hongo. En la fase presimbiótica, Glomus intrarradiceses uno de los hongos micorrízicos que ha mostrado mayor tolerancia a metales como Cd y Pb (Pawlowska y Charvat 2004). En fase simbiótica, este hongo también ha mostrado tolerancia a metales pesados; un ejemplo de ello es la mayor acumulación de Pb en las raíces micorrizadas de Vetiveria zizanioides con dicho hongo (Wong et al. 2007).

Los mecanismos de transporte de Pb en el micelio externo de los HMA han sido poco estudiados. Sin embargo, existen datos que sugieren que el movimiento del

Pb hacia el micelio interno podría ser a través del fósforo. El fósforo en HMA es transportado del micelio externo al interno principalmente en forma de polifosfato (Harrison y Van Buuren 1995, Maldonado–Mendoza et al. 2001). La unión del Pb y polifosfato ha sido observada como un mecanismo de estabilización de Pb en suelo (Gaur y Adholeya 2004). El complejo Pb–polifosfato también ha sido observado en el micelio interno de HMA (Turnau et al. 1993). Por lo tanto, existe la posibilidad de que el Pb sea transportado a la raíz micorrizada vía el micelio externo. Sin embargo, se requiere profundizar aun más en el estudio de los mecanismos del transporte de Pb a través del micelio de HMA.

HONGOS MICORRIZICOS ARBUSCULARES EN LA FITOESTABILIZACIÓN DE PLOMO

La fitoestabilización consiste en inmovilizar metales pesados mediante el uso de especies de plantas tolerantes, con un sistema radicular que provea una buena cobertura de suelo. Las plantas con este tipo de sistemas radiculares pueden acumular una gran cantidad de Pb en las raíces. Además la presencia de HMA puede contribuir a una mayor inmovilización del metal. Entre las posibles estrategias de inmovilización de Pb por el hongo se encuentran: la inmovilización del Pb soluble mediante glicoproteínas secretadas por el hongo, la adsorción del Pb en las paredes celulares y la quelación de metales al interior de la hifa, siendo estas estrategias similares a las utilizadas por las plantas (Gaur y Andholeya 2004).

La glomalina es una glicoproteína insoluble secretada por el hongo que se ha encontrado en el suelo ligada a metales pesados. Para el caso específico de suelos contaminados con Pb se ha logrado extraer hasta 1.12 mg de Pb por gramo de glomalina (González–Chávez et al. 2004) y recientemente se ha observado que la concentración de Pb en la glomalina puede variar entre 0.8 y 15.5 % del total de Pb en el suelo (Vodnik et al.2008).

Por otro lado, es ampliamente conocido que los HMA pueden producir una gran cantidad de micelio externo. También es conocido que la pared celular de este micelio está compuesta mayormente por quitina y que este compuesto estructural provee una eficiente superficie para la adsorción de los metales pesados del suelo (Galliet al. 1994, González–Chávez et al. 2004). Este potencial de adsorción se debe a que las hifas del hongo presentan una mayor afinidad (2 a 4 veces más) que las raíces (Joner et al. 2000), por lo que la inoculación de plantas tolerantes con HMA podrían incrementar significativamente la estabilización de metales pesados contenidos en el suelo.

Otros agentes potenciales de retención del Pb en el micelio de los HMA son las metalotioneinas. En plantas acumuladoras de metales (Clemens 2001) y en hongos ectomicorrízicos (Morselt et al. 1986, Galli et al. 1994) se ha observado la presencia de estos polipéptidos capaces de adsorber metales pesados. Aunque estos compuestos no han sido aún observados en unión con Pb, se ha detectado en el micelio de HMA una alta expresión de un gen que codifica para la síntesis

de este tipo de polipéptido en presencia de metales pesados (Lanfranco et al. 2002).

La absorción e inmovilización del Pb es mayor por las raíces que se encuentran micorrizadas en comparación con las raíces no micorrizadas (Gaur y Andholeya 2004, Chen et al. 2005). La forma en que el metal se incorpora al interior de la raíz micorrizada es desconocida. Sin embargo, el hecho de que se ha observado un aumento en el número de vesículas con el incremento de concentración de Pb en el suelo (Joner et al. 2000) sugiere que el Pb en las raíces micorrizadas podría ser inmovilizado en las vesículas o en el interior del micelio interno.

Se ha documentado la acumulación de metales pesados, tales como Cd, Zn y Cu, en el interior del micelio interno de HMA especialmente en gránulos de polifosfato en el interior de la vacuola (Turnau et al. 1993). En el caso de hongos micorrízicos arbusculares no se ha observado la acumulación de Pb en gránulos de polifosfato. Sin embargo los HMA se caracterizan por adquirir una gran cantidad de fósforo y transportarlo de la solución del suelo al interior de la raíz en forma de polifosfato. Una vez que el polifosfato llega a los arbúsculos, es liberado en la reacción de hidrólisis del polifosfato en las vacuolas de las células (Capaccio y Callow 1982, Saito 1995, Kojima et al. 1998, Ezawa et al. 2001). Lo anterior refleja el gran potencial de los HMA con fines de fitoestabilización. Sin embargo, se desconoce si la mayor estabilización de Pb en las raíces micorrizadas se realiza mediante: a) acumulación de Pb en vesículas, b) absorción en pared celular y en vacuolas en micelio interno, y c) absorción en pared celular y en polipéptidos en micelio externo. Probablemente la estabilización podría darse a través de un mecanismo como el propuesto por Ezawa et al. (2001) para el fósforo, donde el metal pesado podría quedarse en la vacuola o incorporarse a la pared celular del micelio (Fig. 2).

