oppsummering av immunologikurs
DESCRIPTION
Oppsummering av immunologikurs. Bjarte G. Solheim. Dag 1. Presipitasjon, dobbeldiffusjon i agarose Enzyme-linked-immunosorbent-assay (ELISA) Hemolyse Agglutinasjon. Dobbeldiffusjon i agarose. ELISA. Bestemmelse mengden av anti-HBsAg i blod. OD. IE antistoff mot HBsAg / liter. 3. 6. - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
Oppsummering av immunologikurs
Bjarte G. Solheim
Dag 1
• Presipitasjon, dobbeldiffusjon i agarose
• Enzyme-linked-immunosorbent-assay (ELISA)
• Hemolyse
• Agglutinasjon
Dobbeldiffusjon i agarose
ELISA
• Bestemmelse mengden av anti-HBsAg i blod
AF substrat tilsettes Gulfarge avlesesjo mer As jo mer
gulfarge!
p-nitrofenylfosfat
Vask
3 6 12 24
OD
IE antistoff mot HBsAg / liter
Hemolyse
C1q binder ikke Anti-A i serum
binding tilantigen
C4
A A A A
C4bC4a+
videre komplement-aktivering, cellelyse
spalting av C4
A A
aggregering av IgG
A A A A
Skrift kunne leses gjennom det hemolyserte blodet, men ikke gjennom blodlegemer i løsning.
Agglutinasjon
Erytrocytter Agglutinater
ABO-systemet A antigen
A-transferase
Karbohydrat- H-substans B-transferase B antigen antigen Manglende transferase
(Stumt gen) H substans ( O antigen )
GalFuc
GalFuc
NAcGal
GalFuc
Gal
A-transferase B-transferase
Aantigenet HsubstansOantigenet
Bantigenet
ABO-systemet• Det klinisk viktigste blodtypesystem
Mange antigener på blodlegemene Antistoffer rettet mot A- og B-egenskaper aktiverer komplement effektivt
Antistoffer av IgM-type dannes mot de antigener man mangler uten forutgående transfusjon el. svangerskap
Uforlikelige blodlegemer hemolyseres oftest av komplement straks de kommer i sirkulasjonen
• ABO-uforlikelige transfusjoner har > 10% dødelighet
• Forbytninger er viktigste årsak til ABO-uforlikelige transfusjoner
ABO-systemet
Individets Antistoffer mot
blodtype A-antigen B-antigen
O + +
A – +
B + –
AB – –
Transfusjon i ABO-systemet
For røde bllg. O
A B
AB
For plasma AB
A B
O
Irregulære reaksjoner ved ABO-typing
• ABO-typen bestemmes av blodlegemenes reaksjon med typereagens
• Reaksjonen mellom plasma og kontrollblodlegemer– tjener som kontroll på at det foreligger antistoffer mot de antigener pasienten
mangler i ABO-systemet
– ved irregulære reaksjoner ser vi uventede reaksjoner mellom plasma og kontrollblodlegemer
• Årsak til irregulære reaksjoner– alloantistoffer etter transfusjon eller svangerskap, reagerer med A1c el. Bc men
ikke med egne blodlegemer
– kuldeagglutininer, reagerer med både A1c, Bc og egne blodlegemer, agglutinatet løses opp ved 370 C, agglutinasjonen kommer tilbake etter avkjøling
– pengeruller, reaksjonen sees med alle celler, men blir borte etter 1x vask med saltvann
Alloantistoff Pengeruller
Rh-systemet• To nært koblete genloci: D og CE• Vanlige genotyper i norsk befolkning:
– DCe (R1), dce (r) og DcE (R2)
• Seks alleler: D og d, det siste er stumt CE, Ce, cE og ce Antigene er proteinmolekyler på erytrocyttoverflaten
Antall RhD-antigener: 10.000 - 20.000 pr. erytrocytt
Antistoff mot Rh-antigener aktiverer ikke komplement, men fører til Fc-reseptorbinding og fagocytose.
• Antistoffer dannes først etter transfusjon eller svangerskap. IgG dominerer antistoffsvaret.
