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MSの基礎1MSの基礎1
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MSMSの基礎の基礎1 1 --内容内容MSMSの基礎の基礎1 1 内容内容
ペクト メトリ とは マススペクトロメトリーとは?
イオン化法 イオン化法
LC条件の検討 LC条件の検討
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MSMSの基礎の基礎1 1 --内容内容MSMSの基礎の基礎1 1 内容内容
ペクト メトリ とは マススペクトロメトリーとは?
イオン化法 イオン化法
LC条件の検討 LC条件の検討
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マススペクトロメトリーとは?マススペクトロメトリーとは?マススペクトロメトリ とは?マススペクトロメトリ とは?
サンプルを気相イオンにする サンプルを気相イオンにする
真空中でイオンを質量電荷比 (m/z) に応じて分離する 真空中でイオンを質量電荷比 (m/z) に応じて分離する
m/z に対するイオン強度を記録する m/z に対するイオン強度を記録する
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分析対象物質分析対象物質分析対象物質分析対象物質
非極性 非極性
揮発性
熱に対して安定おおむねGC/MS (しばしば誘導体化が必要)
熱に対して安定
高極性
低揮発性 低揮発性
熱に対して不安定おおむねLC/MS
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MSMSの利点の利点MSMSの利点の利点
検出感度が高 検出感度が高い
選択性 選択性
広範囲なアプリケーション 広範囲なアプリケ ション
他の検出器と相補的他 検出器 相補的
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MSMSにおける制限における制限MSMSにおける制限における制限
サンプルをイオン化しなければならな サンプルをイオン化しなければならない
イオン分離部を高真空に保たなければならない イオン分離部を高真空に保たなければならない
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MSMSの基礎の基礎1 1 --内容内容MSMSの基礎の基礎1 1 内容内容
ペクト メトリ とは マススペクトロメトリーとは?
イオン化法 イオン化法
LC条件の検討 LC条件の検討
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LC/MSLC/MSで用いられている主なイオン化法で用いられている主なイオン化法LC/MSLC/MSで用いられている主なイオン化法で用いられている主なイオン化法
トリ ク 支援レ ザ 脱離イオン化 (MALDI) マトリックス支援レーザー脱離イオン化 (MALDI)– 平面状のマトリックスに溶解した化合物のレーザーアブレーションによる
エレクトロスプレーイオン化 (ESI)
大気圧化学イオン化 (APCI)
大気圧光イオン化 (APPI)
大気圧固体試料イオン化 (ASAP)
など・・・
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LC/MSLC/MSで用いられている主なイオン化法で用いられている主なイオン化法LC/MSLC/MSで用いられている主なイオン化法で用いられている主なイオン化法
トリ ク 支援レ ザ 脱離イオン化 (MALDI) マトリックス支援レーザー脱離イオン化 (MALDI)– 平面状のマトリックスに溶解した化合物のレーザーアブレーションによる
エレクトロスプレーイオン化 (ESI)
大気圧化学イオン化 (APCI)
大気圧光イオン化 (APPI)
大気圧固体試料イオン化 (ASAP)
など・・・
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エレクトロスプレーイオン化エレクトロスプレーイオン化 ((ESIESI)) の原理の原理エレクトロスプレ イオン化エレクトロスプレ イオン化 ((ESIESI)) の原理の原理
ESIは液相のイオン化ESIプローブ
ESIは液相のイオン化
イオン化は次の3段階 イオン化は次の3段階
– 帯電液滴の生成
– 脱溶媒と液滴の分裂
キャピラリー
脱溶媒と液滴の分裂
– 気相イオンの生成 サンプルコーン
イオンの経路イオン 経路
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帯電液滴の生成帯電液滴の生成帯電液滴の生成帯電液滴の生成
キャピラリー
酸化還元反応
LCフローLCフロ
+1 3 kV
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+1-3 kV
