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NUEVOS MÉTODOS IN SÍLICO Y CLÁSICOS DE SELECCIÓN DE MOLÉCULAS FARMACOLÓGICAMENTE ACTIVAS.

José Antonio Escario García-Trevijano Catedrático de Parasitología

Departamento de Parasitología Facultad de Farmacia

Universidad Complutense RESUMEN Aunque existen medicamentos altamente eficaces para el tratamiento de algu-nas enfermedades infecciosas, la investigación en Farmacología se encuentra en un continuo proceso dinámico de regeneración. Problemas de toxicidad en algunos casos, y, la cada vez más frecuente aparición de resistencias en otros, dejan obsoletos y prácticamente inútiles a muchos de los fármacos desarrolla-dos hace años. Por ello no es de extrañar que la búsqueda de nuevas alternati-vas terapéuticas frente a las enfermedades infecciosas es y será una constante en la labor investigadora de todos los Departamentos relacionados con el área de la salud. Las metodologías aplicadas a los procesos de cribado han ido cambiando al compás de los avances científicos, haciendo a aquellos más fia-bles y objetivos. Además, el alto coste que supone el desarrollo de un nuevo fármaco, ha hecho que irrumpan con fuerza en este campo los modelos virtua-les de cribado “in silico”. Estos procedimientos evitan costosas tareas de sínte-sis y bioensayos, que se realizan solamente después de la predicción de la ac-tividad efectuada tras el análisis de su estructura química. Eso sí, en continua interacción con la Química Orgánica y la Farmacología, siendo por ello un pro-ceso multidisciplinar. En nuestro caso, hemos aplicado esta metodología a la búsqueda de nuevos a-gentes tricomonicidas. Para ello hemos empleado el programa TOMOCOMD-CARDD, que permite el desarrollo de modelos QSAR. Mediante este software, cada compuesto de la base de datos es parametrizado, utilizando diferentes ín-dices, basados en la relación de enlaces y de átomos. A continuación, se dise-ñan una serie de aprendizaje y otra de predicción, obteniéndose finalmente los modelos de clasificación. Posteriormente estos modelos se utilizan para esti-mar “in silico” la actividad de los nuevos compuestos de síntesis, así como de otros ya comercializados con diferentes usos clínicos. Contando con esta herramienta bioinformática, hemos diseñado un proceso secuencial de cribado, integrado por una serie de filtros “in silico”, “in vitro” e “in vivo”, que nos permite el ensayo en el laboratorio de un elevado número de moléculas de forma rápi-da, económica y eficaz.

Uno de los grandes pilares en que se sustenta la mayor esperanza de

vida experimentada en el mundo es sin duda el avance farmacológico, que detiene y/o retrasa la progresión de diferentes patologías. Es llamativo el hecho de que en España, en poco más de 100 años, se haya incrementado esa cifra desde 36 años en 1901 hasta los 84/85 en la actualidad (un 247%). En este

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aspecto, si bien es cierto que existen fármacos altamente eficaces que han contribuido a ello, no lo es menos que, en algunos casos cada vez más numerosos, la alta toxicidad, y, sobre todo en el campo de las enfermedades infecciosas, la aparición de resistencias deja obsoletos y prácticamente inútiles los desarrollados hace años. Este incremento de las resistencias a los agentes infecciosos ha sido recogida en un informe de Review on Antimicrobial Resistence, señalando que en 2014, 700.000 personas (25.000 en la UE), murieron por enfermedades que no se pudieron curar con antibióticos y haciendo una proyección futura, se estima que esta cifra se incrementará a 10 millones en 2050. Esta situación de alarma es recogida por la ONU que, en un reciente informe de 1 de noviembre de este año menciona que, los organismos resistentes son el mayor riesgo para la salud global. Asimismo, afirma que la población mundial verá reducir drásticamente su esperanza de vida a medida que los antibióticos dejen de funcionar.

En este escenario, no es de extrañar que la farmacología necesite un continuo proceso dinámico de regeneración, y que la búsqueda y renovación del arsenal terapéutico frente a las diferentes enfermedades infecciosas, ha sido, es y será una constante en la labor investigadora de todos los departamentos relacionados con el área de la salud.

En la búsqueda de nuevos fármacos, el objetivo principal es encontrar

moléculas que puedan interferir alguna vía o señal metabólica responsable de una enfermedad o proceso patológico. Por tanto, la tarea de la investigación terapéutica es, por un lado localizar el blanco terapéutico, y por otro encontrar la molécula capaz de modificar esta vía, con la finalidad de neutralizarlo o alterarlo.