Stimulering av lymfocytter med mitogen
Antigener og mitogener stimulerer lymfocytter til å gjennomgå en
blastoid transformasjon
Blastoid transformasjon
• Bare lymfocytter med en spesifikk reseptor for et antigen stimuleres av antigen– i praksis vil det være langt under 1 promille av
cellene
• Mitogener stimulerer imidlertid alle cellene i en gruppe lymfocytter– for eksempel B-lymfocytter eller T-lymfocytter
Zeta potensialet
-
-
-
-
-
--
-
-- -
-
-
-
-
-- -
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
--
-
- --
-
-
--
---
-
-
-
--
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
+
+ +
+
+
+
++
+
+.
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
++
++
Positivt ladede poler på magneter frastøter hverandre
-
-
-
-
-
--
-
- --
-
-
-
-
---
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
- -
-
--
-
--
-
-
--
---
-
-
-
-
--
-
-
--
-
-
-
-
-
-
-
-
+
++
+
+
+
++
+
+.
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
++
Positivt ladede ioneskyer rundt erytrocytter frastøter hverandre
zeta-potensial
-
-
-
-
-
--
-
-- -
-
-
--
---
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
--
-
- --
-
--
----
-
-
-
--
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
+
+ +
+
+
+
++
+
+.
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
++
-
-
-
-
-
--
-
---
-
-
--
---
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
- -
-
--
-
--
-
-
--
----
-
-
-
--
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
+
++
+
+
+
++
+
+.
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
++
mindrefrastøtende
krefter
35 nm
IgM
-
-
-
-
-
--
-
-- -
-
-
-
-
-- -
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
--
-
- --
-
-
--
---
-
-
-
--
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
+
+ +
+
+
+
++
+
+.
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
++
-
-
-
-
-
--
-
- --
-
-
-
-
---
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
- -
-
--
-
--
-
-
--
---
-
-
-
-
--
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
+
++
+
+
+
++
+
+.
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
++
Større frastøtendekrefter
14 nm
IgG
Direkte anti-globulin reaksjon• Et kanin-antistoff rettet mot humant immunglobulin
kan påvise humant immunglobulin som har seg festet til blodlegemer in vivo. Kanin-antistoffet bygger da bro over zetapotensialet.
• Problem:– blodlegemene er omgitt av plasma som inneholder store
mengder med immunglobulin
– for å kunne påvise humant antistoff på blodlegemene, må immunglobulinet i plasma vaskes bort. Ellers vil det løselige immunglobulinet nøytralisere kanin antistoffet
– skyldes en negativ reaksjon dårlig vask?
Direkte anti-globulin reaksjon
NaClsentrifugering
NaClSupernatant kastes
X3
Etter vask
Frie antistofferer vasket bort
Direkte anti-globulin reaksjonHumant antistoff Kanin anti-humant
IgG antistoff
+
“sekundær antistoff”“anti-globulin reagens”
HumantIgG
antistoffKanin anti-humant
IgG antistoff
+
“sekundær antistoff”antiglobulinreagensCoombs’ reagens
agglutinasjon
Kontroll av anti-globulin reaksjoner
• Alle negative prøver tilsettes 1 dråpe ”antistoffdekkete kontrollceller” som er RhD positive vaskete blodlegemer dekket med anti-RhD
• Ved riktig vask av negative prøver, vil de tilsatte antistoffdekkete kontrollcellene agglutinere
Direkte anti-globulin reaksjon
• Antistoffer mot egne blodlegemer finnes– hos nyfødte/fostre der mor har allo-antistoffer
rettet mot barnets blodtypeantigener. Bare antistoffer av IgG-type passerer placenta
– ved autoantistoffer mot erytrocytter– etter uforlikelige transfusjoner
Hemolyttisk sykdom hos foster eller nyfødte
• Anti-RhD fra mor kan føre til alvorlig anemi og høy bilirubin (dvs. hemolyttisk sykdom el. erytroblastose) hos nyfødte som er RhD-positive.
• Hos fostere vil bilirubin fjernes via placenta, og sykdommen gir seg uttrykk ved anemi. Etter fødselen utvikles også icterus.
• Behandling av alvorlig hemolyttisk sykdom er:– Etter fødselen: IVIg; evt. utskiftningstransfusjon der barnet tilføres RhD-
negative blodlegemer i AB-plasma. Man skifter vanligvis ut 2x barnets blodvolum.
