Prosiding Seminar Perhimpunan Bioteknologi Pertanian Indonesia81

Perkembangan Awal Jaringan Beberapa Tanaman

Perkebunan setelah Transformasi DNAmelalui Agrobacterium

Djoko Santoso, Tetty Chaidamsari, dan Asmini Budiani

Unit Penelitian Bioteknologi Perkebunan, Bogor

ABSTRAK

Agrobacterium merupakan alat yang penting bagi bioteknologi tanaman karena T-DNAyang dibawanya dapat masuk ke dalam sel tanaman dan diintegrasikan dengan genomset inang. Dengan kapasitas ini, T-DNA dapat digunakan untuk mentransformasi gen kedalam tanaman maupun memutasi gen tanaman. Untuk tujuan transformasi, sifatmutagenik dari T-DNA dapat merugikan karena meskipun melalui proses rekombinasihomologous, mutasi oleh insersi T-DNA terjadi secara acak. Terhadap beberapatanaman perkebunan, transformasi DNA melalui Agrobacterium ini ternyata memberikanpengaruh yang tetap pada perkembangan jaringan tertentu suatu tanaman dan berbedaantara tanaman yang satu dengan yang lainnya. Pada daun tembakau, perkembanganjaringan transforman relatif sama dengan jaringan kontrol, demikian juga pada petalkakao. Pada daun teh, jaringan transforman yang tumbuh menjadi kalus selalu diikutioleh terbentuknya zat kental seperti senyawa mucilage yang menyelimuti kalus tersebut.Sedangkan pada kopi, daun transforman tumbuh lebih lambat daripada daun kontrol.

Kata kunci. Transformasi DNA, Agrobacterium, tanaman perkebunan, perkembanganjaringan.

ABSTRACT

Agrobacterium is an important tool in plant biotechnology because it is able to transferand integrate the T-DNA into the plant cell genome. With this capability, it is often utilizedfor gene transformation as well as mutation of plant cell. Genomic insertion by T-DNAthrough homologous recombination is indicated to occur randomly, therefore, themutagenic character of T-DNA is disadvantageous to transformation purposes.Agrobacterium mediated DNA transformation of several estate crops resulted in specificside effects to the development of transgenic tissues of each estate crops were tested.Development of transgenic leaves of tobacco carrying GUS gene construct was similar tothat of the untransformed leaves. This developmental similarity was also observed incocoa petals. The development of DNA transformed tea leaves to calli always producedmucilage like compound covering the calli. The growth of transgenic leaves of coffee tocalli were slower than that of the non transgenic leaves.

Key words: DNA transformation, Agrobacterium, estate crops, development of planttissues.

82Santoso et aL: Perkembangan AwalJaringan Beberapa Tanaman Perkebunan

PENDAHULUAN

Transformasi DNA ke dalam sel tanaman umumnya dilakukan dengan meng-gunakan biolistik atau melalui perantaraan Agrobacterium.'Car a pertama memilikiefisiensi transformasi yang relatif lebih tinggi dan aplikasinya luas. Namun demikian,biolistik memerlukan peralatan dan bahan yang mahal. Untuk transformasi gen kedalam tanaman dikotil cara kedua lebih disukai karena biayanya relatif murah.Kemampuan Agrobacterium untuk mentransfer DNA ke dalam tanaman pada intinyadibawa oleh plasmid Ti yang dimilikinya. Melalui mekanisme yang melibatkanbeberapa macam protein virulensi, T-DNA dari plasmid Ti masuk ke dalam seltanaman yang terinfeksi dan diintegrasikannya ke dalam kromosom sel inang.

Menurut Tinland (1996) integrasi T-DNA ke dalam DNA tanaman inang terjadimelalui proses rekombinasi homologous. Proses ini diawali oleh komplementasiantara ujung 3' dari T-DNA dengan rentangan urutan basa yang homologous (RUBH)dari DNA tanaman. Dengan demikian, tempat penyisipan T-DNA pada DNA tanamanadalah tertentu, yaitu pada daerah DNA yang memiliki RUBH. Data analisiskromosom beberapa jenis tanaman menunjukkan bahwa integrasi T-DNA ini terjadisecara acak, semua kromosom mempunyai kemungkinan yang sama untuk

menerima insersi T-DNA (Ambros etal, 1986). Dari kedua informasi ini dapat ditarikpengertian bahwa integrasi T-DNA pada genom tanaman terjadi secara spesifikterbatas. T-DNA dapat berintegrasi dengan baik hanya pada daerah DNA tanamanyang memiliki RUBH. Namun demikian, bagian genom yang memiliki RUBH initerdapat cukup banyak pada DNA tanaman dan menyebar ke seluruh kromosomnya.

