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Mukusinteraktion von Magnetit beladenen

kolloidalen Wirkstoffträgern

Dissertation

zur Erlangung des Grades des Doktors der Naturwissenschaften

der Naturwissenschaftlich-Technischen Fakultät

der Universität des Saarlandes

von

Carolin Thum

Saarbrücken

2017

Tag des Kolloquiums: 26.01.2018

Dekan: Prof. Dr. Guido Kickelbick

Berichterstatter: Prof. Dr. Marc Schneider

Prof. Dr. Guido Kickelbick

Vorsitz: Prof. Dr. Claus-Michael Lehr

Akad. Mitarbeiter: Dr. Stefan Boettcher

Die vorliegende Arbeit entstand in der Zeit von Juli 2013 bis Juli 2017 am Institut für Phar-

mazeutische Technologie und Biopharmazie der Philipps-Universität Marburg sowie dem

Institut für Biopharmazie und Pharmazeutische Technologie der Universität des Saarlandes in

der Arbeitsgruppe und unter Leitung von Herrn Prof. Dr. Marc Schneider.

Meiner Familie mit großem Dank gewidmet

„Damit das Mögliche entsteht, muss immer wieder das Unmögliche versucht werden.“

Hermann Hesse

I

Danksagung

An erster Stelle möchte ich mich bei meinem Doktorvater Herrn Prof. Dr. Marc Schneider für

die interessante und zugleich herausfordernde Themenstellung sowie die engagierte Betreu-

ung dieser Arbeit bedanken. Neben den konstruktiven Diskussionen, Anregungen und Moti-

vation, schätze ich besonders die Freiräume, die er mir bei der Ausgestaltung der Arbeit ent-

gegenbrachte. Auch für die Unterstützung bei der Anfertigung wissenschaftlicher Publikatio-

nen sowie der Möglichkeit meine Arbeit auf internationalen Tagungen zu präsentieren und

dabei neue Kontakte knüpfen zu können danke ich ihm sehr.

Des Weiteren danke ich Herrn Prof. Dr. Guido Kickelbick für die freundliche Übernahme des

Zweitgutachtens sowie den weiteren Mitgliedern der Prüfungskommission.

Ein besonderer Dank gilt all meinen Kollegen und Freunden der Schneider-Gruppe sowie den

ehemaligen Kollegen aus der Marburgerzeit. Die angenehme, kollegiale und konstruktive

Arbeitsatmosphäre ist einfach top gewesen. Ohne Euch, sowohl in fachlichen Fragen, als auch

abseits des Instituts wäre diese Arbeit nicht möglich gewesen. Die Zeit mit Euch war einfach

super! Besonders erwähnt seien hier Agnes Weiß und Nashrawan Lababidi, meine beiden

Büro-Leidensgenossen, die immer ein offenes Ohr hatten und mich bei dem einen oder ande-

ren Forschungsrückschlag wieder motivierten. Ebenso möchte ich Aljoscha Könneke und

Marcel Pourasghar für ihre stetige Unterstützung und Hilfsbereitschaft danken. Danke insbe-

sondere für die Hilfe mit den REM-Aufnahmen, bei diversen PC-Problemchen und so man-

cher Chemie- und „Apothekerfrage“. Dr. Sarah Barthold danke ich für die sehr gute Zusam-

menarbeit bei der Durchführung der Studentenpraktika. Dr. Daniel Primaveßy möchte ich für

die Synthese und Zurverfügungstellung des Rhodamin B markierten PLGA danken. Nazende

Günday Türeli danke ich für die Synthese und Zurverfügungstellung des Ciprofloxacin-SDS-

Komplexes sowie der Weitergabe der entwickelten und validierten HPLC-Methode zur Quan-

tifizierung dieses Komplexes. Dr. Afra Torge danke ich für die Einweisung und die Etablie-

rung der besagten HPLC-Methode in unsere Laboratorien. Dear Dr. Chen Shi, thank you so

much for the good teamwork, especially regarding our paper.

Ein großer Dank geht auch an die Techniker Peter Meiers und Marijas Jurisic. Egal ob

CLSM-Fragen oder mal wieder ein Set-up Problem für das man wieder was aus dem Bau-

markt oder Handwerkskoffer braucht – Ihr habt mir immer geholfen. Vielen lieben Dank da-

für! Frau Isabelle Conrad-Kehl danke ich für ihre Hilfe bei den zahlreichen Verwaltungsauf-

gaben und für das gelegentliche Mitbringen ihrer berühmt-berüchtigten Tarte au Chocolat –

unglaublich lecker!

II

Darüber hinaus möchte ich mich bei den verschiedenen Arbeitsgruppen und Institutionen, mit

denen ich im Laufe meiner Doktorarbeit zusammengearbeitet habe, für die gute und konstruk-

tive Kooperation bedanken.

Der Arbeitsgruppe Biophotonik an der Philipps-Universität Marburg, unter der Leitung von

Herrn Prof. Dr. Wolfgang Parak, möchte ich an dieser Stelle für die Synthese und Zurverfü-

gungstellung der Magnetit-NP sowie deren quantitative Analyse mittels ICP-MS danken. Be-

sonders erwähnt seien hier Qian Zhang für die Partikelsynthese, Karsten Kantner für die Ana-

lytik sowie Dr. Beatriz Pelaz für die Zusammenarbeit im Rahmen der gemeinsamen Publika-

tion.

Ebenso möchte ich mich ganz herzlich bei Sandra Schäfer und dem Leiter der Anorganischen

Festkörperchemie an der Universität des Saarlandes, Herrn Prof. Dr. Kickelbick, für die Syn-

these und Zurverfügungstellung der Magnetit-NP bedanken.

Bei Frau Dr. Claudia Fink-Straube, Leiterin der Chemischen Analytik am INM, möchte ich

mich für die quantitative Eisenbestimmung unter Verwendung der HR-CS-AAS bedanken.

Herrn Dr. Andreas Schaper, Leiter des Labors für Elektronenmikroskopie und Mikroanalyse

am Zentrum für Materialwissenschaften der Philipps-Universität Marburg, sowie Herrn Mi-

chael Hellwig danke ich für die Einweisung und Hilfe am TEM. Ebenso danke ich Herrn Jörg

Schmauch für die Einweisung zur Nutzung des TEM an der Universität des Saarlandes.

Frau Johanna Nothacker, Doktorandin der Arbeitsgruppe von Frau Prof. Dr. Annette M.

Schmidt am Institut für Physikalische Chemie der Universität zu Köln, danke ich für die

VSM-Messungen.

Bei der Glasbläserwerkstatt der Universität des Saarlandes bzw. bei Herrn Günther Berlin

möchte ich mich für die Anfertigung der von mir konstruierten Vakuumkammer bedanken.

Der Pferdeklinik Altforweiler danke ich für die Zurverfügungstellung der Mukusproben.

An dieser Stelle möchte ich auch meinen ehemaligen Studenten Bianca Haase, Paula Wei-

mann, Nico Strack sowie meinem ehemaligen Diplomanten Aljoscha Könneke recht herzlich

für ihre experimentellen Arbeiten im Labor danken. Ich hoffe, ich konnte euch das wissen-

schaftliche Arbeiten etwas näher bringen und ihr hattet bei der Laborarbeit auch Spaß!

Meinen Eltern, meiner Schwester, meinem Onkel und natürlich meiner Omi danke ich von

ganzem Herzen für die bedingungslose Unterstützung, die immer offenen Ohren und die Mo-

tivation über die gesamte Zeit meiner akademischen Ausbildung. Mir ist bewusst, dass das

nicht selbstverständlich ist und ich mich glücklich schätzen kann, solch eine Familie zu ha-

ben. Meinem Freund Daniel danke ich zu tiefst für die Geduld und Motivation in den letzten

Monaten, auch wenn es nicht immer einfach war.

Ihr alle habt maßgeblich zum erfolgreichen Beenden dieser Arbeit beigetragen.

Vielen lieben Dank!

III

Abkürzungsverzeichnis

ASL airway surface liquid

Bq. Bezugsquelle

CCD charge-coupled device

CFTR cystic fibrosis transmembrane conductance regulator

Cipro Ciprofloxacin

CLSM confocal laser scanning microscopy

COPD chronic obstructive pulmonary disease

DLS dynamische Lichtstreuung

DMSO Dimethylsulfoxid

DNS Desoxyribonukleinsäure

FDA Food and Drug Administration

HCl Chlorwasserstoff

HEC Hydroxyethylcellulose

HF Hochfrequenz

HPLC high pressure liquid chromatography

HR-CS-AAS high-resolution continuum source atomic absorption spectrometry

ICP-MS inductively coupled plasma mass spectrometry

IH induktive Heizbedingungen

LM Lösemittel

NAC N-Acetylcystein

NAL Nacystelyn

NP Nanopartikel

P. aeruginosa Pseudomonas aeruginosa

PCL periciliary liquid layer

PCS Photonenkorrelationsspektroskopie

PDI Polydispersitätsindex

IV

PEG Polyethylenglycol

PLGA Poly(lactic-co-glycolic acid)

PVA Polyvinylalkohol

REM Rasterelektronenmikroskopie

RhoB Rhodamin B

RP-HPLC reversed-phase high pressure liquid chromatography

RT Raumtemperatur

SAR specific absorption rate

Sdp. Siedepunkt

SDS Natriumdodecylsulfat

SEDDS self-emulsifying drug delivery systems

SPIONs Superparamagnetische Eisenoxidnanopartikel

TEM Transmissionselektronenmikroskopie

VSM vibrating sample magnetometer

XRD X-ray diffraction

ZF Zystische Fibrose

V

Inhaltsverzeichnis

Danksagung ................................................................................................................................I

Abkürzungsverzeichnis ......................................................................................................... III

Inhaltsverzeichnis .................................................................................................................... V

Kurzzusammenfassung ........................................................................................................ VII

Abstract ................................................................................................................................VIII

1 Einleitung und Zielsetzung ........................................................................................ 1

1.1 Pulmonale Arzneistoffapplikation ................................................................................ 3

1.1.1 Anatomie und Physiologie der menschlichen Lunge ................................................... 3

1.1.2 Reinigungsmechanismen der Lunge - mukoziliäre Clearance im Fokus ..................... 4

1.1.3 Die Lunge als Applikationsort: Potential und Anforderungen ..................................... 9

1.2 Pulmonaler Wirkstofftransport ................................................................................... 12

1.2.1 Moderne Wirkstoffträgersysteme für die pulmonale Applikation ............................. 12

1.2.2 Aktuelle Überwindungsansätze der Mukusbarriere ................................................... 14

1.3 Magnetische Nanopartikel .......................................................................................... 16

1.3.1 Magnetische Nanopartikel: Begriffsklärungen und Eigenschaften ............................ 16

1.3.2 Superparamagnetische Eisenoxidpartikel: Magnetit im Fokus .................................. 20

1.3.3 SPIONs im pharmazeutisch-medizinischen Anwendungskontext ............................. 22

1.4 Zielsetzung der Arbeit und Vorgehensweise.............................................................. 23

2 Material und Methoden ........................................................................................... 26

2.1 Verwendete Materialien ............................................................................................. 26

2.1.1 Chemikalien................................................................................................................ 26

2.1.2 Geräte und Verbrauchsmaterialien ............................................................................. 28

2.1.3 Biologisches Material ................................................................................................. 29

2.2 Charakterisierungsmethoden ...................................................................................... 29

2.2.1 Dynamische Lichtstreuung ......................................................................................... 30

2.2.2 Transmissionselektronenmikroskopie ........................................................................ 30

2.2.3 Rasterelektronenmikroskopie ..................................................................................... 32

2.2.4 Vibrationsmagnetometer ............................................................................................ 33

2.2.5 Induktiv gekoppelte Plasma-Massenspektrometrie .................................................... 34

2.2.6 Hochauflösende Kontinuumstrahler-Atomabsorptionsspektrometrie ........................ 34

2.2.7 Hochdruckflüssigkeitschromatographie ..................................................................... 35

2.3 Experimentelle Methoden .......................................................................................... 36

2.3.1 Herstellung magnetischer Nanokomposite ................................................................. 36

VI

2.3.1.1 Nanopräzipitation: Kurzvorstellung der Herstellungsmethode .................................. 36

2.3.1.2 Herstellung von Magnetit-PLGA-Nanopartikeln ....................................................... 37

2.3.1.3 Herstellung von fluoreszierenden Magnetit-PLGA-Nanopartikeln ............................ 39

2.3.1.4 Herstellung von Cipro co-beladenen Magnetit-PLGA-Nanopartikeln ....................... 39

2.3.1.5 Aufreinigung, Trocknung und Aufkonzentrierung der Partikel ................................. 40

2.3.1.6 Berechnung der Kennzahlen, Beladung und Einkapselungseffizienz ........................ 41

2.3.2 Induktives Heizen magnetischer Nanokomposite ....................................................... 42

2.3.2.1 Etablierung eines Setups zum induktiven Heizen ....................................................... 42

2.3.2.2 Identifikation von Einfluss- und geeigneten Heizparametern .................................... 45

2.3.2.3 Induktionserwärmung magnetischer Nanokomposite ................................................ 46

2.3.3 Induktionserwärmung und Partikelmigrationsverhalten in Mukus ............................ 47

2.3.3.1 Etablierung eines Setups zur Untersuchung der Partikelmigration ............................ 47

2.3.3.2 Einfluss von Wärme auf die Partikelpenetration in HEC und Mukus ........................ 50

2.3.3.3 Partikelpenetration unter induktiven Heizbedingungen ............................................. 51

3 Ergebnisse und Diskussion ....................................................................................... 52

3.1 Herstellung von magnetischen Nanokompositen ....................................................... 52

3.1.1 Magnetit-PLGA-Nanopartikel .................................................................................... 52

3.1.2 Magnetit-Rhodamin B PLGA-Nanopartikel ............................................................... 58

3.1.3 Co-Verkapselung von Ciprofloxacin .......................................................................... 59

3.2 Induktives Heizen magnetischer Nanopartikel ........................................................... 63

3.2.1 Vorversuche zur Etablierung eines Setups zum induktiven Heizen ........................... 63

3.2.2 Evaluierung von Heizverhalten beeinflussender Parametern ..................................... 65

3.2.2.1 Einfluss der Konzentration an Magnetit-NP ............................................................... 65

3.2.2.2 Einfluss der Heizleistung ............................................................................................ 68

3.2.3 Heizverhalten von Magnetit-PLGA-Nanopartikel ...................................................... 70

3.2.4 Heizverhalten von Magnetit-RhoBPLGA-Nanopartikel ............................................ 72

3.3 Induktives Heizen zur Verbesserung der Mukuspenetration ...................................... 73

3.3.1 Einfluss einer Gesamterwärmung auf die Partikelpenetration im Modellgel ............. 73

3.3.2 Einfluss einer Gesamterwärmung auf die Partikelpenetration im Mukus .................. 75

3.3.3 Einfluss der Wärmeinduktion auf die Partikelmigration in HEC/ Mukus .................. 78

4 Zusammenfassung und Ausblick ............................................................................. 81

Literaturverzeichnis................................................................................................................ 87

Publikationen und Tagungsbeiträge ..................................................................................... 98

VII

Kurzzusammenfassung

Die pulmonale Wirkstoffapplikation gewinnt zunehmend an Bedeutung. Die Mukusbarriere,

eine der wichtigsten nicht-zellulären Barrieren, limitiert jedoch eine effiziente Pharmakothe-

rapie. Der viskose Schleim überzieht das Lungenepithel und fängt inhalierte Fremdpartikel

ab, die dann abtransportiert werden. Diesem Schicksal unterliegen auch inhalierte Arznei-

stoffpartikel. Die Arbeit setzt an dieser Problematik an. Der vorgestellte Ansatz sieht eine

wärmeinduzierte Penetrationsverbesserung dieser Barriere vor. Die intendierte Erwärmung

soll lokal und induktiv über ein sich im externen Wechselmagnetfeld aufheizendes Wirkstoff-

trägersystem erfolgen. Ein solches System konnte auf Basis von PLGA und Magnetit entwi-

ckelt werden. Die PLGA-Magnetit-NP sind sphärisch, ca. 200 nm groß und induktiv heizbar.

Eine Co-Beladung mit Cipro ist möglich, bedarf jedoch weiterer Optimierung. Angestrebt

wurde dies zur Behandlung von Pseudomonasinfektionen bei Mukoviszidose-Patienten. Die

grundlegende Hypothese, dass die Mukusbarriere unter Wärmeeinfluss besser zu penetrieren

ist, konnte unter externer Wärmeapplikation bewiesen, jedoch nicht unter induktiven Heizbe-

dingungen gezeigt werden. Hierfür kommen mehrere Faktoren in Betracht, die es zu untersu-

chen gilt. Festzuhalten bleibt, dass der Wärmeeinfluss auf die Penetration in einer grundsätz-

lichen Machbarkeitsstudie nachgewiesen werden konnte. Ein erster Schritt, um den neuartigen

Ansatz zur Überwindung der Mukusbarriere voranzutreiben.

VIII

Abstract

Pulmonary drug delivery is gaining increased attention. However, an effective pharmacother-

apy is limited due to the mucus barrier, one of the most important non-cellular barriers. Mu-

cus is a viscous secretion that covers the surface of the lung airway. Its function consists of

trapping foreign materials which are then removed. This can happen to inhaled drugs as well.

This thesis aims at presenting a novel strategy to face this problem. In order to overcome the

mucus barrier, a penetration enhancement induced by heat is considered. The intended heating

is to be carried out locally and inductively via an active drug carrier system which heats up in

the external alternating magnetic field. For this, it was possible to develop a carrier system

based on PLGA and Magnetite. The PLGA-Magnetite-NP are spherical, 200 nm in size and

heat inductively. Co-loading with Cipro is possible. However, further action is needed. The

aim was to create a system for treating cystic fibrosis patients with a pseudomonas infection.

Regarding the hypothesis that the mucus barrier is better to penetrate by the influence of heat,

it was shown that this effect could be demonstrated by applying external heat. However, this

correlation was not found by induction heating. On this basis, several factors should be taken

into account. In conclusion, it can be ascertained that heat influences the penetration; one of

the preliminary steps in promoting this novel approach to overcoming the mucus barrier.

1 Einleitung und Zielsetzung 1

1 Einleitung und Zielsetzung

Die Lunge als Applikationsort für Arzneistoffe birgt ein großes Potential und gewinnt zuneh-

mend an Bedeutung. Die einfache, nicht-invasive Zugänglichkeit, die große Resorptionsflä-

che, die gute Vaskularisierung sowie die Umgehung des First-Pass-Effekts sind nur einige der

Attribute welche, die Lunge zu einer idealen Plattform für die lokale und systemische Arz-

neimitteltherapie machen.[1, 2]

Die inhalative Therapie bei chronischen Lungenerkrankungen, wie COPD, zystische Fibrose

oder Asthma bronchiale ist eine seit Jahrzehnten etablierte Behandlungsform. Die entspre-

chenden Wirkstoffe werden mithilfe von Dosieraerosolen oder Pulverinhalatoren, in fester

oder flüssiger Form, in die Lunge eingebracht und können so direkt am Wirkort lokal wirken.

In diesem Zusammenhang wird derzeit auch die lokale inhalative Behandlung von Lungen-

krebs diskutiert.[3, 4]

Darüber ließe sich die Therapieeffizienz, verglichen mit derzeitigen Stan-

dardtherapieformen, wie der Strahlentherapie und der systemischen Chemotherapie, womög-

lich deutlich steigern.[5]

Durch lokal applizierte Wirkstoffe lässt sich im Allgemeinen die ein-

gesetzte Dosis und damit korrelierend auch die systemischen Nebenwirkungen verringern.

Vor diesem Hintergrund wird derzeit die lokale Therapie vieler weiterer Lungenerkrankungen

erwogen. Ein besonderer Fokus aktueller Forschungsbestrebungen liegt hierbei auf inhalati-

ven Antibiotikatherapien, beispielsweise zur Behandlung diverser Pneumonie Arten [6]

oder

Tuberkulose.[7]

Neben der lokalen Wirkstoffapplikation kann die Lunge aber auch gezielt als Applikations-

route für eine beabsichtigte systemische Wirkung genutzt werden. Inhalationsnarkotika sind

dafür ein bewährtes Beispiel. In den letzen Jahren hat diese Form der Wirkstoffapplikation ein

nahezu sprunghaft gesteigertes Interesse erfahren. Die pulmonale Applikationsroute ist be-

sonders für Wirkstoffe interessant, die durch die perorale Gabe zerstört würden und daher

invasiv verabreicht werden müssen. Protein- und Peptidwirkstoffe sind prominente Vertreter

solcher Wirkstoffkandidaten. Aus diesem Bestreben heraus resultierte mit Exubera® im Jahre

2006 das erste inhalierbare Humaninsulin zur Behandlung von Diabetes mellitus. Ein Inha-

landa, welches das Potential der Lunge als systemischer Applikationsweg deutlich aufzeigt.

Zahlreiche Forschungsbemühungen konzentrieren sich aktuell auf die Möglichkeit über die

Lunge eine systemische Wirkung zu erzielen. Das Spektrum an Erkrankungen die darüber

zukünftig adressiert, beziehungsweise therapiert werden sollen ist beachtlich.[2, 8]

Erforscht

werden derzeit alternative inhalative Therapieansätze u. a. für Parkinson [9]

, Schlafstörungen [10]

, Migräne [11]

oder zur Raucherentwöhnung.[12]

Die pulmonale Vakzinierung stellt ein wei-

terer vielversprechender Ansatz in diesem Kontext dar.[13, 14]

2 1 Einleitung und Zielsetzung

Bezugnehmend darauf lässt sich festhalten, dass die pulmonale Wirkstoffapplikation, sowohl

für die lokale Therapie, als auch zur Behandlung systemischer Erkrankungen zukünftig gro-

ßes Potential verspricht. Doch um dieses Potential ausschöpfen zu können und der jeweiligen

Anwendung gerecht zu werden, müssen Herausforderungen entgegengetreten werden, die den

therapeutischen Nutzeffekt von Inhalanda derzeit einschränken. Die Reinigungsmechanismen

der Lunge stellen eine solche Herausforderung dar.[1]

Mit dem Ziel den Organismus vor inha-

lierten Fremdpartikeln und Pathogenen zu schützen, ist die Lunge mit äußerst effizienten

Schutz- und Abwehrmechanismen ausgestattet. Im Alveolarbereich, vermittelt durch Makro-

phagen, wird die obere Lunge durch den Mechanismus der sogenannten mukoziliären Clea-

rance gereinigt. Dabei überzieht ein viskoser Schleim, der sogenannte Mukus, den Bronchial-

bereich und trägt dafür Sorge inhalierte Partikel abzufangen. Durch die Flimmerzellen des

respiratorischen Epithels, genauer gesagt durch die Schlagbewegung der an der Oberfläche

dieser Zellen angebrachten Zilien, wird dieser Schleim samt inkorporierten Partikeln abtrans-

portiert. Ein Reinigungsmechanismus der nicht nur Pathogene und Fremdpartikel betrifft,

sondern auch einer effizienten pulmonalen Wirkstoffapplikation entgegensteht. Diverse For-

schungsstrategien zielten in den letzten Jahrzehnten auf eine Verbesserung der Inhalationsthe-

rapie ab. Dabei konzentrierte man sich vornehmlich auf die freigesetzte Dosis, die Arznei-

stoffdeposition innerhalb der Lunge und damit zusammenhängend das Partikeldesign und die

Weiterentwicklung des Applikationssystems. Dies sind zweifellos therapeutisch wichtige As-

pekte. Nur wenn der Arzneistoff in dem für die Indikation relevanten Bereich der Lunge ab-

geschieden wird, kann die angestrebte topische oder systemische Wirkung überhaupt erzielt

werden. Aufgrund dieser Verbesserungsstrategien sind zwar heutzutage höhere Wirkstoffdo-

sen möglich und es wird eine höhere Effizienz der Deposition erreicht, die Umgehung des

besagten Reinigungsmechanismus ist bislang jedoch nur unzureichend gelöst. Entsprechend

designte, neuartige Wirkstoffträgersysteme im Nanometerbereich, besitzen in diesem Kontext

ein vermeintlich hohes Potential. Durch Synergien verschiedener Materialien lassen sich

nanoskalige Trägersysteme mit einzigartigen Eigenschaften entwickeln. Trägersysteme mit

denen sich zukünftig womöglich die Effizienz der pulmonalen Wirkstoffapplikation und da-

mit der Therapieerfolg diverser Erkrankungen steigern lassen.


1.1 Pulmonale Arzneistoffapplikation

1.1.1 Anatomie und Physiologie der menschlichen Lunge

Die Lunge ist das Organ des äußeren Gasaustauschs. Ihre Hauptaufgabe besteht darin, Sauer-

stoff (O2) aus der Umgebung in den Blutkreislauf aufzunehmen und gleichzeitig Kohlenstoff-

dioxid (CO2) aus dem Blutkreislauf an die Umgebung abzugeben.

Das Atmungsorgan lässt sich dabei anatomisch und funktionell in den Tracheobronchialbe-

reich und den Alveolarbereich gliedern. Dabei verzweigen sich die Atemwege von der Tra-

chea ausgehend, dichotom in insgesamt 23 Generationen. Die inhalierte Luft wird zunächst

durch den Nasenrachenraum in die Trachea geleitet. Die Trachea gabelt sich gemäß den bei-

den Lungenflügeln in die zwei Hauptbronchien auf. Von jedem Hauptbronchus gehen weitere

Verzweigungen ab, sodass die Bronchien in kleinere Bronchiolen und schließlich in die Ter-

minalbronchien übergehen. In der 17. Teilungsgeneration geht dieser Tracheobronchialbe-

reich in den Alveolarbereich über (vgl. Abbildung 1). In der bis dahin zurückgelegten Passage

wird die Inspirationsluft gefiltert, erwärmt, befeuchtet und somit für den eigentlichen Gasaus-

tausch vorbereitet. Dieser Austausch findet in den Alveolen statt, welche sich an den Endver-

zweigungen befinden und von einem dichten Netz an Blutkapillaren umgeben sind. Der Sau-

erstoff tritt in den luftgefüllten Alveolen in die angrenzenden Lungenkapillaren über. Nach

dem gleichen Prinzip tritt das Kohlenstoffdioxid vom Blut in die Lunge und wird letztlich

über Exhalation abgeatmet.[15]

Abbildung 1: Schematische Darstellung der Gliederung des Atemwegsystems mit seinen 23 Verzweigungen (A) sowie die in

den einzelnen Abschnitten anzutreffenden Epitheltypen (B). Abbildung A ist modifiziert und reproduziert nach Weibel [16],

mit freundlicher Genehmigung der American Thoracic Society. Abbildung B ist modifiziert und reproduziert nach Klein et

al. [17] mit freundlicher Genehmigung von Elsevier.


Die Zahl dieser Alveolen wird auf 150-200 Millionen geschätzt. Daraus resultiert eine Gas-

austauschfläche von 70-140 m².[18]

Gemäß den unterschiedlichen Aufgaben unterscheidet sich

auch das Oberflächenepithel der einzelnen Lungenabschnitte bezüglich Form und Ausführung

stark.

Im Allgemeinen nimmt der Gesamtquerschnitt des Atemwegsystems zu und die Epitheldicke

mit zunehmender Verzweigung ab (siehe Abbildung 1). Das alveoläre Epithel ist ausgespro-

chen dünn, sodass der dort stattfindende Gasaustausch mit dem Blut über Diffusion erfolgen

kann. Die Blut-Luft-Schranke, welche die beiden Atemgase überwinden müssen ist nur zwi-

schen 0,2-0,6 µm breit.[18]

Das Epithel im Alveolarbereich ist ein einschichtiges Plattenepi-

thel, welches hauptsächlich aus Pneumozyten Typ I sowie den Surfactant-sezernierende Typ

II-Pneumozyten besteht. Das an der Oberfläche dieses Epithels abgeschiedene Surfactant

dient u. a. der Reduktion der Oberflächenspannung der Alveolen. Dadurch wird sichergestellt,

dass diese nach vollständiger Exspiration nicht kollabieren. Zudem finden sich im Alveolar-

bereich, diesen Alveolarepithelzellen aufsitzend, Makrophagen, die für die Reinigung in die-

ser Lungenregion verantwortlich sind.[19]

Das respiratorische Epithel der zuführenden Atemwege ist hingegen dicker und hat eine ande-

re zelluläre Zusammensetzung. Im Allgemeinen nimmt die Epitheldicke in Richtung abstei-

gendem Bronchialbaum ab. Dies geht auch aus der schematischen Darstellung in Abbildung 1

hervor. Das respiratorische Epithel der Trachea und der Bronchien ist ein mehrreihiges hoch-

prismatisches Epithel, welches vor allem durch Flimmerzellen und Becherzellen charakteri-

siert ist. Im Bereich der Bronchiolen findet sich ein einschichtiges prismatisches Epithel, das

Flimmer und Clara-Zellen enthält. Die Präsenz der Flimmerzellen sowie der flüssigkeitspro-

duzierenden Zellen im Tracheobronchialbereich ist für die Filterung der Atemluft essentiell.

Der zugrundeliegende Reinigungsmechanismus in diesem Bereich der Lunge wird als muko-

ziliäre Clearance bezeichnet und ist im nachfolgenden Kapitel eingehend beschrieben.

1.1.2 Reinigungsmechanismen der Lunge - mukoziliäre Clearance im Fokus

Die Lunge steht aufgrund ihrer physiologischen Funktion im stetigen Austausch mit ihrer

Umgebung. Um den Organismus von inhalierten Fremdpartikeln, wie beispielsweise Staub

oder Mikroorgansimen zu schützen, verfügt die Lunge über äußerst effiziente Abwehr- und

Schutzmechanismen. Je nachdem in welchem Abschnitt der Lunge die entsprechenden Parti-

kel abgeschieden werden, greifen unterschiedliche Mechanismen. In den luftleitenden Atem-

wegen, im vorherigen Abschnitt als Tracheobronchialbereich bezeichnet, ist dies die mukozi-

liäre Clearance. Partikel, die hingegen die tiefe Lunge, den Alveolarbereich erreichen, unter-

liegen einem Makrophagen-vermittelten Reinigungsmechanismus.[20]

Dabei ist Art und Ur-

sprung der Partikel für beide Mechanismen absolut irrelevant – Arzneistoffpartikel unterlie-

gen diesen Mechanismen ebenso wie pathogene Objekte. Für inhalierte Partikel stellen beide

Mechanismen nicht-zelluläre Barrieren in der Lunge dar. In Abbildung 2 ist der


Reinigungsweg eines wirkstoffbeladenen Arzneistoffträgerpartikel in Abhängigkeit von des-

sen Deposition in der Lunge schematisch dargestellt. Löst sich der Arzneistoffträgerpartikel

nicht direkt nach der Deposition auf, wird er in der tiefen Lunge durch Makrophagen aufge-

nommen oder im Tracheobronchialbereich über die mukoziliäre Clearance aus der Lunge ab-

transportiert. Die Verweildauer eines in der Lunge abgeschiedenen Partikels ist somit von

dem an der jeweiligen Depositionsstelle vorherrschenden Reinigungsmechanismus abhängig.

Für das Verständnis der weiteren Arbeit ist insbesondere die mukoziliäre Clearance von Be-

deutung. Aufgrund dessen wird der Reinigungsmechanismus des Tracheobronchialbereichs

nachfolgend detaillierter beschrieben.

Abbildung 2: Vergleichende Darstellung der Reinigungsmechanismen der Lunge in Abhängigkeit der Deposition eines Arz-

neistoffträgerpartikel (modifiziert und reproduziert nach Ruge et al. [20], mit freundlicher Genehmigung von Elsevier). Wird

ein wirkstoffbeladener Arzneistoffträgerpartikel (1) im Tracheobronchialbereich abgeschieden unterliegt er dem mukoziliä-

ren Reinigungsmechanismus (3), wohingegen er in der tiefen Lunge einem Makrophagen-vermittelten Reinigungsmechanis-

mus (3) unterliegt. Durch beide Reinigungsmechanismen wird letztlich die Wirkstoffaufnahme in den Organismus beeinflusst

bzw. eingeschränkt.

Mukoziliäre Clearance und deren Bedeutung am Fallbeispiel zystische Fibrose

Die mukoziliäre Clearance ist der wichtigste Reinigungsmechanismus der luftleitenden

Atemwegsabschnitte. Die Begrifflichkeit „mukoziliär“, abgeleitet vom lateinischen Wort

Mucus (Schleim) und dem Begriff „Zilie“, indiziert die für diese Art der Reinigung wesentli-

chen Komponenten. Das respiratorische Epithel des Tracheobronchialbereichs besteht haupt-

sächlich aus zwei Zelltypen, Drüsen- und Flimmerepithelzellen.[21]

Einer der Hauptvertreter

dieser exokrinen Drüsenzellen sind die sogenannten Becherzellen, die ca. 20% des Epithels

ausmachen. Dieser Zelltyp sezerniert Muzine, ein wesentlicher Bestandteil der die Oberfläche


des Epithels überziehenden Schleimschicht. Hauptaufgabe dieser ist es, inhalierte Fremdpar-

tikel, wie beispielsweise Staub oder Mikroorganismen abzufangen, um so das unterliegende

Epithel zu schützen. Diese Schleimschicht lässt sich in zwei Bereiche gliedern (Abbildung

3A). In unmittelbarer Nähe zu den Zilien findet sich eine wässrige Sol-Schicht, welche die

Zilienbewegung nicht einschränkt. Dieser periziliären Flüssigkeitsschicht, kurz PCL-Schicht

(periciliary liquid layer), liegt die wesentlich viskosere Mukusschicht auf.[22]

Der genaue

Aufbau dieser beiden, zusammengefasst als ASL-Schicht (airway surface liquid) bezeichneten

Schicht, wird derzeit noch kontrovers diskutiert.[23, 24]

Neben Drüsenzellen bilden die sogenannten Flimmerepithelzellen den Hauptbestandteil des

Epithels.[25]

Daher wird das respiratorische Epithel auch als Flimmerepithel bezeichnet.

Flimmerepithelzellen weisen an ihrer Oberfläche feine Flimmerhärchen, sogenannte Kinozi-

lien, auf. Diese Zilien schlagen koordiniert in metachronen Bewegungswellen. Je nach Region

des Tracheobronchialbereichs erfolgt dies mit einer Frequenz von ca. 5 - 15 Schläge/s.[26, 27]

Die die Flimmerepithelzellen bedeckende Mukusschicht wird dadurch stetig in Richtung

Mund-Rachenraum abtransportiert. Darin abgefangene und inkorporierte Fremdpartikel wer-

den dann entweder durch Husten oder Schlucken aus dem Respirationstrakt entfernt. Die

Transportgeschwindigkeit dieser Mukusschicht ist von der jeweils betrachteten Region im

Tracheobronchialbereich abhängig und liegt in einem Bereich von ca. 2 - 22 mm/min.[28-30]

Die wichtigsten Komponenten der mukoziliären Clearance ist in Abbildung 3A schematisch

zusammengefasst.

Abbildung 3: Schematische Darstellung der mukoziliären Clearance im gesunden Zustand (A) und im Falle von zystischer

Fibrose (B). Gezeigt ist die ASL-Schicht, bestehend aus der periziliären Flüssigkeitsschicht (PCL) und der Mukusschicht.

