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Monografías Electrónicas de Patología VeterinariaMonografías Electrónicas de Patología VeterinariaMon. Electr. Patol. Vet. 2004; 1:38-67

La fasciolosis animal y humana

Fernando Fredes

Unidad de Parasitología, Departamento de Medicina Preventiva Animal, Facultad de Ciencias Veterinariasy Pecuarias, Universidad de ChileAv. Santa Rosa 11735, La Pintana, Santiago – Chile. Correo 15 Casilla [email protected]

ResumenLa presente revisión pretende aportar antecedentes acerca de la enfermedad y el diagnóstico de lafasciolosis tanto en animales como en el ser humano, con énfasis en el estudio de fraccionesantigénicas de interés inmunodiagnóstico

Palabras claves: Fasciolosis, Fasciola hepática

IntroducciónLa fasciolosis hepática es una enfermedadparasitaria que afecta a los conductosbiliares de rumiantes, cerdos, equinos,conejos y otros herbívoros, así como tambiénal hombre (Urquhart et al., 2001). Por lotanto es una enfermedad zoonótica y encomparación con la infección animal, laprevalencia real de esta enfermedad en elhombre es aún desconocida y de difícildiagnóstico. En Chile esta es la principalenfermedad parasitaria que afecta a lasespecies de abasto.

Su agente etiológico es la Fasciola hepatica,un trematodo que se localiza en loscanalículos biliares. Su mayor importanciaradica en el impacto económico queocasiona en productores de todo el país (aexcepción de la XII Región), debido a losdecomisos de hígados infectados y a ladisminución de parámetros productivoscomo leche, carne, lana y ganancia diaria depeso. Otras pérdidas ocasionadas por estaparasitosis, tienen relación con el menornúmero de animales destetados y por los

costos que se producen en la compra defasciolicidas.

El diagnóstico de la fasciolosis se establecepor métodos directos, mediante la búsquedadel parásito o sus huevos en las heces o bilisobtenida por sondeo duodenal.Lamentablemente este método no es 100%eficaz ya que no detecta formas prepatentesde infección, es decir cuando el parásito aúnno alcanza su madurez sexual. Además, suuso es limitado en hospederos infectados conpocas fasciolas o que se encuentran enperíodo de invasión.

Entre los métodos indirectos de diagnóstico,la serología es la herramienta de elecciónpara la detección de anticuerpos específicos.Sin embargo, su valor diagnóstico ha sidolimitado por la presencia de reactividadcruzada con otros parásitos.

En la actualidad la prueba de ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) esuna de las herramientas diagnósticas más

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empleadas y aplicable a gran escala, cuyasensibilidad y especificidad depende de lafuente del antígeno utilizado. Es así como eluso de esta técnica permite un diagnósticomás temprano de esta parasitosis, al detectarestados juveniles del parásito y con ellorealizar la aplicación de tratamientos enforma temprana y oportuna.

La presente revisión pretende aportarantecedentes acerca del diagnóstico conénfasis al estudio de fracciones antigénicasde interés inmunodiagnóstico.

GeneralidadesLa fasciolosis, es una enfermedad parasitariaproducida por parásitos pertenecientes alphylum Platyhelminthes, específicamente ala clase Trematoda. Dentro de esta claseencontramos dos subclases Monogenea yDigenea. Los vermes pertenecientes a lasubclase Monogenea sólo afectan a lospeces, en tanto que los de la subclaseDigenea se hospedan en vertebrados y soncomúnmente denominados “duelas” o“piriguines” (Alcaíno y Apt, 1989).

Los géneros involucrados en estaenfermedad son: Fasciola y Fascioloides(Urquhart et al., 2001). En Chile, sólo seencuentra F. hepatica, la cual tiene unaamplia distribución en el país, afectando aanimales de abasto y silvestres, con una altaprevalencia en la Región VII (87,4% enbovinos), generando grandes pérdidaseconómicas asociadas a sus distintos nivelesde infección en los animales. Es importantedestacar que esta parasitosis es una zoonosis.(Alcaíno y Apt, 1989).

La F. hepatica es un verme aplanado conforma de hoja, posee un cono cefálico, dosventosas de sujeción y una cubierta cuticularespinosa, pudiendo alcanzar un tamaño de3,5 cm de largo por 1,0 de ancho (Urquhartet al., 2001). Afecta diversas especies deanimales domésticos, como los bovinos,ovinos, caprinos, porcinos y equinos.Además, parasita al hombre y especiessilvestres como los conejos, canguros,elefantes y ciervos. Normalmente el parásitoadulto se ubica en los canalículos biliares delos hospederos frecuentes, pero en otroscasos puede ubicarse en pulmón o bajo lapiel, entre otras ubicaciones. Este parásito seencuentra en gran parte del mundo, dondeexisten condiciones de humedad ytemperatura adecuadas para su desarrollo(Urquhart et al., 2001).

Algunos estudios han demostradodiferencias en la resistencia o sensibilidad aesta parasitosis dependiendo de la especieanimal. Es así como se ha descrito que elcerdo, el jabalí, el perro y el gato, montanuna rápida respuesta contra el parásitoevitando su desarrollo. Otro es el caso de losbovinos, los equinos y el hombre quereaccionan en forma tardía permitiendo suproliferación. Finalmente los ovinos, loscaprinos y los lagomorfos son los másreceptivos al parásito (Cordero et al., 1999).

Ciclo BiológicoLos parásitos adultos se ubican en loscanalículos biliares de los hospederosdefinitivos donde producen huevos porautofecundación, los que son liberados por labilis y salen al medio ambiente en las hecesdel animal. Estos huevos son operculados yen su interior desarrollan otro estadío

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evolutivo, el miracidio. Esto ocurre en unlapso de 9 a 14 días y requiere para ellotemperaturas de 22 a 26ºC y una humedadambiental alta. Cuando la condiciónambiental, en particular la temperatura, no esla óptima la evolución es retardada llegandoincluso a ser inhibida completamente a unatemperatura inferior a 10ºC. Por lo anteriorel ciclo queda interrumpido, en el periodode otoño-invierno donde no se producennuevas infecciones (Alcaíno y Apt, 1989).

Después de su eclosión el miracidio busca alhospedero intermediario, un caracol anfibio,que en nuestro país corresponde al Galba(Pectinidens) viatrix. Este también necesitaalta humedad y temperaturas, sobre los 10ºCpara completar su desarrollo (Alcaíno y Apt,1989).

El miracidio una vez eclosionado busca alcaracol y penetra en él a través de la piel,generando en su interior un esporoquisteque produce partenogenéticamente 5 a 8redias las que en condiciones desfavorablesoriginaran redias hijas y nietas. Si estasencuentran condiciones ambientalesapropiadas, originaran cercarias queabandonan el caracol y nadan hastaenquistarse en un vegetal originando lasmetacercarias (Urquhart et al., 2001). Esteúltimo estado es el infectante, el cual resistehasta un año con buena humedad y bajas

temperaturas (Alcaíno y Apt, 1989).Finalmente el ciclo evolutivo dentro delcaracol es de aproximadamente 5 a 6semanas, por lo que por ejemplo en laséptima región la mayor parte de lainfección se produciría a fines de octubre ydurante el mes de noviembre (Alcaíno et al.,1993).

Por lo tanto el hospedero definitivo seinfecta al consumir vegetales contaminadoscon metacercarias, las que al desenquistarseen el tubo digestivo dejan en libertadfasciolas juveniles. Estas al penetrar la paredintestinal, caen en la cavidad peritoneal y através de ella migran al hígado. Luego de 3 o4 días estos estadíos juveniles atraviesan lacápsula de Glisson y migran durante 6semanas por el parénquima hasta alcanzarfinalmente los canalículos biliares dondeculmina su desarrollo en aproximadamente 4semanas. Durante este tiempo las fasciolasalcanzan su madurez sexual y comienzan aproducir huevos (Dunn, 1983; Alcaíno yApt, 1989; Urquhart et al., 2001). La etapa prepatente de esta infección, esdecir, aquel periodo que transcurre desde queel estadío evolutivo infectante es ingeridohasta que el parásito, una vez madurosexualmente, comienza a eliminar huevospor las heces, dura aproximadamente 10-12semanas (Duménigo et al., 1999).

