IDENTIFIKASI ESTERIFIKASI RETINOL OLEH M~CROSOM DARIMUKOSA USUS HALUS AYAM DENGAN MENGGUNAKAN [ H] RETINOL

Retno Murwani*

ABSTRAK

IDENTlrlKASI DAN KARAXTERISASI ESTERlrlKASI RETINOL OLKH MICROSOKK DARI MUCOSA3

USUS BALUS AYAM BERRASIL DILAKUKAN DENGAN MKNGGUNAKAN [ H] RETIONAL. Inkubasi micro-

some dengan [3H] retinol dan palmitoyl CoA memberikan radioaktif [3H] 'retinyl pal.i­

tat yang dapat dideteksi pada kromatografi cairan tekanan tinggi (HPLC). Esterifika­

si meningkat selama 15 menit dan pada temperatur antara 370C - 450C. Pembentukan3 .[ H] retinyl palmitat meningkat dengan konsentrasi protein microsome sampai 240 us

dan konsentrasi palmitoyl-CoA sampai 30 uM.pH optimal esterifikasi yaitu 6,6.3

Konsentrasi serum albumin (DSA) sedikit mempensaruhi pembentukan [H] retinyl

palmitat.

ABSTRACT

IDENTIrICATION AND CHARACTERS OF RETINOL ESTERIFICATION BY MICROSOHE OF CHICK

INTESTINAL MUCOSA WAS DEMONSTRATED IN THIS EXPERIMENT. Incubation of microsome with

[3H] retinol and palmitoyl CoA as substrate produced [3H] retinyl palmitat corres­

ponding to that of authentic retinyl palmitate indentified on (HPLC). No esterifica­

tion occured without palmitoyl CoA and microsome, and heat-inactivated microsome.

Esterification increased for 15 minutes at temperatur 370C - 450C. [3H] retinyl

palmitate formation was enhanced with microsomal protein concentration up to 240 us3

and palmotoyl CoA concentration up to 30 uM. Optimal pH was reached at 6.6. [ H]

retinyl palmitate formation was slightly dependent on bovine serum albumin (DSA).

PENDAHULUAN

Beta-carotene telah lama dikenal sebagai sumber vitamin A alami

yang paling potensil di antara carotenoid (1). Beta-carotene ini

diubah menjadi vitamin A terutama di dalam mukosa usus halus.

* Fakultas peternakan, Universitas Diponosoro

797

Retinal hasil pemecahan beta-carotene direduksi lebih lanjut menJadi

re~inol \2}. Retinol kemudian diesterifikasi kembali dalam sel

mukosa dengan asam lemak terutama asam lemak jenuh berantai panjang

sebelum diserap ke dalam tubuh dalam bentuk chylomicron (3). Esteri­

fikasi retinol ini telah diteliti dan dikarakterisir pada beberapa

jenis mamalia (4, 5, 6), ditemukan dalam fraksi microsome dan be­

reaksi terutama dengan asam palmi tat (7). Dalam penelitiannya SKLAN

(8) berhasi I menunjukkan adanya akti vitas pemecahan beta-carotene

dalam mukosa ayam. Demikian pula telah diteliti bahwa peningkatan

pemberian vitamin A dalam ransum hewan percobaan dapat meningkatkan

kandungan retinol hati. Selain itu peningkatan konsumsi beta-caro­

tenepun ternyata meningkatkan simpanan vitamin A dalam hati. Namun,

masih menjadi pertanyaan apakah esterifikasi retinol yang dihasilkan

dari pemecahan beta-carotene juga dipengaruhi oleh peningkatan

konsumsi beta-carotene tersebut. Untuk mengetahui hal inilah maka

diperlukan indentifikasi adanya aktivitas esterifikasi dalam mukosa

usus ayam. Demikian pula diperlukan karakterisasinya untuk memper­

oleh kondisi optimal bagi penelitian selanjutnya.

BAliAN DAN METODA

Bahan Kimia. [15-3HJ all trans retinol dengan aktivitas spesifik

23.5 Ciimmol. Stok [3HJ retinol ini diambil seperlunya dan diencer­

kan dengan etanol sehingga diperoleh kurang lebih 50.000 cpm serta

diperiksa distribusi radioaktivitasnya dengan HPLC (lihat HPLC dan

Gambar 1). Adanya radioakti vitas di seki tar daerah elusi standar

retinyl palmi tat yang dapat mengganggu uj i akti vitas esteri fikasi

(1ihat uj i ARAT) memerlukan pemurnian terhadap stok [3HJ retinol.