Berdasarkan pengertian ini diduga bahwa mutasi yang disebabkan oleh insersi T-DNA juga terjadi secara spesifik terbatas, demikian juga dampaknya yang teramati.Masuknya T-DNA ke dalam DNA tanaman yang terjadi secara rekombinasihomologous, menyebabkan ada bagian DNA tanaman yang hilang disubstitusi oleh T-DNA tersebut. Peristiwa ini menyebabkan mutasi yang relatif stabil. Meskipun jikaterjadi T-DNA kemudian ditolak oleh sel inang, DNA tanaman tetap kehilangan bagianyang pernah disubstitusi oleh T-DNA. Mutasi oleh insersi T-DNA ini memilikikecenderungan untuk terjadi pada bagian DNA inang yang secara aktiflitranskripsikan (Koncz et al, 1989). Konsekuensi dari termutasinya gen aktif ini

mutasi oleh T-DNA akan memberikan perubahan yang mungkin teramati.

Tulisan ini menyajikan hasil penelitian untuk mempelajari pengaruh transformasiDNA melalui Agrobacterium terhadap perkembangan awal jaringan beberapatanaman perkebunan. Keberhasilan transformasi ditetapkan dengan menentukanaktivitas GUS yang gennya dibawa oleh vektor. Sedangkan perkembangan jaringantransforman pada media diamati secara visual. Komparasi dilakukan terhadap

jaringan kontrol yang tidak ditransformasi.

Prosiding Seminar Perhimpunan Bioteknologi Pertanian Indonesia83

BAHAN DAN METODE

Bahan

Empat bahan tanaman yang digunakan dipelihara di rumah kaca. Tanamantembakau klon Kentucky diperoleh dari Dr. Sonny Harsono, PAU Bioteknologi IPBBogor. Kopi klon BP358 dan kakao klon DR1 diperoleh dari Puslit Kopi dan KakaoJember. Teh klon Gambung 5 diperoleh dari Puslit Teh dan Kina Gambung.Agrobacterium strain EHA 105 yang membawa gen GUS di dalam konstruksi vektorpGPTV-Kan diperoleh dari Dr. Douglas Furtek, Pennsylvania State University, USA.

Acetosyringone dibeli dari Aldrich Chem. Co. (USA), media kultur jaringantanaman, media untuk kultur bakteri, X-glucuronide cyclohexylammonium salt (X-

Gluc), karbenisilin, kanamisin sulfate, moxalactam dari GibcoBRL atau Sigma Chem.Co. (USA). Bahan kimia lainnya dibeli dari Merck (Jerman).

Metode

Kultur Jaringan

Setelah dicuci, eksplan yang diambil dari rumah kaca maupun kebun direndamdi dalam larutan dithane 0,05% selama 20 menit. Setelah dicuci menggunakanakuades steril, eksplan tersebut direndam di dalam larutan kaporit 0,5% selama 20menit kemudian dibilas dengan akuades steril sebanyak tiga kali. Pada jaringantanaman tembakau, eksplan daun yang telah disterilkan tersebut ditanam padamedia MS padat yang mengandung 0,5 mg/1 BAP untuk induksi embriogenesis.Planlet yang tumbuh pada media ini kemudian dipindah ke media MS tanpa hormonuntuk induksi akar (Santoso, 1995).

Pada jaringan tanaman perkebunan, eksplan yang telah disterilisasi tersebutditanam pada media MI padat yang mengandung 2,4-D dan kinetin masing-masingsebanyak 1 mg/1 dan 0,25 mg/1 untuk teh (Lopez-Baez etai, 1993) dan 4,5 mg/1 dan 9mg/1 untuk kopi (Sumaryono dan Tahardi, 1993). Kultur dilakukan di ruangan yangkondisinya terkontrol yaitu 27C dengan periode penyinaran selama 16 jam dan gelapselama delapan jam. Subkultur jaringan dilakukan secara periodik pada setiap 4-6minggu dengan memindahkannya pada media segar dengan komposisi nutrien yang

sama.