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Ciclo Evolutivo de Fasciola hepatica

Huevo de Fasciolahepatica

Caracol hospedero intermediarioGalba (P.) viatrix

Ejemplar adulto de Fasciola hepatica


La fasciolosis animal y su epidemiologíaUn factor importante de considerar en laepidemiología de la fasciolosis, tienerelación con las principales condicionantesen la producción de metacercarias:• Disponibilidad de hábitats adecuados

para los caracoles: condicionesadecuadas de temperatura y humedad.Estas condiciones ambientales lasencuentra el caracol de preferencia enarroyos y aguas corrientes, y su apariciónse producirá en los últimos meses deinvierno, para disminuir en marzocomenzando así su fase de hibernación.

• Temperatura: una temperatura ambientalmedia igual o superior a 10°C esnecesaria tanto para la reproducción decaracoles como para el desarrollo de F.hepatica. Ambos procesos se detienen atemperaturas iguales o menores de 5°C.Esta también es la temperatura mínimapara el desarrollo y eclosión de loshuevos de F. hepatica. Humedad: lascondiciones óptimas de humedad, seproducen cuando las precipitacionessuperan a la transpiración y alcanzanniveles de saturación. Esta condición estambién esencial para que los miracidiosencuentren a los caracoles y para ladispersión de las cercarias liberadas deestos (Urquhart et al., 2001). Por lotanto, es en primavera y verano cuandoencontramos las condicionesambientales que permiten su eclosiónmás rápida.

En nuestro país la infección se encuentraampliamente distribuida en las especiesanimales de interés pecuario, en todas susregiones, excepto en la Región XII (donde la

temperatura promedio no supera los 10ºCpor más de 2 meses); sin embargo existenzonas más afectadas, como es la Región VII(Alcaíno et al., 1993). En esta región, loshuevos detienen su desarrollo en los mesesde invierno, eclosionando y liberandomasivamente los miracidios en los meses deseptiembre y octubre. En estos mismosmeses los caracoles aumentan su población ypor lo tanto un gran número de ellos esatacado por los miracidios. Como el ciclodentro del caracol demora de cinco a seissemanas, se libera una gran cantidad decercarias entre los meses de octubre ynoviembre, así estas se enquistan en lospastos (como metacercarias) infectándolosmasivamente. Por tanto los animalesempiezan a eliminar huevos a través de susexcrementos a fines de diciembre oprincipios de enero. En otoño e invierno nose producen nuevas infestaciones de pastos,pero los animales no tratados presentan ensus hígados fasciolas adquiridas en años omeses anteriores, las que siguen poniendohuevos, los que al salir al medio ambientedetienen su evolución durante el invierno yeclosionan en septiembre y octubre (Alcaínoet al., 1993).

Conocido es el hecho que esta parasitosis, enChile, ha desplazado a la hidatidosis como lazoonosis parasitaria de mayor importancia enlos animales de abasto, beneficiados en losmataderos controlados por los servicios desalud. Así por ejemplo, la prevalencia de lafasciolosis en el periodo 1989 – 1995 fue de30,1% en bovinos, 2,1% en ovinos, 1,4% enporcinos, 12,3% en equinos y 14% encaprinos (Morales et al., 2000). Estimandoque el peso aproximado del hígado de vacuno

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es de 6 kg, el del cerdo 2 kg y el del ovino 1kg, se puede establecer que en un año sedecomisa aproximadamente un total 1,5toneladas de hígados. Estas cifras demuestran,que a pesar que se dispone de eficientes

drogas para tratar a los animales afectados,esta zoonosis no ha disminuido frente a lasestrategias de control basadas exclusivamenteen tratamientos farmacológicos.

Se deben agregar a lo anterior otras pérdidasa nivel productivo, ya sea producción deleche, de carne y/o lana, dependiendo de laespecie animal afectada (González, 1982).Así por ejemplo, se ha visto que ovejasinfectadas experimentalmente disminuyen suconsumo diario de alimento por sobre un50% a las 9 a 12 semanas post infección.Otros autores han reportado un consumopromedio inferior al 15% a las 20 semanaspost infección, al comparar con un grupocontrol (Ferre et al., 1994).

La fasciolosis tiene diferentes formas depresentación, asociadas a la cantidad yfrecuencia de ingestión de metacercarias por

el hospedero (Rojas, 1990). Sin embargo,también existen diferencias según lacapacidad infectante de los parásitos,dependientes de las condiciones ambientalesque han soportado en su desarrollo en elcaracol y al enquistarse en los vegetales(Cordero et al., 1999).

Así, se pueden describir fundamentalmentedos tipos de cuadros clínicos:

1. Fasciolosis aguda: es aquella que seproduce por el consumo de gran cantidadde metacercarias, en un corto periodo detiempo. La migración masiva de fasciolasjuveniles a través del parénquima

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Hígado ovino con lesiones producto de una fasciolosisaguda


provoca una hepatitis traumática condestrucción celular, hemorragias, anemiay muerte en casos graves. Los estadiosmás patógenos son los de 6 a 8 semanas,ya que ellos son los responsables de lagran destrucción del parénquimahepático y debido a ella de la abundantehemorragia (Soulsby, 1987; Urquhart etal., 2001). Este cuadro se producefundamentalmente en la especie ovina, esde curso rápido y puede llegar a lamuerte del animal aproximadamente alos 12 días después de la aparición de losprimeros síntomas (Cordero et al., 1999).Esta forma clínica es imposible dediagnosticar por exámenescoproparasitarios, ya que los estadiosjuveniles no producen huevos (etapa

prepatente de la infección) (Alcaíno yApt, 1989).

2. Fasciolosis crónica: es la forma clínicamenos severa, pero la más común deesta parasitosis, y se produce por elconsumo de pastos leve omoderadamente contaminados en unperiodo largo de tiempo. Esto permiteque el animal reaccione y resista lainfección. Los parásitos se establecen enlos canalículos biliares produciendo unengrosamiento, fibrosis y obstrucción deellos (etapa patente de la infección). Enesta ubicación el verme en un estadomaduro, elimina huevos por la bilis losque aparecerán en las heces, lo cualpermite realizar el diagnosticocoprológico para los individuos quepresenten un cuadro crónico.

El año 1995 de acuerdo a los hallazgos dematadero se encontró una prevalencia defasciolosis de 30,1% en bovinos, 2,1% en

ovinos, 14% en caprinos, 1,4% en cerdos,9,2% y 8,37% en camélidos. Esto confirmaque la fasciolosis es la zoonosis parasitaria

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Ovino con fasciolosis sub aguda (signo de la botella)


de mayor prevalencia en los animales deconsumo humano (Morales et al., 2000).Todas estas alteraciones generan pérdida depeso, debilidad, baja en la producción deleche y lana, entre otras.

La disminución de los parámetrosproductivos que genera esta parasitosis esconsiderable, así un animal parasitado puededisminuir hasta un 28% su producción decarne, reduciendo además la cantidad ycalidad de leche producida, situación que escastigada por las empresas lecheras. Eldecomiso de los hígados en mataderos ennuestro país llega a 1.370.894 kg de hígadosbovinos (US$ 2.741.788), 19.259 kg enovinos (US$ 32.740), 42.243 kg en cerdos(US$63.365), 3.051 kg en caprinos (US$3.661) y 14.895 kg en equinos (US$17.894).

