nutidens og fremtidens biomarkører hos patienter med · pdf filebiopsi/operation...

Nutidens og fremtidens biomarkører hos

patienter med tarmkræft

Julia S. Johansen Onkologisk afd. Herlev Hospital

18. Marts 2015

• Baggrund

• Dansk CancerBiobank

• MikroRNA - eksempel på nye biomarkører

• Fremtiden

·

Ingen individualiseret behandling af patienter med

tarmkræft i 2005

Patienten ønsker: Den rette behandling fra start Lægen ønsker: Effektiv behandling uden alvorlige bivirkninger

Storm P

2015: Lidt individualiseret behandling af patienter med

tarmkræft

KRAS, RAS og BRAF mutations status skal bestemmes før behandling med cetuximab

KRAS (35 %)

RAS + BRAF (15 %)

Rutine kliniske ”biomarkører”: patologisk vurdering (stadie, lymfeglandel

metastaser, vene indvækst), metastaser, og alder

Undersøgelser af patienter med tarmkræft i 2015

Patienten

PT/CT, MRI, CT, UL

Klinisk vurdering Patologisk vurdering

KRAS, RAS, BRAF i væv

CEA i blodet

Undersøgelser af patienter med tarmkræft i 2020

Patienten

PT/CT, MRI, CT, UL

Klinisk vurdering Patologisk vurdering

Væv og blodprøver

Gener, mikroRNA, SNP,

proteiner og metabolitter

Atkinson 2001: En Biomarkør, eller biologisk markør, er generelt et ”stof”, der bruges som

en indikator for en biologisk tilstand. Det er et ”karaktertræk”, der kan måles

objektivt og vurderes som en indikator for normale biologiske processer, for

sygdomsprocesser og farmakologiske reaktioner på en behandling.

En god biomarkør skal kunne bidrage til at patienterne får en bedre

livskvalitet og biomarkøren skal også være samfundsøkonomisk.

Søgning PubMed 15.03.2015:

”Colorectal Cancer Biomarkers” = 19.306 artikler

”Colorectal Cancer Biomarkers Biologics” = 573 artikler

• Ikke specifik for tarmkræft

• Bruges kun til at følge patienter under behandling og i kontrol forløb

• Forhøjet i blodet (dvs. > 5 ng/ml) hos nogle patienter med tarmkræft

• Forhøjet i blodet hos patienter med andre typer kræft (feks. kræft i lunger,

bugspytkirtel, mavesæk, bryst og skjoldbruskkirtel

• Forhøjet hos 3 % af raske personer

• Forhøjet hos 19 % af rygere

• Forhøjet hos patienter med betændelsessygdomme i bugspytkirtlen og

tarmen, lever- og lungesygdomme

CEA - carcinoembryonic antigen Fundet i 1965 i væv fra tyktarmskræft

Betydning for celle adhæsion/sammenhængskraft

PubMed marts 2015:

Serum CEA: 4791 artikler

Serum CEA colorectal cancer: 1430 artikler

Serum CEA

hos patienter med tyk- og endetarmskræft

Kan ikke bruges til screening eller diagnostik

Kan anvendes til vurdering af sygdomsstadie

Bedst til avanceret sygdom

Kan bruges til at monitorere behandlingseffekt og

tilbagefald af sygdommen

Genetisk analyse af alle patienter med tarmkræft er en mulighed Udgiften til en analyse er faldet fra $95 millioner i 2001 til $6000 i 2014

Vi har brug for nye biomarkører!

Mange komplicerede signaleringsveje, mange gener, mikroRNA, proteiner og metabolitter

– mange biomarkører ?