Ebenso sind die für den Gelcharakter des Mukus hauptverantwortlichen Muzintypen MUC5AC und MUC5B indiziert. Bei

der zystischen Fibrose ist die mukoziliäre Clearance stark vermindert. Ursache ist eine genetisch bedingte Funktionsstörung

des CFTR-Kanals, wodurch der Ionentransport gestört und infolgedessen die schützende Schleimschicht wesentlich viskoser

ist. Durch die hohe Viskosität kommt der ziliäre Transport zum Erliegen. Dies begünstigt letztlich bakterielle Infektionen.


Für eine effektive Reinigung ist, sowohl eine adäquate Mukusproduktion, als auch eine intak-

te Funktion der Zilien die Grundvoraussetzung.[31, 32]

Dies wird vor allem deutlich bei Defek-

ten, die eine der beiden Kernkomponenten dieses Reinigungsapparats betrifft. Die Stoffwech-

selerkrankung zystische Fibrose ist dafür ein geeignetes Fallbeispiel.[33]

Bei dieser Erkran-

kung ist aufgrund eines genetischen Defektes die mukoziliäre Clearance beeinträchtigt (siehe

Abbildung 3B). Indiziert durch eine Mutation im CFTR-Gen (cystic fibrosis transmembrane

conductance regulator), welches den CFTR-Kanal codiert, resultiert eine wesentlich viskosere

ASL-Schicht. Bei dem CFTR-Kanal handelt es sich um einen Chloridionenkanal, der durch

die Mutation in seiner Funktionsweise gestört wird. Aufgrund dessen ist die Regulation des

Salzhaushaltes gestört. Die dem Epithel aufliegende ASL-Schicht dehydriert infolgedessen,

wodurch die PCL-Schicht reduziert und der ihr aufliegende Mukus viskoser wird. Die Konse-

quenz dieser Dehydrierung und der darauf basierenden Viskositätserhöhung der Schleim-

schicht ist eine starke Beeinträchtigung des ziliären Transports. Der dadurch bedingt vermin-

derte Abtransport stellt eine ideale Basis für eine Infektion mit Bakterien, wie Pseudomonas

aeruginosa dar.[33, 34]

Derartige Infektionen resultieren bei den betroffenen Patienten häufig in

einer stetig abnehmenden Lungenfunktion. Das Fallbeispiel zystische Fibrose zeigt deutlich

die Wichtigkeit einer funktionierenden, mukoziliären Clearance auf.

Mukus: Zusammensetzung und Struktur

Epithelien die mit der Außenwelt in Kontakt stehen, erfüllen aufgrund bestimmter Barriereei-

genschaften immer eine Schutzfunktion. Im Falle des respiratorischen Epithels entspricht die-

se Barriere einem viskosen schleimartigen Sekret – dem sogenannten Mukus. Diese Mukus-

schicht überzieht das Epithel der luftleitenden Abschnitte der Atmungsorgane und schützt

darüber den Organismus gegen inhalierte Fremdpartikel.

Der respiratorische Mukus besteht zu ca. 97% aus Wasser mit einem Feststoffanteil von ca.

3%. Nahezu ein Drittel dieses Feststoffanteils stellen sogenannte Muzine dar. Darüber hinaus

enthalten sind Lipide, andere Proteine, Salze, DNA, Zellen sowie Zellmaterial.[33, 35]

Den ent-

haltenen Muzinen kommt eine besondere Bedeutung zu. Die multifunktionellen Glykoprotei-

ne stellen den strukturgebenden Bestandteil von Mukus dar, verhindern aufgrund der hohen

Wasserbindungskapazität dessen Dehydrierung [36]

und sind vermutlich für die eigentliche

Bindung der inhalierten Fremdpartikel verantwortlich.[37]

Insgesamt 17 Gene codieren im

menschlichen Organismus für Muzine. In der Lunge werden zwei Muzintypen besonders

stark exprimiert – MUC5AC und MUC5B.[33, 38]

Beide Muzintypen sind durch terminale cys-

teinreiche Domänen charakterisiert, was sie dazu befähigt Disulfidbrücken auszubilden und

sich zu Polymeren zu verbinden. Diese Polymerstrukturen stellen die wesentliche Grundlage

für die viskoelastischen Eigenschaften und den Hydrogelcharakter des Mukus dar.[38]

Die fort-

laufende Sekretation dieser Muzine erfolgt, wie erwähnt, in Becherzellen und anderen sub-

mukösen Drüsenzellen. Im Respirationstrakt werden bei einem gesunden Menschen ca. 10 -


100 ml Mukus pro Tag produziert.[22]

Neben der chemischen Zusammensetzung dieser nicht-

zellulären biologischen Barriere rücken zunehmend deren physikalische Eigenschaften sowie

die innere Struktur in den Fokus aktueller Forschungsbemühungen. Eine genaue Kenntnis

darüber hilft möglichweise zu verstehen, welche Partikelgröße vom Mukus bevorzugt einge-

schlossen wird oder wie die Partikeloberfläche die Mobilität im Mukus beeinflusst. Beides

Aspekte, die derzeit noch unklar, aber zur therapeutisch intendierten Überwindung dieser Bar-

riere von großer Bedeutung sind.[39]

Bekannt ist, dass die beiden Muzintypen MUC5AC und MUC5B als prädominante Faktoren

die Gelbildung von respiratorischem Mukus verantworten. Eine neue Studie indiziert, dass

auch weitere im Mukus enthaltende Proteine an der Ausbildung des dreidimensionalen Poly-

mernetzwerks beteiligt sind. Globuläre Proteine, so konnte gezeigt werden, interagieren mit

Muzinen durch schwache elektrostatische aber auch durch starke hydrophobe oder kovalente

Wechselwirkungen und bestimmen somit die biophysikalische Eigenschaften von Mukus sehr

wahrscheinlich mit.[40]

Bei dem Gelnetzwerk von respiratorischem Mukus handelt es sich um

ein heterogenes Netzwerk. Darauf lassen rheologische Untersuchungen schließen, welche die

Makrorheologie mit der Mikrorheologie von Mukus vergleichen.[41, 42]

Unter makroskopischer

Betrachtung, d. h. als Bulk-Material, wird Mukus als ein viskoelastisches Gel beschrieben,

das ein nichtnewtonsches Verhalten zeigt. Basierend auf entsprechenden Messungen bewegt

sich die Viskosität von Mukus zwischen 10-2

und 102

Pas was die Viskosität von Wasser bis

um das 2000 fache übersteigt. Diese Viskosität würde eigentlich die beobachtbare schnelle

Diffusion bestimmter Partikel in Mukus ausschließen. Da diese jedoch offensichtlich stattfin-

det, reicht die Makrorheologie nicht aus um diese biologische Barriere adäquat zu charakteri-

sieren.[35]

In der Mikrorheologie versucht man Informationen über lokale mechanische Eigen-

schaften, die Strukturrheologie, zu erhalten. Mikrorheologische Untersuchungen an Mukus

zeigen eine klare Diskrepanz zu dem makrorheologischen Verhalten.[41, 42]

Ferner legen diese

Studien offen, dass das Muzinnetzwerk, welches diesem Hydrogel seine Struktur gibt, sehr

starr ist und insgesamt durch eine hohe Heterogenität charakterisiert ist. Festmachen lässt sich

diese heterogene Natur an der breitverteilten Maschenweite des Netzes (siehe Abbildung 4).

Dies konnte anhand von Mikrostrukturvisualisierungen unter Verwendung der Kryo-

Elektronenmikroskopie nachgewiesen werden.[42]

Möglicherweise ist die Struktur von Mukus

noch wesentlich komplexer als bisher angenommen. Eine aktuelle Arbeit postuliert basierend

auf rheologischen Untersuchungen anstelle einer dreidimensionalen Netzstruktur eine

Schwamm- oder Kammerstruktur.[41]

Diese könnte eine Erklärung dafür liefern, weshalb

manche Partikel die Mukusbarriere penetrieren können und andere nicht. Für die therapeu-

tisch intendierte Überwindung dieser Barriere ist deren vollständige Charakterisierung essen-

tiell. Nur so lassen sich pharmazeutisch-technologische Ansätze entwickeln um diese Barriere

effizient zu überwinden.


Abbildung 4: Schematische Darstellung der dem respiratorischen Epithel aufliegenden Mukus (A) sowie die Mikrostruktur-

visualisierung dieser Mukusschicht unter Verwendung der Kryo-Elektronenmikroskopie (B). Die Aufnahme B-2 ist dabei ein

Vergrößerungssauschnitt der in Aufnahme B-1 indizierten Fläche. Die gezeigten kryo-elektronenmikroskopischen Aufnah-

men wurden modifiziert und reproduziert nach Kirch et al. [42], mit freundlicher Genehmigung von PNAS.

1.1.3 Die Lunge als Applikationsort: Potential und Anforderungen

Die Lunge als Applikationsort ermöglicht aufgrund ihrer anatomischen Beschaffenheit die

Pharmakotherapie lokaler Lungenerkrankungen ebenso wie die Behandlung systemischer

Erkrankungen. Im Falle der Lokaltherapie von Lungenerkrankungen, wie beispielsweise

Asthma bronchiale oder COPD, gelangt durch die inhalative Applikation der entsprechende

Wirkstoff direkt an den Wirkort. Dadurch wird eine lokale Wirkstoffanreicherung erreicht, die

mit einer geringen systemischen Wirkung einhergeht. Folglich können unerwünschte Neben-

wirkungen reduziert werden. Der Wirkeintritt ist zudem vergleichsweise schnell.[43]

Durch die

lokale Wirkstoffanreicherung wird, verglichen mit alternativen Applikationsrouten, häufig

eine höhere Therapieeffizienz erreicht. Das Broncholytikum, Salbutamol beispielsweise, er-

reicht bei oraler Gabe die gewünschte Dilatation der Atemmuskulatur der Lunge nach 2,5 -

3 h, wohingegen bei inhalativer Gabe diese bereits nach 10 - 15 min erreicht wird.[44]

Für die

Behandlung einer akuten Atemnot im Rahmen der Asthmatherapie, bei der dieser Wirkstoff

Anwendung findet, ist somit die topische Applikation von Salbutamol zu präferieren. Neben

der lokalen Wirkstoffapplikation kann die Lunge auch als Portal für die systemische Pharma-

kotherapie genutzt werden. Aufgrund ihrer physiologischen Funktion, dem Gasaustausch mit

der Umgebung, verfügt die Lunge insbesondere im Alveolar- und respiratorischen Bronchial-

bereich über eine äußerst große Resorptionsfläche. Diese große Resorptionsfläche verbunden

mit der starken Vaskularisierung macht die Lunge zu einem attraktiven Ort für die Resorption

von Wirkstoffen.[43]

Zudem ist die Anzahl an metabolischen Enzymen in der Lunge ver-

gleichsweise gering.[45]

Bei der pulmonalen Applikationsroute wird darüber hinaus die Leber

und damit einhergend ein möglicher First-Pass-Effekt umgangen. Daher ist beispielsweise die

Bioverfügbarkeit von Makromolekülen wie Peptide und Proteine bei pulmonaler Applikation

wesentlich höher, als bei anderen nicht-invasiven Applikationsrouten.[46]

Der mit der


pulmonalen Applikation assoziierte schnelle Wirkeintritt kann auch für die Therapie systemi-

scher Erkrankungen einen interessanten Aspekt darstellen. Inhalativ appliziertes Insulin ist

hierfür ein geeignetes Beispiel.[47]

Aufgrund dessen wird das FDA-zugelassene inhalierbare

Insulin Afrezza™ im Rahmen der Diabetestherapie als Mahlzeiteninsulin eingesetzt.[48]

Dem Potential das die Lunge für die systemische und lokale Wirkstoffapplikation birgt, ste-

hen jedoch diverse Hürden und Anforderungen gegenüber. Für eine erfolgreiche Inhalations-

therapie ist die effiziente Deposition des Arzneistoffs in dem für die Therapie angestrebten

Lungenabschnitt eine Kernvoraussetzung.[1]

Die Abscheidung der inhalierten Arzneistoffpar-

tikel wird dabei von diversen Faktoren beeinflusst. Hierzu zählen die Eigenschaften der inha-

lierten Partikel, die anatomische Geometrie des Respirationstraktes sowie das dort vorherr-

schende Luftströmungsprofil.[49]

Zudem spielen in diesem Kontext auch Anwendungsparame-

ter, wie die Inhalationstechnik des Patienten, eine Rolle. Die wesentlichen Mechanismen, die

für die Partikeldeposition im Respirationstrakt verantwortlich sind, stellen Impaktion, Sedi-

mentation und Diffusion dar. Die Impaktion beschreibt die Abscheidung eines Partikels auf-

grund von Trägheitskraft, wohingegen die Sedimentation die Abscheidung infolge der auf das

Partikel wirkenden Gravitationskraft beschreibt. Ab einer Partikelgröße < 1µm unterliegen die

Partikel nicht mehr der Sedimentation sondern folgen der Brownschen Molekularbewegung.

Ein derartiges Partikel scheidet sich durch ungerichtete Diffusion ab. Neben diesen, für Arz-

neistoffpartikel dominierenden Depositionsmechanismen, existieren noch die Interzeption und

die elektrostatische Abscheidung. Ersteres ist für Partikel relevant, die in der Größenordnung

des Atemwegdurchmessers liegen. Diese Form der Abscheidung ist daher eher für faserartige

als für sphärische Partikel relevant.[49, 50]

Die drei dominanten Depositionsarten sind von der

Partikelgröße abhängig. Die Partikelgröße steht zudem in Abhängigkeit zur Depositionswahr-

scheinlichkeit für bestimmte Lungenbereiche.[51]

In Abbildung 5 ist dieser Zusammenhang

schematisch dargestellt. Bei der in der Graphik angegeben Partikelgröße handelt es sich um

den aerodynamischen Partikeldurchmesser daero. Dabei handelt sich um eine standardisierte

Kenngröße mit Hilfe derer sich das aerodynamisches Verhalten besser beschreiben lässt. So

entspricht der aerodynamische Durchmesser eines Partikels dem Durchmesser, den ein sphä-

risches Partikel mit einer Dichte von 1 g/cm³ hat, welches dasselbe Flugverhalten/ aerodyna-

mische Verhalten zeigt, wie der zu untersuchende Partikel.[52]


Abbildung 5: Darstellung der Depositionswahrscheinlichkeit und Depositionsart für die jeweiligen Lungenbereiche in Ab-

hängigkeit der Partikelgröße, modifiziert nach Heyder, 2004 [51]. Verwendung der Abbildung mit freundlicher Genehmigung

der American Thoracic Society.

Basierend auf den Depositionsmechanismen und deren Größenabhängigkeit ergibt sich für

den im Rahmen der inhalativen Therapie angestrebten Lungenabschnitt eine primäre Zielvor-

gabe, hinsichtlich der dort geforderten Partikelgröße. Um eine möglichst hohe Effizient der

Inhalationstherapie zu erreichen, müssen neben der Partikelgröße und Größenverteilung die

anderen, bereits genannten, Einflussfaktoren mitberücksichtigt werden. Faktoren wie die rich-

tige Inhalationstechnik oder die anatomische Gegebenheiten in der Lunge sind dafür glei-

chermaßen wichtig wie die Größe, Größenverteilung, Form oder Dichte der Partikel. Dies

stellt sowohl an den Inhalator, als auch an die Formulierung, hohe Anforderungen.[53]

Ein die

Formulierung betreffender Aspekt, der bis dato nur unzureichend gelöst ist, stellt die Umge-

hung der Reinigungsmechanismen der Lunge dar.[54]

Insbesondere Arzneistoffträgerpartikel,

die sich zu langsam oder unzureichend auflösen, werden über diese Mechanismen, samt darin

inkorporiert vorliegendem Wirkstoff, rasch aus der Lunge abtransportiert. Ein Aerosolpartikel

muss sich erst lösen, bevor der Wirkstoff absorbiert werden kann.[46]

Erfolgt dies nicht, so

bleibt die angestrebte Wirkung aus und die therapeutische Effizienz wird entsprechend ernied-

rigt. Diese Reinigungsmechanismen, insbesondere die mukoziliäre Clearance, stellt im Thera-

piemanagement von Lungenerkrankungen eine anzugehende Herausforderung dar.


1.2 Pulmonaler Wirkstofftransport

1.2.1 Moderne Wirkstoffträgersysteme für die pulmonale Applikation

Mit dem Ziel die Inhalationstherapie zur Behandlung systemischer oder lokaler Erkrankungen

weiter zu optimieren, gewinnen neuartige Wirkstofftransport-basierte Strategien, zunehmend

an Bedeutung. Ansatzpunkte die darüber adressiert werden sollen umfassen: Die Verbesse-

rung der Permeabilität des Lungenepithels und somit der Bioverfügbarkeit bestimmter Wirk-

stoffe, die Möglichkeit einer Wirkstoffretention sowie kontrollierten Wirkstofffreisetzung, die

Umgehung der Reinigungsmechanismen der Lunge, die Möglichkeit einer zielgerichteten

Wirkstoffausbringung.[20]

Besonders großes Potential in diesem Zusammenhang und daher intensiv beforscht, verspre-

chen nanoskalige Trägersysteme (Drug Delivery Systeme), sogenannte Nanocarrier. Diese

Bezeichnung umfasst Trägersysteme in einem Größenbereich von ca. 1 - 1000 nm.[43, 54]

Aus

der Fülle existierender Nanocarrier gelten hinsichtlich ihrer Eignung als Wirkstoffträgersys-

tem für die pulmonale Applikation besonders kolloidale Systeme auf Lipid- oder Polymerba-

sis als vielversprechend. Hierunter fallen Trägersysteme wie Liposome, Lipidnanopartikel

oder Polymernanopartikel [55]

(siehe Abbildung 6).

Abbildung 6: Schematische Darstellung von Liposomen (A), Lipidnanopartikel (B) und Polymernanopartikel (C).

Liposome sind aus Lipidmembranen geformte Vesikel, die eine wässrige Phase einschließen.

Auf dieser Struktur basierend können sowohl hydrophobe als auch hydrophile Wirkstoffe

darin eingebettet werden. Durch die Wirkstoffeinkapselung in Liposome kann z. B. eine Re-

tention und eine langfristig, kontrollierte Wirkstoffabgabe erreicht werden. Dies konnte für

das systemisch intendiert wirkende Insulin [56]

ebenso gezeigt werden, wie für Wirkstoffe die

zur lokalen Behandlungen von Lungenerkrankungen eingesetzt werden.[57]

Die inhalative

Antibiotikatherapie zur Behandlung von Pseudomonasinfektionen bei Patienten mit zystischer

Fibrose ließe sich durch eine liposomale Formulierung womöglich ebenfalls verbessern.

Durch die Möglichkeit der verzögerten Wirkstofffreisetzung ließe sich die Inhalationsfre-

quenz reduzieren und die Patientencompliance steigern.[58]

Ein weiteres, in diesem Kontext,

intensiv beforschtes lipidbasiertes Trägersystem stellen die sogenannten Lipidnanopartikel


(Solid Lipid Nanopartikel, SLN) dar. Die Matrix dieser Partikel stellen bei Körper- und

Raumtemperatur feste Lipide oder Lipidmischungen dar. Aufgrund der festen Struktur ist der

darin inkorporiert vorliegende Wirkstoff besser geschützt als bei den eher fragilen Liposo-

men. Darüber hinaus lässt sich die Wirkstofffreisetzung aus einer festen Matrix besser steu-

ern. Diese feste, hydrophobe Matrixstruktur der SLN erlaubt im Gegensatz zu den Liposomen

nur die Inkorporation hydrophober Wirkstoffe. Zudem besteht die Möglichkeit der Oberflä-

chenmodifizierung, um ein gezieltes Targeting zu erreichen. Lactoferrin funktionalisierte SLN

könnten beispielsweise gezielt für das Targeting des Bronchialepithel eingesetzt werden. Das

an der Oberfläche gekoppelte Lactoferrin agiert hier als Ligand für einen am Bronchialepithel

überexprimierten Lactoferrin-Rezeptor.[59, 60]

Darüber ließe sich der Carrier lokal anreichern

und darüber die Therapieeffizienz bei Lungenerkrankungen steigern. Für den zur Behandlung

von Tuberkulose eingesetzte Wirkstoff Rifampicin konnten unter Verwendung dieses Träger-

Systems in-vitro eine höhere Wirkstoffkonzentration am eigentlichen Wirkort nachgewiesen

werden.[60]

Neben Lipid-basierten Trägersystemen werden zur Verbesserung der pulmonalen Wirkstoff-

applikation auch Nanocarrier auf Polymerbasis intensiv beforscht. Die Nutzung von Polyme-

ren als Trägermaterial ist dahingegen vorteilhaft, als dass aufgrund ihrer recht einfachen De-

signbarkeit sowie Modifizierungs- und Funktionalisierungsmöglichkeit eine hohe Anpas-

sungsfähigkeit an spezifische Anforderungen besteht. Darüber hinaus zeichnen diese Träger-

systeme eine vergleichsweise hohe Stabilität und gute Einstellbarkeit physikochemischer Ei-

genschaften, wie beispielsweise der Größe, aus. Basis dieser Trägersysteme können sowohl

synthetische, als auch natürliche Polymere sein.[54, 61, 62]

Ist ein Einsatz als Wirkstoffträgersys-

tem intendiert, sollte das Polymer die Kriterien Biokompatibilität und Biodegradierbarkeit

erfüllen. Polymere, die diesen Anforderungen entsprechen und bezüglich einer pulmonalen

Applikation beforscht werden, umfassen z. B. die natürlichen Polymere Chitosan, Alginat,

sowie die synthetischen Polymere Polymilchsäure (PLA) und Polylactid-co-Glycolid

(PLGA).[61, 62]

Die chemische Diversität, der in diesem Kontext beforschten Polymere, ermög-

licht es Trägersysteme sowohl für hydrophile, als auch für hydrophobe Wirkstoffe zu generie-

ren. Aufgrund dessen und bedingt durch die genannten Vorzüge gegenüber anderen Nanocar-

riern, unterliegen polymere Nanopartikel einer Vielzahl an Forschungsbemühungen, die auf

eine Effizienzsteigerung der pulmonalen Wirkstofftherapie abzielen. Dabei werden lokale

Erkrankungen der Lunge ebenso adressiert wie Systemerkrankungen.[63]

Dies umfasst auch

neuartige Therapieansätze, wie beispielsweise die Gentherapie für bestimmte Formen von

Lungenkrebs. Dabei gelten polymer Nanopartikel als äußerst vielversprechendes Vehikel, um

entsprechende Gene in Tumorzellen einzuschleusen und darüber die Tumorzelle letztlich zu

zerstören.[64]

Bezugnehmend auf den im vorherigen Kapitel 1.1.3 beschriebenen Zusammenhang zwischen

pulmonaler Deposition und Partikelgröße müssen die hier vorgestellten Nanocarrier für eine

ausreichende Lungendeposition in einem Größenbereich von 20 nm liegen. Sofern sie diese


Größe übersteigen müssen sie durch geeignete Methoden, wie z. B. die Sprühtrocknung, ent-

weder in Mikropartikel umformuliert werden, oder bei der Applikation in einer geeigneten

Flüssigkeit aerosolisiert werden. Dadurch lässt sich das zweite Maximum der im Bereich zwi-

schen 1 - 5 µm erreichen und eine Exhalation dieser Trägersysteme umgehen (vgl. Abbildung

5).

1.2.2 Aktuelle Überwindungsansätze der Mukusbarriere

Für eine effiziente pulmonale Wirkstoffapplikation ist nach erfolgreicher Deposition im Tra-

cheobronchialbereich die Mukusbarriere, die erste zu überwindende Hürde. Das unterliegende

Epithelium kann nur nach Passage dieser nicht-zellulären Barriere erreicht werden. Da die

Lunge, als Applikationsort für lokale und systemische Therapien zunehmend an Bedeutung

gewinnt, rückt damit einhergehend die Überwindung der Mukusbarriere in den Fokus. Im

Folgenden sollen derzeit beforschte Ansätze diese Barriere zu überwinden vorgestellt werden.

Lungenerkrankungen wie Asthma bronchiale und insbesondere zystische Fibrose sind mit

äußerst viskosem Mukus und damit einhergehend einer stark beeinträchtigten mukoziliären

Clearance assoziiert. Daher kommt es in Folge dieser Erkrankungen häufig zu bakteriellen

Infektionen mit Pseudomonas aeruginosa oder Staphylococcus aureus.[33]

Behandlungsleitli-

nien empfehlen vor der eigentlichen Antibiotikagabe den Einsatz mukolytisch bzw. mukoak-

tiver Substanzen. Dadurch soll die Viskosität des Mukus erniedrigt und die Effizienz der

Antibiotikatherapie gesteigert werden.[65]

Die Viskositätserniedrigung besteht bei klassischen

Mukolytika darin, die Disulfidbrücken des muzinbasierten Polymernetzwerks zu spalten.[66]

In diesem Kontext wird beispielsweise N-Acetylcystein (NAC) oder das davon abgeleitete

Lysinsalz Nacystelyn (NAL) in inhalativer Form eingesetzt.[67-69]

Neue Forschungsansätze

zum verbesserten Wirkstofftransport durch die Mukusbarriere nutzen derartige Substanzen

gezielt. Ein Beispiel dafür sind inhalierbare Mikropartikel bestehend aus dem Antibiotikum

Clarithromycin und dem mukolytisch wirkenden NAC. Dieses Wirkstoffträgersystem könnte

zukünftig zur effektiven Behandlung von Pseudomonas aeruginosa-Infektionen im Rahmen

von zystischer Fibrose Anwendung finden.[70]

Wirkstoffträgersysteme mit mukolytischer Ak-

tivität werden auch im Nanomaßstab intensiv beforscht. Thiolierte selbstemulgierende Wirk-

stoffträgersysteme (self-emulsifying drug delivery systems, SEDDS) mit einer Größe von ca.

50 nm sind dafür ein geeignetes Beispiel. Die Thiolierung bewirkt eine deutliche Verbesse-

rung der Mukuspenetration dieser Systeme.[71]

Nanocarrier, die mit mukolytischen Enzymen

funktionalisiert sind, stellen ein weiteres Beispiel in diesem Kontext dar. Es konnte gezeigt

werden, dass eine Oberflächenmodifizierung von Nanopartikel auf Polyacrylsäurebasis mit

dem Enzym Papain in einer Verbesserung der Mukuspenetration resultiert.[72]

Diese Penetra-

tionsverbesserung konnte auch für Nanopartikel auf PLGA-Basis, die an ihrer Oberfläche mit

Papain, Trypsin oder Bromelain modifiziert sind, gefunden werden.[73]

Die Funktionalisierung

von Nanopartikel mit Carboxylgruppen stellt wahrscheinlich eine weitere Möglichkeit dar,

Einfluss auf die viskoelastischen Eigenschaften von Mukus zu nehmen, um darüber den


Mukustransport des Trägersystems zu verbessern. Es wird postuliert, dass die beobachtete

Penetrationsverbesserung auf eine durch die Carboxylgruppe induzierte Hydrierung des Mu-

zinnetzwerks zurückzuführen ist.[74]

Die Oberflächenmodifikation von potentiellen Wirkstoff-

trägersystemen als solches, ist einer der Hauptansätze zur Überwindung der Mukusbarriere.

Neben dem Aspekt der Beeinflussung der rheologischen Eigenschaften, wird sie jedoch pri-

mär genutzt, um die Interaktion des Trägersystems mit Muzinen zu unterbinden. Die hydro-

phile und ungeladene Beschaffenheit der Oberfläche sind Charakteristika, die eine Mukuspe-

netration möglicherweise begünstigen.[75]

Die PEGylierung ist als eine effiziente Möglichkeit

zur Penetrationsverbesserung und Verhinderung der Mukoadhesion des Trägersystems be-

schrieben. Zahlreiche Forschungsarbeiten beschreiben Wirkstoffträgerpartikel, die aufgrund

der Funktionalisierung mit PEG den Mukus penetrieren können.[76-78]

Die Oberflächenmodifi-

zierung mit Poloxamer, einem Ethylenoxid-Propylenoxid-Blockcopolymer, resultiert eben-

falls in Partikel, die eine gesteigerte Mukuspenetration aufweisen.[79, 80]

Eine weitere Ein-

flusswirkung auf die Überwindbarkeit der Mukusbarriere wurde für die Größe des Trägersys-

tems beobachtete.[81]

Einer Studie mit carboxylierten Polystyrolpartikel zeigte, dass 500 nm

große Partikel in Mukus hinsichtlich ihrer Mobilität vollständig eingeschränkt waren, wohin-

gegen 100 nm und 200 nm große Partikel ungehindert diffundieren konnten.[82]

Ein derartiger

siebartiger Effekt konnte auch in zervikalem Mukus gefunden werden. Partikel, die eine Grö-

ße von 500 nm überstiegen konnten die Mukusbarriere nicht passieren.[83]

Zurückführen lässt

sich dieser größenabhängige Penetrationseffekt vermutlich auf die heterogene, netzartige

Struktur von Mukus.[41, 42]

In diesem Zusammenhang wird für biologische Hydrogele, wie

Mukus, aufgrund der unterschiedlichen Maschenweite dieser Gele ein Siebeffekt angenom-

men.[81]

Resümierend lässt sich festhalten, dass die Interaktion des Wirkstoffträgersystems mit

der Mukusmatrix sowie dessen Größe vermutlich die wesentlichen penetrationsbestimmenden

Faktoren sind. Technologische Ansätze diese Barriere zu überwinden bestehen entweder da-

rin, sich diese beiden Faktoren zu Nutze zu machen, oder die rheologischen Eigenschaften

diese Barriere entsprechend zu verändern. Ein Überblick der derzeitig verfolgten Ansätze ist

zusammenfassend und schematisch in Abbildung 7 gezeigt.


Abbildung 7: Schematische Darstellung derzeit verfolgter technologischer Ansätze zur Überwindung der Mukusbarriere.

Dargestellt sind Wirkstoffträgersysteme, die aufgrund entsprechender Oberflächenmodifikation und/oder Größe die Mukus-

barriere zu überwinden vermögen. Die Funktionalisierung der Oberfläche beabsichtigt entweder das muzinbasierte Polymer-

netzwerk mukolytisch zu zerstören (A) oder die Interaktion des Trägersystems mit den Muzinen zu unterbinden (B). Darüber

soll letztlich die Penetration des Trägersystems ermöglicht werden. Ein weiterer Ansatz besteht darin, den für Mukus be-

schriebene Siebeffekt aufgrund des heterogenen Netzwerks auszunutzen und über die Größe des Trägersystems dessen Penet-

rationsfähigkeit zu gewährleisten.

1.3 Magnetische Nanopartikel

1.3.1 Magnetische Nanopartikel: Begriffsklärungen und Eigenschaften

Die Begrifflichkeit „Magnetische Nanopartikel“ umfasst nanoskalige Partikel die eine Reak-

tion auf ein äußeres angelegtes Magnetfeld zeigen. Derartige Partikel gewinnen in den unter-

schiedlichsten Forschungs- und Anwendungsbereichen zunehmend an Bedeutung. Insbeson-

dere im Hinblick auf biomedizinische Anwendungen liegt der Forschungsschwerpunkt auf

sogenannten superparamagnetischen Nanopartikeln.[84]

Im Folgenden werden die wesentlichen theoretischen Grundlagen und Begriffe vorgestellt,

die, im Zusammenhang mit magnetischen Nanopartikeln, für das weitere Verständnis dieser

Arbeit essentiell sind. Eine ausführliche Beschreibung hierzu findet sich in entsprechender

Fachliteratur wie z. B. [85-87]

.

Kurzvorstellung der Magnetismusarten

Die Magnetisierbarkeit eines magnetischen Materials, welches einem externen magnetischen

Feld (H) ausgesetzt wird, ist über die sogenannte magnetische Suszeptibilität (χ) angegeben.

Dieser Zusammenhang ist in der untenstehenden Formel verdeutlicht:


Die Magnetisierung (M) ist dabei als magnetisches Moment pro Volumeneinheit definiert.

Das magnetische Moment eines Atoms resultiert vorwiegend aus dem Spin der Elektronen

(Spinmoment) sowie deren Bewegung um den Kern (Bahnmoment). Der Spin des Kerns

selbst trägt in einem wesentlich geringeren Maße zum magnetischen Gesamtmoment bei.

Demnach ergeben sich materialabhängig unterschiedliche Magnetisierungsverhalten. Man

unterscheidet grundlegend Dia-, Para-, Ferro-, Ferri und Antiferromagnetismus.

Bei diamagnetischen Stoffen ist die Magnetisierung dem externen Magnetfeld entgegenge-

richtet, indiziert durch eine negative Suszeptibilität. Im Fall eines paramagentischen Stoffes

ist die Magnetisierung dem externen Feld hingegen proportional gleichgerichtet, was durch

eine positive Suszeptibilität charakterisiert ist. Ebenfalls positiv, jedoch deutlich höher, ist die

Suszeptibilität bei ferromagnetischen Stoffen. Die resultierende Magnetisierung ist bei diesen

Stoffen nicht mehr proportional zur Feldstärke. Es kommt bei derartigen Materialien zu einer

deutlichen Verstärkung des Magnetfeldes. Zurückführen lassen sich diese Effekte auf das

Vorhandensein bestimmter geordneter Bereiche innerhalb dieser Materialien, den Weiß‘schen

Bezirken. In diesen Domänen liegen die Elektronenspins bei ferromagnetischen Materialien

parallel ausgerichtet vor. Durch sogenannte Blochwände sind die einzelnen Bezirke vonei-

nander getrennt. Aufgrund der unterschiedlichen Magnetisierungsrichtung dieser Domänen

heben sich die magnetischen Kräfte auf. Eingebracht in ein Magnetfeld richten sich die Spins

aller Domänen jedoch kollektiv in Richtung des angelegten Feldes aus und verstärken dieses

(siehe Abbildung 8). Dieser Prozess lässt sich über die Feldstärke beeinflussen. Ist jedoch die

vollständige Ausrichtung aller Domänen erreicht kann auch eine Erhöhung der Feldstärke die

Magnetisierung nicht weiter maximieren. Entsprechend wird dieser Punkt als Sättigungsmag-

netisierung (Ms) bezeichnet. Ein weiteres Charakteristikum ferromagnetischer Materialien ist

der Verbleib einer Restmagnetisierung (Mr), auch Remanenz genannt. Nach Abschalten des

Feldes behält ein Teil der Weiß‘schen Bezirke die kollektive Ausrichtung bei, wodurch sich

diese Remanenz begründet. Die Zurücksetzung der Magnetisierung auf ihren Ursprungswert

null wird nur erreicht, wenn man ein entgegengesetztes Feld anlegt. Die Feldstärke bei der

darüber die Ursprungsmagnetisierung erreicht wird, bezeichnet man als Koerzitivfeldstärke.

Die Magnetisierung ferromagnetischer Materialien zeigt demnach Hystereseverhalten (vgl.

Abbildung 8).


Abbildung 8: Schematische Darstellung der Weiß‘schen Bezirke ohne und mit Magnetfeldexposition (A bzw. B) sowie des

Magnetisierungsverhaltens eines ferromagnetischen Materials (rechts). Die Magnetisierung eines derartigen Stoffes ist durch

ein Hystereseverhalten charakterisiert. Demnach nimmt die Magnetisierung des Materials bei Anlegung eines Magnetfeldes

solange zu, bis sich die Spins aller Domänen kollektiv in Richtung des angelegten Feldes ausgerichtet haben (≙ B). Dieser

Punkt wird als Sättigungsmagnetisierung bezeichnet (Ms). Nach Abschalten des Feldes bleibt eine gewisse Restmagnetisie-

rung (Mr) im ferromagnetischen Material vorhanden.

