oral delivery of proteins: effect of chicken and duck ovomucoid on the stability of insulin in the...

5
Pharm. Pharmacol. Commun. 2000, 6: 223±227 # 2000 Pharm. Pharmacol. Commun. Received February 7, 2000 Accepted February 29, 2000 Oral Delivery of Proteins: Effect of Chicken and Duck Ovomucoid on the Stability of Insulin in the Presence of a-Chymotrypsin and Trypsin VIKAS AGARWAL, INDRA K. REDDY AND MANSOOR A. KHAN Department of Pharmaceutical Sciences, Texas Tech University Health Sciences Centre, Amarillo, TX 79106, USA Abstract The in-vitro stability of insulin in the presence of a-chymotrypsin and trypsin has been evaluated in the presence of different concentrations of chicken and duck ovomucoid (CkOVM and DkOVM), a new class of enzyme inhibitor derived from the egg white of avian species. The inhibitory effect was compared with that of aprotinin. The effectiveness of DkOVM was also determined in the presence of agents that accelerate a-chymotrypsin- mediated degradation of insulin in solution by deaggregation. Insulin solutions (18 mM) were incubated at 37 C with 01 mM chymotrypsin and 05 mM trypsin in 100 mM Tris buffer containing 1 mM calcium chloride and different concentra- tions of CkOVM and DkOVM. Samples were treated with cold Tris containing 1% (v=v) tri¯uoroacetic acid to stop the enzyme action and analysed by reversed-phase high-per- formance liquid chromatography. Similar studies were performed with aprotinin, EDTA (005 mM) and sodium glycocholate (30 mM) in the presence of a-chymotrypsin and DkOVM. DkOVM was effective against a-chymotrypsin-mediated degradation of insulin at enzyme-to-inhibitor ratios of 1 : 05, 1 : 1 and 1 : 2. CkOVM was ineffective against a- chymotrypsin even at an enzyme-to-inhibitor ratio of 1 : 4. In contrast, both DkOVM and CkOVM were completely effective against trypsin-mediated degradation of insulin at an enzyme-to-inhibitor ratio of 1 : 1. This effect was comparable with that of aprotinin at an enzyme-to-inhibitor ratio of 1 : 1. Inhibition of the enzyme was reduced in the presence of sodium glycocholate and EDTA. DkOVM effectively stabilized insulin against degradation for a study period of 1 h in the presence of a-chymotrypsin and trypsin. Because insulin is extensively degraded by a- chymotrypsin, DkOVM might be used to enhance the oral delivery of insulin. Enzymatic degradation of proteins and peptides in the gastrointestinal tract limits their absorption (Langguth et al 1997). The degradation might be localized in the lumen, the intestinal epithelium, the brush border or within enterocytic cells. Con- sequently, the pre-systemic stability of proteins should be evaluated. The feasibility of oral administration of insulin has been widely studied. Although insulin is extensively degraded, it can pass through the gastrointestinal epithelium when protected adequately and can reach therapeutic levels in the blood and thus reduce glucose levels (Laskowski et al 1958; Bendayan et al 1990; Saf- fran et al 1997). The in-vitro stability of insulin in the presence of trypsin and a-chymotrypsin has been studied (Ginsburg & Schachman 1960; Young & Carpenter 1961) and four metabolites from the degradation of insulin by a-chymotrypsin have been characterized by combined use of reversed-phase high-perfor- mance liquid chromatography (RP-HPLC), amino acid analysis and mass spectrometry (Schilling & Mitra 1991). The stability of insulin depends on its state of association in aqueous solution. Conse- quently deaggregating agents such as EDTA (Liu et al 1991), bile salts (Li et al 1992) and surfactants (Shao et al 1993) increase the rate of degradation. Interestingly, some of these agents enhance the absorption of proteins by different mechanisms. The use of enzyme inhibitors for oral delivery of insulin is becoming increasingly popular. Most Correspondence: M. A. Khan, School of Pharmacy, Texas Tech University HSC, 1300 Coulter, Suite 400, Amarillo, TX 79106, USA.