Vi kender kun lidt af de mange gener, mikroRNA , proteiner og

metabolitter der produceres i vores celler

Figure 6

Cell 2011;144:640-674

Biomarkers can be related to different Hallmarks of Cancer

Hanahan and Coussens. Cancer Cell 2012;21:309-322

De normale celler omkring cancer cellerne spiller en stor rolle for vækst af cancer

Status 2015

• Vi har ingen rigtig gode biomarkører i blodet til at påvise

kræftsygdomme tidligt, tilbagefald af sygdommen på et

tidligt tidspunkt eller effekten af de forskellige

behandlinger

• Serum CEA, KRAS, RAS og BRAF mutations status er de

eneste godkendte biomarkører til vurdering af kræft i

tarm

• Hvorfor har vi ikke fundet flere biomarkører?

Få bevillinger og få biobanker

Hanahan and Coussens. Cancer Cell 2012;21:309-322

Cancer specifik ? Produceres kun af cancer celler

Høj specificitet ? Ikke forhøjet hos raske personer

Høj følsomhed ? Ofte forhøjet hos patienter med cancer

Screening ? Ændrer sig (sammenlignet med raske) på et tidligt

tidspunkt af sygdommen

Prognostisk faktor ? Kan forudsige prognosen

Prædiktiv faktor ? Kan forudsige effekten af en behandling

Monitorering ? Kan reflektere behandlingsrespons og påvise

tilbagefald/forværring af sygdommen tidligt

Cancer biomarkører

2015

Biomarkør forskning er svært og dyrt

Hvordan kommer vi videre?

I 2001 sagde Dr. Lee Hartwell, der fik Nobel Prisen i Fysiologi og

Medicin:

”Although the science and technology are ready for the cataloguing of

genes and proteins that cells express in health and disease states

(e.g. cancer, inflammation) there is a big rate-limiting factor in

organizing the coordinated research program that will be necessary.

Only by organizing an academic-industry partnership with many

different laboratories working on the same samples, sharing data,

developing standards and pooling information will it be possible to

identify new biomarkers for disease states.”

Samarbejde

• Baggrund


• MikroRNA og andre eksempel på nye biomarkører

• Fremtiden

·

Danskere er genetisk meget ens - det er lettere at påvise en

biomarkør i blodet som er relateret til kræftsygdomme

31

On-line registration system

Estrid Høgdall

Dansk CancerBiobank

National indsamling

On-line registrering i databaser samlet i

Regionernes Landsdækkende Sekretariat

i MolekylærEnheden, Patologiafdelingen,

Herlev Hospital

-- Sikre høj kvalitet

- Nationale anbefalinger

- Personale med speciale

- Høj dækningsgrad

- Udnyttelse af midler

Hospitaler indsamler blod

og vævsprøver

DCB & DRB

DATA

1. besøg

Blod prøver

Biopsi/Operation

Vævs prøver

Kliniske databaser Nationale registre

Accept

Henvisning

Max 14 dage

Under behandling med

kemoterapi og biologiske stoffer

Dansk CancerBiobank

Estrid Høgdall

Blod

Blodet tappesEDTA-blod Blod i gelglas

Fuldblod afpipetteres

Centrifugering

4 x 2ml serum

2 x 2ml plasma

1 x 1½ml buffycoat

1 x 1½ml fuldblod

Centrifugering

76 21

43Hvidt mellemlag

(buffy coat)

5

8

Tissue6 7

8 9

1

3

2

4

Side 2 Side 1

9-10 mm

3 mm

3 mm3 mm

5 mm

5 mm

Tissue -Tek og RNA3x10x10 udsk æres til

Frisk frys

3x10x10 udsk æres til

4 stk væv 5x5x3 mm

Formalin/paraffin

3x10x10 mm (5)

2 stk væv 5x5x3 mm

2 stk væv 5x5x3 mm

HE - side 1HE - side 2

-Tek

RNA

Frisk frys

Væv til formalin/paraffin

Væv til RNA-later og Tissue-Tek behandlingFrisk frys

Væv til formalin/paraffin

Væv til RNA-later og Tissue-Te behandling

Alternativ udskæring

Væv

http://www.cancerbiobank.dk

Eksempler på biobanker kombineret med kliniske databaser til translational biomarkør forskning på Onkologisk afd., Herlev Hospital