脱溶媒と液滴の分裂脱溶媒と液滴の分裂脱溶媒と液滴の分裂脱溶媒と液滴の分裂
++
+
+
+ + +++
+溶媒の蒸発
+
+ +
+
+
+
++++
++
+
不均一な液滴の分裂
+ +++
++
+++高温のガス
(DesolvationGas) ++
+ + ...( eso at o Gas)
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気相イオンの生成気相イオンの生成気相イオンの生成気相イオンの生成
イオン蒸発のモデルイオン蒸発のモデル
AH+
AHAH+X-
AH+A
AH+ AH+A
AH+
AH+AH+
AH+
AH+ AH+r < 10 nm
AH+X-
A
AH+
AH+X- AH+AH+X-AH+
AH+ AH+
AH+
AAH+
AH+AH+X- 半径 < 10 nmの液滴では、
静電斥力による液滴表面からのイオン蒸発が起こる
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イオンは液相から気相へ
ESIESI法において感度に影響する因子法において感度に影響する因子ESIESI法において感度に影響する因子法において感度に影響する因子
移動相の種類
– 揮発性であることが必要
o 水、アセトニトリル、メタノール、エタノール、イソプロパノール
ギ酸 酸o 添加剤(ギ酸、酢酸アンモニウムなどを低濃度で使用)
移動相の流量
適感度の得られる流量を使用– 適感度の得られる流量を使用
o イオン化法
o カラム内径
試料中の共存成分
– マトリックス効果
o イオン化阻害
o イオン化促進
カラムの汚れ
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カラムの汚れ
マトリックス効果マトリックス効果マトリックス効果マトリックス効果
Blank
100
H030312_CS_ES+_001 1: TOF MS ES+ TIC6.28
Urine InjectionUrine
Blank Injection100 TIC
3.31e4
6.01
5.93
8.698.51
8.24
7.767.72
6.38
8.989.70 9.86
10.25
10.54
Urine
100
H030312_CS_ES+_004 1: TOF MS ES+ TIC
3.33e48.568.34
7.70
7.336.83
6.696.36
6.29
6.23
8.80 9.63 10.20
10.45
%
5.825.73
5.585.30
4.944.85
4.49
10.74
10.84
10.96
11 26
%
10.87
11.17
11.76
2 00 4 00 6 00 8 00 10 00 12 00Time49
11.26
11.37
2 00 4 00 6 00 8 00 10 00 12 00Time25
2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00
Theophylline
Caffeine
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Nortriptyline
マトリックス効果マトリックス効果 (続き)(続き)マトリックス効果マトリックス効果 (続き)(続き)
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(http://www.waters.com/waters/promotionDetail.htm?id=10073265より抜粋)
ESIESIの特長の特長ESIESIの特長の特長
ソフトなイオン化ソフトなイオン化
– [M+H]+、[M+NH4]+、[M+Na]+、[M+K]+ など
– [M-H]-、[M+CH3COO]-、[M+Cl]- など
中~高極性、イオン性、および低~高分子 (蛋白質では 150 kDa 程度まで) と広い範囲の化合物を比較的高感度にイオン化できる
生体高分子、ポリマーでは多価イオンを生成
– [M+nH]n+ [M+(NH ) ]n+[M+nH] ,[M+(NH4)n]– [M-nH]n-
熱に不安定な化合物もイオン化できる
非共有結合複合体もイオン化できる
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非共有結合複合体もイオン化できる
LC/MSLC/MSで用いられている主なイオン化法で用いられている主なイオン化法LC/MSLC/MSで用いられている主なイオン化法で用いられている主なイオン化法
トリ ク 支援レ ザ 脱離イオン化 (MALDI) マトリックス支援レーザー脱離イオン化 (MALDI)– 平面状のマトリックスに溶解した化合物のレーザーアブレーションによる
エレクトロスプレーイオン化 (ESI)
大気圧化学イオン化 (APCI)
大気圧光イオン化 (APPI)
大気圧固体試料イオン化 (ASAP)
など・・・
