nmr spektroskopie biologicky aktivních molekul - vscht.cz · strategie pro určování struktur...

NMR spektroskopie biologicky aktivních molekul

Jak vidí současné a budoucí uplatnění NMR spektroskopie profesor Richard Ernst.

J.W. Emsley:“NMR started as the plaything of the physicists, it became the favourite toy of the chemists and finally went on to seduce biochemists.”

MedicineBiochemistry

Chemistry

Physics

Nobel prize in chemistry 1991

Kurt WüthrichNobel Price Winner in Chemistry 2002

G. Wagner, K. Wüthrich. 1982. Sequential resonance assignments in protein 1Hnuclear magnetic resonance spectra. Basic pancreatic trypsin inhibitor.J. Mol. Biol. 155, 347-366.

1. Jaké typy biologický aktivních molekul ?

peptidy a proteiny

nukleové kyseliny

oligosacharidy

2. Jaký typ informace může být pomocí NMR získán?

identifikace substrátu

prostorová struktura molekuly

studium dynamického chování systému

prostorová struktura komplexu

zkoumání vazby ligandu a substrátu

První historicky dochované NMR spektrum proteinu.

Saunders M., Wishnia A. and Kirkwood J.G: J.Am.Chem.Soc. 79, 3289 (1957).

900 MHz 1H NMR spektrumlysozymu

900 MHz magnet firmy Bruker

900 MHz magnet firmy Varian

Strategie pro určování struktur biomolekul

Obecné informace o molekule (primární struktura, kovalentnívazby…)

NMR vzorek

NMR experimenty

NMR spektra Přiřazení signálů

Přiřazení experimentálních NMR parametrů (NOE…)

Odhad přibližné struktury

Oprava přiřazení NMR parametrů, signálů

Zhodnocení kvality struktur

Výpočet souboru struktur

Výpočet statistických údajůpro soubor konečných struktur

Výpočet NOESY spekterPorovnání s databázemi(Procheck, Whatif….)

Příprava vzorku proteinu pro NMR měření

1. Získání DNA proteinu

2. Příprava plasmidové DNA

3. Exprese rekombinantního proteinu v E.Coli

4. Izolace a čištění

5. Zakoncentrování vzorku

6. Testování vzorku na dlouhodobou stabilitu

7. Zopakování procesu s médiem obohaceným o izotopy 13C, 15N,případně i 2H

Vzorek pro NMR experimenty

Úspěšné řešení bezpodmínečněvyžaduje kvalitní spolupráci mezi NMR spektroskopiky a biochemiky !

rozpouštědlo H2O, resp. 90-95% H2O a 5-10% D2O

Vzorek musí zůstat aktivní a nedenaturovaný během NMR experimentů!

pH kompromis mezi minimalizací chemické výměny mezi signály labilních protonů a signálem vody a optimem pro studovaný protein (4.0 - 7.0)

pufr fosfátový pufr neobsahuje žádné protonyacetátový pufr (nutno připravit deuterovaný)

teplota podle požadavků studovaného materiálu (15 – 40°C)

aditiva nutná aditiva je možné zaměnit za deuterovaná analoga

koncentrace pro NMR experimenty musí být v rozsahu alespoň 0.5-2.0 mM, vzoreknesmí podléhat agregaci, koagulaci, sebezničení v tomto konc. rozmezí

stabilita nutná dlouhodobá stabilita v rozsahu minimálně několika týdnů

Srovnání sbalené a nesbalené struktury

10.5 10.0 9.5 9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 ppm

WVQPI 107 AA (12 kDa) IMMCS

WVQPI 107 AA (12 kDa) IMMCS

83 AA (9 kDa)

δ(1H)

správně sbalená forma proteinu nesbalená forma téhož proteinu

1H- 15N korelace v oblasti amidických vodíků (vzorek nespecificky obohacen 15N)

7.07.58.08.59.09.5 ppm

108

110

112

114

116

118

120

122

124

126

128

7.07.58.08.59.09.5 ppmδ(1H)

