MAKALAH BIOANALISIS

METODE ENZIMATIK UNTUK PENENTUAN SELEKTIF 4-AMINOBENZOIC

ACID PADA URIN

Disusun oleh :

Meita Eryanti (098114026)

Defi Krishartantri (098114031)

Melantina Maria (098114035)

Mayke Prasastia (098114037)

E.Raras Pramudita (098114040)

Christiana Lambang K. (098114041)

Kelas : B

Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma

Yogyakarta

2011

PENDAHULUAN

Tujuan penelitian ini adalah untuk menampilkan metode yang lebih baik dalam

determinasi PABA dengan kombinasi teknik enzimatik dan kolorimetri dan membandingkan

metode ini dengan colorimetric assay untuk menghitung konsentrasi PABA total dalam

sampel urin dari pasien yang menjalani test fungsi pancreas dengan bentiromide.

4-amonibenzoic acid (PABA) digunakan sebagai komponen beberapa obat (misalnya

untuk analgesik atau anestesi), senyawa sunscreen, bentiromide (reagen yang digunakan

untuk mendiagnosa fungsi pankreas yang jika dihidrolisis menghasilkan PABA dan bisa

diukur dalam urin), dan sebagai senyawa untuk menguji kadar N-asetilasi dari obat obat

arilamin yang secara klinis biasa digunakan untuk terapi.

Metode untuk mendeterminasi PABA sebenarnya sudah ada (misalnya metode

diazocopling Bratton Marshall dan metode 4-dimetilaminobenzaldehide). Akan tetapi metode

metode tersebut memiliki spesifisitas yang rendah karena metode tersebut didasarkan pada

reaksi yang biasa untuk senyawa amin aromatis. Syarat untuk menggunakan metode tersebut

adalah sampel yang dianalisis menggunakan metode kolorimetri harus bebas dari senyawa

amin aromatis lainnya selain PABA.

FAD dependent monooxygenase, 4-aminobenzoate hydroxylase dimurnikan dan

dikarakterisasi dari jamur Agaricus bisporus. Kemudian enzim tersebut dapat merubah

PABA menjadi 4-hydroxyalanine seperti pada skema berikut:

Enzim mengkatalis dekarboksilasi hidroksilasi PABA dan membentuk 4-

hydroxyaniline dengan adanya NADH dan O2. Hasil reaksinya, HA, bisa diubah ke bentuk

indofenol stabil dengan mengkoplingnya dengan fenol dalam suasana asam. Indofenol itu

yang kemudian dikuantifikasi secara kolorimetri.

METODE PENELITIAN

1. Reagen yang digunakan

Semua bahan yang digunakan ada dalam tingkat analisis. Bahan bahan tersebut

adalah:

4-aminobenzoate hidroksilase dari A. bisporus. Enzim murni yang digunakan

memiliki aktivitas spesifik dari 23 kU / g protein di bawah kondisi pengujian

standar, di mana 1 U mewakili jumlah enzim yang dibutuhkan untuk

mengoksidasi 1 µmol dari PABA per menit

Bentiromide (N-benzoil-L-tyrosyl-4-aminobenzoic acid; 500mg dalam 10 mL

saline) diperoleh dari Eizai Pharmaceutical Co (Osaka, Jepang)

N-(1-naftil) etilendiamina dihidroklorida, FAD, NADH, PABA, dan HA dibeli

dari Sigma Chemical Co (St Louis, MO)

2. Penyiapan sampel urin

Sampel urin dikumpulkan dari 30 pasien yang menjalani tes fungsi pankreas dengan

bentiromide, 11 pasien yang memakai berbagai obat selain bentiromide, dan 10 relawan

yang sehat.

