MOLEKULAacuteRNE METOacuteDY AKTUAacuteLNE POUŽIacuteVANEacute V KLINICKEJ GENETIKE RNDr Andrea Pastoraacutekovaacute PhD RNDr Robert Petrovič PhD 2016 Univerzita Komenskeacuteho v Bratislave Lekaacuterska fakulta

MOLEKULAacuteRNE METOacuteDY AKTUAacuteLNE POUŽIacuteVANEacute V KLINICKEJ GENETIKE Vysokoškolskaacute učebnica pre pregraduaacutelne a postgraduaacutelne štuacutedium na lekaacuterskych fakultaacutech RNDr Andrea Pastoraacutekovaacute PhD RNDr Robert Petrovič PhD Univerzita Komenskeacuteho v Bratislave Lekaacuterska fakulta

copy RNDr Andrea Pastoraacutekovaacute PhD a RNDr Robert Petrovič PhD Univerzita Komenskeacuteho v Bratislave Lekaacuterska fakulta 2016 Recenzenti prof RNDr Vanda Repiskaacute PhD doc MUDr Jaacuten Chandoga CSc Všetky praacuteva vyhradeneacute Toto dielo ani žiadnu jeho časť nemožno reprodukovať ukladať do informačnyacutech systeacutemov alebo inak rozširovať bez piacutesomneacuteho suacutehlasu majiteľov autorskyacutech praacutev ISBN 978-80-223-4231-5

2

Obsah Predhovor 3 1 Izolaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten 4 11 Izolaacutecia DNA 4 12 Izolaacutecia RNA 5 2 Stanovenie kvantity a kvality nukleovyacutech kyseliacuten 8 21 Spektrofotometrickaacute kvantifikaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten 8 22 Kvantifikaacutecia s použitiacutem fluorescenčnyacutech farbiacutev 8 221 Využitie migraacutecie nukleovej kyseliny v geacuteli s jej naacuteslednou fluorescenčnou

detekciou 8

222 Využitie kvantifikaacutecie množstva nukleovyacutech kyseliacuten použitiacutem real-time PCR metoacutedy

9

223 Kvantifikaacutecia fluorospektrofotometrom (fluorimetrom) 9 3 PCR (polymeraacutezovaacute reťazovaacute reakcia) 11 31 Najdocircležitejšie PCR komponenty 11 32 Variaacutecie PCR 13 33 Kvantitatiacutevna PCR (qPCR) 16 331 Kvantifikaacutecia pomocou qPCR 18 332 Určenie genotypu metoacutedou alelovej diskriminaacutecie a analyacutezou krivky topenia

(HRM)

20 4 Elektroforetickaacute separaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten 23 41 Vizualizaacutecia DNA 25 42 RFLP 25 43 VNTR a STR 27 5 MLPA 29 6 Sekvenovanie 33 61 Chemickaacute metoacuteda 33 62 Sangerova metoacuteda 33 63 Next Generation Sequencing (NGS) 35 631 Sekvenovanie druhej generaacutecie 35 632 Sekvenovanie tretej generaacutecie 36 7 Fragmentačnaacute analyacuteza DNA 37 8 Metoacutedy založeneacute na princiacutepe hybridizaacutecie 39 81 Southern blot 39 82 FISH (fluorescent in situ hybridization) 40 83 DNA Microarray (DNA mikročip biočip) 47

3

Predhovor

Genetika prekonala v poslednyacutech desaťročiach obrovskyacute pokrok Začiatok predstavoval zavedenie cytogenetickyacutech metoacuted pokračovanie v podobe osekvenovania celeacuteho ľudskeacuteho genoacutemu čo viedlo v suacutečasnosti k možnosti masiacutevneho paralelneacuteho sekvenovania jednotlivcov metoacutedou sekvenovania novej generaacutecie veduacuteceho k ziacuteskaniu raacutedovo tisiacutecov až milioacutenov sekvenciiacute naraz Cieľ ako aj spocircsob spracovania predloženeacuteho textu je zameranyacute na potreby pregraduaacutelneho a postgraduaacutelneho štuacutedia mediciacutenskej komunity Noveacute laboratoacuterne metoacutedy priacutestrojoveacute vybavenie a predovšetkyacutem molekulaacuterno-genetickyacute pokrok sa preniesol do mediciacutenskej praxe s prenikaniacutem do takmer všetkyacutech mediciacutenskych špecializaacuteciiacute Preto je nevyhnutneacute aby si študenti a lekaacuteri tieto noveacute poznatky a trendy osvojili a naacutesledne ich dokaacutezali využiacutevať v klinickej praxi Publikaacutecia sumarizuje a vysvetľuje molekulaacuterno-genetickeacute metoacutedy ktoreacute suacute v suacutečasnosti využiacutevaneacute za uacutečelom genetickej diagnostiky

Autori

4

1 Izolaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten 11 Izolaacutecia DNA

Prvuacute izolaacuteciu DNA uskutočnil v roku 1869 švajčiarsky vedec Friedrich Miescher Izolaacutecia DNA je kľuacutečovyacutem krokom pre množstvo naacuteslednyacutech aplikaacutecii v oblasti molekulovej bioloacutegie a lekaacuterskej genetiky Najčastejšiacutem a najdostupnejšiacutem materiaacutelom vhodnyacutem na izolaacuteciu ľudskej genoacutemovej DNA suacute leukocyty krvi DNA je možneacute ziacuteskať aj z inyacutech tkaniacutev a telesnyacutech tekutiacuten ako suacute napriacuteklad svaly koža kosti zuby sperma sliny moč plodovaacute voda atď Metoacuted izolaacutecie genoacutemovej DNA je viacero Vyacuteber zaacutevisiacute od technickeacuteho vybavenia laboratoacuteria časovyacutech a finančnyacutech možnostiacute ako aj od materiaacutelu z ktoreacuteho sa DNA izoluje od podmienok jej uskladnenia a od množstva potrebneacuteho na analyacutezu Najviac využiacutevanyacutem zdrojom DNA je perifeacuterna krv preto sa zameriame na extrakčneacute protokoly z tohto materiaacutelu Existujuacute viacereacute metoacutedy na izolaacuteciu DNA ktoreacute majuacute však spoločneacute kroky

1) rozrušenie bunkovej membraacuteny a lyacuteza buniek 2) denaturaacutecia nukleoproteiacutenoveacuteho komplexu 3) inaktivaacutecia nukleaacutez a ďalšiacutech bunkovyacutech enzyacutemov 4) DNA precipitaacutecia

Lyacuteza buniek sa dosahuje použitiacutem detergentov a enzyacutemov Sodnaacute soľ dodecylsulfaacutetu (SDS) TritonTMX-100 suacute priacuteklady bežnyacutech detergentov solubilizujuacutecich bunkovuacute membraacutenu Spolu k detergentom sa často pridaacutevajuacute enzyacutemy a to za uacutečelom štiepenia glykoproteiacutenov a inaktivaacutecie DNaacutez Bunkoveacute DNaacutezy suacute enzyacutemy ktoreacute štiepia DNA a tyacutem znehodnocujuacute a znižujuacute vyacuteťažok a kvalitu nukleovyacutech kyseliacuten

Precipitaacutecia DNA z roztoku prebieha pridaniacutem vysokej koncentraacutecie soli (napr octan amoacutenny) a za priacutetomnosti rozpuacutešťadiel (napr etanol v konečnej koncentraacutecii 70-80 alebo izopropanol v konečnej koncentraacutecii 40-50)

Niektoreacute protokoly pokračujuacute premytiacutem DNA precipitaacutetu 70 etanolom čiacutem docircjde k zbaveniu sa nadbytočnyacutech soliacute Nakoniec sa DNA rozpustiacute vo vode alebo v pufri napr TE (pozostaacutevajuacutecom z 10mM Tris 1mM EDTA-kyselina etyleacutendiamintetraoctovaacute) TE pufor sa použiacuteva pre dlhodobeacute uskladnenie DNA pretože zabraňuje degradaacutecii DNA nukleaacutezami nevhodnyacutem pH ťažkyacutemi kovmi a oxidaacuteciou voľnyacutemi radikaacutelmi Tris udržiava vhodneacute pH 7-8 a EDTA viaže dvojmocneacute ioacuteny (ako Mg2+ a Ca2+ ktoreacute suacute potrebneacute pre funkciu DNaacutez) ako aj braacuteni oxidačneacutemu poškodeniu ťažkyacutemi kovmi

Postupov izolaacutecie DNA je viacero vyacuteber zaacutevisiacute od naacutesledneacuteho použitia naacuterokov na kvantitu a kvalitu technickeacuteho vybavenia laboratoacuteria a potreby uskladnenia pre buduacutece použitie Suacute to najmauml

1) Priacuteprava a použitie hrubeacuteho lyzaacutetu kde je priacutetomnaacute DNA Taacuteto bdquoryacutechla a špinavaacuteldquo metoacuteda pozostaacuteva z lyacutezy buniek pri vysokej teplote (90degC 20minuacutet) alebo je uskutočnenaacute proteinaacutezou K Lyzaacutet sa použije priamo v ďalšiacutech aplikaacuteciaacutech Priacutetomnosť kontaminantov v lyzaacutete obmedzuje jeho použitie ako aj skladovanie DNA 2) Vysoľovacie metoacutedy začiacutenajuacute priacutepravou hrubeacuteho lyzaacutetu pokračujuacute tzv vysoľovaniacutem kedy sa proteiacuteny a ineacute kontaminanty precipitujuacute pri vysokej koncentraacutecii soli (octan draselnyacute octan amoacutenny) precipitaacutet je eliminovanyacute centrifugaacuteciou a DNA sa ziacuteskava z roztoku naacuteslednou alkoholovou precipitaacuteciou Vyacuteťažok DNA a jej čistota variacuteruje podľa použitej metodiky 3) Organickaacute extrakcia využiacuteva organickeacute rozpuacutešťadlaacute na odstraacutenenie kontaminantov z bunkoveacuteho lyzaacutetu Bunky suacute lyzovaneacute použitiacutem detergentov lyzaacutet sa zmieša so zmesou fenolu chloroformu a izoamylalkoholu Centrifugaacuteciou zmesi sa docieli oddelenie dvoch vrstiev organickej vrstvy (faacutezy) obsahujuacutecej kontaminanty a vodnej vrstvy (faacutezy) s DNA Zo ziacuteskanej vodnej faacutezy sa DNA izoluje najčastejšie alkoholovou precipitaacuteciou Organickaacute extrakcia bola veľmi využiacutevanaacute v laboratoacuteriaacutech v minulosti v suacutečasnosti je maacutelo použiacutevanaacute na rutinnuacute diagnostiku jednak pretože je časovo naacuteročnaacute

5

DNA mocircže obsahovať fenolchloroform ktoreacute inhibujuacute enzymatickeacute reakcie a taacuteto metoacuteda nie je vhodnaacute ani na izolaacuteciu v automatoch 4) Centrifugaacutecia v gradiente chloridu ceacutezneho (CsCl) umožňuje ziacuteskať genoacutemovuacute DNA vysokej kvality avšak taacuteto metoacuteda je časovo naacuteročnaacute praacutecna drahaacute (potrebnaacute ultracentrifuacutega) a nepoužiteľnaacute v automatoch nie je rutinne využiacutevanaacute Bunkovyacute lyzaacutet je precipitovanyacute alkoholom DNA roztok je zmiešanyacute s CsCl a etiacutediumbromidom nasleduje niekoľkohodinovaacute centrifugaacutecia v ultracentrifuacutege DNA je viditeľnaacute v podobe pruacutežku po jej odobratiacute sa extrahuje izopropanolom aby došlo k odstraacuteneniu etiacutediumbromidu a precipituje sa etanolom 5) Minikoloacutenovaacute (koloacutenkovaacute) purifikaacutecia využiacuteva schopnosť materiaacutelu v minikoloacutene (matrix matrica) adsorbovať DNA za určityacutech konkreacutetnych podmienok pH a koncentraacutecie soli (obr 1) Existujuacute viacereacute typy materiaacutelov viažucich DNA ktoreacute suacute na uacutečely izolaacutecie DNA umiestneneacute v minikoloacutene hydrofilneacute matrice viažuce vodiacutek v priacutetomnosti chaotropnyacutech činidiel matrice využiacutevajuacutece vyacutemenu ioacutenov (ioacutenomeničoveacute) matrice s určitou afinitou a veľkostnou selekciou

Vaumlčšina minikoloacutenovyacutech metoacuted maacute podobnyacute postup na začiatku prebehne lyacuteza buniek potom nasleduje DNA adsorbcia na matricu centrifugovateľnyacutech minikoloacuten premytie nukleovej kyseliny adsorbovanej na matricu v minikoloacutene čiacutem docircjde k zbaveniu sa kontaminantov a finaacutelna eluacutecia (uvoľnenie) DNA

Kremičitanoveacute (SiO2 Silika) matrice majuacute vynikajuacutecu schopnosť viazať DNA pretože suacute kladne nabiteacute a majuacute vysokuacute afinitu k negatiacutevne nabitej DNA V prostrediacute vysokej koncentraacutecie chaotropnyacutech soliacute docircjde k adsorpcii DNA na kremičitanovuacute matricu (silica geacutel) zatiaľ čo bunkoveacute proteiacuteny a ineacute metabolity zostanuacute v roztoku a naacutesledne suacute vymyteacute z koloacuteny DNA vhodnaacute na diagnostickeacute použitie je ziacuteskanaacute eluacuteciou zo silika matrice použitiacutem pufra s niacutezkou koncentraacuteciou soliacute (TE destilovanaacute voda) Existuje množstvo komerčne priacutestupnyacutech kitov (suacuteprav) ktoreacute obsahujuacute všetky potrebneacute chemikaacutelie a minikoloacuteny Izolaacutecia DNA prostredniacutectvom kitu založenom na silika materiaacuteli trvaacute od 40-60minuacutet pričom sa ziacuteska vysokokvalitnaacute DNA vo vysokom vyacuteťažku Dnes suacute k dispoziacutecii kity vhodneacute na poloautomatizovanuacute alebo plnoautomatizovanuacute izolaacuteciu DNA (obr 3)

Ďalšou možnosťou je použiť DNA izolačnyacute kit využiacutevajuacuteci magnetickeacute guľocircčky ktoreacute suacute pokryteacute materiaacutelom viažucim DNA (polymeacutery silika hydroxyapatit) DNA sa naviaže na magnetickeacute guľocircčky a prostredniacutectvom magnetickej sily magnetu je možneacute premyacutevať naviazanuacute DNA V tomto priacutepade nie je potrebneacute použiť centrifugaacuteciu

Obr 1 Minikoloacutena a postup izolaacutecie DNA

12 Izolaacutecia RNA

Ziacuteskanie RNA vysokej kvality je prvyacutem a často najkritickejšiacutem krokom pre molekulaacuterne techniky typu kvantifikaacutecie expresie určiteacuteho geacutenu metoacutedou real-time PCR (RT-qPCR) analyacutezy transkriptoacutemu sekvenovanovaniacutem ďalšej generaacutecie (NGS) analyacutezy RNA profilu mikročipmi northern analyacutezy a konštrukcie cDNA knižnice Pre dosiahnutie čo najcitlivejšiacutech a biologicky

6

najrelevantnejšiacutech vyacutesledkov je potrebneacute dodržať pracovneacute postupy pred počas a po RNA purifikaacutecii Pre optimalizaacuteciu RNA izolaacutecie a analyacutezy suacute docircležiteacute nasledovneacute kroky 1) manipulaacutecia so vzorkami určenyacutemi na RNA izolaacuteciu 2) vyacuteber metoacutedy izolaacutecie RNA 3) uskladnenie RNA

Klasickaacute izolaacutecia RNA prebieha vaumlčšinou v priacutetomnosti inhibiacutetorov ribonukleaacutez Ribonukleaacutezy (RNaacutezy) suacute bunkoveacute enzyacutemy degradujuacutece RNA Inhibiacutetory RNaacutez suacute silneacute denaturanty ktoreacute vo vzorke znižujuacute riziko RNA degradaacutecie (napr guanidiacutenoveacute soli dodecylsufaacutet sodnyacute - SDS chemikaacutelie obsahujuacutece fenol)

Pred vlastnou izolaacuteciou RNA je potrebneacute sterilizovať všetok materiaacutel (skuacutemavky špičky pipety vodu laboratoacuterny priestor) (obr 2) ktoryacute bude v kontakte so vzorkou určenou na izolaacuteciu RNA Kyacutem sa vzorka začne spracovaacutevať udržiava sa v tekutom dusiacuteku na suchom ľade alebo je vloženaacute do špeciaacutelnych stabilizačnyacutech roztokov (napr RNAlaterreg) alebo špeciaacutelnych skuacutemaviek so stabilizačnyacutem roztokom napr PAXgenereg Blood RNA Tube

Existuje niekoľko spocircsobov izolaacutecie RNA

1) Organickaacute extrakčnaacute metoacuteda je zlatyacutem štandardom izolaacutecie RNA Na začiatku izolaacutecie sa vzorka homogenizuje v roztoku obsahujuacutecom fenol (TRIzolreg RNAzolreg RT) naacutesledne sa centrifuguje Počas centrifugaacutecie dochaacutedza vo vzorke k separaacutecii troch vrstiev spodnej organickej faacutezy strednej faacutezy obsahujuacutecej denaturovaneacute proteiacuteny a genoacutemovuacute DNA a vrchnej vodnej faacutezy s RNA Po odobratiacute vrchnej faacutezy sa RNA z nej precipituje (vyzraacuteža) alkoholom a naacutesledne sa rehydratuje 2) Minikoloacutenovaacute metoacuteda (filtračnaacute) využiacuteva membraacuteny (zo sklenyacutech vlaacutekien silika alebo ioacutenomeničoveacute membraacuteny) vloženeacute do minikoloacuten Vzorka je lyzovanaacute v pufri obsahujuacutecom RNaacutezoveacute inhibiacutetory nukleoveacute kyseliny sa naviažu na membraacutenu keď lyzaacutet prechaacutedza membraacutenou počas centrifugaacutecie Membraacutena s naviazanou RNA je viackraacutet premyacutevanaacute RNA sa ziacuteska centrifugaacuteciou do novej skuacutemavky po eluacutecii vhodnyacutem elučnyacutem roztokom 3) Metoacuteda využiacutevajuacuteca magnetickeacute partikuly obsahujuacutece paramagnetickeacute vnuacutetro obklopeneacute obalom modifikovanyacutem tak aby viazal žiaduci objekt teda RNA Vzorka lyzovanaacute v roztoku obsahujuacutecom RNaacutezoveacute inhibiacutetory sa zmieša s magnetickyacutemi partikulami kedy docircjde k naviazaniu RNA na povrch magnetickyacutech partikuacutel Opakovanyacutem použitiacutem externeacuteho magnetickeacuteho poľa je možneacute vychytať magnetickeacute partikuly s naviazanou nukleovou kyselinou odstraacuteneniacutem magnetickeacuteho poľa zase uvoľniť a resupendovať v premyacutevaciacutech roztokoch Na zaacutever sa RNA uvoľniacute do elučneacuteho roztoku a magnetickeacute partikuly sa odstraacutenia 4) Priama lyacuteza sa použiacuteva na priacutepravu vzorky použitiacutem lyzačnyacutech roztokov ktoreacute lyzujuacute vzorku stabilizujuacute nukleoveacute kyseliny a takto pripravenaacute RNA mocircže byť použitaacute na ďalšie analyacutezy Priama lyacuteza teda nie je purifikačnaacute metoacuteda v pravom zmysle slova

Ziacuteskanuacute RNA je potrebneacute kvantifikova ť Ide o docircležityacute a nevyhnutnyacute krok ktoryacute predchaacutedza RNA analyacutezu Existujuacute viacereacute možnosti kvantifikaacutecie nukleovyacutech kyseliacuten ktoryacutem je venovanaacute samostatnaacute časť

Skladovanie RNA - RNA musiacute byť resuspendovanaacute resp eluovanaacute v roztoku bez RNaacutez na tento uacutečel suacute komerčne dostupneacute viacereacute roztoky na skladovanie RNA zabezpečujuacutece maximaacutelnu ochranu pred RNaacutezami RNA sa odporuacuteča skladovať pri teplote ndash 80degC v alikvoacutetoch (rozpipetovanaacute v menšiacutech množstvaacutech v mikroskuacutemavkaacutech) určenyacutech na jedno použitie

7

Obr 2 Laminaacuterny box na izolaacuteciu nukleovyacutech kyseliacuten praacutecu s DNA RNA atď Obr 3 Automatickyacute pipetovaciacute robot napr na izolaacuteciu 96 vzoriek DNA

8

2 Stanovenie kvantity a kvality nukleovyacutech kyseliacuten

Docircležiteacute je určenie koncentraacutecie a čistoty izolovanej DNA a RNA pretože analyacutezy ktoreacute nasledujuacute po izolaacutecii nukleovyacutech kyseliacuten často vyžadujuacute presneacute množstvo a čistotu nukleovyacutech kyseliacuten (NK bez priacutemesiacute) Metoacuted kvantifikaacutecie NK je niekoľko najpoužiacutevanejšie suacute spektrofotometrickaacute kvantifikaacutecia a kvantifikaacutecia UV fluorescenciou za priacutetomnosti farbičky

21 Spektrofotometrickaacute kvantifikaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten

Nukleoveacute kyseliny špecificky absorbujuacute ultrafialoveacute svetlo Vzorka s NK je v spektrofotometri (obr 6) vystavenaacute ultrafialoveacutemu svetlu o vlnovej dĺžke 260nm fotodetektor naacutesledne zmeria svetlo ktoreacute prejde vzorkou čiacutem viac svetla vzorka pohltiacute (absorbuje) tyacutem je vyššia koncentraacutecia nukleovej kyseliny vo vzorke Vyacutepočet koncentraacutecie NK zaacutevisiacute od toho či ide o DNA alebo RNA či je jednovlaacuteknovaacute alebo dvojvlaacuteknovaacute dsDNA c = A260002 [microgml] ssDNA c = A2600027 [microgml] RNA c = A2600025 [microgml]

Teda ak absorbancia dsDNA je 1 koncentraacutecia DNA vo vzorke je 50 microgml (pozn v priacutepade ak je draacuteha luacuteča 1cm)

Pokiaľ poznaacuteme sekvenciu napr pri synteacuteze primeru (ssDNA) mocircžeme z nej vypočiacutetať molekulovuacute hmotnosť a určiť priamo molaacuternu koncentraacuteciu nukleovej kyseliny (pmolmicrol) c = A260 lowast (100[15A + 071lowastC + 12lowastG + 084lowastT]) [pmolmicrol] A je počet adeniacutenov (v skutočnosti dATP) C je počet cytoziacutenov (dCTP) G je počet guaniacutenov (dGTP) a T počet tymiacutenov (dTTP)

Predpokladom pre spraacutevne určenie koncentraacutecie na zaacuteklade absorbancie je samozrejme čistota nukleovej kyseliny vo vzorke Čistota NK sa určuje podľa absorbčnej krivky popriacutepade zjednodušene na zaacuteklade pomeru absorbanciiacute pri 260 a 280 nm pretože proteiacuteny absorbujuacute svetlo vlnovej dĺžky 280nm Čistaacute DNA maacute pomer absorbanciiacute 260280 (A260280) pohybujuacutece sa okolo 18 čistaacute RNA maacute pomer absorbancii A260280 približne 2

Vzorku nukleovyacutech kyseliacuten mocircžu okrem proteiacutenov kontaminovať aj ďalšie laacutetky ako je fenol ktoryacute sa často využiacuteva pri izolaacutecii NK Takto izolovaneacute vzorky nukleovyacutech kyseliacuten nekontaminovaneacute fenolom by mali mať A260280 okolo 2 Ďalšie kontaminanty sa zisťujuacute absorbciou svetla pri 230 nm a 330 nm

22 Kvantifikaacutecia s použitiacutem fluorescenčnyacutech farbiacutev

Ďalšou možnosťou ako zmerať koncentraacuteciu nukleovyacutech kyseliacuten je zmeranie fluorescencie farbiva (napr etidiumbromid) ktoreacute sa viaže na nukleovuacute kyselinu a selektiacutevne svieti v priacutepade že je naviazaneacute na NK Metoacuteda využitia fluorescenčneacuteho farbiva naviazaneacuteho na NK sa použiacuteva v priacutepade ak je koncentraacutecia NK priacuteliš niacutezka na kvantifikaacuteciu spektrofotometrom ako aj v priacutepade že je NK kontaminovanaacute laacutetkou (kontaminantom) absorbujuacutecim svetlo vlnovej dĺžky 260nm 221 Využitie migraacutecie nukleovej kyseliny v geacuteli s jej naacuteslednou fluorescenčnou detekciou

Ak predpokladaacuteme niacutezku koncentraacuteciu NK na jej zistenie použijeme elektroforetickuacute

migraacuteciu NK v geacuteli (mocircže sa použiť agaroacutezovyacute alebo polyakrylamidovyacute geacutel) fluorescenčneacute farbivo je buď primiešaneacute do vzorky NK alebo priamo do geacutelu Spolu so vzorkou NK neznaacutemej koncentraacutecie migruje v geacuteli vo vedľajšej draacutehe vzorka NK so znaacutemou koncentraacuteciou Na zaacuteklade porovnania fluorescencie (po vystaveniacute geacutelu s NK svetlu o konkreacutetnej vlnovej dĺžke) vzorky so znaacutemou

9

koncentraacuteciu a vzorky neznaacutemej koncentraacutecie sa urobiacute odhad resp sa vyacutesledok kalkuluje počiacutetačovyacutem softveacuterom denzitometricky (obr 4)

222 Využitie kvantifikaacutecie množstva nukleovyacutech kyseliacuten použitiacutem real-time PCR metoacutedy

V priacutepade veľmi maleacuteho množstva NK ktoreacute nie je možneacute kvantifikovať ani geacutelovou elektroforeacutezou resp potrebujeme zistiť koncentraacuteciu NK veľmi presne u maleacuteho množstva NK (napr pre kriminalistiku) použije sa metoacuteda absoluacutetnej kvantifikaacutecie prostredniacutectvom real-time PCR (kvantifika čnej PCR qPCR) Princiacutep metoacutedy spočiacuteva v porovnaniacute amplifikaacutecie určiteacuteho uacuteseku nukleovej kyseliny vo vzorke neznaacutemej koncentraacutecii s amplifikaacuteciou tej istej sekvencie vo vzorke presne definovanej koncentraacutecie (obr 5) qPCR je možneacute kvantifikovať koncentraacuteciu raacutedovo v pgul 223 Kvantifikaacutecia fluorospektrofotometrom (fluori metrom)

Ak maacuteme dostatočneacute množstvo vzorky je možneacute na kvantifikaacuteciu použiť fluorospektrofotometer v tomto priacutepade je vzorka zmiešanaacute s fluorescenčnyacutem farbivom a je meranaacute emitovanaacute fluorescencia z ktorej sa vypočiacuteta koncentraacutecia

Moderneacute spektrofotometre a fluorimetre suacute konštruovaneacute tak aby na meranie bolo použiteacute minimaacutelne množstvo vzorky NK (napr pre priacutestroje NanoDrop je potrebnyacute len 05-1 microl vzorky) Pre porovnanie NanoDrop spektrofotometer (NanoDrop 2000c) je schopnyacute zmerať koncentraacutecie od 04 to 15 000 ngmicroL dsDNA NanoDrop fluorospektrometer 005 do 2000 pgmicroL Spektrofotometre a fluorofotometre suacute po meraniacute schopneacute vďaka softveacuteroveacutemu vybaveniu vypočiacutetať nielen koncentraacuteciu ale aj čistotu vzorky (httpwwwnanodropcom) Obr 4 Kvantifikaacutecia nukleovej kyseliny porovnaniacutem s fragmentom podobnej dĺžky a znaacutemej koncentraacutecie (po migraacutecii v agaroacutezovom geacuteli v jednosmernom elektrickom pruacutede a naacuteslednej fluorescenčnej detekcii) - odhad DNA v 3 draacutehe cca 100ng porovnaniacutem s 1000bp fragmentom štandardu molekulovyacutech hmotnostiacute (šmh)

10

Obr 5 Absoluacutetna kvantifikaacutecia DNA priacutestrojom real-time PCR cykleacuterom porovnaniacutem amplifikaacutecie uacuteseku DNA v skuacutemanej vzorke s amplifikaacuteciou vzorky so znaacutemou kvantitou Okrem amplifikaacutecie skuacutemanej vzorky je treba urobiť štandardnuacute krivku amplifikaacutecie vzorky znaacutemej koncentraacutecie z ktorej sa koncentraacutecia skuacutemanej vzorky odčiacuteta V kriminalistike sa bežne použiacuteva pridanie vnuacutetornej kontroly ku vzorke na určenie čistoty vzorky (v priacutetomnosti inhibiacutetorov nedocircjde k amplifikaacutecii žiadnej DNA) Vnuacutetornaacute kontrola je už priacutetomnaacute v kite čiže sa automaticky pridaacuteva pri priacuteprave vzoriek na qPCR amplifikaacuteciu sluacuteži na zistenie priacutetomnosti inhibiacutetorov v skuacutemanej vzorke teda v priacutepade že nedocircjde k amplifikaacutecii vo vzorke sluacuteži na rozliacutešenie či je koncentraacutecia DNA priacuteliš niacutezka alebo suacute vo vzorke priacutetomneacute inhibiacutetory Bežnaacute mediciacutenska molekulaacuterno-genetickaacute diagnostika nevyžaduje priacutetomnosť vnuacutetornej kontroly keďže nukleoveacute kyseliny suacute prevažne izolovaneacute kitmi z krvi čiže je zabezpečenaacute vysokaacute kvalita a čistota naizolovanej NK Obr 6 Spektrofotometer (NanoPhotometer) a ukaacutežka vyacutesledkou merania koncentraacutecie RNA izolovanej minikolonovou metoacutedou

11

3 PCR (polymeraacutezovaacute reťazovaacute reakcia)

Je metoacuteda vyvinutaacute v roku 1983 Karym Mullisom ocenenaacute v roku 1993 Nobelovou cenou za cheacutemiu Polymeraacutezovaacute reťazovaacute reakcia je založenaacute na schopnosti DNA polymeraacutezy syntetizovať noveacute vlaacutekno DNA podľa templaacutetoveacuteho vlaacutekna na zaacuteklade princiacutepu komplementarity DNA polymeraacuteza je schopnaacute pripaacutejať nukleotidy len k voľnej 3acuteOH skupine preto potrebuje primer (čiacutetaj prajmer) ku ktoreacutemu je schopnaacute pridaacutevať nukleotidy Primery suacute kraacutetke jednovlaacuteknoveacute oligonukleotidy ktoreacute umožňujuacute jednak DNA polymeraacuteze začať so synteacutezou noveacuteho vlaacutekna na druhej strane ohraničujuacute špecifickuacute oblasť ktoruacute chceme amplifikovať (namnožiť) Vyacutesledkom PCR reakcie je obrovskyacute počet koacutepii špecifickej sekvencie (obr 7) PCR v podstate napodobňuje replikaacuteciu DNA v in vitro podmienkach s rozdielom že nedochaacutedza k replikaacutecii celej DNA ale len vybraneacuteho primermi ohraničeneacuteho miesta

31 Najdocircležitejšie PCR komponenty

Templaacutetovaacute DNA je vzorka DNA obsahujuacuteca cieľovuacute sekvenciu Na začiatku reakcie docircjde pri vysokej teplote k denaturaacutecii a separaacutecii jednotlivyacutech vlaacutekien dvojvlaacuteknovej DNA

Enzyacutem DNA polymeraacuteza syntetizuje noveacute DNA vlaacutekno komplementaacuterne k cieľovej sekvencii Najčastejšie použiacutevanou a prvou DNA polymeraacutezou je Taq DNA polymeraacuteza (z termofilnej bakteacuterie Thermus aquaticus) zatiaľ čo Pfu DNA polymeraacuteza (z Pyrococcus furiosus) je preferovanaacute kvocircli tzv vysokej fidelite čo je schopnosť inkorporovať spraacutevnu baacutezu do novosyntetizovaneacuteho vlaacutekna DNA DNA polymeraacutezy musia mať dve vlastnosti schopnosť syntetizovať noveacute vlaacutekno DNA podľa templaacutetovej DNA a byť termostabilneacute čiže rezistentneacute na vysokeacute teploty (cca 100degC) V suacutečasnosti sa v laboratoacuteriaacutech často použiacutevajuacute rekombinantneacute polymeraacutezy s požadovanyacutemi vlastnosťami Napriacuteklad pre PCR ktorej produkt bude klonovanyacute je docircležiteacute použiť polymeraacutezu ktoraacute je schopnaacute opraviť vlastnuacute chybu v priacutepade inkorporaacutecie nespraacutevnej baacutezy pri synteacuteze noveacuteho reťazca Schopnosť opravovať nespraacutevne inkorporovaneacute baacutezy počas synteacutezy noveacuteho vlaacutekna DNA sa nazyacuteva tzv proofreading aktivita ktoraacute je zabezpečenaacute 3rarr5acute exonukleaacutezovou aktivitou takejto polymeraacutezy Pred vlastnou molekulaacuterno-genetickou diagnostikou je treba optimalizovať podmienky PCR reakcie pre konkreacutetnu DNA polymeraacutezu a pre špecifickeacute primery treba zistiť optimaacutelnu teplotu annealingu (hybridizaacutecie) primerov koncentraacutecie jednotlivyacutech zložiek PCR reakcie (napr MgCl2)

Primery suacute kraacutetke jednovlaacuteknoveacute DNA sekvencie komplementaacuterne k cieľovej sekvencii DNA polymeraacuteza začiacutena syntetizovať noveacute vlaacutekno z 3acutekonca primeru Docircležitou charakteristikou primerov je teplota topenia (Tm) t j teplota pri ktorej polovica DNA duplexov je disociovanaacute na jednovlaacuteknoveacute molekuly

Nukleotidy (dNTP deoxyribonukleotidtrifosfaacutety) suacute stavebneacute prvky pre novosyntetizovanuacute DNA molekulu