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大気圧化学イオン化大気圧化学イオン化 ((APCIAPCI)) の原理の原理大気圧化学イオン化大気圧化学イオン化 ((APCIAPCI)) の原理の原理
APCIは気相のイオン化 APCIプローブ APCIは気相のイオン化
イオン化は次の3段階: イオン化は次の3段階:
– 急速な気化
– コロナ放電による試薬イオンの生成
プローブ先端
コロナ放電による試薬イオンの生成
– サンプル分子と試薬イオンの反応
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コロナニードル
APCIAPCI法におけるイオン化の過程法におけるイオン化の過程APCIAPCI法におけるイオン化の過程法におけるイオン化の過程
APCI Probe Heater(400 650°C)
Corona Discharge NeedleCorona Discharge
SampleSolution
(400-650 C) Needle
Flash Vaporisation
S l t d
Nebulizer GasSample Cone
Solvent and Analyte Vapour
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気相における化学イオン化気相における化学イオン化 (正イオン)(正イオン)気相における化学イオン化気相における化学イオン化 (正イオン)(正イオン)
プロトン移動
イオンの付加
電荷交換
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電荷交換
気相における化学イオン化気相における化学イオン化 (負イオン)(負イオン)
プ ト 移動
気相における化学イオン化気相における化学イオン化 (負イオン)(負イオン)
プロトン移動
イオンの付加イオンの付加
電荷交換
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電子捕獲
APCIAPCIの特長の特長
ソフトなイオン化
APCIAPCIの特長の特長
ソフトなイオン化
– [M+H]+、[M+NH4]+ など
– [M-H]-、[M+CH3COO]-、[M+Cl]- など3
一般的に一価イオンが生成
ESI でイオン化しにくい低極性化合物もイオン化
移動相とサンプルのプロトン親和力の差が感度に大きく影響
熱に非常に不安定な化合物の場合は熱分解の可能性も
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イオン化法と極性の選択イオン化法と極性の選択
1級~3級アミン どちらでも +
イオン化法と極性の選択イオン化法と極性の選択
1級~3級アミン どちらでも +
4級アミン ESI +
その他塩基性化合物 どちらでも +その他塩基性化合物 どちらでも +
アミノ酸 どちらでも +
ペプチド、蛋白質 ESI +
ヌクレオチド及び重合体 ESI -
ヌクレオシド ESI +
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イオン化法と極性の選択イオン化法と極性の選択 (続き)(続き)
非イオン性界面活性剤 どちらでも +
イオン化法と極性の選択イオン化法と極性の選択 (続き)(続き)
非イオン性界面活性剤 どちらでも +
陽イオン性界面活性剤 ESI +
陰イオン性界面活性剤 ESI -陰イオン性界面活性剤
カルボン酸 どちらでも -
スルホン酸、リン酸 ESI -
ニトロ基 どちらでも -
ステロイド類 APCI +
多くの場合、まずESI を試してみるとよい
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イオン化法イオン化法ESCiESCiマルチモードインターフェイスマルチモードインターフェイス
ESCiは、標準のESIプローブとAPCIのコロナニードルを用いて、ESIとAPCIの両
ESCiESCiマルチモ ドインタ フェイスマルチモ ドインタ フェイス
方の測定を同時に行うことができる機能
– MassLynxソフトウェアで、ESI/APCIの切り替えを行う。
– ESIモードではキャピラリーに APCIモードではコロナニードルに電圧が供給される– ESIモードではキャピラリーに、APCIモードではコロナニードルに電圧が供給される。
– ESCiのAPCIモードはコンベンショナルなAPCIより低流速で使用でき、熱分解も少ない
– 一回の注入でESI(+/-)、APCI(+/-)の測定が可能になるのでイオン化の確認に有効
ESIプローブ
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コロナニードル(MSシステムによって形状が異なります)
LC/MSLC/MSで用いられている主なイオン化法で用いられている主なイオン化法LC/MSLC/MSで用いられている主なイオン化法で用いられている主なイオン化法
トリ ク 支援レ ザ 脱離イオン化 (MALDI) マトリックス支援レーザー脱離イオン化 (MALDI)– 平面状のマトリックスに溶解した化合物のレーザーアブレーションによる
