osnove bioorganometalne kemije
TRANSCRIPT
Osnove bioorganometalne
kemije
Izv. prof. dr. sc. Lidija Barišić
Literatura:
1. G. Jaouen (Editor), Bioorganometallics: Biomolecules, Labeling, Medicine, John Wiley &
Sons, Weinheim, 2006.
2. G. Simonneaux (Editor), Bioorganometallic Chemistry (Topics in Organometallic
Chemistry), Springer-Verlag Berlin Heidelberg, 2006.
3. P. Štepnička (Editor), Ferrocenes: Ligands, Materials and Biomolecules, John Wiley &
Sons, Chichester, 2008.Sons, Chichester, 2008.
4. D. R. van Staveren, N. Metzler-Nolte, Bioorganometallic Chemistry of Ferrocene, Chem.
Rev. 104 (2004) 5931-5985.
5. V. Rapić, M. Čakić Semenčić I. Organometalna i bioorganometalna kemija, Kem. Ind. 60
(2011) 61-79.
6. E. A. Hillard, G. Jaouen, Bioorganometallics: Future Trends in Drug Discovery, Analytical
Chemistry and Catalysis, Organometallics 30 (2011) 20-27.
I. Bioorganometalna kemija – uvod
(G. Jaouen, W. Beck, M. J. Glinchey)1
* ”Po opće prihvaćenoj definiciji organometalni spoj sadrži bar jednu vezu metal-ugljik
koja potječe iz organske molekule.”7
• BioBioorganoorganometalnametalna kemija: sinteza i
studij konjugata organometalnih spojeva* i
biomolekula (steroida, šećera, aminokiselina,
peptida, DNA, vitamina i enzima).
koja potječe iz organske molekule.”7
7 Popović, Z. Osnove kemije organometalnih spojeva, Prirodoslovno-matematički fakultet Sveučilišta u Zagrebu, 2012.
C Xδ δ
Nu
C Mδ δ
• Nukleofilni ugljikov atom iz organometalnog spoja u reakciji s elektrofilnim ugljikovim
atomom (iz alkil-halogenida, estera, aldehida, ketona) stvara novu C−C vezu ⇒ mogućnost
sinteze kompleksnih molekula iz manjih polaznih molekula.
ORGANOMETAL
R−−−−M−−−−X
R−−−−M CH3−Li
CH3−Mg−Br
Tip veze Primjeri
LNI
SPOJEVI
R−−−−M−−−−R C5H5−Fe−C5H5
• Polarne organometalne veze (veze ugljik−metal)
mogu se predstaviti rezonancijskim hibridom
kovalentne i ionske strukture,
• veća razlika u elektronegativnosti metala u odnosu na ugljik pridonosi porastu ionskog
karaktera veze te većoj reaktivnosti organometalnog spoja,8
C Mδ δ
C M
veza C−Li C−Mg C−Al C−Zn C−Sn C−Cu C−Hg
razlika u
Ionski karakterIonski karakter
EC - EM
ECx 100• najčešće se klasificiraju prema indeksu postotnog udjela ionskog karaktera:
razlika u elektronegativnosti
1,5 1,3 1,0 0,9 0,7 0,6 0,6
postotni udio ionskog karaktera
60 52 40 36 28 24 24
8 W. H. Brown et al, Organic Chemistry, Seventh Edition, Brooks/ Cole, Belmont, USA, 2013.
NukleofilnostNukleofilnost
• osim elektronegativnosti metala, na karakter C−M veze utječe i struktura organskog dijela
molekule; ionski karakter raste ukoliko se karbanion može stabilizirati rezonancijskom
delokalizacijom ili utjecajem elektron-odvlačećih supstituenata,
• većina organometalnih spojeva sadrži polarnu kovalentnu C−M vezu.
o primjeri bioorganometalnih spojeva sintetiziranih
u Laboratoriju za organsku kemiju PBF-a9
FFFFeeeeNH
HN
O
ONH
HN
ONH
O
O
OHOHO
OH
O
OH
O
O
Me
FFFFeeeeR
n
OOH OOH
(a) (b)
(c) (d)O
HOO
OH
NHAc
HN
NH
O
O
Fe
O
MeO
9(a) L. Barišić et al, Helically Chiral Ferrocene Peptides Containing 1'-Aminoferrocene-1-Carboxylic Acid Subunit as Turn Inducers, Chemistry A European
Journal 12 (2006) 4965.
(b) L. Barišić et al, Ferrocene conjugates with mannose: synthesis and influence of ferrocene aglycon on mannose-mediated adhesion of E. coli, Applied
Organometallic Chemistry 26 (2012) 74
(c) L. Barišić et al, The first ferrocene analogues of muramyldipeptide, Carbohydrate Research 346 (2011) 678.
(d) L. Barišić et al, Ferrocenyl-Labeled Sugar Amino Acids: Conformation and Properties, Organometallics 31 (2012) 3683.
HOO
OH
NHAc
HN
O FFFFeeee
R
Uloga metala?
• As, Cd, Co, Cr, Cu, Ni i V predstavljaju karcinogene
agense,10
• metal-inducirana karcinogeneza uključena je u sve
faze razvoja karcinoma,
• metali i metalni spojevi prisutni su u svim staničnim
strukturama uključujući membrane, mitohondrije,
endoplazmatski retikulum, jezgru i lizosome,
• sudjeluju u staničnim procesima (proizvodnji energije
10 S. S. Leonard et al, Metal-induced toxicity, carcinogenesis, mechanisms and cellular responses, Molecular and Cellular Biochemistry 255 (2004) 3.
• sudjeluju u staničnim procesima (proizvodnji energije
kroz elektronski transport, detoksifikaciju),
• metalni se ioni na stanične komponente vežu
koordiniranjem ili ionskim vezama, čime mogu
mijenjaju strukturu veznog mjesta,
• vezivanjem metala na DNA i proteine dolazi do lezija, kidanja lanaca i modifikacije baza čime
metal utječe na stanični odgovor.
o koordinirani kompleksi: neutralne molekule ili anioni
(ligandi) vezani su na centralni metalni atom ili ion koordiniranom kovalentnom vezom,
• tetraedarski atom ugljika može se javiti u
dva enantiomerna oblika, dok atom
metala sa svojih 6 supstituenata može
imati i do 30 različitih stereoizomera
(strukturna raznolikost!) ⇒ prednost
organometalnih kompleksa u odnosu na
čiste organske spojeve!,
• u kinetički inertnim kompleksima prijelaznih metala (Ru, Os i Ir) ne opaža se racemizacija, što
znači da su njihovi kompleksi stereokemijski stabilni te se najčešće koriste u medicinskim
istraživanjima,
• metalni ioni igraju važnu ulogu u vitalnim
biokemijskim reakcijama proteina, enzima,
nukleinskih kiselina,...11-13
• smatra se da je trećini proteina neophodan
metalni kofaktor (Cu, Fe, Zn ili Mo),
11 E. J. New, Tools to study distinct metal pools in biology, Dalton Trans. 2013, Advance Article
12 Pandya, N. Et al., DNA Binding, Antioxidant Activity and DNA Damage Protection of Chiral Macrocyclic Mn(III) Salen Complexes, Chirality 2012 (early view)
13 T. V. O’Halloran et al, Metallochaperones, an Intracellular Shuttle Service for Metal Ions, The Journal of Biological Chemistry 33 (2000) 25057.
o metalotionein, ključan za tjelesnu ravnotežu i
detoksifikaciju,
o metalošaperoni, “intracellular shuttle service for
metal ions”12,
o albumin i transferin, esencijalni za transport metala
u krvi,
• C−M veza izvor je različitih elektronskih i steričkih
METALS IN MEDICINE AND THE ENVIRONMENT
• C−M veza izvor je različitih elektronskih i steričkih
efekata kojima se može kontrolirati biološka
aktivnost,
• smatra se da je citotoksičnost posljedica direktnog
vezivanja fragmenta metalnog kompleksa na
biološku metu pri čemu se jedan ili više metalnih
liganada supstituira s biomolekulom,
o pojednostavljeni prikazi supstitucije liganda Ru-kompleksâ s biomolekulama
(DNA, proteinima); rezultirajući bioorganometalni kompleksi ostvaruju antikancerogeni
učinak!14
14 N. Metzler-Nolte et al, A Ruthenocene-PNA bioconjugate – synthesis, characterization, cytotoxicity and AAS-detected cellular uptake, BioconjugateChem. 23 (2012) 1764.
• Kemoterapeutski mehanizam rutenijskih kompleksa uključuje razaranje mitohondrija,15
• mitohondriji kanceroznih stanica strukturno i funkcionalno razlikuju se od mitohondrija
normalnih stanica (u zdravim se stanicama ATP stvara oksidativnom fosforilacijom, dok ga
tumorske stanice generiraju glikolizom, tumorske stanice imaju viši mitohondrijski
membranski potencijal),
• razaranjem mitohondrija oslobađaju se proapoptotični proteini i aktiviraju mehanizmi
programirane stanične smrti.
15 J.-Q. Wang et al, Mitochondria are the primary target in the induction of apoptosis by chiral ruthenium(II) polypyridyl complexesin cancer cells, J. Biol. Inorg. Chem. 2013 (Epub ahead of print).
U čemu je značaj bioorganometalnih spojeva?
• Funkcija našeg organizma zasniva se na transportu tvari i energije u čemu krucijalnu ulogu
imaju metali zahvaljujući svojoj sposobnosti apsorpcije naboja,
• bioorganometalni spojevi mogu apsorbirati naboj i stvarati ionske veze što omogućava
odvijanje reakcija koje su bez njihovog sudjelovanja teško izvedive ili neizvedive,16
• primjenjuju se kao receptori za bio-
loški važne molekule te kao kalupi
za stvaranje foldamera, osjetljivihza stvaranje foldamera, osjetljivih
sondi, kromofora, redoks-aktivnih
spojeva i kemosenzora,
• istražuju se kao potencijalni terape-
utici za kancerogena oboljenja te
gljivične, bakterijske i parazitske
infekcije.
16 A. L. Laine, C. Passirani, Novel metal-based anticancer drugs: a new challenge in drug delivery, Current Opinion in Pharmacology 12 (2012) 420.
Podjela metalnih antikancerogenih spojeva prema načinu djelovanja
I. Metal ima funkcionalnu ulogu (vezuje se na biološku metu)
II. Metal ima strukturnu ulogu
• Pri dizajnu i sintezi organometalnih lijekova mora se znati koji je dio bioaktivne molekule
esencijalan za biološku aktivnost; takva razmatranja dovode do podjele metalnih
antikancerogenih lijekova u 5 glavnih skupina:17
17 T. Gianferrara, A categorization of metal anticancer compounds based on their mode of action, Dalton Trans. (2009) 7588.
II. Metal ima strukturnu ulogu
(vezuje se na biološku metu nekovalentnim interakcijama)
III. Metal je prijenosnik aktivnih liganada koji se dopremaju in vivo
IV. Metal je katalizator
V. Metalni spoj je fotoaktivan
I. Funkcionalni spojevi čija je aktivnost posljedica direktnog vezivanja metalnog fragmenta na
biološku metu
• Funkcionalni spojevi su najčešće prolijekovi koji se aktiviraju hidratacijom,
• moraju imati bar jedan ligand koji podliježe supstituciji, odnosno bar jedno mjesto pogodno za
vezivanje s biološkom metom,
• prvi, a ujedno i najefikasniji antikancerogeni
lijek je cisplatin; u kliničkoj su primjeni i
karboplatin i oksaliplatin, njegovi analozi druge i
treće generacije,
• nakon intravenoznog unosa, neutralni cisplatin se otapa u vodi iz krvožilnog sustava te• nakon intravenoznog unosa, neutralni cisplatin se otapa u vodi iz krvožilnog sustava te
pasivnom difuzijom dospijeva u stanice,
• antitumorska aktivnost posljedica je
vezivanja kationskog hidratiranog
kompleksa s jezgrinom DNA; takvi
adukti uzrokuju distorziju DNA što
rezultira inhibicijom replikacije i
transkripcije, a čak može uzrokovati i
apoptozu.