– I svangerskapet: intrauterin transfusjon av konsentrerte erytrocytter. • Ved utskiftningstransfusjon:
– Blodlegemer må være forlikelige med morens plasma– Plasma må være forlikelig med barnets blodlegemer
Indirekte anti-globulin reaksjon
NaClsentrifugering
NaClSupernatantkastes
3x
Etter vask
Frie antistofferer vasketbort
Humant antistoff Kanin anti-humantIgG antistoff
+
“sekundær antistoff”“anti-globulin reagens”
HumantIgG
antistoffKanin anti-humant
IgG antistoff
+
“sekundær antistoff”antiglobulinreagensCoombs’ reagens
agglutinasjon
Donor eller screening blodlegemerinkuberes med pasientens plasmaved 370C i minst 30 minutter
Antistoffscreening
• Ved antistoffscreening undersøkes om en pasient har irregulære blodtypeantistoffer
• Pasientens plasma inkuberes med 2-4 nøye utvalgte blodlegemer av blodtype O. Disse uttrykker til sammen alle viktige blodtypeegenskaper i vår befolkning
• IgM antistoffer gir direkte agglutinasjon• IgG antistoffer påvises oftest med anti-globulin
reaksjonen
Type and Screen
• Blodtyping for ABO og RhD og samtidig antistoffscreening kalles ”type and screen”
• Alle større sykehus utfører i dag ”type and screen” av pasienter som kan bli transfu-sjonstrengende
• Dermed kan pasienter med irregulære antistoffer oppdages og disse antistoffers spesifisitet bestemmes.
Forlikelighetsprøver• Forlikelighetsprøver ved transfusjon
– Enkelt forlik påviser IgM antistoffer i pasientens plasma rettet mot givers blodlegemer, og settes opp ved romtemperatur
• De vanligst påviste antistoffer er anti-A og anti-B pga. ABO-uforlik og forbytting. De utløser umiddelbar komplementbetinget hemolyse av erytrocytter
– Utvidet forlik med indirekte anti-globulinreaksjon påviser IgG antistoffer i pasientens plasma rettet mot givers blodlegemer, og settes opp ved 370 C
• De påviste antistoffer skyldes immunisering etter transfusjon eller svangerskap. De fører sjelden til komplementbetinget hemolyse av erytrocyttene, derimot utløser de fagocytose gjennom Fc-reseptor-binding
Praksis ved sykehus
• Forliksprøveoppsett er avhengig av ”type and screen” resultat– Dersom ingen irregulære antistoffer er påvist
• utføres det bare enkelt forlik før transfusjon (kontroll på ABO-forlikelighet)
– Dersom irregulære antistoffer er identifisert• velges blod som antistoffene ikke reagerer med (forlikelig blod),
men det settes likevel opp både enkelt og utvidet forlik
– Resultatet av antistoff screeningen er gyldig i 4 døgn; deretter må det tas ny prøve av pasienten
Valg av blodprodukter• Erytrocytter skal være forlikelige med
pasientens plasma– Vi velger i utgangspunktet ABO og Rh(D)
forlikelige blodlegemer
• Dersom pasienten har fått påvist et irregulært alloantistoff, vil vi velge blodlegemer som ikke har det aktuelle antigen
• Ved transfusjon av plasma, skal plasmaet være forlikelig med pasientens blodlegemer
Før transfusjon utføres
• Enkelt forlik (siste ABO-kontroll!)• Utvidet forlik, dersom antistoffscreening er positiv
eller ikke er utført/er for gammel– Ved antistoffscreening undersøkes pasientens plasma på
alloantistoffer av IgG type mot alle vanlig forkommende blodtypeantigener. Man foretar da såkalt ”type and screen”.
– Dersom det ikke foreligger antistoffer mot disse antigener i en nylig gjennomført screening kan man gi blod uten å utføre utvidet forlik.
