oxidacion bacteriana de sulfato ferroso
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UNIVERSIDAD DE CHILE
FACULTAD DE CIENCIAS FÍSICAS Y MATEMÁTICAS
DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA
OXIDACIÓN BACTERIANA DE SULFATO FERROSO
CON Acidithiobacillus ferrooxidans
GABRIEL EDUARDO MERUANE NARANJO
2002
UNIVERSIDAD DE CHILE
FACULTAD DE CIENCIAS FÍSICAS Y MATEMÁTICAS
DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA
OXIDACIÓN BACTERIANA DE SULFATO FERROSO
CON Acidithiobacillus ferrooxidans
GABRIEL EDUARDO MERUANE NARANJO
PROFESOR TUTOR : DR. TOMÁS VARGAS V.PROFESORES DE COMISIÓN : DRA. BARBARA ANDREWS
DR. EDGARDO DONATIDR. LEANDRO HERRERADR. DAVID HOLMES
TESIS PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR EN CIENCIASDE LA INGENIERÍA, MENCIÓN QUÍMICA
SANTIAGO DE CHILEJUNIO 2002
ii
A MI ESPOSA YENNY
Y A MIS HIJOS GABRIELA Y TEODORO
iii
AGRADECIMIENTOS
Al finalizar este trabajo debo reconocer a todos aquellos que colaboraron en mi
formación, y a aquellos que en forma directa e indirecta colaboraron en el desarrollo
de esta tesis. En especial quisiera agradecer a las siguientes personas e
instituciones:
A mis padres, Teodoro Meruane y Bibiana Naranjo, quienes me inspiraron a
realizar estudios de post-grado.
A Conicyt, que contribuyo a financiar mis estudios y permitió la realización de esta
tesis.
A los profesores del departamento de Ingeniería Química, que contribuyeron en
mi formación y me entregaron herramientas para el desarrollo de este trabajo.
Al Dr. Roberto Acevedo y al Dr. Jacques Wiertz, quienes desinteresadamente me
ayudaron en la revisión de los manuscritos originales.
A los profesores de la comisión Dra. Barbara Andrews, Dr. Edgardo Donati, Dr.
Leandro Herrera y Dr. David Holmes, quienes colaboraron al enriquecimiento
conceptual y mejoramiento de esta tesis.
Al Dr. Tomás Vargas, mi profesor tutor, inspirador en parte y cómplice en general
del desarrollo de este trabajo.
A mis colegas del centro de estudios avanzados en Hidrometalurgia /
Electrometalurgia, prof. Blanca Escobar y Dr. Jesús Casas, por sus sabios y
siempre oportunos consejos.
A mis compañeros y amigos del centro, Angel Sanhueza, Raúl Cordoba, Inés
Godoy, Hector Jordan y Juan José Segura, soporte físico, intelectual y sicológico
de mi trabajo.
Finalmente, y en forma muy especial debo agradecer a Yenny, ya que sin su
compañía y apoyo constante este trabajo no hubiese sido posible.
iv
TABLA DE CONTENIDOS
PORTADA iDEDICATORIA iiAGRADECIMIENTOS iiiTABLE DE CONTENIDOS ivÍNDICE DE FIGURAS viiiINDICE DE TABLAS xiRESUMEN xii
PRIMERA PARTE: INTRODUCCIÓN Y ANTECEDENTES 1
1 INTRODUCCIÓN 1
2 ANTECEDENTES BIBLIOGRÁFICOS 3 2.1 Características generales de Acidithiobacillus ferrooxidans 3 2.2 Metabolismo y bioenergética en la oxidación de ion ferroso 4 2.2.1 Metabolismo 4 2.2.2 Mecanismo de transporte directo de electrones 7 2.2.3 Mecanismo de transporte reverso de electrones 13 2.2.4 Reducción de ion férrico 16 2.2.5 Discusión 18 2.3 Oxidación bacteriana de ion ferroso 23 2.3.1 Cinética de oxidación 23 2.3.2 Efecto del pH 27 2.3.3 Efecto de la temperatura 32 2.3.4 Efecto de los aniones 35 2.3.5 Efecto de los cationes 36 2.3.6 Formación y efecto de precipitados 37 2.3.7 Efecto del ion férrico 39 2.3.8 Efecto del potencial redox de la solución y estudios de la actividad de Acidithiobacillus ferrooxidans en celdas electroquímicas
43
2.3.9 Discusión y enfoque la tesis 44
3 OBJETIVOS 46
v
SEGUNDA PARTE: EFECTO DEL Eh EN LA CINÉTICA DE OXIDACIÓN DE IONFERROSO CON Acidithiobacillus ferrooxidans
47
1 INTRODUCCIÓN 47
2 MATERIALES Y MÉTODOS 48 2.1 Cultivo de bacterias 48 2.2 Celda electroquímica 49 2.3 Procedimiento 50
3 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 52 3.1 Calibración de Electrodos 52 3.2 Resultados experimentales 54
4 EL MODELO 57 4.1 Descripción del modelo 57 4.2 Estimación de parámetros 63 4.3 Aplicación del modelo a otra información experimental 67 4.4 Implicaciones mecanísticas del modelo cinético derivado 68
5 CONCLUSIONES 71
TERCERA PARTE: EFECTO DEL pH EN LA CINÉTICA DE OXIDACIÓN DE IONFERROSO CON Acidithiobacillus ferrooxidans
73
1 INTRODUCCIÓN 73
2 MATERIALES Y MÉTODOS 75 2.1 Medición del efecto del pH en la actividad oxidativa bacteriana. Caso I: Rango de pH 1,3 – 2,5
75
2.1.1 Cultivo de bacterias 75 2.1.2 Montaje experimental 76 2.1.3 Preparación de soluciones 77 2.1.4 Procedimiento 77 2.2 Medición del efecto del pH en la actividad oxidativa bacteriana. Caso II: Rango de pH 2,5 – 7,0
78
2.2.1 Cultivo de bacterias 78 2.2.2 Montaje experimental 79 2.2.3 Preparación de soluciones 79 2.2.4 Procedimiento 80
vi
2.3 Medición del efecto del pH en la actividad oxidativa bacteriana. Caso III: Efecto del pH en el rendimiento del crecimiento bacteriano
80
2.3.1 Cultivo de bacterias 81 2.3.2 Bioreactor y montaje 82 2.3.3 Procedimiento 83
3 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 85 3.1 Caso I: Rango de pH 1,3 – 2,5 85 3.2 Caso II: Rango de pH 2,5 – 7,0 92 3.2.1 Metodología de cálculo 92 3.2.2 Velocidad de oxidación de ion ferroso 96 3.3 Caso III: Efecto del pH en el rendimiento del crecimiento bacteriano entre pH 2,0 y 4,0
104
3.3.1 Evaluación del rendimiento 104 3.3.2 Discusión 109
4 EFECTO DEL pH, EL MODELO 110
5 CONCLUSIONES 118
CUARTA PARTE: BIOOXIDACIÓN INDIRECTA DE CLORURO FERROSO ENUNA CELDA ELECTROQUÍMICA
120
1 INTRODUCCIÓN 120
2 MATERIALES Y MÉTODOS 121 2.0.1 Cultivo de bacterias 121 2.0.2 Celda electroquímica 121 2.1 Experiencias con cambio de anolito 122 2.1.1 Preparación de soluciones 122 2.1.2 Procedimiento 123 2.2 Experiencias con recirculación de anolito 123 2.2.1 Preparación de soluciones 123 2.2.2 Procedimiento 123
3 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 124 3.1 Experiencias con cambio de anolito 124 3.2 Experiencias con recirculación de anolito 126
4 CONCLUSIONES 128
vii
REFERENCIAS 129
ANEXOS ANEXO A. INFLUENCIA DE LA CONCENTRACIÓN DE OXÍGENO EN LAS MEDICIONES DE Eh
140
ANEXO B. CALIBRACIÓN DE ELECTRODOS DE Eh 148 ANEXO C. PRUEBAS A POTENCIAL CONTROLADO 153 ANEXO D. DESARROLLO ALGEBRAICO DEL MODELO, SECCIÓN 4 SEGUNDA PARTE
154
ANEXO E. RESPALDO DE PRUEBAS DE OXIDACIÓN DE ION FERROSO EN EL RANGO pH 1,3 – 2,5
159
ANEXO F. DETERMINACIÓN DE ESTEQUIMETRÍAS DE FORMACIÓN DE PRECIPITADOS FÉRRICOS
164
ANEXO G. RESPALDO DE PRUEBAS DE OXIDACIÓN DE ION FERROSO EN EL RANGO pH 2,5 – 7,0
170
ANEXO H. MEDICIÓN DEL COEFICIENTE DE RENDIMIENTO BACTERIANO EN EL RANGO DE pH 2,0 – 4,0
177
ANEXO I. BIOOXIDACIÓN INDIRECTA DE CLORURO FERROSO 182 ANEXO J. PUBLICACIONES INTERNACIONALES GENERADAS CON LOS RESULTADOS DE ESTE TRABAJO DE TESIS
183
viii
ÍNDICE DE FIGURAS
PRIMERA PARTE
Figura 2.1 Esquema del ciclo de Calvin resumido. 5Figura 2.2 Representación de las relaciones redox y metabólicas en
Acidithiobacillus ferrooxidans.6
Figura 2.3 Cadena de transporte directo de electrones propuesta porIngledew y colaboradores.
8
Figura 2.4 Cadena de transporte directo de electrones propuesta por Blake II y colaboradores.
9
Figura 2.5 Cadena de transporte directo de electrones propuesta porYamanaka y colaboradores.
10
Figura 2.6 Cadena de transporte directo de electrones propuesta porElbehti y colaboradores.
11
Figura 2.7 Cadena de transporte directo de electrones propuesta en estetrabajo. En color rojo se resalta el transporte de electrones y encolor azul el flujo de protones.
13
Figura 2.8 Cadena de transporte directo y reverso de electronespropuesto por Elbehti y colaboradores. En color rojo se resaltael transporte de electrones y en color azul y verde el flujo deprotones para cada caso.
15
Figura 2.9 Transporte de electrones en la oxidación de ion ferroso. Encolor rojo se resalta el transporte de electrones y en color azulel flujo de protones.
21
Figura 2.10 Transporte de electrones en la oxidación de azufre. En colorrojo se resalta el transporte de electrones y en color azul elflujo de protones.
21
Figura 2.11 Transporte de electrones en la oxidación anaeróbica de azufre.En color rojo se resalta el transporte de electrones y en colorazul el flujo de protones.
22
Figura 2.12 Efecto del pH sobre la actividad oxidativa de Fe2+ porAcidithiobacillus ferrooxidans (Figura extraída de Pesic, 1993).
28
Figura 2.13 Población de Acidithiobacillus ferrooxidans en función del pHen muestras de relaves. (Figura extraída de Nordstrom ySoutham 1997).
31
Figura 2.14 Efecto de la temperatura sobre la actividad oxidativa de ionferroso por Acidithiobacillus ferrooxidans y su relación con elpH del medio. Figura tomada de MacDonald y Clark (1970).
33
ix
SEGUNDA PARTE
Figura 2.1 Celda electroquímica para medición de actividad oxidativabacteriana a potencial controlado.
50
Figura 3.1 Curva de calibración de electrodo de Eh como función de larazón férrico / ferroso. Caso 1 g/l de hierro total a 30ºC conmedio basal.
54
Figura 3.2 Velocidad específica de oxidación en función de laconcentración de ion ferroso.
55
Figura 3.3 Velocidad específica de oxidación de ion ferroso en función delEh de la solución que se establece para cada corriente.
57
Figura 4.1 Correlación entre valores calculados y experimentales de vFe2+.
Valores calculados usando expresión (17).64
Figura 4.2 Dependencia de la velocidad de oxidación bacteriana de ionferroso con el Eh (o la razón férrico/ferroso) y la concentraciónde ion ferroso en solución, calculada utilizando las expresiones(17) y (22).
65
Figura 4.3 Valores publicados por Harvey y Crundwell (1996) y ajuste almodelo cinético presentado en este trabajo.
67
Figura 4.4 Diagramas corriente – potencial en el mecanismoelectroquímico de la oxidación bacteriana de ion ferroso conAcidithiobacillus ferrooxidans.
70
TERCERA PARTE
Figura 2.1 Montaje experimental para medición del efecto del pH en laactividad oxidativa bacteriana.
77
Figura 2.2 Montaje experimental utilizado para la estimación delrendimiento en el crecimiento bacteriano al oxidar sulfatoferroso.
82
Figura 3.1 Evolución del Eh y pH. Población de bacterias 5,5x107 cel/ml,[Fe2+]inicial = 0,2 g/l, pH promedio 1,84.
86
Figura 3.2 Velocidad de oxidación de ion ferroso. Población de bacterias5,5x107 cel/ml, [Fe2+]inicial = 0,2 g/l, pH promedio 1,84.
87
Figura 3.3 Efecto del pH sobre VMax. 89Figura 3.4 Efecto del pH sobre KS. 89Figura 3.5 KS en función de la concentración de protones. Regresión
lineal de los datos en el rango de pH 1,27 – 2,06.90
Figura 3.6 Evolución de Eh y pH. Población inicial de bacterias 2x107
cel/ml. Concentración inicial de ion ferroso 0,5 g/l en mediobasal.
93
Figura 3.7 Velocidad de oxidación de ion ferroso. [Fe2+]inicial = 0,5 g/l, noinoculado, en medio basal.
97
Figura 3.8 Velocidad de oxidación de ion ferroso. [Fe2+]inicial = 0,5 g/l,inoculado, en medio basal.
97
x
Figura 3.9 Velocidad de oxidación bacteriana de ion ferroso. [Fe2+]inicial =0,5 g/l, inoculado, en medio basal.
99
Figura 3.10 Valores de Vmax calculados, en soluciones de medio basal con2x107 cel/ml para diferentes [Fe2+]inicial.
100
Figura 3.11 Valores de Vmax calculados, en soluciones libres de nutrientescon 2x107 cel/ml para diferentes [Fe2+]inicial.
100
Figura 3.12 Masa acumulada de precipitados férricos, [Fe2+]inicial = 0,1 g/. 101Figura 3.13 Masa acumulada de precipitados férricos, [Fe2+]inicial = 1,0 g/l. 101Figura 3.14 Velocidad de oxidación máxima. Soluciones de medio basal
con 1,0 g/l de ferroso inicial.103
Figura 3.15 Razón masa de precipitados / número de bacterias, durantepruebas de oxidación con 1,0 g/l de ion ferroso inicial en mediobasal.
103
Figura 3.16 Evolución de la velocidad de consumo de oxígeno y potencialredox en experiencia con pH = 2,0. [Fe2+] inicial = 1,0 g/l.
106
Figura 3.17 Velocidad de consumo de oxígeno en función del Eh,experiencia con pH = 2,0. [Fe2+] inicial = 1,0 g/l.
106
Figura 3.18 Evolución de la velocidad de consumo de oxígeno y dióxido decarbono en experiencia con pH = 2,0
107
Figura 3.19 Razón entre velocidad de consumo de dióxido de carbono yoxígeno en experiencia con pH = 2,0
107
Figura 3.20 Evolución de la velocidad de consumo de oxígeno y dióxido decarbono en experiencia con pH = 4,0
108
Figura 3.21 Razón entre velocidad de consumo de dióxido de carbono yoxígeno en experiencia con pH = 4,0
108
Figura 3.22 Razón entre velocidad de consumo de dióxido de carbono yoxígeno promedio en función del pH de cada experiencia.
109
Figura 4.1 Valores de calcmaxV en función del pH. 112
Figura 4.2 VMax vs [H+]. Serie experimental con 1,0 g/l de ion ferroso inicialen medio basal y 8x107 cel/ml. En color azul, datosexperimentales; en rojo modelo ajustado ec. (38).
114
Figura 4.3 +2FeV vs pH calculada según expresión (39). Se considerandistintas concentraciones de férrico total y precipitación deacuerdo a Figura F.11. Concentración de ion ferroso 1,0 g/l.
116
Figura 4.4 +2FeV vs pH calculada según expresión (39). Se considerandistintas concentraciones de ion ferroso y férrico total cero.
117
CUARTA PARTE
Figura 2.1 Esquema del montaje utilizado en biooxidación indirecta. 122Figura 3.1 Potenciales redox en las semi-celdas para la operación celda
bioelectroquímica con recambio de anolito.125
Figura 3.2 Crecimiento bacteriano, oxidación indirecta en reactorbioelectroquimico versus ion ferroso total oxidado en la celda.
127
xi
ÍNDICE DE TABLAS
PRIMERA PARTE
Tabla 2.1 Rango de pH óptimo para la oxidación de ion ferroso porAcidithiobacillus ferrooxidans. Valores de referencia.
30
Tabla 2.2 Temperatura óptima de oxidación de ion ferroso porAcidithiobacillus ferrooxidans en cultivos batch y continuos.Valores de referencia obtenidos por múltiples investigadores.
34
Tabla 2.3 Efecto de aniones sobre la oxidación de Fe(II) porAcidithiobacillus ferrooxidans (Ingledew, 1982).
35
Tabla 2.4 efecto inhibitorio de algunos cationes en la oxidación de ionferroso por Acidithiobacillus ferrooxidans
37
SEGUNDA PARTE
Tabla 2.1 Composición del medio basal. 48Tabla 3.1 Efecto del potencial aplicado sobre la velocidad de oxidación y
el potencial redox de la solución.55
Tabla 3.2 Efecto de la concentración de ion ferroso sobre la velocidad deoxidación y el potencial redox de la solución para cadapotencial aplicado.
56
Tabla 4.1 Parámetros ajustados para expresión (17). 63Tabla 4.2 Parámetros ajustados para expresión (22). 64Tabla 4.3 Parámetros ajustados para expresión (17) con datos de Harvey
y Crundwell (1996).67
TERCERA PARTE
Tabla 2.1 Composición del medio basal. 75Tabla 3.1 Parámetros ajustados para ecuación tipo Monod en
experiencias a pH entre 1,27 y 2,6088
Tabla 4.1 Parámetros ajustados de ecuación (38) 114Tabla 4.2 Valor de parámetros para expresión cinética (39). 115
xii
RESUMEN La disolución de minerales sulfurados en biolixiviación, incluye una etapa de oxidación bacteriana de ion ferroso utilizando oxígeno disuelto como aceptor de electrones. El ion férrico producido ataca posteriormente al sulfuro metálico en una reacción puramente química. La cinética de oxidación bacteriana de ion ferroso con Acidithiobacillus ferrooxidans ha sido descrita normalmente en términos de una expresión del tipo Monod. Sin embargo, la evidencia experimental publicada sugiere un importante efecto del pH y del Eh de la solución sobre la velocidad de oxidación, los cuales no están completamente caracterizados. En este trabajo de tesis se profundiza el estudio del efecto del pH y del Eh sobre la velocidad de oxidación de sulfato ferroso en presencia de Acidithiobacillus ferrooxidans. El estudio de la influencia del Eh en la velocidad de oxidación de ion ferroso se realizó con una celda bioelectroquímica que permite realizar mediciones a potencial controlado. Los resultados obtenidos permitieron validar un original modelo cinético desarrollado que incorpora explícitamente el efecto del Eh y considera asimismo el efecto de las concentraciones de ion ferroso y férrico. La expresión cinética obtenida permite la descripción de la cinética de oxidación de ion ferroso con Acidithiobacillus ferrooxidans en un rango de potencial (0,56 a 0,84 V vs SHE) mucho más amplio que los modelos presentados con anterioridad. Los resultados muestran que con Eh < 0,65 V(SHE) la velocidad de oxidación bacteriana depende sólo de la concentración de ion ferroso. Cuando el Eh está entre 0,65 y 0,82 V(SHE) la oxidación bacteriana de ion ferroso disminuye al crecer la concentración de ion férrico. Para Eh sobre 0,82 V(SHE) la actividad oxidativa bacteriana disminuye fuertemente por el aumento de Eh, siendo nula cuando se alcanza Eh máximo de 0,84 V(SHE). El modelo cinético construido permite relacionar el comportamiento de la velocidad de oxidación bacteriana de ion ferroso con las etapas principales de la cadena de transporte de electrones del microorganismo. El estudio de la influencia del pH en la zona de pH sobre 2,5 se efectuó utilizando una metodología desarrollada por el autor que permite evaluar en forma separada la influencia del pH y de la simultánea formación de precipitados. Los resultados muestran que a pH sobre 2,5 la disminución de la velocidad de oxidación bacteriana de ion ferroso esta principalmente controlada por la disminución en la concentración de protones en solución. Sin embargo, existe una contribución inhibitoria adicional debido a la formación de precipitados férricos en este rango de pH. Se encuentra además, que a pH sobre 5,0 la acción bacteriana se vuelve despreciable y predomina la oxidación química de ion ferroso. Con la información obtenida se demostró que es posible lograr un efectivo aumento de la actividad oxidativa bacteriana mediante un adecuado control de la concentración de hierro (y formación de precipitados) y la acidez en solución.
xiii
Se realizaron mediciones de velocidad de oxidación bacteriana de ion ferroso en el rango de pH de 1,3 a 2,5. Para ello se midieron velocidades iniciales de oxidación utilizando un electrodo de Eh a pH controlado. Se encontró que en este rango de pH el efecto de la acidez es especialmente fuerte sobre la constante de afinidad con el sustrato KS, aumentándola al disminuir el pH. Integrando la información experimental de velocidades de oxidación bacteriana de ion ferroso en el rango de pH de 1,3 a 5,0, se formuló una expresión cinética que permite describir en forma adecuada la influencia de la concentración de ácido y de la formación de precipitados sobre la velocidad de oxidación bacteriana de ion ferroso en todo el rango de pH analizado. Finalmente, se evaluó el comportamiento de un reactor electroquímico para la biooxidación indirecta de ion ferroso en soluciones que inhiben la acción oxidativa de Acidithiobacillus ferrooxidans. Utilizando una celda de dos compartimentos se estudió la oxidación indirecta de ion ferroso en soluciones cloruradas inadecuadas para el desarrollo bacteriano. Se encontró que la bacteria es capaz de sostener durante tiempos prolongados el proceso de oxidación indirecta y, además, crecer utilizando este proceso. El rendimiento obtenido para el crecimiento de los microorganismos en estas condiciones es Y = 8,34 x 104 cel. / µg Fe, un valor similar al reportado para la oxidación de ion ferroso por Acidithiobacillus ferrooxidans en medios de cultivo.
1
PRIMERA PARTE:INTRODUCCIÓN Y ANTECEDENTES
1 INTRODUCCIÓN
Acidithiobacillus ferrooxidans∗ es una bacteria del genero thiobacilli,
quimiolitotrófica, que es capaz de oxidar ion ferroso y compuestos reducidos de
azufre en soluciones de ácido sulfúrico en presencia de oxigeno. En ambientes
anóxicos es capaz de utilizar ion férrico como oxidante para la oxidación de azufre
(Brock y Gustafson, 1976), sulfuros (Das y Mishra, 1996), hidrógeno (Drobner et
al., 1990) y de algunos compuestos orgánicos (Pronk et al., 1991). La energía
obtenida de los procesos oxidativos se utiliza en la fijación de dióxido de carbono,
mantenimiento celular y crecimiento.
Estos microorganismos se han estudiado ampliamente al comprobarse su
contribución en la biolixiviación de una variedad de minerales sulfurados (Brierley
and Brierley, 1999; Hansford and Vargas, 2001). En muchos casos, la
biolixiviación ofrece ventajas económicas, técnicas y genera menor impacto
ambiental que los procesos pirometalúrgicos de tratamiento de sulfuros. Plantas
comerciales de biolixiviación para concentrados refractarios de pirita/arsenopirita
operan en Sudáfrica, Gana, Australia y Brasil; y biolixiviación en pilas de minerales
de cobre se realiza en Chile, Estados Unidos, Australia y Bulgaria (Brierley and
Brierley, 1999).
Para optimizar los parámetros de operación en una planta de biolixiviación es
conveniente, conocer el mecanismo y disponer de un modelo cinético para la
biolixiviación de minerales sulfurados. Aunque existen variadas formas de acción
de los microorganismos (Crundwell, 2001) hay acuerdo en que el mecanismo
∗ El genero Thiobacillus ha sido reclasificado recientemente y la especie Thiobacillus ferrooxidansha sido renombrada a Acidithiobacillus ferrooxidans (Kelly and Wood, 2000)
2
principal de catálisis bacteriana en la disolución de minerales de sulfurados es
aquel identificado como mecanismo indirecto, que está basado en la oxidación
bacteriana de ion ferroso con oxígeno disuelto de acuerdo con la reacción:
OH)SO(FeO2/1H2FeSO2 2342bacteria
24 + →++ + (1)
El ion férrico producido puede luego atacar químicamente a los sulfuros según la
reacción general:
+++ ++→+ 2023 Fe2SMMSFe2 (2)
donde M2+ corresponde a un catión metálico divalente.
Se puede argumentar que, en la biolixiviación de minerales sulfurados, alcanzar
altas velocidades de disolución depende principalmente de una adecuada acción
bacteriana indirecta.
Además de la disolución de sulfuros metálicos, la habilidad de Acidithiobacillus
ferrooxidans para oxidar ion ferroso ha sido explotada en bioprocesos con relación
al tratamiento de aguas (drenajes) ácidas de mina, en procesos de desulfuración
de carbón mineral, oxidación de H2S en gas natural y tratamiento de residuos
orgánicos (Nemati et al., 1998). Estas aplicaciones muestran que la oxidación
biológica de sulfato ferroso es una operación unitaria de relevancia industrial.
Dada su importancia creciente la oxidación bacteriana de sulfato ferroso ha sido
estudiada en las últimas décadas. A continuación se presenta una revisión de los
principales aspectos relativos a su mecanismo de reacción y a las condiciones de
operación que la favorecen, utilizando en particular Acidithiobacillus ferrooxidans.
3
2 ANTECEDENTES BIBLIOGRÁFICOS
2.1 Características generales de Acidithiobacillus ferrooxidans
Acidithiobacillus ferrooxidans son bacterias con forma de bastón, gram negativas,
no forman esporulación y tienen dimensiones de 0,5 µm de ancho y 1,0 a 2,0 µm
de largo con extremos redondeados (Rossi, 1990). Normalmente se encuentran
aisladas o en pares y solo ocasionalmente forman cadenas cortas. Son mótiles y
poseen un flagelo polar, encontrándose usualmente en aguas ácidas de minas de
carbón y fierro. Además, de acuerdo a su metabolismo poseen las características
que se indican a continuación:
Autotróficas: su fuente de carbono para la síntesis celular es el dióxido de
carbono. Además, requiere nitrógeno (como amonio), azufre (como sulfato
o compuestos reducidos) y fósforo (en forma de fosfato) como nutrientes
para el crecimiento celular y síntesis, junto con trazas de metales como: Fe,
K, Mg, Na, Ca y Co.
Quimiolitotrófica: la energía para mantenimiento y crecimiento es obtenida a
partir de la oxidación de compuestos reducidos de azufre y oxidación de ion
ferroso. Además, son capaces de oxidar hidrogeno (Drobner et al., 1990) y
compuestos orgánicos en algunos casos.
Aeróbicas: Utilizan oxígeno como aceptor de electrones, sin embargo, se ha
mostrado que es además anaeróbica facultativa (Brock y Gustafson, 1976).
Mesófila: crece en condiciones de temperatura entre 10 y 45 ºC,
encontrándose el óptimo entre 28 y 33ºC dependiendo de la concentración
total de fierro disuelto y el pH.
4
Acidófila: posee un pH óptimo de crecimiento entre 2,0 y 2,5 en la oxidación
de sulfato ferroso. Cuando oxida compuestos de azufre mantiene altas
actividades oxidativas a pH superior a 4.
2.2 Metabolismo y bioenergética en la oxidación de ion ferroso
2.2.1 Metabolismo
Las rutas metabólicas de Acidithiobacillus ferrooxidans aparentemente
corresponden a las rutas estándar en microorganismos quimiolitotrofos. Esta
bacteria posee un ciclo de Calvin para la fijación de CO2, y rutas para la fijación de
nitrógeno y fosfato (Ingledew, 1982). La fijación de carbono requerida para la
síntesis de material celular y crecimiento, al realizarse a través del ciclo de Calvin,
requiere de la presencia de ATP (Adenosín Trifosfato) y NADPH (Nicotinamida
Adenina Dinucleótido Fosfato) en el citoplasma celular. Un esquema
representativo de este proceso se aprecia en la Figura 2.1. En esta figura 3-PGA
corresponde a 3-fosfoglicerato; G3P es gliceraldehido 3-fosfato; y RuBP es
ribulosa 1,5-bifosfato.
Para la obtención de las moléculas energéticas requeridas para impulsar este ciclo
y las otras funciones metabólicas del microorganismo, la bacteria obtiene la
energía asociada al proceso de oxidación de ion ferroso (o compuestos reducidos
de azufre según sea el caso) con oxigeno.
La transformación energética asociada al proceso oxidativo de ion ferroso puede
ser resumida en dos procesos relacionados: El transporte directo de electrones
desde el ion ferroso al oxígeno, que mediante un mecanismo de quimiosmosis
(que será discutido posteriormente) produce ATP; y un mecanismo reverso de
transporte de electrones que utilizando una parte de la energía disponible en el
transporte directo, transfiere electrones necesarios desde el ion ferroso para la
reducción de NADP+ a NADPH.
5
Figura 2.1: Esquema del ciclo de Calvin resumido.
En términos de una escala de potenciales redox, los procesos de transporte
directo e indirecto de electrones pueden ser esquematizados de acuerdo a la
Figura 2.2, (Ingledew, 1982).
Para la fijación de cada molécula de dióxido de carbono la bacteria utiliza a lo
menos tres moléculas de ATP y dos moléculas de NADPH (Ver Figura 2.1). La
obtención de estos compuestos se realiza en el mecanismo asociado a la
oxidación de ion ferroso (Figura 2.2).
6
La síntesis de ATP utiliza transferencia espontánea de electrones entre el ion
ferroso en solución y el oxigeno disuelto que ingresa a la célula. Este proceso es
denominado transporte directo de electrones y aparece con una flecha gruesa en
la Figura 2.2. La transferencia de electrones se realiza utilizando una cadena de
reacciones bioquímicas, que en una secuencia de pares redox permite formar una
cadena de transporte de electrones, que se discute mas adelante.
Figura 2.2: Representación de las relaciones redox y metabólicas en
Acidithiobacillus ferrooxidans.
En el caso de la síntesis orgánica, se requiere también la reducción de NADP+ a
NADPH utilizando como reductor al ion ferroso. Esta reacción no es espontánea,
ya que la diferencia de potencial de la reacción es negativa. En consecuencia el
7
transporte de electrones se efectúa en un modo reverso, es decir, utiliza una
fuerza electromotriz externa. La energía de este transporte reverso corresponde a
una parte de la obtenida de la oxidación de ion ferroso con oxigeno. Esto es
posible, dado que el mecanismo de transporte directo de electrones utiliza más del
90% de los electrones cedidos por el ion ferroso, en cambio el transporte reverso
utiliza un máximo del orden de un 10% de los mismos (Ingledew, 1982).
A continuación se discuten brevemente los mecanismos de transporte de
electrones en este microorganismo y se proponen los esquemas más probables
para representar estos procesos.
2.2.2 Mecanismo de transporte directo de electrones
En la variedad de los microorganismos oxidantes de fierro que pueden ser
aislados de aguas ácidas de mina o directamente de sulfuros metálicos,
Acidithiobacillus ferrooxidans ha recibido la mayor atención. Este hecho ha sido,
probablemente influido por la facilidad para su aislamiento y mantención en
cultivos de laboratorio (Blake et al., 1993). A pesar de ello el mecanismo utilizado
por este microorganismo para la oxidación de ion ferroso, utilizando oxigeno
disuelto como aceptor de electrones, no ha sido establecido en forma definitiva.
En las últimas tres décadas, se han identificado una variedad de componentes
celulares que pueden estar involucrados en el proceso oxidativo. Entre estos
componentes se incluyen: rusticianina, tres o más citocromos de tipo c, citocromos
de tipo a, proteínas con centros de Fe-S y complejos polinucleares de ion férrico y
sulfato en la pared exterior celular. La organización de estas especies en la
cadena de transporte de electrones para la oxidación de ion ferroso no está
definida y su discusión será llevada a cabo en esta sección.
Ingledew (1986) propuso que los electrones derivados de la oxidación de ion
ferroso disuelto son conducidos a través de un complejo polinuclear de fierro
8
ubicado al interior de la pared celular. Estos equivalentes de reducción capturados
son luego transferidos al oxigeno mediante una cadena de transporte a través del
periplasma y la membrana plasmática. La cadena propuesta se puede observar en
la Figura 2.3.
Ingledew y sus colaboradores (Ingledew and Cobley, 1980; Ingledew, 1982;
Ingledew, 1986; Ingledew and Houston, 1986) demostraron que tanto la
rusticianina como los citocromos c solubles se encuentran en el periplasma,
además, existe otro citocromo c enlazado a la membrana plasmática y el
citocromo a se localiza a través de ella. De igual forma se sugiere que la reducción
de oxigeno se lleva a cabo en el periplasma celular. El proceso respiratorio puede
así convertir la energía de potencial redox disponible entre los pares de reducción
y oxidación en un diferencial electroquímico de protones∗. Este diferencial impulsa
el proceso de fosforilación oxidativa para la obtención de ATP (Ingledew, 1982).
Figura 2.3. Cadena de transporte de electrones propuesta por Ingledew y
colaboradores.
La rusticianina es una proteína soluble con centros de cobre que presenta una
gran abundancia en el periplasma de Acidithiobacillus ferrooxidans (Ingledew,
9
1982; Blake and Shute, 1994). Sin embargo, la reacción de oxidación de ion
ferroso y sus complejos solubles en medio sulfato con rusticianina es muy lenta y
en consecuencia esta especie no es probablemente el aceptor primario de
electrones (Blake and Shute, 1987). Otra dificultad encontrada por Blake al
modelo propuesto por Ingledew es el rol asignado a la cubierta polinuclear de ion
férrico de la bacteria. Se argumenta que es difícil diferenciar entre una película de
fierro organizada y de funciones específicas y una cubierta de Fe(III) que se puede
esperar de acuerdo con la polaridad negativa de pared celular relativa a un
ambiente de abundante fierro disuelto (Blake and Shute, 1994).
En acuerdo con esta evidencia Blake y colaboradores (Blake et al, 1993; Blake
and Shute, 1994) propusieron que el aceptor inicial de electrones es un citocromo
c soluble, que luego reduce la rusticianina. El mecanismo de transporte de
electrones en consecuencia se muestra en la Figura 2.4.
Figura 2.4. Cadena de transporte de electrones propuesta por Blake II y
colaboradores.
También, Yamanaka y colaboradores (Yamanaka et al., 1993; Yamanaka and
Fukumori, 1995) aislaron y caracterizaron una serie de enzimas y proteínas redox
∗ Se utiliza la palabra protones o H+ por simplicidad, ya que en soluciones acuosas la especie
10
que participan en la oxidación de ion ferroso por Acidithiobacillus ferrooxidans.
Ellas son citocromos c solubles, rusticianina, citocromos c enlazados a la
membrana, un citocromo a incrustado a través de la membrana plasmática y una
proteína Fe/S que actuaría como Fe(II) – citocromo c oxidoreductasa. Esta última
proteína posee una secuencia de aminoácidos similar a las proteínas fierro –
azufre de alto potencial redox encontradas en organismos fotosintéticos. Esta
proteína reduce rápidamente citocromos c en presencia de ion ferroso, pero no
puede reducir rusticianina en ausencia de citocromo c. Utilizando un razonamiento
energético, Yamanaka et al. (1993) sugieren adicionalmente que la reducción de
oxigeno se produce en la cara periplasmática de la membrana plasmática. Estos
razonamientos y evidencias le sugirieron plantear un mecanismo alternativo de
transporte de electrones para la oxidación de ion ferroso que se presenta en la
Figura 2.5.
Figura 2.5. Cadena de transporte de electrones propuesta por Yamanaka y
colaboradores.
Acidithiobacillus ferrooxidans es un microorganismo acidófilo, sin embargo, valores
de pH menores a 1,5 producen una disminución en su actividad oxidativa de ion
ferroso (Ingledew, 1982; Nemati et al., 1998). Este fenómeno corresponde a un
presente es H3O+ (ion hidronio) u otras especies hidratadas.
11
proceso inhibitorio reversible (Sand, 1989) y en consecuencia se puede
argumentar que el proceso enzimático de transporte de electrones posee etapas
en las cuales existe transferencia de protones o especies que al estar protonadas
se vuelven inactivas. Appia-Ayme et al. (1999) encontraron que los genes de
Acidithiobacillus ferrooxidans sugieren que la citocromo c oxidasa es del tipo aa3.
Esta oxidasa también se encuentra en la estructura de las mitocondrias donde es
reconocida la translocación de protones asociada a la oxidación de oxigeno (Voet
and Voet, 1995). Un modelo simple que resulta coherente con estos resultados,
indica la translocación de protones asociada a la entrada de electrones desde la
oxidación de ion ferroso hacia el oxigeno molecular en el citoplasma (Nemati et al.,
1998; Elbehti et al., 2000). Este esquema corresponde a una presentación
comúnmente aceptada para los procesos de fosforilación oxidativa utilizando la
teoría quimiosmótica (Slater et al., 1985) como se aprecia en la Figura 2.6.
Figura 2.6. Cadena de transporte de electrones propuesta por Elbehti y
colaboradores.
En el esquema de la Figura 2.6 se hace presente otro aspecto relevante del
proceso de oxidación de ion ferroso que es la definición de la fuerza motriz
protónica suficiente para producir el proceso de fosforilación de ADP. El circuito de
H+ que se define en la membrana plasmática es clave para la generación de ATP
12
y el crecimiento bacteriano y en consecuencia la primera pregunta que debemos
responder es ¿Cómo se establece el ∆µH+ necesario?. Este hecho es relevante
para resolver si el mecanismo es activo (consecuencia de bombeo de protones
asociado a la actividad oxidativa) o pasivo (se genera como consecuencia de la
secuencia de pares redox del sistema y la química de la membrana).
Para Acidithiobacillus ferrooxidans se encuentra que durante el proceso oxidativo
el pH citoplasmático permanece constante, en consecuencia la diferencia de pH a
través de la membrana plasmática queda solo definido por el pH del entorno
(Ingledew, 1982). Un hecho similar se encuentra en otros microorganismos como
Thiobacillus acidophilus (Zychlinsky y Matin, 1983). De igual forma, se encuentra
que la diferencia de potencial eléctrico (∆Ψ) que se establece entre ambas caras
de la membrana citoplasmática es relativamente constante y suficiente para
mantener la diferencia de pH. Esta condición se mantiene aún en condiciones de
ausencia de oxidación e insuficiente ATP para producir su hidrólisis que podría
restablecer el equilibrio de protones (Zychlinsky y Matin, 1983).
Estos antecedentes indican que la mantención de la diferencia de pH en estos
microorganismos acidófilos es un proceso pasivo, es decir, el ∆Ψ existente es
suficiente para mantener un ∆pH de 2 o 3 puntos. En consecuencia la fuerza
motriz para la producción de ATP requiere de un circuito de protones que no está
sustentado en la diferencia de pH entre la solución y el interior del
microorganismo. Este hecho es claramente señalado por Ingledew (1986) al
expresar que ∆µH+ se obtiene del proceso respiratorio que convierte la diferencia
de energía potencial entre los pares redox. Esta energía electroquímica es
convertida en energía química (ATP) a través de un mecanismo de quimiosmosis.
En resumen, los antecedentes anteriores muestran que la fuerza motriz protónica
que produce la fosforilación de ADP para dar ATP, está básicamente definida por
la diferencia de potencial redox entre el par ferroso / férrico y el par oxigeno /
agua. El proceso oxidativo consume protones en el citoplasma (∆[H+] consumido)
13
y simultáneamente realiza la translocación de protones fuera de la membrana
citoplasmática (∆[H+] translocado). Adicionalmente el ion férrico producido es
hidrolizado en el exterior, generando una diferencia mayor de acidez (∆[H+]
hidrólisis).
En la Figura 2.7 podemos sintetizar las conclusiones de este análisis y la siguiente
expresión nos indica la sumatoria de términos que podrían definir la fuerza motriz
protónica para la formación de ATP.
∆[H+] total = ∆[H+] (consumido) + ∆[H+] (translocado) + ∆[H+] (hidrólisis) (3)
Figura 2.7. Cadena de transporte de electrones propuesta en este trabajo. En
color rojo se resalta el transporte de electrones y en color azul el flujo de protones.
2.2.3 Mecanismo de transporte reverso de electrones
En adición al mecanismo de síntesis de ATP en la membrana celular, se desarrolla
simultáneamente un proceso de transporte reverso de electrones orientado a la
reducción de NADPH a partir de NADP+. Esta reacción es imprescindible para la
fijación de CO2 y los procesos de síntesis orgánica que ocurren al interior de la
estructura celular. Esta reducción también utiliza la oxidación de ion ferroso, sin
14
embargo, al ser esta reacción termodinámicamente desfavorable (diferencia de
energía libre positiva), se requiere una fuerza motriz externa para incentivar la
transferencia de electrones. Este proceso utiliza una parte de la energía disponible
de la oxidación de ion ferroso por oxígeno (Ingledew, 1982). En esta reacción la
diferencia de potencial electroquímico de protones sólo se encuentra en la forma
de ∆pH. Aprovechando el potencial químico de la diferencia de actividad de los
protones en ambas caras de la membrana plasmática, se impulsa el transporte de
electrones asociándolo al ingreso simultaneo de protones a la célula.