Upload: vikas-agarwal

Post on 06-Aug-2016

216 views

Category:

Documents


0 download

TRANSCRIPT

������ ��������� ������ ���� �� �� � � ��� ������ ��������� �������������� �������� �� ����������� �������� � ���

!�� "������ �# �������$� %##��� �# ���&�� ��� "��&!�������� �� ��� '������� �# (�$��� �� ��� ���$���� �#

�)��������$�� ��� *���$��

+(,�' �-��.�/� (0"�� ,� �%""1 �0" 2�0'!!� �� ,3�0

���������� ������ ���� �� � ��� ��� ����� �� � ���������� ������ � ��� �� ������� ���������� ��� !� ���

��������

*�� ��)����� $������� �# ��$��� �� ��� ���$���� �# �)���������$�� ��� ����$�� ��$ ������������ �� ��� ���$���� �# ��##����� �������������$ �# ����&�� ��� ���& ���������4&!+2 ��� "&!+25� � ��6 ��$$ �# ��7��� ��������� ������� #��� ��� �88 6���� �#����� $�����$� *�� ���������� �##��� 6�$ �������� 6��� ���� �# ���������� *�� �##��������$$�# "&!+2 6�$ �$� ���������� �� ��� ���$���� �# �8���$ ���� ��������� �)���������$��)�������� ��8�������� �# ��$��� �� $������ �� ���88��8������(�$��� $������$ 49:�25 6��� ��������� �� ��� 6��� ��9 �2 ���������$�� ��� ��;�2

����$�� �� 9���2 *��$ ��##�� ���������8 9�2 ������ ������� ��� ��##����� ���������)����$ �# &!+2 ��� "&!+2� '����$ 6��� ������� 6��� ��� *��$ ���������8 9< 4���5���=���������� ���� �� $��� ��� ��7��� ������ ��� ����$�� �� �����$��)���$� ��8�)���)#������� �>��� ��������8������ '����� $�����$ 6��� ���#����� 6��� ���������� %"*�4���;�25 ��� $����� 8��������� 4���25 �� ��� ���$���� �# �)���������$�� ���"&!+2� "&!+2 6�$ �##������ �8���$� �)���������$��)�������� ��8�������� �# ��$����� ��7���)��)��������� �����$ �# 9 � ��;� 9 � 9 ��� 9 � � &!+2 6�$ ���##������ �8���$� �)���������$�� ���� �� �� ��7���)��)��������� ����� �# 9 � ?� (� ������$�� ���� "&!+2 ���&!+2 6��� �������� �##������ �8���$� ����$��)�������� ��8�������� �# ��$��� ���� ��7���)��)��������� ����� �# 9 � 9� *��$ �##��� 6�$ ��������� 6��� ���� �# ��������� �� ����7���)��)��������� ����� �# 9 � 9� (��������� �# ��� ��7��� 6�$ ������� �� ��� ���$�����# $����� 8��������� ��� %"*��"&!+2 �##������� $�����7�� ��$��� �8���$� ��8�������� #�� � $���� ������ �# 9 � �� ���

���$���� �# �)���������$�� ��� ����$��� @����$� ��$��� �$ �A���$���� ��8����� �� �)���������$��� "&!+2 ��8�� �� �$�� �� ������� ��� ��� ������� �# ��$����

%�7������ ��8�������� �# �������$ ��� �������$ ����� 8�$�������$���� ����� ����$ ����� ��$�������4/��88��� �� � 9 �5� *�� ��8�������� ��8�� ������7�� �� ��� ����� ��� ����$���� ������������� ���$� ������ �� 6����� ����������� ��$� ��)$�>������ ��� ���)$�$����� $������� �# �������$$���� �� ��������� *�� #��$������ �# ���������$������� �# ��$��� ��$ ���� 6���� $������������8� ��$��� �$ �A���$���� ��8������ �� �����$$ �����8� ��� 8�$�������$���� ��������� 6������������ ���>����� ��� ��� ����� ��������������$ �� ��� ���� ��� ���$ ������ 8���$� ���$4/�$&�6$&� �� � 9 ;:B @������� �� � 9 �B '�#)#��� �� � 9 �5�

*�� ��)����� $������� �# ��$��� �� ��� ���$�����# ����$�� ��� �)���������$�� ��$ ���� $������4-��$���8 C '�������� 9 ��B 1���8 C ��������9 �95 ��� #��� ���������$ #��� ��� ��8�������� �#��$��� �� �)���������$�� ���� ���� ����������7���� �������� �$� �# �����$��)���$� ��8�)���#��)����� �>��� ��������8����� 4��)3�/5� ��������� ����$�$ ��� ��$$ $����������� 4'�����8 C2���� 9 95� *�� $������� �# ��$��� ������$ �� ��$$���� �# �$$�������� �� �>����$ $������� ��$�)>����� ���88��8����8 �8���$ $��� �$ %"*� 4/�� ��� 9 95� ��� $��$ 4/� �� � 9 5 ��� $��#������$4'��� �� � 9 �5 ������$� ��� ���� �# ��8���������(�����$���8�� $��� �# ���$� �8���$ ������� �����$������� �# �������$ �� ��##����� �������$�$�*�� �$� �# ��7��� ���������$ #�� ��� ������� �#

��$��� �$ �������8 ������$��8� ������� 2�$�

����$��������� 2� �� ,���� '���� �# ���������*�A�$ *��� D�����$��� 3'� 9��� ������ '���� ?���������� *E � 9��� D'��

$�����$ �������8 ��� �$� �# ���������$ ��� ���8������6���$ ����� ��8�������� 4@�� �� � 9 ;5 �������$��� ��8�������� �� ��$���)��8�����8 ��7���4@�� C ���8 9 ;5�!��������$ ��� ��7��� ���������$ ������� #���

��� �88 6���� �# ����� $�����$� %A���$��� �����6$ �#����� $������ ������ ������$� ��� �������$� �#���������� ������ ��� #���� �$�6���� 4/�$&�6$&� C,��� 9 ��B �����$ �� � 9 ��5� @���=�� ����� ���)������$ ��� ���$��� �� ��� �88 6����$ �# � ����$$������ ��� ������� #�� 9�< 4�����A�5 �# �88)6�����������$� @����$� ���������$ ������� ��8�$������7���$ $��� �$ ������ ����$��� ������ �)�����)����$�� ��� ������� ���������� ��$��$�� ���� ��8������ �� �A������ �$�#� ��� �� ��� ��� ������� �#�������$ �� 8����� ��� ��$��� �� ����������(� ���$ $���� 6� ���� �������� ��� ��)�����

�#F���� �# ��� $����� ������$� ���������$ ���& �������&�� ��������� 4"&!+2 ��� &!+25�8���$� �)���������$��) ��� ����$��)����������8�������� �# ����� ��$���� *�� ���������� �##���6�$ �������� 6��� ���� �# � 6� &��6� �������������������� @����$� %"*� ��� $����� 8������������ &��6� �� ���88��8��� ��$��� �� $������ ������������ ��7������ ��8��������� ��� �##��������$$�# "&!+2 �8���$� �)���������$��)����������8�������� �# ��$��� 6�$ �A������ �� ��� ���)$���� �# ���$� ��������$� *6� ��G�� ���������$�# �)���������$��)�������� ��8�������� �# ��$���6��� ��������� �� ��� ���$���� ��� ��$���� �#"&!+2�

������� �� ���� �

"������������������� ����� ��$��� ��� ��������� 6����������� #��� ��� (����8�� ������ 4������$��015� *���$�� 4*��� E(((� *�, �������5 ��� �)���������$�� 4*��� +((� */, �������5 #��������� �������$� ����&�� ���������� $����� 8�)��������� %"*� ��� ���=���������� ���� 6����������� #��� '�8�� 4'� /���$� 2!5� *��$� *��$���� ��� ������ ������� 6��� ������$�� #���'������� 40�6 @���$6��&� 0H5� "��& ���������6�$ ������� �� "� 2� /�$&�6$&�� "��������� �#����$���� ������ D�����$���� 3�/)8���� $�)����$ 6��� #��� ��$��� '������F� 43��$���� *E5�!���� �������$ 6��� �# �������� 8���� ��� 6����$�� �$ ��������� "�$���� ������7�� 6���� 6�$�$�� #�� � ��� �A��������$�

���#����� ���$��� �� ��� ������ � �� %����$ $� % ��� �$(�$��� $������$ 49:�25 6��� ��������� �� ��� ��9���2 *��$ ��##�� ���������8 9�2 ������ ����)

