Fernanda de Paula Cury

PAPEL FUNCIONAL DAS ISOFORMAS GNNK+ E GNNK- DE KIT EM GLIOBLASTOMA

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação da Fundação Pio XII – Hospital de Câncer de Barretos para obtenção do Título de Mestre em Ciências da Saúde. Área de Concentração: Oncologia Orientadora: Dra. Olga Catarina Lopes Martinho Co-orientador: Dr. Rui Manuel Vieira Reis

Barretos, SP

2016

Fernanda de Paula Cury

PAPEL FUNCIONAL DAS ISOFORMAS GNNK+ E GNNK- DE KIT EM GLIOBLASTOMA

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação da Fundação Pio XII – Hospital de Câncer de Barretos para obtenção do Título de Mestre em Ciências da Saúde. Área de Concentração: Oncologia Orientadora: Dra. Olga Catarina Lopes Martinho Co-orientador: Dr. Rui Manuel Vieira Reis

Barretos, SP

2016

FICHA CATALOGRÁFICA

Preparada por Martins Fideles dos Santos Neto CRB 8/9570

Biblioteca da Fundação Pio XII – Hospital de Câncer de Barretos

C975p Cury, Fernanda de Paula. Papel funcional das isoformas GNNK+ e GNNK- de KIT em glioblastoma/

Fernanda de Paula Cury. - Barretos, SP 2016. 124 f. : il. Orientador: Drª. Olga Catarina Lopes Martinho Co-Orientador: Dr. Rui Manuel Vieira Reis Dissertação (Mestrado em Ciências da Saúde) – Fundação Pio XII – Hospital

de Câncer de Barretos, 2016. 1. Isoformas de RNA 2. Proteínas Proto-Oncogênicas c-KIT 3. Glioblastoma

4. Pacientes 5. Células 6. Terapêutica. I. Autor. II.Martinho, Olga Catarina Lopes. III. Reis, Rui Manuel Vieira. IV. Título

CDD 571.6

FOLHA DE APROVAÇÃO

Fernanda de Paula Cury

Papel funcional das isoformas GNNK+ e GNNK- de KIT em glioblastoma.

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação da Fundação Pio XII – Hospital de

Câncer de Barretos para obtenção do Título de Mestre em Ciências da Saúde - Área de

Concentração: Oncologia

Data da aprovação: 02/03/2016

Banca Examinadora:

Prof.ª Dra. Glaucia Noeli Maroso Hajj

Instituição: Fundação Antônio Prudente, Hospital AC Camargo

Prof. Dr. Luciano Neder Serafini

Instituição: Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto - USP

Prof.ª Dra. Olga Catarina Lopes Martinho

Orientadora

Prof. Dr. Rui Manuel Vieira Reis

Presidente da Banca

SUPORTE À PESQUISA POR AGÊNCIA DE FOMENTO

Este trabalho recebeu apoio da Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo

(FAPESP) através de Bolsa de Mestrado - Regular (processo número 2014/03684-0) e Bolsa

Estágio de Pesquisa no Exterior – BEPE (processo número 2015/02691-6).

As opiniões, hipóteses e conclusões ou recomendações expressas neste material são de

responsabilidade dos autores e não necessariamente refletem a visão da FAPESP.

“Esta dissertação foi elaborada e está apresentada de acordo com as normas da Pós-

Graduação do Hospital de Câncer de Barretos – Fundação Pio XII, baseando-se no Regimento

do Programa de Pós-Graduação em Oncologia e no Manual de Apresentação de Dissertações

e Teses do Hospital de Câncer de Barretos. Os pesquisadores declaram ainda que este

trabalho foi realizado em concordância com o Código de Boas Práticas Científicas (FAPESP),

não havendo nada em seu conteúdo que possa ser considerado como plágio, fabricação ou

falsificação de dados. As opiniões, hipóteses e conclusões ou recomendações expressas

neste material são de responsabilidade dos autores e não necessariamente refletem a visão

da Fundação Pio XII – Hospital de Câncer de Barretos.”

“Embora o Núcleo de Apoio ao Pesquisador do Hospital de Câncer de Barretos tenha

realizado as análises estatísticas e orientado sua interpretação, a descrição da metodologia

estatística, a apresentação dos resultados e suas conclusões são de inteira responsabilidade

dos pesquisadores envolvidos.”

Aos meus pais, pelo amor incondicional,

carinho e preocupação. Pelo exemplo, apoio e

incentivo sempre.

AGRADECIMENTOS

À Profa. Dra. Olga Catarina Lopes Martinho, minha orientadora, por depositar tanta

confiança em mim, por todo ensinamento e ser tão presente apesar da distância. Por

compartilhar de tantas conquistas que, com certeza, foram nossas. Tenho uma imensa

admiração pela sua determinação, exemplo de pessoa e profissional. Além do mais, tenho

enorme orgulho em dizer que sou sua orientanda. Obrigada por tudo!

Ao Prof. Dr. Rui Manuel Vieira Reis, meu co-orientador, por toda ajuda e por estar sempre à

disposição. Apesar de alguns tropeços meus, agradeço pelas correções e elogios que tenho

certeza que me ajudaram amadurecer na pesquisa.

Ao Me. Renato Oliveira pela enorme paciência em ensinar, pela companhia nos almoços e

nos cafés, pelas risadas nos momentos mais críticos do mestrado, pelo abraço todos os dias

de manhã, por aguentar meus momentos de estresse, meus choros e, principalmente, pela

amizade.

Ao Dr. Matias Melendez, Dra. Viviane Aline, Me. André Lengert e Me. Adriana Cruvinel

pelas várias contribuições, pela disponibilidade e boa vontade em ajudar sempre. Obrigada,

também, pela amizade.

Ao Departamento de Patologia do Hospital de Câncer de Barretos, ao Dr. Cristovam

Scapulatempo e à Dra. Gisele Caravina de Almeida, pela revisão de lâminas e avaliação das

imunohistoquímicas, à Patrícia, Bia e Letícia pela eficiência na separação e cortes dos blocos

de parafina. Agradeço também ao Dr. José Manuel Lopes, do IPATIMUP, pela avaliação das

imunohistoquímicas.

Ao Biobanco do Hospital de Câncer de Barretos, pelo levantamento dos casos e extração de

RNA dos tecidos tumorais.

Aos médicos da Neurocirurgia, por sempre estarem dispostos a auxiliar nas dúvidas clínicas.

Ao NAP (Núcleo de Apoio ao Pesquisador) pelo auxílio na confecção do Banco de Dados e

análise estatística.

Ao SAME, em especial ao Dante e ao Kleber, pela eficiência em separar os prontuários.

Ao EPIT (Escritório de Projetos e Inovação Tecnológica) por toda eficiência nas compras de

reagentes e, em especial à Joyce, por todo auxílio com pedido de bolsa e relatórios FAPESP.

Aos membros das bancas de acompanhamento/qualificação e defesa(Dra. Gláucia Maroso

Hajj, Dr. Sérgio Vicente Serrano e Dr. Luciano Neder Serafini), pelas contribuições e

correções deste trabalho.

Ao Departamento de Pós-Graduação, essencialmente à Silvana e a Brenda, por toda

eficiência e organização, pela disposição em ajudar sempre e por lembrarem todos os

prazos.

À FAPESP pela concessão de bolsa de estudos e pela oportunidade da primeira experiência

em outro país.

Ao ICVS (Instituto de Investigação de Ciências da Vida e da Saúde – Universidade do Minho)

por me receber durante três meses e contribuir para esse trabalho.

Ao Hospital de Câncer de Barretos pelo apoio financeiro e toda infraestrutura que, com

certeza, é de uma qualidade imensurável.

Aos meus amigos de toda a vida, que acompanharam desde o início do mestrado, e mesmo

não entendendo muito sobre a pesquisa e biologia molecular, sempre compartilharam a

felicidade com as minhas conquistas, obrigada por compreenderem meus momentos de

ausência e, ainda assim, não desistirem de mim.

E finalmente, e extremamente importantes, à todas as amizades feitas no CPOM (Centro de

Pesquisa em Oncologia Molecular), que desde a iniciação científica, me receberam muito

bem. Em quatro anos, conheci praticamente todas as “gerações” e me orgulho muito de

fazer parte desse laboratório.

À Anna Luiza (Anninha) e Maraísa (Mara), simplesmente pela amizade. Encontrei em

vocês muita parceria, companheirismo, confiança e suporte. Com toda certeza se

tornaram essenciais e sei que posso contar com vocês em todos os momentos.

Obrigada.

Aos meus companheiros de bancada: Weder, pela amizade, pelas conversas durante

o café, por toda ajuda sempre, obrigada por ser essa pessoa tão fácil de dividir a

bancada (deve ser porque somos aquarianos!), à Karina, pela eficiência como

biologista e fazer de tudo pela organização do laboratório, obrigada pelo “bom dia”

de todas as manhãs, além de toda meiguice e alegria em pessoa e, à Izabela,

obrigada pelas conversas e por dividir conhecimento sobre a extração de novos

compostos.

À Paula Felício, Estela, Paula Pastrez, Aline Rocha, Tatiane Honda, Isana pela

amizade e por compartilhar os prazos do mestrado, as disciplinas da Pós-Graduação,

os trabalhos feitos em grupo, a espera de resposta das agências de fomento e a

alegria de aprovação nas bancas de acompanhamento/qualificação.

Ao Maicon (Irmão) pela amizade e pela alegria sempre, à Nathalia pela disposição em

ajudar sempre e à Carol Laus, Vânia, Lidia e Carol Carvalho, pelo auxílio em dúvidas

científicas e pelas experiências de vida trocadas.

Aos meus amigos residentes: Murilo por ter se tornado meu “best” em tão pouco

tempo, e Sâmia pelas conversas, risadas e por me entender tão bem.

A todos que direta ou indiretamente contribuíram para a realização deste trabalho.

“A grandeza de um ser humano não está no quanto ele sabe,

mas no quanto ele tem consciência que não sabe.”

(Augusto Cury)

ÍNDICE

1 INTRODUÇÃO 1

1.1 Câncer 2

1.2 Epidemiologia 3

1.3 Tumores Primários do Sistema Nervoso Central 6

1.4 Glioblastoma 7

1.5 Receptores Tirosina Quinase 7

1.6 KIT 9

1.7 KIT e Sistema Nervoso Central 11

1.8 Isoformas GNNK 13

1.9 Terapia-Alvo 15

2 JUSTIFICATIVA 18

3 OBJETIVOS 21

4 MATERIAL E MÉTODOS 23

4.1 Tecidos tumorais (Casos) 24

4.2 Linhagens celulares e cultura celular 25

4.3 Extração de RNA e RT-PCR (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction) 25

4.4 Imunohistoquímica e Imunoflorescência para CD117 26

4.5 Transfecção estável de linhagens celulares 27

4.6 Ensaio de Viabilidade Celular 28

4.7 Ensaio de Clonogenicidade 28

4.8 Ensaio de Migração (Wound healing) 28

4.9 Ensaio de Invasão em Matrigel 29

4.10 Western blot 29

4.11 Ensaio in vivo em Membrana Corioalantóide (CAM) de embrião de galinha 30

4.12 Análise Estatística 30

4.13 Delineamento Experimental 31

4.13.1 Caracterizar a expressão de RNAm e proteína de KIT em glioblastoma 31

4.13.2 Impacto clínico das isoformas de KIT em pacientes com glioblastoma 31

4.13.3 Análise do papel tumorigênico das isoformas de KIT em glioblastomas 31

4.13.4 Análise das funções bioquímicas das isoformas de KIT em linhagens celulares de

glioblastoma 32

4.13.5 Ensaio in vivo em Membrana Corioalantóide (CAM) de embrião de galinha 32

5 RESULTADOS 33

5.1 Expressão de RNAm e proteína de KIT em glioblastoma 34

5.2 Impacto clínico das isoformas de KIT em pacientes com glioblastoma 38

5.3 Análise do papel tumorigênico das isoformas de KIT em glioblastomas 51

5.4 Análise das funções bioquímicas das isoformas de KIT em linhagens celulares de

glioblastoma 55

5.5 Ensaio in vivo em Membrana Corioalantóide (CAM) de embrião de galinha 57

6 DISCUSSÃO 60

7 CONCLUSÕES 67

8 PERSPECTIVAS 69

REFERÊNCIAS 71

ANEXOS 80

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Estimativas para o ano de 2016 das taxas brutas de incidência por

100 habitantes e do número de casos novos de câncer, segundo

sexo (a: homens; b: mulheres) e localização primária para o Brasil. 5

Figura 2 - Esquema do desenvolvimento de células neuroectodermal

(neurônios e células da glia) e classificação dos tumores

neurológicos. No SNC, células neurais multipotentes originam três

tipos celulares principais no SNC – neurônios, oligodendrócitos e

astrócitos. A classificação dos tumores do SNC é baseada no seu

tipo celular predominante (Adaptado). 6

Figura 3 - Famílias dos Receptores Tirosina Quinase (RTK). Nesse esquema,

estão listados todos os membros de cada família. 9

Figura 4 - Análise de alterações em casos do TCGA no gene KIT em GBMs,

disponível no cBioPortal for Cancer Genomics. a: Avaliação de

alterações encontradas, mutação e amplificação, no gene KIT em

GBMs. b: Mutações encontradas no gene KIT em GBMs. 12

Figura 5 - Esquema das isoformas GNNK de KIT codificadas devido ao

splicing alternativo do RNAm que resultam na produção de duas

isoformas caracterizadas pela presença (+) ou ausência (-) de 12

nucleotídeos que codificam uma sequência tetrapeptídica GNNK. 13

Figura 6 - Caracterização das isoformas GNNK de KIT de um amplo painel

(73) de linhagens celulares tumorais. 15

Figura 7 - Alterações genéticas frequentes de GBMs em três vias de

sinalização críticas. Alterações nas sequências primárias e

mudanças significativas de copy number para os componentes das

vias de sinalização de (a) RTK/RAS/PI3K, (b) p53 e (c) RB. 16

Figura 8 - a: Análise por RT-PCR da expressão das isoformas GNNK de KIT de

linhagens estabelecidas de glioblastoma, linhagem estabelecida de

astrócitos humanos normais (NHA) e tecidos normais (NF: tecido

normal de cérebro fetal, NA e NB: tecidos normais de cérebro

adulto) em gel de agarose a 4%. b: Análise da expressão proteica

das linhagens estabelecidas de glioblastoma, NHA, NF e NA por

western blot utilizando o anticorpo de KIT (CD117 – DAKO A4502). 19

Figura 9 - Representação do número de amostras utilizadas para cada

técnica (RT-PCR e IHQ), número de prontuários revisados e as

respectivas instituições onde foram coletados. 24

Figura 10 - Análise da predominância das isoformas GNNK de KIT nos tecidos

congelados e parafinados de glioblastoma em cinco grupos:

negativo para RNAm, 100% GNNK+, 100% GNNK-, 75%

GNNK+/25% GNNK-, 75% GNNK-/25% GNNK+ e 50% GNNK+/50%

GNNK-. Foram avaliados 136 casos, sendo 120 de tecidos

congelados (Hospital de Câncer de Barretos - Brasil) e 19 de

tecidos parafinados (Hospital Pedro Hispano – Portugal). 34

Figura 11 - Análise da expressão da proteína KIT em cortes parafinados de

glioblastoma por Imunohistoquímica (IHC). a: GBM com baixa

expressão nas células tumorais; b: GBM com expressão moderada

nas células tumorais; c: expressão de CD117 nos microvasos

(tecido endotelial); d: expressão de CD117 na proliferação

microvascular (tecido endotelial). 35

Figura 12 - Análise da expressão das isoformas GNNK de KIT em 8 linhagens

celulares primárias de glioblastoma e análise dos respectivos

tecidos congelados dos pacientes. Análise da expressão proteica

de KIT das respectivas linhagens celulares. 36

Figura 13 - Análise dos níveis de expressão da proteína KIT, expressão do

ligante de KIT (SCF) e expressão de KIT fosforilado (resíduo de

tirosina 719) em células tumorais (A, B, C) e células endoteliais (D,

E, F). 37

Figura 14 - Curvas de sobrevivência de 136 pacientes, utilizando curvas de

Kaplan Meier e teste de log-rank. a: Curvas de sobrevivência com

amostras negativas pra KIT, com predominância da isoforma

GNNK+, com predominância da isoforma GNNK- e expressão igual

de ambas isoformas (p-valor 0,263); b: Curvas de sobrevivência de

amostras com KIT positivo e KIT negativo (p-valor 0,057); c: Curvas

de sobrevivência de amostras com a predominância de GNNK+ e

amostras com predominância de GNNK- (p-valor 0,291). 49

Figura 15 - Curvas de sobrevivência de 136 pacientes, utilizando Kaplan Meier

e teste de log-rank. a: Curvas de sobrevivência com amostras com

expressão positiva e negativa da proteína KIT nas células

neoplásicas (p-valor 0,517); b: Curvas de sobrevivência de

amostras com expressão positiva e negativa da proteína KIT no

tecido endotelial (p-valor 0,354). 50

Figura 16 - Confirmação da transfecção das isoformas GNNK+ e GNNK- de KIT

na linhagem GAMG através do RNAm, expressão da proteina KIT

(CD117) e confirmação da ativação através da expressão de KIT

fosforilado (p-KIT 719). 52

Figura 17 - Ensaios celulares realizados com a linhagem celular GAMG

transfectada estavelmente e selecionada com 300ug/ml de G418.