II. Strukturni spojevi
• U strukturnim metalnim antikancerogenim lijekovima metalni ion nije direktno vezan za biološku
metu,
• mehanizam njihova djelovanja sličan je organskim lijekovima, s tim da se strukturni spojevi ne
mijenjaju in vivo,
• manje su toksični od funkcionalnih spojeva,
• u najjednostavnijim primjerima strukturnih spojeva metalna se skupina ugrađuje u organsku
okosnicu etabliranih lijekova,
• ferokin, ferocenski analog klorokina, jedan je
od napoznatijih i nauspješnijih primjera
strukturnih lijekova; aktivan je i prema
klorokin-rezistentnim sojevima,
• umetanje metalnog fragmenta u organsku
molekulu može dovesti i do neočekivanih
rezultata; za razliku od izvornog tamoksifena
koji se koristi u liječenju ER+ tumora
dojke, ferocenski analog ferocifen citotoksičan
je prema ER+ i ER- staničnim linijama.
III. Metalni ioni kao prenosioci aktivnih liganada
• takav kompleks mora biti stabilan i inertan da bi se izbjeglo
prebrzo otpuštanje nakon unosa,
• Cu(II)-kompleksi nesteroidnih antiinflamatornih lijekova (aspirina i
ibuprofena) često pokazuju poboljšanu aktivnost, pri čemu se
smanjuju gastrointestinalne nuspojave,
• Fizikalno-kemijska i farmakološka svojstva etabliranih organskih lijekova
moguće je poboljšati njihovim koordiniranjem se metalnim ionima,
IV. Metalni kompleksi kao katalizatoriIV. Metalni kompleksi kao katalizatori
• Organometalni polu-sendvič Ru(II)-kompleks premda vrlo inertan (ne
može se aktivirati hidratiranjem), ostvaruje visoku citotoksičnost
prema nekim humanim tumorskim staničnim linijama,
• citotoksičnost je posljedica porasta reaktivnih kisikovih spojeva (ROS)
generiranih tijekom oksidacije glutationa (GSH) u GSSG, procesa
kataliziranog organometalnim kompleksom,• organometalni ligand sam ne može oksidirati glutation, ali nakon koordiniranja s N,N-
dimetilfenil-azopiridinom dolazi do promjene njegovih elektronskih svojstava (dušikov atom
postaje dovoljno pozitivan) tako da se može reducirati djelovanjem glutationa.
Organometalni spojevi
i terapija
Organometalni spojevi
i terapija
Toksikologija
Okoliš
Toksikologija
OkolišMolekulsko prepoznavanje
u vodenom mediju
Molekulsko prepoznavanje
u vodenom mediju
Bioanaliza i senzoriBioanaliza i senzori
Enzimi
Peptidi, proteini
Enzimi
Peptidi, proteini
• Pet glavnih područja koja objedinjuje bioorganometalna kemija:
Bioorganometalna
kemija
Bioorganometalna
kemija
• Broj znanstvenih publikacija objavljenih u području bioorganometalne kemije bilježi stalan porast:
0
50
100
150
200
250
300
1986-1990
1990-1995
1995-2000
2000-2005
2005-2010
2010-2012
II.1. Organometalni spojevi kao terapeutici
1. Početkom 20. stoljeća suradnja kemičara i biologa iznjedrila je
zaključak da su organski arsenovi spojevi manje toksični od
svojih anorganskih analoga. Za medicinsku primjenu
organo-arsenovih spojeva kao antiparazitika dodijeljena je
Nobelova nagrada 1908.,
• salvarsan, lijek koji se koristio u liječenju
Science Museum, London
II. Povijesni pregled razvoja bioorganometalne kemije1
• salvarsan, lijek koji se koristio u liječenju
sifilisa, u tijelu oksidira u stabilni mafarsen,
koji je tijekom 30-ih godina prošloga
stoljeća preuzeo primat u terapeutskoj
primjeni,
• s obzirom da enzimi s pomoću kojih bakterije cijepaju šećere iz stanične stijenke mogu biti
blokirani djelovanjem spojeva koji sadrže arsen, prikazani se spojevi mogu koristiti kao
antibiotici,
Salvarsan Mafarsen
2. Nakon Rosenbergova otkrića antitumorskog djelovanja kompleksâ platine (1965.), o njima
je objavljeno preko 20.000 članaka,
• atom platine iz cisplatina kovalentno se veže na purinski N7 tvoreći 1,2- ili 1,3-unakrsne
veze; adukti cisplatin-DNA uzrokuju različite stanične odgovore (sprečavanje
replikacije, inhibicija transkripcije, obnavaljanje DNA, apoptoza),
3. Kompleksi rutenija pokazuju zanimljiva
antimetastatička svojstva, ali i nisku toksičnost in
vivo. Među njima posebno mjesto zauzima NAMI-A
[ImH][trans-RuCl4(dmso-S)(Im)] (Im = imidazol) koji
se od 1999. godine primjenjuje na Netherland Cancer
Institute of Amsterdam.
• DFT-studija vezivanja NAMI-A na integrin ⇒ antikancerogena aktivnost.• DFT-studija vezivanja NAMI-A na integrin ⇒ antikancerogena aktivnost.
II.2. Toksikologija i okoliš
• Minimata bolest: 1953. trovanje stanovnika u japanskom zaljevu Minimata
organo-živinim spojevima (CH3-Hg+X-; X=SCH3),18,19
• trovanje dietil-kositar-dijodidom (Sn(I)2(C2H5)2): u Francuskoj je zbog posljedica korištenja
lijeka stalinona u liječenju stafilokoknih infekcija umrlo 102 ljudi, a mnogi su trajno oboljeli od
neuroloških poremećaja. Fatalne posljedice korištenja ovoga lijeka pripisuju se dietil-kositar-
dijodidu, snažnom neurotoksičnom agensu.
18 T. Tsubaki, K. Irukayama, in Minamata Disease: Methylmercury Poisoning in Minamata and Niigata Japan, Kodansha, Tokyo, 1977.19 G. Pavlović, S. Siketić Sigurnost 53 (2011) 17.
Mehanizmi trovanja metalima
Inhibicija enzima
(najčešće vezivanjem za sulfhidrilne
skupine u aktivnim mjestima)
Porast reaktivnih kisikovih spojeva ROS Porast reaktivnih kisikovih spojeva ROS
(oksido/redukcijom metalnih iona,
inhibicijom antioksidacijskih enzima)
Karcinogeneza
(oksidacija DNA baza,
inhibicija enzima za popravak DNA)
II.3. Bioanalitičke metode bazirane na svojstvima organometalnih kompleksa
• 1977. uveden je pojam metalo-imunotest [(MIA, metallo immuno assay); imunotest u kojem se
kao obilježivač koristi metalni kompleks],
• najraniji metalo-imunotestovi bazirali su se na trima različitim analitičkim tehnikama:
atomskoj apsorpciji (nedovoljno osjetljiva zbog kontaminacije otapala metalima u
tragovima), elektrokemijskim mjerenjima (visokoosjetljiva i jeftina) i FT-IR-spektroskopiji,
o elektrokemijska detekcija lidokaina
(lijeka za srčanu aritmiju) obilježenoga
ferocenom,
o ferocenski kompleks za elektrokemijsko
praćenje glukoze u krvi: enzim uklanja
dva elektrona iz glukoze, preuzima ih
molekula-posrednik (ferocen) i prenosi
na radnu elektrodu,
o razvoj IR-spektroskopije (1980. godina) označava tehnološku revoluciju u području analitičkih
tehnika, zahvaljujući jedinstvenom svojstvu karbonilnih organometalnih spojeva: pokazuju
rastezne vibracije M−CO veze pri ∼ 1800-2000 cm-1 (u području u kojemu nisu vidljive druge
organske funkcionalne skupine!),
o bez obzira na male količine estradiola u tkivima (uterus, određeni estrogen-ovisni tumori),
nakon obilježavanja organometalnim spojem [Cr(CO)3] moguće ga je detektirati zahvaljujući
karakterističnim signalima pri ∼ 2000 cm-1.
II.4. Prirodni organometalni spojevi
• 1965.: Povijesni primat u istraživanjima ugljik-metal veze u prirodnim sustavima pripada
vitaminu B12, njegovom koenzimu i metil-kobalaminu, za koje se dugo smatralo da su
jedini prirodni spojevi s metal-ugljik vezom,
• vitamin B12 ima ključnu ulogu u funkciji mozga i
živčanog sustava, te tvorbi eritrocita,
• nužan je za odvijanje triju važnih reakcija: (i)
izomerizacije, (ii) metiliranja (npr. konverzija
homocisteina u metionin) i (iii) pretvorbu riboze uhomocisteina u metionin) i (iii) pretvorbu riboze u
deoksiribozu (nukleotidi),
R = CN (vitamin B12)
R = CH3 (metilkobalamin)homocistein metionin R = 5’-deoksiadenozil (koenzim B12)
III. Rutenijsko-arenski antikancerogeni kompleksi (M. Melchart, P. J. Sadler)1
• Priroda metalnog iona, njegovo oksidacijsko stanje, tip i broj vezanih liganada određuju
njegovu biološku aktivnost,
o prikazani Pt(II)-kompleksi imaju kliničku
primjenu u liječenju karcinoma (cisplatin,
• otkrićem antikancerogene aktivnosti
kompleksa platine 1969. započela su
istraživanja drugih metalnih kompleksa kao
potencijalnih lijekova:20
primjenu u liječenju karcinoma (cisplatin,
prvi metalofarmaceutik, jedan je od
naprodavanijih citostatika); nedostatak je
visoka toksičnost,
o titanoceni: vjerovalo se da mogu reagirati
s DNA slično kao cisplatin te uzrokovati
apoptozu stanica raka; nedostatak je brza
hidroliza zbog čega se odustalo od daljnjih
istraživanja,20 A. M. Pizarro et al, Activation Mechanism for organometallic Anticancer
Complexes, Top. Organomet. Chem. 32 (2010) 21.