La identificación de esa diana involucra a conocimientos tanto biológicos

como químicos, con el objetivo de descubrir blancos potenciales y conocer en qué medida éste puede ser alterado. Durante los ensayos biológicos iniciales del ciclo de descubrimiento de fármacos, son identificados las entidades noveles o “hits”. Estos hits identificados, son validados mediante ensayos con-firmativos y refinados estructuralmente con el objetivo de incrementar su

potencia con respecto al blanco. A esta fase de generación de hits le sigue la fase de generación de ca-bezas de serie, líderes o “leads”. Estos líderes, además de potencia específica contra el blanco, deben poseer un perfil biológico favorable, con propiedades fármacocinéticas adecuadas, tales como su capaci-dad de pasar al torrente circulatorio, alcanzar el blanco, y una vez cum-plida su función, ser posteriormente

destruido y eliminado por el organismo: es decir debe incluir los procesos de Absorción, Distribución, Metabolismo y Excreción (ADME). Finalmente, el potencial fármaco debe cumplir, también, unos adecuados parámetros en cuanto a toxicidad que se traduzca en un alto índice de selectividad (ADMET).

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Superada esta fase, el potencial fármaco entra en la fase de los ensayos

clínicos, primero mediante su administración a personas sanas, después en doble ciego y finalmente a gran escala. La siguiente fase es la parte administrativa, en la que se presenta a la aprobación de las distintas agencias de medicamentos mundiales. Finalmente se aborda el proceso de fabricación, comercialización y farmacovigilancia.

En el campo de la investigación farmacológica conocemos el tiempo que

se consume en los cribados, así como el desorbitado coste que supone lanzar un nuevo medicamento al mercado. Lamentablemente en la mayoría de las ocasiones los resultados son poco alentadores. Según estudios relacionados con el desarrollo de nuevos fármacos, se necesitan más de 1.100 millones de euros y 15 años de investigación para llevar un compuesto hasta la fase clínica y, además, 7 de cada 10 medicamentos no recuperan su coste de investiga-ción, siendo el grado de fracaso de un 90%. Es por todo ello que este método de prueba y error es cada vez más ineficaz, siendo necesario evaluar más de 10.000 compuestos para encontrar uno con la actividad deseada. Por otro lado, la investigación de nuevos fármacos presenta una dicotomía, según los centros en los que se realiza. Así a los laboratorios farmacéuticos les interesa que los resultados no den lugar FALSOS NEGATIVOS, pues significaría un gasto inútil, mientras que a los centros de investigación, dado el menor número de moléculas procesadas, les interesa que no haya FALSOS POSITIVOS. Este hecho es algo difícil de ensamblar en los procesos de cribado virtual, pero también habría que tenerlo en cuenta.

Las razones expuestas con anterioridad, sobre todo en el aspecto eco-

nómico y temporal, han hecho que los investigadores hayan profundizado, al compás de los avances científicos, en el desarrollo de las metodologías apli-cadas a los procesos de cribado. Así, el mejor conocimiento del metabolismo de los agentes patógenos, auspiciado en gran parte por la Biología Molecular, Genómica, etc, ha permitido el desarrollo de nuevas técnicas de detección, más sencillas, más objetivas y más rápidas. El avance en las técnicas instru-mentales del que han surgido nuevos y mejores detectores y los microensayos, han proporcionado la posibilidad de automatización del proceso de cribado, que aumenta considerablemente el número de moléculas a ensayar. El desar-rollo de la química, con la comercialización de nuevos y más asequibles com-puestos de partida ha permitido mejorar los procesos de síntesis química sim-plificando la metodología y alcanzándose los nuevos compuestos de manera más rápida y económica. Y finalmente el extraordinario avance en el mundo de la informática, que ha propiciado un enorme incremento en la capacidad y po-tencia de cálculo, ha hecho que irrumpan con fuerza en este campo, la bioin-formática y simuladores, lográndose procesos de cribado virtual, fiables, rápi-dos y sobre todo más económicos. Este desarrollo está siendo de aplicación, sobre todo, en la fase preclínica, con el objetivo de reducir el coste (300 millones de euros), que supone este apartado.

En nuestro caso, nuestro Grupo de Investigación de Terapia Antiparasi-

taria, incluido dentro del Cluster de Medicina Innovadora de la UCM, ha querido aprovechar este impulso científico, para desarrollar nuevos métodos de cribado

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secuenciales para aplicar a diferentes modelos experimentales. Uno de ellos, de los clásicos en nuestro departamento, es el modelo de Trichomonas vaginalis.

Este parásito obligado de naturaleza anaerobia facultativa, agente

etiológico de la ETS no vírica de mayor prevalencia mundial, (unos 280 millones de casos), cuenta en la actualidad con un único tratamiento –el grupo de los 5 nitro-imidazoles-, cuyo principal exponente, el Metronidazol, ha cumplido sobradamente la mayoría de edad (aproximadamente 56 años), y del que son bien conocidos los efectos adversos que impide su uso en mujeres embarazadas, a lo que hay que añadir la creciente resistencia a este derivado imidazólico. Esto ha generado que se incremente la búsqueda de nuevos principios activos, lo que se demuestra con la cantidad de patentes solicitadas hasta el año 2000 para T. vaginalis, que es un número muy superior a las patentes solicitadas para otros microorganismos no víricos causantes de vaginitis. Los orígenes de estas patentes recaen principalmente en EE.UU y China, seguido de varios países europeos y Japón, lo que demuestra la importancia que se le da mundialmente a esta enfermedad. En nuestro caso, nuestro grupo ha contribuido humildemente a incrementar este número en España, con dos patentes; una internacional, de reciente aprobación este año, y la otra, que se presentará en los próximos días.