Sampel urin pasien yang disediakan oleh Departemen Laboratorium Kedokteran, Sekolah

Kedokteran, University of Tokushima, dari pasien rawat inap yang dicurigai sakit

pankreas, pencernaan, dan penyakit lainnya

Para pasien menjalani tes fungsi pankreas dengan diberikan oral 500 mg bentiromide

dengan air berlebih (> 200 ml) setelah puasa semalam

Urin dikumpulkan selama 6 jam setelah pemberian bentiromide

Tidak ada makanan atau obat yang diambil selama tes kecuali untuk asupan air

3. Penyiapan ekstrak ragi

Kue yang dipress (ragi roti, berat basah 40 g) dihomogenisasi dengan 100 mL H2SO4

50 mmol / L

Digunakan homogenizer Polytron kecepatan 4000 rpm selama 3 mm pada 0⁰C

(Kinematika, Kriens/Luzern, Swiss)

Homogenat diekstrasi dengan 100 mL etil asetat

Dipisahkan lapisan etil asetat dengan sentrifugasi pada 2000 x g selama 10 menit

Ekstraksi diulangi tiga kali dan pelarut diuapkan

Residu dilarutkan dalam 10 mL buffer potassium fosfat (100 mmol / L, pH 7,0), dan

residu ini digunakan sebagai bahan biologis yang terdiri dari PABA alami dan

arylamines lainnya

4. Persiapan sampel untuk penentuan PABA total

1 mL urin dimasukkan dalam tes tabung srew-capped Pyrex (12 mm x 4,5 cm)

Tambahkan 1 mL KOH 4 mol / L

Panaskan campuran pada 100⁰C selama 2 jam sesuai dengan metode Braganza untuk

memastikan pembebasan PABA dari PABA konjugat tanpa degradasi spontan dari PABA

Hidrolisat dinetralkan dengan menambahkan 0,25 mL asam asetat glasial, diencerkan sampai

25 mL dengan air deionisasi

PABA diukur untuk mengevaluasi spesifisitas dari metode yang diusulkan

5. Metode enzimatik untuk penentuan PABA

0,4 mL larutan sampel yang mengandung 0-250 µmol PABA per liter, ditambahkan 100 µL

(50 mU) dari larutan enzim dan 1 mL dari buffer potassium fosfat 100 mmol/L, pH 7.0

(mengandung FAD 0,17 mmol, NADH 0,75 mmol, dan 0,3 g per liter serum albumin sapi)

Inkubasi campuran pada 30⁰C selama 20 menit, dan ditambahkan 0,6 mL reagen asam

trikloroasetat 200 g/L untuk menguraikan NADH yang tidak bereaksi, sehingga tidak akan

mengganggu pembentukan pewarna indophenols

Setelah 5 menit, tambahkan 0,6 mL reagen kopling: NaOH 0,83 mol/L, fenol 0,2 mol/L, dan

Na2CO3 1,67 mol/L

Inkubasi campuran ini pada 30⁰C selama 20 menit

Ukur pewarna indophenol dihasilkan pada panjang gelombang 630 nm (Menggunakan

spektrofotometer model 200-20; Hitachi Ltd, Tokyo, Jepang) dalam kuvet kuarsa 1 cm dan

suatu blanko enzim

Untuk mempersiapkan blanko enzim, menggunakan 100 µL buffer potassium fosfat (100

mmol/L, pH 7,0) bukan dari larutan enzim 100 µL

Sampel dengan konsentrasi yang lebih besar dari batas yang dinyatakan linearitas harus

diencerkan dengan air deionisasi

6. Penentuan PABA dengan metode Diazo-kopling

Penentuan konsentrasi PABA dengan metode diazo-kopling sesuai prosedur Bratton dan

Marshall sebagai perbandingan

1 mL larutan sampel yang mengandung PABA 0-250 µmol/L, ditambahkan 1 mL larutan

HCI 100 mmol/L dan 0,2 mL dari masing-masing larutan berturut-turut dengan interval 4

menit:

(a) NaNO2 1 g/L, dalam larutan HC1 1,2 mol/L

(b) asam sulfamat 5 g/L, dan

(c) N-(1-naftil) etilendiamina hidroklorida 1 g/L

Setelah 20 menit, pewarna diazo terbentuk, diukur pada 550 nm terhadap blanko reagen

HASIL

Linearitas dan spesifisitas

Indolphenol terbentuk dari kondensasi HA dan fenol dibawah kondisi standar

pengujian untuk metode enzimatik memperlihatkan absorbs maksimum pada panjang

gelombang 630 nm dan stabil pada pH 10 – 12. Linearitas yang bagus antara konsentrasi HA

dan absorbansi pada panjang gelombang 630 nm didapat hingga konsentrasi 40 µmol/L.

gambar satu menunjukkan waktu pembentukan PABA secara enzimatik menjadi HA dalam

adanya berbagai jumlah enzim dibawah kondisi standar pengujian.

