Optimierung einer Versuchsanordnung zur DLS-Messung im

Fluss und Charakterisierung der UV-induzierten Aggregation des

Prion Proteins

(Optimization of a test arrangement for dynamic light scattering measurement in flow and

characterization of UV-induced aggregation of the prion protein)

von

Stefan Vardanian

geboren am

01. November 1987

Bachelorarbeit im Studiengang Nanowissenschaften

Universität Hamburg

2012

1. Gutachter: Prof. Dr. Michael A. Rübhausen

2. Gutachter: Dr. Stephan Binder

1

2

Abstract

Prion diseases, also known as transmissible spongiform encephalopathies (TSE) belong to a

group of neurodegenerative diseases that affect humans and animals. The cause of prion dis-

eases and the mechanism of their formation are unknown. [15] Understanding the change in

the secondary structure of the cellular prion protein provides knowledge about its functions

and thus scientists hope to prevent or even cure prion diseases.

Dynamic light scattering (DLS) is a method for defining the particle dispersion of polymers,

colloids and biomolecules, such as proteins and enables the determination of the hydrodynam-

ic radius. Together with the sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-

PAGE) and the circular dichroism (CD) spectroscopy, important analytical tools are available

to characterize the UV-induced aggregation and refolding of molecules.

This work provides an insight into the structure and the use of dynamic light scattering (DLS)

for examining the proteins BSA, thaumatin, lysozyme, ferritin and particularly prion proteins.

Static and in flow measurements were conducted with four proteins (BSA, Thaumatin,

Lysozym, Ferritin) in order to find the optimal settings for the experiment. In regard to prion

proteins, structural changes under UV-irradiation lead to their aggregation.

Results indicate that both the hydrodynamic radius and the countrate of the floating particles

in the protein-solution depend on the pump speed and the presence of aggregates. Moreover,

the refolding process of prion proteins and the formation of dimers and oligomers were

demonstrated.

3

Inhaltsangabe

Prion-Krankheiten (engl. transmissible spongiform encephalopathies: TSE) zählen zu neuro-

degenerativen Erkrankungen, die bei Menschen und Tieren vorkommen. Die Ursache der Pri-

on-Krankheiten und der Mechanismus der Entstehung sind unbekannt. [15] Das Verständnis

der Änderung der Sekundärstruktur des zellulären Prion-Proteins liefert Kenntnisse über seine

Funktionen und dadurch erhoffen die Wissenschaftler die Prion-Krankheiten besser vorzu-

beugen oder sogar zu heilen.

Die dynamische Lichstreuung (DLS) ist eine Methode zur Bestimmung der Partikeldispersion

von Polymeren, Kolloide und Biomoleküle, z.B. Proteine. Daraus lässt sich der hydrodynami-

sche Radius ermitteln. Zusammen mit der Natriumdodecylsulfat-

Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) und dem Circulardichroismus (CD-

Spektroskopie) sind wichtige analytische Hilfsmittel vorhanden, um die UV-induzierte Agg-

regation und Umfaltung von Molekülen zu charakterisieren.

Diese Arbeit gewährt einen Einblick über den Aufbau und die Anwendung der dynamischen

Lichtstreuung (DLS) zur Untersuchung der Proteinen BSA, Thaumatin, Lysozym, Ferritin

und insbesondere Prion-Proteine. Es wurden DLS-Messungen statisch und im Fluss mit vier

Eichproteinen (BSA, Thaumatin, Lysozym, Ferritin) durchgeführt und optimale Einstellungen

der Versuchsanordnung identifiziert. Hinsichtlich der Prion-Proteine konnte gezeigt werden,

dass unter UV-Bestrahlung eine strukturelle Änderung zur Aggregation des Prion-Proteins

führt.

Die erbrachten Ergebnisse zeigen, dass sowohl der hydrodynamische Radius als auch die Sig-

nalstärke (Countrate) der in der Lösung schwimmenden Partikel von der Pumpgeschwindig-

keit und der Anwesenheit von Aggregaten beeinflusst werden. Bei den Prion-Proteinen konn-

te der Umfaltungsprozess und die Bildung von Dimeren und Oligomeren nachgewiesen wer-

den.

4

Inhaltsverzeichnis

ABSTRACT ........................................................................................................................................................... 2

INHALTSANGABE .............................................................................................................................................. 3

ABBILDUNGSVERZEICHNIS ........................................................................................................................... 6

TABELLENVERZEICHNIS ................................................................................................................................ 8

1 EINLEITUNG ................................................................................................................................................... 9

2 BIOCHEMISCHE PROBEN ......................................................................................................................... 11

2.1 Proteine ................................................................................................................................................... 11

2.2 Verwendete Proteine ............................................................................................................................... 13

2.2.1 Bovines Serum Albumin ......................................................................................................................... 13

2.2.2 Thaumatin................................................................................................................................................ 13

2.2.3 Lysozym .................................................................................................................................................. 14

2.2.4 Ferritin ..................................................................................................................................................... 15

2.3 Struktur des Prion-Proteins ...................................................................................................................... 15

2.4 Funktion von zellulärem Prion Protein ..................................................................................................... 19

2.5 Prion-Krankheiten .................................................................................................................................... 19

3 THEORETISCHER HINTERGRUND ........................................................................................................ 22

3.1 Wechselwirkungen von Licht und Materie ............................................................................................... 22

3.2 Strukturelle Schädigungen ........................................................................................................................ 22

3.2.1 Direkte Proteinoxidation ......................................................................................................................... 23

3.2.2 Indirekte Proteinoxidation ....................................................................................................................... 24

3.3 Theorie der dynamischen Lichtstreuung ................................................................................................... 25

3.3.1 Interferenz des gestreuten Lichtes und Messsignal ................................................................................. 25

3.3.2 Die Autokorrelationsfunktion und Größenverteilung der Partikel .......................................................... 26

3.4 Biochemische Verfahren ........................................................................................................................... 27

5

3.4.1 SDS-PAGE .............................................................................................................................................. 27

3.4.2 CD-Spektroskopie ................................................................................................................................... 28

4 EXPERIMENTELLE PROZEDUR UND BIOCHEMISCHE ANALYSE ................................................ 29

4.1 Synthese der Proteine .............................................................................................................................. 29

4.1.1 Synthese der Proteinlösungen .................................................................................................................. 29

4.1.2 Synthese der Prion-Proteine .................................................................................................................... 31

4.2 Dynamische Lichtstreuung Messungen ..................................................................................................... 35

4.2.1 Überblich über die Messungen ................................................................................................................ 35

4.2.2 Set-up ohne Pumpe .................................................................................................................................. 36

4.2.3 Set-up im Fluss ........................................................................................................................................ 37

4.2.4 Set-up mit Bestrahlung ............................................................................................................................ 38

4.3 Methoden zur Probenanalyse .................................................................................................................. 40

4.3.1 SDS-Page ................................................................................................................................................ 40

4.3.2 CD-Spektroskopie ................................................................................................................................... 41

5. ERGEBNISSE UND DISKUSSION ............................................................................................................ 42

5.1 Statische Messungen der Proteine ........................................................................................................... 42

5.2 Messungen der Proteine im Fluss ............................................................................................................. 45

5.3 Messungen unter Probenbestrahlung ...................................................................................................... 50

5.3.1 Transmissionsmessungen ........................................................................................................................ 51

5.3.2 Dynamische Lichtstreuung Messungen ................................................................................................... 52

5.4 Biochemische Analysen als Nachweis ....................................................................................................... 55

5.4.1 SDS-PAGE .............................................................................................................................................. 55

5.4.2 CD-Spektroskopie ................................................................................................................................... 58

6 ZUSAMMENFASSUNG UND AUSBLICK ................................................................................................. 60

LITERATURVERZEICHNIS ........................................................................................................................... 63

6

Abbildungsverzeichnis

ABB. 1: STRUKTUR EINER AMINOSÄURE (LINKS) UND EINER PEPTIDBINDUNG (RECHTS) ...................................... 12

ABB. 2: STRUKTUR VON BSA. ............................................................................................................................... 13

ABB. 3: STRUKTUR VON THAUMATIN. ................................................................................................................... 14

ABB. 4: STRUKTUR VON LYSOZYM. ....................................................................................................................... 14

ABB. 5: STRUKTUR VON FERRITIN. ........................................................................................................................ 15

ABB. 6: NMR-STRUKTUR DES ZELLULÄREN PRION-PROTEINS .............................................................................. 16

ABB. 7: SCHEMATISCHE DARSTELLUNG DER STRUKTUR DES ZELLULÄREN PRION-PROTEINS ............................... 16

ABB. 8: STRUKTUR DES ZELLULÄREN PRION-PROTEINS (LINKS) UND DES GPI-ANKERS (RECHTS) ........................ 17

ABB. 9: LINKS IST DIE Β-HELIKALE UND RECHTS DIE Β-SANDWICH STRUKTUR ...................................................... 19

ABB. 10: DAS ZELLULÄRE PRION-PROTEIN (LINKS) UND SEINE ISOFORM-STRUKTUR (RECHTS) ............................ 20

ABB. 11: UMFALTUNG DES PRION-PROTEINS BIS ZUR PATHOGENESE DER PRION-KRANKHEITEN ......................... 21

ABB. 12: AMINOSÄURESEQUENZ DES PRION-PROTEINS ......................................................................................... 24

ABB. 13: AUFTRAGUNG DER SIGNALINTENSITÄT I GEGEN DEN MESSZEITRAUM T ................................................ 25

ABB. 14: AUTOKORRELATIONSFUNKTION .............................................................................................................. 26

ABB. 15: APPARATUR DER GELELEKTROPHORESE ................................................................................................. 27

ABB. 16: NATRIUMDODECYLSULFAT (ENGL: SODIUMDO DODECYL SULFATE:SDS) ............................................... 28

ABB. 17: FOTO DES GERÄTES (JASCO) FÜR DIE ANWENDUNG DER CD-SPEKTROSKOPIE ....................................... 28

ABB. 18: SPEKTROPHOTOMETER, DASS ZUR BESTIMMUNG DER PROTEINKONZENTRATION DIENT ......................... 30

ABB. 19: FPLC-ANLAGE ....................................................................................................................................... 31

ABB. 20: ABBILDUNG EINES THERMOMIXERS ........................................................................................................ 32

ABB. 21: TASCHEN DER APPARATUR (LINKS) UND PROBENAUFTRAGUNG AUF DEM GEL (RECHTS) ....................... 33

ABB. 22: SCHEMATISCHER AUFBAU DER DLS-APPARATUR OHNE PUMPE ............................................................. 36

ABB. 23: SCHEMATISCHE DARSTELLUNG EINER DLS-MESSUNG IM FLUSS ........................................................... 38

ABB. 24: FOTO DES VERSUCHSAUFBAUS EINER DLS-MESSUNG IM FLUSS ............................................................ 38

ABB. 25: VERSUCHSAUFBAU ZUR BESTRAHLUNGSMESSUNG DER PRION-PROTEINE .............................................. 39

ABB. 26: FOTO EINES VERSUCHSAUFBAUS UM PRION-PROTEINE UNTER BESTRAHLUNG ZU MESSEN .................... 39

ABB. 27: GRÖßENVERTEILUNG DES THAUMATINS ................................................................................................. 42

ABB. 28: STATISCHE AUFNAHMEN DES THAUMATINS FÜR 10 S (LINKS) UND 20 S (RECHTS) ................................. 43

ABB. 29: AUTOKORRELATIONSFUNKTION DES THAUMATINS ................................................................................. 43

ABB. 30: AUFNAHMEN DER GRÖßENVERTEILUNG DES LYSOZYMS ........................................................................ 44

ABB. 31: GRÖßENVERTEILUNG DES LYSOZYMS ..................................................................................................... 44

ABB. 32: AUTOKORRELATIONSFUNKTION DES LYSOZYMS .................................................................................... 45

ABB. 33: VERLAUF DES HYDRODYNAMISCHEN RADIUS VON AGGREGATEN DES THAUMATINS ............................. 45

ABB. 34: VERLAUF DER SIGNALSTÄRKE VON AGGREGATEN DES THAUMATINS .................................................... 46

ABB. 35: AUFNAHMEN DES THAUMATINS IM FLUSS FÜR 10 S ................................................................................ 47

ABB. 36: VERLAUF DES HYDRODYNAMISCHEN RADIUS DES LYSOZYMS ................................................................ 48

ABB. 37: VERLUAF DER SIGNALSTÄRKE DER AGGREGATE DES LYSOZYMS ........................................................... 49

ABB. 38: AUFNAHMEN DES LYSOZYMS IM FLUSS FÜR 20 S .................................................................................... 50

ABB. 39: ZEITLICHER VERLAUF DER SIGNALINTENSITÄT VOR DER BESTRAHLUNGSKÜVETTE. .............................. 51

ABB. 40: SIGNALINTENSITÄT NACH DER BESTRAHLUNG DES PRION-PROTEINS ..................................................... 51

ABB. 41: EXPONENTIELLER VERLAUF DER SIGNALINTENSITÄT HINTER DER BESTRAHLUNGSKÜVETTE ................ 52

ABB. 42A: BESTRAHLUNGSMESSUNGEN DES PRION-PROTEINS NACH 5 MIN. (LINKS) UND 10 MIN. (RECHTS) ........ 53

ABB. 42B: BESTRAHLUNGSMESSUNGEN DES PRION-PROTEINS NACH 15 MIN. (LINKS) UND 30 MIN. (RECHTS) ...... 53

7

ABB. 43A: GRÖßENVERTEILUNG DES PRION-PROTEINS VOR DER BESTRAHLUNG (LINKS) UND IM ERSTEN (5 MIN.)