a: ensaio de viabilidade celular; b: ensaio de clonogenicidade; c:

ensaio de wound healing; d: ensaio de invasão em Matrigel. 53

Figura 18 - Ensaios celulares realizados com a linhagem celular U251

transfectada estavelmente e selecionada com 300ug/ml de G418.

a: Confirmação da transfecção das isoformas GNNK+ e GNNK- de

KIT na linhagem GAMG através do RNAm, expressão da proteina

KIT (CD117); b: ensaio de viabilidade celular; c: ensaio de

clonogenicidade; d: ensaio de wound healing. 54

Figura 19 - Efeito na ativação de KIT e vias intracelulares (MAPK e AKT) em

células transfectadas com as isoformas GNNK+ e GNNK- na

linhagem celular GAMG. Os gráficos apresentam a quantificação

das proteínas, sendo (proteína fosforilada/proteína total). 55

Figura 20 - Efeito na ativação de KIT e vias intracelulares em células

transfectadas com as isoformas GNNK+ e GNNK- na linhagem

celular U251. O gráfico apresenta a quantificação das proteínas,

sendo (proteína fosforilada/proteína total). 56

Figura 21 - Imagens de Imunofluorescência (IF) com 0, 15 e 30 min de

estimulação com SCF; utilizando anticorpo CD117 (DAKO A4502)

nas linhagens transfectadas e no pCDNA3 (vetor vazio). 57

Figura 22 - a: Análise da formação tumoral na CAM, nos dias 13 (in ovo) e 17

(ex ovo), com a linhagem GAMG; b: os tumores formados com as

linhagens transfectadas apresentaram maior média de perímetro

em comparação ao vetor vazio, com resultados estatisticamente

significativos (GNNK- p-valor <0,0001; GNNK+ p-valor 0,0154); c:

coloração de H&E e imunohistoquímica para CD117 (KIT) de cortes

feitos a partir da CAM incluída em parafina. 58

Figura 23 - a: Análise da formação tumoral na CAM, nos dias 13 (in ovo) e 17

(ex ovo), com a linhagem U251; b: os tumores formados com a

linhagem transfectada com a isoforma GNNK- apresentaram maior

média de perímetro em comparação ao vetor vazio, com

resultados estatisticamente significativos (p-valor 0,0311). 59

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Casuística dos 21 casos que foram analisados de acordo com a

expressão da proteína KIT, expressão do ligante de KIT (SCF) e

expressão de KIT fosforilado (resíduo de tirosina 719) e suas

respectivas marcações. 38

Tabela 2 - Características e histórico da doença de 148 pacientes com GBM

do Hospital de Câncer de Barretos e Hospital Pedro Hispano

(Portugal). 40

Tabela 3 - Associação da expressão do RNA de KIT com as variáveis

demográficas e clínico-patológicas de pacientes com glioblastoma

(n=136). 41

Tabela 4 - Associação da predominância da isoforma GNNK- de KIT com as

variáveis demográficas e clínico-patológicas de pacientes com

glioblastoma (n=136). 42

Tabela 5 - Associação da predominância da isoforma GNNK+ de KIT com as

variáveis demográficas e clínico-patológicas de pacientes com

glioblastoma (n=136). 43

Tabela 6 - Associação da expressão da proteína KIT (células neoplásicas) com

as variáveis demográficas e clínico-patológicas de pacientes com

glioblastoma (n=70). 44

Tabela 7 - Associação da expressão da proteína KIT (tecido endotelial) com as

variáveis demográficas e clínico-patológicas de pacientes com

glioblastoma (n=70). 45

Tabela 8 - Associação da expressão da proteína KIT (células neoplásicas) com

a expressão do RNA e as isoformas de KIT de pacientes com

glioblastoma (n=63). 46

Tabela 9 - Associação da expressão da proteína KIT (tecido endotelial) com a

expressão do RNA e as isoformas de KIT de pacientes com

glioblastoma (n=63). 46

Tabela 10 - Associação entre os dados clínico-patológicos com a sobrevida de

pacientes com GBM. 47

Tabela 11 - Associação entre dados de expressão de KIT com a sobrevida de

pacientes com GBM. 48

LISTA DE ABREVIATURAS

CAM Ensaio em Membrana Corioalantóide

CD117 KIT; SCFR

cDNA DNA complementar

CEP Comitê de Ética em Pesquisa

DAB 3,3'-diaminobenzidine

DAPI 4',6-diamidino-2-phenylindole

DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium

DMSO Dimetilsulfóxido

DP Desvio padrão

FFPE Formalin-fixed paraffin-embedded

FLT3 Fms-Related Tyrosine Kinase

GBM Glioblastoma multiforme

GIST Gastrointestinal stromal tumors

GNNK Gly-Asn-Asn-Lys

GM-CSF Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor

IC50 Half maximal inhibitory concentration

IF Imunofluorescência

IHQ Imunohistoquímica

INCA Instituto Nacional do Câncer

JAK/STAT Janus kinase/signal transducers and activators of transcription

kDa kilodalton

KPS Índice de Karnofsky

MAPK Mitogen-activated protein kinase

NHA Normal human astrocytes

PBS Phosphate-buffered saline

PDGFRA/B Platelet-derived growth fator receptor alpha/beta

PI3K Phosphoinositide 3-kinase

PTEN Phosphatase and tensin homolog

P/S Penicilina/Streptomicina

QT Quimioterapia

RB Proteína do Retinoblastoma

RNAm RNA mensageiro

RT Radioterapia

RTK Receptor Tirosina Quinase

RT-PCR Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction

SCF Stem cell factor

SFB Soro fetal bovino

SNC Sistema Nervoso Central

TCG Tumores de Células Germinativas

TMZ Temozolamida

TCGA The Cancer Genome Atlas

TKI Inibidor Tirosina Quinase

VEGF Vascular endothelial growth factor

VEGFR Vascular endothelial growth factor receptor

LISTA DE SÍMBOLOS

% Porcentagem

˂ Menor

= Igual

˃ Maior

≤ Menor ou igual

≥ Maior ou igual

µ micro (106)

RESUMO

Cury FP. Papel funcional das isoformas GNNK + e GNNK- de KIT em glioblastoma. Dissertação

(Mestrado). Barretos: Hospital de Câncer de Barretos; 2016.

INTRODUÇÃO: O glioblastoma (GBM) é o tumor cerebral mais comum em adultos e uma das

doenças malignas mais mortais em humanos e essa situação não tem mudado

significativamente nas últimas décadas, devido às propriedades biológicas do GBM. A

proteína KIT, membro da família III dos receptores de tirosina quinase (RTK), está envolvida

com a tumorigênese de alguns tumores e devido à existência de uma pequena molécula

inibidora de KIT tem feito desta proteína um alvo molecular terapêutico para o câncer. Em

GBMs, tem sido observada a presença de amplificação gênica de KIT, em vez de mutações

ativantes neste gene. Devido ao splicing alternativo do RNAm, KIT é expressa em duas

diferentes isoformas, que são caracterizadas pela presença (+) ou ausência (-) da sequência

tetrapeptídica (GNNK) na região extracelular justamembranar. Estas isoformas demonstram

possuir características de sinalização intracelular distintas e também diferente atividade de

transformação tumorigênica em fibroblastos de camundongos. JUSTIFICATIVA: Resultados

preliminares tem mostrado que as isoformas GNNK são frequentemente co-expressas tanto

em linhagens celulares de GBMs quanto em tecidos normais, com GNNK- sendo a forma

predominante em linhagens celulares de GBM, enquanto que em tecidos normais cerebrais

é predominante a isoforma GNNK+, sugerindo que a isoforma GNNK- pode desempenhar um

papel na tumorigênese de GBM. Nosso trabalho é o primeiro a abordar o papel funcional das

isoformas GNNK de KIT em GBM. OBJETIVO: Dessa forma, neste projeto, temos o objetivo

de esclarecer o papel funcional e biológico das isoformas GNNK de KIT em GBMs a fim de

observar se as isoformas GNNK conferem sinalização celular e papel tumorigênico distintos,

além de observar o impacto clínico em pacientes com GBM. MATERIAL E MÉTODOS: Tecidos

congelados/parafinados de glioblastoma foram avaliados quanto à expressão das isoformas

GNNK por RT-PCR e quanto à expressão de KIT por imunohistoquímica. Além disso, foram

realizados ensaios celulares (in vitro e in vivo) com linhagens celulares de GBM transfectadas

com as isoformas GNNK. RESULTADOS: Podemos observar que o RNAm de KIT está presente

em 95% das amostras de tecidos tumorais congelados/parafinados, sendo predominante a

isoforma GNNK+, quanto à presença da proteína, expressa em uma frequência menor, está

presente em apenas 22,8% das células neoplásicas e 40,2% nas células endoteliais. Em uma

casuística de 21 casos, observamos que a expressão de p-KIT só é encontrada nos casos que

expressam SCF e KIT, indicando que KIT é ativado em GBM através de mecanismos

autócrinos/parácrinos. Em relação ao impacto clínico das isoformas, encontramos uma

tendência na sobrevida de pacientes que expressam o RNAm daqueles que não expressam,

estes por sua vez, apresentam uma melhor sobrevida. Nos ensaios celulares, notamos maior

viabilidade, potencial de invasão e proliferação tumoral das células transfectadas com a

isoforma GNNK-; também notamos maior crescimento tumoral nos ensaios in vivo.

CONCLUSÕES: Embora não conseguimos diferenças estatisticamente significativas entre a

expressão das isoformas e a sobrevida global, através dos ensaios celulares conseguimos

notar que há diferenças na ativação de KIT e no papel tumorigênico entre as isoformas,

sendo a GNNK- mais tumorigênica.

PALAVRAS-CHAVE: Isoformas; KIT; Glioblastoma; Terapia-Alvo; Tratamento; Biomarcador.

ABSTRACT

Cury FP. Functional role of KIT GNNK+ and GNNK- isoforms in glioblastoma. Dissertation

(Master’s degree). Barretos: Barretos Cancer Hospital; 2016.

INTRODUCTION: Glioblastoma is the most common adult brain tumor and one of the

deadliest human malignancies and this situation has not significantly changed in the last

decades, due to the biological properties of GBM. KIT, a member of the receptor tyrosine

kinase (RTK) family III, is involved with the tumorigenesis of some tumors and the existence

of specific small molecule inhibitors for KIT made this protein a key molecular therapeutic

target in cancer. In GBMs, it has been observed the presence of KIT gene amplification,

instead of activating mutations in this gene. Due to mRNA alternative splicing, KIT is

expressed by two different functional isoforms, which are characterized by the presence (+)

or absence (-) of a tetrapeptide sequence (GNNK) in the extracellular juxtamembrane region.

They were shown to display distinct intracellular signaling features and also different

tumorigenic transforming activities in mouse fibroblasts. JUSTIFICATIVE: Preliminary results

have showed that GNNK isoform are frequently co-expressed in both glioblastoma cell lines

and normal tissues, with GNNK- being the prevalent form in glioblastoma cell lines, whereas

in normal brain tissues there is predominance of GNNK+ isoform, suggesting that GNNK-

isoform could play a role in glioblastoma tumorigenesis. Hitherto, there are no reports

assessing KIT GNNK isoforms functional role of KIT GNNK isoforms in GBM. AIM: Thus, in this

project we aim to shed light on the functional and biological role of KIT GNNK isoforms in

GBMs to observed if the GNNK isoforms present cell signaling and distinct tumorigenic role,

in addition, observe the clinical impact in patients with GBM. MATERIAL AND METHODS:

Frozen/FFPE glioblastoma tissues was evaluated for expression of GNNK isoforms by RT-PCR

and also evaluated the KIT expression by immunohistochemistry. Additionally, cellular assays

were performed (in vitro and in vivo) in glioblastoma cell lines transfected with GNNK

isoforms. RESULTS: We observe that KIT mRNA is present in 95% of frozen/paraffin

embedded tumor tissues, with GNNK+ isoform predominance in tumor tissues, regarding the

protein presence, expressed in lower frequency, it is present in only 22,8% neoplastic cells

and 40,2% in endothelial cells. In 21 cases, we found that p-KIT expression is found only in

cases that express SCF and KIT, indicating that KIT is activated in GBM through

autocrine/paracrine mechanisms. Relative to isoforms clinical impact, we found differences

in survival between patients that express the mRNA of those who do not express, these in

turn have a better survival; in cellular assays, we noticed greater viability, potential invasion

and proliferation of tumor cells transfected with the isoform GNNK-; also noticed greater

tumor growth in in vivo assays. CONCLUSIONS: Although we cannot statistically significant

differences between the expression of isoforms and overall survival, through cellular assays

can notice that there are differences in the activation of KIT and tumorigenic role between

isoforms, and the GNNK- more tumorigenic.

KEYWORDS: Isoforms; KIT; Glioblastoma; Targeted Therapy; Treatment; Biomarker.

1

INTRODUÇÃO

2

1 INTRODUÇÃO

1.1 Câncer

O câncer é um termo genérico para várias doenças (mais de 100 tipos) que podem

afetar qualquer parte do corpo, é definido também como tumores malignos ou neoplasias.

Sua principal característica é o crescimento descontrolado de células anormais que crescem

além dos seus limites, e que podem invadir partes adjacentes e se espalhar para outros

órgãos, processo conhecido como metástase (OMS – Organização Mundial da Saúde). Essas

células em um determinado tecido já não são responsivas aos sinais específicos deste tecido

que regulam a diferenciação celular, sobrevivência, proliferação e morte.

A ideia de que o câncer é uma doença genética das células somáticas foi proposta em

1914 por Theodor Boveri e, desde então, outros estudos confirmam que o câncer é uma

doença genética, entretanto se diferencia por dois motivos do restante das outras doenças

genéticas: (1) é causado, na sua maioria, a partir de mutações somáticas, enquanto que

todas as outras doenças genéticas em mamíferos (exceto aquelas que envolvem genes

mitocondriais) são causadas unicamente por mutações nas linhagens germinativas; (2) cada

câncer se inicia não a partir de uma única mutação, mas a partir de um acúmulo de

mutações 1.

Como sabemos, em alguns tecidos adultos ocorre a proliferação celular contínua

como estratégia de renovação tecidual. Entretanto, em outros tecidos, essa proliferação

constante não acontece, exceto nos processos de cicatrização, como exemplo os

hepatócitos, células do músculo cardíaco e os neurônios, que permanecem funcionais por

longos períodos ou até mesmo durante toda a vida do organismo. Os danos genéticos em

duas principais classes de genes (Proto-oncogenes e Genes Supressores Tumorais) estão

envolvidos na perda dessa regulação celular, levando à falhas dos mecanismos que

controlam o crescimento e proliferação celular 2. Os proto-oncogenes são ativados por

alterações tornando-se oncogenes, que causa uma atividade excessiva na promoção do

crescimento. Os genes supressores tumorais normalmente reprimem o crescimento, então o

dano nesses genes permite o crescimento inapropriado.

3

Além disso, mecanismos epigenéticos, que são essenciais para o desenvolvimento

normal e manutenção do padrão de expressão gênica de tecidos específicos, podem

contribuir também para a perda da regulação celular, levando à alterações na função do

gene e transformação maligna celular. Mecanismos epigenéticos no câncer incluem

metilação do DNA, modificação de histonas e microRNAs 3.

Com a finalidade de compreender a diversidade das doenças neoplásicas foi proposto

por Hanahan e Weinberg (2000 e 2011) os Hallmarks of Cancer, que são capacidades

biológicas adquiridas durante o desenvolvimento dos tumores. Dessa forma, as células

normais precisariam adquirir uma sucessão dessas capacidades para o processo de

tumorigênese se iniciar. São os hallmarks: manutenção da sinalização proliferativa,

descontrole dos supressores de crescimento, resistência à morte celular, imortalidade,

indução de angiogênese, ativação de invasão e metástase, desregulação energética,

bloqueio da destruição do sistema imune, inflamação como indutor de tumores,

instabilidade genômica e mutações. A compreensão desses conceitos tende a afetar cada

vez mais o desenvolvimento de novos meios para tratar o câncer 4.

O processo de origem do câncer, é chamado de oncogênese ou tumorigênese, sendo

iniciado a partir de erros na duplicação ou reparo de genes que podem ocorrer

espontaneamente, ou pela alteração por carcinógenos. Dessa forma, esse processo é uma

interação entre a genética e o ambiente 2. Aproximadamente 5 – 10% de todos os cânceres

são herdados, sendo portanto, a maioria esporádicos 5. Além de causas genéticas, como as

síndromes hereditárias, já existe um conjunto de fatores ambientais e estilo de vida bem

definidos envolvidos na causa do câncer, são eles: tabagismo, álcool, dieta, atividade física,

fatores ocupacionais, fatores ambientais e agentes infecciosos 6.

1.2 Epidemiologia

Tumores primários do Sistema Nervoso Central (SNC) são representados por

neoplasias benignas e malignas que apresentam histologia e alterações moleculares

distintas. As neoplasias malignas constituem a principal causa de morte relacionada ao

4

câncer (sólido) na população pediátrica e a terceira em adultos de meia-idade, embora

representem menos de 2% de todas as neoplasias malignas 7-9.