Este hecho ya de por sí justifica parte de nuestra línea de investigación

dentro del Grupo de Terapia Antiparasitaria, pero además, T. vaginalis, repre-senta un magnifico modelo experimental por el escaso riesgo que presenta su manipulación, su facilidad de manejo en el laboratorio y por presentar similitu-des metabólicas con otros parásitos anaerobios, que permiten proyectar los re-sultados sobre éstos, pudiendo ser el punto de partida de “leads” o cabezas de serie para el tratamiento de esas otras parasitosis, como Giardia o Entamoeba y, como no, la tricomonosis por Tritrichomonas foetus para el campo veteri-nario.

Con respecto a ambos tricomonádidos, comparten muchas propiedades

comunes, como son la ausencia de mitocondrias y su sustitución por hidroge-nosomas para la producción de ATP; ambos metabolizan el metronidazol en estos orgánulos y escapan a la acción de los anticuerpos protegiéndose con proteínas del hospedador y secretando cistein-proteasas similares, que son ca-paces de degradar los anticuerpos. Además, ambos son capaces de producir daño a fibroblastos y células musculares, así como de interactuar con la quera-tina y digerirla. Incluso se ha logrado transfectar a T. foetus con el gen de la adhesina AP65 de T. vaginalis, promoviendo en el primero una mayor adheren-cia a las células epiteliales. Quizás la única diferencia descrita es que los restos de ácido siálico parecen favorecer la adhesión de T. foetus, mientras que difi-cultan la de T. vaginalis.

Estas similitudes hacen que el esquema de cribado secuencial que

vamos a exponer, realizado para el parásito humano, pueda ser utilizado de igual manera para el parásito bovino.

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El cribado secuencial consta de una serie de pasos, mostrados en el esquema:

1.- Cribado virtual 2.- Determinación de la actividad “in vitro”. De forma clásica, los cribados “in vitro” han sido tediosos, lentos, con muy poca capacidad de proceso y costosos. Como ya hemos mencionado, los avances tecnológicos nos han permitido incorporar nuevas metodologías de cribado, y se ha sustituido el clásico método de incubación en tubos y recuento microscópico, por un nuevo método realizado en microplacas, y de lectura fluorimétrica. El método se basa en la reducción del colorante resazurina a resorufina, en presencia de parásitos viables.

Previamente hubo que efectuar algunos cambios en la composición del medio de culti-vo (Diamond), dado que la pre-sencia de los agentes reduc-tores cisteína y ácido ascórbico, interfería en la reacción colori-métrica de reducción de la resa-zurina.

Posteriormente en el pro-ceso de estandarización del método, se ajustó el tiempo de incubación, así co-mo la concentración óptima de resazurina, seleccionándose la concentración de 3 mM y una hora de incubación. Se comprobó mediante ensayos en parale-lo, que el nuevo método reproducía los valores obtenidos por medio del recuento en cámara de Neubauer, así como los publicados en la bibliografía.

El siguiente paso en este proceso de cribado secuencial es la determina-ción de la citotoxicidad de aquellos compuestos cuya actividad ha superado el umbral establecido. Ello nos permite calcular el Índice de Selectividad. Final-mente, aquellos compuestos que no presentan citotoxicidad inespecífica, pasa-rían a la última fase del cribado que son los ensayos “in vivo”.

Para estos ensayos se utilizan ratones hembra NMRI de 3 semanas de edad y de 18-20 g de peso. El inóculo es de 107 tricomonádidos resuspendidos en medio TYM fresco, administrados en un volumen no superior a 0,6 ml por vía intraperitoneal. El tratamiento se efectúa los días 3º, 4º, 5º, 6º, 10º, 11º y 12º p.i. Al 15º día p.i. se sacrifican los animales y se efectúan las necropsias para valorar las lesiones producidas en la cavidad abdominal. Esa valoración se efectúa de acuerdo a un baremo propuesto inicialmente por Toyos y posteriormente modificado y estandarizado por nuestro equipo. De acuerdo con las valoraciones obtenidas, se obtiene el Índice de Patogenia, que será tanto menor cuanto más activo sea el compuesto ensayado. En la tabla adjunta, se exponen las puntuaciones que se otorgan para cada una de las lesiones en los distintos órganos.

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V.-HÍGADO(CARAVISCERAL)

Necrosis puntiforme en número de 1 a 3 y/o fina capa superficial defibrinasobreellóbulodeSpigelio 2puntos

Necrosisde3a5mmy/onecrosisparcialdellóbulodeSpigelioodeloslóbulosventralesderechooizquierdo

4puntos

Necrosisde5a8mmy/onecrosistotaldellóbulodeSpigelioonecrosisequivalenteenloslóbulosventralesderechooizquierdo

6puntos

Necrosisde8a10mm 8puntosNecrosisafectandoalamayorpartedelasuperficie 10puntos

VI.-HÍGADO(CARADIAFRAGMÁTICA)

Necrosis puntiforme en número de 1 a 3 y/o fina capa superficial defibrinay/oalteracionesenlacoloracióndelórgano 2puntos

