partie 2- gènes et expressions

Partie 2- gènes et expressions

II- Régulation de l’expression des gènes (eucaryotes, transcription)

Mode d’action positif des facteurs de régulation

Activation et positionnement exacte du complexe d’initiation de la transcription



Au niveau de la chromatine

Dans ce cas les facteurs de régulation sont appelés les facteurs de remodelage

Différents mécanismes de décompactions de la chromatine(Mobilisation, acétylation, mèthylation…… des histones )

(basés sur les modifications au niveau des histones)

Mobilisation des histonesEcartement entre H2A et H2B du nucléosome



Au niveau de la chromatine

Acétylation des histones

phénomène est réversible et est contrôlée par des histones acétylases trasférases (HAT). L’élimination d’un groupement acétyle est fait par des désacétylases.

Mode d’action negatif des facteurs de régulation


Les facteurs de régulation sont des répresseurs (plusieurs moyens)

Empêchent les facteurs activateurs d‘inter-agir avec le complexe d’initiation de la transcription

Empêchent la décompaction par dé-acetylation

Méthylation des cytosines:NB: la méthylation est conservée au cours des divisions cellulaires

Agissent comme compétiteurs des FR activateurs en se liant sur les Enhancers

II- Régulation de l’expression des gènes (eucaryotes)

Régulation au niveau de la traduction(Plusieurs mécanismes pour soit le blocage soit l’activation de la traduction )

Blocage par un facteur répresseur de la traduction

Exemple: acotinaserepressur de la ferritine (protéine de stokage de fer

Activation par phosphorylation d’un facteur d’initiation de la traduction(phosphorylation de la sous-unité alpha du facteur d'initiation de la traduction eucaryote 2 (eIF2-a).

impact important sur de nombreuses fonctions cellulaires, principalement - sur la synthèse des protéines,- mais aussi sur l'expression des gènes,

Blocage de la traduction par fixation de l’aconitase sur ‘5 de l’ARNm de la ferritine

Régulation de la concentration d’une protéine synthétisée

II- Régulation de l’expression des gènes (eucaryotes)

Régler la quantité d’une protéine

Maintenir un l’equilibre entre différents mécanismes

Niveau de contrôle

-la synthèse du transcrit primaire de l’ARN-maturation post- transcriptionelle-dégradation de l’ARNm correspondant-traduction-modifications post- traductionnelles -dégradation des protéines

Remarque: -La concentration ou la quantité d’une protéine est contrôlée par des mécanismes portants sur un ou plusieurs ou la totalité de ces points-un grand nombre de facteurs peut jouer sur la vitesse de chacune de ces points-99% de nos gènes sont semblables a ceux de la souris mais environ 5000 segments cis-transsont semblables a ceux du requin

III- Analyse de l’expression d’un gène

Etude qui consiste à caractériser et à quantifier les produits de l’ADN (ARNm et Protéines) de manière à identifier dans un tissu donné , dans un état donné et à un moment donné , la séquences actives (ARNm et protéines ) et ainsi de révéler le niveau d’expression de leurs gènes

Analyse du transcriptome Analyse du protéome


Analyse du transcriptome

Analyses simultanées des niveaux d’expression d’une centaine ou de milliers de gènes dans un échantillon biologique donné

Puces à ADN (Micro-arraysd’ADN) Méthode SAGE

NB: la majorité des techniques appliquées dans le transcriptome repose sur l’utilisation de l’ADNc et donc nécessite une RT-PCR

-Le principe est basé sur la technique d'hybridation. - les sondes (des oligonucléotides, simples brins), spécifiques de différents gènes (ou ADNc), sont Immobilisés sur un support solide (matrice) soit par un greffage sur le support, soit synthétisées in situ (unité d'hybridation = plot).- Les signaux d'hybridation sont détectés selon le type de marquage, (radioactivité ou fluorescence), par mesure radiographique ou par fluorescence, et sont quantifiés.

