PEMERIKSAAN FIBRINOGEN dengan sysmex Ca600

PEMERIKSAAN FIBRINOGENdengan sysmex Ca600Elvan dw/dr. Juli Soemarsono Sp. PK

PENDAHULUANFIBRINOGENFaktor IBagian PlasmaGlikoproteinSolubel BM 340 kDaRantai Peptida , ,, & 3 domainBentuk Fibrin14/3/201422MORFOLOGI

Figure 1. Electron microscope images showing fibrinogen molecules with a central (E) and two peripheral (D) regions (1A), fibrin protofibrils with half-staggered overlapping fibrin monomers Reproduced from Weisel(22).14/3/20143

Seo HS, Xiong YQ, Mitchell J, Seepersaud R, et al. (2010) Bacteriophage Lysin Mediates the Binding of Streptococcus mitis to Human Platelets through Interaction with Fibrinogen. PLoS Pathog 6(8): e1001047. doi:10.1371/journal.ppat.1001047http://www.plospathogens.org/article/info:doi/10.1371/journal.ppat.100104714/3/20144Metabolisme Fibrinogen2-3% dari konsentrasi molekul fibrinogen dibuang dari sirkulasi sebagai konsekuensi dari terjadinya koagulasi dan rangkaian dari fibrinolisisDisintesa dalam hatiKonsentrasi normal dalam tubuh: 200-400 mg/dL114/3/20145Perubahan fibrinogen menjadi fibrin

14/3/20146

14/3/20147Aktivitas FibrinogenPENINGKATAN KADAR FIBRINOGENBertambahnya usia dan jenis kelamin perempuanhamilan dan kontrasepsi oralWanita pasca-menopauseMerokoklatihan akutREAKSI FASE AKUT PROTEINKEGANASAN DISSEMINATA14/3/20148LanjutanPENURUNAN KADAR FIBRINOGENAFIBRINOGENEMIAHIPOFIBRINOGENEMIHEPATITIS VIRUSPENYAKIT HATI DEKOMPENSASI

DICHEMODILUSI14/3/20149*(Eliasson et al, 1993; Hantgan et al, 1994; Lowe et al, 1997; Kluft & Lansink, 1997; van der Bom et al, 1997; Humphries et al,1999).Metode pemeriksaan kadar fibrinogenTes FibrinogenClauss assayClottable protein assayPT-based assayImmunologicalassays

14/3/20141014/3/201411Clottable protein assayMetode yang dijelaskan oleh Jacobsson pada tahun 1955, mencerminkan total clottability fibrinogen . Konsentrasi Fibrinogen diukur setelah menambahkan trombin ke sampel plasma, kemudian diinkubasi selama 2 jam,

kemudian bekuan dicuci, dilarutkan dalam urea, kandungan total protein bekuan diukur

Metode ini dan butuh waktu lama, dan tidak mudah. Dengan demikian, tidak umum digunakan sebagai metode rutin.

14/3/201412PT-based assayNote : Tes tidak dilakukan pada sampel yang dikumpulkan dalam waktu 4 jam dari pemberian heparin atau sampel yang dikumpulkan dari heparin terkontaminasi arteri atau vena, heparin dapat menyebabkan tingkat fibrinogen palsu rendahKadar fibrinogen diukur secara tidak langsung berdasarkan waktu protrombin ( PT )

Kurva standar dengan menggunakan waktu protrombin dan berdasar perubahan densitas optik dari serangkaian pengenceran plasma dengan konsentrasi fibrinogen yang telah diketahuites sederhana dan murah

Tidak direkomendasikan untuk penggunaan laboratorium rutin karena nilai-nilai dapat bervariasi berdasarkan jenis reagen dan analisis yang digunakan, karena itu hasilnya tidak sama antara laboratorium atau rumah sakit . 14/3/201413Immunologcal assaysSebuah metode imunologi berdasarkan pengukuran fibrinogen antigen dan bukan fibrinogen fungsional

Tes immunochemical didasarkan pada antibodi poliklonal bereaksi dengan epitop pada molekul fibrinogen. menghamburkan cahaya dari antigen-antibody larut kompleks berkorelasi dengan konsentrasi fibrinogen dalam sampel.