Hasil pemurnian dengan HPLC diuapkan, dilarutkan kembali dalam

etanol dan diperikasa ulang distritNJsi radioaktivitasnya (Gambar

IB). Stok [3UJ retinol yang telah dimurnikan disimpan pada suhu

-80oC.

Kristal

kemurniannya

si masksimum

nya. Kristal

suhu -BOoC.

retinol (Serva Feinbiochima, Heidelberg,NY) deteksi

dengan Shimadzu UV Spektrofotometer berdasarkan adsorp­

pada panjang gelombang 325 nm dan dihitung konsentrasi­

retinol ini dilarutkan dalam elanol dan disimpan pada

798

Industry)

Chem. Co. )

Retinyl palmi tat dan DPPD (Wako Pure Chemical

dilarutkan dalam etanol. BSA dan palmitoyl-CoA (Sigma

dilarutkan dalam bufer kalium fosfat pH 7,4.

Bahan-bahan kimia lain yang digunakan memiliki kemurnian

komersial tinggi (99.5%).

Percobaan Pada Hewan. Ayam leghorn putih umur satu hari diberi

ransum bebas vitamin A ad libitum selama satu minggu. Kemudian di­

beri ransum dengan tambahan beta-carotene sebesar ZO.OOO ug/kg diet

selama sepuluh hari. Setelah ayam dibunuh, ususnya diambil dan

dicuci dengan larutan NaCI dingin.

Persiapan Mukosa Usus. Usus dicuci dengan larutan NaCI dingin

untuk membersihkan sisa kotoran dan sisa-sisa makanan. Usus dibuka

dan lapisan mukosa dipisahkan dengan pengaduk. Lapisan mukosa ini

dibekukan langsung dalam nitrogen cair dan disimpan beku bila tidak

langsung dipakai.

Persiapan Microso.e. Mukosa beku dihomogenisasi dengan tiga

volume bufer Tris-HCl pH 7,5 yang mengandung 0,25 M Sucrose, 5mM

MgS04, dan Z5 mM KCl. Homogenat disentrifus dengan kecepatan ZO,OOO

g selama 15 menit pada suhu ZOC. Supernatan diambil dan dipindahkan

ke tabung lain, sedangkan pelet dihomogenisasi dan disentrifus

sekali lagi. Kedua supernatan dicampur dan disentrifus dengan kece­

pat an 105,000 g selama satu jam pada suhu ZOC. Supernatan dibuang,

pelet disuspensikan dalam tiga volume bufer kalium fosfat pH 7,4 dan

disentrifus dengan kecepatan 105,000 g selama satu jam pada suhu

ZOC. Pelet dilarutkan kembali dala bufer yang sama.

Uji Aktivitas Acyl CoA: retinol Acyl Transferasi (ARAT). Uj iaktivitas ARAT didasarkan pada terbentunya radioaktif retinyl pal­

mitat dari[3H] retinol dan palmitoyl-CoA (4). Substrat terdiri dari

[3H] retinol (55.000 cpm) dan 10 nmol retinol. Substrat ditambah

DPPD (0,8 ug) dan diuapkan di bawah aliran gas NZ' Selanjutnya 1.25mg BSA bebas asam-asam lemak dan kalium fosfat bufer pH 7,4 di­

tambahkan sehingga tercapai volume 480 ul. Protein microsome (70 ug)

ditambahkan dan diirikubasi selama 5 menit pada suhu 370C. Reaksi

dimulai dengan penambahan 10 ul palmitoyl-CoA 15 nmol) dengan suhu

inkubasi 370 selama 15 menit. Reaksi dihentikan dengan penambahan 2

ml etanol dingin dan lemak diekstrak dengan 2 x 3ml heksan. Empat ml

hasil ekstraksi heksan diuapkan di bawah aliran nitrogen dan residu-

799

nya dilarutkan dalam 200 ul etanol. 180 ul larutan ini diinjeksikan

ke HPLC dan difraksinasi setiap 30 detik. Fraksi retinyl palmitate

diambil dan ditambah larutan scintilasi dan dicacah radioaktivitas­

nya dengan alat "Liquid Scintilation Counter". Hasil yang diperoleh

merupakan persentase [3H]retinyl palmi tat yang terbentuk selama

inkubasi. "Recovery" radioakti vi tas setelah penguj ian >80%.

