Nghiên cứu biểu hiện, tinh chế và đánh giá khả

năng sinh đáp ứng miễn dịch của protein HA5.1 tái tổ hợp biểu hiện trong Escherichia coli

Trần Thị Nhài

Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên

Luận văn ThS chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm; Mã số: 60 42 30

Ngƣời hƣớng dẫn: GS.TS Trƣơng Nam Hải Năm bảo vệ: 2012

Abstract: Tổng quan về virus cúm và biểu hiện gen: cấu trúc và khả năng gây bệnh của

virus cúm; Cơ chế xâm nhiễm gây bệnh của virus cúm A trong tế bào vật chủ; Cấu trúc,

chức năng của HA và NA; Sự biến đổi kháng nguyên của virus cúm A; Vaccine phòng

cúm A/H5N1; Hệ biểu hiện E. coli; Chủng biểu hiện E. coli BL21; Vector biểu hiện

pET22b(+) mang gen trx mã hóa cho Thioredoxin. Trình bày các phƣơng pháp nghiên

cứu biểu hiện, tinh chế và đánh giá khả năng sinh đáp ứng miễn dịch của protein HA5-1

tái tổ hợp biểu hiệu trong Escherichia Coli. Đƣa ra kết quả và thảo luận: thiết kế vector

biểu hiện PET22TRXHA5-1; biểu hiện GEN HA5-1 trong chúng vi khuẩn E. COLI

BL21; lựa chọn điều kiện biểu hiện protein tái tổ hợp TRXHA5-1 trong E. COLI; tinh

chế sơ bộ protein tái tổ hợp TRXHA5-1; kiểm tra tính sinh đáp ứng miễn dịch của protein

tái tổ hợp HA5-1

Keywords: Miễn dịch; Virus cúm; Protein tái tổ hợp; Sinh học

Content

MỞ ĐẦU

Cúm gia cầm thể độc lực cao (Highly Pathogenic Avian Influenza - HPAI) dovirus cúm

A/H5N1 gây ra là bệnh truyền nhiễm cấp tính có tốc độ lây lan nhanh với tỷ lệ gây chết cao

trong đàn gia cầm bị bệnh.

Virus cúm A/H5N1 là một phân type trong nhóm virus cúm A thuộc họ

Orthomyxoviridae, có protein Hemagglutinin (HA) và Neuraminidase (NA) trên bề mặt

capsid của hạt virus mang tính kháng nguyên tham gia quá trình đáp ứng miễn dịch. Kháng

nguyên HA có 16 type (ký hiệu từ H1 đến H16) và kháng nguyên NA có 9 type (ký hiệu từ N1

đến N9).

Tính đến năm 2011 dịch cúm A/H5N1 đã xuất hiện ở hơn 50 quốc gia khác nhau ở châu Á,

châu Âu, châu Phi và có nguy cơ lan rộng khắp thế giới. Theo thông báo của WHO, tính đến

tháng 01/2012 đã có tới 583 trƣờng hợp mắc cúm A/H5N1, trong đó 344 trƣờng hợp tử vong,

120 triệu gia cầm chết do nhiễm virus hoặc bị tiêu hủy. Virus lây lan nhanh và có độc lực rất cao

ở các vật chủ khác nhau.

Tại Việt Nam, dịch cúm gia cầm do virus cumsA/H5N1 bắt đầu xuất hiện từ những

tháng cuối năm 2003 đầu năm 2004 và đã nhanh chóng lan rộng ở hầu hết các địa phƣơng trong

cả nƣớc. Hàng chục triệu gia cầm và thuỷ cầm đã bị chết hoặc bị tiêu huỷ gây thiệt hại kinh tế

nặng nề cho ngành chăn nuôi.

Tiêm vaccine phòng virus cúm A/H5N1 cho gia cầm đƣợc coi là một cách phòng chống hiệu

quả, đỡ tốn kém và không ảnh hƣởng nguy hại tới môi trƣờng.

Xuất phát từ cơ sở khoa học và nhu cầu thực tế trên, chúng tôi đã tiến hành đề tài:

“Nghiên cứu biểu hiện, tinh chế và đánh giá khả năng sinh đáp ứng miễn dịch của

protein HA5-1 tái tổ hợp biểu hiện trong Escherichia coli”

Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tổng quan chung về virus cúm

1.1.1. Một số đặc điểm vê câu truc của virus cúm

Đặc tính cấu trúc chung của tất cả 4 nhóm virus trong họ Orthomyxoviridae là hệ gen của

chúng chỉ chứa duy nhất ribonucleic acid (RNA) sợi đơn âm, ký hiệu là ss(-) RNA.