Es difícil evaluar las pérdidas que segeneran por disminución de los parámetrosproductivos, además de los gastos que segeneran gastos por compras de fasciolicidasy atención veterinaria.

La fasciolosis humana y su epidemiologíaEn comparación con la infección animal, ladistomatosis hepática o fasciolosis humanaes poco común, sin embargo han sidopublicados en dos décadas, un total de 2.594personas infectadas en 42 países (áreas) deEuropa, América Latina, África del Norte,Asia y el Pacífico Oeste. Chile aporta a estacifra 4 casos (Chen y Mott, 1990). A pesarde lo anterior se ha descrito que el númerode casos reportados y de personas infectadasha ido aumentando en los últimos 25 años.Esteban et al. (citado por Mas-Coma et al.,1999a) en al año 1998, describió que de un

total de 7.071 casos humanos reportadosdesde 51 países en los últimos 25 años, 487casos eran de África, 3.267 de América, 354de Asia, 2.951 de Europa y 12 de Oceanía.Estimaciones recientes sugieren que hayentre 2,4 millones hasta 17 millones depersonas infectadas por F. hepatica en todoel mundo.

Debido a esto la fasciolosis humana ya nopuede considerarse simplemente como unaenfermedad zoonótica secundaria, sino comouna importante enfermedad parasitaria delhombre. Todos estos antecedentes hanllevado a la necesidad de revisar losconocimientos actuales sobre laepidemiología de la enfermedad, y en laactualidad se ha llegado a proponer unanueva clasificación epidemiológica de lafasciolosis humana:

1. Casos importados: casoshumanos diagnosticados en zonaslibres de F. hepatica (incluso estáausente entre los animales), esdecir que fueron infectados enuna zona de transmisión defasciolosis.

2. Casos autóctonos, aislados, noconstantes: los pacientesadquieren la infección en el áreaen que habita y en donde tambiénestá presente la fasciolosisanimal. Estos casos sólo aparecenesporádicamente, sin constancia.

3. Casos endémicos: puedendistinguirse tres tipos desituaciones según la prevalenciaen la población total, obtenida pordiagnóstico coproparasitario:

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a) Hipoendémico: la prevalencia esmenor al 1%, la media aritmética dela intensidad es menor a 50 huevospor gramo de heces (hpg), pacientescon altos niveles de hpg sólo soncasos esporádicos; la participaciónhumana en la transmisión, a través dela eliminación de huevos es sinimportancia; en general existenbuenas condiciones sanitarias en elambiente.

b) Mesoendémico: prevalencia del 1 al10%, puede presentarse una altaprevalencia en niños de 5 a 15 años;la intensidad en comunidadeshumanas suele ser de 50-300 hpg,pueden aparecer casos con altosniveles individuales de hpg, aunquelas intensidades mayores a 1.000 hpgson raras; las personas puedenparticipar en la transmisión a travésde la eliminación de huevos.

c) Hiperendémico: prevalencia mayoral 10%, puede existir una altaprevalencia en niños de entre 5 y 15años; generalmente la intensidad esmayor a 300 hpg, pueden aparecercasos con niveles individuales de hpgmuy altos, siendo relativamentefrecuentes las intensidades mayoresa 1.000 hpg; los casos humanosparticipan significativamente en latransmisión a través de laeliminación de huevos. Generalmentese presenta en malas condicionessanitarias.

4. Epidémicos: Hay diferentestipos de brotes de acuerdo a lasituación endémica/noendémica de la zona:

a) Epidemia en áreas donde lafasciolosis es endémica en losanimales, pero no en los humanos:zonas donde los reportes previos decasos humanos han sido siempreaislados y esporádicos; esos brotesusualmente involucran a pocosindividuos, que resultan infectadosdesde el mismo foco decontaminación (familia o pequeñogrupo, berros u hortalizas silvestres,de cultivo doméstico o comercial,portadoras de metacercarias).

b) Epidemia en áreas humanasendémicas: brotes en zonas donde laenfermedad es endémica en loshumanos, pueden involucrar a ungran número de individuos;usualmente está relacionado acondiciones climáticas favorablespara el desarrollo del ciclo biológicotanto del parásito como del caracol.La epidemia puede tener lugar enáreas hipoendémicas, mesoendémicaso hiperendémicas (Mas Coma et al.,1999a).

Considerando las prevalencias animales, esque se han podido identificar zonasepidemiológicas importantes como es laregión del Maule (Alcaíno y Apt, 1989).Sería valido entonces pensar que existe unaalta probabilidad de encontrar altos índicesde infección humana en zonas rurales de estaregión. Un estudio, realizado en unapoblación humana el año 1992, reveló unaprevalencia de 2,7% mediante ELISA, estacifra disminuyó a un 0,7% al considerar sólolos casos confirmados por la detección dehuevos del parásito en las heces (Apt et al.,1992).

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En el resto del mundo se distinguen áreas demuy baja prevalencia humana como son 0,83- 1,16 casos/100.000 habitantes en Córcega,0,34 - 3,1 casos/100.000 habitantes en labaja Normandía (Francia). Existen ademászonas de prevalencia intermedias como sonun 7,3% en el delta del Nilo, Egipto; 8,7%en Cajamarca, Perú. En tanto que ejemplosde alta prevalencia se dan en la región dePuno (con 15,64%) y valle de Mantaro (con34,2%), ambas en Perú. También se haregistrado una alta prevalencia en el altiplanoboliviano, en donde se ha detectado hasta un66,7% a través de exámenescoproparasitarios, y más de un 53% deprevalencia usando técnicas inmunológicas(Mas Coma et al., 1999a).

En el hombre esta zoonosis se manifiesta aveces como brotes familiares de fasciolosisasociada a la ingesta de verdurascontaminados con metacercarias (Espino etal., 1997; Rodriguez et al., 1998; Atias ,1991).

La magnitud del cuadro clínico estácondicionado, al igual que en nuestrosanimales, por el número de metacercariasingeridas con las verduras crudascontaminadas, habitualmente berros(Nasturium officinalis) en el caso de lainfección humana (Atías, 1991). Lapenetración de la pared del duodeno oyeyuno por parte de las metacercarias puedeprovocar hemorragias localizadas einflamación. La migración del parásito através del parénquima hepático induce lamayoría de los cambios patológicos; elparásito digiere tejido hepático y causadestrucción parenquimática extensa con

lesiones hemorrágicas intensas, además dereacciones inmunológicas e inflamatorias.Durante su migración a veces quedancavidades que luego son llenadas condetritus necróticos, y diversas zonas sonreemplazadas por tejido cicatricial. Lesionesde menor severidad pueden ocurrir en elconducto biliar, aunque la inflamación puedeterminar en fibrosis y engrosamiento delmismo.

La anemia es uno de los signos máscaracterísticos, la perdida de sangre en labilis parece ser el más importante, sino elúnico, factor contribuyente a la anemia.

Según Mas-Coma et al., (1999b) sedistinguen los siguientes periodos clínicos:

• Fase de incubación: desde la

ingestión de las metacercariashasta la aparición del primersíntoma.

• Fase aguda o invasiva:comienza cuando ocurre lamigración parasitaria hasta elconducto biliar.

• Fase latente: incluye la etapa demaduración hasta el inicio de laoviposición.

• Fase obstructiva o crónica:cuando el parásito se establece enel conducto biliar.

Algunas características de cada fase son:

1. Fase de incubación: varía dependiendodel número de metacercariasconsumidas y de la repuesta delhospedero. Su duración es variable.

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2. Fase aguda o invasiva: lasintomatología se debe principalmente ala destrucción mecánica del tejidohepático y del peritoneo abdominal,debida a la migración de las larvas. Dura2 a 4 meses, y sus principales signos son:

• Fiebre: la que generalmente esbaja a moderada, llegando a 40°C, y en casos muy parasitados a42°C. Puede remitir, serintermitente o irregular con altatemperatura en las tardes.