El mecanismo de transporte reverso de electrones utiliza una pequeña cantidad
del flujo total de electrones a través de la membrana celular y consecuentemente
la concentración de sus componentes en la célula es pequeña. Los elementos
mencionados han constituido un obstáculo en la investigación de la cadena de
transporte reverso de electrones en Acidithiobacillus ferrooxidans y solo se pueden
mencionar un par de contribuciones que sugieran mecanismos bioquímicos para la
ocurrencia del proceso (Ingledew, 1982; Elbehti et al, 2000).
Ingledew (1982) sugirió la existencia de centros de fierro-azufre, un citocromo c1,
una quinona y citocromos b en la cadena de transporte de electrones y de acuerdo
con sus potenciales redox es de esperar que participen en la cadena de transporte
entre el ion ferroso y NADP+. Adicionalmente, como la fuerza motriz del proceso
está sólo en forma de ∆pH, se debe transportar en forma activa un mínimo de 4
protones para entregar la energía necesaria. Ingledew (1982) sugirió tres
mecanismos para acoplar el transporte de electrones al ingreso de protones,
aunque no encontró evidencia suficiente para completar una hipótesis sólida.
Un sólido complemento al trabajo de Ingledew lo encontramos en las
publicaciones de Elbehti et. al. (1997; 1999; 2000) y Brugna et. al. (1999). En
estos trabajos se presenta evidencia concluyente de la existencia de enzimas del
tipo complejo citocromo bc1 en Acidithiobacillus ferrooxidans y se caracteriza en
detalle su estructura y funcionamiento. De acuerdo con Elbehti et al (1997), en la
15
estructura celular se encuentran citocromos c1 enlazados a la membrana
plasmática, citocromos b y proteínas de tipo Rieske. Estas tres sub-unidades
sugieren la existencia de un complejo enzimático del tipo bc1. Basados en la
evidencia experimental Elbehti et al (2000) propusieron un mecanismo para el
transporte reverso de electrones que resulta coherente con las aseveraciones de
Ingledew y permite explicar la bioenergética del proceso.
El mecanismo propuesto por Elbehti et al (2000) para el transporte directo y
reverso de electrones se ilustra en la Figura 2.8.
Figura 2.8. Cadena de transporte directo y reverso de electrones propuesto por
Elbehti y colaboradores. En color rojo se resalta el transporte de electrones y en
color azul y verde el flujo de protones para cada caso.
En el mecanismo propuesto (Elbehti et al., 2000) el proceso de transporte directo
de electrones que ocurre en la oxidación de ion ferroso con oxigeno disuelto
permite la acumulación de ATP en el citoplasma celular. Se supone que la
16
concentración de ATP regula la actividad de la citocromo c oxidasa, disminuyendo
su actividad cuando la razón ATP/ADP es alta. Cuando se acumula ATP, la fuerza
motriz de protones disminuye y se activa la hidrólisis de ATP, regenerando la
fuerza motriz a través de la membrana. Este gradiente electroquímico de protones
es utilizado para el transporte reverso de electrones a través de los complejos bc1
y NDH-1 (NADH-ubiquinona oxidoreductasa de tipo 1), permitiendo la formación
de NADPH requerida para la fijación de CO2. La razón ATP/ADP disminuye en
este proceso y permite la activación de las oxidasas de citocromo c (transporte
directo) sintetizando nuevamente ATP. En este modelo la razón ATP/ADP controla
el balance de los equivalentes de reducción del ion ferroso entre la ruta de
transporte directo y transporte reverso en Acidithiobacillus ferrooxidans.
2.2.4 Reducción de Ion férrico
De acuerdo con Brock y Gustafson (1976) Acidithiobacillus ferrooxidans tiene la
potencialidad de reducir ion férrico mientras realiza la oxidación de azufre
elemental. La reducción es medible solamente en condiciones anaeróbicas de
acuerdo con estos autores. En contraste, Sand (1989) sugiere que esta bacteria
es capaz de reducir ion férrico en la oxidación de azufre aún en presencia de aire.
En condiciones normales, el ferroso generado en la reducción es rápidamente
oxidado haciendo imposible su detección, pero al aumentar la acidez (pH menor
que 1,2) se produce la inhibición del proceso oxidativo de ion ferroso,
observándose la reducción de férrico. Este proceso inhibitorio es reversible siendo
el tiempo de respuesta del cultivo bacteriano relativamente corto (entre uno y dos
días). Es decir, bacterias que al ser expuestas a valores de pH menores que 1,2
han dejado de oxidar ion ferroso, reinician la actividad oxidativa de ion ferroso al
volver a mayores valores de pH (1,8).
Pronk et al. (1992) demostraron que Acidithiobacillus ferrooxidans es capaz de
crecer en el proceso de oxidación anaeróbica de azufre con férrico como aceptor
de electrones. La velocidad de crecimiento es similar a la velocidad obtenida en la
17
oxidación aeróbica de compuestos de azufre con el mismo microorganismo. En
consecuencia se puede postular que la bacteria es anaeróbica facultativa. En el
mismo trabajo (Pronk et al., 1992) se demostró que el rendimiento del crecimiento
bacteriano para la oxidación de azufre utilizando ion férrico como aceptor de
electrones es similar al rendimiento en la oxidación de ion ferroso utilizando
oxigeno como aceptor de electrones. En contraste, en el proceso de oxidación de
azufre (o compuestos reducidos de azufre) con oxígeno como aceptor de
electrones el rendimiento es más que el doble que el anterior. Este resultado es
consistente con la idea de que en la reducción anaeróbica de ion férrico la cadena
de transporte de electrones es similar a la utilizada en la oxidación aeróbica de ion
ferroso.
A pesar de lo anterior, se ha demostrado que la oxidación bacteriana de
compuestos reducidos de azufre puede ocurrir en ausencia de actividad oxidativa
de ion ferroso. Cabrejos et al. (1999) mostraron que mutando el microorganismo
utilizando cadenas de inserción nativas del tipo IST1 se puede activar o desactivar
la capacidad de Acidithiobacillus ferrooxidans para oxidar ion ferroso, manteniendo
en todos los casos la capacidad de oxidar compuestos reducidos de azufre. En
consecuencia existe a lo menos una parte de la cadena de transporte de
electrones de la oxidación de ion ferroso que no es requerida para la oxidación de
azufre. Esta conclusión es también presentada por Pronk y Johnson (1993).
Corbett e Ingledew (1987) y Pronk et al. (1991) demostraron que tanto el proceso
de oxidación de azufre utilizando oxigeno o ion férrico como aceptor de electrones
son inhibidos al adicionar HOQNO (2-heptyl-4-hydroxyquinoline-N-oxide). Este
compuesto es un inhibidor específico de la transferencia de electrones en los
complejos enzimáticos de tipo bc1. Estos resultados indican que el complejo bc1
participa en la cadena de transporte para la oxidación de compuestos reducidos
de azufre, tanto en la oxidación aeróbica o anaeróbica. En consecuencia los
aceptores primarios de electrones del azufre, y parte de su cadena de transporte
18
de electrones en ambos mecanismos de oxidación deben ser similares (o los
mismos).
También se ha presentado evidencia del crecimiento de Acidithiobacillus
ferrooxidans utilizando sulfuros metálicos como donante de electrones bajo
condiciones anaeróbicas (Donati et al., 1997). Sin embargo, de acuerdo con los
modelos de Shippers et al. (1999) se puede esperar que el mecanismo de
oxidación sea similar al considerado en la oxidación de azufre.
De los antecedentes señalados se puede concluir que: la oxidación de azufre
utilizando la reducción de ion férrico por Acidithiobacillus ferrooxidans, utiliza una
parte de la cadena de transporte de electrones asociada a la oxidación aeróbica
de oxigeno y, además, una parte de la cadena de transporte de electrones
asociada a la oxidación aeróbica de azufre.
2.2.5 Discusión
Los intentos por elucidar la cadena de transporte de electrones en la oxidación de
ion ferroso por Acidithiobacillus ferrooxidans han permitido estudiar una cantidad
importante de enzimas que se encuentran en la estructura de la bacteria, ya sea
en su periplasma, asociadas a la membrana o como estructuras
transmembránicas. La cadena de transporte no es aún comprendida
completamente y se han propuesto distintas alternativas para el mecanismo de
oxidación. Sin embargo, se ha comprobado el rol crítico que presentan en la
cadena de transporte directo de electrones: la rusticianina, citocromos c solubles y
otros asociados a la membrana plasmática y un citocromo a que actúa como
citocromo c oxidasa, reduciendo oxigeno en el espacio citoplasmático.
En la cadena de transporte reverso la situación es aun más incierta, aunque los
recientes trabajos de Elbehti et al. (1999, 2000) entregan una propuesta bastante
19
razonable respecto del mecanismo de transporte. Un aspecto de gran interés dice
relación con la resolución del mecanismo de transporte para la oxidación de
compuestos reducidos de azufre. La interacción de este mecanismo con las
cadenas de transporte asociadas a la oxidación de ion ferroso ha sido propuesta
(Pronk et al., 1992), pero resulta más probable solo una interacción a nivel del
complejo bc1.
Algunas de las claves de la interacción de las distintas cadenas de transporte de
electrones de esta bacteria se pueden buscar en los procesos de reducción
anaeróbica de ion férrico utilizando azufre como donante de electrones. La
evidencia contenida en estos trabajos, indica que la reducción de ion férrico
involucra algunas enzimas asociadas a la oxidación de ion ferroso. De igual forma
la oxidación de azufre en las situaciones aeróbica y anaeróbica sería el resultado
de un mecanismo común.
Realizando una analogía con la cadena de transporte de electrones normalmente
aceptada para la respiración en mitocondrias (Voet and Voet, 1995), se proponen
configuraciones de las cadenas de transporte de electrones para: procesos
aeróbicos de oxidación de ion ferroso (Figura 2.9), oxidación aeróbica de azufre
(Figura 2.10), y para la reducción anaeróbica de ion férrico (Figura 2.11) utilizando
azufre como donante de electrones. Para sugerir estos mecanismos de oxidación
se han tomada en cuenta algunos resultados de la literatura que al ser
considerados conjuntamente se integran en adecuadamente en estas
representaciones. A continuación se enumeran estos elementos:
1º Es posible desacoplar la oxidación de ion ferroso del proceso de oxidación
de azufre. De acuerdo con el mecanismo propuesto (Figura 2.10) en ausencia de
fierro disuelto la oxidación de azufre puede desarrollarse perfectamente.
2º En condiciones aeróbicas la velocidad de oxidación de ion ferroso es
bastante más rápida que la velocidad de oxidación de azufre. Lo anterior se puede
explicar sí se supone que en ambos procesos oxidativos la etapa limitante en la
cinética no es la transferencia de electrones al oxígeno sino que se origina en la
20
cadena de transporte periplasmática en el caso del ion ferroso y en el paso de los
electrones a través de su aceptor primario el complejo bc1 para la oxidación de
azufre.
3º La velocidad de oxidación de azufre es la misma en condiciones aeróbicas
(con oxigeno como aceptor de electrones) o anaeróbicas (siendo el ion férrico
aceptor de electrones). En estos mecanismos una parte importante de la cadena
de transporte de electrones es la misma para ambos procesos de oxidación y es
esta cadena precisamente la que limita el proceso de transporte de electrones.
4º El rendimiento (carbono fijado por mol de electrones transferido) en la
oxidación de azufre es más que el doble cuando se respira oxigeno, respecto del
caso donde el aceptor de electrones es el ion férrico. Como se aprecia en las
Figuras 2.10 y 2.11, cuando se utiliza oxígeno la oxidación de azufre realiza la
translocación de un número mayor de electrones que en la respiración de ion
férrico. En consecuencia la cantidad de energía electroquímica disponible es
mayor para cada mol de azufre oxidado, y por lo tanto el rendimiento es mayor.
5º El rendimiento en la oxidación de ion ferroso es similar al rendimiento
obtenido en la oxidación anaeróbica de azufre. Esto se explica porque en ambos
casos el paso de los electrones solo incluye un complejo enzimático y se podría
esperar que el número de protones translocados (y consumidos en el caso
aeróbica) sea similar aportando una energía electroquímica aprovechable similar.
Como resumen del análisis de la literatura y las hipótesis presentadas se
presentan a continuación esquemas propuestos para la organización de las
cadenas de transporte de electrones en el microorganismo.
21
Figura 2.9. Transporte de electrones en la oxidación de ion ferroso. En color rojo
se resalta el transporte de electrones y en color azul el flujo de protones.
Figura 2.10. Transporte de electrones en la oxidación de azufre. En color rojo se
resalta el transporte de electrones y en color azul el flujo de protones.
22
Figura 2.11. Transporte de electrones en la oxidación anaeróbica de azufre. En
color rojo se resalta el transporte de electrones y en color azul el flujo de protones.
Al presentar las interacciones entre las distintas cadenas de transporte de
electrones para la oxidación de ion ferroso y azufre en las Figuras 2.9, 2.10 y 2.11
resulta evidente que para ambas se considera el mismo conjunto de estructuras
enzimáticas, las cuales han sido reportadas en la literatura. Se espera que, de
acuerdo con las condiciones de desarrollo del microorganismo, la concentración
de las distintas proteínas pueda variar de acuerdo a procesos de selección natural
y adaptación. De esta forma se explica la existencia de etapas (retardo) en el
crecimiento cuando se cambia un cultivo de microorganismos desde un sustrato a
otro.
De acuerdo con esta discusión y las hipótesis presentadas se puede esperar que,
en función con el sustrato disponible y las condiciones redox de la solución
circundante, todos los procesos oxidativos pueden ocurrir en forma simultanea, o
bien pueden favorecerse solo algunos de ellos dependiendo de la cantidad de
energía que la bacteria es capaz de utilizar. Es decir, en forma espontánea la
complejidad de la red enzimática de transporte de electrones es capaz de
23
adaptarse a las condiciones termodinámicas presentes y prepararse para
aprovechar al máximo la energía disponible.
2.3 Oxidación bacteriana de ion ferroso
2.3.1 Cinética de oxidación
Se sabe experimentalmente que la velocidad de oxidación química de ion ferroso
con oxígeno (reacción que termodinámicamente es espontánea) aumenta hasta
seis ordenes de magnitud en sistemas donde existe una población bacteriana de
Acidithiobacillus ferrooxidans. Este hecho indica que la oxidación se encuentra
directamente relacionada con la actividad y crecimiento de esta bacteria.
Específicamente se sabe que la bioenergética del microorganismo se basa en la
oxidación de ion ferroso (sección 2.2.1), siendo el aceptor final de electrones el
oxígeno normalmente. Para la oxidación de ion ferroso podemos expresar la
velocidad de oxidación es de la forma que se indica:
YNr
dtFed
Fe
•][2
2 µ==− +
+
(4)
donde :
µ : es la velocidad especifica de crecimiento del cultivo bacteriano. [1 / hr]
dtdN
N•1
=µ (5)
N : es el número de bacterias / unidad de volumen.
Y : es el coeficiente de rendimiento. [células generadas / g hierro oxidado]
En esta expresión cinética y las que siguen se considera que el volumen de
solución es constante.
Es necesario definir en forma adecuada una expresión para la velocidad
específica de crecimiento µ, de acuerdo con la disponibilidad de sustrato. El
24
modelo más tradicional asume que para el crecimiento de un cultivo de
microorganismos opera una serie de mecanismos enzimáticos que se encuentran
limitados por una etapa también enzimática, en función de un sustrato limitante S:
PEES
ESSE
k
k
k
+→
←→
+
3
2
1
(6)
Según este mecanismo se obtiene una expresión cinética del tipo Michaelis –
Menten para el caso en que el ion ferroso es el sustrato limitante:
mMax KFe
Fe+
×=+
+
][][
2
2
µµ (7)
En esta ecuación µmax es la máxima actividad alcanzable por el microorganismo y
Km es la constante de Michaelis – Menten que corresponde a la cantidad de
sustrato necesaria para que la actividad sea igual a la mitad de la actividad
máxima. Esta expresión fue propuesta por Monod para el crecimiento bacteriano
con un sustrato limitante y ha recibido amplia atención (Kovárová-Kovar y Egli,
1998).
El modelo propuesto por Monod permite una adecuada modelación de la velocidad
de oxidación de ion ferroso por Acidithiobacillus ferrooxidans. Sin embargo, los
parámetros del modelo presentan una fuerte variación al aplicar amplias
variaciones en la concentración de células, concentración de ion ferroso, la
concentración de ion férrico, concentración de cationes metálicos, pH, Eh,
temperatura, fuerza iónica, etc. Estos elementos indican que se debe modificar el
modelo para obtener una expresión cinética que de cuenta con más precisión
además de la concentración de ion ferroso del efecto de las restantes condiciones
de la solución.
En particular, se han propuesto dos esquemas generales de inhibición: Inhibición
competitiva e inhibición no competitiva para intentar la comprensión del efecto de
algunos cationes sobre la actividad oxidativa y crecimiento bacteriano, a saber:
25
1º Inhibición competitiva: En este caso se supone que un ion específico o
especie (X) utiliza el sitio activo en la membrana celular bloqueando la enzima (E)
(De et al., 1997; Lizama y Suzuki, 1989a; Nagpal, 1997; entre otros autores). De
acuerdo a esta concepción, en el modelo de la ecuación (6) se debe agregar la
siguiente reacción.
EXXEk
k
←→
+5
4
(8)
El ion inhibidor (X) bloquea en forma reversible el sitio de reacción del sustrato
compitiendo por tanto con él. Uno de los casos más estudiados para esta situación
es el del ion férrico, que siendo producto de la reacción, es capaz de inhibirla. Del
mismo modo se ha reportado inhibición competitiva por plata (De et al., 1997),
arsénico (Harvey y Crundwell, 1997), etc. Incluso se ha sugerido que altas
concentraciones de bacterias provocan su propia inhibición. Esto puede ser
explicado, al considerar que en la membrana celular se encuentran enzimas que
contiene ion férrico y en consecuencia el contacto con otra célula produce el
bloqueo de los sitios activos (Suzuki et al., 1989; Nemati y Webb, 1997).
Al incorporar en el mecanismo cinético una serie de inhibidores competitivos (Xi)
que actúan de acuerdo a la ecuación (8) se puede modificar la expresión cinética y
obtener la expresión que sigue (Nagpal, 1997):
)][1(][
][•2
2
∑+×+=
+
+
i i
im
Max
KXKFe
Feµµ (9)
2º Inhibición no competitiva: en este caso se asume que el ion o especie (X)
reacciona con el complejo intermedio enzima sustrato (ES) en forma reversible,
produciendo el bloqueo momentáneo del complejo y no permitiendo que se
complete la reacción (De et al., 1997; Nagpal, 1997; Braddock, 1984; entre otros).
Para representar esta acción inhibitoria al mecanismo (6) de reacción se debe
agregar la reacción:
26
ESXXESk
k
←→
+5
4
(10)
De esta forma la especie produce inhibición del proceso oxidativo en forma no
competitiva con el sustrato. De et al. (1997) describieron la inhibición no
competitiva por acción de mercurio; Kupka y Kupsáková (1999) presentaron
inhibición no competitiva por níquel y Nemati et al. (1998) indicaron en su revisión
la existencia de inhibición no competitiva por acción de ion férrico.
Los inhibidores no competitivos en términos simplificados, actúan disminuyendo la
efectividad de los sitios activos en el corto plazo, con lo cual producen una
disminución aparente del valor de la máxima velocidad de actividad, µMax. Se
puede esperar que al existir una colección de inhibidores competitivos (Xi) en el
medio, la expresión que representa la velocidad de oxidación de ion ferroso y
crecimiento bacteriano puede expresarse por la ecuación:
m
i i
i
Max
KFeFe
KX +
×+
=+
+
∑ ][][
)][1(2
2µµ (11)
Lizama y Suzuki (1989a), quienes describieron el efecto sinérgico inhibitorio de la
presencia de ion férrico y la concentración de bacterias, indicaron que la mejor
forma de describir el fenómeno es adicionando a los términos de inhibición
competitiva correspondientes a cada uno (férrico y bacterias) un tercer término
asociado a la interacción entre ellos.
La presencia de una alta concentración de sustrato puede provocar un efecto
inhibitorio sobre la actividad bacteriana. Tan et al. (1996) presentaron una
expresión general basada en la termodinámica estadística que representa el
efecto de la inhibición por sustrato en la actividad de acuerdo a la expresión
siguiente,
27
∑
∑
=
== m
i
ii
n
i
ii
Max
S
S
0
1
][*
][*•
β
αµµ (12)
que en el caso más sencillo se simplifica a la expresión:
221
1
][*][*1][*
SBSBSA++
=µ (13)
Se ha encontrado que en el caso de Acidithiobacillus ferrooxidans es posible
modelar la inhibición por sustrato con una expresión de la forma (13). Nikolov y
Karamanev (1992) utilizaron una expresión como esta, al igual que Nemati y Webb
(1996). Estos autores encontraron que esta inhibición por sustrato es amortiguada
por una alta concentración de células en solución.
2.3.2 Efecto del pH
Al utilizar ion ferroso como fuente de energía, Acidithiobacillus ferrooxidans es
capaz de crecer en distintas condiciones de acidez, habiéndose reportado
actividad oxidativa en el rango de pH entre 1,0 y 7,0. Recordando que el pH
interno de la bacteria se mantiene en un valor cercano a 6,5 a pesar de las
condiciones del entorno, la bacteria esta equipada con un mecanismo eficiente
que le permita adecuarse a las variaciones de acidez del medio externo. Las
bacterias acidófilas tienen una estructura de su pared celular, o más
probablemente de su membrana citoplasmática, capaz de contener el ácido
externo y adecuarse a sus variaciones. En este sentido Amaro et al.(1991)
encontraron que un cambio entre pH 1,5 y 3,5 involucra variaciones visibles en la
composición de proteínas de la célula, lo cual indica un mecanismo de adaptación.
De acuerdo con los antecedentes presentados en la sección 2.2 resulta claro que
la mantención de una diferencia mínima de pH a través de la membrana
plasmática es resultado de la existencia de una diferencia de potencial (∆ψ) a
través de ella.
28
En el proceso de oxidación de ion ferroso el protón se presenta como un sustrato,
es decir, se espera que al disminuir su disponibilidad la bacteria disminuya su
velocidad de oxidación. Equivalentemente, puede haber circunstancias en que el
protón podría actuar como sustrato limitante. Esta hipótesis es planteada por
Kupka y Kupsáková (1999), quienes encontraron que la velocidad de consumo de
oxígeno depende del pH del medio, cuando la concentración de los otros sustratos
se encuentra en exceso. En particular esta dependencia puede expresarse en
acuerdo con una cinética del tipo Monod con el protón como sustrato limitante y,
además, inhibición por sustrato. Un comportamiento muy similar se observa en las
mediciones de Pesic (1993) como se aprecia en la Figura 2.12. En estas
experiencias se estimó la velocidad de oxidación utilizando las variaciones de
potencial redox de solución medidas con un electrodo de pirita. Además, en este
caso se considera solo las velocidades iniciales de oxidación en cultivos batch.
Figura 2.12: Efecto del pH sobre la actividad oxidativa de Fe2+ por Acidithiobacillus
ferrooxidans (Figura extraída de Pesic, 1993).
29
Schnaitman et al. (1969) demostraron que para cultivos batch donde el pH del
sistema es mantenido constante mediante el uso de soluciones tampón, la
velocidad de oxidación de ion ferroso de Acidithiobacillus ferrooxidans varía de
acuerdo a una campana similar a la presentada en la Figura 2.12 en el rango de
pH de 1,8 a 4,5.
De acuerdo con el comportamiento descrito se espera que exista un pH óptimo
para la actividad oxidativa de ion ferroso. Este pH no debe ser tan alto como para
inhibir la actividad por falta de sustrato (protones) y ser lo suficientemente alto
como para no comprometer el metabolismo por excesiva acidez (pH bajo 1,2
provoca severa inhibición de Acidithiobacillus ferrooxidans).
El pH óptimo de crecimiento en cultivos de células suspendidas, de acuerdo a los
resultados de distintos investigadores (Tabla 2.1) presenta una gran variabilidad.
Esta puede estar influenciada por la temperatura a la cual se realizan las
mediciones, el tipo de cultivo utilizado, la condición de entrada de las células, la
concentración de fierro en la solución, etc. Kupka y Kupsáková (1999) encontraron
el óptimo en 2,4, aunque una observación más acuciosa de los datos indica una
actividad máxima entre pH 2 y 3, con una disminución importante fuera de este
rango. Para Pesic (1993) el óptimo está entre pH 1,6 y 1,7 solamente, siendo más
sensible la caída hacia menor pH y menos pronunciada al aumentarlo. Sampson y
Blake (1999) estudiaron dos cepas de Acidithiobacillus ferrooxidans encontrando
comportamientos distintos. En una cepa el óptimo está en pH cercano a 1,7 y para
la otra el óptimo está en el rango de 1,8 a 2,5, aunque la variación en la actividad
para el rango estudiado (de 1,4 a 3,5) no es muy importante. Gómez et al.(1999)
encontraron el óptimo en pH 2,0, aunque la variación de la actividad oxidativa
entre pH 1,5 y 2,5 no es muy importante. MacDonald y Clark (1970) encontraron
un óptimo de pH entre 2,5 y 3,5 en experiencias batch de largo plazo.
En el caso de cultivos continuos el efecto del pH es menos importante aún. Como
se aprecia en la Tabla 2.1 de acuerdo a algunos estudios para un rango
30
importante de pH el efecto obtenido no es notorio. Esto se puede explicar al
considerar la estructura de los biofilms formados en un lecho fijo. De acuerdo con
estudios recientes se establece que el biofilm de bacterias adherido sobre los
sólidos estaría formado por precipitados de hierro (Nemati et al., 1998), con lo cual
el pH en la capa límite que rodea el sólido estaría dado por el equilibrio sólido –
solución para la solubilidad de los precipitados. Del mismo modo se podría esperar
la formación de microclimas en las inmediaciones de las bacterias (capa límite
difusional), de modo que la bacteria no necesariamente es afectada por cambios
de acidez de la solución.
Tabla 2.1: Rango de pH óptimo para la oxidación de ion ferroso por
Acidithiobacillus ferrooxidans. Valores de referencia.
Referencia Rango depH Óptimo
Tipo de cultivo
Schnaitman et al. (1969) 2,8 – 3,5 Batch con medición de concentraciónde ferroso en el tiempo y solucionesbuffer.
MacDonald y Clark (1970) 2,5 – 3,5 Batch con medición de largo plazo,utiliza medio 3K detectando formaciónde precipitados.
Ingledew (1982) 2,0 Revisión bibliográficaGómez et al. (1999) 2,0 Batch durante 120 horas con 1,4 g/l de
Fe en soluciónPesic (1993) 1,6 – 1,7 Batch de velocidad inicial utilizando
sensor redox para estimar la velocidadde oxidación
Sampson y Blake (1999) 1,8 – 2,5 Batch de velocidad inicial de consumode oxígeno utilizando 5,6 g/l de Fe(II).
Kupka y Kupsáková (1999) 2,4 Batch de velocidad inicial paraconsumo de oxígeno utilizando 0,5 g/lde Fe(II).
Manzuelos et al. (1997) -- Cultivo continuo con soporte deesferas de vidrio, estudia rango de pHde 1,15 a 1,5.
Karamanev y Nikolov(1988)
-- Cultivo continuo en un reactor debiofilm de lecho fluidizado, rengo depH de 1,3 a 2,2.
Nakamura et al. (1986) 1,5 – 2,6 Cultivo continuo en un contactadorrotatorio a 20ºC y 0,1 a 0,15 g/l deFe(II)
31
Para completar la discusión respecto del pH óptimo de crecimiento resulta claro
que se deben considerar elementos relativos a la formación y efecto de
precipitados como será descrito en el apartado 2.3.6.
Southam y Beveridge (1992) mostraron la presencia de Acidithiobacillus
ferrooxidans en ambientes de pH neutro en botaderos de Canadá. Esta presencia,
si bien es menor que la asociada a pH menores en el mismo botadero, indica que
a estos valores de pH es posible encontrar condiciones de desarrollo bacteriano.
Nordstrom y Southam (1997) presentaron antecedentes respecto a oxidación de
ion ferroso de especies de Acidithiobacillus ferrooxidans en ambientes de pH
cercano a la neutralidad. La población encontrada en todos los casos dice relación
con el pH del sistema, aunque se señala que este tipo de microorganismos sería
capaz de transformar ambientes alcalinos (pH 8) en ácidos (pH <3) en presencia
de oxígeno. Es decir, participa en la generación de aguas ácidas de mina.
Figura 2.13: Población de
Acidithiobacillus ferrooxidans en
función del pH en muestras de relaves.
(Figura extraída de Nordstrom y
Southam 1997).
En la Figura 2.13 se muestra la población encontrada de Acidithiobacillus
ferrooxidans en muestras de aguas de relaves en función del pH de la muestra.
De acuerdo con los antecedentes presentados no existe claridad respecto de cual
es la actividad oxidativa esperable a pH superior a 3,5. Sin embargo, la existencia
32
de colonias de microorganismos gestadas en forma natural en minerales y relaves
de pH neutro indican una pequeña actividad oxidativa y crecimiento bacteriano.
Nordstrom y Southam (1997) justificaron la presencia de Acidithiobacillus
ferrooxidans en altos pH por la formación de microclimas ácidos en su entorno.
Esta situación es inducida por la hidrólisis del ion férrico obtenido de la oxidación
de pirita o ion ferroso en presencia de oxígeno (ya sea por bacterias o
naturalmente).
Trabajando a valores altos de pH, Rai (1999) utilizó Acidithiobacillus ferrooxidans
para la oxidación de sulfato ferroso en un proceso para la desulfuración de gas
natural. Para ello acompleja el ion férrico producido utilizando ETDA (Etilen Diamin
Tetra Acético), obteniendo crecimiento bacteriano a pH 7,5.
La actividad bacteriana de Acidithiobacillus ferrooxidans a valores altos de pH no
puede ser descartada a priori, ya que existen reportes de distintos tipos de
bacterias que realizan oxidación de sulfato ferroso a pH neutro (Hafelbradl et al.,
1996; Schüler y Baeuerlein, 1996; Emerson y Moyer, 1997; Benz et al., 1998). Por
lo tanto se puede esperar que existan mecanismos de oxidación, quizá utilizando
algún agente quelante que permita la oxidación bacteriana de ion ferroso a altos
pH. Ingledew (1986) encontró que la rusticianina incrementa notablemente su
capacidad oxidativa en presencia de agentes quelantes y de este modo podría
actuar como primer aceptor electrónico en la cadena respiratoria.
2.3.3 Efecto de la Temperatura
Las cepas de Acidithiobacillus ferrooxidans corresponden a microorganismos
mesófilos (viven a temperatura ambiente) con una temperatura óptima de
desarrollo entre 28 y 35ºC. Sin embargo, este óptimo depende del pH del sistema
como lo evidencian MacDonald y Clark (1970), quienes utilizando cultivos batch en
frascos agitados observaron variaciones de la temperatura óptima de desarrollo
desde 30 ºC a pH 1,5 hasta 35ºC a pH 2,5 y superiores (Figura 2.14).
33
Figura 2.14: Efecto de la
temperatura sobre la actividad
oxidativa de ion ferroso por
Acidithiobacillus ferrooxidans y su
relación con el pH del medio.
Figura tomada de MacDonald y
Clark (1970).
Un detalle de las temperaturas óptimas de crecimiento reportadas se presenta en
la Tabla 2.2.
De igual forma los valores de temperatura óptima de crecimiento reportados
poseen una interesante variabilidad, lo cual indica que esta temperatura será
dependiente de las condiciones bajo las cuales se desarrolla el cultivo y en
particular de la cepa bacteriana utilizada. Amaro et al. (1991) indicaron que
cultivos sometidos a shock de temperatura muestran cambios en la composición
de proteínas de la célula, lo cual podría sugerir cambios metabólicos para permitir
la adaptación a las nuevas condiciones. En el mismo sentido Ahonen y Tuovinen
(1989) demostraron que cultivos realizados a temperaturas en el rango de 4 a 37
ºC exhiben adaptación a cambios de temperatura, aunque presenten igualmente
mayor actividad a temperatura de 28 ºC.
Al igual que con el pH, el efecto de la temperatura resulta bastante menor en
cultivos continuos en lechos fijos. En estos casos la temperatura óptima sube
respecto del caso de bacterias suspendidas o cultivos batch y la mayor actividad
se alcanza dentro de un rango de temperaturas y no en un valor específico.
34
Tabla 2.2: Temperatura óptima de oxidación de ion ferroso por Acidithiobacillus
ferrooxidans en cultivos batch y continuos. Valores de referencia obtenidos por
múltiples investigadores.
Referencia T Óptima Tipo de cultivoºC
MacDonald y Clark (1970) 30 a pH 1,535 a pH 2,5
Batch con medición de largo plazo,utiliza medio 3K detectando formaciónde pp.
Ahonen y Tuovinen (1989) 28 Batch utilizando frascos agitados con 6,0g/l de Fe(II), pH inicial 1,5
Nordstrom y Southam (1997) 25 – 33 Revisión bibliográficaHübner (1991) 29 Medición batch utilizando reducción de
ion férrico. pH 1,8 y 6,0 g/l Fe(II)Okereke et al. (1991) 30 Batch midiendo velocidad inicial por
absorbancia pH 2,4De et al. (1997) 20 – 30 Batch midiendo velocidad inicial con
sensor redox, pH 1,7 y 0,06 g/l de Fe(II).Breed et al. (1999c) 40 Continuo con cultivo mixto pH 1,75 y 12
g/l de Fe(II).Nemati y Webb (1997a) 35 Batch midiendo velocidad inicial con
sensor redox, pH 2,0 y Fe variable.Nemati y Webb (1997b) 30 Continuo con bacterias inmovilizadas.
pH 1,7 y 10 g/l de Fe(II).Nikolov y Karamanev (1992) 25 – 37 Continuo con bacterias resuspendidas y
adheridas pH 1,7 y altasconcentraciones de Fe(II).
Gómez et al. (1999) 30 Batch de largo plazo pH 2,0 y 1 g/l deFe(II).
Pesic et al. (1989) 25 – 30 Batch midiendo velocidad inicial conindicador redox
Mazuelos et al. (1999) 31 Continuo en lecho fijo pH 1,5 y 3 g/l deFe(II).
Karamanev y Nikolov (1988) 20 – 40 Continuo en reactor air lift pH 2,0 y 0,3g/l de Fe(II).
Nakamura et al. (1986) 10 – 40 Continuo en contactador rotatorio pH 2,4– 2,6 y Fe(II) 0,04 – 0,16 g/l
35
2.3.4 Efecto de Aniones
Se ha encontrado que el desarrollo de Acidithiobacillus ferrooxidans requiere de la
presencia de sulfato para la oxidación de ion ferroso (Lazaroff, 1963). Este hecho
puede ser explicado al plantear que el ion sulfato es capaz de estabilizar el
complejo de Fe(II) hexahidratado que sirve como substrato directo en el sistema
enzimático de oxidación (Jensen y Webb, 1995). Esta hipótesis explicaría el efecto
inhibitorio de otros aniones, los cuales podrían desacomplejar el ion ferroso o
estabilizar otros complejos no específicos para el mecanismo oxidativo. Es
interesante notar que Ingledew (1986) demostró que la capacidad oxidativa de la
rusticianina está fuertemente asociada a la formación de complejos en solución y
al tipo de ellos.
Tabla 2.3: Efecto de Aniones sobre la oxidación de Fe(II) por Acidithiobacillus
ferrooxidans (Ingledew, 1982).
Especie Velocidad relativa % Observacionesa un cultivo con SO4
2-
SO42- 100 Control, dipolo fuerte
SeO42- 70 Dipolo fuerte
B4O72- 41
TeO42- 60 Dipolo fuerte
AsO43- 62 Dipolo fuerte
PO43- 83 Portador específico (fuente de
fósforo para la bacteria)BO3
3- 120F- 0 Inhibidor de OxidasasCl- 33 Forma protonada gaseosaBr- 0 Forma protonada gaseosaI- 0 Forma protonada gaseosaNO3
- 0 Desacoplador
36
Por otro lado la presencia de sulfato desplaza casi -100 mV el potencial estándar
del par ferroso / férrico (respecto al potencial estándar en medio perclorato), lo
cual lo hace más reductor y más fácil de oxidar. Otro aspecto importante dice
relación con la interacción entre los aniones y la estructura de la membrana. Esta
última al tener polaridad positiva tendrá interacción con aquellos aniones de menor
electronegatividad relativa.
2.3.5 Efecto de Cationes
De acuerdo con las condiciones de crecimiento en ambientes naturales, no es
extraño encontrar que Acidithiobacillus ferrooxidans presente una alta resistencia
a los cationes metálicos y una resistencia relativa a metales pesados. Esta
bacteria posee adicionalmente la capacidad de adaptarse en tiempos breves
(algunos días) a concentraciones elevadas de metales como Fe3+, Zn2+ y Cu2+
(Das et al., 1997). Además, se ha reportado que Acidithiobacillus ferrooxidans es
capaz de oxidar otros cationes además de fierro, por ejemplo Cu+ (en Cu2S), Sb3+
(en Sb2S3), U4+ (en pitchblenda) y Sn2+(Ingledew, 1982). Probablemente la
oxidación de estos cationes no sea directa y corresponda a una oxidación por ion
férrico quien luego es reoxidado por la bacteria.
La resistencia de Acidithiobacillus ferrooxidans a la presencia de cationes
metálicos ha sido estudiada profusamente y se ha encontrado que el efecto que
ellos pueden provocar es de inhibición competitiva y no competitiva (ver sección
2.3.1). De igual forma se encuentra que no todos los cationes tienen un efecto
similar sobre la actividad oxidativa bacteriana, sino que existen algunos como
Cu2+, Ni2+, Co2+ y Zn2+ que tienen muy pequeño efecto sobre la actividad oxidativa
(la bacteria es capaz de adaptarse a su presencia); otros como Sn2+ y Pb2+ que
inhiben en forma parcial (disminuye la velocidad específica de crecimiento
mientras este presente el catión) y algunos como Hg2+ y Ag+ que tienen un fuerte
efecto inhibitorio (la actividad oxidativa disminuye casi a cero con pequeñas
concentraciones de estos cationes). En la Tabla 2.4 se señalan algunos
37
antecedentes respecto del efecto de diversos cationes sobre Acidithiobacillus
ferrooxidans.
Tabla 2.4: efecto inhibitorio de algunos cationes en la oxidación de ion ferroso por
Acidithiobacillus ferrooxidans
Especie Efecto Inhibitorio ReferenciaNi2+ Leve, no competitiva Kupka y Kupsáková (1999)Cu2+ Muy leve Kupka y Kupsáková (1999)Hg2+ Fuerte, no competitiva De et al. (1997)As3+ Competitiva Harvey y Crundwell (1996)Co2+ Media Sampson y Blake (1999)Fe3+ Leve, competitiva Nemati et al. (1998)Ag+ Fuerte, mixta De et al. (1997)Pb2+ Media De et al. (1997)Mn2+ Leve De et al. (1997)Sn2+ Media Ingledew (1982)Zn2+ Leve Ingledew (1982)Cr3+ Media Ingledew (1982)
2.3.6 Formación y efecto de precipitados
Cuando se oxida sulfato ferroso bacterialmente se produce un aumento inicial en
el pH de la solución producto del consumo de protones en la oxidación de acuerdo
con la ecuación (1). Este aumento de pH sumado a la presencia de ion férrico
formado induce la hidrólisis del ion férrico, representada en las reacciones
siguientes:
Fe3+ + H2O → FeOH2+ + H+ (14)
Fe3+ + 2 H2O → Fe(OH)2+ + 2 H+ (15)
Fe3+ + 3 H2O → Fe(OH)3 + 3 H+ (16)
Estas reacciones, al contrario de (1) reducen el pH tendiendo a estabilizarse el
sistema en valores entre 2,0 y 2,5 dependiendo de la concentración total de hierro
38
(Nemati et al., 1998). De esta forma la hidrólisis del ion férrico es un fenómeno
dependiente del pH, sabiendo además que el ion férrico se vuelve cada vez más
insoluble al aumentar el pH sobre 2,5 (Grishin et al., 1988b). Una reacción
competitiva a la hidrólisis es la formación de hidroxisulfatos básicos de hierro
(jarositas) con una fórmula general MFe3(SO4)2(OH)6, donde el catión M+ es K+,
Na+, NH4+ o H3O+ (o más generalmente un catión monovalente). La precipitación
de jarositas es también una reacción generadora de ácido.
3 Fe3+ + M+ + 2 HSO4- + 6 H2O → MFe3(SO4)2(OH)6 + 8 H+ (17)
Las jarositas pueden ser encontradas en sedimentos de drenajes ácidos de mina,
en oportunidades en conjunto con oxi-hidroxidos férricos. La precipitación de
jarositas depende del pH y de la composición iónica y concentración de la
solución.