(RECHTS) BESTRAHLUNGSINTERVALL ........................................................................................................... 54

ABB. 43B: GRÖßENVERTEILUNG DES PRION-PROTEINS NACH DER ZWEITEN (15 MIN.) (LINKS) UND DER DRITTEN

BESTRAHLUNGSPAUSE (30 MIN.) (RECHTS). .................................................................................................. 54

ABB. 43C: DAS LETZTE BESTRAHLUNGSINTERVALL NACH 60 MIN ........................................................................ 55

ABB. 44A: GEL MIT DEN PROBEN 1 BIS 5 ................................................................................................................ 56

ABB. 44B: GEL MIT DEN PROBEN 6-12 ................................................................................................................... 56

ABB. 45: SÄTTIGUNGSWERTE IN ABHÄNGIGKEIT DER BESTRAHLUNGSZEIT .......................................................... 57

ABB. 46: AUFTRAGUNG DER SÄTTIGUNGSWERTE DES PRION-PROTEINS GEGEN DIE BESTRAHLUNGSZEIT. ............ 58

ABB. 47: CD-SPEKTRUM DES BESTRAHLTEN PRION-PROTEINS .............................................................................. 59

ABB. 48: SCHEMATISCHE DARSTELLUNG EINES KAPILLARSYSTEMS ..................................................................... 61

8

Tabellenverzeichnis

TAB. 1: ERMITTELTE WERTE FÜR DIE SEKUNDÄRSTRUKTUR DES ZELLULÄREN UND DES PATHOGENEN PRION-

PROTEINS. ..................................................................................................................................................... 18

TAB. 2: PROTEINE MIT DEN ENTSPRECHENDEN ERMITTELTEN KONZENTRATIONEN. .............................................. 30

TAB. 3: DIE MIT PUBMED UND PROTPARAM ERMITTELTEN PROTEINKONZENTRATIONEN. ...................................... 30

TAB. 4: PUFFER, IHRE EINZELSUBSTANZEN UND DIE ENTSPRECHENDEN MOLARITÄTEN. ....................................... 31

TAB. 5: PROBEN NACH FPLC UND SÄULENCHROMATOGRAPHIE. .......................................................................... 32

TAB. 6: PROBEN NACH SÄULENCHROMATOGRAPHIE. ............................................................................................ 33

TAB 7: DARSTELLUNG DER EINZELSUBSTANZEN DES ELEKTRODENBUFFERS (PH = 8.3) UND DER COOMASSIE. .... 33

TAB. 8: PRION-PROTEINE UND IHRE ERMITTELTEN KONZENTRATIONEN. ............................................................... 34

TAB. 9: PRION-PROTEINE MIT DER ENTSPRECHENDEN ZENTRIFUGENZEIT UND KONZENTRATION. ........................ 35 TAB. 10: STATISCH GEMESSENER HYDRODYNAMISCHER RADIUS DER PROTEINE UND DIE ENTSPRECHENDE

SIGNALSTÄRKE (COUNTRATE) BEI 20 S. ........................................................................................................ 35 TAB. 11: GEMESSENER HYDRODYNAMISCHER RADIUS DER PROTEINE IN FLUSS MIT DER ZUGEORDNETEN

SIGNALSTÄRKE BEI 10 S. ............................................................................................................................... 36

TAB. 12: AUFLISTUNG DER BESTRAHLTEN PROBEN MIT IHREN ZEITLICHEN ENTNAHMEN. .................................... 41

TAB.13: PARAMETER DER FITFUNKTION FÜR THAUMATIN. ................................................................................... 46

TAB. 14: PARAMETER DER FITFUNKTION FÜR LYSOZYM ........................................................................................ 48

9

1 Einleitung

Diese Arbeit beschäftigt sich mit der Etablierung eines Systems zur Messung der dynami-

schen Lichtstreuung von Proteinen statisch und im Fluss, um die zeitlichen Änderungen der

Größenverteilung von Prion-Proteinen während der Bestrahlung mit UV-Licht zu ermitteln.

Die dynamische Lichtstreuung ist ein wichtiges und nicht-invasives Verfahren, um die Grö-

ßenverteilung von Partikeln, wie z.B. Proteinen, aufgrund der Brownschen Molekularbewe-

gung in Lösungen zu untersuchen. Das auftreffende Laserlicht wird an den Partikeln gestreut

und verursacht zeitliche Fluktuationen der Streuintensität, die von einem Detektor gemessen

werden. Dadurch lässt sich der hydrodynamische Radius der Partikel bestimmen. [6] Die kur-

ze Messzeiten und das geringe Probenvolumen stellen die DLS-Technik als eine effektive

Methode dar. Die Grundlagen der Methode werden im Unterkapitel 3.3 näher beschrieben.

Der Begriff "Prion" wurde aus der Kombination der Wörter proteinaceous und infectious ab-

geleitet. [20] Ein neuartiger Mechanismus, der für fatale neurodegenerative Erkrankungen

verantwortlich ist, wurde nach der Entdeckung der Prionen, ihnen zugewiesen. [21] Prionen

sind Proteine, die sowohl in einer normalen (zelluläres Prion: PrPC) als auch in einer pathoge-

nen Konformation (scrapie Prion: PrPSc

) vorliegen können. Das zelluläre Prion-Protein ist auf

der Oberfläche aller menschlichen und tierischen Zellen zu finden, seine physiologische Rolle

ist jedoch weitgehend unbekannt. Das pathogene Prion-Protein dagegen liegt im Nervensys-

tem und vorwiegend in den Gehirnzellen vor. Das zelluläre Prion-Protein kann durch Destabi-

lisierung seiner Struktur in die thermodynamisch stabilere pathogene Form umgefaltet wer-

den. Diese Konversion ist für die entstehenden Prion-Krankheiten verantwortlich. Bekannt

auch als übertragbare schwammartige Hirnerkrankungen (engl. transmissible spongiform

encephalopathies: TSE), repräsentieren die Prion-Krankheiten eine Gruppe von neurodegene-

rativen Erkrankungen, die mit dem Verlust der Nervenzellen und ihrer Funktionen einherge-

hen. Es gibt viele bekannte Formen von TSE, die sowohl Tiere (z.B. Scrapie für Schafe) als

auch Menschen (z.B. Creutzfeld-Jacob Krankheit) betreffen. [4]

In dieser Arbeit wurden die Messungen zunächst mit Standardproteinen (BSA, Thaumatin,

Lysozym, Ferritin) durchgeführt, um den DLS-Aufbau zu optimieren. Danach wurden die

verbesserten DLS-Einstellungen auf die Untersuchung des UV-induzierten Aggreagation des

Prion-Proteins angewandt, um den zeitlichen Verlauf der Radiusverteilung zu bestimmen. Die

10

Strukturanalyse der Prion-Proteine erfolgte nach Bestrahlung der Probe mit UVB-Strahlung

unter Anwendung der CD-Spektroskopie (Circulardichroismus), die in der Arbeit von Svenja

Patjens [18] diskutiert wird, und der Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese

(SDS-PAGE).

11

2 Biochemische Proben

In dieser Arbeit wurden fünf Proteine mittels dynamischer Lichtstreuung untersucht, Bovines

Serum Albumin (BSA), Thaumatin, Lysozym, Ferritin und das humane Prion-Protein. Die

ersten vier Eichproteine dienten zur Verbesserung der Versuchsanordnung und des Messver-

fahrens. Diese Proteine werden ausführlicher in der Arbeit von Svenja Patjens [18] diskutiert.

Im Anschluss wird detailliert auf die Struktur und Funktion von Prion-Proteinen, sowie die

Pathogenese der Prion-Krankheiten eingegangen.

2.1 Proteine

Proteine sind Makromoleküle, die in der Regel aus 20 unterschiedlichen proteinogene Amino-

säuren bestehen. Eine sehr geringe Anzahl der Proteine enthalten zudem eine zusätzliche

Aminosäuren, z.B. Selenocystein. Die verschiedenen Funktionen der Proteine sind von großer

Bedeutung, da sie an vielen wichtigen biochemischen Reaktionen und an der Bildung von

Strukturelementen für die Zellen beteiligt sind. Viele Proteine fungieren als Enzyme und sind

somit in der Lage hochspezifische chemische Reaktionen zu katalysieren. [1] Zusätzlich tra-

gen Proteine zum Transport unlöslicher Stoffe wie z.B. Steroide bei [2] und haben einen akti-

ven Anteil an der Form der Zelle und ihrer inneren Stabilität. Eine wesentliche physiologische

Rolle stellen auch Proteinkomplexe dar, die durch Wechselwirkung einzelner Proteine zu-

stande kommen. An hochmolekularen Proteinkomplexen laufen wichtige Stoffwechselvor-

gänge ab, z.B. die Elektronenübertragung in der Atmungskette. [1]

In der Abbildung 1 ist die Grundstruktur einer Aminosäure zu sehen, die als Zwitterion, d.h.

insgesamt elektrisch neutral vorliegt. Dabei ist der Wasserstoff der Carboxylgruppe zur Ami-

nogruppe verschoben, wobei nun die erstere deprotoniert und die letztere protoniert vorliegt.

Die vierte Position am α-C-Atom (-R) ist die Stelle, an der sich alle Aminosäuren durch un-

terschiedliche Seitengruppen unterscheiden. Die drei anderen Bindungsstellen des α-C-Atoms

sind jedoch immer gleich belegt, mit einem Wasserstoff (-H), einer Aminogruppe (-NH2) und

einer Carboxylgruppe (-COOH): [1]

12

H3N+

-COO

R

α

R1 R2

Abb. 1: Darstellung der Struktur einer Aminosäure (links). Die Aminosäure liegt bei neutra-

lem pH in einer ionisierten Form vor. Rechts ist eine Peptidbindung abgebildet.