Menggunakan antibodi yang ditujukan terhadap fibrinogen

Metode imunologi lain yang termasuk pemeriksaan fibrinogen kuantitaif menggunakan teknik ELISA

Biasanya digunakan dalam investigasi gangguan fibrinogen kongenital di mana ada ketidaksesuaian antara aktivitas fungsional dan kadar antigen14/3/201414Clauss assayAssay berdasarkan kecepatan pembekuan plasma diencerkan setelah pemberian thrombin, (Clauss di 1957)

tes tingkat pembekuan ini juga mudah, membuat mereka cocok untuk tujuan rutin

Biasanya digunakan dalam penyelidikan perdarahan, kelainan bawaan, DIC atau terapi trombolitik14/3/201415Rekomendasi Pemilihan Metode Tes Investigasi PerdarahanCuriga DysfibrinogenemiaGangguan Perdarahan Efek penambahan fibrinogen (DIC)Terapi Obat ThrombolitikKadar Fibrinogen Tinggi ClaussClauss, Clottable Protein, ImmunoassayClaussClaussClauss, ImmunoassaySysmex Ca 60014/3/201416Prinsip clauss assay

Principle of TTCommercially prepared bovine thrombin reagent at 2 NIH units/mL cleaves fibrinopeptides A and B from plasma fibrinogen to form a detectable polymer

1 WHO unit = 0.56 NIH unit 1 NIH unit = 0.324 +/- 0.073 g

14/3/201417Metode Deteksi Optik

14/3/201418Deteksi metode persentasi

14/3/201419Kurva standard

14/3/201420Figure 1. Curve for Quantitative Fibrinogen Procedure An NCCLS global consensus guideline. NCCLS. All rights reserved.

SAMPEL14/3/201421reagen14/3/201422

14/3/20142314/3/201424

14/3/201425

14/3/201426

SAMPELREAGENT RACKREACTION TUBE RACKSAMPEL14/3/201427

14/3/201428

SAMPEL14/3/201429

THROMBIN REAGEN 50L/tes

BUFFERREAGEN 90L/tes14/3/201430

CUVATTE

CIRCLE

14/3/201431

SAMPLE PROBE UNIT

REACTION TUBE WELLREACTION TUBE TRASHCATCHERPRINT PAPER14/3/201432

MONITOR

14/3/201433

TRASH BOX

TRASH BOX14/3/201434

14/3/201435

14/3/201436

14/3/201437

14/3/201438

14/3/201439

14/3/201440

14/3/201441

14/3/201442

14/3/201443

14/3/201444

Quality KontrolQuality control dilakukan untuk memperoleh data keandalan

Dilakukan periodik dan terus-menerus memantau status instrumen untuk mencegah masalah kedepan.

Alat ini menganalisis control plasma dan sampel standar lainnya ( QC sampel) dan melakukan kontrol statistik hasil.14/3/20144545Bahan QCSampel QC atau pooled Plasma

Single QC kontrol (kontrol plsdms)14/3/20144614/3/201447TERIMAKASIHNomanklatur faktor koagulasiPada tahun 1958 International Committee for Standarization of the Nomenclatur of the Blood Clothing Factor memberikan penamaan terhadap plama koagulan dengan angka romawi berdasarkan urutan yang pertamakali ditemukan dan didiskripsikan. Maka fibrinogen dapat disebut dengan faktor I 13.bernadette F.R. at. Al. Hematololy clinical principles and application 3rd ed p.575.D:\ppds13\PK\tutor\fh\fibrinogen\canmedaj00932-0020.pdfTeori tentang koagulasi darah pertamakali diperkenalkan oleh seorang fisiologis bernama Johannes Muller (1801-1858) yang menjelaskan tentang fibrin sebagai subtansi pembentuk thrombus. Fibrin ini terbentuk oleh sebuah zat pendahulu yang mudah dipecah yakni fibrinogen yang pertamakali diperkenalkan oleh Rudolf Virchow (1821-1902), dan dapat dikumpulkan secara kimiawi oleh Prosper Sylvian Dennis (1733-1863).http://www.bionity.com/en/encyclopedia/Coagulation.html

14/3/201448

14/3/201449MIKROSKOP ELEKTRON & MORFOLOGIPada tahun 1959 hall dan slayter dengan mikrosokop electron mampu menggambarkan fibrinogen sebagai suatu 3 molekul globuler yang saling terkait. (16) dengan perkiraan panjangnya 475-25A. dan diameter dari globuler sekitar 50 A, dan globuler dibawah sekitar 65 A (16;17)