Necrosisde3a5mmy/ograndesalteracionesdecolor 4puntosNecrosisde5a8mmy/onecrosisparcialde los lóbulosdiafragmáticosderechooizquierdo

6puntos

Necrosisde8a10mmy/onecrosisparcialdelosdoslóbulosy/ointensadeunlóbulo

8puntos

Necrosisintensaafectandoavarioslóbulos 10puntosNecrosisextendidaatodosloslóbuloseinteresandoaldiafragma 12puntos

Como ya se ha indicado, el tiempo, coste y limitaciones en cuanto a nú-mero de moléculas a ensayar, que suponen los procesos de cribado, hace ne-cesaria la búsqueda de métodos alternativos que aumenten la eficacia. Dentro de estos métodos han surgido con fuerza los procesos de cribado virtual. Cribado Virtual

El cribado virtual (CV) podría definirse como “El análisis computacional de bases de datos de compuestos, dirigido a identificar y seleccionar un núme-ro limitado de candidatos que posean la actividad biológica deseada sobre un blanco terapéutico específico.” Esta tecnología computacional es de carácter multidisciplinar, dado que necesita el apoyo de la Biología, Química Orgánica, Matemáticas, la Computación y, como no, de la Farmacología. Las ventajas que presentan estos sistemas son la rapidez de los cálculos matemáticos com-putacionales y el bajo coste debido al carácter teórico del proceso, así como el posible análisis de entidades moleculares teóricas, aún no sintetizadas, evitán-dose la síntesis de los compuestos que tienen nulas o escasas probabilidades de resultar activos. Así, el objetivo final es el diseño dirigido de ligando que tenga una alta probabilidad de éxito. Existen básicamente dos grandes grupos de técnicas de CV:

a) En función del receptor b) En función del ligando

Las primeras requieren el conocimiento previo de la estructura 3D del re-

ceptor, es decir hay que conocer la estructura de la diana farmacológica. Poste-riormente se buscan moléculas que puedan interaccionar con esa diana y for-mar un complejo estable, que pueda competir con su sustrato natural o blo-quearlo. Este tipo de metodología se conoce como acoplamiento molecular o “docking”. Este acoplamiento molecular puede ser directo o indirecto. En el ca-so del docking directo, lo que se busca es el farmacóforo que se acople al cen-tro activo, compitiendo con su sustrato natural o bloqueándolo. En el indirecto,

I.-MORTALIDAD(díasp.i.)

Ratonesmuertosal3erdíap.i. 50puntosRatonesmuertosal4ºdíap.i. 44puntosRatonesmuertosal5ºdíap.i. 38puntosRatonesmuertosal6ºdíap.i. 32puntosRatonesmuertosal7ºdíap.i. 26puntosRatonesmuertosal8ºdíap.i. 20puntosRatonesmuertosal9ºdíap.i. 14puntosRatonesmuertosal10ºdíap.i. 8puntosRatonesmuertosdespuésdel10ºdíap.i. 6puntosRatonessacrificadosel15ºdíap.i. 0puntos

II.-LÍQUIDOASCÍTICO

Menosde1mL 2puntosDe1a2mL 4puntosMásde2mL 6puntos

III.-PERITONEOYGRASAPÉLVICA

Necrosispuntiformeennúmerode1a3 2puntosNecrosispuntiformemúltipley/onecrosisúnicade3a5mmdediámetro 4puntosNecrosismúltiplesde3a5mmy/onecrosisúnicade5a10mmdediámetro 6puntos

Necrosisextendidaportodalapelvis 8puntosNecrosisdiseminadaencavidadabdominalafectandoelmesointestinoyzonaperirrenal 10puntos

IV.-BAZO,PÁNCREASYESTÓMAGO

Necrosispuntiformeennúmerode1a3y/oesplenomegalia 2puntosNecrosispuntiformemúltipley/onecrosisúnicade3a5mmdediámetro 4puntosNecrosisúnicade5a8mm 6puntosNecrosisde8a10mmafectandoamásdeunórgano 8puntosNecrosisde10a15mmenglobandoamásdeunórgano 10puntosNecrosismayoresde15mmqueocupanmásdeunórganoeinteresandotambiénahígadoyasasintestinales

12puntos

V.-HÍGADO(CARAVISCERAL)

Necrosis puntiforme en número de 1 a 3 y/o fina capa superficial defibrinasobreellóbulodeSpigelio 2puntos

Necrosisde3a5mmy/onecrosisparcialdellóbulodeSpigelioodeloslóbulosventralesderechooizquierdo 4puntos

Necrosisde5a8mmy/onecrosistotaldellóbulodeSpigelioonecrosisequivalenteenloslóbulosventralesderechooizquierdo 6puntos

Necrosisde8a10mm 8puntosNecrosisafectandoalamayorpartedelasuperficie 10puntos

VI.-HÍGADO(CARADIAFRAGMÁTICA)

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la molécula se puede acoplar a otro lugar diferente, provocando esa unión un cambio conformacional que hace disminuir la afinidad por su sustrato.