Die Aminosäuren innerhalb eines Proteins sind durch Peptidbindungen (siehe Abb. 1) mitei-

nander verknüpft. Dabei bindet die Aminogruppe einer Aminosäure an eine Carboxylgruppe

einer benachbarten Aminosäure, wobei Wasser abgespalten wird. [3]

Die Proteinstruktur ist dreidimensional und enthält vier hierarchisch aufgeteilte Ebenen: Pri-

mär-, Sekundär-, Tertiär-, und Quartärstruktur. [3]

Die Primärstruktur stellt die erste Konformationsebene dar und beschreibt die

Aminosäuresequenz in einer Polypeptidkette. [3]

Die Sekundärstruktur kommt durch die polaren Wechselwirkungen von Carbonyl- und Ami-

nogruppen zustande, die nach den Bindungen zwischen den Aminosäuren innerhalb einer

Kette frei liegen. Dadurch entstehen definierte lokale Strukturen im Protein, wie z.B. die α-

Helix und die β-Faltblatt-Struktur. Die α-Helix, ist eine durch Wasserstoffbrückenbindungen

stabilisierte helikale Struktur. Jede Umdrehung entspricht 3.6 Aminosäuren und einer Länge

von 0.54 nm. Beim β-Faltblatt entstehen Wasserstoffbrückenbindungen zwischen der

Carbonyl (CO-)- und Aminogruppen (NH-) innerhalb zweier parallel angeordneter

Polypeptidketten. Verlaufen die Stränge in derselben oder entgegengesetzten Richtung, so

bildet sich ein paralleles oder ein antiparalleles β-Faltblatt. [2]

13

Im Gegensatz zur Sekundärstruktur gehen in der Tertiärstruktur die Seitenketten der Amino-

säuren miteinander nicht-kovalente Wechselwirkungen ein, wodurch sich im Protein lokale

Domänen ausgebildet werden. Es bilden sich aber auch kovalente Bindungen zwischen

Thiolgruppen (SH-) von Cysteinresten aus, die Disulfidbrücken bezeichnet werden. [2]

Die Quartärstruktur ist die Anordnung von mehreren, nicht kovalent-verbundenen

Polypeptidketten im Raum. [3]

2.2 Verwendete Proteine

2.2.1 Bovines Serum Albumin

In Abbildung 2 ist eine dreidimensionale Struktur von BSA zu sehen. Das untersuchte BSA

stammt aus dem Rind (bos taurus) und hat ein Molekulargewicht von 66, 411 kDa. BSA dient

als ein Träger um amphiphile Substanzen in der Blutbahn zu transportieren und kann auf-

grund seiner Struktur Dimere bilden. [12]

Abb. 2: Struktur von BSA. [7]

2.2.2 Thaumatin

In Abbildung 3 ist eine dreidimensionale Struktur von Thaumatin zu sehen, das aus einer tro-

pischen Pflanze Namens Thaumatococcus daniellii stammt. Durch Anwendung von bioche-

mischen Trennmethoden wie der Gelfiltration und der Ionenaustauschchromatographie, ist es

möglich zwei Proteine von der Pflanze zu isolieren, nämlich Thaumatin I (Molekulargewicht:

21,600 kDa) und II (Molekulargewicht: 21 kDa). Beide Proteine sind in ihrem Strukturaufbau

14

und Molekulargewicht sehr ähnlich. Ihr intensiver süßer Geschmack kann durch Erwärmung

oder Erniedrigung des pH-Wertes unter 2.5 an Stärke verlieren. [9]

Abb. 3: Struktur von Thaumatin. [8]

2.2.3 Lysozym

Das verwendete Lysozym (Molekulargewicht: 14,3 kDa) stammt aus Hühnereiweiß (Chicken

Egg White). Lysozym besteht aus einer mit 129 Aminosäuren aufgebauten Peptidkette, die

durch vier Disulfidbrücken vernetzt ist. [19] Eine seiner Hauptaufgaben ist es die bakterielle

Zellwand zu zerstören. Die dreidimensionale Struktur des Lysozyms ist in Abbildung 4 zu

sehen.

Abb. 4: Struktur von Lysozym. [10]

15

2.2.4 Ferritin

Die dreidimensionale Struktur von Ferritin (Molekulargewicht: 450 kDa), das aus der Milz

eines Pferdes (equus caballus) stammt, ist in Abbildung 5 zu sehen. Reduktionsmittel, wie

z.B. Ascorbat oder Thiol, bewirken, dass das Ferritin Eisen abgibt, was die Katalyse der

Lipidoxidation zur Folge hat. Das Eisen verleiht dem Rindfleisch seinen Geschmack. [16]

Abb. 5: Struktur von Ferritin. [11]

2.3 Struktur des Prion-Proteins

Das zelluläre Prion Protein (PrPC) (siehe Abb. 6), ist mit Hilfe eines Glykosyl-Phosphatidyl-

Inositol-Ankers (GPI) (siehe Abb. 8), der mit der Aminosäure S230 verbunden ist, an der äu-

ßeren Zellmembran lokalisiert. [4] Die nicht-kovalente Verankerung in der Zellmembran er-

folgt am C-terminalen Ende und gestattet dem Protein dynamische Flexibilität gegenüber der

Zellmembran, besonders an seinen Bindungsstellen. Das bedeutet, dass das Prion-Protein in

der Lage ist auf der Zellmembran frei in der 2D-Richtung zu bewegen.

In Abbildung 7 wird der Aufbau der Struktur von PrPC schematisch dargestellt. Dabei sind

sowohl alle Struktureinheiten als auch die entsprechenden Bindungsstellen zu erkennen. [13]

16

Abb. 6: NMR-Struktur des zellulären Prion-Proteins. Die drei α-Helices (α1, α2, α3) sind hier

rot, türkis und gelb und die zwei β-Stränge (β1, β2) sind grün und blau dargestellt.

[17]

Abb. 7: Schematische Darstellung der Struktur des zellulären Prion-Proteins mit den abgebil-

deten N- und C-terminalen Bereichen und den dazu gehörenden strukturelle Domä-

nen. [14]

Das PrPC hat im C-terminalen Bereich zwei Glykosylierungsstellen N181 und N197 über die

Zuckerstrukturen binden und sich frei orientieren können (siehe Abb. 8). Die Sekundärstruk-

tur des PrPC besteht aus drei α-Helices, nämlich α1, α2 und α3, und zwei β-Strängen, β1 und

β2. Alle diese Struktureinheiten befinden sich im C-terminalen Bereich, der letztendlich die

Sekundärstruktur des PrPC ausmacht. [4] Der N-terminale Bereich ist dagegen weitgehend

unstrukturiert und enthält am Anfang eine kurze Signalsequenz. Diese ist eine

Aminosäureabfolge, die aus 22 hydrophoben Aminosäuren besteht [3] und das Protein in das

17

richtige Kompartiment der Zelle leitet, hier das Endoplasmatische Retikulum (ER) und den

Golgi-Apparat, wo die Glykosylierung erfolgt. Danach wird sie abgespalten und ist im reifen

PrP auf der Zelloberfläche nicht mehr vorhanden. Am wichtigsten jedoch für die Funktionen

des PrPC sind die Hauptkoordinationsstellen von Cu

2+, die sich in fünf Oktarepeats befinden.

Das Prion-Protein hat vier Oktarepeats von denen jeder ein Cu2+

binden kann und eine fünfte

Koordinationsstelle, die nahe dem C-terminalen gefalteten Bereich lokalisiert ist. Die Bedeu-

tung von Cu2+

und seinen Einfluss auf die physiologische Rolle von PrPC wird im nächsten

Abschnitt (2.4 Funktion von zellulärem Prion-Protein) detaillierter diskutiert. [5]

Abb. 8: Links ist die Struktur des zellulären Prion-Proteins mit zwei Glykosylierungssstellen

im C-terminalen Bereich (N181 und N197), über die zwei Zuckerstrukturen ver-

knüpft sind und einem im C-terminalen Bereich an der Stelle S230 verbundenen

GPI-Anker, dargestellt. Beide Zuckerstrukturen sind hochflexibel. In der Abbildung

orientieren sie sich weg vom GPI-Anker, sodass ein maximaler Abstand zwischen ih-

nen und der Zellmembranoberfläche entsteht. Rechts ist der GPI-Anker mit den ge-

färbten Zuckerresten vergrößert abgebildet. [13]

18

Die GPI-verankerten Proteine sind in Mikrodomänen (Rafts) organisiert, die einen hohen An-

teil an Sphingolipide und Cholesterol besitzen. Dadurch haben die Prion-Proteine die Mög-

lichkeit nicht nur auf andere Zellen übertragen zu werden sondern auch durch die Bildung von

Vesikeln, die aus Lipid-Molekülen bestehen, an anderen Zellmembranen zu haften. Auf dieser

Weise können sich sowohl PrPC als auch PrP

Sc problemlos innerhalb des Nervensystems und

zwischen Zellen fortbewegen. Besonders der freie Zugang von unlöslichem PrPSc

in allen

Zellen stellt eine potentielle Gefahr zur Pathogenese von Prion Krankheiten dar. [13]

Die Struktur von PrPSc

ist bis heute unbekannt, aber es kann mit Sicherheit gesagt werden

dass sein C-terminaler Bereich einen geringeren Anteil an α-Helix-Strukturen aufweist und

von einer β-Faltblatt Struktur dominiert wird. Tabelle 1 zeigt den deutlichen Unterschied der

Sekundärstruktur zwischen PrPC und PrP

Sc. [4]

Tab. 1: Mittels Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie (FTIR) und CD-Spektroskopie

ermittelte Werte für die Sekundärstruktur des zellulären und des pathogenen Prion-

Proteins. [4]

Es existieren verschiedene Strukturmodelle von PrPSc

, von denen zwei in Abbildung 9 zu se-

hen sind: eine parallele β-helikale oder β-Sandwich Struktur. [4] Diese Strukturen können z.B.

durch Dimerisierung des PrPC erreicht werden. Das bedeutet, dass durch die Bildung eines

Heterodimers zwischen PrPC und PrP

Sc, die PrP

Sc-Struktur autokatalytisch wirkt und auf diese

Weise die Umfaltung des PrPC fördert. Genau gesagt, falten die zwei Unterbereiche innerhalb

des PrPC um und ändern somit ihre Sekundärstruktur. Der erste Unterbereich umfasst β1, α1

und β2 und der zweite Unterbereich α2 und α3, wobei die letzteren zwei Untereinheiten, wie

es in Abbildung 7 dargestellt ist, durch Disulfidbrücken miteinander verknüpft sind. Diese

Prion Protein α-Helix [%] β-Faltblatt [%]

PrPC 42 3

PrPSc

30 43

19

stabilisierende Disulfidbrücke muss geöffnet werden damit die Umfaltung funktionieren kann.

[4]

Abb. 9: Links ist die β-helikale und rechts die β-sandwich Struktur der hypotethischen PrPSc

Struktur dargestellt. [4]

2.4 Funktion von zellulärem Prion Protein

Der N-terminale Bereich des Prion-Proteins zeichnet sich durch eine starke Cu2+

-

Bindungsaffinität, die gleich an zwei Stellen vorhanden ist, aus: in dem Oktarepeat-Bereich

zwischen N60 und N91 und an der Bindungsstelle N111, wie es in Abbildung 6 zu erkennen

ist. Daher wird angenommen, dass das Prion-Protein eine primäre Rolle im antioxidativen

Schutz der Zellen übernimmt und eher unwahrscheinlich ist seine Beteiligung bei der Koordi-

nation des Transports von zweiwertigen Kupferionen. Darüber hinaus, gibt es Hinweise, dass

außer den Zellen selbst, auch die Prion-Proteine am Widerstand gegen oxidativen Stress be-

teiligt sind. Die genaue Funktion des Prion-Proteins ist aber weiterhin nicht verstanden. [5]

2.5 Prion-Krankheiten

Die Pathogenese von Krankheiten, die mit dem Prion-Protein assoziiert sind, ist auf die

Konformationsänderungen im C-terminalen Bereich zurückzuführen. [4] Die Ursache der

Veränderung der Sekundärstruktur des Prion-Proteins konnte bisher noch nicht vollständig

geklärt werden. Angenommen werden spontane Mutation, genetische Prädisposition oder so-

gar Infektion. Die meisten Wissenschaftler gehen vom sogenannten "protein-only-Model"

20

aus, das zwei Annahmen macht: zum einen ist PrPSc

eine konformationelle Isoform von PrPC,

d.h. sie unterscheiden sich nur in der Faltung, nicht aber in der Sequenz (siehe Abb. 10). Zum

anderen wird dieses fehlgefaltete Prion-Protein als Auslöser der Prion-Krankheiten angese-

hen, das durch die Bindung an PrPC vervielfältigen kann Diese Aussagen werden von Expe-

rimenten an Hefen und Pilzen bekräftigt, wobei nur das fehlgefaltete Prion-Protein als patho-

gen gilt. Prion-Proteine gelten bis heute als einzige bekannte Beispiele für ein "infektiöses"

Protein, welches ohne Hilfe anderer Moleküle einen Organismus infizieren kann. [15]

Außerdem hängt der oxidativer Stress auch mit der Pathogenese von Prion-Krankheiten zu-

sammen. Das wurde an Scrapie-infizierten Mäusen (mus musculus) belegt, die einen hohen

Anteil an reaktiven Sauerstoffspezies (engl. reactive oxygen species: ROS) aufwiesen. Das

bekräftigt die Vermutung, dass die angenommene Funktion des Prion-Proteins gehindert ist,

Zellen vor oxidativem Stress zu schützen. [5]

In Abbildung 11 sind schematisch die Schritte vom PrPC hin zu den pathologischen Sympto-

men zu sehen, wobei der Anteil an α-Helices geringer geworden ist und die β-Stränge sich

verlängert haben. Das pathogene Prion Protein aggregiert zu β-Faltblatt-reichen Oligomeren,

welche dann TSE auslösen.