Le support se présente sous la forme d'une surface (matrice) inférieure à 1cm2, plane ou poreuse (percées de puits) et composés de matériaux tels que le verre, les polymères, le silicium ou l'or et le platine,

NB:- le support peut être en nylon ou plastique (Microarrays)-les séquences d’ADN fixées sont soit des fragments (0,5 à 1kb), soit des

oligonucleotides longs (60 à 80pb)- 1 à 2 milliers de dépôt (dans le cas de micro-arrays) alors que 10000 à30000 dépôt ne peuvent être réalisés que sur une lame de verre)

Analyse du transcriptomeIII- Analyse de l’expression d’un gène

Puces à ADN (Micro-arrays d’ADN)




Plot= l'unité d'hybridation sur lequel sera greffée une sonde d'ADN synthétique (L'élément principal de la puce à ADN). - Les plots, présents en un grand nombre d'exemplaires, sont répartis régulièrement sur toute la surface de la puce.

La détection des hybridations, est basée sur un marquage (effectué au cour de la transcription inverse) soit par fluorescence en utilisant la cyanine CY3 ou CY5 (puce d’ADN) et par fluorescence ou radiographie en utilisant le 33p (Mico-arrays).NB: la quantité d’ARN nécessaire pour l’analyse est de 20µg (cas de fluoresnce) et 2µ (cas de radioactivité)

La collecte des signaux d’hybridation :

Imgeurs β à haute résolutionReceuillent les valeurs quantitatives (Micro-arrays, cas de la radioactivité)

Scanner à fluoresence (puce à ADN,-difficile a normaliser nécessite beaucoup de répétitions



Etapes pour Puces à ADN

-Retro-transcription et marquage avec fluochrome-l’ARN d’interet avec CY5 (rouge) --l’ARN contrôle avec CY3 (vert)

Hybridation: des quantités identiques des 2 échantillons sont mélangés et hybridés sur une lame porteuse environ 105 sondes

Collecte des signaux d’hybridation: -après lavage , les signaux sont visualisés via un scanner et lecture à 2 longueurs d’ondes (CY5 et CY3)-Obtention d ‘une image pour chacune des lecture--obtention d’une image par superposition des deux autres



Puces à ADNLecture des resultats et determination du niveau d’expression

Par la couleur:Signal CY3=Signal CY5

dépôt de jaune

Gene d’interet est surexprimé

rouge

Gene d’interet est réprimé

vert

Aucune hybridation

noir

Calcul du rapport d’intensité pour chaque gène étudié

-Ce rapport est normalisé a 1 pour tous les gènes dont le niveau d’expression est stable entre deux conditions

-Ce rapport est 1, si le gène est induit

- Ce rapport est 1, si le gène est réprimé



Technique SAGE5 (Serial analysis og gene expression)

Obtention des tags (ou étiquettes)réaliser un inventaire des transcrits (ARNm présents dans un échantillon de cellules, tissus ou organes et convertis en ADNc) en isolant (par un traitement enzymatique) à partir de chacun d'eux un courts fragments spécifiques de 9 à 14 pb appelés séquences tags.

Concaténisation des tags et identification des gènesTous les tag (jusqu'à une cinquantaine) sont ensuite concaténés pour former un fragment d'ADN qui puisse être manipulé et finalement séquencé. Les gènes, à l'origine des tags, peuvent alors être identifiés par comparaison de la séquence avec les banques.

Obtention d’un profil d'expression des gènesL’abondance de chaque tags est proportionnelle au niveau d‘expression de son transcrit dans la population cellulaire d’origine

Principe: repose sur l’utilisation d’une petite séquence spécifique de l’ARNm(diminution et simplification des étapes de clonage et séquençage)



Technique SAGE (Serial analysis og gene expression)

NB:- méthode plus difficile (un gêne peut donner plusieurs Tags)-peu reproductible (résultats significativement différents)-n'est pas adaptée à l'étude de nombreux échantillons et de transcrits rares-elle requiert l'existence de bases de données de séquences génomiques complètes pour les espèces étudiées. -a déjà fait l'objet d'applications chez l'homme, chez la levure et chez les plantes.



Représentation graphique des résultats d’expression d’un gène


Analyse du protéotome

-mesurer les débits des protéines actives et -connaître avec quels composants de la cellule elles interagissent (ADN, ARN, autres protéines et molécules).

le génome est constant (aux mutations somatiques près)

le protéome (tout comme le transcriptome) varie d'un type cellulaire à l'autre (situation physiologique et développement dans laquelle se trouve chaque cellule.

un même individu possède, non pas un protéome, mais plusieurs.

variations de fonctionnement d'une cellule(Une grande partie)

modulation de la quantité des protéines

présence ou l'absence de certaines d'entre elles



Principales étapes de la protéomique

Extraction des protéines et préparation des échantillons

Extraction a partir des tissus, des cellules isolées ou liquides physiologiques en respectant plusieurs points:

-Utilisation des tampons appropriés en considérant la nature des protéines à analyser (cytosoliques, membranaires, nucléaires ……….)