Transformasi

Transformasi DNA ke dalam sel tanaman pekebunan ini dilakukan menggunakan metode Mathis dan Hinchee (1994) dengan sedikit modifikasi. KoloniAgrobacterium .EHA105 yang telah membawa vektor transformasi ditumbuhkan didalam medium 523 cair (Rodriguez dan Trait, 1983) pada suhu 27C dengan

g4Santoto et aL: Perkembangan Awal Jaringan Beberapa Tanaman Perkebunan

HASIL DAN PEMBAHASAN

Media MI ini sebenamya dirancang oleh Lopez-Baez et al. (1993) untukmengkultur kelopak bunga kakao. Namun demikian, media ini temyata dapat lebihcepat menginduksi kalus dari daun kopi maupun teh daripada media yang lainnya(Sumaryono dan Tahardi, 1993). Pada media MI kalus dari daun kopi dan dari daunteh dapat terbentuk hanya dalam waktu satu minggu, yang berarti 3-4 kali lebih cepatdari pada media lainnya. Diperkirakan komponen media yang membuat jaringantanaman lebih responsif di antaranya adalah asam amino. Adanya beberapa asamamino di dalam media dapat menghemat energi untuk biosintesis dan menyediakansecara langsung komponen untuk pertumbuhan sel.

Untuk keperluan transformasi DNA keprimaan dan keresponsifan eksplan untukberkembang di media kultur merupakan salah satu kunci keberhasilan transformasidan regenerasi tanaman transgeniknya (Mathis dan Hinchee, 1994; Gadner, komuni-kasi pribadi). Dengan demikian, terbukti bahwa media MI memberikan keresponsifan yang tinggi bagi jaringan tanaman kopi, teh, dan kakao sehingga mendorong kamiuntuk melakukan transformasi langsung menggunakan eksplan segar tanamantersebut, bukan kultur kalus atau sel yang telah mapan.

kecepatan pengocokan 200 rpm selama semalam atau hingga OD pada 660mencapai 1,0. Kultur bakteri ini kemudian diencerkan dengan cara menambahkanmedia cair segar sebanyak dua volume. Kultur dilanjutkan selama tiga jam padakondisi yang sama.. V • ^

Di dalam erlenmeyer yang berisi medium MS cair (Murashige dan Skoog, 1962)tanpa atau dengan 100 pg asetosiringon (Sain et ai, 1994), eksplan steril diinokulasidengan kultur cair Agrobacterium sebanyak 0,1-1 volume selama 15 menit pada suhu27C. Setelah dikeringkan menggunakan kertas saring steril, eksplan diko-kultivasiselama empat hari pada medium MS padat mengandung asetosiringon dan tanpaantibiotika. Jika terlihat Agrobacterium mendominasi pertumbuhan, eksplan dicucidengan akuades steril untuk menghilangkan bakteri tersebut. Setelah pencuciandalam media cair yang mengandung karbenisilin atau moxalactam 250 mg/1, eksplantersebut ditanam pada media seleksi yang mengandung 50-100 mg/1 kanamisin.Perkembangan eksplan setelah transformasi dilakukan pada media seleksi ini.

Pengujian Aktivitas GUS

Ekspresi transien dari gen reporter GUS pada jaringan yang telah diinokulasidengan Agrobacterium ditentukan dengan menguji aktivitas GUS secara histokimiawi(Castle dan Morris, 1994). Reaksi pengujian dilakukan pada 37C selama 24 jam atauhingga terbentuk bercak wama biru pada jaringan uji.

85Prosiding Seminar Perhimpunan Bioteknologi Pertanian Indonesia

Gambar 1. Pengujian histokimiawi dari aktivitas GUS setelah transformasi DNA pada beberapa tanaman perkebunan. Panel A, B, C, dan D masing-masing adalah jaringan dari tanaman tembakau, teh, kopi, dankakao. Angka 1 pada masing-masing panel menunjukkan jaringan kontrol yang tidak diinokulasisedangkan angka 2 menunjukkan jaringan transforman yang telah diinokulasi dengan Agrobacterium.