• Dolor abdominal: que va desdesuave a severo, generalmentelocalizado en el hipocondrioderecho o bajo el xifoides.

• Trastornos gastrointestinales:como perdida de apetito,flatulencia, nausea y diarrea sonsíntomas comunes.

• Urticaria: es un signo distintivoen el estado temprano de lainvasión parasitaria, puedeacompañarse de ataque de asmabronquial.

• Síntomas respiratorios: tos,disnea, hemoptisis y dolortorácico ocurren ocasionalmente.

• Al examen físico puedenaparecer además: hepato yesplenomegalia; ascitis, la que secaracteriza por ser un liquidoamarillo con un alto conteo deleucocitos, y con predominio deeosinofilos; una anemia leve amoderada; signos torácicos, porauscultación o radiografía; eictericia, la cual es pocofrecuente.

3. Fase latente: puede durar meses o años;los pacientes frecuentemente sondescubiertos durante un “screening”familiar tras detectar a uno de susintegrantes infectado. Pueden tenerdolores gastrointestinales o una o másrecaídas de los síntomas agudos.

4. Fase crónica u obstructiva: puededesarrollarse meses o años después de lainfección inicial. El parásito adulto en elconducto biliar causa inflamación ehiperplasia del epitelio. La resultantecolangitis y colecistitis, combinada conel gran tamaño del parásito sonsuficientes para producir una obstrucciónmecánica del conducto biliar (sitio deobstrucción más común) (Mas-Coma etal., 1999b).

Otra clasificación hecha por Atías (1991)

considera lo siguiente:

• Periodo de invasión:comprendido entre la ingestión delas metacercarias y la llegada deldistoma joven a los conductosbiliares. En esta etapa apareceríansíntomas debidos a la migracióndel parásito joven a través delorganismo.

• Periodo de estado: comienza conla parasitosis de la vía biliar porparte del parásito adulto.

Existen también fasciolosis de tipoectópicas, por parte de estados inmaduros delparásito que pueden desviarse durante lamigración. En el hombre, los sitios más

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frecuentes para esta presentación están en eltracto gastrointestinal. Otros lugares puedenser el tejido subcutáneo, corazón, vasossanguíneos, pulmón y cavidad pleural,cerebro, pared abdominal, apéndice,páncreas y bazo. Aquellos parásitosectópicos nunca logran madurar, y susefectos patológicos son debido a los surcosde migración que causan daño tisular coninflamación y fibrosis. Este parásito puedeser calcificado o incorporado en ungranuloma (Mas-Coma et al., 1999b).

La duración de la infección humana esdesconocida, pero algunos investigadoreshan estimado que el parásito podríasobrevivir por 5 a 12 años (Karnaukhov,1978, citado por Mas-Coma et al., 1999b) ydesde 9 a 13,5 años (Dan et al., 1981, citadopor Mas-Coma et al., 1999b).

DiagnósticoEl diagnóstico de fasciolosis humana seplantea frente a un enfermo con un cuadroclínico compatible, consistente en trastornosdigestivos, especialmente hepatobiliares;que pueden o no presentar crisis febriles ourticaria, de evolución aguda o crónica,acompañada o no de eosinofilia elevada y enel que haya antecedentes de ingestión deberros. Aunque, también es posible que laparasitosis curse en forma subclínica, si lainfección humana es por pocos ejemplares.La infección puede presentarse como unaepidemia familiar, por lo que se debeconsiderar en el estudio médico al grupohumano con el cual vive el caso índice(Borie et al, 1990).

El diagnóstico de certeza en humanos seestablece por:

1. Diagnóstico directo: cuando seencuentra el parásito o sus huevos enlas heces o bilis obtenida por sondeoduodenal (Atías, 1991). La principaltécnica para el diagnósticocoproparasitario de fasciolosis es lasedimentación en copa, para tal casohay que considerar los siguientespuntos:

Si existen parásitos en estadosinmaduros; en este caso no seencontraran huevos pues el parásitoaún no alcanza su madurez sexual.

Fase de la infección: en el hombre lafase de incubación es tan corta que elperiodo de prepatencia y de hallazgosclínicos pueden aparecer mucho antesque los huevos sean hallados en lasheces. Así que este examen solo esútil después de los 3 a 4 meses post-infección.

La dinámica en la producción dehuevos: en el hombre el número dehuevos producidos y su dinámica sonpoco conocidos; pero se sabe que laliberación de huevos puede ser bajay/o intermitente.

Las personas que coman hígadoanimal infectado poco tiempo antesde tomarse una muestra pueden daruna “falsa” fasciolosis cuando esoshuevos aparezcan en las heces, en talcaso el diagnóstico requiere dejar alpaciente con una dieta libre de hígadoy realizar exámenes seriados deheces.

Un parásito ectópico maduro nuncaha sido encontrado, por eso sushuevos nunca serian producidos(Mas-Coma et al., 1999b).

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Por todo lo anterior se recomienda unestudio coproparasitario seriado de a lomenos 10 muestras para mejorar lasensibilidad del examen (Atías, 1991).

2. Diagnostico indirecto: existenhallazgos de laboratorio como son: Las alteraciones del hemograma:

ya que se da eosinofilia marcada,leucocitosis con desviación a laizquierda; anemia la cual escomún, pero generalmente no estan severa (Atías, 1991).

Las pruebas de funcionalidadhepática: en la fase aguda sepuede detectar un aumento deenzimas como la transaminasaglutamica piruvica (GPT) y latransaminasa glutamicaoxalacetica (GOT); además deglobulina y bilirrubina sérica;mediante la electroforesis desuero, se ha observado que existeun aumento de α2 y γ globulinas.En tanto que durante la faseobstructiva la ictericia escaracterística.

Los niveles de inmunoglobulinas(Ig): IgG, IgM e IgE estángeneralmente aumentadas;incluso se ha visto que los nivelesde IgE se correlacionanpositivamente con la carga dehuevos, la edad, lascaracterísticas clínicas y el gradode eosinofilia. En lo que a laclase IgG se refiere, la IgG4 sepresenta como el isotipopredominante (Mas-Coma et al.,1999b).

Además existen métodos indirectos dediagnóstico como son las imágenesobtenidas por radiografía, ultrasonido,scanner, tomografía computarizada o porresonancia magnética nuclear, donde sepueden encontrar hepatomegalia o imágenesde sustitución (Atías, 1991).

El inmunodiagnóstico se ha planteado comouna interesante alternativa en la búsqueda demétodos diagnósticos más sensibles yespecíficos, tal es el caso del método deELISA. Sin embargo, generalmente, se hanusado antígenos constituidos por complejosantigénicos, que frecuentemente conducen aproblemas de sensibilidad o especificidad. Elpreparado antigénico utilizadoprimariamente fue un extracto del gusanoadulto, luego fueron productos excreción –secreción (E-S) y fracciones parcialmentepurificadas. Más recientemente han sidousados antígenos nativos purificados yantígenos recombinantes (Hillyer, 1999). Losantígenos E-S han sido consideradosimportantes inductores de la respuestainmune humoral en la fasciolosis, y tanto suespecificidad como su utilidad diagnósticahan sido demostradas en numerosos estudiosde fasciolosis humana y animal (Díaz et al.,1998).

El análisis mediante inmunoelectroforesis engeles de agarosa (inmunoprecipitaciónsimple y cruzada) ha permitido determinarque los extractos parasitarios crudos de F.hepatica, muestran una composiciónantigénica variada; siendo más complejos losantígenos somáticos y de excreción –secreción (E-S) provenientes de parásitosadultos (Gorman y et al., 1992).