2.5

ABSORCION DE METALES POR LAS PLANTAS

Las plantas han desarrollado mecanismos altamente específicos para absorber y acumular nutrientes, sin embargo, algunos metales y metaloides no esenciales son absorbidos y acumulados en la planta debido a que presente un compartimiento electroquímico similar a los elementos nutritivos requeridos.La absorción de metales pesados por las plantas es comunmente el paso inicual para su entrada en la cadena alimenticia. La absorción y posterior

acumulación dependen del movimiento de los metales desde la solución del suelo a la raiz de la planta, su transporte y movilización hacia las raices y los tallos. Despues de este proceso de absorción en los vegetales, los metales están disponibles para los herbivoros y humanos a traves de la cadena alimenticia. Otro mecanismo de ingreso de sustancias potencialmente tóxicas a las plantas como los metales pesados en mediante la absorción foliar. La disponibilidad a través de las hojas de algunos elementos de traza provenientes de fuentes puede tener un impacto significativo en la contaminación de las plantas y también es de particular importacia en la aplicación de fertilizantes foliares. La absorción foliar es mediada por una fase de penetración cuticular y un mecanismo de carácter metabólico que considera la acumulación de los elementos contra una gradiente de concentración. Las plantas capaces de absorber y acumular metales sobre lo establecido como normal para otras especies en los mismos suelos se llaman hiperacumuladoras generalmente tiene poco biomasa debido a que ellas utilizan más energía en los mecanismos necesarios para adaptarse a altas concentraciones de metal en sus tejidos. La absorción y traslocación de plomo por depositación atomosférica en las hojas puede llegar a ser un 73% - 95% del contenido de plomo total en las plantas de hoja como la lechuga donde tiene un raango de 8 micro gramos de peso seco.

MECANISMOS DE RESPUESTA DE LAS PLANTAS A LA PRESENCIA DE METALES PESADOS

Las plantas tienen diferentes mecanismos de respuesta ante la presencia de compuestos tóxicos como los metales pesados (Reed y Gadd, 1990). Entre ellos, destacan los mecanismos de exclusión, mineralización, reducción, solubilización, acumulación, quelación y translocación (Salt et al., 1995; Lytle et al., 1998). Algunos son pasivos, como la adsorción por exclusión y otros son activos, es decir, que requieren energía metabólica para llevarse a cabo, como la acumulación, translocación o relocalización. La translocación es un tipo de alteración de un patrón de compartamentalización del metal, es decir, algunas plantas translocan o transfieren el exceso de metal a las hojas viejas, otras limitan el transporte de la raíz al tallo.

La vacuola tiene un funcionamiento especial en el almacenamiento de metales. Los iones metálicos se transportan de manera activa al interior del tonoplasto como iones libres o como complejos metal-molécula quelante (Moreno y Devars, 1999).

La pared celular vincula la disminución de permeabilidad de la membrana celular, y en algunas ocasiones activa la extrusión, la absorción por orgánulos y vacuolas o complejación con agentes quelantes tales como las proteínas, por ejemplo, metalotioneínas y fitoquelatinas (Gekeler et al. 1988; Rauser, 1990).

Los procesos de destoxificación que usualmente se conocen son la adsorción y bioacumulación (Verma y Singh, 1995; Sandau et al., 1996; Rehman y Shakoori, 2003; Gin et al., 2002). En años recientes, la habilidad de las plantas para acumular contaminantes ha recibido mayor atención (Black, 1995). Hay informes que indican que algunas especies pueden acumular metales pesados específicos, por ejemplo, Spirodela polyrhiza que acumula Zn (Markert, 1992). Además, se han encontrado algunas especies con la capacidad de acumular altas concentraciones de metales pesados en su biomasa las cuales son llamadas “hiperacumuladoras”.

La hiperacumulación combina los aspectos de adsorción, transporte y translocación de metales. Se considera que existe hiperacumulación en las plantas, cuando la concentración del metal acumulado en los tejidos de las plantas se encuentra en el rango de 0.1-1% del peso seco de

la planta, este porcentaje es particular para diferentes metales (Suresh y Ravishankar, 2004). Hasta la fecha, han sido reportadas más de 430 especies como hiperacumuladoras de metales pesados, desde hierbas anuales hasta arbustos perennes y árboles. Por ejemplo, manglares como Avicenia, han sido reportados como hiperacumulares de cobre, plomo y zinc (Mac y Burchett, 2002).

Las estrategias para evitar que los metales pesados aumenten en las plantas son diversas. Extracelularmente se incluyen las micorrizas, la pared celular y exudados extracelulares. La tolerancia puede además involucrar la membrana plasmática y el citosol. Dentro del protoplasto existe una variedad de mecanismos potenciales, por ejemplo, para la reparación de los daños de estrés se ha involucrado a proteinas de choque térmico o a las metalotioneínas, así como la quelación de metales por ácidos orgánicos, aminoácidos o péptidos, o su compartamentalización a procesos metabólicos para el transporte dentro de la vacuola (Hall, 2002). Esta gama de mecanismos esta resumido en la Figura.

Figura. Resumen de los mecanismos potenciales celulares disponibles para la destoxificación y tolerancia de metales en plantas. 1. Restricción del movimiento del metal a las raíces por micorrizas. 2. Unión a la pared celular y exudados de las raíces. 3. Entrada del flujo reducido frente a la membrana plasmática. 4. Salida activa dentro del apoplasto. 5. Quelación en citosol por varios ligandos. 6. Reparación y protección de la membrana plasmática bajo condiciones de tensión. 7. Transporte del complejo PC-Cd dentro de la vacuola. (Modificado de Marschner, 1995).

