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RENATA RODRIGUES GOMES

Phomopsis spp ENDOacuteFITOS DE PLANTAS MEDICINAIS DIVERSIDADE

GENEacuteTICA E ANTAGONISMO AO FUNGO Guignardia citricarpa

2008

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Dissertaccedilatildeo apresentada ao Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Geneacutetica da Universidade Federal do Paranaacute como requisito parcial para a obtenccedilatildeo do grau de Mestre em Ciecircncias Bioloacutegicas Aacuterea de Concentraccedilatildeo em Geneacutetica

Orientadora Profordf Drordf Chirlei Glienke

Co-orientador Prof Dr Joatildeo Luacutecio de Azevedo

CURITIBA 2008

AGRADECIMENTOS

Agrave minha orientadora Profordf Drordf Chirlei Glienke pela oportunidade ensinamentos

inestimaacuteveis sugestotildees e contribuiccedilotildees oferecidas as quais sem duacutevidas muito

enriqueceram o trabalho Sobretudo pelo exemplo de dedicaccedilatildeo agrave vida acadecircmica

Ao meu co-orientador Prof Dr Joatildeo Lucio Azevedo pela dedicaccedilatildeo e

valorizaccedilatildeo da pesquisa cientiacutefica e pela oportunidade de realizaccedilatildeo desse trabalho

Agrave minha banca de acompanhamento Profordf Drordf Patriacutecia Dalzoto e a Drordf Kaacutetia

Rodrigues pelas sugestotildees e contribuiccedilotildees oferecidas cooperando para o

desenvolvimento desse trabalho

Agraves Profas Dras Lygia Vitoacuteria Galli-Terasawa e Vanessa Kava-Cordeiro pela

convivecircncia sugestotildees e auxiacutelio no LabGeM

Ao Dr Aacutelvaro Almeida da EMBRAPA de Londrina-PR e a Drordf Socircnia Pillegi pelas

linhagens de Phomopsis que muito contribuiacuteram para elucidaccedilatildeo da pesquisa

Ao Prof Dr Joseacute Odair Pereira e a MsC Antonia Souza da Universidade Federal

do Amazonas e a MsC Josiane Gomes pelas linhagens de Pestalotiopsis utilizadas

neste trabalho

Agrave EMBRAPA de Colombo Paranaacute pela disponibilidade da coleta de folhas de

espinheira santa

Agrave Profordf Drordf Thelma Alvim que sempre se disponibilizou no auxiacutelio a microscopia

oacutetica

Aos Professores do Mestrado em Geneacutetica que contribuiacuteram para minha

formaccedilatildeo

Aos meus amigos de turma da poacutes-graduaccedilatildeo Carolina Abuaacutezar Caroline

Bernardi Clineu Uehara Daniele Matoso Dellyana Boberg Fabio Rigoti Maacutercia

Oliveira Patriacutecia de Franccedila Thaiacutes Sczepanski Virginia Coser e Vitor Dantas pelos

momentos de convivecircncia e conforto durante essa jornada Sem vocecircs jamais

suportaria a saudade

Agrave minha amiga Tatiane pelos momentos alegres na convivecircncia diaacuteria pelo

carinho companheirismo pelo conforto durante as minhas preocupaccedilotildees e receios

dentro e fora do laboratoacuterio Assim como pelas excelentes ideacuteias que muito contribuiacuteram

neste trabalho

Aos alunos de Poacutes-graduaccedilatildeo do LabGeM Jociney Josiele Josiane em

especial a Danyelle e Juliana pela amizade e cooperaccedilatildeo no desenvolvimento deste

trabalho

Ao doutorando Rafael Noleto do Laboratoacuterio de Citogeneacutetica Animal pelo

auxiacutelio no desenvolvimento deste trabalho

Aos amigos do LabGeM pela agradaacutevel convivecircncia e ajuda nos momentos

mais difiacuteceis Andreacute Carol Andrade Carol Silvano Douglas Flaacutevia Fernanda Larice

Lisiane Lucinir Maysa Patriacutecia Rosana e Taciana

Agrave amiga Izolde Gartner pela ajuda e disponibilidade

Agrave Anilda Gomes da Silva pelo eventual auxiacutelio teacutecnico na SEAD

Agrave Luciana Marques secretaacuteria do Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Geneacutetica

pelas orientaccedilotildees e informaccedilotildees

Aos meus pais Gislene Rodrigues Gomes e Raimundo de Andrade Gomes por

terem ensinado a buscar meus ideais e pelo esforccedilo e compreensatildeo em manterem-se

distantes todos esses anos que dediquei aos estudos

Ao meu companheiro Helder Franklin pela compreensatildeo o carinho e pela sua

admiraacutevel placidez sobretudo ao apoio e contribuiccedilatildeo para a realizaccedilatildeo deste ideal

Aos meus amigos e familiares pelo carinho compreensatildeo e incentivo nesse

periacuteodo de ausecircncia Sobretudo pelos exemplos de dedicaccedilatildeo e respeito ao proacuteximo

Agrave minha amiga Hafiza pelos conselhos compreensatildeo incentivo paciecircncia e

apoio

ldquoDe tudo ficaram trecircs coisas

A certeza de que estamos sempre comeccedilando

A certeza de que precisamos continuar

A certeza de que seremos interrompidos antes

de terminar

Portanto devemos

Fazer da interrupccedilatildeo um caminho novo

Da queda um passo de danccedila

Do medo uma escada

Do sonho uma ponte

Da procura um encontrordquo

(Fernando Pessoa)

RESUMO Phomopsis spp ENDOacuteFITOS DE PLANTAS MEDICINAIS DIVERSIDADE GENEacuteTICA E ANTAGONISMO AO FUNGO Guignardia citricarpa Autora Renata Rodrigues Gomes Orientadora Chirlei Glienke Microrganismos endofiacuteticos vivem no interior das plantas sem causar dano ao seu hospedeiro podendo produzir compostos biologicamente ativos antibioacuteticos fungicidas e herbicidas Essa comunidade endofiacutetica pode estar relacionada com a accedilatildeo antimicrobiana de plantas medicinais A planta Maytenus ilicifollia conhecida como espinheira-santa eacute uma planta medicinal muito utilizada no tratamento de uacutelceras gaacutestricas e tratamentos digestivos tiacutepica da Ameacuterica do Sul em especial da regiatildeo Sul do Brasil e atualmente encontra-se ameaccedilada de extinccedilatildeo As plantas medicinais Spondias mombin Myracrodruon urundeuva Schinus terebinthifolius e Aspidosperma tomentosun tecircm sido usadas na medicina devido as suas propriedades antimicrobianas No presente trabalho foram isolados fungos endofiacuteticos do gecircnero Phomopsis e avaliados quanto a sua variabilidade geneacutetica e estrutura populacional por meio de marcadores RAPD Observou-se que as plantas medicinais analisadas satildeo colonizadas por grande diversidade de espeacutecies de Phomopsis com grande variabilidade morfoloacutegica e geneacutetica intra e interespeciacuteficas Os isolados foram identificados por meio de sequumlecircncias das regiotildees ITS1 58S e ITS2 do DNA ribossomal e testados quanto ao potencial antimicrobiano contra as linhagens PC1396 e PC3305 de Guignardia citricarpa agente causal da Mancha Preta do Citros Foi possiacutevel identificar nove isolados em niacutevel de espeacutecie por meio de sequumlecircncias ITS do rDNA sendo 4 como P michaeliae 2 como P theicola 2 como P longicolla e 1 como P sojae Foi possiacutevel verificar que as plantas de Maytenus ilicifolia analisadas satildeo colonizadas endofiticamente por pelo menos dez espeacutecies de Phomopsis e as plantas de Schinus terebinthifolius por pelo menos seis espeacutecies deste gecircnero As anaacutelises morfoloacutegicas por meio de marcadores RAPD e sequenciamento de ITS do rDNA permitem sugerir que as espeacutecies de Phomopsis analisadas natildeo satildeo hospedeiro-especiacuteficas sendo necessaacuteria a redefiniccedilatildeo do conceito de espeacutecie para este gecircnero Na anaacutelise antimicrobiana todos os isolados apresentaram grande potencial no controle in vitro do fungo G citricarpa destacando-se os isolados ESDF1 (Phomopsis sp S7) A134 (Phomopsis sp) A115B (Phomopsis sp) ES2AB1 (Phomopsis sp S6) ES2WF1 (Phomopsis sp S4) e ESFH1 (P theicola) que inibiram o crescimento das linhagens PC1396 e PC3305 de G citricarpa em trecircs metodologias avaliadas Desta forma esse estudo indica que os isolados de Phomopsis spp endoacutefitos de plantas medicinais satildeo produtores de substacircncias bioativas que devem ser melhor caracterizadas Palavras chaves Phomopsis spp endoacutefitos plantas medicinais RAPD sequumlecircncias da regiatildeo ITS1 58S e ITS2 do rDNA

ABSTRACT Phomopsis spp ENDOPHYTES OF MEDICINAL PLANTS GENETIC DIVERSITY AND ANTAGONISM IN THE FUNGUS Guignardia citricarpa Author Renata Rodrigues Gomes Adviser Chirlei Glienke-Blanco Endophytic microorganisms live in plants without causing damage to their host being able to produce active biological compounds antibiotics fungicides and herbicides This endophytic community may be related to the antimicrobial action of medicinal plants The plant Maytenus ilicifolia known as ldquoespinheira santardquo is a medicinal plant greatly used for the treatment of stomach ulcers and digestive problems typical from the South America especially in the southern part of Brazil and currently is in danger of extinction The medicinal plants Spondias mombin Myracrodruon urundeuva Schinus terebinthifolius and Aspidosperma tomentosun have been used in medicine due to their antimicrobial properties In the present work endophytic fungi of the genus Phomopsis were isolated and their genetic variability and population structure assessed using RAPD markers The medicinal plants analyzed are colonized by a great variety of Phomopsis species with a high morphological and genetic variability both intra and interspecific The isolated fungi were identified through sequences of ITS1 58S and ITS2 regions of ribosomal DNA and tested in their antimicrobial potential against the PC1396 and PC3305 lineages of Guignardia citricarpa the responsible for the ldquoblack spot in Citrusrdquo It was possible to identify 9 isolates at the level of species through the analysis of ITS sequences of rDNA and among these isolates 4 were identified as P michaeliae 2 as P theicola 2 as P longicolla and 1 as P sojae It was possible to verify that the Maytenus ilicifolia plants analyzed are endophytically colonized by at least ten Phomopsis species and that Schinus terebinthifolius are colonized by at least six species of this genus The morphological analyses using RAPD markers and sequencing of ITS regions of rDNA make possible to suggest that the analyzed species of Phomopsis are not host-specific being necessary the redefinition of the species concept for this genus For the antimicrobial analysis all the isolates presented a high in vitro control potential of the fungus G citricarpa particularly the isolates ESDF1 (Phomopsis sp S7) A134 (Phomopsis sp) A115B (Phomopsis sp) ES2AB1 (Phomopsis sp S6) ES2WF1 (Phomopsis sp S4) and ESFH1 (P theicola) that inhibited the growth of the PC1396 and PC3305 lineages of G citricarpa in the three methodologies tested Thus this study indicates that the isolates of Phomopsis spp endophytic of medicinal plants are producers of bioactive substances which should be better characterized Key words Phomopsis spp endophytes medicinal plants RAPD ITS1 58S and ITS2 of rDNA sequences

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1- MACROMORFOLOGIA DE COLOcircNIAS DOS ISOLADOS ENDOFIacuteTICOS DE Phomopsis DE Spondias mombin (SM9713 SM9638 SM9714 SM9631) Myracrodruon urundeuva (MU0123) Aspidosperma tomentosun (AT9810 AT 9811 e AT 9906) EM TREcircS MEIOS DE CULTURA APOacuteS 14 DIAS DE CRESCIMENTO A 22ordmC SOB LUZ CONTIacuteNUA 59

FIGURA 2- MACROMORFOLOGIA DE COLOcircNIAS DOS ENDOacuteFITOS DE

Phomopsis ISOLADOS DE AROEIRA (Schinus terebinthifolius) EM TREcircS MEIOS DE CULTURAAPOacuteS 14 DIAS DE CRESCIMENTO A 22ordmC SOB LUZ CONTIacuteNUA 61

FIGURA 3- MACROMORFOLOGIA DE COLOcircNIAS DOS ISOLADOS

ENDOacuteFITOS DE Phomopsis ISOLADOS DE Maytenus ilicifolia EM TREcircS MEIOS DE CULTURA APOacuteS 14 DIAS DE CRESCIMENTO A 22ordmC SOB LUZ CONTIacuteNUA 64


PATOGEcircNICOS OBTIDOS DE Glycine max EM TREcircS MEIOS DE CULTURA APOacuteS 14 DIAS DE CRESCIMENTO A 22ordmC SOB LUZ CONTIacuteNUA 68

FIGURA 5- DIAcircMETRO MEacuteDIO DAS COLOcircNIAS DOS ISOLADOS

ENDOFIacuteTICOS DE Phomopsis sp EM MEIO MEA APOacuteS 5 DIAS DE CRESCIMENTO A 22 ordmC SOB LUZ CONTIacuteNUA 69


ENDOFIacuteTICOS DE Phomopsis spp EM MEIO BDA APOacuteS 5 DIAS DE CRESCIMENTO A 22 ordmC SOB LUZ CONTIacuteNUA 70

FIGURA 7- AVALIACcedilAtildeO DAS MEacuteDIAS DO DIAcircMETRO DAS COLOcircNIAS DOS

ISOLADOS ENDOFIacuteTICOS DE Phomopsis spp EM MEIO AV APOacuteS 5 DIAS DE CRESCIMENTO A 22 ordmC SOB LUZ CONTIacuteNUA 71

FIGURA 8- FOTOMICROGRAFIA DOS CONIacuteDIOS DOS ISOLADOS

ENDOFIacuteTICOS DE Phomopsis EM BDA APOacuteS 21 DIAS DE CRESCIMENTO A 22ordmC SOB LUZ CONTIacuteNUA 73

FIGURA 9- FOTOMICROGRAFIA DOS CONIacuteDIOS DO ISOLADO SM9713 EM

MEIOS BDA e AV APOacuteS 21 DIAS DE CRESCIMENTO A 22ordmC SOB

LUZ CONTIacuteNUA 74 FIGURA 10- COMPRIMENTO DOS CONIacuteDIOS DOS ISOLADOS ENDOFIacuteTICOS

DE Phomopsis spp APOacuteS 21 DIAS DE CRESCIMENTO EM BDA A 22ordmC SOB LUZ CONTIacuteNUA 75

FIGURA 11- DENDROGRAMA GERADO A PARTIR DOS DADOS DE

SIMILARIDADE MORFOLOacuteGICA ENTRE OS ISOLADOS ENDOFIacuteTICOS DE Phomopsis 77

FIGURA 12- ANAacuteLISE DE COMPONENTES PRINCIPAIS DE SIMILARIDADE

MORFOLOacuteGICA ENTRE OS ISOLADOS ENDOFIacuteTICOS DE Phomopsis 78

FIGURA 13- PERFIL DE AMPLIFICACcedilAtildeO COM O OLIGONUCLEOTIacuteDEO

OPX11 DOS ISOLADOS ENDOFIacuteTICOS DE Phomopsis sp E GRUPO EXTERNO Pestalotiopsis 79





FIGURA 16- PERFIL DE AMPLIFICACcedilAtildeO COM O OLIGONUCLEOTIacuteDEO OPE

08 DOS ISOLADOS ENDOFIacuteTICOS DE Phomopsis sp E GRUPO EXTERNO Pestalotiopsis 80


SIMILARIDADE GENEacuteTICA ENTRE OS ISOLADOS DE Phomopsis POR MEIO DE MARCADORES MOLECULARES RAPD 82


GENEacuteTICA ENTRE OS ISOLADOS ENDOFIacuteTICOS DE Phomopsis 84 FIGURA 19- AacuteRVORE FILOGENEacuteTICA BASEADA NA SEQUumlEcircNCIA DA

REGIAtildeO ITS1 58S E ITS2 DO rDNA DOS ISOLADOS DE Phomopsis spp (MEacuteTODO DE PARCIMOcircMIA) 86

FIGURA 20- AacuteRVORE FILOGENEacuteTICA PARCIAL BASEADA NA SEQUumlEcircNCIA DA REGIAtildeO ITS1 58S E ITS2 DO rDNA DOS ISOLADOS DE Phomopsis spp (MODELO NEIGHBOR-JOINING COM CORRECcedilAtildeO KIMURA DOIS PARAcircMETROS) 87

FIGURA 21- INTERACcedilAtildeO DOS ISOLADOS DE Phomopsis CONTRA Guignardia citricarpa PC1396 PELA TEacuteCNICA DE CULTURA PAREADA 93

FIGURA 22- INTERACcedilAtildeO DOS ISOLADOS DE Phomopsis CONTRA Guignardia

citricarpa 3305 PELA TEacuteCNICA DE CULTURA PAREADA 96 FIGURA 23- AVALIACcedilAtildeO DO CRESCIMENTO DAS COLOcircNIAS DO

FITOPATOacuteGENO G citricarpa PC1396 e PC3305 INOCULADAS APOacuteS RETIRADA DO PAPEL CELOFANE PARA DETECCcedilAtildeO DE METABOacuteLITOS NAtildeO VOLAacuteTEIS EM MEIO BDA APOacuteS 21 DIAS DE CRESCIMENTO A 28ordmC 98

FIGURA 24- AVALIACcedilAtildeO DA ACcedilAtildeO DOS EXTRATOS METANOacuteLICOS NO

CRESCIMENTO MICELIAL DAS COLOcircNIAS DA LINHAGEM PC3305 DE G citricarpa EM MEIO BDA APOacuteS 14 DIAS DE CRESCIMENTO A 28ordmC 99



LISTA DE TABELAS

TABELA 1- ISOLADOS DE Phomopsis spp PERTENCENTES Agrave COLECcedilAtildeO DO LABGEMUFPR 32

TABELA 2- ISOLADOS GRUPO EXTERNO PARA ANAacuteLISE DE

VARIABILIDADE GENEacuteTICA POR RAPD 35 TABELA 3- EacutePOCAS DO ANO OacuteRGAtildeOS DA PLANTA CONDICcedilOtildeES DE

INCUBACcedilAtildeO E Nordm DE FRAGMENTOS PLAQUEADOS NAS QUATRO COLETAS DE ENDOacuteFITOS DE ESPINHEIRA-SANTA 42

TABELA 4- SEQUumlEcircNCIAS DOS OLIGONUCLEOTIacuteDEOS UTILIZADOS NA

AMPLIFICACcedilAtildeO DA REGIAtildeO ITS1 58S E ITS2 DO DNA RIBOSSOMAL 47



TABELA- 6- Linhagens de Phomopsis spp E de Pestalotiopsis vismae utilizadas

como grupo externo 52 TABELA 7- PORCENTAGEM DE ISOLAMENTO DE Phomopsis

ENDOFIacuteTICOS DE PLANTAS DE ESPINHEIRA SANTA 56 TABELA 8- PORCENTAGEM DE INIBICcedilAtildeO E TIPOS DE INTERACcedilAtildeO ENTRE

OS ISOLADOS ENDOFIacuteTICOS DE Phomopsis E Guignardia citricarpa ndash PC1396 94

TABELA 9- PORCENTAGEM DE INIBICcedilAtildeO E TIPOS DE INTERACcedilAtildeO ENTRE


TABELA 10- AVALIACcedilAtildeO DA ACcedilAtildeO DOS EXTRATOS METANOacuteLICOS NO

CRESCIMENTO MICELIAL DAS COLOcircNIAS DA LINHAGEM PC1396 E PC3305 DE G citricarpa EM MEIO BDA APOacuteS 14 DIAS DE CRESCIMENTO A 28ordmC 101

LISTA DE ANEXOS

ANEXO 1- ANOVA E TESTE DE MEacuteDIAS DO CRESCIMENTO MICELIAL DOS ISOLADOS EM DOS ISOLADOS DE Phomopsis EM DIFERENTES MEIOS DE CULTURA 125

ANEXO 2- ANOVA E TESTE DE MEacuteDIAS DO CRESCIMENTO MICELIAL

DOS ISOLADOS EM DOS ISOLADOS DE Phomopsis EM MEIO BDA 126


DOS ISOLADOS EM DOS ISOLADOS DE Phomopsis EM MEIO AVEIA 128


DOS ISOLADOS EM DOS ISOLADOS DE Phomopsis EM MEIO MEA 130

ANEXO 5- ANOVA E TESTE DE MEacuteDIAS DO COMPRIMENTO DOS

ESPOROS BETACONIacuteDIOS DOS ISOLADOS DE Phomopsis spp EM MEIO BDA 132

ANEXO 6- ANOVA E TESTE DE MEacuteDIAS DAS INTERACcedilOtildeES ENTRE OS

ISOLADOS ENDOFIacuteTICOS DE Phomopsis CONTRA O FITOPATOacuteGENO G citricarpa PC1396 134








ISOLADOS ENDOFIacuteTICOS DE Phomopsis CONTRA O FITOPATOacuteGENO G citricarpa PC3305 PARA DETECCcedilAtildeO DE METABOacuteLITOS NAtildeO VOLAacuteTEIS 139


ISOLADOS ENDOFIacuteTICOS DE Phomopsis CONTRA O

FITOPATOacuteGENO G citricarpa PC1396 PARA DETECCcedilAtildeO DE METABOacuteLITOS NAtildeO VOLAacuteTEIS

141

ANEXO 12- MATRIZ DE DADOS PARA CARACTERIZACcedilAtildeO 143 ANEXO 13- LOCAL DA COLETA DE FOLHAS DE Schinus terebinthifolius

CENTRO POLITEacuteCNICO ndash CURITIBA PR 149

SUMAacuteRIO 1 INTRODUCcedilAtildeO 1

2 OBJETIVOS 3

3 REVISAtildeO BIBLIOGRAacuteFICA 4

31 Microrganismos Endofiacuteticos 4

32 Ocorrecircncia de endoacutefitos 7

33 Fungos endofiacuteticos de plantas medicinais 9

34 Endoacutefitos Produtores de Substacircncias Antimicrobianas 11

35 Maytenus ilicifolia Mart ex Reiss 14

351 Componentes quiacutemicos e propriedades terapecircuticas 16

352 Endoacutefitos isolados de Maytenus ilicifolia 18

36 Guignardia citricarpa Kiely e a Mancha preta do citros 18

361 Mancha Preta do Citros 21

37 O Gecircnero Phomopsis sp 22

38 Marcadores Moleculares 25

381 Marcadores RAPD 27

382 Marcadores ITS 29

4 MATERIAL E MEacuteTODOS 32

41 Material Bioloacutegico 32

411 Fungos endofiacuteticos 32

412 Microrganismos usados para teste de antagonismo 35

413 Fungos endofiacuteticos utilizados para anaacutelise de variabilidade geneacutetica 35

42 Meios de Cultura 35

421 Caldo MEB (Extrato de Malte) 35

422 Meio AV (Aveia-Aacutegar) 36

423 Meio BDA (Meio Batata-Dextrose-Aacutegar) 36

424 Meio MC (Meio Completo) PONTECORVO et al 1953 37

425 Meio MEA (Extrato de Malte) PATERSON e BRIDGE 1994 37

43 Soluccedilotildees e Reagentes 38

431 Clorofane 38

432 Clorofil 38

433 Derozal Bayerreg 38

434 Dodecil Sulfato de Soacutedio (SDS) 10 38

435 Fenol Saturado 38

436 Gel de Agarose (08) 38


438 Lactofenol azul 38

439 Marcador de peso molecular (DNA de fago lambda clivado com Hind III

Gibco) 39

4310 Marcador de peso molecular (DNA Ladder 100pb Ludwing Biotec) 39

4311 Oligonucleotiacutedeos (Invitrogen) 39

4312 RNAse (invitrogen) 39

4313 Soluccedilatildeo de Vitaminas 40

4314 Soluccedilatildeo salina (pv) 40

4315 Soluccedilatildeo Tween-80 01 (vv) 40

4316 Soluccedilatildeo de Tetraciclina 40

4317 Soluccedilatildeo de EDTA 05M 40

4318 Soluccedilatildeo de brometo de etiacutedio 40

4319 Tampatildeo TE (Tris-EDTA) 41

4320 Tampatildeo de Extraccedilatildeo de DNA 41

4321 Tampatildeo da Amostra (6x) 41

4322 Tampatildeo de corrida TBE 10x 41

44 Isolamento 42

45 Conservaccedilatildeo dos fungos 43

46 Caracterizaccedilatildeo morfoloacutegica 43

47 Obtenccedilatildeo de colocircnia monospoacuterica 44

48 Caracterizaccedilatildeo Molecular 44

481 Extraccedilatildeo do DNA (RAEDER e BRODA 1985 modificado por GLIENKE

1995) 44

482 RAPD 45

4821 Anaacutelise da Variabilidade Geneacutetica 46

483 Sequumlenciamento da regiatildeo ITS1 58S e ITS2 do rDNA 47

4831 Amplificaccedilatildeo 47

4832 Purificaccedilatildeo da PCR 48

48321 Purificaccedilatildeo com PEG 48

48322 Purificaccedilatildeo com Acetato de Amocircnio 48

4833 Reaccedilatildeo de Sequumlenciamento 49

4834 Purificaccedilatildeo da Reaccedilatildeo de Sequumlenciamento 50

48341 Purificaccedilatildeo com Isopropanol em tubos 50

48342 Purificaccedilatildeo com Purificaccedilatildeo com Isopropanol em placa 50


4835 Ediccedilatildeo e Anaacutelise das Sequumlecircncia 51

49 Avaliaccedilatildeo da Atividade Antimicrobiana 52

491 Cultura Pareada 52

492 Avaliaccedilatildeo de metaboacutelitos natildeo volaacuteteis 53

493 Atividade dos Extratos metanoacutelicos 54

4931 Obtenccedilatildeo dos extratos 54

4932 Crescimento micelial 55

410 Anaacutelise Estatiacutestica 55

5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO 56

51 Isolamento 56

52 Caracterizaccedilatildeo morfoloacutegica de Phomopsis 58

53 Caracterizaccedilatildeo Molecular de Phomopsis spp 78

531 RAPD 78


54 Avaliaccedilatildeo da atividade antimicrobiana 92

541 Cultura pareada 92

542 Teste para detecccedilatildeo de metaboacutelitos natildeo volaacuteteis 97

543 Avaliaccedilatildeo da accedilatildeo dos Extratos 98

6 CONCLUSOtildeES 104

7 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 106

ANEXOS 125

1

1 INTRODUCcedilAtildeO

A bioprospecccedilatildeo visa identificar plantas e microrganismos dentre a diversidade

de vida existente em determinado local que possam servir como fonte de substacircncias

bioativas que em uacuteltima instacircncia sejam uacuteteis para o desenvolvimento de novas

drogas Neste contexto os fungos endofiacuteticos satildeo considerados de grande importacircncia

pois representam uma fonte potencial de novos compostos quiacutemicos e bioloacutegicos

podendo ser utilizados natildeo somente na Medicina mas tambeacutem na Fitopatologia e

Veterinaacuteria (STROBEL 2002 STROBEL 2003) O potencial de aplicaccedilatildeo de

microrganismos endofiacuteticos no controle bioloacutegico tambeacutem vem sendo explorado

Os microrganismos endofiacuteticos vivem no interior das plantas interagindo com

diferentes espeacutecies sem causar dano ao seu hospedeiro Esses microrganismos

podem influenciar vaacuterias caracteriacutesticas das plantas e conferir certos benefiacutecios a este

vegetal como por exemplo produccedilatildeo de antibioacuteticos Haacute alguns anos natildeo se conhecia

a grande potencialidade dos endofiacuteticos entretanto este interesse vem aumentando

com a descoberta recente de caracteriacutesticas como a produccedilatildeo de compostos

biologicamente ativos antibioacuteticos fungicidas e herbicidas

Plantas medicinais com propriedades antimicrobianas tambeacutem satildeo habitadas por

microrganismos endofiacuteticos sugerindo que a accedilatildeo antibacteriana ou antifuacutengica poderia

estar no endoacutefito e natildeo na planta ou provavelmente na sua interaccedilatildeo No Brasil vaacuterios

autores mostraram a produccedilatildeo de faacutermacos por endoacutefitos como Xylaria sp Fusarium

moniliforme Colletotrichum sp Guignardia sp e tambeacutem Phomopsis sp

Fungos do gecircnero Phomopsis satildeo encontrados como endoacutefitos nos espaccedilos

intercelulares de tecidos de diversos vegetais entre eles a espinheira-santa (Maytenus

ilicifolia Mart Reiss) planta pertencente agrave famiacutelia Celastraceae Essa planta medicinal

encontrada principalmente no sul do Brasil foi acrescentada agrave lista das espeacutecies

consideradas em extinccedilatildeo no Paranaacute pelo governo do Estado em 1995 Tendo em

vista que pouco se conhece a respeito da comunidade endofiacutetica existente nessa

planta sua diversidade e seu potencial antimicrobiano tornam-se relevantes estudos

de diversidade e bioprospecccedilatildeo

2

Pileggi (2006) demonstrou existir alta diversidade de isolados do gecircnero

Colletotrichum dentre outros fungos filamentosos bacteacuterias e actinomicetos em plantas

de Maytenus ilicifolia do pomar do Centro Nacional de Pesquisa de Florestas (CNPF)

da Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuaacuteria (EMBRAPAPR) Alguns desses

isolados apresentaram potencial antimicrobiano inibindo o crescimento de Fusarium

sp Guignardia citricarpa e Micrococcus luteus

Endoacutefitos com atividade antagonista contra o fungo Guignardia citricarpa agente

causal da Mancha Preta dos Citros (MPC) poderiam ser utilizados no controle bioloacutegico

desta doenccedila uma vez que o emprego sucessivo de fungicidas como controle de

doenccedilas de plantas apresenta dentre outros problemas a seleccedilatildeo de linhagens

resistentes do patoacutegeno

O gecircnero Phomopsis representa uma fonte potencial de novos compostos

quiacutemicos e bioloacutegicos como vem sendo relatado em diversos trabalhos Oito dos

isolados que foram estudados nesse trabalho jaacute haviam sido avaliados no

IOCFIOCRUZRJ e possuem potencial antimicrobiano (RODRIGUES et al 2004)

Poreacutem tais isolados ainda natildeo haviam sido caracterizados geneticamente nem

identificados em niacutevel de espeacutecie A identificaccedilatildeo e a caracterizaccedilatildeo molecular dos

microrganismos endofiacuteticos satildeo uacuteteis pois o gecircnero Phomopsis eacute de difiacutecil identificaccedilatildeo

em niacutevel de espeacutecie utilizando-se apenas caracteriacutesticas morfoloacutegicas

Estudos moleculares satildeo realizados na busca de padrotildees geneacuteticos nestes

organismos complementando sua caracterizaccedilatildeo O polimorfismo do DNA amplificado

ao acaso (RAPD) propicia uma forma raacutepida para avaliar a diversidade geneacutetica

existente nestes organismos a estruturaccedilatildeo populacional e para auxiliar na

identificaccedilatildeo ao niacutevel de espeacutecie comparando-as com linhagens referecircncia Outra

estrateacutegia importante nessa caracterizaccedilatildeo baseia-se em marcadores de Sequumlecircncias

Internas Transcritas do DNA Ribossocircmico (ITS) para identificaccedilatildeo taxonocircmica dos

isolados

3

2 OBJETIVOS

1 Isolar linhagens endofiacuteticas de Phomopsis spp de plantas sadias de Maytenus

ilicifolia e Identificar os isolados utilizando-se caracteriacutesticas morfoloacutegicas

2 Caracterizaccedilatildeo de Phomopsis spp endofiacuteticos das plantas medicinais Schinus

terebinthifolius Myracrodruon urundeuva Spondias mombin Aspidosperma

tomentosum pertencentes agrave coleccedilatildeo do LABGEM

3 Avaliar a variabilidade geneacutetica e estrutura populacional das linhagens de

Phomopsis spp por meio de marcadores RAPD (Polimorfismo do DNA

Amplificado ao Acaso)

4 Identificar as linhagens por meio de sequumlecircncias da regiatildeo ITS1 58S e ITS2 do

DNA ribossomal

5 Testar a atividade antimicrobiana de linhagens do fungo Phomopsis spp contra

linhagens do fitopatoacutegeno Guignardia citricarpa

4

3 REVISAtildeO BIBLIOGRAacuteFICA

31 Microrganismos Endofiacuteticos

Microrganismos endofiacuteticos satildeo aqueles que vivem no interior das plantas

interagindo com outras espeacutecies de microrganismos sem causar dano ou prejuiacutezo ao

seu hospedeiro Esses microrganismos podem influenciar em vaacuterias caracteriacutesticas

expressas pelas plantas Segundo Neto Azevedo e Araujo (2002) os endoacutefitos podem

desempenhar relevante funccedilatildeo para a sanidade vegetal jaacute que atuam como agentes

controladores de microrganismos fitopatogecircnicos no controle de insetos e ateacute na

proteccedilatildeo da planta contra herbiacutevoros Todas as plantas jaacute estudadas satildeo habitadas por

microrganismos endofiacuteticos principalmente fungos e bacteacuterias

A comunidade endofiacutetica cuja composiccedilatildeo varia em funccedilatildeo do hospedeiro e das

condiccedilotildees ambientais tem indiviacuteduos que se inter-relacionam dentro da planta em um

equiliacutebrio harmocircnico O desequiliacutebrio dessa harmonia afeta o comportamento de todos

os integrantes da comunidade dando condiccedilotildees para que fungos oportunistas

manifestem seu potencial patoloacutegico contra hospedeiro (MAKI 2006)

A distinccedilatildeo entre endofiacuteticos fitopatogecircnicos e oportunistas eacute puramente

didaacutetica Haacute um gradiente tecircnue que os separa e assim agrave distacircncia entre um e outro

pode ser muito pequena sendo difiacutecil impor limites para separar cada categoria Assim

um microrganismo pode ser considerado endofiacutetico mas com a reduccedilatildeo dos

mecanismos de defesa da planta pode se comportar como um patoacutegeno (AZEVEDO et

al 2000)

A ocorrecircncia de microrganismos endofiacuteticos nos vegetais resulta da penetraccedilatildeo

atraveacutes de feridas ocasionadas nas raiacutezes pela abrasatildeo destas com o solo aberturas

naturais como hidatoacutedios e estocircmatos aberturas artificiais sofridas pela accedilatildeo de

pragas animais e o homem ou agressotildees abioacuteticas (RIBEIRO 1995) ou ainda atraveacutes

da secreccedilatildeo de enzimas hidroliacuteticas (ESPOacuteSITO e AZEVEDO 2004) A penetraccedilatildeo

pode ocorrer por meio de esporos levados pelo vento ou hifas que invadem os tecidos

Muitos endoacutefitos produzem massas de coniacutedios delgados caracteriacutestica associada com

5

a dispersatildeo por chuvas (RIBEIRO 1995) Outra forma de propagaccedilatildeo se daacute pela

transmissatildeo vertical por meio de sementes (WHITE MORGAN-JONES E MORROW

1993 CLAY 2004)

Viret e Petrini (1994) usando microscopia eletrocircnica de varredura e transmissatildeo

detectaram a presenccedila de fungos no interior dos hospedeiros Clay (1987) verificou a

presenccedila de hifas dos fungos Acremonium lolli e A coenophialum no espaccedilo

intercelular da regiatildeo meristemaacutetica no mesofilo das folhas no cerne da inflorescecircncia

na semente

Os endoacutefitos apresentam uma relaccedilatildeo mutualiacutestica antagoniacutestica ou neutra com

o hospedeiro A interaccedilatildeo de um fungo com seu hospedeiro vegetal variam e depende

do modo pelo qual o fungo infecta a planta e tambeacutem da extensatildeo da resposta de

defesa desta A colonizaccedilatildeo pode ser sistecircmica ou local inter ou intracelular (ARAUacuteJO

SILVA E AZEVEDO 2000)

Os fungos endofiacuteticos atuam no controle bioloacutegico de fitopatoacutegenos por

ocuparem o mesmo nicho ecoloacutegico destes (ARAUacuteJO SILVA E AZEVEDO 2000)

Segundo Schulz e Boyle (2005) aproximadamente 80 dos fungos endofiacuteticos

produzem compostos biologicamente ativos como antibioacuteticos fungicidas e herbicidas

Esses microrganismos endofiacuteticos podem ser utilizados como fontes de

metaboacutelitos primaacuterios (STAMFORD ARAUacuteJO E STAMFORD 1998) e secundaacuterios que

inibem o desenvolvimento de patoacutegenos (LI et al 2001 LI e STROBEL 2001 ZOU e

TAN 2001) Como exemplo pode-se citar o taxol uma droga quimioterapecircutica usada

no tratamento de cacircncer de mama e ovaacuterio (WANG et al 2000 e STROBEL et al

2003) O aacutecido coletoacutetrico um metaboacutelico do fungo endofiacutetico Colletotrichum

gloeosporioides isolado da Artemisia mongoacutelica apresenta atividade antimicrobiana

contra Bacillus subtilis Staphylococcus aureus Sarcina lutea e contra o fungo

patogecircnico Helminthosporium sativum (ZOU et al 2000) Lu et al (2000) identificaram

trecircs novos metaboacutelitos do fungo endofiacutetico Colletotrichum sp isolado de Artemisia

annua com propriedades antimicrobianas Diversos autores relatam agrave accedilatildeo

antimicrobiana de substacircncias produzidas por fungos endofiacuteticos como Rodrigues

6

Hesse e Werner (2000) Liu et al (2001) Stinson et al (2003) Bao e Lazarivits (2001)

Huang et al (2001) Strobel (2003) Rodrigues (2004) Chareprasert et al (2006)

Os microrganismos endofiacuteticos satildeo tambeacutem capazes de produzirem anti-

helmiacutenticos e inseticidas (AZEVEDO et al 2000 ESPOacuteSITO e AZEVEDO 2004)

apresentando grande potencial que pode ser explorado na agricultura (ZOU e TAN

2001)

Schulz et al (2002) isolaram mais de seis mil e quinhentos fungos endofiacuteticos de

aacutervores e herbaacuteceas na busca de novos metaboacutelitos com potencial para novos

produtos industriais e sugerem que a associaccedilatildeo entre fungos endofiacuteticos e seus

hospedeiros conduza agrave produccedilatildeo de metaboacutelitos secundaacuterios com atividade

antimicrobiana e anti-herbicida

Autores sugerem que certos fungos endofiacuteticos produzem compostos igualmente

presentes em suas plantas hospedeiras como o taxol utilizado para o tratamento de

cacircncer presente tanto na planta medicinal Taxus brevifolia como no fungo endofiacutetico

Taxomyces andreanae (STIERLE et al 1995) Outros exemplos satildeo algumas enzimas

(celulases e lignases) em Xylaria sp fatores de crescimento como giberelina em

Fuzarium moniliforme Indicando uma possiacutevel transposiccedilatildeo de genes entre plantas e

fungos em uma verdadeira engenharia geneacutetica in vivo Se esses casos forem

confirmados ficaraacute evidente que vegetais e fungos transgecircnicos podem ocorrer

naturalmente pela transferecircncia de genes entre espeacutecies pertencentes a diferentes

reinos (AZEVEDO 1998)

Rodrigues Hesse e Werner (2000) pesquisaram a atividade bioativa de extratos

de fungos endofiacuteticos isolados da planta Spondias mombin L (cajazeiro) Estes extratos

incluindo o de Phomopsis sp foram testados contra determinados microrganismos O

fungo apresentou atividade contra actinomicetos Cladosporium elatum Mycotypha sp

e S cerevisae

Aleacutem da produccedilatildeo de antimicrobianos fungos endofiacuteticos podem excluir

patoacutegenos que ocupem o mesmo nicho ecoloacutegico por competiccedilatildeo como relatado por

Bao e Lazarovits (2001) com Fusarium oxysporum f sp Lycopersici patogecircnico e

Fusarium oxysporum natildeo patogecircnico

7

Os fungos endofiacuteticos satildeo de grande importacircncia pois representam uma fonte

potencial de novos compostos quiacutemicos e bioloacutegicos podendo ser utilizados natildeo

somente na Medicina mas tambeacutem na Fitopatologia e Veterinaacuteria (STROBEL 2002

STROBEL 2003) Tendo em vista essa importacircncia vaacuterios trabalhos vecircm sendo

recentemente publicados envolvendo a capacidade de endofiacuteticos antagonizarem

fitopatoacutegenos assim como satildeo descobertos e descritos metaboacutelitos e outras

substacircncias de interesses produzidos por endofiacuteticos

3 2 Ocorrecircncia de endoacutefitos Uma diversidade de microrganismos endofiacuteticos estaacute presente no interior de

plantas aparentemente saudaacuteveis com potencial para serem estudadas A composiccedilatildeo

das espeacutecies pode variar de acordo com o hospedeiro distribuiccedilatildeo geograacutefica idade da

planta condiccedilotildees ecoloacutegicas e sazonais incluindo altitude e precipitaccedilatildeo Uma ou duas

espeacutecies satildeo predominantes como endofiacuteticas em um dado hospedeiro enquanto

outros isolados satildeo pouco frequumlentes (CARROLL 1978 ARNOLD 2003)

Petrini Stone e Carroll (1982) verificaram um padratildeo de dominacircncia de espeacutecies

em que o endoacutefito encontrado com maior frequumlecircncia em uma determinada espeacutecie

vegetal era isolado menos frequentemente de outros hospedeiros Por outro lado os

endoacutefitos encontrados com menor frequumlecircncia em uma planta pareciam ser menos

especiacuteficos pois eram isolados em um amplo espectro de hospedeiros mas com baixa

frequumlecircncia

A colonizaccedilatildeo do fungo endofiacutetico Stagonospora sp no hospedeiro Phragmites

australis ocorre de forma diferenciada no decorrer do ano Na primavera o endoacutefito eacute

encontrado somente na raiz enquanto no outono ele eacute encontrado em todo o vegetal