Veľmi praktickyacutem riešeniacutem pre molekulaacuterno-genetickeacute diagnostickeacute laboratoacuteria je tzv mastermix to je roztok v ktorom už je priacutetomneacute všetko potrebneacute pre priebeh PCR reakcie samozrejme okrem primerov a templaacutetovej DNA sekvencie PCR Master Mix (2X) od firmy ThermoFisher Scientific je jednyacutem z takyacutechto mixov obsahuje Taq DNA polymeraacutezu tlmivyacute roztok (pufor) MgCl2 a všetky deoxyribonukleotidy trifosfaacutety

Tabuľka č 1 uvaacutedza ako sa PCR reakcia z mastermixu pripravuje pre jednu vzorku Keďže v laboratoacuteriu sa zriedka robiacute PCR reakcia s jednou vzorkou treba si pripraviť tzv premix (tj PCR reakcie pre vaumlčšiacute počet vzoriek ale bez templaacutetovej DNA) ktoryacute sa rozdeliacute do mikroskuacutemaviek a až potom sa k nim pridaacute DNA resp cDNA

12

Tab 1 Priacuteprava PCR premixu

Celkovyacute objem jednej PCR reakcie 10 microl Počet vzoriek 8 2x PCR master mix 5 40

primer sense (10microM) 05 4

primer antisense (10microM) 05 4

H2O 35 28

DNA cDNA 05

rozpipetovať premix po 95microl do mikroskuacutemaviek až potom pridať do každej mikroskuacutemavky zvlaacutešť DNA cDNA

spolu objem 10 76

PCR amplif ikaacutecia je cyklickyacute proces pozostaacutevajuacuteci z troch krokov (obr 7) 1) denaturaacutecia dvojvlaacuteknovej DNA pri vysokej teplote (95degC) 2) hybridizaacutecia (annealing) primerov k špecifickej sekvencii DNA pri teplote vhodnej pre konkreacutetne primery 3) polymerizaacutecia (synteacuteza) novyacutech vlaacutekien DNA (72degC)

Obr 7 Princiacutep PCR

Tieto tri kroky sa opakujuacute 25 ndash 40 kraacutet pričom pri každom cykle sa počet molekuacutel zdvojnaacutesobiacute (vyacuteslednyacute počet cieľovej sekvencie je 2n+1 ak na začiatku bola jedna dvojvlaacuteknovaacute DNA a počet cyklov je n) PCR prebieha v termaacutelnom cykleacuteri (teplotnom cyklovači) je to priacutestroj (obr 8) kde je možneacute vykonať a naprogramovať celyacute termaacutelny priebeh PCR reakcie Tabuľka č 2 je priacutekladom termaacutelneho programu pre konkreacutetnu PCR reakciu

Po PCR reakcii je vyacuteslednyacute produkt možneacute vizualizovať elektroforeticky resp použiť na ďalšiu analyacutezu

13

Tab 2 Priacuteklad klasickeacuteho teplotneacuteho a časoveacuteho profilu PCR PCR Teplota Čas Opakovanie

95degC 2 minuacutety

95degC 15 sekuacutend

66degC 60 sekuacutend 30x

72degC 60 sekuacutend

72degC 5 minuacutet

Obr 8 Termaacutelny cykleacuter v procese a otvorenyacute s mikroskuacutemavkami

32 Variaacutecie PCR

Hot-start PCR využiacuteva DNA polymeraacutezu ktoruacute je treba aktivovať vysokou teplotou (napr 95degC 10 minuacutet) Vyacutehodou použiacutevania hot-start polymeraacutez je možnosť pracovať pri laboratoacuternej teplote keďže polymeraacuteza je pri bežnej teplote neaktiacutevna a tyacutem nemocircže docircjsť k vzniku nešpecifickyacutech produktov

Touchdown PCR maacute v počiatočnyacutech cykloch vyššiu teplotu annealingu (uacutečelom je zvyacutešiť

špecificitu PCR produktov na začiatku PCR) neskocircr sa teplota annealingu zniacuteži čo maacute za naacutesledok vyššiacute vyacuteťažok PCR produktu

Nested PCR maacute dva kroky a potrebuje dva paacutery primerov V prvom kroku sa prostredniacutectvom

prvej sady primerov amplifikuje dlhšiacute DNA fragment Ten sa použije ako templaacutet v druhom kroku s druhou sadou primerov s vyacuteslednyacutem kratšiacutem DNA produktom Nested PCR zvyšuje špecifickosť a citlivosť diagnostickyacutech PCR

Multiplex PCR je vlastne viac PCR reakciiacute prebiehajuacutecich v jednej skuacutemavke suacutečasne

V reakčnej zmesi je viac paacuterov primerov suacutečasne prebehne amplifikaacutecia viaceryacutech uacutesekov DNA takto dochaacutedza k šetreniu vzorky reakčnej zmesi a pracovneacuteho času

14

Real-time PCR je venovanaacute špeciaacutelna časť v skriptaacutech Sluacuteži na kvantifikaacuteciu PCR produktu v reaacutelnom čase na zaacuteklade merania fluorescencie okrem kvantifikaacutecie je využiacutevanaacute aj na určenie genotypov

RT-PCR je variaacutecia PCR umožňujuacuteca amplifikaacuteciu DNA sekvencie z vyacutechodiskovej RNA

sekvencie Najskocircr musiacute prebehnuacuteť prepis RNA do jednovlaacuteknovej cDNA prostredniacutectvom reverznej transkriptaacutezy naacutesledne sa cDNA použije pre PCR Selektiacutevnym použitiacutem primerov pri reverznej transkripcii mocircžeme uacutečelovo prepiacutesať buď celkovuacute RNA (primery - random hexameacutery) alebo len mRNA (primery - oligoT)

Alelovo-špecifickaacute PCR (AS-PCR) (obr 9) sluacuteži na detekciu konkreacutetnych mutaacuteciiacute

a jednonukleotidovyacutech polymorfizmov (SNP) Použije sa sada 3 primerov v dvoch kombinaacuteciaacutech PCR reakciiacute dva primery majuacute odlišnuacute sekvenciu na 3acute-koncoch jeden na detekciu wt (wild type) a druhyacute primer na detekciu mutantnej alely reakcia neprebehne ak miesto na templaacutetovej DNA nie je komplementaacuterne k 3acute-koncu primeru pretože DNA polymeraacuteza vyžaduje uacuteplnuacute hybridizaacuteciu primera na 3acute-konci Takto je možneacute rozliacutešiť priacutetomnosť štandardnej (wildtype ndash wt) a mutantnej alely resp SNP (obr 9) AS-PCR je znaacutema aj pod ďalšiacutemi naacutezvami ASO-PCR (allele-specific oligonucleotide PCR) ARMS (amplification-refractory mutation system)

Obr 9 Alelovo-špecifickaacute PCR (AS-PCR)

Mutageneacuteza prostredniacutectvom PCR (site directed mutagenesis) sa použiacuteva keď je potrebneacute vytvoriť mutaacuteciu v špecifickom mieste geacutenu primerprimery majuacute modifikovanuacute sekvenciu tak že obsahujuacute mutaacuteciu v strednej časti čo neovplyvniacute hybridizaacuteciu primerov s templaacutetovou DNA pričom vyacutesledkom je PCR produkt s cielene mutovanou DNA sekvenciou

Asymetrickaacute PCR sa použiacuteva na synteacutezu koacutepiiacute jedneacuteho vlaacutekna z templaacutetovej DNA a to

použitiacutem veľmi niacutezkej koncentraacutecie jedneacuteho primeru Sekvenačnaacute PCR je PCR v ktorej je použityacute len jeden primer a v reakčnej zmesi suacute okrem

všetkyacutech dNTP priacutetomneacute dideoxynukleotidtrifosfaacutety (ddNTP) značeneacute raacutedioaktiacutevne dnes však prevažne fluorescenčne každyacute typ ddNTP inou fluorescenčnou farbičkou Zaradenie niektoreacuteho zo štyroch ddNTP spocircsobiacute terminaacuteciu (zastavenie) predlžovania DNA reťazca fluorescenčneacute označenie ddNTP umožniacute detekciu dĺžky fragmentu a určenie sekvencie posledneacuteho nukleotidu Vyacuteslednyacute produkt sekvenačnej PCR sluacuteži na sekvenovanie Sekvenovaniu sa venuje samostatnaacute časť

MLPA (multiplex ligation-dependent probe amplification) ndash multiplexnaacute amplifikaacutecia proacuteb zaacutevislaacute od ligaacutecie je variaacutecia multiplexnej PCR umožňujuacuteca namnoženie viaceryacutech uacutesekov DNA za použitia iba jedneacuteho paacuteru primerov avšak s podmienkou vytvorenia sekvenčne špecifickej proacuteby ligaacuteciou sekvenčne špecifickyacutech oligonukleotidov MLPA je metoacuteda umožňujuacuteca detekciu počtu koacutepiiacute

15

až 50 nukleotidovyacutech sekvenciiacute v jednej reakcii Pomocou MLPA je možneacute ryacutechlo identifikovať amplifikaacutecie a deleacutecie veľkeacuteho počtu geacutenov či už z DNA alebo mRNA okrem toho MLPA mocircže byť použitaacute na analyacutezu CpG-metylaacutecie (MS-MLPA) Viac informaacutecii v samostatnej časti

SNaPshotreg Multiplex nazyacutevaneacute aj minisekvenovanie je multiplexnaacute reakcia v ktorej je každyacute primer predĺženyacute iba o jeden nukleotid (obr 10) V reakčnej zmesi nie suacute priacutetomneacute deoxyribonukleotidtrifosfaacutety ale len dideoxyribonukleotidtrifosfaacutety (ddATP ddCTP ddGTP ddTTP) každyacute označenyacute inou fluorescenčnou farbičkou Po integraacutecii ddNTP do DNA vlaacutekna je polymerizaacutecia ukončenaacute Jednovlaacuteknoveacute fragmenty (primery) predĺženeacute presne o jeden ddNTP suacute separovaneacute kapilaacuternou elektroforeacutezou v genetickom analyzaacutetore pričom je detegovanaacute ich fluorescencia a dĺžka (obr 11) Z vyacutesledneacuteho elektroforetogramu (obr 12) je možneacute určiť v jednej reakcii sekvenciu vo viac ako v 10 lokalitaacutech určiteacuteho fragmentu DNA SNaPshot Multiplex sa v molekulaacuterno-genetickom laboratoacuteriu využiacuteva na ryacutechlu detekciu viaceryacutech najčastejšie sa vyskytujuacutecich mutaacuteciiSNP geacutenu

Obr 10 Priacuteklad využitia metoacutedy SnaPshot s použitiacutem sady 13 primerov ktoreacute sa predĺžia len o 1 značenyacute dideoxynukleotid SNaPshot najčastejšiacutech mutaacuteciiacute geacutenu pre 21-hydroxylaacutezu (CYP21A2) ktoreacute spocircsobujuacute kongenitaacutelnu adrenaacutelnu hyperplaacuteziu A T G a C predstavujuacute fluorescenčne značeneacute dideoxynukleotidy

Obr 11 Vyacutesledok analyacutezy DNA pacienta metoacutedou minisekvenovania SnaPshot konkreacutetne použitiacutem sady 13 primerov rozlišujuacutecich najčastejšie bodoveacute mutaacutecie geacutenu pre 21-hydroxylaacutezu (CYP21A2) analyacutezou sa zistila mutaacutecia V281L v heterozygotnom stave (dva fragmenty modryacute a červenyacute)

16

Obr 12 SNaPshot analyacuteza geacutenu CYP21A2 u DNA izolovanej z plodovej vody metoacuteda deteguje najčastejšie bodoveacute mutaacutecie geacutenu pre 21-hydroxylaacutezu vyacutesledok prenataacutelnej analyacutezy = priacutetomnosť mutaacutecie In2G v hemizygotnom stave (keďže qPCR metoacutedou bola u plodu zistenaacute priacutetomnosť len jednej koacutepie geacutenu CYP21A2)

33 Kvantitatiacutevna PCR (qPCR)

Polymeraacutezovou reťazovou reakciou (PCR) docielime namnoženie (amplifikaacuteciu) určiteacuteho DNA uacuteseku (templaacutetu) PCR je katalyzovanaacute DNA polymeraacutezou za priacutetomnosti primerov dNTPs dvojmocnyacutech katioacutenov (ako Mg+2) a pufrovacieho roztoku

Real-time PCR ktoraacute je nazyacutevanaacute aj kvantitatiacutevna PCR (qPCR) umožňuje vizualizaacuteciu a kvantifikaacuteciu amplifikaacutecie DNA v reaacutelnom čase to je tak ako to bežiacute počas PCR qPCR využiacuteva fluorescenčneacute chemikaacutelie (farbivaacute) ktoryacutech emitovanuacute fluorescenciu zaznamenaacuteva optickyacute systeacutem počas každeacuteho PCR cyklu zaznamenanaacute fluorescencia je naacutesledne softveacuterovo spracovanaacute a vyhodnotenaacute

V suacutečasnosti sa využiacutevajuacute dva typy qPCR cheacutemie a to farbivaacute viažuce sa na DNA a fluorescenčne značeneacute proacuteby (obr 13)

Farbivaacute viažuce sa na DNA emitujuacute fluorescenciu v priacutepade ak suacute naviazaneacute na dvojvlaacuteknovuacute DNA proacuteby fluoreskujuacute v priacutepade keď molekula zhaacutešača (angl quencher - Q) sa nenachaacutedza v bliacutezkosti molekuly reporteacutera (R) napr hydrolyzujuacutece proacuteby fluoreskujuacute keď je molekula reporteacutera (R) prostredniacutectvom 5acuteexonukleaacutezovej aktivity DNA polymeraacutezy odstraacutenenaacute z bliacutezkosti molekuly zhaacutešača (Q)

Grafickyacute priebeh real ndash time PCR znaacutezorňuje amplifika čnaacute krivka (angl amplification plot) (obr 14) majuacuteca 4 faacutezy 1) Faacuteza I ndash dochaacutedza k zdvojnaacutesobeniu množstva amplikoacutenu po každom cykle ale naacuterast fluorescencie je pod detekčnyacutem limitom zaznamenaacutevanaacute fluorescencia (baseline) zodpovedaacute zaacutekladnej fluorescencii pozadia tzv šumu

17

2) Faacuteza II nazyacutevanaacute aj exponenciaacutelna faacuteza v ktorej sa fluorescencia zvyacuteši na uacuteroveň optickej detekcie bod resp cyklus kedy začiacutena exponenciaacutelna faacuteza je kľuacutečovyacute na určenie kvantity vstupneacuteho množstva templaacutetovej DNA nazyacuteva sa prahovyacute cyklus označuje sa Ct (angl treshold cycle) alebo Cq (quantification) Čiacutem nižšie je Ct (Cq) tyacutem vaumlčšiacute počet koacutepiiacute templaacutetovej DNA bolo v reakcii Ct hodnota je teda hlavnyacute uacutedaj s ktoryacutem sa pracuje vo vyacutepočtoch fluorescencia v tomto mieste sa nazyacuteva prahovaacute resp treshold 3) Faacuteza III - lineaacuterna faacuteza ndash charakterizuje ju postupneacute spotrebovaacutevanie komponentov reakcie na narastajuacutece množstvo amplikoacutenu 4) Faacuteza IV - plateau (čiacutetaj platoacute) ndash množstvo amplikoacutenu sa v docircsledku vyčerpania zložiek qPCR už nezvyšuje

Obr 13 Princiacutep real-time PCR Obr 14 Faacutezy real-time PCR

Ako štandardnaacute PCR aj qPCR maacute tri zaacutekladneacute kroky 1) Denaturaacutecia dvojvlaacuteknovej DNA na jednovlaacuteknovuacute DNA pri vysokej teplote (obyčajne 95degC) 2) Hybridizaacutecia primerov (annealing) ndash komplementaacuterne sekvencie sa spolu hybridizujuacute 3) Polymerizaacutecia pri 70-72degC kedy v docircsledku optimaacutelnej aktivity DNA polymeraacutezy dochaacutedza k predĺženiu primeru až o 100 baacutez za sekundu

18

Real-time PCR (obr 15) sa využiacuteva na kvantifikaacuteciu expresie geacutenov určenie počtu koacutepiiacute geacutenov určenie genotypu (genotypovanie) alelovou diskriminaacuteciou alebo analyacutezou krivky topenia tzv high resolution melt a multiplexnuacute real time PCR s možnosťou detekcie viaceryacutech cieľovgeacutenov

Multiplexnaacute real-time PCR sa využiacuteva na detekciu viaceryacutech cieľovgeacutenov v jednej reakcii suacutečasne Vyacutehodou multiplexovania je jednak uacutespora vzorky ako aj ziacuteskanie vaumlčšieho množstva informaacuteciiacute z rovnakeacuteho množstva materiaacutelu Nevyhnutnosťou multiplexnej qPCR suacute proacuteby značeneacute rocircznymi fluorescenčnyacutemi farbivami

Najdocircležitejšie zložky qPCR (real-time PCR komponenty) suacute DNA polymeraacuteza (reverznaacute transkriptaacuteza v priacutepade jednokrokovej kvantitatiacutevnej RT-PCT) dNTPs primery resp primeryproacuteby dvojmocneacute Mg templaacutet Na uľahčenie qPCR suacute v suacutečasnosti už komerčne dostupneacute takeacute reakčneacute zmesi ku ktoryacutem stačiacute pridať už len templaacutet (napr kity využiacutevajuacutece TaqManProacuteby) alebo kity s fluorescenčnyacutemi farbami viažucimi sa na dvojvlaacuteknovuacute DNA ku ktoryacutem sa do reakčnej zmesi okrem templaacutetu pridajuacute primery

Obr 15 Real-time PCR cykleacuter

331 Kvantifikaacutecia pomocou qPCR

Na kvantifikaacuteciu DNA pomocou qPCR sa požiacutevajuacute dve zaacutekladneacute metoacutedy - absoluacutetna kvantifikaacutecia a relatiacutevna kvantifikaacutecia

Absoluacutetna kvantifikaacutecia vychaacutedza zo štandardnej krivky (obr 16) ktoraacute sa ziacuteska po qPCR seacuterie riedeniacute DNA znaacutemej koncentraacutecie Kvantifikaacutecia neznaacutemej vzorky sa zistiacute interpolaacuteciou (odčiacutetaniacutem) Ct neznaacutemej vzorky zo štandardnej krivky (obr 16 17) Využiacutevaneacute napr v kriminalistike na stanovenie koncentraacutecie DNA vo vzorke

Relatiacutevna kvantifikaacutecia (obr 18 19) porovnaacuteva uacuteroveň expresie určiteacuteho geacutenu vo vzorke k expresii toho isteacuteho geacutenu v referenčnej (kontrolnej) vzorke alebo množstvo určiteacuteho geacutenu (počet koacutepiiacute) vo vzorke porovnaniacutem s množstvom geacutenu v kontrolnyacutech vzorkaacutech V raacutemci každej vzorky musiacute pred relatiacutevnou kvantifikaacuteciou docircjsť k tzv normalizaacutecii t j porovnanie expresie sledovaneacuteho geacutenu k expresii referenčneacuteho geacutenu (najčastejšie niacutem byacuteva tzv bdquohousekeepingldquo geacuten napr GAPDH aktiacuten tubuliacuten)

V priacutepade kvantifikaacutecie expresie určiteacuteho geacutenu metoacutedou real-time PCR (RT-qPCR) pred samotnou kvantifikaacuteciou cDNA musiacute byť taacuteto cDNA nasyntetizovanaacute prostredniacutectvom reverznej

19

transkripcie za použitia enzyacutemu reverznej transkriptaacutezy Kvantitatiacutevna PCR s reverznou transkripciou RT-qPCR mocircže byť dvojkrokovaacute alebo jednokrokovaacute Pri dvojkrokovej RT-qPCR treba pred qPCR syntetizovať cDNA vlaacutekno z RNA pomocou reverznej transkriptaacutezy - 1 krok druhyacutem krokom je samotnaacute real-time PCR Jednokrokovaacute RT-qPCR umožňuje uskutočniť obidve reakcie reverznuacute transkripciu a kvantitatiacutevnu PCR v jednej skuacutemavke čo zjednodušuje qPCR a redukuje možnosť kontaminaacutecie Obr 16 5-bodovaacute štandardnaacute krivka (amplifikaacutecia piatich koncentraacuteciiacute jednej vzorky konkreacutetne ide o 10-tkoveacute riedenie)

Obr 17 Ukaacutežka amplifikačnyacutech kriviek riedenia a z nich ziacuteskanej štandardnej krivky poukazuje na vysokuacute presnosť metoacutedy RT-PCR

20

Obr 18 Relatiacutevna kvantifikaacutecia - určenie počtu koacutepiiacute geacutenu CYP21A2 vo vzorke DNA izolovanej z perifeacuternej krvi pacientov mutaacutecie v geacutene CYP21A2 spocircsobujuacute kongenitaacutelnu adrenaacutelnu hyperplaacuteziu (CAH) Vyacutesledok analyacutezy všetci pacienti majuacute dve koacutepie geacutenu

Obr 19 Relatiacutevna kvantifikaacutecia - určenie počtu koacutepiiacute geacutenu CYP21A2 vo vzorke DNA izolovanej z plodovej vody mutaacutecie v geacutene CYP21A2 spocircsobujuacute kongenitaacutelnu adrenaacutelnu hyperplaacuteziu (CAH) Prenaacutetalnou diagnostikou (qPCR) sa zistila priacutetomnost jednej koacutepie CYP21A2 geacutenu 332 Určenie genotypu metoacutedou alelovej diskriminaacutecie a analyacutezou krivky topenia (HRM)

Určenie genotypu metoacutedou alelovej diskriminaacutecie (obr 20) sa uskutočňuje použitiacutem hydrolyzujuacutecich proacuteb (sond) je veľmi ryacutechla a senzitiacutevna (presnaacute) metoacuteda frekventovane využiacutevanaacute v laboratoacuteriaacutech Dva variantyalely suacute vyšetreneacute suacutečasne v jednej vzorke a v jednej reakčnej

21

skuacutemavke V reakcii suacute použiteacute dve proacuteby označeneacute rozdielnymi fluorescenčnyacutemi farbičkami emitujuacutecimi svetlo o rocircznej vlnovej dĺžke (najčastejšie jedna označenaacute FAM farbičkou a druhaacute proacuteba označenaacute VIC farbičkou) Počas amplifikaacutecie amplikoacutenu dochaacutedza k odstraacuteneniu zhaacutešača z bliacutezkosti farbičky ktoraacute potom emituje svetlo priacuteslušnej vlnovej dĺžky Vzorky so signaacutelom len jednej fluorescenčnej farbičky (FAM) a bez signaacutelu druhej farbičky (VIC) suacute homozygoti pre alelu 1 vzorky so signaacutelom len druhej farbičky (VIC) a bez signaacutelu prvej (FAM) suacute homozygoti pre alelu 2 v priacutepade ak vyšetrovanaacute vzorka bdquosvietildquo obidvoma farbami jednaacute sa o heterozygota

Obr 20 Určenie genotypu metoacutedou alelovej diskriminaacutecie ndash amplifikačnaacute krivka vzoriek DNA majuacutecich tri rocirczne genotypy A ndash jednotliveacute vzorky (plnaacute čiara predstavuje štandardnuacute alelu guličkovanaacute mutovanuacute alelu) B ndash 72 vzoriek C ndash scatter plot 72 vzoriek

Určenie genotypu analyacutezou krivky topenia tzv high resolution melt (HRM) (obr 21) umožňuje detekciu takmer všetkyacutech genetickyacutech variaacuteciiacute (SNP mutaacuteciiacute) Keďže taacuteto metoacuteda okrem štandardnyacutech podmienok reakcie vyžaduje len primery a farbičku (nie proacuteby) je veľmi jednoduchaacute a lacnejšia Po amplifikaacuteciiacute treba amplikoacuten pomaly zohrievať až kyacutem nedocircjde k denaturaacuteciiacute Teplota topenia amplikoacutenu vo vzorke zaacutevisiacute od DNA sekvencie čo umožňuje detegovať priacutetomnosť mutaacutecie resp SNP Tvar vyacuteslednyacutech kriviek topenia určuje teda genotyp

22

Obr 21 Určenie genotypu analyacutezou krivky topenia tzv metoacutedou high resolution melting (HRM) A ndash krivka topenia vzoriek DNA majuacutecich tri rocirczne genotypy B ndash graf rozdielnosti krivky topenia vzoriek DNA majuacutecich tri rocirczne genotypy

23

4 Elektroforetickaacute separaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten

Separaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten predstavuje rozdelenie molekuacutel DNA alebo RNA na zaacuteklade veľkosti zloženia a poradia baacutez Podobnyacutemi metoacutedami je možneacute separovať aj proteiacuteny

Elektroforeacuteza (ELFO) je technika použiacutevanaacute na separaacuteciu niekedy aj purifikaacuteciu makromolekuacutel ako suacute nukleoveacute kyseliny a proteiacuteny na zaacuteklade ich rozdielnej veľkosti naacuteboja alebo konformaacutecie Je to metoacuteda veľmi často využiacutevanaacute nielen v molekulovej genetike ale aj biocheacutemii Elektroforeacuteza využiacuteva schopnosť nabityacutech molekuacutel migrovať v jednosmernom elektrickom poli k opačneacutemu poacutelu Nukleoveacute kyseliny majuacute vďaka svojej fosfaacutetovej zložke negatiacutevny naacuteboj preto v jednosmernom elektrickom poli migrujuacute ku kladneacutemu poacutelu čiže k anoacutede Elektroforeacuteza prebieha v elektroforetickej aparatuacutere v geacuteloch (v nosiči) so sieťovitou štruktuacuterou ktoraacute umožňuje separaacuteciu molekuacutel Vzorka nukleovej kyseliny zmiešanaacute s tzv nanaacutešaciacutem tlmivyacutem roztokom s farbičkou sa nanesie do jamky v geacuteli ktoryacute je umiestnenyacute v elektroforetickej aparatuacutere v priacutetomnosti elektroforetickeacuteho pufra (TAE alebo TBE) (obr 22) Nanaacutešaciacute tlmivyacute roztoknanaacutešacia farbička umožňuje na zaacuteklade migraacutecie farbičky vidieť migraacuteciu vzorky v geacuteli a suacutečasne zvyacutešeniacutem hustoty vo vzorke umožniacute klesnuacuteť vzorke do jamky a tak zabraacuteniť jej vyplaveniu z geacutelu Draacuteha je časť geacutelu ktoryacutem putuje jedna vzorka od katoacutedy k anoacutede V draacutehe sa nachaacutedzajuacute oddeleneacute jednotliveacute fragmenty nukleovyacutech kyseliacuten určityacutech veľkostiacute viditeľneacute vo forme pruacutežkov (angl bands) Intenzita pruacutežku zaacutevisiacute od množstva molekuacutel danej veľkosti je ekvivalentnaacute hmotnosti Na určenie veľkosti fragmentov NK sa do jednej jamky nanesie štandard molekulovyacutech hmotnostiacute (angl ladder) ktoryacute maacute presne definovaneacute veľkosti fragmentov čo umožňuje odhadnuacuteť veľkosť aj hmotnosť neznaacutemych separovanyacutech fragmentov

Obr 22 Elektroforetickaacute separaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten v agaroacutezovom geacuteli (A) a vizualizaacutecia UV svetlom a GelRedtrade (B C)

24

Nukleoveacute kyseliny je možneacute elektroforeticky separovať 1) v geacuteloch agaroacutezovom (horizontaacutelna elektroforeacuteza) (obr 22) a polyakrylamidovom (vertikaacutelna elektroforeacuteza) 2) v špeciaacutelnych lineaacuternych polymeacuteroch kapilaacuternou elektroforeacutezou použitiacutem genetickeacuteho analyzaacutetora (obr 23)

Agaroacuteza je polysacharid ziacuteskanyacute z morskej riasy použiacuteva sa najčastejšie v koncentraacuteciiacute 05-2 čiacutem vyššia koncentraacutecia tyacutem je geacutel pevnejšiacute a schopnejšiacute rozliacutešiť menšie fragmenty NK Priacuteprava je jednoduchaacute odvaacuteži sa potrebneacute množstvo agaroacutezy ktoraacute sa zmieša s tlmivyacutem roztokom (pufrom) rozvariacute sa v mikrovlnnej ruacutere a naleje sa do špeciaacutelnej naacutedoby na vytvaacuteranie geacutelov kyacutem je geacutel tekutyacute vložiacute sa do neho tzv hrebeň na vytvorenie jamiek Agaroacuteza je netoxickaacute V bežnom agaroacutezovom geacuteli v zaacutevislosti od jeho koncentraacutecie je možneacute separovať DNA fragmenty dĺžky 200-50 000 bp Dnes suacute dostupneacute aj špeciaacutelne agaroacutezy napr MetaPhorreg Agarose schopneacute oddeliť fragment DNA dĺžky 20-800bp Separaacutecia v agaroacutezovom geacuteli prebieha v horizontaacutelnej aparatuacutere preto sa nazyacuteva aj horizontaacutelna elektroforeacuteza

Polyakrylamidovyacute geacutel (PAGE) vznikaacute polymerizaacuteciou akrylamidu v priacutetomnosti špeciaacutelnych chemickyacutech laacutetok (peroxodisiacuteran amoacutenny TEMED bisakrylamid) Jeho priacuteprava je preto odlišnaacute a aj naacuteročnejšia Polyakrylamidoveacute geacutely majuacute vysokuacute rozlišovaciu schopnosť (1bp) preto suacute PAGE geacutely vhodneacute aj na sekvenovanie DNA klasickyacutemi metoacutedami PAGE geacutel nie je vhodnyacute na separaacuteciu fragmentov dlhšiacutech ako 2kb Použiacuteva sa v koncentraacutecii 35 -20 s rozliacutešeniacutem fragmentov od 10bp-2000bp Akrylamid je neurotoxiacuten musiacute sa s niacutem pracovať veľmi opatrne PAGE elektroforeacuteza bežiacute vo vertikaacutelnej aparatuacutere preto sa volaacute aj vertikaacutelna elektroforeacuteza použiacuteva sa často aj na separaacuteciu proteiacutenov

Ryacutechlosť pohybu nukleovyacutech kyseliacuten (mobilita) určuje viacero faktorov 1) veľkosť NK ndash počet baacutezovyacutech paacuterov resp baacutez pričom menšie molekuly prechaacutedzajuacute geacutelom ryacutechlejšie pretože sa ľahšie pohybujuacute v geacuteli 2) konformaacutecia nukleovej kyseliny napr u rovnako veľkyacutech plazmidov kondenzovaneacute superšpiralizovaneacute plazmidy migrujuacute najryacutechlejšie rovnako veľkeacute lineaacuterne molekuly (toho isteacuteho plazmidu) bežia pomalšie a najpomalšie putujuacute relaxovaneacute kruhoveacute molekuly plazmidu 3) koncentraacutecia geacutelu určuje jeho rozlišovaciu schopnosť koncentrovanejšiacute geacutel je schopnyacute separovať kratšie fragmenty NK redšie geacutely suacute vhodneacute pre rozliacutešenie vaumlčšiacutech fragmentov 4) zloženie geacutelu je docircležiteacute pri analyacuteze sekundaacuternych štruktuacuter NK a proteiacutenov v nedenaturovanom stave sekundaacuterna štruktuacutera spomaľuje migraacuteciu NK a proteiacutenov Tento fakt využiacutevajuacute niektoreacute diagnostickeacute techniky (napr SSCP - Single Strand Conformation Polymorphism - polymorfismus konformaacutecie jednovlaacuteknovej DNA) umožňujuacutece detekciu zaacutemeny jedinej baacutezy ktoraacute spocircsobiacute odlišneacute vnuacutetromolekuloveacute paacuterovanie a vyacuteslednuacute konformaacuteciu molekuly Geacutely mocircžu teda byť denaturačneacute a nedenaturačneacute (natiacutevne) 5) napaumltie zdroja - čiacutem vyššie je napaumltie ktoreacute vytvaacutera elektrickeacute pole v elektroforetickej aparatuacutere tyacutem ryacutechlejšie fragmenty NK migrujuacute 6) zloženie roztokov a teploty

Elektroforetickyacute tlmivyacute roztok (pufor - elektrolyt) zabezpečuje stabilneacute elektroforetickeacute podmienky počas separaacutecie geacutel je v ňom ponorenyacute Obsahuje ioacuteny čo umožňuje vedenie elektrickeacuteho pruacutedu

Štandard molekulovyacutech hmotnostiacute (v laboratoacuteriaacutech nazyacutevanyacute ladder alebo marker) je zmes fragmentov DNA alebo RNA s presne definovanou veľkosťou ktoryacute sluacuteži na odhad veľkosti vyšetrovanyacutech fragmentov NK (obr 22) Pomocou špeciaacutelnych štandardov molekulovyacutech hmotnostiacute ktoryacutech fragmenty NK majuacute definovanuacute aj hmotnosť je možneacute odhadnuacuteť množstvo (hmotnosť - koncentraacuteciu) neznaacutemeho fragmentu

B C

25

41 Vizualizaacutecia DNA

Samotnaacute nukleovaacute kyselina je počas elektroforetickej separaacutecie neviditeľnaacute Vizualizaacuteciu NK umožňujuacute interkalačneacute činidlaacute ktoreacute suacute schopneacute naviazať sa na molekuly NK tyacutem že sa včlenia medzi susediace baacutezy Po ožiareniacute UV svetlom interkalačneacute činidlaacute naviazaneacute na NK fluoreskujuacute tak sa vizualizuje NK čiacutem intenziacutevnejšie fluoreskuje tyacutem viac NK je v geacutelipruacutežku priacutetomneacute Interkalačneacute činidlo sa buď primieša do geacutelu pri jeho priacuteprave čo umožniacute sledovať migraacuteciu fragmentov NK počas elektroforeacutezy a to po vybratiacute z ELFO aparatuacutery a po ožiareniacute UV svetlom alebo sa geacutel farbiacute po elektroforetickej separaacutecii V minulosti bol na zviditeľnenie NK najčastejšie použiacutevanyacute etidiumbromid kvocircli jeho mutageacutennym vlastnostiam sa v suacutečasnosti nahraacutedza menej mutageacutennymi a netoxickyacutemi činidlami ako suacute napr komerčne dostupneacute SYBRregSafe GelRedtrade GelGreentrade