HPLC High Pressure Liquid Chromatography. Sampel diinjeksikan

melalui "Rheodyne Injector" (1000 ul loop) dan dipisahkan komponen­

komponennya pada kolom Licrosorb ODS 5 uM (4,6 x 250 cm). Sampel

dibawa keluar melalui kolom dengan larutan 100% metanol berkecepatan

alir 2 ml/menit dan tekanan 1500 psi. Larutan dipompa dengan bantuan

pompa Waters Model 510. Sampel dideteksi dengan detektor Hitachi

650-10 Liq.Chrom.Flourescence Spectrophotometer dan direkam pada

rekorder Hitachi Model 461-4203.

HASIL'DAN PEMBAHASAN

Distribusi Radioaktivitas [3Hlretinol. Distribusi radioaktivitas

stok (3H)retinol terlihat pada Gambar 1. Dengan pelarut metanol

kurang lebih 2% radioaktif terdeteksi pada retinyl pelmitat setelah'

9 - 11 menit. Radioaktif "asing" ini terpisah 30 detik dari retinyl

palmitat. Namun, bila pelarut yang dipakai adalahg etanol, radiok­

tif tersebut terdeteksi tepat di daerah elusi retinyl palmi tat.

Meskipun dengan pelarut etanol waktu fraksinasi menjadi lebih pendek

namun radioaktif asing tersebut dapat mengakibatkan salah pendugaan

sebagai [3H)retinYI palmi tat hasil inkubasi uji aktivitas ARAT.

Demikian pula dengan pelarut metanol, meskipun radioaktif asing

tersebut terpisah selama 30 detik namun dengan semakin lamanya pe­

nyimpanan radioaktif tersebut melebar dan menganggu hasil uji ARAT.

Untuk menjamin ketelitian percohaan, stok [3H)retinol dimurnikan dan

hasil pemurniannya terlihat pada Gambar 2.

Setelah pemurnian, radioaktif hanya muncul pada daerah elusi

standar retinol, sedangkan daerah retinyl palmitat hanya memberikan

radioaktif seki tar 20-50 dpm yang merupakan pack ground count saja

Stok yang telah dimurnikan ini dipakai untuk penelitian selanjutnya

dan secara periodik diperiksa kemurniannya.

800

~o

:10.- ~~~.-:.:-:E

20

c...Q

10

:I2

o1 2 3 ~ 5 6 1 6 II 10 11 12 13

Time(minute)

Gambar 1. Distribusi radioakti stok [3H] retinol. c==r,menunjukan kuantitas radioaktif, -,menunjukan stan­dar retinol (1,5 - 3 menit) dan retinyl palmitat(7 -9 men it) .

Identifik8si Esterifik8si {3Hlretinol yang Dik8t81is ARAT. Untuk

mengidentifikasikan bahwa pembentukan [3H]retinYl palmitat adalah

hasil esterifikasi dari subtrat [3H]retinol dan palmitoyl-CoA yang

dikatalis oleh enzim yang terdapat dalam microsome, maka berbagai

pengaruh hadirnya komponen-komponen inkubasi dicobakan (Tabel 1).

Hasil ekstraksi heksan dari inkubasi dengan [3H]retinol saja (Perco­

baan 1), tanpa palmitoyl-CoA (Percobaan 3), tanpa sumber enzim (Per­

cobaan 5), dan dengan microsome yang telah di tidak-aktifkan (Per­

cobaan 6) menghasilkan [3H]retinyl palmi tat dengan radioakti vitas

yang kurang lebih sama dengan background yang diperoleh pad a hasil

pemurnian stok [3H]retinol (Gambar 2). Dengan komponen inkubasi yang

lengkap (Percobaan 2) terbentuk [3H] retinyl palmitat sebesar 1553

DPM. Hasil ini menunjukan bahwa esterifikasi retinol hanya terjadi

apabila microsome sebagai sumber enzim yang mengkatalis reaksi ter-

801

sebut tersedia bersama-sama dengan subtrat [3H] retinol dan palmi­

toyl-CoA.