(ERNEST MENDGEN e WIRSEL 2003) Gao et al (2005) constataram uma flutuaccedilatildeo

sazonal para os endoacutefitos isolados de Heterosmilax japonica Kunth os autores

verificaram maior abundancia de populaccedilotildees endofiacuteticas em amostras coletadas na

primavera do que no veratildeo

8

Tanto a planta hospedeira como a regiatildeo onde os endofiacuteticos satildeo isolados pode

influenciar a produccedilatildeo de metaboacutelitos secundaacuterios De acordo com dados estatiacutesticos

Bills et al (2002) compararam a produccedilatildeo de metaboacutelitos de endofiacuteticos provenientes

de regiotildees tropicais e de regiotildees temperadas Os dados revelaram que regiotildees tropicais

satildeo mais ricas na produccedilatildeo tanto de endoacutefitos como dos metaboacutelitos secundaacuterios

A presenccedila de endoacutefitos em plantas pode variar dentro de espeacutecies de um

mesmo hospedeiro Nestes hospedeiros tambeacutem eacute encontrada uma grande variedade

geneacutetica entre isolados endofiacuteticos da mesma espeacutecie Tal variabilidade foi encontrada

em isolados do fungo Guignardia citricarpa obtidos de citros (GLIENKE 1995) em

duas espeacutecies de Colletotrichum sp isoladas de Maytenus ilicifolia (PILEGGI 2006) e

tambeacutem Pestalotiopsis sp isolados de Maytenus ilicifolia (FIGUEIREDO 2006)

O gecircnero Phomopsis tem sido frequentemente isolado como endoacutefito em uma

grande variedade de plantas

Azevedo et al (2000) apresentaram algumas plantas hospedeiras de onde jaacute

foram isoladas espeacutecies de Phomopsis entre elas Sabal bermudana Trachycarpus

fortunei Cavendishia pubescens Stylosanthes guianensis Anacardium occidentale e

Mangifera indica Corrado e Rodrigues (2004) isolaram endofiacuteticos de Phomopsis das

plantas medicinais Spondias mombin e Aspidosperma tomentosun

Bussabam et al (2001) isolaram predominantemente Phomopsis sp

Colletotrichum gloeosporiodes Glomerella sp e Xylaria sp endoacutefitos de folhas

pseudocaules e rizomas de gengibre (Amomum siamense Criab) coletadas em dois

locais na Tailacircndia

Em plantas de cacau (Theobroma cacao L) resistentes e suscetiacuteveis ao agente

causal da vassoura da bruxa endoacutefitos foram identificados por caracteriacutesticas

morfoloacutegicas e sequumlenciamento de rDNA como pertencentes aos gecircneros

Acremonium Blastomyces Botryosphaeria Cladosporium Colletotrichum

Cordyceps Diaporthe Fusarium Geotrichum Gibberella Gliocladium Lasiodiplodia

Monilochoetes Nectria Pestalotiopsis Phomopsis Pleurotus Pseudofusarium

Rhizopycnis Syncephalastrum Trichoderma Verticillium e Xylaria Os autores

identificaram ainda alguns endoacutefitos potencialmente antagonistas destacando-se

9

Gliocladium catenulatum que reduziu em 70 a incidecircncia da vassoura da bruxa in

vivo em placircntulas de cacaueiro (RUBINI et al 2005)

O gecircnero Phomopsis foi isolado como endoacutefito de graviola (Annona muricata L)

e pinha (Annona squamosa L) dois isolados promoveram eficientemente o crescimento

vegetal mostrando-se promissores para agricultura uma vez que satildeo capazes de

aumentar a produccedilatildeo dessas culturas (SILVA et al 2006) A capacidade de estimular o

crescimento vegetal apresentada por esses organismos tem sido atribuiacuteda a

mecanismos diretos tais como a fixaccedilatildeo do nitrogecircnio produccedilatildeo de fitohormocircnios e

indiretos como antagonismo em relaccedilatildeo a patoacutegenos levando consequumlentemente ao

aumento na taxa de germinaccedilatildeo crescimento das raiacutezes e parte aeacuterea nuacutemero de

folhas e flores aacuterea foliar e rendimento de culturas (SILVEIRA 2001)

Alguns dos relatos citam o gecircnero Phomopsis como fitopatoacutegeno isolado de

Citrus aurantium (Laranjeira) Citrus nobilis (Tangerineira) Citrus paradisi (Pomelo)

Citrus australis (Laranja) Citrus sinensis (Laranja da China) Citrus sp (Citros)

Mangifera indica (Mangueira) Glycine max (Soja) Ficus carica (Figueira) e Anacardium

occidentale (Cajueiro) entre muitas outras plantas (CENARGEN EMBRAPA 2005) Foi

descrito como agente causal da mancha foliar em Myracrodruon urundeuva (ANJOS

CHARCHAR e GUIMARAtildeES 2001) O fungo Phomopsis sp tambeacutem eacute encontrado

associado a sementes de Dipteryx alata e Cybistax antisyphilitica espeacutecies comuns nos

Cerrados (SANTOS 1996)

33 Fungos endofiacuteticos de plantas medicinais Os microrganismos endofiacuteticos satildeo encontrados em muitas espeacutecies de plantas

medicinais A accedilatildeo antimicrobiana de algumas dessas plantas poderiam estar

relacionadas agrave sua comunidade endofiacutetica sugere-se entatildeo que o princiacutepio ativo

antimicrobiano pode ser produzido pelo microrganismo e natildeo propriamente pelo

vegetal ou provavelmente pela interaccedilatildeo planta-hospedeiro

As plantas Aspidosperma tomentosum e Spondias mombin satildeo utilizada no

Brasil devido as suas propriedades antimicrobianas A avaliaccedilatildeo dos metaboacutelitos

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secundaacuterios produzidos pelo fungo endofiacutetico Phomopsis sp isolado dessas plantas

demonstraram excelentes resultados na inibiccedilatildeo de bacteacuterias fungos filamentosos e

leveduras (CORRADO e RODRIGUES 2004)

Rodrigues Hesse e Werner (2000) avaliaram metaboacutelitos produzidos por fungos

endofiticos isolados de Spondias mombin Guignardia sp apresentaram atividade

contra Escherichia coli Staphylococcus aureus Saccharomyces cerevisiae Geotrichum

sp e Penicillium canadesis Metaboacutelitos de Pestalotiopsis guepinii apresentaram

atividade contra S cerevisiae Os metaboacutelitos produzidos por Phomopsis sp foram

eficientes contra Cladosporium elantum Mycotypha sp e S cerevisiae

Heterosmilax japonica Kunth eacute uma planta medicinal conhecida na China por

seus efeitos diureacuteticos Gao et al (2005) avaliaram a comunidade de fungos endofiacuteticos

e observaram uma grande variedade de fungos colonizando o interior das plantas entre

eles Phomopsis Mycospharella Aureobasidium Cladosporium Glomerella

Botryosphaeria e Guignardia

Plantas do gecircnero Taxus demonstraram atividade anticanceriacutegena assim como

isolados endofiacuteticos dessas plantas O paclitaxel e alguns de seus derivados utilizados

no tratamento de cacircncer satildeo produzidos pelo fungo endofiacutetico Taxus andreanae

isolado da planta medicinal T brevifolia (STROBEL et al 1993 STIERLE et al 1995) e

pelos fungos endofiacuteticos Sporormia minima e Trichothecium sp isolados da planta

medicinal T wallichiana (SHRESTHA et al 2001) A planta medicinal T marei de onde

foi isolado o fungo Tubercularia sp tambeacutem demonstrou atividade anticanceriacutegena

(WANG et al 2000)

O fungo Colletotrichum sp foi isolado como endoacutefito da planta medicinal

Artemisia annua utilizada pelos chineses como uma droga antimalaacuterica produziu

atividade antimicrobiana contra patoacutegenos humanos e de plantas (LU et al 2000) O

fungo endofiacutetico C gloeosporioides da espeacutecie A mongoacutelica sintetiza aacutecido coletoacutetrico

que apresenta atividade antimicrobiana (ZOU et al 2000)

11

34 Endoacutefitos Produtores de Substacircncias Antimicrobianas

A antibiose eacute definida como a interaccedilatildeo entre organismos na qual um ou mais

metaboacutelitos produzidos por um organismo tecircm efeito danoso sobre o outro (BETTIOL e

GHINI 1995) Segundo Melo (1998) muitos fungos e bacteacuterias inibem fitopatoacutegenos

competindo por nutrientes parasitando eou produzindo metaboacutelitos secundaacuterios como

enzimas liacuteticas e antibioacuteticos O resultado dessas interaccedilotildees antagocircnicas tais como

antibiose competiccedilatildeo induccedilatildeo de defesa e parasitismo leva ao controle bioloacutegico de

doenccedilas de plantas assim como pode desenvolver um papel muito importante na

medicina com a descoberta de novos faacutermacos

RODRIGUES HESSE e WERNER (2000) pesquisaram a atividade

antimicrobiana de metaboacutelitos secundaacuterios produzidos por fungos endofiacuteticos de

Spondias mombin (Anacardiaceae) contra actinomicetos bacteacuterias Gram-positivas e

Gram-negativas leveduras e fungos filamentosos e verificaram que os extratos de

Guignardia sp Phomopsis sp e Pestalotiopsis guepinii inibiram o crescimento de

actinomicetos Os extratos de Guignardia sp tambeacutem apresentaram atividade

antimicrobiana contra Escherichia coli Staphylococcus aureus Saccharomyces

cerevisiae Geotrichum sp e Penicillium canadensis Metaboacutelitos de P guepinii foram

ativos contra S cerevisae e os isolados de Phomopsis sp mostraram accedilatildeo antifuacutengica

contra Cladosporium elatum Mycotypha sp e S cerevisae

Liu et al (2001) estudaram a atividade antifuacutengica de fungos endofiacuteticos isolados

de Artemisia annua sobre os fitopatoacutegenos Gaeumannomyces graminis Fusarium

graminearum Rhizoctnia cerealis Phytophthora capsici helminthosporium sativum e

Gerlachia nivalis encontrando isolados com accedilatildeo inibitoacuteria para todos os patoacutegenos Lu

et al (2000) estudando a mesma planta constataram atividade de trecircs novos

metaboacutelitos produzidos pelo fungo Colletotrichum sp apresentando atividade

antifuacutengica contra Bacillus subtilis Sataphylococcus aureus Sarcina lutea

Pseudomonas sp Candida albicans Aspergillus niger e inibiccedilatildeo de crescimento dos

fungos patogecircnicos Gaeumannomyces graminis var tritici Rhizoctonia cerealis

Helminthosporium sativum e Phytophora capisici

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A Cinnamomum zeylnicum (canela) eacute uma planta utilizada no tratamento de

uacutelceras estomacais hipertensatildeo arterial resfriados e dores abdominais Ezra e Strobel

(2003) isolaram dessa planta o fungo Muscodor albus que apresenta accedilatildeo fungicida

fungistaacutetica bactericida e bacteriostaacutetica por emissatildeo de compostos orgacircnicos volaacuteteis

O mesmo foi relatado para o fungo Gliocladium sp da planta Eucryphia cordifolia

inibindo o crescimento dos fungos fitopatogecircnicos Pythium ultimum e Verticillum dahliae

(STINSON et al 2003)

Citocalasinas satildeo metaboacutelitos fuacutengicos relacionados pela estrutura e atividade

bioloacutegica com capacidade antitumoral e atividade antibioacutetica Estas substacircncias

apresentam efeitos que incluem a inibiccedilatildeo da divisatildeo do citoplasma e dos movimentos

celulares induccedilatildeo do deslocamento nuclear retraccedilatildeo de coaacutegulos e agregaccedilatildeo de

plaquetas transporte de glucose e secreccedilatildeo da tireoacuteide Recentemente trecircs novas

citocalasinas foram relatadas como provenientes do fungo endofiacutetico Rhinocladiella sp

de Tripterygium wilfordii (WAGENAAR et al 2000)

Li e Strobel (2001) purificaram duas ciclohexenonas produzidas pelo fungo

endofiacutetico Pestalotiopsis jesteri isolado da planta Fragraea bodenii (Gentianaceae) a

jesterona e a hidroxil-jesterona das quais a primeira apresentou atividade antifuacutengica

contra o patoacutegeno Pythium ultimum Outro metaboacutelito isoldado de P microspora

isolado endofiticamente da planta Terminalia morobensis a isopestacina

(isobenzofuranona) tambeacutem se mostrou ativo contra Pythium ultimum entre outros

fungos como Sclerotinia sclerotiorum e Rhizoctonia (STROBEL et al 2002)

Adicionalmente a isopestacina apresentou atividade antioxidante contra uma variedade

de radicais livres testados

A Monstera sp eacute uma planta que cresce sobre o tronco de aacutervores dela foi

isolado o endoacutefito Streptomyces sp MSU-2110 na Amazocircnia Peruana Este

actinomiceto produz um peptiacutedeo denominado coronamicina com atividade

antimicrobiana contra o fungo patogecircnico Cryptococcus neoformans e agrave bacteacuteria

Streptococcus pneumoniae mas a melhor atividade foi a demonstrada contra

protozoaacuterio Plasmodium falciparum sugerindo potencialidade como uma droga

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antimalaacuterica Aleacutem da coronamicina este endoacutefito tambeacutem produz outros compostos

com atividades antifuacutengicas (EZRA et al 2004)

Castillo et al (2002) isolaram e caracterizaram um antibioacutetico de largo espectro

a munumbicina produzida por uma outra linhagem endofiacutetica de Streptomyces

denominada NRRL 30562 isolada da planta medicinal Kennedia nigriscans nativa do

Norte da Austraacutelia O extrato do endoacutefito obtido com solvente orgacircnico foi purificado e

submetido a HPLC (Cromatografia Liacutequida de Alta Eficiecircncia) Os quatro componentes

principais resultantes foram denominados munumbicinas A B C e D Estes compostos

demonstraram em geral atividade contra bacteacuterias Gram positivas como Bacillus

anthracis e Mycobacterium tuberculosis multi-resistente A munumbicina B inibiu

Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA) enquanto a munumbicina D

apresentou atividade contra o parasita da malaacuteria Plasmodium falciparum O extrato da

linhagem de Streptomyces foi testado ainda contra vaacuterios patoacutegenos de plantas

apresentando atividade contra Pythium ultimum Phytophthora infestans Sclerotinia

sclerotiorum Erwinia carotovora Cochliobolus carbonum e Penicillium sp mostrando o

grande potencial destas novas substacircncias para a medicina e agricultura

O aacutecido coletotricum produzido pelo fungo Colletotrichum gloeosporioides

(Penz) Penz amp Sacc isolado da planta medicinal Artemiacutesia mongolica apresentou

inibiccedilatildeo do crescimento de Bacillus subtilis Staphylococcus aureus e Sarcina lutea e

atividade antifuacutengica contra o patoacutegeno Helminthosporium sativum (ZOU et al 2000)

Corrado e Rodrigues (2004) observaram a atividade bactericida de linhagens do

fungo endofiacutetico Phomopsis sp isolado das folhas de Aspidosperma tomentosum e

peciacuteolos da planta medicinal Spondias mombin Todos os extratos avaliados inibiram o

crescimento de bacteacuterias fungos filamentosos e leveduras testadas mostrando o

grande potencial deste fungo como fonte de produtos bioativos

Chareprasert et al (2006) isolaram fungos endofiacuteticos de Tectona grandis e de

Samanea saman e testaram sua capacidade antimicrobiana Dentre os isolados

testados Phomopsis foi o gecircnero dominante produzindo substacircncias inibidoras contra

Bacillus subtilis S aureus E coli e Candida albicans

14

Aleacutem da capacidade antimicrobiana fungos endofiacuteticos mostram-se importantes

com um grande potencial antitumoral e com habilidade em inibir enzimas sugerindo

que podem representar uma estimada fonte para uso terapecircutico

Rodrigues et al (2005) verificaram que fungos endofiacuteticos possuem a

capacidade de inibir colinesterase dentre eles linhagens de Phomopsis sp Entretanto

o melhor resultado foi obtido com extratos de Penicillium indicando que estes podem

ter aplicaccedilotildees farmacecircuticas

Huang et al (2001) testaram agrave accedilatildeo de fungos endofiacuteticos isolados de plantas

medicinais frente a outros fungos e tumores Os resultados indicaram que esses fungos

satildeo importantes em medicina como agentes antimicrobianos e antitumorais

Silva et al (2005) isolaram dois novos metaboacutelitos de Phomopsis cassiae

endofiacutetico de Cassia specatabilis as substacircncias 24-diidroxi-56-dimetil benzoato de

etila e phomopsilactona que exibiram forte atividade antifuacutengica contra fitopatoacutegenos

bem como citotoxicidade contra a linhagem celular de tumor cervical humano (HeLa)

Outros fungos como o Gliocladium sp da planta Eucryphia cordifolia tambeacutem possuem

atividade contra fungos fitopatogecircnicos (STINSON et al 2003 STROBEL 2003)

Em 2001 Rodrigues-Heerklotz et al elucidaram a estrutura quiacutemica e a siacutentese

assimeacutetrica de um novo metaboacutelito o aacutecido guignardico produzido pelo fungo endofiacutetico

Guignardia sp isolados de Spondias mombin

Satildeo vaacuterios os relatos de fungos endofiticos produtores de substacircncias

antimicrobianas inclusive isolados de plantas medicinais Esses microrganismos tem

se mostrado como uma fonte promissora de agentes bioativos antitumorais e

antifuacutengicos

35 Maytenus ilicifolia Mart ex Reiss

A planta Maytenus ilicifolia Mart Ex Reiss pertence agrave classe Magnoliopsida

ordem Celastrales e famiacutelia Celastraceae a qual compreende 50 gecircneros e cerca de

800 espeacutecies (CRONQUIST 1981) Conhecida popularmente nos diferentes paiacuteses da

Ameacuterica do Sul pode receber diferentes denominaccedilotildees congorosa quebrachillo e

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capororoca na Argentina (GONZALEZ LOMBARDO e VALLARINO 1937) espinheira-

divina cancorosa cancerosa cancrosa sombra-de-touro no Uruguai (SIMOtildeES et al

1986 ALICE et al 1995) coromilho-do-campo e salva-vidas (CARLINI e BRAZ 1988)

espinheira santa espinheira-divina erva-cancrosa e erva-santa (CARVALHO-OKANO

1992) cancorosa-de-Deus limatildeozinho maiteno marteno pau-joseacute salva-vidas

sombra-de-touro no Brasil (BITTENCOURT 2000)

Eacute descrita como uma aacutervore perene de porte arboacutereo-arbustivo encontrada na

mata de clima subtropical e temperado presente em sub-bosques das florestas de

Araucaacuteria nas margens de rios e em regiotildees de estepes Pode se propagar usualmente

por sementes (TAYLOR-ROSA e BARROS 1994) ou estacas de galho Preferindo

climas mais amenos ocorrendo espontaneamente ou por meio de cultivo A colheita

das folhas pode ser feita em qualquer eacutepoca do ano (PANIZZA 1998) Eacute nativa da

Ameacuterica do Sul encontrada no leste da Argentina Paraguai Boliacutevia com menor

intensidade no Chile e Uruguai No Brasil eacute predominante nos estados do Sul

(CARVALHO-OKANO 1992)

Maytenus ilicifolia eacute um arbusto de ocorrecircncia natural da Floresta Ombroacutefila Mista

(Floresta com Araucaacuteria) (BITTENCOURT 2001) Muitas vezes essa planta eacute

encontrada em ambientes ciliares e nos agrupamentos arboacutereos (capotildees) na regiatildeo de

predomiacutenio das estepes (CERVI et al 1989)

Esta planta eacute descrita como um subarbusto ou aacutervore ramificado desde a base

medindo ateacute 50 m de altura Ramos novos glabros angulosos tetra ou multicarenados

Peciacuteolo com 02-05 cm de comprimento A folha apresenta a margem inteira ou com

espinhos em nuacutemero de um a vaacuterios distribuiacutedos regular e irregularmente no bordo

geralmente concentrados na metade apical de um ou de ambos os semilimbos o limbo

com aproximadamente 22 a 89 cm de comprimento e 11 a 30 cm de largura e

nervuras na face abaxial Fruto caacutepsula bivalvar orbicular pericarpo maduro de

coloraccedilatildeo vermelho-alaranjada A presenccedila de disco nectariacutefero eacute um recurso a mais

para atrair os pequenos polinizadores como himenoacutepteros e formigas formando um

conjunto neacutectar-poacutelen interessante para a polinizaccedilatildeo uma vez que as flores satildeo

pequenas brancas e pouco vistosas O florescimento ocorre entre os meses de

16

setembro a outubro enquanto os frutos surgem entre outubro e fevereiro (CARVALHO-

OKANO 1992 RAMDOMSKI 1998 BITTENCOURT 2000)

A fragmentaccedilatildeo da Floresta com araucaacuterias nas uacuteltimas deacutecadas juntamente

com a comprovaccedilatildeo terapecircutica contra males gaacutestricos e o uso em larga escala

causaram grande devastaccedilatildeo de populaccedilotildees naturais de Maytenus ilicifolia

(BITTENCOURT 2001)

351 Componentes quiacutemicos e propriedades terapecircuticas Plantas sempre foram usadas como fonte terapecircutica na medicina tanto em

remeacutedios tradicionais quanto em produtos industrializados A planta Maytenus ilicifolia

Mart eacute geralmente utilizada na medicina popular brasileira As folhas secas desta

planta satildeo usadas como uma infusatildeo para aliviar dores de estocircmago e naacuteuseas e no

tratamento de uacutelceras e gastrites (CAMPAROTO et al 2002) Vaacuterios compostos

isolados de M ilicifolia foram descritos apresentando accedilatildeo antitumoral tambeacutem usado

como analgeacutesico antinflamatoacuterio e antiaacutecido (JORGE 2004)

Esta espeacutecie tem uso popular em comunidades tradicionais e povos indiacutegenas no

Brasil (BITTENCOURT 2001) No Paraguai e Boliacutevia tribos indiacutegenas e populaccedilotildees

rurais a utilizam como substacircncia controladora da fertilidade (CORDEIRO VILEGAS e

LANCcedilAS 1999) e no Paraguai e Argentina eacute usada como contraceptiva e abortiva

(MONTANARI CARVALHO e DOLDER 1998) Citada tambeacutem com uso no tratamento

de febres palustres (MEIRA PENNA 1946) afecccedilotildees pruriginosas cutacircneas

(COIMBRA 1958) dispepsias (CRUZ 1965) Inflamaccedilotildees ulceras e gaacutestricas (JORGE

2004)

As propriedades terapecircuticas de Maytenus ilicifolia foram atribuiacutedas agrave produccedilatildeo

de compostos terpecircnicos como maitenina e pristimerina tanto pelas raiacutezes (LIMA et al

1971 ITOKAWA et al 1991) como em ramos de folhas (JORGE et al 2004) Assim

como fenoacuteis taninos gaacutelicos (CAMPAROTO et al 2002) flavonoacuteides e outros

compostos (SILVA et al 1991 LEITE et al 2001)

17

Jorge et al (2004) avaliaram a eficaacutecia de extratos de M ilicifolia como

antinflamatoacuterio na proteccedilatildeo contra lesotildees gaacutestricas incluindo a cicatrizaccedilatildeo e

citoproteccedilatildeo sugerindo que os extratos de Maytenus ilicifolia podem representar uma

importante alternativa cliacutenica em antinflamatoacuterios e antiulcerogecircnico

Souza-Formigoni et al (1991) avaliaram a potencialidade dos efeitos

antiulcerogecircnicos das folhas de espinheira santa em experimentos realizados em ratos

com ulceras O uso de chaacute tanto por via oral como intraperitoneal mostrou resultados

semelhantes agrave droga cicatrizante cimetidina M ilicifolia assim como outras espeacutecies da

famiacutelia Celastraceae foram investigadas quanto aos seus constituintes de accedilatildeo

citotoacutexica sendo isolados triterpenos aromaacuteticos de accedilatildeo antitumoral Segundo Itokawa

et al (1991 1993) e Shirota et al (1994) os triterpenos satildeo capazes de estimular

fatores atuantes na proteccedilatildeo da mucosa gaacutestrica como a produccedilatildeo de muco e

prostaglandinas

A cimetidina eacute um potente agente na supressatildeo de aacutecido gaacutestrico e pepsina ela

age como antagonista competitivo da histamina nos receptores H2 das ceacutelulas parietais

gaacutestricas produtoras de aacutecido dessa forma bloqueia a secreccedilatildeo aacutecida (SOUZA-

FORMIGONI et al 1991) Ferreira et al (2004) investigaram o efeito e possiacutevel

mecanismo de accedilatildeo do extrato aquoso liofilizado de M ilicifolia sobre a secreccedilatildeo de

aacutecidos em mucosa gaacutestrica de sapos Foi observada uma reduccedilatildeo de 16 da secreccedilatildeo

aacutecida sugerindo os autores que essa reduccedilatildeo ocorra devido a uma atividade

antagoniacutestica dos extratos nos receptores de H2 de histidina

Montanari Carvalho e Dolder (1998) analisaram os efeitos de extratos

etanoacutelicos de M ilicifolia na espermatogecircnese de camundongos e natildeo encontraram

qualquer defeito ou distuacuterbio Poreacutem Montanari e Bevilacqua (2002) em estudos com

fecircmeas de ratos constataram uma diminuiccedilatildeo significativa na implantaccedilatildeo dos embriotildees

com a utilizaccedilatildeo de extrato liofilizado das folhas

18

352 Endoacutefitos isolados de Maytenus ilicifolia

Pileggi (2006) isolou microrganismos endofiacuteticos de folhas peciacuteolos e sementes

de Maytenus ilicifolia e investigou o potencial farmacoloacutegico dos mesmos Foram

isolados em maior frequumlecircncia os fungos Alternaria sp Colletotricum sp Bipolaris sp

Phyllosticta sp e Cladosporium sp Entre os fungos e bacteacuterias testados 15

apresentaram potencial para o controle bioloacutegico Na anaacutelise de caracterizaccedilatildeo

morfoloacutegica por RAPD foi sugerida a presenccedila de duas espeacutecies de Coletotricum

isolados de Maytenus ilicifolia

Figueiredo (2006) isolou de Maytenus ilicifolia fungos endofiacuteticos e os avaliou

quanto ao potencial antimicrobiano contra bacteacuterias patogecircnicas em humanos e o fungo

fitopatogecircnico Guignardia citricarpa agente causal da Mancha Preta do Citros Os

extratos metanoacutelicos de dois isolados exibiram accedilatildeo fungistaacutetica na germinaccedilatildeo e no

crescimento micelial de G citricarpa Dois extratos de Pestalotiopsis sp inibiram o

crescimento dos microrganismos-teste (S aureus oxalino resistente Klebsiella

pneumoniae Micrococcus luteus Staphylococcus aureus e Escherichia coli)

Bacteacuterias com potencial anti-leucemico foram isoladas de Maytenus essas

bacteacuterias interagem com as plantas na produccedilatildeo de alguns metaboacutelitos como a

maytensina substancia que tambeacutem apresenta propriedades antifuacutengicas

Azevedo et al (2000) relataram a presenccedila de bacteacuterias endofiacuteticas em folhas de

Maytenus aquifolium Foram isolados vinte gecircneros os mais frequumlentes foram Bacillus

Clavibacter e Streptomyces aleacutem de actinomicetos Testes preliminares mostraram que

algumas das bacteacuterias podem produzir ansamacroliacutedeos que tambeacutem satildeo produzidos

pela planta hospedeira

36 Guignardia citricarpa Kiely e a Mancha preta do citros

O gecircnero Guignardia foi descrito em 1982 por Viala e Ravaz e compreende as

formas teleomoacuterficas de espeacutecies de Phyllosticta e de alguns outros gecircneros

19

relacionados de fungos imperfeitos geralmente saproacutefitas ou semiparasitas de folhas

(SIVANESAN 1984)

Diversos autores isolaram espeacutecies de Phyllosticta de plantas aparentemente

sadias descrevendo-as como endofiacuteticas (CARROLL e CARROLL 1978 PETRINI

1986 LEUCHTMANN et al 1992 GLIENKE 1995 PENNA 2000) No entanto existe

um grande nuacutemero de relatos citando este gecircnero como fitopatogecircnico de diversas

culturas com grande importacircncia econocircmica como arroz (SUGHA SINGH E SHARMA

1986) cana-de-accediluacutecar (PONS 1990) tabaco (PATEL et al 1988) e eucalipto (CROUS

et al 1993) e tambeacutem frutiacuteferas como abacate e tomate (BAKER 1938) manga e

mamatildeo (McMILLAN JR 1986) uva (IBRAHIM e BAYCA 1989) e principalmente em

citros (McONIE 1964a 1964b HERBERT e GRECH 1985 JOHNSTON e

FULLERTON 1988)

O fungo Guignardia citricarpa Kiely (anamorfo Phyllosticta citricarpa (McALP)

Van Der Aa) eacute um Ascomiceto da ordem Dothideales famiacutelia Dothideaceae Possui

estroma plectenquimatoso pseudoteacutecio globoso a subgloboso medindo 125 a 360 μm

de diacircmetro contendo um poro de 14 a 16 μm e paredes espessas com 20 a 22 μm

Seu asco apresenta forma de clava arredondado na extremidade superior e eacute

bitunicado Conteacutem oito ascoacutesporos unicelulares hialinos ligeiramente cinzentos

romboacuteides contendo gracircnulos e um grande vacuacuteolo central Os ascoacutesporos satildeo

cobertos com um quepe gelatinoso nas extremidades Segundo Sivanesam (1984)

pseudoparaacutefises satildeo encontradas em pseudoteacutecios maduros De acordo com Johnston

e Fullerton (1988) as formas anamorfas e teleomorfa geralmente satildeo encontradas

associadas

As estruturas de frutificaccedilatildeo satildeo os picniacutedios que macroscopicamente satildeo

pequenos globosos pretos e semi-eruptivos A fase sexuada corresponde agrave produccedilatildeo

de ascoacutesporos os quais se encontram em nuacutemero de oito no interior dos ascos Estes

apresentam forma de clava satildeo arredondados na extremidade superior e bitunicados

Os ascoacutesporos satildeo unicelulares hialinos levemente acinzentados romboacuteides

contendo gracircnulos e um grande vacuacuteolo central cobertos com um quepe gelatinoso nas

extremidades (SIVANESAN 1984)

20

Fialho (2004) avaliou in vitro o potencial de linhagens de S cerevisiae como

agentes no controle bioloacutegico contra G citricarpa nos frutos poacutes-colheita Rodrigues

(2006) avaliou o efeito dos principais fungicidas utilizados no campo para o controle da

doenccedila Tambeacutem avaliou 96 linhagens de fungos para a seleccedilatildeo de potenciais agentes

no controle bioloacutegico demonstrando que algumas espeacutecies de Trichoderma satildeo

capazes de atuar in vitro como biocontroladores do fitopatoacutegeno G citricarpa

Cardoso-Filho (2003) avaliou o uso de indutores de resistecircncia Saccharomyces

cerevisiae Bionreg e aacutecido saliciacutelico ao fitopatoacutegeno G citricarpa O autor destaca que os

compostos presentes no albedo (mesocarpo) da laranja como a celulose carboidratos

soluacuteveis pectinas compostos fenoacutelicos (flavonoacuteides) aminoaacutecidos e vitaminas podem

exibir a accedilatildeo antimicrobiana para o controle da MPC Neste contexto ele avaliou os

extratos produzidos pelo albedo da laranja e comprovou accedilatildeo fungicida ou fungistaacutetica

inibindo a germinaccedilatildeo esporulaccedilatildeo e crescimento micelial in vitro de G citricarpa

Blanco (1999) e Christo (2002) observaram esta variabilidade entre linhagens

isoladas de lesatildeo de Mancha Preta de Citros (MPC) ou seja linhagens de G citricarpa

utilizando dados de RAPD Esta variabilidade tambeacutem foi evidenciada em linhagens

isoladas em plantas assintomaacuteticas atualmente descritas como Guignardia mangiferae

(GLIENKE-BLANCO et al 2002 CHRISTO 2002 BAAYEN et al 2002 OKANI

NAKAGIRI e ITO 2001 RODRIGUES et al 2004)

Em 1999 Glienke-Blanco comparou geneticamente por meio de marcadores de

RAPD linhagens de populaccedilotildees patogecircnicas e endofiacuteticas de Guignardia sp de

diversas regiotildees e hospedeiros constatando a existecircncia de trecircs populaccedilotildees de

Guignardia geneticamente muito diferentes coexistindo em citros sendo duas

endofiacuteticas e uma patogecircnica sugerindo que talvez estas trecircs populaccedilotildees pudessem

pertencer a espeacutecies distintas O desenvolvimento de um par de oligonucleotiacutedeos

capaz de amplificar um fragmento de 370 pb especiacutefico para linhagens patogecircnicas de

G citricarpa veio a corroborar para distinccedilatildeo geneacutetica entre estes grupos (GLIENKE et

al 2007)

21

361 Mancha Preta do Citros

A doenccedila mancha preta dos citros (MPC) foi descrita na Austraacutelia em 1985 por

Kiely posteriormente na Aacutefrica do Sul como consequumlecircncia da importaccedilatildeo de mudas da

Austraacutelia Atualmente estaacute distribuiacuteda em regiotildees subtropicais do mundo entre elas o

Brasil (GOacuteES et al 2005)

O ciclo da doenccedila (MPC) inicia-se com a disseminaccedilatildeo dos coniacutedios ou

picnidioacutesporos (esporos assexuais) e ascoacutesporos (esporos sexuais) do fungo

Guignardia citricarpa Os coniacutedios (picnidioacutesporos) satildeo responsaacuteveis pelas infecccedilotildees agrave

curta distacircncia e estatildeo localizados no interior dos picniacutedios oriundos dos frutos

infectados Um agregado de coniacutedios emerge atraveacutes da abertura do picniacutedio (ostiacuteolo)

dissolve-se na aacutegua da chuva orvalho ou irrigaccedilatildeo e cai sobre os pequenos frutos

susceptiacuteveis que se formam apoacutes as floradas Jaacute os ascoacutesporos satildeo responsaacuteveis pela

disseminaccedilatildeo agrave curta e longa distacircncia pois satildeo lanccedilados dos periteacutecios que se

formam em folhas caiacutedas ao solo e satildeo levados por correntes aeacutereas infectando

pequenos frutos susceptiacuteveis (ROBES 1990)

Em estudo epidemioloacutegico da MPC Spoacutesito et al (2008) analisou 27270 frutos

colhidos de 303 aacutervores quanto agrave incidecircncia da doenccedila (porcentagem de frutos doentes

por aacutervore) e quanto agrave severidade da doenccedila (aacuterea com sintoma do fruto) O autor

encontrou frutos doentes em 251 aacutervores das 303 analisadas (83) com diferentes

niacuteveis de incidecircncia Algumas aacutervores tinham a maioria das frutas com lesotildees

agregadas e de alta gravidade enquanto outras tinham a maioria das frutas com

poucas lesotildees e baixa gravidade Segundo os autores quando o agente patogecircnico eacute

disperso pela aacutegua da chuva esta pode transportar muitos esporos de uma vez

formando uma lesatildeo O padratildeo de sintomas resultantes a partir deste tipo de dispersatildeo

eacute tipicamente agregada Os autores concluiacuteram que os ascoacutesporos satildeo os mais

importantes inoacuteculos de G citricarpa

A MPC caracteriza-se por apresentar lesotildees com bordas salientes e com

depressatildeo no centro onde se observam pequenos pontos pretos os picniacutedios As

lesotildees podem atingir os frutos maduros ou no iniacutecio de maturaccedilatildeo podendo aparecer

22

apoacutes a colheita no transporte e armazenamento (ROBES et al 1995) A MPC afeta

apenas a casca do fruto e o flavedo (epicarpo) sem causar dano internamente limitado

pelo albedo (mesocarpo) Poreacutem sua comercializaccedilatildeo no mercado de frutas eacute

prejudicada assim como a sua exportaccedilatildeo devido agrave barreira fitossanitaacuteria existente na

Uniatildeo Europeacuteia por ser uma doenccedila quarentenaacuteria A1 Nos casos em que a doenccedila

atinge o pedicelo do fruto pode ocorrer agrave queda prematura do fruto aumentando as

perdas na produccedilatildeo e ateacute limitando seriamente a citricultura em vaacuterios estados

brasileiros (GOacuteES et al 2005 ROBES et al 1995)

Em funccedilatildeo dos prejuiacutezos causados por G citricarpa na comercializaccedilatildeo de

frutos in natura principalmente no mercado externo satildeo crescentes os estudos que

datildeo ecircnfase ao controle bioloacutegico da doenccedila

37 O Gecircnero Phomopsis sp

O gecircnero Phomopsis descrito em 1905 por (Sacc) Bubak (RIEDL 1981) forma

picniacutedios escuros com ostiacuteolo normalmente em forma de pecircra conidioacuteforos simples

alfa coniacutedios hialinos com gotas nas extremidades predominantemente elipsoacuteides sem

septos unicelulares de forma ovoacuteide Apresenta tambeacutem beta coniacutedios hialinos sem

gotas filiformes a maioria curvos em uma das extremidades sem septos (HANLIN e

MENEZES 1996)

Outra caracteriacutestica dos fungos do gecircnero Phomopsis eacute a formaccedilatildeo de linhas

negras estreitas em tecidos de plantas contaminadas assim como no meio de cultura

em que satildeo repicados (BRAYFORD 1990)

O gecircnero Phomopsis pertence ao filo Ascomycota subfilo Pezizomycotin classe

Sordariomycetes subclasse Sordariomycetidae ordem Diaporthales famiacutelia Valsaceae

mitosporic Valsaceae Apresenta-se na forma anamoacuterfica o seu teleomorfo eacute o

Diaporthe cujo habitat eacute o caule de plantas lenhosas e herbaacuteceas (HANLIN e

MENEZES 1996)

Espeacutecies de Phomopsis satildeo comumente encontradas como patoacutegenos e

endoacutefitos de plantas (BODDY e GRIFFITH 1989) Tradicionalmente o gecircnero tem sido

23

considerado altamente patogecircnico (REHNER e UECKER 1994) mas algumas

espeacutecies de Phomopsis satildeo entretanto endoacutefitos mutualiacutesticos (WEBBER e GIBBS

1984 CARROLL 1986)

Espeacutecie de Phomopsis e Diaporthe tecircm sido tradicionalmente descritos com

base na espeacutecie hospedeira Poreacutem algumas espeacutecies e isolados podem infectar mais

de um hospedeiro (BRAYFORD 1990 FARR CASTLEBURY e ROSSMAN 2002) tal

estrateacutegia tem sido frequentemente questionada (REHNER e UECKER 1994)

Trabalhos incluindo estudos de cruzamentos mostraram que esse criteacuterio natildeo eacute

suficiente para classificaccedilatildeo ao niacutevel de espeacutecie Aleacutem disso isolados de Phomopsis

provenientes do mesmo hospedeiro natildeo necessariamente pertencem agrave mesma espeacutecie

assim como uma mesma espeacutecie de Phomopsis pode infectar diferentes hospedeiros

(REHNER e UECKER 1994)

Foram descritas mais de 1000 espeacutecies do gecircnero Phomopsis baseado

principalmente na associaccedilatildeo com o hospedeiro (UECKER 1988) Embora o

hospedeiro seja atualmente considerado menos importante na definiccedilatildeo de espeacutecies

nenhuma revisatildeo do gecircnero foi realizada A fase teleomoacuterfica (Diaporthe) foi descrita

apenas para aproximadamente 20 das espeacutecies do gecircnero Phomopsis (PHILLIPS

2006) Essa ausecircncia da fase teleomorfica (Diaporthe) em meio de cultura

(principalmente quando isolado endofiticamente) torna a identificaccedilatildeo ao niacutevel de

espeacutecie neste gecircnero muito difiacutecil (REHNER e UECKER 1994)

Wehmeyer (1933) elaborou uma revisatildeo do gecircnero Diaporthe o autor

considerou a associaccedilatildeo com o hospedeiro uma caracteriacutestica de menor importacircncia

tendo reduzido de 650 para 70 o nuacutemero de espeacutecies no gecircnero No entanto este

estudo baseou-se unicamente em caracteriacutesticas morfoloacutegicas do teleomorfo natildeo tendo

sido consideradas as caracteriacutesticas do anamorfo

A delimitaccedilatildeo de espeacutecies de Phomopsis baseado apenas em caracteriacutesticas

morfoloacutegicas demonstrou-se inadequada (VAN DER AA 1990) Em adiccedilatildeo as

caracteriacutesticas de morfologia do coniacutedio e caracteriacutesticas da colocircnia usadas para

identificar espeacutecies alguns autores tecircm utilizado caracteres alternativos que incluem

virulecircncia (VIDIC 1991) proteiacutenas e sorologia (LEE e SNOW 1992 VELICHETI et al

24

1991) sequumlecircncias ITS (ZHANG et al 1998) e enzimas e metaboacutelitos secundaacuterios

(SHIVAS ALLEN e WILLIAMSON 1991) Infelizmente nenhum caraacuteter foi aplicaacutevel

para distinguir todos os grupos de isolados (REHNER e UECKER 1994)

O entendimento sobre o gecircnero expandiu-se por meio de estudos de sequumlecircncias

ITS nos quais alguns dos isolados agruparam-se por regiotildees geograacuteficas (REHNER e

UECKER 1994) Alguns trabalhos tecircm comparado dados morfoloacutegicos com dados

moleculares principalmente o uso de sequumlecircncias da regiatildeo ITS do DNA ribossomal