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La aplicación de SDS-PAGE y su posteriorelectrotransferencia permitió mediante EITBidentificar aquellas fracciones antigénicasque solamente son reconocidas por lospacientes, lográndose una alta especificidady sensibilidad (Silva y et al., 1993).

Así también, Espino et al. (1987) usandosueros de 20 pacientes con fasciolosiscomprobada parasitólogicamente y antígenoE-S, aplicó un ELISA para detectaranticuerpos contra la enfermedad; yconcluyeron que este antígeno es específicoen el diagnóstico de fasciolosis, porque en lalectura de densidades ópticas se presentarondiferencias significativas ente el grupocontrol positivo con el grupo controlnegativo y el grupo con otras parasitosis.

Otros estudios también se han enfocadosobre la detección directa de antígenosparasitarios, ya sea en suero/plasma o heces(Hillyer, 1999). Espino et al. En 1990desarrollaron un ELISA para detectarantígeno parasitario circulante en pacientescon fasciolosis, el cual al aplicarlo sobre 25pacientes, resulto que el 100% de ellos fuereconocido como positivo a fasciolosis;además de ello, no se presentaron reaccionescruzadas con otras parasitosis (Espino et al.,1990, citado por Hillyer, 1999).

En tanto, Pelayo et al. (1998) sobre un totalde 24 pacientes detectó la presencia deantígenos y complejos inmunes circulantes(CIC) en el 100% de los casos confasciolosis aguda (n=5), en tanto que lapresencia de coproantígenos se hizo evidenteen el 100% de los casos crónicos (n=19).

Así también, Espino y Finlay (1994)encontraron que la concentración media deantígeno en las heces de humanos confasciolosis era de 250 ng ml-1,aproximadamente diez veces más que lohallado en suero (Espino y Finlay, 1994,citado por Hillyer, 1999).

Un estudio realizado en Cuba, describe lapresencia de antígenos de F. hepatica en lasheces de pacientes con fasciolosis crónica; ymediante el uso de EITB se detectaron enellas 9 antígenos de posible interésdiagnóstico, cuyos pesos moleculares (PM)eran de 62, 51, 46, 32, 25, 23, 20, 19 y 14kDa. Además los péptidos de 51, 23, 20 y 14kDa también fueron reconocidos por suerosde pacientes con fasciolosis crónica (Espinoet al., 2000).

La detección de anticuerpos es el métodopreferido para el inmunodiagnóstico defasciolosis, la razón es su relativasimplicidad y la temprana seroconversión(usualmente 1-2 semanas) durante lainfección primaria, comparado con lapatencia tardía (2-3 meses) (Hillyer, 1999).Sin embargo, hay que tener en consideraciónque su positividad no puede ser de modoalguno considerada como un criterio deinfección activa, ya que se ha demostradoque muchos pacientes ya curados mantienenelevados niveles de anticuerpos contra elparásito por períodos que pueden llegar hasta2 o 3 años (Espino et al., 1997).

Shaheen et al. (1989) usando antígenoparcialmente purificado de Fasciola, en unaprueba de dot-ELISA, obtuvo 100% desensibilidad previo a la detección de huevos,sin embargo la especificidad fue de 97,8%.

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Hillyer y Soler (1988) aplicando EITB sobreantígeno E-S del parásito, reconocieron dospolipéptidos antigénicos, uno de 17 kDa yotro de 63kDa, sin embargo este últimopresentó reactividad cruzada con otrasparasitosis, sugiriendo que este antígeno de17 kDa es un excelente candidato para eldiagnóstico de la fasciolosis aguda y crónica,y que pudiera ser especifico para esta.Además aplicando un FAST ELISA con elmismo tipo de antígeno, sugiere que existeun limitado número de epitopos causantes dereactividad cruzada en el antígeno E-S.

Khalil et al. (1990) realizaron un trabajo enEgipto, que apuntaba a determinar el efectode la purificación de antígenos crudos de F.gigantica y F. hepatica adultas sobre lasreacciones cruzadas encontradas encontrainmunoelectroforesis (CIEP),hemoaglutinación indirecta (IHA) y ELISA,con sueros de enfermedades parasitarias y noparasitarias. Así determino que usando CIEPes más especifico el antígeno semipurificadode F. hepatica que el antígeno crudo, lomismo sucedió con la aplicación de ELISA,donde se obtuvo mejores resultados con elantígeno semipurificado. En cambio alaplicar IHA el antígeno purificado presentómenor especificidad que el antígeno crudo.

Shaker et al. (1994a) a partir de un antígenocrudo de F. hepatica, realizó SDS-PAGE yEITB, evidenciando 7 bandas entre los 54 y12 kDa, siendo específicamente reconocidaspor los sueros positivos a fasciolosis, lasbandas de 54 y 33 kDa. El mismo año, y losmismos autores, utilizaron ELISA e EITBpara detectar anticuerpos circulantes contraF. hepatica en suero de pacientes infectados;

enfrentados ahora a un antígeno purificadopor inmunoafinidad desde homogeneizadosdel parásito adulto. ELISA resultó ser 100%sensible y tuvo una especificidad de 93%,mientras que con EITB se obtuvo un 100%de especificidad y sensibilidad. Entonces losautores plantearon que ELISA puede serusado como una buena prueba de“screening”, mientras que EITB serviríacomo un test confirmatorio en elinmunodiagnóstico de fasciolosis (Shaker etal., 1994b).

Hillyer et al. (1992) utilizó FAST-ELISA yEITB con antígeno E-S de Fasciola con elfin de determinar la prevalencia de lainfección en el Altiplano boliviano; de 20individuos positivos mediante examencoproparasitario, 19 fueron reconocidos porel FAST-ELISA, lo que determina unasensibilidad de 95%, mientras que en el casode EITB los 20 sueros reconocieron unaproteína de aproximadamente 12 kDa (100%de sensibilidad), en tanto otras proteínascomo las de 63 y 17 kDa solo fueronreconocidas por los individuos quepresentaban altos valores de densidad óptica(DO) en el FAST-ELISA.

También empleando EITB, en Portugal, sereconocieron específicamente polipéptidosde 27, 25, 19, 16 y 12 kDa por parte de 20sueros de pacientes con fasciolosiscomprobada. De todas estas sólo lasproteínas de 27 kDa y 25 kDa fueronreconocidas por la totalidad de los sueros, loque demostró su potencialinmunodiagnóstico. Además se realizó unELISA utilizando como antígeno el extractoE-S del parásito, el que arrojó una

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sensibilidad de 95% y una especificidad de97% (Sampaio-Silva et al., 1996).

En Túnez, el año 1997, se aplicó un ensayode EITB con el fin de identificar antígenosespecíficos de F. hepatica, sobre un total de28 sueros provenientes de pacientespositivos a fasciolosis. Al menos sereconocieron 11 diferentes proteínasantigénicas, siendo las de 57 y 29 kDa lasmás sensibles y especificas, con un 100% deespecificidad y una sensibilidad de 79% y93% respectivamente. Además se encontróque la proteína de 9-12 kDa sólo fuereconocida por el 47% de los casos. Estodemostró que EITB es una herramientadiagnóstica útil (Hammami et al. 1997).

Espino et al. (1997) a través de un ultramicroELISA para la detección de anticuerpos IgGanti-antígeno E-S de Fasciola, demostró unasensibilidad de 100%, una especificidad de98% y valores predictivos positivo ynegativo de 90,3 y 100% respectivamente.Al comparar esta técnica con un ELISAconvencional se obtuvo un índice deconcordancia de 95,5 %.