エレクトロスプレーイオン化 (ESI)
大気圧化学イオン化 (APCI)
大気圧光イオン化 (APPI)
大気圧固体試料イオン化 (ASAP)
など・・・
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APPIAPPI法におけるイオン化の過程法におけるイオン化の過程APPIAPPI法におけるイオン化の過程法におけるイオン化の過程
V UV
SampleSolution
Probe Heater
Vacuum UVSource
RepellerhSolutionFlash Vaporisation
RepellerElectrode
h
Sample ConeNebulizer Gas
Solvent and Analyte Vapour
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イオン化法の適応範囲イオン化法の適応範囲((ESI APCI APPIESI APCI APPIのまとめ)のまとめ)((ESI, APCI, APPIESI, APCI, APPIのまとめ)のまとめ)
10,000
ESI
1,000 APPI
質量
100100APCI
測定対象物質の極性
10高極性無極性
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測定対象物質の極性
LC/MSLC/MSで用いられている主なイオン化法で用いられている主なイオン化法LC/MSLC/MSで用いられている主なイオン化法で用いられている主なイオン化法
トリ ク 支援レ ザ 脱離イオン化 (MALDI) マトリックス支援レーザー脱離イオン化 (MALDI)– 平面状のマトリックスに溶解した化合物のレーザーアブレーションによる
エレクトロスプレーイオン化 (ESI)
大気圧化学イオン化 (APCI)
大気圧光イオン化 (APPI)
大気圧固体試料イオン化 (ASAP)
など・・・
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ASAPASAP(Atomospheric Solid Analysis Probe)(Atomospheric Solid Analysis Probe)
ガラスの棒の先に試料をこすり付けて付着させ(少量でよい、つけてから一度ふき取るくら 量 十分 液体も可能) 脱溶媒ガ 試料を気化させ ナ放電に
(Atomospheric Solid Analysis Probe)(Atomospheric Solid Analysis Probe)
取るくらいの量で十分、液体も可能)、脱溶媒ガスで試料を気化させ、コロナ放電により化学イオン化
ASAP用のプローブをつけるだけで使用可
薬、尿中の薬物代謝物、インクの成分などの分析事例
ASAP
Desolvation Gas(脱溶媒ガス)
ASAPASAP
コロナニードル
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ガラス棒に付着したサンプル
コロナニードル(MSシステムによって形状が異なります)
MSMSの基礎の基礎ⅠⅠ --内容内容MSMSの基礎の基礎ⅠⅠ 内容内容
ペクト メトリ とは マススペクトロメトリーとは?
イオン化法 イオン化法
LC条件の検討 LC条件の検討
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LCLC条件の検討条件の検討
LC条件の検討
LCLC条件の検討条件の検討
– 測定したいイオンをもっとも効率よく発生させる移動相を選択します。
– 測定対象測定対象物質が適切な保持時間をもつカラム、移動相を選択します。
有機溶媒 添加剤 その他
LCMSで使用する溶媒例:
水 メタノール 1~10 mM 酢酸アンモニウム 0.01~0.1%トリエチルアミン(TEA)
アセトニトリル 0.01~0.2% 酢酸 0.01~0.1%トリフルオロ酢酸(TFA)
1~10 mM ギ酸アンモニウム 1~10mM 炭酸水素アンモニウム
0.01~0.2% ギ酸
※アセトニトリル100%では使用しない※100% アセトニトリルに酢酸アンモニウムは溶解しない※100% アセトニトリルに酢酸アンモニウムは溶解しない※TEA、TFAを使用する場合は、システムのメンテナンス頻度をあげること
移動相は、揮発性のものを使用してください。
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有機溶媒の種類、移動相のpH、添加剤の有無、種類および濃度がイオン化効率に影響を与えます。→移動相の 適化が必要!!
MSMSの基礎の基礎1 1 --まとめまとめMSMSの基礎の基礎1 1 まとめまとめ
ペクト メトリ とは マススペクトロメトリーとは?
イオン化法 イオン化法
LC条件の検討 LC条件の検討
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