Abb. 10: Links ist das zelluläre Prion-Protein mit seinen drei roten α-Helices und zwei gelben

antiparallelen β-Strängen zu sehen. Rechts ist eine Isoform des zellulären Prion-

Proteins mit einem deutlich verringerten α-Helix-Anteil und einem erhöhten Anteil

an β-Faltblatt Strukturen zu erkennen. [4]

21

Abb. 11: Schematischer Verlauf der Umfaltung des Prion-Proteins bis zur Pathogenese der

Prion-Krankheiten. [14]

22

3 Theoretischer Hintergrund

In diesem Kapitel werden zuerst die grundlegenden Wechselwirkungen von Licht und Mate-

rie erläutert und danach wird spezifisch auf die Wirkung von UV-B-Licht auf das Prion-

Protein und die daraus resultierende direkte und indirekte strukturelle Schädigung eingegan-

gen. Außerdem wird die DLS-Methode beschrieben, wobei eine detailliertere Darstellung der

Grundlagen der dynamischen Lichtstreuung in der Bachelorarbeit von Svenja Patjens [18] zu

entnehmen ist. Zum Schluss werden zwei zur Untersuchung der Struktur und Aggregation der

Prion-Proteine angewandte biochemische Methoden (Gel-Elektrophorese und CD-

Spektroskopie) beschrieben.

3.1 Wechselwirkungen von Licht und Materie

Die Wechselwirkungen von UV-Licht mit Materie schließt verschiedene Phänomene, wie

Absorption, Transmission und Reflexion, ein. Bei der Absorption wird die auftreffende Strah-

lung und somit deren Energie von der Proteinlösung ganz aufgenommen, was sich auf die

Brownsche Molekularbewegung der in der Lösung befindlichen Partikel auswirkt. Durch die

in der Proteinlösung steigende Wärme bewegen sich die Partikel immer schneller und die de-

tektierte Lichtintensität fluktuiert stark. Beim Durchgang durch die Probe (Transmission)

kann die Strahlung teilweise oder ganz von ihr absorbiert werden. Die ausgehende Strahlung

ist mit einer schwächeren Intensität verbunden. Die Reflexion spiegelt sich in der

inelastischen Streuung der Strahlung innerhalb der Proteinlösung wider, die unter einem be-

stimmten Winkel austritt und von einem Detektor aufgefangen werden kann.

3.2 Strukturelle Schädigungen

UV-Licht und insbesondere die biologisch relevanten Strahlungen UV-A (320 - 380 nm) und

die UV-B (280 – 320 nm) sind in der Lage, die Struktur von Proteinen zu schädigen. Beide

Strahlungen können die Ozonschichte durchdringen und die Erdoberfläche erreichen. Sie sind

Auslöser verschiedener Erkrankungen, z.B. Hautkrebs. [5]

23

Die Auswirkungen des UV-B-Lichts auf die Struktur und Funktion des Prion-Proteins sind

nicht vollständig bekannt. Allgemein werden als Folge der UV-induzierten Proteinoxidation

Aggregate gebildet. Zusätzlich wurde eine direkte Verbindung zwischen oxidativem Stress

und dem Umfaltungsprozess des zellulären Prion-Proteins in seine pathogenene Isoform

nachgewiesen. Abhängig von zwei Parametern (Prionsequenz, pH-Wert der Pufferlösungen)

folgt das Prion-Protein zwei unterschiedlichen Wegen der Strukturänderung. [5]

Prion-Proteine sind anfällig für Oxidation, was als Folge die Schädigung ihre Struktur hat.

Am empfindlichsten sind die Methionin- (Met) und Histidinreste (His). Die Oxidation ist mit

einer zusätzlich erhöhten Hydrophilie der Seitenketten verbunden. Die Proteinoxidation, die

ein Protein durch Oxidationsmitteln des oxidativen Stresses, z.B. ROS auf molekulare Ebene

verändert, kann direkt oder indirekt vonstattengehen. [5]

3.2.1 Direkte Proteinoxidation

Die direkte Proteinoxidation, die sich nach dem Mechanismus der Photoionisation abläuft,

kann nur bei pH = 7.4 beobachtet werden. Die Anwesenheit von Ascorbinsäure kann zum

größten Teil das einfallende UV-B-Licht (302 nm) absorbieren und somit wird die Strukturin-

tegrität des Prion-Proteins nicht stark beeinträchtigt. Trotzdem werden geringe Mengen an β-

Faltblatt-reichen Oligomeren gebildet. Eine wichtige Bedingung für den Ablauf der direkten

Proteinoxidation ist das Vorhandensein aromatischer Strukturen, die bei der entsprechenden

Wellenlänge chromophore Eigenschaften besitzen, was bedeutet, dass sie UV-Licht absorbie-

ren können. Diese Bedingung können bei der Wellenlänge von 302 nm nur Tryptophan (Trp),

Tyrosin (Tyr) und Histidin erfüllen. Die Anzahl der Aminosäuren, die chromophore Eigen-

schaften vorweisen und anfällig zur Oxidation (Trp, Tyr, Phe, His, Met, Cys) sind, korrerliert

direkt mit der Strukturumfaltung des Prion-Proteins und ist an intramolekularen Reaktionen

beteiligt. Dabei steht die α-Helix H1, die dem Bereich 143 - 153 der Prionsequenz (siehe Abb.

12) umfasst im Vordegrund. In der Prionsequenz zwischen den Resten 121 und 230 ist deut-

lich zu erkennen, dass ungefähr die Hälfte der Met- und His-Reste und zwei Drittel der

chromophore Aminosäuren nahe der Helix H1 liegen. Das bedeutet, dass die wesentlichen

Stukturänderungen des Prion-Proteins während der direkten Proteinoxidation im Sequenzbe-

reich 121 – 230 stattfinden. Da keine Trp-Reste vorhanden sind, verläuft die Bildung von

Oligomeren langsam. [5]

24

3.2.2 Indirekte Proteinoxidation

Die indirekte Proteinoxidation tritt bei einem pH von 5 zusätzlich auf und die Strukturschädi-

gung ist auf ROS zurückzuführen. Als starke Oxidationsmittel können sie mit Trp-, His-,

Tyr-, Met- und Cys-Resten in chemische Reaktionen verwickelt werden und auf diese Weise

die Struktur vom Prion-Protein beschädigen und sogar den Umfaltungsprozess beschleunigen.

Einzig die His-Reste werden bei diesem pH-Wert von der Photooxidation verschont, da sie

protoniert vorliegen. Das führt zur verstärkten dynamischen Beweglichkeit der α-helikalen

Struktur des Prion-Proteins, wobei der Umfang der Stabilisierung oder auch Destabilisierung

seiner gesamten Sekundärstruktur noch nicht aufgeklärt worden ist. Mit Sicherheit kann aber

gesagt werden, dass die schnelle Denaturierung des Sequenzbereiches 121 – 230 (siehe

Abb. 12) des Prion-Proteins aufgrund der Photooxidation und der dadurch verbundenen ge-

ringen Stabilität seiner Konformation erfolgt. [5]

Abb. 12: Aminosäuresequenz des Prion-Proteins. Für die Proteinoxidation ist der Bereich

zwischen 121 – 230 sehr interessant, da hier nicht nur der größte Teil de UV-Lichts

absorbiert wird, sondern auch Reaktionen stattfinden, die auf die Prion-Protein

Struktur erheblichen Einfluss haben. In rot sind Aminosäuren mit chromophoren

Eigenschaften und in blau Histidin und Methionin dargestellt. Tryptophan-Reste

sind mit einem Stern markiert. Über dieser Aminosäuresequenz ist die Sekundär-

struktur des Prion-Proteins mit den α-Helices H1, H2, H3 und den β-Strängen S1

und S2 abgebildet. [5]

25

3.3 Theorie der dynamischen Lichtstreuung

3.3.1 Interferenz des gestreuten Lichtes und Messsignal

Ein DLS-Laser bestrahlt eine Probe und der Strahl wird an den in der Probe befindlichen Par-

tikeln gestreut. Dieser wird von einem Detektor aufgefasst und somit kann die Streuintensität

bei einem bestimmten Winkel (hier θ = 90°) gemessen werden. Zu Interferenz kommt es nur

wenn die Größe der Partikel die Wellenlänge des einfallenden Strahls übertrifft. Da diese Par-

tikel mehrere Streuzentren besitzen kommt es sowohl zu destruktiver als auch zu konstrukti-

ver Interferenz. Dadurch entsteht ein winkelabhängiges Fleckenmuster. [22]

Die Partikel sitzen jedoch nicht an einem bestimmten Ort fest, sondern ändern aufgrund der

Brownschen Molekularbewegung ständig ihre Position. Das führt zur zeitlichen Fluktuation

des Fleckenmusters und zur zeitlichen Veränderung des erhaltenen Messsignals (siehe

Abb. 13). [22]

Abb. 13: Auftragung der Signalintensität I gegen den Messzeitraum T. Je intensiver die Be-

wegung der Partikel ist, desto schneller fluktuiert die Signalintensität und mehr

Peaks in eine Zeitspanne τ vorhanden sind. [22]

26

3.3.2 Die Autokorrelationsfunktion und Größenverteilung der Partikel

Die Funktion der Autokorrelationsfunktion ist es Informationen aus dem zeitlichen Verlauf

der gemessenen Signalintensität zu entnehmen. Dies wird in der Abbildung 14 anhand großer

und kleiner Teilchen veranschaulicht. [22]

Abb. 14: Autokorrelationsfunktion g(2)

(τ) bezogen auf die Größe der Teilchen und gegen die

Zeitspanne τ aufgetragen. Die Kurve fällt vom quadratischen Mittelwert der Intensi-

tät bei kleinen Zeitspannen exponentiell ab. Aufgrund der Brownschen Mo-

lekularbewegung weist das Streusignal kleiner Teilchen eine schnelle Fluktuation

auf. Das spiegelt sich in der Autokorrelationsfunktion kleiner Teilchen wider, da sie

schneller abklingt. [22]

Vorausgesetzt, dass die Autokorrelationsfunktion normiert ist und Mehrfachstreuung nicht

stattfindet, kann durch die Stokes-Einstein-Gleichung (Gl. 1) der hydrodynamische Radius

(RH) der Teilchen ermittelt werden:

RH =

(1)

In der Gleichung 1 ist: k: Boltzmann-Konstante

T: Temperatur

η: Viskosität

D0: Diffusionskoeffizient

27

3.4 Biochemische Verfahren

3.4.1 SDS-PAGE

Die Gelelektrophorese ist eine Methode um Nukleinsäuren oder Proteine anhand ihrer Größe

und Ladung zu trennen. Ein angelegtes elektrisches Feld sorgt für die Bewegung der Molekü-

le z.B. eines Proteins auf einer gelartigen Matrix, die aus Agarose und Polyacrylamid besteht

und sich in einem zwischen zwei Plastikrahmen gegossenen Gels befindet (siehe Abb. 15).

Eine Apparatur der Gelelektrophorese ermöglicht die Auftragung bis zu 20 Proben. Der hohe

pH-Wert sorgt dafür, dass die Peptidbindungen innerhalb des Proteins nicht hydrolysiert wer-

den und ist für ihre negative Ladung verantwortlich. Deswegen wandern die Moleküle zur

Anode, wobei je geringer die Größe der Moleküle ist, desto schneller ist ihre Geschwindigkeit

und länger die zurückgelegte Strecke. [19] Durch Färbung des Gels mit z.B. Coomassie sind

nicht nur die Banden (Größe) der einzelnen Moleküle sichtbar, sondern auch ihre Laufstre-

cken.

Abb. 15: Apparatur der Gelelektrophorese. Die Matrix ist durch die Klemmen befestigt. Die

Proben wandern auf sie durch die angelegte Spannung von der Kathode zur Anode.