Darüber hinaus ist das Magnetisierungsverhalten derartiger Materialien temperaturabhängig.

Wird die sogenannte materialabhängige Curie Temperatur überschritten, geht die parallele

Anordnung verloren und es resultiert ein Übergang vom ferromagnetischen zum paramagneti-

schen Verhalten. Ferri- und antiferromagnetische Materialien sind aufgrund ihrer speziellen

Kristallstruktur durch Weiß‘sche Bezirke charakterisiert, in denen sich die magnetischen

Momente nicht parallel, sondern antiparallel ausrichten. Bei den antiferromagnetischen Stof-

fen sind die Kräfte dieser Momente, im Gegensatz zu ferrimagnetischen Materialien, gleich

groß sodass eine vollständige Auslöschung resultiert.

Superparamagnetismus und Induktives Heizen

Superparamagnetismus ist eine besondere Form von Magnetismus, der bei sonst ferro- und

ferrimagnetischen Materialien unterhalb einer kritischen, materialabhängigen Größe auftritt.

Diese kritische Partikelgröße entspricht der Dimension einer einzelnen Weiß´schen Domäne

des Bulkmaterials. Im Größenbereich einer Einzeldomäne kann ein Partikel ein von seinem

ferro- oder ferrimagnetischen Bulkmaterial verschiedenes Magnetisierungsverhalten aufwei-

sen. Man spricht von superparamagnetischem Verhalten. Ab einer bestimmten Teilchengröße

ist die zur Ummagnetisierung aufzuwendende Energie so gering, dass die Magnetisierungs-

richtung des Partikels im magnetfeldfreien Zustand spontan fluktuiert. Die zur Ummagnetisie-

rung notwendige magnetische Anisotropieenergie ist demnach geringer als die thermische

Energie. Dieser Umstand ist kennzeichnend für Superparamagnetismus. Damit besitzen su-

perparamagnetische Partikel, wie Paramagneten, keine fixe Ausrichtung der Magnetisierungs-

richtung. Die Magnetisierungskurve bei Magnetfeldexposition ist durch einen sigmoidalen

Verlauf charakterisiert (vgl. Abbildung 9). Derartige Partikel weisen eine


Sättigungsmagnetsierung auf, ihre Magnetisierung ist jedoch vollständig reversibel. Demnach

zeigen diese Partikel nach der Magnetfeldexposition keine Restmagnetisierung und somit

auch keine Hysterese.[87-89]

Abbildung 9: Magnetisierungskurve von superparamagnetischen Partikeln. Im Rahmen der Magnetfeldexposition eines

solchen Partikels ergibt sich der für den Superparamagnetismus charakteristische sigmoidale Kurvenverlauf. Demnach er-

fährt ein solches Partikel eine Sättigung der Magnetisierung. Eine Restmagnetisierung oder Hysterese ist im Gegensatz zu

seinem ferro- oder ferrimagnetischen Bulkmaterial jedoch nicht feststellbar.

Werden superparamagnetische Partikel einem hochfrequenten, alternierenden Magnetfeld aus-

gesetzt kommt es zur Wärmegenerierung. Dies wird im Rahmen des sogenannten induktiven

Heizens solcher Partikel gezielt genutzt. Der zugrundeliegende Mechanismus dieser Wärme-

generierung stellen bei superparamagnetischen Partikeln zwei mögliche Relaxationsprozesse

dar. Die Néel-Relaxation und die Brown-Relaxation. Beide Mechanismen sind in Abbildung

10 graphisch gegenübergestellt und sollen im Folgenden kurz dargelegt werden. Die Exposi-

tion gegenüber einem Wechselmagnetfeld führt dazu, dass die magnetischen Momente der

Partikel versuchen der wechselnden Feldausrichtung zu folgen. Beim Übergang in den

Gleichgewichtszustand wird infolge der Néel-Relaxation Energie in Form von Wärme abge-

führt (vgl. Abbildung 10A). Darüber hinaus kann das alternierende Magnetfeld zur Gesamtro-

tation des Partikels führen. Liegt der Partikel suspendiert in einer Flüssigkeit vor, wird infol-

gedessen Reibungswärme freigesetzt. Dabei induziert das Wechselfeld ein Drehmoment auf

das magnetische Moment des Partikels, was letztlich dessen Rotation bedingt. Diese Rotation

wird als Brownsche Rotation bezeichnet (vgl. Abbildung 10B).[90, 91]

Abbildung 10: Schematische Darstellung der Néel-Relaxation (A) und Brown-Relaxation (B) in Anlehnung an Schmidt 2007 [92]. Die Exposition gegenüber einem Wechselmagnetfeld resultiert bei superparamagnetischen Partikeln in der Rotation der

magnetischen Momente (A) sowie der Rotation des gesamten Partikel (B). Beide „Rotationen“ haben die Freisetzung von

Wärme zur Folge.


Die Zeitkonstanten der beiden Mechanismen (τN = Néelsche Relaxationszeit; τB = Brownsche

Relaxationszeit) sind folgendermaßen definiert [93]

:

mit: kB: Bolzmannkonstante η: dynamische Viskosität des Mediums

K: effektive Anisotropiekonstante Vh: hydrodynamisches Volumen

V: Partikelvolumen : Versuchszeit (materialabhängig)

T: absolute Temperatur

Beide Mechanismen finden parallel statt, wobei der Prozess mit der kürzeren Relaxationszeit

entsprechend dominiert.

Im Falle suspendiert vorliegender Partikel herrscht bei größeren Partikel im Allgemeinen eher

der Brownsche Mechanismus und bei kleineren Partikeln eher der Néel-Mechanismus vor.[92]

Da beide Relaxationsprozesse in direktem Zusammenhang mit der Wärmegenerierung super-

paramagnetischer Nanopartikel im hochfrequenten alternierenden Magnetfeld stehen, wird

deutlich, von wie vielen Parametern diese abhängt. In einer Theorie von Rosensweig wird das

komplexe physikalische Verhalten superparamagnetischer Partikel in Folge einer derartigen

Magnetfeldexposition beschrieben.[94]

Die detaillierte Ausführung dieser Theorie würde an

dieser Stelle zu weit führen. Rosensweigs physikalische Beschreibung impliziert, dass die

Wärmegenerierung neben den Feldparametern, Magnetfeldstärke und Frequenz, durch diverse

Parameter, wie z. B. Partikelgröße oder der Viskosität des umgebenden Mediums, beeinflusst

und optimiert werden kann.

1.3.2 Superparamagnetische Eisenoxidpartikel: Magnetit im Fokus

Nanopartikel, die einen Eisenoxidkern aufweisen und superparamagnetisches Verhalten zei-

gen, werden als superparamagnetische Eisenoxidnanopartikel (engl. superparamagnetic iron

oxide nanoparticles, SPIONs) bezeichnetet. Aufgrund der unterschiedlichen Modifikationen

von Eisenoxid umfasst dies Nanopartikel mit einem Kern aus Maghemit (γ-Fe2O3), Magnetit

(Fe3O4) und Hämatit (α-Fe2O3). Auch Mischungen dieser Kerne mit beispielsweise Kupfer,

Kobalt und Mangan werden, sofern sie das entsprechende Verhalten aufweisen, prinzipiell


dieser Definition zugeordnet.[95]

Im Folgenden wird nur auf die reinen Eisenoxidpartikel ein-

gegangen und aufgrund seiner Bedeutung für diese Arbeit auf Magnetit im Speziellen. Bei

Magnetit handelt es sich um ein natürlich vorkommendes Oxidmineral, dass Eisen der Oxida-

tionsstufe II und III enthält, weshalb es auch als Eisen(II, III)-oxid bezeichnet wird. Die Kris-

tallstruktur und der Aufbau der Einheitszelle sind in Abbildung 11 detailliert gezeigt. Das

ferrimagnetische Mineral kristallisiert kubisch in der sogenannten inversen Spinell-Struktur.

Insgesamt 32 Oxidionen bilden dabei die dichteste Kugelpackung. Die acht tetraedrischen und

16 oktaedrischen Gitterlücken werden, gemäß der unten gezeigten Abbildung 11, durch Ei-

sen (II) und Eisen (III)-Ionen besetzt.[96, 97]

Abbildung 11: Darstellung der Kristallstruktur bzw. Einheitszelle von Magnetit (a). Die tetraedrischen und oktaedrischen

Lücken werden durch Eisenionen, der gezeigten Legende entsprechend, besetzt. Basierend auf dieser Anordnung kommt es

zur Ausbildung zweier Untergitter (b). Verwendung der Abbildung mit freundlicher Genehmigung des John Wiley & Sons

Verlags, Gossuin et al. 2009 [97].

Für Nanopartikel auf Magnetit-Basis ist ab einer Größe von ca. 20-30 nm ein Übergang vom

ferromagnetischen zum superparamagnetischen Verhalten beschrieben.[98]

Partikel, die diesen

Schwellenwert unterschreiten, bestehen demnach aus einer einzelnen Domäne und weisen

keine Hysterese auf. Nach Entfernen eines externen Magnetfeldes bleibt aufgrund dessen kei-

ne Restmagnetisierung zurück. Dies ist ein ausschlaggebendes Charakteristikum für den bio-

medizinischen Einsatz solcher Partikel. Dadurch wird eine magnetisch induzierte Aggregation

umgangen, was eine potentielle in vivo Anwendung derartiger Partikel grundsätzlich begüns-

tigt.[99]

Ein weiterer in diesem Kontext anzuführender Aspekt ist das gute Toxizitätsprofil die-

ser Partikel.[100]

Die Eisenoxidpartikel werden in vivo zu Eisen abgebaut und dem physiologi-

schen Eisendepot zugeführt. Demnach sind diese Partikel bioabbaubar.[99]


1.3.3 SPIONs im pharmazeutisch-medizinischen Anwendungskontext

Superparamagnetische Eisenoxidnanopartikel besitzen aufgrund ihrer speziellen magneti-

schen Eigenschaften ein breites Anwendungsspektrum im medizinisch-pharmazeutischen Be-

reich.[101]

In Kombination mit ihrer guten Oberflächenmodifizierbarkeit ergeben sich für SPI-

ONs sowohl diagnostische als auch therapeutische Einsatzmöglichkeiten. Eine Übersicht po-

tentieller Modifizierungsmöglichkeiten sowie Anwendungsfelder ist in Abbildung 12 gezeigt.

Im Folgenden soll anhand dessen das Potential dieser Partikel für den medizinisch-

pharmazeutischen Sektor deutlich gemacht werden.

Abbildung 12: Darstellung der Anwendungsfelder und Funktionalisierungsmöglichkeiten von SPIONs im medizinisch-

pharmazeutischen Kontext.

Im Hinblick auf das diagnostische Anwendungsfeld sind mit Dextran-gecoateten superpara-

magnetischen Eisenoxidpartikeln bereits die ersten SPIONs zugelassen (z. B. Resovist®, Feri-

dex l.V.®). Diese SPIONs werden als Kontrastmittel in der Magnetresonanztomographie

(MRT) eingesetzt. Die diagnostische Wirkung der angeführten leberspezifischen Kontrastmit-

tel beruht darauf, dass diese Eisenoxidpartikel in der Leber von bestimmten, in gesundem

Lebergewebe homogen verteilten, Zelltypen aufgenommen werden. Daraus resultiert eine

selektive Kontrastierung. Die inkorporierten SPIONS führen aufgrund ihrer hohen T2/ T2*

Relaxivität zu einem Signalverlust in den entsprechenden Bereichen, sodass das gesunde Le-

bergewebe im MRT schwarz erscheint (Negativkontrastierung). Leberläsionen oder bei-

spielsweise Lebermetastasen, die diese Partikel-inkorporierenden Zellen hingegen nicht oder

in einer funktionsgestörten Form aufweisen, können darüber sichtbar gemacht werden.[102]

Die Entwicklung weiterer SPIONs für diagnostische Zwecke wird derzeit intensiv beforscht.

Durch die Aufnahme in Makrophagen könnten SPIONs zukünftig zur bildlichen Darstellung

von Infektionen und Entzündungen genutzt werden.[103]

Die große Oberfläche dieser Partikel

bietet zudem vielfältige Funktionalisierungsmöglichkeiten. Ein Ansatz der darüber verfolgt

wird ist die gezielte Ansteuerung von Tumoren, um diese am MRT besser lokalisieren zu


können.[104, 105]

Neben der medizinischen Bildgebung stellen SPIONs auch für andere phar-

mazeutisch-medizinische Anwendungen eine interessante Option dar. Hierzu zählt das An-

wendungsfeld des gezielten Wirkstofftransports. Im Rahmen des sogenannten Magnetic-

Drug-Targeting wird versucht über das Anlegen eines Magnetfeldes SPIONs an dem ge-

wünschten Wirkort zu akkumulieren. Der entsprechende Wirkstoff ist hierzu meist durch

Oberflächenmodifizierungen an die SPIONs gebunden. Ein Großteil der Forschungsbemü-

hungen konzentriert sich in diesem Kontext auf die Krebstherapie. Diverse chemotherapeuti-

sche Wirkstoffe wurden bereits an SPIONs gekoppelt und über magnetische Felder erfolg-

reich im Tumorgewebe angereichert.[106-108]

Ein weiteres Anwendungsfeld der SPIONs ist die

Stimulus-responsive Wirkstofffreisetzung. Möglich ist dies aufgrund ihrer Fähigkeit sich un-

ter Anlegen eines hochfrequenten Wechselmagnetfelds zu erwärmen. Eingebettet in ein ent-

sprechendes Polymer oder Lipid, lässt sich ein zusätzlich inkorporierter Wirkstoff über diesen

externen Stimulus freisetzten.[109]

Dies konnte bereits in zahlreichen Arbeiten für diverse

Wirkstoffe gezeigt werden.[110-112]

Ein Ansatz der sich ebenfalls diesem externen Stimulus

bedient ist die sogenannte magnetische Hyperthermie. Dabei handelt es sich um eine aus-

sichtsreiche Therapieform zur Krebsbehandlung. Hierbei werden in das Tumorgewebe SPI-

ONs injiziert, welche sich anschließend durch das Einbringen in ein hochfrequentes Wech-

selmagnetfeld erhitzten. Dieses Übererwärmen des Tumorgewebes begünstigt letztlich dessen

Zerstörung.[113]

Für bestimmte Hirntumore ist diese Art der Behandlung mit dem Produkt

NanoTherm® und der entsprechenden NanoTherm

® Therapie (MagForce AG) bereits zugelas-

sen.[114]

Die hier angeführten Anwendungsbeispiele lassen das Potential der SPIONs für den

medizinisch-pharmazeutischen Sektor erahnen.

1.4 Zielsetzung der Arbeit und Vorgehensweise

Die Motivation dieser Arbeit bestand in der Entwicklung eines neuartigen Ansatzes zur

Überwindung einer der wichtigsten nicht-zellulären Barriere bei der pulmonalen Wirkstoffap-

plikation – die Mukusbarriere. Dieser Barriere kommt eine äußerst wichtige physiologische

Bedeutung zu. Inhalierte Fremdpartikel und Krankheitserreger bleiben an der viskosen Mu-

kusschicht haften und werden über die Bewegung der unterliegenden Zilien im Rahmen der

sogenannten mukoziliären Clearance abtransportiert. Diese Schutz- und Abwehrfunktion der

Lunge macht jedoch andererseits eine effiziente Wirkstoffapplikation über diese Applikati-

onsroute zu einer großen Herausforderung. Dies gilt nicht nur für die systemisch intendierte,

sondern ebenso für lokoregionale Wirkstoffapplikationen in der Lunge. Im Falle der zysti-

schen Fibrose ist diese Mukusschicht noch weitaus viskoser und somit noch schwere

durchdringbar. Eine Pharmakotherapie von Pseudomonas aeruginosa-Infektionen bei ZF-

Patienten ist aufgrund dessen beispielsweise stark limitiert.


Das primäre Ziel der vorliegenden Arbeit ist die Entwicklung eines speziellen Wirkstoffträ-

gersystems, welches diese Mukusbarriere zu überwinden vermag. Der Ansatzpunkt hierfür

stellt die Viskositätserniedrigung dieser äußerst viskosen Barriere dar und zwar induziert

durch eine lokale Temperaturerhöhung. Ein völlig neuartiger Ansatz, der bislang in der Lite-

ratur nicht beschrieben ist.

Ein Trägersystem, dass sich infolge eines externen Stimulus erwärmt, bietet dafür die ideale

Plattform. Vor diesem Hintergrund wurde die Entwicklung eines solchen Systems, bestehend

aus dem Polymer Poly-lactid-co-Glycolid (PLGA) und darin inkorporiert vorliegenden super-

paramagnetischen Magnetit-NP, angestrebt. Beide Materialien sind biokompatibel und bioab-

baubar und somit hoffnungsvolle Kandidaten für ein Wirkstoffträgersystem. Die Magnetit-NP

stellen hierbei die Komponente dar, die auf den hier gewählten physikalischen Stimulus, ein

hochfrequentes Wechselmagnetfeld, reagiert. Setzt man die Kompositpartikel einem derarti-

gen Feld aus, so sollte theoretisch eine Erwärmung dieser Partikel resultieren. Die induktiv

generierte Partikelerwärmung erniedrigt, so die grundlegende Hypothese des hier vorgestell-

ten Ansatzes, die Viskosität des den Kompositpartikel umgebenden Mukus lokal. Infolge der

postulierten Viskositätserniedrigung ist das Trägersystem befähigt, die Mukusbarriere zu

überwinden und den Transport von Wirkstoffen über diese Barriere hinweg zu ermöglichen.

Im Hinblick auf den in dieser Arbeit verfolgten neuartigen Ansatz zur Überwindung der Mu-

kusbarriere, wurden verschiedene Zwischenschritte definiert. Die im Rahmen der vorliegen-

den Arbeit bearbeiteten Teilaspekte sollen an dieser Stelle kurz vorgestellt werden:

Herstellung und Charakterisierung der magnetischen Nanokomposite

Die Etablierung einer Methode mit der sich die für die Indikation angedachten magneti-

schen Kompositpartikel herstellen lassen, stellt den Ausgangspunkt dieser Arbeit dar. In

diesem Zusammenhang wurde sich auf die Nanopräzipitation als Herstellungsmethode der

Wahl festgelegt. Für die Protokolletablierung sollen Kompositpartikel unter Änderung

verschiedener Parameter generiert und hinsichtlich Größe, Größenverteilung und Morpho-

logie charakterisiert werden. Die Beladung mit Magnetit-NP sowie deren Inkorporations-

verhalten in der Polymermatrix sind, ebenso wie die magnetischen Eigenschaften der

Kompositpartikel, weitere wichtige Untersuchungsaspekte. Primäres Ziel ist die kontrol-

lierte und reproduzierbare Herstellung von Kompositpartikeln, die sich unter dem ange-

dachten Stimulus induktiv erwärmen lassen.


Induktives Heizen der magnetischen Nanokomposite

Die Erwärmung der Kompositpartikel unter Anlegung eines hochfrequenten Magnetwech-

selfeldes ist die Grundvoraussetzung für die mit diesem Trägersystem beabsichtige Weise

die Mukusbarriere zu überwinden. Die Testung inwieweit die magnetischen Kompositpar-

tikel dieses Kernkriterium erfüllen, ist daher von großer Bedeutung. Dafür gilt es ein ent-

sprechendes Set-up zu entwickeln, welches neben dem induktiven Heizen der Partikel ei-

ne präzise Messung der generierten Wärme ermöglicht. Zudem sind mögliche Einflusspa-

rameter zu identifizieren und die optimalen Bedingungen für eine effiziente Erwärmung

herauszuarbeiten.

Induktionserwärmung und Partikelmigrationsverhalten in Mukus

Die Einflussuntersuchung der induktiven Erwärmung auf das Partikelmigrationsverhalten

in Mukus stellt ein wesentlicher Schritt hinsichtlich des in dieser Arbeit verfolgten Ansat-

zes dar. Hierfür gilt es zunächst ein geeignetes Set-up zu entwickeln mit dessen Hilfe sich

die Partikelpenetration in Mukus unter induktiven Heizbedingungen grundsätzlich unter-

suchen lässt. Die Etablierung dieses experimentellen Versuchsaufbaus wird in der vorlie-

genden Arbeit aufgrund der geringen Verfügbarkeit von nativem Mukus zunächst anhand

eines entsprechenden Modellgels erfolgen. Im Rahmen der Setup-Etablierung ist zudem

ein erster grundsätzlicher Machbarkeitsnachweis des in dieser Arbeit postulierten Zu-

sammenhangs zwischen applizierter Wärme und Partikelpenetrationsverhalten angedacht.

Darüber hinaus ist in dieser Arbeit die Entwicklung eines Wirkstoffträgersystems zur Behand-

lung chronischer Pseudomonasinfektionen bei ZF-Patienten intendiert. Als Wirkstoff soll in

diesem Zusammenhang das Antibiotikum Ciprofloxacin in die magnetischen Kompositparti-

kel co-verkapselt werden. Die Wirkstofffreisetzung ist Stimulus responsiv über das Anlegen

eines hochfrequenten Wechselmagnetfeldes beabsichtigt. Damit eröffnet dieses Trägersystem,

aufgrund seiner theoretischen Erwärmbarkeit, eine völlig neuartige Behandlungsstrategie.

Durch die hier postulierte, via Erwärmung induzierte, bessere Penetrierbarkeit, könnte das

Trägersystem die im äußerst viskosen ZF-Mukus inkorporiert vorliegenden Erreger erreichen

und diese durch die simultane Wirkstofffreisetzung effektiv bekämpfen.

26 2 Material und Methoden

2 Material und Methoden

2.1 Verwendete Materialien

2.1.1 Chemikalien

Die in dieser Arbeit verwendeten Chemikalien sind in Tabelle 1 aufgeführt und entsprachen,

sofern nicht anders angegeben, dem Reinheitsgrad für analytische Zwecke. Das im Rahmen

dieser Arbeit verwendete Wasser wurde durch Umkehrosmose gewonnen und mit der

Reinstwasser-Aufbereitungsanlage Millipore Q-Gard®2 (Merck Millipore, Billerica, USA)

aufgereinigt.

Tabelle 1: Verwendete Chemikalien

Substanz Hersteller/ Bezugsquelle

Aceton VWR, Fontenay-sous-Bois, Frankreich

Acetonitril Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim

Chloroform Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim

Dimethylsulfoxid Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe

Hydroxyethylcellulose,Tylose H300NG4 SE Tylose GmbH & Co. KG, Wiesbaden

PLGA 50:50, Resomer RG 503 H Evonik Industries AG, Darmstadt

Polyvinylalkohol Kuraray Europe GmbH, Hattersheim

Triethylamin Merck-Schuchardt OHG, Hohenbrunn

Uranylacetat SERVA Electrophoresis GmbH, Heidelberg

Magnetit-NP

Die im Rahmen dieser Arbeit zur Herstellung der magnetischen Nanokompositen verwende-

ten Magnetit-NP wurden von Qian Zhang (Doktorandin im AG Biophotonik, Philipps-

Universität Marburg; Bezugsquelle 1) sowie Sandra Schäfer (Doktorandin am Institut für An-

organische Festkörperchemie, Universität des Saarlandes; Bezugsquelle 2) synthetisiert. Bei

beiden Bezugsquellen wurden die ölsäurestabilisierte Magnetit-NP mit einem hydrodynami-

schen Durchmesser von ca. 10 nm nach dem Protokoll von Sun et al.[115]

synthetisiert. Im

Rahmen der Synthese von Bezugsquelle 2 wurde 1,2-Hexadecanediol durch 1,2-

Tetradecandiol ersetzt, die Partikel magnetisch abdekantiert statt zentrifugiert, 3x mit Ethanol

gewaschen und anschließend (ohne Trocknen) in Chloroform überführt. Die Konzentration

2 Material und Methoden 27

der von beiden Bezugsquellen abgegebenen und in Chloroform redispergierten Magnetit-NP

entspricht 20 mg/ml. Die Partikel wurden nach der Synthese jeweils von der entsprechenden

Arbeitsgruppe hinsichtlich Größe und Größenverteilung mittels TEM bzw. DLS-Messungen

geprüft bzw. charakterisiert. Eine schematische Darstellung sowie eine TEM-Aufnahme der

von Bezugsquelle 1 und 2 synthetisierten Magnetit-NP findet sich in Abbildung 13.

Abbildung 13: Schematische Darstellung (A) und TEM-Aufnahmen (B) der mit Ölsäure hydrophobisierten Magnetit-NP der

Bezugsquelle 1 und 2. Der Maßstabsbalken in B-1 entspricht 60 nm, der Maßstabsbalken in B-2 entspricht 20 nm.

Ciprofloxacin

Der antibiotische Wirkstoff Ciprofloxacin (Cipro) sollte in der vorliegenden Arbeit in die

magnetischen Nanokomposite inkorporiert werden. Hierzu wurde auf eine komplexierte Vari-

ante dieses Wirkstoffes zurückgegriffen. Bestandteil dieser Komplexverbindung ist neben

Ciprofloxacin das anionische Tensid Natriumlaurylsulfat (SDS). In einer vorangegangenen

Forschungsarbeit konnte gezeigt werden, dass diese Komplexierung die Löslichkeit des Wirk-

stoffes erheblich verbessert, wodurch letztlich die Verkapselungseffizienz in PLGA-NP unter

Verwendung der Nanopräzipitationsmethode gesteigert werden konnte.[116, 117]

Vor diesem

Hintergrund wurde in dieser Arbeit auf den komplexierten Wirkstoff zurückgegriffen. In der

vorliegenden Arbeit ist unter der Bezeichnung Ciprofloxacin immer der Gegenionen-

basierende Wirkstoffkomplex zu verstehen. Synthetisiert und zur Verfügung gestellt wurde

der Ciprofloxacin-SDS-Komplex von Nazende Günday Türeli (externe Doktorandin im AK

Schneider, MJR Pharmjet GmbH). In Abbildung 14 ist die chemische Struktur dieses Kom-

plexes dargestellt. Dessen Herstellung ist dem in Günday Türeli et al. beschrieben Protokoll

zu entnehmen.[116]

Abbildung 14: Strukturformel des Ciprofloxacin-SDS-Komplexes nach Günday Türeli et al., 2016 [117].


2.1.2 Geräte und Verbrauchsmaterialien

In den beiden nachstehenden Tabellen sind die Geräte und Verbrauchsmaterialien aufgelistet,

die im Rahmen dieser Arbeit verwendet wurden.

Tabelle 2: Übersicht der verwendeten Geräte

Gerät Hersteller/ Bezugsquelle

Analysewaage, SAR CP 225D Sartorius AG, Göttingen

faseroptischen Temperatursensor, Sensortyp TS4 Optocon AG, Dresden

Gefriertrocknungsanlage, Alpha 2-4 LSC Martin Christ GmbH, Osterode am

Harz

Hochfrequenzgenerator IG 5/30000 Hüttinger Elektronik GmbH & Co.

KG, Freiburg im Breisgau

HPLC Pumpe P 680, ASI-100 Automated Sample

Injector, Detektor UVD340U Dionex GmbH, Idstein

HR-CS AAS ContrAA 700- Graphitrohrmodus mit

Flüssig-Probengeber MPE 60 Jena Analytik AG, Jena

Konfokales Laser-Scanning-Mikroskop, LSM 710 Carl Zeiss AG, Oberkochen

Magnetrührer, VWR VMS-D VWR International GmbH,

Darmstadt

Manuelle Pipette 5000 µl, 1000 µl, 100 µl Eppendorf AG, Hamburg

Massenspektrometer mit induktiv gekoppeltem

Plasma, Serie 7500

Agilent Technologies Deutschland

GmbH, Ratingen

pH-Meter Schott AG, Mainz

Photonenkorrelation-Spektrometer, Zetasizer Nano ZS Malvern Instruments Ltd., Worces-

tershire, UK

Rasterelektronenmikroskop, Zeiss EVO HD15 SEM Carl Zeiss AG, Oberkochen

Rotationsverdampfer, Rotavapor R-205 Büchi Labortechnik GmbH, Essen

Temperaturmessgerät, Fototemp 1-4 Optocon AG, Dresden

Transmissionselektronenmikroskop, JOEL-JEM-2010 JEOL GmbH., Freising

Transmissionselektronenmikroskop, JOEL-JEM-2011 JEOL GmbH., Freising

Vibrating Sample Magnetometer, EV7 ADE Technologies, MicroSense

LLC, Lowell, USA

Vortexter, Vortex-2-Genie Scientific Industries Inc., New York,

USA

Wärmeschrank Binder GmbH, Tuttlingen

Wasserimmersionsobjektiv Objektiv LDC-

Apochromat 40x/1,10 W Korr M27 Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena

Zentrifuge, Heraeus Multifuge X1R Thermo Electron LED GmbH,

Kalkberg


Tabelle 3: Übersicht der verwendeten Verbrauchsmaterialien

Verbrauchsmaterial Hersteller/ Bezugsquelle

15-Kammer-Probenhalter,15μ-Slide Angionese ibidi GmbH, Martinsried

Einmalkanüle, 0,55 x 25 mm B. Braun Melsungen AG, Melsungen

Einmalspritze, 5 ml B. Braun Melsungen AG, Melsungen

Einwegküvette, 1 ml Sarstedt AG & Co., Nümbrecht

HPLC-Säule, LiChroCART 125-4 LiChrospher

100 RP-18e (5 µm) Merck KGaA, Darmstadt

HPLC-Vorsäule, LiChrospher 100 RP-18e

(5 µm) Merck KGaA, Darmstadt

Leit-Tab Plano GmbH, Wetzlar

Midi MACS Säule Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch-

Gladbach

Pipettenspitzen Brand GmbH & Co.KG, Wertheim

Reaktionsgefäß, 1,5 ml Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen

Reaktionsgefäß, 2,0 ml Sarstedt AG & Co., Nümbrecht

Standard-Objekträger Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe

Stiftprobenteller Plano GmbH, Wetzlar

TEM Kupfergrid, S160-3 Kohlefilm auf

Kupfernetz 300 mesh Plano GmbH, Wetzlar

Zentrifugenröhrchen, 15/ 50 ml Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen

2.1.3 Biologisches Material

Bei dem in dieser Arbeit verwendete Mukus handelt es sich um respiratorischen Pferdemu-

kus. Dieser wurde im Rahmen einer Bronchoskopie an Pferden erhalten. Bezogen wurden die

Mukusproben aus der Pferdeklinik Altforweiler (Überherrn-Altforweiler) im Rahmen einer

Kooperation mit Frau Dr. med. Bianca Schwarz.

2.2 Charakterisierungsmethoden

In diesem Kapitel wird eine Übersicht der in dieser Arbeit verwendeten Charakterisierungs-

methoden gegeben. Eine umfassende Charakterisierung der magnetischen Nanokomposite ist

essentiell. Dies gilt sowohl zur Beurteilung der Effizienz des Herstellungsprozesses als auch

zur Bewertung der Zielerreichung und Umsetzbarkeit der angedachten Applikation. Die theo-

retischen Grundlagen der hierfür herangezogenen Methoden sind in der Literatur ausführlich

beschrieben. Daher wird an dieser Stelle nur eine Kurzdarstellung des jeweilig zugrundelie-

genden Messprinzips gegeben.


2.2.1 Dynamische Lichtstreuung

Die dynamische Lichtstreuung (DLS), auch als Photonenkorrelationsspektroskopie (PCS)

bezeichnet, ist eine Methode zur Größenbestimmung sehr kleiner Partikel. Das der Methode

zugrunde liegende Messprinzip beruht auf der Streuung von Licht an kolloidalen Teilchen. Im

Rahmen der Messung wird die Probe mit Laserlicht bestrahlt und die dabei resultierende

Streulichtintensität, bzw. deren Schwankungen, detektiert. Aufgrund der Brownschen Mole-

kularbewegung des Dispersionsmediums kommt es zur Diffusion der Partikel und somit zu

zeitabhängigen Schwankungen dieser Streulichtintensität. Die Intensitätsschwankungen kor-

relieren demzufolge mit der Partikelgröße. Messtechnisch erfasst werden diese durch einen

Photomultiplier. Aus den erhalten Messdaten wird eine Korrelationsfunktion generiert aus der

die Diffusionskonstante D hervorgeht mit der sich letztlich, eingesetzt in die Stokes-Einstein-

Gleichung, der mittlere hydrodynamische Partikeldurchmesser ermitteln lässt. Ausgegeben

wird dieser als z-Average. Zudem wird bei jeder Messung eine Verteilungsbreite in Form des

sogenannten Polydispersitätsindex (PDI) mit angegeben, der in der Praxis wie folgt bewertet

wird: Ein PDI von 0 entspricht einer monodispersen Verteilung. PDI-Werte < 0,200 charakte-

risieren eine enge, Werte von 0,300 - 0,500 eine breite und Werte ab 0,500 eine sehr breite

Partikelgrößenverteilung.[118, 119]

Die PCS wurde zur Charakterisierung der im Rahmen dieser Arbeit entwickelten Partikelsys-

teme herangezogen. Als Messgerät diente ein Zetasizer Nano ZS der Firma Malvern Instru-

ments. Hierzu wurden 50 µl der Partikelsuspension mit 950 µl Wasser verdünnt. Anschlie-

ßend wurde die jeweilige Probe in das Gerät eingebracht und in einem Winkel von 173 °C

dreifach vermessen.

2.2.2 Transmissionselektronenmikroskopie

Die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) ist ein hochauflösendes bildgebendes Ver-

fahren, welches neben der Morphologie auch die Analyse der inneren Struktur eines Objektes

ermöglicht. Die zu untersuchende Probe wird hierbei mit einem hochenergetischen Elektro-

nenstrahl durchstrahlt und optisch abgebildet. Der Strahlengang ähnelt dabei dem eines ge-

wöhnlichen Durchlichtmikroskops. Das zugrundeliegende Prinzip der Bildentstehung ist hin-

gegen ein anderes. Als Strahlquelle dient hier eine Kathode. Die thermisch emittierten Elekt-

ronen werden durch das Anlegen einer hohen Spannung zur Anode hin beschleunigt, bevor

die resultierende Strahlung durch ein Kondensorsystem gebündelt und auf das zu untersu-

chende Objekt fokussiert wird. Beim Durchgang des Elektronenstrahls kommt es zu Wech-

selwirkungen mit dem Objekt. Dabei durchdringen die Elektronen, je nach Position und Mas-

sendichte, das Objekt entweder ungehindert oder werden an den Atomen der Probe gestreut.