La formación de compuestos férricos puede tener un efecto adverso sobre los
procesos biológicos. Disminuye la disponibilidad de ion férrico en solución,
produce una barrera difusional a los sitios de reacción química y en el caso de
procesos de lecho fijo altera las condiciones de percolabilidad de la solución. Lo
anterior indica la necesidad de controlar la formación de estos compuestos.
La precipitación de jarositas se produce a pH tan bajos como 1,8 (Karamanev,
1988), lo cual puede ser comprobado utilizando la termodinámica de soluciones
(Nemati et al., 1998). Al estudiar la cinética de formación de jarositas a pH entre
1,8 y 2,5 se encuentra que su velocidad de formación es hasta treinta veces más
lenta que la velocidad de oxidación bacteriana (Lazaroff, 1982; Toro, 1988), por lo
cual no sería posible que estos precipitados fuesen el producto primario de la
oxidación. Toro (1988) utilizando balances de masa y las concentraciones en el
tiempo de distintos iones para un cultivo batch, encontró que antes de la formación
de jarositas se produce la precipitación de hidróxido férrico, el cual luego es
reformado a jarosita (más estable termodinámicamente en estas condiciones).
39
Lazaroff et al. (1982) propuso la formación de intermediarios poliméricos que
actúan como precursores de la formación de hidróxidos y jarositas. La cantidad de
estos polímeros depende de la disponibilidad de sulfato y de cationes
monovalentes necesarios en solución. Grishin et al. (1988b) encontraron que la
disminución o eliminación de estos cationes, en especial el K+, en los medios de
cultivo empleados con bajo pH, disminuye en forma importante esta indeseable
precipitación de fierro.
A pesar de lo anterior Curuchet et al.(1992) encontraron que la formación
extensiva de precipitados de jarositas no presenta un efecto relevante a la
velocidad de oxidación de ion ferroso o en la cinética de lixiviación bacteriana.
Karamanev (1988) demostró incluso que la estructura del biofilm formado en un
lecho fijo bacteriano incluye en su esqueleto estructural de jarositas, es decir,
estas serían necesarias para lograr una adecuada adherencia de las bacterias a
los sólidos del lecho. Este hecho fue comprobado por Pogliani (1999).
2.3.7 Efecto del ion férrico
La incidencia de los cationes metálicos sobre la actividad oxidativa bacteriana
puede, en general ser explicada por los mecanismos de inhibición competitiva y no
competitiva descritos anteriormente. El efecto del ion férrico merece una discusión
especial, ya que se ha sugerido que actúa de acuerdo a los dos mecanismos
mencionados de inhibición (Nemati et al., 1998).
El ion férrico, que corresponde al producto de la oxidación de ion ferroso por
Acidithiobacillus ferrooxidans en soluciones ácidas aireadas, ha sido reportado
como inhibidor competitivo por diversos autores. Lizama y Suzuki (1989)
estudiaron el consumo de oxígeno en la oxidación de sulfato ferroso adicionando
distintas cantidades de sulfato férrico y bacterias, encontrando que la acción del
ion férrico se correlaciona adecuadamente a un modelo de inhibición competitiva.
40
Adicionalmente encontraron que el efecto inhibitorio del ion férrico es sinérgico con
la concentración de bacterias en solución, es decir, la inhibición férrica es más
importante cuando la concentración bacteriana es mayor. El efecto del ion férrico y
la concentración de bacterias ([C]) se expresó de acuerdo a:
[ ] [ ]
×××
+++×+
×=
+++
+
ICICS
Max
KKFeC
KFe
KCKFe
Fe
α
µµ
][][1][
][33
2
2
(18)
Harvey y Crundwell (1996 y 1997) midieron la velocidad de oxidación de sulfato
ferroso usando un aparato electroquímico, el cual mantiene constantes las
cantidades de ion ferroso y férrico en solución. Para analizar los resultados utilizan
una expresión del tipo Monod con inhibición por producto para la inhibición por ion
férrico obteniendo una buena correlación de los datos al modelo.
][][][
32
2
++
+
++=
FeKKFeFe
IS
Maxµµ (19)
Nyavor et al. (1996) midieron la velocidad inicial de oxidación en frascos agitados
y ajustaron los parámetros para una expresión similar a (19) para un rango de
concentraciones de férrico más bajo (de 0 a 1 g/l) que el utilizado por Harvey y
Crundwell (1996) (ellos utilizaron de 1 a 9 g/l de férrico).
Liu et al. (1988) comprobaron la expresión (19) utilizando mediciones de actividad
oxidativa en cultivos continuos y ajustando numéricamente los resultados para la
oxidación de ion ferroso de concentración inicial entre 0,6 y 9 g/l.
Boon et al. (1999b y 1999c) reformularon la expresión de inhibición competitiva por
ion férrico, considerando una cantidad de ion ferroso necesaria para la
subsistencia de las bacterias, [Fe2+]m. Postularon, de este modo, la siguiente
expresión cinética:
41
mi
S
m
S
Max
FeFeFe
KK
FeFeK
][][][
][][1 22
3
22 ++
+
++ −×+
−+
=µ
µ (20)
Considerando que en los cultivos normalmente la concentración de ion ferroso es
mucho mayor que KS, Boon et al. (1999a) estimaron que es posible simplificar el
segundo término del denominador en la expresión (20) y obtener lo siguiente:
mi
S
Max
FeFeFe
KK
][][][•1 22
3
++
+
−+
=µ
µ (21)
Si en la expresión (21) se considera que el término de mantención [Fe2+]m es
pequeño respecto del ferroso total de la solución, es posible despreciarlo con lo
cual la expresión (21) toma la forma (22). En esta ecuación la velocidad de
oxidación depende solo de la razón [Fe3+]/[Fe2+] en solución, y en forma indirecta
del potencial redox de la solución. La relación esperada entre µ y la razón
[Fe3+]/[Fe2+] y el Eh se expresa en las siguientes ecuaciones:
][][•1 2
3
+
+
+=
FeFe
KK
i
m
Maxµµ (22)
+=
+
+
][][ln 2
30
FeFe
nFRTEEh (23)
Recientemente la expresión (22) ha sido utilizada para explicar la velocidad de
oxidación de sulfato ferroso en medio ácido por Acidithiobacillus ferrooxidans
(Boon et al., 1998; Rawlings et al., 1999; Breed y Hansford, 1999a) y por
Leptospirillum ferrooxidans (Rawlings et al., 1999; Breed et al., 1999). Este modelo
cinético puede ser racionalizado de dos formas distintas: la primera es
42
simplemente como una reformulación de las expresiones de inhibición por
producto que se han presentado; la segunda es interpretar esta expresión en
términos electroquímicos. Es decir, se puede asumir que la velocidad de
transferencia de electrones desde el ion ferroso al oxígeno a través de la bacteria
esta controlada por el potencial redox de la solución (expresión 23).
La hipótesis de una cinética de oxidación controlada por la velocidad de
transferencia de electrones fue utilizada por Crundwell (1997), al plantear un
mecanismo cinético basado en la bioenergética del microorganismo. Crundwell
planteó el mecanismo enzimático expuesto en (6), pero a diferencia del
mecanismo enzimático tradicional, se plantea que la cinética se encuentra
controlada por la segunda reacción que posee una cinética del tipo Tafel:
⋅⋅⋅−
= ηα
TRFnvv exp0 (24)
con lo cual se pudo derivar un modelo cinético para la oxidación de ion ferroso
expresado como:
5.0
2
2
][][
+×=
+
+
FeKFeFekµ (25)
El coeficiente 0,5 que aparece como exponente en la expresión corresponde al
coeficiente de intercambio de la reacción electroquímica.
43
2.3.8 Efecto del potencial redox de la solución y estudios de la actividad de
Acidithiobacillus ferrooxidans en celdas electroquímicas
Al comprobar que existe una relación entre la cinética de oxidación de ion ferroso
de Acidithiobacillus ferrooxidans y el potencial redox de la solución, es posible
comprender e interpretar las experiencias donde este microorganismo ha sido
utilizado en celdas electroquímicas.
Kinsel y Umbreit (1964) encontraron un aumento en el rendimiento de la oxidación
bacteriana de sulfato ferroso mediante la reducción electroquímica del ion férrico
de la solución. De esta forma se logra mantener reducido el sustrato y la actividad
bacteriana es mayor. Yunker y Radovich (1986), Taya et al. (1991), Blacke II et al.
(1994), Suissa y Shield (1997) y Magnin et al. (1998) realizaron el cultivo
electroquímico de Acidithiobacillus ferrooxidans aplicando una corriente constante
(utilizando un galvanostato) de reducción de sulfato férrico, obteniendo de esta
forma un importante aumento del rendimiento de los fermentadores y
concentraciones de bacterias que no han sido obtenidos directamente por otros
métodos. Otra forma de controlar la concentración de ion férrico en solución es
aplicando un potencial a la solución. Operando de esta forma el circuito (en forma
potenciostática) Hübner (1991), Nakasono et al. (1997), Matsumoto et al. (1999)
reportaron el cultivo de Acidithiobacillus ferrooxidans. Este modo de operación
presenta algunas ventajas respecto del galvanostático, ya que utiliza en forma
más eficiente la corriente (al conocer el potencial aplicado se restringe la
ocurrencia de reacciones parásitas en el electrodo) y permite correlacionar la
corriente aplicada con la actividad bacteriana en solución.
Denisov et al. (1980), estudiaron la influencia de la composición de los medios de
cultivo sobre la actividad bacteriana utilizando una celda electroquímica. De igual
forma Aguirre et al. (1989) y Harvey y Crundwell (1996, 1997) reportaron estudios
de la actividad oxidativa de sulfato ferroso por Acidithiobacillus ferrooxidans
44
utilizando reducción de ion férrico. Incluso Harvey y Crundwell (1996,1997)
estudiaron la inhibición por producto y por arsénico bajo potenciales controlados.
2.4 Discusión y enfoque de la tesis
Para el estudio de la cinética del proceso de oxidación bacteriana de sulfato
ferroso se han utilizado normalmente modelos genéricos del tipo Monod para el
crecimiento de microorganismos, que no son respaldados necesariamente por un
mecanismo de reacción específico a las bacterias de interés. El mecanismo de
reacción enzimático que se ha utilizado para explicar la oxidación bacteriana de
ion ferroso no considera variables del entorno como son: la temperatura, fuerza
iónica de la solución, potencial redox, actividad de protones o concentración de
impurezas en la solución. Estas características fisicoquímicas de las disoluciones
han mostrado tener una influencia importante sobre las velocidades de oxidación
de los microorganismos.
En algunos modelos se ha incorporado el efecto de algunas impurezas y del pH de
la solución, sin embargo, las modificaciones en los modelos no se fundamentan en
un conocimiento profundo respecto de los mecanismos de oxidación y en
consecuencia en la literatura encontramos en general modelos semi-empíricos.
Por otro lado, los modelos fenomenológicos que se han formulado para incorporar
el efecto de las distintas variables en un mecanismo de reacción aparecen como
de difícil aplicación. Por ejemplo en el trabajo de Nagpal (1997), el modelo
desarrollado presenta un numero de parámetros excesivamente alto y para su
aplicación es necesario realizar numerosas simplificaciones. Otro caso son los
modelos de Huberts (1994), basados en el circuito de quimiosmosis propuesto
para la bacteria. Una de las conclusiones del trabajo es que las velocidades de
oxidación se correlacionan mucho mejor con un modelo de tipo Monod con
inhibición competitiva con férrico y no con los modelos propuestos. En el caso de
Crundwell (1997), el modelo propuesto resulta innovador y se ajusta bien al
45
conjunto de datos presentado. Sin embargo, para el desarrollo del modelo se
realizan simplificaciones que comprometen su aplicación general y se contradicen
con el espíritu original del enfoque propuesto.
Considerando los mecanismos de oxidación propuestos en sección 2.2, se
concluye que las variables con mayor influencia sobre la velocidad de oxidación
bacteriana de sulfato ferroso son el pH y el potencial redox de las disoluciones. La
evidencia experimental encontrada en la literatura descrita en la sección 2.3
concuerda con este razonamiento e indica la necesidad de desarrollar modelos
que en forma explícita consideran estos factores.
En este trabajo de tesis se profundizó el estudio del efecto del pH y el Eh de la
disolución sobre la velocidad de oxidación de sulfato ferroso en presencia de
Acidithiobacillus ferrooxidans. Las metodologías utilizadas estarán basadas en el
uso de sensores redox y de pH, como asimismo aparatos experimentales que
permitan controlar las condiciones de operación (Eh, pH, Tª y concentraciones de
ion ferroso y férrico) en valores deseados para aislar el efecto de cada una de
estas variables. La información obtenida será combinada con el desarrollo de
modelos que se ajusten fielmente al conocimiento actual de los mecanismos
bioquímicos de la oxidación de ion ferroso por Acidithiobacillus ferrooxidans.
En los procesos de lixiviación donde las disoluciones entran en contacto íntimo
con minerales de composición diversa y compleja, es inevitable la presencia de
abundantes y variados iones en solución. En consecuencia resulta difícil controlar
la composición de la solución para asegurar altos niveles de actividad bacteriana y
se deben estudiar alternativas tecnológicas que puedan resolver este problema.
En esta tesis se analiza el comportamiento de un reactor bioelectroquímico para la
biooxidación indirecta de ion ferroso en soluciones que inhiben la acción oxidativa
bacteriana.
46
3 OBJETIVOS
El objetivo general de este trabajo de tesis es profundizar en el estudio del
mecanismo de oxidación de ion ferroso por Acidithiobacillus ferrooxidans,
utilizando un enfoque que integra aspectos teóricos y experimentales avanzados.
En particular los objetivos específicos son los siguientes:
1) Caracterizar la influencia del potencial redox de una solución de sulfato
ferroso sobre la cinética de oxidación bacteriana de ion ferroso con
Acidithiobacillus ferrooxidans.
2) Caracterizar el mecanismo de inhibición de la cinética de oxidación
bacteriana del ion ferroso con Acidithiobacillus ferrooxidans a pH sobre
2,5.
3) Desarrollar una expresión general que describa la cinética de oxidación
bacteriana del ion ferroso con Acidithiobacillus ferrooxidans en el rango
de pH 1,3 – 7,0.
4) Evaluar la factibilidad técnica y eficiencia de un reactor electroquímico
diseñado para utilizar la acción oxidativa de Acidithiobacillus
ferrooxidans sobre el ion ferroso, en forma indirecta, en soluciones de
alta toxicidad.
47
SEGUNDA PARTE:
EFECTO DEL Eh EN LA CINÉTICA DE OXIDACIÓN DE ION
FERROSO CON Acidithiobacillus ferrooxidans
1 INTRODUCCIÓN
La velocidad de oxidación bacteriana de ion ferroso con Acidithiobacillus
ferrooxidans se representa normalmente mediante ecuaciones del tipo Monod que
consideran solo la influencia de la concentración de ion ferroso en solución o bien
modificando esta expresión para dar cuenta de procesos de inhibición competitiva
o no competitiva.
Al analizar la bioenergética del microorganismo (sección 2.2, primera parte),
queda establecido que el potencial termodinámico que produce la reacción de
oxidación de ion ferroso está relacionado principalmente con la diferencia de
potencial electroquímico entre la solución que rodea la bacteria y su citoplasma.
En consecuencia, se puede esperar que el mecanismo cinético de reacción de
transferencia de electrones desde el ion ferroso a la bacteria presente una cinética
electroquímica relacionada con las condiciones de la membrana celular y la
solución circundante.
El efecto del Eh de la solución ha sido considerado al analizar la oxidación
bacteriana de ion ferroso desde el punto de vista de la teoría de la quimioosmosis
(Crundwell, 1997; Huberts, 1994). Sin embargo, una expresión cinética que incluya
explícitamente el efecto del Eh de la solución no ha sido deducida aún.
El objetivo de esta parte de la tesis es caracterizar con mayor detalle la influencia
del potencial redox de la solución sobre la velocidad de oxidación de ion ferroso
con Acidithiobacillus ferrooxidans y relacionarla con los modelos fundamentales de
respiración de este microorganismo (Ingledew, 1982).
48
El trabajo experimental utilizará las ventajas de una celda bioelectroquímica de
dos compartimentos (Aguirre et al., 1989; Harvey y Crundwell, 1996) que permite
estimar la velocidad de oxidación de ion ferroso a potenciales controlados. Los
resultados serán integrados en una expresión cinética, que incorpora
explícitamente el efecto del potencial redox de la solución y, además, considera el
efecto de la concentración de ion ferroso y la inhibición por ion férrico.
2 MATERIALES Y MÉTODOS
2.1 Cultivo de bacterias
Se utilizó una cepa pura de Acidithiobacillus ferrooxidans (ATCC 19859). El cultivo
de las bacterias se efectuó en matraces Erlenmeyer de 250 ml, utilizando 100 ml
de medio basal de composición similar a la propuesta por Touvinen and Kelly
(1973), y que se presenta en la Tabla 2.1:
Tabla 2.1: Composición del medio basal.
Compuesto Concentración, g/l
(NH4)2SO4 0,400
MgSO4•7H2O 0,400
K2HPO4•3H2O 0,056
FeSO4•7H2O 14,9
El pH del medio se ajustó en 1,8 utilizando ácido sulfúrico concentrado. El cultivo
se mantuvo a 30,0ºC en un agitador orbital.
Para mantener el cultivo bacteriano en su fase exponencial de crecimiento se
realizó diariamente sub-cultivos. Para ello se toma un 20 ml de la solución ya
oxidada y se agregan 80 ml de medio basal fresco.
49
El inóculo, a ser utilizado en la celda electroquímica, se preparó con 80 ml del
cultivo bacteriano. Esta solución es filtrada utilizando una membrana Millipore de
0,22µm. Los microorganismos separados son lavados tres veces con 20 ml de
solución de ácido sulfúrico a pH 1,8 para la remoción de precipitados de fierro
adheridos, y luego son resuspendidos en 20 ml de medio basal libre de sulfato
ferroso. La población de bacterias en el inóculo es determinada por contéo directo
en una cámara Petroff-Hausser, resultando típicamente de 2 a 6 x 108 células por
ml.
2.2 Celda Electroquímica
Un esquema del montaje y funcionamiento de la celda electroquímica se presenta
en la Figura 2.1. La celda electroquímica, está construida en Pyrex, posee dos
compartimentos separados por una membrana de intercambio catiónica Nafion
de 1 cm2. En el compartimento catódico se coloca un alambre de platino (diámetro
0,5 mm, largo 2 m), área total 16 cm2 que es utilizado como electrodo de trabajo.
Este diseño, con gran área catódica, permite determinar la actividad bacteriana en
altas razones [Fe2+]/[Fe3+] (Salhe, 1999). Además, en este compartimento se ubica
un electrodo de referencia Hg/HgSO4 Radiometer Analytical Modelo REF601, junto
con 20 ml de medio basal libre de fierro y la población bacteriana que será
caracterizada. Para la determinación del potencial redox del catolito en el mismo
compartimento se coloca un electrodo de platino combinado Cole-Palmer 5990-57.
Como contraelectrodo se utiliza una lámina de platino de área total 3 cm2, que es
ubicada en el compartimento anódico.
El catolito es agitado con impulsor magnético y burbujeado con aire. La celda
electroquímica completa se ubica en un baño termostático de agua, manteniendo
la temperatura en 30,0 ± 0,1 ºC. El electrodo de trabajo, la referencia y el
contraelectrodo son conectados a una interfase electroquímica EG&G Princeton
Applied Research, modelo 363. Para las mediciones de corriente se utiliza un
voltímetro digital Solartron Schlumberger modelo 7150.
50
Figura 2.1: Celda electroquímica para medición de actividad oxidativa bacteriana a
potencial controlado.
2.3 Procedimiento
El compartimento catódico es llenado con 20 ml de medio basal que contienen una
concentración inicial de ion ferroso entre 50 y 200 mg/l, junto con una población de
bacterias en el rango 2 – 8 x 107 bac/ml. El sulfato ferroso se adiciona a la celda
como alicuotas de una solución concentrada de 33,3 g/l de ion ferroso y la bacteria
se adiciona como alicuota del inóculo preparado de acuerdo al procedimiento
descrito con anterioridad.
Se aplica un potencial constante en el electrodo de trabajo generando corrientes
catódicas relacionadas con la reducción de ion férrico. Los valores de potencial
aplicado se fijan entre 0,2 y 0,7 V (versus electrodo estándar de hidrógeno, SHE).
La corriente obtenida, que inicialmente es despreciable, aumenta en el tiempo en
la medida que aumenta la concentración de ion férrico como consecuencia de la
oxidación bacteriana de sulfato ferroso. Un valor estacionario de corriente se
obtiene en el sistema después de un tiempo que varía entre 20 y 60 minutos,
MEMBRANA
ELECTRODO DE TRABAJO
CONTRA ELECTRODO
ELECTRODO DE Eh
WE
ELECTRODO DE REFERENCIA
CE
e-
H+
¼ O2+H+
½ H2O ½ H2O
¼ O2+H+
A.f.Fe2+
Fe3+
Potenciostato
O2
51
dependiendo de la población bacteriana y la concentración total de fierro en la
celda. Este estado estacionario corresponde a la relación ferroso/férrico para la
cual la velocidad de generación de ion ferroso (debida a la reducción
electroquímica de ion férrico) es igual a la velocidad de oxidación de sulfato
ferroso de la población bacteriana en la solución. Se agregan cantidades
sucesivas de ion ferroso en el compartimento catódico, generando en cada caso
aumentos progresivos en la corriente estacionaria que se obtiene al aumentar la
velocidad de oxidación bacteriana.
Cuando se ha establecido un valor estacionario de corriente, se registran los
valores de corriente y potencial redox de la solución. Simultáneamente se toman
muestras de la solución para determinar la población bacteriana presente y la
concentración de fierro total disuelto. La concentración de fierro es determinada
por el método de la o-fenantrolina (Herrera et al., 1989). La concentración de ion
ferroso se determina de la concentración total de hierro y el Eh determinado.
La relación entre el potencial redox (Eh) de la disolución y la razón entre las
actividades de ion férrico ( +3Fea ) y ion ferroso ( +2Fe
a ) esta dada por la ecuación de
Nernst (Pesic et al., 1989; Graindorge et al., 1994; Boon,1996):
×+=
+
+
2
3
ln 0
Fe
Fe
a
a
nFRT
EEh (1)
El valor del potencial estándar (E0) se puede calcular como nFGE 00 ∆−= ,
siendo 0,770 V (SHE). Las actividades de los iones (ai) se relacionan con su
concentración (ci) utilizando los coeficientes de actividad (γi), iii ca ×= γ . Estos
coeficientes son iguales a 1, sólo cuando la fuerza ionica ( ( )∑ ××=i
ii czI 221 ) de
la disolución es cero. Además, la formación de complejos en solución modifica las
concentraciones libres de los distintos iones como se puede esperar en presencia
de sulfato u otros ligandos. Por lo tanto, al considerar la razón entre [Fe3+] y [Fe2+]
52
el valor de potencial se establece respecto a un pseudo potencial estándar (E0p)
que debe ser determinado experimentalmente.
Utilizando el valor estacionario de corriente establecido después de cada adición
de sulfato ferroso, se determina la velocidad de oxidación bacteriana de ion
ferroso utilizando la siguiente expresión:
NFzI
vFe ××
=+2 (2)
Esta ecuación corresponde a la aplicación de la ley de Faraday para las
reacciones de electrodo, comportamiento que es comprobado para la celda
utilizada en experiencias sin microorganismos, registrándose eficiencias de
corriente cercanas al 100%.
En la expresión (2), +2Fev es la velocidad de oxidación bacteriana y se expresa en
(mol de ferroso /( s x bacteria)), I es la corriente estacionaria que se ha registrado
en (A), z es el número de electrones necesarios para la reducción de un átomo de
ion férrico (z=1), F es la constante de Faraday (96496 C/eq) y N es el número de
bacterias que se encuentra en el compartimento catódico.
Cada una de las series experimentales se reprodujo a lo menos dos veces.
3 RESULTADOS Y DISCUSIÓN
3.1 Calibración de Electrodos
En estas experiencias se ha realizado la medición de la velocidad de oxidación ion
ferroso con Acidithiobacillus ferrooxidans en función de la cantidad de hierro total y
el Eh de la disolución.
53
El Eh de una disolución se encuentra definido por los pares de redox que
interactúan sobre el electrodo platino. En el caso de los sistemas utilizados en este
estudio los pares redox de interés son: el par ferroso/férrico y el par
oxígeno(disuelto)/agua. Sin embargo, como se muestra en el Anexo A, en
presencia de hierro en solución el efecto del oxígeno no es considerable y para
efectos prácticos será considerado que el Eh está fundamentalmente definido por
el par ferroso/férrico.
Para relacionar la razón de concentraciones de ion férrico y ion ferroso con el
potencial redox de la solución (Eh) se determinó experimentalmente una expresión
del tipo Nernst que representa el rango de concentraciones de hierro utilizado para
el pH de trabajo. Esta expresión fue obtenida para las mismas condiciones de
aireación que son utilizadas luego en las experiencias. La expresión obtenida es:
×+= +
+
][
][log0579,0671,0SHE) vs(V 2
3
Fe
FeEh (3)
Los valores de los parámetros corresponden a una media de los valores obtenidos
para distintas concentraciones de hierro total. De este modo la expresión será
utilizada para el rango de concentraciones de 0,05 a 1 g/l de hierro total, razón
férrico/ferroso entre 0,01 – 100 y el medio basal presentado en la tabla 2.1. La
ecuación (3) muestra que el pseudo potencial estándar de la reacción esta
desviado 0,1 V respecto del potencial estándar termodinámico, en cambio la
pendiente de la curva se acerca bastante al valor esperado a esta temperatura
(0,06 V a 30ºC). En la Figura 3.1 se presenta como ejemplo la correlación obtenida
para el caso de una concentración de hierro total de 1 g/l. El procedimiento
utilizado para la obtención de esta expresión y los resultados correspondientes se
encuentran en el Anexo B.
54
y = 0,0588x + 0,6704R2 = 0,9983
0,500
0,550
0,600
0,650
0,700
0,750
-2 -1 0 1 2
Log[Fe(III)/Fe(II)]
Eh
, V v
/s S
HE
Figura 3.1:
Curva de calibración de electrodo
de Eh como función de la razón
férrico / ferroso.
Caso 1 g/l de hierro total a 30ºC
con medio basal.
3.2 Resultados experimentales
En la Figura 3.2 se presentan las mediciones de la velocidad específica de
oxidación de ion ferroso por Acidithiobacillus ferrooxidans en función de la
concentración de ion ferroso en la disolución. La concentración de ion ferroso para
cada punto del gráfico corresponde al valor que se estabiliza en el catolito en el
momento que se ha establecido una corriente de reducción estacionaria. El
parámetro Va corresponde al potencial aplicado en el electrodo de trabajo en cada
serie experimental.
Los resultados expuestos en la Figura 3.2 muestran que la velocidad de oxidación
bacteriana no depende solo de la concentración de ion ferroso en la solución y en
consecuencia estos resultados no pueden ser descritos según una ecuación tipo
Monod con ion ferroso como sustrato limitante. En la Figura 3.2 se aprecia que
para una concentración dada de ion ferroso la velocidad de oxidación aumenta
con el desplazamiento de los potenciales aplicados hacia potenciales catódicos.
Simultáneamente este aumento de potencial aplicado se refleja en un aumento de
los potenciales redox de la disolución como se ejemplifica en la Tabla 3.1. La
totalidad de los datos experimentales obtenidos se presentan en el Anexo C.
55
0,0E+00
5,0E-07
1,0E-06
1,5E-06
2,0E-06
2,5E-06
3,0E-06
3,5E-06
4,0E-06
0 200 400 600 800 1000
[Fe2+
], mg/l
VF
e2
+,
[g
Fe/
(Hr
cel)
]
Va = 0.2 V vs SHEVa = 0.4 V vs SHEVa = 0.5 V vs SHEVa = 0.6 V vs SHE
Figura 3.2: Velocidad
específica de oxidación en
función de la
concentración de ion
ferroso.
Tabla 3.1: Efecto del potencial aplicado sobre la velocidad de oxidación y el
potencial redox de la solución.
Va (V vs SHE)
Ferroso mg/l
VFe2+ µg Fe / (hr cel)
Eh (V vs SHE)
0,600 30,10 6,57E-07 0,702 0,400 40,12 8,96E-07 0,664 0,400 40,43 9,23E-07 0,662 0,200 48,79 1,02E-06 0,636 0,700 97,22 3,22E-07 0,756 0,700 99,20 3,70E-07 0,756 0,600 96,91 1,11E-06 0,693 0,400 93,36 1,49E-06 0,648 0,650 270,72 8,11E-07 0,721 0,600 259,89 1,57E-06 0,688 0,400 279,33 2,14E-06 0,625 0,200 266,63 2,52E-06 0,601
Es necesario hacer notar que, para cada valor específico de potencial aplicado Va,
el potencial redox de la solución disminuye, con el aumento de la concentración de
ion ferroso, como se aprecia en la Tabla 3.2.
56
Tabla 3.2: Efecto de la concentración de ion ferroso sobre la velocidad de
oxidación y el potencial redox de la solución para cada potencial aplicado.
Va (V vs SHE)
Ferroso mg/l
VFe2+ µg Fe / (hr cel)
Eh (mV vs SHE)
0,200 48,79 1,02E-06 0,636 0,200 113,30 1,77E-06 0,625 0,200 266,63 2,52E-06 0,601 0,200 586,99 3,09E-06 0,585 0,200 999,97 3,26E-06 0,571 0,400 40,12 8,96E-07 0,664 0,400 61,56 1,17E-06 0,658 0,400 93,36 1,49E-06 0,648 0,400 384,27 2,29E-06 0,634 0,400 885,57 2,57E-06 0,629 0,400 909,65 2,63E-06 0,620
Esto ocurre porque la corriente de reducción de ion férrico en el cátodo está
controlada por transferencia de masa. Al disponer de gran área catódica, cuando
se aumenta la concentración de ion ferroso disponible, sólo un pequeño aumento
de concentración de ion férrico es requerido en el cátodo para balancear el
aumento en la velocidad de oxidación bacteriana.
En la Figura 3.3 se presenta ahora la velocidad específica de oxidación de ion
ferroso en función del potencial redox (Eh) de la solución que se establece en
cada medición. De esta figura resulta evidente que la velocidad de oxidación
bacteriana de ion ferroso, a pesar de depender de la concentración de ion ferroso,
se encuentra más fuertemente influida por el Eh de la solución, el cual es
determinado principalmente por la razón férrico/ferroso que se establece en la
solución cuando se ha alcanzado una corriente catódica estacionaria.
57
0,0E+00
5,0E-07
1,0E-06
1,5E-06
2,0E-06
2,5E-06
3,0E-06
3,5E-06
0,50 0,55 0,60 0,65 0,70 0,75 0,80
Eh, V vs SHE
VF
e2
+ ,
[g
Fe/
(hr
cel)]
Figura 3.3: Velocidad
específica de oxidación
de ion ferroso en función
del Eh de la solución que
se establece para cada
corriente.
Los resultados experimentales comprueban que la cinética de oxidación de ion
ferroso con Acidithiobacillus ferrooxidans no puede ser descrita simplemente en
función de una expresión tipo Monod con ion ferroso como sustrato limitante. Los
resultados obtenidos indican, además, una importante influencia del Eh de la
solución sobre la velocidad de oxidación. Los modelos cinéticos disponibles no
permiten describir en forma adecuada este comportamiento, en consecuencia se
estima necesario desarrollar un modelo cinético que incorpore en forma explícita el
efecto del Eh de la solución, para interpretar los resultados. Las mediciones de
actividad oxidativa bacteriana en un amplio rango de Eh que son posibles con el
especial diseño utilizado, se mostrarán especialmente útiles para caracterizar el
proceso de oxidación del microorganismo en función de parámetros
electroquímicos.
4 EL MODELO
4.1 Descripción del modelo
Acidithiobacillus ferrooxidans es capaz de obtener la energía necesaria para su
mantención y crecimiento de la oxidación de ion ferroso utilizando oxígeno como
58
aceptor de electrones. La bacteria obtiene la energía con la cadena de transporte
de electrones que se establece entre las siguientes semi-reacciones:
eFeFe +→ ++ 23 (4)
OHeHO 22 222
1 →++ + (5)
Los electrones generados en la oxidación de ion ferroso en el periplasma celular,
son transportados a través de la cadena de transporte de electrones hasta una
oxidasa terminal (véase sección 2.2 primera parte), donde reducen oxígeno a
agua en el lado citoplasmático de la membrana celular. Este proceso es
acompañado por la simultanea disminución en la concentración de protones en el
citoplasma celular, estableciendo una diferencia de potencial electroquímico de
protones a través de la membrana, que es capaz de impulsar el proceso de
fosforilación para formar ATP (Ingledew, 1982; Elbehti et al., 2000).
El modelo enzimático de Michaelis-Menten normalmente aceptado para describir
la oxidación de ion ferroso por Acidithiobacillus ferrooxidans considera el siguiente
esquema (Lacey y Lawson, 1970):
)(22
2
1
EFeFeEk
k++
←→
+ (6)
−++ ++→ eEFeEFe k 32 3)( (7)
donde E corresponde a la enzima que interviene en el proceso y Fe2+(E)
representa el ion ferroso ligado a la enzima. Adicionalmente se considera una
etapa independiente para describir la inhibición competitiva por ion férrico (Jones y
Kelly, 1983; Lizama y Suzuki, 1989):
59
)(33
5
4
EFeFeEk
k++
←→
+ (8)
donde Fe3+(E) corresponde a ion férrico ligado a la enzima. Sin embargo, el efecto
inhibitorio del ion férrico puede ser incluido en la reacción (7) si es que esta etapa
es descompuesta en dos reacciones reversibles:
−++ +←→
eEFeEFek
k
)()( 32
4
3
(9)
++ +←→ 33
6
5
)( FeEEFek
k
(10)
Utilizando el enfoque propuesto, la cinética de oxidación de ion ferroso, incluyendo
el efecto inhibitorio del ion férrico, puede ser expresada por las reacciones
relacionadas: (6), (9) y (10).
Las reacciones (6) y (10) son reacciones enzimáticas, y sus velocidades dependen
solamente de la concentración de sitios activos y la concentración de ion ferroso y
ion férrico en la solución. Sus velocidades netas pueden ser expresadas como
sigue:
( ) ])[(][])[(])[(][ 22
23216 EFekFeEFeEFeEkr t
++++ ×−×−−×= (11)
( ) ])[(][])[(])[(][ 35
332610 EFekFeEFeEFeEkr t
++++ ×+×−−×−= (12)
donde [Et] es la concentración total de enzimas en la superficie de la membrana;
[Fe+2], [Fe+3] son las concentraciones de ion ferroso y ion férrico en la solución,
respectivamente; [Fe+2(E)], [Fe+3(E)] son las concentraciones de ion ferroso y ion
férrico enlazados a enzimas, respectivamente; y k1, k2, k5, k6 son las constantes
cinéticas asociadas.
60
La reacción (9) involucra transferencia de carga y su velocidad puede ser descrita
de acuerdo con la teoría cinética electroquímica. En una primera aproximación, la
interferencia de la transferencia de masa puede ser despreciada y la velocidad de
la reacción (9) puede ser expresada en función de la ecuación de Butler – Volmer,
como sigue:
( )
××−−
××−×= ηαηα
RTFn
RTFn
nF
ir exp
1exp0
9 (13)
donde i0 representa la corriente de intercambio, α es el coeficiente de simetría de
la reacción, n es el número de equivalentes, R es la constante del gas ideal, T es
la temperatura absoluta y η es el sobrepotencial. La velocidad de oxidación del
complejo enzima-ferroso en la membrana de la bacteria tiene unidades de mol /
(área x tiempo). Ella se expresa como i/nF, donde i es la densidad de corriente de
electrones removidos desde el complejo enzima-ferroso hacia el circuito redox
interno de la bacteria. El sobrepotencial, η, se expresa de acuerdo a los
potenciales establecidos en la membrana celular y se define como:
meq
m EE −=η (14)
meqE es el potencial de membrana para el cual el sistema se encuentra en equilibrio
(i=0), se encuentra determinado por la razón de las concentraciones de los
complejos enzima-férrico y enzima-ferroso en la superficie de la membrana, y puede
ser determinado por la expresión siguiente:
××
+= +
+
])[(
])[(ln 2
3
0 EFe
EFeFnTR
EE mmeq (15)
61
Cuando la corriente de oxidación de ion ferroso en la membrana es cero este
potencial debe igualarse al potencial de Nernst asociado a la razón [Fe3+]/[Fe2+] en la
solución, el cual se puede representar adecuadamente por el Eh:
××
+= +
+
][
][ln 2
30
Fe
FeFnTR
EhEh (16)
Por otro lado, mE es el potencial establecido en la cara periplasmática de la
membrana cuando el proceso de oxidación de ion ferroso se desarrolla a una
velocidad finita. Este potencial está inducido por la reducción de oxígeno en la
zona citoplasmática, que impulsa la cadena de transporte de electrones que
comienza en la zona periplasmática con la oxidación del complejo ferroso-enzima.
Utilizando las hipótesis expuestas en la descripción del modelo, la siguiente
expresión para la velocidad de oxidación de ion ferroso fue derivada (ver detalles
en Anexo D):
][
][
][
11
][
][
2
3
2
2
3
2
2
+
+
+
+
+
×+×+
×−=+
FeFe
KFe
K
FeFe
KVv
IS
Max
Fe (17)
donde los parámetros VMax, K2, KS y KI se definen a continuación:
( )
−××
×= 0
21
51
620
21
exp][ EhERTnF
Ekkkk
nFk
V mtMax (18)
[ ] ( )
−−××= 00
2 2
1exp EhE
RTnF
EnFk
K mt (19)
1
2
kk
KS = (20)
62
51
62
kkkk
K I = (21)
La ecuación (17) es similar a las expresiones del tipo Monod con inhibición por
férrico utilizadas para representar la oxidación de ion ferroso con Acidithiobacillus
ferrooxidans (ver expresiones (19) y (22), sección 2.3.7, primera parte). La
diferencia es que en este caso existe un término que disminuye el numerador, el
cual resulta del supuesto de reversibilidad en la reacción de transporte de
electrones (9). Este término indica la existencia de una razón férrico/ferroso para
la cual la velocidad neta de oxidación de ion ferroso es cero. Este aspecto puede
ser observado en forma más clara al expresar la velocidad de oxidación de ion
ferroso, +2Fev , en función del potencial de membrana ( mE ) y el Eh de la solución.
En este caso la siguiente expresión fue obtenida (la deducción se puede revisar en
Anexo D):
( ) ( )
( )
−×++
−−−×
−×
=∗
+
∗
∗
+
032
2
01
exp][
1
exp12
exp
2
EhEhRTnF
KFe
K
EhERTnF
EhERTnF
K
v
mm
Fe (22)
donde: K1*=
21
51
62
kkkk
nFk
; K2*=
1
2
kk
; K3*=
51
62
kkkk
63
4.2 Estimación de parámetros
Para la estimación de los parámetros (VMax, KS, KI, K2) que mejor ajustan el
modelo a los valores experimentales se utiliza el método de Newton. Para ello se
definió una función objetivo como la suma de los cuadrados de las diferencias
entre los valores experimentales y la predicción del modelo. El proceso se
desarrollo con Solver de MS Excel, obteniéndose los valores presentados en la
tabla 4.1.
Tabla 4.1: Parámetros ajustados para expresión (17).
Parámetro Valor
VMax [µg Fe/(hr cel)] 2,817 x 10-6
KS [g/l] 0,073
KI [ - ] 0,641
K2 [µg Fe/(hr cel)] 8,833 x 10-9
La expresión (17) muestra una adecuada descripción de los datos experimentales
que se demuestra en una alta correlación (R2 = 0,95). Esto puede ser visualizado
en la Figura 4.1 que correlaciona los valores experimentales de vFe2+ obtenidos
para distintas concentraciones de ion ferrosos y razones férrico/ferroso con
respecto a aquellos valores calculados utilizando la expresión (17) y los
parámetros de la tabla 4.1.
En forma similar, la información experimental fue correlacionada con la expresión
(22), una ecuación que proviene del mismo modelo cinético, pero que
explícitamente muestra el efecto del Eh sobre la velocidad de oxidación de ion
ferroso vFe2+, y el potencial de membrana Em
. Los parámetros de la ecuación (22)
fueron determinados de igual forma al caso anterior, obteniéndose los valores
presentados en la tabla 4.2.
64
0,0E+00
1,0E-06
2,0E-06
3,0E-06
4,0E-06
0,0E+00 1,0E-06 2,0E-06 3,0E-06 4,0E-06
VFe2+ Experimental [µg Fe/ (hr cel)]
VF
e2
+ C
alc
ula
da
[g
Fe
/ (h
r ce
l)]
Figura 4.1: Correlación entre valores calculados y experimentales de vFe2+.
Valores calculados usando expresión (17).
Tabla 4.2: Parámetros ajustados para expresión (22).
