二代测序助力感染性 疾病的精准诊疗 · 2016. 11. 7. · 军事医学科学院...
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军事医学科学院
临床微生物检验存在的问题
• 培养阳性率低（培养条件、抗生素等导致）
• 检测种类有限（累计成本高）
• 缺乏病原体型别、致病性、耐药信息
• 无法检出罕见、未知和新发病原体
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高通量测序筛查病原体的优势• 不依赖于培养
• 死细菌、使用抗生素亦可检出
• 可同时检出病原体型别、毒力基因、耐药基因
• 准确可靠，碱基序列没有模糊信号，不像ELISA、PCR、杂交芯片等
• 通量极大
20bp序列即具有很高的特异性（特异引物长20bp），每条大于100bp的序列reads即可确定一个物种
一次可以测出超过1千万条序列，理论上检测病原体通量可以达到1千万
• 既可以发现已知病原体、又可以发现完全未知的病原体
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高通量测序已经成为常规技术
• 测序通量越来越大，Hiseq X 10：18T/run，100人60X，千美元/人，3.6万细菌100X。
• 测序成本大幅下降，PGM测序仪：< 1万元RMB/Run• 测序速度越来越快， PGM测序仪：< 24小时/Run• 测序质量越来越高， PGM测序仪：≈ 400bp读长
• 测序自动化程度越来越高，自动建库，自动上机，Miseq：人工操作 < 5小时
• 高通量测序技术大众化的技术，人人都可以拥有
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美国FDA出台基于二代测序的微生物鉴定及耐药与独立分析设备指南（草案）
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病原体测序筛查影响因素
病毒容易发现
容易与宿主分离
环境中少，易于判别
细菌真菌原虫确认难
浓度低
抗生素
恢复期
局部感染未入血
环境微生物
定植微生物
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病原体测序的关键问题
• 样品的前处理：
– 病原体含量低：核酸含量万分之一到百万分之一
– 核酸种类不同：DNA or RNA，建库问题
– 物种差别：原虫、真菌、细菌、病毒，富集问题
– 核酸提取难题：破壁与核酸提取问题
• 数据处理：
– 数据库大小与比对速度（本地/在线，特异性/通用性）
– 假阳性与病原体识别（内源病毒，环境微生物）
– 致病性判断（定植/感染，文献参考）
• 其他手段作为补充：临床指征、细菌培养、动物攻毒
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关键问题之一样本（血液、组织、唾液、尿液、脑脊液、蜱、蚊）
病原体富集宿主细胞去除
病原体直接捕获
核酸捕获去除宿主核酸
病原体核酸
高通量建库方案
DNA+RNA 分别建库
宏DNA建库(RNA->cDNA)+gDNA 混合建库
宏RNA建库(DNA->mRNA)+gRNA混合建库
高通量测序实验室测序
现场便携测序
扩增特异
非特异
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关键问题之二
本地病原体数据库
病原体快速过滤
病原体智能判别算法
病毒
细菌
真菌
原虫
目标病原体全基因组测序
致病机制研究病原体溯源
生物信息学分析
高通量测序数据
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案例1 引进非洲绿猴疫情引进非洲绿猴疫情
• 样本来源：北京某实验动物中心• 样本类型：非正常死亡非洲绿猴的肝、肺组织切片• 宏基因组测序发现大量的猴疱疹病毒（SVV）基因组序列
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• 不明病因死亡的非洲绿猴肝、肺组织测序结果
• Realtime-PCR确认病原体存在• 分离培养得到病原体• 深度测序获得了SVV的全基因组• 基因组注释和比较基因组分析
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案例2 儿童呼吸道病原体筛查儿童呼吸道病原体筛查
• 样本来源：重庆儿童医院• 样本类型：不明原因上呼吸道感染儿童咽拭子• 病原体发现：
病毒感染较为普遍，其中偏肺病毒、Bufa病毒、博卡病毒、腺病
毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒、鼻病毒、副流感病毒是咽拭子当中常见的病毒
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案例3 儿童皮肤溃疡儿童皮肤溃疡
• 样本来源：某医院
• 样本类型：儿童手指头严重溃疡
• 病原体发现：
发现疱疹病毒，设计定量PCR引物，证实为疱疹病毒感染
高通量测序病原体的判别
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案例4 食物中毒死亡病人食物中毒死亡病人
• 样本来源：某食物中毒病人
• 样本类型：呕吐物
• 病原体发现：蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）
Bacillus cereus
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培养物16S rDNA测序验证
• 分离细菌培养鉴定结果
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案例5 食蟹猴未知感染死亡食蟹猴未知感染死亡
• 样本来源：某实验动物中心• 样本类型：一例非正常死亡食蟹猴的大脑、小脑组织• 病原体发现：筛选出2 株可能的致病菌
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• 细菌培养
图1 组织匀浆血平板培养
大脑匀浆血平板培养 小脑匀浆血平板培养 PBS血平板培养
组织匀浆细菌纯培养 链球菌、巨球菌（？）。培养物16S测序
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• 动物攻毒实验
。
取链球菌、巨球菌的菌液（CFU值为107），对BalB/C小鼠大脑注射，每组3只，注射后24小时，统计小鼠的死亡情况
菌液 稀释10-1 稀释10-2
巨型球菌 死亡3只 死亡3只 死亡1只
巴黎链球菌 死亡3只 死亡3只 死亡2只
大肠杆菌标准株 未死亡 未死亡 未死亡
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案例6 未知病因肺部感染未知病因肺部感染
• 样本来源：北大人民医院
• 样本类型：未知病因肺部感染病人的肺组织样本
• 病原体发现：发现烟霉菌
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案例7 ICU病人痰标本ICU病人痰标本
• 样本来源：江阴市人民 医院
• 样本类型：ICU病人痰标本
• 病原体发现：
病例1： Serratia marcescens（粘质沙雷菌）
Pseudomonas aeruginosa（铜绿假单胞菌）
Streptococcus（链球菌属）
Stenotrophomonas maltophilia（嗜麦芽窄食单胞菌）
病例2：Streptococcus（链球菌属）