Các hạt virus cúm A (virion) có hình cầu hoặc hình khối đa diện, đƣờng kính 80 -120 nm,

đôi khi cũng có dạng hình sợi, khối lƣợng phân tử khoảng 250 triệu Da.

Vo virus với bản chất là protein có nguôn gốc từ màng tế bào nhiễm đã đƣợc đặc hiệu

hóa để gắn protein màng của virus vào , bao gôm môt sô protein đƣơc glycosyl hoa va môt sô

protein dang trân không đƣơc glycosyl hoa .

Hình 1.1. Ảnh chụp kính hiển vi điện tử (A), mô hình (B) và phức hợp ribonucleoprotein RNP

(C) của virus cúm A. A: Các dạng hình thái khác nhau của virus cúm A dƣới kính hiển vi điện

tử; B: Mô hình cấu tạo hạt virus cúm A; C: Cấu trúc của phức hợp ribonucleoprotein RNP

(Nguồn: © Paul Digard, Dept Pathology, University of Cambridge).

Hệ gen của virus cúm A đƣợc cấu tạo từ 8 đoạn đoạn riêng biệt (HA, NA, M, NS, NP, PA,

PB1 và PB2) nối với nhau thành một sợi duy nhất bên trong vo virus, mã hóa cho 11 protein tƣơng

ứng của virus, trong đó phân đoạn M mã hóa cho 2 protein là M1 và M2; phân đoạn NS mã hóa cho

2 protein là NS1 và NS2, phân đoạn PB1 mã hóa cho 2 protein là PB1 và PB1-F2.

1.1.2 Cơ chế xâm nhiễm gây bệnh của virus cúm A trong tế bào vật chủ

Quá trình xâm nhiễm của virus cúm A đƣợc mở đầu bằng sự kết hợp của HA và thụ thể

thích ứng của nó trên bề mặt các tế bào biểu mô và cuối cùng là giải phóng hệ gen của virus vào

trong bào tƣơng của tế bào nhiễm (Hình 1.2).

Hình 1.2: Mô hình cơ chế xâm nhiễm và nhân lên của virus cúm A ở tế bào chủ

1.1.3 Cấu trúc, chức năng của HA và NA

Protein HA (hemagglutinin)

Protein hemagglutinin là một glycoprotein thuộc protein màng type I (lectin), có khả năng

gây ngƣng kết hông cầu gà trong ống nghiệm, kháng thể đặc hiệu với HA có thể phong toa sự

ngƣng kết đó, đƣợc gọi là kháng thể ngăn trở ngƣng kết hông cầu (HI- Hemagglutinin Inhibitory

antibody).

Protein NA (neuraminidase)

Protein neuraminidase còn gọi là sialidase có bản chất là glycoprotein đƣợc gắn trên bề mặt

capsid của virus cúm A, mang tính kháng nguyên đặc trƣng theo từng phân type NA.

Protein NA có vai trò là một enzyme cắt đứt liên kết giữa gốc sialic acid của màng tế bào

nhiễm với phân tử cacbonhydrate của protein HA trong quá trình giải phóng hạt virus mới khoi

tế bào nhiễm và ngăn cản sự tập hợp của các hạt virus mới trên màng tế bào.

1.1.4 Sự biến đổi kháng nguyên của virus cúm A

Do kháng nguyên HA và NA của virus thƣờng xuyên biến đổi mà bệnh cúm rất khó kiểm

soát.

Có hai phƣơng thức chủ yếu làm biến đổi kháng nguyên ở virus cúm A

Hiện tượng lệch kháng nguyên

Lệch kháng nguyên (antigenic drift) thực chất là các đột biến điểm xảy ra các phân đoạn gen/hệ

gen của virus do virus cúm A không có cơ chế “đọc và sửa bản sao - proof reading” trong quá trình

phiên mã và sao chép ở nhân tế bào đích.

Hiện tượng trộn kháng nguyên

Hiện tƣợng trộn kháng nguyên (còn gọi là trao đổi hay tái tổ hợp) giữa các gen kháng

nguyên của virus cúm với gen khác ở một số rất ít virus RNA gây bệnh gia cầm khác, cho phép

virus có khả năng biến chủng rất cao.

1.1.5 Vaccine phòng cúm A/H5N1

Đối với bệnh truyền nhiễm, vaccine đƣợc coi là biện pháp có tính chiến lƣợc, nhằm ngăn

chặn lây lan, tạo bảo hộ miễn dịch.

Hiện nay có 3 loại vaccine đƣợc bán và sử dụng rộng rãi tại Việt Nam là: Vaccine vô hoạt

nhũ dầu H5N2 (Trung Quốc: đây là loại vaccine dị chủng; vaccine vô hoạt nhũ dầu H5N1 (Trung

Quốc): là loại vaccine đông chủng; vaccine vô hoạt Nobilis Influenza H5 (Hà lan): là loại

vaccine dị chủng.