Zhang et al (1998) destingiu cinco taacutexons de Phomopsis isolados de Soja (Glycine

max) utilizando sequumlecircncias da regiatildeo ITS do DNA ribossomal poreacutem natildeo foram

capazes de diferenciar-los com base nas caracteriacutesticas morfoloacutegicas Farr et al (2002)

caracterizaram por anaacutelise molecular com o uso de sequumlecircncias ITS1 58S ITS2 e por

caracteriacutesticas morfoloacutegicas linhagens de Phomopsis sp isolados de Vaccinium

corymbosum e V macrocarpon Baseados nesse estudo verificaram que a maioria dos

isolados tratava-se de Phomopsis vaccinii uma vez que as sequumlecircncias agruparam-se

com uma cultura referecircncia dessa espeacutecie

Castlebury e Mengistu (2006) avaliaram Phomopsis isolados de soja e outros

hospedeiros combinando dados de sequumlecircncias de ITS do DNA ribossomal o

sequumlenciamento do gene EF1-alpha e genes de actina seis grupos de Phomopsis

foram formados desses trecircs correspondem aos taacutexons P longicolla Diaporthe

melonis e D phaseolorum Os autores concluiacuteram entatildeo que agrave ausecircncia de distinccedilatildeo

morfoloacutegica e informaccedilatildeo bioloacutegica torna problemaacutetica a identificaccedilatildeo de espeacutecies aos

grupos de isolados geneticamente distintos Aleacutem disso natildeo estaacute esclarecida a

importacircncia bioloacutegica e geneacutetica dos diferentes grupos e trabalhos adicionais quanto

aos hospedeiros patogenicidade e morfologia satildeo necessaacuterios para resolver a distinccedilatildeo

de espeacutecies neste gecircnero

O gecircnero Phomopsis eacute um importante grupo de fungos com potencial

biotecnoloacutegico devido agrave produccedilatildeo de importantes metaboacutelitos secundaacuterios entre os

quais se incluem o micotoxinas que afeta o sistema nervoso de vertebrados (BILLS et

al 2002) alcaloacuteides com capacidades farmacoloacutegicas tais como phomopsins

(COCKRUM PETTERSON e EDGAR 1994) e 24-diidroxi-56-dimetil benzoato de etila

25

e phomopsilactona produzidos por Phomopsis cassiae endofiacutetico de Cassia

specatabilis (SILVA et al 2005)

38 Marcadores Moleculares

A variabilidade geneacutetica em microrganismos pode ser detectada por teacutecnicas

claacutessicas ou moleculares As teacutecnicas claacutessicas baseiam-se na anaacutelise de fenoacutetipos a

partir da caracterizaccedilatildeo morfoloacutegica (produccedilatildeo de coniacutedios crescimento radial da

colocircnia) ou bioquiacutemica (produccedilatildeo de substacircncias auxotrofias) restringindo a

possibilidade de se conduzir estudos populacionais e muitas vezes de sistemaacutetica As

teacutecnicas moleculares por sua vez fornecem ferramentas para evidenciar e entender

melhor diversos aspectos relacionados direta ou indiretamente com o DNA Desta

forma a anaacutelise dos aacutecidos nucleacuteicos vem sendo amplamente utilizada na diferenciaccedilatildeo

de organismos e no esclarecimento taxonocircmico e filogeneacutetico dos organismos

estudados

Os diversos meacutetodos de detecccedilatildeo de polimorfismo geneacutetico diretamente ao niacutevel

de aacutecidos nucleacuteicos tecircm permitido a anaacutelise molecular da variabilidade do DNA

determinando pontos de referecircncia nos cromossomos tecnicamente denominados

ldquomarcadores molecularesrdquo Por marcador molecular define-se todo e qualquer fenoacutetipo

molecular oriundo de um gene expresso ou de um segmento especiacutefico de DNA

(GRATTAPAGLIA e FERREIRA 1998)

Os dados moleculares frequumlentemente complementam e corroboram hipoacuteteses

baseadas em estudos morfoloacutegicos embora algumas vezes os resultados obtidos da

anaacutelise de DNA sejam conflitantes com dados de anaacutelise exclusivamente feneacuteticas

Esta contradiccedilatildeo pode ser observada principalmente na classificaccedilatildeo taxonocircmica de

microrganismos (SAMUELES e SEIFERT 1995)

Algumas teacutecnicas moleculares utilizadas principalmente em fungos para a

detecccedilatildeo do polimorfismo geneacutetico de sequumlecircncias de DNA satildeo Eletroforese em Campo

Pulsado (PFGE) Polimorfismos dos fragmentos de Restriccedilatildeo (RFLPs) Polimorfismos

26

do DNA Amplificados ao Acaso (RAPDs) Sequumlenciamento das Regiotildees Internas

Transcritas (ITS1 e ITS2) do DNA ribossocircmico (rDNA)

Aleacutem de avaliarem a variabilidade geneacutetica estes marcadores moleculares

podem determinar relaccedilotildees filogeneacuteticas como tambeacutem colaborar na identificaccedilatildeo de

um determinado isolado Tais marcadores podem ser gerados independentemente do

fenoacutetipo e revelar polimorfismos altamente informativos em sequumlecircncias de DNA

A teacutecnica de RFLP surgiu a partir da descoberta de que os siacutetios para enzimas

de restriccedilatildeo poderiam ser polimoacuterficos ou seja alteraccedilotildees em um uacutenico par de bases

que muitas vezes satildeo neutras poderiam ser detectadas pela presenccedila ou ausecircncia

destes siacutetios para endonucleases Esta teacutecnica propiciou a introduccedilatildeo de um elevado

nuacutemero de marcadores moleculares nas anaacutelises de variabilidade geneacutetica (ALBERTS

et al 2004) Dentre as inuacutemeras aplicaccedilotildees dos marcadores RFLP pode-se citar o

estudo da evoluccedilatildeo dos genomas a identificaccedilatildeo de genes especiacuteficos o estudo de

geneacutetica de populaccedilotildees a taxonomia e obtenccedilatildeo de mapas geneacuteticos (MICHELEMORE

e HULBERT 1987) Entretanto seu uso torna-se limitado pois eacute necessaacuterio DNA de

alta qualidade e em grande quantidade (GLIENKE 1995)

O uso do DNA ribossomal (rDNA) como marcador molecular tambeacutem pode ser

empregado na anaacutelise da variabilidade geneacutetica para uma ampla faixa de niacuteveis

taxonocircmicos As sequumlecircncias codificantes do rDNA evoluem muito lentamente e satildeo

altamente conservadas possibilitando a sua utilizaccedilatildeo em estudos com organismos

pouco relacionados taxonomicamente Ao contraacuterio do rDNA as regiotildees espaccediladoras

internas destes genes conhecidas como ITS evoluem rapidamente apresentando alto

polimorfismo e sendo desta forma de grande interesse nos estudos filogeneacuteticos de

gecircneros espeacutecies e populaccedilotildees (WHITE e MORROW 1990)

A reaccedilatildeo em cadeia da polimerase (PCR) tornou-se uma das mais importantes e

utilizadas teacutecnicas em Biologia Molecular por apresentar rapidez baixo custo e

capacidade de amplificaccedilatildeo de pequenas quantidades de DNA (MULLIS e FALOONA

1987 WHITE e MORROW 1989)

Concebida por KARY MULLIS em meados da deacutecada de 80 a teacutecnica baseia-se

em amplificar fragmentos de sequumlecircncias de DNA com alta especificidade e fidelidade

27

utilizando oligonucleotiacutedeos especiacuteficos ou natildeo Tais oligonucleotiacutedeos delimitam a

sequumlecircncia de DNA gerando um sinal molecular que pode ser amplificado (MULLIS e

FALOONA 1987 WHITE e MORROW 1989 McPHERSON QUIRKE e TAYLOR

1991 GRATTAPAGLIA e FERREIRA 1998)

A PCR consiste em uma teacutecnica in vitro capaz de produzir muacuteltiplas coacutepias de

sequumlecircncias especificas de DNA Alterando-se as condiccedilotildees de reaccedilatildeo pode-se

amplificar cadeias simples de DNA detectar e distinguir entre genes portadores de

mutaccedilatildeo em uma uacutenica base ou proporcionar quantidades suficientes de DNA para

anaacutelise eou manipulaccedilatildeo subsequumlente (WALKER e RAPLEY 1999)

Uma das limitaccedilotildees da teacutecnica PCR eacute a necessidade do conhecimento preacutevio da

sequumlecircncia que flanqueia o segmento a ser amplificado para que os oligonucleotiacutedeos

possam ser construiacutedos (WATSON et al 1992 ALBERTS et al 2004) A teacutecnica de

RAPD entretanto natildeo apresenta este obstaacuteculo pois segundo Williams et al (1990)

esta teacutecnica baseia-se na amplificaccedilatildeo de segmentos de DNA por um uacutenico

oligonucleotiacutedeo de sequumlecircncia arbitraacuteria que amplifica vaacuterias regiotildees simultaneamente

381 Marcadores RAPD

O RAPD (polimorfismo do DNA amplificado ao acaso) envolve a utilizaccedilatildeo de

oligonucleotiacutedeos de sequumlecircncia arbitraacuteria que amplificam vaacuterias regiotildees do genoma

simultaneamente (WILLIAMS et al 1990 WELSH E MCCLELLAND 1990

VILARINHOS et al 1995 FUNGARO et al 1996 ALZATE-MARIN et al 1997

ABBASI et al 1999 PAAVANEM-HUHTALA AVIKAINEM e YLI-MATTILA 2000)

Dessa forma natildeo eacute necessaacuterio o desenvolvimento preacutevio de uma biblioteca de sondas

especiacuteficas para o organismo de interesse

A teacutecnica de RAPD utiliza o mesmo princiacutepio da PCR (SAIKI et al 1985) A

principal diferenccedila entre a PCR usual e o RAPD estaacute na reaccedilatildeo de amplificaccedilatildeo que

utiliza apenas um uacutenico oligonucleotiacutedeo com sequumlecircncia arbitraacuteria de 10 a 15 bases A

amplificaccedilatildeo somente ocorre se este oligonucleotiacutedeo for complementar a um siacutetio em

uma das fitas e complementar a um mesmo siacutetio (orientaccedilatildeo invertida) na outra fita de

28

DNA (GRATTAPAGLIA e FERREIRA 1998) Segundo Williams et al (1993) o tamanho

ideal do oligonucleotiacutedeo para amplificaccedilatildeo de RAPD eacute em torno de dez bases

devendo seu conteuacutedo GC ser em torno de 50 a 70 e no miacutenimo de 40 Aleacutem disso

os oligonucleotiacutedeos natildeo devem conter sequumlecircncias palindrocircmicas a fim de evitar o

autopareamento

Os marcadores RAPD tecircm sido amplamente utilizados para o estudo de diversos

grupos de seres vivos A partir dos marcadores moleculares clonados e sequumlenciados

haacute a possibilidade de sintetizar oligonucleotiacutedeos especiacuteficos aumentando o seu poder

de resoluccedilatildeo (GRATTAPAGLIA e FERREIRA 1998)

Esses marcadores permitem caracterizar e avaliar o grau de similaridade

geneacutetica entre genoacutetipos em niacuteveis inter e intraespeciacuteficos sendo altamente sensiacuteveis

quanto diferenccedilas de ateacute um uacutenico nucleotiacutedeo entre o oligonucleotiacutedeo e o DNA molde

Permitem ainda analisar a estrutura geneacutetica de populaccedilotildees naturais populaccedilotildees de

melhoramento e bancos de germoplasma a construccedilatildeo de mapas geneacuteticos de alta

cobertura genocircmica a localizaccedilatildeo de genes de interesse econocircmico e ainda a

obtenccedilatildeo de novos marcadores para diagnoacutesticos via PCR (FUNGARO e VIEIRA 1998

FUNGARO 2000 GLIENKE-BLANCO et al 2002 ANCHORENA-MATIENZO 2002)

Diferentes niacuteveis taxonocircmicos podem ser inferidos atraveacutes de marcadores

RAPD cujos padrotildees podem apresentar-se como variaacuteveis quando polimoacuterficos e

constantes quando natildeo-polimoacuterficos

Avaliando a variabilidade geneacutetica de organismos geneticamente relacionados

diversos autores confrontaram resultados obtidos a partir de anaacutelises moleculares ao

niacutevel de proteiacutenas com os dados obtidos a partir de marcadores moleculares de DNA

Meijer Megnegneau e Linders (1994) estudando linhagens de Phomopsis subordinaria

isoladas de 23 localidades diferentes chegaram a resultados conflitantes obtidos por

RAPD e isoenzimas Os marcadores de RAPD mostraram alta similaridade entre 47

linhagens de P subordinaria isoladas de oito localidades diferentes enquanto a anaacutelise

por isoenzimas sugeriu que todas as linhagens eram idecircnticas

Jaacute Pioli et al (2003) caracterizaram por RAPD isolados do complexo

DiaporthePhomopsis coletados de soja na Argentina Eles foram separados em quatro

29

grupos (i) Diaporthe phaseolorum variedade meridionalis (ii) D phaseolorum variedade

caulivora (iii) D phaseolorum variedade sojae and (iv) Phomopsis longicolla revelando

a existecircncia de variabilidade entre isolados da mesma variedade

Fernandez e Hanlin (1996) obtiveram resultados concordantes entre a anaacutelise

molecular por RAPD e as caracteriacutesticas morfoculturais separando os isolados

coletados de soja em dois grupos Diaporthe phaseolorum e Phomopsis longicolla

Os marcadores de RAPD tambeacutem podem ser usados na anaacutelise de

recombinantes obtidos por parameiose em Beauveria bassiana (DALZOTO et al 2003)

A teacutecnica RAPD tambeacutem eacute utilizada como um meacutetodo eficiente na diferenciaccedilatildeo

de microrganismos patogecircnicos e natildeo patogecircnicos Guthirie et al (1992) e Vasconcelos

(1994) caracterizaram diferentes espeacutecies do gecircnero Colletotrichum diferenciando-as

quanto agrave sua patogenicidade

Grajal-Martin Simon e Muehlbauer (1993) conseguiram diferenciar o tipo 2 de

Fusarium oxysporum f sp pisi de trecircs outros grupos por marcadores RAPDs Da

mesma maneira isolados patogecircnicos de Fusarium oxysporum f sp dianthi que

atacam cravos puderam ser distinguidas de vaacuterios natildeo patogecircnicos por marcadores

RAPD (MANULIS et al 1993)

Blanco (1999) utilizando seis oligonucleotiacutedeos de RAPD confirmou a existecircncia

de trecircs populaccedilotildees distintas de Guignardia citricarpa coexistindo em citros sendo duas

endofiacuteticas e uma patogecircnica responsaacutevel pelas lesotildees da mancha preta nos citros

Glienke-Blanco et al (2002) utilizando sete oligonucleotiacutedeos de RAPD encontraram

alta variabilidade geneacutetica em linhagens endofiacuteticas de Guignardia citricarpa isoladas

de plantas assintomaacuteticas de citros

382 Marcadores ITS

O DNA ribossocircmico contido nas regiotildees organizadoras de nucleacuteolos (NOR) tem

sido objeto de um grande nuacutemero de estudos com diversas aplicaccedilotildees em geneacutetica

evoluccedilatildeo e melhoramento Tal interesse estaacute diretamente relacionado agrave estrutura

destas regiotildees que se encontram em locais especiacuteficos do genoma e repetidos em

30

sequumlecircncia inuacutemeras vezes A funccedilatildeo do rDNA eacute codificar as diferentes moleacuteculas de

RNA ribossocircmico (GRATTAPAGLIA e FERREIRA 1998)

Segundo White et al (1990) as regiotildees espaccediladoras internas do DNA

ribossomal (ITS) evoluem rapidamente apresentando alto polimorfismo ao contraacuterio

do rDNA e sendo assim essas regiotildees satildeo de grande interesse nos estudos

filogeneacuteticos em niacuteveis de gecircnero espeacutecies e populaccedilotildees Esta caracteriacutestica permite

ainda a sua utilizaccedilatildeo na obtenccedilatildeo de polimorfismos de comprimento de fragmentos

(RFLP) nos loci de rDNA O nuacutemero de coacutepias de uma determinada sequumlecircncia de

rDNA e variaccedilotildees de nucleotiacutedeos nestas sequumlecircncias tambeacutem tecircm sido utilizados em

tais estudos (FERREIRA 1994)

Orsquodonnell e Gray (1995) avaliaram a relaccedilatildeo filogeneacutetica e a variaccedilatildeo geneacutetica

dentro de 24 isolados do complexo Fusarium solani por meio da sequecircncia de rDNA e

marcador RFLP e concluiacuteram que esta espeacutecie eacute formada por espeacutecies filogeneacuteticas

distintas Utilizando a mesma teacutecnica Ouellet e Seiffert (1993) diferenciaram F

graminearum de outras 11 espeacutecies que atacam trigo aleacutem de terem permitido a

identificaccedilatildeo de diversas raccedilas desta espeacutecie provenientes de isolados

morfologicamente semelhantes

Jasalavich Ostrofskf e Jellison (2000) utilizaram os oligonucleotiacutedeos ITS1 e

ITS4 (especiacutefico para basidiomicetos) na identificaccedilatildeo de microrganismos A

amplificaccedilatildeo da regiatildeo ITS1-58S-ITS2 detectou a presenccedila de basidiomicetos em

diferentes amostras Testes complementares foram realizados no produto da

amplificaccedilatildeo por meio da teacutecnica de RFLP permitindo a identificaccedilatildeo de espeacutecie

Satoko et al (2000) e Promputtha et al (2005) utilizaram a regiatildeo ITS1 58S e

ITS2 do rDNA para identificar fungos endofiacuteticos que natildeo esporularam sendo relatados

como Phomopsis e Diaporthe (anamoacuterfico Phomopsis)

Farr Castlebury e Rossman (2002) caracterizaram por anaacutelise molecular com o

uso de sequumlecircncias ITS1 58S ITS2 e por caracteriacutesticas morfoloacutegicas linhagens de

Phomopsis sp isolados de Vaccinium corymbosum e V macrocarpon Baseados nesse

estudo verificaram que a maioria dos isolados tratava-se de Phomopsis vaccinii uma

vez que as sequumlecircncias agruparam-se com uma cultura referecircncia dessa espeacutecie

31

Mostert et al (2001) tambeacutem usaram anaacutelise filogeneacutetica das regiotildees 58S ITS1

e ITS2 e DNA mitocondrial para elucidar a taxonomia de espeacutecies de Phomopsis

obtidas de vinhedos Eles observaram que os fungos endofiacuteticos tratavam-se de

Diaporthe perjuncta e Phomopsis sp taacutexon 1 Jaacute os isolados patogecircnicos e com alta

virulecircncia pertenciam a espeacutecie Phomopsis viticola assim como os isolados descritos

em estudos anteriores como Phomopsis taacutexon 2 Eles tambeacutem puderam elucidar que

os isolados descritos na Austraacutelia como Phomopsis taacutexon 4 tratavam-se de Libertella

sp excluindo-o do complexo P viticola

Djaouida et al (2004) sequenciaram as regiotildees ITS1 58S e ITS2 e do gene

mitocondrial atp6 para avaliar a diversidade molecular de linhagens patogecircnicas contra

o girassol de Diaporthe helianthi (anamoacuterfico Phomopsis helianthi) isolados de

diferentes origens geograacuteficas

32

4 MATERIAL E MEacuteTODOS 41 Material Bioloacutegico 411 Fungos endofiacuteticos

Quarenta e oito isolados endofiacuteticos de Phomopsis spp e um de Diaporthe sp

foram utilizados neste estudo (TABELA 1) Destes oito foram cedidos cordialmente pela

Dra Kaacutetia Rodriguez e foram isolados de Spondias mombin (Cajazeiro) Myracrodruon

urundeuva (Aroeira) e Aspidosperma tomentosum (Peroba-de-campos) e dois isolados

de Maytenus ilicifolia (Espinheira Santa) cedidos gentilmente pela Dra Socircnia Pileggi

Dezessete isolados foram obtidos de amostras de folhas de Schinus terebinthifolius

(Aroeira Vermelha) coletados em 2007 pelo MsC Jocinei Lima e fazem parte do banco

bioloacutegico do Laboratoacuterio de Geneacutetica de Microrganismos (LABGEM) da Universidade

Federal do Paranaacute Curitiba Paranaacute Vinte e um isolados de Phomopsis sp e um

isolado de Diaporthe sp foram obtidos como endoacutefitos de folhas e peciacuteolos de M

ilicifolia (espinheira santa) em quatro coletas de outubro de 2006 a julho de 2007 no

Centro Nacional de Pesquisa de Floresta (CNPF) da EMBRAPA (Empresa Brasileira de

Pesquisa Agropecuaacuteria) localizada no municiacutepio de Colombo Paranaacute Dois isolados de

Phomopsis patoacutegenos de soja foram utilizados como linhagens referecircncia (TABELA 1)

TABELA 1 ISOLADOS DE Phomopsis spp PERTENCENTES Agrave COLECcedilAtildeO DO LABGEMUFPR (CONTINUA)

Coacutedigo Hospedeiro Procedecircncia Isolados por SM9631 Spondias mombin Redenccedilatildeo ndash Paraacute Dra Kaacutetia Rodriguez do

IOC (FIOCRUZRJ)SM9713 S mombin Redenccedilatildeo ndash Paraacute Dra Kaacutetia Rodriguez do



IOC (FIOCRUZRJ)MU0123 Myracrodruon urundeuva Redenccedilatildeo ndash Paraacute Dra Kaacutetia Rodriguez do

IOC (FIOCRUZRJ)AT9810 Aspidosperma Jardim Botacircnico do Dra Kaacutetia Rodriguez do

33

tomentosum Rio de JaneiroRJ IOC (FIOCRUZRJ)AT9811 A tomentosum Jardim Botacircnico do

Rio de JaneiroRJ Dra Kaacutetia Rodriguez do IOC (FIOCRUZRJ)

AT9906 A tomentosum Jardim Botacircnico do Rio de JaneiroRJ

Dra Kaacutetia Rodriguez do IOC (FIOCRUZRJ)

ES80J Maytenus ilicifolia ColomboPR Dra Socircnia A V Pileggi no LABGEMPR

ESPAC22 Maytenus ilicifolia ColomboPR Dra Socircnia A V Pileggi no LABGEMPR

A135 Schinus terebinthifolius CuritibaPR MsC Jocinei Lima no LABGEMPR

A113 S terebinthifolius CuritibaPR MsC Jocinei Lima no LABGEMPR

A115B S terebinthifolius CuritibaPR MsC Jocinei Lima no LABGEMPR









A333A S terebinthifolius CuritibaPR MsC Jocinei Lima no LABGEMPR






ES2WF1 Maytenus ilicifolia ColomboPR O autor

ES2WC1 Maytenus ilicifolia ColomboPR O autor

ES2KF1 Maytenus ilicifolia ColomboPR O autor

ES2NA1 Maytenus ilicifolia ColomboPR O autor

TABELA 1 ISOLADOS DE Phomopsis spp PERTENCENTES Agrave COLECcedilAtildeO DO LABGEMUFPR (CONTINUACcedilAtildeO)

34

ES2AB1 Maytenus ilicifolia ColomboPR O autor

ESBA1 Maytenus ilicifolia ColomboPR O autor

ESDF1 Maytenus ilicifolia ColomboPR O autor

ESFF1 Maytenus ilicifolia ColomboPR O autor

ESFH1 Maytenus ilicifolia ColomboPR O autor

ESFB2 Maytenus ilicifolia ColomboPR O autor

ESGA1 Maytenus ilicifolia ColomboPR O autor

ESGF1 Maytenus ilicifolia ColomboPR O autor

ESIE1 Maytenus ilicifolia ColomboPR O autor

ESIA1 Maytenus ilicifolia ColomboPR O autor

ESJH1 Maytenus ilicifolia ColomboPR O autor

ESJD1 Maytenus ilicifolia ColomboPR O autor

ESJG1 Maytenus ilicifolia ColomboPR O autor

ESJE1 Maytenus ilicifolia ColomboPR O autor


ESKD1 Maytenus ilicifolia ColomboPR O autor

ESRD1 Maytenus ilicifolia ColomboPR O autor

ESSD1 Maytenus ilicifolia ColomboPR O autor

PHO1 (Phomopsis longicolla)

Glycine max (L) Merr Mato Grosso Dr Aacutelvaro Almeida EMBRAPALondrina-PR

PHO19 Glycine max (L) Merr Roraima Dr Aacutelvaro Almeida EMBRAPALondrina-PR

FONTE O autor

NOTA patoacutegenos de soja


35

412 Microrganismos usados para teste de antagonismo

Para determinar a atividade antimicrobiana dos isolados foram utilizadas as

seguintes linhagens teste G citricarpa linhagens PC1396 e PC3305 pertencentes ao

banco bioloacutegico do Laboratoacuterio de Geneacutetica de Microrganismos da Universidade

Federal do Paranaacute

413 Fungos endofiacuteticos utilizados para anaacutelise de variabilidade geneacutetica

Como grupo externo para anaacutelise de variabilidade geneacutetica por RAPD foram

utilizadas cinco linhagens de Pestalotiopsis sp (TABELA 2)

TABELA 2 ISOLADOS GRUPO EXTERNO PARA ANAacuteLISE DE VARIABILIDADE GENEacuteTICA POR RAPD

Coacutedigo Hospedeiro Procedecircncia Pestalotiopsis phothiniae Gustavia cf eliacuteptica Amazonia Pestalotiopsis neglecta voucher Muraya paniculata Amazonia Pestalotiopsis vismeae Maytenus ilicifolia Paranaacute Pestalotiopsis sp 3 Maytenus ilicifolia Paranaacute Pestalotiopsis sp 11 Maytenus ilicifolia Paranaacute FONTE O autor NOTA Isolado cedidos pelo Profordm Dr Joseacute Odair Pereira da Universidade Federal do Amazonas Isolados por Josiane Gomes Figueiredo no LABGEMPR 42 Meios de Cultura 421 Caldo MEB (Extrato de Malte)

Extrato de Malte 20g

Glicose 20g

Peptona 1g

Aacutegua destilada p1000mL

36

O pH foi ajustado para 58 adicionando-se NaOH 1N eou HCl 1N conforme a

necessidade Adicionou-se o aacutegar

422 Meio AV (Aveia-Aacutegar) Aveia 300 g

Aacutegar 150g


A aveia foi fervida durante 30 minutos com metade do volume da aacutegua A

suspensatildeo foi filtrada com gaze Adicionou-se aacutegua para completar o volume O pH foi

ajustado para 58 adicionando-se NaOH 1N eou HCl 1N conforme a necessidade

Acrescentou-se o aacutegar

423 Meio BDA (Meio Batata-Dextrose-Aacutegar)

Batata 2000g

Dextrose 100g

Aacutegar 150g


As batatas foram cozidas em 500 mL de aacutegua destilada durante 20 minutos Em

seguida foram filtradas com gaze adicionou-se a dextrose ao caldo e completou-se

com aacutegua destilada para 1000 mL O pH foi ajustado para 58 adicionando-se NaOH 1N

eou HCl 1N conforme a necessidade Acrescentou-se o aacutegar

37

424 Meio MC (Meio Completo) PONTECORVO et al 1953

NaNO3 60g

KH2PO4 15g

KCl 05g

MgSO47H2O 05g

FeSO4 002g

ZnSO4 002g

Glicose 100g

Peptona 20g

Extrato de levedura 20g

Caseiacutena hidrolisada 15g

Soluccedilatildeo de vitaminas 10mL

Aacutegar 150g




425 Meio MEA (Extrato de Malte) PATERSON e BRIDGE 1994


Glicose 20g

Peptona 1g

Agar 15g




38

OBS Todos os meios de cultura foram autoclavados durante 20 minutos a 1 atm e

armazenados em temperatura ambiente

43 Soluccedilotildees e Reagentes 431 Clorofane ndash FenolClorofoacutermio (11)

432 Clorofil ndash ClorofoacutermioAacutelcool Isoamiacutelico (241)

433 Derozal Bayerreg - 1mg de carbendazim em 1mL de aacutegua destilada

434 Dodecil Sulfato de Soacutedio (SDS) 10 (pv) em aacutegua destilada

435 Fenol Saturado

Um volume de fenol cristalizado foi dissolvido em banho-maria a 60degC e

acrescentado um volume de tampatildeo Tris-HCl 02 M pH 80 Apoacutes agitaccedilatildeo por 30

minutos a fase aquosa foi retirada e entatildeo acrescentado um volume de tampatildeo Tris-

HCl 02 M pH 80 Este processo foi repetido ateacute atingir o pH desejado (pH 80) Em

seguida foi adicionado um volume final de 110 do tampatildeo Tris-HCl 02 M pH 80 e

estocado em frasco escuro a uma temperatura de 4degC usado apoacutes 48 horas

(SAMBROOK E MANIATS 1989)

436 Gel de Agarose 08 (pv) em Tampatildeo TBE 1x

437 Gel de Agarose15 (pv) em em Tampatildeo TBE 1x

438 Lactofenol azul Aacutecido laacutetico 200 g

Cristais de fenol 200 g

Glicerina 200 g

39

Azul de algodatildeo (Metyl Blue Difco) 005 g

Aacutegua destilada 200 mL

Os cristais de fenol foram derretidos em banho-maria Adicionaram-se os demais

componentes Depois de 24 horas filtrou-se e armazenou-se em frasco escuro

439 Marcador de peso molecular (DNA de fago lambda clivado com Hind III Gibco)

O marcador de peso molecular do DNA foi fornecido concentrado e no momento

do uso diluiu-se na proporccedilatildeo de 1 μL do marcador 1 μL do tampatildeo da amostra 4 μL

de aacutegua Milli-Q esterilizada Na corrida eletroforeacutetica foi utilizado 6 μL do marcador

4310 Marcador de peso molecular (DNA Ladder 100pb Ludwing Biotec)

O marcador de peso molecular foi fornecido concentrado e no momento do uso

diluiu-se na proporccedilatildeo de 1 μL do marcador 2 μL do tampatildeo da amostra 7 μL de aacutegua

Milli-Q autoclavada Na corrida eletroforeacutetica foram utilizados 15 μL do marcador

4311 Oligonucleotiacutedeos (Invitrogen)

Foi adicionado Tris-HCl 10 mM pH70 aos oligonucleotiacutedeos para obter uma

soluccedilatildeo estoque com 50 μM No momento do uso a soluccedilatildeo estoque foi diluiacuteda para

concentraccedilatildeo final de 4μM

4312 RNAse (invitrogen)

A soluccedilatildeo foi preparada na concentraccedilatildeo de 10 mM de Tris-HCl pH 75 e 15 mM

de NaCl Aqueceu-se a 100degC por 15 minutos e estocou-se a ndash 20degC

40

4313 Soluccedilatildeo de Vitaminas Aacutecido Nicotiacutenico 1000 mg

Aacutecido para Aminobenzoacuteico 100 mg

Biotina 02 mg

Piridoxina 500 mg

Riboflavina 1000 mg

Tiamina 500 mg

Aacutegua destilada esterilizada p 1000 mL

A soluccedilatildeo foi aquecida em banho-maria a 98degC por 15 minutos e armazenada em

frasco escuro previamente autoclavado a 4degC

4314 Soluccedilatildeo de NaCl 085 (pv) em aacutegua destilada

4315 Soluccedilatildeo Tween-80 01 (vv) em aacutegua destilada

4316 Soluccedilatildeo de Tetraciclina 5 (pv) em etanol absoluto Preparou-se a soluccedilatildeo sob

agitaccedilatildeo e estocou-se em frasco escuro a ndash 20degC

4317 Soluccedilatildeo de EDTA 05M em aacutegua destilada O pH foi ajustado para 80

adicionando-se NaOH 1N

4318 Soluccedilatildeo de brometo de etiacutedio 1 (pv) em aacutegua destilada O brometo de etiacutedio

foi dissolvido em aacutegua destilada agitou-se e estocou-se a temperatura ambiente

protegido de luz No momento do uso adicionou-se 3μL desta soluccedilatildeo a 100 mL de

tampatildeo TBE (1X)

41

4319 Tampatildeo TE (Tris-EDTA)

Tris-HCl pH 80 100 mM

EDTA pH 80 10 mM

4320 Tampatildeo de Extraccedilatildeo de DNA Tris-HCl pH 80 2000 mM

EDTA pH 80 250 mM

NaCl 2500 mM

SDS (pv) 1

O tampatildeo de Extraccedilatildeo foi preparado no momento do uso

4321 Tampatildeo da Amostra (6x)

Azul de bromofenol3 1000 mL

Glicerol 1035 mL

Aacutegua destilada p 50 mL

4322 Tampatildeo de corrida TBE 10x

Trizma base 54g

Aacutecido boacuterico 275g

EDTA 465g

Aacutegua Milli-Q p 500mL

A soluccedilatildeo foi autoclavada e estocada a temperatura ambiente No momento do

uso diluiu-se 10 vezes com aacutegua Milli-Q

42

44 Isolamento

A metodologia utilizada para o isolamento dos microrganismos endofiacuteticos foi

descrita por Petrini (1991) modificada por Glienke (1995) Os diferentes oacutergatildeos da

planta temperatura de incubaccedilatildeo nuacutemero de plantas e o de fragmentos plaqueados

estatildeo listados na tabela 3

Isolamento Eacutepoca do ano Oacutergatildeo da

planta Temperatura

de incubaccedilatildeo

Nuacutemero de Plantas

Nuacutemero de fragmentos plaqueados

1 Outubro de 2006 Folha 28deg C 20 360 2 Marccedilo de 2007 Folha 22-23deg C 30 540 3 Julho de 2007 Folha 22-23deg C 20 360 4 Julho de 2007 Peciacuteolo 22-23deg C 20 160

Total de fragmentos plaqueados 1360

FONTE O autor

Os fungos foram isolados de plantas aparentemente sadias com folhas sem

marcas arranhaduras ou ferimentos Apoacutes a coleta as folhas foram colocadas em

sacos plaacutesticos devidamente identificados em seguida as superfiacutecies das folhas foram

lavadas em aacutegua corrente com auxiacutelio de uma esponja para a remoccedilatildeo dos

microrganismos epifiacuteticos e outros contaminantes Os peciacuteolos foram vedados com

parafina derretida para evitar a entrada dos desinfetantes nos seus tecidos internos

desta forma preservando os endoacutefitos a serem isolados As folhas vedadas foram

mergulhadas em frascos com aacutegua destilada autoclavada sendo mantidos por 1

minuto em etanol 70 por 1 minuto em hipoclorito de soacutedio (NaOCl) a 3 por 6

minutos etanol 70 por 30 segundos e por uacuteltimo em aacutegua destilada autoclavada por

6 minutos Devido agrave dificuldade de isolar fungos do gecircnero Phomopsis nos isolamentos

1 e 2 foi reduzido o tempo de tratamento com hipoclorito de soacutedio para 4 minutos nos

isolamentos 3 e 4 (TABELA 3) As folhas foram cortadas em seis fragmentos de 5-7 mm

e os peciacuteolos foram cortados das folhas e oito deles foram transferidos para placas de

TABELA 3 EacutePOCAS DO ANO OacuteRGAtildeOS DA PLANTA CONDICcedilOtildeES DE INCUBACcedilAtildeO E NUacuteMERO DE FRAGMENTOS PLAQUEADOS NAS QUATRO COLETAS DE ENDOacuteFITOS DE ESPINHEIRA-SANTA

43

Petri (90 mm) contendo os meios de cultura BDA adicionados de Tetraciclina (10

mgmL) para impedir o crescimento bacteriano (ARAUJO et al 2002)

Como controle apoacutes o processo de desinfestaccedilatildeo foram inoculados 01 mL da

uacuteltima aacutegua autoclavada utilizada no tratamento em trecircs placas de Petri As placas

permaneceram incubadas nas mesmas condiccedilotildees do isolamento

45 Conservaccedilatildeo dos fungos

Os isolados foram estocados utilizando-se duas metodologias 1) em frascos

contendo meio de cultura BDA inclinado apoacutes sete dias de crescimento a 28degC foram

mantidos a 4degC realizando-se repiques mensalmente 2) em frascos contendo aacutegua

destilada esterilizada com 12 discos de 5 mm meio de cultura BDA contendo miceacutelios

Repetiu-se o procedimento a cada trecircs meses

46 Caracterizaccedilatildeo morfoloacutegica

A caracterizaccedilatildeo macromorfoloacutegica dos isolados de Phomopsis foi realizada com

base na forma dos bordos crescimento micelial aspecto da colocircnia e a sua coloraccedilatildeo

no verso e reverso da placa em diferentes meios de cultura Discos de miceacutelio (8 mm)

provenientes de colocircnias de Phomopsis com sete dias de crescimento em meio de

cultura BDA foram inoculados no centro de placas de Petri com diferentes meios de

cultura Batata-dextrose-aacutegar (BDA) aveia-aacutegar (MAV) e extrato de malte-aacutegar (MEA)

Foram incubados durante 14 dias a 22ordmC sob luz contiacutenua Os ensaios foram

realizados em triplicata O diacircmetro das colocircnias foi medido a partir do terceiro dia de

crescimento ateacute o quinto dia quando alguns atingiram completamente as bordas da

placa de Petri

Para anaacutelise da micromorfologia foram avaliados os coniacutedios apoacutes 21 dias de

crescimento Os picniacutedios foram comprimidos entre a lacircmina e a lamiacutenula com uma

gota de lactofenol azul de algodatildeo possibilitando a observaccedilatildeo ao microscoacutepio oacuteptico

44

com aumento de 1000x O comprimento e largura dos coniacutedios foram medidos usando

uma reacutegua na objetiva com escala de 1μM

47 Obtenccedilatildeo de colocircnia monospoacuterica

Apoacutes os isolados terem sido identificados como pertencentes ao gecircnero

Phomopsis colocircnias monospoacutericas foram obtidas cultivando os isolados endofiacuteticos em

placas de Petri com meio BDA a 28degC Observou-se o crescimento da colocircnia e

monitorou-se com observaccedilatildeo em microscopia oacuteptica a produccedilatildeo de esporos Os

picniacutedios foram coletados e macerados em soluccedilatildeo de ldquoTween 80rdquo 01 A suspensatildeo

de esporos foi filtrada com seringas contendo latilde de vidro Em seguida adicionou-se 10

mL de soluccedilatildeo salina Centrifugou-se a soluccedilatildeo filtrada durante 4 minutos a 7000 rpm

Descartou-se o sobrenadante adicionou-se 400 μL de soluccedilatildeo salina para suspender o

precipitado onde ficaram contidos os esporos retirou-se 10 μL desta suspensatildeo sendo

a concentraccedilatildeo estimada em Cacircmara de Neubauer Quando necessaacuterio diluiu-se em

soluccedilatildeo salina para viabilizar a contagem dos esporos Foram semeados 100 μL de

suspensatildeo em uma placa de Petri contendo meio BDA espalhou-se com alccedila de

Drigalsky incubou-se a 28degC Colocircnias isoladas foram selecionadas e repicadas em

tubos com BDA inclinado que apoacutes crescimento por sete dias a 28ordmC foram mantidos a

4degC

48 Caracterizaccedilatildeo Molecular 481 Extraccedilatildeo do DNA (RAEDER e BRODA 1985 modificado por GLIENKE 1995)

O DNA genocircmico foi obtido de acordo com a metodologia descrita por Raeder e

Broda (1985) modificada por Glienke (1995) Os isolados endofiacuteticos de Phomopsis

foram cultivados em meio MEA durante cinco dias a 28degC O miceacutelio obtido a partir da

raspagem da colocircnia com espaacutetula esterilizada foi liofilizado e mantido em freezer ou na

45

sequumlecircncia macerados com adiccedilatildeo de nitrogecircnio liacutequido O material foi pesado e para

cada grama de miceacutelio acrescentou-se 1 mL de Tampatildeo de Extraccedilatildeo Incubou-se a

soluccedilatildeo homogeneizada durante 20 minutos em banho-maria a 70degC Acrescentou-se

um volume de fenol saturado misturaram-se as fases e centrifugou-se durante 15

minutos a 5000 rpm Coletou-se a fase aquosa colocou-se em um novo tubo e

adicionou-se a este um volume de Clorofane Centrifugou-se novamente sob as

mesmas condiccedilotildees anteriores Coletou-se a fase aquosa como na etapa anterior e

adicionou-se um volume de Clorofil repetindo-se o processo de centrifugaccedilatildeo sob as

mesmas condiccedilotildees Coletou-se a fase aquosa em um novo tubo e adicionou-se etanol

absoluto O material foi incubado a ndash 20ordmC durante uma hora Apoacutes este periacuteodo a

suspensatildeo foi centrifugada (10000 rpm por 20 min) desprezou-se o sobrenadante

Acrescentou-se 500 μL de etanol 70 centrifugou-se a 10000 rpm durante 5 minutos

descartou-se o aacutelcool 70 inverteu-se o tubo sobre uma folha de papel absorvente

para secar a borda do tubo e este secou a uma temperatura de 37degC durante 30

minutos Ressuspendeu-se o DNA com 200 μL de aacutegua milli-Q por uma hora

temperatura ambiente As amostras foram tratadas RNAse (30 μgmL) a 37degC por uma

hora

A concentraccedilatildeo de DNA foi estimada por meio de eletroforese em gel de agarose

08 utilizando como padratildeo de peso molecular o DNA do fago λ (Gibco) clivado com

HindIII com concentraccedilatildeo conhecida Apoacutes a eletroforese o gel foi corado com brometo

de etiacutedio observado sobre transiluminador de luz ultravioleta e fotodocumentado

482 RAPD

As soluccedilotildees foram realizadas de acordo com as condiccedilotildees descritas por Glienke-

Blanco et al (2002) onde foram utilizados 50ng de DNA tampatildeo PCR 1x 05U de Taq

polimerase 02mM de oligonucleotideos 02mM de dNTP 3mM de MgCl2 em um

volume final de 25microL Foi realizada uma preacutevia seleccedilatildeo usando-se os oligonucleotiacutedeos

46

da linha OPX11 (5rsquo TCACCACGGT 3rsquo) OPX14 (5rsquo TCACCACGGT 3rsquo) OPX19 (5rsquo

TCACCACGGT 3rsquo) e OPE 08 (5rsquo TCACCACGGT 3rsquo) da Operon Technologiesreg

A amplificaccedilatildeo foi realizada com as condiccedilotildees descritas por Pioli et al (2003)

com modificaccedilotildees sendo cada reaccedilatildeo submetida a 40 ciclos apoacutes a desnaturaccedilatildeo

inicial a 940C por 4 minutos Cada ciclo consiste de 1 minuto a 940C 1 minuto e 30

segundos a 350C e 2 minutos a 720C

4821 Anaacutelise da Variabilidade Geneacutetica

Os produtos de amplificaccedilatildeo foram separados por eletroforese (3 Vcm) em gel

de agarose 15 e posteriormente corados por 20 minutos com soluccedilatildeo de brometo de

etiacutedio Os fragmentos amplificados foram visualizados em um transiluminador de luz

