NOVÉ POSTUPY V MEDICÍNĚ

Kurz lékařské biologie 190109

Nové technologie

• Klonování

• Kmenové buňky

• Genová terapie

K = výhonek

J.Petr 2004

KLONOVÁNÍ

• Vytvoření jednoho nebo mnoha geneticky identických jedinců využívající jedné somatické buňky mnohobuněčného organismu

• Klon je linie geneticky identických jedinců nebo buněk

• Klon je organismus geneticky identický s jiným organismem (lidově)

K = výhonek

J.Petr 2004

Vegetativní rozmnožování =přírodní klonování

             A

J.Petr 2004

Jednovaječní sourozenci

J.Petr 2004

Produkce identických dvojčat

J.Petr 2004

TOTIPOTENCE

Schopnost zachovávat potenciál zygoty k vytvoření

všech částí dospělého organismu

Totipotence

• Totipotence u rostlin

• Diferencované buňky zůstávají totipotentní

• Schopnost dediferenciace

• U živočichů se dosahuje genomické ekvivalence přenosem jader somatických buněk do neoplodněných vajíček nebo zygoty

Jaderné transplantace u živočichů I

• 1950s, Briggs, King, Gurdon, žabí model, jádra se diferenciací mění

• 1997, Wilmut, Dolly, genomický potenciál somatické buňky lze revertovat

• 1998, myš, dodnes 13 savčích druhů• Buňka dospělého savce může zopakovat

svůj vývoj od počátku a lze z ní vytvořit nového jedince

Přenos jaderEnukleace oocytuEnukleace oocytu

Přenos somatické buňky pod zonu cytoplastuPřenos somatické buňky pod zonu cytoplastu

J.Petr 2004

Jaderné transplantace u živočichů II

• Malá úspěšnost, důvodem může být nesprávná metylace embryonální DNA

• Syndrom náhlého úmrtí dospělých klonů, poruchy imunity, nadváha, deformace vnitřních orgánů, defekty placenty

• Klonování u primátů se nedaří, Makak rhesus, proteiny mitotického vřeténka (2000)

• Genetické a epigenetické faktory, imprinting genů

DefektyDefekty

J.Petr 2004

Klonování

• REPRODUKČNÍ• Výsledkem je

narození nového jedince

• LÉČEBNÉ• Výsledkem jsou

embryonální kmenové buňky, použité v budoucnu k léčbě např. chorob srdce, mozku i genetických chorob, organismus je nevnímá jako cizí

Léčebné klonování

• Lidské reprodukční klonování je neetické, ale může přinést prospěch

• Jak učinit léčebné klonování bezpečným?

• Neúspěch u makaka, nutné stadium blastocysty

• Fúze ESC s normálními buňkami, riziko nádorového onemocnění

Odběr buněk pokožkyOdběr buněk pokožky

Potřebuje srdeční Potřebuje srdeční svalovinusvalovinu

PacientPacient

Terapeutické klonování

J.Petr 2004

PokožkaPokožka OocytOocyt

J.Petr 2004

Embryonální Embryonální kmenové buňkykmenové buňky

J.Petr 2004

chrupavkachrupavkaSval Sval kosternkosterníí

LangerhansovLangerhansovy y ostrůvkyostrůvky

Srdeční Srdeční svalsval

ESCESCDiferenciaceDiferenciaceDiferenciaceDiferenciace

PacientPacientJ.Petr 2004

Soumrak klonování lidí?(Nature Rewiew Genetics)

Ian Wilmut: „Na současném stupni poznání jsou neodpovědným hazardem i pokusy s klonováním pro léčebné účely. “

Josef Fulka ml.: „Pokusů bylo provedeno žalostně málo.“

Klonování pomocí přenosu somatických jader je

neefektivní

Dokud nebudeme znát hlavní faktory, které je vymezují, jsou

snahy o klonování u lidí vědecky naivní a naprosto

neodpovědné

Pluripotentní kmenové buňky

Éra biologie kmenových buněk

Kmenové buňky jsou jediné buňky, které si zachovaly schopnost sebeobnovy a

diferenciace v alespoň jeden, často však v mnoho

buněčných typů.

Kmenové buňkyvlastnosti a příklady

• Přítomny v mnoha tkáních savců,• Zajišťují tkáňový repair a homeostázi,• Spermatogoniální kmenové buňky jsou

unipotentní, tvoří spermatozoa,• Hematopoetické kmenové buňky jsou

pluripotentní, tvoří erytrocyty a všechny typy bílých krvinek,

• Pluripotentní kmenové buňky dávají teoreticky vzniknout všem buněčným typům savčího organismu a jsou odvozeny z embryonálních tkání.

Pluripotentní kmenové buňky

• V kultuře se mohou neomezeně množit• Zachovávají stejný karyotyp• Jsou schopné vytvořit jakýkoliv buněčný

typ v lidském těle• Představují obrovský opravný zdroj

nemocných nebo poškozených tkání• Důležité pro poznání vývoje

embryonálního, fetálního a postnatálního

Typy embryonálních savčích pluripotentních kmenových

buněk

• Embryonální karcinomové buňky ECC

• Embryonální kmenové buňky ESC

• Embryonální zárodečné buňky EGC (primordial germ cells PGC, prvopohlavní buňky)

Jaká je skutečnost?