Dentre os principais fatores de risco associados aos tumores do SNC estão as

síndromes genéticas raras, responsáveis por cerca de 5% dos gliomas malignos, são elas:

neurofibromatose do tipo 1 e 2, esclerose tuberosa, doença de Von Hippel-Lindau,

síndromes de Li-Fraumeni, Gorlin e Turcot. Em relação aos fatores ambientais, a exposição a

altas doses de radiação ionizante está associada ao aumento do risco, enquanto substâncias

químicas, exposição ocupacional, etilismo, tabagismo, radiação não-ionizante (telefone

celular), trauma craniano e infecções não apresentam resultados conclusivos 9-11.

Considerando os tumores do SNC malignos, os gliomas são responsáveis por 70% dos

casos, e os astrocitomas correspondem a 76% dos gliomas 12.

As taxas de incidência dos gliomas variam de acordo com o tipo histológico, idade de

diagnóstico, gênero, raça e país. Os gliomas são mais comuns em homens que em mulheres,

exceto os astrocitomas pilocíticos que ocorrem em taxas semelhantes 11. Os astrocitomas de

alto-grau (anaplásico e glioblastoma) aumentam sua incidência de acordo com a idade,

atingindo pacientes entre 75-84 anos, na sua maioria. Já os oligodendrogliomas e

oligoastrocitomas, são mais comuns em pacientes com idade entre 35-44 anos 13.

Para o Brasil, no ano de 2014, foram estimados 4.960 casos novos de câncer do SNC

em homens e 4.130 em mulheres, segundo o Instituto Nacional do Câncer (INCA). Mesmo

não sendo muito frequentes, os tumores de SNC contribuem significativamente para a

morbidade global. Durante as últimas décadas, a incidência e mortalidade dos tumores de

SNC têm aumentado na maioria dos países desenvolvidos e, isso se deve à melhoria de

novas tecnologias diagnósticas e também à maior expectativa de vida 14, 15. As estatísticas de

casos novos para 2016 no Brasil têm aumentado, cerca de 5.440 novos casos em homens e

4.830 novos casos em mulheres, como mostra a figura 1.

5

a.

b.

Figura 1 – Estimativas para o ano de 2016 das taxas brutas de incidência por 100 habitantes e do

número de casos novos de câncer, segundo sexo (a: homens; b: mulheres) e localização primária

para o Brasil 16.

6

1.3 Tumores Primários do Sistema Nervoso Central

A base para o conceito de classificação dos tumores do SNC foi lançada em 1856 por

Virchow, que descreveu a neuroglia. Atualmente, a classificação mais aceita e empregada

para tumores do SNC, é a classificação da OMS de 2007, que pode ser considerada como

uma escala de malignidade de acordo com o comportamento clínico e biológico, o perfil

genético e o prognóstico das neoplasias 17.

Os gliomas malignos são o grupo mais comum, representando aproximadamente 70%

de todos os tumores cerebrais, são denominados dessa forma devido à sua semelhança com

as células gliais do cérebro. São classificados de acordo com a diferenciação das células

progenitoras, apresentando propriedade de astrócitos, oligodendrócitos e células

ependimais 18.

Os gliomas são classificados histologicamente em astrocitomas, oligodendrogliomas,

oligoastrocitomas e ependimomas. Estes, por sua vez, são classificados de acordo com o

grau de malignidade: astrocitomas são graduados em astrocitoma pilocítico (grau I),

astrocitoma difuso (grau II), astrocitoma anaplásico (grau III) e glioblastoma (IV);

oligodendrogliomas e oligoastrocitomas são graduados em difuso (grau II) e anaplásico (grau

III) 19. Ependimomas são classificados em ependimoma mixopapilar (grau I), subependimoma

(grau I), ependimoma clássico (grau II) e ependimoma anaplásico (grau III) 17.

Diferente de outros tumores sólidos, nos gliomas raramente ocorre metástase para

outros locais do corpo 19.

Meduloblastoma

Oligodendroglioma

Oligoastrocitoma

Astrocitoma

Neurônios

Oligodendrócitos

Astrócitos

Células-tronco neurais

Células progenitoras

neurais

Células progenitoras gliais restritas

Células progenitoras

neurais restritas

7

Figura 2 – Esquema do desenvolvimento de células neuroectodermal (neurônios e células da glia) e

classificação dos tumores neurológicos. No SNC, células neurais multipotentes originam três tipos

celulares principais no SNC – neurônios, oligodendrócitos e astrócitos. A classificação dos tumores

do SNC é baseada no seu tipo celular predominante (Adaptado) 20.

1.4 Glioblastoma

A manifestação mais frequente e agressiva entre os gliomas, o GBM, apresenta uma

proliferação endotelial, necrose, alta densidade de células e atipias 18, é dividido em primário

e secundário, que afetam vias genéticas diferentes, afetam pacientes em idades diferentes

e, também apresentam prognósticos diferentes 21. O GBM, tipo mais agressivo entre os

astrocitomas, é responsável por 53,8% dos gliomas 12.

GBMs primários (de novo) acometem cerca de 80% dos casos e ocorrem em pacientes

mais idosos (média de idade: 62 anos), enquanto GBMs secundários desenvolvem-se a partir

de astrocitomas ou oligodendrogliomas de baixo-grau (média de idade: 45 anos); em

crianças, os GBMs são raros, acometendo apenas 3 % dos tumores cerebrais e do SNC em

pacientes de 0-19 anos de idades. O GBM possui um mau prognóstico com sobrevida relativa

bastante baixa, sendo a média de 16 meses; apenas alguns pacientes alcançam o tempo de

sobrevida de 2,5 anos e menos de 5 % dos pacientes alcançam uma sobrevida de 5 anos

após o diagnóstico 22.

Os glioblastomas apresentam a pior sobrevida global, onde os fatores prognósticos

mais importantes para a sobrevida após diagnóstico desses pacientes são: grau de ressecção

do tumor, idade do diagnóstico e índice de Karnofsky 23, 24.

O tratamento consiste na máxima ressecção cirúrgica, seguido de radioterapia (RT)

com temozolamida (TMZ) concomitante seguido de seis ciclos de manutenção de TMZ 25;

apesar de todos os avanços da neurocirurgia, radioterapia e quimioterapia – o fato

estatístico pouco mudou ao longo das últimas três décadas 7. Portanto, novas formas de

terapias são necessárias para melhoras significativas na sobrevivência desses pacientes.

1.5 Receptores Tirosina Quinase

8

Os Receptores Tirosina Quinase (RTK) são receptores de membrana celular que foram

descobertos há 25 anos atrás e, emergiram como chave regulatória de processos celulares

importantes, como proliferação, diferenciação, sobrevivência, metabolismo, migração

celular e controle do ciclo celular 26. São responsáveis por receber e transmitir os sinais

extracelulares, se ligando a fatores de crescimento e outras proteínas liberadas localmente

que estão presentes em baixas concentrações. Humanos possuem 58 RTKs conhecidos, que

são divididos em 20 subfamílias como ilustrado na figura 3. Todos os RTKs apresentam uma

estrutura bastante similar, são constituídos por uma porção extracelular com o sítio de

ligação para o fator de crescimento, uma região transmembrana e a região citoplasmática

que contém os domínios tirosina quinase (TK) além de uma terminação carboxila (C-) e

regiões regulatórias justamembrana 26, 27.

O ligante é responsável por induzir ou estabilizar a dimerização do receptor, levando

ao aumento da atividade quinase do RTK. O domínio intracelular catalítico deste receptor

apresenta sítios de ligação de ATP responsáveis por catalizar a autofosforilação de resíduos

tirosina citoplasmáticos, que servem como sítios de ligação para Src homology 2 (SH2) e

phosphotyrosine-binding (PTB) contendo proteínas como Shc, Grb2, Src, Cbl e PLC. Essas

proteínas, então, recrutam moléculas efetoras que ativam a cascata de sinalização

intracelular, sendo as principais: MAPK, PI3K/AKT e JAK/STAT 28.

Os RTKs apresentam uma atividade fundamental nas células normais, entretanto, a

desregulação da sua sinalização, seja por mecanismos autócrinos ou parácrinos dos fatores

de crescimento ou por alterações genéticas resultam em uma ativação da sinalização

constitutiva ou fortemente aumentada, levando à uma transformação maligna. São três os

principais mecanismos que levam à essa desregulação: (1) Amplificação gênica: ocorre a

superexpressão de um RTK na membrana celular aumentando a incidência da dimerização

do receptor mesmo na ausência do ligante, um exemplo importante é a superexpressão

e/ou amplificação de HER2 em casos de câncer de mama e ovário 29 e, também a

amplificação de EGFR em câncer de pulmão não-pequenas-células, bexiga, cervical, ovário,

rim, pâncreas e cabeça e pescoço; (2) Mutações gênicas: incluem deleções ou mutações no

domínio extracelular e alterações no domínio catalítico de ligação do ATP, um exemplo é a

forma mutada de EGFR, EGFRvIII, caracterizado pela deleção de 267 aminoácidos no

domínio extracelular levando a uma ativação constitutiva na ausência do ligante 30; e (3)

9

Estimulação autócrina ou parácrina: esse mecanismo ocorre quando o RTK é expresso de

forma aberrante ou superexpresso na presença de um ligante conhecido ou quando ocorre a

superexpressão do ligante 31. Dentre as desordens causadas pela desregulação da atividade

tirosina quinase estão: câncer, diabetes, inflamação, arteriosclerose e angiogênese 26.

Figura 3 – Famílias dos Receptores Tirosina Quinase (RTK). Nesse esquema, estão listados todos os

membros de cada família 26.

1.6 KIT

O KIT foi originalmente isolado como um oncogene retroviral (v-kit) a partir da

transformação aguda do Hardy-Zuckerman retrovirus 4 felino 32. Logo após ser descoberto,

10

KIT foi encontrado codificado pelo locus W que possui mais de 30 mutações conhecidas 33.

Além disso, a proteína KIT também denominada CD117, foi definida como um receptor

tirosina quinase (RTK) pertencente à subfamília III das RTKs, incluindo também PDGFRA/B

(Platelet-derived growth fator receptor alpha/beta), FLT3 (Fms-Related Tyrosine Kinase) e

GM-CSF (Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor). Essa subfamília é composta

por um domínio extracelular e um domínio intracelular de tirosina quinase dividido em duas

partes. O domínio extracelular de KIT contém cinco imunoglobulinas (codificada pelo éxons

1-9), o domínio transmembrana (codificada pelo éxon 11) e o domínio tirosina quinase

(codificada pelos éxons 13-21) 34, e por fim, a extremidade terminal COOH. KIT é uma

proteína com 976 aminoácidos, fazendo com que o tamanho da proteína seja de

aproximadamente 110 kDa; ligações heterogêneas de glicosilação resultam na proteína

madura com 145 e 160 kDa 34, 35. Existem até nove sítios de N-glicosilação, a maioria

concentrada no domínio extracelular próximo à membrana plasmática. Outras modificações

pós-traducionais são conhecidas no KIT, incluindo a fosforilação nos resíduos tirosina e

serina 36 e também a ubiquitinação para regulação da sua internalização de degradação 37-39.

O ligante de KIT, também conhecido como Stem cell factor (SCF) ou Steel factor, é um

fator de crescimento que existe ligado à membrana ou então na forma solúvel. O gene que

codifica o ligante está localizado no cromossomo 10 em camundongos e no cromossomo 12

em humanos 40 e possui nove éxons 41. O SCF é expresso por fibroblastos e células

endoteliais em todo o corpo, promovendo a proliferação, migração e sobrevivência e

diferenciação de progenitores hematopoiéticos, de melanócitos e de células germinativas 40.

Sob circunstâncias normais, o ligante SCF se liga no KIT e ativa a sua função tirosina quinase

intrínseca formando um elo de ligação com duas moléculas de KIT a um dímero, levando a

uma fosforilação cruzada de dois resíduos de tirosina (Y568 e Y570) no domínio da

justamembranar autoinibitório e a transfosforilação do Y823 no local de ativação do domínio

tirosina quinase. A autofosforilação subsequente de outros resíduos de tirosina quinase

(Y703, Y721, Y730, Y736) permite a ativação de vias de cascatas de sinalização como MAPK,

PI3K/AKT e JAK/STAT. Essas cascatas de sinalização culminam na regulação gênica de vários

mecanismos celulares, incluindo apoptose, proliferação celular, diferenciação, adesão e

mobilidade 42. A sinalização de KIT é essencial para a manutenção de células-tronco durante

a hematopoiese, gametogênese, e melanogênese. Conforme estas observações, a falta de

11

KIT provoca múltiplos defeitos que incluem anemia, esterilidade, e despigmentação

(piebaldismo), e a ausência de KIT leva camundongos mutados à morte durante a primeira

semana de vida devido ao defeito hematopoiético 43.

Alterações em KIT têm sido implicadas no câncer. Diversas evidências, incluindo

algumas do nosso grupo 44-46, mostraram que as propriedades oncogênicas de KIT são devido

à mutações de ganho de função deste gene [por exemplo, tumores estromais

gastrointestinais (GISTs)], com a presença de mecanismos autócrinos/parácrinos com SCF

(por exemplo, carcinomas de pulmão e ginecológicos), e pela presença de amplificação

gênica (por exemplo gliomas e seminomas) 43, 47. Ressalta-se que o oncogene KIT representa

um alvo molecular terapêutico chave no câncer, com o desenvolvimento de inibidores

específicos, como o imatinib e sunitinib, levando à eficácia clínica sem precedentes no

tratamento de GIST com KIT (éxons 11 e 9 hotspots) mutado 48.

1.7 KIT e Sistema Nervoso Central

O papel do KIT no SNC está longe de ser bem compreendido. KIT está descrita como

sendo expressa em diferentes regiões do SNC durante o desenvolvimento normal do cérebro

49. Uma variedade de abordagens sugere que, no sistema nervoso de adultos, a sinalização

KIT pode exercer diversas funções como, o estabelecimento da conexão neuronal,

sobrevivência, e potenciar as atividades sinápticas. Além disso, o KIT exerce um papel na

diferenciação oligodendrocítica, na migração de células progenitoras à locais de danos no

cérebro e, é expresso em zonas neuroproliferativas do cérebro adulto 50-52.

Nos tumores do SNC, alguns estudos têm mostrado a superexpressão em

meduloblastoma, neuroblastoma e glioma 53. O nosso grupo analisou uma série de 185

gliomas, detectando a superexpressão de KIT em 16% dos casos e amplificação gênica de KIT

em 33% dos gliomas positivos para KIT, principalmente nos GBMs, sugerindo que a

amplificação gênica de KIT, em vez de mutações ativantes, pode ser o mecanismo molecular

subjacente à superexpressão da proteína em GBMs 46, 54. Estes resultados foram confirmados

por outros estudos 55-57, destacando o papel de KIT em um subconjunto de GBMs.

Interessantemente, um estudo relatou a superexpressão de KIT induz a proliferação de

12

astrócitos em camundongos, que é inibida pelo imatinib 58. Além disso, em outro estudo

onde verificaram a expressão de KIT em 345 tumores, sendo de 34 diferentes histologias,

observaram que somente os glioblastomas apresentam a expressão de KIT no tecido

endotelial em 59% dos casos de GBM (13/22), estes tumores são conhecidos por abrigar

proliferação microvascular com características morfológicas próprias 59.

Segundo dados do TCGA (The Cancer Genome Atlas) - TCGA, Nature 2008, TCGA, Cell

2013 e TCGA Provisório – disponível no cBioPortal for Cancer Genomics, foram avaliados

dados de mutação, deleção e amplificação de KIT em GBMs. No TCGA 2008, em 91 casos,

foram encontrados 11% (10 casos) de amplificação e 1,1% (1 caso) de mutação; no TCGA

2013, em 281 casos, foram encontrados 9,6% (27 casos) de amplificação e 1,1% (3 casos) de

mutação; e no TCGA Provisório, em 273 casos, foram encontrados 9,2% (25 casos) de

amplificação e 1,1% (3 casos) de mutação. As mutações encontradas foram V50M (2), D72E

(2), T132M (2) e A599T (1).

a.

Mutação

Deleção

Amplificação

Múltiplas alterações

13

b.

V5

0M

D7

2E

T13

2M

A5

99

T

Figura 4 – Análise de alterações em casos do TCGA no gene KIT em GBMs, disponível no cBioPortal

for Cancer Genomics. a: Avaliação de alterações encontradas, mutação e amplificação, no gene KIT

em GBMs. b: Mutações encontradas no gene KIT em GBMs.

1.8 Isoformas GNNK

O splicing alternativo do RNA mensageiro (RNAm), devido ao uso alternativo da

região de corte doadora 5’, resulta na produção de duas isoformas caracterizadas pela

presença (+) ou ausência (-) de 12 nucleotídeos que codificam uma sequência tetrapeptídica

Gly-Asn-Asn-Lys (GNNK) na parte extracelular da região justamembranar (éxon 9) como

ilustrado na figura 5. As isoformas GNNK+ e GNNK- também são denominadas de c-Kit e c-

KitA, respectivamente. São coexpressas na maioria dos tecidos, mas a isoforma GNNK-

geralmente é predominante 34, 60-62.