Ultravioleta e a imagem do gel documentada atraveacutes de sistema fotograacutefico Digi-doc it

O marcador de peso molecular utilizado foi o Ladder de 100 pb (Ludwing Biotec)

A anaacutelise da variabilidade geneacutetica foi realizada pelo agrupamento das linhagens

segundo os princiacutepios adotados em taxonomia numeacuterica utilizando o coeficiente de

similaridade de Jaccard que permite calcular similaridades com base em variaacuteveis

binaacuterias (0 para ausecircncia e 1 para presenccedila de banda) As bandas foram consideradas

como variaacuteveis enquanto as linhagens como unidades O coeficiente foi calculado

segundo a foacutermula J=MP onde M eacute o nuacutemero de concordacircncias positivas e P o

nuacutemero total de variaacuteveis menos concordacircncias negativas (SNEATH e SOKAL 1973)

Desta forma o coeficiente de similaridade Jaccard (J) leva em conta apenas as

discordacircncias e as concordacircncias positivas quanto agrave presenccedila ou ausecircncia de bandas

desconsiderando as concordacircncias negativas Quanto maior a semelhanccedila entre duas

linhagens maior eacute o valor de similaridade As unidades foram agrupadas atraveacutes do

meacutetodo UPGMA (Unweighted Pair-Group Method with Arithmetical Average) que eacute um

modelo de agrupamento hieraacuterquico e permite a construccedilatildeo de dendrogramas

(SNEATH e SOKAL 1973) Matrizes e dendrogramas foram elaborados usando o

software NTSYS (Numerical taxonomy system of multivariate programs) (ROHLF

1988)

47

Para verificar a consistecircncia dos agrupamentos verificados foi realizada uma

anaacutelise bootstrap segundo Felsenstein (1985) utilizando o software BOOD (COELHO

2005)

483 Sequumlenciamento da regiatildeo ITS1 58S e ITS2 do rDNA

4831 Amplificaccedilatildeo

A reaccedilatildeo foi realizada com os oligonucleotiacutedeos LS266 e V9D (TABELA 4) que

satildeo universais para fungos e permitem amplificar a regiatildeo ITS1 58S e ITS2 do DNA

Ribossomal

Oligonucleotiacutedeos Sequumlecircncia

LS266 5 TTACGTCCCTGCCCTTTGTA 3

V9D 5GCATTCCCA AA C AACTCGAC 3rsquo

FONTE O autor

As condiccedilotildees da reaccedilatildeo foram realizadas de acordo com a descriccedilatildeo de White et

al (1990) com algumas modificaccedilotildees 50 ng de DNA tampatildeo PCR 1x 15U de Taq

DNA polimerase 08microM de oligonucleotiacutedeos 02mM de dNTP 3mM de MgCl2 para um

volume final de 50microL

A amplificaccedilatildeo foi realizada em um termociclador Eppendorf (Modelo

Mastercycler Gradiente) com desnaturaccedilatildeo inicial a 94degC por 2 minutos 30 ciclos de 30

segundos a 94degC 1 minuto a 56degC 1 minuto a 72degC seguida de extensatildeo final de 3

minutos a 72degC

TABELA 4 SEQUumlEcircNCIAS DOS OLIGONUCLEOTIacuteDEOS UTILIZADOS NA AMPLIFICACcedilAtildeO DAREGIAtildeO ITS1 58S E ITS2 DO DNA RIBOSSOMAL

48

4832 Purificaccedilatildeo da PCR

Foram testadas duas metodologias de purificaccedilatildeo da reaccedilatildeo de PCR

48321 Purificaccedilatildeo com PEG

Aos produtos da amplificaccedilatildeo da PCR com os oligonucleotiacutedeos LS266 e V9D

foram acrescentados 50microL de PEG os tubos foram incubados a 37ordmC por 30 minutos

em seguida foram centrifugados por 15 minutos a 14000rpm O sobrenadante foi

descartado com micropipeta Adicionou-se 125microL de Etanol 80 gelado apoacutes 1min os

tubos foram centrifugados por 2 min a 13000 rpm descartou-se o sobrenadante Foram

adicionados 125microL de Etanol 96 (gelado) descartou-se o sobrenadante O Etanol foi

evaporado em speed vac por 10min a 70ordmC O pellet foi ressuspendido em 15 microL de

aacutegua Milli-Q e misturado em seguida ficou agrave temperatura ambiente por pelo menos 2

horas

Para confirmaccedilatildeo da presenccedila do DNA na amostra 1microL foi submetido agrave

eletroforese em gel de agarose 15

48322 Purificaccedilatildeo com Acetato de Amocircnio


foram acrescentados 34 microL de acetato de amocircnio (AcNH4) 75M e 100 microL de etanol

96 Os tubos ficaram em temperatura ambiente por 10 minutos e em seguida foram

centrifugados por 15 minutos a 14000rpm Os pellets resultantes foram lavados com

250 microL de etanol 70 (receacutem preparado) centrifugou-se por 15 minutos a 14000rpm e

descartou-se o etanol O pellet foi seco na estufa a 37ordmC por 30 mim e ressuspendidos

em 15microL de aacutegua Milli-Q

Para confirmaccedilatildeo da presenccedila do DNA na amostra 1microL foi submetido a


49

4833 Reaccedilatildeo de Sequumlenciamento

Foram realizadas trecircs reaccedilotildees de sequumlenciamento a primeira foi realizada

usando o produto tratado com PEG e nas duas posteriores usou-se o produto de PCR

tratado com acetato de amocircnia Para o restante da metodologia natildeo houve alteraccedilatildeo

O sequumlenciamento da regiatildeo ITS1 58S e ITS2 do rDNA foi realizado pelo

meacutetodo de terminaccedilatildeo de cadeia segundo Sanger et al (1977) utilizando a

incorporaccedilatildeo de dideoxinucleotiacutedeos fluorescentes em Sequumlenciador Automaacutetico de

DNA megaBACE

Para a reaccedilatildeo de sequumlenciamento foram utilizados cerca de 50ng da reaccedilatildeo de

PCR purificada 02 microM do oligonucleotiacutedeo ITS1 (TABELA 5) e 4microL de mistura para

sequumlecircnciamento ET (Kit ldquoDYEnamic ET Dye Terminator Cycle Sequencing Kit for

MegaBACErdquo da Amersham Biosciences) completando com aacutegua milli-Q para um

volume final de 10microL As mesmas condiccedilotildees foram aplicadas para o oligonucleotiacutedeo

ITS4 (TABELA 5)

FONTE O autor


Mastercycler Gradient) seguindo uma desnaturaccedilatildeo inicial a 96degC por 1 minuto 30

ciclos de 10 segundos a 96degC 1 minuto e 5 segundos a 50degC 4 minutos a 60degC 20 min

a 8degC


ITS1 5rsquoTCCGTAGGTGAACCTGCGG3rsquo

ITS4 5rsquoTCCTCCGCTTATTGATATGC3rsquo


50

4834 Purificaccedilatildeo da Reaccedilatildeo de Sequumlenciamento

Foram testadas trecircs metodologias de purificaccedilatildeo da reaccedilatildeo de sequumlenciamento

48341 Purificaccedilatildeo com Isopropanol em tubos

Ao produto da reaccedilatildeo de sequumlenciamento realizado com produto de PCR

purificado com PEG (item 38321) foram adicionados 40 microL de isopropanol 75

sendo precipitados por um spin down As amostras ficaram agrave temperatura ambiente por

20 minutos em seguida foram centrifugadas por 25 minutos a 13000 rpm e o

isopropanol foi removido por inversatildeo dos tubos Foram adicionados 200 microL de etanol

70 natildeo gelado e centrifugado por 5 minutos a 13000 rpm em seguida o etanol foi

removido com auxiacutelio de uma micropipeta e foi submetido a secagem em speed vac por

45 minutos a 60degC

Apoacutes esse tratamento cada amostra foi ressuspendida em 10 microL Loading

Solution e submetida agrave eletroforese em Sequumlenciador Automaacutetico de DNA modelo

megaBACE da Amersham Biosciences Com os seguintes paracircmetros voltagem de

injeccedilatildeo 2V tempo de injeccedilatildeo 80 segundos voltagem da corrida 8V por 160 minutos

48342 Purificaccedilatildeo com Isopropanol em placa


purificado com acetato de amocircnio (item 38322) foram adicionados 40microL de

isopropanol 75 sendo precipitados por um spin down As amostras ficaram agrave

temperatura ambiente por 20 minutos e em seguida foram centrifugadas por 50

minutos a 4000 rpm O isopropanol foi removido por inversatildeo da placa Foram

adicionados 100microL de etanol 70 natildeo gelado e centrifugado por 30 minutos a 4000

rpm em seguida o etanol foi descartado por inversatildeo da placa seguido de um spin a

300 rpm por 1 minuto Em seguida a placa ficou em estufa a 37degC durante 3 minutos

Apoacutes esse tratamento as amostras foram processadas como no item anterior

51



purificado com acetato de amocircnio (item 38322) foram adicionados 1 microL de acetato

de amocircnio (AcNH4) 75M e 30 microL de etanol 96 Apoacutes a homogeneizaccedilatildeo por inversatildeo

30 vezes a placa foi centrifugada por 45 minutos a 2500 RCF a 4degC

O sobrenadante foi descartado por inversatildeo da placa seguido de um spin a 500

RCF com a placa invertida sobre papel toalha O pellet foi lavado com 100 microL de etanol

70 (receacutem preparado natildeo gelado) Seguindo-se uma nova centrifugaccedilatildeo a 2500 RCF

por 45 minutos e o sobrenadante foi descartado por inversatildeo da placa seguido de um

spin a 750 RCF com a placa invertida sobre papel toalha Em seguida a placa ficou em

estufa a 37degC durante 3 minutos

Apoacutes esse tratamento cada amostra foi ressuspendida e tratada como nos itens

anteriores

Todos os procedimentos desde a reaccedilatildeo de sequumlenciamento foram realizados

sob proteccedilatildeo de luz direta cobrindo a placa com papel alumiacutenio

4835 Ediccedilatildeo e Anaacutelise das Sequumlecircncias

As sequumlecircncias foram entatildeo alinhadas utilizando-se o programa CLUSTAL-W

versatildeo 17 (THOMPSON HIGGINS e GIBSON 1994) sendo realizada posterior

inspeccedilatildeo visual atraveacutes do programa BioEdit 7053 (HALL 1999) Apoacutes a ediccedilatildeo

alinhamento e anaacutelise preacutevia das sequumlecircncias estas foram submetidas ao software

MEGA 31 (KUMAR TAMURA NEI 2004) para obtenccedilatildeo das aacutervores filogeneacuteticas

baseadas em distacircncia A consistecircncia dos noacutes obtidos foi avaliada pelo procedimento

de bootstrap (FELSENSTEIN 1985) com 10000 reamostragens Foram utilizadas como

referecircncias linhagens de Phomopsis sp Diaporthe e Pestalotiopsis vismae (como

grupo externo) depositadas no GenBank (httpwwwncbinlmnihgov) (TABELA 6)

52

TABELA 6 LINHAGENS DE Phomopsis spp E DE Pestalotiopsis vismae UTILIZADAS COMO GRUPO EXTERNO

Espeacutecie Nuacutemero de acesso (GenBank)

Diaporthe Melonis AB105147 D melonis AB105148 Phomopsis longicolla AY857868 P longicolla AF000207 P camptothecae AY622996 D Phaselorum AF001024 D helianthi AJ312348 D helianthi AJ312363 D helianthi AF358441 Phomopsis sp P7 DQ235673 Phomopsis sp P3 DQ235669 P sojae AY050627 P chimonanthi AY622993 Phomopsis sp P4 DQ235670 D conorum AB201443 D conorum DQ116551 P theicola DQ286286 P theicola DQ286287 Phomopsis sp 1 AY485724 Phomopsis sp CBS DQ286285 Phomopsis sp Taxon 3 AF230762 Diaporthe AJ312359 Diaporthe AY745024 Pestalotiopsis vismae EF451801

FONTE O autor

49 Avaliaccedilatildeo da Atividade Antimicrobiana

491 Cultura Pareada

Para avaliar a atividade antimicrobiana dos 49 isolados de Phomopsis sp

endofiacuteticos (TABELA 1) contra o fitopatoacutegeno Guignardia citricarpa foi utilizado a

metodologia de Cultura Pareada (MARIANO1993) Os discos contendo miceacutelio eou

coniacutedios dos isolados endofiacuteticos ou dos fitopatoacutegenos ensaiados foram obtidos de

53

colocircnias crescidas em BDA durante sete dias a 28degC incubadas em estufa BOD e com

fotoperiacuteodo de 12 horas Apoacutes este periacuteodo foram retirados os discos da borda das

colocircnias com auxiacutelio de vazador de rolhas

Em placas de Petri contendo meio de cultura BDA colocou-se um disco (Oslash 8

mm) da cultura do fitopatoacutegeno G citricarpa Apoacutes trecircs dias de crescimento foi

adicionado no lado oposto um disco com o isolado de Phomopsis sp endofiacutetico a ser

avaliado ambos a 10 cm da borda Apoacutes o pareamento as placas foram vedadas com

filme de PVC e mantidas durante 14 dias em estufa BOD com fotoperiacuteodo de 12 h a

28degC Foi realizado um delineamento inteiramente casualizado com cinco repeticcedilotildees O

controle recebeu apenas o fitopatoacutegeno A avaliaccedilatildeo foi realizada mediante mediccedilatildeo do

diacircmetro da colocircnia comparando com o controle e observaccedilatildeo das interaccedilotildees entre as

colocircnias

Para determinar a porcentagem de inibiccedilatildeo do crescimento mediu-se o diacircmetro

das colocircnias do fitopatoacutegeno com 14 dias de crescimento subtraindo-se o diacircmetro do

inoacuteculo original Os caacutelculos foram realizados de acordo com Edginton et al (1971)

pela foacutermula

Onde Dc eacute o diacircmetro meacutedio da colocircnia do fitopatoacutegeno no controle e Dt eacute o

diacircmetro meacutedio da colocircnia do patoacutegeno nos tratamentos testados

492 Avaliaccedilatildeo de metaboacutelitos natildeo volaacuteteis

Cobriu-se assepticamente toda a superfiacutecie do meio PDA inclusive nas bordas

com discos de papel celofane (Oslash11 cm) esterilizado A seguir foi inoculado no centro

sobre a superfiacutecie do papel celofane discos de aacutegar (Oslash8 mm) contendo miceacutelio do

isolado endofiacutetico As placas foram incubadas por quatro dias a temperatura de 28degC

as placas controles receberam apenas o fitopatoacutegeno incubados por 7 dias com

Dc -Dt

Dc

Porcentagem de inibiccedilatildeo (PI) = X 100

54

fotoperiacuteodo de 12 horas Mediu-se o diacircmetro da colocircnia e retirou-se o papel celofane

(juntamente com a colocircnia do isolado) Sobre a superfiacutecie de meio PDA inoculou-se um

disco de miceacutelio do fitopatoacutegeno a ser avaliado no centro da placa Foi realizado um

delineamento inteiramente casualizado com cinco repeticcedilotildees As placas foram

incubadas a 28degC com fotoperiacuteodo de 12 horas Apoacutes 7 e 14 dias mediu-se o

crescimento das colocircnias e comparou-se com o controle (ETHUR CEMBRANEL e

SILVA 2001 Adaptado por Figueiredo 2006)

493 Atividade dos Extratos Metanoacutelicos 4931 Obtenccedilatildeo dos extratos

Para avaliaccedilatildeo da atividade dos extratos metanoacutelicos foi utilizada a metodologia

descrita por Rodrigues Hesse e Werner (2000) com algumas modificaccedilotildees No

processo de fermentaccedilatildeo trecircs discos (Oslash 8 mm) dos 49 isolados endofiacuteticos de

Phomopsis (TABELA 1) foram inoculados em Erlenmeyer (250 mL) contendo 100 mL

de caldo extrato de malte Incubou-se durante 7 dias (110 rpm 28degC fotoperiacuteodo de 12

horas)

Apoacutes a fermentaccedilatildeo o miceacutelio foi separado do liacutequido fermentado por filtraccedilatildeo

em papel Whatman ndeg 4 Ao volume do filtrado obtido adicionou-se o mesmo volume

de acetato de etila (EtOAc) (Merck) em um balatildeo de separaccedilatildeo Agitou-se

vigorosamente por trecircs vezes e aguardou-se a formaccedilatildeo de duas camadas uma

aquosa na parte inferior e outra orgacircnica na parte superior Transferiu-se a fase

orgacircnica para um novo recipiente e submeteu-se a fase aquosa a mais uma extraccedilatildeo

com EtOAc Repetiu-se o procedimento por mais duas vezes Adicionou-se agrave fase

orgacircnica 5 de sulfato de soacutedio anidro e filtrou-se novamente com papel Whatman ndeg

4 Obteve-se extrato bruto seco passando a fase orgacircnica em rotaevaporador O extrato

foi pesado e diluiacutedo em metanol (10mgmL)

55

4932 Crescimento micelial

Foram obtidos discos (Oslash 12 mm) de colocircnias com 14 dias de crescimento em

meio completo da cultura do fitopatoacutegeno G citricarpa PC1396 ou PC3305 Estes

foram inoculados no centro de placas de Petri contendo meio de cultura BDA A 10 cm

da borda em posiccedilatildeo oposta foi colocado um disco de papel filtro esterilizado (Oslash 5 mm)

e sobre este foram inoculados 100μL do extrato metanoacutelico a ser avaliado As placas

foram fechadas com filme de PVC e mantidas a 28degC fotoperiacuteodo de 12 horas em

BOD Avaliou-se o potencial de inibiccedilatildeo medindo-se o diacircmetro das colocircnias apoacutes sete

dias de crescimento comparando-se com o controle negativo onde foi inoculado aacutegua

destilada autoclavada ou metanol Como controle positivo foi utilizado fungicida Derosal reg (10 mgmL) (QUIROGA SAMPIETRO e VATTUONE 2001 adaptado por

FIGUEIREDO 2006)

410 Anaacutelise Estatiacutestica

Todos os experimentos foram realizados com delineamento inteiramente

casualizado (DIC) com 5 repeticcedilotildees As anaacutelises de variacircncia foram realizadas em

todas as etapas do trabalho Sempre que foi encontrado um valor significativo em

relaccedilatildeo ao teste F completou-se a anaacutelise com teste de Tukey para comparaccedilatildeo das

meacutedias utilizando software ASSISTAT (SILVA 1996 e SILVA 2002) ou o teste de Scott

Knott utilizando software SISVAR (FERREIRA 1994)

56

5 Resultados e Discussatildeo

51 Isolamento

Foram isolados 1005 endoacutefitos de folhas e peciacuteolos de 30 plantas de Espinheira

Santa (M ilicifolia) Destes 21 foram identificados a partir de anaacutelise em microscopia

oacuteptica como pertencentes ao gecircnero Phomopsis A tabela 7 compara os resultados

obtidos quanto agrave proporccedilatildeo de isolamento de Phomopsis sobre os diferentes tecidos da

planta nos quatro isolamentos realizados A frequumlecircncia dos isolamentos foi calculada

de acordo com Souza et al (2004)

TABELA 7 PORCENTAGEM DE ISOLAMENTO DE Phomopsis ENDOFIacuteTICOS DE PLANTAS DE ESPINHEIRA SANTA

Isolamento Oacutergatildeo da planta


Endoacutefitos Nuacutemero ()

Phomopsis Nuacutemero ()

Frequumlecircncia isolamento Phomopsis

1 Folha 360 140 (39) 0 (0) 0

2 Folha 540 310 (57) 2 (064) 037

3 Folha 360 375 (gt100) 3 (08) 083

TOTAL FOLHA

1260 825 (65) 5 (061) 04

4 Peciacuteolo 160 180 (gt100) 16 (89) 100

TOTAL 1420 1005 (71) 21 (209) 15 FONTE O Autor

Observando a tabela 7 percebe-se claramente que a partir de peciacuteolo a

frequumlecircncia de isolamento de Phomopsis (10) foi maior do que em folhas (04) tanto

em relaccedilatildeo ao nuacutemero de fragmentos plaqueados quanto em comparaccedilatildeo ao nuacutemero

total de endoacutefitos isolados (89 contra 061) Provavelmente devido agrave menor

frequumlecircncia de fungos filamentosos de crescimento raacutepido que pudessem sobrepor ao

crescimento de Phomopsis Segundo Souza et al (2004) as folhas dos vegetais

57

hospedeiros satildeo provavelmente as portas de entrada para os microrganismos pois

apresentam tecidos mais fraacutegeis e expostos pela presenccedila de estocircmatos ocorrendo

posterior migraccedilatildeo para outros tecidos da planta O mesmo jaacute foi relatado em espeacutecies

de Citrus para o isolamento de fungos do gecircnero Guignardia sendo o peciacuteolo o tecido

de mais faacutecil isolamento deste gecircnero por apresentar menor colonizaccedilatildeo por

Colletotrichum (BLANCO 1999)

Assim sugere-se que em trabalhos futuros de isolamento de Phomopsis sejam

tambeacutem utilizados os peciacuteolos especialmente em Espinheira Santa

Foram tambeacutem obtidos 18 isolados de Phomopsis de trecircs plantas de S

terebinthifolius (Aroeira Vermelha) representando uma frequumlecircncia de 11 Em Aroeira

a frequumlecircncia do isolamento de Phomopsis em folha foi maior do que em Espinheira

Santa em todos os isolamentos realizados

Fungos do gecircnero Phomopsis Phyllosticta e Colletotrichum satildeo comumente

isolados como endoacutefitos de tecidos de diferentes espeacutecies de plantas em muitos casos

esses fungos estatildeo juntos num mesmo hospedeiro (PANDEY et al 2003 LU et al

2004)

O gecircnero Phomopsis tem sido descrito com grande frequumlecircncia em isolamentos

de diversas plantas (UECKER 1988 BODDY e GRIFFITH 1989) Azevedo et al (2000)

apresentaram algumas plantas hospedeiras de onde jaacute foram isoladas espeacutecies de

Phomopsis entre elas Sabal bermudana Trachycarpus fortunei Cavendishia

pubescens Stylosanthes guianensis Anacardium occidentale e Mangifera indica

Corrado e Rodrigues (2004) isolaram endofiacuteticos de Phomopsis das plantas medicinais

Spondias mombin e Aspidosperma tomentosun

Bussabam et al (2001) isolaram entre outros fungos o gecircnero Phomopsis

endoacutefitos de folhas pseudocaules e rizomas de gengibre (Amomum siamense Criab)

coletadas em dois locais na Tailacircndia Silva et al (2006) isolou Phomopsis como

endoacutefito de graviola (Annona muricata L) e pinha (Annona squamosa L)


diversas espeacutecies de Citrus Mangifera indica (Mangueira) Glycine max (Soja) Ficus

carica (Figueira) e Anacardium occidentale (Cajueiro) entre muitas outras plantas

58

(CENARGEN EMBRAPA 2005) Natildeo haacute relatos de gecircnero Phomopsis como

fitopatoacutegeno das plantas medicinais utilizadas no presente trabalho Aspidosperma

tomentosum Spondias mombin e Maytenus ilicifolia assim como em Aroeira Vermelha

(Schinus terebinthifolius) Entretanto o gecircnero foi relatado por Anjos Charchar e

Guimaratildees (2001) como patoacutegeno em culturas de Aroeira (Myracrodruon urundeuva)

causando sintomas de queimas nas folhas que consiste de uma necrose escura

predominantemente nos bordos dos foliacuteolos

52 Caracterizaccedilatildeo morfoloacutegica de Phomopsis

A caracterizaccedilatildeo macromorfoloacutegica das colocircnias dos isolados endofiacuteticos de

Phomopsis sp foi realizada de acordo com a forma dos bordos crescimento micelial

aspecto da colocircnia e a sua coloraccedilatildeo no verso e reverso da placa em diferentes meios

de cultura (FIGURAS 1 a 4 ANEXO 12)

A coloraccedilatildeo das colocircnias dos isolados de Phomopsis apresentaram elevada

variabilidade tanto no verso quanto reverso da placa nos trecircs meios de cultura

ensaiados Em geral variou entre combinaccedilotildees das cores branca preto verde claro e

oliva amarelo marrom marrom avermelhado cinza e bege

Os isolados de Phomopsis apresentaram no verso da placa com meio Aveia (AV)

coloraccedilatildeo branca alguns isolados apresentaram combinaccedilotildees de branco com marrom

verde amarelo e cinza exceto os isolados ESJG1 ES2KF1 ES2WF1 ESPAC22

ES80J ESFB2 ESGF1 A134 A333B que diferiram dos demais por apresentarem

coloraccedilatildeo intensa e o isolado A116 de coloraccedilatildeo marrom e verde (FIGURAS 1 a 4)

Nos meios de cultura MEA e BDA observou-se que a coloraccedilatildeo no verso da

placa foi mais variaacutevel do que no meio Aveia Igualmente o reverso das placas

contendo as colocircnias de Phomopsis mostrou-se bastante variaacutevel entre os isolados e

os trecircs meios de cultura utilizados havendo variaccedilatildeo intra-individual com coloraccedilotildees

branca preto verde claro e oliva amarelo marrom marrom avermelhado cinza e

bege

59

A morfologia micelial nos meios de cultura ensaiados variou de granuloso aeacutereo

a algodonoso Nos meios de cultura MEA e BDA todos os isolados apresentaram

miceacutelio denso poreacutem no meio AV esses dois tipos de miceacutelio variaram de denso a ralo

A maioria dos isolados de Phomopsis analisados possuem miceacutelio granuloso aeacutereo em

todos os meios ensaiados exceto os isolados SM9638 SM9631 e Phomopsis longicolla

PHO1 que apresentam miceacutelio algodonoso Observou-se variaccedilatildeo intra-individual na

morfologia micelial entre os meios de cultura nos isolados A333B e A323 que

apresentaram miceacutelio algodoso no meio AV e granuloso aeacutereo nos meios MEA e BDA

Igualmente os isolados A123 e SM9811 apresentaram-se algodonoso no meio MEA e

granuloso aeacutereo nos meios AV e BDA

O aspecto dos bordos das colocircnias mostrou variaccedilatildeo intra-individual entre os

diferentes meios de cultura para a maioria dos isolados exceto os isolados de

Phomopsis SM9638 ESKD1 ESPAC22 A323 A113 A331 A115 que apresentaram

bordos regulares e os isolados SM9714 ES2WC1 ESJG1 A126 A333A PHO1

(Phomopsis longicolla) e o isolado PHO19 que possuem bordos irregulares em todos os

meios utilizados

FIGURA 1 MACROMORFOLOGIA DE COLOcircNIAS DOS ISOLADOS ENDOFIacuteTICOS DE Phomopsis DE Spondias mombin (SM9713 SM9638 SM9714 SM9631) Myracrodruon urundeuva (MU0123) Aspidosperma tomentosun (AT9810 AT 9811 e AT 9906) EM TREcircS MEIOS DE CULTURA APOacuteS 14 DIAS DE CRESCIMENTO A 22ordmC SOB LUZ CONTIacuteNUA (CONTINUA)

AV MEA BDA

M

U 0

123

S

M97

13

60

FIGURA 1 MACROMORFOLOGIA DE COLOcircNIAS DOS ISOLADOS ENDOacuteFITOS DE Phomopsis ISOLADOS DE

Spondias mombin (SM9713 SM9638 SM9714 SM9631) Myracrodruon urundeuva (MU0123) Aspidosperma tomentosun (AT9810 AT9811 e AT9906) EM TREcircS MEIOS DE CULTURA APOacuteS 14 DIAS DE CRESCIMENTO A 22ordmC SOB LUZ CONTIacuteNUA (CONTINUACcedilAtildeO)

SM

9631

SM

9638

AT

9811

A

T990

6

AT9

810

SM

9714

AV MEA BDA

61

FIGURA 2 MACROMORFOLOGIA DE COLOcircNIAS DOS ENDOacuteFITOS DE Phomopsis ISOLADOS DE AROEIRA (Schinus terebinthifolius) EM TREcircS MEIOS DE CULTURAAPOacuteS 14 DIAS DE CRESCIMENTO A 22ordmC SOB LUZ CONTIacuteNUA (CONTINUA)

A32

1

A

132

A21

5A

A

113

A

323

A13

1

AV MEA BDA

62

FIGURA 2 MACROMORFOLOGIA DE COLOcircNIAS DOS ENDOacuteFITOS DE Phomopsis ISOLADOS DE AROEIRA (Schinus terebinthifolius) EM TREcircS MEIOS DE CULTURAAPOacuteS 14 DIAS DE CRESCIMENTO A 22ordmC SOB LUZ CONTIacuteNUA (CONTINUACcedilAtildeO)

A

135

A11

6

A

115B

A

124

A12

6

A21

6 B

AV MEA BDA

63


A

134

A33

3A

A

334

A12

3

A33

3B

AV MEA BDA

64

FIGURA 3 MACROMORFOLOGIA DE COLOcircNIAS DOS ISOLADOS ENDOacuteFITOS DE Phomopsis ISOLADOS DE Maytenus ilicifolia EM TREcircS MEIOS DE CULTURA APOacuteS 14 DIAS DE CRESCIMENTO A 22ordmC SOB LUZ CONTIacuteNUA (CONTINUA)

E

S2N

A1

E

SIE1

ES

GA

1

ES8

0J

E

SPA

C22

ES2

WF1

AV MEA BDA

65

FIGURA 3 MACROMORFOLOGIA DE COLOcircNIAS DOS ISOLADOS ENDOacuteFITOS DE Phomopsis ISOLADOS DE Maytenus ilicifolia EM TREcircS MEIOS DE CULTURA APOacuteS 14 DIAS DE CRESCIMENTO A 22ordmC SOB LUZ CONTIacuteNUA (CONTINUACcedilAtildeO)

ESFB

2

ESJ

D1

ESK

D1

E

SJH

1

ESD

F1

E

S2A

B1

AV MEA BDA

66


E

S2K

F1

ESJ

E2

ESJ

E1

ESG

F1

ESF

H1

ESF

F1

AV MEA BDA

67

FIGURA 3 MACROMORFOLOGIA DE COLOcircNIAS DOS ISOLADOS ENDOacuteFITOS DE Phomopsis E Diaporthe (BA1) ISOLADOS DE Maytenus ilicifolia EM TREcircS MEIOS DE CULTURA APOacuteS 14 DIAS DE CRESCIMENTO A 22ordmC SOB LUZ CONTIacuteNUA (CONTINUACcedilAtildeO)

ESB

A1

ESI

A1

ES

RD

1

E

S2W

C1

ESS

D1

ES

JG1

AV MEA BDA

68

Na avaliaccedilatildeo do diacircmetro das colocircnias houve diferenccedila significativa entre os

isolados de Phomopsis dentro dos diversos meios de cultura avaliados Entre os meios

de cultura MEA BDA e AV houve diferenccedila significativa de crescimento em geral o

crescimento micelial foi menor no meio AV (ANEXO 1) Portanto os grupos de

Phomopsis formados quando considerada agrave taxa de crescimento foram inferidos para

os meios de cultura separadamente

Na figura 5 observa-se o resultado do diacircmetro meacutedio das culturas dos isolados

apoacutes 5 dias de crescimento em meio MEA Os isolados foram reunidos em oito grupos

diferentes A A323 SM9631 ESKD1 A134 e ESIE1 B A116 A334 A215A ESSD1

C A321 MU0123 ESGF1 ESRD1 AT9811 SM9713 A123 ESJH1 ESDF1 A131

ESIA1 ESBA1 ESJD1 D A333A A135 ES2NA1 A124 A132 SM9714 ESFB2 E A115B ES2AB1 A216B A113 F PHO1 SM9638 ES2WF1 A126 ESJE1 ESPAC22

ESFF1 ES2KF1 ESJG1 ES80J G ESJE2 ESFH1 AT9906 ESGA1 AT9810

ES2WC1 Os isolados do grupo A apresentaram os maiores valores de crescimento

radial em torno de 70 cm (apoacutes 5 dias de crescimento) e o grupo H apresentou menor

crescimento micelial em torno de 20 cm (apoacutes 5 dias de crescimento) (ANEXO 4)

FIGURA 4 MACROMORFOLOGIA DE COLOcircNIAS DOS ISOLADOS PATOGEcircNICOS OBTIDOS DE Glycine max EM TREcircS MEIOS DE CULTURA APOacuteS 14 DIAS DE CRESCIMENTO A 22ordmC SOB LUZ CONTIacuteNUA

PH

O19

P

lon

gico

lla (P

HO

1) AV MEA BDA

69

O diacircmetro meacutedio das culturas dos isolados apoacutes 5 dias de crescimento em meio

BDA estaacute representado na figura 6 Os isolados foram reunidos em seis grupos

diferentes A ESBA1 A323 A215A ESSD1 SM9713 ESGF1 SM9631 ESJD1

ESKD1 A334 B ESDF1 A132 A123 A333A MU0123 ESJH1 A321 ESRD1 A116

A134 A115B C ESIA1 A131 SM9714 A135 ESIE1 ESFB2 A124 ESPAC22

ES2KF1 A113 ESJE1 D ESJE2 ESFH1 ESJG1 ES2WC1 PHO1 SM9638

ES2NA1 ES2AB1 ESFF1 AT9811 AT9810 ES2WF1 A126 PHO19 A216B ES80J

ESGA1 E AT9906 F A333B Em geral a taxa de crescimento foi maior em meio BDA Os isolados do grupo A

apresentaram as maiores taxas de crescimento em torno de 70 cm (apoacutes 5 dias de

FONTE O autor

000

100

200

300

400

500

600

700

800

EB A F HD G C

NOTA As letras indicam os diferentes agrupamentos formados em relaccedilatildeo ao diacircmetro meacutedio das colocircnias dos isolados endofiacuteticos de Phomopsis spp Os isolados seguidos pela mesma letra natildeo diferem estatisticamente entre si Foi aplicado o Teste de Scott Knott ao niacutevel de 5 de probabilidade (ANEXO 4) A A323 SM9631 ESKD1 A134 e ESIE1 B A116 A334 A215A ESSD1 C A321 MU0123 ESGF1 ESRD1 AT9811 SM9713 A123 ESJH1 ESDF1 A131 ESIA1 ESBA1 ESJD1 D A333A A135 ES2NA1 A124 A132 SM9714 ESFB2 E A115B ES2AB1 A216B A113 F PHO1 SM9638 ES2WF1 A126 ESJE1 ESPAC22 ESFF1 ES2KF1 ESJG1 ES80J G ESJE2 ESFH1 AT9906 ESGA1 AT9810 ES2WC1

FIGURA 5 DIAcircMETRO MEacuteDIO DAS COLOcircNIAS DOS ISOLADOS ENDOFIacuteTICOS DE Phomopsis spp EM MEIO MEA APOacuteS 5 DIAS DE CRESCIMENTO A 22 ordmC SOB LUZ CONTIacuteNUA

Diacirc

met

ro e

m c

m

70

crescimento) e o grupo F representado pelo isolado A333B apresentou menor

crescimento micelial (ANEXO 2)

Estudos sobre fisiologia envolvendo o gecircnero Phomopsis satildeo escassos Almeida

(1982) estudando Phomopsis sojae isolados de sementes de soja em seis diferentes

meios de cultura e nos regimes de luminosidade claro contiacutenuo e escuro contiacutenuo

verificou maior crescimento do fungo nos meios de haste de soja extrato de malte

aveia cenoura e BDA natildeo houve efeito da luz sobre o crescimento micelial de nenhum

dos isolados

Gurgel Menezes e Coelho (1997) verificaram maior crescimento micelial de P

anacardii e P mangiferae no meio BDA e uma melhor esporulaccedilatildeo nos meios BDA e V8

(Campbell CO) apoacutes 15 e 30 dias de incubaccedilatildeo No presente trabalho foi verificado

maior crescimento dos isolados de Phomopsis em meio BDA seguido do meio MEA em

meio AV a taxa de crescimento foi inferior

FONTE O autor

000

100

200

300

400

500

600

700

B A FEC D

NOTA As letras indicam os diferentes agrupamentos formados em relaccedilatildeo ao diacircmetro meacutedio das colocircnias dos isolados endofiacuteticos de Phomopsis Os isolados seguidos pela mesma letra natildeo diferem estatisticamente entre si Foi aplicado o Teste de Scott Knott ao niacutevel de 5 de probabilidade (ANEXO 2) A ESBA1 A323 A215A ESSD1 SM9713 ESGF1 SM9631 ESJD1 ESKD1 A334 B ESDF1 A132 A123 A333A MU0123 ESJH1 A321 ESRD1 A116 A134 A115B C ESIA1 A131 SM9714 A135 ESIE1 ESFB2 A124 ESPAC22 ES2KF1 A113 ESJE1 D ESJE2 ESFH1 ESJG1 ES2WC1 PHO1 SM9638 ES2NA1 ES2AB1 ESFF1 AT9811 AT9810 ES2WF1 A126 PHO19 A216B ES80J ESGA1 E AT9906 F A333B

FIGURA 6 DIAcircMETRO MEacuteDIO DAS COLOcircNIAS DOS ISOLADOS ENDOFIacuteTICOS DE Phomopsis spp EM MEIO BDA APOacuteS 5 DIAS DE CRESCIMENTO A 22 ordmC SOB LUZ CONTIacuteNUA

Diacirc

met

ro e

m c

m

71


AV estaacute representado na figura 7 Os isolados foram reunidos em sete grupos

diferentes A ESKD1 B ESJE2 A123 C ESJE1 SM9638 AT9811 SM9713 PHO1

ESBA1 SM9631 ESFB2 A334 A323 MU0123 D A333A ESJD1 ESGF1 A116 E ESPAC22 ESDF1 A321 A132 ES2KF1 ESJG1 ESRD1 PHO19 A115B A124

ESFF1 A134 ESIE1 A135 A131 A113 ES2WF1 ESSD1 ESIA1 F ESGA1 ESJH1

ESFH1 AT9906 ES2NA1 A216B ES80J A215A G AT9810 A333B ES2AB1

SM9714 ES2WC1 A126 Apenas o isolado ESKD1 representante do grupo A

apresentou taxa de crescimento raacutepida de 70 cm (apoacutes 5 dias de crescimento) a

maioria dos isolados tiveram crescimento lento (ANEXO 3)

NOTA As letras indicam os diferentes agrupamentos formados em relaccedilatildeo ao diacircmetro meacutedio das colocircnias dos isolados endofiacuteticos de Phomopsis spp Os isolados seguidos pela mesma letra natildeo diferem estatisticamente entre si Foi aplicado o Teste de Scott Knott ao niacutevel de 5 de probabilidade (ANEXO 3) A ESKD1 B ESJE2 A123 C ESJE1 SM9638 AT9811 SM9713 PHO1 ESBA1 SM9631 ESFB2 A334 A323 0123 D A333A ESJD1 ESGF1 A116 E ESPAC22 ESDF1 A321 A132 ES2KF1 ESJG1 ESRD1 PHO19 A115B A124 ESFF1 A134 ESIE1 A135 A131 A113 ES2WF1 ESSD1 ESIA1 F ESGA1 ESJH1 ESFH1 AT9906 ES2NA1 A216B ES80J A215A G AT9810 A333B ES2AB1 SM9714 ES2WC1 A126

FIGURA 7 AVALIACcedilAtildeO DAS MEacuteDIAS DO DIAcircMETRO DAS COLOcircNIAS DOS ISOLADOS ENDOFIacuteTICOS DE Phomopsis spp EM MEIO AV APOacuteS 5 DIAS DE CRESCIMENTO A 22 ordmC SOB LUZ CONTIacuteNUA

000

100

200

300

400

500

600

700

B A F C GD E

FONTE O autor

Diacirc

met

ro e

m c

m

72

Foi observado que dos 49 endoacutefitos e os 2 isolados patogecircnicos de Phomopsis

spp avaliados (TABELA 1) 27 apresentaram variaccedilatildeo intra-individual quanto ao

crescimento nos diversos meios Por exemplo os isolados A323 e SM9631 em meio

MEA e BDA pertencem ao grupo A e no meio AV ao grupo C Os outros 24 isolados

natildeo apresentaram variaccedilatildeo entre os agrupamentos formados nos diferentes meios

Os isolados que se agrupam baseados no crescimento nos trecircs meios natildeo satildeo

os mesmos quando se considera a cor do verso e reverso da placa assim como natildeo

satildeo semelhantes aos agrupamentos formados quando comparados com os bordos e

aspecto da colocircnia

Gurgel Menezes e Coelho (2002) estudando Phomopsis anacardii e Phomopsis

mangiferae observaram maior produccedilatildeo de picniacutedios nos meios de extrato de malte

aveia haste de soja e cenoura somente quando mantidos sob luz contiacutenua A

produccedilatildeo de picniacutedios foi reduzida em alternacircncia de luz e quase nula no escuro

contiacutenuo No presente trabalho foi observado que a maioria dos isolados formaram

estruturas de reproduccedilatildeo com o uso de luz contiacutenua em baixas temperaturas 22 a 25 degC

e pH 58 nos trecircs meios avaliados apoacutes 14 dias de crescimento

Segundo Cochrane (1959) e Griffin (1994) a luminosidade promove formaccedilatildeo

das estruturas reprodutivas assim como estatildeo diretamente ligadas agrave composiccedilatildeo do

meio de cultura atraveacutes de diferentes reaccedilotildees enzimaacuteticas Leonian (1924) descreve

que o efeito da luz como indutor da reproduccedilatildeo de fungos estaacute associado agraves

modificaccedilotildees que ocorrem no seu metabolismo celular combinados aos elementos que

constituem o meio de cultura

Timnick Lilly e Barnett (1951) detectaram efeito positivo da luz para a formaccedilatildeo

de picniacutedios ao verificarem que o regime escuro contiacutenuo inibia a formaccedilatildeo de picniacutedios

de Diaporthe phaseolorum Resultados semelhantes foram observados por Correcirca

(1995) avaliando Phomopsis sp provenientes de sementes florestais observou uma

melhor esporulaccedilatildeo em meio aveia sob regime de claro contiacutenuo por 12 dias de

incubaccedilatildeo

Na anaacutelise da micromorfologia observou-se que os isolados apresentavam

estruturas de reproduccedilatildeo a partir de 14 dias ateacute 21 dias de crescimento (FIGURA 8)