Díaz et al. (1998), con el fin de realizar laidentificación de los principalescomponentes presentes en el antígeno E-S deparásitos adultos de F. hepatica, que seanreconocidos por los sueros de ratasinfectadas experimentalmente conmetacercarias, usó la técnica de EITB,donde se detectaron bandas de entre 136 y 11kDa, entre las fracciones predominantesdestacan: 86-136 kDa, 65-71 kDa, 55-57kDa, 23-33 kDa, 14-16 kDa y 11-13 kDa.

Carnevale et al. (2001) usando antígeno E-Sdel parásito y para evaluar la detección deanticuerpos anti- F. hepatica en humanos,aplicó un ELISA y un micro-ELISA. Lasensibilidad de ambas pruebas fue de 100%,pero la especificidad fue de 100% paraELISA y de 97% para el micro-ELISA. Porlo anterior se concluyó que el micro-ELISApodría ser aplicado como una prueba de“screening” cuando hay un gran número demuestras involucradas (debido al bajoconsumo de reactivos), mientras que ELISApuede ser usado como prueba deconfirmación tras el uso de micro-ELISA.

Algunos de los estudios de fasciolosishumana realizados en nuestro país, son porejemplo, el de Mercado en el año 1989, elque aplicando SDS-PAGE y posterior EITBa un extracto crudo de F. hepaticadistinguió al menos 18 bandas con PM entrelos 96 y 14 kDa, demostrando la diversidady complejidad de la respuesta de anticuerposespecíficos inducidos por la presencia de F.hepatica; 12 de 14 pacientes (86%) confasciolosis comprobada reconocieron ungrupo de péptidos cuyo PM estaría entre los94 y 66 kDa. Esta elevada sensibilidad hacede ellos potenciales candidatos para serempleados en pruebas serológicas de rutina.

Tello et al. (1988) en orden a mejorar eldiagnóstico serológico de la fasciolosis enesa época, evalúo la reacción deinmunofluorescencia indirecta (RIFI),comparándola con el método de fijación delcomplemento (FC); y demostró que ambaspruebas tenían un 77,14% de correlación y laconsideró una herramienta útil en elinmunodiagnóstico de la fasciolosis, con unasensibilidad comparable, y aún levemente

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mayor que la de FC y que sería una buenaalternativa frente a resultados deanticomplementaridad.

Zulantay et al. (1992) usó un IgG ELISA yun antígeno somático soluble de F. hepatica,con el que obtuvo una sensibilidad de92,3% y una especificidad de 99,4%, entanto los valores predictivos positivo ynegativo fueron de 91,6% y 99,4%respectivamente.

Otro estudio, en el ámbito nacional,realizado en nuestro laboratorio y en el quese utilizó EITB y antígeno E-S del parásito,se describió una alta sensibilidad yespecificidad de varios grupos de bandaspolipeptídicas de PM aproximados de 96-109; 75-84; 49-50; 38-40; 30-33; y 16-26kDa (Silva et al., 1993).

En los últimos años, se ha avanzado en eldiagnóstico de fasciolosis, se han estudiadonuevos tipos de antígenos, generalmentepurificados a partir de productos E-S de F.hepatica, e incluso se ha estado trabajandoen moléculas recombinantes en eldiagnóstico de la fasciolosis animal.

El primer estudio que identificó y caracterizóuna enzima, la cisteín proteinasa de 27 kDa,purificada a partir de ejemplares adultos delparásito, se realizó en Japón. Esta proteínaluego fue usada como antígeno en unaprueba de ELISA, demostrando serreconocida por el 100% de los pacientes confasciolosis que fueron estudiados (Yamasakiet al., 1989). Esta proteasa estaríainvolucrada en la alimentación, migración yevasión de la respuesta inmune del parásito(Smooker et al., 2000).

En el año 1997, Córdova et al. , medianteinmunoelectroforesis identificó dosantígenos de F. hepatica, Fas 1 y Fas 2, lascuales presentaban actividad de cisteínproteinasa con diferente especificidadproteolítica. Es así como el mismo autor enel año 1999 elaboró un IgG ELISA usandocomo antígeno ambas cisteín proteinasas, de26 kDa (Fas 1) y otra de 25 kDa (Fas 2), lasque fueron obtenidas a partir de productos E-S del parásito, ambas fueron evaluadas consueros de 38 pacientes positivos afasciolosis obteniendo resultados desensibilidad y especificidad para Fas 1 de89% y 98%; y para Fas 2 de 95% y 100%, entanto que los valores predictivos positivo ynegativo para ambas fueron de 95% y 96%en el caso de Fas 1 y de 100% y 98% paraFas 2. Con esto se demuestra que IgG ELISAcon Fas 2 es altamente sensible y especificopara el inmunodiagnóstico de fasciolosis humana(Córdova et al., 1999).

O’ Neill et al. (1998) determinaron queCatepsina L1 (CL1), una cisteín proteinasasecretada por estadios adultos y juveniles deF. hepatica tiene un potencial como agentediagnóstico de la fasciolosis humana. Paraello realizaron un ELISA dentro de unapoblación de 95 pacientes en el AltiplanoBoliviano; usaron tres tipos de antígenos:crudo, E-S y CL1; en el caso del antígenocrudo la diferencia entre individuosseronegativos y seropositivos fuepobremente definida, en tanto con losantígenos E-S y CL1 hubo una grandiscriminación entre ambos grupos. Estadiferencia fue mejorada al usar un segundoELISA, pero sobre IgG4 (isotipopredominante en la infección), CL1

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identificó menos individuos seropositivos alcompararlo con E-S, pero mejoró mucho ladiscriminación entre individuosseropositivos y seronegativos. En tanto alaplicar esta prueba sobre sueros con otrasparasitosis, todos dieron resultadosnegativos, por lo que se demuestra queademás este IgG4 ELISA es especifico en eldiagnóstico de fasciolosis.

El mismo grupo de trabajo un año después,utilizó dos ELISA basados en la detección deIgG4, (en suero de pacientes fasciolósicos),producida por una Catepsina L1recombinante (CL1) (en cDNA deSaccharomyces cerevisiae) y una CatepsinaL1 nativa. Los resultados mostraron unasignificativa correlación estadística entre losresultados de los valores de absorbanciaobtenidos con los dos antígenos. Además, nose presentaron reacciones cruzadas con otrasparasitosis en ambos casos. Por esta razón,CL1 recombinante presenta un excelentepotencial para el desarrollo del primerensayo estandarizado para un diagnósticosensible y específico de la fasciolosishumana (O’Neill et al., 1999).

También han sido importantes los estudiosrespecto al tipo de respuesta inmunemontada por parte del hospedero, es asícomo Maher et al. (1999) utilizando 60sueros de pacientes egipcios positivos(mediante examen coproparasitario), midióla respuesta isotípica de anticuerpos contraantígeno crudo de gusanos adultos de F.hepatica. Los isotipos IgG1 e IgG 4 fueronencontrados en el 97-100% de los casos. Losanticuerpos IgM, IgA, IgG2 e IgG3 fueronmenos dominantes. En el caso de IgG1, estefue encontrado también en sueros de

pacientes infectados con otras parasitosiscomo Schistosoma, E. granulosus y otros; encambio IgG4 fue detectado exclusivamenteen sueros de pacientes con fasciolosis. Estolleva a la conclusión que el IgG4 ELISA conantígeno crudo de F. hepatica puede serusado para un correcto y sensibleinmunodiagnóstico de fasciolosis humana.

Finalmente a partir de la proteína CL1 seconfeccionaron péptidos sintéticos, a loscuales se les evaluó su potencial diagnósticomediante ELISA usando sueros de bovinosinfectados naturalmente, los valores desensibilidad y de especificidad fueron de98,9% y 99,8% respectivamente(Cornelissen et al.,2001).