60

40,,-...,

QQc:a-X'-"' 20 .-:E a..Q

5 r" -

:U1l1- ~o 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

lime (minute)

Gambar 2. Distribusi radioaktif stok c3r:r) re- .tinol setelah pernumian denganHPLC.D,rnemmjukkan kuanti tasradi oakti f

Gambar 3 memperlihatkan distribusi radioaktif hasil ekstraksi dengan

heksan yang kemudian diinjeksikan ke HPLC. lnkubasi lengkap denganmicrosome menunjukan ada radioakti vi tas pada fraksi retinol dan

retinyl palmitat, sedangkan inkubasi lengkap dengan microsome yangtelah dipanaskan hanya menunjukkan radioakti vi tas di daerah elusi

retinol saja. Hasil ini menegaskan bahwa produk radioaktif yang

802

Tabel 1. P3ngaruh komponen inkubasi terhadp pembentukan[ H]retinyl palmi tat

Komponenlnkubasi 1 2

Percobaan

3 4 5 6-------------------------------------------------------------------

[3H]retinol + + + + + +retinol + + + + + +DPPD + + + + + +BSA + + + + + +

Palmitoyl-CoA + + + + + +Microsome + + + + + +

)[3H]retinylPalmitat (DPM)

82 1533 71 661 59 63

* Microsome dipanaskan pada suhu 800C selama 30 menit.

terelusi bersama standar retinyl-palmitat adlah [3H]retinyl-palmitat

yang berasal dari radioaktif retinol [15-3H] dan palmitoyl-CoA. Hal

ini tidak terjadi bila palmitoyl-CoA digantikan oleh asam palmitat

(9). Pene lit ian HELGERUD et al. (4) dan HELGERUD et al. (5) dengan

menggunakan substrat berlabel [1-14C]palmitat membuktikan pula bahwa

radioaktivitas yang ditemukan dari hasil ekstraksi lemak tidak hanya

terdapat pada fraksi retinol saja, tetapi juga di daerah fraksi

retinyl palmitat.

lnkubasi tanpa BSA menghasilkan radiokatif retinyl palmi tat

sebesar 43% dari hasil inkubasi lengkap (percobaan 4). Hal ini me­

nunjukan bahwa BSA diperlukan dalam sistim inkubasi di sini. BSA

diduga memiliki struktur yang meyerupai cRBP (cellur Retinol Binding

Protein) yang ditemukan dalam sel-sel usus halus dan hati (10,11,12)

BSA mampu mengikat retinol sehingga memungkinkan retinol lebih

mudah mengalami esterifikasi daripada dalam bentuk bebas terlarut

dalam larutan organik (9).

BiEat-siEat EsteriEikasi Retinol Jari Microsome Usu Ayam. Untuk

memperoleh kondisi optimal bagi aktivitas esterifikasi retinol, maka

diteliti berbagai pengaruh kondisi inkubasi terhadap pembentukan

[3H]retinYl palmitat. Gambar 4 menunjukan bahwa pembentukan retinyl

palmi tat naik perlahan selama awal 5 menit inkubasi dan naik hampir

803

-g 10oor-

X-~C-o 4

2

O'.~N'"""--- r~ ....5 10

Time (minute)

10-~

-000or-x 5-~c..0

o 5Time (minute)

10

Ganbar 3. Pembentukan (7+1)retinyl palmi tat oleh microsom ususayam. A, Inkubasi lengkap dengan microsom; B, Inku­basi dengan microsom yang telah dip anask an ; (J, me­mmjukkan standar retinol (1~5 - 3 menit) dan retinylpalmi tat (r - 9 menit). Kondisi dan prosedur inkubasiseperti tersebut dalam materi clan meto de

liner dari 5 sampai 15 menit inkubasi. lnkubasi lebih lama dari 15

menit hanya memberikan sedikit kenaikan terhadap pembentukan [3H]re­

tinyl pelmi tat (panel A). Esterifikasi naik secara linier dengan

konsentrasi protein microsome sampai 240 ug per inkubasi (panel B)

dan mencapai maksimum pada konsentrasi palmitoyl-CoA 60 uM (panel

C). Est~rifikasi retinol mencapai maksimal pada pH 6,6 dan meningkat

antara temperatur 37°C sampai 45°C. Tanpa BSA t~rbentuk [3H]retinYl

palmi tat sekitar 45% dari kondisi optimal yang dicapai dengan mg/mlBSA.

KESIMPULAN

Dari keseluruhan hasil di atas dapat disimpulkan bahwa identifi­

kasi pembentukan [3H]retinYl palmitat dari inkubasi [3H]retinol clan

804

palmitoyl-CoA beserta microsom dapat dideteksi dengan bantuan HPLC.