Las técnicas que se basan en el ligando se aplican cuando no se conoce la

estructura del receptor. Existen básicamente dos procedimientos:

1.- Superposición de farmacóforos: Fragmento estructural mínimo necesario para que el fármaco presente una actividad concreta, es decir, la parte de la estructura que interacciona con la diana farmacológica. Para detectar el farma-cóforo, es necesario saber los grupos que son importantes para la actividad que tiene la molécula en estudio. Por ejemplo, los grupos nitro, para la activi-dad tricomonicida. Una de las formas de identificar el farmacóforo es a través de QSAR (“Quantitive Structure Activity Relationship”), o sea relación cuantitati-va entre la estructura y la actividad del compuesto. Si obtenemos el farmacófo-ro 3D, obtendremos una información de la contraparte, que es el receptor; es decir, de los grupos del receptor que interaccionan con el farmacóforo, y podre-mos analizar su distribución espacial, y obtener, teóricamente, una imagen es-quemática del sitio de unión. Existen ya diversos programas dedicados a la búsqueda de farmacóforos 3D que superponen las moléculas y buscan la con-formación óptima para esa superposición. 2.- Técnicas QSAR: Estas técnicas QSAR se iniciaron, aunque muy grosera-mente, hace más de un siglo, cuando en 1893 Richet relaciona la toxicidad con las propiedades fisicoquímicas de una serie de compuestos orgánicos, obser-vando que a mayor solubilidad menor toxicidad (Regla de Richet). Al mismo tiempo Fisher estudio las la influencia de las configuraciones a y b de diferen-tes glucosidos en su división enzimática. Pero el comienzo de la Química cuan-titativa lo marcó L.P Hammet en 1940 con la publicación del libro “Physical Organic Chemistry”. Y el gran paso de los estudios de relación estructura-activi-dad, lo dieron en 1964 Hansch y Fujita que estudiaron las relaciones entre las propiedades físico-químicas y la actividad biológica y Free y Wilson que de-sarrollaron un modelo de contribución aditiva de sustituyentes químicos a la actividad biológica

A partir de ahí, la Química Médica ha intentado siempre relacionar las

estructuras químicas con su actividad biológica, intentando identificar los gru-pos químicos responsables de esa actividad. Un gran avance en este campo fue posible con la aparición de los ordenadores, que han incrementado expo-nencialmente la capacidad de cálculo, propiciando la aparición de programas QSAR. Para llevar a cabo un estudio de tipo QSAR se necesitan básicamente tres tipos de información: (A) Estructura molecular de diferentes compuestos que tengan un mismo mecanismo de acción (farmacodinamia), y por lo tanto se consideran como ligandos ante una diana biomolecular común. (B) Datos de actividad biológica de cada uno de los ligandos incluidos en el estudio (por ejemplo: DE50, DL50, Ki, IC50, etc.) (C) Propiedades fisicoquímicas (descriptores numéricos) de los ligandos calculados por medios computacionales a partir de la estructura molecular generada in sílico.

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Además de lo anterior se debe cumplir una condición y es que la actividad biológica del fármaco, producto de su interacción con el receptor, sea una función de las características estructurales de la molécula. La ecuación matemática de la que derivan los puntos fundamentales de esta metodología, se basó en el modelo extratermodinámico1 de Hansch que establece: Ln A = fh(Xh)+ fe(Xe)+ fs(Xs)+ cte. Donde A es la actividad y fh(Xh), fe(Xe), fs(Xs) son índices hidrofóbicos electrónicos y estéricos de las moléculas. Los puntos que se derivan de esta ecuación, conocidos como el paradigma de Hansch, serían: 1. La actividad biológica es función de la estructura del fármaco. 2. La estructura del fármaco implica ciertas propiedades globales como la hidrofobicidad, carga neta, solubilidad etc. y ciertas propiedades locales como la distribución de la hidrofobicidad, carga y volumen en determinadas posiciones de la molécula. 3. Estas propiedades globales y locales pueden ser cuantificadas mediante ciertos parámetros. 4. Siempre existe una función que relaciona los cambios de actividad biológica con los cambios en las propiedades globales y locales, aunque puede ser que no sea sencilla ni evidente.

Estas técnicas QSAR, mediante diferentes modelos, lo que buscan es una clasificación en cluster de los compuestos, que los agrupe teniendo en cuenta la relación de la actividad biológica buscada con los descriptores elegi-dos. Con esta agrupación en cluster se construyen las series de entrenamiento y predicción.

Para el diseño de la serie de entrenamiento existen varios modelos; los más comúnmente utilizados son el modelo extratermodinámico y el modelo de Free-Wilson. En el primero, como se puede intuir de lo explicado con anteriori-dad, se correlacionan las propiedades fisico/químicas con la actividad, produ-ciéndose conclusiones generales de la acción del producto a nivel molecular. Es un modelo que no es capaz de correlacionar fragmentos estructurales.