Secara bertahap analisis terhadap keberhasilan awal dari percobaan transfor-

masi DNA umumnya dilakukan melalui dua tahapan yaitu menguji apakah DNA yangditransformasikan dapat masuk ke dalam sel target dan ekspresi dari gen uji. Untuk

tujuan efisiensi, analisis hasil transformasi dari penelitian ini dilakukan langsungdengan menguji ekspresi transien GUS sebagai gen reporter. Uji ekspresi inidilakukan dengan cara menetapkan aktivitas GUS secara histokimiawi. Hasilpengujian aktivitas GUS pada jaringan tanaman perkebunan yang telah ditransformasitertera pada Gambar 1. Adanya bercak warna biru pada setiap jaringan transformanmenunjukkan bahwa gen reporter GUS yang ditransformasikan telah masuk dandiekspresikan di dalam sel dari jaringan tanaman tersebut. Intensitas dan corak

bercak biru tersebut tidak sama untuk setiap jaringan transforman. Pada dauntembakau, corak biru tersebut terang dan tajam. Keterangan dan ketajaman corak

biru pada daun kopi berada sedikit di bawah daun tembakau. Wama biru pada daunteh lebih gelap. Sedangkan pada kelopak bunga kakao, wama biru tersebut agak

gelap dan kurang tajam.

86Santoso et aL; Perkembangan Awal Jaringan Beberapa Tanaman Perkebunan

ambar 2. Perkembangan daun tembakau kontrol dan transforman pada media kultur. Panel A adalah planletdari daun kontrol dan panel B planlet dari dauntransforman.

Perbedaan corak wama biru pada masing-masing jaringan tanaman uji inimungkin disebabkan oleh kombinasi dari dua hal yaitu: (1) Perbedaan jumlahaktivitas GUS yang mungkin secara kuantitas karena adanya perbedaan tingkatekspresi GUS atau karena adanya perbedaan aktivitas individu- GUS pada setiapjaringan yang disebabkan oleh keadaan Iingkungan yang berlainan, dan (2) Perbedaan latar belakang wama dari jaringan. Pada daun tembakau transforman, aktivitas GUS sangat tinggi dan latar belakang wama jaringan relatif terang. Sedangkanpada jaringan yang lainnya aktivitas lebih rendah dan latar belakang wama jaringanrelatif lebih gelap.

Perkembangan Jaringan Transforman

Selain oleh gen yang dibawa oleh T-DNA, perubahan yang terjadi akibat trans-formasi DNA melalui Agrobacterium dapat disebabkan oleh insersi T-DNA. Perubahanoleh transformasi ini dievaluasi berdasarkan perkembangan jaringan transformanpada media kultur seleksi.

Tembakau

Perkembangan awal daun tembakau transforman pada media seleksi yang

mengandung BAP 0,5 mg/1 hampir sama dengan daun tembakau kontrol. Padamedia MS yang mengandung cytokinin tersebut tetapi tanpa antibiotika, daun kontrolmaupun daun transforman dapat membentuk tunas setelah dikultur selama 3-4

minggu. Sedangkan pada media dengan 50-100 mg/1 kanamisin, daun transformanmembentuk tunas setelah dikultur 4-5 minggu dan daun kontrol mati. Pada mediaperakaran, kedua jenis tunas tersebut memiliki perkembangan yang hampir sama(Gambar 2). Akarnya terbentuk setelah 2-3 minggu pada media tanpa hormon.

Gambar 3. Pertumbuhan daun kopi setelah 4 minggu dikulturpada media Ml yang mengandung 4,5 mg/1 2,4-D

* '•-, ; •dan 9 mg/1 kinetin. Panel A adalah daun kopikontrol yang tidak diinokulasi dengan Agrobac-terium sedangkan panel B yang diinokulasi.