Hiện có 3 cơ sở đang nghiên cứu thử nghiệm loại vaccine virus phòng bệnh cúm gia cầm

H5N1 cho cả ngƣời và gia cầm nhƣ:

+ Công ty Vắc xin và sinh phẩm số 1 (VABIOTECH) của Viện Vệ sinh & Dịch tễ Trung

Ƣơng;

+ Viện Pasteur TP.HCM,

+ Viện Vaccine & Chế phẩm sinh học Nha Trang.

1.2 BIỂU HIỆN GEN

1.2.1 Hệ biểu hiện E. coli

Việc sử dụng rộng E. coli dựa vào những ƣu điểm nổi bật là: thao tác trên vật liệu di truyền

dễ, có thể biểu hiện các protein ngoại lai lên đến 50% protein tổng của tế bào, biểu hiện lƣợng lớn

protein ngoại lai khi tốc độ tăng trƣởng của tế bào cao và mật độ tế bào đủ lớn, môi trƣờng nuôi cấy

đơn giản và rẻ.

1.2.2 Chủng biểu hiện E. coli BL21

Chủng biểu hiện E. coli BL21, gen lon protease (một protease nội bào) và ompT protease (một

protease định khu ở màng ngoài) đã bị đột biến. Vì vậy, protein ngoại lai sẽ ít bị phân cắt bởi

protease của tế bào chủ.

1.2.3 Vector biểu hiện pET22b(+) mang gen trx mã hóa cho Thioredoxin

+ Gen ngoại lai đƣợc điều khiển bởi promotor T7

+Phiên mã đƣợc điều khiển bởi lac operator, có cơ chế cảm ứng IPTG.

+ Sau vùng đa nối có đoạn trình tự mã hóa cho 6 aa Histidin

Ngoài ra Thioredoxin đƣợc biết:

+ Nhƣ là tá chất làm tăng tính sinh miễn dịch của kháng nguyên khi gây miễn dịch cho gia

cầm.

+ Giúp cho protein ngoại lai tránh bị phân cắt bởi protease

+ Hình thành cấu trúc bậc 3 chính xác hơn

Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. VẬT LIỆU

2.1.1 Các chủng sinh vật và plasmid

- Chủng vi khuẩn E. coli DH5α đƣợc sử dụng để tách dòng gen trxha5-1;Chủng vi khuẩn

E. coli BL21 đƣợc sử dụng để biểu hiện gen ha5-1; Plasmid pET22b(+)mang gen trx; Plasmid

pCR2.1 mang gen ha5-1 (pCRha5-l).

2.1.2 Hóa chất và enzym

* Hóa chất:

SDS, Tris-HCl, EDTA (Serva, Đức); X-Gal (Sigma, Mỹ); phenol, metanol isoamylalcohol,

EtBr, glyxerol, IPTG, etanol, chloroform (Roth, Đức); agan (Fluka, Đức); d-NTP (Promega, Mỹ);

ampicillin (Merk, Đức); agaroza (Gibco, Mỹ); MgS04 (BioLabs, Anh).

* Enzyme

Các enzyme hạn chế (BioLab, Anh); Taq-DNA polymeraza (BioLabs, Anh); rionucleaza

(Sigma, Mỹ); phosphataza kiềm, T4-DNA ligaza (BioLabs, Anh).

2.1.3 Máy móc và thiết bị

Máy PCR (MJ Research, Mỹ); máy ly tâm lạnh (Sorvall RC5B, Mỹ); máy ổn nhiệt (Mỹ); máy

điện di, máy xác định DNA trên gel agaroza (Bio-Rad, Mỹ); máy lắc ổn nhiệt (New Jersey, Mỹ);

máy ly tâm Eppendorf; Bộ tinh sạch DNA từ gel agarose.

2.1.4 Môi trƣờng nuôi cấy

2.1.4.1 Môi trƣờng và dung dịch sử dụng trong biến nạp DNA plasmid vào tế bào E. coli DH5α

2.1.4.2 Các dung dịch đƣợc sử dụng trong tách chiết DNA plasmid từ tế bào E. coli DH5α

2.1.4.3 Các dung dịch đƣợc sử dụng trong điện di DNA trên gel agarose

2.1.4.4 Các dung dịch dùng trong điện di trên gel polyacrylamide-SDS

2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Xử lý cắt DNA plasmid bằng enzym cắt giới hạn

