Neproteinski duikovi spojevi

Dr.sc. eljka VogrincKliniki zavod za laboratorijsku

dijagnostiku KBC Zagreb

Neproteinski duikovi spojevi (NPN) Niskomolekularni spojevi s duikom koji nastaju u

tijelu kao produkt razliitih metabolikih pregradnji proteina

Najvei dio NPN ine: Ureja Kreatinin Mokrana kiselina (urati) Amonijak

Izluuju se iz tijela najvie bubrezima (glomerularnom filtracijom) - mjerenje u krvi i urinu se koristi kao indikator bubrene funkcije

Ureja Glavni metaboliki produkt razgradnje

proteina i aminokiselina Oko 75% neproteinskog duika se iz

organizma izluuje u obliku ureje Sinteza u jetri urea ciklus

Uklanjanje toksinog amonijaka nastalog katabolizmom AK

Uklanjanje iz organizma: Bubrezi oko 90% - urin GIT Koa

Biljeg bubree funkcije

NH4+ + HCO3- + Aspartat + 3ATP + H2O Urea + Fumarat + 2ADP + AMP 2Pi + PPi

Ureja i bubrena funkcija Filtracija u glomerulima, ne reapsorbira se niti se dodatno stvara Porast koncentracije ureje u krvi u razliitim bubrenim bolestima:

Akutni i kronini glomerulonefritis ili pijelonefritis Nefroskleroza ...

Porast koncentracije ureje u krvi proporcionalan je oteenju bubrega Uremija ( ureja u krvi): akutna i kronina insuficijencija bubrega

Na koncentraciju ureje u krvi utjeu jo i: Prehrana (proteinska dijeta - ureje u krvi!) Pojaana razgradnja proteina Terapija (kortikosteroidi!) Dehidracija Srane bolesti...

Metode odreivanja ureje1. Reakcija ureje s -diketonima

- Nedovoljno specifina metoda, potrebna prethodna deproteinizacija seruma, reagens je nestabilan... - zastarjelo, nije za rutinsku uporabu

2. Odreivanje amonijaka nakon hidrolize ureje s ureazom(npr. Berthelotova reakcija)- metode s ureazom specifine; razliite modifikacije

3. Odreivanje ureje pomou ion-selektivnih elektroda (ISE)- selektivne metode za odreivanje amonijaka koji nastaje iz urejedjelovanjem ureaze s ISE membrane

4. Enzimsko odreivanje osloboenog amonijaka nakon hidrolize s ureazom (optiki test)- visoko specifina metoda na principu optikog testa referentna metoda- naelo mjerenja: djelovanjem ureaze ureja se hidrolizira, a nastali amonijak reagira uz katalitiko djelovanje glutamat-dehidrogenaze (GLDH) s 2-oksoglutaratom i NADH. Smanjenje apsorbancije do kojeg dolazi proporcionalno je koncentraciji duika iz ureje u uzorku

Referentne vrijednosti za ureju Serum/plazma:

2,8-8,3 mmol/L Mokraa (24-satni uzorak)

430-710 mmol/dU Predanalitika:

Stabilnost ureje u uzorku: +4-25C do 7 dana-20C do 1 god.

Kreatinin Nastaje spontanom razgradnjom

iz kreatina i kreatin fosfata kao nusprodukt miinog metabolizma

Dnevna pregradnja: oko 2% kreatina

Koncentracija u krvi je proporcionalna miinoj masi u fiziolokim uvjetima konstantna koncentracija u krvi iz dana u dan

Uklanjanje iz organizma: Bubrezi

Kompletno se filtrira u glomerulima, ne reapsorbira se, a dodatno se vrlo malo secernira u tubulima

Biljeg bubrene funkcije

Kreatinin kao biljeg bubrene funkcije Kompletno se filtrira u

bubregu endogeni biljeg glomerularne filtracije (GFR)

Pouzdan za praenje GFR kod bolesnika s kroninom bubrenom boleu

Mjerenje u krvi jednostavno, brzo i jeftino

Zlatni standard

Klirens testovi

Razliita stanja utjeu na koncentraciju u krvi, neovisno o funkciji bubrega

Velike inter- i intraindividualne razlike dob, spol, ishrana, fizika

aktivnost... Bubreni tubuli secerniraju

dodatno malu koliinu kreatinina

U akutnim stanjima(gubitak miine mase, ok, parenteralna prehrana, terapija...) -koncentracija u krvi jako varira

Kasni biljeg bubrenog oteenja: porast koncentracije u serumu nekoliko dana nakon poetka bolesti gubitak i do 50% bubrene funkcije

Kreatinin kao biljeg bubrene funkcije

KREATININ NIJE IDEALNI BILJEG!