Der ungebeugte Primärstrahl wird durch diverse Linsen vergrößert bevor am Leuchtschirm

das Bild erzeugt bzw. dieses via CCD Kamera in ein digitales Bild umgewandelt wird. Die

gestreute Strahlung wird hingegen durch die sogenannte Kontrastblende weitgehend


absorbiert und somit von der Bildentstehung größtenteils ausgeschlossen. Man spricht in die-

sem Fall, da nur die schwach streuenden Bereiche abgebildet werden, von einer Hellfeldauf-

nahme. Die stark streuenden Bereiche erscheinen hierin dunkel auf hellem Untergrund. Nutzt

man zur Bilderzeugung durch Verschiebung dieser Blende hingegen ausschließlich die ge-

beugten Strahlen, resultiert eine sogenannte Dunkelfeldaufnahme. Eine detaillierte Herleitung

der Bild- und Kontrastentstehung sowie tiefergehende physikalische und mathematische

Grundlagen dieser Methode sind in entsprechender Fachliteratur zu finden.[120]

In der vorliegenden Arbeit wurde das TEM routinemäßig zur Untersuchung der hergestellten

magnetischen Kompositpartikel eingesetzt. Hauptaugenmerke lagen hierbei auf der Bestim-

mung von Partikelgröße, Partikelform und insbesondere auf der Anordnung der in den Kom-

positpartikel inkorporierten Magnetit-NP. Ferner wurden mittels TEM die reinen Magnetit-

NP untersucht. Im Rahmen der Forschungstätigkeiten am Institut für Pharmazeutische Tech-

nologie und Biopharmazie der Philipps-Universität Marburg erfolgten die transmissionselekt-

ronischen Untersuchungen an einem JOEL-JEM-2010 der Firma Jeol (JEOL GmbH, Frei-

sing). Im Zuge der Fortführung der Doktorarbeit am Institut für Biopharmazie und Pharma-

zeutischen Technologie der Universität des Saarlandes wurden die entsprechenden TEM-

Analysen an einem JOEL-JEM-2011 der Firma Jeol (JEOL GmbH, Freising) durchgeführt.

Die TEM-Untersuchung erfolgte an beiden Geräten ausschließlich im Hellfeldmodus. Im

Rahmen der Probenpräparation wurden die magnetischen Kompositpartikel mit einer 2%igen

Uranylacetatlösung kontrastiert. Ausschlaggebend hierfür ist die chemische Beschaffenheit

der Polymermatrix der Kompositpartikel. Das verwendete Polymer PLGA besteht ausschließ-

lich aus Elementen bzw. Atomen mit niedrigen Ordnungszahlen (O, C, H). Aufgrund dessen

ist keine nennenswerte Streuung und folglich auch kein nennenswerter Kontrast im Rahmen

einer transmissionselektronischen Untersuchung zu erwarten.

Um dennoch die Kompositpartikel mittels TEM abbilden zu können, wurde die sogenannte

Negativkontrastierung unter Verwendung von Schwermetallen angestrebt. Dabei lagern sich

die Metallionen beim Trocken der Schwermetallsalzlösung um die Partikel herum ab. Unter

dem Einwirken des Elektronenstrahls resultiert an diesen schweren Atomen eine starke Streu-

ung und somit ein starker Kontrastunterschied. Der Partikel erscheint im Zuge dessen im ne-

gativen Kontrast, d. h. hell auf dunklem Untergrund.[121]

Protokoll der Probenpräparation und Kontrastierung

Im Rahmen der Arbeit wurde ein Protokoll zur Probenpräparation und Kontrastierung entwi-

ckelt und etabliert, welches an dieser Stelle kurz vorgestellt werden soll. In Abbildung 15B ist

die hier etablierte Vorgehensweise schematisch dargestellt. Das dargestellte Protokoll umfasst

folgende Schritte: In einem ersten Schritt (1) wird die Partikelsuspension auf den Probenträ-

ger aufgebacht. Als Probenträger diente ein sogenanntes TEM-Grid mit einem Durchmesser


von 3 mm. Dieses besteht aus einem Kupfernetz, das mit einem dünnen Trägerfilm aus Koh-

lenstoff beschichtet ist. Nach Probenauftrag folgt der Kontrastierungsschritt (2) bei dem das

Grid mit der Probenseite zunächst 45 s in die 2%ige wässrige Uranylacetatlösung eintaucht

und danach weitere 2 min einwirken gelassen wird. Daran schließt sich ein Waschschritt mit

Wasser (3) an. Nach Absaugen der Flüssigkeit und Trocknen wird die so aufgebrachte und

kontrastierte Probe in den Probenhalter eingespannt und transmissionselektronenmikrosko-

pisch untersucht. In Abbildung 15A ist darüber hinaus die generelle Notwendigkeit der Ura-

nylacetat-Kontrastierung zur TEM-Untersuchung der hier hergestellten magnetischen Kom-

positpartikel gezeigt. In der linken TEM-Aufnahme sind partikuläre Objekte erkennbar, je-

doch mit einem schlechten Kontrast. Eine detaillierte Betrachtung der Partikel ist unmöglich,

da sie dem Elektronenstrahl ausgesetzt, unmittelbar zerlaufen. Die Kontrastierung erhöht

nicht nur den Kontrast, sondern verleiht den Partikeln eine gewisse Stabilität gegen den

Strahl.

Abbildung 15: Darstellung der Notwendigkeit der Kontrastierung zur TEM-Untersuchung (A). Gezeigt sind TEM-

Aufnahmen zum Zeitpunkt t0 sowie 1 s nach der Betrachtung am TEM. Daraus geht hervor, dass die Partikel aufgrund des

schwachen Kontrasts schwierig zu erkennen sind und aufgrund ihrer Sensitivität gegenüber dem Elektronenstrahl bei der

transelektronenmikroskopischen Betrachtung zerstört werden. Eine detaillierte Untersuchung ist demnach unmöglich. Durch

die Kontrastierung wird dem entgegengewirkt. In B sind die einzelnen Schritte der etablierten Probenpräparation zur TEM-

Untersuchung schematisch dargestellt.

2.2.3 Rasterelektronenmikroskopie

Die Rasterelektronenmikroskopie (REM), engl. Scanning Electron Microscopy (SEM), ist ein

bildgebendes Verfahren zur Charakterisierung der Form und Oberflächenbeschaffenheit von

Objekten. Im Gegensatz zu der im vorherigen Abschnitt beschrieben Elektronenmikroskopie-

art wird bei der REM die Probe nicht durchstrahlt, sondern die Probenoberfläche mit einem

scharf fokussierten Elektronenstrahl zeilenweise abgetastet. Dieser sogenannte Primärstrahl

erzeugt beim Auftreffen Wechselwirkungen mit dem Objekt. Infolgedessen werden u. a.

Rückstreuelektronen sowie Sekundärelektronen emittiert. Beide genannten Elektronenarten

können zur Bilderzeugung im REM genutzt werden. Meist wird jedoch in diesem Kontext auf

die Sekundärelektronen zurückgegriffen. Hierzu wird der am jeweiligen Rasterpunkt detek-

tierten Intensität an Sekundärelektronen eine Grauwertinformation zugeordnet und als Bild-

punkt dargestellt. Nach diesem Prinzip, hier vereinfacht dargestellt, entsteht eine Punkt-für-

Punkt Abbildung der Probenoberfläche. Eine ausführliche Darstellung der physikalischen und

technischen Grundlagen der Rasterelektronenmikroskopie findet sich in der Literatur.[122]


In der vorliegenden Arbeit wurde die Rasterelektronenmikroskopie eingesetzt um die herge-

stellten magnetischen Nanokomposite hinsichtlich Morphologie und Größe zu untersuchen.

Die Probe wurde hierzu in Tropfenform auf ein Siliziumwaferstück aufgebracht, welches zu-

vor auf den REM-Probenhalter geklebt wurde. Nach Trocknung der Probe wurde diese an-

schließend in einer Kathodenzerstäubungsanlage bei 40 mA für 50 s mit einer 30 nm Gold-

schicht besputtert. Dadurch wird die Probe für die nachfolgende REM-Untersuchung elekt-

risch leitfähig gemacht. Nach erfolgtem Sputtern wurde die Probe in die Probenkammer des

REM eingebracht und im Hochvakuum vermessen.

Die rasterelektronenmikroskopischen Untersuchungen erfolgten in dieser Arbeit an einem

Zeiss EVO HD15 REM der Firma Zeiss (Carl Zeiss AG, Oberkochen). Die Kompositpartikel

wurden hierzu aufgereinigt und verdünnt. Diese verdünnte Partikelsuspension wurde dann,

wie oben beschrieben, auf den Wafer aufgebracht und entsprechend untersucht.

2.2.4 Vibrationsmagnetometer

Das Vibrationsmagnetometer, engl. Vibrating Sample Magnetometer (VSM), dient zur Mes-

sung magnetischer Eigenschaften. Genauer gesagt lässt sich damit das Magnetisierungsver-

halten einer Probe näher untersuchen. Hierzu wird die zu charakterisierende Probe in ein

Magnetfeld eingebracht. In diesem wird die Probe bei bekannter Frequenz in Vibration ver-

setzt. Die dadurch resultierende Änderung der Probenmagnetisierung führt zu einem sich än-

dernden Fluss in der probennahen Aufnahmespule. Dies wiederum induziert eine messbare,

sich zeitlich ändernde Spannung. Basierend auf der hervorgerufenen Induktionsspannung

kann auf die Probenmagnetisierung rückgeschlossen werden, da sie zu dieser proportional ist.

Eine detaillierte Beschreibung des Messprinzips und apparativen Aufbaus findet sich in der

entsprechenden Fachliteratur.[123]

Die VSM-Messungen wurden am Institut für Physikalische Chemie der Universität zu Köln

von Frau Johanna Nothacker durchgeführt (Doktorandin in der Arbeitsgruppe von Frau Prof.

Dr. Anette Schmidt). Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde das VSM zur magentischen

Charakterisierung der hergestellten magnetischen Kompositpartikel sowie der hierzu einge-

setzten Magnetit-NP herangezogen. Primär sollten diese Messungen klären, inwieweit die

hergestellten Kompositpartikel das postulierte superparamagnetische Verhalten aufweisen.

Die zur Herstellung der Kompositpartikel genutzten Magnetit-NP wurden diesbezüglich eben-

falls untersucht. Die Proben wurden vor der Untersuchung gefriergetrocknet und vermessen.

Für eine Messung wurden 9-15 mg eingewogen. Das Probenmaterial wurde hierzu in einen

versiegelten Teflonbehälter überführt. Dieser wurde in den Probenraum zwischen den beiden

Polen des Elektromagneten eingebracht und bei einer Frequenz von 75 Hz in Vibration ver-

setzt. Die Magnetisierungskurven wurden unter Raumtemperaturbedingungen an einem Mag-

netics Vibrating Sample Magnetometer EV7 der Firma ADE Technologies (ADE Technolo-

gies, MicroSense LLC, Lowell, USA) mit einer maximalen Feldstäke bis zu 1600 kA m-1


aufgenommen. Aus den erhaltenen Kurven wurden die nachfolgenden Parameter berechnet:

Sättigungsmagnetisierung Ms, magnetischer Moment m, initiale Suszeptibilität χini, Durch-

messer des magnetischen Kerns sowie der magnetische Gehalt µmag der Probe.

2.2.5 Induktiv gekoppelte Plasma-Massenspektrometrie

Die Induktiv gekoppelte Plasma-Massenspektrometrie, engl. inductively coupled mass spect-

rometry (ICP-MS), ist eine spektrometrische Methode der Elementaranalyse. Dabei wird die

zu analysierende Probe zunächst aerosolisiert bevor sie mittels Plasma ionisiert wird. Dieses

Plasma wird durch die Induktion eines hochfrequenten Stroms in einem Trägergas, meist Ar-

gon, erzeugt. Die im Rahmen des Ionisierungsprozess entstehenden Probenionen werden an-

schließend unter Verwendung eines Massenspektrometers nach ihrem Masse-zu-Ladung-

Verhältnis (M/z) getrennt und detektiert. Eine ausführliche Beschreibung dieser Analyseme-

thode findet sich in der Fachliteratur.[124]

Die ICP-MS Messungen wurden im AG Biophotonik, Fachbereich Physik an der Philipps-

Universität Marburg von Herrn Karsten Kantner (Doktorand in der Arbeitsgruppe von Herr

Prof. Dr. Wolfgang Parak), durchgeführt. Die Methode wurde in der vorliegenden Arbeit zur

Eisenbestimmung herangezogen. Darüber sollte letztlich die Magnetit-Beladung der Nano-

komposite sowie die Effizienz dieser Magnetit-Einkapselung berechnet werden. Konkret

wurden mit dieser Methode die Nanokomposite untersucht, die unter Verwendung der Mag-

netit-NP der Bezugsquelle 1 hergestellt wurden. Im Hinblick auf Eisenbestimmung wurde

1 ml der jeweilig hergestellten Partikelsuspension entnommen und zentrifugiert (10.000 x g,

20 min). Das resultierende Pellet wurde anschließend in Wasser resuspendiert, gefrierge-

trocknet und gewogen. Für die Analyse des darin enthaltenen Eisens wurden die getrockneten

Kompositpartikel zur vollständigen Zerstörung bzw. Aufschluss der Polymermatrix für 4 h

mit Königswasser versetzt. Diese Aufschlusslösung wurde anschließend mit 2%iger Salzsäure

verdünnt, bevor sie in die ICP-MS (Serie 7500) der Fima Agilent (Agilent Technologies

Deutschland GmbH, Ratingen) eingebracht und analysiert wurde. Basierend auf dem hierbei

bestimmten Eisengehalt lässt sich auf den Magnetitgehalt schließen. Unter dessen Verwen-

dung lässt sich schließlich die Beladung und Einkapselungseffizienz für Magnetit ermitteln.

Die genaue Berechnung dieser Kennzahlen sowie die Umrechnung von Eisen auf Magnetit ist

im Kapitel 2.3.1.6 näher beschrieben.

2.2.6 Hochauflösende Kontinuumstrahler-Atomabsorptionsspektrometrie

Die hochauflösende Kontinuumstrahler-Atomabsorptionsspektrometrie, engl. high-resolution

continuum-source atomic absorption spectrometry (HR-CS-AAS), ist eine atomspektralanaly-

tisches Verfahren zur Elementanalyse. Das Grundprinzip der Atomabsorptionsspektrometrie

(AAS) besteht darin, die zu analysierende, atomisiert vorliegende Probe zu bestrahlen und die

Absorption dieser Strahlung messtechnisch zu erfassen. Aufgrund der elementspezifischen


Absorption kann über die Schwächung des eingestrahlten Lichtes auf die entsprechende Kon-

zentration des Elements geschlossen werden. Demnach gilt das Lambert-Beer'sche Gesetz.

Durch die Nutzung unterschiedlicher Verdampfungs- und Atomarisierungstechniken existie-

ren zahlreiche Formen der AAS. Eine ausführliche Beschreibung dieser findet sich in der ent-

sprechenden Fachliteratur [124, 125]

. Die in dieser Arbeit genutzte Form, die hochauflösende

Kontinuumstrahler-AAS, stellt eine relativ neue Weiterentwicklung dar. Das besondere hier

ist die Nutzung einer speziell entwickelten Xenon-Kurzbogenlampe als kontinuierliche Strah-

lungsquelle. Damit lassen sich alle Elemente und Wellenlängen abdecken, wodurch mehrere

Elemente parallel analysiert werden können.[126]

Die Wahl des Atomisators ist dabei unab-

hängig von der Verwendung des Kontinuumstrahlers. Im Rahmen dieser Arbeit erfolgte die

Atomisierung mittels Graphitrohrofen.

Die HR-CS-AAS Messungen wurden am INM – Leibniz-Institut für Neue Materialien unter

der Leitung von Frau Dr. Claudia Fink-Straube (Leiterin der Abteilung Chemische Analytik)

vorgenommen. In der vorliegenden Arbeit wurde diese Methode zur Analyse des Eisengehalts

unterschiedlich hergestellter magnetischer Nanokomposite herangezogen. Genauer gesagt

handelte es sich um Nanokomposite, die unter Verwendung von Magnetit-NP der Bezugs-

quelle 2 hergestellt wurden. Der Eisengehalt ist essentiell, um die beiden zur Beurteilung der

Herstellung relevanten Kenngrößen Einkapselungseffizienz und Beladung zu berechnen. Die

Proben-Vor- und Aufbereitung erfolgten analog zur Eisenbestimmung via ICP-MS (vgl.

2.2.5). Die Aufschlusslösungen der untersuchten Proben wurden, um im dynamischen Bereich

der Kalibration zu bleiben, mit 2%iger HCl entsprechend verdünnt. Die Eisenbestimmung

erfolgte an einem HR-CS AAS ContrAA 700 im Graphitrohrmodus der Firma Analytik Jena

(Analytik Jena AG, Jena). Durch den Flüssig-Probengeber MPE 60 (Analytik Jena AG, Jena)

wurde die Probe automatisiert aufgegeben. Anschließend wurde sie nach einem speziellen

Temperatur/Zeit-Programm im Graphitrohrofen atomisiert und analysiert. Die bestimmten

Eisenkonzentrationen (Fe) wurden in der vorliegenden Arbeit in Magnetitkonzentrationen

(Fe3O4) umgerechnet. Diese Umrechnung sowie die drauf basierende Bestimmung der beiden

Kennzahlen Beladung und Einkapselungseffizienz ist in Kapitel 2.3.1.6 gezeigt.

2.2.7 Hochdruckflüssigkeitschromatographie

Die Hochdruckflüssigkeitschromatographie, engl. High Pressure Liquid Chromatography

(HPLC), ist eine flüssigchromatographische Trenn- und Analysetechnik. Das zu trennende

Stoffgemisch, aufgenommen in der sogenannten mobilen Phase, wird hierbei mit hohem

Druck durch eine Trennsäule, die mit der sogenannten stationären Phase dicht bepackt ist,

geleitet. Der eigentliche Trennprozess resultiert aufgrund unterschiedlich starker Wechselwir-

kung der im Stoffgemisch enthaltenen Komponenten mit den beiden Phasen. Je ausgeprägter

diese ist, desto länger dauert es bis die entsprechende Substanz eluiert und detektiert wird. Im

Hinblick auf die stoffliche Zusammensetzung der beiden Phasen unterscheidet man verschie-

dene HPLC-Modi. Im Normalphasen-Modus ist die stationäre Phase polar und die mobile


Phase apolar, wohingegen im Umkehrphasen-Modus dies genau gegensätzlich ist. Für eine

vertiefende Darstellung der einzelnen Modi sowie der theoretischen Grundlagen sei an dieser

Stelle auf die einschlägige Fachliteratur verwiesen.[127]

In der vorliegenden Arbeit wurde die HPLC zur quantitativen Gehaltsbestimmung von Cip-

rofloxacin in den hergestellten Ciprofloxacin co-beladenen Nanokompositen herangezogen.

Für die HPLC-Analyse wurde auf eine im Arbeitskreis für diese Substanz etablierte HPLC-

Methode im Umkehrphasen-Modus zurückgegriffen. Es wurde ein Dionex UltiMate 3000

HPLC-System verwendet. Die Trennung erfolgte durch eine LiChrospher®100 RP-18 Säule

(125 x 4 mm; 5µm) und einer mobilen Phase bestehend aus 25 mM Orthophosphorsäure (pH

3; adjustiert mit Triethylamin) und Acetonitril (87:13, v/v) mit einer isokratischen Flussrate

von 1,5 ml/min. Die Detektion von Ciprofloxacin erfolgte bei einer Wellenlänge von 278 nm.

Das Injektionsvolumen betrug bei allen Messungen 50 µl.

Für die quantitative Bestimmung des in den co-beladenen Kompositpartikel verkapselten Cip-

rofloxacin wurden die zuvor gefriergetrockneten Partikel, zur Auflösung der Polymermatrix,

in DMSO gelöst. Für die RP-HPLC-Analyse wurden hiervon 500 µl in ein HPLC-

Probengefäß überführt und analysiert. Zur Erstellung der Kalibriergeraden wurden Ciproflo-

xacin-Standardlösungen unterschiedlichster Konzentrationen verwendet. Anhand dieser Ka-

libriergerade wurde die Ciprofloxacinkonzentration in den Proben bestimmt.

2.3 Experimentelle Methoden

Dieses Kapitel befasst sich mit den experimentellen Methoden und Versuchsaufbauten, die im

Rahmen dieser Arbeit Anwendung fanden bzw. entwickelt wurden. Zunächst wird in diesem

Kontext die Herstellung der magnetischen Nanokompositpartikel, einschließlich des zugrun-

deliegenden Prinzips, vorgestellt. Es folgt die Darstellung der experimentellen Vorgehenswei-

se bezugnehmend auf die induktive Erwärmbarkeit dieser Partikel. Darüber hinaus wird der

experimentelle Ansatz zur Untersuchung der temperaturabhängigen Mukuspenetration dieser

Partikel vorgestellt – der Kernhypothese dieser Arbeit.

2.3.1 Herstellung magnetischer Nanokomposite

2.3.1.1 Nanopräzipitation: Kurzvorstellung der Herstellungsmethode

Die Herstellung der magnetischen Nanokompositpartikel erfolgte im Rahmen dieser Arbeit

nach der Nanopräzipitationsmethode. Ein für Nanopartikel auf Polymerbasis als relativ ein-

fach, kostengünstig und schonend beschriebenes Herstellungsverfahren. Darüber hinaus be-

sitzt diese Methode neben ihrer prinzipiellen Scale-up-Fähigkeit ein hohes Automatisierungs-

potenzial und offeriert die Steuerbarkeit der Partikelgröße.[128, 129]

Aspekte, die einen


industriellen Einsatz dieser Methode grundsätzlich begünstigen und mitentscheidend für de-

ren Auswahl im Rahmen dieser Arbeit waren.

Eingeführt und etabliert wurde diese Technik zur Herstellung polymerer Nanopartikel Ende

der achtziger Jahre von Fessi et al.[130]

. Das der Methode zugrundeliegende Prinzip der Parti-

kelherstellung besteht darin ein in organischem Lösemittel gelöst vorliegendes Polymer mit

einem Nichtlösemittel in Kontakt zu bringen. Infolgedessen präzipitiert das Polymer in nano-

skaliger partikulärer Form. Grundvoraussetzung hierfür ist die vollständige Mischbarkeit des

Nichtlösemittels mit dem Polymerlösemittel.

Der zugrundeliegende Mechanismus dieser Partikelbildung ist hingegen wesentlich komple-

xer und konnte bis dato noch nicht vollständig geklärt werden. Ein in der Literatur diskutierter

und favorisierter Erklärungsansatz für die Partikelentstehung bei dieser Methode ist der soge-

nannte „Ouzo-Effekt“.[129, 131]

Die Namensgebung dieses Effekts rührt von der sich einstellen-

den milchigen Trübung durch Zugabe von Wasser zu anishaltigen Spirituosen, wie Ouzo. Der

zugrunde liegende und auf die Partikelentstehung übertragbare Mechanismus dieser Trübung

erklärt sich wie folgt: Das im Ouzo enthaltene, gelöst vorliegende ätherische Öl, Anethol ver-

hält sich ähnlich zu dem im Lösemittel gelöst vorliegenden Polymer. Durch Kontakt mit dem

Nichtlösemittel resultiert eine Übersättigung, wodurch die Bildung von Nukleationskeimen

induziert wird. Die einsetzende Aggregation dieser Keime zu größeren Tröpfchen wirkt der

Übersättigung entgegen. Ist die wässrige Phase nicht mehr mit dem Anethol übersättigt stoppt

die Agglomeration. Die milchige Trübung entsteht letztlich durch die Streuung des Lichts an

den resultierenden kolloidalen Teilchen. Der geschilderte Mechanismus lässt sich auf die

Nanopartikelbildung bei der Nanopräzipitation übertragen. Die lokale Übersättigung des

Polymers wird durch die Diffusion des Lösemittels in das Nichtlösemittel induziert. Es resul-

tiert ein metastabiler Zustand, der wie zuvor für das Öl beschrieben, eine spontane Nukleation

des Polymers bewirkt. Diese Polymerkeime aggregieren nach dem LaMer-Modell bis die kri-

tische Keimbildungskonzentration unterschritten wird und sich die kolloidale Stabilität ein-

stellt.[131]

2.3.1.2 Herstellung von Magnetit-PLGA-Nanopartikeln

Für die Verkapselung der Magnetit-NP in die aus PLGA bestehende Polymermatrix wurde

sich auf die Nanopräzipitationsmethode festgelegt. Die in der vorliegenden Arbeit entwickelte

Vorgehensweise ist in Abbildung 16 schematisch dargestellt. In einem ersten Schritt (1) wird

das Polymer PLGA in einem Lösemittel (LM), hier Aceton, gelöst. Der Polymerlösung wer-

den anschließend die in Chloroform vorliegenden, zu inkorporierenden, Magnetit-NP

(20 mg/ml; 10 nm) zugegeben. Zum Lösen des Polymers, bzw. Homogenisieren der in der

Lösung dispergiert vorliegenden Magnetit-NP, wird die Polymerlösung für 4 min mit Ultra-

schall beschallt. Anschließend folgt die eigentliche Nanopräzipitation (2). Hierzu wird die

Magnetit-NP enthaltende Polymerlösung (A) in eine Spritze aufgezogen und langsam, unter

Rühren in das Nichtlösemittel (B) präzipitiert. Das Nichtlösemittel stellt eine wässrige


Polyvinylalkohol-(PVA)-Lösung (2%) dar. Der Kontakt mit dem Nichtlösemittel induziert,

wie bereits im vorangegangenen Abschnitt beschrieben, die Fällung des Polymers in nanopar-

tikulärer Form. Die resultierenden Magnetit-PLGA-NP liegen letztlich suspendiert vor.

Abbildung 16: Schematische Darstellung der Vorgehensweise zur Herstellung von Magnetit-PLGA-NP nach der Nanopräzi-

pitationsmethode. Hierbei wird zunächst das Polymer im Lösemittel gelöst, bevor die zu inkorporierenden Magnetit-NP

zugegeben und darin homogenisiert werden (I). Daran schließt sich die eigentliche Partikelherstellung an, bei der die Poly-

merlösung mit den darin enthaltenen Magnetit-NP (A), mittels Spritze in ein Nichtlösemittel (B) präzipitiert werden. Das

Nichtlösemittel wird während des Injizierens der Polymerlösung gerührt.

Im Zuge einer anfänglichen Methodenentwicklung erfolgte die Einflussuntersuchung unter-

schiedlicher Mengen an Magnetit-NP auf deren Verkapselung und Einbettung in die Poly-

mermatrix. Hierzu wurden 35 µl, 50 µl und 85 µl der in CHCl3 dispergierten Magnetit-NP

(d. h. 0,7 mg, 1,0 mg und 1,7 mg) der Polymerlösung zugegeben. Die Methodenentwicklung

erfolgte unter Verwendung der von Bezugsquelle 1 erhaltenen Magnetit-NP. Für die Partikel-

herstellung wurde in der vorliegenden Arbeit die Magnetit-NP enthaltende Polymerlösung

unter Rühren (1000 rpm) in 10 ml PVA-Lösung injiziert. Die Konzentration der Polymerlö-

sung wurde auf 16,67 mg/ml festgelegt. Hierzu wurden 25 mg PLGA (Resomer RG 503H,

50:50) in 1,5 ml Aceton gelöst. Im Rahmen der Arbeit wurden die Herstellungsparameter

nach der anfänglichen Methodenentwicklung nicht weiter variiert. Sofern es nicht ausdrück-

lich anders angegeben ist, erfolgte die Herstellung von Magnetit-beladenen PLGA-NP unter

Verwendung von 50 µl, d. h. 1 mg Magnetit-NP. Das entspricht der mittleren, der hier evalu-

ierten Magnetit-Menge. Darüber hinaus wurden die Kompositpartikel im späteren Verlauf der

Arbeit, nach einer entsprechenden Evaluierung (Übertragbarkeit auf die Partikel aus Bezugs-

quelle 2 war gegeben) ausschließlich mit Magnetit-NP von Bezugsquelle 2 hergestellt.


2.3.1.3 Herstellung von fluoreszierenden Magnetit-PLGA-Nanopartikeln

Die Herstellung fluoreszenzmarkierter Magnetit-PLGA-NP erfolgte analog zu der im vorheri-

gen Kapitel beschriebenen Herstellung von Magnetit-beladenen PLGA-NP. Der einzige Un-

terschied besteht in der Verwendung von Rhodamin B markiertem PLGA (RhoBPLGA). Die

Fluoreszenzmarkierung des Polymers erfolgte in Anlehnung an das von Horisawa et al. etab-

lierte Protokoll [132, 133]

. Durch Verwendung dieses PLGA-Typs sind die resultierenden Nano-

partikel unter Anregung mit der entsprechenden Wellenlänge detektierbar. Die Menge an

Polymer, Magnetit-NP, Lösemittel und Nichtlösemittel sowie alle andere Prozessparameter

wurden gleich gehalten. Die Magnetit-RhoBPLGA-NP wurden demnach unter Verwendung

von 25 mg RhoBPLGA, 1,5 ml Aceton, 50 µl Magnetit-NP (20 mg/ml in CHCl3) sowie 10 ml

PVA-Lösung (2%) hergestellt.

2.3.1.4 Herstellung von Cipro co-beladenen Magnetit-PLGA-Nanopartikeln

Die Herstellung magnetischer Nanokompositpartikel, in denen zusätzlich der Wirkstoff Cip-

rofloxacin (Cipro) inkorporiert vorliegt, erfolgte in Anlehnung an die zuvor in Kapitel 2.3.1.2

beschriebene Methode zur Herstellung von Magnetit-PLGA-NP. Die zusätzliche Einbettung

von Cipro erforderte entsprechende Modifikationen in der Vorgehensweise, die in Abbildung

17 indiziert sind. Um den Wirkstoff zusammen mit den Magnetit-NP in der Polymermatrix

einzubetten, wird dieser in dem ersten Schritt mit dem Polymer in Lösung gebracht. Dieser

Wirkstoff-Polymerlösung werden anschließend die Magnetit-NP zugesetzt. Das weitere Vor-

gehen erfolgte analog zur Herstellung der Magnetit-PLGA-NP.

Abbildung 17: Schematische Darstellung der Vorgehensweise zur Herstellung von Cipro co-beladenen Magnetit-PLGA-NP

nach der Nanopräzipitationsmethode. Hierbei werden zunächst das Polymer und der Wirkstoff Ciprofloxacin im Lösemittel

gelöst. Danach werden die zu inkorporierenden Magnetit-NP zugegeben und darin homogenisiert (I). Daran schließt sich die

eigentliche Präzipitation an (2). Hierbei wird die Polymer-Wirkstoff-Lösung, samt darin dispergiert vorliegender Magnetit-

NP (A), in ein Nichtlösemittel (B) injiziert.


Die bedeutendste Abweichung im Herstellungsprozess gegenüber der Herstellung der Magne-

tit-PLGA-NP betrifft das Lösemittel. Die angestrebte Co-Verkapselung von Ciprofloxacin

erforderte einen Wechsel des Lösemittels von Aceton auf DMSO. Dies liegt im Wesentlichen

in der deutlich besseren Löslichkeit des Wirkstoffkomplexes in DMSO gegenüber Aceton

begründet (24,8 mg/ml ≙ Löslichkeit in DMSO; 289,6 µg/ml ≙ Löslichkeit in Aceton).[116]

Zur Herstellung der Partikel wurde der Ciprofloxacin-SDS Komplex gemeinsam mit dem

PLGA (Resomer RG 503H, 50:50) in DMSO gelöst. Die Konzentration des Wirkstoffs betrug

hierbei 3,3 mg/ml, die Polymerkonzentration 16,67 mg/ml. Um den Einfluss unterschiedlicher

Mengen an Magnetit-NP auf die Co-Verkapselung zu untersuchen wurden 35 µl, 50 µl und

85 µl der in CHCl3 dispergierten Magnetit-NP (d. h. 0,7 mg, 1,0 mg und 1,7 mg) der Polymer-

lösung zugegeben. Die Polymer- und Wirkstoffmenge wurde hingegen konstant gehalten. Das

Lösen des Wirkstoffs und Polymers erfolgte ebenso wie das Homogenisieren der in der Wirk-

stoff-Polymer-Lösung vorliegenden Magnetit-NP unter Einwirkung von Ultraschall. Die vor-

bereitete, die Magnetit-NP enthaltende Wirkstoff-Polymerlösung wurde anschließend zur Par-

tikelbildung in die PVA-Lösung (2%) injiziert. Das Nichtlösemittel ist, wie bei der Herstel-

lung der Magnetit-PLGA-NP, vollständig mit dem LM, hier DMSO, mischbar.

2.3.1.5 Aufreinigung, Trocknung und Aufkonzentrierung der Partikel

Aufreinigung

Die Aufreinigung der nach Herstellung in suspendierter Form vorliegenden Nanokomposit-

partikel erfolgte in der vorliegenden Arbeit primär durch Zentrifugation. Eine derartige Auf-

reinigung wurde zur Bestimmung der Beladungs- und Einkapselungseffizienz, entweder be-

zogen auf die Magnetit-NP oder im Falle der co-beladenen Partikel des Ciprofloxacins vorge-

nommen. Die Zentrifugation sollte, sofern vorhanden, nicht verkapselte Substanzen entfernen,

um sie als Störfaktor in der nachfolgenden Quantifizierung auszuschließen. Zudem wurde

darüber der Stabilisator PVA, der in der finalen Partikelsuspension vorliegt und unabgetrennt

die rasterelektronenmikroskopische Untersuchung der Partikel stört, entfernt. Wenn nicht an-

ders angegeben wurden die Partikel bei 10.000 x g für 20 min zentrifugiert. Die sich anschlie-

ßende Resuspendierung der Partikel erfolgte mit Wasser.

Eine spezielle Form der Aufreinigung wurde für die TEM-Bild basierte Untersuchung hin-

sichtlich des Einflusses der eingesetzten Magnetit-NP auf die resultierende Verkapselung die-

ser NPs in die PLGA-Matrix vorgenommen. In einem dieser Untersuchung vorgeschalteten

Arbeitsschritt wurden 500 µl der jeweiligen Partikelsuspension auf eine Midi MACS Säule

(Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch-Gladbach) gegeben. Hierbei handelt es sich um eine mit

Eisenkugeln gepackte Säule, die in ein Magnetfeld eingebracht, Probenkomponenten auf-

grund von magnetischen Anziehungskräften zurückhalten kann. Hierdurch sollten unbeladene

PLGA-NP von Magnetit-NP beladenen PLGA-NP abgetrennt werden, um den einflussneh-

menden Effekt der Magnetit-NP Konzentration auf die Beladung besser untersuchen zu kön-

nen.


Trocknung

Die Trocknung der Nanokomposite erfolgte im Rahmen dieser Arbeit unter Verwendung der

Gefriertrocknung. Hierfür wurden die aufgereinigten, in suspendierter Form vorliegenden,

Partikel zunächst bei -80 °C vorgefroren. Zur Entfernung des enthaltenen Wassers wurden die

tiefgefrorenen Proben anschließend in die Gefriertrocknungsanlage eingebracht. Der Trock-

nungsvorgang belief sich, abhängig vom Probenvolumen, auf 24 - 72 h. Nach erfolgter Ge-

friertrocknung wurde das Lyophilisat gewogen. Eine derartige Trocknung war zur Bestim-

mung der Beladungs- und Einkapselungseffizienz sowie zur magnetischen Charakterisierung

der Kompositpartikel mittels der VSM vorzunehmen.

Aufkonzentrierung

Die Aufkonzentrierung der hergestellten Nanokompositen erfolgte in der vorliegenden Arbeit

durch Zentrifugation und anschließender Resuspendierung in einem entsprechenden kleineren

Volumen. Erforderlich war diese Aufkonzentrierung bei der induktiven Erwärmung der mag-

netischen Kompositpartikel. Zur induktiven Partikelerwärmung wurden zwei Formulierungs-

ansätze gereinigt und mittels Zentrifugation auf 0,5 ml eingeengt (10.000 x g, 30 min). Eine

derartige Aufkonzentrierung war notwendig, um eine Erwärmung, beziehungsweise deren

messtechnische Erfassung, realisieren zu können.