Parámetro Valor
*1K [µg Fe/(hr cel)] 1,594 x 10-7
*2K [g/l] 0,073
*3K [ - ] 0,641
Em [V vs SHE] 0,839
La dependencia de vFe2+ con [Fe+2], [Fe+3]/[Fe+2] y el Eh de la solución de acuerdo
al modelo cinético desarrollado en este trabajo, se resume en la Figura 4.2. Esta
Figura muestra tres zonas caracterizadas por distinto comportamiento. En la zona
de Eh bajo 0,65 (SHE), vFe2+ depende principalmente de la concentración de ion
ferroso en solución. En este rango de potencial la razón férrico/ferroso asociada es
muy pequeña, y los términos KIx[Fe+3]/[Fe+2] y K2x[Fe+3]/[Fe+2] son despreciables,
con lo cual la ecuación (17) se puede simplificar a una expresión del tipo Monod
estándar (expresión 7, sección 2.3.1, primera parte). Se ha encontrado que esta
expresión describe en forma adecuada la cinética de oxidación de ion ferroso con
Acidithiobacillus ferrooxidans en sistemas con una alta concentración inicial de ion
65
ferroso (Lacey and Lawson, 1970; MacDonald and Clarke, 1970; Jones and Kelly,
1983; Nakamura et al., 1986; Shrihari and Gandhi, 1990).
Eh, V vs SHE
0,500 0,600 0,700 0,800 0,900
VF
e2+ [µ
g F
e/(h
r ce
l)]
10-9
10-8
10-7
10-6
10-5
10-4
10-3
[Fe3+]/[Fe2+]
10-3 10-2 10-1 100 101 102 103
0,10,5110
[Fe+2], g/l
Figura 4.2: Dependencia de la velocidad de oxidación bacteriana de ion ferroso
con el Eh (o la razón férrico/ferroso) y la concentración de ion ferroso en solución,
calculada utilizando las expresiones (17) y (22).
En el rango de Eh 0,70 – 0,80 V (SHE), el incremento en la razón [Fe+3]/[Fe+2]
hace que el término KIx[Fe+3]/[Fe+2] predomine sobre KS/[Fe+2], pero aún el término
K2x[Fe+3]/[Fe+2] es despreciable con respecto a Vmax. En esta situación, la
expresión (17) se simplifica a la expresión (22) de la primera parte, es decir, la
velocidad de oxidación de ion ferroso solo depende de la razón [Fe+3]/[Fe+2]. Esta
expresión ha sido reportada para experiencias donde se opera a alto Eh con el
uso de poblaciones relativamente altas de Acidithiobacillus ferrooxidans, en donde
las variaciones en las mediciones de Eh son utilizadas para estimar la velocidad
de oxidación de ion ferroso (Boon et al., 1995; Breed et al., 1999).
66
En el rango de Eh, 0,65 – 0,72 V (SHE), solo el término K2x[Fe+3]/[Fe+2] se cancela
en la ecuación (17) (es despreciable respecto a Vmax). En ese caso la expresión
(17) se puede reducir a una expresión del tipo Monod con inhibición por ion férrico
(expresión (19) de la primera parte). Esta ecuación entrega una buena descripción
del comportamiento cinético para todos los valores de Eh menores a 0,80 V
(SHE). Esta expresión, corresponde a una de las ecuaciones más completas
reportadas previamente en la literatura, y fue deducida de un modelo enzimático
que incluye inhibición competitiva por ion férrico (Jones and Kelly, 1983; Lizama
and Suzuki, 1989).
Para potenciales sobre 0,80V (SHE), el término K2x[Fe+3]/[Fe+2] es demasiado
grande para ser despreciado, y la velocidad de oxidación de ion ferroso solo
puede ser descrita por la expresión (17) completa. La naturaleza del mecanismo
controlante en este rango de altos potenciales, puede ser más claramente
observado si la cinética es expresada en función de los potenciales, es decir,
según la expresión (22). Se puede observar que cuando el Eh se aproxima al valor
del potencial de membrana, Em, la ecuación (22) se reduce a la siguiente
expresión:
[ ]EhEEhKv mFe
−×
−=+ ββ
2exp2 (23)
donde K y β son constantes reducidas. La expresión (23) muestra que en este
rango de altos potenciales la velocidad de oxidación de ion ferroso queda
predominantemente determinada por la diferencia de potencial entre el potencial
de membrana (Em) y el Eh. Según la expresión (23), además, es evidente que
cuando el Eh iguala al potencial de membrana Em, no existe oxidación neta de ion
ferroso. En otras palabras, Em es el máximo Eh que puede ser alcanzado en
solución al oxidar ion ferroso con Acidithiobacillus ferrooxidans.
67
4.3 Aplicación del modelo a otra información experimental
Para confirmar la validez del modelo desarrollado en este trabajo, se aplico la
expresión cinética del modelo a los datos experimentales publicados por Harvey
and Crundwell (1996). En la Figura 4.3 se presenta la correlación del modelo a los
datos y en la Tabla 4.3 se presentan los parámetros obtenidos al realizar la
regresión de mínimos errores cuadráticos.
0,00
0,04
0,08
0,12
0,16
0 1 2 3 4 5 6 7[Fe 2+], g/l
Vel
ocid
ad d
e O
xida
cion
, [1/
hr]
g/l. g/l. g/l.
g/l.
[Fe3+] = 1,0 .
[Fe3+] = 2,5 .
[Fe3+] = 5,0 .
[Fe3+] = 9,0 .
Figura 4.3: Valores
publicados por Harvey and
Crundwell (1996) y ajuste al
modelo cinético presentado
en este trabajo.
En la Figura 4.3 puede observarse que la correlación de los datos experimentales
publicados por Harvey y Crundwell (1996) al modelo (puntos y líneas continuas,
respectivamente) es excelente.
Tabla 4.3: Parámetros ajustados para expresión (17)
con datos de Harvey y Crundwell (1996).
Parámetro Valor
VMax [µg Fe/(hr cel)] 3,915 x 10-6
KS [g/l] 0,063
KI [ - ] 0,088
K2 [µg Fe/(Hr cel)] 1,750 x 10-8
68
Al comparar la información contenida en las Tablas 4.1 y 4.3 se observa bastante
similitud en los parámetros estimados para cada caso. Aún más, en este caso, el
valor de Em calculado es de 0,813 V (SHE), es decir, es bastante cercano al valor
obtenido en esta tesis, a pesar de desarrollarse las experiencias con otros
electrodos, medios de cultivo y cepas bacterianas.
Para comprender en forma más profunda la solidez del modelo presentado, a
continuación se realiza un análisis de las implicaciones mecanísticas que él
presenta de acuerdo con la teoría de la quimioosmosis y la teoría cinética
electroquímica.
4.4 Implicaciones mecanísticas del modelo cinético derivado
El modelo desarrollado en este trabajo, describe la cinética de oxidación de ion
ferroso con Acidithiobacillus ferrooxidans en condiciones de alto Eh, una situación
que no había sido cubierta adecuadamente con los modelos reportados
previamente. El comportamiento cinético observado en esta región entrega una
clara evidencia del desarrollo de un mecanismo de transporte de electrones que
está gobernado por las diferencias de potencial que se establecen a través de la
membrana citoplasmática. Es importante analizar las implicancias mecanísticas de
estos resultados y, en particular, definir la naturaleza del potencial de membrana
Em, que corresponde a un parámetro electroquímico determinante en el mecanismo
de reacción presentado.
El proceso de transferencia de carga a través de la membrana citoplasmática
puede ser representado utilizando la teoría cinética electroquímica, que de este
modo se representa en el diagrama I-E de la figura 4.4a. La curva a representa la
cinética de oxidación del complejo ferroso-enzima en el lado periplasmático de la
membrana. La curva b representa la cinética electroquímica de la reducción de
oxígeno a agua en el lado citoplasmático de la membrana. +
+2
3
FeFe
E representa el
potencial de Nernst asociado a oxidación del complejo ferroso-enzima que
69
corresponde de hecho al Eh de la solución y OH
OE2
2es el potencial de Nernst
asociado a la reducción de oxígeno. ∆E es la suma de las caídas de voltaje en la
cadena de transporte de electrones y en el sistema de síntesis de ATP que cierra
el circuito electroquímico (Crundwell, 1997). Según este esquema, la presencia de
oxígeno en el citoplasma de la célula induce la polarización de la membrana a un
potencial Em. De la teoría de potencial mixto el potencial Em debe ser tal que
ambas, las corrientes asociadas a la reacción anódica (oxidación de ion ferroso) y
reacción catódica (reducción de oxígeno) sean iguales, y la suma de ∆E más los
sobrepotenciales asociados a las reacciones anódica (ηa) y catódica (ηC) sea igual
a la diferencia de potencial total (+
+2
3
FeFe
E –OH
OE2
2).
El potencial electroquímico de la reacción de reducción de oxígeno a agua está
dado por la siguiente expresión:
OHO apHpE22
log0148,00591,0log0148,023,1 −−+= (24)
que en las condiciones del citoplasma (pH 6,5), resulta ser un potencial de 0,850 V
(SHE) (Ingledew, 1982). La validación del modelo presentado en este trabajo
muestra que el potencial de membrana Em es 0,839 V (SHE), un valor que es muy
cercano al calculado por Ingledew (1982) para el potencial de Nernst de la
reducción de oxígeno en el citoplasma celular. Este es un resultado clave que
sirve para validar el enfoque mecanístico planteado en este trabajo. Esto implica
que la cinética de reducción de oxígeno en el citoplasma es muy reversible y,
además, el ÄE asociado a las caídas de potencial en la cadena de transporte de
electrones y el sistema de síntesis de ATP son despreciables. Este comportamiento
se representa esquemáticamente en la figura 4.4b donde la cinética de oxidación del
complejo ferroso-enzima se presenta en varias situaciones. En este caso Em es muy
cercano a OH
OE2
2y su valor prácticamente no cambia con las variaciones de Eh de
70
la solución o la cinética de oxidación del complejo ferroso-enzima, que se
representan en las curvas a1, a2, a3.
Figura 4.4: Diagramas corriente potencial en el mecanismo electroquímico de la
oxidación bacteriana de ion ferroso con Acidithiobacillus ferrooxidans.
El esquema electroquímico de la Figura 4.4b implica que la cinética de reducción de
oxígeno es, en forma relativa, mucho mayor que la cinética de oxidación de ion
ferroso. Los sitios activos para la reducción de oxígeno en la cara citoplasmática de
la membrana están asociados a citocromo oxidasas del tipo aa3 (Appia-Ayme et al.,
1999) mientras que los sitios activos para la oxidación de ion ferroso en el lado
periplasmático están relacionados a enzimas que no han sido bien definidas (ver
+
+
23
FeFeE
OHOE
22
−++ + → eEFeEFe )()( 32OHeHO22
222
1→++ +
aη cηE∆mE
Corriente a través de la membrana
+
+
23
FeFeE
OHOE
22
aηmE
71
sección 2.2, primera parte). El comportamiento cinético observado implica que la
reactividad específica y/o la densidad de los sitios activos para la reducción de
oxígeno es mucho mayor que los valores respectivos de los sitios activos asociados
a la oxidación de ion ferroso. Sin embargo, aún no existe una descripción detallada
de la cadena respiratoria de Acidithiobacillus ferrooxidans que pueda ayudar a
corroborar esta conclusión.
5 CONCLUSIONES
Se realizaron mediciones experimentales utilizando una celda bioelectroquímica
de potencial controlado que permitieron cuantificar explícitamente el efecto del Eh
en la velocidad de oxidación de ion ferroso con Acidithiobacillus ferrooxidans.
Los resultados experimentales obtenidos con esta celda fueron utilizados en la
validación de un modelo enzimático – electroquímico que describe la cinética de
oxidación de ion ferroso con Acidithiobacillus ferrooxidans. La expresión cinética
obtenida permite integrar en forma explícita la influencia del Eh y las
concentraciones de ion ferroso y férrico en la velocidad de oxidación de ion ferroso
con Acidithiobacillus ferrooxidans. Esta expresión permite la descripción adecuada
del proceso de oxidación bacteriano de ion ferroso en un rango de Eh mucho
mayor que los modelos formulados con anterioridad. El modelo desarrollado
mejora la descripción de la cinética de oxidación de ion ferroso, sin contradecir a
los modelos anteriores, es decir, los incluye.
La expresión cinética desarrollada fue utilizada para ajustar datos otros datos
experimentales de la literatura (Harvey y Crundwell, 1996). Se observa que el
modelo es absolutamente compatible con la información experimental,
encontrándose que los valores de los parámetros son similares a los reportados
en el trabajo de esta tesis, validando de esta forma el modelo.
72
La descripción del proceso biológico de oxidación es compatible con la descripción
bioquímica de los mecanismos de transporte de electrones discutida en la sección
2.2 de la primera parte. De esta forma, se encuentra que en un sistema que no
esta limitado por la disponibilidad de oxígeno, la velocidad de oxidación esta
controlada por la transferencia de electrones desde el aceptor primario al ion
ferroso. Esta hipótesis se comprueba al encontrarse que el potencial anódico (Em)
que impulsa la oxidación corresponde al valor fijado por el par oxígeno/agua en el
interior de la célula.
La formulación de un modelo enzimático-electroquímico se demostró útil en la
descripción del comportamiento cinético del sistema en estudio. La extensión de
este modelo a los casos donde concentración de oxígeno disuelto participa en el
control cinético, se muestra necesaria para comprobar la validez de las hipótesis
en sistemas de mayor complejidad.
73
TERCERA PARTE:
EFECTO DEL pH EN LA CINÉTICA DE OXIDACIÓN DE ION
FERROSO CON Acidithiobacillus ferrooxidans
1 INTRODUCCIÓN
De acuerdo a las cadenas de transporte de electrones y procesos bioenergéticos
que fueron discutidos en la sección 2.2 de la primera parte es claro que la
oxidación de ion ferroso y el crecimiento bacteriano son impulsados
fundamentalmente por dos fuerzas: La diferencia de potencial redox entre los
pares Fe3+/Fe2+ y O2/H2O por un lado y la diferencia de pH a través de la
membrana citoplasmática por otro. El primer proceso que corresponde a un
mecanismo de transporte de electrones, y su cinética fue estudiada en la
segunda parte de esta tesis. Respecto del pH, se ha establecido que su influencia
se presenta en distintas etapas del circuito quimiosmótico y en consecuencia sus
mecanismos de acción merecen especial atención.
El proceso de oxidación de ion ferroso utiliza al oxígeno como aceptor final de
electrones y consume protones en esta reacción. Simultáneamente, la cadena de
transporte directo de electrones produce translocación de protones aumentando la
diferencia de pH. Adicionalmente, y como consecuencia de la oxidación de ion
ferroso, se producen reacciones de hidrólisis de ion férrico que liberan a la
solución una cantidad adicional de protones. La diferencia de actividad de
protones generada de esta forma debe ser suficiente para producir la formación de
ATP por un lado, e impulsar la cadena de transporte reverso de electrones para la
reducción de NADP+ por otro.
A pesar su relevancia la influencia del pH no ha recibido suficiente atención y solo
algunos autores (ver apartado 2.3 de la primera parte) se han atrevido a formular
hipótesis respecto del mecanismo de control.
74
La presencia de Acidithiobacillus ferrooxidans en ambientes de alto pH (4 – 7)
indica que ellos deben poseer actividad en estas condiciones, a pesar de lo cual
no existen estudios de medición de capacidad oxidativa de ion ferroso para la
bacteria a pH superior a 3,5. En estas condiciones de pH es esperable la
formación gran cantidad de precipitados de ion férrico (sección 2.3.5), si esta
especie se encuentra disponible en la solución. En consecuencia resulta de interés
establecer las características de la actividad oxidativa bacteriana en condiciones
de alto pH y verificar como ella se encuentra afectada por la disponibilidad de
protones en solución y la formación de precipitados que se presenta como
consecuencia de la oxidación.
En este trabajo se estudiará la velocidad de oxidación de ion ferroso con
Acidithiobacillus ferrooxidans en el rango de pH 1,3 – 7,0. La formación de
importantes cantidades de precipitados de ion férrico a pH mayor que 2,0 nos han
obligado a separar este estudio en dos partes: la primera se realiza en rango 1,3 –
2,5 estimando la velocidad de oxidación de ion ferroso utilizando un método
convencional; y la segunda que estudiará el rango 2,5 – 7,0 utilizando una
metodología desarrollada especialmente en este trabajo.
75
2 MATERIALES Y MÉTODOS
2.1 Medición del efecto del pH en la actividad oxidativa bacteriana. Caso I: rango de pH 1,3 – 2,5.
En estas experiencias se estimó la velocidad de oxidación de ion ferroso con
Acidithiobacillus ferrooxidans en el rango de pH 1,3 – 2,5 utilizando la metodología
propuesta por Pesic et al. (1989). Este método usa las variaciones del Eh de la
solución como un indicador de las variaciones de concentración de ion ferroso y
férrico cuando la concentración de hierro total es constante. Esta metodología ha
sido utilizada exitosamente con anterioridad (Graindorge et al., 1994; Boon et al.,
1995; Breed et al., 1999) y ha demostrado ser confiable cuando se mantienen las
condiciones de aireación, hierro total, fuerza iónica, pH de la solución y correcto
funcionamiento de los electrodos.
2.1.1 Cultivo de bacterias
Se utilizó una cepa pura de Acidithiobacillus ferrooxidans (ATCC 19859). El cultivo
de las bacterias se efectuó en matraces Erlenmeyer de 250 ml, utilizando 100 ml
de medio basal de composición similar a la propuesta por Touvinen and Kelly
(1973), y que se presenta en la Tabla 2.1:
Tabla 2.1: Composición del medio basal.
Compuesto Concentración, g/l
(NH4)2SO4 0,4
MgSO4•7H2O 0,4
K2HPO4•3H2O 0,056
FeSO4•7H2O 14,9
El pH del medio se ajustó en 1,6 utilizando ácido sulfúrico concentrado. El cultivo
se mantuvo a 30,0ºC en un agitador orbital.
76
Para mantener el cultivo bacteriano en su fase exponencial de crecimiento se
realizó diariamente sub-cultivos. Para ello se toma un 20 ml de la solución ya
oxidada y se agregan 80 ml de medio basal fresco.
Para cada experimento, el inóculo se preparó a partir de 80 ml del cultivo
bacteriano, el cual fue filtrado utilizando una membrana Millipore de 0,22µm. Los
microorganismos separados son lavados cuatro veces: dos veces utilizando una
solución de ácido sulfúrico en agua destilada a pH 1,6, y luego dos veces con
agua destilada para la remoción de precipitados de fierro adheridos y ácido
residual en el pellet. Estas bacterias fueron luego resuspendidas en 10 ml de agua
destilada a pH 6,0. La población de bacterias en el inóculo es determinada por
contéo directo en una cámara Petroff-Hausser, resultando típicamente de 8 a 10 x
108 bacterias/ml.
2.1.2 Montaje experimental
Un esquema del montaje experimental se presenta en la Figura 2.1. La celda
contiene 100 ml de la solución de basal con bacterias en la cual se colocan un
electrodo combinado de pH Sensorex S201C y un electrodo combinado de Eh
Cole-Palmer 5990-57. Ambos electrodos se encuentran conectados a un sistema
de adquisición de datos Opto 22, que registra las variaciones de pH y Eh en el
tiempo. Para evitar el cortocircuito de ambas señales, solo la referencia del
electrodo de pH se encuentra conectado eléctricamente y ambos valores (pH y
Eh) son referidos a éste. La solución en la celda es agitada con un agitador
magnético y es mantenida a una temperatura constante de 30±1ºC usando una
chaqueta de calefacción con agua.
77
Figura 2.1: Montaje experimental para
medición del efecto del pH en la
actividad oxidativa bacteriana.
(1) Burbujeo de aire o Nitrógeno
(2) Electrodo de pH
(3) Electrodo de Eh
(4) Sistema de adquisición de
datos.
(5) Circuito de agua termostatizada.
(6) Agitador magnético.
2.1.3 Preparación de soluciones
La solución de trabajo es preparada in situ de acuerdo al siguiente procedimiento:
Se colocan en la celda 100 ml de medio basal (pH 1,6) libre de fierro. Se remueve
el oxígeno disuelto mediante el burbujeo continúo de nitrógeno de alta pureza
durante 15 minutos. Se adiciona sulfato ferroso de grado analítico en forma de
cristales hasta completar una concentración de 0,2 g/l, sin dejar de burbujear
nitrógeno. Se ajusta el pH deseado, entre 1,3 y 2,5 dependiendo de la experiencia,
utilizando ácido sulfúrico concentrado o solución de hidróxido de sodio 1 N.
2.1.4 Procedimiento
Se agrega una población aproximada de 5x107 cel/ml a la solución acondicionada
previamente y se cambia el burbujeo de nitrógeno por burbujeo de aire. La
concentración de bacterias es determinada por contéo directo utilizando una celda
Petroff-Hausser.
78
En la celda experimental se colocan los electrodos de Eh y pH y se comienza la
adquisición de datos en función del tiempo durante 150 minutos. En todas las
experiencias se encontró que las variaciones de pH son muy pequeñas, con lo
cual la aplicación del método de Pesic et al. (1989) resulta adecuada.
2.2 Medición del efecto del pH en la actividad oxidativa bacteriana. Caso II: rango de pH 2,5 – 7,0
Es bien conocido que la actividad de Acidithiobacillus ferrooxidans en la oxidación
de ion ferroso decae rápidamente a pH sobre 2,5. Sin embargo el mecanismo
detrás de esta inhibición no esta completamente definido. Esta falta de
conocimiento está en parte relacionada con las limitaciones que presentan las
metodologías utilizadas actualmente para estudiar la oxidación de ion ferroso con
microorganismos (normalmente se utiliza la medición de la disminución de la
concentración de ion ferroso, consumo de oxígeno o medición de la evolución del
Eh). Ellas no permiten mediciones precisas a pH sobre 3,0 donde la oxidación de
ion ferroso es acompañada por rápidas variaciones de pH y hierro total. Para
resolver este problema, se desarrolló un método para estimar las velocidades de
oxidación de ion ferroso a partir del seguimiento de las variaciones de pH y Eh que
ocurren durante el proceso oxidativo.
2.2.1 Cultivo de bacterias
Se utilizó una cepa pura de Acidithiobacillus ferrooxidans (ATCC 19859). El cultivo
de las bacterias se efectuó en matraces Erlenmeyer de 250 ml, utilizando 100 ml
de medio basal de composición similar a la propuesta por Touvinen and Kelly
(1973), y que se presentó en la Tabla 2.1.
El pH del medio se ajustó en 1,6 utilizando ácido sulfúrico concentrado. El cultivo
se mantuvo a 30,0ºC en un agitador orbital.
79
Para mantener el cultivo bacteriano en su fase exponencial de crecimiento se
realizó diariamente sub-cultivos. Para ello se toma un 20 ml de la solución ya
oxidada y se agregan 80 ml de medio basal fresco.
Para cada experimento, el inóculo se preparó a partir de 80 ml del cultivo
bacteriano, el cual fue filtrado utilizando una membrana Millipore de 0,22µm. Los
microorganismos separados fueron lavados cuatro veces: dos veces utilizando
una solución de ácido sulfúrico en agua destilada a pH 1,6, y luego dos veces con
agua destilada para la remoción de precipitados de fierro adheridos y ácido
residual en el pellet. Estas bacterias fueron luego resuspendidas en 10 ml de agua
destilada a pH 6,0. La población de bacterias en el inóculo es determinada por
contéo directo en una cámara Petroff-Hausser, resultando típicamente de 8 a 10 x
108 bacterias/ml.
2.2.2 Montaje experimental
Un esquema del montaje experimental se presentó en la Figura 2.1. La celda
contiene 100 ml de la solución de basal con bacterias en la cual se colocan un
electrodo combinado de pH Sensorex S201C y un electrodo combinado de Eh
Cole-Palmer 5990-57. Ambos electrodos se encuentran conectados a un sistema
de adquisición de datos Opto 22, que registra las variaciones de pH y Eh en el
tiempo. Para evitar el cortocircuito de ambas señales, solo la referencia del
electrodo de pH se encuentra conectado eléctricamente y ambos valores (pH y
Eh) son referidos a éste. La solución en la celda es agitada con un agitador
magnético y es mantenida a una temperatura constante de 30±1ºC usando una
chaqueta de calefacción con agua.
2.2.3 Preparación de soluciones
La solución de trabajo es preparada in situ de acuerdo al siguiente procedimiento:
se colocan en la celda 100 ml de agua destilada o medio basal libre de fierro,
80
siendo desoxigenados mediante el burbujeo continúo de nitrógeno de alta pureza.
Luego, se agregan gotas de una solución 1N de NaOH hasta alcanzar un pH
levemente superior a 7,0. Manteniendo el burbujeo de nitrógeno se adiciona una
cantidad predeterminada de sulfato ferroso (en forma de cristales hidratados de
calidad analítica) suficiente para alcanzar la concentración deseada de ion ferroso
en solución (0,1 g/l, 0,5 g/l o 1 g/l). Este procedimiento permite la solubilización de
ion ferroso a alto pH previniendo la oxidación espontánea del reactivo. Si se
requiere, se agrega una cantidad adicional de NaOH necesaria para reajustar el
pH a 7,0. Finalmente, la bacteria resuspendida es agregada para lograr en la
solución de trabajo la concentración deseada de microorganismos (8 x 106 a 8 x
107 cel/ml).
2.2.4 Procedimiento
La oxidación de fierro se inicia al cambiar desde burbujeo de nitrógeno a burbujeo
de aire en la celda. La velocidad de oxidación de ion ferroso fue determinada a
partir de las variaciones de Eh y pH de acuerdo con el procedimiento de cálculo
que se describe junto a los resultados. Quince condiciones experimentales
distintas fueron utilizadas, correspondientes a tres diferentes concentraciones
iniciales de ion ferroso (0,1 g/l, 0,5 g/l o 1 g/l), en soluciones con bacterias y
condiciones abióticas y cuatro concentraciones iniciales de bacterias (0,8, 2, 5 y 8
x 107 cel/ml). Se operó además en soluciones de medio basal libre de fierro y
soluciones libres de nutrientes, Cada condición experimental fue desarrollada en
duplicado para asegurar la reproducibilidad del procedimiento.
2.3 Medición del efecto del pH en la actividad oxidativa bacteriana. Caso III: Efecto del pH en el rendimiento del crecimiento bacteriano.
Acidithiobacillus ferrooxidans obtiene la energía para su crecimiento y mantención
de un origen distinto a su fuente de carbono. Por lo tanto, puede desacoplar los
procesos de oxidación de ion ferroso y de fijación de dióxido de carbono para la
81
formación de biomasa. Considerando lo anterior, es necesario comprobar si los
procesos de oxidación de ion ferroso a distintos pH se encuentran relacionados
con crecimiento celular. Una forma simple de comprobar si estos procesos están
acoplados es realizar la medición simultánea del consumo de oxígeno (cuantifica
la velocidad de oxidación) y el consumo de dióxido de carbono (estima la
velocidad de síntesis de biomasa).
Estas experiencias fueron desarrolladas en el Mineral Bioprocessing Laboratory
del Departamento de Ingeniería Química de la Universidad de Cape Town,
Sudáfrica, con la supervisión del profesor Goeff Hansford.
2.3.1 Cultivo de bacterias
En este estudio se utilizó una cepa pura de Acidithiobacillus ferrooxidans (ATCC
19859). El cultivo de las bacterias se efectuó en matraces Erlenmeyer de 300 ml,
utilizando 150 ml del medio basal presentado en la Tabla 2.1.
El pH del medio fue ajustado en 1.6 utilizando ácido sulfúrico concentrado. El
cultivo fue mantenido a 30,0ºC en un agitador orbital.
Para mantener el cultivo bacteriano en su fase exponencial de crecimiento se
realizó diariamente sub-cultivos. Para ello se toma un 30 ml de la solución ya
oxidada y se agregan 120 ml de medio basal fresco.
El inóculo a ser utilizado en el reactor se preparó con 480 ml del cultivo bacteriano,
correspondiente a cuatro matraces, el cual fue filtrado utilizando una membrana
Millipore de 0,22µm. Las bacterias separadas fueron lavadas tres veces con 20
ml de solución de ácido sulfúrico a pH 1,6 para la remoción de precipitados de
fierro adheridos, y es luego resuspendido en 20 ml de medio basal libre de sulfato
ferroso. La población de bacterias en el inóculo no se determinó, pero se estimó
de acuerdo con las experiencias realizadas anteriormente.
82
2.3.2 Bioreactor y Montaje
Las experiencias de oxidación batch de sulfato ferroso fueron desarrolladas en
bioreactores Applikon Z61104CT04 de 2 litros confeccionados en borosilicatos,
con un volumen de trabajo de un litro. Una representación esquemática del
bioreactor y el montaje utilizado se presenta en la Figura 2.2.
Figura 2.2: Montaje experimental utilizado para la estimación del rendimiento en el
crecimiento bacteriano al oxidar sulfato ferroso.
El bioreactor fue termostatizado utilizando una camisa de calefacción con agua. La
disolución fue agitada por un impulsor de acero inoxidable 316 de seis aspas
ubicado a dos cm del fondo del reactor. El agitador fue rotado a 400 rpm con un
motor Applikon P100 y control digital de velocidad.
La entrada de gas fue entregada por un generador de aire libre de aceite Peak
Scientific OAG2000DA. El aire de salida fue filtrado con un filtro Walker A30X1,
luego secado por un secador de aire comprimido refrigerado Denco SN0.75 y
finalmente vuelto a filtrar usando filtros Walker A30XA y A30AC, para producir un
Análisis de O2 y CO2 Salida de gases
Secado de
Gases
Calefactor
Control de
Flujo de Gas
Condensador
Entrada de gases
Adquisición de Datos
83
aire comprimido, seco y libre de aceite. Los flujos de entrada y salida del reactor
fueron medidos utilizando un flujómetro de burbuja Hewllet Packard de 100 ml. El
gas de salida se secó usando un condensador a la salida del reactor, enfriado con
etilenglicol bajo –1ºC..
En cuanto al análisis de gases, la determinación de las concentraciones de dióxido
de carbono y oxígeno en los gases de entrada y salida, se realizó utilizando un
fotómetro industrial Hartmann & Braun Uras 4 NDIR y un analizador
paramagnético de oxígeno Magnos &G, respectivamente.
Para la medición y control del pH se utilizó un electrodo combinado de pH Metler-
Toledo conectado a una biocontrolador Applikon ADI1030. El biocontrolador
estaba conectado a dos bombas peristálticas Masterflex que alimentan soluciones
de ácido sulfúrico e hidróxido de sodio al bioreactor según sea necesario para
mantener el pH en un valor constante. Este controlador asimismo informa las
adiciones de ácido y base, y el valor de pH del reactor en el tiempo.
El potencial redox de la solución es monitoreado utilizando un electrodo
combinado de platino y referencia Ag/AgCl Metler-Toledo. El valor del potencial
junto con el análisis de los gases de entrada y salida son enviados a un sistema
de adquisición de datos que almacena la información.
2.3.3 Procedimiento
Se coloca en el bioreactor 980 ml de medio basal libre de fierro y se comienza la
agitación, calentamiento y aireación. Se agrega al reactor ácido sulfúrico
concentrado hasta lograr el pH deseado. Se agrega al reactor 1 g/l de ion ferroso
como sulfato ferroso hidratado y a continuación se adiciona el inóculo de bacterias
preparado en acuerdo con el procedimiento descrito. Se comienza el control de la
acidez del sistema. La temperatura es mantenida en 30,0 ± 0,1 ºC.
Simultáneamente se comienza el análisis de gases y la adquisición de datos. Se
84
monitoréa pH, Tª , O2, CO2, Eh y las adiciones de ácido o base. Cada una de las
series experimentales tiene una duración mínima de 24 horas continuas.
Se tomó una muestra de solución al inicio de la experiencia, antes de la
inoculación, y otra al final de la serie para realizar un análisis por ion ferroso y
férrico disueltos. La muestra final es filtrada utilizando una membrana Millipore
para eliminar precipitados presentes y separar las bacterias existentes en el
sobrenadante.
El análisis de la información recopilada se realiza utilizando las metodologías
descritas por Boon (1995).
85
3 RESULTADOS Y DISCUSIÓN
3.1 Caso I: Rango de pH 1,3 – 2,5
En estas experiencias se caracterizó la velocidad de oxidación de ion ferroso con
Acidithiobacillus ferrooxidans en el rango de pH 1,3 – 2,5 utilizando la metodología
propuesta por Pesic et al. (1989). Se definió este rango particular, ya que a valores
menores de pH la oxidación prácticamente se detiene (evidencia de este trabajo y
antecedentes en sección 2.3 de la primera parte) y por otro lado, cuando al pH es
mayor que 2,5 la formación de precipitados es abundante. De esta forma se
definió un rango de valores donde la velocidad de oxidación es importante y la
hidrólisis del ion férrico no es relevante.
En cada una de las experiencias se observó un continuo aumento del Eh de la
solución, manteniéndose los valores de pH relativamente constantes. La variación
de Eh está ligada a la oxidación del ion ferroso de acuerdo a la ecuación siguiente:
Fe2+ + ¼ O2 + H+ → Fe3+ + ½ H2O (1)
Simultáneamente, es posible la acidificación producto de la hidrólisis parcial del
ion férrico formado. Sin embargo, la variación de acidez es pequeña en este rango
de pH.
La Figura 3.1 muestra la evolución típica de estas variables en una experiencia de
pH inicial 1,9 y pH promedio 1,84, con 0,2 g/l de ion ferroso inicial y 5,5x107 cel/ml.
Los gráficos correspondientes a las restantes pruebas realizadas se encuentran
en el Anexo E.
86
0,5
0,6
0,7
0,8
0 50 100 150
Tiempo, min
Eh,
V v
s S
HE
1,0
1,1
1,2
1,3
1,4
1,5
1,6
1,7
1,8
1,9
2,0
pH
Eh
pH
Figura 3.1. Evolución del Eh
y pH. Población de bacterias
5,5x107 cel/ml, [Fe2+]inicial =
0,2 g/l, pH promedio 1,84.
El método utilizado se basa en la estimación de las velocidades de oxidación
utilizando las variaciones en la medida del Eh de la solución durante la
experiencia. En consecuencia es necesario conocer la dependencia de la señal de
Eh con la razón férrico/ferroso en solución. Para ello se utilizó la siguiente
expresión, obtenida en la sección 3.1 de la segunda parte de esta tesis:
+= +
+
][
][log0579,0671,0SHE) vs(V 2
3
Fe
FexEh (2)
Utilizando la curva de calibración para el electrodo de Eh (Expresión 2) y la
concentración total de fierro, [Fetot], se calculan las concentraciones instantáneas
de ion ferroso y férrico:
−+
+
=0579,0
671,0
2
101
][][
Eh
totFeFe (3)
][10][ 20579,0
671,0
3 +
−
+ ×= FeFeEh
(4)
Se calculó la velocidad instantánea de oxidación de ion ferroso durante la
experiencia, utilizando una derivada discreta:
87
cel
ttt
Fe Nt
FeFev
1][][ )(2
)(2
2 ×∆
−=−
+∆+
+
+ (5)
donde Ncel es el número de bacterias en solución (cel/ml).
La Figura 3.2 muestra la velocidad de oxidación de ion ferroso obtenida en la
experiencia presentada en la Figura 3.1.
Figura 3.2. Velocidad de
oxidación de ion ferroso.
Población de bacterias
5,5x107 cel/ml, [Fe2+]inicial =
0,2 g/l, pH promedio 1,84.
0,0E+00
5,0E-07
1,0E-06
1,5E-06
2,0E-06
2,5E-06
0 50 100 150Tiempo, min
VF
e2+
, g
Fe/
(hr
cel
)
Los resultados de la Figura 3.2 muestran una disminución importante de velocidad
en la medida que transcurre la oxidación. Esta disminución está ligada al
progresivo consumo de ion ferroso y por lo tanto los valores experimentales
pueden ser correlacionados a una expresión de tipo Monod con ion ferroso como
sustrato limitante (expresión 7 sección 2.3.1, primera parte).
Se realiza una regresión no lineal, utilizando como función objetivo el cuadrado del
error en cada punto. De esta forma, se obtuvieron valores para VMax y KS en cada
pH utilizado, los cuales son presentados en la Tabla 3.1. No se consideró la
influencia del ion férrico, ya que el ajuste numérico se realiza en la zona donde su
concentración es baja y en consecuencia su influencia es muy pequeña (Eh menor
que 0,670 V vs SHE). No fue considerada la prueba correspondiente a las figuras
88
E.5 y E.6 del anexo E, ya que en esta experiencia las variaciones de velocidad no
permiten un adecuado ajuste de parámetros en el modelo. Esto se debe a la baja
población de microorganismos que resultó en esta prueba.
Tabla 3.1. Parámetros ajustados para ecuación tipo Monod
en experiencias a pH entre 1,27 y 2,60
pH KS VMax g/l µg Fe/ (hr cel)
1,27 0,352 3,02E-06 1,31 0,317 2,75E-06 1,55 0,228 2,87E-06 1,66 0,218 2,74E-06 1,71 0,156 3,03E-06 1,84 0,111 2,88E-06 1,87 0,087 2,84E-06 2,03 0,031 2,85E-06 2,07 0,080 2,73E-06 2,25 0,039 2,76E-06 2,28 0,102 2,95E-06 2,55 0,123 2,86E-06 2,60 0,099 2,82E-06
En las pruebas realizadas a mayor pH (sobre 2,0) se observa inicialmente una
etapa de baja velocidad que no concuerda con el comportamiento posterior. Esto
se explica como un retardo inicial en la actividad, producto de la aparición de
trazas de precipitados en el sistema. La precipitación es inducida durante el ajuste
de pH que se realiza con hidróxido de sodio y la importancia de este fenómeno no
fue prevista ni evaluada con anterioridad. Por esta razón estos puntos no fueron
considerados en el ajuste de parámetros realizado en cada caso.
En las Figuras 3.3 y 3.4 se presentan los valores de VMax y KS en función del pH
para la serie experimental realizada.
89
2,0E-06
2,2E-06
2,4E-06
2,6E-06
2,8E-06
3,0E-06
3,2E-06
3,4E-06
3,6E-06
3,8E-06
4,0E-06
1,00 1,50 2,00 2,50 3,00
pH
Vm
ax,
g F
e/(h
r cel
)
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
1,00 1,50 2,00 2,50 3,00
pH
Ks,
g/l
Figura 3.3. Efecto del pH sobre VMax. Figura 3.4. Efecto del pH sobre KS.
En la Figura 3.3 no se observa una clara influencia del pH sobre la velocidad
máxima de oxidación (VMax) en el rango de pH utilizado, por lo tanto en el análisis
se considera que este parámetro es independiente de la acidez para valores de
pH menores a 2,60. Por otro lado, en la Figura 3.4 se aprecia una clara influencia
del pH sobre la constante de afinidad con el sustrato (KS), disminuyendo su valor
en forma importante al aumentar el pH entre 1,27 y 2,0.
Para interpretar la influencia del pH sobre la velocidad de oxidación de ion ferroso
en esta serie experimental se puede considerar un esquema de inhibición por
protonación de los sitios activos. En otras palabras, los protones actúan como
inhibidores de la oxidación de ion ferroso (Shuler y Kargi, 1992). Para explicar
este supuesto debemos volver al mecanismo de oxidación presentado en la Figura
2.9 de la primera parte. En la figura, el proceso de transporte directo de electrones
es acompañado de la translocación simultanea de protones, es decir localmente la
oxidación de ion ferroso produce protones. De esta forma al aumentar la
concentración de protones en solución, ellos dificultan el proceso de translocación
al bloquear los sitios activos de liberación. Es decir, los protones producen
“inhibición por producto” del proceso oxidativo. En consecuencia, el parámetro KS
debe depender de la concentración de protones en solución y la velocidad de
oxidación bacteriana de ion ferroso se puede expresar de acuerdo a la siguiente
expresión (ver sección 2.3.1, primera parte):
90
][])[1(
][2
1
2
++
+
+×+××
=FeHKK
FeVV
H
max (6)
donde K1 y KH son constantes de ajuste. En consecuencia se espera que los
valores obtenidos de KS dependan linealmente de la concentración de protones en
solución en la forma:
])[1(1+×+×= HKKK HS (7)
En la Figura 3.5 se aprecia la relación entre el valor de KS y la concentración de
protones en el rango de pH 1,27 a 2,06. La regresión lineal de los datos indica una
adecuada correlación (R2=0,94) entre el modelo propuesto y la información
experimental, lo cual confirma las hipótesis presentadas. Este hecho es de
particular trascendencia, ya que de acuerdo a los modelos propuestos para el
mecanismo de oxidación en este microorganismo (sección 2.2, primera parte) se
espera que la oxidación de ion ferroso este asociada a la translocación de
protones.
y = 6,571x + 0,015
R2 = 0,935
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
0,000 0,010 0,020 0,030 0,040 0,050 0,060
[H+], M
Ks,
g/l
Figura 3.5.
KS en función de la
concentración de protones.
Regresión lineal de los datos en
el rango de pH 1,27 – 2,06.
91
Finalmente se encuentra que en el rango de pH considerado (1,27 a 2,06) la
velocidad de oxidación puede ser adecuadamente descrita utilizando la siguiente
expresión:
+×+×××=
++
+−
+
cel hr
Fe g
][])[1,4381(015,0
][1085,22
26
2
µFeH
FeV
Fe (8)
donde la concentración de fierro esta en g/l y la concentración de protones en
mol/l. El valor de VMax considerado (2,85x10-6 µgFe/(hr cel)) corresponde al
promedio aritmético de los valores obtenidos para este parámetro en el rango de
pH utilizado.