El diagnóstico de rutina de la fasciolosisanimal se hace mediante un examencoprológico de sedimentación, que evalúa lapresencia de huevos en las heces. Comodesventaja este método no detectainfecciones prepatentes y tiene unasensibilidad de sólo el 72,5% en ovinos(Gorman et al., 1990) 76,6% en los porcinosy 83,3% en los equinos (Gorman et al.,1991b). Esto se debe a que el método solodetecta huevos a partir de los tres meses, porlo tanto no detecta infecciones agudas niprepatentes (Gorman et al., 1990). Ademáses una técnica que detecta menos positivoscuando la carga parasitaria es baja y cuandoexiste una eliminación de huevos en formaintermitente. El examen coprológico demoraalrededor de 20 minutos por muestra, lo quees mayor al tiempo empleado por muestracon técnicas serológicas (Gorman et al.,1991a).

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Otro procedimiento diagnóstico en ocasionesutilizado, pero inespecífico, es el estudio deenzimas celulares ya que el nivel de estasenzimas podrían dar una evidenciacircunstancial y no específica, sobre lapresencia de F. hepatica (Hawkins, 1984;Ferre et al., 1994). Estos parámetrosinespecíficos son el aumento de actividad delas enzimas hepáticas,Gammaglutamiltranspeptidasa (Gamma-GT), Lactato deshidrogenasa ( LDH),Aspartato amino transferasa (TGO)(Martínez, 1999), Sorbitol deshidrogenasa(Hawkins, 1984) correlacionándose suincremento con la intensidad de la infección(Leclipteux et al., 1998). También se hadetectado una eosinofilia moderada enpacientes con fasciolosis (Apt et al., 1995;Atias, 1991) y en infecciones experimentalesen ratas y ratones asociándose incluso, lamagnitud de la eosinofilia con la resistenciaa la reinfección (Hillyer, 1993).

Avanzar en la detección de la infección se haconvertido en un tema de interés, ya que sepodrían disminuir considerablemente lasperdidas económicas con un diagnósticotemprano y certero. Al detectar mástempranamente la infección se podría trataren forma precoz y así disminuir o evitar lacontaminación del medio ambiente(praderas) lo que siempre es más efectivoque hacer un tratamiento con fasciolasadultas en el canalículo biliar que ya estáneliminando huevos al medio ambiente(Rodríguez y Hillyer, 1995). Por lo tanto, aleliminar los parásitos juveniles antes de quealcancen su madurez sexual se impediría laeliminación de huevos y con esto se podríadisminuir la prevalencia de la enfermedad.

La detección de anticuerpos es claramente elmétodo de preferencia para elinmunodiagnóstico de la fasciolosis animal ynumerosas pruebas serológicas han sidoevaluadas para el diagnóstico de infeccionespor F. hepatica. Las pruebas deinmunoprecipitación, hemoaglutinaciónindirecta (HAI), inmunofluorescenciaindirecta (IFI) y pruebasinmunoenzimáticas, pueden ofrecer undiagnóstico temprano de la infección duranteel período prepatente (Mercado et al., 1985;Langley y Hillyer, 1989; Pfister, 1990). Sinembargo recientemente algunos autores hanestudiado un método inmunoenzimático tipo“sandwich” y ELISA, para el diagnóstico dela distomatosis, a través de la detección decoproantígenos específicos de E-S (Castro etal., 1994; Moustafa et al., 1998; Abdel-Rahman et al., 1999). También se hadetectado la presencia de antígenos ycomplejos inmunes circulantes, para loscuales se están desarrollando técnicasdiagnósticas como la mencionada(Rodriguez-Osorio et al., 1998). Al medirestos antígenos circulantes se obtiene, segúnalgunos autores, un mejor indicador de lainfección activa comparada con los niveles deanticuerpos, de tal forma de poder realizar unadecuado manejo clínico de la enfermedad(Rodriguez-Perez y Hillyer, 1995).

La técnica inmuno enzimática de ELISA,emplea el principio de la detección delcomplejo antígeno anticuerpo (IgG o IgM),mediante conjugados anti inmunoglobulinasespecie específicas marcadas con una enzimala cual es revelada por la adición de susustrato. Esto permite determinar laconcentración de antígeno o de anticuerpos,

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mediante el uso de uno de ellos unido a unafase sólida y el otro en solución. Es unatécnica relativamente sencilla que permiteprocesar un gran cantidad de muestras en uncorto período de tiempo, tanto para estudiosclínicos como seroepidemiológicos. Ladetección de anticuerpos mediante ELISA esampliamente utilizada para el diagnóstico deuna serie de enfermedades de interés enmedicina veterinaria y ha venido a resolveruna serie de limitantes de otras pruebasdiagnósticas. Los antígenos mayormenteempleados en ella, corresponden a preparadossomáticos o productos de E-S, provenientesde tremátodos adultos. El primero de elloscorresponde a un macerado total del parásitoadulto y el otro a un derivado metabólico invitro o productos de E-S de estados adultosde F. hepatica. (Espino et al., 1987; Pfister,1990).

Una prueba de ELISA puede detectar larespuesta inmune de corderos contra F.hepatica a partir de la segunda semana deinfección (Jemli et al, 1992). La sensibilidad yespecificidad encontradas en las especies deabasto de nuestro país, bordean los 60% y70% respectivamente. Se ha descrito ademásque existiría una asociación entre el númerode animales positivos y la carga parasitaria(Gorman et al., 1991a).

Se ha podido comprobar, que la calidad delantígeno en el rendimiento de estas pruebases esencial, dado que el empleo de unextracto crudo involucra una gran cantidadde determinantes antigénicos, tal vezcompartidos con otros parásitos causandoreacciones cruzadas o inespecíficas, algunosconservados en sus diferentes estados y otrosno. A esta complejidad se le ha denominado,

"mosaico antigénico" (Farrell et al., 1981).Diversas metodologías se han utilizado parasemipurificar productos de preparadossomáticos y de E-S de F. hepatica, desde elmás simple como la ultracentrifugación,hasta los más específicos como son loscromatográficos convencionales.

Una línea de investigación sobre lafasciolosis ha sido desarrollada en ellaboratorio de Parasitología de la Facultadde Ciencias Veterinarias y Pecuarias, de laUniversidad de Chile, por casi treinta años.Es así como en 1975 se inicia el estudio delpolimorfismo enzimático de F. hepatica(Alcaíno et al., 1976), ya en 1978, secomenzó a estudiar la fasciolosis en diversasespecies animales (Courtin et al., 1979;Gorman et al., 1979; 1980; Alcaíno et al.,1983a, b; Alcaíno y Aguilar, 1985; Alcaínoet al., 1988; Alcaíno et al., 1990). En 1989,se inició el estudio sobre la evaluación demétodos serodiagnósticos (Gorman et al.,1990; 1991a,b). Ellos han permitido revelarque los extractos parasitarios crudosestudiados mediante inmunoelectroforesis engeles de agarosa (inmunoprecipitación simpley cruzada) y luego analizados mediante SDS-PAGE, una composición antigénica de F.hepatica variada, siendo más complejos lospreparados de productos somáticos defasciolas adultas y de E-S, que los deejemplares juveniles. Esto se evidenció por laobservación de numerosas bandas y arcos deprecipitación en los geles de agarosa,correspondientes a complejos antígeno-anticuerpo (Gorman et al., 1992).

Empleando SDS-PAGE en condición dereducción, de los extractos somáticos y de E-Sde F. hepatica, se demostró una gran cantidad

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de bandas, las que luego de laelectrotransferencia y posterior revelado coninmuno sondas radio marcadas con I125 y conEITB, se determinó que varias fraccionesantigénicas eran promisorias para elinmunodiagnóstico de la etapa prepatente ypatente de la fasciolosis (Gorman et al., 1994,1995). Utilizando los productos de E-S delparásito y sueros en “pool” de animalesnaturalmente infectados, se encontraronpolipéptidos de interés diagnóstico, a partir delos 1,5 meses p.i., de 35-38 y 30-33 kDa. Alos 2 meses p.i. se detectaron dospolipéptidos de 26-28 y 19-22 kDa. Tambiénse identificaron algunos polipéptidosinespecíficos, detectados en sueros de ovinossin la infección y sueros de animales conotras parasitosis; tales como hidatidosis oThysanosoma actinioides (Gorman et al.,1995). Estos últimos por lo tanto, noconstituyen fracciones polipeptídicas deimportancia diagnóstica, debido a quereaccionaron en forma inespecífica o cruzadarespectivamente.