El modelo de Free-Wilson relaciona fragmentos estructurales, permitien-

do cuantificar los efectos de los cambios estructurales. Al tener en cuenta solo los sustituyentes y no el comportamiento global de la molécula, la utilidad de este modelo es más limitada, aunque para algunos es el único modelo auténti-co de relaciones estructura/actividad. Este modelo requiere un número mínimo de compuestos, tanto del prototipo como de los análogos. Este número viene definido por las formulas:

1 El término extratermodinámico proviene de que las relaciones se describen en términos termodinámicos, aunque no se deducen de sus leyes.

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Nmin= Sj (ni-1)+1 de análogos del prototipo Nmax= n1* n2* n3*….. nj-1- nj (derivados posibles)

Donde j representa las diferentes posiciones posibles de sustitución e i el número de sustituyentes.

Por esta dicotomía, es difícil establecer criterios fijos que puedan servir para establecer una serie de entrenamiento óptima, ya que en algunos paráme-tros de optimización parecen contrapuestos. No obstante, de modo general, la serie de entrenamiento se construye a partir de un prototipo, constituida por un núcleo común y unos sustituyentes variables, característicos de cada compues-to, y que se han de identificar por medio de descriptores. Estos descriptores son utilizados como variables independientes. Suelen ser, como ya se ha men-cionado, características físico-químicas o moleculares, son invariables y repro-ducibles y no deben ser redundantes; son calculados a partir de la estructura por métodos computacionales. Unos son simples y genéricos como el peso mo-lecular y otros complejos, como distribución de carga eléctrica, superficie polar,etc. La variable dependiente es la actividad biológica, que debe ser eva-luada, y debe tener en cuenta el error humano en la experimentación.

En nuestro caso, nos hemos inclinado, parcialmente, por el modelo

extratermodinámico, de manera que esos descriptores son propiedades físi-co/químicas de la molécula a nivel local y global. La condición impuesta para la construcción de la serie es que aquella no debe ser similar, en cuanto a los pa-rámetros introducidos; es decir, no tiene sentido intentar estudiar cómo influye una característica sobre la actividad, si sólo se estudian compuestos similares respecto a esta característica. Por otro lado, los compuestos deben escogerse de tal forma que la variación en las características se produzca de manera in-dependiente, que no estén correlacionados. Es decir, si la variación de una pro-piedad X1 viene siempre acompañada de la variación en otra propiedad X2, no es posible conocer si el cambio de actividad de unos a otros productos se debe al cambio en la propiedad X1 o en la propiedad X2. Posteriormente, se evalúan los fármacos de forma virtual, a la vez que se efectúa también su valoración biológica. En caso de no obtener una actividad óptima, dichos compuestos re-troalimentan la serie de entrenamiento, repitiéndose el proceso. Además de los anteriores existen los modelos QSAR-3D, que se diferen-cian en que requieren un análisis conformacional de todas las estructuras mo-leculares que formen parte de la serie de entrenamiento. Estos modelos em-plean descriptores 3D, también definidos como dependientes, entre los que destacan el método CoMFA (Comparative Molecular Field Analysis) y el méto-do CoMSIA (Comparative Molecular Similarity Indices Analysis)

A pesar de que “a priori” parecen mejores los modelos 3D, la gran difi-

cultad del análisis conformacional, unido a una mayor exigencia computacional (en una proteína pequeña de 250 amino ácidos el número teórico de conformaciones que puede adoptar es 4750, teniendo en cuenta los grados de libertad que puede adoptar), en la actualidad los métodos más empleados son los modelos 2D, basados en descriptores.

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En este sentido, se han desarrollado multitud de programas QSAR. En

nuestro Departamento, hemos utilizado el programa TOMOCOMD-CARDD, (TOpological MOlecular COMputer Design), programa desarrollado por investi-gadores de la Universidad de las Villas de Santa Clara (Cuba) y que es capaz de generar modelos virtuales a partir del cálculo de descriptores topológicos. A través de este software, en los últimos años, nuestro grupo de investigación ha diseñado modelos de CV que han permitido la selección racional de compues-tos potencialmente activos frente a distintos parásitos como Plasmodium, Trypanosoma cruzi, Trichomonas vaginalis y Leishmania. El proceso de cribado virtual consta de la siguiente serie de pasos: 1.- Transformación de una formula química en algo interpretable por un sistema informático.

Para ello, a partir de la formula química completa, se numeran en primer lugar los átomos de la molécula. Los enlaces de cada uno de los átomos con los contiguos, se denominan aristas.

Con esos datos establecemos una matriz, con una doble entrada de cada uno de los átomos que componen la molécula, de acuerdo al gráfi-co que se adjunta. En esa matriz se establecen las relaciones, es decir el número de enlaces, que tienen cada uno con sus átomos contiguos. Por ejemplo El N1, no tiene ninguno consigo

mismo; por tanto en esa casilla figuraría un 0, en cambio el N1 tiene un triple enlace con el C2, por lo que en la casilla correspondiente fi-guraría un 3. Asimismo, el N1 no comparte nin-gún enlace con C3, así que en esa casilla figu-raría un 0. Esto se hace con cada uno de los átomos de los que se compone la molécula. De ese modo la matriz una vez completado todas las casillas quedaría como sigue:

2.- Establecimiento del grado del vértice:

Es el Nº de aristas que inciden en cada vértice. Para ello, añadimos una nueva columna (d). La función de esta columna es la transformación de la ma-

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triz no estocástica en matriz estocástica. Esto nos permitirá en el futuro estable-cer modelos de predicción basados en matrices no estocásticas y matrices es-tocásticas.