Se debe resaltar que el procedimiento utilizado en el análisis de los datos significa
una importante acumulación de errores, por lo tanto el valor del ajuste realizado
debe considerarse en términos cualitativos. Es decir, el resultado más destacable
de este apartado es la estructura de la expresión cinética encontrada, que
concuerda en forma adecuada con la hipótesis de translocación de protones en el
proceso oxidativo. Dado que los resultados fueron obtenidos en 14 pruebas
independientes no resulta sencillo, ni confiable realizar un ajuste único de
parámetros, ya que se incluiría una incertidumbre importante.
Para el caso de las pruebas de mayor pH (sobre 2,06) ellas no pueden ser
consideradas en el modelo presentado. Se considera que la formación de
pequeñas cantidades de precipitados tiene un efecto sobre el procedimiento de
cálculo, y además introduce nuevos fenómenos que no pueden ser incluidos en
modelo analizado. Sin embargo, en el próximo apartado se presenta una
metodología que permite evaluar el efecto de la acidez y la formación de
precipitados a mayores valores de pH.
92
3.2 Caso II: Rango de pH 2.5 – 7.0
La formación de abundantes precipitados y las rápidas variaciones de pH que se
presentan normalmente en la oxidación bacteriana de sulfato ferroso a pH superior
a 3,0, impiden el seguimiento del proceso oxidativo utilizando métodos
convencionales (normalmente se utiliza la medición de la disminución de la
concentración de ion ferroso, consumo de oxígeno o medición de la evolución del
Eh). Por esta razón se realizaron mediciones de la velocidad de oxidación de ion
ferroso en el rango de pH 2,5 – 7,0 utilizando una metodología que estima las
velocidades de oxidación a partir de las variaciones de pH y Eh que ocurren
durante el proceso oxidativo. El objetivo de estas mediciones fue evaluar por
separado el efecto de la disminución de la concentración de protones y la
presencia de precipitados férricos en la velocidad de oxidación de ion ferroso de
Acidithiobacillus ferrooxidans a pH sobre 2,5.
3.2.1 Metodología de cálculo
En cada uno de los experimentos de oxidación de ion ferroso se observó
simultáneamente un continuo descenso del pH y un aumento en el Eh de la
solución. La tendencia típica se muestra en la Figura 3.6 que corresponde al caso
de una solución inoculada con concentración inicial de ion ferroso de 0,5 g/l en
medio basal y 2x107 cel/ml.
El movimiento del pH hacia valores más ácidos resulta del balance entre el
consumo de protones en la oxidación de ion ferroso y la liberación de protones
asociada a la precipitación de ion férrico. El aumento en el Eh se encuentra
relacionado a un aumento neto en la razón Fe+3/Fe+2 presente en la solución.
La oxidación de ion ferroso puede ser expresada según la reacción:
Fe2+ + ¼ O2 + H+ → Fe3+ + ½ H2O (9)
93
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0 200 400 600 800 1000Tiempo, min
Eh,
V v
s S
HE
2,0
2,5
3,03,5
4,0
4,5
5,0
5,5
6,06,5
7,0
pH
Eh
pH
Figura 3.6.
Evolución de Eh y pH. Población
inicial de bacterias 2x107 cel/ml.
Concentración inicial de ion
ferroso 0,5 g/l en medio basal.
Es necesario desarrollar un método de cálculo que permita estimar la velocidad de
oxidación de ion ferroso a partir de la variación de Eh y pH en la solución. Para
ello fue necesario determinar previamente la estequiometría asociada a las
reacciones de precipitación de ion férrico.
Se realizaron experiencias independientes utilizando la metodología expuesta en
[R.H. Byrne y Yu-Ran Luo, 2000] y se demostró que la reacción de precipitación
de ion férrico en soluciones sin nutrientes queda bien descrita por la reacción:
Fe3+ + 3 H2O → Fe(OH)3 + 3 H+ (10)
Por otro lado, en el sistema que contiene medio basal, se observo que el proceso
de precipitación es mejor descrito por la estequiometría de la reacción:
X+ + 3 Fe3+ + 2 SO42- + 6 H2O → XFe3(SO4)2(OH)6 + 6 H+ (11)
donde X corresponde a un catión monovalente. Los dichos anteriores no implican
que las reacciones que ocurren sean precisamente estas, sino más bien que la
estequiometría global de precipitación puede ser descrita por medio de estas
reacciones. Los detalles de estas experiencias y sus resultados se presentan en el
Anexo F.
94
Si la velocidad de oxidación de ion ferroso, +2FeV , se define por:
[ ]+−=
+
2
2
FeV
dtFed
(12)
y la velocidad de precipitación de ion férrico, pptV , se define por:
[ ]ppt
tot
VdtFed −= (13)
el balance de masa para H+ y Fe3+ en la solución para el caso con medio basal es
entregado por las ecuaciones:
Fe3+ : [ ]
pptFeVV
dtFed −= +
+
2
3
(14)
H+ : [ ]
pptFeVV
dtHd ×+−= +
+
22 (15)
Y en el caso de soluciones sin nutrientes los balances se representan por la
ecuación (14) y la siguiente expresión
H+ : [ ]
pptFeVV
dtHd ×+−= +
+
32 (16)
Utilizando las ecuaciones (14) y (15), +2FeV y pptV pueden ser expresados para el
caso con medio basal según las expresiones:
[ ] [ ]dtFed
dtHd
VFe
++
×+=+
3
22 (17)
[ ] [ ]dtFed
dtHd
Vppt
++
+=3
(18)
95
y en el caso de soluciones sin nutrientes utilizando (14) y (16), se obtiene:
[ ] [ ]23
3
2
×+=
++
+
dtFed
dtHd
VFe
(19)
[ ] [ ]2
3
+=
++
dtFed
dtHd
Vppt (20)
Para evaluar la velocidad de oxidación de ion ferroso durante las experiencias se
realizó separadamente un procedimiento de calibración para obtener
explícitamente la concentración de protones, [H+], y la concentración de ion férrico
en solución, [Fe3+], a partir del pH, el Eh y la determinación de hierro total en
solución. Para las expresiones que relacionan el Eh con la concentración de ion
ferroso y ion férrico, el detalle se encuentra en el anexo B. Para el caso de medio
basal se obtuvo:
+=
+
+
][
][log*0579.0471.0
2
3
FeFe
Eh (Ag/AgCl) (21)
y para el caso de soluciones sin nutrientes:
+=
+
+
][
][log*0644.0492.0
2
3
Fe
FeEh (Ag/AgCl) (22)
De la calibración del electrodo de pH se encontró que la señal de potencial del
electrodo (∆E) y la concentración de H+ en solución están relacionadas según la
siguiente expresión:
( )][log*056.04092.0 ++=∆ HE (23)
96
Las concentraciones de ion férrico y ion ferroso son calculadas con el valor de
hierro total y en Eh en cada momento durante la experiencia utilizando las
siguientes expresiones:
−
+
+
== 579.0
471.0
2
3
10][
][Eh
FeFe
R (24)
][1
][ 3 totFeR
RFe
+=+ (25)
RFe
Fetot
+=+
1
][][ 2 (26)
Finalmente, la velocidad de oxidación de ion ferroso se evalúa de acuerdo a la
expresión (17) o (19), al considerar en cada intervalo de tiempo las variaciones de
concentración ion férrico y protones en solución.
El ion férrico precipitado (masa) en cada intervalo de tiempo se evalúa utilizando la
siguiente integral (en forma discreta):
∫=t
pptTppt dtVVFe
0][ (27)
donde VT es el volumen del reactor. Finalmente, la concentración total de hierro
que será utilizada en el siguiente escalón de tiempo se corrige descontando el
hierro precipitado de acuerdo a la ecuación:
Tppttot
ttot VFeFeFe /][][][ 0 −= (28)
3.2.2 Velocidad de oxidación de ion ferroso
En las Figuras 3.7 y 3.8 se presentan las velocidades de oxidación de ion ferroso
calculadas para las experiencias en medio basal con 0,5 g/l de ion ferroso inicial
para el caso abiótico y para el caso inoculado, respectivamente. Los valores
97
presentados corresponden al valor instantáneo de la velocidad de oxidación como
función del pH, el que evoluciona en el tiempo. En el Anexo G se presentan los
resultados de velocidad de oxidación calculada en todos los casos considerados.
La integración de la velocidad de precipitación en el tiempo permite estimar al final
de la experiencia la cantidad de hierro disuelto disponible. Estos valores fueron
comparados con el análisis químico de las soluciones finales filtradas,
encontrándose en todos los casos que el error en la estimación realizada por el
método de cálculo es inferior a un 10%.
La Figura 3.7 muestra que existe una importante velocidad de oxidación química
de ion ferroso a pH sobre 5. Inicialmente existe una zona donde la velocidad de
oxidación es relativamente constante (no muestra una tendencia clara de
variación), que corresponde a un estado transitorio inicial durante el cual se
alcanza la plena oxigenación de la solución (zona 1). Luego la velocidad de
oxidación química decrece rápidamente como resultado del proceso de
acidificación (zona 2).
-2.0
-1.5
-1.0
-0.5
0.0
0.5
1.0
2 3 4 5 6 7
pH
log
(Vel
ocid
ad d
e O
xida
ción
) [m
g F
e / H
r]
ZONA 1
ZONA 2
Figura 3.7. Velocidad de oxidación de
ion ferroso. [Fe2+]inicial = 0,5 g/l, no
inoculado, en medio basal.
-2.0
-1.5
-1.0
-0.5
0.0
0.5
1.0
2 3 4 5 6 7
pH
log
(Vel
ocid
ad d
e O
xida
ción
) [m
g F
e / H
r]
ZONA 4ZONA 3
ZONA2
ZONA 1
Figura 3.8. Velocidad de oxidación de
ion ferroso. [Fe2+]inicial = 0,5 g/l,
inoculado, en medio basal.
En la Figura 3.8, correspondiente al caso inoculado, se pueden definir cuatro
zonas: las zonas 1 y 2 poseen un comportamiento similar al observado en el caso
abiótico; en la zona 3 el logaritmo de la velocidad de oxidación crece casi
98
linealmente con la disminución del pH; en la zona 4 esta tendencia de aumento se
atenúa.
Los resultados anteriores muestran que la oxidación de ion ferroso en el rango de
pH entre 4,8 y 7,0 no esta relacionada con actividad bacteriana. Por el contrario,
cuando el pH cae a valores bajo 4,8 la velocidad de oxidación esta relacionada
principalmente a actividad oxidativa bacteriana y crece en forma estable con la
disminución de pH. Este comportamiento también es observado en las
experiencias con 0,1 y 1 g/l de ion ferroso inicial (El detalle de los resultados
puede ser revisado en Anexo G). De acuerdo a estas observaciones para obtener
la velocidad neta de oxidación biológica de ion ferroso es necesario descontar la
componente inicial de oxidación abiótica que predomina entre pH 7,0 y 4,8. Para
ello se supone que la velocidad de oxidación química (no microbiana) depende
sólo del pH en cada experiencia. La expresión obtenida en cada caso es
descontada de las experiencias inoculadas. De esta forma se calcula la velocidad
específica de oxidación ( +2FeV ) de la población de microorganismos según la
siguiente expresión:
celFeFe NVV +
+ = 22 (29)
donde Ncel es la población de microorganismos en cada tiempo, cuyas variaciones
se calculan considerando la oxidación microbiana de ion ferroso de acuerdo a la
ecuación:
∫ ++=t
t Fecelcel dtVYNN0
2*0 (30)
donde t0 es el tiempo en el cual se alcanza pH 5,0 (predomina la acción
bacteriana) y 0celN es la población bacteriana inicial de la experiencia.
99
Para el caso de una solución de medio basal y 0,5 g/l de ion ferroso inicial, se
obtuvo la velocidad de oxidación bacteriana que se presenta en la Figura 3.9.
0,0E+00
1,0E-06
2,0E-06
3,0E-06
2 3 4 5 6 7pH
Vel
ocid
ad d
e O
xida
ción
, g
Fe/
(h
cell)
Figura 3.9.
Velocidad de oxidación bacteriana
de ion ferroso.
[Fe2+]inicial = 0,5 g/l, inoculado, en
medio basal.
La evolución del pH en cada experimento es acompañada por una disminución
continua en la concentración de ion ferroso y un aumento en la concentración de
ion férrico. Además existe una cantidad creciente de precipitados de ion férrico
formados. Asumiendo que la velocidad de oxidación bacteriana sigue una
expresión cinética del tipo Monod con ion ferroso como sustrato limitante e
incluyendo un término de inhibición por ion férrico (ver sección 2.3, primera parte),
la velocidad de oxidación puede ser expresada por la siguiente ecuación:
])[1(][
][32
2
2++
+
×++×
=+
FeKKFe
FeVV
IS
MaxFe (31)
en donde Vmax = µmax/Y, Y es el rendimiento para la oxidación de ion ferroso.
Usando esta expresión los valores de Vmax pueden obtenidos a partir de la
velocidad de oxidación ( +2FeV ) en cada pH. Los siguientes valores fueron utilizados
en estos cálculos (Harvey y Crundwell, 1996): KS = 73 ppm, KI = 1,29 l/g. Los
valores de [Fe2+] y [Fe3+] en cada pH fueron obtenidos de los balances de masa
del sistema (ver metodología de cálculo). Los valores Vmax calculados se
100
presentan en las Figuras 3.10 y 3.11 correspondientes a soluciones con medio
basal y medio sin nutrientes, respectivamente.
0,0E+00
5,0E-07
1,0E-06
1,5E-06
2,0E-06
2,5E-06
3,0E-06
2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0
pH
Vm
ax, µ
g F
e/ (
hr c
el)
1,0 g/l
0,5 g/l
0,1 g/l
0,0E+00
5,0E-07
1,0E-06
1,5E-06
2,0E-06
2,5E-06
3,0E-06
2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0pH
Vm
ax,
g F
e/ (
hr c
el)
0,1 g/l
0,5 g/l
0,1 g/l
Figura 3.10: Valores de Vmax calculados,
en soluciones de medio basal con 2x107
cel/ml para diferentes [Fe2+]inicial.
Figura 3.11 Valores de Vmax calculados,
en soluciones libres de nutrientes con
2x107 cel/ml para diferentes [Fe2+]inicial.
La información presentada en las Figuras 3.10 y 3.11 muestra que, excepto para
la experiencia en medio sin nutrientes y 1,0 g/l de ion ferrosos inicial, VMax
aumenta con la disminución de pH en un importante rango de pH. Esta tendencia
se encuentra dentro de lo esperado de acuerdo al rol asignado a los protones en
la teoría de la quimiosmosis. Sin embargo, en el rango de menores pH se observa
un cambio en la tendencia y se produce una disminución de la VMax. Es conocido
que el aumento en la acidez a bajos pH provoca una disminución en la actividad
bacteriana, pero como fue encontrado en la sección anterior este efecto solo es
importante en pH inferior a 2,5. Esta baja en VMax se puede relacionar con el
aumento en la cantidad de precipitados de ion férrico en el sistema que no han
sido considerados en la ecuación (31). Esto hecho es explícito en las Figuras 3.12
y 3.13, las cuales muestran que la disminución del pH está acompañada de un
aumento casi exponencial de la cantidad de precipitados. Se puede observar que
la zona donde se observa una importante disminución de VMax corresponde a la
zona en que hay gran cantidad de precipitados. Por ejemplo para la experiencia
con medio basal y 1,0 g/l de ion ferroso inicial, la cantidad de precipitados a pH 3,0
101
es diez veces mayor que la presente a pH 3,5. De esta forma es muy probable que
el progresivo aumento de los precipitados pueda contrarrestar el efecto positivo de
la disminución de pH sobre la actividad oxidativa bacteriana.
0,0E+00
1,0E-03
2,0E-03
3,0E-03
4,0E-03
5,0E-03
6,0E-03
7,0E-03
8,0E-03
9,0E-03
1,0E-02
2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0pH
[Fepp
t ], g
Sin Nutrientes
Medio Basal
0,0E+00
1,0E-03
2,0E-03
3,0E-03
4,0E-03
5,0E-03
6,0E-03
7,0E-03
8,0E-03
9,0E-03
1,0E-02
2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0pH
[Fepp
t ], g
Sin Nutrientes
Medio Basal
Figura 3.12. Masa acumulada de
precipitados férricos, [Fe2+]inicial = 0,1 g/.
Figura 3.13. Masa acumulada de
precipitados férricos, [Fe2+]inicial = 1 g/l.
De acuerdo a las Figuras 3.10 y 3.11 se observa además que VMax en las
soluciones sin nutrientes es bastante menor que la obtenida a igual pH en
soluciones de medio basal. Esta es una evidencia de que la composición de los
precipitados férricos posee además una influencia en el efecto inhibitorio que ellos
poseen sobre la actividad oxidativa bacteriana. Como se demostró anteriormente
en este trabajo (Ver anexo F), cuando se utilizan soluciones libres de nutrientes el
ion férrico precipita solamente como hidróxido férrico (ver ecuación 10), mientras
que en soluciones de medio basal el ion férrico precipita en compuestos del tipo
jarositas (ver ecuación 11). En este sentido, los resultados muestran que la
formación de hidróxidos posee una influencia inhibitoria más fuerte que las
jarositas sobre la actividad bacteriana. Esta conclusión es consistente con
propiedad bloqueadora que se atribuye a precipitados tipo gel, como los hidróxidos
férricos. Contrariamente, las jarositas son asociadas normalmente a estructuras
porosas y precipitados cristalinos.
102
Los comentarios anteriores merecen una discusión más profunda, al considerar
que en un medio libre de nutrientes el crecimiento disminuye notablemente (o
puede desaparecer). En consecuencia, aún cuando la oxidación de ion ferroso se
encuentre desacoplada del crecimiento, las velocidades de oxidación deben
necesariamente disminuir en el tiempo como resultado de la acumulación de ATP.
No es claro que para el caso de estas experiencias sea precisamente la falta de
nutrientes la que limite las velocidades de oxidación bacteriana. Más aún cuando
en experiencias reproducibles el uso de bajas concentraciones de ion ferroso (0,1
g/l) permite alcanzar altas velocidades durante el breve lapso de duración de las
experiencias (10 horas).
En la figura 3.14 se presenta el efecto de aumentar la concentración inicial de
bacterias sobre la velocidad máxima bacteriana de oxidación de ion ferroso, para
experiencias con 1,0 g/l de ion ferroso inicial en soluciones de medio basal. Se
observa que el aumento en el número de bacterias contribuye a aumentar la
velocidad máxima de oxidación. Este fenómeno puede ser atribuido a la dilución
de los precipitados en una mayor población bacteriana. Es decir, la cantidad de
precipitados de ion férrico formado por cada bacteria en solución es menor
mientras mayor sea el número de bacterias. Para realizar esta comparación se
considera la cantidad específica de precipitados por bacteria ( ][ pptspFe ), que se
calcula como:
celpptppt
sp NFeFe ][][ = (32)
Los cálculos de ][ pptspFe se pueden apreciar explícitamente en la figura 3.15.
103
0,0E+00
1,0E-06
2,0E-06
3,0E-06
2 3 4 5 6 7pH
Vm
ax,
g F
e/ (
hr c
el)
a
c
d b
Figura 3.14. Velocidad de
oxidación máxima. Soluciones
de medio basal con 1,0 g/l de
ferroso inicial. Curva a: 8 x 107
cel/ml, Curva b: 5 x 107 cel/ml,
Curva c: 2 x 107 cel/ml, Curva d:
8 x 106 cel/ml.
Figura 3.15. Razón masa de
precipitados / número de
bacterias, durante pruebas de
oxidación con 1,0 g/l de ion
ferroso inicial en medio basal.
Curva a: 8 x 107 cel/ml, Curva b:
5 x 107 cel/ml, Curva c: 2 x 107
cel/ml, Curva d: 8 x 106 cel/ml.
0,0E+00
1,0E-09
2,0E-09
3,0E-09
4,0E-09
5,0E-09
6,0E-09
3 4 5 6pH
[Fep
pt sp
], m
g/c
el
d
c
b
a
Al observar conjuntamente las Figuras 3.14 y 3.15 se observa que en aquellas
series de menor número de bacterias la cantidad de precipitados por cada bacteria
es mayor y simultáneamente la velocidad específica máxima de oxidación
bacteriana de ion ferroso, VMax, es inferior. Estas observaciones indican una
directa relación entre la masa de precipitados formados y la inhibición producida
en la actividad oxidativa bacteriana en la zona de pH estudiada. Las implicaciones
de este comportamiento en la cinética de oxidación serán integradas en los
modelos cinéticos que se presentan en el apartado correspondiente.
104
3.3. Caso III: Efecto del pH en el rendimiento del crecimiento bacteriano
entre pH 2,0 y 4,0.
En microorganismos autotróficos, como Acidithiobacillus ferrooxidans, es posible
desacoplar los procesos de oxidación y crecimiento celular. Sin embargo, la
adecuada interpretación de los resultados presentados en las secciones 3.1 y 3.2
requiere que ambos procesos estén relacionados, ya que de esa forma las
velocidades de oxidación evaluadas pueden ser atribuidas a procesos
permanentes que desarrolla el microorganismo. En caso contrario, cuando la
oxidación de ion ferroso no esta ligada a crecimiento celular (fijación de CO2), las
mediciones corresponden a fenómenos transitorios, que no pueden ser sostenidos
en el largo plazo y su explicación mecanística se vuelve difusa.
En esta sección se evalúa el rendimiento del crecimiento bacteriano en la
oxidación de ion ferroso con Acidithiobacillus ferrooxidans en el rango de pH 2,0 a
4,0. Para ello se realizaron mediciones de la razón entre el consumo de oxígeno
del microorganismo y el consumo de dióxido de carbono en experiencias batch a
pH controlado.
3.3.1 Evaluación de rendimiento
Para calcular el consumo de oxígeno en el reactor se consideran los flujos de gas
en la entrada, el flujo de gas en la salida y las concentraciones de oxígeno en
ambos flujos. El flujo de gas a la entrada es medido y controlado en 20 l/hr y el
flujo de gas en la salida es calculado como se explica a continuación. Suponiendo
que el flujo volumétrico de gas inerte (nitrógeno es constante en ambos flujos) se
establece la siguiente relación entre los flujos:
outout
inininGoutG COO
COOFF
][][1
][][1
22
22,, −−
−−×= (33)
105
donde FG,out es el flujo molar de gas a la salida del reactor, FG,in es el flujo molar de
gas a la entrada, [O2]out es la fracción molar de oxígeno en el gas de salida, [O2]in
es la fracción molar de oxígeno en el gas de entrada, [CO2]out es la fracción molar
de dióxido de carbono en la salida y [CO2]in es la fracción molar de dióxido de
carbono en el gas que ingresa al reactor.
Una vez conocidos los flujos de gas, la velocidad de consumo de oxígeno se
calcula con la siguiente expresión:
( )outoutGininGR
O OFOFV
r ][][1
2,2,2×−××=− (34)
donde VR es el volumen de líquido en el reactor. En forma equivalente se calcula
la velocidad de consumo de dióxido de carbono con la siguiente expresión:
( )outoutGininGR
CO COFCOFV
r ][][1
2,2,2×−××=− (35)
La Figura 3.16 presentan los resultados obtenidos en una experiencia batch de
oxidación de sulfato ferroso con Acidithiobacillus ferrooxidans manteniendo el pH
controlado en 2,0 (la información completa de los resultados obtenidos en estas
pruebas se encuentra en el Anexo H). Se puede apreciar que el potencial redox
crece en forma progresiva al transcurrir la experiencia en la medida que el ion
ferroso es oxidado. En este gráfico se observa además que inicialmente la
velocidad de consumo de oxígeno aumenta durante las primeras dos horas y
luego tiene un valor casi constante hasta que el Eh alcanza 0,7 V (SHE), para
luego disminuir en forma simultanea al aumento de Eh.
106
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0 5 10 15 20 25
tiempo, horas
-rO
2, (
mm
ole/
(l.hr
))
0,55
0,60
0,65
0,70
0,75
0,80
0,85
0,90
Eh,
V v
s S
HE
-rO2
redox
Figura 3.16.
Evolución de la velocidad de
consumo de oxígeno y potencial
redox en experiencia con pH = 2,0.
[Fe2+] inicial = 1,0 g/l.
En términos del modelo de actividad oxidativa presentado en la segunda parte, es
claro que un alto potencial redox tiene un efecto perjudicial en la velocidad de
oxidación, aún cuando existe una cantidad importante de ion ferroso disponible
(más de 0,1 g/l a las 18 horas). Esto se puede apreciar mejor al presentar los
resultados de la Figura 3.16 en función del Eh de la solución como se aprecia en
la Figura 3.17.
Figura 3.17.
Velocidad de consumo de oxígeno
en función del Eh, experiencia con
pH = 2,0.
[Fe2+] inicial = 1,0 g/l.
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,55 0,60 0,65 0,70 0,75 0,80 0,85 0,90
Eh, V vs SHE
-rO
2 (m
mol
O2.
l-1.
hr-1
)
107
En la Figura 3.18 se observa que la velocidad de consumo de dióxido de carbono
en esta experiencia se encuentra relacionada directamente con el proceso
oxidativo de ion ferroso y el consumo de oxígeno. En consecuencia el rendimiento
en el crecimiento, que se pude relacionar por la razón entre la fijación de carbono
y el consumo de oxígeno, se presenta prácticamente constante como se aprecia
en la Figura 3.19.
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0 10 20 30
tiempo, horas
-rO
2 (m
mol
O2.
l-1.h
r-1)
0,000
0,005
0,010
0,015
0,020
0,025
0,030
0,035
0,040
-rC
O2
(mm
olC
O2.
l-1.h
r-1)
-rO2
-rCO2
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16
0,18
0,20
0 5 10 15 20 25
tiempo, horas
-rC
O2
/ -rO
2
Figura 3.18.
Evolución de la velocidad de
consumo de oxígeno y dióxido de
carbono en experiencia con pH = 2,0
Figura 3.19
Razón entre velocidad de consumo
de dióxido de carbono y oxígeno en
experiencia con pH = 2,0
En forma similar a los resultados obtenidos con pH 2,0, en los otros casos también
se aprecia una correlación entre la velocidad de consumo de dióxido de carbono y
oxígeno en cada serie experimental. En las Figuras 3.20 y 3.21 se presente el
caso de la experiencia realizada a pH 4,0. A pesar de que las velocidades de
oxidación son mucho menores que las obtenidas a menor pH, la fijación de CO2 se
mantiene acoplada con el proceso oxidativo y más aún la razón promedio de las
velocidades de consumo de dióxido de carbono y oxígeno es similar a la obtenida
en otros pH.
108
En la figura 3.22 se presenta el valor representativo de los coeficientes de
rendimiento en la fijación de carbono (moles de carbono fijado / moles de oxígeno
utilizados) en función del pH de la experiencia. Este valor corresponde a la razón
entre el consumo total de dióxido de carbono,∫ dtrCO2, y el consumo total de
oxígeno,∫ dtrO2. En este cálculo no se han considerado aquellas zonas de algunas
experiencias donde el consumo de CO2 no existe, ya que el origen de estas
irregularidades no es claro y merece mayor discusión (ver detalles de los
resultados en Anexo H).
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0 10 20 30 40 50
tiempo, horas
-rO
2 (m
mol
O2.
l-1.h
r-1)
0,000
0,005
0,010
0,015
0,020
0,025
0,030
0,035
0,040
-rC
O2
(mm
olC
O2.
l-1.h
r-1)
-rO2
-rCO2
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16
0,18
0,20
0 10 20 30 40 50
tiempo, horas
-rC
O2
/ -r
O2
Figura 3.20.
Evolución de la velocidad de
consumo de oxígeno y dióxido de
carbono en experiencia con pH = 4,0
Figura 3.21.
Razón entre velocidad de consumo
de dióxido de carbono y oxígeno en
experiencia con pH = 4,0
Se puede apreciar que no existe una importante variación de la razón
∫∫ dtrdtr OCO 22en las experiencias distinto pH, lo que indica que la fijación de CO2
siempre se mantiene acoplada al proceso oxidativo. En consecuencia, se puede
concluir que en este rango de pH, la oxidación bacteriana de ion ferroso está
directamente ligada a crecimiento bacteriano.
109
Figura 3.22.
Razón entre velocidad de consumo
de dióxido de carbono y oxígeno
promedio en función del pH de cada
experiencia.
0,00
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
0,07
0,08
0,09
0,10
1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5
pH
-rC
O2
/ -r
O2
Adicionalmente se observa que el valor promedio del rendimiento observado en
estas experiencias, Y = 0,057 mol C / mol O2, es cercano a otros valores
reportados con anterioridad con otras cepas de Acidithiobacillus ferrooxidans. Por
ejemplo Boon (1996) reporta YMax = 0,051 mol C / mol O2.
3.3.2 Discusión
Considerando el esquema presentado en la Figura 2.9 de la primera parte se
puede concluir que la translocación de protones asociada a la oxidación de ion
ferroso en la cadena de transporte directo, será siempre suficiente para soportar el
transporte reverso necesario para la fijación de CO2 con independencia del pH que
exista en el entorno en el rango de pH estudiado. Por otro lado la formación de
abundantes precipitados en la zona de alto pH (sobre 2.5) libera protones
directamente sobre la superficie de la bacteria, esta mayor presencia de ácido
puede formar un microclima entre los precipitados y la bacteria permitiendo que
localmente el pH sea siempre menor, con lo cual la bacteria no siente en forma
directa la disminución de ácido disponible en su entorno. En cualquiera de los
casos presentados la evidencia indica crecimiento bacteriano en todo el rango de
pH analizado, manteniendo un rendimiento constante.
110
4 EFECTO DEL pH, EL MODELO.
En la sección 3.2 se mostró que en el rango de pH 2,5 a 5,0 existe actividad
bacteriana y ella se encuentra influenciada por la concentración de ácido
disponible. Por otro lado en el apartado 3.1 se ha presentado un modelo que
permite describir el efecto en el cambio de pH para el rango entre pH 1,3 y 2,0.
Finalmente en la sección 3.3 se muestra que la actividad oxidativa en rango de pH
2,0 a 4,0 esta asociada a crecimiento bacteriano y por lo tanto es sostenible en el
tiempo. Es razonable entonces asociar la oxidación de ion ferroso en este rango
de pH con actividad bacteriana y tiene sentido buscar un modelo cinético que
describa el comportamiento de dicha actividad.
El objetivo de esta sección será desarrollar una expresión cinética unificada que
describa adecuadamente el efecto del pH sobre la velocidad de oxidación
bacteriana de ion ferroso en todo el rango de pH en que Acidithiobacillus
ferrooxidans muestra actividad oxidativa, 1,3 – 5,0.
De acuerdo a los conceptos presentados en la sección 2.2 de la primera parte, se
sabe que altos valores de pH pueden afectar el proceso oxidativo de dos formas.
En un caso se limita la velocidad con que ocurre la síntesis de ATP, ya que no se
dispone de una cantidad suficiente de protones; y en el segundo caso es afectado
el transporte reverso de electrones que utiliza la diferencia de pH a través de la
membrana citoplasmática como fuerza motriz. En adición a estos elementos, la
presencia de bajas concentraciones de protones puede producir que el transporte
de protones desde la solución sea el proceso limitante en la cinética de oxidación.
Es decir, la oxidación de ion ferroso puede llegar a ser limitada por la difusión de
protones desde el seno de la solución hasta la membrana plasmática.
De acuerdo a la complejidad del escenario, no es posible plantear un modelo
sencillo que describa la cinética del proceso. Por lo tanto, se utilizará un enfoque
111
semi-empírico para obtener una expresión cinética de oxidación de ion ferroso que
incluya los rangos de altos pH.
La Figuras 3.14 y 3.15 de la sección 3.2 sugieren claramente que la formación de
precipitados férricos juega un rol importante en la disminución de la actividad
oxidativa del microorganismo. Para comprender, a lo menos en parte, la acción de
estos precipitados sobre la cinética de oxidación a continuación se propone un
modelo simple que es luego probado. Si se supone que una parte importante de
los precipitados de hierro formados permanecen sobre la superficie de la bacteria
formando una capa compacta, Vmax se puede expresar en términos de un
mecanismo de control cinético mixto. Este mecanismo incluye una resistencia
asociada a la reacción química y una resistencia relacionada a la difusión de
reactivos hacia la célula (Levenspiel, 1962). La cinética de la reacción química
esta relacionada al proceso de oxidación de ion ferroso y puede ser expresado
como Vquim; el proceso difusional puede ser relacionado a la difusión de protones a
través de la capa de precipitados férricos formados sobre la bacteria. De esta
forma, Vmax puede ser expresado de la siguiente forma:
xkV
Vquim
max ∆×+=
1 (36)
donde ∆x representa el espesor de la capa de precipitados y k es una constante
proporcional a la razón entre las constantes difusionales y cinéticas. La validez del
modelo expuesto fue comprobada utilizando las curvas b, c y d de la Figura 3.14,
como función de la concentración específica de precipitados formados en cada
caso ( ][ pptspFe en Figura 3.15). Los valores de Vmax en la curva a de la Figura 3.14
(la experiencia con menor concentración específica de precipitados y mayor
población de bacterias) son utilizados como pseudo-Vchem ( chempsV ). Usando como
referencia la expresión (36), se calcularon valores de calcmaxV vs pH utilizando la
siguiente expresión:
112
]['1 pptsp
quimpscalc
max Fek
VV
×+= (37)
Los valores de k’ son ajustados en cada caso de modo que el valor máximo de
calcmaxV en cada curva sea igual al valor al más alto valor de Vmax en la Figura 3.14.
Los valores de calcmaxV calculados con este procedimiento se muestran en la Figura
4.1: las curvas b, c y d corresponden a la modelación de las curvas b, c y d de la
Figura 3.14; la curva a simplemente reproduce la curva a de la Figura 3.14, y es
incluida como referencia.
0,0E+00
1,0E-06
2,0E-06
3,0E-06
2 3 4 5 6 7
pH
Vm
axca
lc
a
d
b
c
Figura 4.1.
Valores de calcmaxV en función del pH.
Curva a: 8 x 107 cel/ml, Curva b: 5
x 107 cel/ml, Curva c: 2 x 107
cel/ml, Curva d: 8 x 106 cel/ml.
Los resultados en la Figura 4.1 muestran que las curvas calculadas reproducen
bastante bien las tendencias de las curvas Vmax – pH en la Figura 3.14.
Adicionalmente, se observa que los más altos valores de Vmax en cada curva se
encuentran en valores de pH muy cercanos a los experimentales. Sin embargo,
los valores de k’ calculados en cada curva son distintos, resultando: 2x107 para
curva b, 1,2x108 para curva c, y 1,2x109 para la curva c. Esta diferencia puede ser
atribuida, en principio, a variaciones en la fracción de precipitados que
efectivamente se depositan sobre la bacteria, espesores no uniformes en las
películas formadas o bien, a variaciones en la permeabilidad de estas películas.
113
Los resultados del modelo propuesto muestran que la disminución en la actividad
oxidativa observada a pH sobre 2,5 esta relacionada con la formación de películas
de precipitados férricos, los cuales disminuyen la velocidad de difusión de
protones hacia la célula. Sin embargo, como también fue mostrado claramente de
los resultados de la sección 3.2, la cinética de oxidación de ion ferroso a pH sobre
2,5 depende fundamentalmente de la concentración de ácido en solución.
La oxidación bacteriana de ion ferroso utiliza como sustrato ion ferroso, oxígeno y
protones. En las experiencias realizadas, para el rango de pH analizado se estima
que el sustrato limitante es el protón. La forma más simple de modelar le cinética
de oxidación es una expresión de tipo Monod con protones como sustrato
limitante, como la siguiente:
][1 1
0
++
=
HK
VV
H
maxmax (38)
donde 0maxV es el valor de Vmax máximo, es decir, cuando deja de limitar la
concentración de ácido; y KH1 es la constante de afinidad con los protones.
Para determinar los parámetros de esta ecuación en nuestras experiencias se
debe descontar previamente el efecto de la formación de precipitados férricos. En
términos de la ecuación (36), es necesario contar con los valores de Vquim vs pH.
Como no es posible determinar estos valores con la información disponible, se
utilizaran nuevamente los valores de chempsV , es decir, la curva a de la Figura 3.14.
Hacia el final de esta experiencia, para valores de pH menor que 3,0 es evidente
que se manifiesta un efecto de los precipitados, por lo tanto para el ajuste de
parámetros se considera solamente la zona de pH 3,0 – 5,0.
114
En la Figura 4.2 se presenta el resultado del ajuste de parámetros realizado. Los
puntos en color azul corresponden a los valores de Vmax para esta serie
experimental, y la línea continua (rojo) representa el modelo de la expresión (38)
con los parámetros ajustados de la tabla 4.1.
0,0E+00
5,0E-07
1,0E-06
1,5E-06
2,0E-06
2,5E-06
3,0E-06
3,5E-06
4,0E-06
0,0E+00 5,0E-04 1,0E-03 1,5E-03 2,0E-03
[H+], M
Vm
ax,
g F
e/(h
r ce
l)
Figura 4.2.
VMax vs [H+]. Serie experimental
con 1,0 g/l de ion ferroso inicial
en medio basal y 8x107 cel/ml.
En color azul, datos
experimentales; en rojo modelo
ajustado ec. (38).
Tabla 4.1: Parámetros ajustados de ecuación (38)
Parámetro Valor
Vm0 4,22 x 10-6 [µg Fe/ (hr cel)]
KH1 3,99 x 10-4 [mol / l]
En la sección 3.1 se muestra que para valores de pH menores a 2,5, VMax
permanece constante. De esta forma los valores de VMax obtenidos en la sección
3.1 y en la sección 3 de la segunda parte, pueden ser comparados con los
obtenidos de este análisis. El valor de velocidad máxima (independiente del pH),
Vm0 obtenida resulta ser similar (un poco mayor) a los valores obtenidos en otras
secciones de este trabajo de tesis utilizando la misma cepa de microorganismos,
lo cual valida estos resultados del ajuste de datos y de cierta forma la metodología
experimental utilizada.
115
De igual forma considerando la coherencia de la información es posible integrar el
modelo de la ecuación (38) con el modelo de la ecuación (37) y la expresión (6),
obteniéndose una expresión que integra la influencia de la acidez y de la
formación de precipitados, en el rango de pH 1,3 – 5,0, sobre la actividad
oxidativa bacteriana de ion ferroso con Acidithiobacillus ferrooxidans. La expresión
obtenida es:
( ) ( )
+×+
+××
+××+
=
+
+
+
+
+
+
1][
][
][
][1
][1]['1
2
3
211
0
2
FeFe
KFe
HKK
H
KFek
VV
IHHppt
sp
maxFe
(39)
Los valores sugeridos de acuerdo a la información experimental para los distintos
parámetros de esta expresión cinética se presentan en la Tabla 4.2.
Tabla 4.2. Valor de parámetros para expresión cinética (39).
Parámetro Valor
0maxV 4,22 * 10-6 [µg Fe/ (hr cel)]
K1 0,015 [g/l]
KI 0,641 [ - ]
KH 438,1 [l / mol]
KH1 3,99 * 10-4 [mol / l]
En la expresión (39) se considera el efecto de los precipitados, aunque el valor
que se debe utilizar para el parámetro k’ depende de la población de bacterias en
solución. En el ejercicio que se presenta a continuación se considera un valor bajo
(1x107 cel/mg Fe).
Para ilustrar como varía la actividad oxidativa del microorganismo en función del
pH se realizó el siguiente calculo. Se considera una concentración constante de
ion ferroso (1 g/l) y una cantidad inicial de ion férrico (0 g/l, 0,5 g/l, 3,0 g/l) con una
población de 2x107 cel/ml.
116
La solubilidad de ion férrico cambia en función del pH, en consecuencia en los
cálculos se considera la curva de equilibrio presentada en la Figura F.11 del anexo
F. Para cada valor de pH se evalúa la solubilidad, y se considera que el exceso de
férrico se encuentra precipitado de acuerdo a la curva de pseudo equilibrio. El
resultado de los cálculos se presenta en la Figura 4.3.
0,0E+00
5,0E-07
1,0E-06
1,5E-06
2,0E-06
2,5E-06
3,0E-06
3,5E-06
4,0E-06
1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0
pH
VF
e2+
, µg
Fe/
(hr
cel)
[Fe3+] = 0,0 g/l
[Fe3+] = 0,5 g/l
[Fe3+] = 3,0 g/l
Figura 4.3.
+2FeV vs pH calculada según
expresión (39). Se consideran
distintas concentraciones de
férrico total y precipitación de
acuerdo a Figura F.11.
Concentración de ion ferroso
1,0 g/l.