Así por ejemplo, en el caso del preparadoE-S, no se logró observar un polipéptido de12 kDa identificado y destacado, por surelevancia diagnóstica (Hillyer et al., 1988;Hillyer, 1995). En el caso del polipéptido de17 kDa, caracterizado como importantedesde el punto de vista diagnóstico, resultóser compartido con los otros parasitismosestudiados (Hillyer et al., 1987, 1990;Gorman et al., 1995).

Dada la facilidad de obtención del preparadoE-S y su menor "background" se recomiendasu uso para estudios en el área. Siendo deinterés en él los polipéptidos de 35-38; 30-33; 26-28 y 19-22 kDa, dada la sensibilidad,

especificidad y persistencia de ellos en eltiempo (Gorman et al., 1994; 1995). Sinembargo aún su complejidad influye enforma negativa en el rendimiento de laspruebas inmunodiagnósticas, por lasreacciones cruzadas o inespecíficasgeneradas por los determinantes antigénicoscompartidos con otras parasitosis (Farrell etal., 1981; Gorman et al., 1994, 1995). Es porello que la separación y purificación de estosantígenos parasitarios, surge como unaalternativa necesaria para aumentar losvalores de sensibilidad y especificidad de laspruebas diagnósticas. Por esta razón serealizaron ensayos de semipurificación deeste preparado mediante cromatografía, paraseparar por masa las fracciones que handemostrado una mayor sensibilidad yespecificidad, sin embargo cabe destacar quecada “peak” solo es medianamente resueltopor un efecto de traslape de curvas.

Desde el punto de vista diagnóstico medianteSDS-PAGE – Western Blot (WB),demostramos que las fraccionescromatográficas de 400, 150, 29 y menoresde 29 kDa, fueron las inmunorreactivos parala enfermedad en animales. La fraccióncromatográfica de 29 kDa mediante SDS-PAGE y WB, dio dos bandas dereconocimiento específico, una de 29-30 kDay otra de 14 kDa aprox, lo anterior enovinos, equinos, porcinos y bovinos(Gorman y col., 1997, 1998; Fredes y col.,1997). Con esta misma fracción, la prueba deELISA ofreció valores de sensibilidad yespecificidad mayores al 90%, valores queincluso se dieron al enfrentar esta fraccióncon sueros de ovinos en la etapa prepatentede la infección. Sin embargo, aunque con lafracción cromatográfica de 150 kDa los

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valores de sensibilidad y especificidad enpromedio fueron más bajos, esta no presentódiferencias diagnósticas, en la especie ovinay porcina, entre el examen postmortem y laprueba de ELISA (p<0,05) (Gorman et al.,1996; Fredes et al., 1997).

Gorman et al., en el año 2000, evaluaron eléxito terapéutico de una fracciónsemipurificada de menos de 30 kDa de F.hepatica , empleando para ello ELISA yEITB para el reconocimiento antigénico porparte de ovinos infectados. En dicho estudiose concluyó que a los 5 meses pos-tratamiento hubo total ausencia dereconocimiento de dicha fracción en losovinos tratados. Por lo tanto esta fracción demenos de 30 kDa contiene polipéptidos queofrecen un gran potencial para predecir eléxito terapéutico después de un tratamientofasciolicida.

En estudios más recientes, en nuestraFacultad de Veterinaria, se obtuvo lospolipéptidos, ya mencionados (29kDa y 14kDa), purificados por separado, mediante latécnica de electroelución, no utilizadaanteriormente en nuestro laboratorio. Serealizó una electroforesis en geles depoliacrilamida (SDS-PAGE) de un antígenode Excreción-Secreción (Ag. E-S) completode F. hepatica, donde se identificaron lospolipéptidos de interés; luego, se cortaronlos trozos de gel que los contenían. Alrealizar una electroelución de estos trozos, seobtuvo eluídos que contenían cadapolipéptido purificado por separado.Posteriormente se evaluó la eficienciadiagnóstica de los eluídos mediante WesternBlot, empleando sueros de ovinos detectores:un “pool” de sueros sin fasciolosis, 10 sueros

con fasciolosis en etapa prepatente, 30sueros con fasciolosis en etapa patente, 10sueros sin fasciolosis pero con otrasparasitosis. De esta manera, se obtuvo parael polipéptido de alrededor de 14 kDa,valores de sensibilidad y especificidad de 95y 100%, respectivamente, mientras que parael polipéptido de alrededor de 29 kDa, estosvalores fueron de 97,5 y 100%,respectivamente. En ambos casos se logróaltos valores predictivos. Además, seencontraron los valores de sensibilidad paraambas etapas de infección. En la faseprepatente se obtuvo una sensibilidad de 80y 100% para los polipéptidos de alrededor de14 y 29 kDa, respectivamente, mientras quecon sueros en etapa patente de infecciónestos valores fueron de 100 y 97%,respectivamente (Sánchez, 2000 Fredes etal., 2001).

Al comparar estos resultados con losobtenidos en WB realizados con fraccionescromatográficas semipurificadas, se observaque la eficiencia diagnóstica mejora alutilizar los polipéptidos purificados. Latécnica de electroelución resultó ser un buenaporte, al ser fácil de implementar yaltamente eficiente en la obtención deeluídos purificados. Finalmente, de esteestudio fue posible concluir que lospolipéptidos purificados de alrededor de 14 y29 kDa, y en especial este último,representan una buena alternativa para eldesarrollo de una prueba inmunodiagnósticade campo (Sánchez, 2000 Fredes y col.,2001). Estas mismas proteínas fueron evaluadas porseparado, pero ahora mediante una técnicade ELISA utilizando para ello sueros de

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ovinos con fasciolosis, sueros de ovinos sinfasciolosis y sueros de ovinos con otrasparasitosis. Así con la proteína de 14 kDatuvo una sensibilidad baja de un 60% y unaespecificidad del 100 %, mientras que suvalor predictivo positivo fue de un 100% yel negativo de 77%. Los valores desensibilidad y especificidad obtenidos para laproteína de 29 kDa fueron de un 94% y 98%respectivamente, mientras que el valorpredictivo positivo fue de un 97% y elnegativo de un 96%. Finalmente, se pudoconcluir que la proteína de 14 kDa nomostró ser útil en el inmunodiagnóstico de

esta enfermedad mediante ELISA. Encambio la proteína de 29 kDa, debido a susaltos valores de sensibilidad y especificidad,puede ser utilizada en el inmunodiagnósticode la fasciolosis animal mediante la técnicade ELISA. (Fredes et al., 2003).

En nuestro país, aún no se cuenta con unantígeno recombinante, que permitiría por unlado no depender del parásito para suobtención y lo más importante mejorar,fundamentalmente, los valores desensibilidad de la prueba de ELISA.

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1 2 3 4 5

ffm

SDS-PAGE (12%) del electroeluídoSDS-PAGE (12%) del electroeluídode la proteína dede la proteína de 29 kDa. Carril 1:29 kDa. Carril 1:(PM): Peso(PM): Peso molecular estandar (SDS-molecular estandar (SDS-7 Sigma); otros carriles eluídos.7 Sigma); otros carriles eluídos.


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Recibido 07/nov/2004Aceptado 26/nov/2004Editor Responsable Adolfo Godoy

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