Metode odreivanja kreatinina:

Kolorimetrijska metoda (Jaff, 1886.god.) kreatinin + pikrinska kiselina alkalni pH naranasto-uto

obojeni kompleks Intenzitet obojenja proporcionalan je koncentraciji

kreatinina u uzorku Razliite modifikacije metode Jednostavna i dostupna, automatiziranaNEDOSTACI: Velik utjecaj interferirajuih supstanci Interferencije:

Pseudokromogeni iz plazme (proteini, glukoza, ketoni...): lano poviene vrijednosti KN

Hiperbilirubinemija: lano sniene vrijednosti KN

Enzimske metode

Kreatinin se uz kreatininazu, kretinazu i sarkozin oksidazu prevodi u glicin, formaldehid i H2O2:

Intenzitet obojenja direktno je proporcionalan koncentraciji kreatinina u uzorku i mjeri se fotometrijski

Metoda je specifinija od kolorimetrijske; manje interferencija Bolja korelacija rezultata s HPLC metodom Tonija procjena GFR mogua primjena empirijskih formula

HPLC Referentna metoda Nije za rutinski rad

creatinine + H2O creatininase creatinecreatine + H2O creatinase sarcosine + ureasarcosine + O2 + H2O sarcosine oxidase glycine + formaldehyde + H2O2H2O2 + aminophenazone/HTIB POD chromogen + H2O

Standardizacija mjerenja kreatinina

Standardizacija mjerenja: uvoenje kompenzacijeu kolorimetrijske metode matematika korekcija kojom se smanjuje utjecaj proteina na reakciju (najee od -18 do -26 mol/L)

Standardizacijom se osiguravaju jednaki rezultati pretrage iz razliitih laboratorija osiguravanje sljedivosti u procjeni GFR Doziranje terapije, praenje bolesnika s KBB ...

Od 2009. standardizacija mjerenja je obaveza za sve proizvoae IVD testova za kreatinin (sve metode!) pripravak humanog serumskog referentnog materijala za kreatinin - NIST SRM

967 ; IDMS (kalibratori!) Standardizacija mjerenja: uvoenje kompenzacije matematika

korekcija kojom se smanjuje utjecaj proteina na reakciju (najee od -18 do -26 mol/L)

Visok analitiki bias izmeu pojedinih metoda velike razlike u rezultatima kreatinina izmeu laboratorija

Referentne vrijednosti za kreatinin Ovisne o dobi i spolu Serum/plazma (odrasli):

M: 64-104 mol/L : 49-90 mol/L

Mokraa (24-satni uzorak): M: 7,1-17,1 mmol/L :9,7-17,7 mmol/L

Omjer koncentracije ureja/kreatinin: kriterij za razlikovanje prerenalne od renalne bolesti konc. ureje u odnosu na KN je znak prerenalne

bolesti (zastoj rada srca, pojaan katabolizam proteina i dr.)

Mokrana kiselina Krajnji metaboliki

produkt razgradnje nukleinskih kiselina (purinskih baza) u organizmu Egzogeni i endogeni

purini Egzogeni purini:

uneeni hranom (meso!) koncentracija u krvi

ovisna o prehrani

Biosinteza i razgradnja purina:

Krv: 134-403 mol/L Urin (75%): 1,48-4,43 mmol/LStolica (25%)

Homeostaza mokrane kiseline (urata)

Mokrana kiselina (urati) u krvi Na koncentraciju u krvi utjeu:

Spol (vie vrijednosti kod mukaraca) Dob (najvee vrijednosti kod novoroenadi) Genetski imbenici ivotni uvjeti (prehrana)

Uklanjanje iz cirkulacije : Bubrezi (oko 75%)

Filtracija u glomerulima, reapsorpcija u proksimalnim tubulima, aktivno izluivanje u distalnim tubulima