• I akuttsituasjoner prioriteres enkelt forlik
ANTISTOFFSCREENING OG FORLIKELIGHETSPRØVER
Enkelt forlik settes opp med alle aktuelle givere. Utvidet forlik settes bare opp på pasienter som har irregulært antistoff, dvs. positivt resultat med screening celle I og/el. II.Vurder resultatene av screening, enkelt og utvidet forlik og trekk konklusjonen om undersøkelsen viser at blodet fra de oppgitte giverne er forlikelig eller uforlikelig.Det skal være mulig å finne minst en giver for hver av pasientene.Resultatene av dagens oppsett blir gjennomgått i smågrupper etter hvert som studentene er ferdige.
Pasient plasma Screening celle I
(+ el. -)
Kontroll celle
(+ el. -)
Screening celle II
(+ el. -)
Kontroll celle
(+ el. -)
Ris - +/- - +/-
Aas + - +/-
Pasient Giver(plasma) (celler)
Enkelt forlik
( + eller - )
UtvidetForlik
( + el. - )
KontrollCeller
( + el. - )
Konklusjon(forlikelig eller
uforlikelig)
Ris 1 - ja
Ris 2 + nei
Aas 3 - - +/- ja
Aas 4 - - +/- ja
ANTISTOFFSCREENING
FORLIKELIGHETSPRØVER
Problemer ved forlik
• Enkelt forlik– Kuldeagglutininer– Pengeruller
• Se om også pasientens blodlegemer er agglutinert. I så fall undersøk om agglutinat i forlik og pasientblodlegemer løses opp ved oppvarming (kuldeagglutininer) eller vask (pengeruller)
• Utvidet forlik– Negativ reaksjon på grunn av dårlig vask
Blod er forlikelig
• Når enkelt forlik er negativt– Positivt enkelt forlik pga. kuldeagglutininer
eller pengeruller godkjennes som negativt, men transfusjon må evt. gis med oppvarmede blodlegemer ved kuldeagglutininer
• Når utvidet forlik er negativt og tilsetting av antistoffdekkede kontrollblodlegemer gir partiell agglutinasjon
Hva gjør man på blodbanker i dag?
• Type and screen– Pasienten blodtypes og undersøkes samtidig på
irregulære blodtypeantistoffer. Antistoffundersøkelsen gjentas hvert 4. døgn under sykehusoppholdet.
• Enkelt forlik
• Utvidet forlik bare hos pasienter med irregulære blodtypeantistoffer
• Elektronisk forlik kan erstatte enkelt forlik
Hvilke metoder benyttes på blodbanker i dag?
• Enkelt og utvidet forlik settes ofte opp slik som dere har gjort– Anvendes spesialløsninger kan inkuberingstider
kortes ned
• Blodtyping og antistoffscreening utføres i Norge oftest med gelkort teknik
Gelkort teknikk• Reaksjonen foregår enten
– I væskefasen over en gel og synliggjøres ved sentrifugering. Agglutinater blir liggende på geloverflaten, mens frie blodlegemer sentrifugeres ned i gelen.
• eller– Ved at gelen er tilsatt antistoffer. Disse reagerer med aktuelle
antigener og holder blodlegemene tilbake i de øvre lag av gelen.
• Ved anti-globulinreaksjon– Gelen er tilsatt anti-globulinreagens. Antistoffer i plasma
”vaskes” vekk når blodlegmene sentrifugeres ned i gelen. Når blodlegemer med antistoffer på overflaten kommer ned i gelen agglutineres de derfor av anti-globulinreagenset.
Gel-kort teknikk for påvisning av agglutinasjon
Positiv Negativ
Agglutinater er forstore til å passeremellom gelkulene
1. Tilsetting av røde blodlegemer til gel-brønnen
2. Inkubering (reaksjon med antistoff)
3. Sentrifugering
4. Avlesning
O RhDpos B RhDneg
PartiellPositiv Negativ
Anvendelse av gel-kort teknikken
Gel-kort teknikken kan benyttes til påvisning av agglutinasjon
ved ulike problemstillinger og trenger ingen vasking:• Blodtyping (som vist med ABO/RhD typingen nedenfor)• Antisoffpåvisning (antistoff-screening og utvidet forlik)• Direkte anti-globulin test
Partiell agglutinasjon er lett å påvise i gel-kort teknikk
4+ 2+ 1+3+ ABO/RhD typing
Antistoffscreening
Anti-globulinreagens i gelenScreeningcelle I+II
Anti-globulinreagens i gelen Screeningcelle III+IV