Kapilaacuterna elektroforeacuteza NK prebieha v špeciaacutelnom priacutestroji genetickom analyzaacutetore (obr 23) ktoryacute musiacute mať zaacutekladneacute komponenty ako suacute elektroacutedy kapilaacutera zdroj vysokeacuteho napaumltia detektor prepojenie s počiacutetačom a softveacuteroveacute vybavenie priestor na vloženie vzoriek atď Genetickyacute analyzaacutetor predstavuje automatizovanyacute systeacutem umožňujuacuteci sekvenovanie určovanie dĺžky DNA fragmentov ndash fragmentačnuacute analyacutezu a kvantifikaacuteciu nukleovyacutech kyseliacuten V novšiacutech typoch genetickeacuteho analyzaacutetora je proces analyacutezy od vloženia vzoriek do stojana automatizovanyacute

Vzorka určenaacute na analyacutezu je elektrokineticky injektovanaacute do tenkej kapilaacutery naplnenej lineaacuternym polymeacuterom Vplyvom vysokeacuteho napaumltia sa negatiacutevne nabiteacute fragmenty DNA pohybujuacute v polymeacuteri k pozitiacutevne nabitej elektroacutede Kapilaacuterna elektroforeacuteza je tak citlivaacute že je schopnaacute detegovať jednobaacutezovyacute rozdiel DNA fragmentov DNA fragmenty musia byť pred kapilaacuternou elektroforeacutezou fluorescenčne označeneacute v kapilaacutere suacute separovaneacute na zaacuteklade veľkosti Kraacutetko pred dosiahnutiacutem kladne nabitej elektroacutedy docircjde po excitaacutecii laserovyacutem žiareniacutem k emisii žiarenia fluoroformi (farbičkami) tak že optickyacute detekčnyacute systeacutem zaznamenaacute fluorescenciu ktoraacute je naacutesledne softveacuterovo spracovanaacute a vyhodnotenaacute

Obr 23 Genetickyacute analyzaacutetor

42 RFLP

Metoacuteda polymorfizmu dĺžky restrik čnyacutech fragmentov (angl Restriction Fragment Length Polymorfism) bola prvou metoacutedou využiacutevanou na detekciu DNA variaacuteciiacute rocircznych biologickyacutech vzoriek Princiacutep metoacutedy spočiacuteva v priacutetomnosti polymorfizmov v DNA sekvencii rocircznych ľudiacute ktoreacute zapriacutečinia rozdielny profil (obrazec) DNA fragmentov po štiepeniacute jednou alebo viaceryacutemi restrikčnyacutemi endonukleaacutezami Restrikčneacute endonukleaacutezy (RE) suacute enzyacutemy ktoreacute štiepia DNA molekulu v oblasti špecifickej nukleotidovej sekvencie nazyacutevanej restrik čneacute miesto RE najčastejšie rozpoznaacutevajuacute a štiepia miesto veľkeacute 4-6 baacutez RE suacute priacutetomneacute u prokaryotov (bakteacuterie a archebakteacuterie) kde suacute suacutečasťou restrik čno-modifikačneacuteho systeacutemu akoby prokaryotickeacutej vrodenej imunity sluacutežia

26

na ochranu pred cudzou DNA (napr viacuterusovou) ktoruacute po rozpoznaniacute špecifickej sekvencie štiepia

Restrikčno-modifikačnyacute systeacutem maacute dve zložky 1) modifikačneacute enzyacutemy - metylaacutezy ktoreacute procesom metylaacutecie modifikujuacute určiteacute baacutezy svojej DNA čiacutem ich označia za vlastnuacute DNA takže takaacuteto DNA je potom rezistentnaacute voči štiepeniu restrikčnyacutemi endonukleaacutezami Najčastejšiacutem spocircsobom metylaacutecie u bakteacuteriiacute je metylaacutecia adeniacutenu na N6 pričom vznikne metyladeniacuten alebo cytoziacutenu na C5 metylcytoziacuten 2) restrikčneacute endonukleaacutezy štiepia špecifickeacute miesto dvojvlaacuteknovej DNA ktoreacute je tvoreneacute symetrickou sekvenciou zrkadlovo sa opakujuacutecich nukleotidov ndash tzv palindroacutem Restrikčneacute enzyacutemy sa použiacutevajuacute na štiepenie DNA sekvencie na mieste špecifickom pre tuacute ktoruacute restrikčnuacute endonukleaacutezu napr pri analyacuteze polymorfizmov dĺžky restrikčnyacutech fragmentov (RFLP) analyacuteze jednonukleotidovyacutech polymorfizmov (SNP) mutaacuteciiacute ako aj pri klonovaniacute DNA do vhodnyacutech vektorovyacutech DNA molekuacutel

Po štiepeniacute dvojvlaacuteknovej DNA restrikčnou endonukleaacutezou mocircžu vzniknuacuteť tri typy koncov - 5´-prečnievajuacutece konce (lepiveacute) 3´-prečnievajuacutece konce (lepiveacute) a tupeacute konce (obr 24)

Obr 24 Restrikčneacute štiepenie zanechaacutevajuacutece rocirczne konce tupeacute a lepiveacute

Restrikčneacute štiepenie je často použiacutevanou metoacutedou geacutenovyacutech manipulaacuteciiacute na konštrukciu

hybridnyacutech molekuacutel DNA s naacuteslednyacutem klonovaniacutem Priebeh RFLP analyacutezy je nasledovnyacute restrikčnaacute endonukleaacuteza sa pridaacute k DNA a zmes sa vo

vhodnyacutech reakčnyacutech podmienkach (pufor teplota) inkubuje niekoľko hodiacuten Počas inkubaacutecie docircjde k štiepeniu DNA na špecifickyacutech miestach DNA je potom elektroforeticky separovanaacute v geacuteli a naacutesledne vizualizovanaacute V minulosti po geacutelovej elektroforeacuteze nasledoval Southern blot (čiže prenos separovanyacutech fragmentov DNA z geacutelu na špeciaacutelnu membraacutenu) (obr 35) po ktorom nastala vizualizaacutecia raacutedioaktiacutevne značenou proacutebou V suacutečasnosti sa kvocircli praacutecnosti a zdravotnyacutem rizikaacutem od Southern blotu upuacutešťa a prechaacutedza sa na ryacutechlejšie menej praacutecne a zdravotne šetrnejšie metoacutedy priateľskejšie aj k životneacutemu prostrediu

RFLP bola prvou metoacutedou použiacutevanou na zistenie DNA profilu (DNA fingerprinting) mapovanie geacutenov zapriacutečiňujuacutece genetickeacute ochorenia a testovanie otcovstva Vaumlčšina RFLP markerov je vysoko lokusovo špecifickyacutech a kodominantnyacutech (obidve alely suacute detekovaneacute u heterozygota)

PCR-RFLP je laboratoacuterne priacutestupnejšia metoacuteda molekulaacuterno-genetickej diagnostiky keďže PCR umožňuje amplifikaacuteciu veľmi malyacutech množstiev DNA Alternatiacutevny naacutezov použiacutevanyacute v literatuacutere je CAPS z angl Cleaved Amplified Polymorphic Sequence assay Použitiacutem špecifickyacutech primerov docircjde PCR metoacutedou k amplifikaacutecii požadovaneacuteho uacuteseku DNA ten sa potom štiepi restrikčnou endonukleaacutezou vo vhodnyacutech podmienkach naacutesledne sa štiepne produkty elektroforeticky separujuacute a vizualizujuacute použitiacutem interkalačnyacutech farbiacutev a UV svetla (obr 25)

27

Obr 25 Princiacutep metoacutedy PCR-RFLP

43 VNTR a STR V geacutenome suacute priacutetomneacute dva typy tandemovyacutech (za sebou nasledujuacutecich) opakovaniacute

1) minisatelity ndash nazyacutevaneacute variabilnyacute počet tandemovyacutech opakovaniacute VNTR (variable number of tandem repeats) 2) mikrosatelity tiež kraacutetke tandemoveacute repetiacutecie STR (short tandem repeats)

Obidva tieto typy satelitnej DNA suacute rozmiestneneacute po celom genoacuteme suacute využiacutevaneacute hlavne vo forenznej genetike na identifikaacuteciu osocircb a určenie otcovstva popriacutepade materstva ale aj v mediciacutene na detekciu chromozoacutemovyacutech aneuploidiiacute Štruktuacutera obidvoch je podobnaacute Rozdiel medzi jednotlivyacutemi alelami je spocircsobenyacute rozdielnym počtom opakovaniacute opakujuacutecej sa sekvencie (motiacutevu) čo spocircsobiacute rocircznu dĺžku alel s rocircznym počtom tandemovyacutech opakovaniacute nazyacutevanuacute polymorfizmus dĺžky fragmentov

VNTR ndash variabilnyacute počet tandemovyacutech opakovaniacute pričom opakujuacuteca sa sekvencia maacute dĺžku od 6 do 100 baacutez pričom sa mocircže opakovať aj tisiacutece kraacutet alely tak mocircžu mať od 500do 30 000 baacutez VNTR boli v kombinaacutecii s RFLP (DNA fingerprinting ) prvyacutem polymorfizmom použiacutevanyacutem na zistenie DNA profilov a identifikaacuteciu osocircb v kriminalistickej praxi V suacutečasnosti jeho využitie v kriminalistike je kvocircli potrebe relatiacutevne veľkeacuteho množstva DNA nahradeneacute využitiacutem STR

STR - kraacutetke tandemoveacute repetiacutecie suacute v kriminalistike najčastejšie použiacutevanyacutem polymorfizmom STR lokusy suacute rozmiestneneacute po celom genoacuteme repetiacutecia obsahuje jednu až šesť baacutez pričom jej opakovaniacutem vznikne STR v rozsahu od 50 do 300bp V našom genoacuteme suacute tisiacutece STR ktoreacute mocircžu byť použiteacute pre forenznuacute analyacutezu V kriminalistike sa v suacutečasnosti na identifikaacuteciu osocircb použiacuteva 13 STR locusov ktoreacute patria k medzinaacuterodne uznaacutevanyacutem štandardom Z iniciatiacutevy FBI bola vytvorenaacute databaacuteza CODIS (Combined DNA Index System) každaacute krajina maacute svoju databaacutezu CODIS kde je možneacute vložiť a archivovať DNA profily jednotlivcov ako aj profily DNA ziacuteskanyacutech z miest kriminaacutelneho činu v databaacuteze je ich možneacute navzaacutejom porovnať a tak zistiť pocircvodcu trestneacuteho činu Medzinaacuterodnaacute jednotnosť v použiacutevaniacute CODIS STR lokusov umožňuje v priacutepade potreby vzaacutejomneacute porovnanie DNA profilov zistenyacutech na uacutezemiacute rocircznych štaacutetov CODIS STR lokusov je 13 a suacute to CSF1PO FGA TH01 TPOX VWA D3S1358 D5S818 D7S820 D8S1179 D13S317 D16S539 D18S51 a D21S11 Zistenie DNA profilu sa uskutočniacute multiplexnou PCR reakciou s fluorescenčne značenyacutemi primermi špecifickyacutemi pre konkreacutetny STR Naacutesledne suacute PCR produkty analyzovaneacute kapilaacuternou elektroforeacutezou genetickyacutem analyzaacutetorom ktoryacute rozliacuteši amplifikovaneacute fragmenty na zaacuteklade fluorescencie a dĺžky (fragmentačnaacute analyacuteza) (obr 26 Tab 3) DNA profil každeacuteho človeka je jedinečnyacute rovnakyacute profil mocircžu mať len jednovaječneacute dvojčataacute

28

Obr 26 Ukaacutežka DNA profilu človeka 15 STR lokusov s určeniacutem pohlavia pomocou lokusu pre amelogeniacuten (ženskeacute pohlavie - XX) maleacute oranžoveacute piacuteky predstavujuacute fragmenty veľkostneacuteho štandardu Tabuľka č 3 Zaacutepis DNA profilu človeka z obraacutezka č 26 15 STR lokusov s určeniacutem pohlavia pomocou lokusu pre amelogeniacuten System Alela 1 Alela 2

D3S1358 16 17

TH01 9 93 D21S11 28 28

D18S51 15 18

Penta E 7 14 D5S818 9 12

D13S317 8 11

D7S820 8 11 D16S539 11 12

CSF1PO 10 11

Penta D 11 12 vWA 15 18

D8S1179 13 16

TPOX 8 9 FGA 20 21

amel X X

29

5 MLPA

Multiplexnaacute amplifikaacutecia proacuteb zaacutevislaacute od ligaacutecie (z angl multiplex ligation-dependent probe amplification) je metoacuteda schopnaacute v jednej reakcii (v jednej skuacutemavke a vzorke) detegovať zmeny v počte až 50 nukleotidovyacutech sekvenciiacute Metoacutedou MLPA je možneacute ryacutechlo identifikovať amplifikaacutecie (duplikaacutecie) a deleacutecie veľkeacuteho počtu geacutenov či už použitiacutem DNA alebo mRNA krvnyacutech vzoriek alebo vzoriek z naacutedorov

Princiacutep MLPA spočiacuteva v multiplexnej amplifikaacutecii 50 špecifickyacutech nukleotidovyacutech sekvenciiacute použitiacutem jedneacuteho paacuteru primerov pričom jeden primer je fluorescenčne označenyacute Vyacutesledneacute PCR produkty suacute analyzovaneacute kapilaacuternou elektroforeacutezou (fragmentačnaacute analyacuteza) Dĺžka každeacuteho namnoženeacuteho produktu je jedinečnaacute narastaacute postupne o 6 alebo 9 nukleotidov pričom produkty PCR suacute 120 ndash 500 nukleotidov dlheacute Tento veľkostnyacute rozsah PCR fragmentov (dĺžka 120-500 nukleotidov s naacuterastom postupne o 6 alebo 9 nukleotidov) je optimaacutelny pre kapilaacuternu elektroforeacutezu MLPA multiplexnaacute PCR prebieha za použitia iba jedineacuteho paacuteru primerov ktoreacute amplifikujuacute špecifickeacute sekvencie Trik spočiacuteva v tom že nedochaacutedza k amplifikaacutecii DNA sekvencie ale MLPA proacuteb ktoreacute suacute pridaneacute k vzorkaacutem Každaacute MLPA proacuteba pozostaacuteva z dvoch oligonukleotidov (dve hemiproacuteby) pričom každyacute oligonukleotid obsahuje jednu zo sekvencie rozpoznaacutevanuacute PCR primermi Proacuteba vznikne jedine za predpokladu hybridizaacutecie dvoch oligonukleotidov (hemiproacuteb) k cieľovej sekvencii (geacutenu) a po ligaacutecii enzyacutemom ligaacutezou Iba ligovaneacute proacuteby suacute exponenciaacutelne amplifikovaneacute pomocou jedneacuteho paacuteru primerov Množstvo zligovanyacutech proacuteb teda zaacutevisiacute od množstva cieľovyacutech sekvenciiacute (geacutenov) vo vzorke

Postup MLPA analyacutezy je nasledovnyacute (obr27) K vzorke nukleovej kyseliny (DNA resp mRNA) sa pridaacute zmes 50 jedinečnyacutech proacuteb každaacute

proacuteba je komplementaacuterna k určitej cieľovej sekvencii NK vzorky Každaacute proacuteba však pozostaacuteva z dvoch oligonukleotidov hybridizujuacutecich vedľa seba zaacuteroveň každyacute oligonukleotid (hemiproacuteba) obsahuje pridanuacute sekvenciu rozpoznaacutevanuacute paacuterom PCR primerov Po hybridizaacuteciiacute oligonukleotidov (hemiproacuteb) dochaacutedza k ich ligaacutecii ligaacutezou Ligačnaacute reakcia je tak špecifickaacute že je schopnaacute rozliacutešiť sekvenciu liacutešiacu sa v jednom nukleotide Vyacuteslednyacute ligačnyacute produkt (proacuteba) obsahuje obidve sekvencie pre PCR primery na jednom fragmente čiže mocircže docircjsť k namnoženiu takeacutehoto fragmentu PCR reakciou V priacutepade ak nedocircjde k ligaacutecii priacuteslušnyacutech hemiproacuteb pretože hemiproacuteby nenaacutejdu cieľovuacute sekvenciu na DNA každaacute takaacuteto nezligovanaacute hemiproacuteba maacute len jednu sekvenciu rozpoznaacutevanuacute len jednyacutem PCR primerom v docircsledku čoho nemocircže prebehnuacuteť jej PCR amplifikaacutecia a počas fragmentačnej analyacutezy nie je detegovanaacute pretože negeneruje fluorescenčnyacute signaacutel

Pri MLPA analyacuteze je docircležiteacute okrem MLPA amplifikaacutecie vzorky urobiť aj MLPA amplifikaacuteciu referenčnej vzorky ku ktorej sa bude porovnaacutevať počet geacutenov (cieľovyacutech sekvenciiacute) Po kapilaacuternej elektroforeacuteze MLPA referenčnej a skuacutemanej vzorky porovnaniacutem obsahu nameranyacutech hodnocirct tzv piacutekov priacuteslušnyacutech proacuteb sa určiacute relatiacutevny počet koacutepiiacute v skuacutemanej vzorke

MLPA

1 DNA denaturaacutecia a hybridizaacutecia s MLPA proacutebami (hemiproacuteby)

2 Ligaacutecia (vytvorenie kompletnyacutech proacuteb)

3 PCR amplifikaacutecia proacuteb paacuterom primerov

4 Kapilaacuterna elektroforetickaacute separaacutecia PCR produktov

5 Analyacuteza daacutet

30

Obr 27 Princiacutep MLPA

Firma MRC-Holland v suacutečasnosti ponuacuteka stovky MLPA setov proacuteb ktoreacute suacute vhodneacute na 1) diagnostiku kongenitaacutelnych a dedičnyacutech ochoreniacute 2) zisťovanie profilu naacutedorov 3) zisťovanie metylačneacuteho profilu

MLPA je metoacuteda vhodnaacute na detekciu malyacutech prestavieb (BRCA1 BRCA2 MSH2 atď)

veľkyacutech chromozoacutemovyacutech prestavieb (Williamsov syndroacutem Prader-WilliAngelman syndroacutem atzď)

31

detekciu zmien v počte koacutepii geacutenov (obr 28 29) ako aj zistenie počtu kompletnyacutech chromozoacutemov (chromozoacutem 13 18 21 XY tiež aj z amniovej tekutiny) diagnostiku naacutedorov (zmeny počtu pri ALL CLL atď) kvantifikaacuteciu metylaacutecie (Prader-WilliAngelmanov syndroacutem Fragilnyacute X inaktivaacutecia naacutedorovyacutech supresorovyacutech geacutenov atď) mRNA analyacutezu geacutenov zuacutečastňujuacutecich sa apoptoacutezy alebo zaacutepalov

MS-MLPA (Methylation-Specific MLPA) je varianta MLPA určenaacute špeciaacutelne na analyacutezu aberantnyacutech metylaacutecii imprintovanyacutech oblastiacute ako aj detekciu metylačnyacutech zmien CpG ostrovčekov lokalizovanyacutech bliacutezko promoacutetora Rozdiel oproti štandardnej MLPA spočiacuteva v použitiacute metylačne senzitiacutevneho restrikčneacuteho enzyacutemu HhaI ktoryacute štiepi MS-MLPA proacuteby hybridizovaneacute k nemetylovanej sekvencii Každaacute DNA vzorka určenaacute pre MS-MLPA analyacutezu prejde dvoma reakciami v jednej mikroskuacutemavke štandardnou MLPA analyacutezou (bez štiepenia metylačne senzitiacutevnym enzyacutemom) a v druhej mikroskuacutemavke docircjde okrem ligaacutecie proacuteb aj k metylačne senzitiacutevnemu štiepeniu hybridizovanyacutech proacuteb s nemetylovanou DNA Amplifikujuacute sa len ligovaneacute proacuteby po PCR amplifikaacutecii sa fragmentačnou analyacutezou porovnaniacutem oboch reakciiacute zistia rozdiely v metylačnom profile vzorky k referenčnej vzorke

RT-MLPA (Reverse Transkriptase MLPA) je variaacutecia MLPA určenaacute pre zistenie mRNA profilu vzorky je alternatiacutevou k real-time PCR a mikročipom RT-MLPA nedeteguje mRNA množstvo priamo pretože použiacutevanaacute ligaacuteza nie je schopnaacute ligovať DNA oligonukleotidy keď suacute hybridizovaneacute s RNA Preto RT-MLPA začiacutena reverznou transkripciou so špeciaacutelne navrhnutyacutemi RT primermi tak aby vytvorili kraacutetke oligonukleotidy (cDNA) Potom reakcia pokračuje ako štandardnaacute MLPA

Obr 28 MLPA analyacuteza geacutenu DMD (koacutedujuacuteceho dystrofiacuten) mutaacutecie ktoreacuteho spocircsobujuacute Duchennovu svalovuacute dystrofiu u pacienta je priacutetomnaacute deleacutecia exoacutenu 45 v porovnaniacute s referenčnou vzorkou ndash kontrolou

32

Obr 29 MLPA analyacuteza geacutenu DMD (koacutedujuacuteceho dystrofiacuten) mutaacutecie ktoreacuteho spocircsobujuacute Duchennovu svalovuacute dystrofiu u pacienta suacute priacutetomneacute duplikaacutecie exoacutenov 41 42 43 44 45 (piacuteky vo vzorke pacienta sa porovnajuacute s piacutekmi v kontrole ndash referenčnej vzorke)

33

6 Sekvenovanie

Sekvenovaniacutem rozumieme určenie primaacuternej štruktuacutery DNA teda určenie poradia nukleotidov v reťazci DNA Začiatky moderneacuteho sekvenovania siahajuacute do roku 1977 kedy boli objaveneacute dve metoacutedy sekvenovania 1) chemickaacute metoacuteda Maxama a Gilberta 2) enzymatickaacute metoacuteda Sangera Nicklena a Coulsona

Princiacutep obidvoch metoacuted sekvenovania spočiacuteva v tom že sa vytvoriacute suacutebor DNA molekuacutel s rocircznou veľkosťou ktoreacute suacute zakončeneacute konkreacutetnym nukleotidom tieto DNA molekuly sa elektroforeticky separujuacute v geacuteloch s rozlišovacou schopnosťou 1 nukleotid 61 Chemickaacute metoacuteda

DNA molekuly sa na 5-konci raacutedioaktiacutevne označia raacutedioaktiacutevnym fosforom a naacutesledne sa chemicky modifikujuacute špecificky pre každuacute baacutezu DNA sa potom v modifikovanyacutech miestach štiepi čiacutem vzniknuacute rocirczne dlheacute fragmenty pričom podmienky suacute nastaveneacute tak aby sa DNA na každom mieste štiepila len raz Modifikaacutecia DNA a štiepenie prebehne v štyroch separaacutetnych reakciaacutech (skuacutemavkaacutech) takže po elektroforetickej separaacuteciiacute takto opracovanej DNA v štyroch draacutehach polyakrylamidoveacuteho geacutelu a naacuteslednej autoraacutediografii (podobne ako pri Southernovej hybridizaacutecii) je možneacute odčiacutetať nukleotidovuacute sekvenciu približne 100 nukleotidov od raacutedioaktiacutevneho označenia (v čase objavu Maxama a Gilberta) 62 Sangerova metoacuteda

Zaacuteklady metoacutedy boli popiacutesaneacute už v roku 1975 (metoacuteda plus a miacutenus) ale až vylepšenie použitiacutem dideoxynukleotidov (ddNTP) v roku 1977 došlo k zjednodušeniu sekvenovania Princiacutepom enzyacutemoveacuteho sekvenovania je terminaacutecia (zastavenie) polymerizaacutecie inkorporaacuteciou 2´ 3 -dideoxynukleotidov do novosyntetizujuacuteceho sa vlaacutekna DNA Keďže ddNTP neobsahujuacute hydroxylovuacute skupinu na 3 uhliacuteku riboacutezy nemocircžu sa zuacutečastniť na tvorbe fosfodiesterovej vaumlzby nemocircže sa pripojiť k nim ďalšiacute nukleotid čiže musiacute docircjsť k terminaacuteciiacute polymeraacutecie Reakcia prebieha v štyroch skuacutemavkaacutech s raacutedioaktiacutevne značenyacutem primerom V každej skuacutemavke suacute priacutetomneacute všetky štyri deoxynukleotidtrifosfaacutety (dNTP) ale pre každuacute skuacutemavku je špecifickyacute priacutedavok maleacuteho množstva jedneacuteho z dideoxynukleotidtrifosfaacutetov (v prvej skuacutemavke je ddATP v druhej ddCTP v tretej ddTTP a vo štvrtej ddGTP) Maleacute množstvo ddNTP spocircsobiacute že pri polymerizaacutecii dochaacutedza k prednostneacutemu zaradeniu štandardnyacutech dNTP do narastajuacuteceho reťazca a len občas sa inkorporuje ddNTP čiacutem sa zastaviacute synteacuteza reťazca V každej skuacutemavke tak vznikne suacutebor DNA fragmentov rocircznych veľkostiacute zakončenyacutech priacuteslušnyacutem ddNTP (v prvej skuacutemavke ddATP v druhej ddCTP v tretej ddTTP a vo štvrtej ddGTP) Po elektroforetickej separaacutecii v 4 draacutehach polyakrylamidoveacuteho geacutelu a autoraacutediografii sa z autoraacutediogramu odčiacuteta sekvencia

V suacutečasnosti je sekvenovanie do značnej miery automatizovaneacute pričom využiacuteva princiacutep Sangerovej enzyacutemovej metoacutedy s určityacutemi obmenami Uacutesek DNA ktoryacute treba sekvenovať sa prostredniacutectvom termostabilnyacutech DNA polymeraacutez namnožiacute PCR metoacutedou po ktorej nasleduje sekvenačnaacute reakcia (asymetrickaacute PCR) s fluorescenčne značenyacutemi ddNTP (každyacute druh označenyacute inyacutem fluorescenčnyacutem farbivom) Sekvenačnaacute reakcia prebieha v jednej skuacutemavke s jednyacutem primerom vznikne tak suacutebor jednovlaacuteknovyacutech DNA rocircznej dĺžky ktoreacute suacute na 3konci označeneacute ddNTP so špecifickyacutem fluorescenčnyacutem farbivom Taacuteto metoacuteda sekvenovania sa tiež nazyacuteva rdquodye-terminator cycle sequencingrdquo(obr 30) Po kapilaacuternej elektroforeacuteze vzorky v genetickom analyzaacutetore zaznamenaacutevaniacute fluorescencie jednotlivyacutech fragmentov CCD kamerou a softveacuterovom spracovaniacute sa ziacuteska sekvencia DNA (obr 31)

34

Obr 30 Princiacutep sekvenovania Sangerova dideoxy metoacuteda alebo tzv chain termination method (reťazec zastavujuacuteca metoacuteda) Obr 31 Určenie genotypu plodu a rodičov sekvenčnou analyacutezou DNA ziacuteskanej z plodovej vody (prenataacutelna diagnostika) a perifeacuternej krvi sekvenčnaacute analyacuteza geacutenu ASPA vyacutesledok u plodu priacutetomnaacute mutaacutecia c 914CgtA v homozygotnom stave (AA) rodičia heterozygoti (AC) Uvedenaacute mutaacutecia je v homozygotnom stave kauzaacutelnou priacutečinou Canavanovej choroby

Automatizovaneacute sekvenovanie prinaacuteša viacereacute vyacutehody oproti klasickej Sangerovej metoacutede vyššiu presnosť a ryacutechlosť v jednej sekvenačnej reakcii možnosť osekvenovať až 1200 nukleotidovyacute fragment maleacute množstvo templaacutetu potrebneacute na analyacutezu

35

63 Next Generation Sequencing (NGS)

NGS (sekvenovanie novej generaacutecie) maacute obrovskyacute potenciaacutel v analyacuteze genoacutemov pričom toto označenie zahŕňa viacereacute technologickeacute metoacutedy reprezentovaneacute niekoľkyacutemi firmami Princiacutepom je masiacutevne paralelneacute sekvenovanie čiacutem sa ziacuteskajuacute raacutedovo tisiacutece až milioacuteny sekvenciiacute naraz 631 Sekvenovanie druhej generaacutecie

Na začiatku sa analyzovanaacute DNA vo vaumlčšine priacutepadov fragmentuje (vznikne tak DNA

knižnica) na fragmenty sa pripoja kraacutetke sekvencie ndash adapteacutery naacutesledne sa tieto fragmenty rocircznymi priacutestupmi amplifikujuacute a určiacute sa ich sekvencia Vďaka čiastočnyacutem prekryvom je zo ziacuteskanyacutech sekvencii možneacute poskladať plynuluacute sekvenciu zodpovedajuacutecu pocircvodnej nefragmentovanej DNA

Pyrosekvenovanie je podobne ako Sangerova metoacuteda založenaacute na princiacutepe synteacutezy komplementaacuterneho vlaacutekna DNA avšak rozdiel je v tom že sa na detekciu inkorporaacutecie nukleotidu využiacuteva inyacute systeacutem tvorby luminiscenčneacuteho signaacutelu v priebehu reakcie Pyrosekvenovanie je umožneneacute vďaka aktivite 4 enzyacutemov - DNA polymeraacutezy ATP sulfurylaacutezy luciferaacutezy a apyraacutezy Reakčnaacute zmes obsahuje aj ďalšie komponenty - enzymatickeacute substraacutety adenoziacutenfosfosulfaacutet (APS) d-luciferiacuten sekvenovanyacute templaacutet a cyklicky postupne po jednom type pridaacutevaneacute nukleotidtrifosfaacutety Po zabudovaniacute nukleotidu do novovznikajuacuteceho reťazca docircjde k uvoľneniu pyrofosfaacutetu naacutesledne je využityacute ATP sulfurylaacutezou na synteacutezu ATP z APS počas ďalšej reakcie docircjde k využitiu ATP luciferaacutezou na premenu luciferiacutenu na oxyluciferiacuten čo spocircsobiacute svetelnyacute signaacutel a ten zaznamenaacute detekčnyacute systeacutem Poslednou enzymatickou reakciou je reakcia apyraacutezy ktoraacute odstraacuteni nezainkorporovaneacute nukleotidy a nevyužiteacute ATP aby sa celyacute proces mohol zopakovať s reakčnou zmesou obsahujuacutecou ďalšiacute nukleotidtrifosfaacutet (inyacute ako v predchaacutedzajuacutecej reakcii) Po každej reakcii detektor zaznamenaacuteva emisiu svetla na zaacuteklade intenzity svetla je možneacute určiť či bol vradenyacute priacuteslušnyacute nukleotidtrifosfaacutet či bol inkorporovanyacute jeden priacutepadne viac rovnakyacutech nukleotidtrifosfaacutetov

Zvyacutešenie vyacutekonu pyrosekvenovania umožnila tzv emulznaacute PCR v mikročasticiach a použitie platničky PicoTiterPlatereg toto sekvenovanie zaviedla firma Roche pod pojmom 454 pyrosekvenovanie v roku 2005 Na začiatku sa DNA fragmentuje na uacuteseky dlheacute 400-600 baacutez dvojvlaacuteknovaacute fragmentovanaacute DNA sa liguje s adapteacutermi prostredniacutectvom nich sa naviaže na mikročastice dvojvlaacuteknoveacute fragmenty sa oddelia mikročastice s naviazanyacutemi jednovlaacuteknovyacutemi fragmentami sa premiešajuacute so zmesou oleja a roztoku ktoryacute obsahuje všetky komponenty na uacutespešnuacute PCR Tyacutemto spocircsobom sa okolo každej mikročastice vytvoriacute vlastnyacute mikroreaktor v ktorom prebehne amplifikaacutecia fragmentu Po PCR reakcii sa mikročastice prenesuacute do platničky PicoTiterPlate v ktorej sa do jamky zmestiacute akuraacutet jedna mikročastica a reakčneacute komponenty pyrosekvenačnej reakcie PicoTiterPlatereg maacute 1 600 000 jamiek každaacute jamka maacute maximaacutelny objem 75 picolitra Platnička s mikročasticami sa vložiacute do sekvenačneacuteho systeacutemu ndash priacutestroja v ktorom sa celeacute pyrosekvenovanie uskutočniacute Chemiluminiscenčneacute signaacutely ktoryacutech počas sekvenovania vznikajuacute milioacuteny v priebehu hodiny suacute zachyteneacute CCD kamerou a analyzovaneacute softveacuterom

Firma Illumina predstavila inuacute technoloacutegiu PCR amplifikaacutecia a sekvenovanie sa uskutočňuje na skliacutečku (flow cell) Fragmentaacutecia DNA a pripojenie adapteacuterov prebieha za uacutečasti transpozoacutemov v procese nazvanom tagmentaacutecia Po hybridizaacutecii fragmentov DNA na skliacutečko prebehne v klastroch PCR amplifikaacutecia (tzv mostiacutekovaacute amplifikaacutecia) sekvenaacutecia prebieha za uacutečasti rozdielne fluorescenčne značenyacutech a chemicky modifikovanyacutech nukleotidov pričom každyacute nukleotid emituje fluorescenciu s inou vlnovou dĺžkou Na skliacutečku prebieha paralelne až 6 miliaacuterd sekvenaacutecii (obr 32)

Ďalšiacutemi možnosťami sekvenovania druhej generaacutecie je systeacutem SOLid (vyvinutyacute firmou Applied Biosystem dnes pod Thermo Fisher Scientific) a Ion Semiconductor Sequencing ndash polovodičoveacute ioacutenoveacute sekvenovanie (od firmy Ion Semiconductor Sequencing v suacutečasnosti Thermo Fisher Scientific)

36

Obr 32 Princiacutep sekvenovania novej generaacutecie od firmy Illumina PCR amplifikaacutecia a sekvenovanie sa uskutočňuje na skliacutečku (flow cell) paralelne prebieha až 6 miliaacuterd sekvenaacutecii