• potencijalni biološki značaj rutenijskih kompleksa21: inhibitori apsorpcije Ca2+, antikancerogeni
agensi, imunosupresanti, radiofarmaceutici,
• u vodi topljivi arensko-rutenijski kompleksi pogodni su za dizajn antikancerogenih lijekova zbog
svoje niske toksičnosti, ali i povoljne kombinacije hidrofilnih i lipofilnih svojstava što utječe na
transport u biološkom mediju,
o staurosporin, [inhibira kinazu (aktivnu u stanicama karcinoma prostate) zahvaljujući
kompeticijskom vezivanju za ATP-vezno mjesto], poslužio je kao strukturna inspiracija za
dizajn rutenijskih organometalnih inhibitora koji za biološku metu imaju jednu od 518
različitih kinaza enkodiranih u ljudskom genomu,različitih kinaza enkodiranih u ljudskom genomu,
21 G. Süss-Fink, Arene ruthenium complexes as anticancer agents, Dalton Transactions 39 (2010) 1673.
o antibakterijska aktivnost: RAPTA-C [niska
aktivnost in vitro (inaktivan prema
primarnim tumorima), vrlo aktivan in vivo
(inhibitor metastaza sekundarnih tumora),
o antikancerogena aktivnost: kationski
arensko- rutenijski kompleksi pokazuju
visoku citotoksičnost prema A2780
stanicama karcinoma jajnika i in vitro i in
vivo
o citotoksični arenski rutenijski
kompleksi s N,N-, N,O- ili O,O-
kelirajućim ligandima
• DNA i proteini su najvjerojatnije mete rutenijsko-arenskih
kompleksa,
• kristalografskom analizom i 2D NMR-spektroskopijom
potvrđena je veza između rutenijskog kompleksa i N7 iz
gvanozina odn. N3 iz timidina; vezivanje s N3 iz citidina je vrlo
slabo, dok veza s adenozinom nije opažena,
• s povećanjem koordiniranog arena povećava se i aktivnost u
staničnim linijama karcinoma jajnika,
• promjena kelirajućih liganada značajno utječe na kinetiku i• promjena kelirajućih liganada značajno utječe na kinetiku i
selektivnost arenskih rutenijskih kompleksa prema bazi,
IV. Organometalni terapeutici (G. Jaouen, S. Top, A. Vessières)1, 22
• Primjena organometalnih spojeva u liječenju bolesti bazira se na
korištenju poznatog vektora (“trojanskog konja”) koji doprema
organometalni lijek do ciljne stanice,
• uporabom takvih vektora može se prevladati problem rezistencije
na lijek, lakše ciljati stanice karcinoma i regulirati otpuštanje lijeka,
• sustavi za prijenos lijekova trebaju biti visoko selektivni, biorazgra-
divi te moraju osigurati vremenski kontrolirano otpuštanje lijeka,
(Nat
iona
lRes
earc
hC
ounc
ilC
anad
a)
IV.1. Uvod
• krvno-moždana barijera sprječava
prijenos lijeka D do ciljne stanice,
prin
cip
“tro
jans
kog
konj
a”(N
atio
nal
22 N. Metzler-Nolte et al, Organometallic Anticancer Compounds, J. Med. Chem. 54 (2011) 3.
• kompleks lijek-antitijelo DA
komplementaran je receptoru R1
na površini krvno-moždane
barijere,
• kompleks lijek-antitijelo-receptor
transportira se poput trojanskog
konja.23 B. Therrien, Drug Delivery by Water-Soluble Organometallic Cages, Top. Curr. Chem 319 (2012) 35.
o Pt(acac)2 (inducira apoptozu u stanicama raka dojke)
doprema se do ciljnih stanica zatvoren u organometalni
kavez, 23
o ferocen (M = Fe) sastoji se iz dvaju aniona (C5H5-) i jednog kationa Fe2+ (4s23d4),
• najranije terapeutski korišteni organometalni spojevi su metaloceni (male, rigidne, redoks-
aktivne, aromatske i lipofilne molekule koje lako prolaze kroz staničnu membranu),
Mo metaloceni, “sendvič-molekule”: atom metala (M = Fe, Co, Cr, Ni, V,...) smješten
je između dvaju ciklopentadienilnih (C5H5) prstena,
o svoju veliku stabilnost duguje prisutnosti 18 valentnih elektrona [Fe(0) = 8 valentnih
elektrona (4s23d6) + 2 Cp⋅ = 2 × 5 valentnih elektrona] što mu daje konfiguraciju plemenitog
plina,o 1973. Nobelova nagrada G. Wilkinsonu i E. O. Fischeru za utvrđivanje strukture ferocena
i rezultate na području organometalnih sendvič-spojeva,
H
H
B
H2 2 + Fe2+ Fe
• zamjenom aromatske podjedinice iz penicilina i cefalosporina s ferocenom pripravljena je
serija potencijalnih organometalnih inhibitora β-laktamaze,
• primjenom metalocena nastojao se prevladati problem rastuće rezistencije nekih bakterija
na antibiotike (za rezistenciju je odgovorna β-laktamaza koja razgrađuju antibiotike iz
skupine penicilina i cefalosporina),
HOOC H
β-laktamaza
o u direktno vezanim analozima
nije opažena aktivnost!
o umetanjem metilenskih razmaknica
obnavlja se antimikrobna aktivnost!
o unatoč pokazanoj antimikrobnoj aktivnosti,
ferocenski analozi penicilina i cefalosporina
nisu komercijalizirani,
• obećavajući rezultati u liječenju
anemije i bolesti zubnog mesa
postignuti su s feroceronom,
COONa × 4H2O
IV.2. Metalni kompleksi selektivnih modulatora estrogenskih receptora (SERMs)1,24,25
• Rast ⅔ stanica karcinoma dojke stimuliran je estrogenom,
su locirane blizu gena i kontrolirane
• tkiva koja su pod utjecajem estrogena sadrže estrogenske receptore
koji su, uz molekule DNA, smješteni u staničnoj jezgri,
• u odsutnosti estrogena, njihovi su receptori inaktivni i ne utječu na
DNA,
• nakon vezivanja estrogena na receptor, mijenja se oblik receptora te se nastali kompleks
estrogen-receptor veže na specifične DNA-sekvence ERE (estrogen response element) koje
su locirane blizu gena i kontrolirane
estrogenom. Potom se kompleks estrogen-
receptor vezuje na koaktivator proteina te bliži
geni postaju aktivni. Aktivni geni proizvode
mRNA koja upravlja sintezom proteina,
• nastali proteini mogu utjecati na stanice (npr.
uzrokovati proliferaciju epitela),
24 M. Kvasnica et al, Synthesis and cytotoxic activities of estrone and estradiol
cis-dichloroplatinum(II) complexes, Bioorg. Med. Chem.20 (2012) 6969.25 http://www.cancer.gov/cancertopics/understandingcancer/estrogenreceptors/AllPages
• antiestrogeni: lijekovi koji vezivanjem na estrogenske receptore blokiraju aktivnost estrogena
(aktivaciju gena odgovornih za sintezu proteina koji mogu uzrokovati nekontroliran rast
stanica) i preveniraju proliferaciju kanceroznih stanica u dojci i uterusu,
• neke molekule mogu istovremeno blokirati aktivnost estrogena u jednoj vrsti tkiva i oponašati
njegovu aktivnost u drugom tkivu,
• takva je selektivnost uzrokovana razlikama u kemijskoj strukturi estrogenskih receptora u
različitim tkivima,
TUMOR
• estrogenski se receptori u različitim tkivima razlikuju po svojoj kemijskoj strukturi uslijed čega
ih SERMs (selective estrogen receptor modulators) selektivno inhibiraju ili stimuliraju [npr.
inhibiraju estrogenski receptor u dojci (inhibiraju proliferaciju) i istovremeno aktiviraju
estrogenski receptor u maternici (aktiviraju proliferaciju)],
estrogenestrogen
• istraživanja antikancerogenih svojstava SERMs-a započela su s
tamoksifenom (blokira estrogen vezujući se na njegove receptore u
stanicama dojke; pri tom ne mijenja oblik receptora što
onemogućuje vezivanje koaktivatora te se geni koji stimuliraju
proliferaciju stanica ne mogu aktivirati),
• aktivno se radi na razvoju novih SERMs-a s kojima bi se ostvarili povoljni i izbjegli štetni
učinci,
IV.2.1. Anorganski kompleksi platine26,27
• Cisplatin, učinkovit u liječenju karcinoma jajnika i
pluća; njegovo otkriće potaknulo je brojna
istraživanja u cilju pronalaska derivatâ platine s
unaprijeđenom biološkom aktivnošću, smanjenom
toksičnošću i bez moguće kemorezistencije stanica
karcinoma,
• povećanje selektivnost Pt-lijekova prema
stanicama tumora postiže se njihovimstanicama tumora postiže se njihovim
konjugiranjem s vektorima (folatom, porfirinom,
adeninom, terpenoidima, peptidima,...) nakon
čega slijedi vezivanje na ciljna estrogen-ovisna
tkiva (dojka, jajnici, maternica),
• priroda Pt-podjedinice u vektorskim kompleksima utječe na antiproliferativnu aktivnost i
selektivnost za ERα (estrogenski receptor α),
27 J.R.W. Masters, B. Köberle, Curing metastatic cancer lessons from testicular germ-cell tumours, Nature Reviews Cancer 3 (2003) 517.
26 P. Saha et al, Synthesis, antiproliferative activity and estrogen receptor affinity of novel estradiol-linked platinum(II) complex analogs to carboplatin and
oxaliplatin. Potential vector complexes to target estrogen-dependent tissues, European Journal of Medicinal Chemistry 48 (2012) 385.
• kompleski estradiola i cisplatina
ostvaruju značajnu citotoksičnost in
vitro i in vivo,
• zamjena cisplatinske podjedinice
s oksaliplatinom doprinosi odličnoj
selektivnosti konjugata za ERα,selektivnosti konjugata za ERα,
• supstitucija s karboplatinom rezultira
gubitkom selektivnosti za ERα,
IV.2.2. Karboranski derivati s estrogenskim svojstvima28
• Terapija karcinoma zračenjem u prisutnosti
bora (BNCT, boron neutron capture therapy):
kad se stanice tumora u koje je ugrađen veliki
broj atoma bora izlože zračenju neutronima
dolazi do njihovog uništenja, bez negativnih
posljedica na okolno zdravo tkivo,
• kompleks u kojem hidrofobni karboran oponaša • novi tip karboranskog SERM za
C2B10H12
• kompleks u kojem hidrofobni karboran oponaša
C i D prstene estradiola ima jači estrogenski
učinak zahvaljujući jačoj hidrofobnoj interakciji
sferne karboranske rešetke s receptorom,
A B
C D
• novi tip karboranskog SERM za
liječenje osteoporoze (sprječava
smanjenje gustoće kostiju),
28 T. Ogawa et al, Synthesis and biological evaluation of p-carborane bisphenols and their derivatives: Structure–activity relationship for estrogenic
activity, Bioorganic & Medicinal Chemistry 17 (2009) 1109.
IV.2.3. Titanocen-dikloridni analozi tamoksifena29
• Titanocen-diklorid, jaki antiproliferativni učinak čak i pri
vrlo niskim koncentracijama (10 µM),
o supstitucija jedne aromatske podjedinice tamoksifena s
titanocen-dikloridom pridonosi neočekivano jakom
antiproliferativnom učinku rezultirajućeg titanocen-tamoksifena,
o titanocen K ostvaruje 55-80% antiprolifera-
tivnog učinka titanocen-diklorida; dodatak
o titanocenu Y, koji ne ostvaruje citoto-
ksičnu aktivnost, dodatkom albumina
BSA (bovine serum albumin) ne inducira
značajne promjene u aktivnosti,
inducira se antiproliferativni efekt,
29 A. Vessières et al, Proliferative and anti-proliferative effects of titanium-and iron-based metallocene anti-cancer drugs, J. Organomet. Chem. 694 (2009) 874.