En la Figura 4.3 se observa en negro la curva asociada al caso donde no existe
ion férrico presenta. En esta situación se anulan en la expresión (39) los términos
asociados a la acción del ion férrico y a los precipitados de hierro. En
consecuencia, esta curva representa una situación ideal donde la velocidad sólo
depende de la concentración de protones, es decir, la máxima velocidad esperable
en cada valor de pH. Las curvas con presencia de ion férrico muestran valores
menores para cada pH, lo cual muestra como les mediciones de velocidad se
pueden ver afectadas por la presencia de ion férrico y precipitados de hierro. En la
curva azul (3,0 g/l de férrico total y la mayor cantidad de precipitados por bacteria),
se aprecia que entre pH 1,8 y 3,0 la velocidad de oxidación prácticamente no varía
con la concentración de ácido. Esto se debe a que la acción inhibitoria del ion
férrico a bajos valores de pH, es reemplazada luego por la acción inhibitoria de los
precipitados presentes al aumentar el pH. Esta observación explica los
comportamientos observados en reactores o sistemas continuos, donde la
formación de precipitados es siempre importante.
117
Por otro lado se observa, que el pico en las curvas de velocidad de oxidación se
desplaza hacia la izquierda al aumentar la concentración de ion férrico presente.
Esto se explica por la formación de precipitados a menores valores de pH al
aumentar la disponibilidad de ion férrico, lo cual impide que se alcancen mayores
velocidades al aumentar el pH.
Finalmente, utilizando la misma expresión (39) se ha modificado la concentración
de ion ferroso presente, manteniendo concentración de ion férrico total igual a
cero. Los resultados se encuentran en la Figura 4.4.
0,0E+00
5,0E-07
1,0E-06
1,5E-06
2,0E-06
2,5E-06
3,0E-06
3,5E-06
4,0E-06
1,0 3,0 5,0 7,0
pH
VFe
2+
, g
Fe/
(hr
cel)
[Fe2+] = 0,3 g/l
[Fe2+] = 1,0 g/l
[Fe2+] = 3,0 g/l
Figura 4.4.
+2FeV vs pH calculada según
expresión (39). Se consideran
distintas concentraciones de
ion ferroso y férrico total cero.
En la Figura 4.4 se observa que al disminuir la concentración de ion ferroso
disponible se produce un desplazamiento del pico de la curva hacia valores más
básicos. Encontrándose que el máximo de la curva se alcanza a pH cercano a 3,0
cuando la concentración de hierro es suficientemente baja (0,01 g/l). Además de
acuerdo a esta figura se observa que es posible mantener importantes
velocidades de oxidación de ion ferroso en el rango de pH 2,0 – 3,0 si la
concentración de ion férrico presente se mantiene siempre suficientemente baja.
118
5 CONCLUSIONES
Las mediciones de velocidad de oxidación bacteriana de ion ferroso con
Acidithiobacillus ferrooxidans en el rango de pH 1,3 – 2,5 indican que al aumentar
la concentración de ácido en el sistema se produce una importante disminución de
la actividad oxidativa. El análisis de los datos muestra que la oxidación es descrita
en forma adecuada por una expresión del tipo Monod donde el parámetro KS
depende de la concentración de ácido en solución y el parámetro VMax es
constante. La constante de afinidad disminuye linealmente con el aumento de
acidez, es decir, la disminución en las velocidades de oxidación puede ser
explicada por un mecanismo de inhibición competitiva por protones.
Se realizaron mediciones de velocidad de oxidación de ion ferroso con
Acidithiobacillus ferrooxidans en el rango de pH 2,5 – 7,0. De los resultados se
desprende que la metodología permite estimar en forma adecuada la actividad
oxidativa bacteria en el rango de pH de 2,5 a 5,0, lo cual no es posible lograr con
otras metodologías convencionales.
Se encontró que a valores de pH sobre 5,0 la oxidación bacteriana de ion ferroso
es despreciable y predomina el proceso de oxidación química. Además se pudo
mostrar que la formación de precipitados de ion férrico tiene un rol importante en
la disminución de la actividad oxidativa bacteriana a pH sobre 2,5. Sin perjuicio de
lo anterior se encontró que a pH sobre 2,5 la disminución de las velocidades de
oxidación esta principalmente controlada por la disminución en la concentración de
protones en solución.
La medición del rendimiento en el crecimiento para la oxidación de ion ferroso en
el rango de pH 2,0 a 4,0 demostró que en este rango de pH los valores no
cambian en forma importante. Esto indica que el proceso oxidativo se encuentra
acoplado a la fijación de CO2 en el rango de pH analizado, es decir, la oxidación
de ion ferroso está directamente ligada a síntesis de biomasa.
119
Utilizando la información experimental de ambos rangos de pH analizados, se ha
formulado una expresión cinética que permite describir en forma adecuada la
influencia de la concentración de ácido sobre la velocidad de oxidación bacteriana
de ion ferroso en todo el rango donde la bacteria presenta actividad oxidativa
(hasta pH 5,0). El uso de esta expresión para describir experiencias realizadas con
distinta razón masa de precipitados / número de bacterias permitió mostrar como
un adecuado control de la concentración de hierro (y formación de precipitados)
resulta en un efectivo mejoramiento de la actividad oxidativa bacteriana de ion
ferroso con Acidithiobacillus ferrooxidans.
120
CUARTA PARTE:BIOOXIDACIÓN INDIRECTA DE CLORURO FERROSO ENUNA CELDA ELECTROQUÍMICA
1 INTRODUCCIÓN
Los microorganismos presentes en los procesos de biolixiviación, si bien
presentan resistencias relativamente altas a la mayoría de los cationes metálicos
(sección 2.3.5, primera parte), son sensibles a la presencia de algunos iones y en
particular requieren la presencia de sulfato para realizar sus procesos de oxidación
y crecimiento. En la lixiviación de minerales en pilas, botaderos o reactores, de
acuerdo a la composición del mineral y su ganga, resulta inevitable la aparición de
especies disueltas especialmente tóxicas para el desarrollo de las bacterias y
microorganismos oxidantes de fierro y azufre. Es ampliamente reconocido que la
presencia de altas concentraciones de cloruros, arsénico, mercurio y otras
especias no permite el desarrollo de las bacterias de nuestro interés. Como la
disolución de estas especies es simultanea a los metales de interés, resulta difícil
controlar la composición de la solución para asegurar altos niveles de actividad
bacteriana y se deben estudiar alternativas tecnológicas que puedan resolver este
problema. En esta sección se analiza el comportamiento de un original diseño de
reactor bioelectroquímico para la biooxidación indirecta de ion ferroso en
soluciones que inhiben la acción oxidativa bacteriana.
121
2 MATERIALES Y MÉTODOS
En estas experiencias se utiliza una celda electroquímica de dos compartimentos
separados por una membrana de intercambio catiónica Nafion. La celda opera
como una celda combustible, es decir se produce una espontánea transferencia
de carga motivada por la diferencia de potencial establecida entre los dos
compartimentos conectados por un circuito eléctrico externo. De esta forma es
posible transferir el poder oxidativo de un cultivo bacteriano en adecuadas
condiciones de crecimiento a una solución que posee una composición
inadecuada para la actividad oxidativa bacteriana.
2.0.1 Cultivo de bacterias
Se utiliza la cepa de Acidithiobacillus ferrooxidans ATCC 19859 en este estudio.
La bacteria fue crecida en un medio de nutrientes conteniendo 1,5 g/l de ion
ferroso (como sulfato ferroso), 0,4 g/l MgSO4⋅H2O, 0,4 g/l (NH4SO4)2 y 0,056 g/l
K2HPO4⋅H2O en agua destilada. El pH inicial del cultivo es ajustado en 1,6
utilizando ácido sulfúrico.
2.0.2 Celda electroquímica
La celda electroquímica, cuyo montaje se presenta en la Figura 2.1, esta
construida en Pyrex y posee dos compartimentos separados por una membrana
de intercambio iónico catiónica Nafion 117 de 1 cm2. En cada compartimento se
coloca un disco de platino de área 95 mm2 utilizados como electrodos (F y G).
Estos electrodos son cortocircuitados externamente a través de una cable de
cobre (H). El compartimento catódico (B) es burbujeado por aire a baja presión y
agitado utilizando una agitador magnético. La celda completa es mantenida a 30 ±
1 ºC colocándola en un baño termostático de agua. La composición y volúmenes
de las soluciones utilizadas dependen de los modos de operación de la celda y se
describe luego.
122
AIR
V
D
D
E
C
B
G
F
A
H H
Figura 2.1: Esquema del montaje utilizado en experiencias de biooxidación
indirecta.
2.1 Experiencias con cambio de anolito
2.1.1 Preparación de soluciones
De acuerdo con el procedimiento descrito en 2.0.1 se preparan tres matraces de
cultivo de bacterias. Se toman 210 ml de la solución obtenida y se dispone como
catolito. En esta solución típicamente se encuentran 108 bacterias/ml, con un pH
de 2,2.
Como anolito se utilizan 15 ml de disolución de cloruro ferroso. Esta disolución es
preparada disolviendo 1,6 g/l de ion ferroso (como cloruro ferroso) en agua
destilada, el pH de la disolución se ajusta en 1,5 utilizando ácido clorhídrico. Todos
los reactivos utilizados son de grado analítico.
123
2.1.2 Procedimiento
Una vez dispuestas las soluciones en los respectivos compartimentos, se cierra el
circuito al conectar eléctricamente ambos electrodos. Al comenzar la transferencia
de carga se registra en forma periódica el Eh medido en ambas soluciones
utilizando un electrodo combinado de platino Cole-Palmer 5990-57. Asimismo se
tomas muestras para analizar la variación en el número de bacterias en el tiempo.
El contenido del compartimento anódico es reemplazado después de un máximo
de 72 horas de operación, para aumentar la fuerza motriz de la transferencia de
carga.
Las experiencias fueron desarrolladas en duplicado.
2.2 Experiencias con recirculación de anolito
2.2.1 Preparación de soluciones
De acuerdo con el procedimiento descrito en 2.0.1 se preparan tres matraces de
cultivo de bacterias. Se toman 210 ml de la solución obtenida y se dispone como
catolito. En esta solución típicamente se encuentran 108 bacterias/ml, con un pH
de 2,2.
Como anolito se utilizan 400 ml de disolución de cloruro ferroso. Esta disolución es
preparada disolviendo 1,6 g/l de ion ferroso (como cloruro ferroso) en agua
destilada, el pH de la disolución se ajusta en 1,5 utilizando ácido clorhídrico.
2.2.2 Procedimiento
La solución de cloruro ferroso es continuamente recirculada entre el
compartimento anódico y el estanque (E) utilizando un sistema de bombas
peristálticas (D). De esta forma se mantiene un volumen de anolito muy superior al
124
disponible en el compartimento anódico y no es necesario el recambio de la
solución. Utilizando un sistema de adquisición de datos se registra en forma
continua el potencial de ambos compartimentos y periódicamente se toman
muestras para recuento de la población bacteriana y análisis de la composición de
las soluciones.
Se desarrollaron tres series experimentales en las condiciones y sus resultados se
utilizan para describir el rendimiento en el crecimiento bacteriano para la
biooxidación indirecta.
3 RESULTADOS Y DISCUSIÓN
3.1 Experiencias con cambio de anolito
La Figura 3.1 muestra la evolución del Eh en la semi-celda de FeCl2 y el Eh en la
semi-celda de Fe2(SO4)3 con bacterias, en el tiempo. Cada curva de Eh para el
compartimento de FeCl2 corresponde a recambios de solución en el
compartimento anódico. Se observa que el Eh de este compartimento aumenta
rápidamente, registrándose una variación desde 0,580 V (SHE) hasta 0,700 V
(SHE) en aproximadamente 60 horas, en cada uno de los recambios. El Eh en el
compartimento catódico con bacterias se mantiene en el rango de los 0,810 V
(SHE), lo cual indica que la capacidad oxidativa bacteriana fue siempre suficiente
para contrarrestar el consumo de Fe3+ por transferencia de carga al compartimento
anódico.
125
0,55
0,60
0,65
0,70
0,75
0,80
0,85
0,90
0 20 40 60 80 100 120 140 160
Tiempo [Horas]
Eh V
v/s
SHE
Eh Solucion Cl- Eh Solución SO4
Figura 3.1: Potenciales redox en
las semi-celdas para la operación
celda bioelectroquímica con
recambio de anolito.
Paralelamente se midió la velocidad de oxidación natural y bacteriana, para una
solución de cloruro ferroso similar, en frascos agitados a 30°C. A esta solución se
adicionaron nutrientes en el caso bacteriano. Se comprobó que en 60 horas la
oxidación fué sustancialmente menor que en el caso del reactor bioelectroquímico,
lograndose un aumento hasta 0,604 V (SHE) en al caso de oxidación natural con
aire y hasta 0,611 V (SHE) en el caso bacteriano.
Los resultados de esta experiencia indican que en este reactor el ion ferroso esta
siendo efectivamante oxidado por acción indirecta de las bacterias activas en el
compartimento catódico. Sin embargo dada la pequeña cantidad de solución de
cloruro ferroso que es oxidada cada vez, no se detectan variaciones medible en el
número de bacterias presentes en el compartimento catódico.
Para comprobar si el proceso oxidativo indirecto es capaz de sustentar crecimiento
bacteriano, debemos operar la celda con un aumento importante en la
disponibilidad de cloruro ferroso. Esto se puede lograr al recircular el anolito desde
la celda a un estanque como se muestra en la siguiente experiencia.
126
3.2 Experiencias con recirculación de anolito
Se midio la variación de la concentración de ion ferroso en el compartimento
anódico y el aumento de la población bacteriana en el compartimento catódico, en
el tiempo.
Para obtener la masa neta de ion ferroso oxidado por las bacterias es necesario
considerar las variaciones concentración de ion ferroso en el compatimiento
catódico y la transferencia de carga hacia el compartimento anódico, que se
origina en el desbalance de potenciales electroquímicos en ambos
compartimientos. Considerando los balance de masa para el ion ferroso en ambos
compartimientos se obtienen las siguientes expresiones:
Compartimento Catódico aCdeciaTransferenBacterianaOxidacionc
VVt
Fearg___
2
−=
∆
∆ +
(1)
Compartimento Anódico aCdeiaTransfereca
Vt
Fearg__
2
=
∆
∆ +
(2)
Combinando ambas expresiones de puede despejar la velocidad de oxidación
bacteriana neta, como se refleja en la ecuación:
BacterianaOxidacionac
Vt
Fet
Fe_
22
=
∆
∆+
∆
∆ ++
(3)
En forma integral la ecuación (3) indica que el ion ferroso oxidado bacterialmente
es igual a la suma de las variación de concentración por el volumen en cada
sección. La Figura 3.2 muestra el aumento en la población bacteriana obtenida
como función del ion ferroso total oxidado para tres experimentos a distinta
población inicial de bacterias, el detalle de los resultados tabulados se puede
encontrar en el Anexo I.
127
1,0E+05
1,0E+06
1,0E+07
1,0E+08
1,0E-02 1,0E-01Ion Ferroso Total Oxidado, g
Cre
cim
ient
o de
Bac
teria
s, c
el/m
l
Figura 3.2: Crecimiento
bacteriano, de acuerdo a
oxidación indirecta en reactor
bioelectroquimico versus ion
ferroso total oxidado en la celda.
De esta forma queda claramente establecido que las bacterias en el
compartimento catódico crecen ligadas a la oxidación de ion ferroso en el
compartimento anódico. El rendimiento de biomasa promedio de estos
experimentos es Y = 8,34 x 104 cel/µg de Fe2+ ( 4,66 x 109 cel/mmol de Fe2+), que
es similar a los valores obtenidos por Harvey y Crundwell (1997) de 8,4 x 104
cel/µg de Fe2+, Taya et al. (1991) de 2,5 x 104 cel/µg de Fe2+ o los valores
mencionados por Pronk y Johnson (1993) del orden de 5,4 x 104 cel/µg de Fe2+.
El diseño de celda presentado en este trabajo es especialmente interesante, ya
que presenta una alternativa para la biooxidación indirecta de ion ferroso en
soluciones de composición inhibitoria para la actividad oxidativa bacteriana. El uso
industrial de esta celda permitiría el beneficio de minerales realizando lixiviación
bacteriana indirecta con agua de mar o bien el trtamiento de minerales con alto
contenido de arsénico o alta fuerza ionica.
Por otro lado el uso de esta celda permitiría procesos de lixiviación a potencial
controlado, ya que se puede controlar en forma simple el traspaso de carga a las
soluciones de lixiviación desde al cultivo bacteriano. Esta alternativa es atractiva
ya que se ha encontrado que algunos sulfuros metálicos poseen potenciales
óptimos de disolución (Hiroyoshi et al., 2000) que no siempre son muy altos y
128
resultaría rentable controlar la actividad oxidativa bacteriana para no superar estos
valores.
4 CONCLUSIONES
Utilizando una celda electroquímica de dos compartimentos separados por una
membrana de intercambio catiónica se ha encontrado que una población de
Acidithiobacillus ferrooxidans es capaz de soportar durante un tiempo prolongado
la oxidación indirecta de cloruro ferroso, el cual es incapaz de oxidar en forma
directa. De igual forma se comprobó que este proceso oxidativo indirecto es capaz
de sustentar el crecimiento de la población de bacterias a un ritmo similar al
encontrado en soluciones de medio basal. El rendimiento en el crecimiento de
estos experimentos es Y = 8,34 x 104 cel / µg Fe.
129
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140
ANEXO AINFLUENCIA DEL OXÍGENO EN LAS MEDICIONES DE Eh
Se desarrollaron experiencias para determinar la influencia de la concentración de
oxígeno disuelto sobre el Eh de una mezcla de soluciones de sulfato férrico y
sulfato ferroso. Estas experiencias tiene por objeto comprobar la validez del
procedimiento utilizado en la estimación de la velocidad de oxidación bacteriana
de ion ferroso a pH sobre 2,5. Como se ha destacado con anterioridad el cálculo
de las velocidades de oxidación se realiza considerando las variaciones de Eh y
pH que se producen el sistema, y en consecuencia es importante comprobar que
las variaciones de Eh de la solución sólo están asociadas a variaciones en la
razón férrico/ferroso para el sistema en estudio. Este punto tiene especial
relevancia para poder comparar experiencias donde la velocidad de oxidación es
notablemente distinta y en consecuencia se puede esperar diferencias en la
concentración de oxígeno disuelto disponible en solución. La situación descrita se
produce, por ejemplo, cuando se dispone en solución de números de bacterias
distintos, o bien cuando se cambia en forma importante el pH.
Las pruebas se dividieron en dos partes. En la primera de ellas se evaluará la
variación en la disponibilidad de oxígeno disuelto al cambiar la población
bacteriana en la oxidación de sulfato ferroso. En la segunda etapa se verificará la
influencia de la concentración de oxígeno disuelto en el Eh que es medido en
soluciones que contienen sulfato férrico y sulfato ferroso.
Cultivo de bacteriasSe utilizó una cepa pura de Acidithiobacillus ferrooxidans (ATCC 19859). El cultivo
de las bacterias se efectuó en matraces Erlenmeyer de 250 ml, utilizando 100 ml
de medio basal de composición similar a la propuesta por Touvinen and Kelly
(1973), y que se presenta en la Tabla 2.1 de la segunda parte.
141
El procedimiento de cultivo se describe en detalle en la sección 2.1 de la segunda
parte de esta tesis.
ProcedimientoLas experiencias se desarrollan en una celda de vidrio pyrex termostatizada con
agua a 30 ± 0,5 ºC. La celda contiene 100 ml de la solución de prueba y en ella se
colocan un electrodo combinado de pH Sensorex S201C, un electrodo combinado
de Eh Cole-Palmer 5990-57 y un electrodo de oxígeno. Estos electrodos se
encuentran conectados a un sistema de adquisición de datos Opto 22, que registra
las variaciones de O2 disuelto, pH y Eh en el tiempo. Para evitar el cortocircuito de
las distintas señales, solo se conecta eléctricamente la referencia del electrodo de
pH y los distintos potenciales (pH y Eh y O2 disuelto) son referidos a él. La
solución en la celda es agitada con un agitador magnético.
La solución de trabajo se prepara con 100 ml de medio de nutrientes a pH 1,8
donde se agregan alicuotas de soluciones concentradas de sulfato férrico y sulfato
ferroso para alcanzar las concentraciones esperadas en cada experiencia.
Etapa 1: [O2] versus Nº de bacterias en solución.En estas experiencias se agrega sulfato ferroso a la solución de trabajo hasta
alcanzar una concentración de 1 g/l. La solución resultante es burbujeada con
nitrógeno durante un mínimo de 30 minutos y luego es agregada una alicuota del
inoculo de bacterias para alcanzar una concentración en solución de 5 x 106
células/ml. Superadas estas etapas se cambia manualmente el burbujeo de
nitrógeno a aire para enriquecer en oxígeno la solución y comenzar el proceso de
oxidación. Esta condición se mantiene durante un mínimo de 30 minutos
almacenando las lecturas de [O2] disuelto, pH y Eh de la solución. Posteriormente
se adiciona una nueva cantidad de bacterias a la solución para alcanzar una
concentración de 1 x 108 bacterias/ml. Se registran las variaciones durante otros
30 minutos y luego se cambia la concentración de microorganismos hasta 3 x 108
bacterias/ml De esta forma se cubre con amplitud el rango de trabajo de las
142
experiencias presentadas en la tercera parte de esta tesis y es posible comprobar
las variaciones en la concentración de oxígeno disuelto en las condiciones
utilizadas. Las experiencias fueron desarrolladas en duplicado y sus resultados se
presentan en las Figuras A.1 y A.2.
En las Figuras A.1 y A.2 las zonas 1, 2 y 3 corresponden a las distintas
concentraciones de microorganismos utilizadas en las experiencias. De acuerdo a
los resultados obtenidos se puede afirmar que cuando se utiliza una baja
concentración de microorganismos (5 x106 bac/ml) la concentración de oxígeno
disuelto (7,4 mg/l, 97% de la saturación) no difiere en forma importante de la
concentración de saturación para esta solución, temperatura y presión de
operación (7,6 mg/l, valor obtenido en forma independiente). En cambio al
aumentar la concentración de células en solución se aprecia una disminución de
[O2] disuelto, llegando a 6,7 mg/L (88% de saturación) con 108 bac/mL y hasta 5,5
mg/L (72% de saturación) con 3 x108 bac/mL.
0123456789
0 50 100 150 200 250Tiempo, minutos
[O2]
, mg/
l
0,40
0,50
0,60
0,70
0,80
Eh,
V v
s S
HE
O2Eh
1 2 3
Figura A.1. Oxígeno y Eh en el tiempo. Serie 1.
143
0123456789
0 50 100 150 200 250Tiempo, minutos
[O2]
, mg/
l
0,40
0,50
0,60
0,70
0,80
Eh,
V v
s S
HE
O2Eh
1 2 3
Figura A.2. Oxígeno y Eh en el tiempo. Serie 2.
Estos resultados indican que en las condiciones de aireación (y velocidades de
oxidación) utilizadas la concentración de oxígeno varía desde un 97% a un 72%
de saturación. Si bien las variaciones de las concentraciones de O2 disuelto
encontradas son importantes, aún es necesario verificar los cambios que se
producen en el Eh de la solución producto de estas variaciones. Para verificar
estos cambios se desarrolla una segunda etapa de experiencias.
Etapa 2: Eh versus [O2] disuelto.Para estas experiencias se burbujea nitrógeno durante treinta minutos a 100 ml de
solución de medio de cultivo. Luego se preparan soluciones con [Fe3+]/[Fe2+]=1
agregando los reactivos como sulfatos para alcanzar concentraciones totales de
hierro desde 0,1 g/l hasta 1 g/l. Una vez estabilizada las lecturas se cambia el
burbujeo de nitrógeno a aire y se registran las variaciones de Eh y [O2] disuelto
durante una hora. Las experiencias fueron realizadas en duplicado y sus
resultados se presentan en las Figuras A.3 a A.8.
144
0,40
0,50
0,60
0,70
0,80
0 2 4 6 8[O2], mg/l
Eh,
V v
s S
HE
0,40
0,50
0,60
0,70
0,80
0 2 4 6 8 10[O2], mg/l
Eh, V
vs
SHE
Figura A.3. Eh como función de [O2]
disuelto. [Fetot] = 1 g/l. Serie 1
Figura A.4. Eh como función de [O2]
disuelto. [Fetot] = 1 g/l. Serie 2
0,40
0,50
0,60
0,70
0,80
0 2 4 6 8 10[O2], mg/l
Eh, V
vs
SHE
0,40
0,50
0,60
0,70
0,80
0 2 4 6 8[O2], mg/l
Eh, V
vs
SHE
Figura A.5. Eh como función de [O2]
disuelto. [Fetot] = 0,2 g/l. Serie 1
Figura A.6. Eh como función de [O2]
disuelto. [Fetot] = 0,2 g/l. Serie 2
0,40
0,50
0,60
0,70
0,80
0 2 4 6 8 10[O2], mg/l
Eh, V
vs
SHE
0,40
0,50
0,60
0,70
0,80
0 2 4 6 8[O2], mg/l
Eh, V
vs
SHE
Figura A.7. Eh como función de [O2]
disuelto. [Fetot] = 0,1 g/l. Serie 1
Figura A.8. Eh como función de [O2]
disuelto. [Fetot] = 0,1 g/l. Serie 2
145
Los resultados expuestos en estas Figuras, muestran que para las condiciones
utilizadas el efecto de los cambios en la concentración de oxígeno disuelto no es
significativo. Aún cuando [O2] disuelto cambia desde casi cero hasta la saturación
el Eh de la solución se muestra constante y en todos los casos se mantiene entre
0,669 y 0,673 V (SHE). Sin embargo, debe observarse que la más baja
concentración de ion férrico utilizada en estas experiencias es de 50 mg/l, valor
que puede considerarse no despreciable. En consecuencia podemos argüir que no
está demostrado que sucedería en presencia de concentraciones más pequeñas
de ion férrico. Este punto es relevante, ya que en las experiencias donde el pH es
superior a 3,0 la concentración de ion férrico disuelto será inferior a 10 mg/l y aún
no es clara la influencia de la concentración de oxígeno en estas condiciones.
Para responder esta interrogante es posible hacer uso de la Figura A.2 presentada
anteriormente. Para esta experiencia los primeros 50 minutos corresponden a la
desoxigenación de una solución de 1 g/l de ion ferroso que incluye 4 ± 3 mg/l de
ion férrico (promedio en tres análisis) como impureza. En la Figura A.9 se presenta
un acercamiento a esta zona de la experiencia.
0123456789
0 10 20 30 40Tiempo, minutos
[O2]
, mg/
l
0,20
0,30
0,40
0,50
0,60
Eh,
V v
s S
HE
O2Eh
Figura A.9. Variación en Eh y [O2] disuelto durante la desoxigenación
de medio basal y sulfato ferroso utilizando nitrógeno extra puro.
146
En la Figura A.9 se aprecia que la pequeña concentración de ion férrico presente
junto al ion ferroso es capaz de estabilizar el Eh de la solución (varía desde 0,521
a 0,519 V vs SHE), aún cuando se produce una dramática disminución de la
concentración de oxígeno disuelto en la solución. Como conclusión es posible
señalar que bajas concentraciones de ion férrico en solución permiten que sea el
par férrico/ferroso el que determine el Eh de la solución para el sistema en estudio.
En otras palabras la influencia del oxígeno disuelto no es notable sobre el Eh de la
solución en presencia de hierro disuelto.
En la Figura A.10 se presenta la variación de Eh como función del oxígeno
disuelto para la desoxigenación de una solución de medio basal libre de hierro, es
decir la concentración de hierro total es menor que 0,1 mg/l al aparecer como
impureza.
0,550,560,570,580,590,600,610,620,630,640,65
0 2 4 6 8[O2], mg/l
Eh, V
vs
SHE
Figura A.10. Eh en función de oxígeno disuelto en la desoxigenación
de medio basal libre de hierro con nitrógeno de alta pureza.
De acuerdo a los resultados de la Figura A.10 se aprecia que el Eh de la solución
depende fuertemente de la concentración de oxígeno disuelto cuando la presencia
de hierro sólo es en forma de trazas. Este resultado sin contradecir los anteriores,
147
indica que la concentración de oxígeno disuelto es importante en la definición del
Eh de una solución, pero en presencia de hierro disuelto será el par férrico/ferroso
el que tenga una mayor influencia sobre el valor del Eh.
148
ANEXO BCALIBRACIÓN DE ELECTRODOS DE Eh
La interpretación de la señal redox de diferencia de potencial enviada por el
electrodo combinado de Eh se puede realizar utilizando una expresión del tipo
Nernst (Pesic et al., 1989; Graindorge et al., 1994; Boon, 1996) como la siguiente:
××
+=+
+
][][ln 2
30
FeFe
FnTREEh p (1)
Es decir, el potencial redox es relacionado con la razón férrico/ferroso en solución.
Para completar este procedimiento es necesario comprobar la validez de esta
expresión en las soluciones de trabajo y determinar el pseudo potencial estándar
de la reacción. Este potencial es determinado realizando mediciones de Eh en
soluciones que han sido preparadas con distinta razón férrico/ferroso,
manteniendo la temperatura de operación.
Inicialmente, se preparan dos soluciones de ácido sulfúrico en agua destilada a pH
2,0. A la primera de ellas se adiciona sulfato ferroso y a la segunda se le agrega
sulfato férrico, obteniendo soluciones cuya composición se detalla en la Tabla B.1.
Tabla B.1: Composición de soluciones para calibración
electrodo de Eh en soluciones sin nutrientes.
Solución A Solución B
[Fe2+], mg/l 1004,9 11,2
[Fe3+], mg/l 19,2 864,7
PH 2,0 2,0
Utilizando las soluciones A y B, se preparan mezclas en distintas proporciones de
ellas, totalizando en cada caso un volumen total de 10 ml y se mide el Eh
resultante en la solución. Los resultados obtenidos se observan en la Tabla B.2.
149
Tabla B.2: Características de las mezclas de soluciones preparadas
y Eh medido en soluciones sin nutrientes. Caso 1 g/l Fe total.
Vol. Soln. A 0,1 ml 1,0 ml 5,0 ml 9,0 ml 9,9 ml
Vol. Soln. B 9,9 ml 9,0 ml 5,0 ml 1,0 ml 0,1 ml
[Fe2+], mg/l 21,14 110,57 508,05 905,53 994,9
[Fe3+], mg/l 856,3 780,15 441,95 103,75 27,66
[Fe3+] / [Fe2+] 40,51 7,06 0,87 0,115 0,0278
Eh medidoV vs SHE
0,796 0,744 0,688 0,631 0,591
El potencial redox de la solución (Eh) es graficado versus el logaritmo de la razón
férrico – ferroso obtenida en cada caso y mediante una regresión lineal se
obtienen los parámetros de la ecuación. Este procedimiento se aprecia en la
Figura B.1 para el caso con 1 g/l de Fe total.
y = 0,0644x + 0,6913R2 = 0,9998
0,400
0,500
0,600
0,700
0,800
0,900
-2 -1 0 1 2
Log[Fe(III)/Fe(II)]
Eh, V
v/s
SH
E
Figura B.1: Obtención de parámetros para ecuación del
electrodo Eh en ausencia de nutrientes. Caso 1 g/l Fe total.
El procedimiento anterior fue repetido utilizando diluciones de las soluciones A y B
para obtener concentraciones de hierro total de 0,1 g/l, 0,3 g/l y 0,5 g/l. Se
150
obtuvieron los parámetros para la expresión del Eh que se presentan en la Tabla
B.3.
Tabla B.3. Parámetros expresión (1) para distintas concentraciones
de hierro total en agua destilada.
Fe tot Pendiente E°P R2
[g/l] [V vs SHE] [V vs SHE] [-]0,100 0,0640 0,6910 0,99950,300 0,0636 0,6919 0,99940,500 0,0639 0,6919 0,99971,000 0,0644 0,6913 0,9998
Media 0,0640 0,6916
Finalmente en promedio se considera que en el rango de concentraciones de
hierro utilizado en agua destilada el electrodo de Eh puede ser descrito por:
×+=
+
+
][][log0640,0692,0 2
3
FeFeEh (2)
El procedimiento anterior es repetido utilizando ahora una solución de medio basal
a pH 1,8 (los detalles del medio basal se encuentran la sección 2, de la segunda
parte) sin fierro. A la primera se le agrega sulfato ferroso y a la segunda sulfato
férrico obteniéndose las concentraciones que se detallan en la Tabla B.4.
Solución C Solución D
[Fe2+], mg/l 1093,5 8,5
[Fe3+], mg/l 3,6 988,7
pH 1,8 1,8
Tabla B.4: Composición de soluciones para calibración electrodo Eh
en soluciones medio basal.
151
En la Tabla B.5 se presentan las características esperadas y los resultados con las
mezclas específicas de soluciones C y D. Utilizando esta información se construye
la Figura B.2 que permite correlacionar la información experimental con una
expresión del tipo Nernst.
Tabla B.5: Características de las mezclas de soluciones preparadas
y Eh medido en soluciones de medio basal. Caso Fe total 1 g/l.
Vol Soln C 1,0 ml 3,0 ml 5,0 ml 7,0 ml 9,0 ml
Vol Soln D 9,0 ml 7,0 ml 5,0 ml 3,0 ml 1,0 ml
[Fe2+], mg/l 107,28 308,84 510,40 711,96 913,52
[Fe3+], mg/l 894,71 696,93 499,15 301,37 103,59
[Fe3+] / [Fe2+] 8,34 2,26 0,978 0,423 0,1134
Eh medidoV vs SHE
0,726 0,691 0,667 0,649 0,616
y = 0,0588x + 0,6704R2 = 0,9983
0,400
0,500
0,600
0,700
0,800
0,900
-2 -1 0 1 2
Log[Fe(III)/Fe(II)]
Eh, V
v/s
SH
E
Figura B.2: Obtención de parámetros para ecuación del
electrodo Eh en medio basal. Caso 1 g/l Fe total.
El procedimiento anterior fue repetido utilizando diluciones de las soluciones C y D
para obtener concentraciones de hierro total de 0,1 g/l, 0,3 g/l y 0,5 g/l. Se
152
obtuvieron los parámetros para la expresión del Eh que se presentan en la Tabla
B.6.
Tabla B.6. Parámetros expresión (1) para distintas concentraciones
de hierro total en medio basal.
Fe tot Pendiente E°P R2
[g/l] [V vs SHE] [V vs SHE] [-]0,100 0,0567 0,6718 0,99910,300 0,0579 0,6714 0,99580,500 0,0580 0,6716 0,99931,000 0,0588 0,6704 0,9983
Media 0,0579 0,6713
Finalmente en promedio se considera que en el rango de concentraciones de
hierro utilizado en medio basal el electrodo de Eh puede ser descrito por:
×+=
+
+
][][log0579,0671,0 2
3
FeFeEh (3)
153
ANEXO CPRUEBAS A POTENCIAL CONTROLADO
Tabla C.1: Velocidad de oxidación de ion ferroso en celda electroquímica depotencial controlado.Fe total(mg/l)
Eh (V vs SHE)
Corriente(A)
Va(V vs SHE)
[bact](cel/ml)
[Fe3+] / [Fe2+](--)
[Fe2+](mg/l)
[Fe3+](mg/l)
VFe2+(µg/hr/cel)
55,47 0,636 4,90E-04 0,200 5,00E+07 0,1369 48,79 6,68 1,02E-06123,77 0,625 8,50E-04 0,200 5,00E+07 0,0924 113,30 10,47 1,77E-06230,11 0,600 8,00E-04 0,200 3,50E+07 0,0379 221,71 8,40 2,38E-06277,09 0,601 1,09E-03 0,200 4,50E+07 0,0392 266,63 10,46 2,52E-06496,10 0,580 1,22E-03 0,200 4,50E+07 0,0185 487,07 9,03 2,82E-06600,00 0,585 1,93E-03 0,200 6,50E+07 0,0222 586,99 13,01 3,09E-061013,42 0,571 1,72E-03 0,200 5,50E+07 0,0134 999,97 13,45 3,26E-06
55,04 0,664 4,30E-04 0,400 5,00E+07 0,3720 40,12 14,92 8,96E-0754,43 0,662 3,10E-04 0,400 3,50E+07 0,3464 40,43 14,00 9,23E-0780,04 0,658 5,60E-04 0,400 5,00E+07 0,3003 61,56 18,48 1,17E-06
112,98 0,648 5,00E-04 0,400 3,50E+07 0,2101 93,36 19,62 1,49E-06166,06 0,629 8,40E-04 0,400 5,00E+07 0,1066 150,06 16,00 1,75E-06305,15 0,625 7,20E-04 0,400 3,50E+07 0,0924 279,33 25,82 2,14E-06433,26 0,634 1,10E-03 0,400 5,00E+07 0,1275 384,27 48,99 2,29E-06667,52 0,609 8,30E-04 0,400 3,50E+07 0,0522 634,39 33,13 2,47E-06980,00 0,629 1,43E-03 0,400 5,80E+07 0,1066 885,57 94,43 2,57E-06980,00 0,627 2,05E-03 0,400 8,40E+07 0,0993 891,49 88,51 2,54E-06980,00 0,620 1,16E-03 0,400 4,60E+07 0,0773 909,65 70,35 2,63E-061000,00 0,629 1,05E-03 0,450 4,69E+07 0,1066 903,64 96,36 2,33E-06
92,00 0,678 5,10E-04 0,500 5,00E+07 0,6132 57,03 34,97 1,06E-06207,18 0,669 7,40E-04 0,500 5,10E+07 0,4447 143,41 63,77 1,51E-06512,36 0,661 1,05E-03 0,500 5,21E+07 0,3342 384,01 128,35 2,10E-06762,84 0,653 1,14E-03 0,500 5,31E+07 0,2512 609,69 153,15 2,24E-06778,41 0,651 1,84E-03 0,500 5,42E+07 0,2339 630,86 147,55 3,54E-06794,29 0,650 1,28E-03 0,500 5,89E+07 0,2257 648,04 146,25 2,26E-06810,50 0,643 9,70E-04 0,500 6,01E+07 0,1758 689,34 121,17 1,68E-061084,14 0,644 1,24E-03 0,500 6,14E+07 0,1822 917,08 167,06 2,11E-061106,27 0,659 1,03E-03 0,550 6,26E+07 0,3112 843,71 262,55 1,71E-06
73,58 0,702 2,90E-04 0,600 4,60E+07 1,4444 30,10 43,48 6,57E-07198,42 0,693 5,00E-04 0,600 4,69E+07 1,0475 96,91 101,51 1,11E-06487,62 0,688 7,20E-04 0,600 4,79E+07 0,8763 259,89 227,73 1,57E-06804,25 0,684 8,30E-04 0,600 4,89E+07 0,7597 457,05 347,20 1,77E-06820,66 0,694 1,27E-03 0,600 4,99E+07 1,0856 393,50 427,17 2,65E-06837,41 0,689 1,13E-03 0,600 5,42E+07 0,9081 438,87 398,54 2,17E-06854,50 0,680 8,70E-04 0,600 5,53E+07 0,6586 515,20 339,30 1,64E-061154,20 0,681 8,70E-04 0,600 5,64E+07 0,6825 686,00 468,20 1,61E-061177,76 0,724 7,20E-04 0,650 5,76E+07 3,1679 282,58 895,18 1,30E-061201,79 0,721 5,80E-04 0,650 6,26E+07 2,8462 312,46 889,33 9,65E-071226,32 0,742 4,70E-04 0,675 6,39E+07 6,0234 174,60 1051,71 7,67E-071251,34 0,756 2,50E-04 0,700 6,94E+07 9,9289 114,50 1136,85 3,75E-071276,88 0,756 3,30E-04 0,700 7,09E+07 9,9289 116,84 1160,05 4,85E-07
154
ANEXO DDESARROLLO ALGEBRAICO DEL MODELO, SECCIÓN 4 SEGUNDA PARTE
E)Fe(FeEk
k++
←→
+ 22
2
1
(1)
−++ +←→
eE)Fe(E)Fe(k
k32
4
3
(2)
++ +←→ 33
6
5
FeEE)Fe(k
k
(3)
La velocidades asociadas a estas tres etapas reversibles del mecanismo pueden
ser expresadas como sigue:
( ) ])[(][])[(])[(][ 22
2321 EFekFeEFeEFeEkr tA
++++ ×−×−−×= (4)
( )
××−
−
××−
××
= ηαηαRT
FnRT
FnFn
irB exp1exp0 (5)
( ) ])[(][])[(])[(][ 35
3326 EFekFeEFeEFeEkr tC
++++ ×+×−−×−= (6)
donde i0, α, n, R, T son los parámetros estándar utilizados en cinética electroquímica
(ver sección nomenclatura. La velocidad de oxidación del complejo enzima-ferroso
sobre la membrana de la bacteria tiene unidades de mol/(área x tiempo). Ella se
expresa como i/nF, donde i es la densidad de corriente de electrones removidos del
complejo enzima-ferroso hacia la cadena de transporte de electrones al interior de la
célula. El sobrepotencial, η, esta expresado en términos de los potenciales
establecidos en la membrana bacteriana como:
η = Em - Emeq (7)
155
Emeq es el potencial de membrana cuando el sistema se encuentra en equilibrio y Em
es el potencial de membrana cuando la reacción de oxidación se desarrolla una
velocidad finita. Emeq esta determinado por la razón entre las concentraciones de los
complejos férrico-enzima y ferroso-enzima en la superficie de la membrana, y puede
ser expresado como:
××
+=+
+
])[(])[(ln 2
3
0 EFeEFe
FnTREE mm
eq (8)
Cuando el corriente neta de oxidación en la membrana es cero este potencial puede
ser igualado al potencial de Nernst asociado a la razón [Fe3+]/[Fe2+] en solución, es
decir:
××
+=+
+
][][ln 2
30
FeFe
FnTREhEh (9)
y asumiendo que rB << rA y rB << rC, la cinética del mecanismo queda limitada por
la transferencia de electrones en la reacción 2. En consecuencia es razonable
suponer que las reacciones 1 y 3 se encuentran en estado pseudo-estacionario.