28

Die SDS-PAGE (Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese) erlaubt, dass Prote-

ine nur nach ihrer molekularen Masse und unabhängig vom Ladungszustand aufgetrennt wer-

den. Das geschieht indem die negativ geladenen SDS-Moleküle (siehe Abb. 16), die

detergierend wirken, an alle Proteine binden und ihnen so viel negative Ladung verleihen,

sodass die Wanderungsgeschwindigkeit im elektrischen Feld und anschließend die Auftren-

nung der Proteine nur von der Molekülgröße abhängen. [3]

+H3C

- Na

Abb. 16: Natriumdodecylsulfat (engl: Sodium dodecyl sulfate: SDS).

3.4.2 CD-Spektroskopie

CD-Spektroskopie (siehe Abb. 17) ist eine wichtige und empfindliche Methode um die

Konformation bzw. Strukturänderung der Proteine oder Peptide zu untersuchen. Insbesondere

aber, können die Strukturumfaltung der Proteine und mögliche vorgenommenen Änderungen

der Aminosäurereste in der Proteinsequenz leicht nachgewiesen und charakterisiert werden.

[23]

Abb. 17: Foto des Gerätes (Jasco) für die Anwendung der CD-Spektroskopie.

29

4 Experimentelle Prozedur und bioche-

mische Analyse

In diesem Kapitel wird die Synthese der Proteine und der Prion-Proteine sowie der Versuchs-

aufbau ohne Pumpe, im Fluss und mit Bestrahlung beschrieben. Die Synthese der Proteine

sowie deren biochemische Analyse fanden im Institut für Biochemie und Molekularbiologie

unter Anleitung der Nachwuchsgruppe SIAS (Gruppenleiter: Dr. Lars Redecke) statt. Die

DLS- und Bestrahlungsmessungen wurden im Institut für Angewandte Physik durchgeführt.

4.1 Synthese der Proteine

4.1.1 Synthese der Proteinlösungen

Bevor die Proteine synthetisiert werden konnten, musste der Puffer, der für BSA, Thaumatin,

Lysozym und Thaumatin, Natriudihydrogenphosphat (NaH2PO4) diente, hergestellt werden.

Dafür wurden 0,17 g NaH2PO4 eingewogen und in ein Becherglas gegeben. Danach wurde

destilliertes Wasser hinzugefügt und die Lösung wurde auf dem Magnetheizrührer gestellt.

Nachdem die Lösung aufgelöst wurde, wurde ihr pH gemessen, der anfangs 4,48 betrug. Auf-

grund des geringen Puffervolumens und der niedrigen Pufferkapazität, wurde mittels 0,1 M

NaOH, der pH-Wert der Lösung auf 7 erhöht. Schließlich wurde die Lösung in ein Tube über-

führt und bis 50 mL mit destilliertem Wasser aufgefüllt.

BSA, Thaumatin und Lysozym wurden auf die gleiche Weise synthetisiert. 0,0602 g BSA,

0,0498 g Thaumatin und 0,501 g Lysozym wurden eingewogen und jeweils in ein Falcon ge-

geben. Anschließend wurde jeweils 5 mL Pufferlösung überführt und nachdem die Lösungen

auf dem Vibrationsmixer (VWR International) aufgelöst wurden, wurden sie in jeweils 2 Ep-

pendorf Tubes aufgetrennt. Die Lösungen wurden für 60 min., bei 8 °C und 16.100 x g (rcf)

zentrifugiert. Zum Schluss wurde mittels eines Spektrophotometers (NanoDrop, ND-1000

Spectrophotometer) (siehe Abb. 18) die Konzentration der 6 Lösungen bestimmt. Die Kon-

zentrationen wurden vom Programm Proteins A280 entnommen und sind in der Tabelle 2

dargestellt.

30

Abb. 18: Spektrophotometer, der zur Bestimmung der Proteinkonzentration diente.

Tab. 2: Proteine mit den entsprechenden ermittelten Konzentrationen.

Nummerierung der

Eppendorf Tubes BSA (mg/ml) Thaumatin (mg/ml) Lysozym (mg/ml)

1 6,44 9,26 21,96

2 6,46 9,30 21,47

Anhand zweier Datenprogrammen (pubmed und protparam) konnte die tatsächliche Konzent-

ration (siehe Tabelle 3) bestimmt werden. Dafür muss die Referenzsequenz des Proteins im

pubmed gefunden und in protparam angegeben werden. Um nun die richtige Konzentration

zu finden, wird die vorher ermittelte Konzentration durch den Mittelwert der Absorptionsko-

effizienten geteilt.

Tab. 3: Die mit pubmed und protparam ermittelten Proteinkonzentrationen.

Nummerierung der

Eppendorf Tubes BSA (mg/ml) Thaumatin (mg/ml) Lysozym (mg/ml)

1 9,14 7,15 9,36

2 9,17 7,18 9,15

31

4.1.2 Synthese der Prion-Proteine

Genau wie bei den vorherigen Proteinen, erfolgt auch hier, zunächst die Pufferherstellung,

wobei für die Prion-Proteine gleich vier verschiedene Puffer eingesetzt wurden. Die Puffer

zusammen mit ihren Molaritäten sind in der Tabelle 4 aufgelistet.

Tab. 4: Puffer, ihre Einzelsubstanzen und die entsprechenden Molaritäten.

Puffer A (pH = 8) Puffer B (pH = 8) Puffer C (pH = 8) Elutionspuffer

(pH = 5.8)

Tris Base (10 mM) Tris Base (10 mM) Tris Base (10 mM) Tris-HCl/Base

(10 mM)

NaH2PO4 (100 mM) NaH2PO4 (100 mM) NaH2PO4 (100 mM) NaH2PO4 (100 mM)

Red Gluthatione

(10 mM) Imidazol (50 mM) Imidazol (500 mM)

GuHCl (4 M)

Puffer A und B wurden zur Reinigung an der FPLC-Anlage (Fast Protein Liquid

Chromatography) (siehe Abb. 19) angeschlossen. Der Durchlauf wurde nach dem Zumischen

aufgefangen.

Abb. 19: FPLC-Anlage dient der Reinigung von Proteinen.

32

Danach fand die Säulenchromatographie statt. Die Säule wurde zuerst mit 20 mL Puffer A

und anschließend mit 20 mL Puffer B und 25 mL Puffer C gewaschen. Schließlich wurde

zweimal mit jeweils 40 mL und 25 mL Elutionspuffer E eluiert. Zusätzlich wurden zwei Prio-

nen (PrP90) in die Säule gegeben. Alle Durchläufe wurden aufgefangen, wobei der Durchlauf

vom Elutionspuffer E Prion und Histidin-tag enthielt. Es ist wichtig zu erwähnen, dass auf-

grund des hohen Anteils an Imidazol (zehnfach höher als bei Puffer C) konnte das

Elutionspuffer E ausgewaschen werden. Anschließend wurde die Säule mit destilliertem Was-

ser gespült, regeneriert und in 20% Ethanol gelagert. Alle Proben (Durchläufe) wurden bei

96 °C für 7 min. in dem Thermomixer (Eppendorf, Thermomixer Comfort) (siehe Abb. 20)

erwärmt. In der Tabelle 5 und 6 sind alle Proben aufgelistet und als Vorbereitung für die

nächste Synthesestufe, enthalten sie zudem Probenpuffer (PP).

Abb. 20: Abbildung eines Thermomixers.

Tab. 5: Proben nach FPLC und Säulenchromatographie.

Proben P1 P2 D FPLC PM

Inhalt D(hPrP90(23.2.11)) +

5xPP

D(hPrP90(16.6.11)) +

5xPP

D(beiden

hPrP90) +

5x PP

D(FPLC)

+ 5x PP PM

33

Tab. 6: Proben nach Säulenchromatographie.

Proben B C E1 E2

Inhalt D(B) + 5x PP D(C) + 5x PP D(E1) + 5xPP D(E2) + 5x PP

Es folgt nun die SDS-Page. Zuerst wurden beide Taschen der Apparatur (siehe Abb. 21) mit

1% Elektrodenbuffer (siehe Tab. 7) aufgefüllt. Anschließend wurden jeweils 20 μl der Proben

und 7 μl des Probenmarkers in den Probenkammern des Gels aufgetragen. Die Apparatur

wurde mit einem Gerät angeschlossen, das für die nötige elektrische Spannung sorgte. Das

Gerät wurde auf 110 V, 50 W und 26 mA eingestellt.

Abb. 21: Links sind die Taschen der Apparatur und rechts die Probenauftragung auf dem Gel

zu sehen.

Tab 7: Darstellung der Einzelsubstanzen des Elektrodenbuffers (pH = 8.3) und der

Coomassie.

Elektrodenbuffer 10x Coomassie Staining Solution

30,3 g Tris Base 250 ml Isopropanol

144 g Glycin 100 ml Essigsäure

10 g SDS 1 g Coomassie blau

1000 mL H2O 1000 mL H2O

34

Das Gel mit den auslaufenden Proben wurde dann abgezogen und in einem Behälter mit

Coomassie angefärbt. Nach 60 min. auf dem Schüttler und Entfärbung des Gels mit Essigsäu-

re, waren die Laufstrecken der Proben sichtbar.

Der letzte Schritt der Synthese der Prion-Proteine stellt die Dialyse dar. Nach der Auswertung

der Gele wurde festgestellt, dass die Prion-Proteine in den Proben E1 und E2 zu finden sind.

E1 und E2 wurden in zwei Dialysetaschen überführt, die vorher in der Pufferlösung Tris

(Pufferan, pH = 8) eingetaucht wurden. Beide Proben wurden dann über Nacht im Kühlraum

auf einem Magnetheizrühr (60 rpm) gestellt. Die Lösungen aus den Dialysetaschen wurden

anschließend in zwei Falcons gegeben und ihre Konzentration wurde mittels des

Spektrophotometers bestimmt. Dieser Schritt wurde nochmal wiederholt. Allerdings wurde

dieses Mal Natriumacetat (pH = 5) als Puffer ausgewählt. Die Werte der beiden Dialysen sind

in der Tabelle 8 eingetragen.

Tab. 8: Prion-Proteine und ihre ermittelten Konzentrationen.

Prion-Proteine

Konzentration [mg/ml]

Dialyse 1 Dialyse 2

PrP90 1 0,54 0,49

PrP90 2 0,56 0,62

Um bessere Konzentrationen und möglichst wenig Aggregate in Prion-Proteine zu haben,

wurden sie eingeengt. Ein Falcon das mit destilliertem Wasser aufgefüllt war und als Gegen-

gewicht wirkte und ein weiteres das Prion-Protein enthielt, wurden bei 3700 rpm und 4 °C

zentrifugiert. Beide hatten eingebauten Filter und nach jedem Zentrifugieren wurde das

Gleichgewicht der Falcons durch Zufuhr an Prion-Proteinlösung wiederhergestellt. Am Ende

wurden fünf Prion-Proteinlösungen erhalten, deren Konzentrationen in der Tab. 9 aufgeführt

sind.

35

Tab. 9: Prion-Proteine mit der entsprechenden Zentrifugenzeit und Konzentration.

Prion-Proteine Zentrifugenzeit [min] Konzentration [mg/ml]

1 15 1,07

2 35 1,16

3 30 1,09

4 30 1,14

5 40 1,48

4.2 Dynamische Lichtstreuung Messungen

4.2.1 Überblich über die Messungen

Anhand der Tabellen 10 und 11 ist es möglich einen Überblick über die gesamten DLS-

Messungen zu erhalten, die in einem Reinraum mit konstanten Klimaverhältnissen (Tempera-

tur: 24 °C 0.5 °C und Luftfeuchtigkeit: 30% 1%) durchgeführt wurden.

Tab. 10: Statisch gemessener hydrodynamischer Radius der Proteine und die entsprechende

Signalstärke (Countrate) bei 20 s.

Protein Berechneter RH

[nm]

Statitischer RH

von Monome-

ren [nm]

Statisicher RH

von Aggregaten

[nm]

Signalstärke

[kHz]

BSA 3,05 6,09 +/- 0,31 148,97 +/- 23,41 136,1 +/- 35,6

Thaumatin 2,12 3,93 +/- 0,48 102,17 +/- 21 30 +/- 9,3

Lysozym 1,842 2,51 +/- 0,35 - 15,2 +/- 3,8

Ferritin 5,73 10,43 +/- 1,46 60,01 +/- 3,81 10890,4 +/-

619,3

36

Tab. 11: Gemessener hydrodynamischer Radius der Proteine in Fluss mit der zugeordneten

Signalstärke bei 10 s.