632 Sekvenovanie tretej generaacutecie

Pred sekvenovaniacutem netreba amplifikovať DNA PCR metoacutedou ale sekvencia sa ziacuteskava zachyteniacutem signaacutelu v reaacutelnom čase Medzi sekvenovanie tretej generaacutecie patriacute SMRT (Single Molecule Real-Time Sequencing) a Nanopore Sequencing

37

7 Fragmentačnaacute analyacuteza DNA

Je metoacuteda použiacutevanaacute na určenie veľkosti fragmentov DNA ziacuteskanyacutech PCR reakciou Dĺžka amplifikovanyacutech DNA fragmentov sa zistiacute ich porovnaniacutem s veľkostnyacutem štandardom (obr 33) ktoryacute je tvorenyacute DNA fragmentami znaacutemej dĺžky Veľkostnyacute štandard je pred kapilaacuternou elektroforeacutezou zmiešanyacute so vzorkou DNA fragmenty veľkostneacuteho štandardu suacute fluorescenčne označeneacute pričom použiteacute fluorescenčneacute farbivo je ineacute ako fluorescenčneacute farbivo použiteacute na označenie DNA fragmentov vo vyšetrovanej vzorke

Obr 33 Elektroforetogram veľkostneacuteho štandardu použiacutevaneacuteho na určenie veľkostiacute fragmentov analyzovanyacutech kapilaacuternou elektroforeacutezou v genetickom analyzaacutetore (GeneScantrade 500 LIZtrade dye Size Standard) dĺžka fragmentov v nukleotidoch (napr 50 nukleotidov)

Fragmentačnaacute analyacuteza pozostaacuteva z viaceryacutech krokov Prvyacutem je izolaacutecia DNA nasleduje PCR amplifikaacutecia počas ktorej sa novosyntetizovaneacute DNA fragmenty označia fluorescenčnyacutemi farbivami Vzorka s PCR produktom sa pripraviacute na kapilaacuternu elektroforeacutezu tak že sa zmieša s veľkostnyacutem štandardom (sluacuteži na určenie veľkosti fragmentov) a denaturačnou laacutetkou (formamid) nasleduje denaturaacutecia Pripraveneacute vzorky suacute injektovaneacute do priacutestroja (genetickyacute analyzaacutetor) kde v kapilaacutere naplnenej polymeacuterom v elektrickom poli migrujuacute fluorescenčne značeneacute fragmenty DNA na zaacuteklade veľkosti (kapilaacuterna elektroforeacuteza) Počas elektroforeacutezy genetickyacute analyzaacutetor zaznamenaacuteva fluorescenciu fragmentov Analyacutezou daacutet prostredniacutectvom špeciaacutelnych softveacuterov sa ziacuteskajuacute elektroforetogramy z ktoryacutech je možneacute zistiť veľkosť fragmentov ako aj typ fluorescencie (docircležiteacute ak suacute genetickeacute varianty rozliacutešiteľneacute rocircznou fluorescenciou napr SNaPshot) Fragmentačnaacute analyacuteza je suacutečasťou množstva molekulaacuterno-genetickyacutech metoacuted (pozri obr 12 26 28 29 34) ako suacute napr STR analyacuteza (Short Tandem Repeat) AFLP analyacuteza (Amplified Fragment Lenght Polymorfism) RFLPT-RFLP analyacuteza (Restriction Fragment Lenght PolymorfismTerminal Restricted Fragment Lenght Polymorfism) SSCP (Single Strand Conformation Polymorfism) VNTR (Variable Number of Tandem Repeat) analyacuteza straty heterozygotnosti (LOH loss of heterozygozity) MLPA (Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification) MSMSA (Methylation-Sensitive Mobility Shift Assay) SNP genotypovanie (SNaPshotreg) HiCEP (High-Coverage Expression Profiling)

38

Obr 34 Kvantitatiacutevna fragmentačnaacute PCR analyacuteza (QF-PCR) DNA izolovanej z plodovej vody vyacutesledok prenataacutelnej analyacutezy = priacutetomnosť troch piacutekov pre chromozoacutem 18 (u všetkyacutech fragmentov detegujuacutecich chromozoacutem 18 je pomer vyšetrovanyacutech markerov aberantnyacute 21 resp 111) čo znamenaacute trizoacutemiu chromozoacutemu 18 Edwardsov syndroacutem

39

8 Metoacutedy založeneacute na princiacutepe hybridizaacutecie

Nukleoveacute kyseliny majuacute schopnosť vytvaacuterať dvojvlaacuteknoveacute reťazce z jednovlaacuteknovyacutech molekuacutel na zaacuteklade komplementarity baacutez Komplementarita baacutez umožňuje replikaacuteciu DNA transkripciu RNA komplementarita baacutez zabezpečuje teda reprodukovateľnosť živej hmoty

Hybridizaacutecia je proces v ktorom na zaacuteklade komplementarity baacutez dochaacutedza k vytvoreniu dvojvlaacuteknovej nukleovej kyseliny z dvoch jednovlaacuteknovyacutech molekuacutel DNA alebo RNA alebo ich kombinaacuteciou DNA RNA pričom kratšia jednovlaacuteknovaacute nukleovaacute kyselina vystupuje ako sonda (proacuteba) Hybridizaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten je jeden z najpoužiacutevanejšiacutech naacutestrojov v molekulaacuternej bioloacutegii a genetike (hybridizaacutecia primerov alebo proacuteb sa využiacuteva v takmer každej metoacutede - v PCR RT-PCR qPCR RT-qPCR MLPA sekvenovaniacute fragmentačnej analyacuteze FISH DNA mikročipoch atď)

Denaturaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten je proces pri ktorom dochaacutedza k porušeniu vodiacutekovyacutech vaumlzieb medzi vlaacuteknami nukleovyacutech kyseliacuten (strata sekundaacuternej a terciaacutelnej štruktuacutery) tak že docircjde k ich uacuteplneacutemu oddeleniu vzniknuacute jednovlaacuteknoveacute reťazce Denaturaacutecia NK mocircže byť spocircsobenaacute vplyvom vysokyacutech teplocirct pH alebo chemickyacutech laacutetok (denaturačneacute činidlaacute) Renaturaacutecia je opačnyacute proces v ktorom na zaacuteklade komplementarity dochaacutedza k tvorbe dvojvlaacuteknovyacutech NK

Hybridiza čnaacute sonda (proacuteba) je jednovlaacuteknovaacute nukleovaacute kyselina určitej znaacutemej dĺžky a sekvencie (najčastejšie DNA pretože je stabilnejšia ako RNA) ktoraacute je značenaacute a sluacuteži na detekciu komplementaacuternych molekuacutel DNA alebo RNA v procese hybridizaacutecie V zaacutevislosti od podmienok hybridizaacutecie (stringencia) mocircže byť detegovanaacute sekvencia uacuteplne komplementaacuterna alebo v menej priacutesnych podmienkach mocircže mať sekvenčneacute odchyacutelky Proacuteba sluacuteži na vyhľadanie a zviditeľnenie cieľovyacutech NK Zviditeľnenie sa deje prostredniacutectvom označenia proacuteby ešte pred hybridizaacuteciou Značenie proacuteby mocircže byť raacutedioaktiacutevne a neraacutedioaktiacutevne (najčastejšie fluorescenčneacute)

Raacutedioaktiacutevne značeneacute proacuteby pomocou izotopov (32P) sa využiacutevali viac v minulosti v suacutečasnosti suacute kvocircli zdravotnyacutem rizikaacutem ohľaduplnosti k životneacutemu prostrediu ako aj kvocircli jednoduchšej manipulaacutecii použiacutevaneacute fluorescenčne značeneacute proacuteby Raacutedioaktiacutevne značeneacute sondy boli použiacutevaneacute hlavne metoacutedou Southernovej hybridizaacutecie (Southern blotting Southern blot) Citlivosť raacutedioaktiacutevne značenyacutech proacuteb je vyššia dosahuje schopnosť zachytiť 10 fg (femtogram 10-15) cieľovej DNA sekvencie 81 Southern blot

Metoacutedu objavil v roku 1975 britskyacute bioloacuteg Edwin Southern (preto Southern) Pri Southernovej hybridizaacutecii sa restrikčne štiepeneacute fragmenty DNA elektroforeticky separujuacute v geacuteli potom sa metoacutedou blottingu prenesuacute na nylonovuacute alebo nitroceluloacutezovuacute membraacutenu kde suacute naacutesledne hybridizovaneacute v roztoku obsahujuacutecom raacutedioaktiacutevne značenuacute sondu Priloženiacutem fotografickeacuteho filmu k membraacutene a vyvolaniacutem filmu autoraacutediografiou docircjde k zviditeľneniu lokaliacutet kde došlo k hybridizaacuteciiacute raacutedioaktiacutevne značenej sondy s fragmentom DNA (autoraacutediogram) Southern blot bol kľuacutečovou a prvou metoacutedou na identifikaacuteciu osocircb (DNA fingerprinting DNA pofiling) (obr 35)

Okrem Southern blotu existuje Northern blot na analyacutezu RNA (geacutenovej expresie) a Western blot na analyacutezu proteiacutenov postup je obdobnyacute ako pri Southern blote s obmenami špecifickyacutemi pre konkreacutetny blot Pri Northern blote sa použiacutevajuacute hybridizačneacute proacuteby ale pre vizualizaacuteciu proteiacutenov western blotom je potrebneacute použiť protilaacutetky s naacuteslednou vizualizaacuteciou Pomenovanie techniacutek je hra so sloviacutečkami (keďže paacuten Northern ani Western neobjavili takto nazvaneacute techniky)

Neraacutedioaktiacutevne značenie proacuteb použiacutevanyacutech v molekulaacuternej genetike mocircže byť nepriame (použitie haptenu) alebo priame Konečnaacute vizualizaacutecia je najčastejšie zabezpečenaacute fluoreskujuacutecimi farebnyacutemi značkami farbivami fluorochroacutemami (fluorofoacuterami) Pri priamom značeniacute je farbička kovalentne naviazanaacute na nukleotid a na zachytenie fluorescencie suacute potrebneacute špeciaacutelne priacutestroje umožňujuacutece excitaacuteciu farbičky ktoraacute potom emituje žiarenie určitej vlnovej dĺžky (emisneacute žiarenie) a to zachytiacute detekčnyacute systeacutem priacutestroja Využitie fluorochroacutemov v molekulaacuternej genetike je masiacutevne napr na vizualizaacuteciu NK elektroforeticky separovanyacutech v geacuteli kvantifikaacuteciu produktov PCR reakcie v priacutestroji real-time PCR cykleacuter sekvenovaniacute fragmentačnej analyacuteze FISH DNA mikročipoch atď

40

Obr 35 Princiacutep Southern blotu

82 FISH (fluorescenčnaacute in situ hybridizaacutecia)

FISH (fluorescent in situ hybridization fluorescenčnaacute in situ hybridizaacutecia) metoacuteda patriacute medzi molekulovo-cytogenetickeacute techniky Princiacutep FISH metoacutedy je založenyacute na hybridizaacuteciiacute fluorescenčne značenyacutech proacuteb ku komplementaacuternym uacutesekom vyšetrovanej DNA na podložnom skle (priamo na mieste - in situ) K denaturaacutecii dsDNA dochaacutedza buď vplyvom denaturačnyacutech činidiel alebo zvyacutešenou teplotou a naacuteslednou renaturaacuteciou dochaacutedza k naviazaniu sondy na komplementaacuterny uacutesek DNA Vyacutesledok hybridizaacutecie sa vizualizuje fluorescenčnyacutem mikroskopom vybavenyacutem vhodnyacutemi fluorescenčnyacutemi filtrami a vizuaacutelne zhodnotiacute skuacutesenyacutem odborniacutekom Fluorescencia sa v niektoryacutech priacutepadoch mocircže zaznamenať a hodnotiť aj pomocou softveacuteru (obr 36)

Pomocou FISH detegujeme numerickeacute aberaacutecie - zmeny v počte chromozoacutemov (napr trizoacutemia monozoacutemia chromozoacutemov) alebo štruktuacuterne aberaacutecie a prestavby (napr translokaacutecie inverzie deleacutecie duplikaacutecie amplifikaacutecie) FISH metoacuteda umožňuje identifikaacuteciu a detekciu každeacuteho ľudskeacuteho chromozoacutemu jeho zaradenie do karyotypu odhalenie malyacutech submikroskopickyacutech chromozoacutemovyacutech zmien a tiež mapovať poziacutecie jednotlivyacutech geacutenov na chromozoacuteme

41

Obr 36 Princiacutep štandardnej FISH a FISH maľovania celeacuteho chromozoacutemu

Veľkou vyacutehodou FISH metoacutedy je možnosť analyacutezy buniek v metafaacuteze aj v interfaacuteze kedy nie je nutnaacute kultivaacutecia buniek a tiež ryacutechle analyzovanie veľkeacuteho počtu buniek (stovky až tisiacutece) K ďalšiacutem vyacutehodaacutem patriacute bezpečnosť vysokaacute citlivosť dostatočnaacute stabilita relatiacutevne kraacutetky čas hybridizaacutecie a možnosť ryacutechleho vyhodnotenia Hybridizaacutecia pri vaumlčšine suacutečasne dodaacutevanyacutech sond trvaacute 10-12 hodin (na trhu suacute už dostupneacute aj sondy so skraacutetenyacutem časom hybridizaacutecie na 2-3 hodiny) Po hybridizaacuteciiacute nasleduje odmyacutevanie kedy pri priacuteslušnej teplote dochaacutedza k odmytiu nenaviazanyacutech a nespraacutevne hybridizovanyacutech sond Preparaacutet sa naacutesledne podfarbiacute a vyacutesledok sa zhodnotiacute vo fluorescenčnom mikroskope Na podfarbenie chromozoacutemov alebo jadier sa použiacuteva modreacute kontrastneacute farbivo DAPI (46-diamidino-2-fenylindol) ktoreacute maacute silneacute fluorescenčneacute vlastnosti dokaacuteže prechaacutedzať jadrovou membraacutenou a viazať sa na DNA Vyacutesledkom je modreacute zafarbenie ktoreacute vyacuteborne kontrastuje so signaacutelmi jednotlivyacutech sond

Limitujuacutecim faktorom FISH je možnosť identifikaacutecie len tyacutech uacutesekov DNA ku ktoryacutem suacute použiteacute sondy V jednej analyacuteze je možneacute použiť najviac 3 odlišne značeneacute sondy a tak zistiť priacutepadneacute abnormality len na 1 alebo na paacuter lokusoch Na relevantnuacute detekciu je potrebneacute mať vo vzorke 1-5 aberantnyacutech interfaacutezovyacutech jadier

FISH je možneacute uskutočniť na širokej škaacutele biologickeacuteho materiaacutelu na vzorkaacutech perifeacuternej krvi kostnej drene naacuteteroch choriovyacutech klkoch plodovej vode rocircznych druhov tkaniacutev natiacutevnych alebo zaliatych v parafiacutene na 1 bunke (predimplantačnaacute genetickaacute diagnostika PGD) (obr 37)

Využiacuteva sa na detekciu aberaacuteciiacute pri mnohyacutech onkologickyacutech ochoreniach (napr pri diagnoacuteze mnohopočetnyacute myeloacutem sa v suacutečasnosti po separaacutecii CD138+ buniek robiacute FISH s 5 sondami pre geacuteny IGH TP53 RB1 oblasť 1p321q21 a stanovuje sa hyperploidia chromozoacutemov 5 9 a 15) a tiež k spresneniu doplneniu a k overeniu bežneacuteho cytogenetickeacuteho vyšetrenia

Podľa miesta na chromozoacuteme na ktorom dochaacutedza k hybridizaacutecii sondy rozlišujeme 4 typy

DNA sond bull centromeacuteroveacute sondy ndash sa viažu na strednuacute časť chromozoacutemu ndash centromeacuteru sluacutežia k diagnostike zmien v počte chromozoacutemov k detekcii chromozoacutemov neznaacutemeho pocircvodu umožňujuacute interfaacuteznu FISH na nedeliacich sa bunkaacutech (obr 38-41)

42

Obr 37 Interfaacutezna FISH preimplantačnyacute genetickyacute skriacutening aneuploidiiacute ndash blastomeacutera 3-denneacuteho ľudskeacuteho embrya s normaacutelnym počtom chromozoacutemov 13 18 21 pohlavie XY použityacutech 5 sond pre chromozoacutemy 13 ndash orange 18 ndash aqua 21 ndash green X ndash blue a Y ndash yellow (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

Obr 38 Interfaacutezne jadro po hybridizaacutecii s centromeacuterovou sondou pre chromozoacutem 8 (Vysis Abbott) V pravom jadre je priacutetomnaacute trizoacutemia chromozoacutemu 8 (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex) Obr 39 Metafaacutezna (A) a interfaacutezna FISH (B) použitaacute centromeacuterovaacute sonda CEPX spectrum orangeCEPY spectrum green (Vysis Abbott) Sonda hybridizuje k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (červenyacute signaacutel) a Y (zelenyacute signaacutel) (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

43

Obr 40 Interfaacutezna FISH vyšetrenie spermiiacute použiteacute sondy CEPX greenCEPY orange (Aneuscore Metasystems) Sondy hybridizujuacute k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (zelenyacute signaacutel) Y (červenyacute signaacutel) vľavo ndash dve haploidneacute spermie (majuacutece jedna spermia X druhaacute Y chromozoacutem) vpravo ndash dve patologickeacute spermie obsahujuacutece gonozoacutemovyacute komplement XY (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

Obr 41 Interfaacutezna FISH vyšetrenie spermiiacute použiteacute sondy CEPX greenCEPY orange a CEP18 aqua (Aneuscore Metasystems) Sondy hybridizujuacute k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (zelenyacute signaacutel) Y (červenyacute signaacutel) a 18 (modryacute signaacutel) vľavo ndash normaacutelne haploidneacute ľudskeacute spermie - 1x chromozoacutem X alebo Y a jedenkraacutet chromozoacutem 18 v strede ndash patologickaacute spermia obsahujuacuteca gonozoacutemovyacute komplement XY a jeden chromozoacutem 18 vpravo ndash patologickaacute diploidnaacute spermia s chromozoacutemami X Y a dvoma chromozoacutemami 18 (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

bull lokusovo špecifickeacute sondy ndash hybridizaacutecia prebehne na konkreacutetnom mieste geacutenu (lokuse) (obr 42-44) použiacutevajuacute sa k vyšetreniu mikrodeleacuteciiacute (straty malyacutech častiacute chromozoacutemu pri mikrodelečnyacutech syndroacutemoch) k zisteniu amplifikaacutecie onkogeacutenov a niektoryacutech špecifickyacutech translokaacuteciiacute prestavby geacutenov umožňujuacute interfaacuteznu FISH na nedeliacich sa bunkaacutech bull subtelomeroveacute ndash vaumlzba na koncoveacute časti chromozoacutemu ndash telomeacutery bull celochromozoacutemoveacute alebo celomaľovacie sondy ndash sondy hybridizujuacute s mnohopočetnyacutemi chromozoacutemovyacutemi sekvenciami pričom sa fluorescenčne tak bdquovymaľujeldquo celyacute chromozoacutem (Obr 45) Použiacutevajuacute sa na vyšetrenie chromozoacutemovyacutech prestavieb k analyacuteze translokaacuteciiacute a k detekcii pocircvodu tzv marker chromozoacutemov (malyacutech nadpočetnyacutech chromozoacutemov neznaacutemeho pocircvodu) K použitiu sondy suacute potrebneacute metafaacutezne chromozoacutemy nepoužiacutevaju sa pre interfaacuteznu FISH

Pri konvenčnej chromozoacutemovej FISH suacute homogeacutenne DNA proacuteby hybridizovaneacute s fixovanyacutem metafaacuteznym alebo prometafaacuteznym chromozoacutemomchromozoacutemami na skliacutečku (Obr 36a) Maximaacutelna rozlišovacia schopnosť metafaacuteznej FISH je niekoľko megabaacutez (Obr 39a 45) využitiacutem viac

44

natiahnutyacutech prometafaacuteznych chromozoacutemov sa dosiahne 1 Mb rozliacutešenie Prostredniacutectvom fiber FISH konkreacutetne artificiaacutelne deproteinizovanej natiahnutej DNA pripravenej in situ z celyacutech buniek na mikroskopickom skliacutečku je možneacute vizualizovať individuaacutelne geacuteny maleacute DNA elementy na chromozoacuteme s rozliacutešeniacutem okolo 1000 bp

Obr 42 Interfaacutezne jadro po hybridizaacutecii s lokusovo-špecifickou sondou LSI 5q31 Spectrum Orange5p12 Spectrum Green (Vysis Abbott) Na ľavom obraacutezku suacute priacutetomneacute dva červeneacute (5q31) a dva zeleneacute signaacutely (5p12) v pravom jadre je priacutetomnaacute deleacutecia 5q31 oblasti chyacuteba jeden červenyacute signal (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

Obr 43 Interfaacutezna FISH použitaacute lokusovo-špecifickaacute sonda ndash translokačnaacute - XL BCRABL1 plus (Metasystems) dvojfarebnaacute dvojfuacutezna kde červenaacute označuje lokus ABL1 na chromozoacuteme 9 a zelenaacute oblasť BCR na chromozoacuteme 22 Sonda deteguje fuacuteziu protoonkogeacutenu ABL1 (9q34) a geacutenu BCR (22q11) v priacutepade že červenyacute a zelenyacute signaacutel suacute pri sebe (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

45

Obr 44 Interfaacutezna FISH Použitaacute lokusovo-špecifickaacute sonda- typ break apart pre IGH geacuten V docircsledku translokaacutecie došlo k rozskočeniu geacutenu pričom translokačneacuteho partnera nepoznaacuteme vieme určiť len percento v koľkyacutech jadraacutech je geacuten prestavanyacute (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex) Obr 45 Použiteacute celochromozoacutemoveacute sondy WCP 15 (červenyacute chromozoacutem) a WCP 17 (zelenyacute chromozoacutem) Na metafaacuteze je potvrdenaacute reciprokaacute translokaacutecia t(1517)(q2221) (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

FISH vizualizaacutecia celeacuteho chromozoacutemu maľovanie chromozoacutemu anglicky chromosome

painting je špeciaacutelnou aplikaacuteciou chromozoacutemovej FISH proacuteba je koktail veľkeacuteho počtu rocircznych fluorescenčne značenyacutech DNA fragmentov hybridizujuacutecich pozdĺž celeacuteho konkreacutetneho chromozoacutemu (obr 36b 45) bdquoChromosomepaintingldquo analyzuje metafaacutezne chromozoacutemy V minulosti bola FISH vizualizaacutecia celyacutech chromozoacutemov limitovanaacute malyacutem množstvom rocirczne sfarbenyacutech fluorochroacutemov

V suacutečasnosti je možneacute detegovať množstvo cieľovyacutech sekvenciiacute naraz čo sa využiacuteva pri celogenoacutemovej chromozoacutemovej vizualizaacutecii (whole-chromosomepainting - WCP) metoacutedou multiplex FISH (M-FISH multicolor FISH o br 46) alebo spektraacutelnej karyotypizaacutecie (SKY) kedy možno rozliacutešiť všetky ľudskeacute chromozoacutemy ndash teda 24 rocircznych chromozoacutemov M-FISH a SKY patria medzi metafaacutezne formy FISH diagnostiky ktoreacute umožňujuacute simultaacutennu vizualizaacuteciu všetkyacutech ľudskyacutech chromozoacutemov v rocircznych farbaacutech čo predstavuje uľahčenie analyacutezy karyotypu hlavne pri komplexnyacutech zmenaacutech a markeroch neznaacutemeho pocircvodu Obe techniky vychaacutedzajuacute z použitia

46

celochromozoacutemovyacutech sond značenyacutech kombinaacuteciou viaceryacutech fluorochroacutemov Rozdiel medzi M-FISH a SKY spočiacuteva v technike ziacuteskania konečneacuteho obrazu

Obr 46 Multicolor FISH - každyacute chromozoacutemovyacute paacuter je zafarbenyacute inou farbou pričom na ich zafarbenie postačuje kombinaacutecia 5 fluorochroacutemov Na vyhodnocovanie je potrebnaacute špeciaacutelna sada fluorescenčnyacutech filtrov pre jednotliveacute fluorochroacutemy a špeciaacutelnyacute softweacuter Vľavo-štandardnyacute karyotyp vpravo karyotyp s mutaacuteciami (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

V molekulovej cytogenetike suacute komerčne dostupneacute sety M-FISH proacuteb umožňujuacutece

viacfarebneacute pruacutežkovanie chromozoacutemov (banding) s vysokyacutem rozliacutešeniacutem (multicolor-banding mBAND FISH MCB) čo umožňuje identifikaacuteciu intrachromozoacutemovyacutech prestavieb (Obr 47) Nevyhnutnosťou mBAND-u je mať chromozoacutemy v metafaacuteze Taacuteto metoacuteda bola prvyacutekraacutet uskutočnenaacute na chromozoacuteme 5 v roku 1999 mBAND FISH umožňuje rozliacutešiť špecifickeacute oblasti chromozoacutemov na uacuterovni pruacutežku - bandu a sub-bandu s detekciou 550 bandov haploidneacuteho karyotypu

Obr 47 A - mBAND chromozoacutemu 11 - inverzia duplikovanej oblasti 11q223-q25 B - mBAND chromozoacutemu 3 - na kruhovom chromozoacuteme deleacutecia oblasti 3p263 C - mBAND chromozoacutemu 2 - potvrdenie inverzie duplikovanej časti chromozoacutemu (poskytnuteacute RNDr Dagmar Landlovou Medirex)

FISH metoacuteda a jej varianty (M-FISH mBAND SKY) majuacute v suacutečasnosti širokeacute využitie v

klinickej genetike v onkologickej genetike na detekciu aberaacuteciiacute v čase diagnoacutezy počas liečby po

47

liečbe monitorovanie po transplantaacutecii kostnej drene v prenataacutelnej a postnataacutelnej diagnostike pri detekcii submikroskopickyacutech deleacuteciiacute (napr DiGeorge syndroacutem - 22q112 delečnyacute syndroacutem PraderndashWilli syndroacutem- chromozoacutem 15q11-13) prostredniacutectvom FISH je možnaacute detekcia numerickyacutech zmien chromozoacutemov (trizoacutemia chromozoacutemu 21 pri Downovom syndroacuteme trizoacutemia chromozoacutemu 15 pri Patauovom syndroacuteme trizoacutemia chromozoacutemu 18 pri Edwardsovom syndroacuteme) rocirczne zmeny v počte pohlavnyacutech chromozoacutemov (monozoacutemia X pri Turnerovom syndroacuteme Klinefelterov syndroacutem s X chromozoacutemom naviac - XXY) podobne v predimplantačnej diagnostike

83 DNA Microarray (DNA mikro čip biočip) DNA mikročipovanie je technika využiacutevajuacuteca hybridizaacuteciu skuacutemanej nukleovej kyseliny

(cieľovaacute vzorka) s veľkyacutem množstvom oligonukleotidovyacutech proacuteb (desať tisiacutec až milioacuten) ktoreacute suacute prichyteneacute na pevnyacute podklad najčastejšie sklenyacute silikoacutenovyacute alebo nylonovyacute (doštička čip) Skuacutemanaacute nukleovaacute kyselina je pred hybridizaacuteciou fragmentovanaacute označenaacute fluorofoacuterom a denaturovanaacute Po kontakte čipu s cieľovou vzorkou ktoraacute je vlastne zmes označenyacutech oligonukleotidov značeneacute oligonukleotidy hybridizujuacute s oligonukleotidovyacutemi sekvenciami prichytenyacutemi na čipe Potom suacute na zaacuteklade fluorescencie detekovaneacute miesta kde došlo k hybridizaacutecii čiže vzorka obsahovala takuacuteto nukleotidovuacute sekvenciu Z jedneacuteho mikročipu sa ziacuteska obrovskeacute množstvo daacutet ktoreacute je vždy nutneacute softveacuterovo spracovať V dnešnej dobe existuje niekoľko firiem poskytujuacutecich komerčne mikročipy na objednaacutevku alebo si ich laboratoacuteria produkujuacute sami

Mikročipovanie prebieha nasledovne

1) Vytvorenie DNA čipu ndash tisiacutece rocircznych jednovlaacuteknovyacutech DNA oligonukleotidov znaacutemych sekvencii sa kovalentne naviažu na povrch doštičky vždy v určitej lokalite je niekoľko rovnakyacutech oligonukleotidov veľkosť takejto lokality je ˂ 200 microm Proacutebami mocircže byť DNA cDNA alebo syntetizovaneacute oligonukleotidy Už hotoveacute mikročipy ponuacutekajuacute viacereacute firmy (Affymetrix Agilent Technologies Eppendorf Illumina) alebo si ich jednotliveacute laboratoacuteria vyraacutebajuacute sami pomocou robotickyacutech zariadeniacute DNA čip sa vytvaacutera buď nanaacutešaniacutem kvapiek oligonukleotidov na podklad alebo synteacutezou oligonukleotidov in situ na čipe 2) Priacuteprava vzorky ndash nukleovaacute kyselina (mRNA DNA) sa purifikuje určiacute sa jej kvantita a kvalita (spektrofotometericky) fragmentuje resp v priacutepade mRNA sa syntetizuje cDNA v priacutepade potreby sa mocircže DNA amplifikovať PCR reakciou štiepiť restrikčnyacutemi endonukleaacutezami 3) Fluorescenčneacute označenie (zriedkavejšie raacutedioaktiacutevne) fragmentov DNA prebieha počas reverznej transkripcie alebo PCR amplifikaacutecie za uacutečasti fluorescenčne značenyacutech nukleotidov Keď sa analyzujuacute dve rocirczne vzorky napr zdraveacute tkanivo a naacutedoroveacute tkanivo označenie nukleovyacutech kyseliacuten v tyacutechto tkanivaacutech byacuteva rozdielne a to použitiacutem dvoch rocircznych fluorescenčnyacutech farbiacutev (napr zeleneacute a červeneacute) Pred hybridizaacuteciou je potrebneacute vzorku denaturovať čiacutem sa vytvoriacute zmes jednovlaacuteknovyacutech DNA označenyacutech značkou 4) Hybridizaacutecia s mikročipom ndash v špeciaacutelnom hybridizačnom roztoku hybridizujuacute komplementaacuterne sekvencie zo vzorky s priacuteslušnyacutemi oligonukleotidovyacutemi sondami naviazanyacutemi na čipe Potom sa čip obmyje aby došlo k odstraacuteneniu čiastočne hybridizovanyacutech nukleovyacutech kyseliacuten 5) Skenovanie mikročipu ndash skenerom čipov docircjde k ožiareniu čipu laserom pričom v mieste hybridizaacutecie fluorescenčne značenyacutech DNA fragmentov s proacutebou docircjde k emisii svetla určitej vlnovej dĺžky ktoruacute skener zaznamenaacute 6) Analyacuteza daacutet prebieha metoacutedami bioinformatiky spracovaniacutem softveacutermi sa zistiacute ktoreacute lokality čipu navzaacutejom hybridizovali v priacutepade použitia dvoch vzoriek kontrolnej a skuacutemanej je možneacute analyzovať ich relatiacutevnu intenzitu hybridizaacutecie (expresie určiteacuteho geacutenu)

Existujuacute štyri typy mikročipov 1) Čipy ur čeneacute na analyacutezu expresie (obsahujuacute cDNA proacuteby) pre tzv dvojkanaacutelovyacute experiment kedy je vzorka určenaacute k hybridizaacutecii na čipe ziacuteskanaacute zmiešaniacutem DNA fragmentov kontrolnej a skuacutemanej vzorky pričom fragmenty suacute rozdielne fluorescenčne označeneacute (napr zelenyacute fluorofoacuter pre kontrolnuacute vzorku a červenyacute pre skuacutemanuacute) Na zaacuteklade intenzity a typu fluorescencie sa deteguje expresia geacutenov typickaacute pre kontrolnuacute vzorku (napr zelenaacute fluorescencia) pre skuacutemanuacute vzorku (napr

48

červenaacute fluorescencia) a expresia podobnaacute u oboch vzoriek (žltaacute fluorescencia) neexprimovaneacute geacuteny (čierna fluorescencia) rocirczne odtiene (v zaacutevislosti od prevažujuacutecej hybridizaacutecie) (obr 48) 2) Čipy ur čeneacute na analyacutezu mutaacutecii použije sa genoacutemovaacute DNA označenaacute jednou fluorescenčnou farbičkou na určenie jednonukleotidovej zmeny (SNP ndash Single Nukleotide Polymorphism) 3) Čipy na komparatiacutevnu genoacutemovuacute hybridizaacuteciu (aCGH array Comparative Genomic Hybridization) ndash použiacutevaneacute na zistenie zvyacutešenia alebo zniacuteženia množstva chromozoacutemovyacutech fragmentov obsahujuacutecich geacuteny zodpovedneacute za určiteacute ochorenie Na analyacutezu sa použije skuacutemanaacute gDNA a referenčnaacute (kontrolnaacute) DNA každaacute sa značiacute inou fluorescenčnou farbičkou (princiacutep ako pri analyacuteze expresie) (obr 49 50) 4) Čipy CGH - SNP kombinovaneacute čipy ur čeneacute na analyacutezu aj mutaacuteciiacute SNP aj na komparatiacutevnu genoacutemovuacute hybridizaacuteciu CGH

Mikročipy majuacute rozsiahle využitie napriacuteklad v identifikaacuteciiacute novyacutech geacutenov vo vyacuteskume ich funkciiacute expresie v rocircznych podmienkach pri diagnostike mnohyacutech ochoreniacute vo farmakogenomike vo vyacuteskume vplyvu toxiacutenov

Obr 48 Heatmapa geacutenovej expresie vybranyacutech geacutenov (mRNA) mikročip obsahuje 46000 cDNA proacuteb (poskytnuteacute Ing Helenou Gbelcovou PhD Uacutestav lekaacuterskej bioloacutegie genetiky a klinickej genetiky LF UK a UNB)