COOH

NH2

IG1

IG2

IG3

IG3

IG3

TM

TK1

TK2

GNNK

IG1

IG2

IG3

IG3

IG3

TM

TK1

TK2

NH2

COOH

G N N K

CO

OH

NH

2

IG1

IG2 IG

3

IG3

IG3

TM

TK1

TK2

…GCA TTT AAA GGT AAC AAC AAA GAG CAA

G N N K

…GCA TTT AAA GAG CAA

-

Reith et al, Embo J, 1991

Yarden at al, Embo J, 1987

cDNA

cDNA

+

14

Figura 5 – Esquema das isoformas GNNK de KIT codificadas devido ao splicing alternativo do RNA

mensageiro que resultam na produção de duas isoformas caracterizadas pela presença (+) ou

ausência (-) de 12 nucleotídeos que codificam uma sequência tetrapeptídica GNNK (Gly-Asn-Asn-Lys)

(Imagem adaptada).

Um estudo demonstrou que células NIH3T3 transfectadas com a isoforma GNNK- são

tumorigênicas in vitro e in vivo, enquanto células transfectadas com a isoforma GNNK+ não

são 63. Tem sido demonstrado também que essas isoformas diferem na intensidade e

duração de ativação de diferentes vias de sinalização, sendo a isoforma GNNK- tirosina

altamente fosforilada e rapidamente internalizada. Mais importante, o efeito de ambas

isoformas na cascata de vias de sinalização parece ser dependente do tipo celular 63-67. As

isoformas GNNK+ e GNNK- parecem ser coexpressas numa variedade de tipos celulares, com

a predominância da isoforma GNNK-. Em neoplasias hematológicas, os estudos sugerem

que não há diferenças entre a distribuição de células normais e neoplásicas em isoformas

GNNK. Em relação a tumores sólidos, os poucos relatos sobre diferentes neoplasias

apresentam resultados inconsistentes 61, 63-69. Um estudo mostrou que a co-expressão de

ambas isoformas resulta na diminuição da sobrevida global em pacientes com leucemia

mieloide aguda (LMA) comparado com pacientes que apresentam apenas a isoforma GNNK-

70.

Recentemente o nosso grupo realizou uma caracterização geral das isoformas de KIT

em um painel de 73 linhagens celulares comerciais provenientes de vários locais, como:

próstata, meduloblastoma, pâncreas, colo do útero, bexiga, cabeça e pescoço, mama,

esôfago, melanoma, cólon, glioma pediátrico, GBM, ovário e pulmão. Entre as diversas

linhagens celulares, podemos perceber, na maioria, a positividade de expressão de RNAm de

KIT com predominância da isoforma GNNK- (Martinho O et al, dados não publicados).

15

100% 100%

75%

50% 50%42,8%

33,3% 33,3%27,3%

20% 20%14,3%

25%

50%

25% 42,8% 66,6% 66,6%

54,5%

40% 40%

85,7%

100%

60%

20%10%

25%14,3% 18,2%

30%40%

20%

negativa 25% GNNK+; 75% GNNK- 50% GNNK+; 50% GNNK- 75% GNNK+; 25% GNNK- 100% GNNK+ 100% GNNK-

N=3 N=2 N=4 N=4 N=4 N=7 N=6 N=3 N=11 N=10 N=5 N=7 N=2 N=5

Figura 6 - Caracterização das isoformas GNNK de KIT de um amplo painel (73) de linhagens celulares

tumorais (Martinho O et al, dados não publicados).

1.9 Terapia-Alvo

Os GBMs são um dos maiores desafios para o tratamento do câncer, apresentam um

mau prognóstico devido à resistência terapêutica (heterogeneidade molecular intratumoral

e resistência às “glioma stem-cells”) e recorrência tumoral após a ressecção cirúrgica (alto

potencial invasivo tumoral) 71. Entretanto, a terapia-alvo têm sido uma promessa para o

tratamento de pacientes com gliomas malignos, devido ao sucesso alcançado em outros

tipos tumorais, como câncer de pulmão não-pequenas células 72, melanoma 73 e leucemia

mieloide aguda 74.

Em 2008, o TCGA (The Cancer Genome Atlas) identificou três vias de sinalização

principais na patogênese dos glioblastomas: receptores tirosina quinase (RTK)/RAS/PI3K, p53

e proteína do retinoblastoma (RB) 75. Além da via pró-angiogênica, importante para a

gliomagênese e manutenção do fenótipo dos gliomas 71.

16

Figura 7 – Alterações genéticas frequentes de GBMs em três vias de sinalização críticas. Alterações

nas sequências primárias e mudanças significativas de copy number para os componentes das vias de

sinalização de (a) RTK/RAS/PI3K, (b) p53 e (c) RB. Vermelho indica alterações genéticas ativantes,

com genes mais frequentemente alterados em tons de vermelho mais forte. Em azul, estão indicadas

alterações de inativação, quanto mais forte o azul, corresponde à maior porcentagem de alterações.

Para cada componente alterado de cada via de sinalização, o tipo da alteração e a porcentagem dos

tumores afetados estão indicados. Caixas azuis contêm as porcentagens finais de glioblastomas com

alterações em pelo menos um componente conhecido da via designada 75.

Terapia-alvo específicas para essas vias de sinalização tem sido a principal estratégia

de tratamento para a terapia molecular de gliomas. Entretanto, as vias de p53 e RB são

difíceis de tornar-se um alvo terapêutico, dessa forma, as vias dos RTK tem sido o principal

foco para potenciais estratégias terapêuticas. Receptores de fatores de crescimento (EGFR E

PDGFR, por exemplo) ou RTKs são proteínas que atravessam a membrana plasmática e

apresentam um domínio extracelular que se ligam aos seus respectivos ligantes (EGF e

17

PDGF, por exemplo) e domínios intracelulares associados à atividade tirosina quinase. Essas

alterações genéticas na via dos RTK/RAS/PI3K em GBM foi confirmada em mais de 88% dos

tumores 75. VEGFR (Vascular endothelial growth factor receptor) também é um RTK

responsável pela regulação da angiogênese, VEGF (Vascular endothelial growth factor) se

liga em VEGFR ativando cascatas de sinalização intracelular pelas vias de RAS/MAPK e

PI3K/AKT, promovendo a migração e proliferação de células endoteliais e estimulando a

formação de novos vasos sanguíneos, além disso, a expressão de VEGF tem sido relatada de

acordo com o grau de malignidade do tumor, por isso a proposta do alvo VEGF/VEGFR

parece efetiva para o controle do crescimento tumoral 76, 77. O Bevacizumab é um anticorpo

monoclonal contra o VEGF, aprovado pelo FDA em 2009 78. Entretanto, apesar da resposta e

aumento da sobrevida livre de progressão, o bevacizumab não beneficiou a sobrevida global

de pacientes com glioblastoma, tanto recorrentes quanto diagnosticados de novo 79-81.

Existem diversos inibidores de KIT, conhecidos como TKIs (tyrosine kinase inhibitor),

que atuam em outros receptores também, por exemplo: Imatinib/Gleevec (alvos: KIT e

PDGFRA), Sunitinib/Sutent (alvos: KIT, PDGFRA e VEGFR2), Sorafenib/Nexavar (alvos: KIT,

PDGFRA e VEGFR2), Dasatinib/Sprycel (alvos: Abl, Src e KIT), Nilotinib/Tasigna (alvos: Bcr-Abl

e KIT) e Cediranib/Recentin (alvos: Bcr-Abl, VEGFR e KIT). Todos já são aprovados pelo FDA

para outros tipos tumorais. É importante ressaltar que ensaios clínicos que avaliam a eficácia

de fármacos anti-KIT como agente único ou em combinação com a quimioterapia em

pacientes com GBM estão em andamento 82, 83, entretanto, é desconhecida sua resposta em

relação às isoformas GNNK de KIT em GBMs.

18

JUSTIFICATIVA

19

2 JUSTIFICATIVA

Como mencionado na revisão de literatura, KIT parece regular um importante papel

tanto no SNC normal quanto no patológico. Para completar o nosso conhecimento sobre o

impacto de alterações de KIT em GBMs usamos linhagens celulares de GBM como modelos

in vitro. Assim, preliminarmente caracterizamos um painel de 8 linhagens celulares de GBMs

para alterações moleculares de KIT. Nenhuma das linhagens celulares apresenta mutações

ativantes no gene KIT, e a metade delas apresentam amplificação gênica em KIT 84. Sete das

linhagens celulares são positivas para a expressão do RNAm de KIT, e apenas duas

expressam a proteína (Martinho O et al, dados pessoais). Portanto, outros mecanismos

podem regular a expressão gênica e função de KIT, como o splicing do RNAm.

Surpreendentemente, a avaliação da expressão das isoformas GNNK de KIT nunca foi

realizada em ambos os tecidos, normal e tumoral de cérebro. Assim, investigamos a

distribuição relativa das duas isoformas de KIT nas 8 linhagens celulares de GBM e em 3

amostras de tecido cerebral normal através RT-PCR utilizando primers específicos, como

mostrado na figura 8. Em 7 linhagens celulares que expressam KIT, nós encontramos a co-

expressão de ambas isoformas com a predominância da isoforma GNNK-. Em contraste, em

3 amostras de tecidos cerebrais normais encontramos uma baixa expressão da isoforma

GNNK- e predominância de GNNK+ (Martinho O et al, dados pessoais). Essa expressão

inversa dos níveis das isoformas GNNK de KIT entre células normais e tumorais nunca foi

descrito antes para outros tipos celulares. Então, os nossos resultados preliminares são

muito promissores, indicando que o aumento da expressão da isoforma GNNK- pode

desempenhar um papel importante na tumorigênese do GBM.

hGUSRN

Am

GNNK+GNNK-

Linhagens Celulares Tecido cerebral

SW

10

88

U2

51

SN

B-1

9

U3

73

U8

7-M

G

GA

MG

SW

17

83

A1

72

NH

A

NF

NA

NB

a.

20

Pro

teín

a

CD117

β-Actina

Linhagens Celulares Tecido cerebral

SW

10

88

U2

51

SN

B-1

9

U3

73

U8

7-M

G

GA

MG

SW

17

83

A1

72

NH

A

NF

NA

b.

Figura 8 – a: Análise da expressão das isoformas GNNK de KIT por RT-PCR em linhagens estabelecidas

de glioblastoma, linhagem estabelecida de astrócitos humanos normais (NHA) e tecidos normais (NF:

tecido normal de cérebro fetal, NA e NB: tecidos normais de cérebro adulto) em gel de agarose a 4%.

b: Análise da expressão proteica das linhagens estabelecidas de glioblastoma, NHA, NF e NA por

western blot utilizando o anticorpo de KIT (CD117 – DAKO A4502).

21

OBJETIVOS

22

3 OBJETIVOS

O principal objetivo deste projeto é, assim investigar o papel funcional e biológico das

isoformas GNNK de KIT em GBMs. Especificamente, pretendemos avaliar o papel das

isoformas GNNK na sinalização de KIT e analisar o papel tumorigênico das isoformas de KIT.

Finalmente, em uma série de GBMs queremos saber as implicações clínicas das isoformas de

KIT nestes pacientes. Assim, propõe-se dividir o presente projeto em cinco tarefas:

1. Caracterizar a expressão de RNAm e proteína de KIT em linhagens e tecidos tumorais

de glioblastoma;

2. Impacto clínico das isoformas de KIT em pacientes com glioblastoma;

3. Análise do papel tumorigênico das isoformas de KIT;

4. Análise das vias de sinalização das isoformas de KIT;

5. Análise do papel tumorigênico das isoformas de KIT utilizando ensaio in vivo em

Membrana Corioalantóide (CAM) de embrião de galinha.

23

MATERIAL E MÉTODOS

24

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Tecidos tumorais (Casos)

Cento e dezessete amostras de tecidos congelados, dezenove amostras de tecidos

parafinados (FFPE) e noventa e dois cortes de 4 µm de tecidos tumorais parafinados de GBM

foram recuperados do arquivo de Patologia do Hospital de Câncer de Barretos, Barretos, São

Paulo, Brasil, com a aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) nº 802/2014 (Anexo A,

B e C), do Hospital Pedro Hispano, Matosinhos, Portugal e do Hospital Santo António, Porto,

Portugal. Foram coletadas informações clinico-patológicas relevantes como: idade do

paciente, sexo, cor, tabagismo, etilismo, índice de Karnofsky (KPS), lateralidade,

radioterapia, quimioterapia e recidiva da doença. Informações de follow-up também foram

coletadas para todos os pacientes e sobrevida global foi definida como o tempo entre a data

do primeiro diagnóstico e a data da última informação ou morte do paciente (de acordo com

a ficha de coleta – Anexo D). Além disso, tecidos normais cerebrais foram utilizados, sendo

um tecido normal fetal (NF) e dois tecidos normais adultos (NA e NB).

Amostras de GBM Amostras de GBM Prontuários

71 tecidos parafinados de GBM – Hospital de Câncer

de Barretos

21 tecidos parafinados de GBM – Hospital Santo

António

129 prontuários – Hospital de Câncer de Barretos

19 prontuários – Hospital Pedro Hispano (PT)

RNA Proteína

117 tecidos congelados de GBM – Hospital de Câncer

de Barretos

19 tecidos parafinados –Hospital Pedro Hispano (PT)

Revisão

136 amostras para expressão do RNAm e

isoformas

92 amostras para expressão da proteína

148 prontuários revisados

Figura 9 – Representação do número de amostras utilizadas para cada técnica (RT-PCR e IHQ),

número de prontuários revisados e as respectivas instituições onde foram coletados.

25

Critérios de Inclusão (amostras provenientes do Hospital de Câncer de Barretos):

- Indivíduos maiores de 18 anos;

- Pacientes com as suas respectivas amostras de tecido congelado tumoral.

4.2 Linhagens celulares e cultura celular

Oito linhagens celulares de GBM imortalizadas foram utilizadas: SW1088, SW1783, U-

87 MG e A172, obtidas da ATCC (American Type Culture Collection), SNB-19 e GAMG foram

obtidas da DSMZ (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures) e U251 e U373

foram fornecidas gentilmente pelo Professor Joseph Costello. Todas as linhagens celulares

foram mantidas em DMEM-10, a 37ºC e 5% CO2 85. Além disso, culturas celulares primárias

tumorais foram derivadas de biópsias cirúrgicas obtidas no Departamento de Neurocirurgia

do Hospital de Câncer de Barretos, São Paulo, Brasil. O estudo foi aprovado pelo Comitê de

Ética em Pesquisa local (nº 491/2011) e, os pacientes assinaram o termo de consentimento.

Cada amostra tumoral foi cortada em pequenos pedaços, removendo os vasos sanguíneos,

então ressuspendidos em tripsina (Gibco, Invitrogen) e incubados a 37ºC por 30 minutos.

Durante a incubação, a suspensão foi pipetada “up and down” várias vezes para a digestão

total dos tecidos 84.

A Autenticação das linhagens celulares foi realizada pelo Laboratório IdentiCell

Departamento de Medicina Molecular (MOMA) no Hospital Skejby - Universidade de Aarhus,

em Aarhus, Dinamarca) em Agosto de 2011. A genotipagem confirmou a identidade

completa de todas as linhagens, com exceção da U373, que se mostrou como um sub-clone

da linhagem celular U251 84. Também foi utilizada a linhagem celular de cérebro normal

denominada NHA (“normal human astrocytes” – astrócitos normais humanos).

4.3 Extração de RNA e RT-PCR (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction)

Para avaliar a expressão das isoformas GNNK de KIT, nós utilizamos a extração de

RNA e RT-PCR. Todas as amostras congeladas foram coletadas no Hospital de Câncer de

Barretos (Brasil), o estudo contém 117 amostras tumorais congeladas de glioblastoma. Para

26

a purificação do RNA total desses tecidos congelados foi utilizado o RNeasy Mini Kit

(Qiagen). Recomenda-se a quantidade máxima de 30 mg de tecido congelado e o RNA foi

extraído de acordo com as instruções do fabricante. Para a extração dos tecidos parafinados

foi utilizado o PureLink FFPE RNA Isolation Kit – Ambion (Thermo Fisher Scientific) .Para as

linhagens celulares, a extração do RNA foi realizada com o TRIzol (Invitrogen), utilizando 1

mL do reagente para 5-10 x 106 células. Para determinar a integridade do RNA extraído foi

utilizado o Agilent 2100 bioanalyzer and RNA LabChip, como nosso objetivo era amplificar

um pequeno amplicon, utilizamos RIN>3.

Para a síntese do cDNA, nós utilizamos o kit Thermo Scientific Phusion RT-PCR de

acordo com as instruções do fabricante. O cDNA foi amplificado por PCR utilizando o método

padrão. Os primers foward e reverse utilizados para amplificar as isoformas GNNK de KIT

foram: 3’TGGGCAAGACTTCTGCCTAT e 5’CTCCTCAACAACCTTCCACTG, respectivamente. A

análise das isoformas GNNK de KIT foi observada em gel de agarose (4%).