IV.2.4. Ciklopentadienil-renij-trikarbonilni derivati tamoksifena
• Supstitucijom fenilne skupine iz tamoksifena s CpRe(CO)3 te uvođenjem metilenskih
razmaknica različitih duljina (n = 2 - 5) pripravljeni su kompleksi čiji antiestrogenski učinak
odgovara tamoksifenu,
• duljina dimetilaminskog bočnog ogranka (koji je odgovoran za antiestrogeni efekt) nema
utjecaja na ukupnu djelotvornost,
O(CHO(CH22))nnNMeNMe22O(CHO(CH22))nnNMeNMe22
IV.2.5. Ferocenski derivati tamoksifena – ferocifeni30
OH• Očekivalo se da će zamjena β-fenilnog
prstena iz tamoksifena s aromatskom
ferocenskom podjedinicom uroditi
SERM-om povećane citotoksičnosti,
• u tu su svrhu pripravljeni su i testirani ferocenski derivati• u tu su svrhu pripravljeni su i testirani ferocenski derivati
tamoksifena s različitim duljinama metilenskih razmaknica,
o antiestrogena svojstva na hormonski ovisne tumorske
stanice MCF7 ovise o duljini ugljikova lanca: za n = 2 i 8
antiproliferativni učinak manji je u odnosu na tamoksifen, dok
su rezultati za n = 3 - 5 usporedivi s tamoksifenom ili čak i
bolji; sam ferocen nema nikakav učinak ,
30 G. Jaouen et al, The first Organometallic Selective Estrogen Receptor Modulators (SERMs) and Their
Relevance to Breast Cancer, Current Medicinal Chemistry 11 (2004) 2505.
o za razliku od tamoksifena koji ne utječe na hormonski neovisne tumorske stanice MDA-
MB231, ferocenski SERMs-i s 3 - 5 metilenskih razmaknica ostvaruju jak citotoksični
učinak,
• prikazani ferocenski SERMs-i predstavljaju po prvi
puta opisane SERMs-e koji su istodobno aktivni i
prema ER(+) i ER(-) tumorskim staničnim linijama!
• mehanizam antiproliferativnog utjecaja ferocenskih
SERMs-a nije poznat; na temelju molekulskog
modeliranja može se pretpostaviti da se ferocifeni
vežu u aktivno mjesto receptora estrogena,
• aktivno mjesto estrogenskog receptora svojom
veličinom više odgovara ferocenilnoj (572Å) nego
fenilnoj skupini (413Å),
• interakcija His524 i ferocenilne grupe, te Asp351 i
dušika iz bočnog ogranka (odgovornog za
antiestrogeni učinak) osigurava povoljno vezivanje,
• genotoksičnost ferocifena posljedica
je oksidacije ferocena (Fe2+) u
fericenijev ion (Fe3+):
Fentonova reakcija
• nastali superoksid radikal slabo je
reaktivan prema DNA, ali dovodi do
nastanka vrlo reaktivnog
hidroksidnog radikala koji može
uzrokovati leziju DNA (oštećenje
baze) i apoptozu.
IV.3. Ferokin – moćno oružje u borbi protiv malarije
• Malarija, najraširenija parazitska bolest na svijetu (odnosi
preko milijun života godišnje),
• svake se godine evidentira preko 300 milijuna kliničkih
slučajeva malarije (5 puta više u odnosu na ukupni broj
oboljelih od tuberkuloze, AIDS-a, rubeole i leproze),
• modifikacijom klorokina s ferocenom
pripravljen je ferokin, lijek poboljšane
učinkovitosti,
• parazit Plasmodium falciparum, odgovoran
za malariju, rezistentan je na poznate
lijekove, uključujući i klorokin, učinkovitosti,lijekove, uključujući i klorokin,
• studijama ovisnosti strukture i aktivnosti (SAR, structural-activity relationship study) utvrđeni su
strukturni elementi koji osiguravaju visoku biološku aktivnost derivata ferokina:
o 4-aminokinolinski fragment omogućuje nakupljanje u vakuolama,
o amino-skupina u bočnom ogranku osigurava jaku antiplazmodijsku aktivnost,
o ferocenska skupina odgovorna za lipofilna i redoks-svojstva.
IV.4. Bioorganometalni derivat aspirina31
• Heksakarbonil-dikobaltni [Co2(CO)6] kompleksi s fruktopiranozom, nukleozidima i
neuropeptidima pokazuju zanimljivu biološku aktivnost,
• modifikacijom aspirina (ASS, o-acetilsalicilna kiselina) s organometalnim derivatom
dolazi do značajnog unapređenja njegove antitumorske aktivnosti,
31 I. Ott, et al, Modulation of the Biological Properties of Aspirin by Formation of a Bioorganometallic Derivative, Angew. Chem. Int. Ed. 48 (2009) 1160.
• obećavajući rezultati kliničkih ispitivanja ferocifena i ferokina potaknuli su pripravu
različitih organometalnih derivata poznatih biološki aktivnih spojeva.
IV.4. Primjeri bioativnih organometalnih kompleksa
IV.4.1. Ferocenski derivati purinskih i pirimidinskih baza
• Testovi na HIV-1, HBV (virus hepatitisa B), YFV (virus
žute groznice) nisu pokazali značajnu antiviralnu ili
citotoksičnu aktivnost.
• Inhibiraju proliferaciju stanica karcinoma dojke.
IV.4.2. Ferocenski derivati etorfina
Cr
ONNO
ClMo
ONNO
Cl
• Uzrokuju širenje krvnih žila stvaranjem NO koji prodire u
tkivo, koriste se u liječenju infarkta miokarda i angine
pectoris.
IV.4.3. Organometalni derivati nitrovazodilatatora
• Dihidropirazol, mala bioaktivna molekula koja je kao strukturni motiv prisutna u brojnim
farmaceutski aktivnim spojevima,
IV.4.5. Ferrocenski derivati dihidropirazola
IV.4.6. Ferocenski derivati herbicida
O
HO
HO
OH
OH
R1 R2
IV.4.7. Ferocenski konjugati s manozom kao inhibitori hemaglutinacije E. coli9b
• Infekcija E. coli posljedica je hemaglutinacije uzrokovane prepoznavanjem bakterijskih
proteina (lektina, lat. legere, birati) i manoze iz stanične stijenke,
• vezno mjesto bakterijskog lektina ograđeno je dvama tirozinskim ostacima (“tyrosine gate”),
• uvođenjem aromatskog aglikona induciraju se π−π interakcije čime se afinitet aromatskog
manozida za bakterijski lektin povećava i do 600 puta,
OHO
HO
OH
O
OH
O
O
Me
O R3
R4
• ferocenom modificirani konjugati s manozom
ostvaruju inhibicijski učinak na hemaglutinaciju!
10, n=1, R=COOMe
12, n=1, R=NHBoc
14, n=2, R=H
Me
Fe
R
n
9b L. Barišić et al, Ferrocene conjugates with mannose: synthesis and influence of
ferrocene aglycon on mannose-mediated adhesion of E. coli, Applied Organometallic
Chemistry 26 (2012) 74.
VI. Konjugati peptida i PNA (peptidnih nukleinskih kiselina) s organometalnim
kompleksima (N. Metzler-Nolte)1
• Uvjeti koje moraju zadovoljavati organometalni spojevi:
1. stabilnost na zraku i u vodi (fiziološki uvjeti),
2. metalni fragment mora biti kompatibilan uvjetima standarne peptidne kemije
(uvođenje zaštittnih skupina, deprotekcija, cijepanje s nosača),
3. stabilnost pri različitim metodama pročišćavanja.
• Mogući načini vezivanja organometalne skupine za aminokiseline ili peptide:
1. metal može biti direktno vezan za peptidnu okosnicu,
2. metal može biti koordiniran s funkcijskom skupinom iz bočnog ogranka,
3. funkcionalizirani metalni fragment je preko organske spojnice vezan za peptid.
VI.1. Konjugati organometalnih spojeva s malim peptidima
VI.1.1. Organometalni spojevi kao kalupi za indukciju elemenata peptidne
sekundarne strukture
NHN
O
No disupstituirani peptidi III izvedeni iz 1’-amino-ferocen-1-
o disupstituirani peptidi I izvedeni iz ferocen-1,1’-dikarboksilne
kiseline stabilizirani su dvjema 10-članim interlančanim
vodikovim vezama – β-okret (Herrickova konformacija),
FFFFeeee
IIIIIIII
HN
NHO
O HN
NH
HN
O
ONH
o disupstituirani peptidi II izvedeni iz ferocen-1,1’-diamina
stabilizirani su dvjema 10-članim interlančanim
vodikovim vezama – β-okret,
FFFFeeee
IIII
O
O
NH
HN
O
O
HN
NH
O
O
FFFFeeee
IIIIIIIIIIII
NH
N
ONH
HN
ONH
O
O
o disupstituirani peptidi III izvedeni iz 1’-amino-ferocen-1-
karboksilne kiseline stabilizirani su 9- i 11-članim
interlančanim vodikovim vezama – P-uzvojnica,32
32 L. Barišić et al, The first oligopeptide derivative of 1’-aminoferrocene-1-carboxylic acid shows helical chirality with antiparallel strands, Chem. Commun.
17 (2004) 2004.
• peptid III, pripravljen u Laboratoriju za
Organsku kemiju PBF-a, predstavlja prvi
organometalni mimetik okreta,
Fe
VI.2. Organometalni konjugati s prirodnim peptidima
• obilježavanje prirodnih peptida s organometalnim spojem provodi se na dva načina:
o jedna ili više aminokiselina iz peptidne sekvencije supstituira se organometalnim derivatom,
o organometalni fragment ugrađuje se na C- ili N-terminus peptida ili u bočni ogranak,
• neuropeptid koji djeluje slično kao morfin (visok afinitet za
opoidne receptore),
• uslijed svoje polarnosti, enkefalin teško svladava krvno-
moždanu barijeru,
VI.2.1. Organometalni konjugati s prirodnim peptidima
• Enkefalin, pentapeptid prisutan u različitim tkivima, uglavnom u mozgu i CNS, najkorišteniji
prirodni peptid za derivatizaciju s organometalnim spojevima,
• njegova se lipofilnost postiže umetanjem organometalne podjedinice,
VI.2.2. Organometalni derivati peptidnih hormona
• Supstanca P: undekapeptid, neurotransmiter
koji sudjeluje u kontrakciji mišića, prijenosu boli
i aktivaciji imunosustava,
• supstuitucijom jednog ili oba Phe-ostatka s Fer
(ferocenilalanin) opada biološka aktivnost,
• biološki učinak N-aciliranih derivata
odgovara aktivnosti nativneodgovara aktivnosti nativne
supstance P,
VI.2.3. Organometalni derivati drugih peptida
• Jezgrin lokalizacijski signal (NLS, nuclear localization signal): ciljna aminokiselinska
sekvencija koju sadrže proteini neophodni za transport u jezgru,
• u okviru studije uporabe staničnih
• Bradikinin: nonapeptid koji je odgovoran za zgrušavanje krvi, njegovim se otpuštanjem snižava
krvni tlak uslijed proširenja krvnih žila,
• zamjenom fenilne podjedinice s ferocenskom
pripravljeno je nekoliko derivata sa smanjenom
biološkom aktivnošću.
• u okviru studije uporabe staničnih
signalnih peptida za direktni unos
organometalnog fragmenta u stanicu
pripravljeni su metalocenski derivati NLS
čiji je ulazak i lokalizacija u različitim
staničnim linijama praćen fluorescentnom
mikroskopijom,
• za razliku od slobodnog NLS koji nije mogao proći kroz staničnu membranu, metalocenski
analozi su se akumulirali unutar stanice čime je potrđena važnost organometalnih spojeva u
procesima endocitoze.