ADSORCIÓN DE METALES PESADOS A SUPERFICIES BIOLÓGICAS

La adsorción es un proceso por el cual las moléculas se adhieren a superficies sólidas. La adsorción física no es específica, y las fuerzas que atraen a las moléculas a las superficies de los sólidos son relativamente frágiles. La energía de activación por adsorción física usualmente no es mayor de una Kcal/gmol. En la adsorción, los iones metálicos son secuestrados de la solución a través de algunos mecanismos como intercambio iónico, quelación, adsorción por fuerzas físicas y atrapamiento de iones (Stirk y Staden, 2001).

Se ha reportado que la temperatura puede influenciar al proceso de adsorción (Volesky, 2003). Kuyucak y Volesky (1989), demostraron que el cobalto (Co) adherido a un alga café, (Ascophyllum nodosum) aumentó de un 50 a un 70%, cuando la temperatura incrementó de 4 hasta 23º C.

En general, los mecanismos de remoción son diferentes entre las distintas especies de plantas y estarán determinados por el tipo de metal. Sin embargo, la adsorción es sin duda el mecanismo de remoción extracelular más reportado en plantas acuáticas (Stirk y Staden, 2001).

Por otro lado, la biomasa usualmente contiene más de un tipo de sitios disponibles para el secuestro de metales y el efecto de la temperatura en cada tipo de sitio puede, además, contribuir al total del metal secuestrado. Esto fue confirmado con la adsorción de Cu a una biomasa microbiana saturada con potasio (Weppen y Hornburg, 1995). Para muchos de los metales, el calor de reacción fue constante, independientemente del grado de ocupación de los sitios. Sin embargo, para el Cu el calor de reacción decreció con el aumento del grado de ocupación delos sitios de 27 a 14 KJ/mol, indicando la unión de varios sitios de ligandos o la formación de diferentes tipos de complejos de Cu con la biomasa. Para otros metales pesados, el calor de reacción de adsorción fue entre 7 y 11 KJ/mol, para metales ligeros entre 2.1 y 6 KJ/mol (Weppen y Hornburg, 1995).

Quelantes intracelularesPor otro lado, a nivel intracelular los metales forman complejos con un ligando existente o sintetizado de nuevo, que pueden ser ácidos orgánicos, algunos aminoácidos, metalotioneínas y fitoquelatinas, siendo los dos últimos los más importantes (Rauser, 1999; Cobbett, 2000).

MATERIALES1. Papel toalla2. Tubos de ensayo3. Mascarilla4. Probetas5. Placa Petri6. Lejía 7. Gotero8. Matraz Erlenmeyer9. Bureta10. Agua destilada11. Semillas de lechuga

PROCEDIMIENTO

Preparación de las concentraciones de acetato de plomo

1. Primero prepararemos 4 concentraciones de acetato de plomo a 50mM, 100mM, 150mM y 200mM

Desinfección de las semillas de lechuga y placas petri

2. Primero contamos 100

semillas

3. Una vez que tengamos nuestras semillas, las desinfectamos, mezclando 18ml de agua y 2ml de hipoclorito de sodio

4. La desinfección debe hacerse en una placa Petri limpia y esterilizada( durante 15 minutos)

5. Seguidamente también desinfectamos 5 placas petri, para lo cual mezclamos en un recipiente 900ml de agua y 100ml de hipoclorito de sodio ( durante 25 minutos)

Lavado y secado de las semillas6. Cortamos el papel toalla en formas circulares para usarlo como

papel filtro

7.Seguidamente

lavamos nuestras semillas con agua destilada para poder evitar que queden residuos de hipoclorito en estas

8. Luego ponemos nuestro papel toalla en 5 placas petri

Cultivo de las semillas de lechuga

9. A continuación pondremos 20 semillas en cada placa petri

10. A nuestra 1ra placa le echamos 3ml de agua destilada ( placa de control)

11. Extraemos 3 ml de cada concentración realizada y le echamos a nuestras placas Petri 2,3, 4 y 5 respectivamente

12. Finalmente las dejamos incubar por 72horas( 3dias) a una temperatura

de 22C

RESULTADOS

MEDICIONES DE LA PLACA 1 DE CONTROL:

“Placa Con 20 Semillas + 3ml De Agua”

semillas radicula hipocotilo foliolo1 0,9 0,8 0,42 0,7 0,7 0,33 0,65 1,1 0,44 1,1 0,7 0,45 0,6 0,7 0,36 0,65 0,8 0,37 0,6 0,9 0,38 0,9 0,7 0,39 0,6 0,6 0,3

10 0,8 0,6 0,311 0,8 1,1 0,412 0,7 0,7 0,413 1,1 0,8 0,414 1 1 0,315 1,1 0,6 0,416 0,5 0,5 0,317 1 0,5 0,318 0,6 0,3 0,419 0,5 0,4 0,420 0,5 0,4 0,3

semillas hipocotilo foliolopromedio 0,765 0,695 0,345

desv. Estandar

0,21 0,22 0,051

NOTA: fue la única placa en la cual germinaron las placas.