En este sentido conviene aclarar, que según las cadenas de Markov, una sucesión de observaciones X1, X2... se denomina proceso estocástico si los valores de estas observaciones no se pueden predecir exactamente, pero se pueden especificar las probabilidades para los distintos valores posibles en cualquier instante de tiempo. Es decir, una cadena de Markov es un proceso estocástico en el que si el estado actual, Xn, y los estados previos X1,...,Xn−1 son conocidos, la probabilidad del estado futuro (F) Xn+1, NO depende de los estados anteriores X1,...,Xn−1, y F SOLAMENTE depende del estado actual Xn. No hay una regla que asegure qué predicción es la mejor, si la de los modelos estocásticos o la de los no estocásticos. Depende de cada caso.

El proceso sería introducir en esa columna la suma de los vértices de cada fila, de modo que la matriz, incluida la columna d, quedaría como se ilus-tra a continuación. 3.- Transformación de matriz no estocástica en estocástica.

Para ello sustituimos en ca-

da una de las casillas el resultado de dividir cada una de las casillas por el valor de la delta (d) de su misma fila, incluida la propia. De esta manera, la matriz no estocásti-ca representada, pasaría a una ma-triz estocástica con los siguientes valores:

4.- Establecimiento de los descriptores.

Consiste en la asociación de los parámetros físico/químicos de los susti-tuyentes que conforman la molécula a la estructura básica de la matriz. En este sentido, cada átomo tiene unas características, como por ejemplo la masa ató-mica, constante de ionización, polarizabilidad, electronegatividad de Pauling, radio de Van der Walls…etc. A cada una de esas propiedades se le conoce co-mo VECTOR. La idea es vincular cada uno de esos vectores a la matriz, me-diante la multiplicación de la matriz por el vector columna correspondiente. Por ejemplo, si queremos incluir el vector de la masa atómica el proceso sería el

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siguiente:

Esto nos daría como resultado un nuevo vector en el que estaría

incluido la propiedad seleccionada 5.- Obtención de los Índices lineales, cuadráticos y bilineales

De este modo podemos obtener los índi-ces lineales locales, es decir los referidos a un solo átomo, o el índice lineal total, que sería el sumatorio de los índices locales y que sería, en nuestro ejemplo, el Índice lineal total no esto-cástico basado en las relaciones entre los áto-mos, y sin tener en cuenta la presencia de hi-drógeno. La ecuación matemática que hace es-

tos cálculos sería:

Si multiplicamos la matriz por un vector fila y por un vector columna, ob-

tendríamos los índices cuadráticos. Estos índices, presentan la ventaja de au-mentar la separación de los puntos, y por tanto ofrecer una mayor discrimi-nación.

Y la ecuación que regiría este proceso sería:

Si en lugar de un índice deseamos introducir dos, el proceso sería el mismo, cambiando el repetido por uno nuevo. Con ello obtendríamos índices bilineales de acuerdo con el siguiente esquema y la correspondiente ecuación:

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6.- Potencia de las matrices

Hasta ahora nos hemos referido a una matriz de potencia 1, en la que

cada uno de los átomos se relaciona exclusivamente con su contiguo. Al au-mentar la potencia de la matriz, se consigue la relación con el siguiente átomo, consiguiéndose diferencias que no se establecían en la de potencia 1. Se pue-den hacer potencia 3, 4…n, donde la relación de los átomos se establece de cierta manera con el resto de los átomos de la molécula. Se suele llegar hasta la potencia 15. Las potencias elevadas, por encima de 10, no se sabe muy bien qué representan, pero en ocasiones, los modelos efectuados con ellos son los mejores. De esta manera, como se puede deducir, el número de índices que se pueden emplear es muy grande. Índices no estocásticos y estocásticos, y para cada caso, índices cuadráticos, lineales y bilineales. Además de totales y loca-les. Para los totales, se puede tener en cuenta o no la presencia de átomos de hidrógeno, la presencia de heteroátomos con y sin hidrógeno, halógenos con y sin hidrógenos para los índices locales…etc. Esta amplia variedad, va multipli-cando el número de cálculos necesarios, siendo preciso una potencia de com-putación elevada para poder efectuarlos. Esta es la principal razón de que es-tos métodos no hayan podido desarrollarse hasta que no han aparecido micro-procesadores capaces de soportar esa ingente cantidad de cálculos. 7.- Diseño de las series de entrenamiento y predicción