2.2.2 Phản ứng ghép nối gen ngoại lai vào plasmid

2.2.3 Biến nạp sản phẩm ghép gen vào tế bào E. coli DH5α bằng phƣơng pháp sốc nhiệt

2.2.4 Tách chiết plasmid DNA từ tế bào E. coli

2.2.5 Điện di DNA trên gel agarose

2.2.6 Thu nhận băng DNA từ gel agarose

2.2.7 Điện di protein trên gel polyacrylamide

2.2.8 Biểu hiện protein tái tổ hợp

2.2.9 Tinh sạch sơ bộ protein tái tổ hợp bằng dung dịch đệm urê

2.2.10 Kiểm tra tính kháng nguyên của TrxHA5-1

2.2.11 Kiểm tra khả năng sinh đáp ứng miễn dịch trên gà

2.2.11.1 Gây miễn dịch và thu huyết thanh gà

2.2.11.2 Phản ứng ngăn trở ngƣng kết hông cầu (HI)

Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN PET22TRXHA5-1

3.1.1. Chuyển gen ha5-1 vào vector biểu hiện pET22trx

Thu nhận đoạn gen ha5-1 từ plasmid pCRha5-1 và mở vòng vector pET22Trx bằng cặp

enzym cắt giới hạn NcoI và BamHI. Sau đó nối đoạn gen ha5-1 vào vactor biểu hiện pET22Trx

để tạo nên vector tái tổ hợp pETTrxha5-1.

Kết quả trên điện di đô cho thấy cả 4 dòng plasmid đƣợc tách chiết (1,2,3,4) đều là dòng

plasmid tái tổ hợp pET22Trxha5-1 và có kích thƣớc lớn hơn kích thƣớc vector pEt22Trx.

3.1.2. Kiểm tra plasmid tái tổ hợp pET22trxha5-l bằng enzyme cắt giới hạn

Cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng cặp enzyme cắt giới hạn NcoI và BamHI. Vector

pET22trx cũng đƣợc xử lý bằng cặp enzyme này để làm đối chứng.

Trên các đƣờng chạy từ số 2 đến số 5 tƣơng ứng với sản phẩm cắt của dòng plasmid tái tổ

Hình 3.2: Phân tích sản phẩm tách chiết DNA plasmid trên gel agarose 0,8%.

1-4: Plasmid tai tô hơp pET22Trxha1; 5: Plasmid đôi chƣng (pET22Trx)

pET22Trxha5-1

1 2 3 4 5

pET22Trx

5.9 kb

pET22Trx

Ha5-1 1 kb

1 2 3 4 5 M

Hình 3.3: Phân tích sản phẩm cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp (pET22Trxha5-1)

bằng enzym cắt giới hạn NcoI và BamHI . 1: plasmid pET22Trx (Đối chứng) ; 2-

5: các dòng plasmid tái tổ hợp; M: Thang ADN chuẩn 1Kb (Fermentas).

hợp xuất hiện hai băng DNA có kích thƣớc tƣơng ứng khoảng 1 kb và 5,9 kb. Dòng đối chứng

khi cắt bằng 2 enzyme chỉ tạo ra đoạn DNA có kích thƣớc tƣơng đƣơng 5,9 kb đúng nhƣ tính

toán lý thuyết

3.2. BIỂU HIỆN GEN HA5-1 TRONG CHỦNG VI KHUẨN E. COLI BL21

Tế bào vi khuẩn E.coli mang plasmid tth đƣợc nuôi cấy cảm ứng với nông độ IPTG

0,5mM ở 37oC. Kết quả phân tích protein tổng số của tế bào E. coli tái tổ hợp cho thấy, ở đƣờng

chạy số 3 protein TrxHA5-1 đã đƣợc biểu hiện với kích thƣớc khoảng 57,5 kDa đúng nhƣ dự

đoán. Dòng đối chứng là chủng E. coli BL21 mang vector pET22Trx cũng tổng hợp ra protein

Trx có kích thƣớc 22 kDa.

3.3. LỰA CHỌN ĐIỀU KIỆN BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP TRXHA5-1 TRONG

E. COLI

3.3.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến sự biểu hiện của gen ha5-l

Chúng tôi tiến hành nuôi cấy cảm ứng ở nhiệt độ 22°C, 28°C, 30°C, 37°C và thu mẫu sau 4

giờ nuôi cấy cảm ứng.