RESULTADOS GENERALES:

Muestras 1: Agua 2: 3ml de Pb 50M

3. con 3ml de Pb 100mL

4. 3ml de Pb 150ml

5. 3ml de Pb 20ml

TOTAL%

crecimiento 20 0 0 0 0 80%inhibicion 0 20 20 20 20 20%

Nº semillas

Muestras

Se dejó germinar la muestra por 3 días (el tiempo adecuado son 120 horas pero por cuestión de tiempo no se pudo dar). Al examinar la muestra después de este tiempo se observó que solo creció el de la placa control que estaba con agua.

En las placas que contenían la solución del plomo en sus diferentes concentraciones no se observó cambio alguna, esto puede ser por dos motivos el primero que el plomo inhibió el crecimiento de las semillas y el segundo que retraso la germinación de estas.

Debido a que el plomo casusa desordenes en la actividades fisiológicas de la semilla es decir mata poco a poco las células esto depende a la cantidad de la concentración al que esta expuesta (mata eventualmente las células a altas concentraciones), dado que los mayores daños se dan en la actividad enzimática, en su estructura y transporte de oxígeno.

Unos ejemplos de su daño en la semilla son:

A altas concentraciones reduce el número de semillas en germinación y encogimiento del hipocótilo.

Muestras

Nº semillas

Las actividades de un amplio rango de enzimas de diferentes vías metabólicas son afectadas por el plomo. La inhibición del 50 % de la mayoría de enzimas se produce a una concentración de entre 10-5 y 2·10-4 M de plomo.

A nivel celular el plomo tambien inhibe las actividades de enzimas que contienen grupos sulfhidrilo (-SH) necesarios para su actividad

A altas concentraciones, la barrera funcional de plasmalema es dañada y una gran cantidad de plomo penetra dentro de las células.

En las plantas altera la fotosíntesis de las plantas debido a que los cloroplastos son alterados por la toxicidad por plomo causando innumerables efectos adversos.

CONCLUSIONES

Se observó que el plomo tuvo un efecto nocivo contra las plantas inhibiendolas o retardando su germinación, sea esta por el efecto toxico que posee. Esta se pudo comprobar por el análisis fisiológico de la muestra con agua, en la que si germino, mientras que en ninguna de las concentraciones con plomo germino.

La elongación de la radícula o del hipocotilo varían de acuerdo al tipo y cantidad de concentración de una solución.

Algunos metales como el acetato de plomo son abdorvidos y acumulados por plantas (lechuga)debido a que presentan un comportamiento electroquimico .

La sensibilidad de la lechuga (Lactuca sativa L.) en las pruebas de germinación de este estudio, y los antecedentes registrados en la literatura que indican que esta especie es una buena acumuladora de metales pesado, en menor proporción.

Los bioensayos nos permiten determinar y evaluar los efectos en los agentes fisicos y químicos de distintas sustancias.

La temperatura medio óptimo para el desarrollo de la lechuga es de15 a 18 grados.

Cada ves que sea mayor la concentración de un metal será más toxico o perjudicial para el desarrollo de una semilla.

CUESTIONARIO

1. EXPLIQUE COMO SE TRANSPORTA EL Pb EN LA RAIZ DE LA PLANTA.

Hacia la superficie de la raíz el Pb2+ se une a los grupos carboxilo del ácido urónico del mucílago. El mucílago establece una barrera importante protegiendo el sistema radicular del metal

entrante. Algunas de las uniones de los metales son liberadas cuando el mucílago es biodegradado (Morel et al., 1986).Los microorganismos del suelo pueden afectar la disponibilidad del metal pesado por procesos de biosorción, bioacumulación y solubilización. Adicionalmente, las ectomicorrizas pueden influenciar la entrada, transporte y toxicidad del Pb2+ en abeto noruego (Marschner et al. 1996).

Plomo en el apoplasto

PARED CELULAR

La retención de plomo en las raíces está basada en la unión de Pb2+ hacia iones con sitios intercambiables sobre la pared celular formando depósitos en la misma. Esta precipitación extracelular corresponde principalmente a la forma de carbonato de plomo.

La adición de quelantes sintéticos, tal como H-EDTA o EDTA, en combinación con un bajo pH, previene la retención de Pb2+en la pared celular, permitiendo su absorción y translocación hacia la parte aérea (Jarvis y Leung, 2002), siendo la localización del metal mayor en raíces que en otras partes de la planta. El Pb2+ se une fuertemente a los grupos carboxilo del ácido galacturónico y al propio ácido galacturónico en la pared celular, el cual restringe su transporte vía apoplasto (Rudakova et al., 1988).

MEMBRANA PLASMÁTICA

En general, las plantas dicotiledóneas acumulan significativamente altas cantidades de plomo en raíces en comparación con las raíces de las plantas monocotiledóneasEl plomo transportado desde el suelo hacia las células tiene que cruzar la membrana plasmática de las células de la raíz. Una posible vía de transporte de plomo a través de la membrana plasmática parece que es a través de los canales catiónicos de la mísma, tales como canales de Calcio. En este sentido, ha sido caracterizado un canal de Ca+2 operado por voltaje en la membrana plasmática de raíz en trigo y maíz encontraron que el Pb2+ inhibe significativamente el voltaje medido como consecuencia de la actividad de los canales de Ca+2 en el plasmalema de raíces de trigo. La inhibición de los canales de Ca+2 por Pb2+ puede originarse por bloqueo del canal por el Pb2+ o debido a transporte competitivo de Pb2+ a través del canal de Ca+2.Los bloqueadores de los canales del calcio son capaces de inhibir la proliferación celular y la falta de calcio ocasiona la apoptosis o muerte celular.