73

exceto os isolados SM9811 SM9638 e Phomopsis longicolla PHO1 que natildeo formaram

estruturas de reproduccedilatildeo em nenhum dos meios ensaiados Os isolados SM9811 e

SM9638 foram descritos como pertencentes ao gecircnero Phomopsis e depositados na

Coleccedilatildeo de Cultura de Fungos do Departamento de Micologia (IOC) da FIOCRUZ e

foram descritos por Rodrigues e Samules (1999) O isolado PHO1 foi isolado e

identificado pela EMBRAPA (Londrina-PR) como pertencente agrave espeacutecie P longicolla

Os coniacutedios do tipo alfa foram menos frequumlentes do que os do tipo beta Em

meio de cultura BDA apenas 11 isolados apresentaram o tipo de esporo alfa jaacute os beta

coniacutedios filiformes curvos na extremidade ou ligeiramente curvos foram visualizados

em quase todos os isolados de Phomopsis spp

Foi observado que para os isolados que apresentaram os dois tipos de esporos

foram visualizados com 14 dias de crescimento apenas alfa coniacutedios hialinos com

vacuacuteolos nas extremidades de forma ovoacuteide e natildeo foram visualizados beta coniacutedios

Apoacutes 21 dias os dois tipos de esporos foram visualizados nesses isolados (FIGURA 8a

e 8c) Alguns alfa coniacutedios apresentavam mais de dois vacuacuteolos nas extremidades

(FIGURA 8b) Essa variaccedilatildeo intra-individual tambeacutem foi observada em relaccedilatildeo agrave

morfologia do beta coniacutedio em que alguns apresentam curvatura na extremidade

outros ligeiramente curvos (FIGURA 8c)

NOTA A - isolado SM9631 aumento de 400x B- isolado SM9714 aumento de 1000x C- isolado SM9713 aumento de 400x microscopia oacuteptica Setas pretas indicam os alfa coniacutedios e setas vermelhas os beta coniacutedios Escala em 1μM

FONTE O autor

FIGURA 8 FOTOMICROGRAFIA DOS CONIacuteDIOS DOS ISOLADOS ENDOFIacuteTICOS DE Phomopsis EM BDA APOacuteS 21 DIAS DE CRESCIMENTO A 22ordmC SOB LUZ CONTIacuteNUA

A B C

74

Alfa coniacutedios do isolado SM9713 provenientes dos meios de cultura AV (FIGURA

9a) e BDA (FIGURA 9e) apresentaram grande variaccedilatildeo morfoloacutegica Na figura 9 no

mesmo conidioacuteforo eacute visiacutevel a diferenccedila morfoloacutegica do alfa coniacutedio Na figura 9e o

conidioacuteforo apresenta alfa coniacutedios com mais de duas gotas nas extremidades (SETA 1)

e alfa coniacutedios com apenas dois vacuacuteolos (SETA 2) Em maior aumento eacute possiacutevel

perceber que existem variaccedilotildees de dois trecircs e ateacute quatro vacuacuteolos no mesmo isolado

(FIGURA 9a 9b e 9c) Tal variaccedilatildeo pode ser decorrente de diferenciados graus de

maturaccedilatildeo destes coniacutedios o que dificulta a caracterizaccedilatildeo morfoloacutegica de espeacutecies do

gecircnero Phomopsis

A medida do comprimento dos beta coniacutedios em meio BDA mostrou que os

isolados apresentam diferenccedilas estatiacutesticas significativas reunindo os isolados em 15

FIGURA 9 FOTOMICROGRAFIA DOS CONIacuteDIOS DO ISOLADO SM9713 EM MEIOS BDA e AV APOacuteS 21 DIAS DE CRESCIMENTO A 22ordmC SOB LUZ CONTIacuteNUA

1 2 A

B C D

E

NOTA A - em meio AV aumento de 400x B C e D- em meio BDA aumento de 650x E- em meio BDA aumento de 400x Microscopia oacutetica

FONTE O autor

75

grupos diferentes (ANEXO 5) A (AT9906 AT8010) B (ESFH1) C (ESPAC22 ES2KF1

SM9631) D (ESGA1 PHO19) E (ES80J) F (ESRD1) G (ESJE2 ESFB2 ESJE1) H

(ESJG1) I (A323) J (A333A A135 A124 A126 A132 A131 A134 A115B ESIE1) K

(ES2WC1 ES2WF1) L (SM9713 A334 ESIA1 A333B ESFF1 ESGF1) M (ES2AB1

A123 A113 ESJD1) N (ESKD1 ES2NA1 A215A SM9714) O (ESSD1 ESJH1

MU0123 A321 ESDF1 A216B A116) (FIGURA 10) Os isolados tambeacutem natildeo se

agrupam de acordo com os outros criteacuterios avaliados como a cor do verso e reverso

da placa diacircmetro das colocircnias assim como natildeo satildeo semelhantes aos agrupamentos

formados quando comparados com os bordos e aspecto do miceacutelio

NOTA As letras maiuacutesculas indicam os diferentes agrupamentos formados em relaccedilatildeo agrave meacutedia do comprimento de beta coniacutedio dos isolados endofiacuteticos de Phomopsis spp Isolados de cada agrupamento A (AT9906 AT8010) B (ESFH1) C (ESPAC22 ES2KF1 SM9631) D (ESGA1 PHO19) E (ES80J) F (ESRD1) G (ESJE2 ESFB2 ESJE1) H (ESJG1) I (A323) J (A333A A135 A124 A126 A132 A131 A134 A115B ESIE1) K (ES2WC1 ES2WF1) L (SM9713 A334 ESIA1 A333B ESFF1 ESGF1) M (ES2AB1 A123 A113 ESJD1) N (ESKD1 ES2NA1 A215A SM9714) O (ESSD1 ESJH1 MU0123 A321 ESDF1 A216B A116) As meacutedias seguidas pela mesma letra minuacutescula natildeo diferem estatisticamente entre si Foi aplicado o Teste de Tukey ao niacutevel de 5 de probabilidade (ANEXO 5)

FIGURA 10 COMPRIMENTO DOS CONIacuteDIOS DOS ISOLADOS ENDOFIacuteTICOS DE Phomopsis spp APOacuteS 21 DIAS DE CRESCIMENTO EM BDA A 22ordmC SOB LUZ CONTIacuteNUA

0

5

10

15

20

25

30

35

40

B C E F MID LJA N H K OG

a

b

c

cd

de

ef

efg

fgh

fghi

ghij

ghil

hil

him

im

m

FONTE O autor

Diacirc

met

ro e

m μ

M

76

Desta forma as caracteriacutesticas macroscoacutepicas (coloraccedilatildeo bordos e tipos de

miceacutelio da colocircnia) e de micromorfologia dos coniacutedios avaliadas isoladamente natildeo

permitiram propor identificaccedilatildeo das espeacutecies dos isolados endofiacuteticos de Phomopsis

Sendo assim optou-se por realizar uma anaacutelise polifaacutesica agrupando as caracteriacutesticas

morfoloacutegicas analisadas tais como crescimento micelial coloraccedilatildeo e bordos da

colocircnia tipo de miceacutelio comprimento dos coniacutedios e tipos de coniacutedios produzidos em

deferentes meios Essa metodologia foi descrita por Figueiredo et al (2006) para

caracterizar isolados de Pestalotiopsis Para todas estas caracteriacutesticas foram

atribuiacutedas notas de 0 ou 1 onde 0 representou ausecircncia da caracteriacutestica e 1 a

presenccedila (ANEXO 12) Os resultados compuseram uma matriz binaacuteria analisada pelo

software NTSYS (coeficiente Jaccard) com o agrupamento pelo meacutetodo UPGMA

permitindo a construccedilatildeo de um dendrograma de similaridade morfoloacutegica (FIGURA 11)

De acordo com o dendrograma de similaridade morfoloacutegica (FIGURA 11)

sugere-se a formaccedilatildeo de seis grupos com elevados valores de bootstrap que conferem

robustez aos agrupamentos No grupo I estatildeo reunidos os isolados MU0123 e

SM9713 no grupo II os isolados AT9810 e AT9906 no grupo III os isolados ESJE1 e

ESJE2 no grupo IV os isolados ESFB2 e ESFF1 no grupo V os isolados ES2KF1 e

ESJG1 e no grupo VI os isolados ES2WF1 e ES80J Os demais agrupamentos

formados natildeo foram considerados pois apresentam baixos valores de bootstrap e ou

baixos valores de similaridade morfoloacutegica

Os dados mostram elevada variabilidade morfoloacutegica dos isolados de Phomopsis

avaliados o que dificulta a delimitaccedilatildeo de espeacutecies apenas com dados morfoloacutegicos

Segundo Parmeter (1958) e Rehner e Uecker (1994) o alto grau de plasticidade das

caracteriacutesticas morfoloacutegicas impossibilita a delimitaccedilatildeo de espeacutecies no gecircnero

Phomopsis Gamboa-Gaitaacuten Laureano e Bayman (2005) estudando isolados de

Phomopsis endofiacuteticos de Guarea guidonia (Meliaceae) de duas regiotildees de Luquillo

(Porto Rico) relataram elevados niacuteveis de variabilidade morfoloacutegica entre os isolados

avaliados Eles observaram uma mistura de diferentes morfotipos em ambas as regiotildees

estudadas

77

Neste trabalho foi observado um elevado niacutevel de variabilidade morfoloacutegica dos

isolados de Phomopsis spp obtidos de seis diferentes espeacutecies de plantas e regiotildees

geograacuteficas Natildeo foi possiacutevel observar estruturaccedilatildeo populacional dos isolados em

funccedilatildeo da espeacutecie hospedeira Na figura 12 os isolados de M ilicifolia encontram-se na

coloraccedilatildeo rosa e distribuiacutedos ao longo dos dois eixos que representam os dois

principais componentes de variaccedilatildeo Igualmente os isolados em preto representam as

linhagens provindas de S terebinthifolius e tambeacutem encontram-se dispersos Tais

resultados natildeo surpreendem pois eacute possiacutevel que a mesma espeacutecie de Phomopsis seja

isolada em diferentes hospedeiros

NOTA I II III IV V VI satildeo grupos formados para inferir sobre a diversidade dos isolados endofiacuteticos de Phomopsis Os valores a esquerda dos noacutes indicam os valores de bootstrap

COEFICIEcircNTE DE SIMILARIDADE MORFOLOacuteGICA

FIGURA 11 DENDROGRAMA GERADO A PARTIR DOS DADOS DE SIMILARIDADE MORFOLOacuteGICA DOS ISOLADOS ENDOFIacuteTICOS DE Phomopsis spp

FONTE O autor

r = 07577 (P= 00001)

V VI

IV

I II III

78

FONTE O autor FIGURA 12 ANAacuteLISE DE COMPONENTES PRINCIPAIS DE SIMILARIDADE MORFOLOacuteGICA ENTRE OS ISOLADOS ENDOFIacuteTICOS DE Phomopsis spp NOTA Isolados em coloraccedilatildeo rosa obtidos de Maytenus ilicifolia Em preto Schinus terebinthifolius Em azul escuro Myracrodruon urundeuva Em azul claro Aspidosperma tomentosun Em verde Spondias mombin 53 Caracterizaccedilatildeo Molecular de Phomopsis spp 531 RAPD

Os isolados de Phomopsis spp foram avaliados por meio de marcadores

moleculares do tipo RAPD a fim de verificar a magnitude da variabilidade geneacutetica

Foram analisados por esta metodologia 54 isolados Destes 47 Phomopsis spp

endoacutefitos os isolados MU0123 e SM9638 natildeo amplificaram em nenhuma das

condiccedilotildees ensaiadas dois isolados de Phomopsis patoacutegenos de soja e cinco isolados

de Pestalotiopsis Foram utilizados 4 oligonucleotiacutedeos gerando 99 bandas O tamanho

dos fragmentos amplificados variou de 400 a 2600 pb e podem ser visualizados nas

Figuras 13 a 16

79

FIG

UR

A 1

4 P

ER

FIL

DE

AM

PLI

FIC

ACcedil

AtildeO

CO

M O

OLI

GO

NU

CLE

OTIacute

DE

O O

PX

14 D

OS

ISO

LAD

OS

EN

DO

FIacuteTI

CO

S D

E P

hom

opsi

s sp

E

GR

UP

O E

XTE

RN

O P

esta

lotio

psis

FIG

UR

A 1

3 P

ER

FIL

DE

AM

PLI

FIC

ACcedil

AtildeO

CO

M O

OLI

GO

NU

CLE

OTIacute

DE

O O

PX

11 D

OS

ISO

LAD

OS

EN

DO

FIacuteTI

CO

S D

E P

hom

opsi

s sp

E

GR

UP

O E

XTE

RN

O P

esta

lotio

psis

80

FIG

UR

A 1

5 P

ER

FIL

DE

AM

PLI

FIC

ACcedil

AtildeO

CO

M O

OLI

GO

NU

CLE

OTIacute

DE

O O

PX

19 D

OS

ISO

LAD

OS

EN

DO

FIacuteTI

CO

S D

E P

hom

opsi

s sp

E

GR

UP

O E

XTE

RN

O P

esta

lotio

psis

FIG

UR

A 1

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esta

lotio

psis

81

A anaacutelise destes marcadores RAPD permitiu a construccedilatildeo de um dendrograma

de similaridade geneacutetica (FIGURA 17) O coeficiente de correlaccedilatildeo das matrizes de

similaridade geneacutetica e cofeneacutetica obtido pelo teste de Mantel foi elevado (r=08157 e

p=00001) indicando que o dendrograma representa de forma adequada a matriz de

similaridade geneacutetica obtida pelos marcadores de RAPD Entretanto os valores de

bootstrap da maioria dos agrupamentos formados foram baixos Desta forma somente

foram considerados na anaacutelise os agrupamentos com bom suporte de bootstrap e

coeficientes de similaridade superiores a 50

Os dados indicam elevada variabilidade geneacutetica dos isolados de Phomopsis

spp avaliados (FIGURAS 17 e 18) com a formaccedilatildeo de sete grupos Os isolados de

Pestalotiopsis utilizados como grupo externo formaram um grupo (boostrap = 100)

isolado (FIGURA 17) sendo relevante para inferir a magnitude da variabilidade geneacutetica

observada entre os isolados de Phomopsis spp

O primeiro agrupamento reuacutene trecircs endoacutefitos de Espinheira Santa ESBA1

ES2AB1 e ESSD1 (49 de similaridade e bootstrap = 64) Esses isolados foram

obtidos do mesmo isolamento e pomar (CNPFEMPRAPA ColomboPR) poreacutem de

tecidos e plantas diferentes Os isolados ESBA1 e ESSD1 foram obtidos de peciacuteolo

enquanto ES2AB1 foi isolado de folha Eacute importante observar que o isolado ESBA1

apresentou estrutura de reproduccedilatildeo sexual sendo classificado como Diaporthe sp e

no entanto apresenta alto valor de similaridade geneacutetica com os isolados de Phomopsis

sp sugerindo assim que pertenccedilam ao mesmo complexo Phomopsis Diaporthe

Esses isolados natildeo se agrupam quanto aos caracteres morfoloacutegicos (FIGURAS 11 e

12)

O segundo agrupamento com 893 de similaridade geneacutetica e com bootstrap

de 100 compreende P longicolla (PHO1) uma linhagem patogecircnica de soja isolada

em Primavera do Leste ndash MT e o isolado SM9713 endoacutefito de Spondias mombin

coletado em Redenccedilatildeo ndash PA Aleacutem de coletados em lugares e hospedeiros totalmente

diferentes esses isolados apresentam caracteriacutesticas morfoloacutegicas divergentes pois

natildeo pertencem ao mesmo agrupamento em nenhuma das caracteriacutesticas morfoloacutegicas

analisadas Entretanto a alta similaridade geneacutetica destes isolados sugere que

82

pertenccedilam agrave mesma espeacutecie o que reforccedila as observaccedilotildees anteriores de que a

definiccedilatildeo de espeacutecie do gecircnero Phomopsis natildeo eacute possiacutevel utilizando-se apenas

caracteriacutesticas morfoloacutegicas

FIGURA 17 DENDROGRAMA GERADO A PARTIR DOS DADOS DE SIMILARIDADE GENEacuteTICA ENTRE OS ISOLADOS DE Phomopsis spp POR MEIO DE MARCADORES MOLECULARES RAPD

COEFICIENTE DE SIMILARIDADE GENEacuteTICA

FONTE O autor

I II

III IV V VI VII

GRUPO EXTERNO

r= 08157 (p=00001)

100

83

O terceiro agrupamento com 75 de similaridade geneacutetica (FIGURA 17)

compreende dois isolados endofiacuteticos de Aspidosperma tomentosun AT9810 e AT9906

Esses isolados apresentaram caracteriacutesticas morfoloacutegicas muito semelhantes

formando o agrupamento II com 81 de similaridade morfoloacutegica (FIGURA 11)

O quarto agrupamento com 72 de similaridade geneacutetica compreende os

isolados ESFH1 e ESFF1 provenientes do peciacuteolo de Espinheira Santa da mesma

coleta poreacutem novamente eles natildeo se agrupam quanto aos caracteres morfoloacutegicos

observados (FIGURAS 11 e12)

O quinto agrupamento com 85 de similaridade geneacutetica reuacutene os isolados

ESKD1 e ESJH2 e ESJH1 provenientes de peciacuteolo da Espinheira Santa coletados na

mesma data Os isolados ESJH1 e ESJH2 foram obtidos do mesmo peciacuteolo e

apresentam caracteriacutesticas morfoloacutegicas mais semelhantes entre si do que quando

comparados ao isolado ESKD1 (FIGURA 11) Entretanto a figura 17 revela que por

meio de marcadores RAPD os isolados ESKD1 e ESJH2 satildeo mais proacuteximos (92 de

similaridade geneacutetica) Sugere-se assim que os 3 isolados pertenccedilam agrave mesma

espeacutecie

O sexto agrupamento com 52 de similaridade (FIGURA 17) compreende os

isolados A321 obtido de Aroeira e ESIA1 obtido de Espinheira Santa Aleacutem de

coletados em lugares e hospedeiros totalmente diferentes esses isolados apresentam

caracteriacutesticas morfoloacutegicas diferentes (FIGURAS 11 e 12) Apesar do valor de

bootstrap atribuir confiabilidade a este agrupamento (77) o valor de similaridade

observado (52) natildeo eacute alto Assim natildeo eacute possiacutevel inferir que pertenccedilam agrave mesma

espeacutecie

O mesmo ocorre com o seacutetimo agrupamento que com 55 de similaridade

compreende os isolados A333A obtido de Aroeira e ESRD1 obtido de Espinheira Santa

Aleacutem de coletados em lugares e hospedeiros totalmente diferentes esses isolados

apresentam caracteriacutesticas morfoloacutegicas diferentes natildeo pertencendo ao mesmo

agrupamento quanto aos caracteres morfoloacutegicos (FIGURAS 11 e 12)

Esses resultados mostram que caracteriacutesticas morfoloacutegicas natildeo satildeo suficientes

para inferir espeacutecies neste gecircnero analisadas individualmente ou em anaacutelise polifaacutesica

84

Aleacutem disso natildeo haacute estruturaccedilatildeo populacional quanto ao hospedeiro Esses dados

reforccedilam a necessidade de revisatildeo na classificaccedilatildeo de espeacutecies do gecircnero Phomopsis

Atualmente a anaacutelise polifaacutesica vem sendo realizada em estudos de diversidade

bacteriana utilizando-se caracteriacutesticas morfoloacutegicas bioquiacutemicas fisioloacutegicas e

moleculares (KIM et al 2006 a b NEDASHKOVSKAYA et al 2006) e

esporadicamente na identificaccedilatildeo de leveduras (SAMPAIO et al 1999 VILLA-

CARVAJAL et al 2004) Em fungos filamentosos a anaacutelise polifaacutesica de caracteriacutesticas

morfoloacutegicas foi utilizada com sucesso na taxonomia de Penicillium (FRISVAD e

SAMSON 2004) Aspergillus (FRISVAD et al 2004) e Pestalotiopsis (FIGUEIREDO

2006)

FIGURA 18 ANAacuteLISE DE COMPONENTES PRINCIPAIS DE SIMILARIDADE GENEacuteTICA ENTRE OS ISOLADOS ENDOFIacuteTICOS DE Phomopsis spp

FONTE O autor

85


Visando elucidar a taxonomia dos isolados de Phomopsis spp utilizados neste

trabalho foi realizado com sucesso o sequumlenciamento da regiatildeo ITS1 - 58S - ITS2 do

rDNA de 29 isolados Apoacutes o alinhamento e ediccedilatildeo destas sequumlecircncias foi realizada

uma busca no banco de dados de sequumlecircncias (httpwwwncbinlmnihgov) a fim de

identificar sequumlecircncias similares Os isolados estatildeo representados na aacutervore filogeneacutetica

(FIGURA 19)

Os isolados agruparam-se em 16 clados sugerindo que as plantas medicinais

estudadas satildeo colonizadas por pelo menos dezesseis diferentes espeacutecies de

Phomopsis (FIGURA 19) Entretanto a maioria dos isolados natildeo apresentaram

sequumlecircncias ITS com identidade superior a 90 com nenhuma sequumlecircncia depositada no

GenBank e portanto foram identificados como Phomopsis sp S1 a Phomopsis sp

S12

O primeiro clado (suportado com bootstrap de 98) estaacute representado na figura

20 e reuacutene os isolados A113 A131 A133 ESIA1 e A321 que apresentaram identidade

com P chimonanthi e com uma linhagem de Phomopsis sp endofiacutetica de Coffea

robusta (DQ123615) Esta linhagem foi isolada e sequumlenciada por Sette et al (2006) e

apresentou 99 de similaridade com as mesmas espeacutecies P chimonanthi P

michaeliae e Diaporthe helianthi (FIGURAS 19 e 20) A espeacutecie P chimonanthi foi

recentemente proposta por Chang e colaboradores (dados natildeo publicados) para

isolados antes denominados de P michaeliae Como esta espeacutecie foi descrita em 1987

e aceita ateacute o momento no presente trabalho sugere-se que os isolados A113 A131

A133 ESIA1 e A321 sejam classificados como P michaeliae

O isolado ESIA1 foi obtido de Espinheira Santa (Maytenus ilicifolia) enquanto os

demais isolados deste clado foram obtidos de Aroeira Vermelha (Schinus

terebinthifolius) Esses isolados apresentaram baixa similaridade geneacutetica quando

avaliados por RAPD e similaridade parcial quanto agraves caracteriacutesticas morfoloacutegicas uma

vez que fazem parte do mesmo agrupamento no diacircmetro da colocircnia em meio BDA

(Grupo C) e MEA (Grupo E)

86

FONTE O autor FIGURA 19 AacuteRVORE FILOGENEacuteTICA BASEADA NA SEQUumlEcircNCIA DA REGIAtildeO ITS1 58S E ITS2 DO rDNA DOS ISOLADOS DE Phomopsis spp (MEacuteTODO DE PARCIMOcircNIA)

ESIA1

A321

A113

A131

AY6229931| Phomopsis

P michaellae

Phomopsis sp S5 A116

ESRD1

ESJE2

ESKD1

Phomopsis sp S1


A334

A323Phomopsis sp S8


AJ3123481| Diaporthe helianthi

DQ2862851| Phomopsis sp CBS

AY8578681| Phomopsis longicolla

AF000207| Phomopsis longicolla

AF0010242| Diaporthe phaseolorum

DQ2356701| Phomopsis sp P4

Phomopsis sp S10 ESGA1


PHO19

AY0506271| Phomopsis sojae


P sojae

AF3584411 Diaporthe helianthi


SM9713

P longicolla PHO1

MU0123

P longicolla

A126

ESJH1Phomopsis sp S11

Phomopsis sp S12 ESJD1

Phomopsis sp S7 ESDF1

AB1051481| Diaporthe melonis

ES2AB1

ESBA1Phomopsis sp S6


AY6229961| Phomopsis camptothecae

AJ3123591| Diaporthe

AY7450241| Diaporthe

ES2KF1

ES2WF1

ESPAC22

Phomopsis sp S4

Phomopsis sp S3 ESGF1

AB2014431| Diaporthe conorum

DQ1165511| Diaporthe conorum CBS

SM9638

ESFH1

DQ2862861| Phomopsis theicola

AF230762 Phomopsis sp taxon 3

AY4857241| Phomopsis sp 1

DQ2862871| P theicola CBS

P theicola

Pestalotiopsis vismae

99

99

3599

98

91

7786

78

75

73

2973

5

5

3

2

11

71

70

25

22

33

40

67

63

33

44

65

41

34

29

27

21

21

18

13

12

8

7

5

3

3

0

0

0

19

32

23

31

87

Os isolados ESRD1 ESKD1 e ESJE2 apresentaram homologia quanto as

sequumlecircncias de ITS com suporte de bootstrap de 95 (FIGURA 19) Entretanto a figura

17 revela que por meio de marcadores RAPD os isolados ESKD1 e ESJE2 satildeo mais

proacuteximos apresentando 92 de similaridade geneacutetica (com bootstrap de 65) e 85

de similaridade desses isolados com o ESJE1 Assim sugere-se que estes 3 isolados

pertenccedilam agrave mesma espeacutecie Entretanto as sequumlecircncias ITS natildeo apresentaram

identidade superior a 90 com nenhuma sequumlecircncia depositada no GenBank Assim

esses isolados foram denominados de Phomopsis sp S1

FONTE O autor FIGURA 20 AacuteRVORE FILOGENEacuteTICA PARCIAL BASEADA NA SEQUumlEcircNCIA DA REGIAtildeO ITS1 58S E ITS2 DO rDNA DOS ISOLADOS DE Phomopsis spp (MODELO NEIGHBOR-JOINING COM CORRECcedilAtildeO KIMURA DOIS PARAcircMETROS)

O isolado PHO19 (patogecircnico de soja) foi classificado como Phomopsis sojae

formou um clado com um endoacutefito natildeo identificado (P3) e com um isolado da espeacutecie P

sojae (FIGURA 19) O isolado Phomopsis sp P3 foi obtido como endoacutefito de Tectona

grandis por Murali Surynarayanan e Geeta (2006)

A113

DQ1236151| Phomopsis sp CBMAI

ESIA1

AY6229931| Phomopsis chimonanthi

A131

A133

P michae liae

A124

A334

ESGA1

DQ1165521| Diaporthe conorum cbs 199-3990

98

62252719

0005

88

Os isolados MU0123 SM9713 e P longicolla (PHO1) apresentaram alta

homologia das sequumlecircncias (clado suportado com 99 de bootstrap) (FIGURA 19) Os

isolados SM9713 e P longicolla (PHO1) apresentaram 893 de similaridade geneacutetica

(com suporte de bootstrap de 100) utilizando-se marcadores RAPD (FIGURA 17) Na

anaacutelise morfoloacutegica os isolados MU0123 e SM9713 apresentaram mais de 70 de

similaridade poreacutem o isolado P longicolla (PHO1) apresentou caracteriacutesticas

morfoloacutegicas diferentes dos isolados MU0123 e SM9713 (FIGURA 11) O isolado PHO1

foi isolado como patoacutegeno de soja (Glycine max (L) Merr) no Mato Grosso enquanto os

isolados MU0123 e SM9713 foram obtidos como endofiacuteticos de Aroeira (Myracrodruon

urundeuva) e Cajaacute (Spondias mombin) respectivamente ambos no estado do Paraacute Em

funccedilatildeo das similaridades geneacuteticas observadas e por ser o isolado PHO1 utilizado

como referecircncia de P longicolla os isolados endofiacuteticos MU0123 e SM9713 foram

identificados como pertencentes a esta espeacutecie A alta similaridade geneacutetica destes

isolados sugere que pertenccedilam agrave mesma espeacutecie o que reforccedila as observaccedilotildees

anteriores de que a definiccedilatildeo de espeacutecie do gecircnero Phomopsis natildeo eacute possiacutevel

utilizando-se apenas caracteriacutesticas morfoloacutegicas O fato de isolados endofiacuteticos de S

mombin e M urundeuva serem identificados como P longicolla demonstra que

espeacutecies patogecircnicas para um hospedeiro podem colonizar de forma assintomaacutetica

diferentes espeacutecies vegetais Isso jaacute foi observado para outros gecircneros como

Guignardia e Phyllosticta (BAAYEN et al 2002 GLIENKE-BLANCO et al 2002)

Os endoacutefitos ESBA1 e ES2AB1 foram reunidos no mesmo clado sendo

denominados de Phomopsis sp S6 (FIGURA 19) esses isolados fazem parte do

mesmo agrupamento utilizando-se marcadores RAPD (FIGURA 17)

Os isolados A323 e A334 apresentaram grande identidade geneacutetica (suportado

com bootstrap de 70) e seu agrupamento estaacute representado na figura 19 Esses

isolados natildeo apresentaram identidade moderada a nenhuma das sequumlecircncias

depositadas no GenBank e portanto natildeo foi possiacutevel inferir sobre a espeacutecie desses

endoacutefitos Sugere-se que esses isolados de Aroeira pertenccedilam agrave mesma espeacutecie e

portanto foram denominados de Phomopsis sp S8 Os isolados ES2KF1 ES2WF1 e

89

ESPAC22 endoacutefitos de Espinheira Santa foram reunidos num mesmo clado sendo

denominados de Phomopsis sp S4 (FIGURA 19)

Os isolados A126 e ESJH1 foram reunidos no mesmo clado sendo denominados

de Phomopsis sp S11 eles foram isolados de diferentes plantas hospedeiras O

isolado ESJH1 foi obtido de Espinheira Santa (Maytenus ilicifolia) enquanto o isolado

A126 foi obtido de Aroeira Vermelha (Schinus terebinthifolius) Estes resultados

reforccedilam a dificuldade em inferir espeacutecies do gecircnero Phomopsis com base na planta

hospedeira

Os isolados A116 A124 A123 ESGA1 ESJD1 ESDF1 e ESGF1 natildeo

apresentaram identidade com nenhuma sequumlecircncia depositada no GenBank nem

similaridade com outros isolados analisados no presente trabalho Sugere-se que esses

endoacutefitos pertenccedilam a diferentes espeacutecies

No uacuteltimo clado o isolado ESFH1 apresentou homologia com a regiatildeo ITS1-

rDNA 58S - ITS2 da espeacutecie P theicola (DQ286286 e DQ286287) e com o isolado

SM9638 (FIGURA 19) Estes dois isolados foram obtidos de diferentes plantas

hospedeiras O isolado ESFH1 foi obtido em 2006 de M ilicifolia no Paranaacute enquanto o

isolado SM9638 foi obtido em 1996 como endofiacutetico da planta Spondias mombin no

Estado do Paraacute Esses isolados apresentam baixa similaridade morfoloacutegica (FIGURAS

11 e 12) Estes resultados reforccedilam a dificuldade em inferir espeacutecies do gecircnero

Phomopsis especialmente utilizando-se caracteriacutesticas morfoloacutegicas

No presente trabalho observou-se que vaacuterias espeacutecies de Phomopsis foram

isoladas de um mesmo hospedeiro assim como uma mesma espeacutecie foi encontrada

colonizando diferentes hospedeiros Isto jaacute foi relatado no gecircnero Phomopsis por

Brayford (1990) Farr Castlebury e Rossman (2002) e por Rehner e Uecker (1994)

Esses resultados reforccedilam a necessidade de revisatildeo do conceito de espeacutecie para o

gecircnero Phomopsis uma vez que muitas espeacutecies tecircm sido identificadas com base na

planta hospedeira (GAMBOA-GAITAacuteN LAUREANO e BAYMAN 2005 MURALI

SURYANARAYANAN GEETA 2006)

Os dados morfoloacutegicos e de RAPD foram altamente variaacuteveis e a anaacutelise das

sequumlecircncias da regiatildeo ITS1- 58S - ITS2 do rDNA foi informativa para alguns dos

90

isolados analisados Entretanto mais estudos satildeo necessaacuterios para a identificaccedilatildeo

precisa dessas espeacutecies A literatura eacute escassa quanto a trabalhos de taxonomia

morfologia biologia e ecologia de isolados endofiacuteticos do gecircnero Phomopsis Segundo

Phillips (2006) a identificaccedilatildeo das espeacutecies do gecircnero Phomopsis eacute difiacutecil porque as

espeacutecies natildeo estatildeo claramente definidas e existe uma sobreposiccedilatildeo entre os caracteres

morfoloacutegicos que as definem

A maioria das sequumlecircncias depositadas no GenBank satildeo de isolados

provenientes de lesotildees sendo portanto de espeacutecies patogecircnicas No presente trabalho

eacute possiacutevel que os isolados pertencentes a clados que natildeo se agruparam com nenhuma

sequumlecircncia jaacute depositada pertenccedilam a novas espeacutecies ou ainda a espeacutecies de

endoacutefitos ainda natildeo sequumlenciados Murali Surynarayanan e Geeta (2006)

caracterizaram por meio de sequumlenciamento da regiatildeo ITS e dados morfoloacutegicos 11

isolados endofiacuteticos de Phomopsis obtidos de Tectona grandis e Cassia fistula Eles

sugerem que apesar da grande variabilidade encontrada os isolados devem ser

reunidos em apenas dois grupos entretanto natildeo foi possiacutevel a identificaccedilatildeo em niacutevel

de espeacutecie Segundo os autores isto natildeo foi possiacutevel em funccedilatildeo dos fungos deste

gecircnero natildeo terem hospedeiros especiacuteficos e pela necessidade de revisatildeo do conceito

de espeacutecie em Phomopsis

Farr Castlebury e Rossman (2002) caracterizaram por anaacutelise de sequumlecircncias

ITS1 58S ITS2 e por caracteriacutesticas morfoloacutegicas linhagens de Phomopsis sp

isolados de Vaccinium corymbosum e V macrocarpon Baseados nesse estudo

verificaram que a maioria dos isolados tratava-se de Phomopsis vaccinii uma vez que

as sequumlecircncias agruparam-se com uma cultura referecircncia dessa espeacutecie


hospedeiros combinando dados de sequumlecircncias de ITS do rDNA do gene do fator1 alfa

de elongaccedilatildeo da traduccedilatildeo (ef-1) e genes de actina Foram formados seis grupos de

Phomopsis sendo que trecircs correspondem aos taacutexons P longicolla Diaporthe melonis e

D phaseolorum Os autores concluiacuteram que a ausecircncia de distinccedilatildeo morfoloacutegica e

informaccedilatildeo bioloacutegica tornam problemaacutetica a identificaccedilatildeo de espeacutecies deste gecircnero

91

No presente trabalho com base nos dados de RAPD (FIGURAS 17 e 18) pode-

se sugerir a existecircncia de pelo menos 10 espeacutecies de Phomopsis colonizando de forma

endofiacutetica as plantas de Maytenus ilicifolia analisadas Tais plantas satildeo provenientes de

um uacutenico pomar localizado no CNPFEMPRAPA em ColomboPR Ainda eacute possiacutevel

sugerir a existecircncia de pelo menos seis espeacutecies de Phomopsis colonizando de forma

endofiacutetica a planta de S terebinthifolius analisada neste trabalho Esta planta natildeo

recebeu qualquer tratamento com fungicidas ou outro agrotoacutexico uma vez que se

encontra isolada entre dois blocos do Setor de Ciecircncias Bioloacutegicas da UFPR (ANEXO

13) Talvez isso justifique a grande diversidade de isolados encontrada Esses dados

demonstram a importacircncia de estudos da comunidade endofiacutetica em plantas medicinais

e apontam para o problema da reduccedilatildeo de diversidade de microrganismos endofiacuteticos

pelo uso continuado de fungicidas

Resultados semelhantes foram obtidos por Gamboa-Gaitaacuten Laureano e Bayman

(2005) estudando isolados de Phomopsis endofiacuteticos da planta medicinal Guarea

guidonia (Meliaceae) Os autores relataram elevados niacuteveis de variabilidade geneacutetica

avaliada pela digestatildeo da regiatildeo ITS e tambeacutem a alta variabilidade morfoloacutegica entre

os isolados avaliados A aacutervore molecular agrupou indiviacuteduos fenotipicamente

diferentes Por outro lado Fernandez e Hanlin (1996) obtiveram resultados

concordantes entre a anaacutelise molecular por RAPD e as caracteriacutesticas morfoculturais

separando os isolados coletados de soja em dois grupos Diaporthe phaseolorum e

Phomopsis longicolla

Pioli et al (2003) caracterizaram por RAPD isolados do complexo





92

54 Avaliaccedilatildeo da atividade antimicrobiana 541 Cultura pareada

Os isolados de Phomopsis foram avaliados pela teacutecnica de cultura pareada

contra as linhagens PC1396 e PC3305 do fitopatoacutegeno G citricarpa As interaccedilotildees

foram classificadas em trecircs tipos 1) Inibiccedilatildeo do crescimento do fitopatoacutegeno com

sobreposiccedilatildeo de hifas 2) Inibiccedilatildeo do crescimento do fitopatoacutegeno sem sobreposiccedilatildeo

de hifas e 3) Ausecircncia de inibiccedilatildeo de crescimento Os resultados obtidos estatildeo

apresentados nas Tabelas 9 e 10

Todos os isolados de Phomopsis inibiram significativamente o crescimento das

duas linhagens de Guignardia exceto o isolado ES2WC1 (Phomopsis sp) que

apresentou interaccedilatildeo do tipo 3 em que natildeo houve inibiccedilatildeo significativa do fitopatoacutegeno

apenas 287 e 828 contra PC1396 e PC3305 respectivamente (ANEXO 6 7 8 e

9) Foi observado que as duas linhagens de G citricarpa apresentaram o mesmo tipo

de interaccedilatildeo frente ao mesmo isolado de Phomopsis ou seja natildeo houve variaccedilatildeo

quanto a linhagem do fitopatoacutegeno avaliado Tal observaccedilatildeo reforccedila a importacircncia dos

resultados aqui apresentados

Dos 49 isolados de Phomopsis endoacutefitos de plantas medicinais avaliados 38

inibiram o crescimento das duas linhagens do fitopatoacutegeno G citricarpa com

porcentagem de inibiccedilatildeo superior a 50 Os isolados A333B (Phomopsis sp) ESGF1

(Phomopsis sp S3) SM9638 (P theicola) AT9810 (Phomopsis sp) AT9906

(Phomopsis sp) e ES2WC1 (Phomopsis sp) apresentaram taxas de inibiccedilatildeo inferiores

a 50 contra PC1396 e PC3305 os isolados ES80J (Phomopsis sp) e AT9811

(Phomopsis sp) apresentaram taxas de inibiccedilatildeo inferiores a 50 apenas contra a

linhagem PC1396 enquanto contra a PC3305 a inibiccedilatildeo foi de 5132 e 5397

respectivamente Por outro lado os isolados de Phomopsis ESFF1 (Phomopsis sp)

SM9714 (Phomopsis sp) e A132 (Phomopsis sp) apresentaram taxas de inibiccedilatildeo

inferiores a 50 apenas contra a linhagem PC3305 enquanto contra PC1396 a

inibiccedilatildeo foi de 5017 6215 e 5492 respectivamente

93

A anaacutelise estatiacutestica demonstrou que haacute diferenccedila significativa entre o controle e

os isolados avaliados O fungicida Derosal apresentou inibiccedilatildeo do crescimento do

fitopatoacutegeno em aproximadamente 19 todos os isolados de Phomopsis que

apresentaram inibiccedilatildeo superior ao fungicida com significacircncia no teste estatiacutestico exceto

o isolado ES2WC1 (Phomopsis sp) como citado anteriormente (TABELA 8 e 9 ANEXO

6 7 8 e 9)

As interaccedilotildees do tipo 1 nas quais ocorre agrave sobreposiccedilatildeo de hifas do endoacutefito

sobre o fitopatoacutegeno sugere a ocorrecircncia de parasitismo Esse tipo de interaccedilatildeo entre

os isolados de Phomopsis e as linhagens de G citricarpa ocorreu em 47 dos isolados

Tais isolados apresentam diferenccedila significativa entre o controle destacando-se os

isolados ESDF1 (Phomopsis sp S7) A134 (Phomopsis sp) (FIGURA 21) ESJD1

(Phomopsis sp S12) e ESJH1 (Phomopsis sp S11) que inibiram o crescimento de G

citricarpa PC1396 em 7338 6885 6826 e 6792 respectivamente A anaacutelise

estatiacutestica demonstra que haacute diferenccedila significativa entre o controle e estes isolados

poreacutem natildeo haacute diferenccedila significativa entre os mesmos (ANEXO 6 7 e 8)

As interaccedilotildees do tipo 2 nas quais natildeo ocorre sobreposiccedilatildeo de hifas ocorreram

em 51 dos isolados destacando-se os isolados ESSD1 (Phomopsis sp) e SM9713

(P longicolla) que inibiram o crescimento da linhagem PC1396 de G citricarpa em

7324 e 6763 respectivamente A anaacutelise estatiacutestica demonstra que haacute diferenccedila

significativa entre o controle e os isolados ESSD1 (Phomopsis sp) e SM9713 (P

longicolla) os isolados de Phomopsis tambeacutem diferem entre si (TABELA 8) Essas

interaccedilotildees devem ser avaliadas posteriormente em microscopia oacutetica para confirmar se

estaacute ocorrendo parasitismo

FIGURA 21 INTERACcedilAtildeO DOS ISOLADOS DE Phomopsis CONTRA Guignardia citricarpa PC1396 PELA TEacuteCNICA DE CULTURA PAREADA