Pseudomonas（铜绿假单胞菌）
Serratia（沙雷氏菌属）
病例3：Streptococcus（链球菌属）
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案例8 肺泡灌洗液和血液肺泡灌洗液和血液
• 样本来源：307医院
• 样本类型：肺泡灌洗液和血液
• 病原体发现：7332条Human herpesvirus 1序列
• 设计引物进行定量PCR检测验证
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案例9 肺泡灌洗液肺泡灌洗液
• 样本来源：北大人民医院
• 样本类型：肺泡灌洗液
• 病原体发现：
病例1：发现76条C型鼻病毒（human rhinovirus C，HRV-C）。
病例2：发现两种RNA病毒混合感染：14条合胞病毒（Human respiratory syncytialvirus, HSV）和8条A型鼻病毒（Rhinovirus A，HRV-A）。
病例1中76条HRV-C序列
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案例10 血液和痰液血液和痰液
• 样本来源：武汉同济医院
• 样本类型：血液和痰液
• 病原体发现：血液中发现丙型肝炎病毒 HCV• 对血液进行HCV定量PCR检测的结果，得到HCV感染验证
Sample5：血液核酸
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案例11 裂谷热病毒测序裂谷热病毒测序
• 2016.7.22获得安哥拉回国发热病人样品
• 当日开展核酸检测，排除常见病原体：黄热、寨卡、拉萨热、疟疾等
• 随后开展深度测序，24日（36小时）分析完成，发现裂谷热病毒，同时获得全基因组序列
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• 同源毒株为Kakamas(南非2009)• 全球首例输入性裂谷热病例• 提示裂谷热在非洲仍在流行• WHO高度关注
Lancet ID Oct 2016,16
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案例12 寨卡病毒测序寨卡病毒测序
• 输入性寨卡病例
• 入境当天血液病毒有阳转阴
• 尿液病毒核酸持续低滴度阳性
• 获得尿液样品后合成引物
• Ampliseq技术迅速获得全基因组序列
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• 解决复杂临床样本中病原体高通量测序难题
• 为病毒溯源、进化提供了直接证据
• 可为诊断试剂、疫苗和药物研发提供数据
Lancet ID 2016,16:641
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• 2014西非各国Ebola肆虐
• 大批本地专科医生感染死亡
• 中国科学家迎着死亡接受命令
案例13 埃博拉病毒测序埃博拉病毒测序
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• 2014年塞拉利昂埃博拉疫情地理分布
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• 2014年Ebola病毒变异
所有175条测序数据用颜色标注利用MrBayes计算后验概率
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• Ebola遗传多样性分析
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• Ebola传播分析
Ebola在塞拉利昂西部主要传播路径
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• 证实Ebola进化速率并未增加
Gire等分析结果认为进化速率加倍
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• Ebola研究总结
研究
结果
>800份样本
获得175条全序
发现440个突变位点
新增 7个子家系
研究
意义
证实Ebola以特定速率进化，否定以前认为的进化速率加快。
2014 EBOLA流行的原因：交通、医疗、教育、宗教因素
更多
意义
避免产生PCR中，由于引物错配产生的假阴性结果。
帮助研发疫苗和相应治疗方案。
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基于rDNA扩增测序
方案一：单重PCR扩增原核：27F + 1492R真核：ITS1 + ITS4
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方案二：多重PCR扩增原核 + 真核
上述两种方法的技术要点：• 选择合适的参考序列• 建立可靠的比对和判别算法
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超多重靶向PCR深度测序
原理：利用特殊设计的引物panel，避免二聚体形成，实现超多重PCR（>1000种病原体）
优点：
对靶标微生物及其耐药基因进行信号放大，解决低丰度的问题，提高灵敏度
可以检测上千种靶标病原体，避免单个的项目的检测
同时检测病原体及其携带的耐药基因，缩短检测时间
减少数据量，降低成本
根据reads数相对定量
标本类型：腹水、血液、呼吸道、消化道、脑脊液
Ampliseq技术
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金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus
表皮葡萄球菌 Staphylococcus epidermidis
溶血葡萄球菌 Staphylococcus haemolyticus
屎肠球菌 Enterococcus faecium
粪肠球菌Enterococcus faecalis
头葡萄球菌 Staphylococcus capitis
口腔链球菌 Streptococcus oralis
血链球菌 Streptococcus sanguinis
酿脓链球菌 Streptococcus pyogenes
山羊葡萄球菌 Staphylococcus caprae
腐生葡萄球菌 Staphylococcus saprophyticus
缓症链球菌 Streptococcus mitis
远缘链球菌 Streptococcus sobrinus
变形链球菌 Streptococcus mutans
无乳链球菌 Streptococcus agalactiae
艰难梭菌 Clostridium difficile
华纳葡萄球菌 Staphylococcus warneri
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耐药基因类型 耐药基因
ESBLs OXA、CTX‐M‐1、TEM、SHV
大环内酯类 ermA、ermB、ermC、msrA
四环素类 tetK、tetL、tetM、tetO
喹诺酮类抗菌药物 qnrA1
氨基糖苷类耐药基因aac6Ib、aac3‐1、ANT‐2、VEB‐1、PER‐1、CARB、
vatA、vatC
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欢迎合作
• 疑似感染患者高通量测序筛查
• 罕见病原菌全基因组测序及基因组分析
• 广谱耐药菌的耐药质粒全长测序和传播分析
• 人体菌群测序