Hình 3.6: Protein tổng số từ chủng tái tổ hợp E. coli BL21 mang vector

pET22Trxha5-1 đƣợc cảm ứng bằng 0,5 mM IPTG ở các nhiệt độ khác nhau; 1-4 :

Nhiệt độ cảm ứng tƣơng ứng 22oC, 28oC, 30oC, 37oC; 5:Thang protein chuẩn

kDa

116

66

45

35

25

18.4

14.4

1 2 3 4 5

TrxHA5-1

Hình 3.4: Protein tổng số từ các chủng tái tổ hợp E. coli BL21; 1: Thang Protein chuẩn (Fermentas); 2: E. coli BL21 mang vector

pET22Trx; 3: E. coli BL21 mang vector pET22Trxha5-1

TrxHA5-1

Trx

1 2 3 kDa

116

66

45

35

25

18.4

14,4

3.3.2. Ảnh hƣởng của nồng độ IPTG đến sự biểu hiện của gen ha5-l

Khảo sát khả năng biểu hiện của protein TrxHA5-l ở nồng độ IPTG khác nhau (0,1;

0,5; 1,0; 1,5; và 2 mM).

Nhƣ vậy để đảm bảo thu đƣợc lƣợng lớn protein, đông thời tiết kiệm chi phí sản xuất chúng

tôi lựa chọn nông độ IPTG là 0,5 mM để biểu hiện protein tái tổ hợp.

3.3.3. Lựa chọn thời điểm thu mẫu thích hợp

Thu tế bào theo thời gian để kiểm tra lƣợng TrxHA5-1.

Hình 3.8: Protein tổng số từ chủng E.coli BL21 mang vector

pET22Trxha5-1 đƣợc cảm ứng bằng 0,5 mM IPTG ở các thời gian thu

mẫu khác nhau; 1-5 : Thời gian thu mẫu 1, 2, 3, 4, 5 giờ; 6: Thang protein chuẩn

Hình 3.7: Protein tổng số từ chủng E. coli BL21 mang vector pET22Trxha5-1 đƣợc

cảm ứng ở các nông độ IPTG khác nhau; 1-5 : Nông độ chất cảm ứng IPTG tƣơng ứng 0,1mM, 0,5mM, 1 mM, 1,5 mM: 2 mM; 6: Thang protein chuẩn

kDa

116

66

45

35

25

18.4

14.4

TrxHA5-1

1 2 3 4 5

6

TrxHA5-1

1 2 3 4 5 6 kDa

116

66

45

35

25

18.4

14.4

Kết quả (Hình 3.8) cho thấy lƣợng protein thu đƣợc cao nhất sau 4 giờ nuôi cấy cảm ứng .

3.4 TINH CHẾ SƠ BỘ PROTEIN TÁI TỔ HỢP TRXHA5-1

Kết quả (Hình 3.9, đƣờng chạy 3) cho thấy protein tái tổ hợp thu đƣợc sau khi loại bo pha tan là

khá sạch, đƣợc thể hiện một băng protein có kích thƣớc khoảng 57,5 kDa khá đậm và sạch hơn

rất nhiều so với protein ban đầu.

Đối với protein tái tổ hợp sử dụng trong vaccine, một điểm rất quan trọng là phải có

tính kháng nguyên giống với tính kháng nguyên của protein tự nhiên. Vì lý do này, protein

sau khi tinh chế sẽ đƣợc tiến hành thử khả năng đáp ứng đặc hiệu với kháng thể kháng virus

cúm A/H5N1 thu đƣợc từ tho bằng kỹ thuật Western blot.

Trên hình 3.10 (B) thấy đƣờng chạy số 3 là protein tổng số tách chiết từ chủng vi khuẩn

E. coli BL21 mang vector pET22trx không mang gen ha5-l, không thấy sự xuất hiện của băng

Hình 3.9: Điện di kiểm tra Trxha5-1 tinh chế trên gel polyacrylamide; 1-

Protein tổng số E. coli BL21 mang plasmid pETT22Trxha5-1;2-Thang

protein chuẩn; 3: phân đoạn chứa Trx-HA5-1 hòa tan trong urê 2 M.

kDa

116

66

45

35

25

18.4

14.4

1 2 3

TrxHA5-1

A

B Hình 3.10: Kiểm tra tính kháng nguyên của protein TrxHA5-1 tái tổ

hợp; (A) Phân tích protein trên gel điện di polyacrylamide; (B): Phân tích khả năng bắt cặp đặc hiệu của kháng nguyên tái tổ hợp với kháng

thể kháng lại HA5 của virus cúm A/H5N1; 1- phân đoạn chứa TrxHA5-

1 sau khi tinh chế; 2 - Thang protein chuẩn; 3 - Protein tổng số E. coli

BL21 mang plasmid pETT22Trx.

1 2 3

TrxHA5-1

kDa

116

66

45

35

25

18.4

14.4

1 2 3

TrxHA5-1

kDa

116

66

35

25

18.4

14.4

màu có kích thƣớc tƣơng ứng với gen TrxHA5-l. Trong khi đó trên đƣờng chạy số 1 xuất hiện

băng protein rất rõ nét, kích thƣớc khoảng 57,5 kDa có khả năng kết hợp đặc hiệu với kháng thể

kháng virus cúm A/H5N1. Điều đó chứng to kháng nguyên tái tổ hợp TrxHA5-l đƣợc tổng hợp

trong E. coli với trình tự amino acid chính xác chứa các quyết định kháng nguyên nằm trên tiểu

phần ha5-1.