Phomopsis A134

G Citricarpa PC1396

Phomopsis SM9713

G Citricarpa PC1396

G Citricarpa PC1396 Controle

G Citricarpa PC1396

Fungicida Derosal

FONTE O autor

94

Isolados Identificaccedilatildeo Tipo de Interaccedilatildeo Inibiccedilatildeo () Fungicida 19

ESDF1 Phomopsis sp S7 1 7338 ESSD1 Phomopsis sp 2 7324 A134 Phomopsis sp 1 6885

ESJD1 Phomopsis sp S12 1 6826 ESJH1 Phomopsis sp S11 1 6792 SM9713 P longicolla 2 6763 ESIE1 Phomopsis sp 1 6758 ESFB2 Phomopsis sp 1 6724

MU0123 P longicolla 2 6663 ESRD1 Phomopsis sp S1 2 6655 ESJG1 Phomopsis sp 2 6621 ESJE1 Phomopsis sp S1 1 6621

ESPAC22 Phomopsis sp S4 1 6516 A131 P michaeliae 2 6393 A126 Phomopsis sp S11 1 6352 A123 Phomopsis sp S2 1 6270 A113 P michaeliae 1 6270

SM9631 Phomopsis sp 1 6265 ES2AB1 Phomopsis sp S6 1 6246 ESJE2 Phomopsis sp S1 1 6246 A323 Phomopsis sp S8 1 6230

SM9714 Phomopsis sp 1 6215 ES2NA1 Phomopsis sp 1 6212

A334 Phomopsis sp S8 1 6189 ESBA1 Phomopsis sp S6 2 6177 A321 P michaeliae 1 6148

ESKD1 Phomopsis sp S1 1 6109 A216B Phomopsis sp 2 6025

ES2KF1 Phomopsis sp S4 2 5939 ESIA1 P michaeliae 2 5904 A135 Phomopsis sp 2 5902 A124 Phomopsis sp S9 2 5861

A115B Phomopsis sp 1 5861 A116 Phomopsis sp S5 2 5820

A215A Phomopsis sp 1 5656 A132 Phomopsis sp 2 5492

ESFH1 P theicola 2 5427 A333A Phomopsis sp 1 5369 ESGA1 Phomopsis sp S10 2 5324

ES2WF1 Phomopsis sp S4 2 5205 ESFF1 Phomopsis sp 2 5017 AT9811 Phomopsis sp 1 4920 ESGF1 Phomopsis sp S3 2 4642 SM9638 P theicola 1 4522 A333B Phomopsis sp 1 4426 ES80J Phomopsis sp 2 4344 AT9810 Phomopsis sp 2 4173 AT9906 Phomopsis sp 2 3078 ES2WC1 Phomopsis sp 3 287

FONTE O autor

TABELA 8 PORCENTAGEM DE INIBICcedilAtildeO E TIPOS DE INTERACcedilAtildeO ENTRE OS ISOLADOS ENDOFIacuteTICOS DE Phomopsis E Guignardia citricarpa ndash PC1396

95

A interaccedilatildeo do tipo 1 entre os isolados de Phomopsis e a linhagem PC3305 de

G citricarpa ocorreu em 47 dos isolados a reduccedilatildeo do crescimento do fitopatoacutegeno

apresentou diferenccedila significativa quando comparados com o controle destacando-se

os isolados A215A (Phomopsis sp) A115B (Phomopsis sp) ESDF1 (Phomopsis sp

S7) ESJD1 (Phomopsis sp S12) A123 (Phomopsis sp S2) que inibiram o crescimento

da linhagem PC3305 de G citricarpa em 7947 7616 7152 7119 e 7119

respectivamente (TABELA 9 FIGURA 22) A anaacutelise estatiacutestica demonstra que haacute

diferenccedila significativa entre o controle e os isolados A215A (Phomopsis sp) A115B

(Phomopsis sp) ESDF1 (Phomopsis sp S7) ESJD1 (Phomopsis sp S12) A123

(Phomopsis sp S2) A215A A115B ESDF1 ESJD1 A123 mas os isolados de

Phomopsis natildeo diferem entre si (ANEXO 9)

Os isolados ESRD1 (Phomopsis sp S1) e A135 (Phomopsis sp) apresentaram

as maiores taxas de inibiccedilatildeo do crescimento da linhagem PC3305 de G citricarpa pela

interaccedilatildeo do tipo 2 6887 e 6623 respectivamente (TABELA 9) A anaacutelise estatiacutestica

demonstra que haacute diferenccedila significativa entre o controle e os isolados ESRD1

(Phomopsis sp S1) e A135 (Phomopsis sp) esses isolados de Phomopsis diferem

entre si (ANEXO 9) Essas interaccedilotildees devem ser avaliadas posteriormente ao

microscoacutepio para confirmar se estaacute ocorrendo parasitismo

O isolado SM9713 (P longicolla) inibiu o crescimento do patoacutegeno G citricarpa e

produziu esporos em volta da colocircnia Segundo Boosalis (1964) a esporulaccedilatildeo pode

ocorrer quando determinados hospedeiros estimulam a reproduccedilatildeo de seus parasitas

Resultados semelhantes foram encontrados por Martins-Corder e Melo (1998) onde

observaram que a maioria dos isolados de Trichoderma spp antagonistas colonizou e

produziu esporos em abundacircncia sobre as colocircnias de Verticillium dahliae

As interaccedilotildees do tipo 2 mostram inibiccedilatildeo mutua na qual o endoacutefito natildeo sobrepotildee

a colocircnia do fitopatoacutegeno apesar de inibir seu crescimento Segundo Bell et al (1982)

os antagonistas selecionados pelo confronto direto satildeo aqueles que apresentam

crescimento sobre o fitopatoacutegeno Poreacutem a relaccedilatildeo entre o tipo de interaccedilatildeo e a

porcentagem de inibiccedilatildeo observada nos resultados natildeo satildeo congruentes uma vez que

96

a porcentagem de inibiccedilatildeo para alguns isolados com interaccedilatildeo do Tipo 2 eacute maior do que

para aqueles com interaccedilatildeo do Tipo 1

Isolados Identificaccedilatildeo Tipo de Interaccedilatildeo

Inibiccedilatildeo ()

Fungicida 1921 A215A Phomopsis sp 1 7947 A115B Phomopsis sp 1 7616 ESDF1 Phomopsis sp S7 1 7152 ESJD1 Phomopsis sp S12 1 7119 A123 Phomopsis sp S2 1 7119

ESFB2 Phomopsis sp 1 7086 ESJE2 Phomopsis sp S1 1 7020 ESJH1 Phomopsis sp S11 1 7020

SM9631 Phomopsis sp 1 6921 ESRD1 Phomopsis sp S1 2 6887 A135 Phomopsis sp 2 6623 A126 Phomopsis sp S11 1 6490

ESPAC22 Phomopsis sp S4 1 6424 A131 P michaeliae 2 6424

ESJE1 Phomopsis sp 1 6358 ES2KF1 Phomopsis sp S4 2 6298

A334 Phomopsis sp S8 1 6291 A124 Phomopsis sp S9 2 6258 ESIA1 P michaeliae 2 6126 ESKD1 Phomopsis sp S1 1 5993 ESSD1 Phomopsis sp L5 2 5960 A134 Phomopsis sp 1 5861 A113 P michaeliae 1 5795

TABELA 9 PORCENTAGEM DE INIBICcedilAtildeO E TIPOS DE INTERACcedilAtildeO ENTRE OS ISOLADOS ENDOFIacuteTICOS DE Phomopsis E Guignardia citricarpa ndash PC3305 (CONTINUA)

FIGURA 22 INTERACcedilAtildeO DOS ISOLADOS DE Phomopsis CONTRA Guignardia citricarpa 3305 PELA TEacuteCNICA DE CULTURA PAREADA

G citricarpa PC3305

Phomopsis ESRD1

Phomopsis ESDF1

G citricarpa PC3305

G citricarpa PC3305 controle

Fungicida Derosal

G citricarpa PC3305

FONTE O autor

97

A333A Phomopsis sp 1 5728 ESIE1 Phomopsis sp 1 5695 ESJG1 Phomopsis sp 2 5662 A323 Phomopsis sp S8 1 5629

ES2AB1 Phomopsis sp S6 1 5596 ESBA1 Phomopsis sp S6 2 5563 A116 Phomopsis sp S5 2 5464

AT9811 Phomopsis sp 1 5397 A216B Phomopsis sp 2 5364 A321 P michaeliae 1 5331

SM9713 P longicolla 2 5298 ES2NA1 Phomopsis sp 1 5265 MU0123 P longicolla 2 5232 ESFH1 Phomopsis sp 2 5132 ES80J Phomopsis sp 2 5132 ESGA1 Phomopsis sp S10 2 5079

ES2WF1 Phomopsis sp S4 2 5033 ESFF1 P theicola 2 4934

SM9714 Phomopsis sp 1 4735 A132 Phomopsis sp 2 4470

A333B Phomopsis sp 1 3775 ESGF1 Phomopsis sp S3 2 3344 SM9638 P theicola 1 2781 AT9810 Phomopsis sp 2 2649 AT9906 Phomopsis sp 2 2583 ES2WC1 Phomopsis sp 3 828

FONTE O autor 542 Teste para detecccedilatildeo de metaboacutelitos natildeo volaacuteteis

No teste de metaboacutelitos volaacuteteis observou-se reduccedilatildeo do crescimento da

linhagem PC1396 e PC3305 de G citricarpa apoacutes a retirada do celofane onde

inicialmente foram inoculados os isolados de Phomopsis Todos os isolados testados

inibiram significativamente o crescimento das duas linhagens de G citricarpa Os

isolados A115B (Phomopsis sp) A134 (Phomopsis sp) ESFF1 (Phomopsis sp)

ESFH1 (Phomopsis theicola) A123 (Phomopsis sp S2) e S2WF1 (Phomopsis sp S4)

apresentaram maior inibiccedilatildeo do crescimento das duas linhagens do fitopatoacutegeno

(ANEXO 10 e 11 e FIGURA 23) sugerindo que a interaccedilatildeo entre os isolados de

Phomopsis e o fitopatoacutegeno ocorre devido agrave produccedilatildeo de metaboacutelitos natildeo volaacuteteis

TABELA 9 PORCENTAGEM DE INIBICcedilAtildeO E TIPOS DE INTERACcedilAtildeO ENTRE OS ISOLADOS ENDOFIacuteTICOS DE Phomopsis E Guignardia citricarpa ndash PC3305 (CONTINUACcedilAtildeO)

98

FONTE O autor FIGURA 23 AVALIACcedilAtildeO DO CRESCIMENTO DAS COLOcircNIAS DO FITOPATOacuteGENO G citricarpa PC1396 e PC3305 INOCULADAS APOacuteS RETIRADA DO PAPEL CELOFANE PARA DETECCcedilAtildeO DE METABOacuteLITOS NAtildeO VOLAacuteTEIS EM MEIO BDA APOacuteS 21 DIAS DE CRESCIMENTO A 28ordmC

Nota a Placa com o fitopatoacutegeno G citricarpa PC3305 inoculado apoacutes retirada do celofane onde previamente foi inoculado o isolado ESFH1 b Placa controle com o fitopatoacutegeno G citricarpa PC3305 c Placa com o fitopatoacutegeno G citricarpa PC1396 inoculado apoacutes retirada do celofane onde previamente foi inoculado o isolado ESFH1 d Placa controle com o fitopatoacutegeno G citricarpa PC1396

FIGUEIREDO (2006) utilizou a teacutecnica de metaboacutelitos natildeo volaacuteteis em

Pestalotiopsis isolados endofiacuteticos de Maytenus ilicifolia e observou uma reduccedilatildeo do

crescimento da linhagem PC1396 de G citricarpa demonstrando que a interaccedilatildeo

ocorre principalmente pela produccedilatildeo de metaboacutelitos natildeo volaacuteteis

Os resultados apresentados aqui demonstram o grande potencial que tais

linhagens endofiacuteticas de Phomopsis possuem como agentes de controle da Mancha

Preta dos Citros e o seu potencial na produccedilatildeo de metaboacutelitos

543 Avaliaccedilatildeo da accedilatildeo dos Extratos

Na avaliaccedilatildeo dos extratos quanto agrave inibiccedilatildeo do crescimento das linhagens

PC1396 e PC3305 de G citricarpa os resultados indicam que a maioria dos extratos

metanoacutelicos produzidos a partir dos isolados de Phomopsis reduziram o crescimento

micelial de ambas as linhagens do fitopatoacutegeno da MPC A inibiccedilatildeo ocorreu devido aos

metaboacutelitos secundaacuterios produzidos pelos isolados endofiacuteticos quando comparados

com o crescimento micelial dos controles com metanol (onde o extrato foi diluiacutedo) e

com aacutegua destilada (FIGURA 24 25 e TABELA 10)

a b c d

99

Foi observado que os isolados de Phomopsis que apresentaram as maiores

porcentagens de inibiccedilatildeo pela teacutecnica de cultura pareada tambeacutem inibiram o

crescimento quando foi utilizado o extrato metanoacutelico Entretanto o isolado ES2WC1

(Phomopsis sp) que natildeo inibiu o crescimento pela teacutecnica de cultura pareada

apresentou reduccedilatildeo no crescimento micelial dos dois fitopatoacutegenos avaliados

utilizando-se o seu extrato metanoacutelico Provavelmente essa falta de inibiccedilatildeo pela

teacutecnica de cultura pareada tenha ocorrido pelo fato do isolado ES2WC1 (Phomopsis

sp) apresentar crescimento lento fazendo com que o crescimento do fitopatoacutegeno natildeo

diferisse significativamente do controle

Os isolados ES80J (Phomopsis sp) ESFF1 (Phomopsis sp) A132 (Phomopsis

sp) A333B (Phomopsis sp) e SM9638 (P theicola) natildeo inibiram o crescimento micelial

de nenhum dos fitopatoacutegenos avaliados Para alguns isolados de Phomopsis natildeo foi

possiacutevel determinar o potencial antimicrobiano dos extratos metanoacutelicos pois houve

grande variaccedilatildeo de accedilatildeo entre as repeticcedilotildees do experimento

FONTE O autor

C

D E F

A B

NOTA A Placa controle com aacutegua destilada autoclavada B Placa controle com metanolC Placa controle com fungicida Derosal reg (10 mgmL) D Placa com extrato metanoacutelicodo isolado ES2WC1 E Placa com extrato metanoacutelico do isolado A215A F Placa comextrato metanoacutelico do isolado ESDF1

FIGURA 24 AVALIACcedilAtildeO DA ACcedilAtildeO DOS EXTRATOS METANOacuteLICOS NOCRESCIMENTO MICELIAL DAS COLOcircNIAS DA LINHAGEM PC3305 DE G citricarpa EMMEIO BDA APOacuteS 14 DIAS DE CRESCIMENTO A 28ordmC

100

Rodrigues-Heerklotz et al (2001) elucidaram a estrutura quiacutemica e a siacutentese


Guignardia sp isolado de Spondias mombin Silva et al (2005) isolaram dois

metaboacutelitos de Phomopsis cassiae endofiacutetico de Cassia specatabilis 24-diidroxi-56-

dimetil benzoato de etila e phomopsilactona que exibiram forte atividade antifuacutengica

contra fitopatoacutegenos bem como citotoxicidade contra a linhagem celular de tumor

cervical humano (HeLa) Estudos adicionais devem ser realizados para determinar a

estrutura quiacutemica produzida pelos endoacutefitos de Phomopsis estudados

NOTA A Placa controle com aacutegua destilada autoclavada B Placa controle commetanol C Placa controle com fungicida Derosal reg (10 mgmL)D Placa com extratometanoacutelico do isolado ES2WC1 E Placa com extrato metanoacutelico do isolado ESGA1 FPlaca com extrato metanoacutelico do isolado ESSD1

FONTE O autor FIGURA 25 AVALIACcedilAtildeO DA ACcedilAtildeO DOS EXTRATOS METANOacuteLICOS NOCRESCIMENTO MICELIAL DAS COLOcircNIAS DA LINHAGEM PC1396 DE G citricarpa EMMEIO BDA APOacuteS 14 DIAS DE CRESCIMENTO A 28ordmC

C

D E F

A B

101

Os resultados da tabela 10 revelam que os isolados endofiacuteticos de Phomopsis

spp avaliados satildeo bastante promissores demonstrando um potencial na produccedilatildeo de

metaboacutelitos Resultados semelhantes foram obtidos por Moller Weber e Dreyfuss

(1996) que avaliaram a accedilatildeo de endoacutefitos de plantas tropicais com alta produccedilatildeo de

metaboacutelitos secundaacuterios

Identificaccedilatildeo Isolados Inibiccedilatildeo PC3305 Cultura Pareada

Inibiccedilatildeo PC3305 Extrato

Metanoacutelico

Inibiccedilatildeo () PC1396 Cultura Pareada


Metanoacutelico Derosal Fungicida 1921 I 19 I

P longicolla SM9713 5298 I 6763 I P longicolla MU0123 5232 ND 6663 I P michaeliae A131 6424 I 6393 I P michaeliae ESIA1 6126 I 5904 I Phomopsis sp A333A 5728 I 5369 I P michaeliae A321 5331 I 6148 I P michaeliae A113 5795 ND 627 ND Phomopsis sp S2 A123 7119 ND 627 ND P theicola ESFH1 5132 I 5427 I Phomopsis sp ESFF1 4934 NI 5017 NI P theicola SM9638 2781 NI 4522 NI Phomopsis sp S4 ES2WF1 5033 I 5205 I Phomopsis sp S3 ESGF1 3344 I 4642 I Phomopsis sp S10 ESGA1 5079 I 5324 I Phomopsis sp S1 ESRD1 6887 I 6655 I Phomopsis sp S8 A334 6291 I 6189 I Phomopsis sp S9 A124 6258 I 5861 I Phomopsis sp S7 ESDF1 7152 I 7338 I Phomopsis sp ESSD1 596 I 7324 I Phomopsis sp S6 ES2AB1 5596 I 6246 I Phomopsis sp S6 ESBA1 5563 I 6177 I Phomopsis sp S11 A126 649 ND 6352 ND Phomopsis sp S12 ESJD1 7119 I 6826 I Phomopsis sp S1 ESJE1 6358 I 6621 I Phomopsis sp S1 ESJE2 702 ND 6246 ND Phomopsis sp S1 ESKD1 5993 ND 6109 ND Phomopsis sp A115B 7616 I 5861 I Phomopsis sp ESFB2 7086 I 6724 I Phomopsis sp S11 ESJH1 702 I 6792 I Phomopsis sp A135 6623 I 5902 ND Phomopsis sp A134 5861 I 6885 I Phomopsis sp ESIE1 5695 I 6758 I Phomopsis sp ESJG1 5662 ND 6621 I

TABELA 10 AVALIACcedilAtildeO DA ACcedilAtildeO DOS EXTRATOS METANOacuteLICOS NO CRESCIMENTO MICELIAL DASCOLOcircNIAS DA LINHAGEM PC1396 E PC3305 DE G citricarpa EM MEIO BDA APOacuteS 14 DIAS DE CRESCIMENTOA 28ordmC (CONTINUA)

102

Phomopsis sp AT9811 5397 I 492 I Phomopsis sp A216B 5364 I 6025 I Phomopsis sp ES2NA1 5265 I 6212 I Phomopsis sp SM9714 4735 I 6215 I Phomopsis sp ES2WC1 828 I 287 I Phomopsis sp SM9631 6921 ND 6265 ND Phomopsis sp S4 ESPAC22 6424 ND 6516 ND Phomopsis sp S4 ES2KF1 6298 ND 5939 ND Phomopsis sp S8 A323 5629 ND 623 ND Phomopsis sp S5 A116 5464 ND 582 ND Phomopsis sp AT9810 2649 ND 4173 ND Phomopsis sp AT9906 2583 ND 3078 ND Phomopsis sp ES80J 5132 NI 4344 NI Phomopsis sp A132 447 NI 5492 NI Phomopsis sp A333B 3775 NI 4426 NI Phomopsis sp A215A 7947 I 5656 I

FONTE O autor

NOTA I- Inibiccedilatildeo do crescimento do fitopatoacutegeno NI- Natildeo ocorreu inibiccedilatildeo do fitopatoacutegeno ND- Natildeo foi determinado a inibiccedilatildeo

No Brasil as plantas Spondias mombin e A tomentosum tecircm sido usadas na

medicina devido as suas propriedades antimicrobianas (AJAO SHONUKAN e FEMI

1984) Os isolados de Phomopsis obtidos como endoacutefitos de S mombin (SM9713 (P

longicolla) SM9638 (P theicola) e SM9714 (Phomopsis sp)) e A tomentosum (AT9810

(Phomopsis sp) AT9811 (Phomopsis sp) e AT9906 (Phomopsis sp)) avaliados no

presente trabalho jaacute haviam sido relatados por Corrado e Rodrigues (2004) como

produtores de compostos bioativos Os autores relatam que os extratos metanoacutelicos

inibiram o crescimento de E coli S aureus P aeruginosa C albicans A niger e F

oxysporum No presente trabalho os isolados de S mombin e A tomentosum inibiram

o crescimento de Guignardia citricarpa confirmando o potencial desses isolados em

produzir substacircncias bioativas mais estudos devem ser realizados para verificar o

potencial antimicrobiano desses extratos contra bacteacuterias patogecircnicas e

fitopatogecircnicas

A planta Schinus terebinthifolius eacute usada no Brasil na medicina alternativa contra

doenccedilas da coacuternea (CORREcircA 1926) doenccedilas reumaacuteticas uacutelceras feridas tumores

linfaacuteticos erisipela e outras moleacutestias provocadas por bacteacuterias que se manifestam em

forma de edema ou eritema (BALBACH 1992) As linhagens de Phomopsis isoladas de

S terebinthifolius avaliadas nesse trabalho A135 (Phomopsis sp) A113 (P michaelae)

TABELA 10 AVALIACcedilAtildeO DA ACcedilAtildeO DOS EXTRATOS METANOacuteLICOS NO CRESCIMENTO MICELIAL DASCOLOcircNIAS DA LINHAGEM PC1396 E PC3305 DE G citricarpa EM MEIO BDA APOacuteS 14 DIAS DECRESCIMENTO A 28ordmC (CONTINUACcedilAtildeO)

103

A115B (Phomopsis sp) A323 (Phomopsis sp S8) A132 (Phomopsis sp) A134

(Phomopsis sp) A333B (Phomopsis sp) A321 (P michaelae) A126 (Phomopsis sp

S11) A216B (Phomopsis sp) A334 (Phomopsis sp S8) A116 (Phomopsis sp S5)

A215A (Phomopsis sp) A124 (Phomopsis sp S9) A333A (Phomopsis sp) A131 (P

michaeliae) e A123 (Phomopsis sp S2) apresentaram excelentes resultados contra G

citricarpa

Extratos da planta M ilicifolia jaacute foram descritos na literatura apresentando

atividade antitumoral tambeacutem usado como analgeacutesico antinflamatoacuterio e antiaacutecido

(JORGE 2004 DUARTE 2005) Pileggi (2006) isolou microrganismos endofiacuteticos de

plantas de Maytenus ilicifolia do mesmo pomar investigado neste trabalho e avaliou o

potencial farmacoloacutegico dos mesmos Entre os fungos e bacteacuterias testados 15

apresentaram potencial para controle bioloacutegico

Figueiredo (2006) isolou fungos endofiacuteticos de plantas de M ilicifolia do mesmo

pomar investigado neste trabalho especialmente Pestalotiopsis spp e os avaliou quanto

ao potencial antimicrobiano contra bacteacuterias patogecircnicas em humanos e o fitopatoacutegeno

G citricarpa Os extratos metanoacutelicos de dois isolados exibiram accedilatildeo fungistaacutetica na

germinaccedilatildeo e no crescimento micelial das linhagens PC1396 e PC3305 de G

citricarpa Aleacutem disso dois extratos de Pestalotiopsis spp inibiram o crescimento dos

microrganismos-teste (S aureus oxalino resistente Klebsiella pneumoniae

Micrococcus luteus Staphylococcus aureus e Escherichia coli)

No presente trabalho observou-se que as linhagens de Phomopsis spp isolados

de M ilicifolia apresentaram excelentes resultados in vitro contra G citricarpa Pouco se

conhece a respeito da comunidade endofiacutetica existente nessas plantas e os resultados

desse trabalho demostram que abrigam uma grande variabilidade de PC1396 e

PC3305 espeacutecies de Phomopsis com portencial para bioprospecccedilatildeo Isto reforccedila a

importacircncia de estudos de microrganismos endofiacuteticos em plantas medicinais em

especial M ilicifolia e S terebinthifolius Faz-se necessaacuterio tambeacutem o estudo da

composiccedilatildeo quiacutemica dos extratos avaliados

104

6 CONCLUSOtildeES Os resultados obtidos no presente trabalho permitiram as seguintes conclusotildees

bull As espeacutecies de Phomopsis analisadas natildeo podem ser identificadas

apenas por caracteriacutesticas morfoloacutegicas ou marcadores moleculares

RAPD sendo necessaacuteria uma anaacutelise polifaacutesica incluindo

sequumlenciamento de vaacuterias regiotildees do genoma

bull As plantas medicinais analisadas satildeo colonizadas por grande

diversidade de espeacutecies de Phomopsis com grande variabilidade

morfoloacutegica e geneacutetica intra e interespeciacuteficas

bull As plantas de Maytenus ilicifolia analisadas satildeo colonizadas

endofiticamente por pelo menos 10 espeacutecies de Phomopsis sendo

possiacutevel identificar por sequumlecircncias ITS do rDNA isolados de P theicola e

P michaeliae

bull A planta de Schinus terebinthifolius analisada eacute colonizada


possiacutevel identificar por sequumlecircncias ITS do rDNA isolados de P

michaeliae

bull As espeacutecies de Phomopsis analisadas natildeo satildeo hospedeiro-especiacuteficas

sendo necessaacuteria a redefiniccedilatildeo do conceito de espeacutecie para este gecircnero

bull Os isolados de Phomopsis spp apresentaram grande potencial no

controle in vitro do fungo G citricarpa Os isolados ESIA1 e A131 (P

michaeliae) ESJE1 ESJE2 ESKD1 e ESRD1 (Phomopsis sp S1) A123

(Phomopsis sp S2) ES2KF1 e ESPAC22 (Phomopsis sp S4) ESDF1

105

(Phomopsis sp S7) A334 (Phomopsis sp S8) A124 (Phomopsis sp

S9) A126 e ESJH1 (Phomopsis sp S11) ESJD1 (Phomopsis sp S12) e

os isolados A134 A135 A115B A215A SM9631 ESFB2 e ESSD1

(Phomopsis sp) foram os mais promissores em inibir o crescimento das

linhagens PC1396 e PC3305 de G citricarpa nas metodologias

avaliadas

106

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120

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121

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123

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124

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125

ANEXOS

EXPERIMENTO FATORIAL

ANOVA FV GL SQ QM F ISOLADOS ENDOFIacuteTICOS 50 496671024 9933420 94396 MEIOS DE CULTURA 2 137912854 68956427 655287 INTERACcedilAtildeO A 100 193198257 1931983 18359 INTERACcedilAtildeO b 100 10989107 0109891 1044 RESIacuteDUO 206 21677560 0105231 Total 458 860448802

INTERACcedilAtildeO A INTERACcedilAtildeO ENTRE OS MEIOS DE CULTURA E OS ISOLADOS de Phomopsis INTERACcedilAtildeO B INTERACcedilAtildeO ENTRE AS REPETICcedilOtildeES DOS ISOLADOS DE Phomopsis significativo ao niacutevel de 5 de probabilidade (p lt 005)

TESTE DAS MEacuteDIAS

MEacuteDIAS ENTRE OS MEIOS DE CULTURA

BDA 5169935 a MEA 4973856 b AV 3921569 c

CV = 62

As meacutedias seguidas pela mesma letra natildeo diferem estatisticamente entre si Foi aplicado o Scott-Knott ao niacutevel de 5 de probabilidade

ANEXO 1 ndash ANOVA E TESTE DE MEacuteDIAS DO CRESCIMENTO MICELIAL DOS ISOLADOS DEPhomopsis EM DIFERENTES MEIOS DE CULTURA

126


ANOVA FV GL SQ QM F ISOLADOS ENDOFIacuteTICOS 50 230248366 4604967 43761 RESIacuteDUO 206 21677560 0105231 Total 458 860448802

significativo ao niacutevel de 5 de probabilidade (p lt 005)

TESTE DAS MEacuteDIAS ESBA1 700 a A323 700 a A215A 700 a ESSD1 700 a SM9713 700 a ESGF1 700 a SM9631 700 a ESJD1 700 a ESKD1 667 a A334 667 a ESDF1 633 b A132 633 b A123 600 b A333A 600 b MU0123 600 b ESJH1 600 b A321 600 b ESRD1 600 b A116 600 b A134 567 b A115B 567 b ESIA1 533 c

ANEXO 2ndash ANOVA E TESTE DE MEacuteDIAS DO CRESCIMENTO MICELIAL DOS ISOLADOS DEPhomopsis EM MEIO BDA

127

A131 500 c SM9714 500 c A135 500 c ESIE1 500 c ESFB2 500 c A124 500 c ESPAC22 500 c ES2KF1 500 c A113 500 c ESJE1 500 c ESJE2 433 d ESFH1 400 d ESJG1 400 d ES2WC1 400 d PHO1 400 d SM9638 400 d ES2NA1 400 d ES2AB1 400 d ESFF1 400 d AT9811 400 d AT9810 400 d ES2WF1 400 d A126 400 d PHO19 400 d A216B 400 d ES80J 367 d ESGA1 367 d AT9906 300 e A333B 233 f


TESTE DAS MEacuteDIAS (CONTINUACcedilAtildeO)

128




TESTE DAS MEacuteDIAS ESKD1 700 a ESJE2 600 b A123 600 b ESJE1 533 c SM9638 500 c AT9811 500 c SM9713 500 c PHO1 500 c ESBA1 500 c SM9631 500 c ESFB2 500 c A334 500 c A323 500 c MU0123 500 c A333A 433 d ESJD1 433 d ESGF1 433 d A116 433 d PAC22 400 e ESDF1 400 e A321 400 e A132 400 e ES2KF1 400 e

ANEXO 3ndash ANOVA E TESTE DE MEacuteDIAS DO CRESCIMENTO MICELIAL DOS ISOLADOS DEPhomopsis EM MEIO AVEIA

129

ESJG1 400 e ESRD1 400 e PHO19 400 e A115B 400 e A124 400 e ESFF1 367 e A134 367 e ESIE1 367 e A135 367 e A131 367 e A113 367 e ES2WF1 367 e SD1 367 e ESIA1 333 e ESGA1 300 f ESJH1 300 f ESFH1 300 f AT9906 300 f ES2NA1 300 f A216B 300 f ES80J 300 f ESA215A 267 f AT9810 200 g A333B 200 g ES2AB1 200 g SM9714 200 g ES2WC1 200 g



130




TESTE DAS MEacuteDIAS A323 733 a SM9631 700 a ESKD1 700 a A134 700 a ESIE1 700 a A116 667 b A334 667 b A215A 633 b ESSD1 633 b A321 600 c MU0123 600 c ESGF1 600 c ESRD1 600 c AT9811 600 c SM9713 600 c A123 600 c ESJH1 600 c ESDF1 600 c A131 567 c IA1 567 c ESBA1 567 c ESJD1 567 c A333A 533 d A135 500 d

ANEXO 4ndash ANOVA E TESTE DE MEacuteDIAS DO CRESCIMENTO MICELIAL DOS ISOLADOS DEPhomopsis EM MEIO MEA

131

ES2NA1 500 d A124 500 d A132 500 d SM9714 500 d ESFB2 500 d A115B 467 e ES2AB1 433 e A216B 433 e A113 433 e PHO1 400 f SM9638 400 f ES2WF1 400 f A126 400 f ESJE1 400 f ESPAC22 400 f ESFF1 400 f ES2KF1 400 f ESJG1 367 f ES80J 367 f ESJE2 333 g ESFH1 333 g AT9906 300 g ESGA1 300 g SM9810 300 g ES2WC1 300 g A333B 233 h PHO19 233 h



132

EXPERIMENTO INTEIRAMENTE CASUALIZADO




MEacuteDIAS DO COMPRIMENTO AT9906 352 a AT9810 353 a ESFH1 297 b ESPAC22 195 c ES2KF1 194 c SM9631 193 c ESGA1 184 cd PHO19 184 cd ES80J 166 de ESRD1 152 ef ESFB2 143 efg ESJE2 142 efg ESJE1 142 efg ESJG1 131 fgh A323 127 fghi A333A 126 ghij A135 123 ghij A124 123 ghij A126 123 ghij A132 123 ghij A131 123 ghij A134 123 ghij

ANEXO 5 ndash ANOVA E TESTE DE MEacuteDIAS DO COMPRIMENTO DOS ESPOROS BETACONIacuteDIOSDOS ISOLADOS DE Phomopsis spp EM MEIO BDA

133

A115B 123 ghij ESIE1 123 ghij ES2WC1 119 ghil ES2WF1 119 ghil SM9713 116 hil A334 116 hil ESIA1 115 hil A333B 113 hil ESFF1 113 hil ESGF1 111 hil ES2AB1 107 him A123 107 him A113 107 him ESJD1 106 him ESKD1 105 im ES2NA1 104 im A215A 103 im SM9714 102 im ESSD1 101 m ESJH1 97 m MU0123 96 m A321 96 m ESDF1 95 m A216B 95 m A116 85 m

DMS = 259444 CV = 1052904

As meacutedias seguidas pela mesma letra natildeo diferem estatisticamente entre si Foi aplicado o Teste de Tukey ao niacutevel de 5 de probabilidade


134




TESTE DAS MEacuteDIAS MEacuteDIAS DAS INTERACcedilOtildeES

FITOPATOacuteGENO G citricarpa PC1396 293 a Fungicida Derosal 236 b ESGF1 157 c ESGA1 137 cde ESFH1 134 cdef ESIA1 120 cdefg ES2KF1 119 cdefgh ESFF1 146 cdefgh ES2NA1 111 defgh ES2AB1 110 defgh ESKD1 114 defgh ESJE2 110 defgh ESBA1 112 defgh ESRD1 098 efgh ESJG1 099 efgh ESJE1 099 efgh ESFB2 096 fgh ESJH1 094 gh ESJD1 093 gh ESIE1 095 gh ESSD1 078 h ESDF1 078 h


ANEXO 6 ndash ANOVA E TESTE DE MEacuteDIAS DAS INTERACcedilOtildeES ENTRE OS ISOLADOSENDOFIacuteTICOS DE Phomopsis CONTRA O FITOPATOacuteGENO G citricarpa PC1396

DMS = 039023 CV = 1340825

135





FITOPATOacuteGENO G citricarpa PC1396 201 a

fungicida 174 ab AT9906 139 bc AT9810 117 cd AT9811 102 cde SM9638 110 cde SM9714 076 de SM9631 075 de MU0123 067 e SM9713 065 e

DMS = 046460 CV = 1946824



136





FITOPATOacuteGENO G citricarpa PC1396 244 a ES2WC1 237 a fungicida 185 b ES80J 138 bc A333B 136 cd ES2WF1 117 cde A333A 113 cde A132 110 cde A215A 106 cde A116 102 cde A124 101 cde A115B 101 cde A135 100 cde A215B 097 cde A321 094 cde A334 093 cde A323 092 cde A123 091 cde A113 091 cde A126 089 de A131 088 e ESPAC22 085 e A134 076 e



DMS = 050157 CV = 1809416

137


ANOVA

FV GL SQ QM F ISOLADOS ENDOFIacuteTICOS 50 6210037 124201 165056 RESIacuteDUO 204 1535052 007525 Total 254 7745089



MEacuteDIAS DAS INTERACcedilOtildeES FITOPATOacuteGENO G citricarpa PC3305 302 a FUNGICIDA Derosal 244 abc ES2WC1 277 ab AT9906 224 bcd AT9810 222 bcde SM9638 218 bcdef ESGF1 201 cdefg A333B 188 cdefgh A132 167 defghi SM9714 159 defghij ESFF1 153 efghil ES2WF1 150 fghil ESGA1 149 fghil ESFH1 147 ghil ES80J 147 ghil MU0123 144 ghil ES2NA1 143 ghil AT9713 142 ghim A321 141 ghim A216B 140 ghim AT9811 139 ghim A116 137 ghim


138

ESBA1 134 ghim ES2AB1 133 ghim A323 132 ghin ESJG1 131 ghin ESIE1 130 hin A333A 129 hin A113 127 hin A134 125 hin ESSD1 122 hin ESKD1 121 hin ESIA1 117 in A124 113 in A334 112 in ES2KF1 112 in ESJE1 110 in ESPAC22 108 in A131 108 in A126 106 in A135 102 in ESRD1 094 n SM9631 093 n ESJE2 090 n ESJH1 090 n ESFB2 088 n ESJD1 087 n A123 087 n ESDF1 086 n A115B 072 n A215A 062 n

DMS = 070465 CV = 1983267



139





MEacuteDIAS DAS INTERACcedilOtildeES FITOPATOacuteGENO G citricarpa PC3305 222 a ESRD1 19 b A131 176 b ESIA1 178 b SM9713 162 bc ESJD1 162 bc A126 154 bcd MU0123 149 bcde A333A 134 cdef ESGA1 134 cdef A113 133 cdef ESGF1 130 cdef A334 130 cdef ESBA1 140 cdef SM9638 127 def ESJH1 119 efg ESDF1 115 fgh ESSD1 112 fgh ESKD1 113 fgh ES2AB1 111 fghi A124 111 fghi

ANEXO 10 ndash ANOVA E TESTE DE MEacuteDIAS DAS INTERACcedilOtildeES ENTRE OS ISOLADOSENDOFIacuteTICOS DE Phomopsis CONTRA O FITOPATOacuteGENO G citricarpa PC3305 PARA DETECCcedilAtildeODE METABOacuteLITOS NAtildeO VOLAacuteTEIS

140

A215A 109 fghi A321 108 fghi A134 089 ghij A115B 082 hij ESFF1 078 ij ESFH1 071 l A123 062 l ES2WF1 042 l

DMS = 033193 CV = 1095343



141


ANOVA



MEacuteDIAS DAS INTERACcedilOtildeES FITOPATOacuteGENO G citricarpa PC1396 422 a ESGA1 275 b ESGF1 267 bc ESBA1 265 bc SM9713 261 bc A333A 251 bcd ESSD1 235 bcde MU0123 234 bcde ESKD1 211 bcdef A215A 203 cdef A321 188 defg A131 173 efgh SM9638 167 efgh A124 148 fghi ESJD1 147 fghi A113 130 ghij ESIA1 122 ghij ES2AB1 128 ghij ESDF1 124 ghij A334 112 hij A115B 106 hij


142

ESRD1 104 hij ES2WF1 086 il A134 083 il A126 080 il ESFF1 075 l A123 065 l ESFH1 025 l ESJH1 017 l

DMS = 069970 CV = 1193907



43

ANE

XO

12

ndash M

ATR

IZ D

E D

AD

OS

PA

RA

CA

RA

CTE

RIZ

ACcedil

AtildeO

CR

ITEacuteR

IOS

ME

DID

AS

ME

IOS

DE

C

ULT

UR

A

MU

0123

SM

9631

SM

9638

SM

9713

SM

9714

AT9

810

AT9

811

AT9

906

ES

2AB

1

ES

2KF1

ES2N

A1

ES2W

C1

ES2W

F1

ES

80J

ESBA

1

ESD

F1

ES

FB2

ES

FF1

ESFH

1

ES

GA

1

ESG

F1

ESIA

1

ESIE

1

ESJD

1

ESJE

1

ESJE

2

1 AV 1 0 1 0 0 1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 1 MEA 0 1 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 1 1 1 0 0 0 1 0 0 1 0 1 BDA 1 1 1 1 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 1 1 1 0 0 0 1 1 0 1 1 0

2 AV 1 1 1 1 0 1 1 1 0 0 1 0 1 1 1 0 0 0 1 1 0 0 1 1 1 1 3 AV 0 0 0 0 1 0 0 1 1 1 0 1 0 0 0 1 1 1 0 0 1 1 0 0 0 0 4 AV 1 0 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

MEA 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 BDA 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

5 AV 0 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 MEA 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 BDA 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

6 AV 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 MEA 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1 0 BDA 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1

7 AV 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 MEA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 BDA 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 0 0

8 AV 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 0 0 MEA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 1 0 0 0

9 AV 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 MEA 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 0 1 0 0 0 0 1 BDA 1 0 1 1 0 1 0 1 0 1 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 1

10 AV 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 MEA 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 BDA 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1

11 MEA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

12 MEA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

13 AV 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 MEA 0 0 1 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 BDA 0 0 1 0 1 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0

14 AV 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 MEA 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 0 1 0 0

44

BDA 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 1 0 1 1 1 0 0 1 1 15 AV 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

MEA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0

16 AV 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 MEA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 0 0

17 AV 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 MEA 1 0 1 1 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 BDA 1 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0

18 AV 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 MEA 0 1 0 0 1 0 1 0 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 BDA 0 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 1

19 AV 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 MEA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0

20 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 21 AV 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 0 0 1 1 0 1 0 1 1 1 0 0 1 1 1 1

MEA 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 0 0 1 1 0 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 0 BDA 1 1 0 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0

22 AV 1 1 0 1 1 1 0 1 0 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 MEA 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 BDA 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

23 352 a 353μM BDA 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 297 μM BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0

195 a 193 μM BDA 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 184 μM BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 166 μM BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 152 μM BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

143 a 142 μM BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 131 μM BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 127 μM BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

126 a 123 μM BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 119 μM BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

116 a 111 μM BDA 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 0 0 0 0 107 a 106 μM BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 105 a 102μM BDA 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

97 a 85μM BDA 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 24 733 a 700cm MEA 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0

677 a 633 cm MEA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 600 a 567 cm MEA 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 533 a 500cm MEA 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0

45

467 a 433cm MEA 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 400 a 367cm MEA 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 333 a 300cm MEA 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1

233cm MEA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 700 a 667cm BDA 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 633 a 567cm BDA 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 533 a 500cm BDA 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 0 1 0 433 a 367cm BDA 0 0 1 0 0 1 1 0 1 0 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 1