Para ello se utiliza el análisis de cluster. Este análisis responde a la si-guiente definición: “Se utiliza la información de una serie de variables para ca-da sujeto u objeto y, conforme a estas variables se mide la similitud entre ellos. Una vez medida la similitud se agrupan en: grupos homogéneos internamente y diferentes entre sí”. En este sentido hay que tener en cuenta que los resulta-dos logrados para una muestra sirven sólo para ese diseño (su valor atañe sólo a los objetivos del analista): elección de individuos, variables relevantes utiliza-das, criterio de similitud utilizado, nivel de agrupación final elegido.... definen di-ferentes soluciones. En nuestro caso se utiliza el análisis de cluster jerárquico, que tiene por objetivo agrupar clusters para formar uno nuevo o bien separar alguno ya existente para dar origen a otros dos, de tal forma que, si sucesiva-mente se va efectuando este proceso de aglomeración o división, se minimice alguna distancia o bien se maximice alguna medida de similitud. En nuestro ca-

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so hemos utilizado una mezcla entre los métodos “aglomerativos” (tratan de agrupar todos los individuos en un único cluster) o “disociativos” (tratan de se-parar cada uno de los casos tratados en un cluster). De acuerdo con estas premisas se siguió el siguiente diagrama.

De cada uno de los cluster en que fueron divididos los compuestos activos e inactivos fueron selec-cionados compuestos para la serie de entrenamiento (SE) y para la serie de predicción (SP).

8.- Generación de la función discriminante

El análisis discriminante permite corroborar las características molecula-

res que mejor describen la actividad que constituye la variable dependiente. Es realmente el proceso que genera los modelos de predicción QSAR, de acuerdo con los cálculos y clasificaciones que hace el programa TOMOCOMD-CARDD. En nuestro caso se utilizó el programa “Statistica”. 9.- Validación de los modelos de predicción

Se realizan tres validaciones de los modelos de predicción.

a) Validación cruzada. Para ello se retiran el 10 % de los com-puestos de la SE realizando nuevamente los modelos con el 90% res-tante de los compuestos de la SE. Los compuestos retirados se pasan por el modelo de predicción para valorar el poder predictivo del modelo al introducir un ruido en su SE inicial. Un buen modelo debe ser capaz de predecir la actividad de los compuestos sustraídos y mantener el va-lor de los parámetros estadísticos. Esta validación cruzada se repite tan-tas veces hasta que todos los compuestos han sido retirados una vez de la serie de entrenamiento.

b) Validación interna. Se efectúa con la serie de predicción, valo-rándose el porcentaje de buena clasificación global de los compuestos.

c) Validación externa: Se realiza la predicción de compuestos que tienen publicada la actividad frente a la diana ensayada, también formada por compuestos activos e inactivos, comparándose la predic-ción por los modelos “in silico” con la actividad reportada.

10.- Fiabilidad de las bases de datos confeccionadas (Diversidad molecular)

Se efectúa por medio del k-NNAC (k-nearest neighbor cluster algorithm). Este es un algoritmo de clasificación supervisado, en el que la clasificación de un punto se basa en la clasificación de los puntos cercanos, diferenciándose de

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los métodos supervisados, en que los puntos no tienen una clasificación externa. Mediante este proceso, y como se puede observar, en los dendrogra-mas generados, la serie de entrenamiento, tanto de los compuestos activos, como inactivos, cumple una de las condiciones de optimización como es la va-riabilidad molecular de los compuestos químicos seleccionados

Inactivos Activos

11.- Ecuaciones de clasificación

Se exponen a continuación las ecuaciones de clasificación generadas para cada uno de los índices:

12.- Resultados

Los resultados obtenidos con las series muestran que, para la serie de

predicción, solo hay un fallo (clotrimazol), que representaría un porcentaje de acierto del 86,25% para los compuestos activos, y del 100% para los inactivos.

En cuanto a los parámetros estadísticos, obtenidos con cada uno de los índices, tanto estocásticos como no estocásticos y tanto basados en enlaces como en átomos, la exactitud supera en todos los casos el 80%, no llegando la falsa alarma al 15% en la serie de predicción en ninguno de ellos. Los mejores parámetros se obtuvieron con los índices bilineales no estocásticos en que la

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exactitud fue superior al 90%, y la falsa alarma, no superó el 10%. En general, se puede decir que los mejores resultados se obtuvieron con los modelos basa-dos en átomos, en comparación con los basados en enlaces.

Para corroborar todos estos resultados sobre nuevos compuestos de síntesis, y en una primera aproximación a estos métodos, se utilizaron 91 com-puestos para la realización de la serie de entrenamiento, y 22 para la serie de predicción, obteniéndose 12 modelos QSAR con un adecuado poder predictivo utilizando los índices cuadráticos, lineales y bilineales (tanto totales como loca-les) no estocásticos y estocásticos. Finalmente, esos modelos se utilizaron pa-ra estimar la actividad de 71 nuevos compuestos de síntesis, 174 con actividad frente a otros protozoos y 370 frente a otros usos farmacológicos. De ellos los 71 productos de síntesis mostraron una buena concordancia, entre el valor pre-dictivo “in silico” y los resultados experimentales “in vitro” obtenidos en el labo-ratorio. Además, 9 del resto de las moléculas que dieron resultados positivos “in silico” también mostraron actividad tricomonicida “in vitro”. Este mismo proceso se aplicó más tarde, en dos nuevas tesis doctorales a Plasmodium y Trypanosoma cruzi, con buenos resultados en exactitud de predicción. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA

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