Protein Berechneter

RH [nm]

RH bei

1 mL/min

[nm]

Signalstärke

[kHz]

RH bei

15 mL/min

[nm]

Signalstärke

[kHz]

BSA 3,05 3,61 +/- 0,13 158,5 +/-

25,4 2,58 +/-0,21 7,02 +/- 6,5

Thaumatin 2,12 4,46 +/- 0,40 47,1 +/- 24,7 7,86 +/- 1,12 77,8 +/- 4,8

Lysozym 1,842 2,05 +/- 0,20 11,5 +/-2,4 9,09 +/- 1,07 19 +/- 1,2

Ferritin 5,73 45,69 +/-

0,68

9332,3 +/-

457,1 5,16 +/- 0,10

8416,2 +/-

166,4

4.2.2 Set-up ohne Pumpe

In Abbildung 22 wird die Versuchsanordnung einer statischen DLS-Messung (ohne Pumpe)

gezeigt.

Abb. 22: Schematischer Aufbau der dynamischen Lichtstreuungsapparatur ohne Pumpe. [mit

freundlicher Genehmigung von Benjamin Lebsanft]

37

Das vom DLS-Laser (660 nm, 40 mW) erzeugtes Laserlicht wird durch eine Aussparung im

Probenhalter auf die DLS-Küvette (5 mm, Hellma) fokussiert, in der das untersuchte Protein

vorliegt. Aufgrund der Brownschen Molekularbewegung der Partikel im Protein wird das

monochromatische Licht gestreuut und in einem Winkel von 90° vom Detektor aufgefasst.

Die Software erstellt eine Korrelationsfunktion und eine Größenverteilung der im Protein

schwimmenden Partikel. Auf diese Weise lassen sich Aussagen über die hydrodynamischen

Radien des untersuchten Proteins treffen.

4.2.3 Set-up im Fluss

Die Abbildung 23 stellt den Aufbau einer DLS-Messung im Fluss dar. In Abbildung 24 ist ein

Foto der tatsächlichen Versuchsanordnung zur DLS-Messung im Fluss. Die DLS-Küvette

(5 mm, Helma) wurde vor der Messung mit destilliertem Wasser und dem Proteinpuffer

(NaH2PO4) gespült. Danach wurde das untersuchte Protein im Reservoir überführt und mittels

der Pumpe durch die Küvette bewegt und im System verteilt. Das Systemvolumen wurde

durch Kürzen des Schlauchs minimiert und hat sich auf 2 mL reduziert. Das Einbringen der

Proteinlösung ins System erfolgte mit einer Spritze, an der ein Filter angebracht wurde. Zwi-

schen dem Reservoir und der Küvette wurde zudem eine Filterfritte eingebaut um Aggregate

zurückzuhalten und nur Partikel mit geringer Größe durchzulassen.

Nach 30 minütiger Warmlaufzeit/Stabilisierungszeit des Lasers wurden die ersten statischen

Messungen durchgeführt. Danach wurden mit ausgeschalteter Pumpe statische Messungen bei

10 s und 20 s durchgeführt. Die Akkumulationszahl war für diesen Versuchsteil immer 10.

Anschließend erfolgte die DLS-Messung im Fluss mit Pumpgeschwindigkeiten im Bereich

von 0.25 mL/min bis 15 mL/min. Anhand der erhaltenen Messdaten (Signalstärke, hydrody-

namischer Radius) wurden entsprechende Einstellungen der Pumpgeschwindigkeit vorge-

nommen. Zwischen der Änderung der Pumpgeschwindigkeit wurde 5 min. gewartet. Am En-

de wurde nochmal eine statische Messung durchgeführt und um das System zu reinigen und

die Proteine aus dem Schlauchsystem zu entfernen, wurden sowohl die Küvette als auch das

System mit destilliertem Wasser und NaH2PO4 gespült.

38

Abb. 23: Schematische Darstellung einer DLS-Messung im Fluss. [mit freundlicher Geneh-

migung von Benjamin Lebsanft]

Abb. 24: Foto des Versuchsaufbaus einer DLS-Messung im Fluss.

4.2.4 Set-up mit Bestrahlung

Der Aufbau einer Versuchsanordnung zur Bestrahlungsmessung des Prion-Proteins ist in Ab-

bildung 25 als Schema und in Abbildung 26 als Foto zu sehen.

39

Abb. 25: Schematische Darstellung des Versuchsaufbaus zur Bestrahlungsmessung der Prion-

Proteine. [mit freundlicher Genehmigung von Benjamin Lebsanft]

Abb. 26: Foto eines Versuchsaufbaus um Prion-Proteine unter Bestrahlung zu messen.

40

Das Prion-Protein wurde von einem Tsunami + FHG bestrahlt. Der Tsunami ist ein gepulster

Titan:Saphir-Laser (Spectra Physics, 532 nm) und FHG ist ein Frequenverdoppler bzw. –

verdreifacher. Damit war es möglich das Prion-Protein im UV-Bereich zu untersuchen. Mit

dem DLS-Laser wurden statische Messungen durchgeführt.

Das System wurde zunächst mit destilliertem Wasser und dem Prion-Protein-Puffer (Natri-

umacetat) gespült. Im Reservoir wurde 3.7 mL Prion-Protein gegeben, das sich mit Hilfe der

Pumpe durch das System bewegte und in die DLS- (5 mm, Helma) und Bestrahlungsküvette

(10 mm, Helma) gelangte. Am Anfang des Versuches wurden die Messungen bei 10 s und

20 s statisch aufgenommen. Anschließend wurde das Prion-Protein bei einer Pumpgeschwin-

digkeit von 5.6 mL/min für 5 min., 10 min., 15 min. und 30 min bestrahlt. Nach jedem Be-

strahlungsintervall wurde der Klappspiegel nach unten gekippt und die Pumpe gestoppt. Nach

5 min. wurde eine statische Messung durchgeführt und danach wurde die Pumpe eingeschal-

tet. Nachdem wieder 5 min. vergangen waren, wurde der Klappspiegel nach oben gestellt und

es folgte die neue Bestrahlungsmessung. Der Klappspiegel diente dazu, den Strahlengang

vom Tsunami entweder zu blockieren, wenn er nach oben gerichtet war oder auf die Probe

freizugeben, wenn er nach unten umgestellt wurde. Die Strahlung vom Tsunami wurde von

zwei Leistungsmessköpfen (Coherent, Powermax USB) aufgefasst und die Intensität regis-

triert. Bei der statischen Messung, sowie nach 1 min., 2 min., 3 min., 4 min., 5 min., 10 min.,

15 min., 30 min. und 60 min. wurden aus dem Reservoir 100 μl der Probe entnommen. Am

Ende wurde das System nochmal mit destilliertem Wasser und Natriumacetat gespült.

4.3 Methoden zur Probenanalyse

Die im Unterkapitel 4.2.4 gesammelten Proben wurden mittels SDS-Page und CD-

Spektroskopie weiter analysiert.

4.3.1 SDS-Page

Die Proben würden mit 5 x PP gemischt und zusammen mit dem Probenmarker, wie schon im

4.1.2 beschrieben, auf dem 15%-Polyacrylamid-Gel auftragen. Die Gele sind im Unterkapitel

5.4.1 zu sehen. In der Tabelle 12 ist die Probenentnahme dargestellt.

41

Tab. 12: Auflistung der bestrahlten Proben mit ihren zeitlichen Entnahmen.

Probe Zeitliche Entnahme

[min] Probe

Zeitliche Entnahme

[min]

1 0 7 5 + 5 min. warten

2 1 8 10

3 2 9 10 + 5 min. warten

4 3 10 15

5 4 11 15 + 5 min. warten

6 5 12 Endprobe

4.3.2 CD-Spektroskopie

Jeweils 50 μl der bestrahlten Proben wurden mit 50 μl Puffer verdünnt und im CD-Gerät ge-

stellt. Zwischen den Probenwechsel wurde die CD-Küvette mit filtriertem Wasser gespült.

Mit Hilfe eines Auswertprogramms wurde der Mittelwert der pro Probe 15 durchgeführten

Messungen bestimmt und der Puffer abgezogen. Die Messergebnisse sind im Unterkapitel

5.4.2 zu sehen.

42

5. Ergebnisse und Diskussion In diesem Kapitel werden die Ergebnisse der statischen und in Fluss DLS-Messungen der

Eichproteine Thaumatin und Lysozym präsentiert. Zudem werden die Messergebnisse der

Bestrahlung von Prion-Proteinen dargestellt und die Bildung von Aggregaten anhand der er-

haltenen Gele diskutiert. Eine Analyse der Umfaltungsprozesse des Prion-Proteins mittels

CD-Spektroskopie, in der die Änderung der Sekundärstruktur des Prion-Proteins untersucht

wurde, ist in der Arbeit von Svenja Patjens [18] enthalten.

5.1 Statische Messungen der Proteine

Thaumatin wurde statisch für Akkumulationszeiten von 10 s und 20 s und mit einer Akkumu-

lationszahl von 10 gemessen. Die Bilder, die in Abbildung 28 zu sehen sind, zeigen, dass die

Monomere im Thaumatin eine deutliche Radiusgröße unter 10 nm aufweisen. Die rotgelbe

Linie bezieht sich auf den tatsächlich gemessenen Radius des Thaumatins, wobei die hell-

blaue- und türkisförmigen Strukturen eher größeren Teilchen (Aggregate) zugeordnet werden

können. Diese Teilchen weisen wegen ihrer großen Radien, schwache Signalintensitäten (sie-

he Abb. 27) auf.

Abb. 27: Durchschnittliche Größenverteilung der schwimmenden Teilchen im Thaumatin für

die Akkumulationszeit von 20 s.

43

Abb. 28: Links ist eine statische Aufnahme der Radiusverteilung des Thaumatins für die Ak-

kumulationszeit von 10 s dargestellt: Der hydrodynamische Radius der Monomere

ist 4,46 nm 0,40 nm und der Aggregate 119,23 nm 24,99 nm. Die Signalstärke

beträgt Signalstärke: 47,1 kHz 24,7 kHz. Das rechte Bild entspricht einer Akku-

mulationszeit von 20 s. Der hydrodynamische Radius der Monomere ist

3,93 nm 0,48 nm und der Aggregate 102,17 nm 21 nm. Die Signalstärke be-

trägt 30 kHz 9,3 kHz.

In Abbildung 29 ist die Autokorrelationsfunktion für die Akkumulationszeit von 20 s zu se-

hen, die wie erwartet exponentiell abfällt.

Abb. 29: Autokorrelationsfunktion des Thaumatins.

Bei dem Lysozym wurde ebenfalls eine statische Messung für die Akkumulationszeiten von

10 s und 20 s und mit einer Akkumulationszahl von 10 durchgeführt. In Abbildung 30 ist es

44

deutlich zu erkennen, dass der hydrodynamische Radius des Thaumatins etwas über 1 nm ist.

Zudem weisen die Bilder auf eine geringe Anzahl an Aggregaten auf, die aber vom Detektor

nicht aufgefasst wurden und zu einer Überlagerung der Streuintensitäten führen.

Abb. 30: Aufnahmen der Größenverteilung des Lysozyms. Im linkem Bild (Akkumulations-

zeit: 10 s) entspricht der hydrodynamische Radius des Lysozyms

2,75 nm 0,44 nm und die Signalstärke beträgt 15,6 kHz 3,4 kHz. Im rechten

Bild (Akkumulationszeit: 20 s) beträgt der hydrodynamische Radius 2,51 nm

0,35 nm und die Signalstärke ist 15,2 kHz 3,8 kHz.

Die für die Akkumulationszeit von 20 s aufgenommenen Messdaten, zu sehen in Abbildungen

31 und 32, veranschaulichen die Radiusverteilung bei den Monomeren und Aggregaten und

den zeitlichen Verlauf der Autokorrelationsfunktion.

Abb. 31: Größenverteilung vom Lysozym.

45

Abb. 32: Zeitlicher Abfall der Autokorrelationsfunktion.