4.4 Imunohistoquímica e Imunoflorescência para CD117

Cortes representativos de 4 µm de espessura foram submetidos à

imunohistoquímica. A expressão de KIT (CD117) foi avaliada por imunohistoquímica de

acordo com o sistema indireto do complexo estreptavidina-biotina peroxidase, utilizando o

anticorpo primário CD117 (diluição de 1:50; clone A4502, DAKO Corporation, Carpentaria,

CA, EUA), como descrito anteriormente 44, 46, 54. Resumidamente, lâminas desparafinizadas e

re-hidratadas foram submetidas a 10 minutos de incubação em peróxido de hidrogênio em

metanol (3%), a fim de inibir a peroxidase endógena. Não foi utilizada recuperação

antigênica. Após a incubação com o anticorpo primário, overnight a 4ᵒC, o anticorpo

secundário biotinilado polivalente foi aplicado durante 10 minutos seguido de incubação

com o complexo de estreptavidina-peroxidase. A reação imune foi visualizada por 3,3'-

Diamonobenzidine (DAB) como cromogênio (Ultravision Sistema de Detecção do Anti-

polivalente, HRP / DAB; Lab Vision, Fremont, CA, EUA). Controles positivos e negativos

apropriados foram incluídos em cada série. Os controles positivos incluíram um tumor

estromal gastrointestinal como previamente caracterizados superexpressão CD117. Os

27

controles negativos incluíram omissão do anticorpo primário e do controle negativo DAKO

(N1699, DAKO Corp., Carpentia, Califórnia, EUA). Foi realizada a contra-coloração das

lâminas com hematoxilina Gill-2 (25%). Em uma série de 21 casos, também foi realizada a

imuno-histoquímica com o mesmo método, mas utilizando o anticorpo primário p-KIT (Cell

Signalling Tyr 719) e o anticorpo primário SCF (diluição de 1:500; Santa Cruz Biotechnology).

Amostras de tumor coradas foram analisadas de acordo com um método semi

quantitativo previamente descrito e sem o conhecimento dos achados clínicos. Marcação de

CD117 na membrana celular com ou sem immunoreatividade citoplasmática em células

neoplásicas foi considerado específico. Também foi analisada a marcação do tecido

endotelial que parece específico em GBM 46, 59. A determinação da distribuição de

intensidade e extensão eram semi-quantitativamente pontuado como se segue: (-)

(negativo), (+) (≤ 5%), (++) (5-50%), e (+++) (> 50 %). As amostras com contagens de (-) e (+)

foram considerados negativos, e aqueles com as contagens (++) e (+++) foram considerados

positivos.

Para detectar a localização e a abundância relativa da proteína KIT, foi realizada a

Imunofluorescência (IF) nas células GAMG, de acordo com o método indireto, utilizando o

anticorpo primário contra CD117 (diluição 1:50; clone A4502, DAKO Corporation,

Carpentaria, CA, US). Aproximadamente 1x103 células foram plaqueadas em lamínulas,

esperou-se até atingir a confluência desejada, o meio de cultura foi aspirado, foram lavadas

três vezes em PBS 1x. As células foram fixadas com metanol gelado por 5 minutos a -20ºC,

lavadas três vezes com PBS 1x. As células foram incubadas com Block (Labvision) por 15

minutos a temperatura ambiente, depois incubadas com o anticorpo primário overnight a

4ºC, o anticorpo secundário (diluição 1:500; Goat anti-Rabbit IgG; TRITC – Invitrogen,

Thermo Fisher Scientific) foi aplicado por 1 hora a temperatura ambiente e as lamínulas

lavadas três vezes em PBS 1x. Na lâmina, foi colocada uma gota da solução de montagem

com DAPI e colocada a lamínula na lâmina.

4.5 Transfecção estável de linhagens celulares

28

Os construtos que codificam ambas isoformas GNNK de KIT, clonados no plasmídeo

pBluescript, foram fornecidos pela Dra Leonie Ashman 86. Então, cDNAs foram subclonadas

no plasmídeo pCDNA3. As linhagens celulares foram estavelmente transfectadas, utilizando

a seleção do antibiótico G418, com as isoformas GNNK+ e GNNK-. As mesmas linhagens

celulares foram transfectadas com o vetor vazio a fim de serem utilizadas como controle.

4.6 Ensaio de Viabilidade Celular

Para determinar a diferença de viabilidade celular entre as células transfectadas com

as isoformas e o vetor vazio, as células foram plaqueadas em placas de 96 poços em uma

densidade de 2x103 células por poço e foi permitida a aderência das células overnight em

DMEM 10% SFB. Ao final de 24h, a viabilidade celular foi quantificada utilizando Cell Titer96

Aqueous Cell Proliferation Assay (MTS) (Promega), sendo o tempo 0 (controle). A viabilidade

foi quantificada em tempos subsequentes (48h, 72h e 96h). Os resultados foram expressos

como a média ± DP das células viáveis relativas ao controle (tempo 0). Os gráficos foram

realizados utilizando o software GraphPad Prism. Os ensaios foram realizados em triplicata

por pelo menos três vezes (triplicata biológica e triplicata experimental).

4.7 Ensaio de Clonogenicidade

As células (1x103) foram plaqueadas em placas de 12 poços e incubadas por 24 horas

para sua aderência. O meio de cultura foi retirado e colocado novamente de acordo com as

condições: DMEM 0,5% SFB e DMEM 10% SFB por 10-15 dias. As colônias foram coradas com

Giemsa 20% em metanol por 45 minutos e contadas manualmente 87.

4.8 Ensaio de Migração (Wound healing)

As células foram plaqueadas em placas de 6 poços e cultivadas até cerca de 95% de

confluência. A monocamada de células foram lavadas com PBS, foi realizada uma “ranhura”

29

com uma ponteira de plástico de 200 µl e incubado com condições definidas (ou

concentrações fixas de inibidores). As “ranhuras” foram fotografadas em microscópio de

contraste de fase em 0, 24 e 48 horas. A distância de migração relativa foi calculada pela

seguinte fórmula: porcentagem do fechamento da ranhura (%) = 100 (A-B)/A, onde A é a

largura da ranhura antes da incubação e B é a largura da ranhura depois da incubação 85.

4.9 Ensaio de Invasão em Matrigel

A invasão de células foi medida utilizando os insertos BD BioCoat Matrigel (BD

Biosciences), como indicado nas instruções do fabricante. Em resumo, 2.5x104 células foram

plaqueadas nos insertos de 24 poços revestidos com matrigel com meio de cultura 0,5% de

SFB. DMEM 10% SFB foi utilizado como quimioatrativo. Foi permitida a invasão das células

por 48 horas. As células invasivas, ligadas à membrana do inserto, foram fixadas com

metanol e coradas com hematoxilina. As células invasivas foram fotografadas no

microscópio com aumento de 40x e contados todos os campos da membrana. Os resultados

foram expressos em relação ao controle (vetor vazio) como a porcentagem média ± DP da

invasão.

4.10 Western blot

Para avaliar o efeito das vias de sinalização intracelulares e o KIT, as células foram

cultivadas em placas de 6 poços, permitindo o crescimento de 85% de confluência e depois

foram colocadas em starvation (meio de cultura sem SFB) por 2 horas e em seguida

estimuladas com o ligante SCF. Nos tempos indicados, as células foram lavadas e raspadas

em PBS 1X gelado e lisadas em buffer contendo 50 mM Tris pH 7.6-8, 150 mM NaCl, 5 mM

EDTA, 1 mM Na3VO4, 10 mM NaF, 10 mM NaPyrophosphate, 1% NP-40 e 1/7 de coquetel de

inibidores de proteases (Roche). Para a quantificação da concentração das proteínas foi

utilizado o reagente Bradford (Sigma-Aldrich). Western blotting foi realizado utilizando o

método padrão 10% SDS-PAGE, carregado 20ug de proteína por poço. Todos os anticorpos

foram utilizados como recomendado pelo fabricante [KIT (A4502), p-KIT Tyr-719 (#3391S),

30

ERK (#4695), p-ERK (#4370), AKT (#4691), p-AKT (#4060) e β-actina (#4967), todos anticorpos

da Cell Signaling, exceto KIT, da Dako.

A detecção das proteínas através do Western blot foi realizada por

quimioluminescência (SuperSignal™ West Pico Chemiluminescent Substrate – Thermo Fisher

Scientific) no ChemiDoc MP System (Bio-Rad).

4.11 Ensaio in vivo em Membrana Corioalantóide (CAM) de embrião de galinha

Para avaliar a proliferação e angiogênese in vivo, foi utilizada a CAM, como já descrito

previamente 84, 85, 88. Ovos de galinha fertilizados foram incubados a 37ᵒC e 70% de umidade,

em que no terceiro dia de desenvolvimento, uma janela é aberta na casca dos ovos, sendo

coberta com fita adesiva e retornaram à incubação. No nono dia de desenvolvimento,

células tumorais, aproximadamente 3x106 células, foram ressuspendidas em 20 µl de

matrigel e colocadas/injetadas sobre a CAM. No 13º dia, os tumores formados foram

fotografados in ovo utilizando Stereomicroscópio (Olympus S2616). No 17ᵒ dia, os tumores

foram fotografados novamente in ovo. Os ovos de galinha foram sacrificados a -80ᵒC por 10

minutos, e a CAM de cada um foi retirada, fixada em paraformaldeído 4% e fotografada ex

ovo, além de ser incluída em parafina para análises histológicas posteriores O perímetro dos

tumores foram medidos utilizando o ImageJ nos dias 13 e 17. Os resultados são expressos

através da média da porcentagem do crescimento dos tumores de cada grupo, do dia 13

(considerado como 0%) até o dia 17, ± SD. Para o descarte, os ovos são autoclavados.

4.12 Análise Estatística

Os resultados foram estatisticamente relacionados com dados clínicos dos pacientes

utilizando o programa SPSS (versão 21.0, SPSS Inc). O teste χ2 foi aplicado para correlacionar

a expressão das isoformas de KIT e os parâmetros clínico-patológicos. Estimativa da

sobrevida global (morte por qualquer motivo) foi realizada utilizando o método de Kaplan-

Meier, e a diferença entre as curvas de sobrevida foram avaliadas com o teste log-rank.

31

Comparações únicas entre diferentes condições foram realizadas utilizando o teste t-

Student, e diferenças entre grupos foram realizadas utilizando ANOVA. Análises estatísticas

foram realizadas utilizando o Graph Pad Prism versão 5. O nível de significância adotado em

todas as análises foi p-valor<0,05.

4.13 Delineamento Experimental

4.13.1 Caracterizar a expressão de RNAm e proteína de KIT em glioblastoma

Para esta proposta, analisamos a predominância das isoformas GNNK de KIT em

linhagens celulares primárias e estabelecidas, em um grupo de amostras congeladas ou

parafinadas por conveniência (136 casos) de GBMs, que foram coletadas nos últimos anos

no Hospital de Câncer de Barretos e Hospital Pedro Hispano (Portugal), de acordo com o

Comitê de Ética e o consentimento do paciente. Além de analisar a expressão das isoformas,

analisamos também a expressão proteica de KIT (células neoplásicas e tecido endotelial) em

uma casuística de 92 pacientes, além de avaliar p-KIT e SCF em uma casuística de 21

pacientes, através de imunohistoquímica.

4.13.2 Impacto clínico das isoformas de KIT em pacientes com glioblastoma

Dados demográficos e informações clínicas relevantes, incluindo a idade, sexo, cor,

tabagista, etilista, índice de Karnofsky (KPS), lateralidade, radioterapia, quimioterapia e

recidiva foram coletados e associados à predominância das isoformas e expressão da

proteína, também foram associados à sobrevida global dos pacientes. Além disso, avaliamos

a predominância das isoformas e presença da proteína em relação à sobrevida global.

4.13.3 Análise do papel tumorigênico das isoformas de KIT em glioblastomas

Para determinar o papel tumorigênico das isoformas GNNK de KIT em GBM por meio

de estudos in vitro, utilizamos as linhagens celulares transfectadas com GNNK, que foram

estimuladas com 100 ng/ml de SCF humano e a viabilidade celular foi medida pelo ensaio de

MTS (Promega) 84, 85, 89. Também avaliamos as mudanças na migração e invasão celular nas

32

células transfectadas, pelo ensaio de wound healing e ensaio de invasão em matrigel (BD

Biosciences), respectivamente 84, 85, 89. Além disso, avaliamos a habilidade de uma única

célula formar uma colônia através do ensaio de clonogenicidade, como descrito 87. Para

todos os ensaios in vitro, os experimentos foram repetidos três vezes e as células

transfectadas com o vetor vazio foram utilizadas como controle.

4.13.4 Análise das funções bioquímicas das isoformas de KIT em linhagens celulares

de glioblastoma

Para avaliarmos as diferenças de sinalização das isoformas de KIT em linhagens

celulares de GBM, foram utilizadas as linhagens GAMG e U251. Para isto, linhagens celulares

de GBM transfectadas com as isoformas GNNK- e GNNK+ e vetor vazio (controle) foram

estimuladas com 100 ng/ml de SCF recombinante humano ao longo do tempo. Após cada

espaço de tempo (0, 5 min, 15 min, 30 min, 1 hora, 3 horas e 6 horas) os lisados foram

coletados para análise de western blot de KIT e vias de ativação intracelular. Para ativação

de KIT utilizamos um anticorpo contra o resíduo de fosfotirosina (Tyr719). Também

avaliamos as vias de sinalização intracelular MAPK e PI3K/AKT 84. A ativação e abundância da

proteína KIT também foram avaliadas por Imunofluorescência.

4.13.5 Ensaio in vivo em Membrana Corioalantóide (CAM) de embrião de galinha

Para avaliar a proliferação tumoral foram realizados 2 ensaios a fim de conseguirmos

ao menos 20 ovos por grupo (GNNK+, GNNK- e vetor vazio) para ambas as linhagens, GAMG

e U251. O ensaio tem a duração de 17 dias e, além de ser medido o perímetro do tumor

formado no 13º dia e 17º para a comparação do crescimento, também foi realizado a

imunohistoquímica desses tumores com a finalidade de observar a expressão de KIT.

33

RESULTADOS

34

5 RESULTADOS

5.1 Caracterizar a expressão de RNAm e proteína de KIT em glioblastoma

Para determinar o padrão de expressão das isoformas GNNK de KIT em GBM,

avaliamos 136 casos de GBM em tecidos congelados/parafinados (Figura 10). De um modo

geral verificou-se que RNAm de KIT está presente em 95% (129/136) dos tumores, sendo

apenas 5% (7/136) totalmente negativa para o RNAm de KIT. No que diz respeito as

isoformas GNNK, foram observados cinco padrões diferentes de expressão: tumores que

expressam 75% de GNNK+ e apenas 25% de GNNK-, correspondendo a 43% (58/136) dos

casos; tumores que expressam 75% de GNNK- e apenas 25% de GNNK+, correspondendo a

17% (23/136) dos casos; tumores que expressam 50% de cada uma das isoformas, o que

corresponde a 30% (41/136) dos casos; tumores que expressam apenas GNNK+,

correspondendo a 3% (4/136) dos casos e tumores que expressam apenas GNNK-,

correspondente a 2% (3/136) dos casos. Assim, em tecidos de GBM, RNAm de KIT é

altamente expresso, tendo a maioria das amostras de predominância da isoforma GNNK+.

0

10

20

30

40

50

% o

f cases

59/139

41/139

25/139

7/1394/139 3/139

GNNK+

GNNK-

Figura 10 - Análise da predominância das isoformas GNNK de KIT nos tecidos congelados e

parafinados de glioblastoma em cinco grupos: negativo para RNAm, 100% GNNK+, 100% GNNK-, 75%

GNNK+/25% GNNK-, 75% GNNK-/25% GNNK+ e 50% GNNK+/50% GNNK-. Foram avaliados 136 casos,

sendo 117 de tecidos congelados (Hospital de Câncer de Barretos - Brasil) e 19 de tecidos parafinados

(Hospital Pedro Hispano – Portugal).

35

Em seguida, em um grupo de 92 amostras avaliou-se os níveis de expressão da

proteína CD117 por imunohistoquímica. Observou-se que a proteína CD117 é expressa em

níveis fraco a moderado no citoplasma das células tumorais, e fortemente expresso nos

microvasos e na proliferação microvascular do tumor (Figura 11). Em geral, a proteína KIT

estava presente em células neoplásicas em apenas 22,8% (21/92) dos casos, enquanto que

em relação à microvasos, KIT estava presente em 40,2% (37/92) das amostras existentes,

não existindo uma correlação entre eles uma vez que 29,3 % (27/92) das amostras

expressam KIT exclusivamente nos microvasos. Em 63 amostras dos casos temos informação

da expressão do RNAm e proteína, observou-se que todas as amostras que expressam a

proteína KIT, tanto nas células tumorais e / ou nos microvasos, são positivas para RNAm de

KIT, e encontramos associação entre a ausência da expressão da proteína KIT nos microvasos

com a predominância de GNNK- (p-valor 0,022), como demonstrado na tabela 9.

a

c

b

d

36

Figura 11 - Análise da expressão da proteína KIT em cortes parafinados de glioblastoma por

Imunohistoquímica (IHC). a: GBM com baixa expressão nas células tumorais; b: GBM com expressão

moderada nas células tumorais; c: expressão de CD117 nos microvasos (tecido endotelial); d:

expressão de CD117 na proliferação microvascular (tecido endotelial) (Aumento 200x).