300cm BDA 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 233cm BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 700cm AV 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

600cm AV 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 533 a 500cm AV 1 1 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 433cm AV 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 400 a 333cm AV 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 0 1 1 0 0 0 300 a 267cm AV 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 200cm AV 0 0 0 0 1 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

CR

ITEacuteR

IOS

ME

IOS

DE

C

ULT

UR

A

ES

JG1

ES

JH2

ES

KD

1

ES

PA

C22

ES

RD

1

ES

SD

1

A131

A126

A123

A323

A113

A334

A321

A216

B

A135

A115

B

A124

A116

A215

A

A132

A333

A

A333

B

A134

P l

ongi

colla

PH

O19

1 AV 0 0 1 1 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 1 0 0 MEA 0 0 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 0 1 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 BDA 0 0 1 1 1 1 1 0 0 1 1 0 1 1 0 1 0 1 1 1 0 0 0 0 0

2 AV 0 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 3 AV 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 4 AV 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1

MEA 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 BDA 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1

5 AV 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 MEA 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0

6 AV 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 MEA 1 1 0 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 BDA 1 0 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1

7 AV 1 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0

46

MEA 0 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 BDA 0 1 0 1 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0

8 AV 0 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 MEA 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 1 1 BDA 0 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 0 0 0 1 0 1 0 0 1 1

9 AV 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 0 0 0 MEA 0 0 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 1 1 0 0 0 1 1 0 0 BDA 1 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 1 1 1 0 1 1 1 0 0 0 1 1 0 0

10 AV 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 MEA 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 BDA 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

11 MEA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

12 MEA 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0

13 AV 0 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 0 1 1 1 MEA 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 BDA 0 1 1 0 1 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1

14 AV 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 MEA 1 1 0 1 1 1 1 0 1 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 0 BDA 0 1 0 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 0 1 0 0 1 0 1 0 1 0

15 AV 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 MEA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 BDA 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0

16 AV 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 MEA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0

17 AV 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 MEA 0 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 BDA 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0

18 AV 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 MEA 1 0 1 1 0 1 0 1 0 1 0 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1 0 1 1 BDA 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

19 AV 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 MEA 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 BDA 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0

20 ESP 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 21 AV 1 1 0 0 0 1 0 1 1 1 0 0 0 1 0 1 0 0 1 0 1 1 0 0 1

MEA 1 1 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 0 1 1 0 0 1 1 0 1 1 0 0 1 BDA 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 0 0

22 AV 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 MEA 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1

47

BDA 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 23 352 a 353μM BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

297 μM BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 195 a 193 μM BDA 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

184 μM BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 166 μM BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 152 μM BDA 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

143 a 142 μM BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 131 μM BDA 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 127 μM BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

126 a 123 μM BDA 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 1 0 1 0 0 119 μM BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

116 a 111 μM BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 107 a 106 μM BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 105 a 102μM BDA 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0

97 a 85μM BDA 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 24 733 a 700cm MEA 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0

677 a 633 cm MEA 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 600 a 567 cm MEA 0 1 0 0 1 0 1 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 533 a 500cm MEA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 1 1 0 0 0 0 467 a 433cm MEA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 400 a 367cm MEA 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 333 a 300cm MEA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

233cm MEA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 700 a 667cm BDA 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 633 a 567cm BDA 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0 1 1 0 1 0 0 533 a 500cm BDA 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 433 a 367cm BDA 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1

300cm BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 233cm BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 700cm AV 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

600cm AV 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 533 a 500cm AV 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 433cm AV 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 400 a 333cm AV 1 0 0 1 1 1 1 0 0 0 1 0 1 0 1 1 1 0 0 1 0 0 1 0 1 300 a 267cm AV 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 200cm AV 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0

Nota - Caracteriacutestica avaliada nos trecircs meios As caracteriacutesticas foram avaliadas seguindo os seguintes criteacuterios

48

1 Bordos da colocircnia regular (1) ou irregular (0) 2 Miceacutelio denso 3 Miceacutelio ralo 4 Miceacutelio granuloso aeacutereo 5 Miceacutelio algodonoso 6 Coloraccedilatildeo do miceacutelio Branco 7 Coloraccedilatildeo do miceacutelio Marrom 8 Coloraccedilatildeo do miceacutelio Cinza 9 Coloraccedilatildeo do miceacutelio Verde 10 Coloraccedilatildeo do miceacutelio Amarelo 11 Coloraccedilatildeo do miceacutelio Bege 12 Coloraccedilatildeo do miceacutelio Preto 13 Coloraccedilatildeo do reverso da placa de Petri Branco 14 Coloraccedilatildeo do reverso da placa de Petri Marrom 15 Coloraccedilatildeo do reverso da placa de Petri Preto 16 Coloraccedilatildeo do reverso da placa de Petri Cinza 17 Coloraccedilatildeo do reverso da placa de Petri Verde 18 Coloraccedilatildeo do reverso da placa de Petri Amarelo 19 Coloraccedilatildeo do reverso da placa de Petri Bege 20 Esporulaccedilatildeo com esporulaccedilatildeo (1) sem esporulaccedilatildeo (0) 21 Coniacutedio do tipo alfa 22 Coniacutedio do tipo beta 23 Comprimento dos coniacutedios do tipo beta 24 Diacircmetro meacutedio do crescimento das colocircnias

49 ANEXO 13 LOCAL DA COLETA DE FOLHAS DE Schinus terebinthifoliusCENTRO POLITEacuteCNICO ndash CURITIBAPR

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CURITIBA 2008

AGRADECIMENTOS















neste trabalho


espinheira santa


oacutetica


formaccedilatildeo









neste trabalho



trabalho


















apoio





de terminar

Portanto devemos



Do medo uma escada

Do sonho uma ponte


(Fernando Pessoa)



LISTA DE FIGURAS














































LISTA DE TABELAS

















LISTA DE ANEXOS























141




2 OBJETIVOS 3



























431 Clorofane 38

432 Clorofil 38








Gibco) 39














44 Isolamento 42






1995) 44

482 RAPD 45





















51 Isolamento 56



531 RAPD 78








ANEXOS 125

1






























2



























isolados

3

2 OBJETIVOS










DNA ribossomal



4





















al 2000)








5



1993 CLAY 2004)





na semente






















6






2001)




















e S cerevisae





7



















frequumlecircncia








8































9




























10






















(WANG et al 2000)






11






























12






























13






























14























antifuacutengicos






15































16






(BITTENCOURT 2001)















2004)






17













prostaglandinas














18



























19


(SIVANESAN 1984)










FULLERTON 1988)











associadas








20




























al 2007)

21






























22


















MENEZES 1996)








MENEZES 1996)



23



1984 CARROLL 1986)




























24































25













estudados















26































27
















381 Marcadores RAPD













28





autopareamento


























29
























382 Marcadores ITS





30































31













32























33





























34






















FONTE O autor



35












Glicose 20g

Peptona 1g


36




Aacutegar 150g







Batata 2000g

Dextrose 100g

Aacutegar 150g






37


NaNO3 60g

KH2PO4 15g

KCl 05g

MgSO47H2O 05g

FeSO4 002g

ZnSO4 002g

Glicose 100g

Peptona 20g




Aacutegar 150g






Glicose 20g

Peptona 1g

Agar 15g




38







435 Fenol Saturado












Glicerina 200 g

39




















40



Biotina 02 mg

Piridoxina 500 mg

Riboflavina 1000 mg

Tiamina 500 mg














41



EDTA pH 80 10 mM


EDTA pH 80 250 mM

NaCl 2500 mM

SDS (pv) 1




Glicerol 1035 mL



Trizma base 54g


EDTA 465g




42

44 Isolamento






planta Temperatura






FONTE O autor
















43






















placa de Petri




44


















4degC






45

















hora





482 RAPD





46




























1988)

47



2005)





Ribossomal




FONTE O autor








minutos a 72degC


48












horas













49








DNA megaBACE






ITS4 (TABELA 5)

FONTE O autor




a 8degC





50











45 minutos a 60degC















51













anteriores













52




FONTE O autor


491 Cultura Pareada





53












colocircnias




pela foacutermula









Dc -Dt

Dc


54














horas)











55











FIGUEIREDO 2006)








56


51 Isolamento













1 Folha 360 140 (39) 0 (0) 0

2 Folha 540 310 (57) 2 (064) 037

3 Folha 360 375 (gt100) 3 (08) 083

TOTAL FOLHA

1260 825 (65) 5 (061) 04

4 Peciacuteolo 160 180 (gt100) 16 (89) 100








57
















2004)















58



























bege

59
















meios utilizados


AV MEA BDA

M

U 0

123

S

M97

13

60



SM

9631

SM

9638

AT

9811

A

T990

6

AT9

810

SM

9714

AV MEA BDA

61


A32

1

A

132

A21

5A

A

113

A

323

A13

1

AV MEA BDA

62


A

135

A11

6

A

115B

A

124

A12

6

A21

6 B

AV MEA BDA

63


A

134

A33

3A

A

334

A12

3

A33

3B

AV MEA BDA

64


E

S2N

A1

E

SIE1

ES

GA

1

ES8

0J

E

SPA

C22

ES2

WF1

AV MEA BDA

65


ESFB

2

ESJ

D1

ESK

D1

E

SJH

1

ESD

F1

E

S2A

B1

AV MEA BDA

66


E

S2K

F1

ESJ

E2

ESJ

E1

ESG

F1

ESF

H1

ESF

F1

AV MEA BDA

67


ESB

A1

ESI

A1

ES

RD

1

E

S2W

C1

ESS

D1

ES

JG1

AV MEA BDA

68

















PH

O19

P

lon

gico

lla (P

HO

1) AV MEA BDA

69










FONTE O autor

000

100

200

300

400

500

600

700

800

EB A F HD G C



Diacirc

met

ro e

m c

m

70








dos isolados






FONTE O autor

000

100

200

300

400

500

600

700

B A FEC D



Diacirc

met

ro e

m c

m

71












000

100

200

300

400

500

600

700

B A F C GD E

FONTE O autor

Diacirc

met

ro e

m c

m

72




























incubaccedilatildeo



73




















FONTE O autor


A B C

74













1 2 A

B C D

E


FONTE O autor

75












0

5

10

15

20

25

30

35

40


a

b

c

cd

de

ef

efg

fgh

fghi

ghij

ghil

hil

him

im

m

FONTE O autor

Diacirc

met

ro e

m μ

M

76





























estudadas

77













FONTE O autor

r = 07577 (P= 00001)

V VI

IV

I II III

78









Figuras 13 a 16

79

FIG

UR

A 1

4 P

ER

FIL

DE

AM

PLI

FIC

ACcedil

AtildeO

CO

M O

OLI

GO

NU

CLE

OTIacute

DE

O O

PX

14 D

OS

ISO

LAD

OS

EN

DO

FIacuteTI

CO

S D

E P

hom

opsi

s sp

E

GR

UP

O E

XTE

RN

O P

esta

lotio

psis

FIG

UR

A 1

3 P

ER

FIL

DE

AM

PLI

FIC

ACcedil

AtildeO

CO

M O

OLI

GO

NU

CLE

OTIacute

DE

O O

PX

11 D

OS

ISO

LAD

OS

EN

DO

FIacuteTI

CO

S D

E P

hom

opsi

s sp

E

GR

UP

O E

XTE

RN

O P

esta

lotio

psis

80

FIG

UR

A 1

5 P

ER

FIL

DE

AM

PLI

FIC

ACcedil

AtildeO

CO

M O

OLI

GO

NU

CLE

OTIacute

DE

O O

PX

19 D

OS

ISO

LAD

OS

EN

DO

FIacuteTI

CO

S D

E P

hom

opsi

s sp

E

GR

UP

O E

XTE

RN

O P

esta

lotio

psis

FIG

UR

A 1

6 P

ER

FIL

DE

AM

PLI

FIC

ACcedil

AtildeO

CO

M O

OLI

GO

NU

CLE

OTIacute

DE

O O

PE

08 D

OS

ISO

LAD

OS

EN

DO

FIacuteTI

CO

S D

E P

hom

opsi

s sp

E

GR

UP

O E

XTE

RN

O P

esta

lotio

psis

81























12)








82






FONTE O autor

I II

III IV V VI VII

GRUPO EXTERNO

r= 08157 (p=00001)

100

83
















espeacutecie







espeacutecie








84










2006)


FONTE O autor

85







(FIGURA 19)






S12

















86


ESIA1

A321

A113

A131


P michaellae


ESRD1

ESJE2

ESKD1

Phomopsis sp S1


A334

A323Phomopsis sp S8










PHO19



P sojae



SM9713

P longicolla PHO1

MU0123

P longicolla

A126





ES2AB1






ES2KF1

ES2WF1

ESPAC22

Phomopsis sp S4




SM9638

ESFH1





P theicola


99

99

3599

98

91

7786

78

75

73

2973

5

5

3

2

11

71

70

25

22

33

40

67

63

33

44

65

41

34

29

27

21

21

18

13

12

8

7

5

3

3

0

0

0

19

32

23

31

87














A113


ESIA1


A131

A133

P michae liae

A124

A334

ESGA1


98

62252719

0005

88






























89








hospedeira























90






























91



























92




























93






6 7 8 e 9)



















Phomopsis A134

G Citricarpa PC1396

Phomopsis SM9713

G Citricarpa PC1396


G Citricarpa PC1396

Fungicida Derosal

FONTE O autor

94















FONTE O autor


95






























96













G citricarpa PC3305

Phomopsis ESRD1

Phomopsis ESDF1

G citricarpa PC3305


Fungicida Derosal

G citricarpa PC3305

FONTE O autor

97



















98


















a b c d

99















FONTE O autor

C

D E F

A B



100











C

D E F

A B

101








Metanoacutelico






102


FONTE O autor














fitopatogecircnicas







103






citricarpa























104












P michaeliae




michaeliae







105






avaliadas

106


107


108


109


110


111


112


113


114


115


116


117


118


119


120


121


122


123


124


125

ANEXOS






BDA 5169935 a MEA 4973856 b AV 3921569 c

CV = 62



126






127




128






129




130






131




132







133


DMS = 259444 CV = 1052904



134








DMS = 039023 CV = 1340825

135







DMS = 046460 CV = 1946824



136








DMS = 050157 CV = 1809416

137


ANOVA






138


DMS = 070465 CV = 1983267



139







140


DMS = 033193 CV = 1095343



141


ANOVA





142


DMS = 069970 CV = 1193907



43

ANE

XO

12

ndash M

ATR

IZ D

E D

AD

OS

PA

RA

CA

RA

CTE

RIZ

ACcedil

AtildeO

CR

ITEacuteR

IOS

ME

DID

AS

ME

IOS

DE

C

ULT

UR

A

MU

0123

SM

9631

SM

9638

SM

9713

SM

9714

AT9

810

AT9

811

AT9

906

ES

2AB

1

ES

2KF1

ES2N

A1

ES2W

C1

ES2W

F1

ES

80J

ESBA

1

ESD

F1

ES

FB2

ES

FF1

ESFH

1

ES

GA

1

ESG

F1

ESIA

1

ESIE

1

ESJD

1

ESJE

1

ESJE

2

1 AV 1 0 1 0 0 1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 1 MEA 0 1 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 1 1 1 0 0 0 1 0 0 1 0 1 BDA 1 1 1 1 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 1 1 1 0 0 0 1 1 0 1 1 0

2 AV 1 1 1 1 0 1 1 1 0 0 1 0 1 1 1 0 0 0 1 1 0 0 1 1 1 1 3 AV 0 0 0 0 1 0 0 1 1 1 0 1 0 0 0 1 1 1 0 0 1 1 0 0 0 0 4 AV 1 0 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

MEA 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 BDA 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

5 AV 0 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 MEA 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 BDA 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

6 AV 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 MEA 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1 0 BDA 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1

7 AV 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 MEA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 BDA 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 0 0

8 AV 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 0 0 MEA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 1 0 0 0

9 AV 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 MEA 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 0 1 0 0 0 0 1 BDA 1 0 1 1 0 1 0 1 0 1 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 1

10 AV 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 MEA 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 BDA 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1

11 MEA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

12 MEA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

13 AV 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 MEA 0 0 1 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 BDA 0 0 1 0 1 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0

14 AV 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 MEA 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 0 1 0 0

44

BDA 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 1 0 1 1 1 0 0 1 1 15 AV 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

MEA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0

16 AV 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 MEA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 0 0

17 AV 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 MEA 1 0 1 1 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 BDA 1 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0

18 AV 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 MEA 0 1 0 0 1 0 1 0 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 BDA 0 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 1

19 AV 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 MEA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0

20 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 21 AV 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 0 0 1 1 0 1 0 1 1 1 0 0 1 1 1 1

MEA 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 0 0 1 1 0 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 0 BDA 1 1 0 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0

22 AV 1 1 0 1 1 1 0 1 0 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 MEA 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 BDA 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

23 352 a 353μM BDA 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 297 μM BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0



126 a 123 μM BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 119 μM BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0


97 a 85μM BDA 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 24 733 a 700cm MEA 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0


45



300cm BDA 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 233cm BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 700cm AV 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0


CR

ITEacuteR

IOS

ME

IOS

DE

C

ULT

UR

A

ES

JG1

ES

JH2

ES

KD

1

ES

PA

C22

ES

RD

1

ES

SD

1

A131

A126

A123

A323

A113

A334

A321

A216

B

A135

A115

B

A124

A116

A215

A

A132

A333

A

A333

B

A134

P l

ongi

colla

PH

O19

1 AV 0 0 1 1 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 1 0 0 MEA 0 0 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 0 1 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 BDA 0 0 1 1 1 1 1 0 0 1 1 0 1 1 0 1 0 1 1 1 0 0 0 0 0

2 AV 0 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 3 AV 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 4 AV 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1

MEA 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 BDA 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1

5 AV 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 MEA 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0

6 AV 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 MEA 1 1 0 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 BDA 1 0 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1

7 AV 1 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0

46

MEA 0 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 BDA 0 1 0 1 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0

8 AV 0 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 MEA 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 1 1 BDA 0 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 0 0 0 1 0 1 0 0 1 1

9 AV 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 0 0 0 MEA 0 0 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 1 1 0 0 0 1 1 0 0 BDA 1 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 1 1 1 0 1 1 1 0 0 0 1 1 0 0

10 AV 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 MEA 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 BDA 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

11 MEA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

12 MEA 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0

13 AV 0 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 0 1 1 1 MEA 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 BDA 0 1 1 0 1 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1

14 AV 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 MEA 1 1 0 1 1 1 1 0 1 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 0 BDA 0 1 0 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 0 1 0 0 1 0 1 0 1 0

15 AV 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 MEA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 BDA 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0

16 AV 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 MEA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0

17 AV 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 MEA 0 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 BDA 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0

18 AV 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 MEA 1 0 1 1 0 1 0 1 0 1 0 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1 0 1 1 BDA 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

19 AV 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 MEA 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 BDA 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0

20 ESP 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 21 AV 1 1 0 0 0 1 0 1 1 1 0 0 0 1 0 1 0 0 1 0 1 1 0 0 1

MEA 1 1 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 0 1 1 0 0 1 1 0 1 1 0 0 1 BDA 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 0 0

22 AV 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 MEA 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1

47

BDA 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 23 352 a 353μM BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

297 μM BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 195 a 193 μM BDA 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0



126 a 123 μM BDA 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 1 0 1 0 0 119 μM BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0


97 a 85μM BDA 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 24 733 a 700cm MEA 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0



300cm BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 233cm BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 700cm AV 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0



48












CURITIBA 2008

AGRADECIMENTOS















neste trabalho


espinheira santa


oacutetica


formaccedilatildeo









neste trabalho



trabalho


















apoio





de terminar

Portanto devemos



Do medo uma escada

Do sonho uma ponte


(Fernando Pessoa)



LISTA DE FIGURAS














































LISTA DE TABELAS

















LISTA DE ANEXOS























141




2 OBJETIVOS 3



























431 Clorofane 38

432 Clorofil 38








Gibco) 39














44 Isolamento 42






1995) 44

482 RAPD 45





















51 Isolamento 56



531 RAPD 78








ANEXOS 125

1






























2



























isolados

3

2 OBJETIVOS










DNA ribossomal



4





















al 2000)








5



1993 CLAY 2004)





na semente






















6






2001)




















e S cerevisae





7



















frequumlecircncia








8































9




























10






















(WANG et al 2000)






11






























12






























13






























14























antifuacutengicos






15































16






(BITTENCOURT 2001)















2004)






17













prostaglandinas














18



























19


(SIVANESAN 1984)










FULLERTON 1988)











associadas








20




























al 2007)

21






























22


















MENEZES 1996)








MENEZES 1996)



23



1984 CARROLL 1986)




























24































25













estudados















26































27
















381 Marcadores RAPD













28





autopareamento


























29
























382 Marcadores ITS





30































31













32























33





























34






















FONTE O autor



35












Glicose 20g

Peptona 1g


36




Aacutegar 150g







Batata 2000g

Dextrose 100g

Aacutegar 150g






37


NaNO3 60g

KH2PO4 15g

KCl 05g

MgSO47H2O 05g

FeSO4 002g

ZnSO4 002g

Glicose 100g

Peptona 20g




Aacutegar 150g






Glicose 20g

Peptona 1g

Agar 15g




38







435 Fenol Saturado












Glicerina 200 g

39




















40



Biotina 02 mg

Piridoxina 500 mg

Riboflavina 1000 mg

Tiamina 500 mg














41



EDTA pH 80 10 mM


EDTA pH 80 250 mM

NaCl 2500 mM

SDS (pv) 1




Glicerol 1035 mL



Trizma base 54g


EDTA 465g




42

44 Isolamento






planta Temperatura






FONTE O autor
















43






















placa de Petri




44


















4degC






45

















hora





482 RAPD





46




























1988)

47



2005)





Ribossomal




FONTE O autor








minutos a 72degC


48












horas













49








DNA megaBACE






ITS4 (TABELA 5)

FONTE O autor




a 8degC





50











45 minutos a 60degC















51













anteriores













52




FONTE O autor


491 Cultura Pareada





53












colocircnias




pela foacutermula









Dc -Dt

Dc


54














horas)











55











FIGUEIREDO 2006)








56


51 Isolamento













1 Folha 360 140 (39) 0 (0) 0

2 Folha 540 310 (57) 2 (064) 037

3 Folha 360 375 (gt100) 3 (08) 083

TOTAL FOLHA

1260 825 (65) 5 (061) 04

4 Peciacuteolo 160 180 (gt100) 16 (89) 100








57
















2004)















58



























bege

59
















meios utilizados


AV MEA BDA

M

U 0

123

S

M97

13

60



SM

9631

SM

9638

AT

9811

A

T990

6

AT9

810

SM

9714

AV MEA BDA

61


A32

1

A

132

A21

5A

A

113

A

323

A13

1

AV MEA BDA

62


A

135

A11

6

A

115B

A

124

A12

6

A21

6 B

AV MEA BDA

63


A

134

A33

3A

A

334

A12

3

A33

3B

AV MEA BDA

64


E

S2N

A1

E

SIE1

ES

GA

1

ES8

0J

E

SPA

C22

ES2

WF1

AV MEA BDA

65


ESFB

2

ESJ

D1

ESK

D1

E

SJH

1

ESD

F1

E

S2A

B1

AV MEA BDA

66


E

S2K

F1

ESJ

E2

ESJ

E1

ESG

F1

ESF

H1

ESF

F1

AV MEA BDA

67


ESB

A1

ESI

A1

ES

RD

1

E

S2W

C1

ESS

D1

ES

JG1

AV MEA BDA

68

















PH

O19

P

lon

gico

lla (P

HO

1) AV MEA BDA

69










FONTE O autor

000

100

200

300

400

500

600

700

800

EB A F HD G C



Diacirc

met

ro e

m c

m

70








dos isolados






FONTE O autor

000

100

200

300

400

500

600

700

B A FEC D



Diacirc

met

ro e

m c

m

71












000

100

200

300

400

500

600

700

B A F C GD E

FONTE O autor

Diacirc

met

ro e

m c

m

72




























incubaccedilatildeo



73




















FONTE O autor


A B C

74













1 2 A

B C D

E


FONTE O autor

75












0

5

10

15

20

25

30

35

40


a

b

c

cd

de

ef

efg

fgh

fghi

ghij

ghil

hil

him

im

m

FONTE O autor

Diacirc

met

ro e

m μ

M

76





























estudadas

77













FONTE O autor

r = 07577 (P= 00001)

V VI

IV

I II III

78









Figuras 13 a 16

79

FIG

UR

A 1

4 P

ER

FIL

DE

AM

PLI

FIC

ACcedil

AtildeO

CO

M O

OLI

GO

NU

CLE

OTIacute

DE

O O

PX

14 D

OS

ISO

LAD

OS

EN

DO

FIacuteTI

CO

S D

E P

hom

opsi

s sp

E

GR

UP

O E

XTE

RN

O P

esta

lotio

psis

FIG

UR

A 1

3 P

ER

FIL

DE

AM

PLI

FIC

ACcedil

AtildeO

CO

M O

OLI

GO

NU

CLE

OTIacute

DE

O O

PX

11 D

OS

ISO

LAD

OS

EN

DO

FIacuteTI

CO

S D

E P

hom

opsi

s sp

E

GR

UP

O E

XTE

RN

O P

esta

lotio

psis

80

FIG

UR

A 1

5 P

ER

FIL

DE

AM

PLI

FIC

ACcedil

AtildeO

CO

M O

OLI

GO

NU

CLE

OTIacute

DE

O O

PX

19 D

OS

ISO

LAD

OS

EN

DO

FIacuteTI

CO

S D

E P

hom

opsi

s sp

E

GR

UP

O E

XTE

RN

O P

esta

lotio

psis

FIG

UR

A 1

6 P

ER

FIL

DE

AM

PLI

FIC

ACcedil

AtildeO

CO

M O

OLI

GO

NU

CLE

OTIacute

DE

O O

PE

08 D

OS

ISO

LAD

OS

EN

DO

FIacuteTI

CO

S D

E P

hom

opsi

s sp

E

GR

UP

O E

XTE

RN

O P

esta

lotio

psis

81























12)








82






FONTE O autor

I II

III IV V VI VII

GRUPO EXTERNO

r= 08157 (p=00001)

100

83
















espeacutecie







espeacutecie








84










2006)


FONTE O autor

85







(FIGURA 19)






S12

















86


ESIA1

A321

A113

A131


P michaellae


ESRD1

ESJE2

ESKD1

Phomopsis sp S1


A334

A323Phomopsis sp S8










PHO19



P sojae



SM9713

P longicolla PHO1

MU0123

P longicolla

A126





ES2AB1






ES2KF1

ES2WF1

ESPAC22

Phomopsis sp S4




SM9638

ESFH1





P theicola


99

99

3599

98

91

7786

78

75

73

2973

5

5

3

2

11

71

70

25

22

33

40

67

63

33

44

65

41

34

29

27

21

21

18

13

12

8

7

5

3

3

0

0

0

19

32

23

31

87














A113


ESIA1


A131

A133

P michae liae

A124

A334

ESGA1


98

62252719

0005

88






























89








hospedeira























90






























91



























92




























93






6 7 8 e 9)



















Phomopsis A134

G Citricarpa PC1396

Phomopsis SM9713

G Citricarpa PC1396


G Citricarpa PC1396

Fungicida Derosal

FONTE O autor

94















FONTE O autor


95






























96













G citricarpa PC3305

Phomopsis ESRD1

Phomopsis ESDF1

G citricarpa PC3305


Fungicida Derosal

G citricarpa PC3305

FONTE O autor

97



















98


















a b c d

99















FONTE O autor

C

D E F

A B



100











C

D E F

A B

101








Metanoacutelico






102


FONTE O autor














fitopatogecircnicas







103






citricarpa























104












P michaeliae




michaeliae







105






avaliadas

106


107


108


109


110


111


112


113


114


115


116


117


118


119


120


121


122


123


124


125

ANEXOS






BDA 5169935 a MEA 4973856 b AV 3921569 c

CV = 62



126






127




128






129




130






131




132







133


DMS = 259444 CV = 1052904



134








DMS = 039023 CV = 1340825

135







DMS = 046460 CV = 1946824



136








DMS = 050157 CV = 1809416

137


ANOVA






138


DMS = 070465 CV = 1983267



139







140


DMS = 033193 CV = 1095343



141


ANOVA





142


DMS = 069970 CV = 1193907



43

ANE

XO

12

ndash M

ATR

IZ D

E D

AD

OS

PA

RA

CA

RA

CTE

RIZ

ACcedil

AtildeO

CR

ITEacuteR

IOS

ME

DID

AS

ME

IOS

DE

C

ULT

UR

A

MU

0123

SM

9631

SM

9638

SM

9713

SM

9714

AT9

810

AT9

811

AT9

906

ES

2AB

1

ES

2KF1

ES2N

A1

ES2W

C1

ES2W

F1

ES

80J

ESBA

1

ESD

F1

ES

FB2

ES

FF1

ESFH

1

ES

GA

1

ESG

F1

ESIA

1

ESIE

1

ESJD

1

ESJE

1

ESJE

2

1 AV 1 0 1 0 0 1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 1 MEA 0 1 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 1 1 1 0 0 0 1 0 0 1 0 1 BDA 1 1 1 1 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 1 1 1 0 0 0 1 1 0 1 1 0

2 AV 1 1 1 1 0 1 1 1 0 0 1 0 1 1 1 0 0 0 1 1 0 0 1 1 1 1 3 AV 0 0 0 0 1 0 0 1 1 1 0 1 0 0 0 1 1 1 0 0 1 1 0 0 0 0 4 AV 1 0 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

MEA 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 BDA 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

5 AV 0 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 MEA 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 BDA 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

6 AV 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 MEA 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1 0 BDA 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1

7 AV 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 MEA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 BDA 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 0 0

8 AV 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 0 0 MEA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 1 0 0 0

9 AV 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 MEA 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 0 1 0 0 0 0 1 BDA 1 0 1 1 0 1 0 1 0 1 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 1

10 AV 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 MEA 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 BDA 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1

11 MEA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

12 MEA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

13 AV 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 MEA 0 0 1 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 BDA 0 0 1 0 1 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0

14 AV 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 MEA 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 0 1 0 0

44

BDA 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 1 0 1 1 1 0 0 1 1 15 AV 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

MEA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0

16 AV 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 MEA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 0 0

17 AV 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 MEA 1 0 1 1 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 BDA 1 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0

18 AV 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 MEA 0 1 0 0 1 0 1 0 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 BDA 0 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 1

19 AV 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 MEA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0

20 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 21 AV 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 0 0 1 1 0 1 0 1 1 1 0 0 1 1 1 1

MEA 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 0 0 1 1 0 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 0 BDA 1 1 0 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0

22 AV 1 1 0 1 1 1 0 1 0 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 MEA 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 BDA 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

23 352 a 353μM BDA 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 297 μM BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0



126 a 123 μM BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 119 μM BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0


97 a 85μM BDA 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 24 733 a 700cm MEA 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0


45



300cm BDA 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 233cm BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 700cm AV 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0


CR

ITEacuteR

IOS

ME

IOS

DE

C

ULT

UR

A

ES

JG1

ES

JH2

ES

KD

1

ES

PA

C22

ES

RD

1

ES

SD

1

A131

A126

A123

A323

A113

A334

A321

A216

B

A135

A115

B

A124

A116

A215

A

A132

A333

A

A333

B

A134

P l

ongi

colla

PH

O19

1 AV 0 0 1 1 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 1 0 0 MEA 0 0 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 0 1 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 BDA 0 0 1 1 1 1 1 0 0 1 1 0 1 1 0 1 0 1 1 1 0 0 0 0 0

2 AV 0 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 3 AV 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 4 AV 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1

MEA 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 BDA 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1

5 AV 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 MEA 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0

6 AV 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 MEA 1 1 0 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 BDA 1 0 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1

7 AV 1 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0

46

MEA 0 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 BDA 0 1 0 1 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0

8 AV 0 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 MEA 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 1 1 BDA 0 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 0 0 0 1 0 1 0 0 1 1

9 AV 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 0 0 0 MEA 0 0 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 1 1 0 0 0 1 1 0 0 BDA 1 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 1 1 1 0 1 1 1 0 0 0 1 1 0 0

10 AV 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 MEA 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 BDA 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

11 MEA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

12 MEA 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0

13 AV 0 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 0 1 1 1 MEA 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 BDA 0 1 1 0 1 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1

14 AV 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 MEA 1 1 0 1 1 1 1 0 1 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 0 BDA 0 1 0 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 0 1 0 0 1 0 1 0 1 0

15 AV 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 MEA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 BDA 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0

16 AV 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 MEA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0

17 AV 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 MEA 0 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 BDA 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0

18 AV 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 MEA 1 0 1 1 0 1 0 1 0 1 0 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1 0 1 1 BDA 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

19 AV 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 MEA 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 BDA 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0

20 ESP 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 21 AV 1 1 0 0 0 1 0 1 1 1 0 0 0 1 0 1 0 0 1 0 1 1 0 0 1

MEA 1 1 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 0 1 1 0 0 1 1 0 1 1 0 0 1 BDA 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 0 0

22 AV 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 MEA 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1

47

BDA 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 23 352 a 353μM BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

297 μM BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 195 a 193 μM BDA 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0



126 a 123 μM BDA 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 1 0 1 0 0 119 μM BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0


97 a 85μM BDA 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 24 733 a 700cm MEA 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0



300cm BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 233cm BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 700cm AV 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0



48






AGRADECIMENTOS















neste trabalho


espinheira santa


oacutetica


formaccedilatildeo









neste trabalho



trabalho


















apoio





de terminar

Portanto devemos



Do medo uma escada

Do sonho uma ponte


(Fernando Pessoa)



LISTA DE FIGURAS














































LISTA DE TABELAS

















LISTA DE ANEXOS























141




2 OBJETIVOS 3



























431 Clorofane 38

432 Clorofil 38








Gibco) 39














44 Isolamento 42






1995) 44

482 RAPD 45





















51 Isolamento 56



531 RAPD 78








ANEXOS 125

1






























2



























isolados

3

2 OBJETIVOS










DNA ribossomal



4





















al 2000)








5



1993 CLAY 2004)





na semente






















6






2001)




















e S cerevisae





7



















frequumlecircncia








8































9




























10






















(WANG et al 2000)






11






























12






























13






























14























antifuacutengicos






15































16






(BITTENCOURT 2001)















2004)






17













prostaglandinas














18



























19


(SIVANESAN 1984)










FULLERTON 1988)











associadas








20




























al 2007)

21






























22


















MENEZES 1996)








MENEZES 1996)



23



1984 CARROLL 1986)




























24































25













estudados















26































27
















381 Marcadores RAPD













28





autopareamento


























29
























382 Marcadores ITS





30































31













32























33





























34






















FONTE O autor



35












Glicose 20g

Peptona 1g


36




Aacutegar 150g







Batata 2000g

Dextrose 100g

Aacutegar 150g






37


NaNO3 60g

KH2PO4 15g

KCl 05g

MgSO47H2O 05g

FeSO4 002g

ZnSO4 002g

Glicose 100g

Peptona 20g




Aacutegar 150g






Glicose 20g

Peptona 1g

Agar 15g




38







435 Fenol Saturado












Glicerina 200 g

39




















40



Biotina 02 mg

Piridoxina 500 mg

Riboflavina 1000 mg

Tiamina 500 mg














41



EDTA pH 80 10 mM


EDTA pH 80 250 mM

NaCl 2500 mM

SDS (pv) 1




Glicerol 1035 mL



Trizma base 54g


EDTA 465g




42

44 Isolamento






planta Temperatura






FONTE O autor
















43






















placa de Petri




44


















4degC






45

















hora





482 RAPD





46




























1988)

47



2005)





Ribossomal




FONTE O autor








minutos a 72degC


48












horas













49








DNA megaBACE






ITS4 (TABELA 5)

FONTE O autor




a 8degC





50











45 minutos a 60degC















51













anteriores













52




FONTE O autor


491 Cultura Pareada





53












colocircnias




pela foacutermula









Dc -Dt

Dc


54














horas)











55











FIGUEIREDO 2006)








56


51 Isolamento













1 Folha 360 140 (39) 0 (0) 0

2 Folha 540 310 (57) 2 (064) 037

3 Folha 360 375 (gt100) 3 (08) 083

TOTAL FOLHA

1260 825 (65) 5 (061) 04

4 Peciacuteolo 160 180 (gt100) 16 (89) 100








57
















2004)















58



























bege

59
















meios utilizados


AV MEA BDA

M

U 0

123

S

M97

13

60



SM

9631

SM

9638

AT

9811

A

T990

6

AT9

810

SM

9714

AV MEA BDA

61


A32

1

A

132

A21

5A

A

113

A

323

A13

1

AV MEA BDA

62


A

135

A11

6

A

115B

A

124

A12

6

A21

6 B

AV MEA BDA

63


A

134

A33

3A

A

334

A12

3

A33

3B

AV MEA BDA

64


E

S2N

A1

E

SIE1

ES

GA

1

ES8

0J

E

SPA

C22

ES2

WF1

AV MEA BDA

65


ESFB

2

ESJ

D1

ESK

D1

E

SJH

1

ESD

F1

E

S2A

B1

AV MEA BDA

66


E

S2K

F1

ESJ

E2

ESJ

E1

ESG

F1

ESF

H1

ESF

F1

AV MEA BDA

67


ESB

A1

ESI

A1

ES

RD

1

E

S2W

C1

ESS

D1

ES

JG1

AV MEA BDA

68

















PH

O19

P

lon

gico

lla (P

HO

1) AV MEA BDA

69










FONTE O autor

000

100

200

300

400

500

600

700

800

EB A F HD G C



Diacirc

met

ro e

m c

m

70








dos isolados






FONTE O autor

000

100

200

300

400

500

600

700

B A FEC D



Diacirc

met

ro e

m c

m

71












000

100

200

300

400

500

600

700

B A F C GD E

FONTE O autor

Diacirc

met

ro e

m c

m

72




























incubaccedilatildeo



73




















FONTE O autor


A B C

74













1 2 A

B C D

E


FONTE O autor

75












0

5

10

15

20

25

30

35

40


a

b

c

cd

de

ef

efg

fgh

fghi

ghij

ghil

hil

him

im

m

FONTE O autor

Diacirc

met

ro e

m μ

M

76





























estudadas

77













FONTE O autor

r = 07577 (P= 00001)

V VI

IV

I II III

78









Figuras 13 a 16

79

FIG

UR

A 1

4 P

ER

FIL

DE

AM

PLI

FIC

ACcedil

AtildeO

CO

M O

OLI

GO

NU

CLE

OTIacute

DE

O O

PX

14 D

OS

ISO

LAD

OS

EN

DO

FIacuteTI

CO

S D

E P

hom

opsi

s sp

E

GR

UP

O E

XTE

RN

O P

esta

lotio

psis

FIG

UR

A 1

3 P

ER

FIL

DE

AM

PLI

FIC

ACcedil

AtildeO

CO

M O

OLI

GO

NU

CLE

OTIacute

DE

O O

PX

11 D

OS

ISO

LAD

OS

EN

DO

FIacuteTI

CO

S D

E P

hom

opsi

s sp

E

GR

UP

O E

XTE

RN

O P

esta

lotio

psis

80

FIG

UR

A 1

5 P

ER

FIL

DE

AM

PLI

FIC

ACcedil

AtildeO

CO

M O

OLI

GO

NU

CLE

OTIacute

DE

O O

PX

19 D

OS

ISO

LAD

OS

EN

DO

FIacuteTI

CO

S D

E P

hom

opsi

s sp

E

GR

UP

O E

XTE

RN

O P

esta

lotio

psis

FIG

UR

A 1

6 P

ER

FIL

DE

AM

PLI

FIC

ACcedil

AtildeO

CO

M O

OLI

GO

NU

CLE

OTIacute

DE

O O

PE

08 D

OS

ISO

LAD

OS

EN

DO

FIacuteTI

CO

S D

E P

hom

opsi

s sp

E

GR

UP

O E

XTE

RN

O P

esta

lotio

psis

81























12)








82






FONTE O autor

I II

III IV V VI VII

GRUPO EXTERNO

r= 08157 (p=00001)

100

83
















espeacutecie







espeacutecie








84










2006)


FONTE O autor

85







(FIGURA 19)






S12

















86


ESIA1

A321

A113

A131


P michaellae


ESRD1

ESJE2

ESKD1

Phomopsis sp S1


A334

A323Phomopsis sp S8










PHO19



P sojae



SM9713

P longicolla PHO1

MU0123

P longicolla

A126





ES2AB1






ES2KF1

ES2WF1

ESPAC22

Phomopsis sp S4




SM9638

ESFH1





P theicola


99

99

3599

98

91

7786

78

75

73

2973

5

5

3

2

11

71

70

25

22

33

40

67

63

33

44

65

41

34

29

27

21

21

18

13

12

8

7

5

3

3

0

0

0

19

32

23

31

87














A113


ESIA1


A131

A133

P michae liae

A124

A334

ESGA1


98

62252719

0005

88






























89








hospedeira























90






























91



























92




























93






6 7 8 e 9)



