Por otra parte, el Ca2+ bloquea el transporte de Pb2+ dentro de la raíz y, en consecuencia, disminuye la toxicidad por Pb2+ sobre el crecimiento de la misma. El efecto protector del Ca+2 sobre la toxicidad del Pb2+ puede ser relacionada con su inhibición para ser acumulado el metal pesado en la punta de la raíz, sitio potencialmente blanco de la toxicidad del Pb2+. El Mg2+, a pesar de que bloquea tanto como el calcio la absorción de Pb2+, no mejora la toxicidad por Pb2+ sobre el crecimiento de la raíz tanto como el calcio. Estos resultados sugieren que el efecto protector del Ca+2 sobre la toxicidad del Pb2+ involucra múltiples mecanismos, incluyendo la competición para entrar, y que el Pb2+ y el Cd2+ pueden competir con cationes divalentes por el transporte dentro de las raíces de plantas de arroz.

TRANSPORTE DE PLOMO EN LA RAÍZ DE LA PLANTA

El plomo se mueve predominantemente dentro del apoplasto de la raíz en una forma radial a través del córtex y se acumula cerca de la endodermis. La endodermis actúa como una barrera parcial al movimiento de plomo entre la raíz y la parte aérea. Tal y como muestran la mayoría de datos referidos a la elevada acumulación de plomo en raíces comparada con la de la parte aérea El transporte limitado de plomo desde las raíces hacia otros órganos es debido a la barrera de la endodermis de la raíz.

Parece ser que la banda de Caspari de la endodermis es el mayor factor limitante que restringe el transporte de plomo dentro del tejido del cilindro central.La posibilidad de transporte simplástico del plomo ha sido demostrada en raíces de cebolla e hipocótilos de berro (Wierzbicka, 1987). Altas concentraciones de plomo causan lesiones e interrupción en la función de la barrera del plasmalema tanto en la permeabilidad selectiva del plasmalema como en el tonoplasto.Se ha demostrado que el plomo se retiene más en la superficie del plasmalema que en las paredes celulares. El plomo puede entrar en células dañadas junto con otros componentes como determinados colorantes, los cuales no entran en células no dañadas (Seregin et al., 2004).El patrón de distribución de plomo en la raíz difiere considerablemente dependiendo de concentraciones de plomo y variando según la concentración (Seregin et al., 2004). A bajas concentraciones de plomo predomina el flujo de iones plomo en el apoplasto, mientras que a altas concentraciones, la barrera funcional de plasmalema es dañada y una gran cantidad de plomo penetra dentro de las células.

El contenido de plomo en varios órganos de la planta tiende a decrecer en el siguiente orden: raíces > hojas > tallos > inflorescencia > semillas. Sin embargo, este orden puede presentar variaciones intraespecíficas.

En plantas de cebolla (Allium cepa), el plomo absorbido es localizado en altasConcentraciones en las puntas de la raíz seguidas por partes proximales de la raíz, mientras que bajas concentraciones han sido encontradas en la base de la raíz (Michalak y Wierzbicka, 1998). Las hojas difieren su capacidad para acumular plomo dependiendo de la edad. El máximo contenido de plomo es encontrado en hojas senescentes y el mínimo en hojas jóvenes (Godzik, 1993).Estudios ultraestructurales han revelado que cantidades variables de depósitos de plomo están presentes principalmente en el espacio intercelular, pared celular y vacuolas, mientras que pequeños depósitos de este metal han sido vistos en el retículo endoplasmático, dictiosomas y vesículas derivadas de los mismos. El factor por el cual el plomo es encontrado en el retículo endoplasmático y dictiosomas está aparentemente relacionado con la secreción del metal de la superficie celular dentro de la vacuola. Puesto que una pequeña cantidad de plomo alcanza el

núcleo, cloroplastos y mitocondrias, es lógico suponer que ejerce su efecto tóxico sobre estos orgánulos.

2. EFECTOS BIOLOGICOS DE LA FITOTOXICIDAD DE Pb E PLANTAS EXPUESTAS A ALTAS Y BAJAS CONCENTRACIONES DE Pb.

EFECTOS FISIOLÓGICOS

La fitotoxicidad por plomo ocasiona desordenes en las actividades fisiológicas normales de las plantas hasta matar eventualmente las células a altas concentraciones (Ernst, 1998; Seregin e Ivanov, 2001). Los principales procesos fisiológicos afectados son la actividad enzimática, la nutrición mineral, el potencial hídrico, el estatus hormonal, la estructura de la membrana y el transporte de electrones. Los síntomas de toxicidad por Pb pueden dividirse en síntomas no específicos y específicos.los síntomas visuales no específicos consisten en una inhibición rápida del crecimiento radicular, reducción del área foliar, clorosis y aparición de manchas pardo-rojizas fenólicas en tallos, pecíolos y hojas, y necrosis foliaLos síntomas específicos consisten en una disminución del porcentaje e índice de germinación, de la proporción longitud radicular/parte aérea, del índice de tolerancia a plomo y mercurio, y del peso seco de las raíces y de la parte aérea.

I) A altas concentraciones de Pb

Los efectos ocasionados por el plomo a altas concentraciones son:

Disminución del 14 al 30 % en la germinación de semillas de arroz y reducción del crecimiento de semillas de 13 a 45 % con 1mM Pb (Verma y Dubey, 2003)

Reducción del número de semillas en germinación y encogimiento del hipocótilo de Lupinus (Wozny, et al., 1982).