Penamaan A, B, merupakan gambaran dari peptide A dan B terpotong dari fibrinogen oleh thrombin dan rantai panjang dari -, -, - . pada perubahan bentuk dari fibrinogen ke fibrin peptida dari tidak mengalami perubahan. Fibrinogen dibentuk oleh asam amino dengan jumlah total sebesar 2964 dan rangkaian komlpeks dari asam amino ini telah perkenalkan oleh Henschen and Lottspeichp pada tahun 1980 (23;24) berat molekul masing-masing adalah 66,5 kDa sebanyak (610 asam amino)untuk -, 52 kDa (461 asam aminio) untuk - dan 46,5 Dka (411 asam amino) untuk -. (25;26). Keenam rantai polipeptida dikumpulkan pada satu titik tengah yaitu E region (E Domain) (27). Yang dihubungkan dengan 2 D region (D-Domain) molekul melalui interkonnektor yang berisi 111-112 asam amino dari rantai -, -, -, yang terhubung dalam bentuk coiled coil(28)Torstein Jensen, MD. Studies of subfraction on fibrinogen, University of Oslo Norway 200814/3/20145014/3/201451

Beberapa teknik yang berbeda telah digunakan untuk menentukan konsentrasi fibrinogen dalam plasma. Metode yang dijelaskan oleh Jacobsson pada tahun 1955 telah sering dianggap sebagai metode referensi, mencerminkan total clottability fibrinogen (165). Fibrinogen Konsentrasi diukur setelah menambahkan trombin ke buffer sebagai pengencer sampel plasma, meninggalkan sampel untuk membeku selama 2 jam, kemudian secara sinergis berikutnya mencuci bekuan darah, dan mengukur kandungan total protein clottable spektrofotometri setelah melarutkan bekua dalam urea. Metode ini melelahkan dan memakan waktu, dan tidak mudah. Dengan demikian, tidak umum digunakan sebagai metode rutin. Assay berdasarkan tingkat pembekuan sampel plasma diencerkan digambarkan oleh Clauss di 1957 (166), dengan penambahan thrombin dalam jumlah besar dalam sampel plasma yang telah diencerkan, dan mencatat waktu menggumpal. Karena konsentrasi trombin tinggi, monomer fibrin membentuk cepat, dan metode clauss ini mencerminkan konsentrasi fibrinogen dan sifat polimerisasi monomer fibrin. Koagulasi endpoint dapat dinilai secara manual sebagai waktu pembentukan bekuan visual, tes tingkat pembekuan ini juga mudah, membuat mereka cocok untuk tujuan rutin.Metode lain , seperti garam atau pengendapan panas ( 167-169 ) , yang kurang umum digunakan sebagai tes rutin . Tes immunochemical didasarkan pada antibodi poliklonal bereaksi dengan epitop pada molekul fibrinogen ( 167 , 170 ) . The menghamburkan cahaya dari antigen-antibody larut kompleks berkorelasi dengan konsentrasi fibrinogen dalam sampel. Metode imunologi lain yang termasuk pemeriksaan fibrinogen kuantitaif menggunakan teknik ELISA. Selain metode yang digunakan untuk menentukan tingkat konsentrasi fibrinogen plasma yang beragam juga standar kalibrasi yang masih heterogen , menjadikan perbandingan tingkat fibrinogen yang diperoleh dari beberapa laboratorium berbeda ( 171 ) . Dalam rangka untuk mendapatkan perkiraan yang sebanding konsentrasi fibrinogen , Internasional First Fibrinogen Standard ( IS ) ( 89/644 ) adalah diperkenalkan oleh Institut Nasional untuk Standar Biologi di 1992 (172) , dan diganti pada tahun 2000 oleh 2 IS untuk fibrinogen ( 173 ) . Kalibrasi plasma memiliki laboratorium diaktifkan dan produsen untuk mengkalibrasi terhadap internasional umum fibrinogen standar.14/3/201452INVESTIGASI PERDARAHAN-CLAUSS14/3/20145314/3/201454instrumen melakukan analisis sesuai dengan prosedur yang dijelaskan di bawah ini: Sampel diatur dalam rak sampel, menempatkannya pada posisi analisis yang tepat. Analisis dimulai pada sampel dalam tabung Posisi No 1 menurut urutan yang telah ditetapkan pada pengaturan untuk setiap sampel. Tabung reaksi dalam rak sampel kemudian ditempatkan pada posis untuk diaspirasi satu demi satu. Probe yang dipanasi mengaspirasi sejumlah volume plasma yang dibutuhkan dari sampel rak. Volume sampel yang diperlukan dihitung secara otomatis dari jumlah parameter uji yang ditentukan untuk masing-masing sampel. Probe yang dipanasi kemudian membagi-bagikan sampel yang telah disedot tadi ke dalam tabung reaksie di rak tabung reaksi. Tabung reaksie yang berisi sampel plasma kemudian ditransfer ke sumuran inkubasi oleh tangan penangkap, dan diinkubasi (hangat) untuk jumlah waktu tertentu. Probe yang dipanasi mengaspirasi sejumlah reagen tertentu dari botol reagen di rak reagen. Reagen yang disedot adalah hangat untuk jangka waktu tertentu di dalam Heater Probe. Alat catcher hand sampel memindahkan tabung reaksi pada posisi tempat pembagian reagen, dan reagen yang telah diinkubasi dituang saat tabung reaksie masih di catcher hand.Catcher mencampur sampel dengan reagen dengan menggetarkan tabung reaksi sambil memegangnya. Kemudian tabung reaksi diangkut ke sumur deteksi dan diterangi dengan lampu merah. Dalam detektor, reaksi terdeteksi melalui perubahan cahaya tersebar atau cahaya yang ditransmisikan. Setelah prosedur, sampel catcher mengangkut tabung reaksi dan membuang itu di laci tabung sampah.