δ(15N)



NMR vzorek

NMR experimenty









Biomolekulární NMR spektroskopie: měřená jádra

vysoké přirozené zastoupení (99.98%)vysoká citlivost (1.00)malá disperze chemických posunů NMR signálů (~15.0 ppm)

velká disperze chemických posunů NMR signálů (~200.0 ppm)nízké přirozené zastoupení (1.108%), možné uměle navýšit až na 100%nízká citlivost (1.76x10-4), po 100%ním izotopovém obohacení(1.59x10-2)

menší počet atomů než 13Cstřední disperze chemických posunů NMR signálů (~30.0 ppm) (oproti 13C nezávislost na typu aminokyseliny)nízké přirozené zastoupení (0.37%), možné uměle navýšit až na 100%velmi nízká citlivost (3.85x10-6), po 100%ním izotopovém obohacení (1.04x10-3)

používá se pro speciální účely

1H

13C

15N

2H

Potlačení signálu vody

Signál H2O je 104-105 násobně intenzivnější než odezva měřené molekuly.

Metoda presaurace

Během relaxační doby ozařujeme signál vody slabým RF polem.

Proč H2O?1. Voda je fyziologické prostředí2. Nelze použít D2O z důvodů chemické výměny s amidickými protony.

CW -ozařování

90 deg

1H spektrum proteinu po presaturaci H2O

zbytkový signál H2O

WATERGATE: Metoda založena na selektivní manipulaci signálů vody a rozpuštěné látky spolu s gradientním echem.

90 deg

180 deg puls

τ τG1 G2

180 deg1H

G

Potlačení signálu vody: metoda WATERGATE



NMR vzorek

NMR experimenty









1D 1H spektrum proteinu

kuřecí lysozym

129 AA, Mw = 14.6 kDa

aromatic HNH-backbone

NH-SCCαH

aliphatic H

methyl H

Multidimensionální NMR spektroskopie jakonástroj pro zjednodušení spekter

3D

F1(1H)

1D

F2(X)2D

F2(1H)F1(1H/X) F1(1H/X)

F3(1H)

Lepší rozlišení je ve vícedimenzionálních spektrech zajištěno využitím izotopového obohacení 15N a 13C.

F3(X)4D

F2(X)

F1(1H)F4(1H)

Přiřazování rezonancí• NMR experimenty pro přiřazení signálů pracují se dvěma nebotřemi různými jádry najednou (experimenty s trojnásobnou rezonancí),tato jádra jsou navzájem zkorelována.

• Názvy takovýchto experimentů se tvoří podle typu jader, která korelují:

HNCA koreluje amidický vodík s příslušným dusíkem a uhlíkem vpozici α.

HN(CO)CA koreluje stejné typy atomů (jader) jako HNCA, ale přesCO. To naznačuje směr korelace, tj. H a N i-té aminokyseliny a Cα aminokyseliny v pozici i-1.

• Směr přenosu magnetizace je v případě těchto experimentůH N Cα a zpět. Experimenty se nazývají „out and back“

• Naproti tomu přenos magnetizace u experimentů např. CBCA(CO)NHzačíná na atomu CΒ (i-1) aminokyseliny a končí na amidickém Haminokyseliny následující, tj. experimenty „out and stay“.

Přiřazování rezonancí

13Cβ13Cβ

13Cγ

13C’ 15N

Hβ Hβ

Hα HαHN

13C’13Cα13Cα

55Hz 15Hz

90Hz

35Hz

7Hz<1Hz

130Hz

140Hz

35Hz

35Hz

11Hz 55Hz

HNCA experiment

aminokyselinový zbytek Iaminokyselinový zbytek I-1

HNCA experiment

Korelace ve spektru: HN

i - Ni - Cαi

HNi - Ni – Cα

i-1-1

x x φ2 x x x x x x

t2/2

1H

φ1 xφ4

xx

τ τ τ τδδt1/2 t1/2

x

t2/2

x

x x

acq t3

dec

φ4

15N

φ3

13Cα

13CO

vývojová periodapřenos magnetizace



NMR vzorek

NMR experimenty









Konstrukce multidimensionálních NMR spekter3D HNCA

F2(15N )