Inhibición de crecimiento de la raíz a 10-2 - 10-6 M Pb in vitro o con un contenido superior a 10 mg / kg de contenido de plomo en el suelo (Breckle, 1991).

A nivel celular el plomo inhibe las actividades de enzimas que contienen grupos sulfhidrilo (-SH) necesarios para su actividad (Van Assche y Clijsters, 1990).

II) A bajas concentraciones de Pb

Los efectos ocasionados por el plomo a bajas concentraciones son:

Mayor sensibilidad en el desarrollo y la extensión de la raíz principal a diferencia de las raíces laterales (Obroucheva et al., 1998).

Incremento del contenido de plomo en las raíces en relación directa con la concentración en niveles de entre 0.1 y 2 µM de Pb en Picea abies. Paralelamente, cuando se realiza una exposición de las plantas a 0.5 µM de Pb durante 4 semanas se reduce el crecimiento de las raíces primaria, secundaria y terciaria (Godbold y Kettner, 1991).

En semillas se ha observado una fuerte inhibición del crecimiento de la raíz primaria y una corta zona de ramificación cuyas raíces laterales son más compactas, ocupando una posición mucho más íntima en la punta de la raíz con respecto a raíces crecidas en la ausencia de plomo (Obroucheva et al., 1998)

3 DESCRIBA LOS EFECTOS BIOQUIMICOS DEL Pb EN LAS PLANTAS

Efectos bioquímicos

Los primeros estudios sobre la acción del plomo a nivel bioquímico se centraron en descripciones sobre la considerable reducción de la síntesis de DNA, RNA y proteínas en el embrión axial, y en los endospermos de plantas de arroz en germinación sometidos a concentraciones crecientes de plomo Asimismo se ha aceptado que la toxicidad por plomo además de disminuir los niveles del contenido de proteínas en tejidos también causa alteraciones significativas en la composición lipídica En el caso de P. vulgaris y Z. mays se observaron cambios sustanciales a nivel de glucolípidos, especialmente

monogalactosil y diacilgliceroles, los cuales fueron asociados con alteraciones en la permeabilidad de la membrana en los cloroplastos (Stefanov et al., 1993). Específicamente, al incubar cloroplastos con concentraciones constantes de sales de plomo, los niveles de ácidos grasos insaturados ascendieron notablemente con respecto a los ácidos grasos saturados.

Efectos sobre las actividades enzimáticas

Las actividades de un amplio rango de enzimas de diferentes vías metabólicas son afectadas por el plomo. La inhibición del 50 % de la mayoría de enzimas se produce a una concentración de entre 10-5 y 2·10-4 M de plomo. A esta concentración se hace referencia en términos de la constante de inactivación (Ki).La inhibición sobre la actividad enzimática es causada por la interacción de Pb con los grupos sulfidrilo (–SH) que están presentes en el centro activo de los enzimas, los cuales son esenciales para la estabilización de su estructura terciaria. Además, la reacción con los grupos (–SH) puede bloquear los grupos –COOH con iones plomo, lo que parecer también juega un papel importante en la inhibición de la actividad enzimática bajo el tratamiento con este metal (Levina, 1972).El plomo forma un mercáptido con el grupo (–SH) de la cisteína y también forma complejos con grupos fosfato. La inhibición de metaloenzimas bajo tratamiento con plomo parece ser debida a un desplazamiento del metal esencial por plomo. La inhibición de la actividad enzimática debdida al plomo no parece ser especiifica para este metal : tales inhibiciones son también evidente con otros cationes que tienen comparables afinidades por grupos proteicos funcionales. Sin embargo, las actividades de algunos enzimas se han visto incrementadas al ser expuestas a plomo. Tales resultados aparentemente conciernen a cambios en la síntesis enzimática, inmovilización de los inhibidores de los enzimas, o como un resultado efector de moléculas, las cuales son sintetizadas bajo fitotoxicidad con plomo.

PROCESOS ENZIMAS ESPECIES EFECTO REFERENCIAS

METABÓLICOS

VEGETALES DEL Pb

Síntesis de α -amino levulinato Pennisetum ( - ) Prassad &Clorofila dehidrogenasa typhoideum Prassad (1987)

Fijación de CO2 Ribulosa-1,5 bis fosfato

Avena sativa ( - ) Moustakas et al. (1994)

Fosfoenol Zea mays ( - ) Vojtechova

PiruvatoCarboxilasa & Leblova (1991)

Ciclo de Calvin Gliceraldehido 3- Spinach oleracea

( - ) Vallee & Ulmer (1972)

fosfato dehidrogenasa

Spinach oleracea

Ribulosa 5 fosfato

( - ) Vallee & Ulmer (1972)

kinasa Spinach oleraceaVía Pentosa Glucosa 6-fosfato ( - ) Vallee & Ulmer

(1972)Fosfato Dehidrogenasa

Asimilación Nitrato reductasa Cucumis sativus

( - ) Burzynski (1984)

De N2 Glutamina sintetasa

Glicine max ( - ) Lee et al. (1976)

Enzimas Deoxyribonucleasa

Hydrilla ( + ) Jana & Choudhary (1982)

Nucleolíticas verticillataRibonucleasa Hydrilla ( + ) Jana & Choudhari

(1982)verticillata

Hidrólisis de Proteasa Hydrilla ( + ) Jana & Choudhari (1982)

Proteínas verticillataFosfohidrolasa Alcalina fosfatasa Hydrilla ( + ) Jana & Choudhari