Aus den statischen Messungen an Thaumatin und Lysozym geht hervor, dass die Singalstärke

relativ stabil bleibt.

5.2 Messungen der Proteine im Fluss

Thaumatin und Lysozym wurden auch im Fluss untersucht. In Abbildung 33 ist der hydrody-

namische Radius und in Abbildung 34 die Signalstärke des Thaumatins jeweils gegen die

Pumpgeschwindigkeit aufgetragen.

Abb. 33: Verlauf des hydrodynamischen Radius von Aggregaten im Bezug auf die Pumpge-

schwindigkeit. Die Radiusgröße fällt mit steigender Pumpgeschwindigkeit doppelt

exponentiell ab (blaue Kurve) und stabilisiert sich mit einem linearen Verlauf nach

7 mL/min.

46

Die Paramater der Fitfunktion ( + + ) sind in der Tabelle 13

gezeigt.

Tab.13: Parameter der Fitfunktion für Thaumatin.

Parameter Werte

11,509 3,49

277,52 36,4

0,80433 0,117

3854,9 585

7,5596 0,737

Abb. 34: Abhängigkeit der Signalstärke von der Pumpgeschwindigkeit. Die Signalstärke der

Aggregate nimmt mit steigender Pumpgeschwindigkeit zu. Im Bereich 5 mL/min

bis 9 mL/min ist ein leichter Abfall durch einen Anstieg der Signalintensität gefolgt.

47

Als Grund für den leichten Abstieg der Signalstärke zwischen 5 mL/min und 9 mL/min könn-

te die Überlagerung der Signalintensitäten von Monomeren und Aggregaten (siehe Abb. 35)

in der Proteinlösung (Thaumatin) genannt werden. In den oben erwähnten Geschwindigkeits-

bereich wurden vermutlich auch Signalintensitäten vom an den Aggregaten gestreuten

Laserlicht detektiert.

Abb. 35: Im linken Bild (Pumpgeschwindigkeit: 9 mL/min, hydrodynamischer Radius:

10,63 nm 0,60 nm, Signastärke: 74,7 kHz 6,3 kHz) ist die Anwesenheit von

Monomeren und Aggregaten zu sehen, die für eine Abschwächung der Signalin-

tensität verantwortlich sind. Im rechten Bild (Pumpgeschwindigkeit: 15 mL/min,

hydrodynamischer Radius: 7,86 nm 1,12 nm, Signalstärke:

77,8 kHz 4,8 kHz) sind nur Monomere präsent. Beide Aufnahmen wurden für

eine Akkumulationszeit von 10 s und bei einer Akkumulationszahl 10 aufgenom-

men.

Die Abhängigkeit des hydrodynamischen Radius und der Signalstärke der Aggregate des

Lysozyms von der Pumpgeschwindigkeit sind in Abbildungen 36 und 37 entsprechend darge-

stellt.

48

Abb. 36: Auftragung des hydrodynamischen Radius gegen die Pumpgeschwindigkeit von

Aggregaten des Lysozyms. Die Messpunkte wurden mit einer doppelten Exponen-

tialfunktion gefittet.

Die Paramater der Fitfunktion ( + + ) sind in der Tabelle 14

gezeigt.

Tab. 14: Parameter der Fitfunktion für Lysozym.

Parameter Werte

19,772 5,13

349,78 51,1

1,036 0,133

3192,3 251

6,2314 0,472

49

Abb. 37: Die Signalstärke der Aggregate nimmt ab 2 mL/min mit steigender Pumpgeschwin-

digkeit zu. Zwischen 0,25 mL/min und 1,75 mL/min ist allerdings ein kleiner Inten-

sitätsabfall des Streusignals zu sehen, der vermutlich durch Verwirbelung des

Lysozyms an den Verbindungstücken in den Schläuchen entstand.

Abbildung 38 bietet einen direkten Vergleich zwischen der Größenverteilung der Aggregate

und der Monomere des Lysozyms. bei einer niedrigen (0,75 mL/min) und einer hohen Pump-

geschwindigkeit (10 mL/min).

50

Abb. 38: Das linke Bild zeigt sowohl die Radiusverteilung von Monomeren (hydrodynami-

sche Radius: 1,98 nm 0,21 nm) als auch von Aggregaten (hydrodynamischer Ra-

dius: 207,84 nm 15,50 nm) für die Akkumulationszeit von 20 s (Akkumulations-

zahl 10) und bei einer Pumpgeschwindigkeit von 0,75 mL/min. Die Signalstärke ist

11,5 kHz 1,6 kHz. Im rechten Bild ist nur die Radiusverteilung von Monomeren

(hydrodynamischer Radius: 11,37 nm, Signalstärke: 18,8 kHz 1,9 kHz) für die

Akkumulationszeit von 20 s (Akkumulationszahl 10) und bei einer Pumpgeschwin-

digkeit von 10 mL/min dargestellt.

Der anfängliche Abfall der Signalintensität zwischen dem Geschwindigkeitsbereich

0,25 mL/min und 1,75 mL/min ist auf die temporäre Anwesenheit der Aggregate zurückzu-

führen. Zusätzlich verändern sich die Foki des Detektors aufgrund der Ausrichtung. Dieser

marginale Ausdehnungseffekt wurde durch minimales Justieren aufgehoben und die Signal-

stärke wurde wieder erhöht.

5.3 Messungen unter Probenbestrahlung

Die Messungen des bestrahlten Prion-Proteins sind im Unterkapitel 5.3.1 und die zwischen

den Bestrahlungsintervallen aufgenommenen DLS-Messungen sind im Unterkapitel 5.3.2 zu

entnehmen.

51

5.3.1 Transmissionsmessungen

Der vom Tsunami erzeugte monochromatische Laserstrahl (532 nm) bestrahlt das Prion-

Protein und wird vor und hinter der Bestrahlungsküvette von Leistungsmessköpfen aufge-

fasst. Seine Signalintensität vor der Bestrahlung ist in Abb. 39 und nach der Bestrahlung in

Abb. 40 dargestellt.

Abb. 39: Zeitlicher Verlauf der Signalintensität vor der Bestrahlungsküvette. Die Intensität

bleibt im Laufe der Bestrahlungszeit relativ stabil.

Abb. 40: Die Signalintensität ist nach der Bestrahlung des Prion-Proteins aufgrund der Wech-

selwirkung zwischen Laserstrahl und Prion-Protein abgeschwächt.

52

Die in der Abb. 40 aufgenommene Signalintensität wurde zum Teil ausgeschnitten und mit

einer Exponentialfunktion (schwarze Kurve) gefittet (siehe Abb. 41).

Abb. 41: Exponentieller Verlauf der Signalintensität hinter der Bestrahlungsküvette.

5.3.2 Dynamische Lichtstreuung Messungen

In Abbildungen 42a und 42b sind Messungen im Fluss (5,6 mL/min) unter Bestrahlung ge-

zeigt. Die hydrodynamische Radien (RH) und die entsprechende Signalstärke (CR) sind unter

jedem Bild aufgeschrieben.

53

Abb. 42a: Bestrahlungsmessungen des Prion-Proteins nach 5 min. (links) und nach 10 min.

(rechts). Am Anfang wurde eine schwache Signalstärke detektiert, die aus der cha-

otischen Anordnung der Partikel resultiert.

Abb. 42b: Größenverteilung des Prion-Proteins nachdem es 15 min. und 30 min. bestrahlt

wurde. Die Signalstärke steigt je länger das Prion-Protein bestrahlt wird.

54

In Abbildungen 43a, 43b und 43c sind Messungen ohne Fluss in Bestrahlungspausen zu se-

hen. Die hydrodynamische Radien (RH) und die entsprechende Signalstärke (CR) sind wieder

unter jedem Bild aufgeschrieben.

Abb. 43a: Aufnahme der Größenverteilung des Prion-Proteins vor der Bestrahlung (links) und

im ersten (5 min.) (rechts) Bestrahlungsintervall. Der hydrodynamische Radius so-

wie die Signalstärke zeigen eine steigende Tendenz.

Abb. 43b: Die Signalstärke steigt nach der zweiten (15 min.) (links) und nach der dritten Be-

strahlungspause (30 min.) an (rechts). Der hydrodynamische Radius fällt jedoch

aufgrund der kurzen Relaxationszeit kurz ab.

55

Abb. 43c: Das letzte Bestrahlungsintervall fand nach 60 min. statt. Der hydrodynamische Ra-

dius steigt wie zu erwarten an. Die hohe Signalstärke kann durch eine mögliche

Kontamination in den Schläuchen erklärt werden.

5.4 Biochemische Analysen als Nachweis

Mit der SDS-Page ist es möglich die UV-induzierte Aggregation des Prion-Proteins zu unter-

suchen und die Bildung Oligomeren analytisch zu betrachten. CD-Spektroskopie wurde ver-

wendet um die Strukturänderung des Prion-Proteins darzustellen und auf diese Weise seine

Umfaltung nachzuweisen.

5.4.1 SDS-PAGE

Die Abbildungen 44a und 44b zeigen die Banden und Laufstrecken des bestrahlten Prion-

Proteins. In Abbildung 45 sind die Sättigungswerte (Intensität der Färbung) der Gele 44a und

44b des Prion-Proteins gegen die Bestrahlungszeit aufgetragen.

56

Abb. 44a: Gel mit den Proben 1 bis 5. Es wurden Dimere gebildet.

Abb. 44b: Gel mit den Proben 6-12. Zusätzlich wurden Oligomere gebildet.

57

Die Banden unter 25 kDa (18,4 kDa und 14,4 kDa) sind den Spaltungsprodukten des Prion-

Proteins zuzuordnen. Das Prion-Protein spaltet sich wegen Unsterilitäten und die Folge ist ein

gefaltetes Prion-Protein (14,4 kDa) und eine Kontamination die das Prion-Protein

wegverdauut (18,4 kDa).

Abb. 45: Sättigungswerte in Abhängigkeit der Bestrahlungszeit. Je mehr Strahlung vom Pri-

on-Protein absorbiert wurde, desto unspezifischer ist die Aggregation durch

Umfaltung. Sowohl das Monomer (rotes Kreuz) als auch das Dimer (blaues Drei-

eck) fallen ab. Das Verhalten der Oligomere (grünes Quadrat) ist auf die Alterungs-

erscheinung und die Trennung des Prion-Proteins zurückzuführen. Nach der

Zentrifugation wurden die Aggregate nicht richtig abgetrennt und die Prion-

Proteinlösung scheint nicht monodispers zu sein. Zudem kommt auch ein systemati-

scher Fehler durch ungenaue Bestimmung der Sättigungswerte in Betracht, die aber

auf Beobachtung basiert und nicht quantifiziert werden kann.

58

Einem direkten Vergleich zur Abbildung 45 liefert die Abbildung 46 [Ezeogo], die den richti-

gen Verlauf der Oligomere zeigt. Nach einem Anstieg, stabilisiert sich die Bildung der

Oligomere, während die Monomere und Dimere abfallen.

Abb. 46: Auftragung der Sättigungswerte des Prion-Proteins gegen die Bestrahlungszeit.

Monomere sind mit einem roten Kreuz, Dimere mit einem blauen Dreieck und die

Oligomere mit einem grünen Quadrat dargestellt.

5.4.2 CD-Spektroskopie

Die Änderung der Sekundärstruktur wurde mittels CD-Spektroskopie untersucht und in Ab-

bildung 47 ist die fortschreitende Abschwächung der α-Helix-Struktur und letztendlich die

Umfaltung der Struktur des Prion-Proteins gezeigt.

59

Abb. 47: CD-Spektrum des bestrahlten Prion-Proteins. Vor der Bestrahlung (rote Kurve) ist

deutlich die α-Helix mit den zwei charakteristischen Minimas zu erkennen. Nach

5 min. (gelbe Kurve), 15 min. (grüne Kurve), 30 min. (türkis Kurve) und 60 min.