I

I-1

F1(13Cα)

F2(15N )

F1(13Cα)

F3(1HN)

F3(1HN)

Sekvenční přiřazení hlavního řetězce

HNCAHN(CO)CA

missing crosspík

Přiřazování rezonancí

13Cβ13Cβ

13Cγ

13C’ 15N

Hβ Hβ

Hα HαHN

13C’13Cα13Cα

55Hz 15Hz

90Hz

35Hz

7Hz<1Hz

130Hz

140Hz

35Hz

35Hz

11Hz 55Hz

HN(CO)CA experiment

Konstrukce multidimensionálních NMR spekter3D HNCA/HN(CO)CA

F3(1HN)

F2(15N )

F1(13C)

F2(15N )

I-1

F2(15N )

I

I-1

F1(13C)

F3(1HN)

Sekvenční přiřazení hlavního řetězce

HNCAHN(CO)CA

missing crosspík

Přiřazování rezonancí postranních řetězců

Cβ

C’ N

Hβ Hβ

HαHN

C’Cα

Hα

Cα

CγHγ Hγ

CβHβ Hβ

CγHγ Hγ

Přiřazování rezonancí postranních řetězců

ON

H

HH

H

H

H

H

OCH 3

αβγ

δ

Kompletní přiřazení Prolinu 4 proteázyM-PMV pomocí hCCH-COSY spektra

55 50 55 50

60

50

40

30

35 30 35 30 30 2565 60

60

50

40

30

ppm

ppm

Pro4CG-CD-HD2

Pro4CD-CD-HD2

Pro4CG-CD-HD3

Pro4CD-CD-HD3

Pro4CA-CB-HB2

Pro4CG-CB-HB2

Pro4CB-CB-HB2

Pro4CA-CB-HB3

Pro4CB-CB-HB3

Pro4CG-CB-HB3

Pro4CB-CG-HG

Pro4CD-CG-HG

Pro4CG-CG-HG

Pro4CB-CA-HA

Pro4CA-CA-HA

H : 4.296 ppmα H : 1.818 ppmβ2 H : 2.185 ppmβ3 H : 1.913 ppmγ H : 3.589 ppmδ2 H : 3.715 ppmδ3

δ(13

C)

δ(13C)

3D

F2(1H)

F1(13C)

F3(13C)

Práce s extra velkými molekulami Mw> 25 kDa

Práce s velkými molekulami způsobuje dvojí komplikaci

• velmi komplikovaná spektra

• rychlá spin-spinová relaxace

)](....'[8 6

22)(

cfsJrCH

CDH τγγ h=2R

γH/ γD ~ 6.6

Řešení: výměna atomů vodíku za deuterium

Práce s extra velkými molekulami Mw> 25 kDa

Exprese proteinu v růstovém médiu obohaceném o 13C/ 15N/ 2H

13Cβ13Cβ

13Cγ

13C’ 15N

Hβ Hβ

Hα HαHN

13C’13Cα13Cα

55Hz 15Hz

90Hz

35Hz

7Hz<1Hz

130Hz

140Hz

35Hz

35Hz

11Hz 55Hz

D D

DD

CD3 CD3

C D

Cα

D

CON

H

Teoreticky může být R2 snížen až 44 násobně, prakticky většinou maximálně 15x.