(1982)verticillata

Acido fosfatasa Glycine max ( + ) Lee et al. (1976)

Metabolismo α-amilasa Oryza sativa ( - ) Mukherji & Maitra (1977)

De Glucosa Zea maysGeneración de ATP sintetasa ( - ) Tu Shu &

Brouillette (1987)Energía ATPasa Zea mays ( - ) Tu Shu &

Brouillette (1987)Metabolismo Catalasa Oryza sativa ( - ) Verma & Dubey

(2003)Antioxidativo Guiacol

peroxidasaGlicine max ( + ) Lee et al. (1976)

Ascorbato oxidasa

Phaseolus aureus

( + ) Rashid & Mukherjee (1991)

Ascorbato peroxidasa

Oryza sativa ( + ) Verma & Dubey (2003)

Glutatión reductasa

Oryza sativa ( + ) Verma & Dubey (2003)

Superóxido dismutasa

Oryza sativa ( + ) Verma & Dubey (2003)

4 EXPLIQUE LOS EFECTOS DEL PLOMO EN LA FOTOSINTESIS, RESPIRACION Y ABSORCION DE NUTRIENTES.

. EFECTOS SOBRE LA FOTOSÍNTESIS

El proceso de la fotosíntesis de las plantas es alterado en los cloroplastos por la toxicidad por plomo causando innumerables efectos adversos. Sin embargo, se pueden resumir a continuación para facilitar su comprensión:

Disminución de la tasa fotosintética Distorsión de la ultraestructura del cloroplasto Restricción de síntesis de clorofila, plastoquinona y

carotenoides o Obstrucción de transporte de electrones

Inhibición de actividades enzimáticas del ciclo de Calvin. o Deficiencia de CO2 como un resultado de cierre estomático.

Los cloroplastos son los principales órganos indicadores de los daños ocasionados por el plomo sobre el proceso metabólico de la fotosíntesis. Plantas de Ceratophyllum demersum crecidas en medio acuático con Pb (NO3)2 mostraron distintos cambios en la ultraestructura de los cloroplastos (Rebechini y Hanzely, 1974). Las células de las hojas de tales plantas exhibieron reducción de apilamientos de granas junto con una reducción en la cantidad de estroma en relación con la del sistema lamelar. También exhibieron ausencia de granos de almidón. El tratamiento con plomo también cambió la composición lipídica de las membranas tilacoidales en hojas de Zea mays L. (Stefanov et al., 1995).El plomo perjudica la absorción de elementos esenciales tales como hierro y magnesio en plantas de pepino y, como consecuencia, inhibe la síntesis de clorofila(Burzynski, 1987). Estos daños de los aparatos fotosintéticos son debido a la afinidad del plomo por ligandos de proteínas N- y S- (Ahmed y Tajmir-Riahi, 1993). Asimismo se ha observado degradación de la clorofila debido al incremento de la actividad clorofilasa (Drazkiewicz, 1994). También se ha hallado que la clorofila b es más afectada que la clorofila a por tratamiento con plomo en abetos de Noruega (Vodnik et al., 1999).Acerca del efecto sobre la obstrucción del transporte de electrones (Rashid et al., 1994) se sabe que el plomo afecta el sitio donador y el sitio receptor del fotosistema II (PS II), el complejo citocromo b/f y el fotosistema I (PS I). Esto ha sido en su mayor parte aceptado ya que la inhibición del transporte de electrones del PS I es más sensible que la del PS II en cloroplastos de espinaca (Mohanty et al., 1989; Sersen et al., 1998).

El plomo también causa una fuerte disociación del polipéptido extrínseco del complejo disociador de oxigeno del PS II originando desplazamiento de Ca, Cl- y Mn desde este sitio donador del PSII (Rashid et al., 1991). Esto hace proponer que los cambios conformacionales de las LHC II (Light Harvesting Complexes) subunidades fundamentales del PSII, conllevan al no ensamblaje de los componentes redox, de los cofactores y de las proteínas extrínsecas, conduciendo a la degradación de las subunidades PSII (Ahmed y Tajmir-Riahi, 1993). En suma, el plomo in vitro altera los complejos proteína-pigmento responsables de la absorción de la radiación incidente.

. EFECTOS SOBRE LA RESPIRACIÓN Y CONTENIDO EN ATP

En relación con los enzimas fotorrespiratorios el mecanismo sobre la estimulación de la respiración por plomo aún no está claro. Se plantean varias incongruencias; una de éstas es que se inhibe la actividad cloroplástica de la ATP sintetasa /ATPasa (Tu Shu y Brouillette, 1987) y no se afectan otros enzimas como NADH-hidroxipiruvato reductasa, glicolato oxidasa y el enzima NAD-málico (Romanowska et al., 2002) bajo exposición a plomo.

Aunque la sensibilidad de la fotofosforilación a los iones de los metales pesados está bien documentada, no hay un acuerdo general sobre el sitio de acción ni sobre el mecanismo señalado. Solamente algunos experimentos pueden sugerir diferentes mecanismos existentes para la acción de los iones de los metales pesados sobre la actividad ATPasa cloroplástica cuando estos iones metálicos son aplicados bajo condiciones in vivo o in vitro.