VI.3. Organometalni konjugati s PNA
• Peptidne nukleinske kiseline (PNA): oligonukleotidni analozi
DNA s obećavajućim svojstvima za primjenu u molekularnoj
biotehnologiji i medicini,
• riboza-fosfatni ester iz okosnice zamijenjen je
pseudopeptidnom podjedinicom,
• za razliku od DNA, ne sadrže šećerne i fosfatne podjedinice,
a ipak oponašaju DNA, nerijetko pokazujući i superiorna
svojstva,
• PNA se vezuje za komplementarnu DNA ili RNA, dajući
konjugate povećane stabilnosti,
• N-terminalno obilježeni organo-
metalni derivati PNA: konstante
asocijacije PNA monomera
odgovaraju literaturnim podacima
za DNA!
o Pseudopeptid: peptidomimetik koji sadržava pseudopeptidnu vezu kao surogat amidne veze.
H2N
NN
N
O
O
O
O
OHH
H H
O N
O OH
H2N N
N
O
O
O
OHH
H
N
O OH
H2NN
NN
O
O
O
OHH
H H
• Uvođenjem pseudopeptidnih veza povećava se otpornost prema enzimskoj degradaciji,
ostvaruju se konformacijske izmjene koje se odražavaju na karakter vodikovih veza i
fleksibilnost, te se povećavaju specifičnost , potencijal i biološka aktivnost receptora!
H2NS
N
N
O
O
O
OHH
H
H2NO
N
N
O
OHH
H2N N
N
O
O
O
O
OHH
H
H2N N
N
O
OHH
OH
VII. Obilježavanje proteina organometalnim kompleksima (M. Salmain)1
• Glutation (GSH), intracelularni nukleofil i antioksidans,
ima zaštitnu i detoksifikacijsku ulogu u organizmu („hvata”
slobodne radikale i reaktivne kisikove spojeve),
• glutation S-transferaza (GST), katalizator pretvorbe GSH u različite elektrofilne
spojeve, smatra se dijagnostičkim indikatorom kemijske karcinogeneze,
• rezistencija kanceroznih stanica na brojne antikancerogene terapeutike direktno je povezana
GSH
• rezistencija kanceroznih stanica na brojne antikancerogene terapeutike direktno je povezana
s povećanom razinom GST u malignim stanicama u odnosu na njegovu koncentraciju u
zdravom tkivu ⇒ GST se koristi kao biomarker,33
• razvojem inhibitora i senzora GST moguće je smanjiti rastuću kemorezistenciju tumorskih
stanica,
• u literaturi su opisani brojni inhibitori GST, uključujući analoge GSH, GSH-konjugate, male
organske molekule i prirodne produkte,
33 D.M. Townsend et al, Novel Role for Glutathione S-Transferase, The Journal of biological chemistry 284 (2009) 436.
• organometalni senzori i inhibitori GST-a pripravljeni su umetanjem razmaknica različite duljine
i strukture između ferocenske i peptidne glutationske jedinice,34,35
• takvi su konjugati vrlo efikasni inhibitori GST
(inhibitorni učinak raste s povećanjem duljine
• s obzirom da je moguće primjenom
voltametrije pratiti njihovo vezivanje
razmaknice što se objašnjava porastom
entropije uslijed vezanja),
za ciljne proteine, koriste se kao
elektrokemijski senzori GST-a,
34 M. C. Martos-Maldonado et al, Ferrocene labelings as inhibitors and dual electrochemical sensors of human glutathione S-transferase P1-1, Bioorg. Med.Chem. Lett. 22 (2012) 7256.
35 M. C. Martos-Maldonado et al, Binding properties of ferrocene–glutathione conjugates as inhibitors and sensors for glutathione S-transferases, Biochimie94 (2012) 541.
VII.3. Redoks-sonde
VII.3.1. Amperometrijski biosenzori
• Biosenzor je uređaj koji omogućuje identifikaciju i
kvantifikaciju nekog analita ( , , , , )
VII. 2. Radioaktivno obilježavanje
• Oktreotid (mimetik somatostatina) obilježen radioaktivnim
organometalnim fragmentom služi kao ligand za receptore u
stanicama pankreasa i nadbubrežne žlijezde kod miševa.
kvantifikaciju nekog analita ( , , , , )
u uzorku (vodi, hrani, krvi, urinu,...)
• ključno svojstvo svakog biosenzora je prisutnost
elementa molekulskog prepoznavanja koji selek-
tivno reagira s analitom ,
• element molekulskog prepoznavanja integriran je
u prijetvornik (ili je smješten u njegovoj blizini) koji
molekulsko prepoznavanje u kojem sudjeluje analit
pretvara u mjerljiv signal (npr. struja u ampero-
metrijskom biosenzoru),
i. ET (electron-transfer) između enzimskog redoks-centra i elektrode
omogućen je dodatkom difuzijskog elektronskog medijatora M
• kod većine redoks-enzima redoks-centar (kofaktor) je elektronski nedo-
stupan i elektrokemijski neupotrebljiv − lociran je predaleko od površine
proteina („ukopan” u unutrašnjosti proteinske molekule) što onemogućava
izravni prijenos elektrona između enzima i elektrode,
• obilježavanje “redox-silent” proteina elektroaktivnom komponentom
[redoks-medijatorom (posrednikom) koji brzo izmjenjuje elektrone s
elektrodom] čini ih pogodnima za elektrokemijske analize:
(medijator difundira u protein) koji ubrzava protok elektrona prema
elektrodi i od elektrode,
ii. redoks-medijatori su kovalentno vezani
za površinu enzima te usmjeravaju
elektrone prema elektrodi i od elektrode,
iii. enzim je imobiliziran na umreženom
redoks-polimeru adsorbiranom na
površini elektrode,
VII.3.1.1. Organometalni difuzijski medijatori
• posredovanje u prijenosu naboja između redoks-enzima GOx i elektrode postiže se
korištenjem difuzijskog posrednika, redoks-para ferocen/ fericenijev ion,36,37
• Glukoza-oksidaza (GOx) oksidira glukozu pri čemu se FAD reducira u
FADH2; direktno mjerenje prijenosa elektrona s FAD na elektrodu ote-
žava njegova lokacija u GOx (protein zasjenjuje FAD čineći ga gotovo
nedostupnim),
36 M.F. Burritt, Current analytical approaches to measuring blood analytes, Clin. Chem. 36 (1990) 1562.
37 D. Ross et al, Short-term evaluation of an electro-chemical system (ExacTech) for blood glucose monitoring, Diabetes. Res. Clin. Pract. 10 (1990) 281.
• 1987., ExacTech trake za mjerenje razine glukoze u krvi:
nakon oksidacije glukoze GOx preuzima dva e- i predaje
ih fericenijevu kationu koji se reducira u ferocen, potom se
ferocen oksidira i elektrone predaje elektrodi; uređaj mjeri
struju elektrona i pretvara signal u µmol glukoze/ litri krvi.
• Prema IUPAC-u, biosenzori su uređaji koji koriste biokemijske reakcije enzima, imunosustava,
tkiva, organela ili cijelih stanica za detekciju kemijskih spojeva pomoću električnih, termičkih ili
optičkih signala,38
• sastoje se iz dva glavna elementa:
1. bioreceptor: imobilizirani osjetljivi biološki element (npr. enzim, DNA, protutijelo) koji
specifično prepoznaje analit (npr. enzimski supstrat, komplementarna DNA, antigen),
2. prijetvornik: biokemijski signal proistekao iz reakcije analita i bioreceptora pretvara u
mjerljivi signal; intenzitet tako generiranog signala proporcionalan je koncentraciji analita,
VIII. Organometalne biosonde (G. R. Stephenson)1
mjerljivi signal; intenzitet tako generiranog signala proporcionalan je koncentraciji analita,
38 PAC 64 (1992) 143 (Glossary for chemists of terms used in biotechnology (IUPAC Recommendations 1992))
• prepoznavanje, prijenos i odgovor, nužni za funkcioniranje sonde, limitirani su
selektivnošću receptora,
• s obzirom da se često slični analiti natječu za isti receptor, potrebno je dizajnirati i
sintetizirati optimizirani receptor za svaki pojedini analit,
IX. Organometalni kompleksi kao “obilježivači” u imunotestovima (M. Salmain, A. Vessières)1
o analit: komponenta u uzorku za koju se traži analitička informacija,
o antigen: molekula koja potiče stvaranje protutijela, odnosno imunoodgovor,
o protutijelo: globularni protein koji se stvara kao reakcija na prisutnost stranih tijela (antigena)
• Imunotest: analitička metoda kojom se na temelju vezivanja analita (antigena) s poznatim
komplementarnim antitijelom određuje količina ispitivanog analita u uzorku,
• imunotest se bazira se na specifičnoj interakciji između triju komponenti: analita (antigena) koji
će biti detektiran, protutijela specifičnog za ispitivani analit te obilježivača (tracer) kojeg
sadrži ili analit ili protutijelo, a koji je podložan detekciji nekom od analitičkih metoda,
u organizmu; obrambena uloga,
obilježeno protutijelo
obilježeni analit
• princip metaloimunotesta: nakon priprave
specifičnog protutijela (P), koje ima jednaki
afinitet za antigen (A, analit) i antigen
obilježen organometalnim spojem (A*),
P
A A*
• metaloimunotestovi (engl. metalloimmuno-
assay, MIA): metalni atomi iz organometalnih
kompleksa koriste se za obilježavanje
antigena u imunotestovima,
nastupa kompetitivna reakcija tih analita za
vezna mjesta na protutijelu uz tvorbu
kompleksâ P-A i P-A*. Budući da je
koncentracija protutijela P i obilježenog
antigena A* poznata, iz izmjerenog se
analitičkog signala P-A* (FT-IR, elektrosignal)
indirektno određuje količina imuno-kompleksa
P-A, odn. analita A.
A A*
P-A*P-A
• dva su glavna tipa imunotestova:
o kompetitivni imunotest: neobilježe-
ni analit iz uzorka određuje se na
temelju njegove sposobnosti da se
s obilježenim analitom (poznate
koncentracije) natječe za vezno
mjesto na antitijelu (poznate
koncentracije); pri tomu neobi-
1. inkubacija
koncentracije); pri tomu neobi-
lježeni analit zauzima vezno mjesto
na antitijelu onemogućujući
vezivanje obilježenog analita,
o izmjerena količina vezane frakcije
obilježenog analita obrnuto je
proporcionalna koncentraciji neobi-
lježenog analita iz uzorka,
2. separacija vezane i slobodne
frakcije obilježivača
3. kvantifikacija vezane ili slobodne
frakcije obilježivača
o nekompetitivni imunotest: suvišak specifi-
čnoga antitijela vezan je na čvrstu fazu npr.
(stijenka pločice za mikrotitraciju), nakon čega
se doda otopina analita. Nakon inkubacije
doda se drugo, obilježeno antitijelo poznate
koncentracije; slijedi druga inkubacija, te se
slobodna frakcija antitijela ukloni, a vezana se
dodatak obilježenog antitijela
frakcija kvantificira – direktno je
proporcionalna količini prisutnoga analita
(obilježeno antitijelo neće se vezati ukoliko
nije prisutan analit); ELISA (Enzyme Linked
Immunosorbent Assay) ubraja se u ovu
kategoriju,eliminacija slobodne frakcije antitijela
i kvantifikacija vezane frakcije
• ferocenom obilježeni lidokain (lijek za
srčanu aritmiju) među prvima je
korištenima u MIA; detekcija cikličkom
voltametrijom,
• cimantrienilom obilježeni antidepresiv
nortriptilin; detekcija atomskom
apsorpcijskom spektroskopijom,
• kobaltocenom obilježeni amfetamin;
detekcija pravokutnovalnom voltametrijom,
IX.1. FT-IR detekcija
o karbamazepin, antiepileptik
o fenobarbital, antikonvulziv
bez
apso
rpci
je!
o difenilhidantoin, antiepileptik
Pod
ručj
e21
00–
1800
cm-1
bez
IX.2. Elektrokemijska detekcija
• jeftina analitička metoda,
• nakon obilježavanja redoks-aktivnim ferocenom,
moguće je elektrokemijski detektirati enzime
koji su redoks-inaktivni,39
39 C. Baier et al, In-situ Electrochemical Detection of Enzymes using Ferrocene Affinity Label (abstract), 216th Electrochemical Society Meeting, Vienna,
Austria, 2009.