3.5 KIỂM TRA TÍNH SINH ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH CỦA PROTEIN TÁI TỔ HỢP HA5-

1

Protein TrxHA5-1 sau khi tinh chế đƣợc trộn với tá chất Freund dùng để tiêm, tá chất Cbt

dùng để nho mũi (gà 2 tuần tuổi). Lƣợng kháng nguyên TrxHA5-1 sử dụng để tiêm và nho mũi

là 100 µg. Sau khi gây miễn dịch lần 1 đƣợc 14 ngày, gà đƣợc gây miễn dịch lần 2. Huyết thanh

của gà sau khi tiêm và nho mũi, mắt đƣợc thu lại sau mỗi tuần trong 5 tuần.

Kết quả trên hình 3.11 cho thấy, ở lô đƣợc gây miễn dịch với PBS đã không tạo kháng

thể kháng lại TrxHA5-1, lô gà gây miễn dịch với chủng đối chứng, hiệu giá HI ở mức thấp

Hiệu giá kháng thể của gà đƣợc tiêm và nho mắt, mũi với TrxHA5-1 tăng dần từ tuần thứ

1 đến tuần thứ 4 và đạt giá trị lớn nhất sau 3, 4 tuần, sang tuần thứ 5 hiệu giá kháng thể ở lô tiêm

giảm xuống rất nhanh trong khi ở lô nho mắt, mũi hiệu giá có xu hƣớng giảm nhƣng vẫn duy trì

ở mức cao hơn so với lô tiêm. Nhƣ vậy, sơ bộ có thể thấy độ dài miễn dịch của kháng nguyên

đƣợc đƣa vào bằng đƣờng nho mắt, mũi tốt hơn là bằng đƣờng tiêm.

KẾT LUẬN

Với các kết quả thu đƣợc ở trên, chúng tôi đi đến một số kết luận sau:

PBS Dịch lên men TrxHA5-1, tiêm TrxHA5-1, nhỏ

chủng đối chứng mắt, mũi

Hình 3.11: Khả năng sinh đáp ứng miễn dịch của TrxHA5-1 trên gà

- Protein tái tổ hợp TrxHA5-l đƣợc biểu hiện tốt trong tế bào E. coli BL21 dƣới sự điều kiến

của promoter T7 và chất cảm ứng IPTG có trong môi trƣờng.

- Protein tái tổ hợp TrxHA5-l đƣợc tổng hợp tốt nhất ở điều kiện lên men là 30°C, 0,5 mM

IPTG và thời gian thu mẫu sau khi cảm ứng là 4 giờ.

- Protein tái tổ hợp TrxHA5-l đã đƣợc tinh chế thành công bằng siêu âm và hòa tủa trong urê

2 M.

- Protein tái tổ hợp đảm bảo tính kháng nguyên và tính sinh miễn dịch trên gà. Tuy nhiên

hiệu giá kháng thể thu đƣợc sau khi gây miễn dịch với liều 100 g TrxHA5-1 còn thấp. Hiệu giá

tối đa thu đƣợc khi gây miễn dịch bằng đƣờng tiêm là 2,7 log2, gây miễn dịch qua đƣờng nho

mắt, mũi là 2,2 log 2.

ĐỊNH HƢỚNG NGHIÊN CỨU

Nghiên cứu liều vaccine thích hợp để thu đƣợc đáp ứng miễn dịch cao trên gà với hiệu

giá HI ngang bằng với vaccine thƣơng phẩm.

References

Tiếng Việt

1. Lê Thanh Hòa, Đinh Duy Kháng, Phan Văn Chi, Nông Văn Hải, Trƣơng Nam Hải, Nguyễn

Thị Bích Nga và Lê Trần Bình (2006), “Molecular characterization of the H5 gene for the

highly pathogenic A/H5N1 strains isolated in Vietnam during”, 68-71. Proceedings of

International Workshop on Biotechnology in Agriculture (20.10.2006). Nong Lam

University Ho Chi Minh City.

Tiếng Anh

2. Aoki F.Y., Boivin G., Roberts N. (2007), “Influenza virus susceptibility and resistance to

oseltamivir”, Antivir Ther 12(4B), PP. 603-616, Review.

3. Baigent S. J., McCauley J. W. (2001), “Glycosylation of haemagglutinin and stalk-length of

neuraminidase combine to regulate the growth of avian influenza viruses in tissue culture”,

Virus Res 79(1-2), PP 177-185.