2.3.1.6 Berechnung der Kennzahlen, Beladung und Einkapselungseffizienz

Ciprofloxacin

Die Beladung und Einkapselungseffizienz von Ciprofloxacin wurde wie folgt berechnet:

ä

Die Masse an Cipro in den Partikeln bezieht sich hierbei auf die in den gefriergetrockneten

Partikeln unter Verwendung der HPLC analysierte Menge. Durch das Volumen, das zur Auf-

lösung der gefriergetrockneten Partikel verwendet wurde, lässt sich von der Cipro-

Konzentration auf die in den Partikeln verkapselte Cipro-Menge rückschließen.


Magnetit

Die Bestimmung der Beladung und Einkapselungseffizienz von Magnetit erfolgte nach den

beiden nachstehenden Formeln:

Die Masse an Magnetit in den Partikeln bezieht sich hierbei auf die in den gefriergetrockneten

Partikeln unter Verwendung der ICP-MS bzw. HR-CS-AAS analysierte Menge an Eisen.

Nach Auflösung der Polymermatrix lässt sich über den ermittelten Eisengehalt auf den Mag-

netitgehalt schließen. Unter Berücksichtigung der chemischen Formel von Magnetit, d. h.

Fe3O4, lässt sich die Konzentration des Sauerstoffs unter Verwendung der molaren Masse von

Sauerstoff (MO = 16 g/mol) und Eisen (MFe = 55,85 g/mol) folgendermaßen herleiten:

cO = 4/3 cFe (MO/MFe)

Die Massenkonzentration von Magnetit (Fe3O4) entspricht demnach:

cFe3O4 = cFe+cO

Eine derartige Umrechnung in Magnetit wurde für sämtliche, in dieser Arbeit bestimmten,

Eisenkonzentrationen vorgenommen.

2.3.2 Induktives Heizen magnetischer Nanokomposite

2.3.2.1 Etablierung eines Setups zum induktiven Heizen

Für die angedachte Applikation des hier entwickelten Wirkstoffträgersystems ist die Eigen-

schaft sich in einem Magnetwechselfeld induktiv zu erwärmen essentiell. Inwieweit die her-

gestellten magnetischen Kompositpartikel dieses Kernkriterium erfüllen, stellte einen wichti-

gen Untersuchungsaspekt dieser Arbeit dar. Dafür galt es ein entsprechendes Set-up zu entwi-

ckeln, welches neben dem induktiven Heizen der Partikel eine präzise Messung der generier-

ten Wärme ermöglicht.

Set-up zur Induktionserwärmung und Temperaturmessung

Das in dieser Arbeit verwendete Set-up für die Induktionserwärmung und Temperaturmes-

sung ist modular aufgebaut. In Abbildung 18 sind die einzelnen Komponenten dieses Setups

schematisch dargestellt.


Abbildung 18: Schematische Darstellung des Setups zur Induktionserwärmung und Temperaturmessung. Dieses Setup um-

fasst den Hochfrequenzgenerator IG 5/30000 (1), die drei windige, wassergekühlte Kupferspule, den sogenannten Induktor

(2), die Probenkammer mit der induktiv zu erwärmenden Probe (3), den faseroptischen Temperatursensor (4), das Tempera-

turmessgerät (5), sowie einen daran angeschlossenen PC zur Darstellung und Weiterverarbeitung des Temperaturverlaufs (6).

Für die Induktionserwärmung der Partikel wurde auf den Hochfrequenzgenerator IG 5/30000

(1) der Firma Trumpf Hüttinger (Hüttinger Elektronik GmbH + Co. KG, Freiburg im Breis-

gau) und einer daran gekoppelten dreiwindigen zylindrischen Kupferspule (2) zurückgegrif-

fen. Die Spule, als Induktor bezeichnet, hatte in der vorliegenden Arbeit einen Durchmesser

von 4,8 cm und eine Länge von 2,2 cm. Sowohl die Spule, als auch der Generator sind auf-

grund der hohen Ströme und der dadurch resultierenden Überhitzungsgefahr an eine Wasser-

kühlung angeschlossen. Der verwendete Generator hat eine maximale Frequenz von

2000 kHz. Bei der hier verwendeten Spulengeometrie wurde eine Magnetfeldstärke von nähe-

rungsweise 62 kA/m berechnet (Mohring, J., Persönliche Mitteilung, Trumpf Hüttinger

GmbH & Ko KG, Freiburg, 2015). Der Generator dient als Energiequelle des Erwärmungs-

prozesses, wobei sich die gewünschte Hochfrequenz (HF)-Ausgangsleistung über ein Poten-

tiometer variieren bzw. einstellen lässt. Der generierte Wechselstrom wird vom Generator an

die daran gekoppelte Spule übertragen. Infolgedessen wird durch die wechselstromdurchflos-

sene Spule ein Magnetwechselfeld erzeugt. Dieses induziert letztlich die induktive Erwär-

mung der sich in der Spule befindlichen magnetithaltigen Proben. Um diese Erwärmung unter

kontrollierten und reproduzierbaren Bedingungen zu ermöglichen, befindet sich die zu er-

wärmende Probe in einer speziell dafür entwickelten Probenkammer (3). Das Design und die

Entwicklung dieser Probenkammer sind im nächsten Abschnitt ausführlich beschrieben.

Zur Temperaturmessung wurde in der vorliegenden Arbeit das faseroptische Temperatur-

messgerät Fototemp 1-4 (5) mit einem daran gekoppelten faseroptischen Temperatursensor

(4) (Sensortyp TS4; Messgenauigkeit: +/- 0.2 °C; Optocon AG, Dresden) verwendet. Die fa-

seroptische Temperaturmessung ermöglicht eine äußerst präzise Messung der Temperatur

ohne dabei von magnetischen Feldern beeinflusst zu werden – beides Kriterien für die Wahl

dieser Art von Temperaturmessung im Rahmen der vorliegenden Arbeit. Die darüber gemes-

sene Temperatur wurde während des kompletten Erwärmungsprozesses unter Verwendung


der Software "FOTEMP Assistent" (Optocon AG, Dresden) an einem PC (6) aufgezeichnet

und anschließend weiterverarbeitet.

Probenkammer – Evaluierung, Entwicklung und Design

Im Hinblick auf eine reproduzierbare Wärmeerzeugung sowie deren störungsfreie Detektion

wurde im Rahmen der Arbeit die Entwicklung einer entsprechenden Probenhalterung ange-

strebt. Das Design dieser Halterung erfolgte unter Berücksichtigung der folgenden drei Kern-

aspekte:

- mittige Position der Probe innerhalb der Spule

- mittige Position des faseroptischen Sensors innerhalb der Probe

- Isolierung der Probe

Von physikalischen Gesichtspunkten betrachtet ist das Magnetfeld in der Mitte einer zylindri-

schen Spule am stärksten. Ziel war es daher, die Probe während der induktiven Erwärmung

mittig in der Spule zu positionieren. Dadurch sollte eine maximale Wärmegenerierung ermög-

licht werden. Für den Temperatursensor wurde ebenfalls eine mittige Position in der Probe

angestrebt. Zudem sollte die Möglichkeit bestehen diese Sensorposition probenübergreifend

konstant zu halten. Eine besonders große Bedeutung wurde der Probenisolierung beigemes-

sen. Durch eine effiziente Isolierung sollte dem Wärmeaustausch mit der Umgebung und so-

mit einem Energieeintrag respektive einem Energieverlust entgegengewirkt werden. Die nicht

kontrollierbare Raum- und Spulentemperatur wurden in diesem Kontext, als potentielle Ein-

flussfaktoren gewertet. Um die induktive Erwärmung sowie die Messung der Wärmegenerie-

rung unter quasi adiabatischen Bedingungen durchführen zu können, wurden mehrere Materi-

alien zu Isolationszwecken getestet. Die Auswahl der Testmaterialien erfolgte unter den Ge-

sichtspunkten: Geringe Wärmeleitfähigkeit und gute Verform- und Bearbeitbarkeit. Die getes-

teten Materialien umfassen den Polyethylenschaum Tubolit® (λ40 °C = 0,040 W/mK;

Armacell GmbH, Münster), den synthetische Kautschukschaum Armaflex (λ40 °C ≤

0,037 W/mK; Armacell GmbH, Münster) sowie Neopor®

, einen Schaumstoff auf Polystyrol-

basis (λ10 °C = 0,032 W/mK; BASF SE, Ludwigshafen). Die angegebenen Wärmeleitfähig-

keiten (λ) wurden dem vom Hersteller und Vertreiber herausgegeben Technischen Datenblatt

entnommen. Darüber hinaus wurde ein doppelwandiges Vakuum-Glasgefäß designt und in

der universitätseigenen Glasbläserei angefertigt (Günther Berlin, Servicestelle Glasbläser-

werkstatt, Universität des Saarlandes).

Für die Evaluierung der Materialien hinsichtlich ihrer Eignung als thermischer Isolator wurde

jeweils ein Eppendorf Reaktionsgefäß mit 1 ml 50 °C-temperiertem Wasser in die Isolierung

eingebracht. Nachfolgend wurde der Temperaturabfall über die Zeit gemessen. In einem zwei-

ten Versuchsaufbau wurde das, im Isolator befindliche, raumtemperierte Wasser einem 50 °C

bzw. 30 °C warmen Wasserbad ausgesetzt und der Temperaturverlauf gemessen. Für die


Temperaturmessungen wurden das faseroptische Temperaturmessgerät und der entsprechende

Sensor verwendet (Sensortyp TS4; Messgenauigkeit: +/- 0.2 °C; Optocon AG, Dresden).

In diesen Evaluierungsexperimenten, soviel sei an dieser Stelle den Ergebnissen in 3.2.1

vorweggegriffen, zeigte sich die eigens konstruierte Vakuum-Probenkammer als die geeig-

netste Variante. Basierend darauf wurden sämtliche Heizexperimente der vorgelegten Arbeit

unter Verwendung dieser Probenkammer vorgenommen. In der Abbildung 19 ist der Aufbau

der hier entwickelten Probenhalterung sowie deren Positionierung in der Spule gezeigt. Die

induktiv zu erwärmende Probe wird in einem Eppendorf Reaktionsgefäß in die doppelwandi-

ge Vakuumkammer eingebracht. Zur Bestimmung der Temperatur wird ein faseroptischer

Sensor mit Hilfe einer entsprechenden Befestigungsvorrichtung mittig in der Probe positio-

niert. Der Proberaum ist nach oben hin durch eine spezielle Korkabdichtung isoliert.

Abbildung 19: Entwickelte Probenhalterung zur induktiven Erwärmung der Partikel. Die Probenkammer besteht aus einem

doppelwandigen evakuierten Glasgefäß (1), in das die induktiv zu erwärmende Probe in einem Eppendorf Reaktionsgefäß

eingebracht wird (4). Der optische Temperatursensor (5) wird unter Verwendung einer Befestigungsvorrichtung (2) mittig in

der Probe fixiert. Eine Korkabdichtung (3) schließt den Probenraum nach oben hin ab. Die Vakuum-Kammer ist so konstru-

iert, dass die Probe mittig in der Spule (6) positioniert ist.

2.3.2.2 Identifikation von Einfluss- und geeigneten Heizparametern

Die induktive Erwärmung der hergestellten magnetischen Kompositpartikel ist einer der

Kernaspekte in dieser Arbeit. Für die angestrebte Applikation des hier entwickelten nanopar-

tikulären Kompositsystems ist diese Art der Erwärmbarkeit von essentieller Bedeutung. Im

Hinblick darauf wurden potentielle Einflussfaktoren auf den induktiven Erwärmungsprozess

untersucht. Ziel dieser Einflussuntersuchung war die Findung optimaler Parameter für eine

effiziente Wärmeentwicklung. Vor dem Hintergrund, dass die magnetisch induzierte Wärme-

generierung von den in der Polymermatrix inkorporierten Magnetit-NP ausgeht, erfolgte diese

Evaluierung unter Verwendung von unverkapselten Magnetit-NP. Im Rahmen der Prozess-

evaluierung wurden die folgenden Parameter in Hinsicht auf eine effiziente Magnetit-NP

Wärmeentwicklung untersucht:

- Konzentration der Magnetit-NP

- HF-Ausgangsleistung


Im Rahmen dieser Evaluierung wurden drei unterschiedliche Heizleistungen sowie drei ver-

schiedene Partikelkonzentrationen getestet. Die Heizleistung bzw. die Hochfrequenzabgabe

des Generators wurde, über ein Potentiometer, unter Berücksichtigung der im Anzeigeinstru-

ment angezeigten Anodenspannung und des damit korrelierenden Anodenstroms (in % des

Maximalwertes), eingestellt. Der darüber eingestellte Sollwert entsprach für die drei vorge-

nommenen Einstellungen (20V20A, 40V34A, 60V52A) 4%, 13,6% und 31,2% des vom Her-

steller angegebenen Maximalwerts von 7,2 kW. Damit wurden der Einfluss auf die Partike-

lerwärmung unter den Ausgangsleistungen von 0,23 kW, 1,01 kW sowie 2,3 kW getestet.

Bezüglich der Partikelkonzentration wurde neben der Ausgangskonzentration von 20 mg/ml

auch 2 mg/ml und 0,2 mg/ml getestet. Hierzu wurden die in Chloroform vorliegenden Magne-

tit-NP, ausgehend von ihrer Anfangskonzentration von 20 mg/ml entsprechend verdünnt. Für

die Heizexperimente wurden 0,5 ml der entsprechenden Partikeldispersion in ein Eppendorf

Reaktionsgefäß überführt und in die Probenkammer eingebracht. Der faseroptische Sensor

wurde mittig in der Probe positioniert. Vor Beginn der induktiven Erwärmung wurde gewartet

bis sich in der Probe eine konstante Temperatur eingestellt hatte. Der Erwärmungsprozess

belief sich in allen Experimenten auf eine Zeitspanne von 20 min. Jedes einzelne Experiment

wurde zudem als Kontrollexperiment unter Verwendung von reinem Chloroform durchge-

führt. Das Kontrollexperiment fand immer am gleichen Tag vor dem eigentlichen Heizexpe-

riment statt, um Einflussfaktoren wie die Raumtemperatur oder die Temperatur des Kühlwas-

sers in der Spule gleich zu halten. Die anschließende Normierung ermöglicht einen experi-

mentübergreifenden Vergleich der Messdaten.

2.3.2.3 Induktionserwärmung magnetischer Nanokomposite

Die induktive Erwärmung der Magnetit-PLGA-NP erfolgte unter der zuvor evaluierten nied-

rigsten und höchsten Heizleistung, d. h. 0,23 kW (20V20A) respektive 2,3 kW (60V52A).

Unter Berücksichtigung des aus der Evaluierung hervorgehenden Zusammenhangs zwischen

Konzentration an Magnetit-NP und Wärmegenerierung wurde eine Aufkonzentrierung der

Magnetit-PLGA-NP vorgenommen (siehe Kapitel 2.3.1.5). Anschließend wurden 0.5 ml der

in Wasser dispergiert vorliegenden magnetischen Nanokomposite in die Probenhalterung ein-

gebracht und induktiv erwärmt. Der Temperaturverlauf des zwanzigminütigen Erwärmungs-

prozesses wurde, wie im vorherigen Abschnitt beschrieben, unter Verwendung eines faserop-

tischen Messgerätes gemessen und aufgezeichnet. Bereinigt wurden die Messdaten durch ein

Kontrollexperiment mit 0,5 ml reinem Wasser. Dadurch sollte ausschließlich die Wärmegene-

rierung der Partikel erhalten werden. Das Kontrollexperiment fand unter den gleichen Heiz-

bedingungen statt.

Die induktive Erwärmung der aus Rhodamin B markiertem PLGA hergestellten Magnetit-

PLGA-NP erfolgte anlog zu der Erwärmung der Magnetit-PLGA-NP. Für die Induktionser-

wärmung der fluoreszierenden Nanokomposite wurde sich auf die Verwendung der höchsten

Heizleistung von 2,3 kW (60V52A) beschränkt. Im Rahmen dieses Heizexperimentes sollte


lediglich die prinzipielle Machbarkeit der Induktionserwärmung dieser Partikel gezeigt wer-

den.

2.3.3 Induktionserwärmung und Partikelmigrationsverhalten in Mukus

2.3.3.1 Etablierung eines Setups zur Untersuchung der Partikelmigration

Die Etablierung eines experimentellen Setups, mit dem sich der Einfluss induktiv generierter

Wärme auf die Partikelmigration in Mukus untersuchen lässt, stellte eine Grundvoraussetzung

für die weitere Vorgehensweise dar. Hinsichtlich der genannten Zielkonzeption wurden für

die Entwicklung dieses Setups verschiedene Anforderungen definiert. Diese umfassen:

- Kompatibilität mit der Spulendimension und Probenkammer

- Möglichkeit einer reproduzierbaren, einfachen und schnellen Versuchsdurchführung

- relativ einfache Detektierbarkeit der Partikelmigration

- Adaptierbarkeit z. B. hinsichtlich Spulendimension oder Probenvolumina

Der nach diesen Anforderungskriterien entwickelte experimentelle Versuchsaufbau soll im

Folgenden beschrieben werden. Aufgrund der begrenzten Verfügbarkeit an natürlichem Mu-

kus erfolgte die Etablierung des nachfolgend vorgestellten Setups anhand eines Modellgels.

Hierbei handelt es sich um 1%iges Hydroxyethycellulose-Gel, nachstehendend als HEC-Gel

bezeichnet. Die Verwendung von HEC stützt sich auf dessen chemische Ähnlichkeit zu den,

als Hauptkomponente von Mukus bekannten, Muzinen. Darüber hinaus zeigt dieses Gel ein

zu Mukus ähnliches mikrorheologisches Verhalten.[41, 42]

Basierend darauf hat sich HEC als

ein gängiges Modellgel für Mukus etabliert. Die Nutzung von HEC ist in diesem Zusammen-

hang für mehrere Forschungsansätze beschrieben.[42, 134]

Der hier etablierte Versuchsaufbau umfasst mehrere Teilaspekte und wird in den beiden nach-

stehenden Abschnitten detailliert beschrieben. Der Fragestellung nachgehend, inwieweit sich

das Partikelmigrationsmuster durch induktiv generierte Wärme beeinflussen lässt, galt es zu-

nächst eine Möglichkeit zu finden diese Migration nachzuweisen. Vor diesem Hintergrund

wurde sich entschieden, die magnetischen Nanokompositpartikel durch Fluoreszenzmarkie-

rung detektierbar zu machen. Dazu wurden die Kompositpartikel nach dem etablierten Her-

stellungsprotokoll hergestellt, jedoch unter Verwendung von Rhodamin B markiertem PLGA.

Der an das Polymer gekoppelte Fluoreszenzfarbstoff ermöglicht unter Anregung mit der ent-

sprechenden Wellenlänge die Partikel nachzuweisen (vgl. Kapitel 2.3.1.3; Herstellung von

fluoreszierenden Magnetit-PLGA-Nanopartikel).


Experimentelles Vorgehen – Partikelmigration unter Wärmeeinfluss

Die in dieser Arbeit etablierte experimentelle Vorgehensweise zur Untersuchung des Einflus-

ses von Wärme auf die Penetration von Magnetit-beladenen PLGA-NP in Mukus ist in Abbil-

dung 20 schematisch gezeigt. Der experimentelle Versuchsaufbau umfasst, wie in der sche-

matischen Darstellung indiziert, mehrere Schritte, die im Folgenden vorgestellt werden.

Abbildung 20: Experimentelles Setup zur Untersuchung des Einflusses von Wärme auf das Penetrationsverhalten von Mag-

netit-PLGA-NP. Der Versuchsaufbau gliedert sich in vier Einzelschritte. Zunächst wird ein Schlauchstück mit Mukus bzw.

HEC Gel befüllt, bevor die Nanopartikelsuspension oben aufgegeben wird. Der zweite Schritt entspricht dem eigentlichen

Partikelpenetrationsexperiment. Hierbei wird das Schlauchstück für eine bestimmte Zeit erwärmt, bevor es im nächsten

Schritt zur Fixierung des Penetrationsmusters bei -80 °C eingefroren und anschließend in 0,5 cm große Stücke geschnitten

wird. Im letzten Schritt wird das Penetrationsmuster über die Fluoreszenzintensität der jeweiligen Schnitte am CLSM aufge-

klärt.

Das eigentliche Partikelmigrationsexperiment erfolgt nach dem hier entwickelten Set-up in

einem mit Mukus bzw. Modellgel gefüllten Schlauchstück. Die Nutzung solcher Schlauchstü-

cke erfolgte in Anlehnung an bereits publizierte Arbeiten, in denen die prinzipielle Eignung

von Schläuchen oder Kapillaren für derartige Penetrationsstudien demonstriert wurde.[42, 135]

Die fluoreszierenden Partikel werden auf die Mukus- bzw. Gelschicht aufgegeben und können

anschließend, so die Idee, zur Beeinflussung des Penetrationsverhaltens induktiv erwärmt

werden. Die Verwendung von Schlauchstücken, die kommerziell in unterschiedlichen Dimen-

sionen erhältlich sind, gibt dem Set-up eine gewisse Anpassungsfähigkeit. Die Einweg-

schlauchstücke hatten im Hinblick auf die Kompatibilität zu der hier verwendeten Induktions-

spule eine Länge von 4 cm und ein Durchmesser von 0,6 cm. Nach Ablauf der Erwärmungs-

zeit sieht der etablierte Versuchsaufbau zur Beendigung der Partikelpenetration sowie der

Beibehaltung des resultierenden Penetrationsmusters das Einfrieren des Schlauchstücks bei -

80 °C vor. Zur Beurteilung der jeweiligen Penetrationsstrecke wird anschließend das

Schlauchstück in 0,5 cm breite Schnitte zerlegt. Das Schneiden mit einer scharfen Klinge er-

folgt auf gefrorenem Untergrund von den Schlauchenden ausgehend. Dadurch wird verhin-

dert, dass das gefrorene Schlauchstück während des Schneidprozesses auftaut und sich somit


das Penetrationsmuster möglicherweise nachträglich ändert. Die einzelnen Schlauchschnitte

werden anschließend hinsichtlich ihrer Fluoreszenzintensität unter Zuhilfenahme der konfoka-

len Laser-Scanning-Mikroskopie, engl. confocal laser scanning microscopy (CLSM), unter-

sucht. Diese Intensität ist proportional zur Konzentration angeregter Moleküle. Da das ange-

regte Fluoreszenzmolekül Bestandteil der Nanokomposite ist, lassen sich diese in den

Schlauchabschnitten detektieren.

Experimentelles Vorgehen - Detektion des Partikelmigrationsmusters

Das resultierende Partikelpenetrationsmuster nach erfolgter Erwärmung wird in dem hier

etablierten Set-up über die Fluoreszenzintensität der einzelnen Schnitte untersucht. Für diese

Untersuchung wurde ein CLSM der Firma Carl Zeiss genutzt (LSM 710; Carl Zeiss AG,

Oberkochen). Als Objektiv wurde sich auf das Wasserimmersionsobjektiv Korr M27 mit der

numerischen Apertur 1,1 festgelegt. Die experimentelle Vorgehensweise und Probenpräpara-

tion ist in Abbildung 21 illustriert. In einem ersten Schritt werden 50 µl des jeweilig aufgetau-

ten Inhalts eines Schlauchschnittes unter Verwendung einer Direktverdränger-Pipette in einen

15-Kammer-Probenhalter (15 μ-Slide Angionese, ibidi GmbH, Martinsried) überführt. Dieser

Probenhalter-Typ wurde gewählt, um einer Verdunstung des Wassers aus dem geringen Pro-

benvolumens entgegen zu wirken. Zudem ermöglicht er, als Ausgangspunkt für die mikro-

skopischen Aufnahmen, ein Scharfstellen des Probenhalterbodens. Ausgehend vom Boden

des Probenhalters werden an verschiedenen Positionen jeweils drei optische Schnitte in einem

Abstand von 200 µm senkrecht zur Probennormalen (z-Achse) aufgenommen (z-Stack =

200 µm). Die Anregung der Rhodamin B markierten Nanokomposite erfolgte mit einer Wel-

lenlänge von 561 nm. Die entsprechende Emission wurde bei 620 nm detektiert. Im Rahmen

der Methodenentwicklung wurde die Empfindlichkeit des Detektors anhand einer Kontrolle

ohne Partikel eingestellt, d. h. mittels reinem HEC bzw. Mukus. Die, das CLSM normaler-

weise charakterisierende Detektionslochblende wurde vollständig geöffnet, um maximale

Intensitäten zu erhalten. Die Detektorempfindlichkeit wurde anhand der Kontrolle so einge-

stellt, dass gerade keine Fluoreszenz mehr detektierbar ist. Die Intensitätswerte der auf diese

Weise generierten nicht-konfokalen Bilder können anschließend unter Verwendung eines spe-

ziellen Bildbearbeitungs- und Bildverarbeitungsprogramms ausgelesen werden (Open-Source

Software ImageJ bzw. Fiji). Durch die Intensitätsmessungen der verschiedenen Schlauch-

stückschnitte sollte letztlich die Penetrationsstrecke der magnetischen Nanokomposite zu-

gänglich sein. Zu jedem Penetrationsexperiment erfolgte die Durchführung eines entspre-

chenden Kontrollexperimentes ohne Wärmeapplikation.

https://de.wikipedia.org/wiki/Lochblende


Abbildung 21: Vorgehensweise und Probenpräparation zur Untersuchung des Partikelpenetrationsmusters am CLSM. Der

Inhalt der aufgetauten Schnitte wird in die Probenkammer überführt und anschließend am CLSM analysiert. Hierfür wird der

Boden der Probenkammer fokussiert und anschließend an unterschiedlichen Positionen in der der Probe ein z-Stapel von

Bildern aufgenommen. Diese werden hinsichtlich ihrer Fluoreszenzintensität analysiert. Wiederholt man diesen Prozess mit

allen Schnitten erhält man eine Information über das Penetrationsmuster der Partikel.

2.3.3.2 Einfluss von Wärme auf die Partikelpenetration in HEC und Mukus

Die der Arbeit zugrundeliegende Hypothese geht davon aus, dass sich die Partikelmigration

im Mukus über eine lokale Viskositätserniedrigung erleichtern lässt. Diese Viskositätsernied-

rigung soll, so die Idee, über die induktive Partikelerwärmung erreicht werden. Mit dem im

vorherigen Kapitel vorgestellten Set-up wurde ein erster grundsätzlicher Machbarkeitsnach-

weis für diese Hypothese angestrebt. In dieser ersten Studie sollte zunächst der generelle Ein-

fluss von Wärme auf das Penetrationsverhalten von Partikeln untersucht werden.

Die Untersuchung dieses postulierten Zusammenhangs erfolgte in einem ersten Schritt unter

Verwendung des Mukusmodell-Gels HEC. Dieses wurde hierzu luftblasenfrei in ein zuvor

zugeschnittenes Schlauchstück überführt. Die untere Schlauchöffnung wurde mit Parafilm

abgedichtet. Das 4 cm lange Schlauchstück wurde bis zu einer Markierung bei 3,5 cm mit

dem HEC-Gel befüllt. Auf die Gel-Schicht wurden 60 µl der in Wasser dispergiert vorliegen-

den Magnetit-RhoBPLGA-NP aufgegeben. Anschließend wurde das obere Ende des

Schlauchs ebenfalls mit Parafilm versiegelt und das Schlauchstück vertikal in eine entspre-

chende Halterung eingebracht. Für die Untersuchung des Einflusses von Wärme auf die Parti-

kelmigration wurden die Schlauchstücke für 30 min einer Temperatur von 40 °C ausgesetzt.

Diese Inkubation erfolgte in einem Trockenschrank. Als Kontrolle wurden auf diese Weise

präparierte Schlauchstücke lichtgeschützt bei Raumtemperatur gelagert. Nach Ablauf der Er-

wärmungszeit wurden die Schlauchstücke bei -80 °C eingefroren. Für die Detektion der Parti-

kelpenetration wurde, wie in Kapitel 2.3.3.1 beschrieben, das Schlauchstück in 0,5 cm große

Schnitte zerlegt. Von den resultierenden acht Schnitten wurden anschließend am CLSM mik-

roskopische Aufnahmen angefertigt und deren Intensität gemessen. Bei jedem Schnitt wurden

von fünf Positionen ausgehend drei Schnitte in einem Abstand von 100 µm senkrecht zur

Probennormalen (z-Achse) aufgenommen. Insgesamt standen somit pro Schnitt 15 Aufnah-

men zur Intensitätsmessung zur Verfügung.

In einem zweiten Schritt wurde dieses Experiment unter Verwendung von natürlichem Mu-

kus, wiederholt. Bei dem verwendeten Mukus handelt es sich um respiratorischen Mukus der


im Rahmen einer Bronchoskopie an Pferden erhalten wurde (Pferdeklinik Altforweiler, Über-

herrn-Altforweiler). Das erhaltene, bis dahin bei -20 °C gelagerte Mukusmaterial enthielt z. T.

Pufferlösungen, mit denen es von dem Bronchoskopie-Besteck gespült wurde. Zur Entfernung

dieser Pufferlösungen und aufgrund von zu geringem Probenmaterial wurden die erhaltenen

Proben gepoolt und zentrifugiert (5000 x g, 10 min). Das zurückbleibende aufgereinigte Mu-

kusmaterial wurde im Anschluss für die Experimente verwendet.

Die Durchführung der Penetrationsexperimente unter Verwendung von Mukus erfolgte ana-

log zu den zuvor beschriebenen Penetrationsexperimenten mit HEC-Gel. Die einzige Aus-

nahme davon bildet die Anzahl der am CLSM aufgenommenen Bilder pro Schlauchschnitt.

Im Rahmen der Untersuchung wurden anstatt an 5 an 10 Positionen Aufnahmen generiert. Die

Aufnahmen der obersten Ebene (z = 3) wurden hier jedoch nicht zur Intensitätsauswertung

herangezogen. Begründet liegt dies in der Beobachtung, dass sich der Inhalt eines Schlauch-

stückes im Falle des Penetrationsexperimentes mit Mukus aufgrund seiner Konsistenz schwie-

riger in die Probenkammer überführen lässt. Dies bedingt eine ungleichmäßige Füllung der

Probenkammer. Dadurch besteht die Möglichkeit, dass beim letzten virtuellen Schnitt, d. h.

der Aufnahmen der obersten Ebene (z = 3) an einer Position in der Probenkammer gar keine

Probe ist. Daher beläuft sich die zur Auswertung herangezogene Anzahl pro Schnitt auf 20

anstatt 15 Aufnahmen.

2.3.3.3 Partikelpenetration unter induktiven Heizbedingungen

Im Hinblick auf das in dieser Arbeit verfolgte neuartige Konzept zur Überwindung der Mu-

kusbarriere, stellt die Untersuchung der Partikelpenetration unter induktiven Heizbedingun-

gen der finale Schritt dar. Um den potentiellen Effekt der induktiven Erwärmung auf das Pe-

netrationsverhalten zu untersuchen, wurde der gleiche Versuchsaufbau gewählt, wie zuvor bei

der grundsätzlichen Untersuchung von Wärme auf die Partikelmigration (vgl. 2.3.3.2). Die

Untersuchung wurde darüber hinaus ebenfalls zunächst an HEC-Gel und danach an nativem

Pferdemukus vorgenommen.

Hierzu wurde das Schlauchstück zunächst mit HEC, respektive Mukus gefüllt, bevor die fluo-

reszierenden Magnetit-PLGA-NP aufgegeben wurden. Für die Untersuchung der Partikelpe-

netration unter in situ Bedingungen wurde dieses Schlauchstück in die Spule bzw. in die sich

darin befindliche Vakuumkammer eingebracht. Anschließend wurden die Partikel zu Erwär-

mungszwecken und damit zur postulierten Beeinflussung der Penetration im Modellgel bzw.

Mukus für 30 min einer Heizleistung von 2,3 kW (60V52A) ausgesetzt. Nach Ablauf dieser

Zeit wurden die Schlauchstücke, wie in Kapitel 2.3.3.1 beschrieben, bei -80 °C eingefroren,

geschnitten und die einzelnen Schnitte zur Detektion der Partikelpenetration via CLSM-

Aufnahmen nach Fluoreszenzintensität ausgewertet. Anzumerken ist, dass im Rahmen dieser

Untersuchung neben dem standardmäßigen 1%igem Modellgel HEC auch Gele mit 5% bzw.

10%igen HEC-Anteil genutzt wurden.

52 3 Ergebnisse und Diskussion

3 Ergebnisse und Diskussion

3.1 Herstellung von magnetischen Nanokompositen

3.1.1 Magnetit-PLGA-Nanopartikel

Für die Herstellung der angedachten magnetischen Kompositpartikel auf Basis des Polymers

PLGA und den darin inkorporiert vorliegenden Magnetit-NP wurde auf die Nanopräzipitati-

onsmethode zurückgegriffen. Im Zuge der Methodenentwicklung konnte ein Protokoll etab-

liert werden, welches die Herstellung derartiger Partikel ermöglicht.

Die in Abbildung 22 repräsentativ ausgewählten raster- und transmissionselektronenmikro-

skopischen Aufnahmen zeigen, dass sich unter dem hier etablierten Protokoll sphärische Par-

tikel mit einer Größe von ca. 200 nm herstellen lassen. Dabei entsprechen die kleinen schwar-

zen Punkte in der gezeigten TEM-Aufnahme den in die PLGA-Matrix inkorporierten 10 nm

großen Magnetit-NP. Demnach liegen die Magnetit-NP homogen verteilt und nicht agglome-

riert in der Polymer-Matrix vor (siehe Abbildung 22 B). Die in der hochaufgelösten TEM-

Aufnahme C des Magnetit-NP zu erkennenden Gitterebenen indizieren monokristalline Parti-

kel. Die hier gezeigten Magnetit-beladenen Partikel wurden unter Verwendung von 25 mg

PLGA und einer eingesetzten Menge von 1 mg Magnetit-NP hergestellt – den im Rahmen der

Methodenentwicklung als „Standard“ etablierten und definierten Herstellungsparametern.

Abbildung 22: SEM-Aufnahme (A) und TEM-Aufnahme (B) von Magnetit-PLGA-NP sowie eine TEM-Aufnahme von den

inkorporierten Magnetit-NP in Hochauflösung (C). Der Maßstabsbalken in B entspricht 20 nm und in C 2 nm. In dem in C

abgebildeten Magnetit-NP sind deutlich die durchlaufenden Gitterebenen zu erkennen, die auf dessen monokristallinen Cha-

rakter schließen lassen.

Die magnetische Charakterisierung dieser Partikel wurde mittels VSM unter Raumtemperatur

vorgenommen. Hierdurch sollte geklärt werden, inwieweit die magnetischen

A B

-

C

-

3 Ergebnisse und Diskussion 53

Kompositpartikel für die angedachte Applikation prinzipiell geeignet sind und ein superpara-

magnetisches Verhalten zeigen. Hierfür wurden das Ausgangmaterial, d. h. die magnetischen

Magnetit-NP, sowie die daraus hergestellten magnetischen Kompositpartikel untersucht. Die

erhaltenen Magnetisierungskurven, dargestellt in Abbildung 23, zeigen sowohl für die Mag-

netit-NP als auch für die Kompositpartikel einen sigmoidalen und somit superparamagneti-

schen Verlauf. Eine Hystereseschleife ist in beiden Fällen nicht zu erkennen. Folglich weisen

die Partikel keine Remanenz auf. Dies bedeutet, dass keine Restmagnetisierung in den Parti-

keln verbleibt, wenn das Magnetfeld entfernt wird. Eine magnetisch induzierte Agglomeration

ist somit auszuschließen was für eine potentielle biomedizinische Anwendung in vivo ein

wichtiger Aspekt darstellt.