Jumlah kuantitatif perubahan PABA menjadi HA ditunjukkan pada setiap konsentrasi

enzim. Ketika kurva kalibrasi untuk metode enzimatik (keseluruhan reaksi, mulai dari PABA

hingga terbentuk indolphenol) diplotkan sebagai standar larutan PABA, kurva melalui

asalnya, dan konsentrasi PABA dan absorbansi pada panjang gelombang 630 nm

berhubungan secara linear hingga paling tidak untuk PABA konsentrasi 40µm/L. Jika tidak

ada enzim, PABA tidak memberi warna yang berarti pada panjang gelombang 630 nm pada

kondisi standar percobaan. Molar absortivitas indophenols adalah 2.8x104 L.mol-1.cm-1 pada

panjang gelombang 630 nm dibandingkan diazo yang nilainya 5.8x10-4 L.mol-1.cm-1 pada

panjang gelombang 550 nm.

Presisi

Ketika reprodusibilitas metode enzimatik diperkirakan untuk sampel urin dengan

PABA yang berbagai konsentrasi, terhitung dalam 10 kali replikasi, CV yang didapat 1.2%

dengan rata rata konsentrasi 0.86 mmol/L dan 0.5% pada rata rata konsentrasi 2.07 mmol/L.

presisi tersebut dinilai dengan menguji sampel urin (2 konsentrasi PABA yang berbeda)

rangkap 3 tiap hari untuk 10 hari berturut turut. CV tiap rangkap 3 tersebut adalah 2.7% pada

0.95 mmol/L dan 2.4% pada 2.29 mmol/L.

Korelasi antara metode enzimatik dan metode diazokopling

Konsentrasi PABA diuji dengan mengemukakan metode (x) yang dibandingkan

dengan penentuan menggunakan metode diazokopling (y) untuk hydrolisate sampel urin dari

sukarelawan yang sehat, yang diberi berbagai jumlah PABA. Persamaan keduanya terlihat

bagus yaitu: y = 1.03x + 0.15mmol/L (r=0.999). sampel urin dari sukarelawan yang sehat

dideteksi dengan metode enzimatik, tapi memberi hasil yang tidak bisa dideteksi PABAnya.

Analitical recovery

Analitical recovery dilakukan dengan 2 cara yaitu menggunakan sampel urine dari

pasien yang telah diberikan bentiromide dan alikuot dari yeast ekstrak, dimana pada

keduanya terdapat amin aromatis lain yang tidak diketahui yang bukan berasal dari PABA.

PABA dalam jumlah tertentu ditambahkan untuk memperkirakan jumlah PABA yang

diperoleh dari sampel. PABA ditambahkan pada larutan sampel yang akan dianalisis secara

kuantitatif dan dideteksi dengan menggunakan dua metode yaitu metode enzimatik dan

metode pengkoplingan diazo, tetapi nilai yang diperoleh dari metode pengkoplingan diazo

lebih tinggi dibandingkan dengan metode enzimatik (Tabel 1), menunjukkan adanya amin

aromatis selain dari PABA.

Selektivitas

Untuk melihat selektifitas dari metode enzimatik, dibandingkan dengan konsentrasi

dari PABA pada urin dari 30 pasien yang sedang mencalani tes fungsi pankreas yang

kadarnya diambil dari kedua metode tersebut. Pasien meminum obat sebelum malam berlalu.

Delapan sampel dari 30 pasien diuji dengan metode pengkoplingan diazo yang memberikan

hasil yang konstan dengan metode enzimatik, tetapi 22 sampel lain dianalisis dengan metode

pengkoplingan-diazo yang menunjukkan suatu nilai dimana antara 6% dan 37% lebih tinggi

diperoleh dari metode enzimatik (21,7±7,9%, mean±SD). Secara keseluruhan koefisien

korelasi antara kedua metode tersebut adalah 0,994, dngan slope 1,11, dan y-intersep adalah

0,07 mmol/L (y=metode pengkoplingan-diazo, n=30).