Studie

Navn

BETmiRC CREBB Bi-weekly REBECCA BIOPAC CHOCA LUCAS PRIME

Kræft

type

Stage

Tarm

Metastatisk

Tarm

Metastatisk

Tarm

Metastatisk

Tarm

Alle

stadier

Bugspyt-

kirtel

Alle

stadier

Galdeveje

Alle

stadier

Lunge

Alle

stadier

Bryst

Alle

stadier

Behand

-ling

Bevacizumab

+

capecitabine

og

oxaliplatin

Bevacizumab

+

Alle typer

kemoterapi

Cetuximab

+

irinotecan

Alle

typer

Alle

typer

Alle

typer

Alle

typer

Alle

typer

Herlev Hospital Onkologisk afd. indsamler blodprøver

Ny: Rebecca protokollen

30 ml ved forskellige

Tidspunkter

LIQUID BIOPSI

BESØG

O P Q R A B1 E1 E2 Ex

Operation Diagnose

1 måned efter

operation

Før stråle-behandling

14 dage efter

Start Før

2. serie 1.

skanning 2.

skanning x.

skanning

Blodprøve taget Dato

3 X 6 ml Rød/sort Tørglas SERUM Greiner rør 5 stk. RØD

3 X 6 ml Lilla/sort EDTA-glas EDTA plasma Greiner rør 5 stk. BLÅ

3 X 3,5 ml Lyseblå/sort Citrat-glas CITRAT plasma Greiner rør 5 stk. HVID

3 X 4 ml Grøn/sort Heparin-glas HEPARIN plasma Greiner rør 3 stk. GRØN

Buffycoat fra 3 EDTA glas Greiner rør 3 stk. GUL

2 Paxgene RNA-rør

Signatur

Blodprøve håndtering – VIGTIGT med ”Standard Operating Procedure” (SOP)

OPSAMLING

ALLE BESØG

3 X 6 ml

RØDT

TØRGLAS

3 X 6 ml

LILLA EDTA

GLAS

3 X 3,5 ml

BLÅT

CITRAT

GLAS

3 X 4 ml

GRØNT

HEPARIN

GLAS

3 rør med Buffy coat 2 X PAXGEN RNA-rør

PREPARERING Henstår

mindst 30

min.

Centrifuger

es ved

2330g

10 min

4° C

Serum

overføres til

5 x cryorør

med rødt

låg

minimum

500 µl

Henstår

mindst 30

min.

Centrifugere

s ved 2330g

10 min

4° C

Plasma

overføres til

5 x cryorør

med blåt låg

minimum

500 µl

Henstår

mindst 30

min.

Centrifugere

s ved 2330g

10 min

4° C

Plasma

overføres til

5 x cryorør

med hvidt

låg

minimum

500 µl

Henstår mindst

30 min.

Centrifugeres

ved 2330g

10 min

4° C

Plasma

overføres til

3 x cryorør med

grønt låg

minimum 500

µl

Brug glasset fra EDTA-

plasmaen

Fjern plasma til ca. 5 mm

over cellelag.

Tag alle de hvide

blodlegemer fra 1 glas og

kom dem i 1 cryorør med

gult låg

1 glas = 1 cryorør

Så man i alt har 3 cryorør.

Skal vendes forsigtigt

8-10 gange, STRAKS efter

blodprøvetagning!

Henstår i 2 - 48 timer ved

stuetemperatur.

Vendes godt inden røret fryses.

OPBEVARING -80° C

fryser

-80° C fryser -80° C fryser -80° C fryser -80° C fryser Fryses ved -20° C i 24-72

timer.

Derefter flyttes glasset over til -

80° C.