Abbildung 23: Magnetisierungskurve von Magnetit-PLGA-NP (links) und Magnetit-NP (rechts) aufgenommen bei Raum-

temperatur.

Basierend auf den beiden gezeigten Magnetisierungskurven wurden weitere Parameter abge-

leitet, die zur magnetischen Charakterisierung der Partikel herangezogen werden können. Für

die Magnetit-NP wurde ausgehend von der Magnetisierungskurve eine Sättigungsmagnetisie-

rung von Ms = 58,00 Am2 kg

-1 ermittelt. Damit liegt dieser Wert in einem für superparamag-

netische Eisenoxidpartikel ähnlicher Größe vergleichbaren Bereich.[136, 137]

Gegenüber dem

bekannten Bereich des Bulk-Materials Eisenoxid (Ms = 92 - 96 emu/g) bleibt der hier ermit-

telte Wert der Sättigungsmagnetisierung zurück. Er liegt eher im Bereich der Sättigungsmag-

netisierung von γ-Fe2O3-Festkörpern (Ms = 60 - 80 emu/g)[138, 139]

. Die vergleichsweise nied-

rige Sättigungsmagnetisierung der Kompositpartikel mit 2,24 Am2 kg

-1 erklärt sich dadurch,

dass die Sättigungsmagnetisierung auf die Masse normiert ist. Ausgehend davon ist zu erwar-

ten, dass die Sättigungsmagnetisierung sinkt, wenn ein Hybrid aus ferromagnetischem und

nicht ferromagnetischem Material vorliegt. Eine bestimmte Masse an Kompositpartikel ent-

hält, verglichen mit der gleichen Masse an Magnetit-NP, weniger magnetisches Material.

Folglich ist die Sättigungsmagnetisierung niedriger. Dieses Phänomen ist bereits in der Litera-

tur für derartige Hybridpartikel beschrieben.[112, 140, 141]


Ausgehend von der Sättigungsmagnetisierung wurde der Gehalt an magnetischem Material

µmag in den beiden Partikeltypen bestimmt. Für die Magnetit-NP beträgt dieser 62,84% und

für die magnetischen Kompositpartikel 2,40%. Dass der magnetische Gehalt der Magnetit-NP

nicht 100% entspricht war zu erwarten. Dies lässt sich beispielsweise mit der Oberflächen-

hydrophobisierung dieser Partikel unter Verwendung der Ölsäure begründen. Zudem besteht

grundsätzlich die Möglichkeit, dass ein Teil des Eisens möglicherweise nicht als Magnetit

vorliegt. Um Aufschluss darüber zu erhalten wären Methoden wie XRD oder die Mößbauer-

spektroskopie heranzuziehen, bei denen die Kristallstruktur genauer betrachtet wird. Die Sät-

tigungsmagnetisierung alleine lässt diesbezüglich keine Rückschlüsse zu. Der magnetische

Anteil der Kompositpartikel ist erwartungsgemäß niedriger als der der reinen Magnetit-NP.

Dies liegt darin begründet, dass die Magnetit-NP im Falle der Kompositpartikel in der Poly-

mermatrix eingebettet vorliegen. Der magnetische Gehalt der Kompositpartikel korreliert mit

deren Magnetit-Beladung. Diese Beladung wurde in der vorliegenden Arbeit mittels HR-CS-

AAS, eine spezielle Variante der Atomabsorptionsspektrometrie, bestimmt. Sie liegt, soviel

sei an dieser Stelle den nachstehenden Ergebnissen vorweggegriffen, mit ca. 2% in der Grö-

ßenordnung des ermittelten magnetischen Gehalts der hier charakterisierten Kompositpartikel.

Darüber hinaus wurde ausgehend von den Magnetisierungskurven die magnetische Partikelg-

röße dmag für beide Partikeltypen bestimmt. Diese liegen mit ~8 nm zwar leicht unterhalb der

mittels DLS und TEM charakterisierten Größe von 10 nm aber in einer vergleichbaren Grö-

ßenordnung. Bezugnehmend auf die magnetische Charakterisierung mittels VSM lässt sich an

dieser Stelle festhalten, dass die unter dem etablierten Standardprotokoll hergestellten Kom-

positpartikel superparamagnetisch und somit zur induktiven Erwärmung grundsätzlich befä-

higt sind.

Im Rahmen der zu Beginn dieses Kapitels angesprochenen anfänglichen Methodenentwick-

lung wurde der Einfluss unterschiedlicher Mengen an Magnetit-NP zur Herstellung der mag-

netischen Kompositpartikel näher untersucht. Dabei lag das Augenmerk der Evaluierung auf

der Beeinflussung der resultierenden Beladung und Einkapselungseffizienz, der Homogenität

der Verkapselung aber auch auf der Größe und Größenverteilung. Im Zuge dessen wurden

Magnetit-beladene PLGA-NP unter Verwendung von 35 µl, 50 µl und 85 µl der in CHCl3

dispergiert vorliegenden Magnetit-NP (d. h. 0,7 mg, 1,0 mg und 1,7 mg Magnetit-NP) herge-

stellt. Die Menge an PLGA und alle weiteren prozessrelevanten Parameter, wie beispielswei-

se Art und Menge des Solvent oder Stabilisators, wurden hingegen konstant gehalten. Die

Evaluierung wurde zunächst mit den Magnetit-NP der Bezugsquelle 1 (Bq. 1) vorgenommen

und im weiteren Verlauf der Arbeit mit den Magnetit-NP der Bezugsquelle 2 (Bq. 2) wieder-

holt. Hierdurch sollte die Herstellungsmethode unter Verwendung dieser Magnetit-NP vali-

diert werden. Der Gehalt an Eisenoxid in den magnetischen Kompositpartikeln wurde mit

Hilfe von ICP-MS (Bq. 1) bzw. HR-CS GF-AAS (Bq. 2) und unter Verwendung der entspre-

chenden, in Kapitel 2.3.1.6 eingeführten Formeln, bestimmt. Die daraus resultierenden Er-

gebnisse sind für die Magnetit-NP beider Bezugsquellen hinsichtlich Beladung und


Einkapselungseffizienz in Tabelle 4 zusammengefasst. Demnach erhöht sich mit steigender

Menge an eingesetzten Magnetit-NP die Eisenoxid-Beladung der Kompositpartikel. Betrach-

tet man in diesem Zusammenhang die Einkapselungseffizienz, so ist ein ähnlicher Trend zu

beobachten.

Tabelle 4: Beladung und Einkapselungseffizienz in Abhängigkeit der zur Kompositpartikelherstellung eingesetzten initialen

Menge an Magnetit-NP. Dabei sind die Ergebnisse der Partikelherstellung unter Verwendung der in CHCl3 vorliegenden

10 nm großen Magnetit-NP der Bezugsquelle 1 und 2 gegenübergestellt (n = 3). Die dargestellten Kennzahlen basieren auf

den ermittelten Eisenkonzentrationen die für Bq. 1 unter Verwendung der ICP-MS und für Bq. 2 unter Verwendung der HR-

CS GF-AAS erhalten wurden.

Ansatz Magnetit-NP Beladung (%) Einkapselungseffizienz (%)

initial [mg] Bq. 1 Bq. 2 Bq. 1 Bq. 2

A 0,7 0,78 ± 0,06 0,82 ± 0,15 27,53 ± 3,57 33,83 ± 6,38

B 1 1,03 ± 0,08 1,70 ± 0,27 23,01 ± 0,63 47,26 ± 8,48

C 1,7 1,74 ± 0,01 3,42 ± 0,17 28,65 ± 0,41 54,41 ± 3,20

Die hier aufgezeigten Tendenzen hinsichtlich Beladung und Einkapselungseffizienz gelten für

die Magnetit-NP beider Bezugsquellen gleichermaßen. Dies war auch zu erwarten, da die

Magnetit-NP nach demselben Herstellungsprotokoll [115]

synthetisiert wurden, beide an ihrer

Oberfläche mit Ölsäure funktionalisiert sind und eine Größe von 10 nm aufweisen. Lediglich

die Bezugsquelle, d. h. der Hersteller dieser Partikel, unterscheidet sich. Betrachtet man die

Beladung und Einkapselungseffizienz der hergestellten Kompositpartikel genauer fällt auf,

dass die Magnetit-NP der Bezugsquelle 2 ein leicht besseres Verkapselungsprofil aufweisen.

Eine mögliche Erklärung wäre ein leicht hydrophoberer Charakter dieser Magnetit-Partikel,

wodurch sie besser in das hydrophobe Polymer PLGA eingebettet werden können. Unabhän-

gig davon zeigen die erhalten Ergebnisse, dass sich die Beladung der Kompositpartikel über

die eingesetzte Menge an Magnetit-NP beeinflussen lässt. Ein wichtiger Aspekt, um bei-

spielsweise die magnetischen Charakteristika der Kompositpartikel zu ändern. So ließe sich

darüber z. B. die Sättigungsmagnetisierung der Partikel entsprechend variieren. Dies könnte

für die spätere Applikation und die beabsichtigte induktive Erwärmung dieser Kompositparti-

kel von Interesse sein. Zudem zwischen der Sättigungsmagnetisierung und der induktiven

Erwärmbarkeit von Eisenoxidpartikel ein entsprechender Zusammenhang beschrieben ist [142]

.

Den Einfluss der eingesetzten Magnetit-NP auf die resultierende Verkapselung dieser NPs in

die PLGA-Matrix wurde zusätzlich mittels TEM näher untersucht. Im Zuge dieser Untersu-

chung wurde die Anzahl an verkapselten Magnetit-NP in den magnetischen Kompositparti-

keln bestimmt. Dies erfolgte durch manuelles Auszählen der Magnetit-NP pro Kompositpar-

tikel, wobei die Auszählungsbasis mindestens 100 Kompositpartikel entsprach. Der


prozentuale Anteil der jeweiligen Partikelfraktion in Abhängigkeit der eingesetzten Menge an

Magnetit-NP ist in Abbildung 24 graphisch gegenübergestellt. Bei 50 Magnetit-NP pro Kom-

positpartikel wurde eine Auszählgrenze gesetzt, da eine fehlerfreie Auszählung von Magnetit-

NP, die diese Anzahl übersteigt nicht mehr möglich ist. Betrachtet man die einzelnen Fraktio-

nen ist deutlich zu erkennen, dass sich diese mit steigender Menge an eingesetzten Magnetit-

NP verändern. Die Anzahl an Magnetit-NP pro Kompositpartikel erhöht sich, sprich die Bela-

dung der Kompositpartikel nimmt zu. Besonders deutlich wird dies wenn man die Fraktion

mit mehr als 50 Magnetit-NP pro Kompositpartikel betrachtet. Unter Verwendung der ge-

ringsten Menge an Magnetit-NP (vgl. Abbildung 24A) werden derart stark beladene Kompo-

sitpartikel quasi gar nicht erhalten. Bei der höchsten Menge an eingesetztem Magnetit macht

diese Fraktion hingegen knapp 50% der erhaltenen Kompositpartikel aus (vgl. Abbildung

24C). Die transmissionsmikroskopische Untersuchung verifiziert somit die Ergebnisse der

vorherigen Eisenoxidbestimmung. Zudem belegt diese Untersuchung, dass die Magnetit-NP

in sämtlichen hier getesteten Mengenverhältnissen in der PLGA-Matrix als einzelne Partikel

in der Polymermatrix vorliegen. Es ist keine Agglomeration dieser Magnetit-NP zu beobach-

ten. Eine Einflussnahme der eingesetzten Menge an Magnetit-NP auf die resultierende Mag-

netit-Beladung, wie sie hier gezeigt werden konnte, ist in der Literatur auch für andere Mag-

netit-basierte Kompositpartikel beschrieben.[143]

Daher war das hier beobachtete Verhalten

gewissermaßen zu erwarten.

Abbildung 24: Ergebnis der TEM-Bild basierten Untersuchung hinsichtlich des Einflusses der eingesetzten Magnetit-NP auf

die resultierende Verkapselung dieser NP in die PLGA-Matrix. Die TEM-Aufnahmen A, B, C mit entsprechender Aus-

schnittvergrößerung zeigen magnetische Kompositpartikel, die unter Verwendung von 0,7 mg, 1,0 mg und 1,7 mg Magnetit-

NP hergestellt wurden. Die hergestellten Partikelformulierungen sind fotographisch dargestellt. Zur Bestimmung der prozen-

tualen Anzahl an Fe3O4-NP pro Kompositnanopartikel wurden mindestens 100 magnetische Kompositpartikel ausgezählt.

Neben der Beladung und Einkapselungseffizienz wurden zudem die Partikelgröße und die

Partikelgrößenverteilung in Abhängigkeit der eingesetzten Menge an Magnetit-NP untersucht.

In der untenstehenden Tabelle 5 sind die diesbezüglich erhaltenen Ergebnisse der DLS-

A B C


Messungen gezeigt. Daraus geht hervor, dass die Erhöhung der zur Herstellung verwendeten

Menge an Magnetit-NP die resultierende Größe und Größenverteilung der Kompositpartikel

minimal zu beeinflussen scheint. Tendenziell nehmen die Größe sowie die Größenverteilung

mit steigender Menge an Magnetit-NP leicht zu. Ungeachtet dessen werden, basierend auf

einem PDI von 0,162, auch unter der höchsten Menge an Magnetit-NP noch monodisperse

Kompositpartikel erhalten. Inwieweit sich, beispielsweise zur Erhöhung der Magnetit-

Beladung, diese Menge an Magnetit-NP steigern lässt, um noch eine für die Indikation geeig-

nete Größe und Größenverteilung der Kompositpartikel zu erhalten, bleibt zu untersuchen.

Tabelle 5: Partikelgröße und PDI magnetischer Kompositpartikel in Abhängigkeit der zur deren Herstellung eingesetzten

Menge an Magnetit-NP. Die Partikel wurden unter Verwendung von 0,7 mg, 1,0 mg und 1,7 mg Magnetit-NP via Nanoprä-

zipitation unter dem in dieser Arbeit etablierten Protokoll hergestellt (n = 3).

Ansatz Magnetit-NP Größe PDI

initial [mg] [nm]

A 0,7 182,69 ± 2,04 0,030 ± 0,016

B 1,0 188,43 ± 5,63 0,031 ± 0,015

C 1,7 224,57 ± 8,02 0,162 ± 0,035

Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass sich unter den hier getesteten und eingesetzten

Mengen an Magnetit-NP sphärische, magnetische Kompositpartikel in einem Größenbereich

von ca. 200 ± 20 nm herstellen lassen. Dabei wird insbesondere die Beladung, aber auch die

Größe und Größenverteilung der resultierenden Kompositpartikel über die eingesetzte Menge

an Magnetit-NP beeinflusst. Die Kenntnis darüber könnte für eine Optimierung hinsichtlich

der magnetischen Eigenschaften oder vor dem Hintergrund einer zusätzlichen Verkapselung

mit einem Wirkstoff dienlich sein. Für das weitere experimentelle Vorgehen wurde sich in

dieser Arbeit auf die mittlere der hier evaluierten Menge an Magnetit-NP zur Herstellung der

magnetischen Kompositpartikel festgelegt. Dies entspricht 50 µl der in Chloroform disper-

gierten Magnetit-NP (20 mg/ml) respektive 1 mg Magnetit-NP. Darüber hinaus wurde sich

außer bei der anfänglichen Etablierung der Herstellungsmethode unter Verwendung der Mag-

netit-NP der Bezugsquelle 1 auf die Magnetit-NP der Bezugsquelle 2 festgelegt. Diese Her-

stellungsparameter wurden entsprechend als „Standardprotokoll“ etabliert und definiert. Die

im Rahmen dieser Arbeit hergestellten Kompositpartikel wurden, sofern nicht ausdrücklich

angegeben, unter Verwendung exakt dieser Bedingungen hergestellt. Dass unter diesem Stan-

dardprotokoll Kompositpartikel mit den hier angestrebten superparamagnetischen Charakte-

ristika resultieren, konnte zu Beginn dieses Kapitel gezeigt werden.


3.1.2 Magnetit-Rhodamin B PLGA-Nanopartikel

Die Herstellung von Magnetit-beladenen Rhodamin B PLGA-NP, d. h. fluoreszierender mag-

netischer Kompositpartikel, erfolgte nach dem in dieser Arbeit etablierten Standard-

Herstellungsprotokoll für Magnetit-PLGA-NP unter Verwendung von fluoreszenzmarkiertem

PLGA[132, 133]

.

Diese magnetischen Kompositpartikel (RhoBPLGA) sind in den repräsentativ ausgewählten

raster- und transmissionselektronenmikroskopischen Aufnahmen in Abbildung 25 gezeigt.

Demnach lassen sich mittels RhoBPLGA in Bezug auf Größe und Morphologie vergleichbare

Kompositpartikel herstellen. Die erhaltenen fluoreszierenden Kompositpartikel sind sphärisch

und ca. 170 nm groß. Die Partikelgrößenverteilung ist sehr eng. Dies wird auch durch die in

Tabelle 6 gezeigten Ergebnisse der DLS-Messung gestützt. Die inkorporierten Magnetit-NP

sind homogen in der Polymermatrix verteilt und zeigen keine Agglomeration (siehe TEM-

Aufnahme in Abbildung 25B).

Abbildung 25: Dargestellt ist eine rasterelektronenmikroskopische Aufnahme (A) und eine transmissionselektronische Auf-

nahme (B) von Magnetit-RhoBPLGA-NP sowie das Ergebnis der VSM Messung dieser Partikel (C).

Tabelle 6: Partikelgröße und PDI von Magnetit-RhoBPLGA-NP sowie die zugehörige Beladung und Einkapselungseffizienz

von Magnetit-NP (n = 3).

Größe PDI Beladung Einkapselungseffizienz

[nm] (%) (%)

170,41 ± 6,91 0,027 ± 0,018 2,06 ± 0,70 48,30 ± 0,70

Bezüglich der Beladung und Einkapselungseffizienz der zu verkapselnden Magnetit-NP wur-

den mit ca. 2% und 48% ebenfalls vergleichbare Werte zu den Magnetit-beladenen PLGA-NP

erzielt (vgl. Tabelle 6 mit Tabelle 5, Ansatz B). Diese beiden Kenngrößen wurden auf Basis

der Eisenoxidbestimmung mittels HR-CS-AAS erhalten. Die magnetischen Eigenschaften der

hergestellten fluoreszierenden Kompositpartikel wurden mittels VSM bei Raumtemperatur

charakterisiert. Das Ergebnis dieser Untersuchung ist in Form der erhaltenen Magnetisie-

rungskurve in Abbildung 25C dargestellt. Der sigmoidale Verlauf dieser

B C Á


Magnetisierungskurve spricht für ein superparamagnetisches Verhalten der fluoreszierenden

magnetischen Kompositpartikel. Hysterese und Remanenz sind nicht zu beobachten. Anhand

dieser VSM-Messung und den erzielten Ergebnissen aus den VSM-Messungen reiner Magne-

tit-NP, konnte darüber hinaus die Sättigungsmagnetisierung Ms, die Größe des magnetischen

Kerns dmag sowie der magnetische Gehalt µmag der Kompositpartikel bestimmt werden. Die

Sättigungsmagnetisierung ist mit 2,32 Am2kg

-1 im Vergleich zu reinen Magnetit-NP mit

58,0 Am2kg

-1 wesentlich geringer. Da die Sättigungsmagnetisierung auf die Masse normiert

ist, ist zu erwarten, dass diese sinkt, wenn ein Hybrid, wie die Kompositpartikel aus ferro-

magnetischem und nicht ferromagnetischem Material, vorliegt. Das gleiche Phänomen war

auch schon bei den im vorherigen Kapitel gezeigten Magnetit-PLGA-NP zu beobachten und

wird an dieser Stelle nicht weiter diskutiert. Auf Basis der Sättigungsmagnetisierung wurde

auch der magnetische Gehalt der Kompositpartikel bestimmt. Mit einem Massenprozentanteil

von 2,51% liegt der magnetische Gehalt in einem mit der Magnetit-Beladung vergleichbaren

Größenbereich (vgl. Beladungswert in Tabelle 6). Die magnetischen Kerne wurden mit

7,9 nm bestimmt, was ähnlich zu der im TEM ermittelten Größe von 10 nm für die Magnetit-

NP ist. Die hier gezeigten Ergebnisse belegen, dass durch Verwendung dieses PLGA-Typs

Kompositpartikel resultieren, welche hinsichtlich Morphologie, Größe und Größenverteilung

mit den Magnetit-PLGA-NP vergleichbar sind. Dies stellt zugleich die Grundvoraussetzung

dar, um diese Partikel als Äquivalent für die ungelabelten Kompositpartikel in der weiteren

experimentellen Vorgehensweise nutzen zu können.

3.1.3 Co-Verkapselung von Ciprofloxacin

Die Herstellung magnetischer, mit Ciprofloxacin co-beladener Kompositpartikel, erfolgte auf

Basis des in dieser Arbeit etablierten Standard-Herstellungsprotokolls. Aufgrund der Co-

Verkapselung mit dem Antibiotikum Ciprofloxacin und dessen schlechter Löslichkeit in Ace-

ton, musste dieses Protokoll jedoch entsprechend adaptiert werden. Die grundlegende Idee

hinter der Co-Verkapselung mit dem Antibiotikum Ciprofloxacin war die Entwicklung eines

Stimulus-responsiven Trägersystems zur Behandlung von Pseudomonas aeruginosa verur-

sachten chronischen Lungeninfektionen bei ZF-Patienten. Die angedachte Wirkstofffreiset-

zung sollte hierbei thermoresponsiv infolge der induktiven Partikelerwärmung erfolgen. In

Hinblick darauf wurde der Einfluss unterschiedlicher Mengen an Magnetit-NP auf die Parti-

kelbildung und insbesondere Co-Verkapselung von Ciprofloxacin untersucht. Die Magnetit-

NP repräsentieren hierbei den für den Stimulus essentiellen Bestandteil des Trägersystems.

Basierend auf den DLS Messungen gilt es zunächst festzuhalten, dass unter den hier geteste-

ten Mengen an Magnetit-NP für alle Ansätze nanoskalige Partikel mit einer Größe von ca.

200 nm erhalten wurden (siehe Tabelle 7).

Betrachtet man die resultierende Partikelgröße in Abhängigkeit der zur Herstellung eingesetz-

ten Menge an Magnetit-NP, zeichnet sich eine Verringerung der Größe mit zunehmender

Menge an Magnetit-NP ab. Die gleiche Tendenz ist für die Partikelgrößenverteilung,


ausgedrückt durch den PDI, zu beobachten. Bei der geringsten Menge an Magnetit-NP (≙

Ansatz b1) resultieren Partikel mit einem PDI von ca. 0,163, wohingegen dieser PDI bei der

höchsten Menge an Magnetit-NP (≙ Ansatz b3) auf 0,026 abfällt.

Tabelle 7: Partikelgröße und PDI in Abhängigkeit der zur Herstellung der Cipro co-beladenen magnetischen Kompositparti-

kel eingesetzten Menge an Fe3O4-NP mit b0 = 0 mg, b1= 0,7 mg, b2= 1 mg, b3= 1,7 mg. Die eingesetzte Ciprofloxacin-

Menge betrug in allen Ansätzen 2,5 mg und die PLGA-Menge 25 mg (n = 3).

Ansatz Magnetite-NP

initial [mg]

Größe [nm] PDI

b0 0 211,68 ± 63,63 0,113 ± 0,070

b1 0,7 233,04 ± 35,39 0,163 ± 0,090

b2 1 200,84 ± 41,79 0,090 ± 0,094

b3 1,7 172,91 ± 2,64 0,026 ± 0,015

Das Ergebnis der Untersuchung zum Einfluss der eingesetzten Magnetit-Menge auf die Co-

Verkapselung von Ciprofloxacin ist in Abbildung 26 graphisch dargestellt. Die darin für den

jeweiligen Ansatz gezeigte Beladung und Einkapselungseffizienz für Ciprofloxacin wurde auf

Grundlage der HPLC-Analyse ermittelt. In Kapitel 2.3.1.6 ist der hierfür angewandte Berech-

nungsweg dargelegt.

Betrachtet man die Wirkstoffbeladung und Einkapselungseffizienz für Ciprofloxacin ist fest-

zustellen, dass beide Kennzahlen mit Erhöhung der zur Partikelherstellung eingesetzten Men-

ge an Magnetit-NP kleiner werden. Diese Beobachtung korreliert demnach mit der bereits

beschriebenen sinkenden Partikelgröße und -größenverteilung bei Erhöhung der eingesetzten

Magnetit-NP. Basierend auf den erhaltenen Ergebnissen scheint die eingesetzte Menge an

Magnetit-NP sowohl die Co-Verkapselung von Ciprofloxacin als auch die resultierende Parti-

kelgröße zu beeinflussen. Ein Sachverhalt, welcher gewissermaßen zu erwarten war.


Abbildung 26: Beladung und Einkapselungseffizienz von Ciprofloxacin in Abhängigkeit der zur Herstellung der co-

beladenen magnetischen Kompositpartikel eingesetzten Menge an Fe3O4-NP mit b0 = 0 mg, b1= 0,7 mg, b2= 1 mg,

b3 = 1,7 mg. Die eingesetzte Cipro- und PLGA-Menge wurde dabei konstant gehalten. Zudem ist eine fotographische Auf-

nahme der zur Ciprofloxacin-Beladungsbestimmung herangezogenen gefriergetrockneten Partikel vor und nach deren Auflö-

sung gezeigt. Die zunehmende Braunfärbung von links nach rechts korreliert dabei mit der eingesetzten Menge an Fe3O4-NPs

(n = 3).

Bei einer Co-Beladung von Wirkstoff und Magnetit-NP konkurrieren beide Substanzen um

eine Inkorporation in die Polymermatrix. Weist einer dieser beiden Cargos bestimmte Charak-

teristika auf welche seine Verkapselung präferieren, wird dieser folglich zu einem höheren

Maße inkorporiert. Bei einem hydrophoben Trägermaterial, wie dem hier verwendeten

PLGA, könnte dies beispielsweise eine stärkere Hydrophobizität sein. Ein derartiges Verhal-

ten ist beispielsweise für die Kobeladung von Magnetit-NP und den Wirkstoff Tetrandrin in

PLGA beschrieben.[112]

Im angeführten Beispiel reduziert sich ebenfalls bei Erhöhung der

Magnetit-NP die eingekapselte Wirkstoffmenge. Die Magnetit-NP scheinen demnach eine

höhere Affinität zur Polymermatrix PLGA aufzuweisen als der Wirkstoff Tetrandrin.

Ein solcher Zusammenhang konnte in der vorliegenden Arbeit für die mit Ciprofloxacin co-

beladenen Kompositpartikel jedoch nicht gefunden werden. Auf Basis der TEM-Aufnahmen

der Partikel ist eine Erhöhung der Magnetit-Beladung als möglicher Grund für die beobacht-

bare sinkende Cipro-Beladung quasi auszuschließen. Betrachtet man die in Abbildung 27 re-

präsentativ ausgewählten TEM-Aufnahmen so ist festzustellen, dass, unabhängig von der ein-

gesetzten Menge an Magnetit-NP, eine sehr geringe Einkapselung dieser Partikel in die

PLGA-Matrix stattfindet. Die abgebildeten, polymerbasierten Partikel enthalten nur sehr we-

nige oder z. T. auch gar keine Magnetit-NP. Die Magnetit-Beladung scheint mit Erhöhung der

eingesetzten Menge an Magnetit-NP nur minimal anzusteigen. Von einer zusätzlichen Quanti-

fizierung des Eisenoxidgehalts wurde an dieser Stelle abgesehen.


Eine weitere wichtige Beobachtung, welche die TEM-Untersuchung hervorbrachte, ist das

Vorliegen agglomerierender Magnetit-NP. Dabei sind sowohl nicht verkapselte als auch in

der Polymermatrix verkapselt vorliegende Agglomerate von Magnetit-NP zu erkennen (siehe

Abbildung 27 A-2 und B).

Abbildung 27: TEM-Aufnahmen der aus Ansatz b2 (≙A-1und A-2) und b3 (≙B) resultierenden Ciprofloxacin co-beladenen

Kompositpartikel. Die roten Pfeile in A-1 markieren die verkapselten Magnetit-NP in den Kompositpartikeln. In der TEM-

Aufnahme A-2 sind nicht verkapselte Agglomerate von Magnetit-NP zu erkennen (roter Pfeil).

Das Vorhandensein dieser Agglomerate liefert eine mögliche Erklärung für die sinkende Be-

ladung und Einkapselungseffizienz von Ciprofloxacin bei Erhöhung der zur Herstellung ein-

gesetzten Menge an Magnetit-NP. Gleiches gilt für die Beeinflussung der Partikelgröße. Ein

möglicher Erklärungsansatz an dieser Stelle könnte wie folgt lauten: Die an der Oberfläche

der Magnetit-NP zur Stabilisierung aufgebrachte Ölsäure könnte im Zuge der Kompositparti-

kelherstellung durch das Ciprofloxacin teilweise ausgetauscht worden sein. Hierdurch wären

letztlich die Magnetit-NP instabiler und aufgrund des dann teilweise gebundenen Ciprofloxa-

cins hydrophiler. Ein derartiger Ligandenaustausch und die damit einhergehende unerwünsch-

te Oberflächenmodifikation der Magnetit-NP sind durchaus vorstellbar. Ciprofloxacin weist

eine freie Carboxylgruppe auf, welche exakt der chemischen Gruppe entspricht, über die auch

die Ölsäure an die Ferrit-Partikel adsorbiert. Demnach würden durch die Erhöhung der zur

Partikelherstellung eingesetzten Menge an Magnetit-NP, bei gleichbleibender Ciprofloxacin-

Konzentration, zunehmend mehr Wirkstoffmoleküle an die Oberfläche dieser Magnetit-NP

adsorbieren. Dadurch sinkt die Anzahl der Wirkstoffmoleküle, die in die Polymermatrix in-

korporiert werden können. Gleichzeitig sind die Magnetit-NP aufgrund dieses Ligandenaus-

tauschs hydrophiler funktionalisiert, wodurch sie auch schlechter in die hydrophobe PLGA-

Matrix inkorporiert werden können. Aufgrund dessen sinkt nicht nur die Beladung und Ein-

kapselungseffizienz des Ciprofloxacins, sondern aufgrund der geringeren Inkorporation von

Magnetit-NP und Ciprofloxacin auch die Partikelgröße.

A-1 A-2 B


Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass die Herstellung magnetischer, mit Ciprofloxacin

co-beladener Kompositpartikel zwar prinzipiell möglich ist, jedoch optimiert werden muss.

Inwieweit sich diese Kompositpartikel auf Basis des aktuellen Entwicklungsstands als induk-

tiv heizbares Trägersystem zur Behandlung von P. aeruginosa verursachten chronischen

Lungeninfektionen eignet, bleibt abzuklären. Die eingeschränkte Beladbarkeit mit Magnetit-

NP, dem für den Stimulus essentielle Bestandteil dieses Trägersystems, könnte diesbezüglich

ausschlaggebend sein. Es gilt daher zu untersuchen, inwieweit die Partikel induktiv heizbar

oder dahingehend optimierbar sind. Hierfür wäre es interessant den angeführten Erklärungs-

ansatz für die beobachtete geringe Kobeladung näher zu untersuchen. Unter Verwendung der

CHN-Elementaranalyse könnte beispielsweise untersucht werden, inwieweit der Wirkstoff

Ciprofloxacin die Tendenz aufweist, die Ölsäure auf der Oberfläche der Magnetit-NP zu ver-

drängen bzw. auszutauschen. Eine weitere Möglichkeit diesen postulierten Ligandenaustausch

quantitativ zu untersuchen, wäre die Verwendung von radioaktiv gelabelter Ölsäure.[144]

3.2 Induktives Heizen magnetischer Nanopartikel

3.2.1 Vorversuche zur Etablierung eines Setups zum induktiven Heizen

Hinsichtlich der induktiven Erwärmung der Kompositpartikel wurde ein Set-up benötigt, das

neben dem eigentlichen Erwärmungsprozess auch die Messung einer Temperaturerhöhung

störungsfrei und reproduzierbar ermöglicht. Vor diesem Hintergrund und dem Anspruch diese

Erwärmung sowie deren messtechnische Erfassung unter möglichst adiabatischen Bedingun-

gen durchzuführen, wurde die Entwicklung einer entsprechenden Probenkammer angestrebt.

Hierfür wurden verschiedene Materialien auf ihre Isolationsfähigkeit getestet. Diese umfass-

ten Luft, den Polyethylenschaum Tubolit®, den synthetische Kautschukschaum Armaflex

®,

den Schaumstoff auf Polystyrolbasis Neopor® sowie ein eigens dafür konstruiertes doppel-

wandiges Vakuum-Glasgefäß. In einer ersten Evaluierung wurden diese Materialien, bzw.

daraus bestehende Probenkammern hinsichtlich ihrer Fähigkeit einem Energieverlust entge-

genzuwirken, verglichen. Der Wärmeverlust an die Umgebung ist bei der induktiven Erwär-

mung ein wichtiger Parameter, der letztlich die messbare Erwärmung beeinflusst. Daher gilt

es den Wärmeverlust entsprechend zu minimieren. Vor diesem Hintergrund wurde 50 °C

temperiertes Wasser in den entsprechenden Isolator eingebracht und der Temperaturverlauf

über die Zeit gemessen. Das Ergebnis dieser Evaluierung ist in Abbildung 28 dargestellt. Die

darin dargestellten Temperaturprofile zeigen, dass keine der Probenkammern wirklich adiaba-

tische Bedingungen gewährleisten kann. In allen getesteten Probenkammern nimmt die Tem-

peratur über die Zeit ab. Der Temperaturabfall ist jedoch unterschiedlich hoch. Luft ist dem-

nach das schlechteste der hier getesteten Isoliermaterialien, gefolgt von dem Polyethylen-

schaum Tubolit®. Vergleicht man Luft mit den Probenkammern aus Amaflex

®, Neopor

® und

der hier entwickelten Vakuumkammer ist ein extrem starker Temperaturabfall zu beobachten.


Innerhalb von ca. 10 min fällt die Probentemperatur um die Hälfte ab. Luft als alleiniger Iso-

lator stellte somit keine Option dar. Der über die Zeit gemessene Wärmeverlust der drei ande-

ren Isolatoren ist nahezu gleich.

Abbildung 28: Evaluierung der Isolationsfähigkeit verschiedener Materialien anhand des Energieverlusts von temperiertem

Wasser. Hierfür wurde jeweils 1 ml 50 °C-temperiertes Wasser in die entsprechende Isolierung eingebracht und der Tempe-

raturabfall über die Zeit gemessen.

Für eine weitere Evaluierung wurde die Neopor®

-basierte Probenkammer der Vakuumkam-

mer gegenübergestellt. Im Rahmen dieser Testung wurden die Isolatoren in ein 50 °C bzw.

30 °C temperiertes Wasserbad eingebracht und ihre Isolationsfähigkeit hinsichtlich eines

Energieeintrag von außen untersucht. Dies erfolgte vor dem Hintergrund eines während der

induktiven Erwärmung störenden Wärmeeintrags von außen. Ein solcher Wärmeeintrag könn-

te durch das potentielle Aufheizen der Spule während des Erwärmungsprozesses resultieren.