Phomopsis A134

G Citricarpa PC1396

Phomopsis SM9713

G Citricarpa PC1396


G Citricarpa PC1396

Fungicida Derosal

FONTE O autor

94















FONTE O autor


95






























96













G citricarpa PC3305

Phomopsis ESRD1

Phomopsis ESDF1

G citricarpa PC3305


Fungicida Derosal

G citricarpa PC3305

FONTE O autor

97



















98


















a b c d

99















FONTE O autor

C

D E F

A B



100











C

D E F

A B

101








Metanoacutelico






102


FONTE O autor














fitopatogecircnicas







103






citricarpa























104












P michaeliae




michaeliae







105






avaliadas

106


107


108


109


110


111


112


113


114


115


116


117


118


119


120


121


122


123


124


125

ANEXOS






BDA 5169935 a MEA 4973856 b AV 3921569 c

CV = 62



126






127




128






129




130






131




132







133


DMS = 259444 CV = 1052904



134








DMS = 039023 CV = 1340825

135







DMS = 046460 CV = 1946824



136








DMS = 050157 CV = 1809416

137


ANOVA






138


DMS = 070465 CV = 1983267



139







140


DMS = 033193 CV = 1095343



141


ANOVA





142


DMS = 069970 CV = 1193907



43

ANE

XO

12

ndash M

ATR

IZ D

E D

AD

OS

PA

RA

CA

RA

CTE

RIZ

ACcedil

AtildeO

CR

ITEacuteR

IOS

ME

DID

AS

ME

IOS

DE

C

ULT

UR

A

MU

0123

SM

9631

SM

9638

SM

9713

SM

9714

AT9

810

AT9

811

AT9

906

ES

2AB

1

ES

2KF1

ES2N

A1

ES2W

C1

ES2W

F1

ES

80J

ESBA

1

ESD

F1

ES

FB2

ES

FF1

ESFH

1

ES

GA

1

ESG

F1

ESIA

1

ESIE

1

ESJD

1

ESJE

1

ESJE

2

1 AV 1 0 1 0 0 1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 1 MEA 0 1 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 1 1 1 0 0 0 1 0 0 1 0 1 BDA 1 1 1 1 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 1 1 1 0 0 0 1 1 0 1 1 0

2 AV 1 1 1 1 0 1 1 1 0 0 1 0 1 1 1 0 0 0 1 1 0 0 1 1 1 1 3 AV 0 0 0 0 1 0 0 1 1 1 0 1 0 0 0 1 1 1 0 0 1 1 0 0 0 0 4 AV 1 0 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

MEA 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 BDA 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

5 AV 0 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 MEA 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 BDA 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

6 AV 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 MEA 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1 0 BDA 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1

7 AV 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 MEA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 BDA 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 0 0

8 AV 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 0 0 MEA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 1 0 0 0

9 AV 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 MEA 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 0 1 0 0 0 0 1 BDA 1 0 1 1 0 1 0 1 0 1 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 1

10 AV 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 MEA 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 BDA 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1

11 MEA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

12 MEA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

13 AV 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 MEA 0 0 1 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 BDA 0 0 1 0 1 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0

14 AV 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 MEA 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 0 1 0 0

44

BDA 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 1 0 1 1 1 0 0 1 1 15 AV 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

MEA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0

16 AV 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 MEA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 0 0

17 AV 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 MEA 1 0 1 1 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 BDA 1 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0

18 AV 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 MEA 0 1 0 0 1 0 1 0 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 BDA 0 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 1

19 AV 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 MEA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0

20 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 21 AV 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 0 0 1 1 0 1 0 1 1 1 0 0 1 1 1 1

MEA 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 0 0 1 1 0 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 0 BDA 1 1 0 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0

22 AV 1 1 0 1 1 1 0 1 0 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 MEA 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 BDA 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

23 352 a 353μM BDA 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 297 μM BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0



126 a 123 μM BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 119 μM BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0


97 a 85μM BDA 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 24 733 a 700cm MEA 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0


45



300cm BDA 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 233cm BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 700cm AV 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0


CR

ITEacuteR

IOS

ME

IOS

DE

C

ULT

UR

A

ES

JG1

ES

JH2

ES

KD

1

ES

PA

C22

ES

RD

1

ES

SD

1

A131

A126

A123

A323

A113

A334

A321

A216

B

A135

A115

B

A124

A116

A215

A

A132

A333

A

A333

B

A134

P l

ongi

colla

PH

O19

1 AV 0 0 1 1 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 1 0 0 MEA 0 0 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 0 1 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 BDA 0 0 1 1 1 1 1 0 0 1 1 0 1 1 0 1 0 1 1 1 0 0 0 0 0

2 AV 0 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 3 AV 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 4 AV 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1

MEA 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 BDA 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1

5 AV 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 MEA 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0

6 AV 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 MEA 1 1 0 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 BDA 1 0 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1

7 AV 1 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0

46

MEA 0 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 BDA 0 1 0 1 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0

8 AV 0 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 MEA 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 1 1 BDA 0 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 0 0 0 1 0 1 0 0 1 1

9 AV 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 0 0 0 MEA 0 0 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 1 1 0 0 0 1 1 0 0 BDA 1 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 1 1 1 0 1 1 1 0 0 0 1 1 0 0

10 AV 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 MEA 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 BDA 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

11 MEA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

12 MEA 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0

13 AV 0 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 0 1 1 1 MEA 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 BDA 0 1 1 0 1 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1

14 AV 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 MEA 1 1 0 1 1 1 1 0 1 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 0 BDA 0 1 0 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 0 1 0 0 1 0 1 0 1 0

15 AV 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 MEA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 BDA 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0

16 AV 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 MEA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0

17 AV 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 MEA 0 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 BDA 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0

18 AV 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 MEA 1 0 1 1 0 1 0 1 0 1 0 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1 0 1 1 BDA 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

19 AV 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 MEA 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 BDA 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0

20 ESP 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 21 AV 1 1 0 0 0 1 0 1 1 1 0 0 0 1 0 1 0 0 1 0 1 1 0 0 1

MEA 1 1 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 0 1 1 0 0 1 1 0 1 1 0 0 1 BDA 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 0 0

22 AV 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 MEA 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1

47

BDA 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 23 352 a 353μM BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

297 μM BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 195 a 193 μM BDA 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0



126 a 123 μM BDA 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 1 0 1 0 0 119 μM BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0


97 a 85μM BDA 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 24 733 a 700cm MEA 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0



300cm BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 233cm BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 700cm AV 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0



48







neste trabalho



trabalho


















apoio





de terminar

Portanto devemos



Do medo uma escada

Do sonho uma ponte


(Fernando Pessoa)



LISTA DE FIGURAS














































LISTA DE TABELAS

















LISTA DE ANEXOS























141




2 OBJETIVOS 3



























431 Clorofane 38

432 Clorofil 38








Gibco) 39














44 Isolamento 42






1995) 44

482 RAPD 45





















51 Isolamento 56



531 RAPD 78








ANEXOS 125

1






























2



























isolados

3

2 OBJETIVOS










DNA ribossomal



4





















al 2000)








5



1993 CLAY 2004)





na semente






















6






2001)




















e S cerevisae





7



















frequumlecircncia








8































9




























10






















(WANG et al 2000)






11






























12






























13






























14























antifuacutengicos






15































16






(BITTENCOURT 2001)















2004)






17













prostaglandinas














18



























19


(SIVANESAN 1984)










FULLERTON 1988)











associadas








20




























al 2007)

21






























22


















MENEZES 1996)








MENEZES 1996)



23



1984 CARROLL 1986)




























24































25













estudados















26































27
















381 Marcadores RAPD













28





autopareamento


























29
























382 Marcadores ITS





30































31













32























33





























34






















FONTE O autor



35












Glicose 20g

Peptona 1g


36




Aacutegar 150g







Batata 2000g

Dextrose 100g

Aacutegar 150g






37


NaNO3 60g

KH2PO4 15g

KCl 05g

MgSO47H2O 05g

FeSO4 002g

ZnSO4 002g

Glicose 100g

Peptona 20g




Aacutegar 150g






Glicose 20g

Peptona 1g

Agar 15g




38







435 Fenol Saturado












Glicerina 200 g

39




















40



Biotina 02 mg

Piridoxina 500 mg

Riboflavina 1000 mg

Tiamina 500 mg














41



EDTA pH 80 10 mM


EDTA pH 80 250 mM

NaCl 2500 mM

SDS (pv) 1




Glicerol 1035 mL



Trizma base 54g


EDTA 465g




42

44 Isolamento






planta Temperatura






FONTE O autor
















43






















placa de Petri




44


















4degC






45

















hora





482 RAPD





46




























1988)

47



2005)





Ribossomal




FONTE O autor








minutos a 72degC


48












horas













49








DNA megaBACE






ITS4 (TABELA 5)

FONTE O autor




a 8degC





50











45 minutos a 60degC















51













anteriores













52




FONTE O autor


491 Cultura Pareada





53












colocircnias




pela foacutermula









Dc -Dt

Dc


54














horas)











55











FIGUEIREDO 2006)








56


51 Isolamento













1 Folha 360 140 (39) 0 (0) 0

2 Folha 540 310 (57) 2 (064) 037

3 Folha 360 375 (gt100) 3 (08) 083

TOTAL FOLHA

1260 825 (65) 5 (061) 04

4 Peciacuteolo 160 180 (gt100) 16 (89) 100








57
















2004)















58



























bege

59
















meios utilizados


AV MEA BDA

M

U 0

123

S

M97

13

60



SM

9631

SM

9638

AT

9811

A

T990

6

AT9

810

SM

9714

AV MEA BDA

61


A32

1

A

132

A21

5A

A

113

A

323

A13

1

AV MEA BDA

62


A

135

A11

6

A

115B

A

124

A12

6

A21

6 B

AV MEA BDA

63


A

134

A33

3A

A

334

A12

3

A33

3B

AV MEA BDA

64


E

S2N

A1

E

SIE1

ES

GA

1

ES8

0J

E

SPA

C22

ES2

WF1

AV MEA BDA

65


ESFB

2

ESJ

D1

ESK

D1

E

SJH

1

ESD

F1

E

S2A

B1

AV MEA BDA

66


E

S2K

F1

ESJ

E2

ESJ

E1

ESG

F1

ESF

H1

ESF

F1

AV MEA BDA

67


ESB

A1

ESI

A1

ES

RD

1

E

S2W

C1

ESS

D1

ES

JG1

AV MEA BDA

68

















PH

O19

P

lon

gico

lla (P

HO

1) AV MEA BDA

69










FONTE O autor

000

100

200

300

400

500

600

700

800

EB A F HD G C



Diacirc

met

ro e

m c

m

70








dos isolados






FONTE O autor

000

100

200

300

400

500

600

700

B A FEC D



Diacirc

met

ro e

m c

m

71












000

100

200

300

400

500

600

700

B A F C GD E

FONTE O autor

Diacirc

met

ro e

m c

m

72




























incubaccedilatildeo



73




















FONTE O autor


A B C

74













1 2 A

B C D

E


FONTE O autor

75












0

5

10

15

20

25

30

35

40


a

b

c

cd

de

ef

efg

fgh

fghi

ghij

ghil

hil

him

im

m

FONTE O autor

Diacirc

met

ro e

m μ

M

76





























estudadas

77













FONTE O autor

r = 07577 (P= 00001)

V VI

IV

I II III

78









Figuras 13 a 16

79

FIG

UR

A 1

4 P

ER

FIL

DE

AM

PLI

FIC

ACcedil

AtildeO

CO

M O

OLI

GO

NU

CLE

OTIacute

DE

O O

PX

14 D

OS

ISO

LAD

OS

EN

DO

FIacuteTI

CO

S D

E P

hom

opsi

s sp

E

GR

UP

O E

XTE

RN

O P

esta

lotio

psis

FIG

UR

A 1

3 P

ER

FIL

DE

AM

PLI

FIC

ACcedil

AtildeO

CO

M O

OLI

GO

NU

CLE

OTIacute

DE

O O

PX

11 D

OS

ISO

LAD

OS

EN

DO

FIacuteTI

CO

S D

E P

hom

opsi

s sp

E

GR

UP

O E

XTE

RN

O P

esta

lotio

psis

80

FIG

UR

A 1

5 P

ER

FIL

DE

AM

PLI

FIC

ACcedil

AtildeO

CO

M O

OLI

GO

NU

CLE

OTIacute

DE

O O

PX

19 D

OS

ISO

LAD

OS

EN

DO

FIacuteTI

CO

S D

E P

hom

opsi

s sp

E

GR

UP

O E

XTE

RN

O P

esta

lotio

psis

FIG

UR

A 1

6 P

ER

FIL

DE

AM

PLI

FIC

ACcedil

AtildeO

CO

M O

OLI

GO

NU

CLE

OTIacute

DE

O O

PE

08 D

OS

ISO

LAD

OS

EN

DO

FIacuteTI

CO

S D

E P

hom

opsi

s sp

E

GR

UP

O E

XTE

RN

O P

esta

lotio

psis

81























12)








82






FONTE O autor

I II

III IV V VI VII

GRUPO EXTERNO

r= 08157 (p=00001)

100

83
















espeacutecie







espeacutecie








84










2006)


FONTE O autor

85







(FIGURA 19)






S12

















86


ESIA1

A321

A113

A131


P michaellae


ESRD1

ESJE2

ESKD1

Phomopsis sp S1


A334

A323Phomopsis sp S8










PHO19



P sojae



SM9713

P longicolla PHO1

MU0123

P longicolla

A126





ES2AB1






ES2KF1

ES2WF1

ESPAC22

Phomopsis sp S4




SM9638

ESFH1





P theicola


99

99

3599

98

91

7786

78

75

73

2973

5

5

3

2

11

71

70

25

22

33

40

67

63

33

44

65

41

34

29

27

21

21

18

13

12

8

7

5

3

3

0

0

0

19

32

23

31

87














A113


ESIA1


A131

A133

P michae liae

A124

A334

ESGA1


98

62252719

0005

88






























89








hospedeira























90






























91



























92




























93






6 7 8 e 9)



















Phomopsis A134

G Citricarpa PC1396

Phomopsis SM9713

G Citricarpa PC1396


G Citricarpa PC1396

Fungicida Derosal

FONTE O autor

94















FONTE O autor


95






























96













G citricarpa PC3305

Phomopsis ESRD1

Phomopsis ESDF1

G citricarpa PC3305


Fungicida Derosal

G citricarpa PC3305

FONTE O autor

97



















98


















a b c d

99















FONTE O autor

C

D E F

A B



100











C

D E F

A B

101








Metanoacutelico






102


FONTE O autor














fitopatogecircnicas







103






citricarpa























104












P michaeliae




michaeliae







105






avaliadas

106


107


108


109


110


111


112


113


114


115


116


117


118


119


120


121


122


123


124


125

ANEXOS






BDA 5169935 a MEA 4973856 b AV 3921569 c

CV = 62



126






127




128






129




130






131




132







133


DMS = 259444 CV = 1052904



134








DMS = 039023 CV = 1340825

135







DMS = 046460 CV = 1946824



136








DMS = 050157 CV = 1809416

137


ANOVA






138


DMS = 070465 CV = 1983267



139







140


DMS = 033193 CV = 1095343



141


ANOVA





142


DMS = 069970 CV = 1193907



43

ANE

XO

12

ndash M

ATR

IZ D

E D

AD

OS

PA

RA

CA

RA

CTE

RIZ

ACcedil

AtildeO

CR

ITEacuteR

IOS

ME

DID

AS

ME

IOS

DE

C

ULT

UR

A

MU

0123

SM

9631

SM

9638

SM

9713

SM

9714

AT9

810

AT9

811

AT9

906

ES

2AB

1

ES

2KF1

ES2N

A1

ES2W

C1

ES2W

F1

ES

80J

ESBA

1

ESD

F1

ES

FB2

ES

FF1

ESFH

1

ES

GA

1

ESG

F1

ESIA

1

ESIE

1

ESJD

1

ESJE

1

ESJE

2

1 AV 1 0 1 0 0 1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 1 MEA 0 1 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 1 1 1 0 0 0 1 0 0 1 0 1 BDA 1 1 1 1 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 1 1 1 0 0 0 1 1 0 1 1 0

2 AV 1 1 1 1 0 1 1 1 0 0 1 0 1 1 1 0 0 0 1 1 0 0 1 1 1 1 3 AV 0 0 0 0 1 0 0 1 1 1 0 1 0 0 0 1 1 1 0 0 1 1 0 0 0 0 4 AV 1 0 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

MEA 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 BDA 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

5 AV 0 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 MEA 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 BDA 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

6 AV 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 MEA 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1 0 BDA 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1

7 AV 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 MEA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 BDA 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 0 0

8 AV 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 0 0 MEA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 1 0 0 0

9 AV 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 MEA 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 0 1 0 0 0 0 1 BDA 1 0 1 1 0 1 0 1 0 1 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 1

10 AV 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 MEA 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 BDA 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1

11 MEA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

12 MEA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

13 AV 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 MEA 0 0 1 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 BDA 0 0 1 0 1 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0

14 AV 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 MEA 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 0 1 0 0

44

BDA 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 1 0 1 1 1 0 0 1 1 15 AV 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

MEA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0

16 AV 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 MEA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 0 0

17 AV 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 MEA 1 0 1 1 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 BDA 1 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0

18 AV 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 MEA 0 1 0 0 1 0 1 0 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 BDA 0 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 1

19 AV 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 MEA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0

20 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 21 AV 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 0 0 1 1 0 1 0 1 1 1 0 0 1 1 1 1

MEA 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 0 0 1 1 0 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 0 BDA 1 1 0 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0

22 AV 1 1 0 1 1 1 0 1 0 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 MEA 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 BDA 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

23 352 a 353μM BDA 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 297 μM BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0



126 a 123 μM BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 119 μM BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0


97 a 85μM BDA 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 24 733 a 700cm MEA 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0


45



300cm BDA 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 233cm BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 700cm AV 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0


CR

ITEacuteR

IOS

ME

IOS

DE

C

ULT

UR

A

ES

JG1

ES

JH2

ES

KD

1

ES

PA

C22

ES

RD

1

ES

SD

1

A131

A126

A123

A323

A113

A334

A321

A216

B

A135

A115

B

A124

A116

A215

A

A132

A333

A

A333

B

A134

P l

ongi

colla

PH

O19

1 AV 0 0 1 1 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 1 0 0 MEA 0 0 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 0 1 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 BDA 0 0 1 1 1 1 1 0 0 1 1 0 1 1 0 1 0 1 1 1 0 0 0 0 0

2 AV 0 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 3 AV 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 4 AV 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1

MEA 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 BDA 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1

5 AV 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 MEA 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0

6 AV 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 MEA 1 1 0 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 BDA 1 0 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1

7 AV 1 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0

46

MEA 0 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 BDA 0 1 0 1 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0

8 AV 0 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 MEA 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 1 1 BDA 0 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 0 0 0 1 0 1 0 0 1 1

9 AV 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 0 0 0 MEA 0 0 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 1 1 0 0 0 1 1 0 0 BDA 1 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 1 1 1 0 1 1 1 0 0 0 1 1 0 0

10 AV 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 MEA 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 BDA 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

11 MEA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

12 MEA 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0

13 AV 0 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 0 1 1 1 MEA 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 BDA 0 1 1 0 1 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1

14 AV 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 MEA 1 1 0 1 1 1 1 0 1 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 0 BDA 0 1 0 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 0 1 0 0 1 0 1 0 1 0

15 AV 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 MEA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 BDA 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0

16 AV 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 MEA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0

17 AV 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 MEA 0 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 BDA 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0

18 AV 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 MEA 1 0 1 1 0 1 0 1 0 1 0 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1 0 1 1 BDA 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

19 AV 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 MEA 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 BDA 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0

20 ESP 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 21 AV 1 1 0 0 0 1 0 1 1 1 0 0 0 1 0 1 0 0 1 0 1 1 0 0 1

MEA 1 1 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 0 1 1 0 0 1 1 0 1 1 0 0 1 BDA 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 0 0

22 AV 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 MEA 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1

47

BDA 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 23 352 a 353μM BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

297 μM BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 195 a 193 μM BDA 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0



126 a 123 μM BDA 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 1 0 1 0 0 119 μM BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0


97 a 85μM BDA 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 24 733 a 700cm MEA 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0



300cm BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 233cm BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 700cm AV 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0



48










de terminar

Portanto devemos



Do medo uma escada

Do sonho uma ponte


(Fernando Pessoa)



LISTA DE FIGURAS














































LISTA DE TABELAS

















LISTA DE ANEXOS























141




2 OBJETIVOS 3



























431 Clorofane 38

432 Clorofil 38








Gibco) 39














44 Isolamento 42






1995) 44

482 RAPD 45





















51 Isolamento 56



531 RAPD 78








ANEXOS 125

1






























2



























isolados

3

2 OBJETIVOS










DNA ribossomal



4





















al 2000)








5



1993 CLAY 2004)





na semente






















6






2001)




















e S cerevisae





7



















frequumlecircncia








8































9




























10






















(WANG et al 2000)






11






























12






























13






























14























antifuacutengicos






15































16






(BITTENCOURT 2001)















2004)






17













prostaglandinas














18



























19


(SIVANESAN 1984)










FULLERTON 1988)











associadas








20




























al 2007)

21






























22


















MENEZES 1996)








MENEZES 1996)



23



1984 CARROLL 1986)




























24































25













estudados















26































27
















381 Marcadores RAPD













28





autopareamento


























29
























382 Marcadores ITS





30































31













32























33





























34






















FONTE O autor



35












Glicose 20g

Peptona 1g


36




Aacutegar 150g







Batata 2000g

Dextrose 100g

Aacutegar 150g






37


NaNO3 60g

KH2PO4 15g

KCl 05g

MgSO47H2O 05g

FeSO4 002g

ZnSO4 002g

Glicose 100g

Peptona 20g




Aacutegar 150g






Glicose 20g

Peptona 1g

Agar 15g




38







435 Fenol Saturado












Glicerina 200 g

39




















40



Biotina 02 mg

Piridoxina 500 mg

Riboflavina 1000 mg

Tiamina 500 mg














41



EDTA pH 80 10 mM


EDTA pH 80 250 mM

NaCl 2500 mM

SDS (pv) 1




Glicerol 1035 mL



Trizma base 54g


EDTA 465g




42

44 Isolamento






planta Temperatura






FONTE O autor
















43






















placa de Petri




44


















4degC






45

















hora





482 RAPD





46




























1988)

47



2005)





Ribossomal




FONTE O autor








minutos a 72degC


48












horas













49








DNA megaBACE






ITS4 (TABELA 5)

FONTE O autor




a 8degC





50











45 minutos a 60degC















51













anteriores













52




FONTE O autor


491 Cultura Pareada





53












colocircnias




pela foacutermula









Dc -Dt

Dc


54














horas)











55











FIGUEIREDO 2006)








56


51 Isolamento













1 Folha 360 140 (39) 0 (0) 0

2 Folha 540 310 (57) 2 (064) 037

3 Folha 360 375 (gt100) 3 (08) 083

TOTAL FOLHA

1260 825 (65) 5 (061) 04

4 Peciacuteolo 160 180 (gt100) 16 (89) 100








57
















2004)















58



























bege

59
















meios utilizados


AV MEA BDA

M

U 0

123

S

M97

13

60



SM

9631

SM

9638

AT

9811

A

T990

6

AT9

810

SM

9714

AV MEA BDA

61


A32

1

A

132

A21

5A

A

113

A

323

A13

1

AV MEA BDA

62


A

135

A11

6

A

115B

A

124

A12

6

A21

6 B

AV MEA BDA

63


A

134

A33

3A

A

334

A12

3

A33

3B

AV MEA BDA

64


E

S2N

A1

E

SIE1

ES

GA

1

ES8

0J

E

SPA

C22

ES2

WF1

AV MEA BDA

65


ESFB

2

ESJ

D1

ESK

D1

E

SJH

1

ESD

F1

E

S2A

B1

AV MEA BDA

66


E

S2K

F1

ESJ

E2

ESJ

E1

ESG

F1

ESF

H1

ESF

F1

AV MEA BDA

67


ESB

A1

ESI

A1

ES

RD

1

E

S2W

C1

ESS

D1

ES

JG1

AV MEA BDA

68

















PH

O19

P

lon

gico

lla (P

HO

1) AV MEA BDA

69










FONTE O autor

000

100

200

300

400

500

600

700

800

EB A F HD G C



Diacirc

met

ro e

m c

m

70








dos isolados






FONTE O autor

000

100

200

300

400

500

600

700

B A FEC D



Diacirc

met

ro e

m c

m

71












000

100

200

300

400

500

600

700

B A F C GD E

FONTE O autor

Diacirc

met

ro e

m c

m

72




























incubaccedilatildeo



73




















FONTE O autor


A B C

74













1 2 A

B C D

E


FONTE O autor

75












0

5

10

15

20

25

30

35

40


a

b

c

cd

de

ef

efg

fgh

fghi

ghij

ghil

hil

him

im

m

FONTE O autor

Diacirc

met

ro e

m μ

M

76





























estudadas

77













FONTE O autor

r = 07577 (P= 00001)

V VI

IV

I II III

78









Figuras 13 a 16

79

FIG

UR

A 1

4 P

ER

FIL

DE

AM

PLI

FIC

ACcedil

AtildeO

CO

M O

OLI

GO

NU

CLE

OTIacute

DE

O O

PX

14 D

OS

ISO

LAD

OS

EN

DO

FIacuteTI

CO

S D

E P

hom

opsi

s sp

E

GR

UP

O E

XTE

RN

O P

esta

lotio

psis

FIG

UR

A 1

3 P

ER

FIL

DE

AM

PLI

FIC

ACcedil

AtildeO

CO

M O

OLI

GO

NU

CLE

OTIacute

DE

O O

PX

11 D

OS

ISO

LAD

OS

EN

DO

FIacuteTI

CO

S D

E P

hom

opsi

s sp

E

GR

UP

O E

XTE

RN

O P

esta

lotio

psis

80

FIG

UR

A 1

5 P

ER

FIL

DE

AM

PLI

FIC

ACcedil

AtildeO

CO

M O

OLI

GO

NU

CLE

OTIacute

DE

O O

PX

19 D

OS

ISO

LAD

OS

EN

DO

FIacuteTI

CO

S D

E P

hom

opsi

s sp

E

GR

UP

O E

XTE

RN

O P

esta

lotio

psis

FIG

UR

A 1

6 P

ER

FIL

DE

AM

PLI

FIC

ACcedil

AtildeO

CO

M O

OLI

GO

NU

CLE

OTIacute

DE

O O

PE

08 D

OS

ISO

LAD

OS

EN

DO

FIacuteTI

CO

S D

E P

hom

opsi

s sp

E

GR

UP

O E

XTE

RN

O P

esta

lotio

psis

81























12)








82






FONTE O autor

I II

III IV V VI VII

GRUPO EXTERNO

r= 08157 (p=00001)

100

83
















espeacutecie







espeacutecie








84










2006)


FONTE O autor

85







(FIGURA 19)






S12

















86


ESIA1

A321

A113

A131


P michaellae


ESRD1

ESJE2

ESKD1

Phomopsis sp S1


A334

A323Phomopsis sp S8










PHO19



P sojae



SM9713

P longicolla PHO1

MU0123

P longicolla

A126





ES2AB1






ES2KF1

ES2WF1

ESPAC22

Phomopsis sp S4




SM9638

ESFH1





P theicola


99

99

3599

98

91

7786

78

75

73

2973

5

5

3

2

11

71

70

25

22

33

40

67

63

33

44

65

41

34

29

27

21

21

18

13

12

8

7

5

3

3

0

0

0

19

32

23

31

87














A113


ESIA1


A131

A133

P michae liae

A124

A334

ESGA1


98

62252719

0005

88






























89








hospedeira























90






























91



























92




























93






6 7 8 e 9)



















Phomopsis A134

G Citricarpa PC1396

Phomopsis SM9713

G Citricarpa PC1396


G Citricarpa PC1396

Fungicida Derosal

FONTE O autor

94















FONTE O autor


95






























96













G citricarpa PC3305

Phomopsis ESRD1

Phomopsis ESDF1

G citricarpa PC3305


Fungicida Derosal

G citricarpa PC3305

FONTE O autor

97



















98


















a b c d

99















FONTE O autor

C

D E F

A B



100











C

D E F

A B

101








Metanoacutelico






102


FONTE O autor














fitopatogecircnicas







103






citricarpa























104












P michaeliae




michaeliae







105






avaliadas

106


107


108


109


110


111


112


113


114


115


116


117


118


119


120


121


122


123


124


125

ANEXOS






BDA 5169935 a MEA 4973856 b AV 3921569 c

CV = 62



126






127




128






129




130






131




132







133


DMS = 259444 CV = 1052904



134








DMS = 039023 CV = 1340825

135







DMS = 046460 CV = 1946824



136








DMS = 050157 CV = 1809416

137


ANOVA






138


DMS = 070465 CV = 1983267



139







140


DMS = 033193 CV = 1095343



141


ANOVA





142


DMS = 069970 CV = 1193907



43

ANE

XO

12

ndash M

ATR

IZ D

E D

AD

OS

PA

RA

CA

RA

CTE

RIZ

ACcedil

AtildeO

CR

ITEacuteR

IOS

ME

DID

AS

ME

IOS

DE

C

ULT

UR

A

MU

0123

SM

9631

SM

9638

SM

9713

SM

9714

AT9

810

AT9

811

AT9

906

ES

2AB

1

ES

2KF1

ES2N

A1

ES2W

C1

ES2W

F1

ES

80J

ESBA

1

ESD

F1

ES

FB2

ES

FF1

ESFH

1

ES

GA

1

ESG

F1

ESIA

1

ESIE

1

ESJD

1

ESJE

1

ESJE

2

1 AV 1 0 1 0 0 1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 1 MEA 0 1 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 1 1 1 0 0 0 1 0 0 1 0 1 BDA 1 1 1 1 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 1 1 1 0 0 0 1 1 0 1 1 0

2 AV 1 1 1 1 0 1 1 1 0 0 1 0 1 1 1 0 0 0 1 1 0 0 1 1 1 1 3 AV 0 0 0 0 1 0 0 1 1 1 0 1 0 0 0 1 1 1 0 0 1 1 0 0 0 0 4 AV 1 0 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

MEA 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 BDA 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

5 AV 0 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 MEA 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 BDA 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

6 AV 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 MEA 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1 0 BDA 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1

7 AV 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 MEA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 BDA 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 0 0

8 AV 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 0 0 MEA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 1 0 0 0

9 AV 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 MEA 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 0 1 0 0 0 0 1 BDA 1 0 1 1 0 1 0 1 0 1 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 1

10 AV 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 MEA 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 BDA 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1

11 MEA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

12 MEA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

13 AV 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 MEA 0 0 1 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 BDA 0 0 1 0 1 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0

14 AV 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 MEA 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 0 1 0 0

44

BDA 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 1 0 1 1 1 0 0 1 1 15 AV 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

MEA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0

16 AV 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 MEA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 0 0

17 AV 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 MEA 1 0 1 1 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 BDA 1 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0

18 AV 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 MEA 0 1 0 0 1 0 1 0 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 BDA 0 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 1

19 AV 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 MEA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0

20 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 21 AV 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 0 0 1 1 0 1 0 1 1 1 0 0 1 1 1 1

MEA 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 0 0 1 1 0 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 0 BDA 1 1 0 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0

22 AV 1 1 0 1 1 1 0 1 0 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 MEA 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 BDA 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

23 352 a 353μM BDA 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 297 μM BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0



126 a 123 μM BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 119 μM BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0


97 a 85μM BDA 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 24 733 a 700cm MEA 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0


45



300cm BDA 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 233cm BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 700cm AV 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0


CR

ITEacuteR

IOS

ME

IOS

DE

C

ULT

UR

A

ES

JG1

ES

JH2

ES

KD

1

ES

PA

C22

ES

RD

1

ES

SD

1

A131

A126

A123

A323

A113

A334

A321

A216

B

A135

A115

B

A124

A116

A215

A

A132

A333

A

A333

B

A134

P l

ongi

colla

PH

O19

1 AV 0 0 1 1 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 1 0 0 MEA 0 0 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 0 1 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 BDA 0 0 1 1 1 1 1 0 0 1 1 0 1 1 0 1 0 1 1 1 0 0 0 0 0

2 AV 0 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 3 AV 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 4 AV 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1

MEA 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 BDA 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1

5 AV 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 MEA 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0

6 AV 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 MEA 1 1 0 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 BDA 1 0 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1

7 AV 1 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0

46

MEA 0 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 BDA 0 1 0 1 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0

8 AV 0 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 MEA 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 1 1 BDA 0 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 0 0 0 1 0 1 0 0 1 1

9 AV 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 0 0 0 MEA 0 0 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 1 1 0 0 0 1 1 0 0 BDA 1 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 1 1 1 0 1 1 1 0 0 0 1 1 0 0

10 AV 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 MEA 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 BDA 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

11 MEA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

12 MEA 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0

13 AV 0 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 0 1 1 1 MEA 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 BDA 0 1 1 0 1 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1

14 AV 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 MEA 1 1 0 1 1 1 1 0 1 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 0 BDA 0 1 0 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 0 1 0 0 1 0 1 0 1 0

15 AV 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 MEA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 BDA 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0

16 AV 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 MEA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0

17 AV 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 MEA 0 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 BDA 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0

18 AV 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 MEA 1 0 1 1 0 1 0 1 0 1 0 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1 0 1 1 BDA 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

19 AV 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 MEA 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 BDA 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0

20 ESP 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 21 AV 1 1 0 0 0 1 0 1 1 1 0 0 0 1 0 1 0 0 1 0 1 1 0 0 1

MEA 1 1 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 0 1 1 0 0 1 1 0 1 1 0 0 1 BDA 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 0 0

22 AV 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 MEA 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1

47

BDA 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 23 352 a 353μM BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

297 μM BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 195 a 193 μM BDA 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0



126 a 123 μM BDA 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 1 0 1 0 0 119 μM BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0


97 a 85μM BDA 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 24 733 a 700cm MEA 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0



300cm BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 233cm BDA 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 700cm AV 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0



48








LISTA DE FIGURAS














































LISTA DE TABELAS

















LISTA DE ANEXOS























141




2 OBJETIVOS 3



























431 Clorofane 38

432 Clorofil 38








Gibco) 39














44 Isolamento 42






1995) 44

482 RAPD 45





















51 Isolamento 56



531 RAPD 78








ANEXOS 125

1






























2



























isolados

3

2 OBJETIVOS










DNA ribossomal



4





















al 2000)








5



1993 CLAY 2004)





na semente






















6






2001)




















e S cerevisae





7



















frequumlecircncia








8































9




























10






















(WANG et al 2000)






11






























12






























13






























14























antifuacutengicos






15































16






(BITTENCOURT 2001)















2004)






17













prostaglandinas














18



























19


(SIVANESAN 1984)










FULLERTON 1988)











associadas








20




























al 2007)

21






























22


















MENEZES 1996)








MENEZES 1996)



23



1984 CARROLL 1986)




























24































25













estudados















26































27
















381 Marcadores RAPD













28





autopareamento


























29
























382 Marcadores ITS





30































31













32























33





























34






















FONTE O autor



35












Glicose 20g

Peptona 1g


36




Aacutegar 150g







Batata 2000g

Dextrose 100g

Aacutegar 150g






37


NaNO3 60g

KH2PO4 15g

KCl 05g

MgSO47H2O 05g

FeSO4 002g

ZnSO4 002g

Glicose 100g

Peptona 20g




Aacutegar 150g






Glicose 20g

Peptona 1g

Agar 15g




38







435 Fenol Saturado












Glicerina 200 g

39




















40



Biotina 02 mg

Piridoxina 500 mg

Riboflavina 1000 mg

Tiamina 500 mg














41



EDTA pH 80 10 mM


EDTA pH 80 250 mM

NaCl 2500 mM

SDS (pv) 1




Glicerol 1035 mL



Trizma base 54g


EDTA 465g




42

44 Isolamento






planta Temperatura






FONTE O autor
















43






















placa de Petri




44


















4degC






45

















hora





482 RAPD





46




























1988)

47



2005)





Ribossomal




FONTE O autor








minutos a 72degC


48












horas













49








DNA megaBACE






ITS4 (TABELA 5)

FONTE O autor




a 8degC





50











45 minutos a 60degC















51













anteriores













52




FONTE O autor


491 Cultura Pareada





53












colocircnias




pela foacutermula









Dc -Dt

Dc


54














horas)











55











FIGUEIREDO 2006)








56


51 Isolamento













1 Folha 360 140 (39) 0 (0) 0

2 Folha 540 310 (57) 2 (064) 037

3 Folha 360 375 (gt100) 3 (08) 083

TOTAL FOLHA

1260 825 (65) 5 (061) 04

4 Peciacuteolo 160 180 (gt100) 16 (89) 100








57
















2004)















58



























bege

59
















meios utilizados


AV MEA BDA

M

U 0

123

S

M97

13

60



SM

9631

SM

9638

AT

9811

A

T990

6

AT9

810

SM

9714

AV MEA BDA

61


A32

1

A

132

A21

5A

A

113

A

323

A13

1

AV MEA BDA

62


A

135

A11

6

A

115B

A

124

A12

6

A21

6 B

AV MEA BDA

63


A

134

A33

3A

A

334

A12

3

A33

3B

AV MEA BDA

64


E

S2N

A1

E

SIE1

ES

GA

1

ES8

0J

E

SPA

C22

ES2

WF1

AV MEA BDA

65


ESFB

2

ESJ

D1

ESK

D1

E

SJH

1

ESD

F1

E

S2A

B1

AV MEA BDA

66


E

S2K

F1

ESJ

E2

ESJ

E1

ESG

F1

ESF

H1

ESF

F1

AV MEA BDA

67


ESB

A1

ESI

A1

ES

RD

1

E

S2W

C1

ESS

D1

ES

JG1

AV MEA BDA

68

















PH

O19

P

lon

gico

lla (P

HO

1) AV MEA BDA

69










FONTE O autor

000

100

200

300

400

500

600

700

800

EB A F HD G C



Diacirc

met

ro e

m c

m

70








dos isolados






FONTE O autor

000

100

200

300

400

500

600

700

B A FEC D



Diacirc

met

ro e

m c

m

71












000

100

200

300

400

500

600

700

B A F C GD E

FONTE O autor

Diacirc

met

ro e

m c

m

72




























incubaccedilatildeo



73




















FONTE O autor


A B C

74













1 2 A

B C D

E


FONTE O autor

75












0

5

10

15

20

25

30

35

40


a

b

c

cd

de

ef

efg

fgh

fghi

ghij

ghil

hil

him

im

m

FONTE O autor

Diacirc

met

ro e

m μ

M

76





























estudadas

77













FONTE O autor

r = 07577 (P= 00001)

V VI

IV

I II III

78









Figuras 13 a 16

79

FIG

UR

A 1

4 P

ER

FIL

DE

AM

PLI

FIC

ACcedil

AtildeO

CO

M O

OLI

GO

NU

CLE

OTIacute

DE

O O

PX

14 D

OS

ISO

LAD

OS

EN

DO

FIacuteTI

CO

S D

E P

hom

opsi

s sp

E

GR

UP

O E

XTE

RN

O P

esta

lotio

psis

FIG

UR

A 1

3 P

ER

FIL

DE

AM

PLI

FIC

ACcedil

AtildeO

CO

M O

OLI

GO

NU

CLE

OTIacute

DE

O O

PX

11 D

OS

ISO

LAD

OS

EN

DO

FIacuteTI

CO

S D

E P

hom

opsi

s sp

E

GR

UP

O E

XTE

RN

O P

esta

lotio

psis

80

FIG

UR

A 1

5 P

ER

FIL

DE

AM

PLI

FIC

ACcedil

AtildeO

CO

M O

OLI

GO

NU

CLE

OTIacute

DE

O O

PX

19 D

OS

ISO

LAD

OS

EN

DO

FIacuteTI

CO

S D

E P

hom

opsi

s sp

E

GR

UP

O E

XTE

RN

O P

esta

lotio

psis

FIG

UR

A 1

6 P

ER

FIL

DE

AM

PLI

FIC

ACcedil

AtildeO

CO

M O

OLI

GO

NU

CLE

OTIacute

DE

O O

PE

08 D

OS

ISO

LAD

OS

EN

DO

FIacuteTI

CO

S D

E P

hom

opsi

s sp

E

GR

UP

O E

XTE

RN

O P

esta

lotio

psis

81























12)








82






FONTE O autor

I II

III IV V VI VII

GRUPO EXTERNO

r= 08157 (p=00001)

100

83
















espeacutecie







espeacutecie








84










2006)


FONTE O autor

85







(FIGURA 19)






S12

















86


ESIA1

A321

A113

A131


P michaellae


ESRD1

ESJE2

ESKD1

Phomopsis sp S1


A334

A323Phomopsis sp S8










PHO19



P sojae



SM9713

P longicolla PHO1

MU0123

P longicolla

A126





ES2AB1






ES2KF1

ES2WF1

ESPAC22

Phomopsis sp S4




SM9638

ESFH1





P theicola


99

99

3599

98

91

7786

78

75

73

2973

5

5

3

2

11

71

70

25

22

33

40

67

63

33

44

65

41

34

29

27

21

21

18

13

12

8

7

5

3

3

0

0

0

19

32

23

31

87














A113


ESIA1


A131

A133

P michae liae

A124

A334

ESGA1


98

62252719

0005

88






























89








hospedeira























90






























91



























92




























93






6 7 8 e 9)



















Phomopsis A134

G Citricarpa PC1396

Phomopsis SM9713

G Citricarpa PC1396


G Citricarpa PC1396

Fungicida Derosal

FONTE O autor

94















FONTE O autor


95






























96













G citricarpa PC3305

Phomopsis ESRD1

Phomopsis ESDF1

G citricarpa PC3305


Fungicida Derosal

G citricarpa PC3305

FONTE O autor

97



















98


















a b c d

99















FONTE O autor

C

D E F

A B



100











C

D E F

A B

101








Metanoacutelico






102


FONTE O autor














fitopatogecircnicas







103






citricarpa























104












P michaeliae




michaeliae







105






avaliadas

106


107


108


109


110


111


112


113


114


115


116


117


118


119


120


121


122


123


124


125

ANEXOS






BDA 5169935 a MEA 4973856 b AV 3921569 c

CV = 62



126






127




128






129




130






131




132







133


DMS = 259444 CV = 1052904



134








DMS = 039023 CV = 1340825

135







DMS = 046460 CV = 1946824



136








DMS = 050157 CV = 1809416

137


ANOVA






138


DMS = 070465 CV = 1983267



139







140


DMS = 033193 CV = 1095343



141


ANOVA





142


DMS = 069970 CV = 1193907



43

ANE

XO

12

ndash M

ATR

IZ D

E D

AD

OS

PA

RA

CA

RA

CTE

RIZ

ACcedil

AtildeO

CR

ITEacuteR

IOS

ME

DID

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