• Baggrund


• MikroRNA – og andre eksempel på nye

biomarkører

• Fremtiden

·

MicroRNA kan være nye biomarkører

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014

MiRNA and CRC

MiRNA and cancer

MiRNA

PubMed articles February 2015 microRNAs: 37.106

microRNA biomarkers: 5822 microRNA cancer: 16.169 microRNA cancer biomarkers: 1814

microRNA CRC: 1192 microRNA breast cancer: 1884 microRNA lung cancer: 1574

microRNA CRC angiogenesis: 54 microRNA ovarian cancer: 600 microRNA pancreatic cancer: 571

MicroRNA – et hastigt voksende forskningsfelt

MicroRNAome: En “guldgruppe” for bedre kræftdiagnose og behandling

Berindan-Neagoe I. CA Cancer J Clin 2014; 64:311-336

Små ikke-kodende RNAs

1 % af genomet er microRNA

30 % af alle gener reguleres af mindst et

microRNA

MicroRNA regulerer cellevækst og celledød

MicroRNA regulerer vigtige signalveje i

relation til forskellige sygdomme – bla.

kræftsygdomme

http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.3322/caac.21244/full

Liquid biopsi: Celle-frit tumor DNA og microRNA kan bestemmes i serum, plasma og fuld blod

“Liquid biopsier” kan anvedes til bestemmelse af biomarkører hurtigt. Mindre invasiv metode end vævsbiopsier.

Crowley. Nat Rev Clin Oncol 2013;10:472

Arbejdstid 5 til 7 dage

Genetiske forandringer kan måles i circulerende celle-frit tumor DNA.

Kræft cellerne frigiver små fragmenter af cell-frit DNA til blodet:

Diaz L A , and Bardelli A JCO 2014;32:579-586

Hwa Jin Jung. J Genetics Genomics 2014;41:465-472

Cirkulerende microRNA i blodbanen

Detection of tumor-specific DNA mutations in the blood of patients to monitor response and

relapse with targeted therapies.

Diaz L A , and Bardelli A JCO 2014;32:579-586

©2014 by American Society of Clinical Oncology

Advantages of blood-based testing

High compliance

Low risk, less invasive

Fresh DNA, RNA and microRNA

Archival tissue can be degraded to have different

mutation profile

Accessible

Tissue not always accessible

No selection bias

Assess primary tumor and metastases with one sample

Tumor intra/inter-heterogeneity not a problem

Monitoring possible

Allows monitoring for drug response and resistance

Tissue

Testing

Physician Specialist

(i.e. Surgeon)

Pathology

Clinical Laboratory

Direct

Plasma

Testing

Patient / Oncologist

MicroRNAome genome: Stor betydning for cancer diagnose og behandling

Berinda-Neague I. CA Cancer J Clin 2014:311-336

http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.3322/caac.21244/full

En microRNA kan virke på mange måder – både som et

oncogene og et tumor suppressor gene

Cortez MA. 2011 MicroRNAs in body fluids—the mix of hormones and biomarkers

microRNA har betydning for metastaser

Andrea L. Kasinski. Nature Reviews Cancer 2011;1, 849-864

Celle-frit microRNA kan påvirke hvert step i udvikling af metastaser:

stimulering (onocmirs, røde) eller hæmning (tumor suppressive miRNAs, grønne)

.

Regulering af cancer metastaser af celle-frit microRNA

Alečković et al . Biochimica et Biophysica Acta 2015;1855:24.

I dag er der en dansk landsdækkende undersøgelse af

biomarkører i blodet fra personer der får foretaget

koloskop-screeningen

Formål: Kan man påvise en profil af gener, microRNA og

proteiner I blodet, der kan påvise tarmkræft tidligt og

kunne anvendes som en screeningsmarkør

Prof. Hans Jørgen Nielsen, Hvidovre Hospital

Prof. Torben Ørntoft, Århus Universitets Hospital

Screening

7 typer behandlinger i Danmark til patienter med tarmkræft – kan kombineres på mange måder

Hvem har især gavn af de forskellige behandlinger?