Die aus diesem Experiment hervorgehenden Temperaturprofile sind in Abbildung 29 gegen-

übergestellt. Daraus geht hervor, dass bei einer Umgebungstemperatur von 50 °C die Vaku-

umkammer die Temperatur wesentlich geringer ansteigen lässt als die Neopor®-basierte Pro-

benkammer. Demnach wirkt die doppelwandige Vakuumkammer einem Wärmeeintrag in die

Probe effizienter entgegen. Bei einer niedrigeren Umgebungstemperatur von 30 °C kann die

hier konstruierte Vakuumkammer die Probentemperatur über einen sehr langen Zeitraum na-

hezu konstant halten. Dies wird durch den äußerst flachen Anstieg der Temperatur-Zeit-Kurve

belegt. Basierend auf diesen Evaluierungsexperimenten wurde sich auf die selbst entwickelte

Vakuumkammer als die Probenkammer der Wahl festgelegt. Sie gilt damit als fester Bestand-

teil des Set-ups zum induktiven Heizen. Die Konzeption dieser Kammer ermöglicht zudem

die Probe mittig in der Spule zu positionieren. Dadurch ist sowohl der Erwärmprozess, als

auch die Temperaturmessung unter reproduzierbaren Bedingungen möglich. Der


Energieaustausch zwischen Probe und Umgebung sollte durch Verwendung dieser Kammer

beim induktiven Heizen minimiert werden. Dies lässt sich zumindest aus den hier gezeigten

Ergebnissen schlussfolgern.

Abbildung 29: Evaluierung der Fähigkeit der aus Neopor® bestehenden Probenkammer sowie der Vakuum-Kammer einem

Energieeintrag entgegenzuwirken. Zur Testung wurden die beiden Isolatoren in ein 50 °C bzw. 30 °C temperiertes Wasser-

bad eingebracht und der Temperaturverlauf der Probe (1 ml H2O) über die Zeit gemessen.

3.2.2 Evaluierung von Heizverhalten beeinflussender Parametern

Ein wichtiger Aspekt, den es im Rahmen dieser Arbeit zunächst zu adressieren galt, war die

Identifikation potentieller Parameter, die das Heizverhalten beim induktiven Erwärmungspro-

zess beeinflussen. Die systematische Herangehensweise und die Kenntnis dieser Einflussfak-

toren stellen die Basis für eine effiziente induktive Erwärmung der Kompositpartikel und de-

ren Applikation dar. Im Fokus der Evaluierung standen im Wesentlichen zwei Parameter,

deren Einfluss anhand des Heizverhaltens reiner Magnetit-NP untersucht wurde. Nachfolgend

werden die Ergebnisse dieser Evaluierung vorgestellt und diskutiert.

3.2.2.1 Einfluss der Konzentration an Magnetit-NP

Der erste Parameter, dessen Einfluss auf das Heizverhalten der Magnetit-NP untersucht wur-

de, stellt die Konzentration der Magnetit-NP dar. Die induktive Erwärmung von superpara-

magnetischen Partikeln, wie den hier verwendeten Magnetit-NP, resultiert aufgrund der

Brown- und Néel-Relaxation.[145]

Beim Anlegen eines magnetischen Wechselfeldes trägt

demnach jeder einzelne, in der Partikelsuspension enthaltene NP zur Erwärmung dieser Sus-

pension bei. Ausgehend von dieser Annahme, ist bei einer Erhöhung der Partikelkonzentrati-

on prinzipiell eine höhere Wärmegenerierung zu erwarten. Die messtechnisch erfassbare

0 100 200 300 400 500 600

20

25

30

35

40

45

50

Tem

pera

tur

[°C

]

Zeit [s]

Neopor (50°C)

Vakuum (50°C)

Vakuum (30°C)


Temperatur der Partikelsuspension wird von dieser Wärmegenerierung und dem Wärmever-

lust an die Umgebung beeinflusst. Unterschiedliche Partikelkonzentrationen müssten dem-

nach in unterschiedlichen Temperaturprofilen resultieren. Anhand derer sollte ein, für die an-

gestrebte Erwärmung der Kompositpartikel, geeigneter Konzentrationsbereich ermittelt wer-

den.

Im Rahmen dieser Arbeit wurden drei unterschiedliche Partikelkonzentrationen dem Wech-

selmagnetfeld ausgesetzt. Die resultierende Erwärmung der jeweiligen Partikelsuspension

wurde via Glasfaseroptik messtechnisch erfasst. Induktiv erwärmt wurden jeweils 500 µl in

Chloroform vorliegende Magnetit-NP mit einer Konzentration von 20 mg/ml, 2 mg/ml und

0,2 mg/ml. In Abbildung 30 ist das Ergebnis dieser Evaluierung unter Anwendung einer Heiz-

leistung von 0,23 kW beispielhaft gezeigt. Die Untersuchung wurde darüber hinaus auch für

die anderen in dieser Arbeit genutzten Heizleistungen, d. h. 1,01 kW und 2,3 kW, vorgenom-

men. Der zu beobachtende Trend ist für alle drei Heizleistungen gleich. Daher wird an dieser

Stelle, stellvertretend für sämtliche hier getesteten Heizleistungen, die in Abhängigkeit der

Partikelkonzentration resultierende Temperaturprofile unter einer Heizleistung von 0,23 kW

diskutiert.

Abbildung 30: Einfluss der Partikelkonzentration auf die messtechnisch erfassbare Temperaturänderung der Partikelsuspen-

sion beim induktiven Heizen. Dargestellt ist der Temperaturverlauf über einen Messzeitraum von 1200 s der verschiedenen

Partikelkonzentrationen (links) sowie den Temperaturanstieg ΔT der jeweiligen Partikelsuspension einschließlich der ermit-

telten SAR-Werte (rechts). Das zu erwärmende Volumen betrug jeweils 500 µl und die zur induktiven Erwärmung genutzte

Heizleistung 0,23 kW (n = 3).

Das linke Diagramm in Abbildung 30 zeigt den aufgenommenen Temperaturverlauf der je-

weiligen Partikelsuspensionen über den gesamten induktiven Erwärmungsprozess. Daraus

lässt sich ableiten, dass die Temperatur, unabhängig von der jeweilig hier untersuchten Parti-

kelkonzentration, zu Beginn der Erwärmung ansteigt und dann in ein Plateau übergeht. Die

Abflachung der Heizkurve erklärt sich dadurch, dass der induktiv induzierten Wärmegenerie-

rung durch die Magnetit-NP der Energieverlust an die Umgebung gegenübersteht. Aus der


Testung hinsichtlich Isolierfähigkeit ist bekannt, dass mit der Probenkammer keine adiabati-

schen Bedingungen realisierbar sind (siehe 3.2.1). Die Wärmegenerierung wird durch die An-

zahl an Wärmegeneratoren, sprich Magnetit-NP, beeinflusst. Demnach korreliert die Höhe

dieses Plateaus mit der Partikelkonzentration. Dies ist an den hier erhaltenen Temperaturpro-

filen deutlich zu erkennen. Bei der niedrig konzentrierten Suspension ist der Temperaturver-

lauf erwartungsgemäß durch eine wesentlich flacher ansteigende Kurve charakterisiert. Dieser

Zusammenhang wird auch deutlich, wenn man den Temperaturanstieg über den gesamten

Messzeitraum von 1200 s gegen die Partikelkonzentration aufträgt (siehe Abbildung 30; rech-

ter Graph). Bei der geringsten Partikelkonzentration von 0,2 mg/ml beläuft sich Temperatur-

änderung auf ΔT = 0,4 ± 0,1 °C, wohingegen bei der höchsten Magnetit-NP Konzentration

eine Änderung von ΔT = 31,4 ± 1,5 °C zu beobachten ist. Ein derartiges konzentrationsab-

hängiges Verhalten ist in der Literatur auch für die induktive Erwärmung von Magnetit-NP

unter anderen Heizbedingungen beschrieben.[146]

Darauf basierend lässt sich an dieser Stelle

folgendes festhalten: Um die induktive Erwärmung der Partikelsuspension messtechnisch

erfassen zu können, muss die Konzentration an Magnetit-NP ausreichend hoch sein. Bei-

spielsweise sollte die Konzentration an Magnetit-NP bei der hier genutzten Heizleistung von

0,24 kW nicht kleiner als 0,2 mg/ml sein. Andernfalls ist die Erwärmung der Partikelsuspen-

sion messtechnisch nicht nachweisbar. Die induktive Erwärmung der Magnetit-NP ist auf-

grund des parallel stattfindenden Wärmeverlusts nicht ausreichend, um die Temperatur der

Partikelsuspension signifikant zu erhöhen. Die Partikelkonzentration ist somit ein wichtiger

Aspekt, den es im Hinblick auf die angedachte induktive Erwärmung der Kompositpartikel zu

berücksichtigen gilt.

Die generelle Fähigkeit unter induktiven Heizbedingungen Wärme zu generieren ist theore-

tisch unabhängig von der Konzentration der Magnetit-Partikel. Dies ist in der Literatur für

diverse magnetische Nanopartikel beschrieben.[147, 148]

Dies lässt sich auch für die in dieser

Arbeit genutzten Magnetit-NP anhand von SAR-Wert Berechnungen belegen. Die Unabhän-

gigkeit des SAR-Wertes von der Partikelkonzentration geht bereits aus der zur Berechnung

zugrundeliegenden Formel hervor. Darin berücksichtigt ist nämlich die Masse an Magnetit-

NP. Die von den magnetischen Partikeln generierte Wärme wird durch die Masse der magne-

tischen Partikel normalisiert. Der SAR-Wert ermöglicht somit den Vergleich anderer, auf die

Heizeffizienz einflussnehmender Parameter, wie beispielsweise die Frequenz oder die Parti-

kelbeschaffenheit. Eine akkurate Bestimmung des SAR-Werts setzt eigentlich ideale adiabati-

sche Bedingungen voraus.[149]

Dies zu realisieren ist jedoch äußerst komplex. Daher ist die

Nutzung der initialen Steigung der Temperatur-Zeit-Kurve nach Einschalten des Wechsel-

magnetfeldes gängige Praxis, um diesen charakteristischen Wert zu erhalten.[146, 150, 151]

Die

initiale Steigung wurde auch in dieser Arbeit zur Ermittlung des SAR-Wertes herangezogen

(hier Heizrate nach t = 60 s). Die Berechnung des SAR-Wertes erfolgte gemäß der nachste-

henden Formel:


mit: mProbe: Masse der Probe berechnet aus VProbe x ρChloroform (g)

mNP: Masse an Magnetit-NP (g)

cCHCl3: spezifische Wärmekapazität von Chloroform (J/g*K-1

)

(ΔT/ Δt)initial: Heizrate nach t = 60 s

In der vorliegenden Arbeit wurden für die getesteten Konzentrationen die SAR-Werte unter

einer Heizleistung von 0,24 kW nach obiger Formel ermittelt. Die Ergebnisse dieser SAR-

Wert Bestimmung sind in Abbildung 30 dargestellt. Betrachtet man die SAR-Werte, so ist zu

erkennen, dass sich diese für die hier getesteten Konzentrationen bei einer Heizleistung von

0,23 kW nicht wirklich unterscheiden. Dieses Ergebnis ist erwartungsgemäß und, wie er-

wähnt, auch für diverse andere magnetische Nanopartikel beschrieben.

3.2.2.2 Einfluss der Heizleistung

Der zweite Parameter, dessen Einfluss auf das Heizverhalten beim induktiven Erwärmungs-

prozess untersucht wurde, ist die verwendete Heizleistung. Evaluiert wurden in diesem Zu-

sammenhang die drei HF-Ausgangsleistungen 0,23 kW, 1,01 kW und 2,3 kW. Im Rahmen

dieser Untersuchung wurden die aus der vorangegangen Evaluierung der Partikelkonzentrati-

on bekannten Konzentrationen von 0,2 mg/ml, 2 mg/ml und 20 mg/ml genutzt. Es zeigte sich

ein deutlicher Einfluss der Heizleistung auf die Wärmegenerierung. Dies geht aus der verglei-

chenden Darstellung der initialen Temperaturänderung nach 60 s (ΔT60s) unter den hier getes-

teten Heizleistungen deutlich hervor (siehe Abbildung 31). Die Temperaturänderung zu die-

sem Zeitpunkt (t = 60 s) nimmt mit größer werdender Heizleistung zu. Dieser Trend spiegelt

sich darüber hinaus bei jeder der hier evaluierten Konzentration wieder. Betrachtet man z. B.

die Temperaturänderung der Partikelsuspension mit einer Magnetit-NP Konzentration von

2 mg/ml in Abhängigkeit der Heizleistung, so steigt diese Änderung von ΔT~ 0,6 °C bei

0,23 kW auf ΔT~ 7 °C bei 2,3 kW an. Anzumerken ist, dass bei den Heizleistungen 1,01 kW

und 2,3 kW und den höheren Konzentrationen 2 mg/ml und 20 mg/ml die Wärmegenerierung

so groß war, dass eine Aufnahme des Temperaturverlaufs über den kompletten Messzeitraum

nicht möglich war. Dies liegt darin bergründet, dass im Laufe der induktiven Erwärmung der

Siedepunkt des Partikelsuspensionsmediums (Sdp. Chloroform ≙ 61 °C) erreicht wurde. Daher

musste die Erwärmung entsprechend abgebrochen werden, um eine Aufkonzentrierung und

damit verbunden eine Ergebnisverfälschung zu vermeiden. Um die Einflussuntersuchung der

Heizleistung dennoch zu ermöglichen, wurde die Temperaturänderung nach den initialen 60 s

herangezogen. Die zu diesem Zeitpunkt erreichte Temperatur lag bei allen Konzentrationen


und unter allen Heizleistungen unterhalb des Siedepunktes von Chloroform. Damit ist die

Voraussetzung einer generellen Vergleichbarkeit der Heizrate zu diesem Zeitpunkt gegeben.

Abbildung 31: Darstellung des Temperaturanstiegs ΔT nach 60 s in Abhängigkeit der Heizleistung und der jeweiligen Parti-

kelkonzentration. Das Volumen der jeweiligen induktiv zu erwärmenden Partikelsuspension belief sich auf 500 µl (n = 3).

Die initialen Heizraten (dT/dt) wurden herangezogen, um den Einfluss der Heizleistung auf

den SAR-Wert und somit die Heizeffizienz der Partikel zu untersuchen. Die Untersuchung

des Zusammenhangs zwischen Heizleistung und SAR-Wert wurde exemplarisch anhand der

Partikelsuspension mit einer Magnetit-NP Konzentration von 2 mg/ml vorgenommen. Die

Berechnung des SAR-Werts erfolgte unter Verwendung der im vorherigen Kapitel eingeführ-

ten Formel (siehe 3.2.2.1). Das entsprechende Ergebnis ist in Abbildung 32 dargestellt. Da-

raus geht eine deutliche Abhängigkeit des SAR-Wertes von der zur induktiven Erwärmung

genutzten Heizleistung hervor. Mit Erhöhung der Heizleistung nimmt der SAR-Wert und so-

mit die Wärmegenerierung pro Masse Magnetit-NP kontinuierlich zu. Mit einem bei der

Heizleistung von 0,23 kW beginnenden Wert von 11,4 ± 3,6 W/g steigt der SAR-Wert bei

1,1 kW auf 51,7 ± 16,6 W/g an und weist bei der höchsten Heizleistung einen Wert von

82,9 ± 10,1 W/g auf. Die durch das induktive Heizen erbrachte Wärmeleistung pro Gramm

Magnetit-NP lässt sich demnach durch die Heizleistung bedeutend beeinflussen. Die Variati-

on der HF-Ausgangsleistung hat einen Einfluss auf die Feldparameter. Dass derartige Feldpa-

rameter die Wärmegenerierung von magnetischen Partikeln beeinflussen ist über die von Ro-

sensweig etablierte Gleichung bereits ausgedrückt.[94]


Zudem beschreiben mehrere Veröffentlichungen einen derartigen Zusammenhang für ver-

schiedenste magnetische Partikeltypen.[146, 147]

Im Rahmen einer Arbeit von Shah et al.[147]

beispielsweise, konnte die Signifikanz der Magnetfeldparameter anhand der induktiven Er-

wärmung von Dextran-gecoateten Eisenoxid-NP eindrucksvoll gezeigt werden. Über die Er-

höhung der Magnetfeldstärke konnte die Heizrate der Partikel und somit auch der SAR-Wert

wesentlich gesteigert werden. Der gleiche Trend konnte durch Erhöhung der Frequenz gezeigt

werden. Dabei wurden beide Parameter und ihr Einfluss einzeln voneinander getestet.[147]

Mit

zunehmender Frequenz rotieren die Spins der Eindomänen-Partikel schneller, wodurch letzt-

lich die Wärmegenerierung verstärkt wird. Dies stellt ein möglicher Erklärungsansatz für die

hier beobachtete Relation zwischen Heizleistung und Wärmegeneration dar. Darüber hinaus

ist der Einfluss von Parametern wie Magnetfeldstärke und Frequenz auf die Wärmeleistung

der magnetischen Partikel hinreichend bekannt und in der Literatur beschrieben.[151]

Abbildung 32: Einfluss der Heizleistung auf den Temperaturverlauf beim induktiven Erwärmen einer Partikelsuspension mit

einer Konzentration an Magnetit-NP von 2 mg/ml (links). Ausgehend von diesen Temperatur-Zeit-Kurven wurde (ΔT/Δt)60s

ermittelt und die entsprechenden SAR-Werte berechnet (rechts). Das zu erwärmende Volumen betrug jeweils 500 µl (n = 3).

Zusammenfassend lässt sich an dieser Stelle festhalten, dass die im Rahmen der Evaluierung

erhaltenen Ergebnisse eine wichtige Grundlage für die induktive Erwärmung der Komposit-

partikel darstellen. Die gewählte Heizleistung ist entscheidend für eine effiziente Erwärmung

der in dieser Arbeit verwendeten Magnetit-NP. Um diese Erwärmung messtechnisch erfassen

zu können ist eine ausreichend hohe Magnetit-NP Konzentration anzustreben.

3.2.3 Heizverhalten von Magnetit-PLGA-Nanopartikel

Die induktive Erwärmbarkeit der Magnetit-PLGA-NP wurde auf Basis der Erkenntnisse un-

tersucht, welche die vorherige Evaluierung der reinen Magnetit-NP hervorbrachte. Dabei

wurde angenommen, dass die identifizierten Parameter, die das Heizverhalten reiner Magne-

tit-NP beeinflussen, sich auf die Magnetit-PLGA-NP und deren Heizverhalten übertragen


lassen. Diese Annahme erfolgte unter dem Aspekt, dass diese Magnetit-NP den notwendigen

Bestandteil der Kompositpartikel für die induktive Erwärmung darstellen. Um eine mögliche

Erwärmung überhaupt messtechnisch erfassen zu können, wurden die Magnetit-PLGA-NP

entsprechend aufkonzentriert. Dabei wurde darauf geachtet, dass die Menge an inkorporierten

Magnetit-NP, bezogen auf das zu erwärmende Probenvolumen, größer als 0,2 mg/ml ist. Die

wässrige Partikelsuspension wurde mit einer Heizleistung von 0,23 kW und 2,3 kW induktiv

erwärmt. In Abbildung 33 ist das Ergebnis dieser induktiven Erwärmung gezeigt. Die darge-

stellten Temperaturverläufe indizieren deutlich die induktive Erwärmbarkeit der Magnetit-

PLGA-NP. Auch ist zu erkennen, dass die Wärmegenerierung der magnetischen Komposit-

partikel, wie schon bei den reinen Magnetit-NP beobachtet, stark von der Heizleistung ab-

hängt. Bei der geringeren Heizleistung von 0,23 kW wird im Rahmen des induktiven Er-

wärmprozesses ein Temperaturanstieg von ΔT = 2,1 ± 1,5 °C erzielt, wohingegen im gleichen

Zeitraum bei der höheren Heizleistung ein fast zehnfach höherer Anstieg von

ΔT = 20,1 ± 0,2 °C erreicht wird. Die hier gezeigte heizleistungsabhängige Wärmegenerie-

rung wurde, wie bereits erwähnt, schon bei den reinen Magnetit-NP beobachtet. Entsprechen-

de Erklärungsansätze hierfür sind anhand der reinen Magnetit-NP bereits in Kapitel 3.2.2.2

ausführlich diskutiert und werden an dieser Stelle nicht wiederholt.

Abbildung 33: Einfluss der beim induktiven Erwärmen von Magnetit-PLGA-NP genutzten Heizleistung auf den resultieren-

den Temperaturverlauf der Partikelsuspension. Das Volumen der jeweiligen induktiv zu erwärmenden Partikelsuspension

belief sich auf 500 µl (n = 3).

Für das mit den Magnetit-PLGA-NP angestrebte Vorhaben, die Mukusbarriere durch eine

induzierte Erwärmung der Partikel und einer dadurch postulierten lokalen Viskositätsernied-

rigung zu überwinden, sind die hier erzielten Ergebnisse essentiell. Die nachgewiesene Heiz-

barkeit der magnetischen Kompositpartikel stellt in diesem Kontext die Grundvoraussetzung

dar. Die Fragestellung, inwieweit sich die Partikelkonzentration reduzieren lässt, um unter


den hier genutzten Heizbedingungen noch eine Erwärmung detektieren zu können, wurde in

der vorliegenden Arbeit nicht adressiert. Hauptaugenmerk lag auf dem Nachweis der prinzipi-

ellen Erwärmbarkeit dieser Partikel. Dass sich dies nur an einer hochkonzentrierten Partikel-

suspension untersuchen lässt ist der Tatsache geschuldet, dass nur der Temperaturanstieg der

Suspension messtechnisch zugänglich ist. Die induktiv erwärmten Partikel liefern als Output

keine bestimmte Temperatur, sondern Wärme. Diese Wärme wird an das Suspensionsmedium

abgegeben und die resultierende Temperatur ist von der Wärmekapazität des Mediums sowie

den thermischen Umgebungsbedingungen abhängig. Das ist zugleich die Erklärung für das

Abflachen der Heizkurven über die Zeit. Je größer der Gradient zwischen Probe und Umge-

bung ist, desto größer ist der Wärmeverlust. Bei einer gering konzentrierten Probe oder bei

einer geringen Heizleistung wird vergleichsweise weniger Wärme an das Suspensionsmedium

abgegeben. Folglich ist die resultierende Temperaturänderung bei gleichbleibender Wärme-

kapazität des Suspensionsmediums geringer.

Für den hier verfolgten Ansatz wäre die Temperaturänderung an der Partikeloberfläche we-

sentlich interessanter als die des Suspensionsmediums. Dieses Interesse liegt in der Annahme

begründet, dass die Temperatur direkt an der Partikeloberfläche wesentlich höher sein müsste

als die gemessene Suspensionstemperatur. Eine experimentelle Verifizierung dieser Annahme

erfolgte beispielsweise indem man ein Fluorophor über ein thermosensitives Molekül an

PEGylierte Eisenoxidpartikel koppelte. Dadurch ließ sich nachweisen, dass beim induktiven

Heizen die Temperatur in Oberflächennähe der Partikel (~ 0,5 nm) wesentlich höher ist als die

messbare Suspensionstemperatur.[152]

Eine derartige Temperaturmessung ist jedoch äußerst

komplex und routinemäßig derzeit nicht einfach realisierbar. In diesem Zusammenhang gibt

es mehrere Forschungsansätze, die sich mit dieser Problematik und Fragestellung

befassen.[153, 154]

Für die angedachte Applikation stellt die Oberflächentemperatur der Partikel

ein wichtiger zukünftig zu adressierender Aspekt dar. Letztlich ist die induktive Erwärmung

der Kompositpartikel so anzupassen, dass die Mukusbarriere überwunden werden kann ohne

dabei das unterliegende Epithel aufgrund zu hoher Temperatur und einer daraus induzierten

Zellapoptose zu schädigen.

3.2.4 Heizverhalten von Magnetit-RhoBPLGA-Nanopartikel

Die gezeigte induktive Erwärmbarkeit der Magnetit-PLGA-NP stellte die Basis für die weite-

re Vorgehensweise hinsichtlich des hier verfolgten Ansatzes zur Überwindung der Mukusbar-

riere dar. Im Hinblick darauf wurde ein Set-up etabliert, welches zu Detektionszwecken fluo-

reszenzmarkierte Magnetit-PLGA-NP vorsieht (siehe Kapitel 2.3.3.1). Infolgedessen wurden

auch die Rhodamin B markierten Magnetit-PLGA-NP hinsichtlich ihres Heizverhaltens im

elektromagnetischen Feld untersucht. Die Untersuchung beschränkte sich allerdings auf die

Verwendung der höchsten Heizleistung von 2,3 kW. Die notwendige Aufkonzentrierung er-

folgte analog zu den ungelabelten Kompositpartikeln. Das Ergebnis dieser induktiven Erwär-

mung ist in Abbildung 34 gezeigt. Die ansteigende Temperaturkurve impliziert die Fähigkeit


dieser fluoreszenzmarkierten Nanokomposite sich unter den gewählten Heizbedingungen in-

duktiv zu erwärmen. Nach einer Heizzeit von 1200 s konnte ein Temperaturanstieg von

ΔT = 19,23 ± 1,2 °C erzielt werden. Damit ergibt sich für die Magnetit-beladenen

RhoBPLGA-NP unter gleicher Aufkonzentrierung und Heizbedingung ein mit den ungelabel-

ten Magnetit-PLGA-NP vergleichbares Heizprofil (vgl. ΔT1200 s Magnetit-PLGA-NP

= 20,1 ± 0,2 °C). Da die Beladung mit Magnetit sowie die magnetischen Charakteristika für

beide Kompositpartikel vergleichbar sind war dieses Ergebnis zu erwarten. Demnach können

die Magnetit-RhoBPLGA-NP als Äquivalent angesehen werden. Ihre Verwendung anstelle

der Magnetit-PLGA-NP ist somit für das weitere Vorgehen legitimiert. Die hieraus resultie-

renden Ergebnisse sollten sich theoretisch mit den Magnetit-PLGA-NP reproduzieren lassen.

Abbildung 34: Temperaturanstieg von Magnetit-PLGA-NP unter induktiven Heizbedingungen. Das Volumen der jeweiligen

induktiv erwärmten Partikelsuspension belief sich auf 500 µl. Die applizierte Heizleistung betrug 2,23 kW (n = 3).

3.3 Induktives Heizen zur Verbesserung der Mukuspenetration

3.3.1 Einfluss einer Gesamterwärmung auf die Partikelpenetration im

Modellgel

Der in der Arbeit verfolgte neuartige Ansatz zur Überwindung der Mukusbarriere setzt an

einer wärmeinduzierten Penetrationsverbesserung dieser Barriere an. Die intendierte Erwär-

mung soll lokal und induktiv über das die Barriere zu überwindend beabsichtigte Wirkstoff-

trägersystem erfolgen. Die grundlegende Hypothese, sprich, dass die Mukusbarriere unter

Wärmeeinfluss besser zu penetrieren ist, galt es zunächst in einer grundsätzlichen Machbar-

keitsstudie nachzuweisen. Hierfür wurde im Rahmen der Arbeit ein spezielles Set-up


entwickelt, welches die Untersuchung der prognostizierten temperaturabhängigen Partikelpe-

netration in Mukus unter induktiven Heizbedingungen ermöglichen sollte.

Zunächst wurde dieses Set-up jedoch genutzt um den grundsätzlichen Einfluss von Wärme

auf das Migrationsverhalten näher zu untersuchen und zwar im Mukus-Modellgel, sprich

1%igem HEC-Gel. Hierfür wurden Schlauchstücke mit diesem Gel befüllt, bevor anschlie-

ßend Magnetit-RhoBPLGA-NP aufgegeben wurden. Das Modellgel simuliert dabei die von

den Partikeln zu überwindende Mukusbarriere. Die Fähigkeit der Partikel diese Barriere zu

penetrieren wurde vergleichend unter Raumtemperatur und 40 °C untersucht. Die Schlauch-

stücke mit den aufgegebenen fluoreszierenden magnetischen Kompositpartikeln wurden hier-

zu für 30 min den beiden genannten Temperaturen ausgesetzt. Zur Erhaltung des Penetrati-

onsmusters wurden sie anschließend eingefroren, in Sektionen aufgeschnitten und diese hin-

sichtlich ihrer Fluoreszenzintensität mittels CLSM untersucht. Das Ergebnis dieser Untersu-

chung ist in Abbildung 35 graphisch dargestellt.

Abbildung 35: Vergleichende Darstellung des Penetrationsmusters Rhodamin B markierter Magnetit-PLGA-NP im Modell-

gel HEC nach 30-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur (RT) und 40 °C. * signifikanter Unterschied zur Kontrolle (K),

d. h. HEC ohne Partikel (p<0,05). ** signifikanter Unterschied in der jeweiligen Sektion unter RT und 40 °C (p< 0,05). Die

Intensität jeder Sektion wurde für jeden Versuch anhand von 15 Bildern gemessen, d. h. die gezeigte Intensität wurde bei drei

Experimenten anhand von 45 Bildern bestimmt (n = 3).

Anzumerken ist, dass die Sektion 1 den aufgegebenen Partikeln entspricht, die eigentliche von

den Partikeln zu penetrierende Barriere beginnt erst ab Sektion 2. Verfolgt man die gemesse-

nen Fluoreszenzintensitäten der jeweiligen Sektionen ist zu erkennen, dass diese Intensität

über die Länge des Schlauchstücks hin abnimmt. Dieser Trend ist sowohl für die Partikelpe-

netration unter Raumtemperatur als auch unter 40 °C zu beobachten. Die zurückgelegte Pe-

netrationsstrecke ist hingegen bei der höheren Temperatur wesentlich größer. Unter


Erwärmung penetrieren die Partikel bis in Sektion 5, wohingegen Partikel unter Raumtempe-

raturbedingungen nur bis in Sektion 3 detektiert werden konnten. Darüber hinaus ist die Fluo-

reszenzintensität in den jeweiligen Sektionen bei Erwärmung signifikant höher als unter

Raumtemperatur. Die Intensität ist proportional zu der Konzentration angeregter Fluores-

zenzmoleküle, welche hier Bestandteil der Nanokomposite sind. Folglich bedeutet ein signifi-

kanter Intensitätsunterschied einen signifikanten Unterschied der Partikelanzahl in der ent-

sprechenden Sektion.

Das aus dieser ersten Machbarkeitsstudie erhaltene Ergebnis lässt den Rückschluss zu, dass

sich das Partikelpenetrationsmuster im Mukus-Modellgel über die Temperatur beeinflussen

lässt. Eine Temperaturerhöhung wirkt sich demnach positiv auf die Partikelmobilität im Mo-

dellgel HEC aus. Hintergrund hierfür ist sehr wahrscheinlich die Erniedrigung der Viskosität

des HEC-Gels durch die höhere Temperatur. Dass die Viskosität des Hydrogels HEC mit der

Temperatur korreliert ist bekannt. Für ein 1,5%igen HEC-Gel, beispielsweise, erniedrigt sich

die dynamische Viskosität von 3,200 mPas bei 25 °C auf 1,900 mPas bei 37 °C. Zudem ist

durch sogenannte Einzelpartikelverfolgung in unterschiedlichen Hydrogelen ein Zusammen-

hang zwischen dynamischer Viskosität und Partikelmigration indiziert.[155]

Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass zum einen das entwickelte Set-up zur Detektion

des Partikelpenetrationsmusters in HEC geeignet ist, zum anderen eine Temperaturerhöhung

die Penetration der Kompositpartikel im Modellgel HEC verbessert. Inwieweit sich darüber

die Penetrierbarkeit der Mukusbarriere verbessern lässt galt es im nächsten Schritt zu untersu-

chen.

3.3.2 Einfluss einer Gesamterwärmung auf die Partikelpenetration im Mukus

Das Ergebnis aus der vorherigen ersten Machbarkeitsstudie zum Einfluss von Wärme auf das

Partikelpenetrationsverhalten im Mukus-Modellgel galt es auf nativen Mukus zu übertragen.

Hierfür wurde ebenfalls auf das in dieser Arbeit entwickelte und etablierte Set-up zurückge-

griffen. Die Untersuchungsbedingungen wurden gleich gehalten bis auf die Ausnahme, dass

die Schlauchstücke mit Pferdemukus anstelle des zuvor verwendeten HEC als Modellgel be-

füllt wurden. Das Ergebnis dieser Penetrationsexperimente ist in Abbildung 36 gezeigt.

Anzumerken ist, dass wie im vorherigen Experiment mit HEC, die von den Partikeln zu pe-

netrierende Barriere, erst ab Sektion 2 beginnt. Sektion 1 entspricht dem Auftrageort der Par-

tikel. Betrachtet man den Verlauf der Fluoreszenzintensität, so ist auch hier zu beobachten,

dass diese Intensität unter beiden Inkubationstemperaturen zu den Schlauchenden hin ab-

nimmt. Vergleicht man die Penetrationstiefen unter den beiden Inkubationsbedingungen ist

jedoch ein signifikanter Unterschied zu verzeichnen. Eine Erhöhung der Temperatur resultiert

in einer Erhöhung der zurückgelegten Penetrationsstrecke. Die Partikel penetrieren unter Er-

wärmung weiter. Bei 40 °C bis in Sektion 5, wohingegen die Penetration unter Raumtempera-

tur nur bis Sektion 3 detektierbar ist.


Abbildung 36: Vergleichende Darstellung des Penetrationsmusters Rhodamin B markierter Magnetit-PLGA-NP in Mukus

nach 30-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur (RT) und 40 °C. * signifikanter Unterschied zur Kontrolle (K), d. h. Pfer-

demukus ohne Partikel (p<0,05). ** signifikanter Unterschied in der jeweiligen Sektion unter RT und 40 °C (p< 0,05). Die

Intensität jeder Sektion wurde für jeden Versuch anhand von 20 Bildern gemessen, d. h. die gezeigte Intensität wurde bei vier

Experimenten anhand von 80 Bildern bestimmt (n = 4).

Damit konnte die zuvor gemachte Kernbeobachtung in nativem Mukus wiederholt und zu-

gleich die Ausgangshypothese für den angestrebten Ansatz verifiziert werden. Die

Penetrierbarkeit der Mukusbarriere lässt sich unter Wärmeeinfluss verbessern. Wie schon

zuvor bei dem Modellgel diskutiert, liegt die Vermutung nahe, dass diese bessere

Penetrierbarkeit auf eine durch die Erwärmung induzierte Viskositätserniedrigung zurückzu-

führen ist. Der Zusammenhang zwischen Viskosität und Partikelmobilität stellt nicht nur das

Leitmotiv des in dieser Arbeit verfolgten Ansatzes die Mukusbarriere zu überwinden dar. Es

gibt auch die Strategie die Viskosität von Mukus durch den Einsatz mukolytischer Enzyme zu

erniedrigen.[72, 73]

Für Papain modifizierte Nanopartikel konnte verglichen mit unmodifizier-

ten Kontrollpartikeln eine signifikant bessere Penetrierbarkeit dieser Barriere gezeigt werden.