Prosiding Seminar Perhimpunan Bioteknologi Pertanian Indonesia37

Perkembangan yang sama antara daun tembakau kontrol dengan daun tem-

bakau transforman mengindikasikan bahwa insersi T-DNA tidak terjadi pada gen-genyang mempengaruhi proses regenerasi daun tembakau. Kemungkinan lainnya adalah

insersi gen-gen tersebut oleh T-DNA sebenarnya telah terjadi, namun dalam kadar

yang relatif rendah. Tembakau (Nicotiana tabacum) adalah tanaman ampliploid, per-silangan alami dari N. sylvertris dan A. tomentosiformis (Akehurst, 1968), sebenamya

memiliki kromosom 4n = 48). Dengan demikian, gen-gen yang dimilikinya memilikijumlah duplikat (copy number) dua kali lebih banyak daripada tanaman ploidi murni(Santoso, 1995). Keadaan apliploid dari tembakau ini menyebabkan mutasi dosistertentu pada gen oleh insersi T-DNA tidak terlalu berpengaruh pada perkembanganjaringan transformannya, karena masih ada gen sejenis yang masih dapat berfungsidengan baik.

Kopi

Perkembangan awal daun kopi transforman lebih lambat daripada daun kopikontrol. Pada media MI yang mengandung 2,4-D dan kinetin masing-masing se-

banyak 4,5 mg/1 dan 9 mg/1, daun kopi kontrol membentuk kalus setelah dua minggu.Dalam 2-4 minggu belum ada kalus yang terbentuk dari daun kopi transforman

(Gambar 3). Perbedaan perkembangan yang nyata antara daun kopi kontrol dengandaun kopi transforman dapat diasumsikan bahwa insersi T-DNA telah memutasi

salah satu gen yang berperan dalam perkembangan eksplan daun kopi menjadikalus. Karena pembentukan kalus ini sering berkaitan dengan adanya hormon auksin

dalam dosis tertentu, asumsi lebih lanjut adalah mutasi menyebabkan eksplantersebut menjadi kurang responsif terhadap hormon pada media kultur.

Santoso et aL: Perkembangan Awal Jaringan Beberapa Tanaman Perkebunan88

Teh

Perkembangan daun teh kontrol berbeda dengan daun teh transforman. Namun

demikian, jenis perbedaannya berlainan dengan yang terjadi pada daun kopi. Padamedia MI yang mengandung 2,4-D dan kinetin masing-masing sebanyak 1 mg/l dan0,25 mg/l, perkembangan kalus dari daun kontrol adalah normal sedangkan daridaun transforman membentuk senyawa kental seperti mucilage (Gambar 4). Dalam

konteks ini mekanisme proses biosintesis mucilage ini sulit untuk dijelaskan. Dalamsistem yang lain senyawa karbohidrat kompleks ini memiliki fungsi antara lain untukmelindungi dari invasi dari luar (Voet dan Voet, 1990). Dalam kasus ini kemungkinanmucilage dari kalus teh tersebut memiliki juga fungsi melindungi dan T-DNA yangmasuk dari Agrobacterium ke dalam sel teh dikenali juga sebagai penyerang.

Kakao

Pada media untuk induksi kalus MI, perkembangan awal kelopak bunga kontroltidak jauh berbeda dengan yang transforman. Setelah di kultur selama 10 hari padamedia tersebut, kalus mulai terbentuk baik dari jaringan kontrol maupun transforman

(data tidak ditunjukkan). Perkembangan selanjutnya dari kultur transforman tersebutkurang begitu baik, kalus terkontaminasi dan mengalami pencoklatan. Pengamatan

secara visual mengindikasikan bahwa kontaminasi disebabkan oleh Agrobacterium.Masalah kontaminasi pada jaringan kelopak bunga kakao transforman tersebutmungkin dapat diatasi dengan melakukan inokulasi menggunakan konsentrasiAgrobacterium yang lebih rendah, pencucian yang lebih baik maupun antibiotika yanglebih kuat.

Gambar4. Perkembangan daun teh kontrol dan transformanpada media Mi yang mengandung 1 mg/l 2,4-0 dan0,25 mg/l kinetin. Panel A adalah kalus yangberkembang dari daun kontrol, panel B kalus daridaun transforman.

DAFTAR PUSTAKA

Akehurst, B.C. 1968. Tobacco. Longmans and Green Co., London, pp. 456.

Ambros, P.F., AJ.M. Matzke, and MA Matzke. 1986. Localization of Agrobacterium

rhizogenes T-DNA in plant chromosomes by in situ hybridization. EMBO J. 5:2073-2077.