4. Basler C. F. (2007), “Influenza viruses: basic biology and potential drug targets”, Infect

Disord Drug Targets 7(4), PP 282-293, Review.

5. Bender C., Hall H., Huang J., Klimov A., Cox N., Hay A., Gregory V., Cameron K., Lim W.

and Subbarao K. (1999), “Characterization of the surface proteins of influenza A (H5N1)

viruses isolated from humans in 1997 – 1998”, Virology 254, pp 115-123.

6. Bosch F. X., Garten W., Klenk H. D., Rott R. (1981), “Proteolytic cleavage of influenza virus

hemagglutinins; primary structure of the connecting peptide between HA1 and HA2

determines proteolytic cleavability and pathogenicity of avian influenza viruses”, Virology

113, pp 725-735.

7. Bublot M., Pritchard N., Swayne D. E., Selleck P., Karaca K., Suarez D. L., Audonnet J.

C., Mickle T. R. (2006), “Development and use of fowlpox vectored vaccines for avian

influenza”. Ann N Y Acad Sci, pp 193-201.

8. Castrucci M. R., Kawaoka Y. (1993), “Biologic importance of neuraminidase stalk length in

influenza A virus”, J Virol67, pp 759-764.

9. Chen H., Deng G., Li Z., Tian G., Li Y., Jiao P. (2004), “The evolution of H5N1 influenza

viruses in ducks in southern China”, Proc Natl Acad Sci USA 101, pp 10452-10457.

10. Chen L. M., Davis C. T., Zhou H., Cox N. J., Donis R. O. (2008), “Genetic compatibility and

virulence of reassortants derived from contemporary avian H5N1 and human H3N2

influenza A viruses”. PLoS Pathog 4(5), e1000072.

11. Conenello G.M., Zamarin D., Perrone L.A., Tumpey T., Palese P. (2007), “A single mutation

in the PB1-F2 of H5N1 (HK/97) and 1918 influenza A viruses contributes to increased

virulence”, PLoS Pathog 3(10), pp 1414-1421.

12. Doherty P. C., Turner S. J., Webby R. G., Thomas P. G. (2006), “Influenza and the

challenge for immunology”, Nat Immunol 7(5), pp 449-55, Review.

13. Ellebedy A. H., Webby R.J. (2009), Influenza vaccines, Vaccine 27, D65-D68.

14. Fouchier R. A., Smith D. J. (2010), “Use of antigenic cartography in vaccine seed strain

selection”, Avian diseases, PP 220-223.

15.Glick B.R. and Pasternak J.J. (2003), Molecular Biotechnology, ASM Press, Washington DC.

16. Hilleman M. (2002), “Realities and enigmas of human viral influenza: pathogenesis,

epidemiology and control”, Vaccine 20 (25-26), PP 3068-3087.

17. Horimoto T., Kawaoka Y. (2001) “Pandemic threat posed by avian influenza A viruses”,

Clin Microbiol Rev 14(1), PP 129-149.

18. Ito T., Couceiro J. N., Kelm S., Baum L. G., Krauss S., Castrucci M. R., Donatelli I., Kida

H., Paulson J. C., Webster R. G. and Kawaoka Y. (1998), “Molecular basis for the

generation in pigs of influenza A viruses with pandemic potential”, J Virol 72, PP 7367-

7373.

19. Kamp B. S., Hoffmann C., Preiser W. (2006), Influenza report .

20. Kash J.C., Goodman A.G., Korth M.J., Katze M.G. (2006), “Hijacking of the host-cell

response and translational control during influenza virus infection”, Virus Res 119(1), PP

111-120, Review.

21. Keawcharoen J., Amonsin A., Oraveerakul K., Wattanodorn S., Papravasit T., Karnda S.,

Lekakul K., Pattanarangsan R., Noppornpanth S., Fouchier R. A., Osterhaus A. D.,

Payungporn S., Theamboonlers A. and Poovorawan Y. (2005), “Characterization of the

hemagglutinin and neuraminidase genes of recent influenza virus isolates from different

avian species in Thailand”, Acta Virol 49(4), PP 277-280.

22. Li S., Liu C., Klimov A., Perdue M. L., Mo D., Ji Y, Woods L., Hietala S., Bryant M. (1999),

"Recombinant influenza A virus vaccines for the pathogenic human A/Hong Kong/97

(H5N1) viruses", Infect Dis 179, PP 55-60.

23. Macken C.A., Webby R.J., Bruno W.J. (2006), “Genotype turnover by reassortment of

replication complex genes from avian influenza A virus”, J Gen Virol 87(10), PP 2803-

2815.