• Jaké jsou vlastnosti pluripotentních kmenových buněk (PSC)?

• Jak blízko jsme k použití PSC v klinice?

Původ a vlastnosti PSC

• První linie z teratokarcinomů (ECC)

• ESC jsou odvozeny z vnitřní buněčné masy (ICM) z preimplantovaných embryí ve stadiu blastocysty

• EGC jsou odvozeny z prekursorů gametických buněk

• Markery PSC (Oct4)

Kultivace PSC

• PSC se dělí symetricky, je známo doposud malo faktorů odpovědných za sebeobnovu PSC

• Kultivace na vrstvě fibroblastů (živná vrstva - feeder layer), diferenciaci-inhibující aktivita (DIA) faktoru LIF (cytokin)

• K izolaci kromě LIF nutný i ligand Kit a bFGF

Multipotentní kmenové buňky

• Počet derivátů je snížen

• Není třeba embryonální zdroj a jeho zničení

• „Dospělé“ kmenové buňky (orgánové kmenové buňky)

Kmenové buňky v klinice

• Úspěchy na živočišných modelech

• Terapie pomocí buněk u člověka

• Kultivace ve velkém množství

• Zatím málo použitelných linií

• Optimalizace kultivačních podmínek, pomoc genomiky

Bezpečnost terapie pomocí buněk

• 3 klíčové aspekty:

• Histokompatibilita

• Vedlejší nádorové onemocnění

• Asociace s infekčními agens v kultivačních mediích

Úvod do genové terapie

Léčebný postup nebo postup zmírňující projevy

genetické poruchy pomocí geneticky modifikovaných

buněk pacienta s terapeutickým přínosem pro

pacienta

2 x 2 základní strategie

• Reparace genů in situ - terapie genů

• Ektopická reparace – terapie geny

• GT somatická

• GT germinální

Přenos genetického materiálu (genů, genových segmentů, oligonukleotidů

• GENOVÁ TERAPIE IN VIVO (IN SITU)

• Genetický materiál je přenášen přímo do buněk pacienta

• GENOVÁ TERAPIE EX VIVO

• Buňky jsou odebrány z těla pacienta

• Genetická manipulace je provedena in vitro

• Buňky jsou transplantovány zpět do těla pacienta

Typy nemocí vhodných ke genové terapii

• Infekční choroby (virový nebo bakteriální patogen)

• Nádorová onemocnění (poruchy biologické funkce protoonkogenů, nádorových supresorových, apoptotických a opravných genů)

• Genetická onemocnění (genetická deficience genového produktu, nepřiměřená exprese genu)

• Poruchy imunitního systému (alergie, záněty a autoimunní choroby)

Strategie genové terapie

• KLASICKÁ GENOVÁ TERAPIE

• Optimální exprese vloženého genu

• Tvorba chybějícího produktu

• Přímá likvidace nemocných buněk

• Aktivace imunitního systému

• NEKLASICKÁ GENOVÁ TERAPIE

• Inhibice exprese patogenního genu

• Restaurace normální exprese

• siRNA

Podmínky zdařilé GT

• Ve správném čase, místě, množství a se stálým výsledkem EMIR (EST MODUS IN REBUS)

• Opravovaný gen nesmí být dominantní• Vysoká účinnost genového přenosu• Stálá integrace a exprese• Verifikace na savčích modelech• Bezpečnost manipulací, interference se

zárodečnými buňkami• Jen u vážných onemocnění• Etické posouzení protokolů

Transfer genů do buněk I

• Savčí virové vektory:

• Retrovirové vektory

• Adenovirové vektory

• Vektory viru herpes simplex

• Vektory adenoasociovaného

viru

5LTR 3LTRGag Pol Env

Proteiny core

Replikace/integrace

Obalové proteiny

Retrovirus

Signál obalování

5LTR 3LTRMarker Promotor Cizorodý gen

Identifikace/separace

Exprese genu

Opravný gen

Retrovirový vektor

Signál obalování

Transfer genů do buněk II

Nevirový přenos:

• Endocytóza mediovaná receptory

• Lipozómy

• Přímé injikování nebo

bombardování částicemi

Schválené protokoly

• Deficience adenosindeaminázy – první historicky úspěšný postup GT

• Familiální hypercholesterolemie, deficience LDLR – retrovirový transfer do hepatocytů

• Cystická fibróza – adenovirový transfer genu CFTR do epiteliálních buněk – aerosol

• DMD – chybí vhodný vektor

Etické aspekty GT

• Bezpečnost manipulací

• Ověření na savčích modelech

• Hierarchické schvalování protokolu

• Nebezpečí vedlejších účinků

• GT zárodečných buněk

• Perspektivy GT

Děkuji vám za pozornost a přeji úspěch u zkoušek.