. EFECTOS SOBRE LA ABSORCIÓN DE NUTRIENTES

Muchas de las acciones atribuidas al plomo parecen ser indirectas como un resultado del desequilibrio mineral dentro de los tejidos. Así, se sabe que altas concentraciones de plomo en el suelo causan desequilibrio en las proporciones de nutrientes minerales dentro de los tejidos de las plantas en crecimiento.Cambios significativos se han observado tanto en los contenidos de nutrientes como en las proporciones internas de nutrientes en plantas bajo la toxicidad con plomo (Kabata-Pendias y Pendias, 1992). En la mayoría de los casos, el plomo bloquea la entrada

de cationes (K+, Ca+2, Mg+2, Mn+2, Zn+2, Cu+2, Fe+3) y aniones (NO3-) en el sistema radicularHasta el momento, los mecanismos sugeridos para regular la entrada de micro- y macronutrientes bajo toxicidad por plomo consisten en el mecanismo físico y químico.

El primer mecanismo, se relaciona con el tamaño de los radios iónicos del metal, que pueden actuar bloqueando el acceso de muchos iones en los sitios de absorción de las raíces (Godbold y Kettner, 1991). Aunque tanto el contenido de plomo en la punta como en la base de la raíz pueden parecer similares, el plomo altera los niveles de elementos minerales en las mismas.El plomo influye en la distribución total de los elementos nutritivos dentro de los diferentes órganos de la planta. Ya que, la distribución total de Mn y S cambió a favor de la raíz por encima de la parte aérea bajo condiciones de toxicidad con plomo, lo cual representa retención de estos iones en la raíz. Con respecto al contenido de fósforo, en Pisum sativum siempre se han hallado correlaciones negativas con el contenido de plomo en el suelo, y también se ha detectado que la actividad fitasa es afectada por el contenido de plomo (Paivoke, 2002).El segundo mecanismo sugerido para explicar la disminución de la absorción de micro y macronutrientes bajo toxicidad con plomo se relaciona con el desorden que induce el plomo en el metabolismo celular causando cambios en las actividades enzimáticas de la membrana y en la estructura de la membrana. Aparentemente, un ejemplo puede ser el eflujo de K+ desde las raíces, el cual es debido a la extrema sensibilidad de la ATPasa y de los grupos –SH de las proteínas de la membrana celular hacia el plomo.

RECOMENDACIONES:

Utilizar guantes en el movimiento de las semillas para evitar su contaminación con algunos agentes externos.

Para la medición de la radícula y el hipocotilo utilizar hojas milimetradas para una mayor precisión.

Utilizar protección para evitar ser afectados con el xenobiotico.

En el momento de rociar el contaminante en la placa, asegurarnos que este equitativamente rociado por toda la circunferencia.

Seleccionar las semillas adecuadas y de calidad, para prevenir que el ensayo realizado sea alterado.

BIBLIOGRAFIA

Anónimo. (2006). CRITERIOS DE CALIDAD DE SUELOS Y DE AGUAS O EFLUENTES TRATADOS PARA USO EN RIEGO. 2015, de anónima. Sitio web: http://bibliotecadigital.sag.gob.cl/documentos/medio_ambiente/criterios_calidad_suelos_aguas_agricolas/pdf_aguas/anexo_A/plomo.pdf

Cesar Marc. (2005). Bioensayos de toxicidad. 2015, de monografias Sitio web: http://www.monografias.com/trabajos12/neon/neon.shtml.

Anónimo. (2014). Ensayo de toxicidad aguda con semillas de lechuga Lactuca sativa L.. 2015, de Universidad Nacional de Avellaneda Sitio web: http://ibio.ddns.net/Ensayo_de_Ecotoxicidad.pdf

Herman Tarazona Mirabal. (2011). FITOTOXICIDAD DE COBRE Y LECHUGA. 2015, de concytec. Sitio web: http://www.concytec.gob.pe/portalsinacyt/images/stories/corcytecs/huanuco/fitotoxicidad_de_cobre_en_lechuga_unh.pdf

P. Bohórquez-Echeverry, C. Campos-Pinilla. (2007). EVALUACIÓN DE Lactuca sativa Y Selenastrumcapricornutum COMO INDICADORES DE TOXICIDAD ENAGUAS. 2015, de

Pontificia Universidad Javeriana Sitio web:http://www.academia.edu/2915582/EVALUACI%C3%93N_DE_Lactuca_sativa_Y_Selenastrum_capricornutum_COMO_INDICADORES_DE_TOXICIDAD_EN_AGUAS

Rubén Sierra Villagrana. (2010). Fitorremediación de un Suelo Contaminado con Plomo por Actividad Industrial. Sitio web: http://www.monografias.com/trabajos-pdf/fitorremediacion/fitorremediacion2.shtml

CASTILLO BRAVO Azael, NETZAHUAL NAVA Marina, PÉREZ PÉREZ Fanny y GUEVARA GARCÍA José Antonio. (2006). ESTUDIO DE LA ABSORCIÓN DE METALES PESADOS POR LA PLANTA DE NOPAL OPUNTIA FICUS INDICA.. 2015, de Laboratorio de Investigación en Bioinorgánica y Biorremediación (LIByB). Departamento de Ciencias Básicas, Universidad Autónoma de Tlaxcala Sitio web: http://www.uaemex.mx/Red_Ambientales/docs/memorias/Resumen/TA/RC/TAC-26.pdf

P.delaVega. (abril 24, 2014). La fitorremediación: plantas para tratar la contaminación ambiental. 2015, de La Mama Pacha Sitio web: http://lamamapachama.com/2014/04/24/la-fitorremediacion-plantas-para-tratar-la-contaminacion-ambiental/

Análisis del crecimiento de lechuga Lactuca sativa L. 'Bativia'cultivada en un suelo salino de la Sabana de Bogata, 19 de febrero 2009