Fully protonated versus perdeuterated EIN protein

Fully protonated versus perdeuterated EIN protein

Missing crosspeaks are marked



NMR vzorek

NMR experimenty









Nukleární Overhauserův efekt

σIS - rychlost křížové relaxace, nárůstu NOEτc - korelační časrIS - meziatomová vzdálenostω - pracovní frekvence NMR spektrometru

HH

rIS < 5Ǻ

dipól - dipólováinterakce mezi atomy

62

422

416

104−

2 ⎥⎦

⎤⎢⎣

⎡−

+⎟⎠⎞

⎜⎝⎛= ISc

c

cIS rh τ

τωτγ

πµσ ο

6−

⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛=

cal

IS

cal

IS

rr

σσ { } 6−

⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛=

cal

IS

cal

I

rr

fSf

Poměr intenzit NOE efektů fI{S}/fcal je úměrný poměru vzdáleností příslušných atomů vodíku pouze pro velmi krátké časy!!!

Převod intenzity NOE krospíků na vzdálenost mezi atomy.

Dolní mez :1.8 ǺJedná se o součet vzdáleností van der Waalsovskýchpoloměrů dvou interagujících atomů vodíku

Horní mez :Nastavuje se podle intenzity příslušného krospíku. Pro větší molekuly se používá max. vzdálenost až 6 Å.

1.8 Ǻ ≤ r ≤ 2.5 Ǻ

1.8 Ǻ ≤ r ≤ 3.5 Ǻ

1.8 Ǻ ≤ r ≤ 5.0 Ǻ

Editovaná NOESY spektra4D 13C/ 15N-editované NOESY

1H1H

13C

15N

NOE1H 1H

15N 13CJHCJHN

15N= 106.4 ppm 15N= 106.4 ppm13C= 45.8 ppm

15N= 106.4 ppm13C= 56.1 ppm

G78HN-G78Hα G78HN-S77Hα

3D 15N-editované NOESY 4D 13C/15N-editované NOESY

Nepřímá spin-spinová interakční konstantaExperimentální omezení dihedrálních úhlů

Karplusova rovnice3J = A cos2Θ + Β cosΘ + C

Vztah mezi interakční konstantou a dihedrálními úhly peptidu

3J

H

O

O

N

Cα

CβC

C

ψ

φχ1

χ2

Cγ

H

H

H

ω

[Hz]-120 600 120

Θ deg

H-NCα-H

CO-NCα-H

H-NCα-CβH-NCα-CO

10

8

6

4

2

0

Typické hodnoty interakčních konstant 3JHH pro dihedrální úhel φ

α-helix φ ∼ − 60 deg

3 ≤ J ≤ 6 Hz

typické nastavení pro úhel φ:

−110 ≤ φ ≤ −10 deg

β-struktura skládanéholistu φ ∼ −120ο

6 ≤ J ≤ 9 Hz

typické nastavení pro úhel φ:

−170 ≤ φ ≤ −70 deg

Stereospecifické přiřazení diastereotopních atomů v CβH2 skupinách

- Jαβ coupling- HN-Hβ NOE

N

COHα

R

Hβ3

Hβ2

N

COHα

R

Hβ2 Hβ3

N

COHα

RHβ3

Hβ2

tg (g-) gg (g+)gt (t)

Jαβ = 9.5 cos2θ −1.6 cos θ +1.8

0 5 10 15

Jαβ2

0

180 (gt)

60 (gg) -60 (tg)

0

15

10

Jαβ

3 5

Vodíkové vazby

OC HN

Měření: - výměnné experimenty s D2O- teplotní závislost výměnitelných

protonů (NH, OH…)

NMR experimenty:- malé molekuly -COSY- velké molekuly - 1H-15N HSQC

Z NMR experimentů je možné získat pouze informaci o donoru!! Akceptory jsou většinou určeny až z molekulárního modelování a výpočtů!!

Vodíkové vazby v pravidelných strukturáchα-helix

β-sheet



NMR vzorek

NMR experimenty









Jak vše poskládat dohromady ????

Cray T3E

Info o kovalentnístruktuře

Omezení vzdáleností(NOEs)

Omezení dihedrálních úhlů(interakční konst.)

potkintot EEE +=

Výpočetní algoritmus: Molekulární mechanika

simulované žíhání s experimentálními omezeními (vzdálenosti,

dihedrální úhly…)

- molekula se ohřeje na vysokou teplotu (2000 – 50 000 K)

- pomalu se ochladí na teplotu blízkou nule

simulované žíhání v Kartézském prostoru (Newtonovy pohybové

rovnice)

simulované žíhání v prostoru torsních úhlů (Lagrangeovy rovnice)

Růstový modulátor Granulin 1eCyprinus carpio

Studium dynamických jevů proteinů pomocí NMR. Proč?