Interferensi

Sampel urin dari pasien yang meminum berbagai macam obat yang sama dengan

yang telah tercantum pada kurva klinis diatas yang sedang ditest fungsi pankreasnya, tetapi

tidak mendapatkan bentiromide, yang diperiksa dengan cara yang sama dengan menentukan

konsentrasi PABA. Tujuh dari sebelas sampel memberi hasil yang positif (ekuivalen dengan

0,6-1,73 mmol/L PABA) yang dideteksi dengan metode pengkoplingan-diazo, sedangkan

semua nilai dari metode enzimatik perlu dicari lagi jumlahnya. Inhibitor pada metode

enzimatik yaitu sampel urin yang diuji dengan cara yang sama dengan pengujian recovery

seperti yang telah dijelaskan diatas, sebelum dan sesudah hidrolisis sampel urin. Peneliti juga

mengamati adanya efek tanpa inhibitor pada metode enzimatik dan penambahan PABA pada

sampel perolehan secara kuantitatif.

Peneliti juga melakukan pengujian secara in vitro pada obat yang biasa digunakan

(e.g.xylocaine, hydralazine, diazepam, sulfamethoxazol, phenacetin, prokain, asetaminofen,

clonidin, dan furosemid) yang mungkin dapat mengganggu metode enzimatik atau metode

pengkoplingan-diazo. Setiap obat yang ditambahkan pada sampel urin dari relawan yang

sehat pada konsentrasi 100mg/L. Sampel ini diambil dari hasil hidrolisis dan analitis

prosedurnya telah dijelaskan diatas. Hampir semua obat-obatan diatas, kecuali diazepam,

prokain, dan phenacetin, tidak menghasilkan absorbansi pada 630 nm pada metode enzimatik.

Hanya diazepamyang terhambat pada konversi enzimatik dari PABA ke HA, tetapi

penghambatan tersebut diabaikan pada konsentrasi diazepam <10 mg/L pada sampel urin.

Penghambatan ini juga dapay dihindari dengan menambahkan jumlah enzim berlebih

(100mU) dalam standart dala kondisi pengujian. Prokain dan acetominofen adalah derivat

dari 4-aminobenzoic acid dan 4-hidrokxyanilin, berturut-turut, terdapat kesalahan pada kedua

metode tersebut. Terutama pada penambahan prokain pada sampel urin didapatkan nilai

PABA sebagai hasil kuantitatif (97%-100%) pada kedua metode ini. Perolehan kembali

acetaminofen sebagai 4-hydroxyanilin antara 0,7%-8%, menunjukkan bahwa sebagian besar

acetaminofen terdegradasi oleh hidrolisis basa. Phenacetin dan obat sulfa seperti

sulfamethoxazol memberikan absorbansi yang signifikan pada 550 nm pada metode

pengkoplingan-diazo, tetapi tidak mengganggu metode enzimatik.

PEMBAHASAN

Prinsip kerja dalam metode enzimatik ini yaitu mengukur 4-Aminobenzoic acid

(PABA) dengan menggunakan enzim 4-aminobenzoate hydroxylase menjadi 4-

hydroxyaniline (HA). HA dikonversi menjadi indophenol dengan melakukan reaksi

pengklopingan dengan fenol pada kondisi alkali.

Peneliti memilih sampel berupa PABA karena PABA merupakan komponen dari

beberapa obat misalnya analgesik atau anestesi. Metode yang selama ini digunakan untuk

mengukur PABA adalah metode kolorimetri tapi metode ini tidak spesifik pada PABA karena

metode itu berdasar adanya reaksi umum untuk banyak senyawa amin aromatis. Jika

menggunakan metode kolorimetri maka sampel tersebut harus dipastikan bebas dari senyawa

amin aromatis selain PABA. Oleh karena itu, peneliti mengajukan metode baru yang

merupakan kombinasi antara metode enzimatik dan kolorimetri.