Equivalentemente rA ≈ 0 y rC ≈ 0, obteninedose expresiones para las
concentraciones de los complejos ferroso-enzima y férrico enzima.
( ) 0])[(][])[(])[(][ 22
2321 =×−×−−× ++++ EFekFeEFeEFeEk t (10)
( ) 0])[(][])[(])[(][ 35
3326 =×+×−−×− ++++ EFekFeEFeEFeEk t (11)
[ ]52
362
251
2512
][][][][)(
kkFekkFekkFeEkkEFe t
+×+×××
=++
++ (12)
[ ]52
362
251
3623
][][][][)(
kkFekkFekkFeEkkEFe t
+×+×××
=++
++ (13)
Emeq se define en condiciones de equilibrio y en ese caso (i=0) el potencial de
membrana se iguala al potencial redox de la solución por (Eh):
156
EhE meq = (14)
La corriente de intercambio para esta reacción puede ser expresada de acuerdo a
la siguiente expresión:
)1(23
00 ])[(])[( αα −++ ××= EFeEFeki (15)
combinando las expresiones (12), (13) y (15) la corriente de intercambio queda
expresada como:
)1(
523
622
51
362
523
622
51
251
00 ][][][][
][][][][
αα −
++
+
++
+
+×+×
×××
+×+×
×××=
kkFekkFekkFeEkk
kkFekkFekkFeEkkki tt (16)
y reordenando:
523
622
51
)1(23)1(6251
00 ][][][][][)()(
kkFekkFekkFeFeEkkkkki t
+×+×××××
×=++
−++− αααα
(17)
utilizando (9) y (14) el sobrepotencial definido en la ecuación (7) queda expresadocomo:
−−= +
+
][][ln 2
30
FeFe
nFRTEhE mη (18)
reemplazando la expresión (18) en (5) la velocidad de transferencia de electronesqueda expresada según:
( ) ( )( )
( )
×
−−
−
×
−
−=
+
+−
+
+ αααα
][][exp
][][1exp 2
30
1
2
300
FeFeEhE
RTnF
FeFeEhE
RTnF
nFi
r mmB
(19)
utilizando α = ½ y definiendo la constante kE:
157
))(2
exp( 0EhETR
Fnk mE −××
×= (20)
la ecuación (19) se simplifica a:
−
= +
+−
+
+
][][1
][][
2
321
2
30
FeFe
kk
FeFe
nFir E
EB (21)
similarmente utilizando α = ½ en la expresión (17) la corriente de intercambio sepuede escribir como:
( ) ( )52
362
251
21322
16521
00 ][][][][][
kkFekkFekkFeFeEkkkkki t
+×+××××
×=++
++
(22)
reemplazando (22) in (21) y reordenando se obtiene:
][][
][11
][][1][
2
3
51
622
1
2
2
321
51
62
0
+
+
+
+
+
×++
−××
××
=
FeFe
kkkk
Fekk
FeFe
kkE
kkkk
Fnkr
EE
t
B (23)
Introduciendo la siguiente notación:
( )
−××
×= 0
21
51
620
21exp][ EhE
RTnFE
kkkk
nFkV m
tMax (24)
[ ] ( )
−−
××= 002 2
1exp EhERTnFE
nFkK m
t (25)
1
2
kkKS = (26)
51
62
kkkkKI = (27)
la velocidad rB puede ser finalmente expresada como:
158
][][
][11
][][
2
3
2
2
3
2
+
+
+
+
+
×++
×−
=
FeFeK
FeK
FeFeKV
rIS
Max
B (28)
La ecuación (23) se puede modificar para expresar rB explícitamente en funcióndel Eh. Si la expresión (9) se escribe como:
( )
−=
+
+0
2
3
exp][][ EhEh
RTnF
FeFe (29)
y es reemplazada en (24), reordenando se obtiene:
( )
( )
−×++
−×−××
××
=
+
−
0
51
622
1
2
022
1
51
62
0
exp][
11
exp)(1][
EhEhRTnF
kkkk
Fekk
EhEhRTnFkkE
kkkk
Fnkr
EEt
B (30)
Introduciendo la siguiente notación:
[ ]tEkkkk
nFkK
21
51
6201
= (31)
1
22 k
kK = (32)
51
623 kk
kkK = (33)
rB puede ser finalmente escrito como:
( ) ( )
( )
−×++
−−
−×
−×
=
+0
322
01
exp][
1
exp12
exp
EhEhRTnFK
FeK
EhERTnFEhE
RTnFK
r
mm
B (34)
159
ANEXO ERESPALDO DE PRUEBAS DE OXIDACIÓN DE SULFATO FERROSO EN ELRANGO DE pH 1,3 – 2,5.
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0 50 100 150Tiempo, min
Eh, V
vsS
HE
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
2,2
2,4
2,6
2,8
pH
Eh
pH
0,0E+00
5,0E-01
1,0E+00
1,5E+00
2,0E+00
2,5E+00
0 50 100 150Tiempo, min
Velocidad de Oxidación, mg Fe/ (L min)
Figura E.1 Evolución del Eh y pH. Nº bact =3,2x107 cel/ml, [Fe2+]inicial = 0,2 g/l, pHpromedio 1,27.
Figura E.2 Velocidad de oxidación de ionferroso. Nº bact = 3,2x107 cel/ml, [Fe2+]inicial =0,2 g/l, pH promedio 1,27.
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0 50 100 150Tiempo, min
Eh, V
vsS
HE
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
2,2
2,4
2,6
2,8
pH
Eh
pH
0,0E+00
5,0E-01
1,0E+00
1,5E+00
2,0E+00
2,5E+00
0 50 100 150Tiempo, min
Vel
ocid
ad d
e O
xida
ción
, mg
Fe/ (
L m
in)
Figura E.3 Evolución del Eh y pH. Nº bact =5,5x107 cel/ml, [Fe2+]inicial = 0,2 g/l, pHpromedio 1,31.
Figura E.4 Velocidad de oxidación de ionferroso. Nº bact = 5,5x107 cel/ml, [Fe2+]inicial =0,2 g/l, pH promedio 1,31.
160
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0 50 100 150Tiempo, min
Eh, V
vs
SHE
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
2,2
2,4
2,6
2,8
pH
Eh
pH
0,0E+00
5,0E-01
1,0E+00
1,5E+00
2,0E+00
2,5E+00
0 50 100 150Tiempo, min
Velocidad de Oxidación, mg Fe/ (L min)
Figura E.5 Evolución del Eh y pH. Nº bact =1,7x107 cel/ml, [Fe2+]inicial = 0,2 g/l, pHpromedio 1,33.
Figura E.6 Velocidad de oxidación de ionferroso. Nº bact = 1,7x107 cel/ml, [Fe2+]inicial =0,2 g/l, pH promedio 1,33.
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0 50 100 150Tiempo, min
Eh, V
vs
SHE
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
2,2
2,4
2,6
2,8pH
Eh
pH
0,0E+00
5,0E-01
1,0E+00
1,5E+00
2,0E+00
2,5E+00
0 50 100 150 200 250Tiempo, min
Velocidad de Oxidación, mg Fe/ (L min)
Figura E.7 Evolución del Eh y pH. Nº bact =4,8x107 cel/ml, [Fe2+]inicial = 0,2 g/l, pHpromedio 1,55.
Figura E.8 Velocidad de oxidación de ionferroso. Nº bact = 4,8x107 cel/ml, [Fe2+]inicial =0,2 g/l, pH promedio 1,55.
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0 50 100 150Tiempo, min
Eh, V
vs
SHE
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
2,2
2,4
2,6
2,8
pH
Eh
pH
0,0E+00
5,0E-01
1,0E+00
1,5E+00
2,0E+00
2,5E+00
0 50 100 150Tiempo, min
Velocidad de Oxidación, mg Fe/ (L min)
Figura E.9 Evolución del Eh y pH. Nº bact =6,3x107 cel/ml, [Fe2+]inicial = 0,2 g/l, pHpromedio 1,66.
Figura E.10 Velocidad de oxidación de ionferroso. Nº bact = 6,3x107 cel/ml, [Fe2+]inicial =0,2 g/l, pH promedio 1,66.
161
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0 50 100 150Tiempo, min
Eh, V
vs
SHE
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
2,2
2,4
2,6
2,8
pH
Eh
pH
0,0E+00
5,0E-01
1,0E+00
1,5E+00
2,0E+00
2,5E+00
0 50 100 150Tiempo, min
Velocidad de Oxidación, mg Fe/ (L min)
Figura E.11 Evolución del Eh y pH. Nº bact= 4,0x107 cel/ml, [Fe2+]inicial = 0,2 g/l, pHpromedio 1,71.
Figura E.12 Velocidad de oxidación de ionferroso. Nº bact = 4,0x107 cel/ml, [Fe2+]inicial =0,2 g/l, pH promedio 1,71.
0,5
0,6
0,7
0,8
0 50 100 150Tiempo, min
Eh, V
vs
SHE
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
2,2
2,4
2,6
2,8pH
Eh
pH
0,0E+00
5,0E-01
1,0E+00
1,5E+00
2,0E+00
2,5E+00
0 50 100 150Tiempo, min
VFe2+, mg Fe/ (l min)
Figura E.13 Evolución del Eh y pH. Nº bact= 5,5x107 cel/ml, [Fe2+]inicial = 0,2 g/l, pHpromedio 1,84.
Figura E.14 Velocidad de oxidación de ionferroso. Nº bact = 5,5x107 cel/ml, [Fe2+]inicial =0,2 g/l, pH promedio 1,84.
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0 50 100 150Tiempo, min
Eh, V
vs
SHE
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
2,2
2,4
2,6
2,8
pH
Eh
pH
0,0E+00
5,0E-01
1,0E+00
1,5E+00
2,0E+00
2,5E+00
0 50 100 150Tiempo, min
Velocidad de Oxidación, mg Fe/ (L min)
Figura E.15 Evolución del Eh y pH. Nº bact= 5,0x107 cel/ml, [Fe2+]inicial = 0,2 g/l, pHpromedio 1,87.
Figura E.16 Velocidad de oxidación de ionferroso. Nº bact = 5,0x107 cel/ml, [Fe2+]inicial =0,2 g/l, pH promedio 1,87.
162
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0 50 100 150Tiempo, min
Eh, V
vs
SHE
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
2,2
2,4
2,6
2,8
pH
Eh
pH
0,0E+00
5,0E-01
1,0E+00
1,5E+00
2,0E+00
2,5E+00
0 50 100 150Tiempo, min
Velocidad de Oxidación, mg Fe/ (L min)
Figura E.17 Evolución del Eh y pH. Nº bact= 3,0x107 cel/ml, [Fe2+]inicial = 0,2 g/l, pHpromedio 2,03.
Figura E.18 Velocidad de oxidación de ionferroso. Nº bact = 3,0x107 cel/ml, [Fe2+]inicial =0,2 g/l, pH promedio 2,03.
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0 50 100 150Tiempo, min
Eh, V
vs
SHE
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
2,2
2,4
2,6
2,8pH
Eh
pH
0,0E+00
5,0E-01
1,0E+00
1,5E+00
2,0E+00
2,5E+00
0 50 100 150Tiempo, min
Velocidad de Oxidación, mg Fe/ (L min)
Figura E.19 Evolución del Eh y pH. Nº bact= 3,0x107 cel/ml, [Fe2+]inicial = 0,2 g/l, pHpromedio 2,07.
Figura E.20 Velocidad de oxidación de ionferroso. Nº bact = 3,0x107 cel/ml, [Fe2+]inicial =0,2 g/l, pH promedio 2,07.
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0 50 100 150Tiempo, min
Eh, V
vs
SHE
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
2,2
2,4
2,6
2,8
pH
Eh
pH
0,0E+00
5,0E-01
1,0E+00
1,5E+00
2,0E+00
2,5E+00
0 50 100 150Tiempo, min
Velocidad de Oxidación, mg Fe/ (L min)
Figura E.21Evolución del Eh y pH. Nº bact =4,0x107 cel/ml, [Fe2+]inicial = 0,2 g/l, pHpromedio 2,25.
Figura E.22 Velocidad de oxidación de ionferroso. Nº bact = 4,0x107 cel/ml, [Fe2+]inicial =0,2 g/l, pH promedio 2,25.
163
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0 50 100 150Tiempo, min
Eh, V
vs
SHE
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
2,2
2,4
2,6
2,8
pH
Eh
pH
0,0E+00
5,0E-01
1,0E+00
1,5E+00
2,0E+00
2,5E+00
0 50 100 150Tiempo, min
Velocidad de Oxidación, mg Fe/ (L min)
Figura E.23 Evolución del Eh y pH. Nº bact= 6,8x107 cel/ml, [Fe2+]inicial = 0,2 g/l, pHpromedio 2,28.
Figura E.24 Velocidad de oxidación de ionferroso. Nº bact = 6,8x107 cel/ml, [Fe2+]inicial =0,2 g/l, pH promedio 2,28.
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0 50 100 150Tiempo, min
Eh, V
vs
SHE
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
2,2
2,4
2,6
2,8pH
Eh
pH
0.0E+00
5.0E-01
1.0E+00
1.5E+00
2.0E+00
2.5E+00
0 50 100 150Tiempo, min
Vel
ocid
ad d
e O
xida
ción
, mg
Fe/ (
L m
in)
Figura E.25 Evolución del Eh y pH. Nº bact= 7,0x107 cel/ml, [Fe2+]inicial = 0,2 g/l, pHpromedio 2,55.
Figura E.26 Velocidad de oxidación de ionferroso. Nº bact = 7,0x107 cel/ml, [Fe2+]inicial =0,2 g/l, pH promedio 2,55.
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0 50 100 150Tiempo, min
Eh, V
vs
SHE
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
2,2
2,4
2,6
2,8
pH
Eh
pH
0,0E+00
5,0E-01
1,0E+00
1,5E+00
2,0E+00
2,5E+00
0 50 100 150Tiempo, min
Velocidad de Oxidación, mg Fe/ (L min)
Figura E.27 Evolución del Eh y pH. Nº bact= 3,0x107 cel/ml, [Fe2+]inicial = 0,2 g/l, pHpromedio 2,60.
Figura E.28 Velocidad de oxidación de ionferroso. Nº bact = 3,0x107 cel/ml, [Fe2+]inicial =0,2 g/l, pH promedio 2,60.
164
ANEXO F
DETERMINACIÓN DE LAS ESTEQUIOMETRÍAS DE FORMACIÓN DE
PRECIPITADOS FÉRRICOS
Para la determinación de las estequiometrías de reacción en la formación de
precipitados férricos se utiliza la metodología descrita por Byrne y Lou (2000). Este
método esta basado en mediciones potenciométricas de pH y concentración de
ion férrico en solución para el rango de pH entre 3,0 y 7,3.
Las ventajas de este método radican en que para su desarrollo no es necesario
tomar muestras del reactor donde se efectúan las reacciones, sino que se realizan
los cálculos de acuerdo con las mediciones de pH y potencial redox en línea.
Procedimiento
Figura F.1
Montaje Experimental
1 Burbujeo de Nitrógeno
2 Electrodo combinado de pH
3 Electrodo combinado redox
4 Sistema de adquisición de datos
5 Baño de agua termostatizada
6 Agitador magnético
En la Figura F.1 se aprecia un esquema del montaje experimental utilizado. Las
experiencias se desarrollan en una celda de vidrio pyrex termostatizada con agua
a 30 ± 0,5 ºC. La celda contiene 150 ml de la solución de prueba y en ella se
colocan un electrodo combinado de pH Sensorex S201C y un electrodo
combinado de Eh Cole-Palmer 5990-57. Ambos electrodos se encuentran
165
conectados a un sistema de adquisición de datos Opto 22, que registra las
variaciones de pH y Eh en el tiempo. Para evitar el cortocircuito de ambas señales,
solo uno de los electrodos de referencia se encuentra conectado eléctricamente y
ambos valores (pH y Eh) son referidos a él. La solución en la celda es agitada con
un agitador magnético.
La solución de trabajo es preparada mezclando 135 ml de solución de agua ácida
(o medio de nutrientes) a pH 1,8 con 7,5 ml de una solución 0,2 M de sulfato
ferroso y 7,5 ml de una solución 0,2 M de sulfato férrico. La mezcla se realiza en la
celda bajo continuo burbujeo de Nitrógeno extra puro. Este burbujeo se mantiene
durante el desarrollo completo de la prueba.
Se realiza la adición de cantidades pre-establecidas de NaOH 0,1 N (establecidas
en una experiencia de prueba) y se espera hasta que las variaciones de pH y Eh
en la celda sean poco significativas. Luego se adiciona una nueva dosis de
hidróxido de sodio. Este procedimiento se repite hasta alcanzar un pH cercano a
7,0. Durante toda la prueba se mantiene un registro minuto a minuto de los valores
de pH y Eh de la solución. Las pruebas en ambas condiciones (con agua ácida y
medio nutriente) son efectuadas en duplicado. En la tabla F.1 se presenta las
condiciones experimentales utilizadas.
Estas pruebas se realizaron en dos condiciones: Caso A, donde la solución inicial
es agua destilada con ácido sulfúrico; y Caso B, donde se utiliza medio basal libre
de hierro. Las pruebas se realizaron en duplicado identificándose como prueba 1 y
prueba 2 en cada caso.
En las Figuras F.2 y F.3 se presenta los resultados obtenidos para el caso A y en
las Figuras F.4 y F.5 los resultados del caso B.
166
Tabla F.1. Características de las soluciones utilizadas.
Caso A Caso B
Soporte H2O + H2SO4 MC 1.8
[Fe2+], g/l 0,57 0,58
[Fe3+], g/l 0,56 0,55
pH 1,8 1,8
Volumen, l 0,15 0,15
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,60
0,70
0,80
0 100 200 300Tiempo, minutos
Eh,
V v
s S
HE
1
2
3
4
5
6
7
pH
Eh
pH
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,60
0,70
0,80
0 100 200 300Tiempo, minutos
Eh,
V v
s S
HE
1
2
3
4
5
6
7
pH
Eh
pH
Figura F.2. Variaciones de pH y Eh en el
tiempo. Caso A, prueba 1.
Figura F.3. Variaciones de pH y Eh en el
tiempo. Caso A, prueba 2.
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,60
0,70
0,80
0 100 200 300
Tiempo, minutos
Eh,
V v
s S
HE
1
2
3
4
5
6
7
pH
Eh
pH
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,60
0,70
0,80
0 100 200 300
Tiempo, minutos
Eh,
V v
s S
HE
1
2
3
4
5
6
7pH
Eh
pH
Figura F.4. Variaciones de pH y Eh en el
tiempo. Caso B, prueba 1.
Figura F.5. Variaciones de pH y Eh en el
tiempo. Caso B, prueba 2.
167
En las condiciones de operación utilizadas y suponiendo que en la formación de
precipitados no se arrastra una cantidad importante de ion ferroso, es posible
calcular la concentración de ion férrico asociada a cada valor de potencial redox.
Para ello se consideran las siguientes expresiones que fueron obtenidas de
acuerdo con los procedimientos del Anexo B.
Caso A:
+= +
+
][
][log*0640.0692.0 2
3
Fe
FeEh
Caso B:
+=
+
+
][
][log*0579.0671.0
2
3
FeFe
Eh
Con esta información se puede graficar el log [Fe3+] versus el pH como se aprecia
en las figuras F.6 a F.9.
-14,0
-12,0
-10,0
-8,0
-6,0
-4,0
-2,0
0,0
2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0
pH
log
[Fe3
+]
-12,0
-10,0
-8,0
-6,0
-4,0
-2,0
0,0
2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0
pH
log
[Fe3
+]
Figura F.6. Log [Fe3+] versus pH, Caso
A, prueba 1.
Figura F.7. Log [Fe3+] versus pH, Caso
A, prueba 2.
168
-12,0
-10,0
-8,0
-6,0
-4,0
-2,0
0,0
2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0
pH
log
[Fe3
+]
-12,0
-10,0
-8,0
-6,0
-4,0
-2,0
0,0
2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0
pH
log
[Fe3
+]
Figura F.8. Log [Fe3+] versus pH, Caso
B, prueba 1.
Figura F.9. Log [Fe3+] versus pH, Caso
B, prueba 2.
En estas Figuras (F.6 a F.9) se aprecia una tendencia lineal entre el log [Fe3+]
calculado y el pH. Esta tendencia es la esperada y refleja el exponente que
relaciona la cantidad de ácido liberado con la cantidad ion férrico precipitado. Para
observar con mayor claridad este resultado se han graficado solo los puntos
finales que se obtiene después de cada adición de hidróxido de sodio, para las
dos pruebas de cada caso. Este ejercicio se aprecia en las Figuras F.10 y F.11.
y = -2,8848x + 7,0201
R2 = 0,9983
-12,0
-10,0
-8,0
-6,0
-4,0
-2,0
0,0
2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0
pH
log
[Fe3
+]
y = -2,2161x + 3,4462
R2 = 0,9995
-12,0
-10,0
-8,0
-6,0
-4,0
-2,0
0,0
2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0
pH
log
[Fe3
+]
Figura F.10. Log [Fe3+] versus pH, Caso
A, resumen de datos.
Figura F.11. Log [Fe3+] versus pH, Caso
B, resumen de datos.
De acuerdo con las pendientes observadas en las Figuras F.10 y F.11 se puede
concluir que: en el caso de las soluciones de agua ácida, por cado mol de ion
169
férrico precipitado se liberan poco menos de tres moles de protones; en cambio el
caso de soluciones de medio nutriente, por cada mol de ion férrico precipitados se
liberan a la solución un poco más de dos moles de protones. Estas
estequiometrías de reacción pueden ser bien representadas por la formación de
hidróxido férrico en el caso A y jarositas en el caso B, como se presenta en las
reacciones siguientes:
Caso A: Fe3+ + 3 H2O → Fe(OH)3 + 3 H+
Caso B: X+ + 3 Fe3+ + 2 SO42- + 6 H2O → XFe3(SO4)2(OH)6 + 6 H+
170
ANEXO GRESPALDO DE PRUEBAS DE OXIDACIÓN DE SULFATO FERROSO EN ELRANGO DE pH 2,5 – 7,0.
En este apartado se presentan los cálculos de las velocidades de oxidación de ionferroso de la sección 3.2 de la segunda parte de esta tesis. Las velocidades sepresentan como logaritmo (base 10) de la velocidad (mg/(l min)) y se denotanlog(V1). Este anexo se divide en tres partes: pruebas realizadas en soluciones sinnutrientes; pruebas realizadas en medio basal; y pruebas realizadas cambiando elnúmero inicial de microorganismos. En los casos que corresponde las pruebas A,By C corresponden a repeticiones de las mismas condiciones experimentales (nº debacterias, [Fe2+], etc.). En todos los casos, para los cálculos se considera laexperiencia que tiene menor disgregación de datos.
Pruebas en soluciones sin nutrientes.
-3.0-2.5-2.0-1.5-1.0-0.50.00.5
1.0
2 3 4 5 6 7
pH
log(
V1)
-3.0-2.5-2.0-1.5-1.0-0.50.00.51.0
2 3 4 5 6 7
pH
log(
V1)
Figura G.1 Log(V) vs pH, 0,1 g/l de ionferroso sin bacterias, sin nutrientes.
Figura G.2 Log(V) vs pH, 0,5 g/l de ionferroso sin bacterias, sin nutrientes.
-3.0-2.5-2.0-1.5-1.0
-0.50.00.51.0
2 3 4 5 6 7
pH
log(
V1)
Figura G.3 Log(V) vs pH, 1 g/l de ionferroso sin bacterias, sin nutrientes.
171
-3.0-2.5-2.0-1.5-1.0-0.50.00.51.0
2 3 4 5 6 7
pH
log(
V1)
-3.0-2.5
-2.0-1.5-1.0-0.50.00.5
1.0
2 3 4 5 6 7
pH
log(
V1)
Figura G.4 Log(V) vs pH, 0,1 g/l de ionferroso con bacterias, sin nutrientes Nºbact = 2x107 cel/ml. Prueba A
Figura G.5 Log(V) vs pH, 0,1 g/l de ionferroso con bacterias, sin nutrientes Nºbact = 2x107 cel/ml. Prueba B
-3.0-2.5-2.0-1.5-1.0-0.50.00.51.0
2 3 4 5 6 7
pH
log(
V1)
-3.0-2.5-2.0-1.5-1.0-0.50.00.51.0
2 3 4 5 6 7
pH
log(
V1)
Figura G.6 Log(V) vs pH, 0,5 g/l de ionferroso con bacterias, sin nutrientes Nºbact = 2x107 cel/ml. Prueba A
Figura G.7 Log(V) vs pH, 0,5 g/l de ionferroso con bacterias, sin nutrientes Nºbact = 2x107 cel/ml. Prueba B
-3.0-2.5-2.0
-1.5-1.0-0.50.00.5
1.0
2 3 4 5 6 7
pH
log(
V1)
-3.0-2.5
-2.0-1.5-1.0-0.50.00.5
1.0
2 3 4 5 6 7
pH
log(
V1)
Figura G.8 Log(V) vs pH, 1 g/l de ionferroso con bacterias, sin nutrientesNº bact = 2x107 cel/ml. Prueba A
Figura G.9 Log(V) vs pH, 1 g/l de ionferroso con bacterias, sin nutrientesNº bact = 2x107 cel/ml. Prueba B
172
Pruebas en soluciones de medio basal
-3.0-2.5-2.0-1.5-1.0-0.50.00.51.0
2 3 4 5 6 7
pH
log(
V1)
-3.0-2.5-2.0-1.5-1.0-0.50.00.51.0
2 3 4 5 6 7
pH
log(
V1)
Figura G.10 Log(V) vs pH, 0,1 g/l de ionferroso sin bacterias, con nutrientes.
Figura G.11 Log(V) vs pH, 0,5 g/l de ionferroso sin bacterias, con nutrientes.
-3.0-2.5-2.0
-1.5-1.0-0.50.0
0.51.0
2 3 4 5 6 7
pH
log(
V1)
Figura G.12 Log(V) vs pH, 1 g/l de ionferroso sin bacterias, con nutrientes.
173
-3.0-2.5-2.0-1.5-1.0-0.50.00.51.0
2 3 4 5 6 7
pH
log(
V1)
-3.0-2.5-2.0-1.5-1.0-0.50.00.51.0
2 3 4 5 6 7
pH
log(
V1)
Figura G.13 Log(V) vs pH, 0,1 g/l de ionferroso con bacterias, con nutrientes Nºbact = 2x107 cel/ml. Prueba A
Figura G.14 Log(V) vs pH, 0,1 g/l de ionferroso con bacterias, con nutrientes Nºbact = 2x107 cel/ml. Prueba B
-3.0-2.5
-2.0-1.5
-1.0-0.5
0.00.5
1.0
2 3 4 5 6 7
pH
log(
V1)
Figura G.15 Log(V) vs pH, 0,1 g/l de ionferroso con bacterias, con nutrientes Nºbact = 2x107 cel/ml. Prueba C
-3.0-2.5-2.0-1.5-1.0
-0.50.00.51.0
2 3 4 5 6 7
pH
log(
V1)
-3.0-2.5-2.0-1.5-1.0
-0.50.00.51.0
2 3 4 5 6 7
pH
log(
V1)
Figura G.16 Log(V) vs pH, 0,5 g/l de ionferroso con bacterias, con nutrientes Nºbact = 2x107 cel/ml. Prueba A
Figura G.17 Log(V) vs pH, 0,5 g/l de ionferroso con bacterias, con nutrientes Nºbact = 2x107 cel/ml. Prueba B
174
-3.0-2.5-2.0-1.5-1.0-0.50.00.51.0
2 3 4 5 6 7
pH
log(
V1)
Figura G.18 Log(V) vs pH, 0,5 g/l de ionferroso con bacterias, con nutrientes Nºbact = 2x107 cel/ml. Prueba C
-3.0-2.5-2.0-1.5-1.0
-0.50.00.51.0
2 3 4 5 6 7
pH
log(
V1)
-3.0-2.5-2.0-1.5-1.0-0.50.00.51.0
2 3 4 5 6 7
pH
log(
V1)
Figura G.19 Log(V) vs pH, 1 g/l de ionferroso con bacterias, con nutrientes Nºbact = 2x107 cel/ml. Prueba A
Figura G.20 Log(V) vs pH, 1 g/l de ionferroso con bacterias, con nutrientes Nºbact = 2x107 cel/ml. Prueba B
-3,0-2,5-2,0-1,5-1,0-0,50,00,51,0
2 3 4 5 6 7
pH
log(
V1)
Figura G.21 Log(V) vs pH, 1 g/l de ionferroso con bacterias, con nutrientes. Nºbact = 2x107 cel/ml Prueba C
175
Pruebas con diferente número inicial de microorganismos
-3.0-2.5-2.0-1.5-1.0-0.50.00.51.01.52.0
2 3 4 5 6 7
pH
log(
V1)
-3,0-2,5-2,0-1,5-1,0-0,50,00,51,01,52,0
2 3 4 5 6 7
pH
log(
V1)
Figura G.22 Log(V) vs pH, 1 g/l de ionferroso con bacterias, con nutrientes. Nºbact = 8x106 cel/ml. Prueba A
Figura G.23 Log(V) vs pH, 1 g/l de ionferroso con bacterias, con nutrientes. Nºbact = 8x106 cel/ml. Prueba B
-3.0-2.5-2.0-1.5-1.0-0.50.00.51.01.52.0
2 3 4 5 6 7
pH
log(
V1)
-3,0-2,5-2,0-1,5-1,0-0,50,00,51,01,52,0
2 3 4 5 6 7
pH
log(
V1)
Figura G.24 Log(V) vs pH, 1 g/l de ionferroso con bacterias, con nutrientes. Nºbact = 5x107 cel/ml. Prueba A
Figura G.25 Log(V) vs pH, 1 g/l de ionferroso con bacterias, con nutrientes. Nºbact = 8x107 cel/ml. Prueba B
176
-3.0-2.5-2.0-1.5-1.0-0.50.00.51.01.52.0
2 3 4 5 6 7
pH
log(
V1)
-3,0-2,5-2,0-1,5-1,0-0,50,00,51,01,52,0
2 3 4 5 6 7
pH
log(
V1)
Figura G.26 Log(V) vs pH, 1 g/l de ionferroso con bacterias, con nutrientes. Nºbact = 8x107 cel/ml. Prueba A
Figura G.27 Log(V) vs pH, 1 g/l de ionferroso con bacterias, con nutrientes. Nºbact = 8x107 cel/ml. Prueba B
177
ANEXO HMEDICIÓN DEL COEFICIENTE DE RENDIMIENTO BACTERIANO EN ELRANGO DE pH 2,0 – 4,0.
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0 5 10 15 20 25
tiempo, horas
-rO
2, (m
mol
e/(l.
hr))
0,55
0,60
0,65
0,70
0,75
0,80
0,85
0,90
Eh, V
vs
SHE
-rO2redox
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,55 0,60 0,65 0,70 0,75 0,80 0,85 0,90
Eh, V vs SHE-r
O2
(mm
olO
2.l-1
.hr-
1)Figura H.1 Velocidad de consumo deOxigeno y potencial redox enexperiencia pH = 2,0. [Fe2+]ini = 1 g/l.
Figura H.2 Velocidad de consumo deOxigeno en función del potencial redoxen experiencia pH = 2,0. [Fe2+]ini = 1 g/l.
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0 10 20 30
tiempo, horas
-rO
2 (m
mol
O2.
l-1.h
r-1)
0,000
0,005
0,010
0,015
0,020
0,025
0,030
0,035
0,040
-rC
O2
(mm
olC
O2.
l-1.h
r-1)
-rO2-rCO2
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16
0,18
0,20
0 5 10 15 20 25
tiempo, horas
-rC
O2
/ -rO
2
Figura H.3 Velocidad de consumo deOxigeno y Dióxido de carbono enexperiencia pH = 2,0. [Fe2+]ini = 1 g/l.
Figura H.4 Razón velocidad de consumode dióxido de carbono/oxigenoexperiencia pH = 2,0. [Fe2+]ini = 1 g/l.
178
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0 5 10 15 20 25
tiempo, horas
-rO
2, (m
mol
e/(l.
hr))
0,55
0,60
0,65
0,70
0,75
0,80
0,85
0,90
Eh, V
vs
SHE
-rO2redox
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,55 0,60 0,65 0,70 0,75 0,80 0,85 0,90
Eh, V vs SHE
-rO
2 (m
mol
O2.
l-1.h
r-1)
Figura H.5 Velocidad de consumo deOxigeno y potencial redox enexperiencia pH = 2,5. [Fe2+]ini = 1 g/l.
Figura H.6 Velocidad de consumo deOxigeno en función del potencial redoxen experiencia pH = 2,5. [Fe2+]ini = 1 g/l.
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0 5 10 15 20 25
tiempo, horas
-rO
2 (m
mol
O2.
l-1.h
r-1)
0,000
0,005
0,010
0,015
0,020
0,025
0,030
0,035
0,040
-rC
O2
(mm
olC
O2.
l-1.h
r-1)
-rO2-rCO2
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16
0,18
0,20
0 5 10 15 20 25
tiempo, horas
-rC
O2
/ -rO
2
Figura H.7 Velocidad de consumo deOxigeno y Dióxido de carbono enexperiencia pH = 2,5. [Fe2+]ini = 1 g/l.
Figura H.8 Razón velocidad de consumode dióxido de carbono/oxigenoexperiencia pH = 2,5. [Fe2+]ini = 1 g/l.
179
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0 5 10 15 20 25
tiempo, horas
-rO
2, (m
mol
e/(l.
hr))
0,55
0,60
0,65
0,70
0,75
0,80
0,85
0,90
Eh, V
vs
SHE
-rO2redox
0,000,050,100,150,200,250,300,350,400,450,500,550,60
0,55 0,60 0,65 0,70 0,75 0,80 0,85 0,90
Eh, mV vs Ag/AgCl
-rO
2 (m
mol
O2.
l-1.h
r-1)
Figura H.9 Velocidad de consumo deOxigeno y potencial redox enexperiencia pH = 3,0. [Fe2+]ini = 1 g/l.
Figura H.10 Velocidad de consumo deOxigeno en función del potencial redoxen experiencia pH = 3,0. [Fe2+]ini = 1 g/l.
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0 10 20 30
tiempo, horas
-rO
2 (m
mol
O2.
l-1.h
r-1)
0,000
0,005
0,010
0,015
0,020
0,025
0,030
0,035
0,040
-rC
O2
(mm
olC
O2.
l-1.h
r-1)
-rO2-rCO2
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16
0,18
0,20
0 5 10 15 20 25
tiempo, horas
-rC
O2
/ -rO
2
Figura H.11 Velocidad de consumo deOxigeno y Dióxido de carbono enexperiencia pH = 3,0. [Fe2+]ini = 1 g/l.
Figura H.12 Razón velocidad deconsumo de dióxido de carbono/oxigenoexperiencia pH = 3,0. [Fe2+]ini = 1 g/l.
180
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0 5 10 15 20 25
tiempo, horas
-rO
2, (m
mol
e/(l.
hr))
0,55
0,60
0,65
0,70
0,75
0,80
0,85
0,90
Eh, V
vs
SHE
-rO2redox
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,55 0,60 0,65 0,70 0,75 0,80 0,85 0,90
Eh, V vs SHE
-rO
2 (m
mol
O2.
l-1.h
r-1)
Figura H.13 Velocidad de consumo deOxigeno y potencial redox enexperiencia pH = 3,5. [Fe2+]ini = 1 g/l.
Figura H.14 Velocidad de consumo deOxigeno en función del potencial redoxen experiencia pH = 3,5. [Fe2+]ini = 1 g/l.
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0 5 10 15 20 25
tiempo, horas
-rO
2 (m
mol
O2.
l-1.h
r-1)
0,000
0,005
0,010
0,015
0,020
0,025
0,030
0,035
0,040
-rC
O2
(mm
olC
O2.
l-1.h
r-1)
-rO2-rCO2
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16
0,18
0,20
0 5 10 15 20 25
tiempo, horas
-rC
O2
/ -rO
2
Figura H.15 Velocidad de consumo deOxigeno y Dióxido de carbono enexperiencia pH = 3,5. [Fe2+]ini = 1 g/l.
Figura H.16 Razón velocidad deconsumo de dióxido de carbono/oxigenoexperiencia pH = 3,5. [Fe2+]ini = 1 g/l.
181
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0 10 20 30 40 50
tiempo, horas
-rO
2, (m
mol
e/(l.
hr))
0,55
0,60
0,65
0,70
0,75
0,80
0,85
0,90
Eh, V
vs
SHE
-rO2redox
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,55 0,60 0,65 0,70 0,75 0,80 0,85 0,90
Eh, V vs SHE
-rO
2 (m
mol
O2.
l-1.h
r-1)
Figura H.17 Velocidad de consumo deOxigeno y potencial redox enexperiencia pH = 4,0. [Fe2+]ini = 1 g/l.
Figura H.18 Velocidad de consumo deOxigeno en función del potencial redoxen experiencia pH = 4,0. [Fe2+]ini = 1 g/l.
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0 10 20 30 40 50
tiempo, horas
-rO
2 (m
mol
O2.
l-1.h
r-1)
0,000
0,005
0,010
0,015
0,020
0,025
0,030
0,035
0,040
-rC
O2
(mm
olC
O2.
l-1.h
r-1)
-rO2-rCO2
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16
0,18
0,20
0 10 20 30 40 50
tiempo, horas
-rC
O2
/ -rO
2
Figura H.19 Velocidad de consumo deOxigeno y Dióxido de carbono enexperiencia pH = 4,0. [Fe2+]ini = 1 g/l.
Figura H.20 Razón velocidad deconsumo de dióxido de carbono/oxigenoexperiencia pH = 4,0. [Fe2+]ini = 1 g/l.
182
ANEXO IBIOOXIDACIÓN INDIRECTA DE CLORURO FERROSO
Solución Medio CloruroExperiencia Nº Bac Eh Fe Tot Fe 2+ ∆ [Fe2+]
[cel. / ml] V vs SHE [g/l] [g/l] [g/l]25-3-99 6,00E+07 0,466 0,169 0,1690 0,00025-3-99 9,60E+07 0,626 0,169 0,1625 0,06525-3-99 1,52E+08 0,650 0,169 0,1538 0,152
8-4-99 2,00E+06 0,374 0,160 0,1600 0,0008-4-99 3,00E+06 0,623 0,160 0,1552 0,0488-4-99 5,50E+06 0,650 0,160 0,1525 0,0758-4-99 6,25E+06 0,656 0,160 0,1502 0,098
14-4-99 8,25E+06 0,470 0,1642 0,1642 0,00014-4-99 1,60E+07 0,615 0,1642 0,1596 0,04614-4-99 2,40E+07 0,625 0,1642 0,1563 0,07914-4-99 3,20E+07 0,633 0,1642 0,1535 0,10714-4-99 2,60E+07 0,641 0,1642 0,1515 0,127
Solución Medio SulfatoExperiencia Eh Fe2+ ∆ [Fe2+] Σ ∆ [Fe2+] ∆ Nº Bacterias
V vs SHE [g/l] [g/l] [g Fe] [cel / ml]25-3-99 0,852 0,0040 0,0000 0,0000 0,00E+0025-3-99 0,822 0,0127 0,0088 0,0242 3,60E+0725-3-99 0,815 0,0167 0,0127 0,0581 9,20E+07
8-4-99 0,838 0,0068 0,0000 0,0000 0,00E+008-4-99 0,796 0,0346 0,0277 0,0134 1,00E+068-4-99 0,784 0,0545 0,0476 0,0200 3,50E+068-4-99 0,777 0,0708 0,0640 0,0258 4,25E+06
14-4-99 0,813 0,0180 0,0000 0,0000 0,00E+0014-4-99 0,822 0,0127 -0,0053 0,0195 7,75E+0614-4-99 0,828 0,0101 -0,0079 0,0333 1,58E+0714-4-99 0,812 0,0187 0,0007 0,0427 2,38E+0714-4-99 0,800 0,0297 0,0117 0,0483 1,78E+07
ANEXO J PUBLICACIONES INTERNACIONALES GENERADAS CON LOS RESULTADOS DE ESTE TRABAJO DE TESIS J.1. Trabajo publicado en: Biohydrometallurgy: Fundamentals, Technology and Sustainable Development, Ciminelli, VST & Garcia, O. Jr. (eds.), Process Metallurgy 11A, Elsevier Science, Amsterdam, The Netherlands. Trabajo presentado por uno de nosotros (G.M.) en International Biohydrometallurgy Symposium IBS-2001, Ouro Preto, Brazil, Septiembre 16-19, 2001.