• elektrokemijsko određivanje HIV-1 reverzne transkriptaze (HIV-1 RT),40 katalizatora konverzije
viralnog genoma iz jednostruke RNA u dvostruku DNA, koristi se u detekciji infekcije HIV-om,
(III) “hvatanje” HIV-1 RT pomoću RT-specifičnog peptida imobiliziranog
na površini elektrode:
• (I) ferocenom obilježena lipoična kiselina imobilizira se na zlatnoj elektrodi,
(II) kratki RT-specifični peptid VEAIIRILQQLLFIH kovalentno se veže na C-terminus
ferocenom obilježene lipoične kiseline,
40 H.-B. Kraatz et al, A bioorganometallic approachf orr apid electrochemicala nalysis of huma immunodeficiency virust ype-1r everset ranscriptase in serum
Electrochimica Acta 56 (2011) 5122.
X. Genosenzori bazirani na metalnim kompleksima (S. Takenaka)1,41
• DNA-senzori ili genosenzori posebno su važni biosenzori s obzirom
na potrebu za analizom gena povezanih s različitim bolestima,
• DNA je elektrokemijski inaktivna molekula, ali se nakon
• Genosenzori koriste imobiliziranu DNA-sondu kao element
prepoznavanja pri hibridizaciji (tvorba DNA-DNA i DNA-RNA
hibrida) kao i u interakcijama s različitim proteinima,42
obilježavanja elektrokemijski aktivnom molekulom može detektirati
elektrokemijskim metodama,
• metalni kompleksi pokazuju reverzibilni redoks-odgovor što ih čini
izuzetno pogodnima za obilježavanje DNA,
41 Y. Xiang et al, A reagentless and disposable electronic genosensor: from multiplexed analysis to molecular logic gates , Chem. Commun. 47 (2011) 2080.
42 S. Alerget, A. Merkoçi, Comprehensive analytical chemistry, Elsevier, Amsterdam, London, 2007.
• elektrokemijski genosenzori: u vodi topljivi metalni kompleksi s afinitetom za dvostruku
uzvojnicu DNA ili elektrokemijski aktivne DNA-sonde kovalentno vezane za metalni kompleks,
X.1. Metalni kompleksi kao DNA sonde
• Mnogi se kationski metalni kompleksi [Co(phen)33+,
[Ru (/bpy)32+, FND] mogu kao ligandi vezivati s DNA;
ukoliko postoji korelacija između količine vezanog liganda i
DNA, DNA se može kvantificirati na temelju magnitude
elektrokemijskog odgovora liganda,
X.1.1. Kationski metalni kompleksi43
43 S. Sato et al, Electrochemical detection of aberrant methylated gene using naphthalene diimide derivative carrying four ferrocene moieties, J. Organometal.
Chem. 695 (2010) 1858.
X.1.2. Metalni kompleksi konjugirani s DNA-fragmentom ili DNA-veznim ligandom
• DNA-sonde koriste se za detekciju ciljne DNA ili gena,
o DNA tvori dvostruku uzvojnicu zahvaljujući uspostavljanju vodikovih veza između
komplementarnih baza,
o zagrijavanjem dolazi do disocijacije, odn. denaturacije, a hlađenjem se ponovno
uspostavlja dupleks (hibridizacija),
• za detekciju nekog gena potrebno je (i) pripraviti DNA-sekvenciju (DNA-sondu)
komplementarnu ciljnoj DNA, (ii) obilježiti DNA-sondu (fluorescentnim ili elektrokemijskimkomplementarnu ciljnoj DNA, (ii) obilježiti DNA-sondu (fluorescentnim ili elektrokemijskim
obilježivačem) i (iii) hibridizirati s DNA iz ispitivanog uzorka,
• kod elektrokemijske detekcije
metalni se kompleks konjugira s
kratkim fragmentom DNA ili
oligonukleotidom čime se dobiva
elektroaktivna DNA-sonda,
• elektrokemijski indikatori hibridizacije: DNA-sonda imobilizira se na površini zlatne elektrode
nakon čega slijedi hibridizacija s DNA ispitivanog uzorka; nakon hibridizacije elektroda se uroni
u otopinu elektrolita koji sadrži DNA-vezujući metalni kompleks te se provede elektrokemijsko
mjerenje,
• metalni kompleks mora razlikovati jednolančanu DNA (ssDNA, single-strand) i dvostruku
uzvojnicu DNA (dsDNA, double-strand); nakon vezivanja za dsDNA dolazi do koncentriranja
metala na površini elektrode uslijed čega se stvara elektrokemijski signal iz čije se magnitude
može odrediti ispitivani gen,
X.1.3. Ferocenski genosenzori
• Postoje brojne laboratorijske metode za identifikaciju patogena koje zahtijevaju veliki oprez
pri rukovanju uzorcima i podrazumijevaju uporabu skupih kemikalija i opreme,
• s druge strane, idealni sustavi za identifikaciju patogena zamišljen je tako da omogući
istovremeno procesuiranje uzorka i njegovu karakterizaciju korištenjem jedinstvenog
automatiziranog uređaja,
• bioelektronska detekcija nukleinskih kiselina na
Genmark eSensor
minijaturnom čvrstom nosaču prvi je korak u
razvoju integriranih detekcijskih uređaja,
• bioelektronska detekcija DNA uključuje stvaranje
elektroničkog sklopa posredstvom hibridizacije
nukleinskih kiselina te predstavlja bazu za DNA-
detekcijske sustave (eSensorTM),
1) Ispitivana DNA (target DNA) izmiješa 2) Otopina koja sadrži hibridizirani kompleks1) Ispitivana DNA (target DNA) izmiješa
se s otopinom signalne sonde (signal
probe) obilježene elektroaktivnim
ferocenom; ukoliko je ispitivana DNA
prikladna (sadrži komplementarne
baze) odmah će doći do hibridizacije
ispitivane DNA s obilježenom
signalnom sondom,
2) Otopina koja sadrži hibridizirani kompleks
ispitivane i obilježene signalne DNA pumpa se
kroz uređaj koji sadrži elektrode s vezanom DNA
sondom (DNA capture probe); dolazi do
hibridizacije ispitivane DNA i vezanom
DNA, odnosno do uspostavljanja kontakta
između DNA vezane za elektrodu i ferocena –
stvara se strujni tok,
• elektrokemijski signal generira
se nakon što DNA iz HPV
hibridizira s ferocenom
obilježenom signalnom sondom i
o elektrokemijska detekcija humanog papiloma
virusa (HPV)44
sondom vezanom za elektrodu,
• u slučaju da u uzorku nema HPV
ne registrira se signal!44 S. D. Vernon et al, Bioelectronic DNA detection of human papillomaviruses using eSensor™:
a model system for detection of multiple pathogen, BMC Infectious Diseases 3 (2003) 1.
XI. Supramolekulske interakcije organometalnih spojeva (R. H. Fish)1
• J.-M. Lehn, Nobel lecture, 1987: “Supramolecular chemistry is the chemistry of the
intermolecular bond, covering the structures and functions of the entities formed by
association of two or more chemical species”.
• supramolekulske interakcije (prepoznavanje, reaktivnost, transport...) predstavljaju
fundamentalne fenomene u biološkim sustavima uključene u brojne procese između biološki
važnih molekula (DNA, RNA) s proteinima, lijekovima, sondama koje sadrže metalni ion,...
• organski kemičari pripravljaju brojne supramolekulske domaćine koji sudjeluju u
molekulskom prepoznavanju s molekulama gostima (nukleozidi, nukleotidi, aminokiseline,
peptidi i male organske molekule) i to putem nekovalentnih vodikovih veza, π-π- i hidrofobnih
interakcija,
XI.1. Bioorganometalne supramolekule kao domaćini
• Opisane su bioorganometalne molekule koje
kao domaćini prepoznaju molekule goste
(aromatske i alifatske amino- i karboksilne
kiseline) u vodenom mediju pri pH 7,
• takvo prepoznavanje u vodenom mediju
može se smatrati jednostavnim modelom za
proučavanje interakcija između DNA i RNA i
njihovih veznih proteina (npr. onih proteinanjihovih veznih proteina (npr. onih proteina
koji reguliraju gene).
XI.1.1. Molekulsko prepoznavanje aromatskih
i alifatskih aminokiselina s bioorgano-
metalnim domaćinom 1
• Procesi molekulskog prepoznavanja proučavani su 1H NMR spektroskopskim metodama,
• kompleksiranje molekula domaćina i gosta inducira kemijski pomak molekula gosta u više
polje,
• ciklički trimer [Cp*Rh(µ-η1(N1):η2
(N6,N7)-9-metiladenin]3(OTf)3 (1) odlikuje
se stabilnošću u vodi te velikim
promjerom šupljine što su osnovni
parametri “host-guest” kemije,
• utvrđeno je da variranjem koncentracije
molekule domaćina 1 (0-1 eq.) u
prisutnosti odgovarajuće molekule
gosta (L-Phe, L-Trp, L-Leu, L-Ile; konst.
konc. 1 eq.) nakon kompleksiranja dola-
zi do pomaka NMR signala molekula
gosta u više polje (CICS, complexation
induced chemical shift),
• 1 prepoznaje aromatske aminokiseline
kao i aminokiseline s duljim hidrofobnim
bočnim ograncima zahvaljujući steri-
čkim, elektronskim i hidrofobnim
utjecajima,
XI.1.2. Molekulsko prepoznavanje supstituiranih aromatskih
karboksilnih kiselina s bioorganometalnim domaćinom 1
• Ciklički trimer 1 korišten je u studijama molekulskog prepoznavanja s
neproteinogenom o-, m- i p-aminobenzojevom kiselinom,
o o-Aminobenzojeva kiselina (vitamin L) prekursor je Trp, a rabi se kao
intermedijar u sintezi bojila te u proizvodnji parfema i farmaceutika; m-amino-
benzojeva kiselina umetanjem u ciklo(peptide) potiče tvorbu β-plohe i β-
okreta, p-aminobenzojeva kiselina (vitamin Bx) intermedijar je u bakterijskoj
sintezi folatâ koji sprječavaju kardiovaskularne bolesti i neke tipove karcinoma.
o-
sintezi folatâ koji sprječavaju kardiovaskularne bolesti i neke tipove karcinoma.