49

Obr 49 Princiacutep komparatiacutevnej genoacutemovej hybridizaacutecie (aCGH - array comparative genomic hybridization) Obr 50 A) Vyacutesledok komparatiacutevnej genoacutemovej hybridizaacutecie (aCGH - array comparative genomic hybridization) vzorky DNA izolovanej plodovej vody U plodu s abnormaacutelnym ultrasonografickyacutem vyšetreniacutem bola identifikovanaacute duplikaacutecia oblasti 3q261q29 (modryacute paacutes) a deleacutecia oblasti 5p1533p151 (červenyacute paacutes) Pre porovnanie chromozoacutem 1 bez aberaacutecie b) Ten istyacute pacient ale ineacute softveacuteroveacute spracovanie (poskytnuteacute RNDr Miroslavom Tomkom PhD Medirex)

50

Odporuacutečanaacute a použitaacute literatuacutera

Odborneacute knihy Klug W S Cummings M R Spencer Ch A Palladino M A Concepts of Genetics jedenaacuteste vydanie (2015) Carson S Molecular Biology Techniques tretie vydanie (2012) Strachan T Read A Human Molecular Genetics štvrteacute vydanie (2011) Sudbery P Sudbery I Human Molecular Genetics tretie vydanie (2009)

Internetoveacute straacutenky

wwwncbinlmnihgov wwwmlpacom wwwthermofishercom wwwilluminacom wwwpromegask wwwqiagencom wwwambioncom

Odborneacute člaacutenky Chacon-Cortes D Griffiths L R Methods for extracting genomic DNA from whole blood samples current perspectives Journal of Biorepository Science for Applied Medicine Volume 2 strany 1- 9 Viltrop T Krjutskov K Palta P Metspalu A Comparison of DNA extraction methods for multiplex polymerase chain reaction Anal Biochem 2010 Volume 398(2) strany 260-262 Ing Martin Čermaacutek Molekulaacuterna cytogenetika v problematike familiaacuternych maligniacutet Onkoloacutegia Volume 2 strany 77 - 83 Livak KJ Schmittgen TD Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method Methods 2001 Volume 25(4) strany 402 - 408 Bustin S A Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays J Mol Endocrinol 2000 Volume 25(2) strany169 - 193

MOLEKULAacuteRNE METOacuteDY AKTUAacuteLNE POUŽIacuteVANEacute V KLINICKEJ GENETIKE RNDr Andrea Pastoraacutekovaacute PhD RNDr Robert Petrovič PhD Vydala Univerzita Komenskeacuteho v Bratislave Lekaacuterska fakulta Rozsah 50 straacuten 246 AH prveacute vydanie ISBN 978-80-223-4231-5

MOLEKULAacuteRNE METOacuteDY AKTUAacuteLNE POUŽIacuteVANEacute V KLINICKEJ GENETIKE Vysokoškolskaacute učebnica pre pregraduaacutelne a postgraduaacutelne štuacutedium na lekaacuterskych fakultaacutech RNDr Andrea Pastoraacutekovaacute PhD RNDr Robert Petrovič PhD Univerzita Komenskeacuteho v Bratislave Lekaacuterska fakulta

copy RNDr Andrea Pastoraacutekovaacute PhD a RNDr Robert Petrovič PhD Univerzita Komenskeacuteho v Bratislave Lekaacuterska fakulta 2016 Recenzenti prof RNDr Vanda Repiskaacute PhD doc MUDr Jaacuten Chandoga CSc Všetky praacuteva vyhradeneacute Toto dielo ani žiadnu jeho časť nemožno reprodukovať ukladať do informačnyacutech systeacutemov alebo inak rozširovať bez piacutesomneacuteho suacutehlasu majiteľov autorskyacutech praacutev ISBN 978-80-223-4231-5

2

Obsah Predhovor 3 1 Izolaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten 4 11 Izolaacutecia DNA 4 12 Izolaacutecia RNA 5 2 Stanovenie kvantity a kvality nukleovyacutech kyseliacuten 8 21 Spektrofotometrickaacute kvantifikaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten 8 22 Kvantifikaacutecia s použitiacutem fluorescenčnyacutech farbiacutev 8 221 Využitie migraacutecie nukleovej kyseliny v geacuteli s jej naacuteslednou fluorescenčnou

detekciou 8

222 Využitie kvantifikaacutecie množstva nukleovyacutech kyseliacuten použitiacutem real-time PCR metoacutedy

9

223 Kvantifikaacutecia fluorospektrofotometrom (fluorimetrom) 9 3 PCR (polymeraacutezovaacute reťazovaacute reakcia) 11 31 Najdocircležitejšie PCR komponenty 11 32 Variaacutecie PCR 13 33 Kvantitatiacutevna PCR (qPCR) 16 331 Kvantifikaacutecia pomocou qPCR 18 332 Určenie genotypu metoacutedou alelovej diskriminaacutecie a analyacutezou krivky topenia

(HRM)

20 4 Elektroforetickaacute separaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten 23 41 Vizualizaacutecia DNA 25 42 RFLP 25 43 VNTR a STR 27 5 MLPA 29 6 Sekvenovanie 33 61 Chemickaacute metoacuteda 33 62 Sangerova metoacuteda 33 63 Next Generation Sequencing (NGS) 35 631 Sekvenovanie druhej generaacutecie 35 632 Sekvenovanie tretej generaacutecie 36 7 Fragmentačnaacute analyacuteza DNA 37 8 Metoacutedy založeneacute na princiacutepe hybridizaacutecie 39 81 Southern blot 39 82 FISH (fluorescent in situ hybridization) 40 83 DNA Microarray (DNA mikročip biočip) 47

3

Predhovor

Genetika prekonala v poslednyacutech desaťročiach obrovskyacute pokrok Začiatok predstavoval zavedenie cytogenetickyacutech metoacuted pokračovanie v podobe osekvenovania celeacuteho ľudskeacuteho genoacutemu čo viedlo v suacutečasnosti k možnosti masiacutevneho paralelneacuteho sekvenovania jednotlivcov metoacutedou sekvenovania novej generaacutecie veduacuteceho k ziacuteskaniu raacutedovo tisiacutecov až milioacutenov sekvenciiacute naraz Cieľ ako aj spocircsob spracovania predloženeacuteho textu je zameranyacute na potreby pregraduaacutelneho a postgraduaacutelneho štuacutedia mediciacutenskej komunity Noveacute laboratoacuterne metoacutedy priacutestrojoveacute vybavenie a predovšetkyacutem molekulaacuterno-genetickyacute pokrok sa preniesol do mediciacutenskej praxe s prenikaniacutem do takmer všetkyacutech mediciacutenskych špecializaacuteciiacute Preto je nevyhnutneacute aby si študenti a lekaacuteri tieto noveacute poznatky a trendy osvojili a naacutesledne ich dokaacutezali využiacutevať v klinickej praxi Publikaacutecia sumarizuje a vysvetľuje molekulaacuterno-genetickeacute metoacutedy ktoreacute suacute v suacutečasnosti využiacutevaneacute za uacutečelom genetickej diagnostiky

Autori

4

1 Izolaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten 11 Izolaacutecia DNA

Prvuacute izolaacuteciu DNA uskutočnil v roku 1869 švajčiarsky vedec Friedrich Miescher Izolaacutecia DNA je kľuacutečovyacutem krokom pre množstvo naacuteslednyacutech aplikaacutecii v oblasti molekulovej bioloacutegie a lekaacuterskej genetiky Najčastejšiacutem a najdostupnejšiacutem materiaacutelom vhodnyacutem na izolaacuteciu ľudskej genoacutemovej DNA suacute leukocyty krvi DNA je možneacute ziacuteskať aj z inyacutech tkaniacutev a telesnyacutech tekutiacuten ako suacute napriacuteklad svaly koža kosti zuby sperma sliny moč plodovaacute voda atď Metoacuted izolaacutecie genoacutemovej DNA je viacero Vyacuteber zaacutevisiacute od technickeacuteho vybavenia laboratoacuteria časovyacutech a finančnyacutech možnostiacute ako aj od materiaacutelu z ktoreacuteho sa DNA izoluje od podmienok jej uskladnenia a od množstva potrebneacuteho na analyacutezu Najviac využiacutevanyacutem zdrojom DNA je perifeacuterna krv preto sa zameriame na extrakčneacute protokoly z tohto materiaacutelu Existujuacute viacereacute metoacutedy na izolaacuteciu DNA ktoreacute majuacute však spoločneacute kroky

1) rozrušenie bunkovej membraacuteny a lyacuteza buniek 2) denaturaacutecia nukleoproteiacutenoveacuteho komplexu 3) inaktivaacutecia nukleaacutez a ďalšiacutech bunkovyacutech enzyacutemov 4) DNA precipitaacutecia

Lyacuteza buniek sa dosahuje použitiacutem detergentov a enzyacutemov Sodnaacute soľ dodecylsulfaacutetu (SDS) TritonTMX-100 suacute priacuteklady bežnyacutech detergentov solubilizujuacutecich bunkovuacute membraacutenu Spolu k detergentom sa často pridaacutevajuacute enzyacutemy a to za uacutečelom štiepenia glykoproteiacutenov a inaktivaacutecie DNaacutez Bunkoveacute DNaacutezy suacute enzyacutemy ktoreacute štiepia DNA a tyacutem znehodnocujuacute a znižujuacute vyacuteťažok a kvalitu nukleovyacutech kyseliacuten

Precipitaacutecia DNA z roztoku prebieha pridaniacutem vysokej koncentraacutecie soli (napr octan amoacutenny) a za priacutetomnosti rozpuacutešťadiel (napr etanol v konečnej koncentraacutecii 70-80 alebo izopropanol v konečnej koncentraacutecii 40-50)

Niektoreacute protokoly pokračujuacute premytiacutem DNA precipitaacutetu 70 etanolom čiacutem docircjde k zbaveniu sa nadbytočnyacutech soliacute Nakoniec sa DNA rozpustiacute vo vode alebo v pufri napr TE (pozostaacutevajuacutecom z 10mM Tris 1mM EDTA-kyselina etyleacutendiamintetraoctovaacute) TE pufor sa použiacuteva pre dlhodobeacute uskladnenie DNA pretože zabraňuje degradaacutecii DNA nukleaacutezami nevhodnyacutem pH ťažkyacutemi kovmi a oxidaacuteciou voľnyacutemi radikaacutelmi Tris udržiava vhodneacute pH 7-8 a EDTA viaže dvojmocneacute ioacuteny (ako Mg2+ a Ca2+ ktoreacute suacute potrebneacute pre funkciu DNaacutez) ako aj braacuteni oxidačneacutemu poškodeniu ťažkyacutemi kovmi

Postupov izolaacutecie DNA je viacero vyacuteber zaacutevisiacute od naacutesledneacuteho použitia naacuterokov na kvantitu a kvalitu technickeacuteho vybavenia laboratoacuteria a potreby uskladnenia pre buduacutece použitie Suacute to najmauml

1) Priacuteprava a použitie hrubeacuteho lyzaacutetu kde je priacutetomnaacute DNA Taacuteto bdquoryacutechla a špinavaacuteldquo metoacuteda pozostaacuteva z lyacutezy buniek pri vysokej teplote (90degC 20minuacutet) alebo je uskutočnenaacute proteinaacutezou K Lyzaacutet sa použije priamo v ďalšiacutech aplikaacuteciaacutech Priacutetomnosť kontaminantov v lyzaacutete obmedzuje jeho použitie ako aj skladovanie DNA 2) Vysoľovacie metoacutedy začiacutenajuacute priacutepravou hrubeacuteho lyzaacutetu pokračujuacute tzv vysoľovaniacutem kedy sa proteiacuteny a ineacute kontaminanty precipitujuacute pri vysokej koncentraacutecii soli (octan draselnyacute octan amoacutenny) precipitaacutet je eliminovanyacute centrifugaacuteciou a DNA sa ziacuteskava z roztoku naacuteslednou alkoholovou precipitaacuteciou Vyacuteťažok DNA a jej čistota variacuteruje podľa použitej metodiky 3) Organickaacute extrakcia využiacuteva organickeacute rozpuacutešťadlaacute na odstraacutenenie kontaminantov z bunkoveacuteho lyzaacutetu Bunky suacute lyzovaneacute použitiacutem detergentov lyzaacutet sa zmieša so zmesou fenolu chloroformu a izoamylalkoholu Centrifugaacuteciou zmesi sa docieli oddelenie dvoch vrstiev organickej vrstvy (faacutezy) obsahujuacutecej kontaminanty a vodnej vrstvy (faacutezy) s DNA Zo ziacuteskanej vodnej faacutezy sa DNA izoluje najčastejšie alkoholovou precipitaacuteciou Organickaacute extrakcia bola veľmi využiacutevanaacute v laboratoacuteriaacutech v minulosti v suacutečasnosti je maacutelo použiacutevanaacute na rutinnuacute diagnostiku jednak pretože je časovo naacuteročnaacute

5

DNA mocircže obsahovať fenolchloroform ktoreacute inhibujuacute enzymatickeacute reakcie a taacuteto metoacuteda nie je vhodnaacute ani na izolaacuteciu v automatoch 4) Centrifugaacutecia v gradiente chloridu ceacutezneho (CsCl) umožňuje ziacuteskať genoacutemovuacute DNA vysokej kvality avšak taacuteto metoacuteda je časovo naacuteročnaacute praacutecna drahaacute (potrebnaacute ultracentrifuacutega) a nepoužiteľnaacute v automatoch nie je rutinne využiacutevanaacute Bunkovyacute lyzaacutet je precipitovanyacute alkoholom DNA roztok je zmiešanyacute s CsCl a etiacutediumbromidom nasleduje niekoľkohodinovaacute centrifugaacutecia v ultracentrifuacutege DNA je viditeľnaacute v podobe pruacutežku po jej odobratiacute sa extrahuje izopropanolom aby došlo k odstraacuteneniu etiacutediumbromidu a precipituje sa etanolom 5) Minikoloacutenovaacute (koloacutenkovaacute) purifikaacutecia využiacuteva schopnosť materiaacutelu v minikoloacutene (matrix matrica) adsorbovať DNA za určityacutech konkreacutetnych podmienok pH a koncentraacutecie soli (obr 1) Existujuacute viacereacute typy materiaacutelov viažucich DNA ktoreacute suacute na uacutečely izolaacutecie DNA umiestneneacute v minikoloacutene hydrofilneacute matrice viažuce vodiacutek v priacutetomnosti chaotropnyacutech činidiel matrice využiacutevajuacutece vyacutemenu ioacutenov (ioacutenomeničoveacute) matrice s určitou afinitou a veľkostnou selekciou

Vaumlčšina minikoloacutenovyacutech metoacuted maacute podobnyacute postup na začiatku prebehne lyacuteza buniek potom nasleduje DNA adsorbcia na matricu centrifugovateľnyacutech minikoloacuten premytie nukleovej kyseliny adsorbovanej na matricu v minikoloacutene čiacutem docircjde k zbaveniu sa kontaminantov a finaacutelna eluacutecia (uvoľnenie) DNA

Kremičitanoveacute (SiO2 Silika) matrice majuacute vynikajuacutecu schopnosť viazať DNA pretože suacute kladne nabiteacute a majuacute vysokuacute afinitu k negatiacutevne nabitej DNA V prostrediacute vysokej koncentraacutecie chaotropnyacutech soliacute docircjde k adsorpcii DNA na kremičitanovuacute matricu (silica geacutel) zatiaľ čo bunkoveacute proteiacuteny a ineacute metabolity zostanuacute v roztoku a naacutesledne suacute vymyteacute z koloacuteny DNA vhodnaacute na diagnostickeacute použitie je ziacuteskanaacute eluacuteciou zo silika matrice použitiacutem pufra s niacutezkou koncentraacuteciou soliacute (TE destilovanaacute voda) Existuje množstvo komerčne priacutestupnyacutech kitov (suacuteprav) ktoreacute obsahujuacute všetky potrebneacute chemikaacutelie a minikoloacuteny Izolaacutecia DNA prostredniacutectvom kitu založenom na silika materiaacuteli trvaacute od 40-60minuacutet pričom sa ziacuteska vysokokvalitnaacute DNA vo vysokom vyacuteťažku Dnes suacute k dispoziacutecii kity vhodneacute na poloautomatizovanuacute alebo plnoautomatizovanuacute izolaacuteciu DNA (obr 3)

Ďalšou možnosťou je použiť DNA izolačnyacute kit využiacutevajuacuteci magnetickeacute guľocircčky ktoreacute suacute pokryteacute materiaacutelom viažucim DNA (polymeacutery silika hydroxyapatit) DNA sa naviaže na magnetickeacute guľocircčky a prostredniacutectvom magnetickej sily magnetu je možneacute premyacutevať naviazanuacute DNA V tomto priacutepade nie je potrebneacute použiť centrifugaacuteciu

Obr 1 Minikoloacutena a postup izolaacutecie DNA

12 Izolaacutecia RNA

Ziacuteskanie RNA vysokej kvality je prvyacutem a často najkritickejšiacutem krokom pre molekulaacuterne techniky typu kvantifikaacutecie expresie určiteacuteho geacutenu metoacutedou real-time PCR (RT-qPCR) analyacutezy transkriptoacutemu sekvenovanovaniacutem ďalšej generaacutecie (NGS) analyacutezy RNA profilu mikročipmi northern analyacutezy a konštrukcie cDNA knižnice Pre dosiahnutie čo najcitlivejšiacutech a biologicky

6

najrelevantnejšiacutech vyacutesledkov je potrebneacute dodržať pracovneacute postupy pred počas a po RNA purifikaacutecii Pre optimalizaacuteciu RNA izolaacutecie a analyacutezy suacute docircležiteacute nasledovneacute kroky 1) manipulaacutecia so vzorkami určenyacutemi na RNA izolaacuteciu 2) vyacuteber metoacutedy izolaacutecie RNA 3) uskladnenie RNA

Klasickaacute izolaacutecia RNA prebieha vaumlčšinou v priacutetomnosti inhibiacutetorov ribonukleaacutez Ribonukleaacutezy (RNaacutezy) suacute bunkoveacute enzyacutemy degradujuacutece RNA Inhibiacutetory RNaacutez suacute silneacute denaturanty ktoreacute vo vzorke znižujuacute riziko RNA degradaacutecie (napr guanidiacutenoveacute soli dodecylsufaacutet sodnyacute - SDS chemikaacutelie obsahujuacutece fenol)

Pred vlastnou izolaacuteciou RNA je potrebneacute sterilizovať všetok materiaacutel (skuacutemavky špičky pipety vodu laboratoacuterny priestor) (obr 2) ktoryacute bude v kontakte so vzorkou určenou na izolaacuteciu RNA Kyacutem sa vzorka začne spracovaacutevať udržiava sa v tekutom dusiacuteku na suchom ľade alebo je vloženaacute do špeciaacutelnych stabilizačnyacutech roztokov (napr RNAlaterreg) alebo špeciaacutelnych skuacutemaviek so stabilizačnyacutem roztokom napr PAXgenereg Blood RNA Tube

Existuje niekoľko spocircsobov izolaacutecie RNA

1) Organickaacute extrakčnaacute metoacuteda je zlatyacutem štandardom izolaacutecie RNA Na začiatku izolaacutecie sa vzorka homogenizuje v roztoku obsahujuacutecom fenol (TRIzolreg RNAzolreg RT) naacutesledne sa centrifuguje Počas centrifugaacutecie dochaacutedza vo vzorke k separaacutecii troch vrstiev spodnej organickej faacutezy strednej faacutezy obsahujuacutecej denaturovaneacute proteiacuteny a genoacutemovuacute DNA a vrchnej vodnej faacutezy s RNA Po odobratiacute vrchnej faacutezy sa RNA z nej precipituje (vyzraacuteža) alkoholom a naacutesledne sa rehydratuje 2) Minikoloacutenovaacute metoacuteda (filtračnaacute) využiacuteva membraacuteny (zo sklenyacutech vlaacutekien silika alebo ioacutenomeničoveacute membraacuteny) vloženeacute do minikoloacuten Vzorka je lyzovanaacute v pufri obsahujuacutecom RNaacutezoveacute inhibiacutetory nukleoveacute kyseliny sa naviažu na membraacutenu keď lyzaacutet prechaacutedza membraacutenou počas centrifugaacutecie Membraacutena s naviazanou RNA je viackraacutet premyacutevanaacute RNA sa ziacuteska centrifugaacuteciou do novej skuacutemavky po eluacutecii vhodnyacutem elučnyacutem roztokom 3) Metoacuteda využiacutevajuacuteca magnetickeacute partikuly obsahujuacutece paramagnetickeacute vnuacutetro obklopeneacute obalom modifikovanyacutem tak aby viazal žiaduci objekt teda RNA Vzorka lyzovanaacute v roztoku obsahujuacutecom RNaacutezoveacute inhibiacutetory sa zmieša s magnetickyacutemi partikulami kedy docircjde k naviazaniu RNA na povrch magnetickyacutech partikuacutel Opakovanyacutem použitiacutem externeacuteho magnetickeacuteho poľa je možneacute vychytať magnetickeacute partikuly s naviazanou nukleovou kyselinou odstraacuteneniacutem magnetickeacuteho poľa zase uvoľniť a resupendovať v premyacutevaciacutech roztokoch Na zaacutever sa RNA uvoľniacute do elučneacuteho roztoku a magnetickeacute partikuly sa odstraacutenia 4) Priama lyacuteza sa použiacuteva na priacutepravu vzorky použitiacutem lyzačnyacutech roztokov ktoreacute lyzujuacute vzorku stabilizujuacute nukleoveacute kyseliny a takto pripravenaacute RNA mocircže byť použitaacute na ďalšie analyacutezy Priama lyacuteza teda nie je purifikačnaacute metoacuteda v pravom zmysle slova

Ziacuteskanuacute RNA je potrebneacute kvantifikova ť Ide o docircležityacute a nevyhnutnyacute krok ktoryacute predchaacutedza RNA analyacutezu Existujuacute viacereacute možnosti kvantifikaacutecie nukleovyacutech kyseliacuten ktoryacutem je venovanaacute samostatnaacute časť

Skladovanie RNA - RNA musiacute byť resuspendovanaacute resp eluovanaacute v roztoku bez RNaacutez na tento uacutečel suacute komerčne dostupneacute viacereacute roztoky na skladovanie RNA zabezpečujuacutece maximaacutelnu ochranu pred RNaacutezami RNA sa odporuacuteča skladovať pri teplote ndash 80degC v alikvoacutetoch (rozpipetovanaacute v menšiacutech množstvaacutech v mikroskuacutemavkaacutech) určenyacutech na jedno použitie

7

Obr 2 Laminaacuterny box na izolaacuteciu nukleovyacutech kyseliacuten praacutecu s DNA RNA atď Obr 3 Automatickyacute pipetovaciacute robot napr na izolaacuteciu 96 vzoriek DNA

8

2 Stanovenie kvantity a kvality nukleovyacutech kyseliacuten

Docircležiteacute je určenie koncentraacutecie a čistoty izolovanej DNA a RNA pretože analyacutezy ktoreacute nasledujuacute po izolaacutecii nukleovyacutech kyseliacuten často vyžadujuacute presneacute množstvo a čistotu nukleovyacutech kyseliacuten (NK bez priacutemesiacute) Metoacuted kvantifikaacutecie NK je niekoľko najpoužiacutevanejšie suacute spektrofotometrickaacute kvantifikaacutecia a kvantifikaacutecia UV fluorescenciou za priacutetomnosti farbičky

21 Spektrofotometrickaacute kvantifikaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten

Nukleoveacute kyseliny špecificky absorbujuacute ultrafialoveacute svetlo Vzorka s NK je v spektrofotometri (obr 6) vystavenaacute ultrafialoveacutemu svetlu o vlnovej dĺžke 260nm fotodetektor naacutesledne zmeria svetlo ktoreacute prejde vzorkou čiacutem viac svetla vzorka pohltiacute (absorbuje) tyacutem je vyššia koncentraacutecia nukleovej kyseliny vo vzorke Vyacutepočet koncentraacutecie NK zaacutevisiacute od toho či ide o DNA alebo RNA či je jednovlaacuteknovaacute alebo dvojvlaacuteknovaacute dsDNA c = A260002 [microgml] ssDNA c = A2600027 [microgml] RNA c = A2600025 [microgml]

Teda ak absorbancia dsDNA je 1 koncentraacutecia DNA vo vzorke je 50 microgml (pozn v priacutepade ak je draacuteha luacuteča 1cm)

Pokiaľ poznaacuteme sekvenciu napr pri synteacuteze primeru (ssDNA) mocircžeme z nej vypočiacutetať molekulovuacute hmotnosť a určiť priamo molaacuternu koncentraacuteciu nukleovej kyseliny (pmolmicrol) c = A260 lowast (100[15A + 071lowastC + 12lowastG + 084lowastT]) [pmolmicrol] A je počet adeniacutenov (v skutočnosti dATP) C je počet cytoziacutenov (dCTP) G je počet guaniacutenov (dGTP) a T počet tymiacutenov (dTTP)

Predpokladom pre spraacutevne určenie koncentraacutecie na zaacuteklade absorbancie je samozrejme čistota nukleovej kyseliny vo vzorke Čistota NK sa určuje podľa absorbčnej krivky popriacutepade zjednodušene na zaacuteklade pomeru absorbanciiacute pri 260 a 280 nm pretože proteiacuteny absorbujuacute svetlo vlnovej dĺžky 280nm Čistaacute DNA maacute pomer absorbanciiacute 260280 (A260280) pohybujuacutece sa okolo 18 čistaacute RNA maacute pomer absorbancii A260280 približne 2

Vzorku nukleovyacutech kyseliacuten mocircžu okrem proteiacutenov kontaminovať aj ďalšie laacutetky ako je fenol ktoryacute sa často využiacuteva pri izolaacutecii NK Takto izolovaneacute vzorky nukleovyacutech kyseliacuten nekontaminovaneacute fenolom by mali mať A260280 okolo 2 Ďalšie kontaminanty sa zisťujuacute absorbciou svetla pri 230 nm a 330 nm

22 Kvantifikaacutecia s použitiacutem fluorescenčnyacutech farbiacutev

Ďalšou možnosťou ako zmerať koncentraacuteciu nukleovyacutech kyseliacuten je zmeranie fluorescencie farbiva (napr etidiumbromid) ktoreacute sa viaže na nukleovuacute kyselinu a selektiacutevne svieti v priacutepade že je naviazaneacute na NK Metoacuteda využitia fluorescenčneacuteho farbiva naviazaneacuteho na NK sa použiacuteva v priacutepade ak je koncentraacutecia NK priacuteliš niacutezka na kvantifikaacuteciu spektrofotometrom ako aj v priacutepade že je NK kontaminovanaacute laacutetkou (kontaminantom) absorbujuacutecim svetlo vlnovej dĺžky 260nm 221 Využitie migraacutecie nukleovej kyseliny v geacuteli s jej naacuteslednou fluorescenčnou detekciou

Ak predpokladaacuteme niacutezku koncentraacuteciu NK na jej zistenie použijeme elektroforetickuacute

migraacuteciu NK v geacuteli (mocircže sa použiť agaroacutezovyacute alebo polyakrylamidovyacute geacutel) fluorescenčneacute farbivo je buď primiešaneacute do vzorky NK alebo priamo do geacutelu Spolu so vzorkou NK neznaacutemej koncentraacutecie migruje v geacuteli vo vedľajšej draacutehe vzorka NK so znaacutemou koncentraacuteciou Na zaacuteklade porovnania fluorescencie (po vystaveniacute geacutelu s NK svetlu o konkreacutetnej vlnovej dĺžke) vzorky so znaacutemou

9

koncentraacuteciu a vzorky neznaacutemej koncentraacutecie sa urobiacute odhad resp sa vyacutesledok kalkuluje počiacutetačovyacutem softveacuterom denzitometricky (obr 4)

222 Využitie kvantifikaacutecie množstva nukleovyacutech kyseliacuten použitiacutem real-time PCR metoacutedy

V priacutepade veľmi maleacuteho množstva NK ktoreacute nie je možneacute kvantifikovať ani geacutelovou elektroforeacutezou resp potrebujeme zistiť koncentraacuteciu NK veľmi presne u maleacuteho množstva NK (napr pre kriminalistiku) použije sa metoacuteda absoluacutetnej kvantifikaacutecie prostredniacutectvom real-time PCR (kvantifika čnej PCR qPCR) Princiacutep metoacutedy spočiacuteva v porovnaniacute amplifikaacutecie určiteacuteho uacuteseku nukleovej kyseliny vo vzorke neznaacutemej koncentraacutecii s amplifikaacuteciou tej istej sekvencie vo vzorke presne definovanej koncentraacutecie (obr 5) qPCR je možneacute kvantifikovať koncentraacuteciu raacutedovo v pgul 223 Kvantifikaacutecia fluorospektrofotometrom (fluori metrom)

Ak maacuteme dostatočneacute množstvo vzorky je možneacute na kvantifikaacuteciu použiť fluorospektrofotometer v tomto priacutepade je vzorka zmiešanaacute s fluorescenčnyacutem farbivom a je meranaacute emitovanaacute fluorescencia z ktorej sa vypočiacuteta koncentraacutecia

Moderneacute spektrofotometre a fluorimetre suacute konštruovaneacute tak aby na meranie bolo použiteacute minimaacutelne množstvo vzorky NK (napr pre priacutestroje NanoDrop je potrebnyacute len 05-1 microl vzorky) Pre porovnanie NanoDrop spektrofotometer (NanoDrop 2000c) je schopnyacute zmerať koncentraacutecie od 04 to 15 000 ngmicroL dsDNA NanoDrop fluorospektrometer 005 do 2000 pgmicroL Spektrofotometre a fluorofotometre suacute po meraniacute schopneacute vďaka softveacuteroveacutemu vybaveniu vypočiacutetať nielen koncentraacuteciu ale aj čistotu vzorky (httpwwwnanodropcom) Obr 4 Kvantifikaacutecia nukleovej kyseliny porovnaniacutem s fragmentom podobnej dĺžky a znaacutemej koncentraacutecie (po migraacutecii v agaroacutezovom geacuteli v jednosmernom elektrickom pruacutede a naacuteslednej fluorescenčnej detekcii) - odhad DNA v 3 draacutehe cca 100ng porovnaniacutem s 1000bp fragmentom štandardu molekulovyacutech hmotnostiacute (šmh)

10

Obr 5 Absoluacutetna kvantifikaacutecia DNA priacutestrojom real-time PCR cykleacuterom porovnaniacutem amplifikaacutecie uacuteseku DNA v skuacutemanej vzorke s amplifikaacuteciou vzorky so znaacutemou kvantitou Okrem amplifikaacutecie skuacutemanej vzorky je treba urobiť štandardnuacute krivku amplifikaacutecie vzorky znaacutemej koncentraacutecie z ktorej sa koncentraacutecia skuacutemanej vzorky odčiacuteta V kriminalistike sa bežne použiacuteva pridanie vnuacutetornej kontroly ku vzorke na určenie čistoty vzorky (v priacutetomnosti inhibiacutetorov nedocircjde k amplifikaacutecii žiadnej DNA) Vnuacutetornaacute kontrola je už priacutetomnaacute v kite čiže sa automaticky pridaacuteva pri priacuteprave vzoriek na qPCR amplifikaacuteciu sluacuteži na zistenie priacutetomnosti inhibiacutetorov v skuacutemanej vzorke teda v priacutepade že nedocircjde k amplifikaacutecii vo vzorke sluacuteži na rozliacutešenie či je koncentraacutecia DNA priacuteliš niacutezka alebo suacute vo vzorke priacutetomneacute inhibiacutetory Bežnaacute mediciacutenska molekulaacuterno-genetickaacute diagnostika nevyžaduje priacutetomnosť vnuacutetornej kontroly keďže nukleoveacute kyseliny suacute prevažne izolovaneacute kitmi z krvi čiže je zabezpečenaacute vysokaacute kvalita a čistota naizolovanej NK Obr 6 Spektrofotometer (NanoPhotometer) a ukaacutežka vyacutesledkou merania koncentraacutecie RNA izolovanej minikolonovou metoacutedou

11

3 PCR (polymeraacutezovaacute reťazovaacute reakcia)

Je metoacuteda vyvinutaacute v roku 1983 Karym Mullisom ocenenaacute v roku 1993 Nobelovou cenou za cheacutemiu Polymeraacutezovaacute reťazovaacute reakcia je založenaacute na schopnosti DNA polymeraacutezy syntetizovať noveacute vlaacutekno DNA podľa templaacutetoveacuteho vlaacutekna na zaacuteklade princiacutepu komplementarity DNA polymeraacuteza je schopnaacute pripaacutejať nukleotidy len k voľnej 3acuteOH skupine preto potrebuje primer (čiacutetaj prajmer) ku ktoreacutemu je schopnaacute pridaacutevať nukleotidy Primery suacute kraacutetke jednovlaacuteknoveacute oligonukleotidy ktoreacute umožňujuacute jednak DNA polymeraacuteze začať so synteacutezou noveacuteho vlaacutekna na druhej strane ohraničujuacute špecifickuacute oblasť ktoruacute chceme amplifikovať (namnožiť) Vyacutesledkom PCR reakcie je obrovskyacute počet koacutepii špecifickej sekvencie (obr 7) PCR v podstate napodobňuje replikaacuteciu DNA v in vitro podmienkach s rozdielom že nedochaacutedza k replikaacutecii celej DNA ale len vybraneacuteho primermi ohraničeneacuteho miesta

31 Najdocircležitejšie PCR komponenty

Templaacutetovaacute DNA je vzorka DNA obsahujuacuteca cieľovuacute sekvenciu Na začiatku reakcie docircjde pri vysokej teplote k denaturaacutecii a separaacutecii jednotlivyacutech vlaacutekien dvojvlaacuteknovej DNA