Além disso, avaliamos a expressão de isoformas KIT em 8 linhagens celulares de GBM

primárias e, mais uma vez, quase todas eles expressam predominantemente a isoforma

GNNK- (Figura 12). Esta mesma análise foi realizada em 5 destes casos, entretanto, na

amostra congelada do paciente e 3 deles apresentaram um padrão de expressão diferente,

onde a predominância da isoforma negativa não é observada. Curiosamente, em 3 das

linhagens celulares primárias, a proteina de KIT estava presente no western blot, enquanto

que, para os mesmos pacientes, utilizando as amostras de FFPE não fomos capazes de

detectar a proteína KIT por IHQ (Dados não mostrados).

HC

B7

HC

B2

HC

B1

8

Proteína Linhagem Celular

CD117

β-Actina

HC

B1

9

HC

B7

HC

B2

HC

B4

0

HC

B1

8

HC

B2

9

HC

B1

62

HC

B1

48

RNAm Linhagem Celular

KIT

hGUS

HC

B2

9

HC

B2

HC

B1

62

HC

B1

48

HC

B4

0

RNAm Pacientes

Figura 12 - Análise da expressão das isoformas GNNK de KIT em 8 linhagens celulares primárias de

glioblastoma e análise dos respectivos tecidos congelados dos pacientes. Análise da expressão

proteica de KIT das respectivas linhagens celulares.

Nesse conjunto, os dados sugerem que existe uma mudança da expressão das

isoformas de KIT, o que sempre favorece a predominância da negativa, em adaptação de

células tumorais para as condições de cultura e que culmina na expressão da proteína. Se KIT

é uma oncoproteina, a hipótese de que a mudança para a superexpressão da isoforma

GNNK- poderia ser um evento oncogênico em GBM.

Finalmente, nós nos perguntamos sobre o significado da expressão da proteína KIT

em tumores GBM, já que ele existe em uma freqüência muito menor. Assim, em uma coorte

de 21 pacientes em que avaliamos os níveis de expressão da proteína KIT, também

avaliamos a expressão do ligante de KIT, o SCF, e forma ativada de KIT, resíduo de

37

fosforilação tirosina 719. Observamos que a fosforilação de KIT só foi encontrada em casos

que expressam SCF e KIT (CD117). Além disso, observamos também SCF, KIT e expressão de

fosfo-KIT positivos em células endoteliais do tumor (os resultados são ilustrados na figura 13

e tabela 1). Os dados indicam que a oncoproteína KIT é ativada em tumores de GBM através

de mecanismos autócrinos / parácrinos com o seu ligante SCF.

SCF CD117 p-KIT

Célu

las T

um

ora

isC

élu

las

En

do

teliais

Figura 13 - a: Análise dos níveis de expressão da proteína KIT, expressão do ligante de KIT (SCF) e

expressão de KIT fosforilado (resíduo de tirosina 719) em células tumorais (A, B, C) e células

endoteliais (D, E, F) – Imagens Representativas (Aumento 200x).

38

Tabela 1 - Casuística dos 21 casos que foram analisados de acordo com a expressão da proteína KIT,

expressão do ligante de KIT (SCF) e expressão de KIT fosforilado (resíduo de tirosina 719) e suas

respectivas marcações.

Casos Células tumorais

Células endoteliais

SCF CD117 p-KIT SCF CD117 p-KIT

1 + - -

+ + +

2 + - n.d

+ - n.d

3 + - n.d

+ - n.d

4 - - -

+ + -

5 + + +

+ + +

6 + - -

+ - -

7 + + +

+ + +

8 + - n.d

+ - n.d

9 + - -

+ - -

10 + + +

+ + +

11 + - -

+ + -

12 + - -

- - -

13 + + +

+ - -

14 + - -

+ + -

15 - - -

+ - -

16 - - n.d

+ - n.d

17 - - n.d

+ - n.d

18 + - -

+ - -

19 + - n.d

+ - n.d

20 + - -

+ + +

21 + - n.d

+ - n.d

+: Expressão positiva; -: Expressão negativa; n.d.: não realizado

5.2 Impacto clínico das isoformas de KIT em pacientes com glioblastoma

No levantamento realizado dos casos de glioblastoma do Hospital de Câncer de

Barretos, revisamos os prontuários de 129 casos, entre o ano de 2002 e 2014; também

foram revisados 19 casos do Hospital Pedro Hispano (Braga, Portugal). Portanto, foram

revisados 148 prontuários, sendo esses pacientes com idades entre 18 e 79 anos, maioria do

sexo masculino (59,5%), maioria branca (62,2%) e quanto ao tabagismo, 63,5% não são

fumantes e 75% não são etilistas.

39

Em relação à história da doença, 58,1% dos pacientes apresentaram, no momento do

diagnóstico, o KPS (Índice de Karnofsky) ≥ 80, o que indica apenas alguns sinais e sintomas

da doença. Apenas 6 pacientes, apresentaram um tumor antes do tumor cerebral e em

outro local, dentre os locais: colo do útero, próstata, pele (melanoma) e tireoide. Dentre as

localizações mais frequentes estão os lobos temporal e parietal, seguidos dos lobos frontal e

occipital; acometendo as lateralidades com frequências bastante similares, lateralidade

direita (48,6%) e esquerda (48,6%), e ambas as lateralidades (1,4%). Cerca de 65,5% dos

pacientes realizaram apenas 1 cirurgia para ressecção do tumor. Em relação ao tratamento,

a maioria dos pacientes realizaram radioterapia (56,8%) e quanto à quimioterapia, apenas

37,2% foram submetidas, sendo o quimioterápico mais utilizado a temozolamida seguido de

carmustina. Dos 148 pacientes, 110 (74,4%) apresentaram óbito em decorrência do câncer,

18 (12,2%) houve a perda de seguimento e 20 (13,5%) estão vivos; 73% apresentaram

sobrevida global ≤ 15 meses (Tabela 2).

A partir da obtenção de todas as características e informações clínicas relevantes dos

pacientes, obtidas através de prontuários, realizamos as análises estatísticas utilizando o

teste de χ2 (Qui-quadrado), afim de verificar associações estatisticamente significativas

entre a expressão das isoformas e expressão da proteína com Idade, Sexo, Cor, Tabagismo,

Etilismo, KPS, Lateralidade, Radioterapia, Quimioterapia, Recidiva e Sobrevida.

Encontramos associação estatísticamente significativa entre a predominância da

isoforma GNNK- e a lateralidade dos tumores (p-valor 0,027), entre a expressão da proteína

KIT (tecido endotelial) e o KPS (p-valor 0,022) e entre a expressão da proteína KIT (tecido

endotelial) e a predominância da isoforma GNNK- (p-valor 0,022), listadas nas tabelas 4, 7 e

9, respectivamente. No restante das análises, não foram encontradas associações

estatisticamente significativas entre as isoformas e expressão da proteína com as variáveis

clínico patológicas e demográficas.

40

Tabela 2 – Características e histórico da doença de 148 pacientes com GBM do Hospital de

Câncer de Barretos e Hospital Pedro Hispano (Portugal).

Idade 18 - 79 Nº de cirurgias

KPS (diagnóstico) Uma 97 (65,5%)

< 80 43 (29,1%) Duas 25 (16,9%)

≥ 80 86 (58,1%) Três 4 (2,7%)

Ignorado 19 (12,8%) Quatro ou mais 3 (2,1%)

Tumor em outro local Ignorado 19 (12,8%)

Não 123 (83,1%) Radioterapia

Sim 6 (4,1%) Não 45 (30,4%)

Ignorado 19 (12,8%) Sim 84 (56,8%)

Glioblastoma Primário Ignorado 19 (12,8%)

Não 6 (4,1%) Quimioterapia

Sim 123 (83,1%) Não 74 (50%)

Ignorado 19 (12,8%) Sim 55 (37,2%)

Localização tumoral Ignorado 19 (12,8%)

Temporal 110 (40%) Status

Frontal 68 (24,7%) Óbito por câncer 110 (74,4%)

Parietal 65 (23,6%) Vivo (com ou sem doença) 20 (13,5%)

Occipital 25 (9,1%) Perda de seguimento 18 (12,2%)

Insular 7 (2,5%) Sobrevida global

Lateralidade ≤ 15 meses 108 (73%)

Direito 72 (48,6%) ˃ 15 meses 40 (27%)

Esquerdo 72 (48,6%)

Ambos 2 (1,4%)

Ignorado 2 (1,4%)

Indivíduos (N): 148

*Os 19 casos ignorados geralmente encontrados em algumas variáveis são referentes aos casos do Hospital Pedro Hispano (Portugal) que não conseguimos todas as informações clínicas.

41

Tabela 3 – Associação da expressão do RNA de KIT com as variáveis demográficas e clínico-

patológicas de pacientes com glioblastoma (n=136).

RNA negativo RNA positivo

Variável Categoria n n (%) n (%) p-valor

Idade ≤ 50 anos 45 2 (4,4%) 43 (95,6%)

˃ 50 anos 91 5 (5,5%) 86 (94,5%) 1,000

Sexo Feminino 56 2 (3,6%) 54 (96,4%)

Masculino 80 5 (6,3%) 75 (93,7%) 0,700

Cor Branco 85 1 (1,2%) 84 (98,8%)

Pardo 25 1 (4,0%) 24 (96,0%)

Negro 6 0 (0,0%) 6 (100,0%) 0,465

Tabagista Não 85 2 (2,4%) 83 (97,6%)

Sim 21 0 (0,0%) 21 (100,0%) 1,000

Etilista Não 101 2 (2,0%) 99 (98,0%)

Sim 6 0 (0,0%) 6 (100,0%) 1,000

KPS ˂ 80 38 2 (5,3%) 36 (94,7%)

≥ 80 81 5 (6,2%) 76 (93,8%) 1,000

Lateralidade Direito 67 5 (7,5%) 62 (92,5%)

Esquerdo 65 2 (3,1%) 63 (96,9%)

Ambos 2 0 (0,0%) 2 (100,0%) 0,498

Radioterapia Não 40 0 (0,0%) 40 (100,0%)

Sim 77 2 (2,6%) 75 (97,4%) 0,546

Quimioterapia Não 64 0 (0,0%) 64 (100,0%)

Sim 53 2 (3,8%) 51 (96,2%) 0,203

Recidiva Não 100 2 (2,0%) 98 (98,0%)

Sim 16 0 (0,0%) 16 (100,0%) 1,000

RNA

* Dados de alguns pacientes são ignorados.

42

Tabela 4 – Associação da predominância da isoforma GNNK- de KIT com as variáveis

demográficas e clínico-patológicas de pacientes com glioblastoma (n=136).

negativo positivo

Variável Categoria n n (%) n (%) p-valor

Idade ≤ 50 anos 45 37 (82,2%) 8 (17,8%)

˃ 50 anos 91 73 (80,2%) 18 (19,8%) 0,780

Sexo Feminino 56 47 (83,9%) 9 (16,1%)

Masculino 80 63 (78,7%) 17 (21,3%) 0,450

Cor Branco 85 66 (77,6%) 19 (22,4%)

Pardo 25 22 (88,0%) 3 (12,0%)

Negro 6 6 (100,0%) 0 (0,0%) 0,306

Tabagista Não 85 70 (82,4%) 15 (17,6%)

Sim 21 16 (76,2%) 5 (23,8%) 0,539

Etilista Não 101 81 (80,2%) 20 (19,8%)

Sim 6 6 (100,0%) 0 (0,0%) 0,591

KPS ˂ 80 38 33 (86,8%) 5 (13,2%)

≥ 80 81 63 (77,8%) 18 (22,2%) 0,243

Lateralidade Direito 67 57 (85,1%) 10 (14,9%)

Esquerdo 65 51 (78,5%) 14 (21,5%)

Ambos 2 0 (0,0%) 2 (100,0%) 0,027

Radioterapia Não 40 32 (80,0%) 8 (20,0%)

Sim 77 63 (81,8%) 14 (18,2%) 0,811

Quimioterapia Não 64 53 (82,8%) 11 (17,2%)

Sim 53 42 (79,3%) 11 (20,7%) 0,623

Recidiva Não 100 80 (80,0%) 20 (20,0%)

Sim 16 14 (87,5%) 2 (12,5%) 0,733

Predominância GNNK-

* Dados de alguns pacientes são ignorados.

43

Tabela 5 – Associação da predominância da isoforma GNNK+ de KIT com as variáveis

demográficas e clínico-patológicas de pacientes com glioblastoma (n=136).

negativo positivo

Variável Categoria n(%) n (%) p-valor

Idade ≤ 50 anos 45 21 (46,7%) 24 (53,3%)

˃ 50 anos 91 53 (58,2%) 38 (41,8%) 0,202

Sexo Feminino 56 29 (51,8%) 27 (48,2%)

Masculino 80 45 (56,2%) 35 (43,8%) 0,607

Cor Branco 85 45 (52,9%) 40 (47,1%)

Pardo 25 12 (48,0%) 13 (52,0%)

Negro 6 4 (66,7%) 2 (33,3%) 0,793

Tabagista Não 85 46 (54,1%) 39 (45,9%)

Sim 21 10 (47,6%) 11 (52,4%) 0,593

Etilista Não 101 54 (53,5%) 47 (46,5%)

Sim 6 3 (50,0%) 3 (50,0%) 1,000

KPS ˂ 80 38 24 (63,2%) 14 (36,8%)

≥ 80 81 43 (53,1%) 38 (46,9%) 0,302

Lateralidade Direito 67 34 (50,7%) 33 (49,3%)

Esquerdo 65 37 (56,9%) 28 (43,1%)

Ambos 2 2 (100,0%) 0 (0,0%) 0,431

Radioterapia Não 40 20 (50,0%) 20 (50,0%)

Sim 77 42 (54,5%) 35 (45,5%) 0,640

Quimioterapia Não 64 31 (48,4%) 33 (51,6%)

Sim 53 31 (58,5%) 22 (41,5%) 0,278

Recidiva Não 100 54 (54,0%) 46 (46,0%)

Sim 16 7 (43,7%) 9 (56,3%) 0,446

Predominância GNNK+

* Dados de alguns pacientes são ignorados.

44

Tabela 6 – Associação da expressão da proteína KIT (células neoplásicas) com as variáveis

demográficas e clínico-patológicas de pacientes com glioblastoma (n=70).

positivo negativo

Variável Categoria n n (%) n (%) p-valor

Idade ≤ 50 anos 14 1 (7,1%) 13 (92,9%)

˃ 50 anos 56 15 (26,8%) 41 (73,2%) 0,164

Sexo Feminino 22 2 (9,1%) 20 (90,9%)

Masculino 48 14 (29,2%) 34 (70,8%) 0,074

Cor Branco 47 12 (25,5%) 35 (74,5%)

Pardo 17 4 (23,5%) 13 (76,5%)

Negro 5 0 (0,0%) 5 (100,0%) 0,715

Tabagista Não 48 10 (20,8%) 38 (79,2%)

Sim 14 5 (35,7%) 9 (64,3%) 0,296

Etilista Não 60 15 (25,0%) 45 (75,0%)

Sim 3 0 (0,0%) 3 (100,0%) 1,000

KPS ˂ 80 25 6 (24,0%) 19 (76,0%)

≥ 80 36 8 (22,2%) 28 (77,8%) 0,871

Lateralidade Direito 32 8 (25,0%) 24 (75,0%)

Esquerdo 34 8 (23,5%) 26 (76,5%)

Ambos 2 0 (0,0%) 2 (100,0%) 1,000

Radioterapia Não 26 8 (30,8%) 18 (69,2%)

Sim 44 8 (18,2%) 36 (81,8%) 0,226

Quimioterapia Não 46 10 (21,7%) 36 (78,3%)

Sim 24 6 (25,0%) 18 (75,0%) 0,758

Recidiva Não 64 16 (25,0%) 48 (75,0%)

Sim 5 0 (0,0%) 5 (100,0%) 0,583

Proteína - KIT (células neoplásicas)

* Dados de alguns pacientes são ignorados.

45

Tabela 7 – Associação da expressão da proteína KIT (tecido endotelial) com as variáveis

demográficas e clínico-patológicas de pacientes com glioblastoma (n=70).

positivo negativo

Variável Categoria n n (%) n (%) p-valor

Idade ≤ 50 anos 14 4 (28,6%) 10 (71,4%)

˃ 50 anos 56 25 (44,6%) 31 (55,4%) 0,275

Sexo Feminino 22 10 (45,5%) 12 (54,5%)

Masculino 48 19 (39,6%) 29 (60,4%) 0,643

Cor Branco 47 20 (42,6%) 27 (57,4%)

Pardo 17 7 (41,2%) 10 (58,8%)

Negro 5 2 (40,0%) 3 (60,0%) 1,000

Tabagista Não 48 20 (41,7%) 28 (58,3%)

Sim 14 6 (42,9%) 8 (57,1%) 0,937

Etilista Não 60 23 (38,3%) 37 (61,7%)

Sim 3 3 (100,0%) 0 (0,0%) 0,065

KPS ˂ 80 25 15 (60,0%) 10 (40,0%)

≥ 80 36 11 (30,6%) 25 (69,4%) 0,022

Lateralidade Direito 32 15 (46,9%) 17 (53,1%)

Esquerdo 34 12 (35,3%) 22 (64,7%)

Ambos 2 0 (0,0%) 2 (100,0%) 0,422

Radioterapia Não 26 13 (50,0%) 13 (50,0%)

Sim 44 16 (36,4%) 28 (63,6%) 0,263

Quimioterapia Não 46 20 (43,5%) 26 (56,5%)

Sim 24 9 (37,5%) 15 (62,5%) 0,630

Recidiva Não 64 26 (40,6%) 38 (59,4%)

Sim 5 2 (40,0%) 3 (60,0%) 1,000

Proteína - KIT (tecido endotelial)

* Dados de alguns pacientes são ignorados.