Crijeva (oko 25%) Crijevne bakterije - razgradnja

Dijagnostiko znaenje Poveana koncentracija mokrane kiseline (urata) u krvi

(hiperuricemija) moe biti posljedica: Pojaane sinteze purina Poveanog unosa purina hranom (meso) Pojaane razgradnje purina Smanjenog izluivanja bubrezima

Primarna i sekundarna hiperuricemija: Primarna zbog poremeaja u kontrolnom mehanizmu povratne

sprege u sintezi i razgradnji Sekundarna zbog ubrzanog metabolizma purina

najee u zloudnim bolestima ali i u infekcijama, psorijazi i dr.

Sniena koncentracija urata u krvi Nasljedne metabolike bolesti Lijekovi (aspirin)

Najei uzroci hiperuricemije: Bolesti bubrega

Akutne i kronine bolesti bubrena insuficijencija

Giht (ulog) Odlaganje urata u zglobove zbog prekomjerne

sinteze purina (primarna hiperuricemija!) Kristali urata u zglobnoj tekuini

Nasljedni poremeaji Lesh-Nyhanov sindrom

Metode odreivanja urata Dvije skupine spektrometrijskih metoda: REDUKTIVNE I ENZIMSKE Reduktivne metode

Princip: mokrana kiselina se s fosfovolframatom oksidira u alantoin pri emu se fosfovolframat reducira u plavo obojeni spoj

Nedovoljno specifine Enzimske metode

Princip: mokrana kiselina se oksidira djelovanjem enzima urikaze u alantoin pri emu nastaje vodikov peroksid (H2O2) koji se mjeri u UV podruju (340-380 nm) direktno ili razliitim pomonim reakcijama s kromogenom

Preporuena metoda: spektrofotometrijska UV metoda s urikazom

Referentne vrijednosti za urate (odrasli >20 god.) Serum/plazma:

M: 182-403 mol/L : 134-337 mol/L

Mokraa (24-satni uzorak): M, : 1,48-4,43 mmol/dU

Amonijak NH3 Nastaje deaminacijom

aminokiselina najveim dijelom u probavnom traktu djelovanjem bakterijskih enzima (proteaze, ureaze i aminooksidaze)

Ostala mjesta stvaranja: Bubreg, mozak, miii

Brzo uklanjanje iz organizma zbog velike toksinosti amonijaka:

utjecaj na acidobazinu ravnoteu

direktna oteenja mozga (koma!)...

HIPERAMONIJEMIJA !!

Uklanjanje amonijaka iz organizma: Jetra

uklanja najvei dio stvorenog amonijaka

Ureja ciklusom se amonijak prevodi u ureju

Mozak, miii Vezivanjem za

glutaminsku kiselinu i stvaranjem glutamina

Bubreg Izluivanje mokraom

UREJA CIKLUS

DIJAGNOSTIKA BOLESTI JETRE

Metode odreivanja amonijaka u plazmi Vanost predanalitike:

Amonijak se poveava u krvi i nakon vaenja (enzimska pregradnja se nastavlja i in vitro, u epruveti)

Krv odmah nakon vaenja staviti na led (-20C) Metode odreivanja (NH3 ili NH4+)

Direktno, enzimsko mjerenje preporuene metode Indirektno mjerenje

titracijom nakon eluiranja amonijaka iz plazme Kolorimetrijski nakon vezivanja za ionske izmjenjivae...

Enzimska UV metoda s -ketoglutaratom i glutamat dehidrogenazom (GLD)

Naelo mjerenja: amonijak reagira s -ketoglutaratom i NADPH u prisutnosti GLD (katalizator) pri emu nastaje glutamat i NADP+. Koncentracija stvorenog NADP+ je direktno proporcionalna koncentraciji amonijaka u uzorku. Mjeri se pad apsorpcije svjetlosti na 340 nm

Rutinski u laboratoriju!

Referentne vrijednosti za amonijak: Ovisne o dobi djeca imaju vie vrijednosti

Plazma (odrasli): M: 14,7-55,3 mmol/L : 11,2-48,2 mmol/L

Hiperamonijemija ( NH3): Teka oteenja jetre, hepatika koma Teka krvarenja iz GIT Nasljedni metaboliki poremeaji