5-FU Capecitabine Irinotecan

Oxaliplatin Bevacizumab

Panitumumab

Cetuximab

Aflibercept Regorafenib

I dag er biologisk behandling af patienter med metastatisk tarmkræft med antistoffer rettet mod 2 hovedsignaleringsveje

Blodkarsdannelsen

(VEGF)

Hud

vækstfaktor signalet

(EGFR)

Bevacizumab, Aflibercept, Regorafenib Cetuximab Panitumumab

Mange nye behandlinger er på vej

Fremtidens biomarkører hos patienter med kræft i tyk- og endetarm

Gener

MicroRNA

Proteiner

Metabolitter

Status 2015: Mange nye biomarkører er fundet

– men de skal valideres i store patientgrupper

Genetiske ændringer påvirker behandlingseffekt

• Det humane genome • 3 milliarder basepar

• 20.000-25.000 kodende gener

• Vi er 99,9 % identiske

• Enkelt nukleotid polymorfier(SNPs) • Forskelle i DNA sekvens

en base (A, T, C eller G ) varierer:

- Person 1) AAGCCTA

- Person 2) AAGCTTA

PubMed: SNP cancer: 6433 artikler

SNP tarmkræft : 579 artikler

SNP tarmkræft biologics: 20 artikler

Next generation sekventering

• Hele genomet undersøges

• Prisen for testen falder: 2005 (100.000 kr.); 2012 (22.000 kr.); 2015 (5000 kr.)

• Januar 2013 første artikel vedr. NGS og effekt af panitumumab

Fremtidens DNA microarray

Etablere et tumorbibliotek med

genprofiler hos patienter med kræft i

tyk- og endetarm

Undersøge genprofilen hos patienter,

der har stor gavn af de forskellige

behandlinger

Opnå større biologisk viden om

sygdommen

Barplot showing signed statistic of the association between gene signatures and tumor side

observed in 589 CRC from the PETACC3 and 325 from the TCGA datasets.

Missiaglia E et al. Ann Oncol 2014;25:1995-2001

© The Author 2014. Published by Oxford University Press on behalf of the European Society for

Medical Oncology. All rights reserved. For permissions, please email:

[email protected].

• Hver cancerform har en specifik

gen ekspressions profil

• DNA mikroarray teknik har i

blindede forsøg kunnet påvise det

anatomiske udgangspunkt for

tumor i op til 89 % af tilfældene og

for deres metastaser i 74-87 %

• Metastaser bibeholder mange af

primær tumorens molekylær-

biologiske karakteristika

• I dag kan der kun anvendes kræft

væv til disse metoder, men måske i

fremtiden kan der udvikles metoder

til anvendelse i blodet

BETmiRC studiet – Bevacizumab Tissue miRNAs in Colorectal Cancer

Mogens K. Boisen

Herlev Hospital

Hypothese:

En specifik miRNA profil i væv fra tarmkræft kan forudsige effekt af

bevacizumab behandling.

Patienter: 667 patienter med metastatisk tarmkræft

behandlet med CAPEOXBEV i 1st linie, og 213

patienter behandlet med CAPEOX uden bevacizumab.

10 danske hospitaler.

Prøver: Kræftvæv fra primær tumor.

microRNA har betydning for karnydannelse

Small EM. Nature 2011;469:336-342

BETmiRC – data indsamling

• Journal

• Patobanken (National patologi database)

• CPR-register (opfølgning)

BETmiRC – vævs prøver (FFPE)

• Kun vævsprøver fra primær tumor

• Prøver fra resektion eller diagnostisk biopsi

”MikroRNA i plasma som non-invasive prædiktive biomarkører for effekt af behandling med bevacizumab hos patienter med

metastatisk colorektal cancer”

• Sted: Onkologisk Afdeling, Herlev Hospital

• Projektgruppe:

• Professor, overlæge, dr.med. Julia S. Johansen (Herlev)

• Læge Mogens K. Boisen (Herlev)

• Statistiker, ph.d. Christian Dehlendorff (KB)

• Desuden: læger fra flere kræftafdelinger i Danmark og Sverige samt AROS

Applied Biotechnology (analyser)

• Knæk Cancer bevilling: 3.550.000 kr. (2015–2017).