��� 4��G�$��� �� �3:��5� "�8�������� ���F�$ 8����)���� �� ��� ���$���� �# ��9�2 �)���������$�� �����;�2 ����$�� #�� ����� $����� �$ ������$� *��$��������������$ 6��� $������ �� ��� ��$�$ �# � $������������ �$�6���� 4'�����8 C 2���� 9 95�"&!+2 ��� &!+2 6��� �������� �� ��##�������7���)��)��������� �����$ �� ������� ����� �����������# ��$��� ��8��������� (�$��� ��� ��7��� $������$6��� ��������� #�� 9;��� �� ��� ��#��� $������8 ����A��������$� '����$ 6��� ��&�� �#��� �� ;� 9;� ����� ����� ��� ���������� ������ 6��� ��� 9<���=���������� ���� 4*��5�*��$ �� ������ ��� �3 �� �;� *�� $����$ 6��� ����$�� �� ?� �� ��3�/6��� � +����� �������8����� 6��&$������� ���$ �#��$��� ��������8 �8���$� ���� 6��� 8��������� (������$ 4������ �# ��$��� 4<5 ��������8 �#��������5 6��� �$�� �� ������� ��� �#F���� �# ������������$� '����� $�����$ 6��� ���#����� 6�������������

���#����� ���$��� �� ��� ������ � &�����$ �$��� '�� �����*�� ��������� #��6�� 6�$ �$ ��$������ �����6��� ����� ����F������$� ������������$ �# %"*���� $����� 8��������� 6��� ���$�� �� ��A���7����88��8����� �# ��$��� �� $������ 4/�� �� � 9 9B/� �� � 9 5� *�� ������ $������ ������������;�2 %"*� ��� ���2 $����� 8��������� ���������� �� ��$���� *�� ��8�������� ���F�$ 6���8�������� �� ��� ���$���� �# �)���������$�� ���"&!+2 ���� *�� ��7���)��)��������� ����� �$��6�$ 9 � 9 ������� �� �)���������$���

������� �� ����$(�$��� 6�$ ����$�� �� ����$ �# �� ��3�/$�$��� ������$��8 � ��������)�������� +������������8����� 6��&$������ ���$�$���8 �# �6�"�����A '") �� ����$� �� �() �� ����$������� "�����A D+)9 �������� ��� '��� ;�� ��������)8����� $�#�6���� �������$ 6��� $�������� �� �9: ���������A H������ ������ *�� ����� ���$�6�$ � �� � �� 4< ���5 ��A���� �# ��9< 4���5 *���6���� 4��A���� �5 ��� ��9< 4���5 *��������)������ 4��A���� @5� '����$ 6��� ��������8������#�� 9;��� �� � =�6 ���� �# 9�/����9 ���� 6�����8�� �# 9� ��� D���� ���$� ���������$ ������������ ����$ �# ��$���� ��������� ( ��� ����)����� (( 6��� 9 �;� ;�� ��� ��:���� ��$���������

������ �� ��������

������� ��$ �) ���������� $�'��$���� ��������� ��� ������ � ��� �$�*�� ��8�������� ���F�$ �# ��$��� �� ��� ���$�����# �)���������$�� ��� ��##����� �������������$ �#

? +(,�' �-��.�/ %* �/

"&!+2 ��� $��6� �� ��8��� 9� *�� �A���� �#��8�������� ������$�� �$ ��� ��7���)��)�������������� 6�$ ������$��� �� �� ��7���)��)��������� ������# 9 � � (�� 6�$ :���� ���< 4����� $�����5 �#��� ������ ���� 4*��� 95� *�� �A���� �# ��8��)������ �� �)���������$�� 6�$ ��� �##����� �� ������$���� �# &!+2� %��� �� �� ��7���)��)����)����� ����� �# 9 � ?� (�� 6�$ �?�� �� �< �# ��������� ���� 4*��� 5� (� ������$�� ���� "&!+2��� &!+2� �� �� ��7���)��)��������� ����� �#9 � 9� 6��� �������� �##������ �8���$� ����$��)�������� ��8�������� �# ��$��� 4(�� ���������

��8��� � *���$��)�������� ��8�������� �# ��$��� �$ � #���)���� �# ���� �� ��� ��$���� �# ��������� 4�5 ��� �� �� ��7���)��)��������� 4���& ��������� 4�5 ��� ����&�� ���������4�55 ����� �# 9 � 9�

*��� 9� ������ 4<5 �# ��$��� ��������8 �#��� ����� 4(��5�� ��� ���$���� �# ���& ��������� 4"&!+25 ��� ����������

���������� (��

����� 9����������$�� 4��9 �25 99�:� 9� :���������$���"&!+2 9 � ��; ; ��?� 9�?���������$���"&!+2 9 � 9 �;�; � 9�?���������$���"&!+2 9 � :���� �����������$��� ��������� 9 � 9 � ��;� ���?*���$�� 4��;�25 �:�� � 9�:;�*���$���"&!+2 9 � 9 �; � ��9�*���$��� ��������� 9 � 9 �� � ���:��������$��� ��;�2 %"*� ��� � ������������$��� ���2 $�����

8���������?���� ��:

��������$��� ��;�2

%"*��"&!+2 9 � 9;��: � 9�;

��������$��� ���2 $�����8����������"&!+2 9 � 9

;��;:� ?�:?

(�� ����$ ��� ����$� $����� #��� ����� �A��������$ �A�����#��� $�A �A��������$ ��� �#��� F�� �A��������$�

��8��� 9� ��������$��)�������� ��8�������� �# ��$��� �$ �#������� �# ���� �� ��� ��$���� �# ��������� 4�5 ��� �� ��7���)��)��������� 4���& ���������5 �����$ �# 9 � ��; 4�5� 9 � 9 4�5��� 9 � 4�5�

��8��� �� ��������$��)�������� ��8�������� �# ��$��� �$ �#������� �# ���� �� ��� ��$���� �# ��������� 4�5 ��� �� ����7���)��)��������� 4��������� 4�5 ��� ���& ��������� 4�55����� �# 9 � 9�

*��� � ������ 4<5 �# ��$��� ��������8 �#��� ����� 4(��5�� ��� ���$���� �# ����&�� ��������� 4&!+25�

���������� (��

����� 9����������$�� 4��9 �25 99�:� 9� :���������$���&!+2 9 � �;9� �� ;��������$���&!+2 9 � ? �?�� �� �*���$�� 4��;�25 �:�� � 9�:;�*���$���&!+2 9 � 9 � �� ���

(�� ����$ ��� ����$� $����� #��� ����� �A��������$ �A�����#��� $�A �A��������$ ��� �#��� F�� �A��������$�

'*�@(/(*1 !� (0'D/(0 (0 *3% ��%'%0% !� �)312!*�1�'(0 �0" *�1�'(0 ;

6��� ��� ������ ���� 4��8��� B *���$ 9 ��� 5�*��$ �##��� 6�$ ��������� 6��� ��� �##��� �#��������� �� ����$�� ��� �)���������$�� �� ����7���)��)��������� ����� �# 9 � 9 4��8��� ��*��� 95�(� �$ ���� ���� ��� ���������� ������ �# �����)

����$ �$ ��7���) ��� $�����$)���������� !����)����$ ����8 �� ��� ���������� $�������� ����$��#���� �# ���������$ 4/�$&�6$&� C ,��� 9 ��5�%��� ��������� ������ ��$ �� ��$� ��� ������������ &��6� �$ ��� �������� $���� ���� ��������$ 6������ �����$������8 ��7��� �� ����$ �# +�� ���.��$ ������������ �����8��)������8 ��� $������8�$� &!+2 ��$ ��� ��� ���������� $��� #������$�� 6�����$ "&!+2 ��$ �6� $���$ #�� ����$����� ��� ���� #�� ���������$��� $�����$�� �����$��$�� *�� ��$��$ ���$����� $��6 ��� ���������������� �# &!+2 ��� "&!+2 6��� ��$��� �$�$�� �$ $��$������ ������� ���������� ��$���$������$ 6��� �$����$��� �$ � #������� �# ���)���������� �� ��� ���8� ���; �� �� �2 #�� ��� ����)�����$ $������� ��������� �$ � ���)$����F� ������$���������� ������� #��� ������ ��8 ��$$�� ��� �$�$$������� 6��� ����)F��������� �������� ��� ���)$�������� �# ������ #������� 4������ �� � 9 �5� (#�� �$ ������$����� ���� �� �����8��$ 8�$���� ����)�������� 4���$��� 9 5�

��'��$���� �� ��� ������ � $��''��'����'�'����*�� ��8�������� �# ��$��� �������� �� �)�����)����$�� �� ��� ���$���� �# ���88��8����8 �8���$%"*� 4���;�25 ��� $����� 8��������� 4���25

�$ $��6� �� ��8��� ?� "�8�������� �# ��$���������$�� $�8��F����� �� ��� ���$���� �# �����8���$� (�� ����$ 6��� ������� �� �� ��$� ;�< ����� ���$���� �# �)���������$�� ���� 4*��� 95�'��$�>������ 6��� ��$��� 6�$ ��������� 6���"&!+2 �� ��7���)��)��������� ����� �# 9 � 9����������� �������� ������$��� *�� (�� ����$;��: � 9�; < 4����� $�����5 ��� ;��;:� ?�:?<�������� �� ��� ���$���� �# %"*� ��� $�����8��������� ��=��� 9�< ��� 9 < ��������� ������������ �������� �������� 6��� (�� ����$ �� ������$���� �# "&!+2 �� �� ��7��� ��������� ����� �#9 � 9 4*��� 95�%"*� ��� $����� 8��������� ���88��8���

��$��� �� $������ �� ��##����� �������$�$I%"*� ���$ �� �������� �# 7��� ���$ ��� $�����8��������� �� ����������� ������ ���������)���� �# �������$� ����������� ��$��� #��� ��������$ �� $������ �� � ������� �# �$$�������#���$I�������$� �����$ ��� ��8���)����� ��8�)���$ 4@�� C ���8 9 �5� .��� ��8���)������88��8���$ ��$$������ �� $������ ���� �������$��� �A��$�� �� �)���������$��)�������� ��8����)����� �����8� ��� �A���� �# ��8�������� ������$���� ��$� �6�#�� �� ��� ���$���� �# %"*� ���$����� 8���������� ��� �##��������$$ �# "&!+2��� ��� ������$� �� ����������� *��$ $�88�$�$ ������� ������������� �# ��� ���������$ $������ $���� ����G�$��� �� ��� ��$�$ �# ��� $���� �# �$$�������� �#��$��� �� $�������

���$� ����#����� �) ���������� $�'��$����*�� ���& ����$ �# ��������� ( ��� ��������� ((8�������� �� ��� ���$���� �# �)���������$�� 6���

��8��� ?� ��������$��)�������� ��8�������� �# ��$��� �$ �#������� �# ���� �� ��� ��$���� �# ���88��8����8 �8��� 4�5 ����� ��� ���$���� �# %"*� 4�B ���;�25 ��� $����� 8������)��� 4�B ���25�

��8��� ;� ���& ����$ �# ���������$ ( 4�5 ��� (( 4�5 �� �����$���� �# ��������� ��� 4�5 �� ��� ���$���� �# ���& �����)�����

� +(,�' �-��.�/ %* �/

��������� �� ��� ���$���� ��� ��$���� �# "&!+2���� *�� #�������� �# ���������$ ( ��� (( 6�$��$��� �� ��� ���$���� �# "&!+2 4��8��� ;5� !�������������$ 6��� ��� �������� 6����� 9 � ����7���)��)��������� �����$ �# 9 � ��; ��� 9 � 9� �������������$ 4�� @� ��� "5 �# �)���������$��)�������� ��8�������� �# ��$��� ���� ���� ����)������7�� 4'�����8 C 2���� 9 95� *�� ����������& ����$ �# ���������$ ( ��� (( ���� ���� ���$����� �� ��� ���������$ " ��� �������� ��'�����8 C 2���� 49 95�

�� ������"��& ��������� �������� ��� $������� �# ��$����� ��� ���$���� �# �)���������$�� ��� ����$������&�� ��������� 6�$ �##������ �8���$� �������$��)�������� ��8��������� *�� ���������� �������# ���& ��������� 6�$ ������� �� ��� ���$���� �#���88��8����8 �8���$� �����8� #������ ����$��8�)����$ ��� 6��������� ���$� ��$��$ $�88�$� ����������� �# "&!+2 �� ��� ��� ������� �# ��$����

� %�(��$'������*��$ 6��& �$ � ���� �# ��� ��$$�������� ��$����� �# +��8��6� �� ��� "��������� �# �������������'������$ �� ��� '���� �# �������� �� *�A�$ *���D�����$��� 3���� '������$ ������ .� 8����#����&��6��8� "� 2����� /�$&�6$&� #�� ��� ���)������ $����� ������������ �$ �$� �A������ �� "�J������ '���� #�� ��$ $������ ��� �������8������

������

@��� H� ��� ���8� /� /� 49 ;5 *���$�������� ����$���� �#��$���� ���� 9� (�$��� ��8�������� �� ��$��� ��8�����8��7��� �� $�� ����$���� ���������� ������ ��$� 9 �99�9�99�;

@��� H� ��� ���8� /� /� 49 �5 %##���$ �# ��7��� ���������$ �����$��� ������������� �� ����$�������� ����$���� �# ��$����� ���$� H� ������ ��������� ?:� 9��:�9�:

@��� H� ��� ���8� /� /�� -��� H� 3� 49 ;5 %##���$ �#��������� ������$ �� ��� ����� �������$�$ �# ����������8$ �� ��� ����� H� ������ '��� :?� 9 9�9 ?

@�������� 2�� K��� %�� @�� '�$$��� ��� @��)!�� 3�� ,������ 2�49 �5 2�����)����������� ��� ���������� �������� #����$��� ��$������� �� ��� ��� ��� ���������� "�������8����� 9 �� �?

-��$���8� ��� '��������� 3� ,� 49 ��5 '�����$ �� ��� ��7�)����� ����&��6� �# �������$ (� ������ �# ���������$�� ����$���� H� @��� ���� �;� 9�:�99?

/��88���� ��� @������ +�� 3��7����� H�� 2��&�� 3� ���1���$����� '� 49 �5 ����8� �# ���������� ��7���$ ������$���� ������� �������� H� ����� ��� ?�� � �;�

/�$&�6$&�� 2�� ,���� (� 49 ��5 ������� ���������$ �# �������)�$�$� ����� ���� @������� ? � ; ��� �

/�$&�6$&�� 2� H�� 3��$$��� 3� ��� 2����� �� ��� ����$&�� �� H��/�$&�6$&�� 2� 49 ;:5 %##��� �# ����$�� ��������� �� ��$$�8� �#��$��� ����$$ ��� ����$���� �������� '������ 9 �� 999;�999�

/�� 1�� '���� K�� 2����� �� ,� 49 5 "�$$�������� �# ��$�����8����$ �� ��� $�� �����$ ��� ��$ �##��� �� ����)���������$��)�������� ���������� ��8��������� ��������$� � :�?�:�

/��� ��� ,��$�8� "� !�� 2����� �� ,� 49 95 (�$��� �88��8������� �>����$ ����� ��� ��$ �##��� �� ����)���������$��)�������� ���������� ��8��������� ������ ��$� :� ;�

�����$� 2�� @������� 0�� ������� %� 49 ��5 *�� ����$�� ������������$�� ���������$ #��� ����� �88 6����$� H� @������� �;� 9�:��9� �

������� '�� .�8���� @� ,�� @����8��� 2�� ������� 2� 49 �5���������� ���� ������������� ��� �� ��:�

���$���� "� 49 5 3�8�)��$� ��������� �������� � �����6 �#��� F�$� F�� ����$L �A��������� H� ������������ +�$�����$��� �� ���9��

'�##���� 2�� ���$&�� @�� @���� -� �� .����$� �� %� 49 �5(�$��� ��� ��� 8�$�������$���� ������ H� ����� ��� ?�� : � :

'�����8� �� H�� 2����� �� ,� 49 95 "�8�������� �# ��$��� ������$�� ��� ����)���������$��� ������ ��$� :� � 9�� �

'���� K�� /�� 1�� ,��$����������� ��� �����&� *�� 2����� ��,� 49 �5 "�##������� �##���$ �# �������� ��������� ������������ ���$���8�� $��#������$ �� ��� ��$$��������� ����)���)��������� ��8��������� ��� ������ ��$������� �# ��$�����A����$� ������ ��$� 9�� ?�� ;9

1���8� H� "�� ��������� �� 3� 49 �95 ($������ ��� ���������)�7����� �# �������$ #����� �� ��� ������ �# ����$�� ����$���� H� @��� ���� ��� �?���?:

'*�@(/(*1 !� (0'D/(0 (0 *3% ��%'%0% !� �)312!*�1�'(0 �0" *�1�'(0 