46

Tabela 8 – Associação da expressão da proteína KIT (células neoplásicas) com a expressão do

RNA e as isoformas de KIT de pacientes com glioblastoma (n=63).

positivo negativo

Variável Categoria n n (%) n (%) p-valor

RNA negativo 1 0 (0,0%) 1 (100,0%)

positivo 62 14 (22,6%) 48 (77,4%) 1,000

Predominância GNNK+ negativo 36 9 (25,0%) 27 (75,0%)

positivo 27 5 (18,5%) 22 (81,5%) 0,540

Predominância GNNK- negativo 50 10 (20,0%) 40 (80,0%)

positivo 13 4 (30,8%) 9 (69,2%) 0,461

Presença Positiva ausente 1 0 (0,0%) 1 (100,0%)

presente 62 14 (22,6%) 48 (77,4%) 1,000

Presença Negativa ausente 1 0 (0,0%) 1 (100,0%)

presente 62 14 (22,6%) 48 (77,4%) 1,000

Proteína - KIT (células neoplásicas)

Tabela 9 – Associação da expressão da proteína KIT (tecido endotelial) com a expressão do

RNA e as isoformas de KIT de pacientes com glioblastoma (n=63).

positivo negativo

Variável Categoria n n (%) n (%) p-valor

RNA negativo 1 1 (100,0%) 0 (0,0%)

positivo 62 22 (35,5%) 40 (64,5%) 0,365

Predominância GNNK+ negativo 36 10 (27,8%) 26 (72,2%)

positivo 27 13 (48,1%) 14 (51,9%) 0,097

Predominância GNNK- negativo 50 22 (44,0%) 28 (56,0%)

positivo 13 1 (7,7%) 12 (92,3%) 0,022

Presença Positiva ausente 1 1 (100,0%) 0 (0,0%)

presente 62 22 (35,5%) 40 (64,5%) 0,365

Presença Negativa ausente 1 1 (100,0%) 0 (0,0%)

presente 62 22 (35,5%) 40 (64,5%) 0,365

Proteína - KIT (tecido endotelial)

Foram realizadas análises de sobrevivência entre as informações demográficas e

características clínicas com a sobrevida global dos pacientes. Através de curvas de

sobrevivência (Kaplan-Meier), observamos diferenças estatisticamente significativas nas

47

variáveis idade, cor, KPS, radioterapia, quimioterapia e recidiva, como mostrado na tabela

10.

Tabela 10 – Associação entre os dados clínico-patológicos com a sobrevida de pacientes com

GBM.

Variável Categoria n p-valor

Idade ≤ 50 anos 34

˃ 50 anos 86 0,001

Sexo Feminino 48

Masculino 72 0,112

Cor Branco 69

Pardo 26

Negro 7 0,006

Tabagista Não 76

Sim 18 0,591

Etilista Não 87

Sim 8 0,060

KPS ˂ 80 40

≥ 80 65 0,042

Lateralidade Direito 57

Esquerdo 59

Ambos 2 0,271

Radioterapia Não 41

Sim 61 < 0,001

Quimioterapia Não 64

Sim 38 < 0,001

0.0 ± 0.0

4.1 ± 1.0

11.5 ± 1.1

4.6 ± 0.7

15.0 ± 1.3

9.0 ± 0.9

4.1 ± 1.3

7.6 ± 1.1

11.5 ± 1.2

9.3 ± 1.1

9.9 ± 1.2

8.6 ± 0.9

9.4 ± 1.0

8.0 ± 1.7

2.0 ± 0.8

8.8 ± 1.0

7.2 ± 1.4

Análises Univariadas

(meses ± DP)

14.1 ± 1.7

7.7 ± 0.8

11.1 ± 1.5

DP: Desvio-padrão; IC: 95% Intervalo de confiança

Além de análises de sobrevivência com as características demográficas e clínicas,

realizamos a mesma análise de sobrevivência entre a predominância das isoformas e a

sobrevida global. Não foram encontradas diferenças estatisticamente significantes entre as

curvas de sobrevivência, embora entre os casos que apresentam KIT positivo e KIT negativo

houve uma diferença importante, em que, os casos negativos pra KIT apresentam uma

48

melhor sobrevida. Além disso, há uma tendência interessante em que a predominância de

GNNK- parece aumentar a sobrevida dos pacientes (Tabela 11 e Figura 14).

Também tentamos associar a expressão da proteína KIT, tanto das células

neoplásicas quanto do tecido endotelial, com a sobrevida global, entretanto não

encontramos nenhuma diferença estatisticamente significativa (Tabela 11 e Figura 15).

Tabela 11 – Associação entre dados de expressão de KIT com a sobrevida de pacientes com

GBM.

Variável n p-valor

CD117 Tumor

14

49 0,517

CD117 Vasos

38

25 0,354

KIT RNAm

101

7 0,057

GNNK+ predominância

48

60 0,291

GNNK- predominância

24

84 0,933

10.8 ± 1.2

Positiva

Negativa

Positiva

Negativa 16.4 ± 2.3

Negativo

Positivo

Ausente

Presente

Positivo

Negativo

8.0 ± 1.0

7.0 ± 1.2

14.2 ± 3.9

8.3 ± 1.4

9.4 ± 0.9

8.8 ± 1.2

17.0 ± 2.7

Análises Univariadas

(meses ± DP)

6.1 ± 1.6

DP: Desvio-padrão; IC: 95% Intervalo de confiança

49

a.

b.

50

c.

Figura 14 – Curvas de sobrevivência de 136 pacientes, utilizando Kaplan Meier e teste de log-rank. a:

Curvas de sobrevivência com amostras negativas pra KIT, com predominância da isoforma GNNK+,

com predominância da isoforma GNNK- e expressão igual de ambas isoformas (p-valor 0,263); b:

Curvas de sobrevivência de amostras com KIT positivo e KIT negativo (p-valor 0,057); c: Curvas de

sobrevivência de amostras com a predominância de GNNK+ e amostras com predominância de

GNNK- (p-valor 0,291).

a.

51

b.

Figura 15 – Curvas de sobrevivência de 136 pacientes, utilizando Kaplan Meier e teste de log-rank. a:

Curvas de sobrevivência com amostras com expressão positiva e negativa da proteína KIT nas células

neoplásicas (p-valor 0,517); b: Curvas de sobrevivência de amostras com expressão positiva e

negativa da proteína KIT no tecido endotelial (p-valor 0,354).

5.3 Análise do papel tumorigênico das isoformas de KIT em glioblastomas

Para determinar o papel tumorigênico das isoformas GNNK de KIT, foram realizados

ensaios in vitro com a linhagem GAMG. Foi realizada a transfecção das células com os

respectivos plasmídeos (GNNK+, GNNK- e pCDNA3) e a seleção com 300ug/ml de G418, a

confirmação da transfecção pode ser vista na Figura 16.

52

GN

NK

+

GN

NK

-

pC

DN

A3

RN

Am

Prot

eína

hGUS

KIT

CD117

β-Actina

p-KIT (Y719)

Figura 16 - Confirmação da transfecção das isoformas GNNK+ e GNNK- de KIT na linhagem GAMG

através do RNAm, expressão da proteina KIT (CD117) e confirmação da ativação através da expressão

de KIT fosforilado (p-KIT 719). Observação: Devido à limitação da técnica na revelação do western

blot, não conseguimos demonstrar a expressão de KIT no vetor vazio (pCDNA3), já que nas linhagens

transfectadas, houve maior expressão da proteina KIT e a GAMG é uma linhagem que expressa a

proteína.

Os ensaios de viabilidade celular foram realizados com MTS (Promega), sendo

medida até 72 horas em intervalos de 24 horas, em que observou-se maior viabilidade em

GNNK- comparado à GNNK+ e ao veto vazio, não havendo diferenças com a estimulação de

SCF. Em relação ao ensaio de wound healing, monitoramos o fechamento da ranhura

durante 72 horas e também com a estimulação de SCF (100ng/ml), percebemos maior

potencial das células transfectadas em fechar a ranhura em comparação ao vetor vazio, sem

diferenças estatisticamente significativas com a estimulação de SCF. Para determinar a

capacidade de formação de colônias, utilizamos o ensaio de clonogenicidade, encontramos

maior formação de colônias nas células transfectadas com a isoforma GNNK- e, no ensaio de

invasão em matrigel (BD Biosciences) encontramos maior potencial de invasão também nas

células transfectadas com a isoforma GNNK-. Todas as diferenças foram estatisticamente

significativas.

53

a. b.

c.

0 24 48 720

25

50

75

100

125pCDNA3 GNNK+ GNNK-

pCDNA3/SCF GNNK+/SCF GNNK-/SCF

*

Tempo (horas)

Fe

ch

am

en

to d

a f

eri

da (

%)

GNNK + GNNK -pCDNA3

0h

48

h

d.

0

50

100

150

200

250 *

pCDNA3 GNNK+ GNNK-

Mé

dia

do

nú

me

ro d

e

cé

lula

s in

vasiv

as

GNNK + GNNK -pCDNA3

Figura 17 - Ensaios celulares realizados com a linhagem celular GAMG transfectada estavelmente

com 300ug/ml de G418. a: ensaio de viabilidade celular; b: ensaio de clonogenicidade; c: ensaio de

wound healing; d: ensaio de invasão em Matrigel.

0 24 48 720

100

200

300

400

pCDNA3 GNNK+ GNNK-

pCDNA3/SCF GNNK+/SCF GNNK-/SCF

*

Tempo (horas)

% d

e c

élu

las v

iáveis

0

25

50

75

100

125

*

pCDNA3 GNNK+ GNNK-

Mé

dia

do

nú

me

ro

de

co

lôn

ias

Inva

sio

n

GNNK + GNNK -pCDNA3

54

E para a confirmação dos resultados, foram realizados os ensaios com a linhagem

celular U251, transfectada com as isoformas e o vetor vazio e, selecionada com 300ug/ml de

G418. Também encontramos maior viabilidade e maior potencial de migração nas células

transfectadas com a isoforma GNNK-. Em relação ao ensaio de clonogenicidade, foi

encontrado maior potencial de formação de colônias em GNNK+, entretanto com diferenças

não estatisticamente significativas.

a.

GN

NK

+

hGUS

GN

NK

-

pC

DN

A3

KIT

CD117

β-Actin

mR

NA

Pro

tein

b.

c. d.

Figura 18 - Ensaios celulares realizados com a linhagem celular U251 transfectada estavelmente com

300ug/ml de G418. a: Confirmação da transfecção das isoformas GNNK+ e GNNK- de KIT na linhagem

GAMG através do RNAm, expressão da proteina KIT (CD117); b: ensaio de viabilidade celular; c:

ensaio de clonogenicidade; d: ensaio de wound healing.

0 24 48 720

100

200

300 pCDNA3 GNNK+ GNNK-

*

Tempo (horas)

% d

as c

élu

las v

iáv

eis

0

50

100

150

200

*

pcDNA3 GNNK+ GNNK-

Mé

dia

do

nú

me

ro

de

co

lôn

ias

0 24 48 720

25

50

75

100

125 pCDNA3 GNNK+ GNNK-

*

Tempo (horas)

Fe

ch

am

en

to d

a f

eri

da (

%)

55

5.4 Análise das funções bioquímicas das isoformas de KIT em linhagens celulares de

glioblastoma

Para avaliar o efeito das isoformas na sinalização e internalização de KIT, através de

western blot, avaliamos a ativação de KIT nos tempos determinados (0, 5 min, 15 min, 30

min, 1 hora, 3 horas e 6 horas) com a estimulação de SCF e a ativação das vias intracelulares

MAPK e AKT em duas linhagens celulares de glioblastoma: GAMG e U251. Em ambas as

linhagens, conseguimos a superexpressão de KIT e a estimulação com SCF induz maior

ativação de KIT em GNNK-. A maior ativação de KIT nas linhagens transfectadas com as

isoformas refletiu-se a nível intracelular na GAMG, mas não na U251, isso mostra que a U251

não é dependente de KIT para ativar ou controlar níveis de ativação intracelular e

provavelmente, por isso, a U251 não expressa KIT e tem ativação de outros receptores, além

de ser mutante para PTEN, o que significa que possui AKT sempre ativa.

0 5’ 15’ 30’ 1h 3h 6h

GAMG pCDNA3 GAMG GNNK+ GAMG GNNK-

p-KIT

KIT

p-AKT

AKT

p-ERK

ERK

0 5’ 15’ 30’ 1h 3h 6h 0 5’ 15’ 30’ 1h 3h 6h SCF

56

Figura 19 - Efeito na ativação de KIT e vias intracelulares (MAPK e AKT) em células transfectadas com

as isoformas GNNK+ e GNNK- na linhagem celular GAMG. Os gráficos apresentam a quantificação das

proteínas, sendo (proteína fosforilada/proteína total).

U251 pCDNA3 U251 GNNK+ U251 GNNK-

0 5’ 15’ 30’ 1h 3h 6h

p-KIT

KIT

p-AKT

AKT

p-ERK

ERK

0 5’ 15’ 30’ 1h 3h 6h 0 5’ 15’ 30’ 1h 3h 6h

Figura 20 - Efeito na ativação de KIT e vias intracelulares em células transfectadas com as isoformas

GNNK+ e GNNK- na linhagem celular U251. O gráfico apresenta a quantificação das proteínas, sendo

(proteína fosforilada/proteína total).

Por imunoflorescência, avaliamos a internalização e abundância do receptor KIT, após

estimulação com SCF em 15 e 30 minutos. Entre os diferentes tempos de estimulação não

observamos grandes diferenças de marcação, entretanto, conseguimos observar uma

marcação mais forte, abundante e “granulada” intracelularmente, ao longo do tempo nas

células transfectadas, em especial em GNNK-, o que demonstra uma internalização mais

rápida do receptor nas células que superexpressam KIT em relação ao controle não

transfectado.

57

pC

DN

A3

GN

NK

+G

NN

K-

0 min SCF 15 min SCF 30 min SCF

Figura 21 – Imagens de Imunofluorescência (IF) com 0, 15 e 30 min de estimulação com SCF;

utilizando anticorpo CD117 (DAKO A4502) nas linhagens transfectadas e no pCDNA3 (vetor vazio).

5.5 Ensaio in vivo em Membrana Corioalantóide (CAM) de embrião de galinha

Para determinar o papel tumorigênico das isofomas GNNK de KIT em um modelo in

vivo, foi utilizada a CAM. Neste ensaio, foi verificado e comparado o tamanho tumoral entre

as isoformas e o vetor vazio, foram utilizadas as linhagens GAMG e U251.

Com a linhagem GAMG, percebemos uma maior média do perímetro das linhagens

transfectadas com as isoformas GNNK- e GNNK+ em relação ao vetor vazio. Também

observamos a expressão de KIT nos tumores formados a partir do ensaio de CAM, onde

encontramos maior expressão de KIT (CD117) nos tumores formados com a isoforma GNNK-.

58

a.

pCDNA3 GNNK+ GNNK-

In o

vo

day 1

3E

x o

vo

day 1

7

b.

c.

GNNK + GNNK -pCDNA3

H&

EC

D117

Figura 22 - a: Análise da formação tumoral na CAM, nos dias 13 (in ovo) e 17 (ex ovo), com a

linhagem GAMG [Aumento 10x (in ovo) e 20x (ex ovo)]; b: os tumores formados com as linhagens

transfectadas apresentaram maior média de perímetro em comparação ao vetor vazio, com

59

resultados estatisticamente significativos (GNNK- p-valor <0,0001; GNNK+ p-valor 0,0154); c:

coloração de H&E e imunohistoquímica para CD117 (KIT) de cortes feitos a partir da CAM incluída em

parafina.

Nos ensaios com a linhagem U251, podemos confirmar os achados com a GAMG. Os

tumores formados com as isoformas GNNK- apresentaram maior média do perímetro em

relação ao vetor vazio (pCDNA3), sendo estatisticamente significativo.

a.

pCDNA3 GNNK+ GNNK-

In o

vo d

ay1

3Ex

ovo

day

17

b.

Figura 23 - a: Análise da formação tumoral na CAM, nos dias 13 (in ovo) e 17 (ex ovo), com a

linhagem U251 [Aumento 10x (in ovo) e 20x (ex ovo)]; b: os tumores formados com a linhagem

transfectada com a isoforma GNNK- apresentaram maior média de perímetro em comparação ao

vetor vazio, com resultados estatisticamente significativos (p-valor 0,0311).