Aktivitas esterifikasi retinol pada mucosa usus ayam ini dikatalisis

oleh Acyl-CoA:retinol acyl traferase yang terdapat dalam microsome.

Kondisi optimal ARAT ini dapat dikarakterisir dan dapat digunakan

untukmenentukan aktivitas terhadap berbagai perlakuan percobaan.

UCAPAN TERIMKASIH

Terimaksih yang sebesar-besarnya kepada Prof. Soichi Masushige

atas segal a bimbingannya selama penulis melaksanakan penelitiannya

kepada Dr. Kato atas saran dan kritiknya; kepada Mr. Furusho atas

saran dan bantuan teknis yang diberikan; serta Mr. Ota yang telah

memberi ijin untuk menggunakan fasili tas di Pusat Radioisotop Tokyo

University of Agriculture yang dipimpinnya.

DAFTAR PUSTAKA

1. BAURENFEIND, J.C., Carotenoid vitamin A precursors and analog infoods and feeds, J. Agric. Food Chem. 20-3 (1972) 456.

2. OLSON, J.A., The conversion of radioactive B-carotene into

vitamin A by the rat intestine in vivo, J. Biol. Chem. 236­2 (1961) 349.

3. GOODMAN, D.S., Vitamin A metabolism, Federation Proc. 39 (1980)2716.

4. HEGERUD, P, PETERSON, L.B., and NORUM, K.R., Acyl CoA:retinol

aclyltransferase in rat small intestine: its activity and someproperties of the enzymic reaction, J.Lipid Res 23 (1982) 609.

5. HEGERUD, P, PETERSON, L.B., and NORUM, .K.R., Retinol esteri­fication by microsome from the mucosa of human small

intestine;evidence for acyi-coenzyme A retinol acyl transferaseactivity, J. Clin. Invest. 71 (1982) 747.

6. MAC DONALD, P.N., and ONG, D.E., Evidence for a lecithin­

retinol acyltransferase activity in the rat small intestine,J.Biol Chem. 263-25 (1988) 12478.

805

7. FUTTERMAN, S., and ANDREWS, J.S. The composition of livervitamin A ester and the synthesis of vitamin A ester by liver

microsome, J. BioI. Chem. 239-12(1964)4077

8. SKLAN, D., Carotene-cleavage activity in chick intestinal mucosa

cytosol:association with a high-moleculer-weight lipid-protein

aggregate fraction and partial characterization of the activi­ty, British J. Nutr. 50 (1983)417

9. ROSS, A.C., Retinol esterification by rat liver microsome;evidence for a fatty acyl coenzyme A: retinol acytransferese.

J.Biol Chern. 257-5 (1982) 2453.

10. ONG, D.E., KAKKAD, B, and MAC DONALD, P.N., . Acyl-CoA-Inde­

pendent esterification of retinol bound to cellular

retinol-binding protein (type II) by microsome from rat smallintestine, J.Biol.Chem 6(1987)2729

11. OGN, D.E., MAC DONALD, P.N., and GIBITOSI, A.M., Esterification

of retinol in rat liver; Possible participication by cellular

'retinol-binding protein and cellular retinol-binding proteinIL, J. BioI. Chern. 263-12 (1988) 5789.

12. YOST, R.W., HARRISON, E.H., and ROSS, A.C., Esterification byrat liver microsome os retinol bound to cellular retinol­

binding protein, J. Biol.Chem 5(1989) 18693

806

20 C3-oo 2o,....

x-~a...o

o

A

5 is 25 35

Time (minute)

10- B0 00,....xc-'"

~C-O

o 60 120 240

Microsomal Protein f,ug}

-0._01::1,....

X-10~C-­0;)

o30 60 120

Palmitoyl-CoA CuM)

00o-J

5D

f(E

2F-0.4

000 0o ':

,....,.... ..

ft~1X ;2

~c-C- O2

°01

aLl.,,. 0

10[) 37!;J50 2.55

261:1j!;

pH

Temperature r~C)Bovine Serum Albumin(mg/ml)

Gani>ar4. Pengaruh-penganil waktu (A); konsentrasi protein rnicrosorre(B); konsentrasi palrnitoyl-CoA(C); pH(D); suhu(EJ; clan. BSA(F). Setiap titik ada­lah nilai rata-rata hasil percobaan secara duplo yang telah dikoreksidengan kontrol dari inkti:>asi tanpa rnicrosorre atau rengan rnicrosorreyang telah dipanaskan