Enzyacutem DNA polymeraacuteza syntetizuje noveacute DNA vlaacutekno komplementaacuterne k cieľovej sekvencii Najčastejšie použiacutevanou a prvou DNA polymeraacutezou je Taq DNA polymeraacuteza (z termofilnej bakteacuterie Thermus aquaticus) zatiaľ čo Pfu DNA polymeraacuteza (z Pyrococcus furiosus) je preferovanaacute kvocircli tzv vysokej fidelite čo je schopnosť inkorporovať spraacutevnu baacutezu do novosyntetizovaneacuteho vlaacutekna DNA DNA polymeraacutezy musia mať dve vlastnosti schopnosť syntetizovať noveacute vlaacutekno DNA podľa templaacutetovej DNA a byť termostabilneacute čiže rezistentneacute na vysokeacute teploty (cca 100degC) V suacutečasnosti sa v laboratoacuteriaacutech často použiacutevajuacute rekombinantneacute polymeraacutezy s požadovanyacutemi vlastnosťami Napriacuteklad pre PCR ktorej produkt bude klonovanyacute je docircležiteacute použiť polymeraacutezu ktoraacute je schopnaacute opraviť vlastnuacute chybu v priacutepade inkorporaacutecie nespraacutevnej baacutezy pri synteacuteze noveacuteho reťazca Schopnosť opravovať nespraacutevne inkorporovaneacute baacutezy počas synteacutezy noveacuteho vlaacutekna DNA sa nazyacuteva tzv proofreading aktivita ktoraacute je zabezpečenaacute 3rarr5acute exonukleaacutezovou aktivitou takejto polymeraacutezy Pred vlastnou molekulaacuterno-genetickou diagnostikou je treba optimalizovať podmienky PCR reakcie pre konkreacutetnu DNA polymeraacutezu a pre špecifickeacute primery treba zistiť optimaacutelnu teplotu annealingu (hybridizaacutecie) primerov koncentraacutecie jednotlivyacutech zložiek PCR reakcie (napr MgCl2)

Primery suacute kraacutetke jednovlaacuteknoveacute DNA sekvencie komplementaacuterne k cieľovej sekvencii DNA polymeraacuteza začiacutena syntetizovať noveacute vlaacutekno z 3acutekonca primeru Docircležitou charakteristikou primerov je teplota topenia (Tm) t j teplota pri ktorej polovica DNA duplexov je disociovanaacute na jednovlaacuteknoveacute molekuly

Nukleotidy (dNTP deoxyribonukleotidtrifosfaacutety) suacute stavebneacute prvky pre novosyntetizovanuacute DNA molekulu

Veľmi praktickyacutem riešeniacutem pre molekulaacuterno-genetickeacute diagnostickeacute laboratoacuteria je tzv mastermix to je roztok v ktorom už je priacutetomneacute všetko potrebneacute pre priebeh PCR reakcie samozrejme okrem primerov a templaacutetovej DNA sekvencie PCR Master Mix (2X) od firmy ThermoFisher Scientific je jednyacutem z takyacutechto mixov obsahuje Taq DNA polymeraacutezu tlmivyacute roztok (pufor) MgCl2 a všetky deoxyribonukleotidy trifosfaacutety

Tabuľka č 1 uvaacutedza ako sa PCR reakcia z mastermixu pripravuje pre jednu vzorku Keďže v laboratoacuteriu sa zriedka robiacute PCR reakcia s jednou vzorkou treba si pripraviť tzv premix (tj PCR reakcie pre vaumlčšiacute počet vzoriek ale bez templaacutetovej DNA) ktoryacute sa rozdeliacute do mikroskuacutemaviek a až potom sa k nim pridaacute DNA resp cDNA

12

Tab 1 Priacuteprava PCR premixu

Celkovyacute objem jednej PCR reakcie 10 microl Počet vzoriek 8 2x PCR master mix 5 40

primer sense (10microM) 05 4

primer antisense (10microM) 05 4

H2O 35 28

DNA cDNA 05

rozpipetovať premix po 95microl do mikroskuacutemaviek až potom pridať do každej mikroskuacutemavky zvlaacutešť DNA cDNA

spolu objem 10 76

PCR amplif ikaacutecia je cyklickyacute proces pozostaacutevajuacuteci z troch krokov (obr 7) 1) denaturaacutecia dvojvlaacuteknovej DNA pri vysokej teplote (95degC) 2) hybridizaacutecia (annealing) primerov k špecifickej sekvencii DNA pri teplote vhodnej pre konkreacutetne primery 3) polymerizaacutecia (synteacuteza) novyacutech vlaacutekien DNA (72degC)

Obr 7 Princiacutep PCR

Tieto tri kroky sa opakujuacute 25 ndash 40 kraacutet pričom pri každom cykle sa počet molekuacutel zdvojnaacutesobiacute (vyacuteslednyacute počet cieľovej sekvencie je 2n+1 ak na začiatku bola jedna dvojvlaacuteknovaacute DNA a počet cyklov je n) PCR prebieha v termaacutelnom cykleacuteri (teplotnom cyklovači) je to priacutestroj (obr 8) kde je možneacute vykonať a naprogramovať celyacute termaacutelny priebeh PCR reakcie Tabuľka č 2 je priacutekladom termaacutelneho programu pre konkreacutetnu PCR reakciu

Po PCR reakcii je vyacuteslednyacute produkt možneacute vizualizovať elektroforeticky resp použiť na ďalšiu analyacutezu

13

Tab 2 Priacuteklad klasickeacuteho teplotneacuteho a časoveacuteho profilu PCR PCR Teplota Čas Opakovanie

95degC 2 minuacutety

95degC 15 sekuacutend

66degC 60 sekuacutend 30x

72degC 60 sekuacutend

72degC 5 minuacutet

Obr 8 Termaacutelny cykleacuter v procese a otvorenyacute s mikroskuacutemavkami

32 Variaacutecie PCR

Hot-start PCR využiacuteva DNA polymeraacutezu ktoruacute je treba aktivovať vysokou teplotou (napr 95degC 10 minuacutet) Vyacutehodou použiacutevania hot-start polymeraacutez je možnosť pracovať pri laboratoacuternej teplote keďže polymeraacuteza je pri bežnej teplote neaktiacutevna a tyacutem nemocircže docircjsť k vzniku nešpecifickyacutech produktov

Touchdown PCR maacute v počiatočnyacutech cykloch vyššiu teplotu annealingu (uacutečelom je zvyacutešiť

špecificitu PCR produktov na začiatku PCR) neskocircr sa teplota annealingu zniacuteži čo maacute za naacutesledok vyššiacute vyacuteťažok PCR produktu

Nested PCR maacute dva kroky a potrebuje dva paacutery primerov V prvom kroku sa prostredniacutectvom

prvej sady primerov amplifikuje dlhšiacute DNA fragment Ten sa použije ako templaacutet v druhom kroku s druhou sadou primerov s vyacuteslednyacutem kratšiacutem DNA produktom Nested PCR zvyšuje špecifickosť a citlivosť diagnostickyacutech PCR

Multiplex PCR je vlastne viac PCR reakciiacute prebiehajuacutecich v jednej skuacutemavke suacutečasne

V reakčnej zmesi je viac paacuterov primerov suacutečasne prebehne amplifikaacutecia viaceryacutech uacutesekov DNA takto dochaacutedza k šetreniu vzorky reakčnej zmesi a pracovneacuteho času

14

Real-time PCR je venovanaacute špeciaacutelna časť v skriptaacutech Sluacuteži na kvantifikaacuteciu PCR produktu v reaacutelnom čase na zaacuteklade merania fluorescencie okrem kvantifikaacutecie je využiacutevanaacute aj na určenie genotypov

RT-PCR je variaacutecia PCR umožňujuacuteca amplifikaacuteciu DNA sekvencie z vyacutechodiskovej RNA

sekvencie Najskocircr musiacute prebehnuacuteť prepis RNA do jednovlaacuteknovej cDNA prostredniacutectvom reverznej transkriptaacutezy naacutesledne sa cDNA použije pre PCR Selektiacutevnym použitiacutem primerov pri reverznej transkripcii mocircžeme uacutečelovo prepiacutesať buď celkovuacute RNA (primery - random hexameacutery) alebo len mRNA (primery - oligoT)

Alelovo-špecifickaacute PCR (AS-PCR) (obr 9) sluacuteži na detekciu konkreacutetnych mutaacuteciiacute

a jednonukleotidovyacutech polymorfizmov (SNP) Použije sa sada 3 primerov v dvoch kombinaacuteciaacutech PCR reakciiacute dva primery majuacute odlišnuacute sekvenciu na 3acute-koncoch jeden na detekciu wt (wild type) a druhyacute primer na detekciu mutantnej alely reakcia neprebehne ak miesto na templaacutetovej DNA nie je komplementaacuterne k 3acute-koncu primeru pretože DNA polymeraacuteza vyžaduje uacuteplnuacute hybridizaacuteciu primera na 3acute-konci Takto je možneacute rozliacutešiť priacutetomnosť štandardnej (wildtype ndash wt) a mutantnej alely resp SNP (obr 9) AS-PCR je znaacutema aj pod ďalšiacutemi naacutezvami ASO-PCR (allele-specific oligonucleotide PCR) ARMS (amplification-refractory mutation system)

Obr 9 Alelovo-špecifickaacute PCR (AS-PCR)

Mutageneacuteza prostredniacutectvom PCR (site directed mutagenesis) sa použiacuteva keď je potrebneacute vytvoriť mutaacuteciu v špecifickom mieste geacutenu primerprimery majuacute modifikovanuacute sekvenciu tak že obsahujuacute mutaacuteciu v strednej časti čo neovplyvniacute hybridizaacuteciu primerov s templaacutetovou DNA pričom vyacutesledkom je PCR produkt s cielene mutovanou DNA sekvenciou

Asymetrickaacute PCR sa použiacuteva na synteacutezu koacutepiiacute jedneacuteho vlaacutekna z templaacutetovej DNA a to

použitiacutem veľmi niacutezkej koncentraacutecie jedneacuteho primeru Sekvenačnaacute PCR je PCR v ktorej je použityacute len jeden primer a v reakčnej zmesi suacute okrem

všetkyacutech dNTP priacutetomneacute dideoxynukleotidtrifosfaacutety (ddNTP) značeneacute raacutedioaktiacutevne dnes však prevažne fluorescenčne každyacute typ ddNTP inou fluorescenčnou farbičkou Zaradenie niektoreacuteho zo štyroch ddNTP spocircsobiacute terminaacuteciu (zastavenie) predlžovania DNA reťazca fluorescenčneacute označenie ddNTP umožniacute detekciu dĺžky fragmentu a určenie sekvencie posledneacuteho nukleotidu Vyacuteslednyacute produkt sekvenačnej PCR sluacuteži na sekvenovanie Sekvenovaniu sa venuje samostatnaacute časť

MLPA (multiplex ligation-dependent probe amplification) ndash multiplexnaacute amplifikaacutecia proacuteb zaacutevislaacute od ligaacutecie je variaacutecia multiplexnej PCR umožňujuacuteca namnoženie viaceryacutech uacutesekov DNA za použitia iba jedneacuteho paacuteru primerov avšak s podmienkou vytvorenia sekvenčne špecifickej proacuteby ligaacuteciou sekvenčne špecifickyacutech oligonukleotidov MLPA je metoacuteda umožňujuacuteca detekciu počtu koacutepiiacute

15

až 50 nukleotidovyacutech sekvenciiacute v jednej reakcii Pomocou MLPA je možneacute ryacutechlo identifikovať amplifikaacutecie a deleacutecie veľkeacuteho počtu geacutenov či už z DNA alebo mRNA okrem toho MLPA mocircže byť použitaacute na analyacutezu CpG-metylaacutecie (MS-MLPA) Viac informaacutecii v samostatnej časti

SNaPshotreg Multiplex nazyacutevaneacute aj minisekvenovanie je multiplexnaacute reakcia v ktorej je každyacute primer predĺženyacute iba o jeden nukleotid (obr 10) V reakčnej zmesi nie suacute priacutetomneacute deoxyribonukleotidtrifosfaacutety ale len dideoxyribonukleotidtrifosfaacutety (ddATP ddCTP ddGTP ddTTP) každyacute označenyacute inou fluorescenčnou farbičkou Po integraacutecii ddNTP do DNA vlaacutekna je polymerizaacutecia ukončenaacute Jednovlaacuteknoveacute fragmenty (primery) predĺženeacute presne o jeden ddNTP suacute separovaneacute kapilaacuternou elektroforeacutezou v genetickom analyzaacutetore pričom je detegovanaacute ich fluorescencia a dĺžka (obr 11) Z vyacutesledneacuteho elektroforetogramu (obr 12) je možneacute určiť v jednej reakcii sekvenciu vo viac ako v 10 lokalitaacutech určiteacuteho fragmentu DNA SNaPshot Multiplex sa v molekulaacuterno-genetickom laboratoacuteriu využiacuteva na ryacutechlu detekciu viaceryacutech najčastejšie sa vyskytujuacutecich mutaacuteciiSNP geacutenu

Obr 10 Priacuteklad využitia metoacutedy SnaPshot s použitiacutem sady 13 primerov ktoreacute sa predĺžia len o 1 značenyacute dideoxynukleotid SNaPshot najčastejšiacutech mutaacuteciiacute geacutenu pre 21-hydroxylaacutezu (CYP21A2) ktoreacute spocircsobujuacute kongenitaacutelnu adrenaacutelnu hyperplaacuteziu A T G a C predstavujuacute fluorescenčne značeneacute dideoxynukleotidy

Obr 11 Vyacutesledok analyacutezy DNA pacienta metoacutedou minisekvenovania SnaPshot konkreacutetne použitiacutem sady 13 primerov rozlišujuacutecich najčastejšie bodoveacute mutaacutecie geacutenu pre 21-hydroxylaacutezu (CYP21A2) analyacutezou sa zistila mutaacutecia V281L v heterozygotnom stave (dva fragmenty modryacute a červenyacute)

16

Obr 12 SNaPshot analyacuteza geacutenu CYP21A2 u DNA izolovanej z plodovej vody metoacuteda deteguje najčastejšie bodoveacute mutaacutecie geacutenu pre 21-hydroxylaacutezu vyacutesledok prenataacutelnej analyacutezy = priacutetomnosť mutaacutecie In2G v hemizygotnom stave (keďže qPCR metoacutedou bola u plodu zistenaacute priacutetomnosť len jednej koacutepie geacutenu CYP21A2)

33 Kvantitatiacutevna PCR (qPCR)

Polymeraacutezovou reťazovou reakciou (PCR) docielime namnoženie (amplifikaacuteciu) určiteacuteho DNA uacuteseku (templaacutetu) PCR je katalyzovanaacute DNA polymeraacutezou za priacutetomnosti primerov dNTPs dvojmocnyacutech katioacutenov (ako Mg+2) a pufrovacieho roztoku

Real-time PCR ktoraacute je nazyacutevanaacute aj kvantitatiacutevna PCR (qPCR) umožňuje vizualizaacuteciu a kvantifikaacuteciu amplifikaacutecie DNA v reaacutelnom čase to je tak ako to bežiacute počas PCR qPCR využiacuteva fluorescenčneacute chemikaacutelie (farbivaacute) ktoryacutech emitovanuacute fluorescenciu zaznamenaacuteva optickyacute systeacutem počas každeacuteho PCR cyklu zaznamenanaacute fluorescencia je naacutesledne softveacuterovo spracovanaacute a vyhodnotenaacute

V suacutečasnosti sa využiacutevajuacute dva typy qPCR cheacutemie a to farbivaacute viažuce sa na DNA a fluorescenčne značeneacute proacuteby (obr 13)

Farbivaacute viažuce sa na DNA emitujuacute fluorescenciu v priacutepade ak suacute naviazaneacute na dvojvlaacuteknovuacute DNA proacuteby fluoreskujuacute v priacutepade keď molekula zhaacutešača (angl quencher - Q) sa nenachaacutedza v bliacutezkosti molekuly reporteacutera (R) napr hydrolyzujuacutece proacuteby fluoreskujuacute keď je molekula reporteacutera (R) prostredniacutectvom 5acuteexonukleaacutezovej aktivity DNA polymeraacutezy odstraacutenenaacute z bliacutezkosti molekuly zhaacutešača (Q)

Grafickyacute priebeh real ndash time PCR znaacutezorňuje amplifika čnaacute krivka (angl amplification plot) (obr 14) majuacuteca 4 faacutezy 1) Faacuteza I ndash dochaacutedza k zdvojnaacutesobeniu množstva amplikoacutenu po každom cykle ale naacuterast fluorescencie je pod detekčnyacutem limitom zaznamenaacutevanaacute fluorescencia (baseline) zodpovedaacute zaacutekladnej fluorescencii pozadia tzv šumu

17

2) Faacuteza II nazyacutevanaacute aj exponenciaacutelna faacuteza v ktorej sa fluorescencia zvyacuteši na uacuteroveň optickej detekcie bod resp cyklus kedy začiacutena exponenciaacutelna faacuteza je kľuacutečovyacute na určenie kvantity vstupneacuteho množstva templaacutetovej DNA nazyacuteva sa prahovyacute cyklus označuje sa Ct (angl treshold cycle) alebo Cq (quantification) Čiacutem nižšie je Ct (Cq) tyacutem vaumlčšiacute počet koacutepiiacute templaacutetovej DNA bolo v reakcii Ct hodnota je teda hlavnyacute uacutedaj s ktoryacutem sa pracuje vo vyacutepočtoch fluorescencia v tomto mieste sa nazyacuteva prahovaacute resp treshold 3) Faacuteza III - lineaacuterna faacuteza ndash charakterizuje ju postupneacute spotrebovaacutevanie komponentov reakcie na narastajuacutece množstvo amplikoacutenu 4) Faacuteza IV - plateau (čiacutetaj platoacute) ndash množstvo amplikoacutenu sa v docircsledku vyčerpania zložiek qPCR už nezvyšuje

Obr 13 Princiacutep real-time PCR Obr 14 Faacutezy real-time PCR

Ako štandardnaacute PCR aj qPCR maacute tri zaacutekladneacute kroky 1) Denaturaacutecia dvojvlaacuteknovej DNA na jednovlaacuteknovuacute DNA pri vysokej teplote (obyčajne 95degC) 2) Hybridizaacutecia primerov (annealing) ndash komplementaacuterne sekvencie sa spolu hybridizujuacute 3) Polymerizaacutecia pri 70-72degC kedy v docircsledku optimaacutelnej aktivity DNA polymeraacutezy dochaacutedza k predĺženiu primeru až o 100 baacutez za sekundu

18

Real-time PCR (obr 15) sa využiacuteva na kvantifikaacuteciu expresie geacutenov určenie počtu koacutepiiacute geacutenov určenie genotypu (genotypovanie) alelovou diskriminaacuteciou alebo analyacutezou krivky topenia tzv high resolution melt a multiplexnuacute real time PCR s možnosťou detekcie viaceryacutech cieľovgeacutenov

Multiplexnaacute real-time PCR sa využiacuteva na detekciu viaceryacutech cieľovgeacutenov v jednej reakcii suacutečasne Vyacutehodou multiplexovania je jednak uacutespora vzorky ako aj ziacuteskanie vaumlčšieho množstva informaacuteciiacute z rovnakeacuteho množstva materiaacutelu Nevyhnutnosťou multiplexnej qPCR suacute proacuteby značeneacute rocircznymi fluorescenčnyacutemi farbivami

Najdocircležitejšie zložky qPCR (real-time PCR komponenty) suacute DNA polymeraacuteza (reverznaacute transkriptaacuteza v priacutepade jednokrokovej kvantitatiacutevnej RT-PCT) dNTPs primery resp primeryproacuteby dvojmocneacute Mg templaacutet Na uľahčenie qPCR suacute v suacutečasnosti už komerčne dostupneacute takeacute reakčneacute zmesi ku ktoryacutem stačiacute pridať už len templaacutet (napr kity využiacutevajuacutece TaqManProacuteby) alebo kity s fluorescenčnyacutemi farbami viažucimi sa na dvojvlaacuteknovuacute DNA ku ktoryacutem sa do reakčnej zmesi okrem templaacutetu pridajuacute primery

Obr 15 Real-time PCR cykleacuter

331 Kvantifikaacutecia pomocou qPCR

Na kvantifikaacuteciu DNA pomocou qPCR sa požiacutevajuacute dve zaacutekladneacute metoacutedy - absoluacutetna kvantifikaacutecia a relatiacutevna kvantifikaacutecia

Absoluacutetna kvantifikaacutecia vychaacutedza zo štandardnej krivky (obr 16) ktoraacute sa ziacuteska po qPCR seacuterie riedeniacute DNA znaacutemej koncentraacutecie Kvantifikaacutecia neznaacutemej vzorky sa zistiacute interpolaacuteciou (odčiacutetaniacutem) Ct neznaacutemej vzorky zo štandardnej krivky (obr 16 17) Využiacutevaneacute napr v kriminalistike na stanovenie koncentraacutecie DNA vo vzorke

Relatiacutevna kvantifikaacutecia (obr 18 19) porovnaacuteva uacuteroveň expresie určiteacuteho geacutenu vo vzorke k expresii toho isteacuteho geacutenu v referenčnej (kontrolnej) vzorke alebo množstvo určiteacuteho geacutenu (počet koacutepiiacute) vo vzorke porovnaniacutem s množstvom geacutenu v kontrolnyacutech vzorkaacutech V raacutemci každej vzorky musiacute pred relatiacutevnou kvantifikaacuteciou docircjsť k tzv normalizaacutecii t j porovnanie expresie sledovaneacuteho geacutenu k expresii referenčneacuteho geacutenu (najčastejšie niacutem byacuteva tzv bdquohousekeepingldquo geacuten napr GAPDH aktiacuten tubuliacuten)

V priacutepade kvantifikaacutecie expresie určiteacuteho geacutenu metoacutedou real-time PCR (RT-qPCR) pred samotnou kvantifikaacuteciou cDNA musiacute byť taacuteto cDNA nasyntetizovanaacute prostredniacutectvom reverznej

19

transkripcie za použitia enzyacutemu reverznej transkriptaacutezy Kvantitatiacutevna PCR s reverznou transkripciou RT-qPCR mocircže byť dvojkrokovaacute alebo jednokrokovaacute Pri dvojkrokovej RT-qPCR treba pred qPCR syntetizovať cDNA vlaacutekno z RNA pomocou reverznej transkriptaacutezy - 1 krok druhyacutem krokom je samotnaacute real-time PCR Jednokrokovaacute RT-qPCR umožňuje uskutočniť obidve reakcie reverznuacute transkripciu a kvantitatiacutevnu PCR v jednej skuacutemavke čo zjednodušuje qPCR a redukuje možnosť kontaminaacutecie Obr 16 5-bodovaacute štandardnaacute krivka (amplifikaacutecia piatich koncentraacuteciiacute jednej vzorky konkreacutetne ide o 10-tkoveacute riedenie)

Obr 17 Ukaacutežka amplifikačnyacutech kriviek riedenia a z nich ziacuteskanej štandardnej krivky poukazuje na vysokuacute presnosť metoacutedy RT-PCR

20

Obr 18 Relatiacutevna kvantifikaacutecia - určenie počtu koacutepiiacute geacutenu CYP21A2 vo vzorke DNA izolovanej z perifeacuternej krvi pacientov mutaacutecie v geacutene CYP21A2 spocircsobujuacute kongenitaacutelnu adrenaacutelnu hyperplaacuteziu (CAH) Vyacutesledok analyacutezy všetci pacienti majuacute dve koacutepie geacutenu

Obr 19 Relatiacutevna kvantifikaacutecia - určenie počtu koacutepiiacute geacutenu CYP21A2 vo vzorke DNA izolovanej z plodovej vody mutaacutecie v geacutene CYP21A2 spocircsobujuacute kongenitaacutelnu adrenaacutelnu hyperplaacuteziu (CAH) Prenaacutetalnou diagnostikou (qPCR) sa zistila priacutetomnost jednej koacutepie CYP21A2 geacutenu 332 Určenie genotypu metoacutedou alelovej diskriminaacutecie a analyacutezou krivky topenia (HRM)

Určenie genotypu metoacutedou alelovej diskriminaacutecie (obr 20) sa uskutočňuje použitiacutem hydrolyzujuacutecich proacuteb (sond) je veľmi ryacutechla a senzitiacutevna (presnaacute) metoacuteda frekventovane využiacutevanaacute v laboratoacuteriaacutech Dva variantyalely suacute vyšetreneacute suacutečasne v jednej vzorke a v jednej reakčnej

21

skuacutemavke V reakcii suacute použiteacute dve proacuteby označeneacute rozdielnymi fluorescenčnyacutemi farbičkami emitujuacutecimi svetlo o rocircznej vlnovej dĺžke (najčastejšie jedna označenaacute FAM farbičkou a druhaacute proacuteba označenaacute VIC farbičkou) Počas amplifikaacutecie amplikoacutenu dochaacutedza k odstraacuteneniu zhaacutešača z bliacutezkosti farbičky ktoraacute potom emituje svetlo priacuteslušnej vlnovej dĺžky Vzorky so signaacutelom len jednej fluorescenčnej farbičky (FAM) a bez signaacutelu druhej farbičky (VIC) suacute homozygoti pre alelu 1 vzorky so signaacutelom len druhej farbičky (VIC) a bez signaacutelu prvej (FAM) suacute homozygoti pre alelu 2 v priacutepade ak vyšetrovanaacute vzorka bdquosvietildquo obidvoma farbami jednaacute sa o heterozygota

Obr 20 Určenie genotypu metoacutedou alelovej diskriminaacutecie ndash amplifikačnaacute krivka vzoriek DNA majuacutecich tri rocirczne genotypy A ndash jednotliveacute vzorky (plnaacute čiara predstavuje štandardnuacute alelu guličkovanaacute mutovanuacute alelu) B ndash 72 vzoriek C ndash scatter plot 72 vzoriek

Určenie genotypu analyacutezou krivky topenia tzv high resolution melt (HRM) (obr 21) umožňuje detekciu takmer všetkyacutech genetickyacutech variaacuteciiacute (SNP mutaacuteciiacute) Keďže taacuteto metoacuteda okrem štandardnyacutech podmienok reakcie vyžaduje len primery a farbičku (nie proacuteby) je veľmi jednoduchaacute a lacnejšia Po amplifikaacuteciiacute treba amplikoacuten pomaly zohrievať až kyacutem nedocircjde k denaturaacuteciiacute Teplota topenia amplikoacutenu vo vzorke zaacutevisiacute od DNA sekvencie čo umožňuje detegovať priacutetomnosť mutaacutecie resp SNP Tvar vyacuteslednyacutech kriviek topenia určuje teda genotyp

22

Obr 21 Určenie genotypu analyacutezou krivky topenia tzv metoacutedou high resolution melting (HRM) A ndash krivka topenia vzoriek DNA majuacutecich tri rocirczne genotypy B ndash graf rozdielnosti krivky topenia vzoriek DNA majuacutecich tri rocirczne genotypy

23

4 Elektroforetickaacute separaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten

Separaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten predstavuje rozdelenie molekuacutel DNA alebo RNA na zaacuteklade veľkosti zloženia a poradia baacutez Podobnyacutemi metoacutedami je možneacute separovať aj proteiacuteny

Elektroforeacuteza (ELFO) je technika použiacutevanaacute na separaacuteciu niekedy aj purifikaacuteciu makromolekuacutel ako suacute nukleoveacute kyseliny a proteiacuteny na zaacuteklade ich rozdielnej veľkosti naacuteboja alebo konformaacutecie Je to metoacuteda veľmi často využiacutevanaacute nielen v molekulovej genetike ale aj biocheacutemii Elektroforeacuteza využiacuteva schopnosť nabityacutech molekuacutel migrovať v jednosmernom elektrickom poli k opačneacutemu poacutelu Nukleoveacute kyseliny majuacute vďaka svojej fosfaacutetovej zložke negatiacutevny naacuteboj preto v jednosmernom elektrickom poli migrujuacute ku kladneacutemu poacutelu čiže k anoacutede Elektroforeacuteza prebieha v elektroforetickej aparatuacutere v geacuteloch (v nosiči) so sieťovitou štruktuacuterou ktoraacute umožňuje separaacuteciu molekuacutel Vzorka nukleovej kyseliny zmiešanaacute s tzv nanaacutešaciacutem tlmivyacutem roztokom s farbičkou sa nanesie do jamky v geacuteli ktoryacute je umiestnenyacute v elektroforetickej aparatuacutere v priacutetomnosti elektroforetickeacuteho pufra (TAE alebo TBE) (obr 22) Nanaacutešaciacute tlmivyacute roztoknanaacutešacia farbička umožňuje na zaacuteklade migraacutecie farbičky vidieť migraacuteciu vzorky v geacuteli a suacutečasne zvyacutešeniacutem hustoty vo vzorke umožniacute klesnuacuteť vzorke do jamky a tak zabraacuteniť jej vyplaveniu z geacutelu Draacuteha je časť geacutelu ktoryacutem putuje jedna vzorka od katoacutedy k anoacutede V draacutehe sa nachaacutedzajuacute oddeleneacute jednotliveacute fragmenty nukleovyacutech kyseliacuten určityacutech veľkostiacute viditeľneacute vo forme pruacutežkov (angl bands) Intenzita pruacutežku zaacutevisiacute od množstva molekuacutel danej veľkosti je ekvivalentnaacute hmotnosti Na určenie veľkosti fragmentov NK sa do jednej jamky nanesie štandard molekulovyacutech hmotnostiacute (angl ladder) ktoryacute maacute presne definovaneacute veľkosti fragmentov čo umožňuje odhadnuacuteť veľkosť aj hmotnosť neznaacutemych separovanyacutech fragmentov

Obr 22 Elektroforetickaacute separaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten v agaroacutezovom geacuteli (A) a vizualizaacutecia UV svetlom a GelRedtrade (B C)

24

Nukleoveacute kyseliny je možneacute elektroforeticky separovať 1) v geacuteloch agaroacutezovom (horizontaacutelna elektroforeacuteza) (obr 22) a polyakrylamidovom (vertikaacutelna elektroforeacuteza) 2) v špeciaacutelnych lineaacuternych polymeacuteroch kapilaacuternou elektroforeacutezou použitiacutem genetickeacuteho analyzaacutetora (obr 23)

Agaroacuteza je polysacharid ziacuteskanyacute z morskej riasy použiacuteva sa najčastejšie v koncentraacuteciiacute 05-2 čiacutem vyššia koncentraacutecia tyacutem je geacutel pevnejšiacute a schopnejšiacute rozliacutešiť menšie fragmenty NK Priacuteprava je jednoduchaacute odvaacuteži sa potrebneacute množstvo agaroacutezy ktoraacute sa zmieša s tlmivyacutem roztokom (pufrom) rozvariacute sa v mikrovlnnej ruacutere a naleje sa do špeciaacutelnej naacutedoby na vytvaacuteranie geacutelov kyacutem je geacutel tekutyacute vložiacute sa do neho tzv hrebeň na vytvorenie jamiek Agaroacuteza je netoxickaacute V bežnom agaroacutezovom geacuteli v zaacutevislosti od jeho koncentraacutecie je možneacute separovať DNA fragmenty dĺžky 200-50 000 bp Dnes suacute dostupneacute aj špeciaacutelne agaroacutezy napr MetaPhorreg Agarose schopneacute oddeliť fragment DNA dĺžky 20-800bp Separaacutecia v agaroacutezovom geacuteli prebieha v horizontaacutelnej aparatuacutere preto sa nazyacuteva aj horizontaacutelna elektroforeacuteza

Polyakrylamidovyacute geacutel (PAGE) vznikaacute polymerizaacuteciou akrylamidu v priacutetomnosti špeciaacutelnych chemickyacutech laacutetok (peroxodisiacuteran amoacutenny TEMED bisakrylamid) Jeho priacuteprava je preto odlišnaacute a aj naacuteročnejšia Polyakrylamidoveacute geacutely majuacute vysokuacute rozlišovaciu schopnosť (1bp) preto suacute PAGE geacutely vhodneacute aj na sekvenovanie DNA klasickyacutemi metoacutedami PAGE geacutel nie je vhodnyacute na separaacuteciu fragmentov dlhšiacutech ako 2kb Použiacuteva sa v koncentraacutecii 35 -20 s rozliacutešeniacutem fragmentov od 10bp-2000bp Akrylamid je neurotoxiacuten musiacute sa s niacutem pracovať veľmi opatrne PAGE elektroforeacuteza bežiacute vo vertikaacutelnej aparatuacutere preto sa volaacute aj vertikaacutelna elektroforeacuteza použiacuteva sa často aj na separaacuteciu proteiacutenov

Ryacutechlosť pohybu nukleovyacutech kyseliacuten (mobilita) určuje viacero faktorov 1) veľkosť NK ndash počet baacutezovyacutech paacuterov resp baacutez pričom menšie molekuly prechaacutedzajuacute geacutelom ryacutechlejšie pretože sa ľahšie pohybujuacute v geacuteli 2) konformaacutecia nukleovej kyseliny napr u rovnako veľkyacutech plazmidov kondenzovaneacute superšpiralizovaneacute plazmidy migrujuacute najryacutechlejšie rovnako veľkeacute lineaacuterne molekuly (toho isteacuteho plazmidu) bežia pomalšie a najpomalšie putujuacute relaxovaneacute kruhoveacute molekuly plazmidu 3) koncentraacutecia geacutelu určuje jeho rozlišovaciu schopnosť koncentrovanejšiacute geacutel je schopnyacute separovať kratšie fragmenty NK redšie geacutely suacute vhodneacute pre rozliacutešenie vaumlčšiacutech fragmentov 4) zloženie geacutelu je docircležiteacute pri analyacuteze sekundaacuternych štruktuacuter NK a proteiacutenov v nedenaturovanom stave sekundaacuterna štruktuacutera spomaľuje migraacuteciu NK a proteiacutenov Tento fakt využiacutevajuacute niektoreacute diagnostickeacute techniky (napr SSCP - Single Strand Conformation Polymorphism - polymorfismus konformaacutecie jednovlaacuteknovej DNA) umožňujuacutece detekciu zaacutemeny jedinej baacutezy ktoraacute spocircsobiacute odlišneacute vnuacutetromolekuloveacute paacuterovanie a vyacuteslednuacute konformaacuteciu molekuly Geacutely mocircžu teda byť denaturačneacute a nedenaturačneacute (natiacutevne) 5) napaumltie zdroja - čiacutem vyššie je napaumltie ktoreacute vytvaacutera elektrickeacute pole v elektroforetickej aparatuacutere tyacutem ryacutechlejšie fragmenty NK migrujuacute 6) zloženie roztokov a teploty