Da eine Inkubation von Mukus mit dem entsprechenden Enzym in einer Viskositätserniedri-

gung resultierte, ist davon auszugehen, dass sich die verbesserte Penetration der modifizierten

NP auf deren viskositätserniedrigende Eigenschaft zurückführen lässt.[72]

Für die in dieser Arbeit zu beobachtende bessere Penetrierbarkeit von Mukus infolge einer

Erwärmung scheint demnach eine wärmeinduzierte Viskositätserniedrigung als Ursache sehr

plausibel. Eine Untersuchung hinsichtlich der Temperaturabhängigkeit der Viskosität von

Mukus könnte womöglich diese Annahme stützen. Derartige rheologische Untersuchungen

konnten bisher noch nicht erhoben werden. Information, wie Diffusionsdaten bzw. Scherdaten


des Gels, die aus mikro- und makrorheologische Untersuchungen erhalten werden haben für

die angedachte Applikation eine geringe Relevanz. Für eine erste Hypothesentestung, inwie-

weit die Mukusbarriere unter Wärmeeinfluss besser zu penetrieren ist, erschien das hier etab-

lierte Penetrationsexperiment die geradlinigste Vorgehensweise.

Gleichzeitig indiziert das Penetrationsexperiment, dass sich das Modellgel HEC und der Mu-

kus in ihren Barriereeigenschaften unterscheiden. Der zu beobachtende Trend im Hinblick auf

die Temperaturabhängigkeit der Partikelpenetration ist in beiden Geltypen gleich. Das HEC-

Gel scheint jedoch für die aufgegebenen Partikel eine weniger starke Barriere darzustellen als

nativer Mukus. Dies lässt sich anhand der von den Partikeln zurückgelegten unterschiedlichen

Penetrationsstrecke in beiden Geltypen schlussfolgern (vgl. Abbildung 35 und Abbildung 36).

Die Wahl des HEC-Gels, als gängiges Modellgel, in diesem Kontext stützt sich auf seine

chemische Ähnlichkeit zu den Muzinen, den Hauptkomponenten von Mukus sowie dem zu

Mukus ähnlichem mikrorheologischen Verhalten.[41, 42]

Im Hinblick auf die zu beobachtende

Diskrepanz der Penetration in HEC und Mukus gilt es den folgenden Erklärungsansatz zu

berücksichtigen: Mukus besteht nicht nur aus Muzinen sondern aus vielen weiteren Bestand-

teilen. Jede einzelne Komponente könnte die Partikelmobilität entsprechend beeinflussen.

Daher ist die zu beobachtende Diskrepanz nicht völlig unerwartet. Resümierend lässt sich an

dieser Stelle festhalten, dass sich das HEC-Gel trotz dieser Diskrepanzen grundsätzlich als

Modellgel für Mukus eignet. Die Partikelmobilität in Mukus scheint jedoch insgesamt stärker

und vermutlich von mehreren Faktoren beeinflusst zu werden. An dieser Stelle ist vor allem

auf die Heterogenität dieses Gels zu verweisen, insbesondere in Bezug auf die Maschenweite.

In elektronenmikroskopischen Untersuchungen konnte für Mukus im Vergleich zu HEC eine

sehr viel heterogenere Struktur nachgewiesen werden.[42]

Dies betrifft nicht nur die Porengrö-

ße und Verteilung, sondern bezieht sich auch auf die Beschaffenheit des Polymergerüsts.[42,

156]

Aufgrund der sehr heterogenen Maschenweite wird hinsichtlich der Penetrierbarkeit des Mu-

kus auch eine Filterung nach Partikelgröße diskutiert.[42, 81]

Diese Heterogenität stellt auch

einen Erklärungsansatz für den unerwarteten Anstieg des Intensitätswerts bei Sektion 4 dar. In

einem der mit Mukus befüllten Schlauchstücke könnten im Bereich der Sektion 4 sehr kleine

Poren vorliegen wodurch die Partikel aufgrund ihrer Größe z. T. immobilisiert wurden. Die

Partikelanzahl korreliert mit der Fluoreszenzintensität, wodurch sich die vergleichsweise ho-

hen Intensitätswerte erklären lassen.

Resümierend lässt sich festhalten, dass eine Gesamterwärmung die Penetrierbarkeit der Mu-

kusbarriere signifikant verbessert. Damit konnte der erste grundlegende Machbarkeitsnach-

weis für die angedachte neuartige Überwindungsstrategie der Mukusbarriere erbracht werden.

Inwieweit sich die bessere Penetrierbarkeit auf die hier postulierte wärmeinduzierte Viskosi-

tätserniedrigung des Mukus zurückführen lässt, kann anhand der hier erzielten Ergebnisse nur


spekuliert werden. Die indizierte temperaturabhängige Viskosität von Mukus gilt es anhand

rheologischer Messungen weiter zu untersuchen.

Das hier etablierte Set-up und die damit erzielten Ergebnisse stellten in der vorliegenden Ar-

beit die Basis für das weitere experimentelle Vorgehen dar. Der nächste logische Schritt in

diesem Kontext, stellte die Wiederholung der Penetrationsexperimente unter induktiven Heiz-

bedingungen dar.

3.3.3 Einfluss der Wärmeinduktion auf die Partikelmigration in HEC/ Mukus

Die Gültigkeit der gefundenen Relation zwischen Gesamterwärmung und Partikelpenetration

in HEC bzw. Mukus galt es im nächsten Schritt für die induktive Erwärmung zu überprüfen.

Zur Einflussuntersuchung der durch diese Art von Erwärmung postulierten induzierten loka-

len Erwärmung wurde das Penetrationsexperiment-Setup entsprechend adaptiert. Anstatt die

HEC bzw. Mukus befüllten Schlauchstücke bei 40 °C im Ganzen zu erwärmen, wurden sie in

den Induktor eingebracht und einer Heizleistung von 2,3 kW für 20 min ausgesetzt. Zunächst

wurde dies in einem Vorversuch anhand des 1%igen Mukusmodellgels HEC untersucht. Ent-

gegen der Erwartung war das resultierende Partikelpenetrationsmuster unter beiden Bedin-

gungen gleich. Die induktiv erwärmten Kompositpartikel zeigten, wie auch die nicht erwärm-

ten Partikel, eine detektierbare Penetration bis in Sektion 3. Der Versuch wurde anschließend

unter Verwendung von nativem Pferdemukus wiederholt. Das Ergebnis hierzu ist in Abbil-

dung 37 graphisch dargestellt. Daraus geht hervor, dass auch in Pferdemukus kein signifikan-

ter Unterschied hinsichtlich der Penetration der Partikel unter induktiven Heizbedingungen

(IH) und der Inkubation bei Raumtemperatur (RT) zu beobachten ist. Das erhaltene Penetrati-

onsmuster weicht dabei deutlich von dem charakteristisch stufenförmigen Muster ab, welches

bei den Penetrationsexperimenten erhalten wurde, in denen der Einfluss einer Gesamterwär-

mung untersucht wurde.

Das hier erhaltene Ergebnis legt die Vermutung nahe, dass die erzielte induktiv generierte

Wärme nicht ausreichend hoch war, um einen signifikanten Unterschied gegenüber dem Pe-

netrationsmuster der bei Raumtemperatur inkubierten Partikeln zu erhalten. Die Kompositpar-

tikel wurden, wie zuvor, in Form einer wässrigen Partikelsuspension auf die Mukusschicht

aufgegeben. Erwärmen sich die Partikel induktiv ist davon auszugehen, dass diese Wärme an

das umgebende Suspensionsmedium abgegeben wird. Dies gilt auch für die Partikel, die das

unterliegende Mukus-Gel infiltrieren. Bei dem Suspensionsmedium handelt es sich um Was-

ser, welches zugleich auch Hauptbestandteil von Mukus ist. Wasser hat mit 4,18 kJ/kgK eine

vergleichsweise große spezifische Wärmekapazität. Dies bedeutet, es ist vergleichsweise viel

Energie aufzuwenden, um eine entsprechende Temperaturdifferenz herbeizuführen. Penetrie-

ren die Partikel in den unterliegenden Mukus wird die generierte Wärme an das Hydrogel

abgeführt. Diese Wärme ist vermutlich jedoch nicht ausreichend, um das umliegende Gel

deutlich zu erwärmen. Dadurch wird die postulierte lokale Viskositätserniedrigung


möglicherweise nicht induziert. Zumindest konnte mit dem in dieser Arbeit etablierten Set-up

zur Untersuchung der Partikelmigration keine Penetrationsverbesserung infolge der indukti-

ven Erwärmung messtechnisch erfasst werden. Dies impliziert jedoch nicht zwangsläufig,

dass eine derartige Verbesserung der Partikelpenetration unter induktiven Heizbedingungen

nicht grundsätzlich möglich ist.

Es ist beispielsweise denkbar, dass die Sektionierung des Schlauchstücks mit einem Abstand

von 0,5 cm zu groß gewählt ist. Aufgrund zu groß gewählter Sektionen wäre ein prinzipiell

vorhandener, aber kleiner Unterschied im Penetrationsmuster gegenüber den nicht erwärmten

Partikeln unmöglich nachzuweisen. Ein Erklärungsansatz der in der vorliegenden Arbeit je-

doch nicht detaillierter untersucht wurde. Lediglich die prinzipielle Machbarkeit kleinerer

Schnitte wurde in diesem Zusammenhang gezeigt. Demnach könnte eine Verkleinerung der

Sektionen zur Untersuchung dieser Annahme mittels Kryotom oder virtuell am CLSM, durch

sogenannte Ebenenschnitte (z-stacks), vorgenommen werden. Ein weiterer Aspekt, den es

bezugnehmend auf das erhaltene Ergebnis zu berücksichtigen gilt, ist das Verhältnis der

Kompositpartikel und somit letztlich der Wärmegeneratoren an sich. Möglicherweise war die

zu Penetrationszwecken aufgegebene Menge an Wärmegeneratoren zu gering, um über deren

Erwärmung die Viskosität des umliegenden Mukus lokal zu erniedrigen. Es ist auch denkbar,

dass zur Herbeiführung der postulierten lokalen Viskositätserniedrigung eine kritische Menge

solcher Wärmegeneratoren pro Volumen zwingend vorhanden sein muss. Anders gesagt, eine

kollektive Erwärmung erforderlich ist. Zur Steigerung der Heizeffizienz ist entweder die auf-

gegebene Menge an Kompositpartikeln, die Menge der darin verkapselten Magnetit-NP oder

die Heizleistung zu erhöhen. Den prinzipiellen Konzentrationseinfluss der Wärmegeneratoren

auf die messtechnisch erfassbare Wärmegenerierung konnte im Rahmen dieser Arbeit bereits

gezeigt werden (vgl. Kapitel 3.2.2.1). Bezugnehmend darauf wurde ein Penetrationsexperi-

ment mit einer wesentlich höheren Konzentration an Kompositpartikeln angestrebt. Diese

Untersuchung erfolgte unter Verwendung von 1%igem HEC-Gel. Der verfolgte Ansatz schei-

terte jedoch, da die Partikel in dieser Konzentration direkt nach deren Aufgabe, womöglich

aufgrund von Agglomeration, sedimentierten. Das HEC-Gel stellte demnach keine Barriere

mehr dar. Eine Erhöhung der HEC-Konzentration (5% und 10%) wirkte dieser Sedimentation

zwar entgegen, eine via induktive Erwärmung induzierte Penetrationsverbesserung war auch

hier nicht zu beobachten. Zudem ist an dieser Stelle anzumerken, dass durch Erhöhung der

HEC-Konzentration das resultierende Gel kein gutes Mukus-Modellgel mehr ist. Ferner ist

davon auszugehen, dass durch die Konzentrationserhöhung die Maschenweite des Gels redu-

ziert wird. Ein derartiger Zusammenhang ist für eine Erhöhung der HEC-Konzentration von

0,5% auf 1% beschrieben.[42]

Dadurch wurden die Kompositpartikel womöglich auch auf-

grund ihrer Größe an einer Penetration gehindert.

Neben einer Erhöhung der Anzahl an Wärmegeneratoren in den Kompositpartikeln, stellt die

Erhöhung der Heizleistung eine weitere Option dar, die Heizeffizienz zu steigern. Der prinzi-

pielle Zusammenhang zwischen Heizleistung und Heizeffizienz der Kompositpartikel konnte


im Rahmen dieser Arbeit bereits dargelegt werden (siehe 3.2.3). Die Penetrationsexperimente

wurden mit der höchsten, in dieser Arbeit evaluierten Heizleistung von 2,3 kW durchgeführt.

Es sei an dieser Stelle angemerkt, dass unter einer anderen Frequenz oder Magnetfeldstärke

eine effizientere induktive Erwärmung der Kompositpartikel nicht auszuschließen ist. Dies

gilt es in weiterführenden Arbeiten entsprechend zu untersuchen.

Resümierend lässt sich an dieser Stelle festhalten, dass im Rahmen dieser Arbeit unter Nut-

zung des zuvor etablierten Setups keine Einflussnahme der induktiven Erwärmung auf das

Penetrationsmuster in HEC oder Mukus gezeigt werden konnte. Die zuvor unter Gesamter-

wärmung erhaltenen Ergebnisse ließen sich demnach unter induktiver Erwärmung nicht re-

produzieren. Als mögliche Ursache hierfür wurden verschiedene Faktoren angeführt, deren

Einfluss es diesbezüglich genauer zu untersuchen gilt. Hierunter fällt z. B. die Austestung

anderer Heizparameter, die Variation der aufgegeben Menge an Wärmegeneratoren oder die

Sektionierung des Schlauchstücks. Die Testung dieser Faktoren gilt es abzuwarten bevor eine

Einflussnahme der Partikelpenetration unter induktiven Heizbedingungen grundsätzlich aus-

geschlossen wird. Die zuvor in der Gesamterwärmung gezeigten Ergebnisse lassen aber auf

eine prinzipielle Machbarkeit schließen.

Abbildung 37: Vergleichende Darstellung der Penetrationsmuster Rhodamin B markierter Magnetit-PLGA-NP in Mukus

nach 20-minütiger induktiver Erwärmung (IH) bei 2,23 kW sowie unter Inkubation bei Raumtemperatur (RT). * signifikan-

ter Unterschied zur Kontrolle (K), d. h. Pferdemukus ohne Partikel (p<0,05). ** signifikanter Unterschied in der jeweiligen

Sektion unter RT und induktiven Heizbedingungen (p< 0,05). Die Intensität jeder Sektion wurde für jeden Versuch anhand

von 20 Bildern gemessen, d. h. die gezeigte Intensität wurde bei drei Experimenten anhand von 60 Bildern bestimmt (n = 3).

4 Zusammenfassung und Ausblick 81

4 Zusammenfassung und Ausblick

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit einem neuartigen pharmazeutisch-

technologischen Ansatz zur Überwindung der Mukusbarriere. Diese nicht-zelluläre Barriere

stellt eine äußerst wichtige und wirksame Schutzbarriere dar. Einerseits werden durch sie vie-

le, mit der Atemluft eindringende Krankheitserreger abgefangen, andererseits steht sie auf-

grund dieser Barriereeigenschaften einer effizienten pulmonalen Wirkstoffapplikation entge-

gen. Um die Effizienz der pulmonalen Applikation von Arzneistoffen zukünftig zu verbessern

ist eine effektive Umgehung dieser Barriere notwendig. Dieses Zielvorhaben war auch Ge-

genstand der vorliegenden Arbeit. Die zugrundliegende Idee bestand darin ein Wirkstoffträ-

gersystem zu entwickeln, welches über einen externen Stimulus in der Lage ist sich zu er-

wärmen. Darüber soll letztlich die Viskosität des umgebenden Mukus lokal erniedrigt und die

Barriere für das Trägersystem penetrierbar werden. Bei dem Stimulus handelt es sich um ein

extern angelegtes Wechselmagnetfeld. Unter Berücksichtigung dieser Aspekte sollte ein

nanoskaliges, stimulus-responsives Trägersystem auf Basis der beiden biokompatiblen und

biodegradierbaren Materialien PLGA und Magnetit entwickelt werden. Magnetit stellt bei

diesen Kompositpartikeln die auf den Stimulus reagierende Komponente dar.

Es wurde sich zur Herstellung des intendierten Trägersystems in der vorliegenden Arbeit auf

die Nanopräzipitation als Herstellungsmethode festgelegt. Im Zuge der Methodenentwicklung

und Optimierung konnte ein Protokoll etabliert werden, mit Hilfe dessen sich derartige mag-

netische Nanokomposite reproduzierbar herstellen lassen. Die erhaltenen Partikel besitzen

eine einheitliche, sphärische Partikelform und liegen eng verteilt mit einer Größe von ca.

200 nm vor. Die Magnetit-NP zeigen keine Agglomeration und sind in der PLGA-Matrix ein-

zeln und homogen inkorporiert. Die Magnetit-Beladung lässt sich über den im Rahmen der

Methodenevaluierung identifizierten Einflussfaktor, die eingesetzte Menge am Magnetit-NP,

gezielt variieren und damit an spezifische Anforderungen anpassen. Die in der vorliegenden

Arbeit als Standard festgelegte Einsatzmenge von 1 mg Magnetit-NP resultiert in den Kom-

positpartikeln in einer Magnetit-Beladung von ca. 2%. Diese Nanokomposite zeigen super-

paramagnetisches Verhalten, wobei die Sättigungsmagnetisierung erwartungsgemäß geringer

ist als die der unverkapselten Magnetit-NP. Demnach ist bei den hergestellten Nanokomposi-

ten nach Magnetfeldexposition keine Restmagnetisierung zu beobachten. Ein wichtiges Krite-

rium für den potentiellen in vivo Einsatz dieser Partikel, da durch das Ausbleiben der Rema-

nenz keine magnetisch induzierte Agglomeration zu erwarten ist. Bei Anlegung eines hoch-

frequenten Wechselmagnetfeldes zeigen die zuvor aufkonzentrierten Magnetit-beladenen

PLGA-NP eine deutliche Wärmegenerierung. Demnach wurde das erste Teilziel der vorlie-

genden Arbeit, die Entwicklung eines stimulus-responsiven Trägersystems auf Basis von

PLGA und Magnetit, erreicht. Das etablierte Protokoll lässt sich darüber hinaus auch zur

82 4 Zusammenfassung und Ausblick

Herstellung fluoreszierender Nanokomposite anwenden. Die Verwendung von Rhodamin B

markiertem PLGA resultiert in einem Trägersystem mit vergleichbaren Charakteristika hin-

sichtlich Größe, Morphologie, Magnetisierung und induktiver Erwärmbarkeit. Im Hinblick

auf die induktive Erwärmung des entwickelten Trägersystems ist eine vertiefende Evaluierung

der Heizparameter anzustreben. Möglicherweise erwärmen sich die Nanokomposite bei einer

anderen Feldstärke oder Frequenz wesentlich stärker. Ein weiterer zu untersuchender Aspekt

ist das Toxizitätsprofil der Kompositpartikel. Auch wenn beide Trägersystemkomponenten als

bioabbaubar und biokompatibel gelten, sind die Kompositpartikel im Hinblick auf eine medi-

zinisch-therapeutische Anwendung hinsichtlich in vitro und in vivo Toxizität zu untersuchen.

Aufgrund der vorgesehenen pulmonalen Applikation ist eine in vitro-Toxizitätstestung an in

der Lunge vorkommenden Zelltypen sicherlich der erste zu vollziehende Schritt.

Die Adaption des Protokolls zur Herstellung magnetischer, mit dem Wirkstoff Ciprofloxacin

co-beladener Kompositpartikel bedarf weiterer Optimierungsmaßnahmen. Ziel dieser Kobela-

dung war ein stimulus-responsives Trägersystem, welches in der Therapie Pseudomonas ae-

ruginosa verursachter chronischer Lungeninfektionen eingesetzt werden kann. Die Magnetit-

NP stellen auch hier die auf den Stimulus reagierende Systemkomponente dar. Bei Anlegen

eines Wechselmagnetfeldes erwärmen sich diese und es kommt, so die Idee, zur responsiven

Freisetzung von Ciprofloxacin. Eine an das Herstellungsprotokoll der Kompositpartikel ange-

lehnte Vorgehensweise, die u. a. ein Lösemittelwechsel von Aceton zu DMSO vorsieht, er-

möglicht die Inkorporation von Magnetit-NP und Ciprofloxacin in die PLGA-Matrix. Eine

gleichmäßige und homogene Kobeladung konnte nicht mehr erreicht werden. Ciprofloxacin

wird wesentlich effizienter inkorporiert als die Magnetit-NP. Zurückführen lässt sich dies

vermutlich auf eine gegenseitige Wechselwirkung beider Cargos. Möglicherweise tauscht sich

das Ciprofloxacin mit der an der Oberfläche der Magnetit-NP gebunden Ölsäure im Rahmen

des Herstellungsprozesses der Komposite aus. Dadurch sind die Magnetit-NP vergleichsweise

hydrophiler funktionalisiert und werden entsprechend schlechter in die hydrophobe Polymer-

matrix verkapselt. Gleichzeitig wird sich durch diesen Austauschprozess auch die Anzahl der

zur Einkapselung zur Verfügung stehenden Wirkstoffmoleküle reduzieren. Dies würde zu-

mindest die sinkende Beladung und Einkapselungseffizienz von Ciprofloxacin bei Erhöhung

der zur Herstellung eingesetzten Menge an Magnetit-NP erklären. Inwieweit dieser Erklä-

rungsansatz zutrifft ist durch entsprechende Untersuchungen abzuklären. Im Falle, dass sich

der angenommene Ligandenaustausch bewahrheitet, sollte bei einer zukünftig angestrebten

Kobeladung besser auf Wirkstoffe zurückgegriffen werden, bei denen ein solcher Austausch

aufgrund ihrer chemischen Struktur nicht möglich ist. Ferner bleibt abzuklären wie hoch die

Beladung mit Magnetit-NP zu wählen ist, um eine, für die intendierte responsive

Wirkstofffreisetzung, ausreichende Wärmegenerierung zu erzielen. In diesem Kontext ist

nochmals auf die bereits angeführte vertiefende Evaluierung der Heizparameter zu verweisen.


Ein weiterer wichtiger Aspekt dieser Arbeit stellt die Hypothese dar, dass eine Erwärmung

der Mukusbarriere die Penetration der Wirkstoffträger verbessert. Diese Erwärmung soll mit-

tels externem, magnetfeldbasiertem Stimulus erfolgen. Zur Einflussuntersuchung der Mukus-

penetrierbarkeit induktiv heizbarer Kompositpartikel galt es zunächst ein geeignetes Experi-

mentdesign und Set-up zu finden. Die Setup-Entwicklung erfolgte anhand des Mukus-

Modellgels HEC. Im Rahmen einer ersten Hypothesentestung wurde ein Penetrationsexperi-

ment aufgesetzt, das zunächst den generellen Einfluss von äußerlich applizierter Wärme auf

das Penetrationsverhalten der Nanokomposite im HEC-Gel untersucht. Hierzu wurden fluo-

reszierende Kompositpartikel auf ein mit Gel gefülltes Schlauchstück aufgebracht und bei

40 °C bzw. Raumtemperatur inkubiert. Zur Erhaltung des Penetrationsmusters wurden die

Schlauchstücke eingefroren, in Sektionen aufgeschnitten und anschließend hinsichtlich ihrer

Fluoreszenzintensität mittels CLSM untersucht. Unter Verwendung des etablierten Versuchs-

aufbaus zeigt sich, dass die Kompositpartikel bei höherer Temperatur eine weitere Penetrati-

onsstrecke zurücklegen als bei niedriger Temperatur. Die applizierte Wärme hat demnach

einen signifikanten Einfluss auf die Penetration der Kompositpartikel im HEC-Gel. Dieser

Zusammenhang ist auch unter Verwendung von nativem Mukus zu beobachten. Demnach

scheint sich eine Erwärmung positiv auf die Partikelpenetration auszuwirken. Es liegt nahe,

dass dies auf die postulierte Viskositätserniedrigung zurückzuführen ist. Diese Schlussfolge-

rung gilt es jedoch experimentell zu beweisen. Rheologische Untersuchungen könnten mögli-

cherweise darüber Aufschluss geben, inwieweit sich die Viskosität von Mukus in Abhängig-

keit der Temperatur ändert. Im Falle einer Korrelation würde dies, die dem verfolgten Ansatz

zugrundeliegende Hypothese stützen. Daher sind derartige rheologische Daten unbedingt zu

erheben. Zumal der unter extern applizierter Wärme gefundene Zusammenhang bei der induk-

tiven Erwärmung nicht gezeigt werden kann. Eine induktive Erwärmung der Kompositparti-

kel führt mit dem derzeitigen Set-up nicht zu einer Penetrationsverbesserung. Zumindest lässt

sich eine mögliche Penetrationsverbesserung mit dem aktuellen Versuchsaufbau weder in

HEC noch in Mukus detektieren. Es ist davon auszugehen, dass die Temperatur des im

Schlauch befindlichen HEC bzw. Mukus bei der induktiven Erwärmung der Partikel wesent-

lich geringer ist, als bei der äußerlich applizierten Gesamterwärmung. Der verfolgte Ansatz

zur Überwindung der Mukusbarriere zielt auf eine lokale Erwärmung und keine Gesamter-

wärmung ab. Es ist jedoch nicht bekannt, um wie viel Grad sich ein Kompositpartikel erwär-

men muss, um den ihn umgebenden Mukus lokal zu erwärmen. Die von den inkorporierten

Magnetit-NP generierte Wärme wird an die Umgebung abgegeben, die im Fall von Mukus

größtenteils aus Wasser besteht. Demnach ist vergleichsweise viel Energie aufzuwenden, um

eine entsprechende Temperaturdifferenz und damit korrelierend die postulierte Viskositätsän-

derung herbeizuführen. Möglicherweise ist die Wärmegenerierung der aufgegebenen Partikel

zu gering. Eine Steigerung dieser Wärmegenerierung ließe sich beispielsweise über eine hö-

here Anzahl an Wärmegeneratoren pro Volumen, d. h. Kompositpartikel bzw. darin inkorpo-

riert vorliegenden Magnetit-NP, erzielen. Die Verwendung einer anderen Frequenz oder

84 4 Zusammenfassung und Ausblick

Magnetfeldstärke wäre diesbezüglich eine weitere Option und macht zugleich deutlich, dass

eine ausgedehnte Testung der Heizparameter ein interessanter anzugehender Aspekt ist. Zu-

dem besteht grundsätzlich die Möglichkeit, die für den Stimulus verantwortliche Komponente

gegen eine auf den Stimulus stärker reagierende Komponente auszutauschen. Dabei sollten

jedoch die von den Magnetit-NP bestens erfüllten Prämissen Biokompatibilität und Biodegra-

dierbarkeit bewahrt werden.

Neben einer unzureichenden Wärmegenerierung stellt die Nicht-Detektierbarkeit der potenti-

ell induktiv induzierten Penetrationsverbesserung ein weiterer Erklärungsansatz dar. Die Sek-

tionierung des Schlauchstücks könnte für die induktiv erwärmten Kompositpartikel zu groß

gewählt sein. Sie wurde aus den vorangegangenen Penetrationsexperimenten unter Gesamt-

erwärmung übernommen. Unter der Annahme, dass die induktive Erwärmung der Komposit-

partikel in einer lokalen Viskositätserniedrigung resultiert, ist die zurückgelegte Penetrations-

strecke möglichweise kürzer, als bei Partikeln die in einem ohnehin erwärmten und somit

viskositätserniedrigten Gel penetrieren. Damit wäre bei einer zu groß gewählten Sektion kein

Intensitätsunterschied zur nicht geheizten Kontrolle nachweisbar. Kleinere Schnitte könnten

durch die Verwendung eines Kryotoms realisiert werden. Damit kommen mehrere Faktoren in

Betracht, die es näher zu untersuchen gilt, bevor eine Einflussnahme der Partikelpenetration

unter induktiven Heizbedingungen grundsätzlich auszuschließen ist. Sofern durch die lokale

Temperaturerhöhung keine Partikelimmobilisation induziert wird, sollte sich der Effekt, der

sich bei der Gesamterwärmung des Mukus hinsichtlich des Penetrationsverhaltens abzeichnet,

theoretisch auch unter induktiven Heizbedingungen erzielen lassen.

Zusammenfassend kann man festhalten: Es wurde im Rahmen der Arbeit ein eindeutiger Zu-

sammenhang zwischen der Erwärmung von Mukus und dem Penetrationsverhalten der entwi-

ckelten Kompositpartikel gezeigt. Dies ist als ein erster prinzipieller Machbarkeitsnachweis

für den hier angedachten, neuartigen Überwindungsansatz der Mukusbarriere zu werten. Das

Ziel zukünftiger Arbeiten besteht darin, die durch Erwärmung induzierte und postulierte Vis-

kositätserniedrigung experimentell zu beweisen. Darüber hinaus ist das Versuchsdesign des

Penetrationsexperiments dahingehend zu optimieren, dass sich die bei der Gesamterwärmung

gefundene Korrelation zwischen Partikelpenetration und Erwärmung auf die eigentlich inten-

dierte induktive Erwärmung der Kompositpartikel übertragen lässt. Im Zuge dessen sind die

angesprochenen potentiellen Einflussfaktoren näher zu untersuchen. Das entwickelte Träger-

system erfüllt prinzipiell die für den Überwindungsansatz gestellten Anforderungen. Es zeigt

superparamagnetisches Verhalten und lässt sich induktiv erwärmen. Der erzielbare Wärmeef-

fekt ließe sich sicherlich über diverse Stellschrauben weiter optimieren. Gleiches gilt für eine

Kobeladung mit Wirkstoff. Ein weiterer, sicherlich interessanter und anzugehender Aspekt ist

die Fragestellung nach der Temperatur an der Partikeloberfläche beim induktiven Heizen.

Sofern sich die Mukusbarriere über eine induktive Erwärmung des Trägersystems überwinden

lässt, ist die Kenntnis der Oberflächentemperatur an den Partikeln ein entscheidender Faktor.

Ist diese Temperatur zu hoch oder lässt sich im Rahmen der Penetration nicht rechtzeitig


reduzieren, ist von einer Schädigung des dem Mukus unterliegenden Epithels auszugehen.

Daher ist dieser Fragestellung eine große Bedeutung beizumessen. In weiteren Entwicklungs-

schritten ist zudem das hier entwickelte nanoskalige Trägersystem für die pulmonale Applika-

tion in eine mikropartikuläre Form zu überführen. Dies könnte beispielsweise über die Sprüh-

trocknung erreicht werden. Fazit: Die in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse sind richtungswei-

send für weitere Optimierungsmaßnahmen, um letztlich die Entwicklung und Beforschung

eines neuartigen und vielversprechenden Ansatzes zu Überwindung der Mukusbarriere voran-

zutreiben. Damit leistet die vorliegende Arbeit einen wichtigen Beitrag, um die Effizienz der

pulmonalen Wirkstoffapplikation zukünftig weiter zu steigern.

Literaturverzeichnis 87

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Mater Sci Eng C Mater Biol Appl., 2016. 68: S. 18-29.

152. Riedinger, A., Guardia, P., Curcio, A., Garcia, M.A., Cingolani, R., Manna, L., and

Pellegrino, T., Subnanometer local temperature probing and remotely controlled drug

release based on azo-functionalized iron oxide nanoparticles. Nano Lett, 2013. 13(6):

S. 2399-2406.

153. Dias, J.T., Moros, M., Del Pino, P., Rivera, S., Grazu, V., and de la Fuente, J.M., DNA

as a molecular local thermal probe for the analysis of magnetic hyperthermia.

Angewandte Chemie- Internationale Edition, 2013. 52(44): S. 11526-11529.

154. Polo-Corrales, L. and Rinaldi, C., Monitoring iron oxide nanoparticle surface

temperature in an alternating magnetic field using thermoresponsive fluorescent

polymers. Journal of Applied Physics, 2012. 111(7): S. 334.

155. Bouchemal, K., Aka-Any-Grah, A., Dereuddre-Bosquet, N., Martin, L., Lievin-Le-

Moal, V., Le Grand, R., Nicolas, V., Gibellini, D., Lembo, D., Pous, C., Koffi, A., and

Ponchel, G., Thermosensitive and mucoadhesive pluronic-

hydroxypropylmethylcellulose hydrogel containing the mini-CD4 M48U1 is a

promising efficient barrier against HIV diffusion through macaque cervicovaginal

mucus. Antimicrob Agents Chemother, 2015. 59(4): S. 2215-2222.

156. Lai, S.K., Wang, Y.Y., Hida, K., Cone, R., and Hanes, J., Nanoparticles reveal that

human cervicovaginal mucus is riddled with pores larger than viruses. Proc Natl Acad

Sci U S A, 2010. 107(2): S. 598-603.

98 Publikationen und Tagungsbeiträge

Publikationen und Tagungsbeiträge

Publikationen:

Shi, C.*, Thum, C.*, Zhang, Q., Tu, W., Pelaz, B., Parak, W. J., Zhang, Y., Schneider, M.,

Inhibition of the cancer-associated TASK 3 channels by magnetically induced thermal release

of Tetrandrine from a polymeric drug carrier. Journal of Controlled Release, 2016. 237: S.

50-60.

Rietscher, R.*, Thum, C.*, Lehr, C.-M., Schneider, M., Semi-automated nanoprecipitation-

system – an option for operator independent, scalable and size adjustable nanoparticle syn-

thesis. Pharmaceutical Research, 2015. 32 (6): S. 1859-1863.

*gleichwertige Erstautoren

Tagungsbeiträge, Vorträge:

Thum, C., Schneider, M., Novel approach and first attempt to overcome mucus barrier

by using heat, CRS German Chapter Meeting, Marburg, Deutschland, 2017.

Thum, C., Schneider M., Magnetite loaded PLGA NPs as a powerful combination for

Drug Delivery purposes, GPEN Meeting, Lawrence, Kansas, USA, 2016.

Tagungsbeiträge, Poster:

Thum, C., Schneider, M., Composite system to overcome the mucus barrier – magnetite-

loaded PLGA carriers, DPhG-Doktoranden-/ Postdocstagung 2017, Frankfurt am Main,

Deutschland, 2017.

Thum, C., Shi, C., Zhang, Q., Tu, W., Pelaz, B., Parak, W. J., Zhang, Y., Schneider, M.,

Tetrandrine carrying magnetic PLGA NPs: basis for a novel approach to inhibit a can-

cer-associated TASK3 channel by a heat triggered Tet release, BioBarriers 2016,

Saarbrücken, Deutschland, 2016.

Thum, C., Shi, C., Zhang, Q., Tu, W., Pelaz, B., Parak, W. J., Zhang, Y., Schneider, M.,

Tetrandrine loaded magnetic PLGA NPs: a promising tool for a novel approach to the

treatment of various cancer types, associated with an overexpression of the TASK 3 chan-

nel, Doktorandentag der Naturwissenschaftlich-Technischen Fakultät, Universität des

Saarlandes, Saarbrücken, Deutschland, 2016.

Thum, C., Schneider, M., Magnetite loaded PLGA-NPs – a combo with unique properties

for Drug Delivery, CRS German Chapter Meeting, Muttenz, Schweiz, 2015.

Publikationen und Tagungsbeiträge 99

Thum, C., Schneider, M., Magnetite meets PLGA: a Nanoparticle System with unique

properties for Drug Delivery purposes, Size Matters 2015, Saarbrücken, Deutschland,

2015.

Thum, C., Rietscher, R., Lehr, C.-M., Schneider, M., Semi-automated nanoprecipitation

system for the formulation of protein loaded PLGA Nanoparticles, PBP World Meeting,

Lissabon, Portugal, 2014.

mukusinteraktion von magnetit beladenen kolloidalen ... · for this, it was possible to develop a...

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