Molekuly nejsou statické, vykonávají pohyby v různých časových škálách.

Vypočtená statická struktura je často průměrem skutečných stavůmolekuly.

Funkce mnoha biologicky aktivních molekul závisína jejich flexibilitě.

V roztoku (fyziologické prostředí) podléhají biologicky aktivní molekuly přirozeným pohybům, které nejsou v krystalové mřížce patrné.

Výhoda NMR spektroskopie nad rentgenovou krystalografií.

Studium dynamických jevů proteinů pomocí NMRVztah relaxační rychlostí k molekulárním pohybům v různé časové škále:NMR parametr časová škála

podélná relaxace R1 1012 – 108 s-1

podélná relaxace běhemspin-locku R1ρ 106 – 103 s -1

příčná relaxace R2 103 – 10-3 s -1

Měřená jádra:

1H – téměř se neměří (obtížně definovatelné)

15N – dynamika páteře proteinu (dobře měřitelné, dobře definovatelné)

13C – dynamika postranních řetězců i páteře (obtížněji měřitelné, dobře definovatelné)

2H - měří se ve speciálních případech (CH3, obtížněji připravitelný vzorek, není jednoduché měřit, dobře definovatelné

Lipari-Szabóův přístupZpracování výsledků

Pro analýzu je nutný model pohybu molekuly jako celku a jejích částí.

Jeden z nejúspěšnějších je Lipari-Szabóův „bezmodelový“ přístup (“model-free“ approach)

Předpoklady Lipari-Szabóova modelu:

• relaxace je modulována dvěma pohyby: globálním a lokálním

• oba pohyby jsou statisticky nezávislé

• globální reorientace je izotropní

• molekulární pohyb je charakterizován parametry:

tM korelační čas globálního pohybu

S2 parametr uspořádanosti (hodnota 0 - 1)

te korelační čas lokálního pohybu

Rex rychlost chemické (konformační) výměny

Experimentální uspořádání

Relaxační parametry 15N:

Měřeny relaxační časy: spin-mřížka (podélná) T1spin-spin (příčná) T2krosrelaxační rychlost (NOE) 1H - 15N

Výsledky – parametr uspořádanosti a konformační výměna

Rex znamená příspěvek konformační výměny k relaxačnírychlosti 1/T2

1/T2* = 1/T2 + Rex

Interpretace výsledků měření dynamiky páteře HIV-1 PR

Aminokyselinové zbytky podléhající rychlým pohybům v pikosekundové časovéškále (1-100 ps) o velké amplitudě

Aminokyselinové zbytky podléhající pomalým pohybům (konformační výměny v mikro- až milisekundové časové škále.

HIV-1 proteáza M-PMV proteáza (12 kDa)

Problém: Vyskytuje se M-PMV PR též jako homodimer nebojen v monomerní formě?

Metoda řešení pomocí NMR: Studium dynamiky proteinu.

Srovnání relaxačních vlastností 15N proteáz HIV-1 a M-PMV

M-PMV protease (C7/A, D26/N, C106/A) HIV-1 protease

NOE

-1.5

-1

-0.5

0

0.5

1

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110

T2

00.050.1

0.150.2

0.250.3

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110

T1

00.20.40.60.8

11.2

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110

Závěr: U proteázy viru M-PMV chybí čtyřvláknový ß-sheet („ground floor“),který představuje hlavní stabilizační faktor homodimeru.M-PMV PR (12 kDa) se vyskytuje jako monomer.

HIV-1 protease with indicated “ground floor”

NN’C C’

nmr spektroskopie biologicky aktivních molekul - vscht.cz · strategie pro určování struktur...

Documents