Elektroforetickyacute tlmivyacute roztok (pufor - elektrolyt) zabezpečuje stabilneacute elektroforetickeacute podmienky počas separaacutecie geacutel je v ňom ponorenyacute Obsahuje ioacuteny čo umožňuje vedenie elektrickeacuteho pruacutedu

Štandard molekulovyacutech hmotnostiacute (v laboratoacuteriaacutech nazyacutevanyacute ladder alebo marker) je zmes fragmentov DNA alebo RNA s presne definovanou veľkosťou ktoryacute sluacuteži na odhad veľkosti vyšetrovanyacutech fragmentov NK (obr 22) Pomocou špeciaacutelnych štandardov molekulovyacutech hmotnostiacute ktoryacutech fragmenty NK majuacute definovanuacute aj hmotnosť je možneacute odhadnuacuteť množstvo (hmotnosť - koncentraacuteciu) neznaacutemeho fragmentu

B C

25

41 Vizualizaacutecia DNA

Samotnaacute nukleovaacute kyselina je počas elektroforetickej separaacutecie neviditeľnaacute Vizualizaacuteciu NK umožňujuacute interkalačneacute činidlaacute ktoreacute suacute schopneacute naviazať sa na molekuly NK tyacutem že sa včlenia medzi susediace baacutezy Po ožiareniacute UV svetlom interkalačneacute činidlaacute naviazaneacute na NK fluoreskujuacute tak sa vizualizuje NK čiacutem intenziacutevnejšie fluoreskuje tyacutem viac NK je v geacutelipruacutežku priacutetomneacute Interkalačneacute činidlo sa buď primieša do geacutelu pri jeho priacuteprave čo umožniacute sledovať migraacuteciu fragmentov NK počas elektroforeacutezy a to po vybratiacute z ELFO aparatuacutery a po ožiareniacute UV svetlom alebo sa geacutel farbiacute po elektroforetickej separaacutecii V minulosti bol na zviditeľnenie NK najčastejšie použiacutevanyacute etidiumbromid kvocircli jeho mutageacutennym vlastnostiam sa v suacutečasnosti nahraacutedza menej mutageacutennymi a netoxickyacutemi činidlami ako suacute napr komerčne dostupneacute SYBRregSafe GelRedtrade GelGreentrade

Kapilaacuterna elektroforeacuteza NK prebieha v špeciaacutelnom priacutestroji genetickom analyzaacutetore (obr 23) ktoryacute musiacute mať zaacutekladneacute komponenty ako suacute elektroacutedy kapilaacutera zdroj vysokeacuteho napaumltia detektor prepojenie s počiacutetačom a softveacuteroveacute vybavenie priestor na vloženie vzoriek atď Genetickyacute analyzaacutetor predstavuje automatizovanyacute systeacutem umožňujuacuteci sekvenovanie určovanie dĺžky DNA fragmentov ndash fragmentačnuacute analyacutezu a kvantifikaacuteciu nukleovyacutech kyseliacuten V novšiacutech typoch genetickeacuteho analyzaacutetora je proces analyacutezy od vloženia vzoriek do stojana automatizovanyacute

Vzorka určenaacute na analyacutezu je elektrokineticky injektovanaacute do tenkej kapilaacutery naplnenej lineaacuternym polymeacuterom Vplyvom vysokeacuteho napaumltia sa negatiacutevne nabiteacute fragmenty DNA pohybujuacute v polymeacuteri k pozitiacutevne nabitej elektroacutede Kapilaacuterna elektroforeacuteza je tak citlivaacute že je schopnaacute detegovať jednobaacutezovyacute rozdiel DNA fragmentov DNA fragmenty musia byť pred kapilaacuternou elektroforeacutezou fluorescenčne označeneacute v kapilaacutere suacute separovaneacute na zaacuteklade veľkosti Kraacutetko pred dosiahnutiacutem kladne nabitej elektroacutedy docircjde po excitaacutecii laserovyacutem žiareniacutem k emisii žiarenia fluoroformi (farbičkami) tak že optickyacute detekčnyacute systeacutem zaznamenaacute fluorescenciu ktoraacute je naacutesledne softveacuterovo spracovanaacute a vyhodnotenaacute

Obr 23 Genetickyacute analyzaacutetor

42 RFLP

Metoacuteda polymorfizmu dĺžky restrik čnyacutech fragmentov (angl Restriction Fragment Length Polymorfism) bola prvou metoacutedou využiacutevanou na detekciu DNA variaacuteciiacute rocircznych biologickyacutech vzoriek Princiacutep metoacutedy spočiacuteva v priacutetomnosti polymorfizmov v DNA sekvencii rocircznych ľudiacute ktoreacute zapriacutečinia rozdielny profil (obrazec) DNA fragmentov po štiepeniacute jednou alebo viaceryacutemi restrikčnyacutemi endonukleaacutezami Restrikčneacute endonukleaacutezy (RE) suacute enzyacutemy ktoreacute štiepia DNA molekulu v oblasti špecifickej nukleotidovej sekvencie nazyacutevanej restrik čneacute miesto RE najčastejšie rozpoznaacutevajuacute a štiepia miesto veľkeacute 4-6 baacutez RE suacute priacutetomneacute u prokaryotov (bakteacuterie a archebakteacuterie) kde suacute suacutečasťou restrik čno-modifikačneacuteho systeacutemu akoby prokaryotickeacutej vrodenej imunity sluacutežia

26

na ochranu pred cudzou DNA (napr viacuterusovou) ktoruacute po rozpoznaniacute špecifickej sekvencie štiepia

Restrikčno-modifikačnyacute systeacutem maacute dve zložky 1) modifikačneacute enzyacutemy - metylaacutezy ktoreacute procesom metylaacutecie modifikujuacute určiteacute baacutezy svojej DNA čiacutem ich označia za vlastnuacute DNA takže takaacuteto DNA je potom rezistentnaacute voči štiepeniu restrikčnyacutemi endonukleaacutezami Najčastejšiacutem spocircsobom metylaacutecie u bakteacuteriiacute je metylaacutecia adeniacutenu na N6 pričom vznikne metyladeniacuten alebo cytoziacutenu na C5 metylcytoziacuten 2) restrikčneacute endonukleaacutezy štiepia špecifickeacute miesto dvojvlaacuteknovej DNA ktoreacute je tvoreneacute symetrickou sekvenciou zrkadlovo sa opakujuacutecich nukleotidov ndash tzv palindroacutem Restrikčneacute enzyacutemy sa použiacutevajuacute na štiepenie DNA sekvencie na mieste špecifickom pre tuacute ktoruacute restrikčnuacute endonukleaacutezu napr pri analyacuteze polymorfizmov dĺžky restrikčnyacutech fragmentov (RFLP) analyacuteze jednonukleotidovyacutech polymorfizmov (SNP) mutaacuteciiacute ako aj pri klonovaniacute DNA do vhodnyacutech vektorovyacutech DNA molekuacutel

Po štiepeniacute dvojvlaacuteknovej DNA restrikčnou endonukleaacutezou mocircžu vzniknuacuteť tri typy koncov - 5´-prečnievajuacutece konce (lepiveacute) 3´-prečnievajuacutece konce (lepiveacute) a tupeacute konce (obr 24)

Obr 24 Restrikčneacute štiepenie zanechaacutevajuacutece rocirczne konce tupeacute a lepiveacute

Restrikčneacute štiepenie je často použiacutevanou metoacutedou geacutenovyacutech manipulaacuteciiacute na konštrukciu

hybridnyacutech molekuacutel DNA s naacuteslednyacutem klonovaniacutem Priebeh RFLP analyacutezy je nasledovnyacute restrikčnaacute endonukleaacuteza sa pridaacute k DNA a zmes sa vo

vhodnyacutech reakčnyacutech podmienkach (pufor teplota) inkubuje niekoľko hodiacuten Počas inkubaacutecie docircjde k štiepeniu DNA na špecifickyacutech miestach DNA je potom elektroforeticky separovanaacute v geacuteli a naacutesledne vizualizovanaacute V minulosti po geacutelovej elektroforeacuteze nasledoval Southern blot (čiže prenos separovanyacutech fragmentov DNA z geacutelu na špeciaacutelnu membraacutenu) (obr 35) po ktorom nastala vizualizaacutecia raacutedioaktiacutevne značenou proacutebou V suacutečasnosti sa kvocircli praacutecnosti a zdravotnyacutem rizikaacutem od Southern blotu upuacutešťa a prechaacutedza sa na ryacutechlejšie menej praacutecne a zdravotne šetrnejšie metoacutedy priateľskejšie aj k životneacutemu prostrediu

RFLP bola prvou metoacutedou použiacutevanou na zistenie DNA profilu (DNA fingerprinting) mapovanie geacutenov zapriacutečiňujuacutece genetickeacute ochorenia a testovanie otcovstva Vaumlčšina RFLP markerov je vysoko lokusovo špecifickyacutech a kodominantnyacutech (obidve alely suacute detekovaneacute u heterozygota)

PCR-RFLP je laboratoacuterne priacutestupnejšia metoacuteda molekulaacuterno-genetickej diagnostiky keďže PCR umožňuje amplifikaacuteciu veľmi malyacutech množstiev DNA Alternatiacutevny naacutezov použiacutevanyacute v literatuacutere je CAPS z angl Cleaved Amplified Polymorphic Sequence assay Použitiacutem špecifickyacutech primerov docircjde PCR metoacutedou k amplifikaacutecii požadovaneacuteho uacuteseku DNA ten sa potom štiepi restrikčnou endonukleaacutezou vo vhodnyacutech podmienkach naacutesledne sa štiepne produkty elektroforeticky separujuacute a vizualizujuacute použitiacutem interkalačnyacutech farbiacutev a UV svetla (obr 25)

27

Obr 25 Princiacutep metoacutedy PCR-RFLP

43 VNTR a STR V geacutenome suacute priacutetomneacute dva typy tandemovyacutech (za sebou nasledujuacutecich) opakovaniacute

1) minisatelity ndash nazyacutevaneacute variabilnyacute počet tandemovyacutech opakovaniacute VNTR (variable number of tandem repeats) 2) mikrosatelity tiež kraacutetke tandemoveacute repetiacutecie STR (short tandem repeats)

Obidva tieto typy satelitnej DNA suacute rozmiestneneacute po celom genoacuteme suacute využiacutevaneacute hlavne vo forenznej genetike na identifikaacuteciu osocircb a určenie otcovstva popriacutepade materstva ale aj v mediciacutene na detekciu chromozoacutemovyacutech aneuploidiiacute Štruktuacutera obidvoch je podobnaacute Rozdiel medzi jednotlivyacutemi alelami je spocircsobenyacute rozdielnym počtom opakovaniacute opakujuacutecej sa sekvencie (motiacutevu) čo spocircsobiacute rocircznu dĺžku alel s rocircznym počtom tandemovyacutech opakovaniacute nazyacutevanuacute polymorfizmus dĺžky fragmentov

VNTR ndash variabilnyacute počet tandemovyacutech opakovaniacute pričom opakujuacuteca sa sekvencia maacute dĺžku od 6 do 100 baacutez pričom sa mocircže opakovať aj tisiacutece kraacutet alely tak mocircžu mať od 500do 30 000 baacutez VNTR boli v kombinaacutecii s RFLP (DNA fingerprinting ) prvyacutem polymorfizmom použiacutevanyacutem na zistenie DNA profilov a identifikaacuteciu osocircb v kriminalistickej praxi V suacutečasnosti jeho využitie v kriminalistike je kvocircli potrebe relatiacutevne veľkeacuteho množstva DNA nahradeneacute využitiacutem STR

STR - kraacutetke tandemoveacute repetiacutecie suacute v kriminalistike najčastejšie použiacutevanyacutem polymorfizmom STR lokusy suacute rozmiestneneacute po celom genoacuteme repetiacutecia obsahuje jednu až šesť baacutez pričom jej opakovaniacutem vznikne STR v rozsahu od 50 do 300bp V našom genoacuteme suacute tisiacutece STR ktoreacute mocircžu byť použiteacute pre forenznuacute analyacutezu V kriminalistike sa v suacutečasnosti na identifikaacuteciu osocircb použiacuteva 13 STR locusov ktoreacute patria k medzinaacuterodne uznaacutevanyacutem štandardom Z iniciatiacutevy FBI bola vytvorenaacute databaacuteza CODIS (Combined DNA Index System) každaacute krajina maacute svoju databaacutezu CODIS kde je možneacute vložiť a archivovať DNA profily jednotlivcov ako aj profily DNA ziacuteskanyacutech z miest kriminaacutelneho činu v databaacuteze je ich možneacute navzaacutejom porovnať a tak zistiť pocircvodcu trestneacuteho činu Medzinaacuterodnaacute jednotnosť v použiacutevaniacute CODIS STR lokusov umožňuje v priacutepade potreby vzaacutejomneacute porovnanie DNA profilov zistenyacutech na uacutezemiacute rocircznych štaacutetov CODIS STR lokusov je 13 a suacute to CSF1PO FGA TH01 TPOX VWA D3S1358 D5S818 D7S820 D8S1179 D13S317 D16S539 D18S51 a D21S11 Zistenie DNA profilu sa uskutočniacute multiplexnou PCR reakciou s fluorescenčne značenyacutemi primermi špecifickyacutemi pre konkreacutetny STR Naacutesledne suacute PCR produkty analyzovaneacute kapilaacuternou elektroforeacutezou genetickyacutem analyzaacutetorom ktoryacute rozliacuteši amplifikovaneacute fragmenty na zaacuteklade fluorescencie a dĺžky (fragmentačnaacute analyacuteza) (obr 26 Tab 3) DNA profil každeacuteho človeka je jedinečnyacute rovnakyacute profil mocircžu mať len jednovaječneacute dvojčataacute

28

Obr 26 Ukaacutežka DNA profilu človeka 15 STR lokusov s určeniacutem pohlavia pomocou lokusu pre amelogeniacuten (ženskeacute pohlavie - XX) maleacute oranžoveacute piacuteky predstavujuacute fragmenty veľkostneacuteho štandardu Tabuľka č 3 Zaacutepis DNA profilu človeka z obraacutezka č 26 15 STR lokusov s určeniacutem pohlavia pomocou lokusu pre amelogeniacuten System Alela 1 Alela 2

D3S1358 16 17

TH01 9 93 D21S11 28 28

D18S51 15 18

Penta E 7 14 D5S818 9 12

D13S317 8 11

D7S820 8 11 D16S539 11 12

CSF1PO 10 11

Penta D 11 12 vWA 15 18

D8S1179 13 16

TPOX 8 9 FGA 20 21

amel X X

29

5 MLPA

Multiplexnaacute amplifikaacutecia proacuteb zaacutevislaacute od ligaacutecie (z angl multiplex ligation-dependent probe amplification) je metoacuteda schopnaacute v jednej reakcii (v jednej skuacutemavke a vzorke) detegovať zmeny v počte až 50 nukleotidovyacutech sekvenciiacute Metoacutedou MLPA je možneacute ryacutechlo identifikovať amplifikaacutecie (duplikaacutecie) a deleacutecie veľkeacuteho počtu geacutenov či už použitiacutem DNA alebo mRNA krvnyacutech vzoriek alebo vzoriek z naacutedorov

Princiacutep MLPA spočiacuteva v multiplexnej amplifikaacutecii 50 špecifickyacutech nukleotidovyacutech sekvenciiacute použitiacutem jedneacuteho paacuteru primerov pričom jeden primer je fluorescenčne označenyacute Vyacutesledneacute PCR produkty suacute analyzovaneacute kapilaacuternou elektroforeacutezou (fragmentačnaacute analyacuteza) Dĺžka každeacuteho namnoženeacuteho produktu je jedinečnaacute narastaacute postupne o 6 alebo 9 nukleotidov pričom produkty PCR suacute 120 ndash 500 nukleotidov dlheacute Tento veľkostnyacute rozsah PCR fragmentov (dĺžka 120-500 nukleotidov s naacuterastom postupne o 6 alebo 9 nukleotidov) je optimaacutelny pre kapilaacuternu elektroforeacutezu MLPA multiplexnaacute PCR prebieha za použitia iba jedineacuteho paacuteru primerov ktoreacute amplifikujuacute špecifickeacute sekvencie Trik spočiacuteva v tom že nedochaacutedza k amplifikaacutecii DNA sekvencie ale MLPA proacuteb ktoreacute suacute pridaneacute k vzorkaacutem Každaacute MLPA proacuteba pozostaacuteva z dvoch oligonukleotidov (dve hemiproacuteby) pričom každyacute oligonukleotid obsahuje jednu zo sekvencie rozpoznaacutevanuacute PCR primermi Proacuteba vznikne jedine za predpokladu hybridizaacutecie dvoch oligonukleotidov (hemiproacuteb) k cieľovej sekvencii (geacutenu) a po ligaacutecii enzyacutemom ligaacutezou Iba ligovaneacute proacuteby suacute exponenciaacutelne amplifikovaneacute pomocou jedneacuteho paacuteru primerov Množstvo zligovanyacutech proacuteb teda zaacutevisiacute od množstva cieľovyacutech sekvenciiacute (geacutenov) vo vzorke

Postup MLPA analyacutezy je nasledovnyacute (obr27) K vzorke nukleovej kyseliny (DNA resp mRNA) sa pridaacute zmes 50 jedinečnyacutech proacuteb každaacute

proacuteba je komplementaacuterna k určitej cieľovej sekvencii NK vzorky Každaacute proacuteba však pozostaacuteva z dvoch oligonukleotidov hybridizujuacutecich vedľa seba zaacuteroveň každyacute oligonukleotid (hemiproacuteba) obsahuje pridanuacute sekvenciu rozpoznaacutevanuacute paacuterom PCR primerov Po hybridizaacuteciiacute oligonukleotidov (hemiproacuteb) dochaacutedza k ich ligaacutecii ligaacutezou Ligačnaacute reakcia je tak špecifickaacute že je schopnaacute rozliacutešiť sekvenciu liacutešiacu sa v jednom nukleotide Vyacuteslednyacute ligačnyacute produkt (proacuteba) obsahuje obidve sekvencie pre PCR primery na jednom fragmente čiže mocircže docircjsť k namnoženiu takeacutehoto fragmentu PCR reakciou V priacutepade ak nedocircjde k ligaacutecii priacuteslušnyacutech hemiproacuteb pretože hemiproacuteby nenaacutejdu cieľovuacute sekvenciu na DNA každaacute takaacuteto nezligovanaacute hemiproacuteba maacute len jednu sekvenciu rozpoznaacutevanuacute len jednyacutem PCR primerom v docircsledku čoho nemocircže prebehnuacuteť jej PCR amplifikaacutecia a počas fragmentačnej analyacutezy nie je detegovanaacute pretože negeneruje fluorescenčnyacute signaacutel

Pri MLPA analyacuteze je docircležiteacute okrem MLPA amplifikaacutecie vzorky urobiť aj MLPA amplifikaacuteciu referenčnej vzorky ku ktorej sa bude porovnaacutevať počet geacutenov (cieľovyacutech sekvenciiacute) Po kapilaacuternej elektroforeacuteze MLPA referenčnej a skuacutemanej vzorky porovnaniacutem obsahu nameranyacutech hodnocirct tzv piacutekov priacuteslušnyacutech proacuteb sa určiacute relatiacutevny počet koacutepiiacute v skuacutemanej vzorke

MLPA

1 DNA denaturaacutecia a hybridizaacutecia s MLPA proacutebami (hemiproacuteby)

2 Ligaacutecia (vytvorenie kompletnyacutech proacuteb)

3 PCR amplifikaacutecia proacuteb paacuterom primerov

4 Kapilaacuterna elektroforetickaacute separaacutecia PCR produktov

5 Analyacuteza daacutet

30

Obr 27 Princiacutep MLPA

Firma MRC-Holland v suacutečasnosti ponuacuteka stovky MLPA setov proacuteb ktoreacute suacute vhodneacute na 1) diagnostiku kongenitaacutelnych a dedičnyacutech ochoreniacute 2) zisťovanie profilu naacutedorov 3) zisťovanie metylačneacuteho profilu

MLPA je metoacuteda vhodnaacute na detekciu malyacutech prestavieb (BRCA1 BRCA2 MSH2 atď)

veľkyacutech chromozoacutemovyacutech prestavieb (Williamsov syndroacutem Prader-WilliAngelman syndroacutem atzď)

31

detekciu zmien v počte koacutepii geacutenov (obr 28 29) ako aj zistenie počtu kompletnyacutech chromozoacutemov (chromozoacutem 13 18 21 XY tiež aj z amniovej tekutiny) diagnostiku naacutedorov (zmeny počtu pri ALL CLL atď) kvantifikaacuteciu metylaacutecie (Prader-WilliAngelmanov syndroacutem Fragilnyacute X inaktivaacutecia naacutedorovyacutech supresorovyacutech geacutenov atď) mRNA analyacutezu geacutenov zuacutečastňujuacutecich sa apoptoacutezy alebo zaacutepalov

MS-MLPA (Methylation-Specific MLPA) je varianta MLPA určenaacute špeciaacutelne na analyacutezu aberantnyacutech metylaacutecii imprintovanyacutech oblastiacute ako aj detekciu metylačnyacutech zmien CpG ostrovčekov lokalizovanyacutech bliacutezko promoacutetora Rozdiel oproti štandardnej MLPA spočiacuteva v použitiacute metylačne senzitiacutevneho restrikčneacuteho enzyacutemu HhaI ktoryacute štiepi MS-MLPA proacuteby hybridizovaneacute k nemetylovanej sekvencii Každaacute DNA vzorka určenaacute pre MS-MLPA analyacutezu prejde dvoma reakciami v jednej mikroskuacutemavke štandardnou MLPA analyacutezou (bez štiepenia metylačne senzitiacutevnym enzyacutemom) a v druhej mikroskuacutemavke docircjde okrem ligaacutecie proacuteb aj k metylačne senzitiacutevnemu štiepeniu hybridizovanyacutech proacuteb s nemetylovanou DNA Amplifikujuacute sa len ligovaneacute proacuteby po PCR amplifikaacutecii sa fragmentačnou analyacutezou porovnaniacutem oboch reakciiacute zistia rozdiely v metylačnom profile vzorky k referenčnej vzorke

RT-MLPA (Reverse Transkriptase MLPA) je variaacutecia MLPA určenaacute pre zistenie mRNA profilu vzorky je alternatiacutevou k real-time PCR a mikročipom RT-MLPA nedeteguje mRNA množstvo priamo pretože použiacutevanaacute ligaacuteza nie je schopnaacute ligovať DNA oligonukleotidy keď suacute hybridizovaneacute s RNA Preto RT-MLPA začiacutena reverznou transkripciou so špeciaacutelne navrhnutyacutemi RT primermi tak aby vytvorili kraacutetke oligonukleotidy (cDNA) Potom reakcia pokračuje ako štandardnaacute MLPA

Obr 28 MLPA analyacuteza geacutenu DMD (koacutedujuacuteceho dystrofiacuten) mutaacutecie ktoreacuteho spocircsobujuacute Duchennovu svalovuacute dystrofiu u pacienta je priacutetomnaacute deleacutecia exoacutenu 45 v porovnaniacute s referenčnou vzorkou ndash kontrolou

32

Obr 29 MLPA analyacuteza geacutenu DMD (koacutedujuacuteceho dystrofiacuten) mutaacutecie ktoreacuteho spocircsobujuacute Duchennovu svalovuacute dystrofiu u pacienta suacute priacutetomneacute duplikaacutecie exoacutenov 41 42 43 44 45 (piacuteky vo vzorke pacienta sa porovnajuacute s piacutekmi v kontrole ndash referenčnej vzorke)

33

6 Sekvenovanie

Sekvenovaniacutem rozumieme určenie primaacuternej štruktuacutery DNA teda určenie poradia nukleotidov v reťazci DNA Začiatky moderneacuteho sekvenovania siahajuacute do roku 1977 kedy boli objaveneacute dve metoacutedy sekvenovania 1) chemickaacute metoacuteda Maxama a Gilberta 2) enzymatickaacute metoacuteda Sangera Nicklena a Coulsona

Princiacutep obidvoch metoacuted sekvenovania spočiacuteva v tom že sa vytvoriacute suacutebor DNA molekuacutel s rocircznou veľkosťou ktoreacute suacute zakončeneacute konkreacutetnym nukleotidom tieto DNA molekuly sa elektroforeticky separujuacute v geacuteloch s rozlišovacou schopnosťou 1 nukleotid 61 Chemickaacute metoacuteda

DNA molekuly sa na 5-konci raacutedioaktiacutevne označia raacutedioaktiacutevnym fosforom a naacutesledne sa chemicky modifikujuacute špecificky pre každuacute baacutezu DNA sa potom v modifikovanyacutech miestach štiepi čiacutem vzniknuacute rocirczne dlheacute fragmenty pričom podmienky suacute nastaveneacute tak aby sa DNA na každom mieste štiepila len raz Modifikaacutecia DNA a štiepenie prebehne v štyroch separaacutetnych reakciaacutech (skuacutemavkaacutech) takže po elektroforetickej separaacuteciiacute takto opracovanej DNA v štyroch draacutehach polyakrylamidoveacuteho geacutelu a naacuteslednej autoraacutediografii (podobne ako pri Southernovej hybridizaacutecii) je možneacute odčiacutetať nukleotidovuacute sekvenciu približne 100 nukleotidov od raacutedioaktiacutevneho označenia (v čase objavu Maxama a Gilberta) 62 Sangerova metoacuteda

Zaacuteklady metoacutedy boli popiacutesaneacute už v roku 1975 (metoacuteda plus a miacutenus) ale až vylepšenie použitiacutem dideoxynukleotidov (ddNTP) v roku 1977 došlo k zjednodušeniu sekvenovania Princiacutepom enzyacutemoveacuteho sekvenovania je terminaacutecia (zastavenie) polymerizaacutecie inkorporaacuteciou 2´ 3 -dideoxynukleotidov do novosyntetizujuacuteceho sa vlaacutekna DNA Keďže ddNTP neobsahujuacute hydroxylovuacute skupinu na 3 uhliacuteku riboacutezy nemocircžu sa zuacutečastniť na tvorbe fosfodiesterovej vaumlzby nemocircže sa pripojiť k nim ďalšiacute nukleotid čiže musiacute docircjsť k terminaacuteciiacute polymeraacutecie Reakcia prebieha v štyroch skuacutemavkaacutech s raacutedioaktiacutevne značenyacutem primerom V každej skuacutemavke suacute priacutetomneacute všetky štyri deoxynukleotidtrifosfaacutety (dNTP) ale pre každuacute skuacutemavku je špecifickyacute priacutedavok maleacuteho množstva jedneacuteho z dideoxynukleotidtrifosfaacutetov (v prvej skuacutemavke je ddATP v druhej ddCTP v tretej ddTTP a vo štvrtej ddGTP) Maleacute množstvo ddNTP spocircsobiacute že pri polymerizaacutecii dochaacutedza k prednostneacutemu zaradeniu štandardnyacutech dNTP do narastajuacuteceho reťazca a len občas sa inkorporuje ddNTP čiacutem sa zastaviacute synteacuteza reťazca V každej skuacutemavke tak vznikne suacutebor DNA fragmentov rocircznych veľkostiacute zakončenyacutech priacuteslušnyacutem ddNTP (v prvej skuacutemavke ddATP v druhej ddCTP v tretej ddTTP a vo štvrtej ddGTP) Po elektroforetickej separaacutecii v 4 draacutehach polyakrylamidoveacuteho geacutelu a autoraacutediografii sa z autoraacutediogramu odčiacuteta sekvencia

V suacutečasnosti je sekvenovanie do značnej miery automatizovaneacute pričom využiacuteva princiacutep Sangerovej enzyacutemovej metoacutedy s určityacutemi obmenami Uacutesek DNA ktoryacute treba sekvenovať sa prostredniacutectvom termostabilnyacutech DNA polymeraacutez namnožiacute PCR metoacutedou po ktorej nasleduje sekvenačnaacute reakcia (asymetrickaacute PCR) s fluorescenčne značenyacutemi ddNTP (každyacute druh označenyacute inyacutem fluorescenčnyacutem farbivom) Sekvenačnaacute reakcia prebieha v jednej skuacutemavke s jednyacutem primerom vznikne tak suacutebor jednovlaacuteknovyacutech DNA rocircznej dĺžky ktoreacute suacute na 3konci označeneacute ddNTP so špecifickyacutem fluorescenčnyacutem farbivom Taacuteto metoacuteda sekvenovania sa tiež nazyacuteva rdquodye-terminator cycle sequencingrdquo(obr 30) Po kapilaacuternej elektroforeacuteze vzorky v genetickom analyzaacutetore zaznamenaacutevaniacute fluorescencie jednotlivyacutech fragmentov CCD kamerou a softveacuterovom spracovaniacute sa ziacuteska sekvencia DNA (obr 31)

34

Obr 30 Princiacutep sekvenovania Sangerova dideoxy metoacuteda alebo tzv chain termination method (reťazec zastavujuacuteca metoacuteda) Obr 31 Určenie genotypu plodu a rodičov sekvenčnou analyacutezou DNA ziacuteskanej z plodovej vody (prenataacutelna diagnostika) a perifeacuternej krvi sekvenčnaacute analyacuteza geacutenu ASPA vyacutesledok u plodu priacutetomnaacute mutaacutecia c 914CgtA v homozygotnom stave (AA) rodičia heterozygoti (AC) Uvedenaacute mutaacutecia je v homozygotnom stave kauzaacutelnou priacutečinou Canavanovej choroby

Automatizovaneacute sekvenovanie prinaacuteša viacereacute vyacutehody oproti klasickej Sangerovej metoacutede vyššiu presnosť a ryacutechlosť v jednej sekvenačnej reakcii možnosť osekvenovať až 1200 nukleotidovyacute fragment maleacute množstvo templaacutetu potrebneacute na analyacutezu

35

63 Next Generation Sequencing (NGS)

NGS (sekvenovanie novej generaacutecie) maacute obrovskyacute potenciaacutel v analyacuteze genoacutemov pričom toto označenie zahŕňa viacereacute technologickeacute metoacutedy reprezentovaneacute niekoľkyacutemi firmami Princiacutepom je masiacutevne paralelneacute sekvenovanie čiacutem sa ziacuteskajuacute raacutedovo tisiacutece až milioacuteny sekvenciiacute naraz 631 Sekvenovanie druhej generaacutecie

Na začiatku sa analyzovanaacute DNA vo vaumlčšine priacutepadov fragmentuje (vznikne tak DNA

knižnica) na fragmenty sa pripoja kraacutetke sekvencie ndash adapteacutery naacutesledne sa tieto fragmenty rocircznymi priacutestupmi amplifikujuacute a určiacute sa ich sekvencia Vďaka čiastočnyacutem prekryvom je zo ziacuteskanyacutech sekvencii možneacute poskladať plynuluacute sekvenciu zodpovedajuacutecu pocircvodnej nefragmentovanej DNA

Pyrosekvenovanie je podobne ako Sangerova metoacuteda založenaacute na princiacutepe synteacutezy komplementaacuterneho vlaacutekna DNA avšak rozdiel je v tom že sa na detekciu inkorporaacutecie nukleotidu využiacuteva inyacute systeacutem tvorby luminiscenčneacuteho signaacutelu v priebehu reakcie Pyrosekvenovanie je umožneneacute vďaka aktivite 4 enzyacutemov - DNA polymeraacutezy ATP sulfurylaacutezy luciferaacutezy a apyraacutezy Reakčnaacute zmes obsahuje aj ďalšie komponenty - enzymatickeacute substraacutety adenoziacutenfosfosulfaacutet (APS) d-luciferiacuten sekvenovanyacute templaacutet a cyklicky postupne po jednom type pridaacutevaneacute nukleotidtrifosfaacutety Po zabudovaniacute nukleotidu do novovznikajuacuteceho reťazca docircjde k uvoľneniu pyrofosfaacutetu naacutesledne je využityacute ATP sulfurylaacutezou na synteacutezu ATP z APS počas ďalšej reakcie docircjde k využitiu ATP luciferaacutezou na premenu luciferiacutenu na oxyluciferiacuten čo spocircsobiacute svetelnyacute signaacutel a ten zaznamenaacute detekčnyacute systeacutem Poslednou enzymatickou reakciou je reakcia apyraacutezy ktoraacute odstraacuteni nezainkorporovaneacute nukleotidy a nevyužiteacute ATP aby sa celyacute proces mohol zopakovať s reakčnou zmesou obsahujuacutecou ďalšiacute nukleotidtrifosfaacutet (inyacute ako v predchaacutedzajuacutecej reakcii) Po každej reakcii detektor zaznamenaacuteva emisiu svetla na zaacuteklade intenzity svetla je možneacute určiť či bol vradenyacute priacuteslušnyacute nukleotidtrifosfaacutet či bol inkorporovanyacute jeden priacutepadne viac rovnakyacutech nukleotidtrifosfaacutetov

Zvyacutešenie vyacutekonu pyrosekvenovania umožnila tzv emulznaacute PCR v mikročasticiach a použitie platničky PicoTiterPlatereg toto sekvenovanie zaviedla firma Roche pod pojmom 454 pyrosekvenovanie v roku 2005 Na začiatku sa DNA fragmentuje na uacuteseky dlheacute 400-600 baacutez dvojvlaacuteknovaacute fragmentovanaacute DNA sa liguje s adapteacutermi prostredniacutectvom nich sa naviaže na mikročastice dvojvlaacuteknoveacute fragmenty sa oddelia mikročastice s naviazanyacutemi jednovlaacuteknovyacutemi fragmentami sa premiešajuacute so zmesou oleja a roztoku ktoryacute obsahuje všetky komponenty na uacutespešnuacute PCR Tyacutemto spocircsobom sa okolo každej mikročastice vytvoriacute vlastnyacute mikroreaktor v ktorom prebehne amplifikaacutecia fragmentu Po PCR reakcii sa mikročastice prenesuacute do platničky PicoTiterPlate v ktorej sa do jamky zmestiacute akuraacutet jedna mikročastica a reakčneacute komponenty pyrosekvenačnej reakcie PicoTiterPlatereg maacute 1 600 000 jamiek každaacute jamka maacute maximaacutelny objem 75 picolitra Platnička s mikročasticami sa vložiacute do sekvenačneacuteho systeacutemu ndash priacutestroja v ktorom sa celeacute pyrosekvenovanie uskutočniacute Chemiluminiscenčneacute signaacutely ktoryacutech počas sekvenovania vznikajuacute milioacuteny v priebehu hodiny suacute zachyteneacute CCD kamerou a analyzovaneacute softveacuterom