Metode enzimatik ini dapat menentukan PABA dengan lebih spesifik daripada

pengukuran umumnya yaitu kolorimetri dengan metode diazo kopling. Kurang spesifitasnya

pengukuran kolorimetri untuk PABA diatasi dengan mengkombinasi reaksi enzimatik untuk

mengubah PABA menjadi HA dan pengukuran HA dengan kolorimetri. Enzim spesifik untuk

amin aromatis dengan gugus karboksil pada posisi orto atau para. Perubahan enzimatik dari

PABA menjadi HA juga bermanfaat bagi pengukuran kolorimetri HA karena indophenol

spesifik untuk HA. Pada penentuan awal PABA dengan reaksi pengkoplingan secara

langsung dengan penambahan phenol pada hypochlorite menunjukkan reproduktifitas yang

buruk.

Meskipun reaksi hidroksilase 4-aminobenzoat secara stoikiometri membutuhkan 1

mol NADH untuk mengkonversi 1 mol PABA menjadi HA, beberapa kandungan aromatik

seperti asam anthranilik dan 4-aminosalisilat, dapat bertindak sebagai substrat dengan luas

tertentu. Namun, baik bahan maupun produk yang dibentuk dari asam anthranilik dan 4-

aminosalisilat melalui reaksi pembentukan enzimatik dengan indophenol dilakukan di bawah

kondisi yang digunakan pada metode yang diusulkan. Karena, metode pewarna indophenol

lebih selektif dan spesifik dibandingkan pengukuran spektrofotometri yang secara langsung

mengukur jumlah NADH yang digunakan untuk reaksi enzimatik. Hasil dari kedua reaksi

metode diazo pengkoplingan dan metode baru yang diajukan oleh peneliti dengan sampel

urin menunjukkan beberapa perbedaan antara perkiraan konsentrasi PABA dengan dua

metode mengusulkan bahwa urin pasien mungkin mengandung amin aromatik sebagai

metabolit yang diadministrasikan pada obat atau makanan. Pada kecepatan satu malam,

disarankan dipercepat, mungkin karena tidak cukup untuk menghindari interferensi obat

secara kompleks. Dari tes interferensi obat, banyak obat tidak tercampur pada metode enzim,

kecuali obat yang berhubungan pada asam 4-aminobenzoic dan 4-hydroxyaniline. Obat sulfa

yang bereaksi dengan metode reaksi pengkoplingan diazo tidak menunjukkan efek pada

metode kami. Tes in vitro interferensi obat menunjukkan 100mg/L Diazepam menghambat

perubahan enzimatik PABA menjadi HA. Namun, hasil sampel urin pasien yang menerima

20mg Diazepam menghasilkan diazepam pada konsentrasi therapetik ( 4-20mg untuk pasien

dewasa) tidak mengganggu metode kami. Pada eksperimen, pasien yang menjalani tes fungsi

pankreas dengan bentiromide menurut laporan yang diterima tidak ada obat yang

berhubungan dengan asam 4-aminobenzoic sebelum puasa. Ini mengindikasikan gangguan

pada obat atau makanan dapat dihindari dalam semalam, sehingga ketidaklanjutan

pengobatan dapat diminimalkan dengan menggunakan metode enzimatik. Dengan metode

pertama yang diandalkan, menentukan konsentrasi PABA pada cairan tubuh ketika pasien

masih mengkonsumsi obat.

Kekurangan utama metode yang dipresentasikan ini adalah membutuhkan persiapan

enzim, 4-aminobenzoat hidrosilase, dan membutuhkan waktu untuk persiapan sampel. Enzim

yang digunakan pada metode ini harus bebas dari tirosinase yang ada pada mushroom, yang

dapat dengan mudah dikenali oleh kromatografi ion exchange atau step pertama dari

purifikasi dengan kromatografi afinitas ekstrak yang secara komersial mengandung

mushroom A. bisporus. Studi lebih lanjut sekarang dalam proses untuk mengubah tahap

waktu konsumsi seperti penambahan reagen multipel dan pengubahan enzimatik PABA

menjadi HA, dan juga mengevaluasi aplikasi metode baru ini pada jenis spesimen lain seperti

darah, serum, dan plasma

KESIMPULAN

Metode enzimatik bisa menjadi metode yang lebih spesifik pada pengukuran PABA

dibanding dengan metode diazokopling biasa karena bisa mengurangi pembacaan absorbansi

dari penggangggu.