60

DISCUSSÃO

61

6 DISCUSSÃO

O GBM é o tumor cerebral mais agressivo, sendo um dos maiores desafios no

tratamento do câncer. Embora com os avanços da medicina, o prognóstico para os pacientes

com GBM ainda é ruim devido à resistência terapêutica e a recorrência tumoral após a

remoção cirúrgica, diante disso, apresentam a sobrevida curta, cerca de 15 meses. Novas

vias moleculares importantes estão sendo associadas à biologia, patogênese e abordagem

terapêutica dos GBMs, entre elas os RTKs.

Estudos anteriores mostraram a presença frequente do RNAm total de KIT em tecidos

e linhagens celulares de GBM 90, no entanto não há relatos a respeito da expressão das

isoformas GNNK de KIT em GBMs. Nossos resultados nas linhagens celulares e tecidos

congelados/parafinados são os primeiros a abordar esta questão. Considerando que na

literatura ainda não existem dados sobre as isoformas GNNK de KIT em tecidos cerebrais

normais e tumorais e, baseado em resultados preliminares de linhagens celulares de GBM e

tecidos normais de cérebro (Martinho O, et al. dados pessoais), esperávamos observar a

frequente presença de ambas isoformas, com a predominância da isoforma GNNK- em

tumores primários. Entretanto, os resultados deste estudo apresentam a coexpressão de

ambas isoformas com a predominância da isoforma GNNK+ (45,3%) em tecidos de GBM,

diferente do encontrado em linhagens celulares de GBM. Esses resultados também são

completamente diferentes de estudos anteriores realizados com outros tipos tumorais,

como em leucemia mielóide aguda, mieloma múltiplo, TCGs testiculares e GISTs, em que

demonstram a coexpressão de ambas isoformas com a predominância da isoforma GNNK- 61,

65, 68, 69.

Além de caracterizar os tecidos de GBM quanto à expressão das isoformas, avaliamos

linhagens celulares primárias e seus respectivos tecidos tumorais congelados e, então,

encontramos uma mudança na expressão das isoformas do RNAm de KIT que ainda não foi

descrito em nenhum tipo tumoral. Verificamos a expressão proteica de KIT nas linhagens

primárias, enquanto que nos tecidos parafinados correspondentes, não encontramos a

expressão proteica, acredita-se que devido a utilização de técnicas distintas; western blot

para a linhagens e imunohistoquímica para os tecidos parafinados, é possível a diferença de

sensibilidade entre as técnicas. Esses dados sugerem que existe uma mudança de expressão

62

das isoformas de KIT, que favorece a predominância da isoforma GNNK- e a expressão da

proteína, na adaptação das células à condições de cultura celular.

Observamos também a expressão da proteina KIT em cortes histológicos de tecidos

parafinados através de imunohistoquímica, onde encontramos a expressão de KIT em níveis

fraco a moderado no citoplasma das células tumorais (22,8% dos casos) e forte no tecido

endotelial - microvasos e proliferação microvascular – (40,2% dos casos). As porcentagens de

expressão de KIT encontradas neste trabalho vão de encontro com os dados da literatura,

Gomes et al. encontraram expressão de KIT em 20,8% dos GBMs em células neoplásicas 46 e

Sihto et al. encontraram 59% de expressão nos GBMs em tecido endotelial, além disso, GBM

foi o único tipo tumoral entre 34 diferentes histologias tumorais a apresentar expressão de

KIT no tecido endotelial 59.

Além da análise da proteina KIT em 92 casos, em uma coorte de 21 pacientes, foi

avaliado também a expressão do ligante (SCF) e de KIT ativado (p-KIT Tyr 719), notamos que

nos casos onde há a expressão de p-KIT, há também a expressão de KIT total e do ligante

SCF, portanto, podemos sugerir a ativação de KIT através de mecanismos

autócrinos/parácrinos com o ligante SCF. Estes dados corroboram com os achados de

Stanulla e colaboradores (1995), que mostraram a coexpressão do receptor e do ligante na

maioria dos casos de KIT positivo, levando à ativação de KIT em linhagens celulares de

glioma 57. Demonstrada a ativação de KIT por mecanismos autócrinos, alguns trabalhos

evidenciaram uma maior indução da secreção de SCF em condições de hipóxia (característico

de glioblastomas que apresentam necrose) no microambiente tumoral, levando assim, ao

aumento dos níveis de HIF1α e VEGF e a ativação de KIT, promovendo angiogênese e

sobrevivência do tecido endotelial tumoral. Além disso, SCF atua como fator de

sobrevivência para células-tronco neurais 52, 59, 91, 92.

Quanto aos ensaios celulares, verificamos maior papel tumorigênico da linhagem

transfectada com a isoforma GNNK- em comparação à isoforma GNNK+ e pCDNA3 (vetor

vazio), principalmente em relação à viabilidade, potencial de migração e potencial invasivo,

que já foram descritos em outros trabalhos onde utilizaram fibloblastos de camundongo,

melanoma de camundongo (linhagens celulares NIH3T3 e B16F0, respectivamente) e

mastócitos 63, 67, 86, 93. Um estudo recente relatou um aumento na proliferação de astrócitos

de camundongos após a transfecção de cDNA de KIT humano, não especificando qual

63

isoforma 57. Estudos funcionais em linhagem celular de fibroblastos de camundongos

(NIH3T3) demonstraram que essas células transfectadas com a isoforma GNNK- promove

maior formação de colônias independente de ancoragem e são tumorigênicas in vivo em

camundongos nude, enquanto células transfectadas com a isoforma GNNK+ não são 63.

Com base em estudos anteriores em outros tipos de células humanas e de

camundongos, foi encontrado nos resultados uma fosforilação, ubiquitinação e

internalização mais rápida de KIT em células GNNK- transfectadas 63, 64, 67. Para os nossos

achados, utilizamos as linhagens celulares de GBM, GAMG e U251; a GAMG é uma linhagem

celular que expressa o RNAm e a proteína KIT e a U251 é uma linhagem celular que expressa

apenas o RNAm de KIT. Em ambas linhagens transfectadas, observamos a superexpressão da

proteína KIT e maior ativação de p-KIT (com estimulação de SCF) nas células transfectadas

com a isoforma GNNK-. Também observamos, através da imunofluorescência, uma

marcação mais forte, abundante e granulada nas linhagens transfectadas, principalmente

em GNNK-, o que demonstra maior ativação de KIT e internalização mais rápida,

corroborando com estudos citados acima. De acordo com Phung et al. (2013), observaram

que a consecutiva eliminação de aminoácidos da sequência tetrapeptídica GNNK, aumenta

gradualmente a fosforilação, ubiquitinação, internalização e ativação downstream de MAPK,

além de aumentar a viabilidade celular, como já descrito em outros estudos. Esse trabalho

também mostrou a importância do domínio transmembrana responsável por controlar a

orientação dos domínios tirosina-quinase e, assim, sua atividade. Modificações no domínio

transmembrana, resulta na rotação dos domínios tirosina-quinase em torno do seu eixo,

levando a modificações quando o peptídeo é encurtado 67.

Dados na literatura mostram diferenças significantivas entre as vias de ativação

intracelular dependentes de isoformas transfectadas, um aumento da ativação de MAPK e

PI3K/AKT, entretanto segundo relatórios anteriores, o efeito das isoformas nas vias de

sinalização é dependente do tipo celular 63-66. Avaliamos as principais vias de sinalização,

MAPK e PI3K/AKT, na GAMG observamos um aumento da ativação de ERK nas linhagens

transfectadas em relação ao vetor vazio, o que não aconteceu em AKT; enquanto na U251, a

ativação de KIT não influenciou nas vias intracelulares nas linhagens transfectadas, isso se

deve a U251 ser mutante para PTEN, o que significa que possui AKT sempre ativa e ser

64

dependente de outros receptores, provavelmente de PDGFR. De acordo com um artigo do

grupo, foi observado que PDGFRA foi o único alvo do imatinib na linhagem celular U251 84.

Em relação aos ensaios in vivo, utilizando a CAM, encontramos um maior potencial

tumorigênico das células transfectadas com as isoformas GNNK, formando tumores com

maior perímetro em GNNK-, embora não existem relatos de estudos que tenham utilizado

essa metodologia para avaliação do papel tumorigênico das isoformas GNNK de KIT, de

acordo com Caruana e colaboradores (1999), fibroblastos transfectados com a isoforma

GNNK- levou a tumorigenicidade em camundongos, enquanto fibroblastos transfectados

com a isoforma GNNK+, não 63. Embora nossos resultados não são comparáveis com os

achados de Caruana et al. (1999), pois utilizamos linhagens celulares tumorais, portanto

formam tumores; se KIT é um oncogene, esperamos que ambas isoformas apresentem

potencial tumorigênico, é o que nossos resultados evidenciam. Por outro lado, a

predominância de GNNK+ que encontramos em grande parte dos tecidos tumorais, pode ter

um significado biológico/tumorigênico/terapêutico importante.

Diante de vários trabalhos interessados em elucidar o papel dos RTK em gliomas,

notamos que KIT está envolvido na patogênese molecular de alguns gliomas, seja por

amplificação gênica ou por mecanismos autócrinos/parácrinos. Dessa forma, o KIT poderia

ser um potencial alvo molecular na terapia antitumoral através dos inibidores de tirosina

quinase. O papel das isoformas de KIT em terapias anti-KIT é quase inexplorado. Em tumores

sólidos, a resposta do imatinib é altamente associada com a presença de mutações ativantes

no gene KIT como observado em GIST 48. Para os outros fármacos em estudo, não é claro

quais os biomarcadores de resposta, no entanto, eles mostram-se eficazes em casos

resistentes ao imatinib 48. Um estudo recente em células de mieloma tratadas com imatinib

mostrou uma inibição igual na ativação de KIT em ambas isoformas 65. As linhagens celulares

de GBM que foram utilizadas neste projeto não possuem mutações ativantes em KIT e o

Imatinib, em contraste com o sunitinib, como agente isolado, não apresentaria benefício

terapêutico 83, 84. Baseado nesses fatos espera-se que linhagens celulares de GBM tratadas

com imatinib não apresentem um efeito anti-tumorigênico acentuado, independentemente

da isoforma utilizada. Por outro lado, espera-se encontrar efeito inibitório com outros

fármacos anti-KIT. Com base na maior ativação da sinalização de KIT na isoforma GNNK-,

talvez essas células exibiriam uma resposta mais acentuada a alguns desses inibidores,

65

embora os resultados sejam inesperados. Atualmente, agentes farmacológicos que tem

como alvo as tirosina quinases, incluindo o KIT (por exemplo, imatinib, sunitinib, sorafenib e

dasatinib) já são utilizados na prática clínica para o tratamento de câncer. Alguns desses

medicamentos estão em fase de ensaios clínicos para glioblastomas 83. O papel das

isoformas de KIT em resposta às terapias alvo de KIT em GBMs ainda é desconhecido.

Com a finalidade de encontrar associações entre a presença das isoformas e a

expressão da proteína KIT com os dados clínico-patológicos: idade, sexo, raça, tabagismo,

etilismo, KPS, lateralidade, radioterapia, quimioterapia e recidiva realizamos o teste de χ2.

Encontramos apenas três associações com p-valor significativo. Entre elas: associação entre

a predominância da isoforma GNNK- com a lateralidade tumoral, em que ambos os lados

está associado à predominância da isoforma GNNK-; associação entre a expressão da

proteína KIT (tecido endotelial) com o KPS categorizado ˂ 80 e; associação entre a expressão

da proteína KIT (tecido endotelial) negativa com a predominância da isoforma GNNK-.

Com os mesmos dados clínico-patológicos que utilizamos para associar com as

isoformas e expressão da proteína KIT, também utilizamos para associar com a sobrevida

global dos pacientes. Não observamos resultados estatisticamente significativos entre a

sobrevida global associada aos dados de expressão de KIT, tanto RNAm quanto proteína.

Quanto à associação da sobrevida com os dados clínico-patológicos, observamos o aumento

da sobrevida em pacientes com idade menor ou igual a 50 anos, pacientes com KPS maior ou

igual a 80, pacientes que realizaram radioterapia, pacientes que realizaram quimioterapia e,

pacientes que apresentaram recidiva. Essas associações estão de acordo com dados já

publicados 25, 94, quanto à associação com o etilismo e tabagismo, dados anteriores também

não encontraram associações ou então observaram resultados inconclusivos 95.

Os fatores de risco ambientais para o desenvolvimento de GBMs ainda são

desconhecidos e apresentam alguns resultados inconclusivos. De acordo com vários estudos

citados por Ostrom e colaboradores (2014), fatores de risco tem sido estudados como

potenciais contribuidores para o risco de glioma, entre eles: condições alérgicas e doenças

atópicas estão relacionadas à diminuição do risco, enquanto exposição à radiação ionizante,

ao aumento do risco; quanto à radiação não-ionizante (celulares) e exposição ocupacional,

não foram obtidos resultados conclusivos 11. Sabemos que o tabagismo e o etilismo

aumentam o risco de vários tipos tumorais e certos componentes do cigarro e do álcool

66

podem penetrar na barreira hemato-encefálica, entretanto, segundo Braganza e

colaboradores (2014), não foi encontrada associação entre o tabagismo/etilismo e o

aumento do risco de glioma 95. Também não encontramos associações estatisticamente

significativas entre o tabagismo/etilismo com a expressão do RNAm, proteína de KIT e

sobrevida global.

Este é o primeiro trabalho a avaliar o impacto de cada isoforma em pacientes com

GBM, se as isoformas distintas de KIT levam a diferenças no comportamento bioquímico e

funcional de linhagens celulares de GBM, o impacto na sobrevida do paciente poderá ser

observado. Guerrini et al. relataram uma associação entre a diferença de expressão das

isoformas GNNK de KIT e a sobrevida global em pacientes com leucemia mieloide aguda, em

que pacientes que expressam somente a isoforma GNNK- apresentam maior sobrevida

global e sobrevida livre de progressão 70. Esses achados corroboram com os nossos

resultados, em que pacientes com a predominância da isoforma GNNK- apresentam a

tendência de maior sobrevida. Mais que isso, observamos uma tendência quanto à

expressão de RNAm de KIT, os pacientes que não expressam RNAm, apresentam maior

sobrevida (p-valor 0,057), embora os resultados não sejam estatisticamente significativos.

Esses dados parecem contraditórios em relação aos ensaios celulares, em que observamos,

nas linhagens transfectadas com a isoforma GNNK-, como sendo mais oncogênica, no

entanto, outros autores já demonstraram a internalização e degradação mediada por

ubiquitinação mais rápida em GNNK-, implicando em um “switch-off” mais rápido da

atividade de KIT. A expressão da proteína KIT também foi associada com a sobrevida global

dos pacientes, entretanto não encontramos diferenças estatisticamente significativas.

67

CONCLUSÕES

68

7 CONCLUSÕES

Diante dos resultados deste estudo, podemos concluir que a proteína não é expressa

na mesma proporção que o RNAm de KIT, este expresso em 95% das amostras, enquanto a

proteína nas células neoplásicas (22,8%) e no tecido endotelial (40,2%), além disso, as

isoformas de KIT são diferentemente expressas em tecidos normais e congelados versus

linhagens celulares de GBM, esses dados sugerem uma mudança da expressão das isoformas

de KIT em adaptação das células tumorais para as condições de cultura celular. KIT parece

ser ativado em GBM através de mecanismos autócrinos/parácrinos com o ligante SCF. Em

relação ao papel tumorigênico, a isoforma GNNK- está associada parece ser mais oncogênica

devido à maior viabilidade e fenótipo invasivo em linhagens celulares de GBM, e através de

ensaios in vivo, observamos maior formação tumoral com as células transfectadas com as

isoformas e aumento da expressão de KIT nos tumores em GNNK-. Observamos maior

ativação de KIT em GNNK- e sua influência na ativação de ERK nas linhagens transfectadas

(GAMG). Apesar de diferenças não significativas, pacientes que expressam o RNAm de KIT

apresentam pior prognóstico e pacientes com a predominância da isoforma GNNK-

apresentam uma tendência a maior sobrevida.

69

PERSPECTIVAS

70

8 PERSPECTIVAS

De acordo com os achados deste trabalho, notamos que KIT está envolvido na

patogênese molecular de alguns gliomas, seja por amplificação gênica, que já foi descrito em

outros trabalhos, ou por mecanismos autócrinos/parácrinos, além de observar diferenças no

papel funcional e tumorigênico das isoformas GNNK de KIT. Dessa forma, o KIT poderia ser

um potencial alvo molecular na terapia antitumoral dos GBMs através dos inibidores de

tirosina quinase, além do mais, o papel das isoformas de KIT em resposta às terapias alvo de

KIT em GBMs é desconhecido. Diante disso, pretendemos avaliar o papel dos inibidores de

KIT (Imatinib, Sorafenib, Sunitinib, Cediranib, Nilotinib e Dasatinib) nas células transfectadas

com as respectivas isoformas.

71

REFERÊNCIAS

72

REFERÊNCIAS

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80

ANEXOS

81

ANEXOS

ANEXO A

82

83

84

85

ANEXO B

86

87

ANEXO C

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92

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94

95

ANEXO D

Ficha de coleta utilizada para coletar dados clínico-patológicos de pacientes com

glioblastoma do Hospital de Câncer de Barretos – Fundação Pio XII, no período de 2002 –

2014.

96

97