• Bevacizumab (BEV) er et antistof som bruges til behandling af

patienter med spredt tarmkræft

• BEV gavner imidlertid kun en mindre del af patienterne og

behandlingen er dyr og giver bivirkninger

• FORMÅL: vi ønsker at undersøge om måling af mikroRNA (en slags

arvemateriale) i blodet (”liquid biopsy”) kan bruges til at målrette

behandling med bevacizumab



• PRØVER: Blodprøver før start og før anden behandling fra 810

patienter behandlet med kemoterapi med eller uden BEV

• ANALYSER: Niveau af mikroRNA måles i prøverne og sammenholdes

med behandlingseffekt

• PERSPEKTIV: Målrettet behandling med BEV via en hurtig og billig

mikroRNA-”liquid biopsy” vil øge effekten og mindske bivirkningerne for

patienterne og give besparelser for sundhedsvæsenet

Konklusioner

• Der er et stort behov for nye biomarkører hos patienter med

kræft i tyk- og endetarm mhp. monitorering i kontrolforløbet

efter behandling, men også pga. de mange nye biologiske

behandlinger, der er dyre og har betydelige bivirkninger og

ikke virker hos alle patienter

• Genetiske faktorer har betydning for 15 - 30 % af forskellene

i metabolismen og effekten af biologiske behandlinger

• En kombination af forskellige biomarkører vil være

nødvendigt pga. sygdommens kompleksitet

• Baggrund


• MikroRNA og andre eksempel på nye biomarkører

• Fremtiden

·

Identifikation af nye og bedre biomarkører til bestemmelse af hvilken behandling patienten skal have

Patienter er forskellige og behandlingerne virke forskelligt hos den enkelte patient

Nye biomarkører kan finde hvilke patienter, der har gavn af de forskellige behandlinger

SPECTAcolor Der forventes inklusion af

600–1000 patienter årligt fra

hele Europa

Konklusioner

• Den medicinske behandling af patienter med

kræftsygdomme har undergået en dramatisk

forbedring i de seneste 15 år.

• Det skyldes dels en mere aggressiv behandling med

de traditionelle kemobehandlinger og operation, men

også behandlingen med de biologiske lægemidler

har stor betydning.

• De biologiske behandlingerne er ikke effektive hos

alle patienter, og på nuværende tidspunkt mangler

lægerne redskaber til at forudsige, hvilke præparater

der vil være mest egnede for den enkelte patient,

både med hensyn til effekt og bivirkninger.

Translationel forskning er nødvendig så vi kan individualisere

behandlingerne i 2020

Hvert menneske er unikt og har sin egen genprofil

Mange diagnostiske, prædiktive og prognostiske biomarkører vil være

kendt så vi bedre kan behandle patienter med tarmkræft

Mange flere bio-

markører end

KRAS, RAS og

BRAF

Behandling af patienter med tarmkræft i 2020

2020

Molecular

subtype 1 Targeted therapy 1

Molecular


Molecular


Molecular


Molecular


Molecular


Biomarker

profiling

NGS

miRNAs

Samarbejde

Patienter

Læger

Sygeplejersker

Pharmafirmaer

Biotekfirmaer

Universiteter

Private Fonde

ESMO

ASC

EU

NCI

Mit håb - I 2020 har vi fundet en række klinisk anvendelige biomarkører til tidlig

diagnostik og tilbagefald af kræft i tarmen samt til vurdering af behandlingseffekt

Identifikation af nye biomarkører er

svært men muligt

http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/d/d1/Mount_Everest_(topgold).jpg

nutidens og fremtidens biomarkører hos patienter med · pdf filebiopsi/operation...

Documents