-éviter les contaminations acides nucléiques, lipides, sels………

Faire solubiliser les protéines





Separation des proteines (EBD) par electrophorésebidimentionnelle sur gel (2D)

une combinaison de deux électrophorèses.-La première, une isoélectrofocalisation (IEF), fait se déplacer tout polypeptide contenu dans l'échantillon en fonction de son point isoélectrique (pl) (gel présentant un gradient de pH)-La deuxième en présence de dodecyl sulfate de sodium (SDS), le fait se déplacer en fonction de sa masse moléculaire (MM)

plusieurs centaines des constituants d'un mélange de polypeptides peuvent être individualisés sous forme de spots sur un gel.

NB: des logiciels d'analyse des gels d'EBD sont actuellement appliqués pour le cas du grand nombre de spots par gels (en particulier pour l'analyse des variations quantitatives)



Separation des proteines (EBD) par electrophorésebidimentionnelle sur gel (2D)



Détection et quantification des protéines

Détection par coloration du gel

Bleu de commassie-permet de detecter un minimum de 100ng de proteine/spot-donne une intensité de coloration proportionnelle à la quantité de protéines

Nitrate d’argent-permet de détecter des spots contenant 0,1ng de protéine-- Linéarité d’intensité de coloration n’est pas totale--reproductibilité dificille--certaines proteines sont peu ou pas colorées

Détection par fluorescence(sypro orange, sypro red……-Linéarité d’intensité de coloration similaire a celle du nitrate--reproductibilité, rapidité meilleurs ue celles des nitrates

AutoradiographieIncorporation dans les protéines les isotopes (35S, 32P, 33P)-détection des quantités très faibles de protéines(1-100pg)



Détection et quantification des protéines

Exemple: Cas du proteome de E.coli dans différentes temperatures

Remarques:-l’analyse des gels est développée avec l’informatique et le traitement d’images--la digitalisation est une transformation de l’image expérimentale en une information numérique utilisable par l’ordinateur--les gels 2D sont comparés aux gels inscrits dans les bases de donnés (SWIS6-2-DPAGE/-http://expasy org/swis-2dpage/)

http://expasy/

III- Analyse de l’expression d’un gène, protéome

Identification des protéines

Spectrophotométrie de masse et recherche dans la banque des donnés

Permet d’identifier une protéine et ses modifications en mesurant la masse du peptide (fragments protéique), issues de la digestion enzymatique.Les résultats sont comparés avec ceux stockés dans la banque de donnés

Remarque: La spectrométrie de masse permet de réaliser un séquençage direct des peptides même si le peptide n'est pas pur



Autres techniques d’identification

Digestion enzymatique spécifiqueExemple la trypsine (appliquée aux quantités infimes des protéines) qui libère des fragments caractéristiques de chacune des protéines analysée

Micro-sequencage N et C- terminal automatiséExemple :Le séquençage d’Edman

Puces à proteinesTechnique basée sur la réaction:Antigène -anticorps



Système double hybride

vise à établir des cartes d'interactions protéiques de manière à reconstituer des voies métaboliques.permettent de guider sur le rôle d'une protéine totalement inconnue, pour peu qu'elle interagisse avec une autre dont on connaît la fonction.

L'analyse bioinformatique des homologies de séquences protéiques avec d'autres protéines connues (stockées dans la banque des données

d'établir une liste des interactions des protéines inconnues, susceptibles de se produire

Vérification et validation in vivo de chacune des interactions, (double hybride).

Système double hybride consiste à étudier, dans un organisme (notamment une bactérie), la capacité d'une protéine connue (la cible) à interagir avec une protéine inconnue (la proie) in vivo.

l'interaction est détectée par la formation d'un complexe moléculaire qui active l'expression d'un gène (rapporteur).

Fin du chapitre 2

Merci

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