Improving the rate of bacterial oxidation of ferrous iron with Acidithiobacillus ferrooxidans in the pH range 2.5 - 5.0. Gabriel Meruane and Tomás Vargas Centro de Estudios Avanzados en Hidrometalúrgia/Electrometalúrgia. Departamentos de Ingeniería de Minas e Ingeniería Química. Universidad de Chile. Tupper 2069 Santiago, Chile. Email: [email protected] In the present work the ferrous ion oxidation activity of Acidithiobacillus ferrooxidans in the pH range 2.5 - 7.0 was characterized. In order to measure the rate of bacterial oxidation of ferrous iron with Acidithiobacillus ferrooxidans in this high pH range a novel experimental methodology was developed. The results of this study showed that the inhibition in the ferrous iron oxidation activity of Acidithiobacillus ferrooxidans observed when increasing the pH to values over 3.0 is partially linked to the formation of ferric iron precipitates, which apparently hinder transport phenomena on the cell surface. In fact, by introducing an accurate control of the amount of iron precipitates formed during the oxidation of ferrous iron in this pH range an important enhancement in the bacterial activity could be obtained. Keywords: Acidithiobacillus ferrooxidans; Ferrous iron oxidation; Bioleaching; Bacterial activity; Iron precipitation.
1. INTRODUCTION
It is well known that the activity of Acidithiobacillus ferrooxidans in the oxidation of ferrous iron rapidly decays at pH ranges over 2.5. In fact, most of the measurements of ferrous iron bacterial oxidation report evidence of bacterial activity only up to pH = 3.5 [1,2,3]. According to the chemiosmotic theory [4] a decrease in the ferrous iron oxidation activity of Acidithiobacillus ferrooxidans is expected when the pH increases. However, the high inhibition that is observed at pHs over 3.0 cannot be explained only by this factor. It is well known that bacterial oxidation of ferrous iron in this pH range is accompanied by iron precipitate formation which usually cover the microorganisms[5]. However, the inhibiting influence of this phenomenon on the bacterial activity has not been evaluated yet.
In the present work the bacterial oxidation of ferrous iron in the pH range 2.5 – 7.0 was investigated. A novel experimental methodology to evaluate bacterial activity in this pH range was developed. The results permitted to evaluate separately the inhibiting effect of both proton concentration depletion and ferric iron precipitation linked to pH increase.
2. MATERIALS AND METHODS
2.1. Bacterial culture preparation A pure strain of Acidithiobacillus ferrooxidans (ATCC 19859) was used in the study. The bacteria were cultured in 250 ml Erlenmeyer flasks using 100 ml of basal medium with composition: 0.4 g/l (NH4)2SO4, 0.4 g/l MgSO4•7H2O, 0.056 g/l K2HPO4•3H2O, 14.9 g/l FeSO4•7H2O [6]. The pH of the medium was adjusted to 1.6 using sulfuric acid. The culture was kept at 30 ºC in a rotary shaker. The bacteria were maintained in the exponential growth phase by daily subculturing 20 % of the solution. The inoculum to be used in each experimental run was prepared from 80 ml of culture sample, which were filtered using a 0.22µm Millipore® membrane. The formed pellet was washed four times: two times with 20 ml of pH 1.6 sulfuric acid solution for iron removal and twice with distilled water for residual acid removal. Then it was resuspended in 10 ml of pH 6.0 distilled water or iron-free basal medium. The cell population in this inoculum, determined by direct counting using a Petroff–Hausser chamber, was typically in the range: 8-10 x 108 cells per ml.
2.2. Experimental assembly and procedure The abundant precipitate formation and rapid pH variations which are normally obtained in the bacterial oxidation of ferrous iron at high pH precludes from monitoring the oxidation process from direct measurement of variations of ferrous iron concentrations in solution. Consequently, a novel method was developed to determine the rate of ferrous iron oxidation from the data of the evolution of Eh and pH during the oxidation process. The scheme of the experimental set up is shown in Figure 1. The cell contained 25 ml of the test solution in which a combined pH electrode Sensorex S201C and a combined Eh electrode Cole-Palmer 5990-57 were immersed. Both electrodes were connected to a data acquisition system Opto 22 that measured the potential difference in both electrodes and send its data to an IBM compatible PC, that registers the pH and Eh variations in time. In order to avoid the short circuit of signals, only one of the reference electrodes was electrically connected and the values of both the pH and Eh electrodes were referred to it. The solution in the cell was agitated using a magnetic stirrer. The cell was maintained at constant temperature of 30±1ºC using a water heating jacket.
Figure 1: Experimental Assembly
(1) Air or N2 bubbling (2) pH electrode (3) Eh Electrode (4) Data Acquisition system (5) Thermostatized water circuit (6) Magnetic stirrer
The test solution was prepared in situ according to the following procedure: 25 ml of distilled water or iron-free basal medium were initially added to the cell and deoxygenated by continuous bubbling of high purity nitrogen. Then, drops of a 1M NaOH solution were added until obtaining a pH slightly over 7.0. Still under nitrogen bubbling, a predetermined amount of ferrous sulfate was added to reach the initial desired ferrous iron concentration (100 , 500 or 1000 ppm). This procedure permitted the solubilization of ferrous iron at high pH preventing completely its spontaneous oxidation. If required, some additional NaOH was added to adjust the solution to pH = 7.0. Finally, bacteria resuspended in about 1 ml of distilled water was added in order to fix in the test solution an initial bacterial concentration of 2 x 107 cells/ml. Ferrous iron oxidation was started when switching from nitrogen to air bubbling. Twelve different experimental conditions were used, corresponding to 3 different initial ferrous iron concentrations (100, 500 and 1000 ppm), both in iron-free basal medium and nutrients-free solution, and both in abiotic and inoculated conditions. Each experimental condition was tested in duplicate. Ferrous iron oxidation rate was determined from the data of the evolution of Eh and pH according to a calculation procedure described below.
3. RESULTS AND DISCUSSION
3.1. Calculation methodology In every experiment of ferrous iron oxidation a continuous pH decrease and Eh increase was observed. A typical trend is shown in Figure 2 which corresponds to the case of an inoculated basal medium solution with an initial ferrous iron concentration of 500 ppm. Shifting of the pH towards acidic values results from the simultaneous consumption of protons in the oxidation of ferrous iron and the release of protons related to ferric iron precipitation. Shifting of the Eh towards more positive values is related to a net increase in the Fe+3/Fe+2 ratio in solution. The oxidation of ferrous iron can be expressed by the reaction: Fe2+ + ¼ O2 + H+ → Fe3+ + ½ H2O (1) From initial experimental measurements using the methodology exposed in [7] it was demonstrated that the precipitation of ferric iron in the system with nutrients-free solution was well described by the reaction: Fe3+ + 3 H2O → Fe(OH)3 + 3 H+ (2) On the other hand, in the system with basal medium, the precipitation process was more accurately described by the following reaction, where X correspond to a monovalent cation [8]. X+ + 3 Fe3+ + 2 SO4
2- + 6 H2O → XFe3(SO4)2(OH)6 + 6 H+ (3)
Figure 2. Evolution of Eh and pH. Initial bacterial population: 2x107 cells/ml. Initial ferrous iron concentration: 500 ppm. Basal medium solution.
If the rate of ferrous iron oxidation is defined as:
[ ]1
2
VdtFed −=
+
(4)
and the rate of ferric iron precipitation is defined as:
[ ]2V
dtFed tot
−= (5)
the mass balance for H+ and Fe+3 in solution in the case of basal medium is given by the equations,
Fe3+ : [ ]21
3
VVdtFed −=
+
(6)
H+ : [ ]21 2 VV
dtHd •+−=
+
(7)
and in the case with nutrients-free solution by equation 6 and the equation:
H+ : [ ]21 3 VV
dtHd •+−=
+
(8)
Therefore, V1 and V2 can be expressed in the case with basal medium as:
[ ] [ ]
23
1
+=
++
dtFed
dtHd
V (9)
[ ] [ ]22
3
2
•+=
++
dtFed
dtHd
V (10)
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0 200 400 600 800 1000Time, min
Eh,
Vol
ts v
s A
g/A
gCl
2.02.5
3.03.54.0
4.55.0
5.56.0
6.57.0
pH
Eh
pH
and in the case with nutrients-free solution as equation 9 and the equation:
[ ] [ ]
233
2
•+=
++
dtFed
dtHd
V (11)
To evaluate the rate of ferrous iron oxidation during the experiment a preliminary calibration procedure was developed to obtain explicit data of [H+] and [Fe+3] from the values of Eh and pH. For this purpose Nernst expressions which relate the solution redox potential with the ferric/ferrous ratio in solution were obtained, giving:
In basal medium:
+= +
+
][][log*0579.0471.0
2
3
FeFe
Eh (12)
In nutrients-free solution :
+= +
+
][][
log*0644.0492.0 2
3
FeFe
Eh (13)
From calibration of the pH elecrode the following expression, which relate the potential signal (V), to H+ concentration, was obtained:
[ ]( )++=∆ HV log*056.04092.0 (14) The concentration of ferric iron and ferrous iron was calculated from values of Fe tot and Eh at each time during the experiment. Finally, ferrous iron oxidation rate was evaluated according to equation 9, by evaluating at each time the instantaneous variation of ferric iron and protons concentration.
3.2. Ferrous iron oxidation rates. The results of the calculated ferrous iron oxidation rate for the experiment with 500 ppm initial ferrous iron concentration for the abiotic case are shown in Figure 3 and for the inoculated case in Figure 4. Represented data correspond to values of instantaneous oxidation rates as a function of the pH, which evolves with time. Figure 3 shows that there is a noticeable rate of abiotic ferrous iron oxidation in this high pH range. Initially, there is a zone which does not show a clear variation trend in the oxidation rate, which should corresponds to a transition before full oxygenation of the solution is reached (zone I). Then the oxidation rate rapidily decays as a result of the acidification process (zone II). In Figure 4, four areas can be defined: zones I and II are similar to the behavior observed in the abiotic case; in zone III the logarithm of the oxidation rate grows almost linearly with the pH decrease; in zone IV this increasing trend is attenuated. The previous results show that the ferrous iron oxidation at pH values higher than 4.8 –5.0 is not related to bacterial activity. On the contrary, at pH below 4.8 the oxidation rate is mainly linked to bacterial action and rises steadily with the pH decrease. This behavior was also observed in experiments at 100 and 1000 ppm. Accordingly, the net rate of biological oxidation of ferrous iron was obtained in each case after discounting the initial abiotic oxidation component.
-2,0
-1,5
-1,0
-0,5
0,0
0,5
1,0
2 3 4 5 6 7
pH
log
(Oxi
datio
n R
ate)
[mg
Fe
/ Hr]
ZONE I
ZONE II
Figure 3. Ferrous iron oxidation rate. [Fe2+]initial = 500 ppm, non inoculated, in basal medium.
-2.0
-1.5
-1.0
-0.5
0.0
0.5
1.0
2 3 4 5 6 7
pH
log
(O
xid
ati
on
Ra
te)
[mg
Fe
/ H
r]
ZONE IVZONE III
ZONE II
ZONE I
Figure 4. Ferrous iron oxidation rate. [Fe2+]initial = 500 ppm, inoculated in basal medium.
The evolution of pH in each experiment was accompanied by a continuous decrease of the ferrous iron concentration and increase of ferric iron concentration. Therefore, values of oxidation rate obtained in different experiments can not be directly compared with each other. Assuming that the ferrous oxidation kinetics followed a Monod dependence on ferrous iron and includes a term related to ferric inhibition, the rate of ferrous iron oxidation (v) can be expressed [9] as:
( )][*1*][][*
32
2
1 ++
+
++=
FeKKFe
FeVV
IS
Max (15)
where Vmax = µmax/Y, Y being the yield for ferrous iron oxidation. Using this expression values of Vmax were obtained from the values of v at each pH. The following values were used in this calculations[10]: KS = 73 ppm, KI = 1.29*10-3 ppm-1. Values of [Fe+2] and [Fe+3] at each pH were obtained from the mass balance in the system (see section 3.1). Values of Vmax obtained with this normalization procedure are shown in Figures 5 and 6, which compares the behavior in basal medium and nutrients-free solution for 100 ppm and 1000 ppm respectively.
Figure 5. Calculated values of Vmax, [Fe2+]initial = 100 ppm.
Figure 6. Calculated values of Vmax, [Fe2+]initial = 1000 ppm.
0.0E+00
5.0E-07
1.0E-06
1.5E-06
2.0E-06
2.5E-06
3.0E-06
2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0pH
Max
imum
Oxi
datio
n R
ate,
mg
Fe/
(H
r ce
ll)
Nutrients-free
Basal Medium
0.0E+00
5.0E-07
1.0E-06
1.5E-06
2.0E-06
2.5E-06
3.0E-06
2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0pH
Ma
xim
um
Oxi
da
tio
n R
ate
, g
Fe
/ (H
r ce
ll) Nutrients-free
Basal Medium
Figure 7. Accumulated mass of Fe3+ precipitates. [Fe2+]initial = 100 ppm.
Figure 8. Accumulated mass of Fe3+ precipitates. [Fe2+]initial = 1000 ppm.
Results in Figures 5 and 6 show that with the present methodology it is possible to quantify ferrous iron bacterial oxidation activity in the pH range 3.0-5.0. Normally, works conducted with standard methodologies has been able to quantify the bacterial ferrous iron oxidation activity only up to pH = 3.5 [1,2,3]. Bacterial oxidation activity is possible at this high pH because with the present experimental approach there is an accurate control of the amount of ferric iron precipitates formation. The amount of ferric iron accumulated as precipitates during each experiment, which can be also obtained from the mass balance shown in section 3.1, is explicitly shown in Figures 7 and 8 for the cases of 100 and 1000 ppm respectively. From these figures one can see, for instance, that at pH = 3.5 the amount of precipitated ferric iron is only 10 ppm in every experimental condition. Data in Figure 5 and 6 show that, except for the experiment with nutrients-free solution and 1000 ppm, the bacterial oxidation activity increases with the pH decrease in an important range of pH. This trend is in agreement with what is expected from the role of protons according to the chemiosmotic theory [4]. However, the bacterial oxidation activity decays in the lower pH range.This decay reveals, according to our interpretation, the inhibiting influence of ferric iron precipitate formation. Figures 7 and 8 show that the amount of precipitates formed in each experiment grows almost exponentially with the pH decrease. For instance, in the experiment with basal medium containing 1000 ppm the amount of ferric iron precipitates formed at pH = 3.0 is about 10 times the one obtained at pH = 3.5. It is then very likely that in the lower pH range the inhibiting effect associated to the presence of such a high mass of precipitates may counteract the positive influence of pH decrease. Data in Figures 5 and 6 also show that bacterial activity in nutrients-free solution is much smaller than in the case of basal medium. This is an evidence that the composition of the ferric iron precipitate is also influencing its inhibition effect on the bacterial activity. As it was reported above, when using nutrients-free solutions ferric iron is precipitated solely as ferric hydroxide (see equation 2), while in the case of basal medium ferric iron is precipitated as a jarosite-type compound (see equation 3). Therefore, these results show that the formation of ferric hydroxide has a stronger inhibiting influence than jarosite formation on the bacterial activity. This conclusion is consistent with the blocking influence which is normally associated to gel-like precipitates such as ferric hydroxide [11]. On the contrary, jarosites are normally associated to porous and crystalline precipitates [12].
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0pH
Fe
rric
Iro
n p
reci
pita
tes,
pp
mNutrients-free
Basal Medium
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0pH
Fe
rric
Iro
n p
reci
pita
tes,
pp
m
Nutrients-free
Basal Medium
ACKNOWLEDGMENTS This work was conducted with the support of Fundación Andes/Fundación Antorcha grant C-13398/6. REFERENCES 1. B. Pesic, D.J. Oliver and P. Wichlacz, Biotechnology and Bioengineering 33 (1989) 428. 2. D. Kupka and I. Kupsáková, In: R. Amils and A. Ballester (Editors), Biohydrometallurgy and the Environment Towards the Mining of the 21st Century, Part A: Proceedings of an International Biohydrometallurgy Symposium. Elsevier, Amsterdam, (1999) 387. 3. D.G. MacDonald and R.H. Clark, The Canadian Journal of Chemical Engineering 48(1970) 699. 4. W.J. Ingledew, Biochimica et Biophysica Acta 683 (1982) 117. 5. Espejo R., Escobar B., Jedlicki, Uribe P. and Badilla_Ohlbaum R., Applied & Env. Microb.54(1988) 1694 6. O. H. Touvinen and D.P. Kelly, Archives on Microbiology 68 (1973) 285. 7. R.H. Byrne and Yu-Ran Luo, Geochimica et Cosmochimica Acta 64 (2000) 1873. 8. G. Meruane and T. Vargas, “On the mechanism of inhibition of bacterial oxidation of ferrous iron with Thiobacillus ferrooxidans at low and high pH”. In preparation. 9. M.S. Liu, R.M.R. Branion and D.W. Duncan, The Canadian Journal of Chemical Engineering 66 (1988) 445. 10. P.I. Harvey and F.K. Crundwell, Applied and Environmental Microbiology 63 (1997) 2586. 11. J.W. Mellor, Química Inorgánica Moderna, Ed El Ateneo, 1958. 12. N. Lazaroff, W. Sigal and A. Wasserman, Applied and Environmental Microbiology 43 (1982) 924.
J.2. Trabajo enviado a: Hydrometallurgy en Enero 2002. Actualmente el trabajo se encuentra aceptado y en corrección.
1
Bacterial oxidation of ferrous iron by Acidithiobacillus ferrooxidans in the pH
range 2.5 - 7.0.
Gabriel Meruane and Tomás Vargas∗
CHEM-CHILE. Centro de Hidrometalúrgia/Electrometalúrgia. Depto. de Ingeniería de Minas
Depto. de Ingeniería Química. Universidad de Chile. Tupper 2069 Santiago, Chile.
Abstract
The oxidation of ferrous iron by Acidithiobacillus ferrooxidans in the pH range 2.5 - 7.0 was
characterized. In order to measure the rate of bacterial oxidation of ferrous iron with
Acidithiobacillus ferrooxidans in this high pH range a novel experimental methodology was
developed. The results showed that the inhibition of ferrous iron oxidation activity by
Acidithiobacillus ferrooxidans observed at pH values above 3.0 is partially linked to the
formation of ferric iron precipitates, which apparently hinder transport processes on the cell
surface. By introducing an accurate control on the amount of iron precipitates formed during
the oxidation of ferrous iron in this pH range, enhanced bacterial activity was obtained.
Keywords: Acidithiobacillus ferrooxidans; Ferrous iron oxidation; Bioleaching; Bacterial
activity; Iron precipitation.
∗ Correspondence author. Tel.: (562)6784283; Fax: (562) 6991084. E-mail address: [email protected]
2
1. INTRODUCTION
The main mechanism of bacterial catalysis in the dissolution of sulfide minerals is based on
the bacterial oxidation of ferrous iron, with oxygen as electron acceptor, according to the
reaction:
Fe2+ + ¼ O2 + H+ → Fe3+ + ½ H2O (1)
It is known that ferrous iron oxidation by Acidithiobacillus ferrooxidans rapidly decreases at
pH greater than 2.5 (Nakamura et al., 1986; Pesic et al., 1989; Kupka and Kupsáková, 1999).
In most reports of ferrous iron oxidation by acidophiles, bacterial catalysis is significant only
up to pH ~3.5 (MacDonald and Clark, 1970; Pesic et al., 1989; Kupka and Kupsáková, 1999).
According to the chemiosmotic theory, a decrease in the ferrous iron oxidation activity of
Acidithiobacillus ferrooxidans is expected when the pH increases (Ingledew, 1982). Some
authors have suggested that the formation of ferric iron precipitates can also have an
inhibiting influence in this pH range (Nemati et al., 1998; Espejo et al., 1988), though there is
not clear evidence to support this suggestion. This lack of understanding is related to the
limitations of the current methodologies, which prevent accurate measurements of bacterial
ferrous iron oxidation rate at pH over 3.0. Current measurements are mainly based on the
monitoring of ferrous iron concentration decrease, oxygen consumption or Eh evolution
(MacDonald and Clark, 1970; Pesic et al., 1989; Kupka and Kupsáková, 1999). These
methods are not directly applicable at high pH ranges, where ferrous iron oxidation is
accompanied by rapid variations of pH and total iron concentration.
In the present work the bacterial oxidation of ferrous iron in the pH range 2.5 – 7.0 was
investigated. A novel experimental methodology was developed to evaluate bacterial activity
over this pH range. This approach permitted the separate evaluation of the inhibiting effects
of both proton concentration depletion and ferric iron precipitation linked to pH increase on
bacterial ferrous iron oxidation.
3
2. MATERIALS AND METHODS
2.1. Bacterial culture preparation
A pure strain of Acidithiobacillus ferrooxidans (ATCC 19859) was used in the study. The
bacteria were cultured in 250 mL Erlenmeyer flasks containing 100 mL of medium with the
composition: 0.4 g/L (NH4)2SO4, 0.4 g/L MgSO4*7H2O, 0.056 g/L K2HPO4*3H2O, 14.9 g/L
FeSO4*7H2O (Touvinen and Kelly, 1973). The pH of the medium was adjusted to 1.6 using
sulfuric acid, and cultures were incubated, shaken, at 30°C. The bacteria were maintained in
the exponential growth phase by daily subculturing 20 % of the solution.
The inoculum to be used in each experimental run was prepared from 80 mL of culture
sample, which was filtered through a 0.22µm Millipore® membrane. The bacterial pellet was
washed four times: twice times with 20 mL of pH 1.6 sulfuric acid solution for iron removal
and twice with distilled water to remove residual acid. It was then resuspended in 10 mL of
pH 6.0 distilled water or iron-free basal medium. The cell population in this inoculum,
determined by direct counting using a Petroff–Hausser chamber, was typically in the range: 8-
10 x 108 cells per mL.
2.2. Experimental assembly and procedure
The abundant precipitate formation and rapid variations in pH that are associated with the
oxidation of ferrous iron at pH > 2.3, precludes accurate measurements of the bacterial
process by direct measurement of variations of ferrous iron concentrations in solution.
Consequently, a novel method was developed to determine the rate of ferrous iron oxidation
from the data of the evolution of Eh and pH during the oxidation process.
The scheme of the experimental set up is shown in Figure 1. The cell contained 25 mL of the
test solution in which a combined pH electrode (Sensorex S201C) and a combined Eh
electrode (Cole-Palmer 5990-57), which uses Ag/AgCl(sat) as reference electrode, were
immersed. Both electrodes were connected to a data acquisition system Opto 22 that
measured the potential difference in both electrodes and sent the data to an IBM compatible
PC that registers the pH and Eh variations in time. In order to avoid the short circuit of
4
signals, only one of the reference electrodes was electrically connected and the values of both
the pH and Eh electrodes were referred to it. The solution in the cell was agitated using a
magnetic stirrer, and the cell was maintained at constant temperature of 30±1ºC using a water-
heating jacket.
The test solution was prepared in situ according to the following procedure: 25 mL of iron-
free basal medium were initially added to the cell and deoxygenated by the continuous
bubbling of high purity nitrogen. Next, 1M NaOH solution was added drop wise until a pH
slightly over 7.0 was obtained. Whilst still under nitrogen bubbling, a predetermined amount
of ferrous sulfate was added to reach the initial desired ferrous iron concentration (1 g/L).
This procedure enabled the solubilization of ferrous iron to occur at high pH completely
preventing its spontaneous oxidation. If required, some additional NaOH was added to
readjust the solution to pH = 7.0. Finally, bacteria, resuspended in about 1 mL of distilled
water, were added to give an initial bacterial concentration of 2 x 107 cells/mL. Ferrous iron
oxidation was initiated by when switching from nitrogen bubbling to air bubbling. All the
experiments were conducted with 1 g/L initial ferrous iron concentration, and at 4 different
initial bacterial concentrations: 8 x 106, 2 x 107, 5 x107, 8 x 107 cells/mL. A blank experiment
in abiotic conditions with the same initial ferrous iron concentration was also conducted.
Every experimental run was conducted in duplicate. Ferrous iron oxidation rates were
determined from the data of the evolution of Eh and pH, according to a calculation procedure
described below.
3. RESULTS AND DISCUSSION
3.1. Calculation methodology
In every experiment a continuous pH decrease and Eh increase was observed, which was
triggered by the oxidation of ferrous iron, either by a chemical or microbiologically mediated
mechanism. A typical trend is shown in Figure 2, which corresponds to the case of an
inoculated basal medium solution containing an initial ferrous iron concentration of 1 g/L.
Shifting of the Eh towards more positive values is directly related to the net increase of the
Fe+3/Fe+2 ratio in solution. Shifting of the pH towards acidic values results from the balance
5
between the simultaneous consumption of protons in the oxidation of ferrous iron and the
release of protons related to ferric iron precipitation. A calculation procedure to determine the
rate of ferrous iron oxidation from the variations of Eh and pH was developed, as described
below.
The oxidation of ferrous iron can be expressed by the reaction described in equation 1. Using
the methodology proposed in Byrne and Luo (2000), it was experimentally shown that the
ferric iron precipitation process in the basal medium could be described by the following
stoichiometry (Meruane, 2002):
X+ + 3 Fe3+ + 2 SO42- + 6 H2O → XFe3(SO4)2(OH)6 + 6 H+ (2)
where X+ corresponds to a monovalent cation. This stoichiometry provides the numeric
relation between moles of precipitated iron and moles of released protons to be used in the
calculations.
If the rate of ferrous iron oxidation is defined as:
[ ]+−=
+
2
2
FeV
dtFed (3)
and the rate of ferric iron precipitation is defined as:
[ ]ppt
tot
VdtFed −= (4)
The mass balance for Fe+3 and H+ in solution are given by the equations:
Fe3+ : [ ]pptFe
VVdtFed −= +
+
2
3
(5)
H+ : [ ]pptFe
VVdtHd *22 +−= +
+
(6)
6
Therefore, +2FeV and pptV can be expressed as:
[ ] [ ]dtFed
dtHd
VFe
++
∗+=+
3
22 (7)
[ ] [ ]dtFed
dtHd
Vppt
++
+=3
(8)
A preliminary calibration procedure was developed to obtain explicit data of [H+] and [Fe+3]
from the values of Eh and pH. For this purpose, the Nernst equation, which relates the
solution redox potential with the ferric/ferrous ratio in solution, were obtained, giving:
+= +
+
][][log*0579.0471.0
2
3
FeFe
Eh (9)
(At 30°C)
This equation proved to be valid in the pH range 1.4 – 2.0 and total iron concentration range
0.1 – 1 g/l.
From calibration of the pH electrode the following expression, which relates the potential
signal ( V∆ ), to H+ concentration, was obtained:
( )][log*056.04092.0 ++=∆ HV (10)
The concentrations of ferric iron and ferrous iron were calculated from values of [Fetot] and
Eh at each time during the experiment using the following expressions:
−
+
+
== 579.0471.0
2
3
10][][ Eh
FeFe
R (11)
][1
][ 3 totFeR
RFe
+=+ (12)
RFe
Fetot
+=+
1][][ 2 (13)
7
Ferrous iron oxidation rate and ferric iron precipitation rate were evaluated according to
equations (7) and (8), by calculating at each time the instantaneous variation of ferric iron and
protons concentration.
The total ferric iron precipitated at each time was calculated using the following equation:
∫=t
pptTppt dtVVFe
0][ (14)
Finally, the total iron concentration to be used in the next time step was evaluated using the
expression:
Tppttot
ttot VFeFeFe /][][][ 0 −= (15)
The validity of the proposed calculation methodology was assessed by comparing at the end
of each experiment the final iron concentration calculated according to equation (15) from the
evolution of Eh and pH (see Figure 2), with that determined by atomic absorption in the final
solution. Calculated iron concentrations presented a deviation which was always less than 10
% with respect to the experimental values. This results ensured the reliability of the procedure
proposed for determining ferrous iron oxidation rates.
3.2 Ferrous iron oxidation rates.
Results of the calculated rates of ferrous iron oxidation for the experiment with 1g/L initial
ferrous iron concentration are shown in Figure 3 (abiotic oxidation), and Figure 4
(biologically-enhanced oxidation). Represented data correspond to values of instantaneous
oxidation rates as a function of the pH, which continuously decreased with time from the
initial value of 7.0.
Results in Figure 3 for abiotic conditions shows that, in this high pH range, there is a
significant rate of chemical ferrous iron oxidation. In the pH range 5.5 to 7.0 this rate is
8
practically constant, but at pH below 5.5 the oxidation rate rapidly decays as a result of the
acidification of the solution.
Results in Figure 4 for the inoculated case show that, in the pH range 5.0 to 7.0, the
dependence of ferrous iron oxidation rate on pH in the presence of bacteria was similar to the
one observed in the abiotic case. This implies that, in this pH range, ferrous iron oxidation is
mainly the result of the chemical oxidation of ferrous iron. At pH below 5.0, however, in the
inoculated experiment the rate of ferrous iron oxidation increased with pH decrease, which
indicates that in this range the process is mainly related to bacterial catalysis. From
comparison of data in Figure 4 and those in Figure 3, it can be seen that, e.g. at pH 3.0, the
rate of bacterial oxidation of ferrous iron is about 104 times larger than the corresponding rate
of chemical oxidation.
The former results show that it is possible to determine the net rate of bacterial oxidation of
ferrous iron after discounting, at each pH, the component attributable to abiotic ferrous iron
oxidation. Results of bacterial oxidation of ferrous iron obtained with this procedure are
shown in Figure 5 for experiments with an initial ferrous iron concentration of 1 g/L and a
varying concentration of initial inoculated bacteria. Data in Figure 5 were then used to obtain
values of Vmax, which enabled comparison of bacterial activity determined at the 4 different
experimental runs. For this purpose, the rate of ferrous iron oxidation was assumed to follow
a Monod dependence on ferrous iron, but also included a term related to ferric iron inhibition.
Then the specific ferrous iron oxidation rate ( bactFeFe NVV ++ = 2
2 ) was expressed as (Liu et
al., 1988):
( )][*1*][][*
32
2
2++
+
++=+
FeKKFe
FeVV
IS
MaxFe (16)
where Vmax = µmax/Y, Y being the yield for ferrous iron oxidation. Using this expression
values of Vmax were obtained from the values of +2FeV at each pH. In this calculation the
following values were used for parameters in equation (16) (Harvey and Crundwell, 1997):
KS = 73 mg/L, KI = 1.29 x 10-3 L/mg. Values of Vmax obtained with this procedure are shown
9
in Figure 6, which compares the behavior of experiments with different initial bacterial
populations (between 8 x 106 and 8 x107 cell/mL) and 1 g/L initial ferrous iron concentration.
3.3. Mechanism of bacterial activity inhibition.
Data in Figure 6 show first that for each experimental run, Vmax starts to increase with pH
decrease at pH below 5.0. This behavior is in agreement with the tendency predicted by the
chemiosmotic theory (Ingledew, 1982). In each run, however, below a certain pH Vmax starts
to decrease with pH decrease. This last trend can not be related to the inhibition of bacterial
activity by acidity, a phenomenon which is only relevant at much lower pH (<pH 2.0) (Pesic
et al., 1989; Nemati et al., 1998; Meruane, 2002). On the other hand, it is interesting to note
that the measured dependence of Vmax on pH was strongly influenced by the population of
bacteria initially added to the experiment.
The possible involvement of the formation of ferric iron precipitates on the peculiar pH
dependence of bacterial activity, indicated by the curvature of the line graphs in Figure 6, was
further investigated. The amounts of ferric iron precipitates that accumulated during the
evolution of pH in each experiment were calculated from the expression:
cellpptppt
sp NFeFe ][][ = (17)
In this expression ][ pptspFe corresponds to the specific amount of ferric iron precipitated per
bacterium. ][ pptFe was calculated according to equation (14). cellN , the population of bacteria
present in the flask at each time during the experiment was calculated from integration of
bacteria grown out of the ferrous iron oxidation, according to the following expression:
∫ ++=t
t Fecellcell dtVYNN0
2*0 (18)
where t0 is the time at which pH reaches a value about 5.0 and the bacterial oxidation starts
and 0cellN is the initial bacterial population.
10
Results of the calculation of ][ pptspFe , shown in Figure 7, demonstrate that the amount of ferric
iron precipitated per bacterium during each experiment is in fact larger in experiments which
show relatively lower bacterial activity. These results clearly suggest that ferric iron precipitates
may be playing an inhibiting role on bacterial iron oxidation. To further clarify the inhibiting
influence of iron precipitates formation on bacterial oxidizing activity, a simple kinetic
mechanism to explain its role was proposed and tested. Assuming that an important fraction of
the formed ferric iron precipitates remains on the cell surface forming a compact layer, Vmax can
be expressed in terms of a mixed control kinetic mechanism involving a chemical resistance and
a diffusional resistance (Levenspiel, 1962). The kinetics of the chemical reaction can be related
to the chemiosmotic mechanism and expressed as chemV ; the diffusional process can be
related to diffusion of protons across the ferric iron precipitates layer formed on the bacteria.
Therefore, Vmax can be expressed as:
xk
VV
chem
max ∆+=
*1 (19)
where ∆x represents the thickness of the precipitates layer and k is a constant proportional to
the ratio between the diffusional and the kinetics constant. The validity of the proposed model
was tested by modeling curves of Vmax vs pH for runs b, c and d in Figure 6, as a function of the
amount of ferric iron precipitated. Values of Vmax from curve a in Figure 6, the run with slowest
][ pptspFe and larger bacterial population, were used as a pseudo- chemV (here denominated chem
psV ).
Consistently with expression (19), curves of calcmaxV vs pH were calculated using the following
formula:
]['1 pptsp
chempscalc
max Fek
VV
∗+= (20)
Values of k' were adjusted so that the maximum in the calculated curves equaled the maximum
in the experimental curves in Figure 6, for each experimental run.
11
Values of calcmaxV calculated with this procedure are shown in Figure 8: curves b, c, d correspond to
modeling of experimental curves b, c, d in Figure 6; curve a simply reproduces curve a from
Figure 6, and is included in this figure as a reference. Results in Figure 8 show that the calculated
curves reproduce very well the tendency of Vmax - pH curves in Figure 6. In addition, maximum
Vmax values in each curve are located in pH values very close to the respective experimental
ones. The values of k', however, are different for each calculated curve, being: 2x107 for curve b,
1.2 x 108 for curve c, and 1.2 x 109 for curve d. This may be related to variations of the fraction
of formed ferric iron precipitates that is effectively attached to the bacteria surface and/or to
variations in the permeability of the passivating layer formed.
Results of the former mechanistic analysis show that the decrease in bacterial activity normally
observed at pH values above 2.5 is, in fact, partially related to the formation of a layer of ferric
iron precipitates on the bacteria, which hinders proton diffusion. Previous measurements of
bacterial oxidation activity in this pH range with conventional methodologies have mostly been
conducted using much greater ferrous iron concentrations (1 – 9 g/L; Nemati et al., 1998). In
such cases, the inhibition observed at high pH may be related to the formation of massive
amounts of ferric iron precipitates. On the other hand, reducing the concentration of ferrous iron
can lead to a dramatic reduction of the amount of precipitates formed. As a consequence, and
according to equation (19), this can lead to a dramatic increase of the bacterial oxidizing activity
of Acidithiobacillus ferrooxidans at pH above 2.5. This behavior could be probed with the use of
the methodology presented in this work, which enables determination of bacterial activity at very
low ferrous iron concentrations.
Maximum rates of bacterial iron oxidation can be obtained when the formation of ferric iron
precipitates is completely avoided. In this hypothetical situation the rate of bacterial oxidation of
ferrous iron will be solely controlled by the chemiosmotic mechanism. The present methodology
has laid a conceptual base, which will facilitate the evaluation of the intrinsic chemiosmotic
kinetics of At. ferrooxidans
12
List of symbols
[Fe2+] Ferrous iron concentration (mg/L)
[Fe3+] Ferric iron concentration (mg/L)
[Feppt] Ferric iron precipitates formed (mg)
][ pptspFe Specific amount of ferric iron precipitated per bacteria (mg/cell)
[Fetot] Total iron concentration (mg/L)
[H+] Proton concentration (mg/L)
k adjustment parameter in equation (19) (1/m)
k’ adjustment parameter in equation (29) (cell/mg)
KS Michaelis-Menten constant (mg/L)
KI Ferric iron inhibition constant (no units)
Ncell Bacterial concentration in solution (cell/mL)
R Ferric to ferrous concentration ratio (no units) chemV Maximum specific ferrous iron oxidation rate non affected by ferric
precipitates (mg/hr cell) chempsV pseudo values of chemV ( mg/hr cell)
+2FeV Ferrous iron oxidation rate (mg/hr)
+2FeV Specific ferrous iron oxidation rate (mg/(hr cell))
Vmax Maximum specific ferrous iron oxidation rate (mg/(hr cell)) calc
maxV Maximum specific ferrous iron oxidation rate calculated using chempsV and
][ pptspFe (mg/(hr cell))
pptV Ferric iron precipitation rate (mg/hr)
VT Total volume (0.025 L)
Y Bacterial Growth yield on ferrous iron oxidation (cell/mg Fe)
V∆ Potential difference at the pH electrode (Volt vs Ag/AgCl)
∆x Ferric iron precipitates thickness at bacterial surface (m)
13
ACKNOWLEDGMENTS
This work was conducted with the support of Fundación Andes/Fundación Antorcha grant
C-13398/6. We thank CONICYT for financial support to one of us (G.M.). We are also
grateful to Héctor Jordan for helpful discussion.
REFERENCES
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solubility products K*SO = [Fe3+][H+]-2.86, Geochimica et Cosmochimica Acta 64(11), 1873-
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ferrous iron and elemental sulfur by Thiobacillus ferrooxidans, Applied and Environmental
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Thiobacillus ferrooxidans, The Canadian Journal of Chemical Engineering 48, 669-676.
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biological Fe2+ oxidation with rotating biological contactors, Water Resource, 20(1), 73-77.
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Engineering Journal, 1,171-190.
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Use of membrane filters and ferrous iron agar to determine viable number and comparison
with CO2 fixation and iron oxidation measures of growth, Archives on Microbiology 68, 285.
15
Figures Captions
Figure 1: Experimental assembly. 1. Air/ N2 bubbling; 2. pH electrode; 3. Eh electrode;
4. Data acquisition system; 5. Thermostatized water circuit; 6.Magnetic stirrer.
Figure 2. Evolution of Eh and pH. Initial bacterial population: 2x107 cells/mL. Initial ferrous
iron concentration: 1 g/L.
Figure 3. Ferrous iron oxidation rate in abiotic system. [Fe2+]initial = 1 g/L.
Figure 4. Ferrous iron oxidation rate in inoculated system. [Fe2+]initial = 1 g/L. . Initial bacterial
population: 2x107 cells/mL.
Figure 5. Net rate of bacterial ferrous iron oxidation for experiments with different initial
bacterial population. Curve a: 8 x 107 cell/mL, Curve b: 5 x 107 cell/mL, Curve c: 2 x 107
cell/mL, Curve d: 8 x 106 cell/mL. [Fe2+]initial = 1 g/L.
Figure 6. Values of Vmax for experiments with different initial bacterial population. Curve a: 8
x 107 cell/mL, Curve b: 5 x 107 cell/mL, Curve c: 2 x 107 cell/mL, Curve d: 8 x 106 cell/mL.
[Fe2+]initial = 1 g/L.
Figure 7. Specific amount of ferric iron precipitates formed per bacteria for experiments with.
different initial bacterial population. Curve a: 8 x 107 cell/mL, Curve b: 5 x 107 cell/mL,
Curve c: 2 x 107 cell/mL, Curve d: 8 x 106 cell/mL. [Fe2+]initial = 1 g/L.
Figure 8. Values of calcmaxV as function of pH. Curve a: 8 x 107 cell/mL (reproduction of Vmax in
Figure 6), Curve b: 5 x 107 cell/mL, Curve c: 2 x 107 cell/mL, Curve d: 8 x 106 cell/mL.
16
Figure 1
17
Figure 2
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0 200 400 600 800 1000Time, min
Eh,
Vol
ts v
s A
g/A
gCl
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
5,0
5,5
6,0
6,5
7,0
pH
pH
Eh
18
Figure 3
-2.0
-1.5
-1.0
-0.5
0.0
0.5
1.0
1.5
2 3 4 5 6 7
pH
log
(VFe
2+ )
[mg
Fe
/ Hr]
19
Figure 4
-2.0
-1.5
-1.0
-0.5
0.0
0.5
1.0
1.5
2 3 4 5 6 7
pH
log
(VFe
2+ )
[mg
Fe
/ Hr]
20
Figure 5
0.0E+00
1.0E-06
2.0E-06
3.0E-06
2 3 4 5 6 7pH
VFe
2+,
g F
e/ (
Hr
cell)
a
c
d b
21
Figure 6
0.0E+00
1.0E-06
2.0E-06
3.0E-06
2 3 4 5 6 7pH
Vm
ax,
g F
e/ (
Hr
cell)
a
c
d b
22
Figure 7
0.0E+00
1.0E-09
2.0E-09
3.0E-09
4.0E-09
5.0E-09
6.0E-09
3 4 5 6pH
[Fep
pt sp
], m
g/ce
lld
c
b
a
23
Figure 8
0.0E+00
1.0E-06
2.0E-06
3.0E-06
2 3 4 5 6 7
pH
Vm
axca
lc
a
c
d
b
J.3. Trabajo enviado a: Biotechnology and Bioengineering en Noviembre 2001. Aceptado en Abril 2002. En prensa, Production Number: # BB01-786.