Castle, LA and R.O. Morris. 1994. Transient expression assays using GUS constructs and fluorometric detection for analysis of T-DNA transfer. In Gelvin, S.B. and

R.A. Schilperoort (Eds.). Plant molecular biology manual. Kluwer Acad. Pub.,

Dordrecht, pp. B5.

Coates, D., E.W. Taliersio, and S.B. Gelvin. 1987. Chromatin structure of integrated

T-DNA in crown gall tumors. Plant Mol. Biol. 8: 159-168.

Koncz, C, N^Martini, R. Mayerhofer, Z. Konez-Kalman, H. Korber, G.P. Redei, and

J. Schell. 198^. High-frequency T-DNA mediated gene tagging in plants. Proc.Natl. Acad. Sci. USA. 86: 8467-8471.

Prosiding Seminar Perhimpunan Bioteknologi Pertanian Indonesia89

Transformasi DNA ke dalam tanaman perkebunan uji melalui Agrobacteriummemberikan pengaruh yang berbeda terhadap perkembangan jaringan transforman-nya. Ini berarti bahwa mutasi oleh insersi T-DNA pada tanaman tersebut berbeda.

Asumsi bahwa insersi T-DNA ke dalam kromosom sel inang terjadi melalui prosesrekombinasi homologous, memberikan implikasi bahwa RUBH yang mengarahkantempat insersi T-DNA pada kromosom inang adalah berbeda lokasinya antara

tanaman yang satu dengan lainnya. Pada tanaman tembakau RUBH ini tidakterlampau jelas posisinya atau terletak pada intron. Posisi RUBH tanaman tehmungkin pada gen yang mengendalikan biosintesis karbohidrat kompleks, tanamankopi pada gen yang untuk pertumbuhan, dan tanaman kakao pada intron.

KESIMPULAN

Transformasi DNA ke dalam sel/jaringan tanaman perkebunan berkayu, kopi,teh, dan kakao dapat dilakukan melaui Agrobacterium dan memberikan pengaruhyang berbeda pada perkembangan awal jaringan transformannya.

UCAPAN TERIMA KASIH

Penelitian ini dibiayai oleh proyek Riset Unggulan Terpadu dan bekerja samadengan Puslitbang Kimia Terapan-LIPI, Bandung. Ucapan terima kasih disampaikankepada Dr. Asril Damssamin, MSc. dan Ir. Roy H. Trisnamurti, MSc. atas dukungannya

terhadap penelitian ini.

9QSantoso et aL: Perkembangan AwalJaringan Beberapa Tanaman Perkebunan

Lopez-Baez, O., H. Bollon, A. Eskes, and V. Petiard. 1993. Embryogenese somati-

que de cacaoyer Theobroma cacao L a partir de pieces florales. CR Acad. Sci.Paris 316: 579-584..^....

Mathis, N.L and MAW. Hinchee. 1994. Agrobacterium inoculation techniques forplant tissues. In Gelvin, S.B. and R.A. Schilperoort (Eds.). Plant molecular biology

manual. Kluwer Acad. Pub., Dordrecht, pp. B6.

Murashige, T. and F. Skoog. 1962. A revised medium for rapid growth andbioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant 15: 473-498.

Rodriques, R.L. and R.C. Trait. 1983. Recombinant DNA techniques: an

introduction. Brenyamin/Cummings, Menlo Park.

Sain, S.L., K.K. Oduro, and D.B. Furtek. 1994. Genetic transformation of cocoa leaf

cells using Agrobacterium tumefaciens. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 37:243-251.

Santoso, D. 1995. 5-Fluoroorotic acid-selected cell lines and regulation of UMP

synthase gene expression in tobacco cells. PhD Dissertation. Iowa State

University, Ames Iowa (USA).

Sumaryono dan J.S. Tahardi. 1993. Perbanyakan klon kopi robusta toleran nema-

toda melalui embriogenesis somatik langsung. Menara Perkebunan. 61: 50-55.

Tinland, B. 1996. The integration of T-DNA into plant genomes. Trend in PlantScience 1: 178-184.

Voet, D. and J.G. Voet. 1990. Biochemistry. John Wiley and Sons, New York. pp. 57-

314.