Pt basedKadar fibrinogen diukur secara tidak langsung dan dihitung berdasarkan waktu protrombin ( PT ) ? Kurva kalibrasi yang dihasilkan menggunakan waktu protrombin dan perubahan densitas optik dari serangkaian pengenceran plasma dengan konsentrasi fibrinogen yang telah diketahuiPT dilakukan pada sampel pasien dan kada fibrinogen dihitung berdasarkan perubahan densitas optik.tes sederhana dan murahtidak direkomendasikan untuk penggunaan laboratorium rutin karena nilai-nilai dapat bervariasi berdasarkan jenis reagen dan analisis yang digunakan, karena itu hasilnya tidak dipertukarkan antara laboratorium atau rumah sakit . Juga , jika dibandingkan dengan hasil yang diberikan oleh assay Clauss , metode PT berbasis telah terbukti untuk menghasilkan nilai yang lebih tinggi dalam kondisi tertentu seperti penyakit hati , DIC , penyakit ginjal , dysfibrinogenemia , dan pada mereka yang menerima antikoagulan atau terapi trombolitik

14/3/20145514/3/201456

14/3/201457

Assay berdasarkan tingkat pembekuan sampel plasma diencerkan digambarkan oleh Clauss di 1957 (166), dengan penambahan thrombin dalam jumlah besar dalam sampel plasma yang telah diencerkan, dan mencatat waktu menggumpal. Karena konsentrasi trombin tinggi, monomer fibrin membentuk cepat, dan metode clauss ini mencerminkan konsentrasi fibrinogen dan sifat polimerisasi monomer fibrin. Koagulasi endpoint dapat dinilai secara manual sebagai waktu pembentukan bekuan visual, tes tingkat pembekuan ini juga mudah, membuat mereka cocok untuk tujuan rutin.

14/3/20145814/3/201459Nilai dapat dipengaruhi oleh spesimen keruh ( misalnya hiperbilirubinemia , hiperlipidemia ) Nilai yang palsu menurun heparin > 0,6 unit / mL atau produk degradasi fibrin paling banyak digunakan metode laboratoriumBiasanya digunakan dalam penyelidikan perdarahan diatesis , kelainan bawaan dan diperoleh fibrinogen , DIC atau terapi trombolitik14/3/201460

14/3/201461Rekomendasi Pemilihan Metode Tes Investigasi PerdarahanCuriga DysfibrinogenemiaGangguan Perdarahan Efek penambahan fibrinogen (DIC)Terapi Obat ThrombolitikKadar Fibrinogen Tinggi ClaussClauss, Clottable Protein, ImmunoassayClaussClaussClauss, ImmunoassayTorstein Jensen, MD. Studies of subfraction on fibrinogen, University of Oslo Norway 2008trombinE thrombinthrombinF guideland ukG fibrinogen 1H fib fibrinogenI fib standard prosedurJ konparasi ca 1500 & cs 2100iBC Thrombin ReagentOWNAG11E05.pdf14/3/201462