(blaue Kurve) Bestrahlung verändert sich die Sekundärstruktur des Prion Proteins

und das β-Faltbatt geht aus dieser Konversion als die dominante Struktur hervor

60

6 Zusammenfassung und Ausblick

In dieser Arbeit wurde der Aufbau der dynamischen Lichtstreuung mittels der Eichproteine

BSA, Thaumatin, Lysozym und Ferritin optimiert. Verbesserungen wurden an der Aufbrin-

gung des Probenhalters, der Position der Küvette im Probenhalter und der Verringerung des

Systemvolumens vorgenommen. Der Probenhalter sollte so fixiert werden, dass der Laser-

strahl und das gestreute Licht 90° zueinander stehen. Die Küvette konnte beim Verschieben

der Bodenplatte teilweise ihre Position ändern, was einen erheblichen Einfluss auf die Signal-

stärke sowie den hydrodynamischen Radius hatte (willkürliche Messungswerte, die hoch und

niedrig waren). Deswegen wurde sie in der "inneren" des Probenhalters mit Schrauben befes-

tigt. Zudem wurde zwischen Reservoir und DLS-Küvette eine Filterfritte eingebaut und für

die Überführung der Proteine in dem Reservoir wurde ein Spritzenfilteraufsatz verwendet.

Das diente zu besserer Qualität der untersuchten Proteine und führte letztendlich zu guten

Ergebnissen.

Die Proteine und insbesondere die Prion-Proteine neigen schnell zu aggregieren. Daher ist es

ratsam sie bei 16.000 x g für 45 min. zu zentrifugieren, bevor die DLS- und Bestrahlungsmes-

sungen durchgeführt werden.

Die statischen Messungen an Thaumatin und Lysozym ergaben relativ stabile Werte sowohl

für den hydrodynamischen Radius als auch für die Signalstärke. Bei der Akkumulationszeit

von 10 s betrug der hydrodynamische Radius für Thaumatin 4,46 nm mit einer Signalstärke

von 47,1 kHz und für Lysozym 2,75 nm mit einer Signalstärke von 15,6 kHz. Bei der Akku-

mulationszeit von 20 s nahmen sowohl der hydrodynamische Radius als auch die Signalstärke

ab. Für Thaumatin betrug der hydrodynamische Radius 3,93 nm und die Signalstärke 30 kHz.

Für Lysozym war der hydrodynamische Radius 2,51 nm mit einer Signalstärke von 15,2 kHz.

Die DLS-Messungen im Fluss zeigten, dass der hydrodynamische Radius des Thaumatins und

Lysozyms mit steigender Pumpgeschwindigkeit exponentiell abnahm. Die Signalstärke des

Thaumatins und Lysozyms hingegen nahm bei höheren Pumpgeschwindigkeiten zu.

Schließlich wurde das Prion-Protein bestrahlt. Die Transmissionsmessungen zeigten einen

Intensitätsabfall des Laserstrahls, weil zum Teil die eintreffende Strahlung vom Prion-Protein

absorbiert wurde. Bei den Messungen im Fluss (5,6 mL/min) unter Bestrahlung war zu erken-

61

nen, dass der hydrodynamische Radius mit steigender Signalstärke abnimmt. Zwischen den

Bestrahlungspausen wurden DLS-Messungen aufgenommen. In diesem Fall war ersichtlich,

dass die Aggregate durch Zentrifugation nicht abgetrennt wurden, was auch vor der Bestrah-

lung betrachtet werden konnte. Der hydrodynamische Radius stieg mit zunehmender Signal-

stärke an.

Zur weiteren Analyse des Prion-Proteins wurde mit der SDS-PAGE, die Bildung von Dime-

ren und Oligomeren und die UV-induzierte Aggregation nachgewiesen. Es wurden auch Spal-

tungsprodukte des Prion-Proteins unter 25 kDa detektiert. Mit der CD-Spektroskopie wurde

der Umfaltungsprozess des Prion-Proteins bestätigt. Die Konversion fand in der Sekundär-

struktur des Prion-Proteins statt, in der der Anteil der α-Helix-Struktur nach intensiver Be-

strahlung immer geringer wurde, bis die β-Faltblatt-Struktur hervorhob.

Während der Messungen wurde festgestellt, dass es oft zu Verwirbelung des Proteins an den

Verbindungstücken über der DLS- und Bestrahlungsküvette kam, wobei viel Volumen ange-

sammelt wurde. Das führte zu erheblich hohen hydrodynamischen Radien und Signalstärke.

Um das Problem zu lösen oder zumindest zu minimieren, wird ein Kapillarsystem (Abb. 48)

vorgeschlagen.

Abb. 48: Schematische Darstellung eines Kapillarsystems.

62

Dabei handelt es sich um ein eckig geformtes Glasröhrchen damit keine Reflexions- und Bre-

chungseffekte stattfinden. Etwa 3 cm vom linken Rand des 9 cm langen Glasröhrchens wird

die Bestrahlungsküvette und ungefähr 4 cm vom rechten Rand der DLS-Laser positioniert.

Über die Bestrahlungsküvette wird der Tsunami + FHG liegen und dazwischen ein Klapp-

spiegel fixiert sein, der die Strahlung entweder durchlässt oder blockiert. Der DLS-Laser bil-

det mit dem Detektor einen 90° Winkel. Im Vergleich zu einem Set-up mit Bestrahlung hat

das Kapillarsystem nur zwei Verbindungsstücke. Dadurch kann sowohl das Systemvolumen

verringert werden als auch vermieden werden, dass die Bestrahlungsküvette beschädigt wird.

Zusätzlich gibt es keine großen Streckungsverluste und eine DLS-Küvette ist nicht mehr vor-

handen.

63

Literaturverzeichnis

[1] J. Rassow, K. Hauser, R. Netzker, R. Deutzmann, Biochemie, Thieme, Stuttgart, 2006.

[2] F. Horn, I. Moc, N. Schneider, C. Grillhösl, S. Berghold, G. Lindenmeier, Biochemie des

Menschen, 3. Auflage, Thieme, Stuttgart, 2005.

[3] M. Köngishoff, T. Brandenburger, Kurzlehrbuch Biochemie, Thieme, Stuttgart, 2004.

[4] A. O. Samson, M. Levitt, Normal Modes of Prion Proteins: From Native to Infectious

Particle, Biochemistry, ACS Publications, 2011, 50, 2243-2248.

[5] L. Redecke, S. Binder, M. Rübhausen, A. Goos, M. I. Y. Elmallah, R. Broadbent, C.

Tilkorn, B. Schulz, P. May, A. Eich, C. Betzel, UV-light-induced conversion and aggre-

gation of prion proteins, Free Radical Biology & Medicine, 46 (2009), 1353-1361.

[6] R. M. Murphy, Static and dynamic light scattering of biological macromolecules: what

can we learn?, Current Opinion in Biotechnologz, 1997, 8:25-30.

[7] K.A.Majorek, P.J.Porebski, M.Chruszcz, S.C.Almo, W.Minor, Crystal Structure of Bovine

Serum Albumin, New York Structural Genomics Research Consortium (Nysgrc)University

of Virginia, 2012.

[8] Kim, S.H., de Vos, A., Ogata, C., Crystal structures of two intensely sweet proteins,

Trends Biochem.Sci. (1988) 13: 13-15.

[9] H. van der Wel, K. Loeve, Isolation and Characterization of Thaumatin I and II, the

Sweet-Tasting Proteins from Thaumatococcus daniellii Benth, Eur. J. Biochem. (1972)

31, 221-225.

[10] Wilson, K.P., Malcolm, B.A., Matthews, B.W., Structural and thermodynamic analysis

of compensating mutations within the core of chicken egg white lysozyme,

(1992) J.Biol.Chem. 267: 10842-10849.

[11] Evans, G., Bricogne, G., Triiodide derivatization and combinatorial counter-ion re-

placement: two methods for enhancing phasing signal using laboratory Cu Kalpha X-ray

equipment, (2002) Acta Crystallogr.,Sect.D 58: 976.

64

[12] A. Valstar, M. Almgren, W. Brown, The Interaction of Bovine Serum Albumin with Sur-

factants Studied by Light Scattering, University of Uppsala, Langmuir 2000, 16, 922-

927.

[13] P. M. Rudd, M. R. Wormald, D. R. Wing, S. B. Prusiner, R. A. Dwek, Prion Glycopro-

tein: Structure, Dynamics, and Roles for the Sugars, ACS 2001, 10.1021/bi002625f.

[14] S. Binder, From UV-irradiation to FLASH-Establishing methods for the investigation of

properties and function of biological and bioinorganic samples, University Hamburg,

2009.

[15] N. J. Cobb, W. K. Surewicz, Prion Diseases and Their Biochemical Mechansims, Bio-

chemistry 2009, 48, 2574-2585.

[16] E. A. Decker, B. Welch, Role of Ferritin as a Lipid Oxidation Catalyst in Muscle Food,

J. Agric. Food Chem. 1990, Vol. 38, No. 3, 674-677.

[17] Zahn R., Liu A., Lührs T., Riek R., C. Schrötter, F. L. Garcia, M. Billeter, L. Calzolai, G.

Wider, K. Wüthrich, NMR solution structure of the human prion protein, (2000)

Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:145.

[18] S. Patjens, Optimierung einer Versuchsanordnung zur DLS-Messung im Fluss und Cha-

rakterisierung der UV-induzierten Umfaltungsprozesse des Prion Proteins, Universität

Hamburg, 2012.

[19] D. Voet, J. C. Voet, C. W. Pratt, Lehrbuch der Biochemie, 2. Auflage, Wiley-VCH,

2010.

[20] S. B. Prusiner, Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie, Science 216

(1982), no. 4542, 136-144.

[21] S. B. Prusiner, Prions, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998), no. 23, 13363-13383.

[22] M. Steuter, S. Flessau, Synthese von PMMA-Partikeln und Dynamische Lichtstreuung,

PC-Vertiefungspraktikum P2, Universität Hamburg, 2011.

65

[23] N. Berova, K. Nakanishi, R. W. Woody, Circular Dichroism: Principles and Applica-

tions, Wiley-VCH, Colorado State University, 2000.

66

Danksagungen

Die vorliegende Arbeit könnte nicht ohne die tatkräftige Unterstützung einiger Personen zu-

stande kommen. An dieser Stelle möchte ich Ihnen meinen besonderen Dank aussprechen:

Prof. Dr. Michael A. Rübhausen bin ich sowohl für die Vergabe dieser einzigartigen

Bachelorabeit als auch für die ausgezeichneten Arbeitsbedingungen dankbar.

Dr. Stephan Binder danke ich für die wertvollen Diskussionen und sein Korrekturlesen.

Dipl. Phys. Benjamin Lebsanft danke ich für die Einführung in die praktischen Aspekte der

DLS und sein Korrekturlesen.

Dipl. Phys. Arne Goos danke ich für seine Hilfsbereitschaft.

Dr. Lars Redecke möchte ich für die ausgiebigen Korrekturarbeiten und Erklärungen danken.

Nachwuchsgruppe SIAS und insbesondere Sven Falke, Marco Klinge und Birgitta Fried dan-

ke ich für die Hilfe bei der Synthese der Proteinen (BSA, Thaumatin, Lysozym, Ferritin), Pri-

on-Proteinen und richtige Anwendung der biochemischen Geräte.

Raphael Eberle danke ich für die Erklärung der Anwendung der CD-Spektroskopie und Ma-

deleine Künz für die viele nützlichen Tipps.

Ezeogo Obaji danke ich für die schönen Gespräche während der Messungen und seine festen

Überzeugung, dass ich die Bachelorarbeit schaffen kann.

Svenja Patjens danke ich für die freundliche Zusammenarbeit.

Ich möchte mich auch bei meinen Kommilitonen Mohammad Vakili, Maryam Hashemi, Lara

Grünig, Philipp Bremer, Bastian Besner und Simon Schneider für die tolle Atmosphäre wäh-

rend des Schreibens der Bachelorarbeit im Büro 357 und die unterhaltsamen Mittagspausen

bedanken.

Meine Familie für ihre stetige Unterstützung sowohl bei guten als auch bei schlechten Zeiten.

67

Erklärung

Hiermit bestätige ich, dass die vorliegende Arbeit von mir selbständig verfasst wurde und ich

keine anderen als die angegebenen Hilfsmittel – insbesondere keine im Quellenverzeichnis

nicht benannten Internet-Quellen – benutzt habe und die Arbeit von mir vorher nicht einem

anderen Prüfungsverfahren eingereicht wurde. Die eingereichte schriftliche Fassung ent-

spricht der auf dem elektronischen Speichermedium.

Ich bin damit einverstanden, dass die Bachelorarbeit veröffentlicht wird.

Hamburg, den 03. September 2012

Stefan Vardanian