• pozicija supstituenata značajno utječe na molekulsko prepoznavanje;
najviše vrijednosti CICS za o- (Hc) i m- (Hc) su 14 odn 7 puta veće nego
za p- (Ha) što se pripisuje steričkim utjecajima: m-
p-
o hidrofobni dijelovi molekula gostiju trebaju se smjestiti u hidrofobnu
šupljinu domaćina; udaljenost između hidrofilnih skupina i sterička
ometanja rastu od o- prema p-gostu; time se izloženost hidrofobnih
skupina smanjuje što rezultira slabijim prepoznavanjem,
• Molekulsko prepoznavanje temeljeno na selektivnim vodikovim vezama između domaćina
trans-[Cp*Rh(η1(N3)-1-metilcitozin)(µ-OH)]2(OTf)2 (2) i Trp ispitano je korištenjem CICS-
metode,
XI.1.2. Molekulsko prepoznavanje aromatskih aminokiselina s bioorganometalnim
domaćinom 2
• kompleksiranjem domaćina 2 s Trp dolazi do njegove desimetrizacije što se očituje
prisutnošću dvaju setova signala; pri tomu jedan set signala kompleksa odgovara signalima
slobodnog domaćina, dok su u drugom setu signala zabilježeni značajni pomaci u više polje,
• CICS izmjereni za jedan metil-citozinski ligand tumače se njegovim nekovalentnim
2
Slobodni domaćin 2 S gostom L-Trp
• CICS izmjereni za jedan metil-citozinski ligand tumače se njegovim nekovalentnim
interakcijama s L-Trp,
Slobodni gost L-Trp Kompleks gost-domaćin
• nadalje, kompleksiranje Trp s bioorganometalnim domaćinom 2 indicirano je i pomacima Trp-
protona u više polje,
• bioorganometalno prepoznavanje temelji se na• bioorganometalno prepoznavanje temelji se na
vodikovim vezama NH3+ skupine iz Trp s atomom
kisika iz jednog od dvaju Rh(µ-OH) liganada te s CO
skupinom iz jednog od dvaju metil-citozinskih
liganada; COO- skupina iz Trp tvori vodikovu vezu s
NH2 skupinom drugog metil-citozinskog liganda,
• opisani domaćin-gost proces razmatra se kao
model za povezivanje biološki značajnih
molekula gostiju s metalo-enzimima i DNA/ RNA.
XII. Aktivna mjesta u metaloenzimima (J. C. Fontecilla-Camps)1
• Trećina poznatih enzima sadrži metalni ion koji sudjeluje u reakcijama prijenosa elektrona i malih
molekula, cijepanja i tvorbe veza, nabiranju proteina, itd.
XII.1. Bakar
• Esencijalna uloga u mnogim staničnim procesima: antioksi-
dacija, pigmentacija, disanje, sinteza neurotransmitera, tvorba
vezivnog tkiva, metabolizam željeza itd.
• njegova je toksičnost posljedica vezivanja s kisikom uslijed
čega nastaju ROS (patološka stanja),
• nalazi se u aktivnim mjestima brojnih enzima [posebno mjesto
zauzima tirozinaza (sudjeluje u tvorbi melanina, zacjeljivanju
rana i imunoodgovoru)],
o oksidacija tirozina u dopakinon uslijed
čega dolazi do posmeđivanja voća,
• enzimska aktivna mjesta koja sadrže Cu razlikuju se po svojim spektroskopskim svojstvima:45
45 Yi Lu, “Cupredoxins”, in “Comprehensive Coordination Chemistry II: From Biology to Nanotechnology”, Jon McCleverty and Tom J. Meyer, Eds., Vol 8
(Biocoordination Chemistry, Lawrence Que, Jr. and William B. Tolman, Eds.) pp 91‐122 (2003).
XII.1.1. Amin-oksidaza
• Prisutna u prokariotskim i eukariotskim organizmima; sadrži
Cu-ion i redoks-aktivni kofaktor topakinon (2,4,5-trihidroksi-
fenilalanin),
• Cu(II) ion koordiniran je s tri histidinska ostatka i tri molekule
vode (W),
• katalizira oksidativno deaminiranje primarnih amina u (i) odgovarajuće aldehide uz (ii)
popratnu redukciju kisika u vodikov peroksid:
46 E. Agostinelli et al, Potential anticancer application of polyamine oxidation products formed by amine oxidase: a new therapeutic approach, Amino Acids 38
(2010) 353.
• amin-oksidaze reguliraju nivo mono-i poliamina (spojeva čija je koncentracija povećana u
tumorskim tkivima) tvorbom citotoksičnih metabolita (aldehida i vodikova-peroksida),
• novi terapeutski pristup u liječenju karcinoma zasniva se na dopremi amin-oksidaze u stanicu
raka nakon čega bi uslijedila intracelularna tvorba toksičnih oksidacijskih produkata koji bi
selektivno ubijali samo stanicu u kojoj su nastali, tj. malignu stanicu,46
XII.1.2. Lakaza
• Široko rasprostranjena među biljkama, insektima i
fungima,
• sadrži četiri atoma bakra u aktivnom mjestu (ubraja se u
plave oksidaze),
• katalizira oksidaciju različitih fenolnih spojeva, diamina i
aromatskih amina uz popratnu redukciju kisika u vodu,
• oksidira supstrat zahvaljujući elektron-akceptorskim
svojstvima bakra; u potpuno reduciranom stanju sadrži 4
elektrona kojima kisik reducira u vodu,
• primjena u prehrambenoj industriji: aditiv u preradi hrane i
pića, stabiliziranje vina i piva, pekarstvo,... 47
47 J. F. Osma, Uses of Laccases in the Food Industry, Enzyme Res. (2010) 1.
• lakaza katalizira oksidativnu dimerizaciju 17β-estradiola ⇒ na takvoj bi se kopulaciji mogla
temeljiti strategija kontrole steroidnih estrogena,48
kontrola bez lakaze
48 Q. XIA et al, Removal of 17β-estradiol in laccase catalyzed treatment processes, Front. Environ. Sci. Eng. 2013.
nakon tretiranja s enzimom
XII.2. Željezo
• najzastupljeniji metal u tragovima,
• u reducirajućem okruženju stanice, željezo katalizira
jedno-elektronsku redukciju vodikova peroksida
stvarajući visokoreaktivni oksidant – hidroksidni radikal,
• takva se nepoželjna reakcija može spriječiti vezivanjem željeza za proteine,
• Željezo igra ključnu ulogu u metabolizmu svih stanica (replikacija DNA, fotosinteza,
proliferacija, itd.),49
XII.2.1. Citokrom c oksidaza (COX)
49 A.M. Thomson et al, Iron-regulatory proteins, iron-responsive elements and ferritin mRNA translation, The International Journal of Biochemistry & Cell
Biology 31 (1999) 1139.
XII.2.1. Citokrom c oksidaza (COX)
• Terminalni enzim u respiratornim lancima mitohondrija i aerobnih
bakterija te u oksidaciji hrane; katalizira prijenos elektrona s
reduciranog citokroma c na kisik reducirajući ga u vodu:
• sadrži dvije hem skupine i tri iona bakra; jedna hem skupina i
jedan ion bakra izgrađuju katalitički centar (hem a3/CuB ),
XII.2.2. Oksigenaze
• Dvije vrste enzima koji kataliziraju reakciju kisika s organskim
supstratima:
o dioksigenaze: ugrađuju oba atoma kisika produkt,
o monooksigenaze: jedan atom kisika ugrađuju u produkt, dok se
drugi atom eliminira redukcijom u vodu;
• metabolička konverzija aromatskih spojeva u
alifatske od fundamentalnog je značaja u
biologiji,biologiji,
• katehol-dioksigenaza: katalizira oksigenaciju
katehola u alifatske kiseline uz cijepanje
aromatskog prstena,50
• važna uloga u razgradnji lignina i
terpena, kao i u katabolizmu Trp i Tyr,
50 R. Yamahara et al, (Catecholato)iron(III) complexes: structural and functional models for the catechol-bound iron(III) form of catechol
dioxygenases, Journal of Inorganic Biochemistry 88 (2002) 284.
XII.2.3. Ribonukleotid-reduktaza (RR)
• katalizira ključni korak u sintezi DNA – redukciju ribonukleotida,
• reakcija uključuje supstituciju hidroksilne skupine na C2’ iz riboze s vodikom,
XII.3. Mangan
• Prisutan u biljnim i životinjskim tkivima,
• kofaktor enzima uključenih u fosforilaciju, hidrolizu, dekarboksilaciju i transaminiranje,
• komponenta antioksidativnog enzima superoksid-dismutaze (SOD), neutralizatora slobodnih
radikala,
XII.3.1. Superoksid-dismutaza51
• Krucijalni enzim; katalizira dismutaciju (disproporcioniranje) superoksid-radikala u vodikov
peroksid i kisik,
• superoksid-radikal nastaje u
stanici kao posljedica enzimske i
spontane oksidacije; toksičan je
za stanicu i razgrađuje biološke
molekule (lipide i proteine),
X = Fe ili Mn
51 A. F. Miller, Superoxide dismutases: active sites that save, but a protein that kills, Current Opinion in Chemical Biology 8 (2004) 162.
XII.3.2. Arginaza
• Katalizira hidrolizu Arg u Orn i ureu,
• arginaza I može se koristiti kao marker za
koronarne srčane bolesti (snižava razinu
• aktivno mjesto sadrži dva iona Mn (na
udaljenosti 3,3 Å) koordinirana s jednim
His- i trima Asp-ostatcima,
• ioni Mn polariziraju i usmjeravaju
premošteni hidroksilini ion u nukleofilni
napad na gvanidinijev C atom (iz
supstrata),
52 T. Eleftheriadis et al, Arginase type I as a marker of coronary
heart disease in hemodialysis patients, Int. Urol. Nephrol. 43
(2011) 1187.
vazodilatatora NO te direktno pridonosi
razvoju ateroskleroze),52
XII.4. Molibden i volfram
• Mo je prisutan u katalitičkom centru nitrogenaza, te
kao Mo-kofaktor u brojnim enzimima,
• Mo- ili W-kofaktori sastoje se iz mononuklearnog
metalnog iona i organskog dijela molibdopterina
(MPT),
• MPT-enzimi se dijele u dvije grupe:
MPT
o medijatori prijenosa kisika (DMSO-
reduktaze i SO-oksidaze),
o katalizatori hidroksiliranja aromatskih
heterocikličkih spojeva (ksantin-
oksidoreduktaze) i aldehida
XII.4.1. DMSO-reduktaza
• katalizira prijenos kisika s DMSO na Mo nakon čega slijedi izdvajanje vode:
• tijekom ishemijskog napada (sma-
njenog dotoka kisika u tkivo) aktivi-
raju se proteaze koje kataliziraju
XII.4.2. Ksantin-oksidoreduktaza (XOR)
• Uloga u katabolizmu purina, detoksifikaciji i regulaciji staničnog redoks-potencijala; javlja se u
dva oblika:
o ksantin-dehidrogenaza (XD): dovodi do nastanka antioksidansa - mokraćne kiseline,
o ksantin-oksidaza (XO): sinteza velikih količina reaktivnih kisikovih (ROS, reactive oxygen
species) i dušikovih čestica (RNS, reactive nitrogen species),
raju se proteaze koje kataliziraju
brzu konverziju XD u XO pri čemu
se generira super-oksid radikal koji
uzrokuje vazodilataciju,53
• mogućnost brze konverzije XD u
XO uslijed različitih ozljeda i ošte-
ćenja tkiva čini XOR idealnom
komponentom imunosustava,
53 H.A. Kontos, Oxygen Radicals in Cerebral Ischemia: The 2001 Willis Lecture, Stroke 32 (2001) 2712.
XII.4.3. Sulfit-oksidaza (SO)54
• katalizira biološki esencijalnu oksidaciju sulfita u sulfate (terminalnu reakciju u oksidativnoj
razgradnji Met i Cys),
• aktivno mjesto sadrži Mo=O skupinu i Cys-ostatak,
54 R. Hille, Molybdenum enzymes in higher organisms, Coordination Chemistry
Reviews 255 (2011) 1179.