24. Matrosovich M., Zhou N., Kawaoka Y., Webster R. (1999), “The surface glycoproteins of

H5 influenza viruses isolated from humans, chickens, and wild aquatic birds have

distinguishable properties”, J Virol 73, PP 1146-1155.

25. Murphy B. R., Webster R. G. (1996), Orthomyxoviruses, In Fields BN, Knipe DM, Howley

PM, (eds.), Fields Virology, 3rd ed, Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, PP 1397-

1445.

26. Nayak D., Hui E., Barman S. (2004), “Assembly and budding of influenza virus”, Virus Res

106(2), PP 147-165.

27. Neumann G., Hatta M., Kawaoka Y. (2003), “Reverse genetics for the control of avian

influenza”, Avian disease 47, PP 882-887.

28. Nicholson K. G., Wood J. M., Zambon M. (2003), “Influenza”. Lancet 362 (93970), PP

1733-1745.

29. OIE - World organisation for animal health (2005), “Avian influenza. Manual of diagnostic

test and vaccines for terrestrial animals.

30. Robertson B. H., Bhown A.S., Compans R.W., and Bennett J. C. (1979), “Structure of the

membrane protein of influenza virus. Isolation and characterization of cyanogens bromide

cleavage products”, J Viro, 30(3), PP 759-766.

31. Suarez D. L., Schultz-Cherry S. (2000), “Immunology of avian influenza virus”, Dev Comp

Immunol 24, PP 269-283.

32. Subbarao K., Luke C. (2007), “H5N1 viruses and vaccines”. PLoS Pathog 3(3): e40, Review.

33. Suzuki Y. (2005), “Sialobiology of influenza: molecular mechanism of host range variation of

influenza viruses”. Biol Pharm Bull 28(3), PP 399-408, Review.

34. Treanor J.J., Campbell J.D., Zangwill K.M., Rowe Thomas and Wolff Mark (2006), “Safety

and Immunogenicity of anInactivated Subvirion Influenza A (H5N1) Vaccine” ,NEJM, PP

1343-1351.

35. Uiprasertkul M., Kitphati R., Puthavathana P., Kriwong R., Kongchanagul A., Ungchusak

K., Angkasekwinai S., Chokephaibulkit K., Srisook K., Vanprapar N, Auewarakul P.

(2007), “Apoptosis and pathogenesis of avian influenza A (H5N1) virus in humans”,

Emerg Infect Dis 13(5), PP 708-712.

36. Wagner R., Matrosovich M., Klenk H. (2002), “Functional balance between

haemagglutinin and neuraminidase in influenza virus infections”, Med Virol 12(3), PP

159-166.

37. Weber T. P., Stilianakis N. I. (2007), “Ecologic immunology of avian influenza (H5N1) in

migratory birds”, Emerg Infect Dis 13(8), PP 1139-1143, Review.

38. Webster R. G. (1998), “Influenza: an emerging disease”, Emerg Infect Dis 4, PP 436-

441.

39. Webster R.G., Guan Y., Peiris M., Walker D., Krauss S., Zhou N. N., Govorkova E. A., Ellis

T. M., Dyrting K. C., Sit T., Perez D.R., Shortridge K.F. (2002), “Characterization of

H5N1 influenza viruses that continue to circulate in geese in southeastern China”, J Virol

76(1), PP 118-126.

40. Weiss R.A. (2003), Cross-species infections. Curr Top Microbiol Immunol 278, PP 47-

71.

41. WHO (2005), “Avian influenza A (H5N1) infection in humans”, NEJM, 1374

42. Wu C., Cheng X., He J., Wang J., Deng R., Long Q., Wang X. (2008), “A multiplex real-

time RT-PCR for detection and identification of influenza virus types A and B and

subtypes H5 and N1”, J Virol Methods 148(1-2), PP 81-88.

43. Yamada S., Suzuki Y., Suzuki T., Le M. Q., Nidom C. A., Sakai-Tagawa Y., Muramoto Y.,

Ito M., Kiso M., Horimoto T., Shinya K., Sawada T., Kiso M., Usui T., Murata T., Lin Y.,

Hay A., Haire L. F., Stevens D. J., Russell R. J., Gamblin S. J., Skehel J. J., Kawaoka Y.

(2006), “Haemagglutinin mutations responsible for the binding of H5N1 influenza A

viruses to human-type receptors”, Nature 444(7117), PP 378-382.

44. Zhou J. J., Fu J., Fang D. Y., Yan H. J., Tian J., Zhou J. M., Tao J. P., Liang Y., Jiang L. F.

(2007), “Molecular characterization of the surface glycoprotein genes of an H5N1

influenza virus isolated from a human in Guangdong, China”, Arch Virol 152(8), 1515-

1521.