• manjak izaziva neurološke poremećaje i mentalnu
retardaciju,
XII.5. Cink55
• Esencijalan za rast svih živih organizama,
• prisutan u više od 300 različitih enzima u kojima ima
ulogu Lewisove kiseline (vezuje vodu koja deprotoni-
ranjem prelazi u nukleofilni OH¯ ion); u proteinima je
najčešće vezan za dušik iz His, kisik iz Asp i Glu te
sumpor iz Cys,
• doprinosi katalitičkoj moći i stabilnosti pripadajućih proteina.
55 K. A. McCall et al, Function and Mechanism of Zinc Metalloenzymes, J. Nutr. 130 ( 2000) 1437S.
XII.5.1. Ugljična anhidraza (CA, carbonic anhydrase)
• Sudjeluje u disanju, fotosintezi i transportu iona,
• katalizira reverzibilno hidratiranje CO2 iz eritrocita u
ugljičnu kiselinu, odnosno hidrogenkarbonatni ion,
• terapeutska primjena (diuretik, liječenje
glaukoma, infekcija i karcinoma).
56 C.T. Supuran, Carbonic anhydrases: novel therapeutic applications for inhibitors and activators, Nat. Rev. Drug. Discov. 7 (2008) 168.
XII.5.2. Alkohol-dehidrogenaza (ADH)57
• Oksidacijom alkohola u acetaldehid (koji se
djelovanjem aldehid-dehidrogenaze prevodi u
acetat), ADH razgrađuje toksične spojeve na
molekule koje stanice mogu koristiti,
• kao koenzime koristi NAD(H) ili NADP(H),
• jetrena ADH (LADH, liver alcohol
dehydrogenase) u aktivnom mjestu
o katalitički ciklus LADH
dehydrogenase) u aktivnom mjestu
sadrži Zn(II)-ion koji koordinira s
alkoholom, dvama Cys- i jednim His-
ostatkom:
57 L. M. Berreau et a., Kinetic and mechanistic studies of the reactivity of Zn–OHn (n=1
or 2) species in small molecule analogs of zinc-containing metallo-
enzymes, Advances in Physical Organic Chemistry 41 (2006) 79.
XII.5.2. Metalo-ββββ-laktamaza58-62
• β-Laktami čine više od polovine antibiotika
prisutnih na tržištu,
• nakon prolaska kroz staničnu membranu
inaktiviraju bakterijske transpeptidaze uključe-
ne u biosintezu stanične stijenke,
• gram-negativne bakterije se protiv ovih
antibiotika bore pomoću β-laktamaza, enzima
koji cijepaju laktamski prsten hidrolizom C−N
veze,
• laktamaze se dijele u 4 skupine; skupine A, C i
D koriste aktivni Ser kao nukleofil, dok skupina
B (koju čine metalo-β-laktamaze) koristi jedan
ili dva Zn-iona za hidrolitički učinak,
• metalo-β-laktamaze doprinose porastu rezistencije na postojeće antibiotike, zbog čega se
provode brojna istraživanja čiji je cilj što bolje shvatiti njihovu strukturu i mehanizam
djelovanja:
o 3D-struktura metalo-β-laktamaze iz B. cereus (Zn-ioni)
• binuklearni Zn-centar smješten je na dnu lako dostupne plitke, široke brazde između dviju β-
plohi,
• sadrži tetraedarski koordinirani Zn1-ion, te trigonalno bipiramidalno koordinirani Zn2-ion
međusobno premoštene H2O/OH¯ ionom,
• Zn1-ion polarizira karbonilnu skupinu β-laktamskog prstena iz supstrata tvoreći oksianionsku
šupljinu čime se olakšava hidroliza; Zn2-ion lociran je u neposrednoj blizini β-laktamskog
dušikova atoma čime se dodatno polarizira amidna veza i stabilizira odlazeća skupina:
58 Z.Wang et al, Metallo-β−lactamase: structure and mechanism, Current Opinion in Chemical Biology 3 (1999) 614.
59 T.R. Walsh et al, Metallo--Lactamases: the Quiet before the Storm? Clin. Microbiol. Rev. 18 (2005) 306.
60 V. Gupta, Metallo beta lactamases in Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter species, Expert Opn Investig Drugs 17 (2008) 131.
61 F. Kaleem et al, Frequency and susceptibility pattern of metallo-beta-lactamase producers in a hospital in Pakistan J Infect Dev Ctries 4 (2010) 810.
62 C. R. Bethel et al, Exploring the Inhibition of CTX-M-9 by β-Lactamase Inhibitors and Carbapenems, Antimicrob Agents Chemother. 55 (2011) 3465.
XIII. Redoks-aktivacija metalnih prolijekova1,12,63-65
• Najvažnija prednost lijekova baziranih na metalima u odnosu na lijekove izvedene iz organskih
molekula leži u njihovoj sposobnosti variranja koordinacijskog broja, geometrije i redoks-stanja;
metali mogu koordinirati s organskim lijekovima stvarajući komplekse izmijenjenih
farmakoloških svojstava,
3. metali koji pojačavaju zračenje,
• metalni farmaceutici svrstavaju se u sedam kategorija ovisno o funkciji metala i liganda:
1. metalni kompleksi aktivni u inertnoj formi,
2. metalni kompleksi aktivni u svom reaktivnom stanju,
4. spojevi koji sadrže radioaktivni metal,
5. aktivni metali ili njihovi biotransformacijski produkti,
6. biološki aktivni ligandi,
7. aktivan je samo dio kompleksa,
• dvije su strategije u dizajnu metalnih lijekova:
o strategija ciljanja: bazira se na selektivnom transportu funkcionaliziranih molekula lijeka
prepoznatih od strane receptora na površini stanica karcinoma,
o strategija prolijekova: prijenos citotoksičnog spoja koji se aktivira u uvjetima prisutnima u
ciljnom tkivu ili stanici,
• okidači za aktivaciju prolijeka su pH, svjetlost ili redoks-reaktivnost,
• tumori imaju nisku koncentraciju kisika – reduktivno mikrookruženje u odnosu na zdravo tkivo
uslijed nedostatnog stvaranja novih krvnih žila tokom rasta,
• smanjena razina kisika u tumorima (hipoksija)
predstavlja ozbiljan problem u terapiji karcinoma;
mogući izlaz predstavljaju bioreduktivni lijekovi
• reduktivnosti tumora pridonosi i visoka koncentracija
staničnih reducirajućih agenasa,
(kinoni, nitroimidazoli, aromatski N-oksidi, te neki
metalni spojevi),
• metalni prolijekovi do ciljnih se stanica dopremaju u inertnom oksidiranom stanju, bez
prethodne redukcije, i metaboliziraju kad dospiju u reduktivno okruženje tumorskih
stanica,
64 N. Graf et al, Redox activation of metal-based prodrugs as a strategy for drug delivery, Advanced Drug Delivery Reviews 64 (2012) 993.
63 W. Kandioller, et al, Tuning the anticancer activity of maltol-derived ruthenium complexes by derivatization of the 3-hydroxy-4-pyrone moiety, Journal of
Organometallic Chemistry 694 (2009) 922.
65 N- Metzler-Nolte et al, The potential of organometallic complexes in medicinal Chemistry Current Opinion in Chemical Biology 16 (2012) 84.
• Potencijalni reducirajući agensi za Pt(IV)-spojeve u stanici su glutation, vitamin C i proteini koji
sadrže Cys (metalotionein, serum-albumin),
• sposobnost vezivanja Pt(IV)-kompleksa s DNA proporcionalna je njegovoj podložnosti
redukciji; čak i baze iz DNA mogu reducirati Pt(IV)-spojeve
XIII.1. Kompleksi platine
• podesiva redoks-svojstva metalnog iona i modifikacija liganda omogućuju kontrolu biološke
aktivnosti; gubitak liganda L tokom reakcije u hipoksičnim tumorskim tkivima može aktivirati
metalni kompleks za vezivanje na ciljni receptor.66
66 Y. Shi, Pt(IV) complexes as prodrugs for cisplatin, Journal of Inorganic Biochemistry 107 (2012) 6.
• Antitumorska aktivnost Ru(III)-spojeva ovisi o njihovoj redukciji u Ru(II) (antimetastatska
aktivnost opaža se u prisutnosti bioloških reducensa),
XIII.2. Kompleksi rutenija
• redoks-potencijal podešava se modifikacijom liganada, a njegove se vrijednosti mogu
reducirati pri fiziološkim uvjetima, u prisutnosti glutationa i vitamina C,
• povećanje razine Ru-DNA adukta opaža se pri niskom parcijalnom tlaku kisika, što je
indikacija porasta udjela reduciranog Ru(II)-oblika,
XIII.3. Nanomaterijali u terapiji67
• Nanomaterijali, objekti nanometarskih
dimenzija, od ogromne su strukturne i
funkcionalne važnosti u biotehnologiji i
medicini,
• nanotehnologija omogućuje ranu detekciju
bolesti, dijagnozu, liječenje i prevenciju,bolesti, dijagnozu, liječenje i prevenciju,
• primjena: kirurgija, onkološka stanja,
biodetekcija markera, molekulsko oslikava-
nje, implantati, tkivno inženjerstvo,...
67 A. Pandey et al, Nanoscience and their biological omportance: human
health and disease, Digest Journal of Nanomaterials and Biostructures
3 (2008) 141.
• sustavi za dopremanje mogu
upravljati transportom molekula
lijeka do željene stanične populacije
zahvaljujući EPR (enhanced
permeability and retention) – efekt
selektivnog ciljanja karcinoma,
• krvne žile u tumoru propusnije su• krvne žile u tumoru propusnije su
nego u zdravom tkivu; nanočestice
lijeka selektivno prolaze u bolesno
tkivo,
• selektivno dopremanje metalnih prolijekova do stanica raka ostvarivo je pomoću nanočestica,
• kombiniranjem Pt(IV)-prolijekova s nanočesticama otvara se mogućnost njihovog transporta
kao i prevencije preuranjene redukcije u krvotoku,
• ugljikove nanocijevi68,69 (CNT, carbon
nanotubes):
velike molekule sačinjene
iz ugljika, cjevastog oblika,
promjera 1- 3 nm,
• istražuje se njihova potencijalna uloga u
biologiji i medicini; veličina, velika dodirna
površina, inertni kemijski sastav i jedinstvena
fizikalna svojstva omogućuju njihovu uporabu u
68 P. N. Yaron et al, Single wall carbon nanotubes enter cells by endocytosis and not membrane penetration, Journal of Nanobiotechnology 9 (2011) 45
fizikalna svojstva omogućuju njihovu uporabu u
transportu DNA, nukleinskih kiselina, lijekova i
različitih proteinskih terapeutika,
• CNT u stanicu ulaze
endocitozom (proces u
kojem stanica apsorbira
(“proguta”) molekulu),
69 T. E. Mallouk, Chemistry at the Nano-Bio Interface, J. Am. Chem. Soc., 131 (2009) 7937.
• nakon vezivanja Pt(IV) za CNT slijedi unos u stanicu procesom
endocitoze; rezultira povećana citotoksičnost CNT-funkcionaliziranih
Pt(IV)-lijekova u usporedbi s cisplatinom,70
• kemoterapija uništava i bolesne i zdrave stanice,
• većina stanica raka sadrži folatne receptore; molekule folata vezane za kompleks Pt(IV)-CNT
procesom endocitoze ciljano ulaze u stanice karcinoma,
70 S. Dar et al, Targeted Single-Wall Carbon Nanotube-Mediated Pt(IV) Prodrug Delivery Using Folate as a Homing Device, J. Am. Chem. Soc. 130 (2008)
11467.