Firma Illumina predstavila inuacute technoloacutegiu PCR amplifikaacutecia a sekvenovanie sa uskutočňuje na skliacutečku (flow cell) Fragmentaacutecia DNA a pripojenie adapteacuterov prebieha za uacutečasti transpozoacutemov v procese nazvanom tagmentaacutecia Po hybridizaacutecii fragmentov DNA na skliacutečko prebehne v klastroch PCR amplifikaacutecia (tzv mostiacutekovaacute amplifikaacutecia) sekvenaacutecia prebieha za uacutečasti rozdielne fluorescenčne značenyacutech a chemicky modifikovanyacutech nukleotidov pričom každyacute nukleotid emituje fluorescenciu s inou vlnovou dĺžkou Na skliacutečku prebieha paralelne až 6 miliaacuterd sekvenaacutecii (obr 32)

Ďalšiacutemi možnosťami sekvenovania druhej generaacutecie je systeacutem SOLid (vyvinutyacute firmou Applied Biosystem dnes pod Thermo Fisher Scientific) a Ion Semiconductor Sequencing ndash polovodičoveacute ioacutenoveacute sekvenovanie (od firmy Ion Semiconductor Sequencing v suacutečasnosti Thermo Fisher Scientific)

36

Obr 32 Princiacutep sekvenovania novej generaacutecie od firmy Illumina PCR amplifikaacutecia a sekvenovanie sa uskutočňuje na skliacutečku (flow cell) paralelne prebieha až 6 miliaacuterd sekvenaacutecii

632 Sekvenovanie tretej generaacutecie

Pred sekvenovaniacutem netreba amplifikovať DNA PCR metoacutedou ale sekvencia sa ziacuteskava zachyteniacutem signaacutelu v reaacutelnom čase Medzi sekvenovanie tretej generaacutecie patriacute SMRT (Single Molecule Real-Time Sequencing) a Nanopore Sequencing

37

7 Fragmentačnaacute analyacuteza DNA

Je metoacuteda použiacutevanaacute na určenie veľkosti fragmentov DNA ziacuteskanyacutech PCR reakciou Dĺžka amplifikovanyacutech DNA fragmentov sa zistiacute ich porovnaniacutem s veľkostnyacutem štandardom (obr 33) ktoryacute je tvorenyacute DNA fragmentami znaacutemej dĺžky Veľkostnyacute štandard je pred kapilaacuternou elektroforeacutezou zmiešanyacute so vzorkou DNA fragmenty veľkostneacuteho štandardu suacute fluorescenčne označeneacute pričom použiteacute fluorescenčneacute farbivo je ineacute ako fluorescenčneacute farbivo použiteacute na označenie DNA fragmentov vo vyšetrovanej vzorke

Obr 33 Elektroforetogram veľkostneacuteho štandardu použiacutevaneacuteho na určenie veľkostiacute fragmentov analyzovanyacutech kapilaacuternou elektroforeacutezou v genetickom analyzaacutetore (GeneScantrade 500 LIZtrade dye Size Standard) dĺžka fragmentov v nukleotidoch (napr 50 nukleotidov)

Fragmentačnaacute analyacuteza pozostaacuteva z viaceryacutech krokov Prvyacutem je izolaacutecia DNA nasleduje PCR amplifikaacutecia počas ktorej sa novosyntetizovaneacute DNA fragmenty označia fluorescenčnyacutemi farbivami Vzorka s PCR produktom sa pripraviacute na kapilaacuternu elektroforeacutezu tak že sa zmieša s veľkostnyacutem štandardom (sluacuteži na určenie veľkosti fragmentov) a denaturačnou laacutetkou (formamid) nasleduje denaturaacutecia Pripraveneacute vzorky suacute injektovaneacute do priacutestroja (genetickyacute analyzaacutetor) kde v kapilaacutere naplnenej polymeacuterom v elektrickom poli migrujuacute fluorescenčne značeneacute fragmenty DNA na zaacuteklade veľkosti (kapilaacuterna elektroforeacuteza) Počas elektroforeacutezy genetickyacute analyzaacutetor zaznamenaacuteva fluorescenciu fragmentov Analyacutezou daacutet prostredniacutectvom špeciaacutelnych softveacuterov sa ziacuteskajuacute elektroforetogramy z ktoryacutech je možneacute zistiť veľkosť fragmentov ako aj typ fluorescencie (docircležiteacute ak suacute genetickeacute varianty rozliacutešiteľneacute rocircznou fluorescenciou napr SNaPshot) Fragmentačnaacute analyacuteza je suacutečasťou množstva molekulaacuterno-genetickyacutech metoacuted (pozri obr 12 26 28 29 34) ako suacute napr STR analyacuteza (Short Tandem Repeat) AFLP analyacuteza (Amplified Fragment Lenght Polymorfism) RFLPT-RFLP analyacuteza (Restriction Fragment Lenght PolymorfismTerminal Restricted Fragment Lenght Polymorfism) SSCP (Single Strand Conformation Polymorfism) VNTR (Variable Number of Tandem Repeat) analyacuteza straty heterozygotnosti (LOH loss of heterozygozity) MLPA (Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification) MSMSA (Methylation-Sensitive Mobility Shift Assay) SNP genotypovanie (SNaPshotreg) HiCEP (High-Coverage Expression Profiling)

38

Obr 34 Kvantitatiacutevna fragmentačnaacute PCR analyacuteza (QF-PCR) DNA izolovanej z plodovej vody vyacutesledok prenataacutelnej analyacutezy = priacutetomnosť troch piacutekov pre chromozoacutem 18 (u všetkyacutech fragmentov detegujuacutecich chromozoacutem 18 je pomer vyšetrovanyacutech markerov aberantnyacute 21 resp 111) čo znamenaacute trizoacutemiu chromozoacutemu 18 Edwardsov syndroacutem

39

8 Metoacutedy založeneacute na princiacutepe hybridizaacutecie

Nukleoveacute kyseliny majuacute schopnosť vytvaacuterať dvojvlaacuteknoveacute reťazce z jednovlaacuteknovyacutech molekuacutel na zaacuteklade komplementarity baacutez Komplementarita baacutez umožňuje replikaacuteciu DNA transkripciu RNA komplementarita baacutez zabezpečuje teda reprodukovateľnosť živej hmoty

Hybridizaacutecia je proces v ktorom na zaacuteklade komplementarity baacutez dochaacutedza k vytvoreniu dvojvlaacuteknovej nukleovej kyseliny z dvoch jednovlaacuteknovyacutech molekuacutel DNA alebo RNA alebo ich kombinaacuteciou DNA RNA pričom kratšia jednovlaacuteknovaacute nukleovaacute kyselina vystupuje ako sonda (proacuteba) Hybridizaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten je jeden z najpoužiacutevanejšiacutech naacutestrojov v molekulaacuternej bioloacutegii a genetike (hybridizaacutecia primerov alebo proacuteb sa využiacuteva v takmer každej metoacutede - v PCR RT-PCR qPCR RT-qPCR MLPA sekvenovaniacute fragmentačnej analyacuteze FISH DNA mikročipoch atď)

Denaturaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten je proces pri ktorom dochaacutedza k porušeniu vodiacutekovyacutech vaumlzieb medzi vlaacuteknami nukleovyacutech kyseliacuten (strata sekundaacuternej a terciaacutelnej štruktuacutery) tak že docircjde k ich uacuteplneacutemu oddeleniu vzniknuacute jednovlaacuteknoveacute reťazce Denaturaacutecia NK mocircže byť spocircsobenaacute vplyvom vysokyacutech teplocirct pH alebo chemickyacutech laacutetok (denaturačneacute činidlaacute) Renaturaacutecia je opačnyacute proces v ktorom na zaacuteklade komplementarity dochaacutedza k tvorbe dvojvlaacuteknovyacutech NK

Hybridiza čnaacute sonda (proacuteba) je jednovlaacuteknovaacute nukleovaacute kyselina určitej znaacutemej dĺžky a sekvencie (najčastejšie DNA pretože je stabilnejšia ako RNA) ktoraacute je značenaacute a sluacuteži na detekciu komplementaacuternych molekuacutel DNA alebo RNA v procese hybridizaacutecie V zaacutevislosti od podmienok hybridizaacutecie (stringencia) mocircže byť detegovanaacute sekvencia uacuteplne komplementaacuterna alebo v menej priacutesnych podmienkach mocircže mať sekvenčneacute odchyacutelky Proacuteba sluacuteži na vyhľadanie a zviditeľnenie cieľovyacutech NK Zviditeľnenie sa deje prostredniacutectvom označenia proacuteby ešte pred hybridizaacuteciou Značenie proacuteby mocircže byť raacutedioaktiacutevne a neraacutedioaktiacutevne (najčastejšie fluorescenčneacute)

Raacutedioaktiacutevne značeneacute proacuteby pomocou izotopov (32P) sa využiacutevali viac v minulosti v suacutečasnosti suacute kvocircli zdravotnyacutem rizikaacutem ohľaduplnosti k životneacutemu prostrediu ako aj kvocircli jednoduchšej manipulaacutecii použiacutevaneacute fluorescenčne značeneacute proacuteby Raacutedioaktiacutevne značeneacute sondy boli použiacutevaneacute hlavne metoacutedou Southernovej hybridizaacutecie (Southern blotting Southern blot) Citlivosť raacutedioaktiacutevne značenyacutech proacuteb je vyššia dosahuje schopnosť zachytiť 10 fg (femtogram 10-15) cieľovej DNA sekvencie 81 Southern blot

Metoacutedu objavil v roku 1975 britskyacute bioloacuteg Edwin Southern (preto Southern) Pri Southernovej hybridizaacutecii sa restrikčne štiepeneacute fragmenty DNA elektroforeticky separujuacute v geacuteli potom sa metoacutedou blottingu prenesuacute na nylonovuacute alebo nitroceluloacutezovuacute membraacutenu kde suacute naacutesledne hybridizovaneacute v roztoku obsahujuacutecom raacutedioaktiacutevne značenuacute sondu Priloženiacutem fotografickeacuteho filmu k membraacutene a vyvolaniacutem filmu autoraacutediografiou docircjde k zviditeľneniu lokaliacutet kde došlo k hybridizaacuteciiacute raacutedioaktiacutevne značenej sondy s fragmentom DNA (autoraacutediogram) Southern blot bol kľuacutečovou a prvou metoacutedou na identifikaacuteciu osocircb (DNA fingerprinting DNA pofiling) (obr 35)

Okrem Southern blotu existuje Northern blot na analyacutezu RNA (geacutenovej expresie) a Western blot na analyacutezu proteiacutenov postup je obdobnyacute ako pri Southern blote s obmenami špecifickyacutemi pre konkreacutetny blot Pri Northern blote sa použiacutevajuacute hybridizačneacute proacuteby ale pre vizualizaacuteciu proteiacutenov western blotom je potrebneacute použiť protilaacutetky s naacuteslednou vizualizaacuteciou Pomenovanie techniacutek je hra so sloviacutečkami (keďže paacuten Northern ani Western neobjavili takto nazvaneacute techniky)

Neraacutedioaktiacutevne značenie proacuteb použiacutevanyacutech v molekulaacuternej genetike mocircže byť nepriame (použitie haptenu) alebo priame Konečnaacute vizualizaacutecia je najčastejšie zabezpečenaacute fluoreskujuacutecimi farebnyacutemi značkami farbivami fluorochroacutemami (fluorofoacuterami) Pri priamom značeniacute je farbička kovalentne naviazanaacute na nukleotid a na zachytenie fluorescencie suacute potrebneacute špeciaacutelne priacutestroje umožňujuacutece excitaacuteciu farbičky ktoraacute potom emituje žiarenie určitej vlnovej dĺžky (emisneacute žiarenie) a to zachytiacute detekčnyacute systeacutem priacutestroja Využitie fluorochroacutemov v molekulaacuternej genetike je masiacutevne napr na vizualizaacuteciu NK elektroforeticky separovanyacutech v geacuteli kvantifikaacuteciu produktov PCR reakcie v priacutestroji real-time PCR cykleacuter sekvenovaniacute fragmentačnej analyacuteze FISH DNA mikročipoch atď

40

Obr 35 Princiacutep Southern blotu

82 FISH (fluorescenčnaacute in situ hybridizaacutecia)

FISH (fluorescent in situ hybridization fluorescenčnaacute in situ hybridizaacutecia) metoacuteda patriacute medzi molekulovo-cytogenetickeacute techniky Princiacutep FISH metoacutedy je založenyacute na hybridizaacuteciiacute fluorescenčne značenyacutech proacuteb ku komplementaacuternym uacutesekom vyšetrovanej DNA na podložnom skle (priamo na mieste - in situ) K denaturaacutecii dsDNA dochaacutedza buď vplyvom denaturačnyacutech činidiel alebo zvyacutešenou teplotou a naacuteslednou renaturaacuteciou dochaacutedza k naviazaniu sondy na komplementaacuterny uacutesek DNA Vyacutesledok hybridizaacutecie sa vizualizuje fluorescenčnyacutem mikroskopom vybavenyacutem vhodnyacutemi fluorescenčnyacutemi filtrami a vizuaacutelne zhodnotiacute skuacutesenyacutem odborniacutekom Fluorescencia sa v niektoryacutech priacutepadoch mocircže zaznamenať a hodnotiť aj pomocou softveacuteru (obr 36)

Pomocou FISH detegujeme numerickeacute aberaacutecie - zmeny v počte chromozoacutemov (napr trizoacutemia monozoacutemia chromozoacutemov) alebo štruktuacuterne aberaacutecie a prestavby (napr translokaacutecie inverzie deleacutecie duplikaacutecie amplifikaacutecie) FISH metoacuteda umožňuje identifikaacuteciu a detekciu každeacuteho ľudskeacuteho chromozoacutemu jeho zaradenie do karyotypu odhalenie malyacutech submikroskopickyacutech chromozoacutemovyacutech zmien a tiež mapovať poziacutecie jednotlivyacutech geacutenov na chromozoacuteme

41

Obr 36 Princiacutep štandardnej FISH a FISH maľovania celeacuteho chromozoacutemu

Veľkou vyacutehodou FISH metoacutedy je možnosť analyacutezy buniek v metafaacuteze aj v interfaacuteze kedy nie je nutnaacute kultivaacutecia buniek a tiež ryacutechle analyzovanie veľkeacuteho počtu buniek (stovky až tisiacutece) K ďalšiacutem vyacutehodaacutem patriacute bezpečnosť vysokaacute citlivosť dostatočnaacute stabilita relatiacutevne kraacutetky čas hybridizaacutecie a možnosť ryacutechleho vyhodnotenia Hybridizaacutecia pri vaumlčšine suacutečasne dodaacutevanyacutech sond trvaacute 10-12 hodin (na trhu suacute už dostupneacute aj sondy so skraacutetenyacutem časom hybridizaacutecie na 2-3 hodiny) Po hybridizaacuteciiacute nasleduje odmyacutevanie kedy pri priacuteslušnej teplote dochaacutedza k odmytiu nenaviazanyacutech a nespraacutevne hybridizovanyacutech sond Preparaacutet sa naacutesledne podfarbiacute a vyacutesledok sa zhodnotiacute vo fluorescenčnom mikroskope Na podfarbenie chromozoacutemov alebo jadier sa použiacuteva modreacute kontrastneacute farbivo DAPI (46-diamidino-2-fenylindol) ktoreacute maacute silneacute fluorescenčneacute vlastnosti dokaacuteže prechaacutedzať jadrovou membraacutenou a viazať sa na DNA Vyacutesledkom je modreacute zafarbenie ktoreacute vyacuteborne kontrastuje so signaacutelmi jednotlivyacutech sond

Limitujuacutecim faktorom FISH je možnosť identifikaacutecie len tyacutech uacutesekov DNA ku ktoryacutem suacute použiteacute sondy V jednej analyacuteze je možneacute použiť najviac 3 odlišne značeneacute sondy a tak zistiť priacutepadneacute abnormality len na 1 alebo na paacuter lokusoch Na relevantnuacute detekciu je potrebneacute mať vo vzorke 1-5 aberantnyacutech interfaacutezovyacutech jadier

FISH je možneacute uskutočniť na širokej škaacutele biologickeacuteho materiaacutelu na vzorkaacutech perifeacuternej krvi kostnej drene naacuteteroch choriovyacutech klkoch plodovej vode rocircznych druhov tkaniacutev natiacutevnych alebo zaliatych v parafiacutene na 1 bunke (predimplantačnaacute genetickaacute diagnostika PGD) (obr 37)

Využiacuteva sa na detekciu aberaacuteciiacute pri mnohyacutech onkologickyacutech ochoreniach (napr pri diagnoacuteze mnohopočetnyacute myeloacutem sa v suacutečasnosti po separaacutecii CD138+ buniek robiacute FISH s 5 sondami pre geacuteny IGH TP53 RB1 oblasť 1p321q21 a stanovuje sa hyperploidia chromozoacutemov 5 9 a 15) a tiež k spresneniu doplneniu a k overeniu bežneacuteho cytogenetickeacuteho vyšetrenia

Podľa miesta na chromozoacuteme na ktorom dochaacutedza k hybridizaacutecii sondy rozlišujeme 4 typy

DNA sond bull centromeacuteroveacute sondy ndash sa viažu na strednuacute časť chromozoacutemu ndash centromeacuteru sluacutežia k diagnostike zmien v počte chromozoacutemov k detekcii chromozoacutemov neznaacutemeho pocircvodu umožňujuacute interfaacuteznu FISH na nedeliacich sa bunkaacutech (obr 38-41)

42

Obr 37 Interfaacutezna FISH preimplantačnyacute genetickyacute skriacutening aneuploidiiacute ndash blastomeacutera 3-denneacuteho ľudskeacuteho embrya s normaacutelnym počtom chromozoacutemov 13 18 21 pohlavie XY použityacutech 5 sond pre chromozoacutemy 13 ndash orange 18 ndash aqua 21 ndash green X ndash blue a Y ndash yellow (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

Obr 38 Interfaacutezne jadro po hybridizaacutecii s centromeacuterovou sondou pre chromozoacutem 8 (Vysis Abbott) V pravom jadre je priacutetomnaacute trizoacutemia chromozoacutemu 8 (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex) Obr 39 Metafaacutezna (A) a interfaacutezna FISH (B) použitaacute centromeacuterovaacute sonda CEPX spectrum orangeCEPY spectrum green (Vysis Abbott) Sonda hybridizuje k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (červenyacute signaacutel) a Y (zelenyacute signaacutel) (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

43

Obr 40 Interfaacutezna FISH vyšetrenie spermiiacute použiteacute sondy CEPX greenCEPY orange (Aneuscore Metasystems) Sondy hybridizujuacute k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (zelenyacute signaacutel) Y (červenyacute signaacutel) vľavo ndash dve haploidneacute spermie (majuacutece jedna spermia X druhaacute Y chromozoacutem) vpravo ndash dve patologickeacute spermie obsahujuacutece gonozoacutemovyacute komplement XY (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

Obr 41 Interfaacutezna FISH vyšetrenie spermiiacute použiteacute sondy CEPX greenCEPY orange a CEP18 aqua (Aneuscore Metasystems) Sondy hybridizujuacute k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (zelenyacute signaacutel) Y (červenyacute signaacutel) a 18 (modryacute signaacutel) vľavo ndash normaacutelne haploidneacute ľudskeacute spermie - 1x chromozoacutem X alebo Y a jedenkraacutet chromozoacutem 18 v strede ndash patologickaacute spermia obsahujuacuteca gonozoacutemovyacute komplement XY a jeden chromozoacutem 18 vpravo ndash patologickaacute diploidnaacute spermia s chromozoacutemami X Y a dvoma chromozoacutemami 18 (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

bull lokusovo špecifickeacute sondy ndash hybridizaacutecia prebehne na konkreacutetnom mieste geacutenu (lokuse) (obr 42-44) použiacutevajuacute sa k vyšetreniu mikrodeleacuteciiacute (straty malyacutech častiacute chromozoacutemu pri mikrodelečnyacutech syndroacutemoch) k zisteniu amplifikaacutecie onkogeacutenov a niektoryacutech špecifickyacutech translokaacuteciiacute prestavby geacutenov umožňujuacute interfaacuteznu FISH na nedeliacich sa bunkaacutech bull subtelomeroveacute ndash vaumlzba na koncoveacute časti chromozoacutemu ndash telomeacutery bull celochromozoacutemoveacute alebo celomaľovacie sondy ndash sondy hybridizujuacute s mnohopočetnyacutemi chromozoacutemovyacutemi sekvenciami pričom sa fluorescenčne tak bdquovymaľujeldquo celyacute chromozoacutem (Obr 45) Použiacutevajuacute sa na vyšetrenie chromozoacutemovyacutech prestavieb k analyacuteze translokaacuteciiacute a k detekcii pocircvodu tzv marker chromozoacutemov (malyacutech nadpočetnyacutech chromozoacutemov neznaacutemeho pocircvodu) K použitiu sondy suacute potrebneacute metafaacutezne chromozoacutemy nepoužiacutevaju sa pre interfaacuteznu FISH

Pri konvenčnej chromozoacutemovej FISH suacute homogeacutenne DNA proacuteby hybridizovaneacute s fixovanyacutem metafaacuteznym alebo prometafaacuteznym chromozoacutemomchromozoacutemami na skliacutečku (Obr 36a) Maximaacutelna rozlišovacia schopnosť metafaacuteznej FISH je niekoľko megabaacutez (Obr 39a 45) využitiacutem viac

44

natiahnutyacutech prometafaacuteznych chromozoacutemov sa dosiahne 1 Mb rozliacutešenie Prostredniacutectvom fiber FISH konkreacutetne artificiaacutelne deproteinizovanej natiahnutej DNA pripravenej in situ z celyacutech buniek na mikroskopickom skliacutečku je možneacute vizualizovať individuaacutelne geacuteny maleacute DNA elementy na chromozoacuteme s rozliacutešeniacutem okolo 1000 bp

Obr 42 Interfaacutezne jadro po hybridizaacutecii s lokusovo-špecifickou sondou LSI 5q31 Spectrum Orange5p12 Spectrum Green (Vysis Abbott) Na ľavom obraacutezku suacute priacutetomneacute dva červeneacute (5q31) a dva zeleneacute signaacutely (5p12) v pravom jadre je priacutetomnaacute deleacutecia 5q31 oblasti chyacuteba jeden červenyacute signal (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

Obr 43 Interfaacutezna FISH použitaacute lokusovo-špecifickaacute sonda ndash translokačnaacute - XL BCRABL1 plus (Metasystems) dvojfarebnaacute dvojfuacutezna kde červenaacute označuje lokus ABL1 na chromozoacuteme 9 a zelenaacute oblasť BCR na chromozoacuteme 22 Sonda deteguje fuacuteziu protoonkogeacutenu ABL1 (9q34) a geacutenu BCR (22q11) v priacutepade že červenyacute a zelenyacute signaacutel suacute pri sebe (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

45

Obr 44 Interfaacutezna FISH Použitaacute lokusovo-špecifickaacute sonda- typ break apart pre IGH geacuten V docircsledku translokaacutecie došlo k rozskočeniu geacutenu pričom translokačneacuteho partnera nepoznaacuteme vieme určiť len percento v koľkyacutech jadraacutech je geacuten prestavanyacute (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex) Obr 45 Použiteacute celochromozoacutemoveacute sondy WCP 15 (červenyacute chromozoacutem) a WCP 17 (zelenyacute chromozoacutem) Na metafaacuteze je potvrdenaacute reciprokaacute translokaacutecia t(1517)(q2221) (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

FISH vizualizaacutecia celeacuteho chromozoacutemu maľovanie chromozoacutemu anglicky chromosome

painting je špeciaacutelnou aplikaacuteciou chromozoacutemovej FISH proacuteba je koktail veľkeacuteho počtu rocircznych fluorescenčne značenyacutech DNA fragmentov hybridizujuacutecich pozdĺž celeacuteho konkreacutetneho chromozoacutemu (obr 36b 45) bdquoChromosomepaintingldquo analyzuje metafaacutezne chromozoacutemy V minulosti bola FISH vizualizaacutecia celyacutech chromozoacutemov limitovanaacute malyacutem množstvom rocirczne sfarbenyacutech fluorochroacutemov

V suacutečasnosti je možneacute detegovať množstvo cieľovyacutech sekvenciiacute naraz čo sa využiacuteva pri celogenoacutemovej chromozoacutemovej vizualizaacutecii (whole-chromosomepainting - WCP) metoacutedou multiplex FISH (M-FISH multicolor FISH o br 46) alebo spektraacutelnej karyotypizaacutecie (SKY) kedy možno rozliacutešiť všetky ľudskeacute chromozoacutemy ndash teda 24 rocircznych chromozoacutemov M-FISH a SKY patria medzi metafaacutezne formy FISH diagnostiky ktoreacute umožňujuacute simultaacutennu vizualizaacuteciu všetkyacutech ľudskyacutech chromozoacutemov v rocircznych farbaacutech čo predstavuje uľahčenie analyacutezy karyotypu hlavne pri komplexnyacutech zmenaacutech a markeroch neznaacutemeho pocircvodu Obe techniky vychaacutedzajuacute z použitia

46

celochromozoacutemovyacutech sond značenyacutech kombinaacuteciou viaceryacutech fluorochroacutemov Rozdiel medzi M-FISH a SKY spočiacuteva v technike ziacuteskania konečneacuteho obrazu

Obr 46 Multicolor FISH - každyacute chromozoacutemovyacute paacuter je zafarbenyacute inou farbou pričom na ich zafarbenie postačuje kombinaacutecia 5 fluorochroacutemov Na vyhodnocovanie je potrebnaacute špeciaacutelna sada fluorescenčnyacutech filtrov pre jednotliveacute fluorochroacutemy a špeciaacutelnyacute softweacuter Vľavo-štandardnyacute karyotyp vpravo karyotyp s mutaacuteciami (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

V molekulovej cytogenetike suacute komerčne dostupneacute sety M-FISH proacuteb umožňujuacutece

viacfarebneacute pruacutežkovanie chromozoacutemov (banding) s vysokyacutem rozliacutešeniacutem (multicolor-banding mBAND FISH MCB) čo umožňuje identifikaacuteciu intrachromozoacutemovyacutech prestavieb (Obr 47) Nevyhnutnosťou mBAND-u je mať chromozoacutemy v metafaacuteze Taacuteto metoacuteda bola prvyacutekraacutet uskutočnenaacute na chromozoacuteme 5 v roku 1999 mBAND FISH umožňuje rozliacutešiť špecifickeacute oblasti chromozoacutemov na uacuterovni pruacutežku - bandu a sub-bandu s detekciou 550 bandov haploidneacuteho karyotypu

Obr 47 A - mBAND chromozoacutemu 11 - inverzia duplikovanej oblasti 11q223-q25 B - mBAND chromozoacutemu 3 - na kruhovom chromozoacuteme deleacutecia oblasti 3p263 C - mBAND chromozoacutemu 2 - potvrdenie inverzie duplikovanej časti chromozoacutemu (poskytnuteacute RNDr Dagmar Landlovou Medirex)

FISH metoacuteda a jej varianty (M-FISH mBAND SKY) majuacute v suacutečasnosti širokeacute využitie v

klinickej genetike v onkologickej genetike na detekciu aberaacuteciiacute v čase diagnoacutezy počas liečby po

47

liečbe monitorovanie po transplantaacutecii kostnej drene v prenataacutelnej a postnataacutelnej diagnostike pri detekcii submikroskopickyacutech deleacuteciiacute (napr DiGeorge syndroacutem - 22q112 delečnyacute syndroacutem PraderndashWilli syndroacutem- chromozoacutem 15q11-13) prostredniacutectvom FISH je možnaacute detekcia numerickyacutech zmien chromozoacutemov (trizoacutemia chromozoacutemu 21 pri Downovom syndroacuteme trizoacutemia chromozoacutemu 15 pri Patauovom syndroacuteme trizoacutemia chromozoacutemu 18 pri Edwardsovom syndroacuteme) rocirczne zmeny v počte pohlavnyacutech chromozoacutemov (monozoacutemia X pri Turnerovom syndroacuteme Klinefelterov syndroacutem s X chromozoacutemom naviac - XXY) podobne v predimplantačnej diagnostike

83 DNA Microarray (DNA mikro čip biočip) DNA mikročipovanie je technika využiacutevajuacuteca hybridizaacuteciu skuacutemanej nukleovej kyseliny

(cieľovaacute vzorka) s veľkyacutem množstvom oligonukleotidovyacutech proacuteb (desať tisiacutec až milioacuten) ktoreacute suacute prichyteneacute na pevnyacute podklad najčastejšie sklenyacute silikoacutenovyacute alebo nylonovyacute (doštička čip) Skuacutemanaacute nukleovaacute kyselina je pred hybridizaacuteciou fragmentovanaacute označenaacute fluorofoacuterom a denaturovanaacute Po kontakte čipu s cieľovou vzorkou ktoraacute je vlastne zmes označenyacutech oligonukleotidov značeneacute oligonukleotidy hybridizujuacute s oligonukleotidovyacutemi sekvenciami prichytenyacutemi na čipe Potom suacute na zaacuteklade fluorescencie detekovaneacute miesta kde došlo k hybridizaacutecii čiže vzorka obsahovala takuacuteto nukleotidovuacute sekvenciu Z jedneacuteho mikročipu sa ziacuteska obrovskeacute množstvo daacutet ktoreacute je vždy nutneacute softveacuterovo spracovať V dnešnej dobe existuje niekoľko firiem poskytujuacutecich komerčne mikročipy na objednaacutevku alebo si ich laboratoacuteria produkujuacute sami

Mikročipovanie prebieha nasledovne

1) Vytvorenie DNA čipu ndash tisiacutece rocircznych jednovlaacuteknovyacutech DNA oligonukleotidov znaacutemych sekvencii sa kovalentne naviažu na povrch doštičky vždy v určitej lokalite je niekoľko rovnakyacutech oligonukleotidov veľkosť takejto lokality je ˂ 200 microm Proacutebami mocircže byť DNA cDNA alebo syntetizovaneacute oligonukleotidy Už hotoveacute mikročipy ponuacutekajuacute viacereacute firmy (Affymetrix Agilent Technologies Eppendorf Illumina) alebo si ich jednotliveacute laboratoacuteria vyraacutebajuacute sami pomocou robotickyacutech zariadeniacute DNA čip sa vytvaacutera buď nanaacutešaniacutem kvapiek oligonukleotidov na podklad alebo synteacutezou oligonukleotidov in situ na čipe 2) Priacuteprava vzorky ndash nukleovaacute kyselina (mRNA DNA) sa purifikuje určiacute sa jej kvantita a kvalita (spektrofotometericky) fragmentuje resp v priacutepade mRNA sa syntetizuje cDNA v priacutepade potreby sa mocircže DNA amplifikovať PCR reakciou štiepiť restrikčnyacutemi endonukleaacutezami 3) Fluorescenčneacute označenie (zriedkavejšie raacutedioaktiacutevne) fragmentov DNA prebieha počas reverznej transkripcie alebo PCR amplifikaacutecie za uacutečasti fluorescenčne značenyacutech nukleotidov Keď sa analyzujuacute dve rocirczne vzorky napr zdraveacute tkanivo a naacutedoroveacute tkanivo označenie nukleovyacutech kyseliacuten v tyacutechto tkanivaacutech byacuteva rozdielne a to použitiacutem dvoch rocircznych fluorescenčnyacutech farbiacutev (napr zeleneacute a červeneacute) Pred hybridizaacuteciou je potrebneacute vzorku denaturovať čiacutem sa vytvoriacute zmes jednovlaacuteknovyacutech DNA označenyacutech značkou 4) Hybridizaacutecia s mikročipom ndash v špeciaacutelnom hybridizačnom roztoku hybridizujuacute komplementaacuterne sekvencie zo vzorky s priacuteslušnyacutemi oligonukleotidovyacutemi sondami naviazanyacutemi na čipe Potom sa čip obmyje aby došlo k odstraacuteneniu čiastočne hybridizovanyacutech nukleovyacutech kyseliacuten 5) Skenovanie mikročipu ndash skenerom čipov docircjde k ožiareniu čipu laserom pričom v mieste hybridizaacutecie fluorescenčne značenyacutech DNA fragmentov s proacutebou docircjde k emisii svetla určitej vlnovej dĺžky ktoruacute skener zaznamenaacute 6) Analyacuteza daacutet prebieha metoacutedami bioinformatiky spracovaniacutem softveacutermi sa zistiacute ktoreacute lokality čipu navzaacutejom hybridizovali v priacutepade použitia dvoch vzoriek kontrolnej a skuacutemanej je možneacute analyzovať ich relatiacutevnu intenzitu hybridizaacutecie (expresie určiteacuteho geacutenu)

Existujuacute štyri typy mikročipov 1) Čipy ur čeneacute na analyacutezu expresie (obsahujuacute cDNA proacuteby) pre tzv dvojkanaacutelovyacute experiment kedy je vzorka určenaacute k hybridizaacutecii na čipe ziacuteskanaacute zmiešaniacutem DNA fragmentov kontrolnej a skuacutemanej vzorky pričom fragmenty suacute rozdielne fluorescenčne označeneacute (napr zelenyacute fluorofoacuter pre kontrolnuacute vzorku a červenyacute pre skuacutemanuacute) Na zaacuteklade intenzity a typu fluorescencie sa deteguje expresia geacutenov typickaacute pre kontrolnuacute vzorku (napr zelenaacute fluorescencia) pre skuacutemanuacute vzorku (napr

48

červenaacute fluorescencia) a expresia podobnaacute u oboch vzoriek (žltaacute fluorescencia) neexprimovaneacute geacuteny (čierna fluorescencia) rocirczne odtiene (v zaacutevislosti od prevažujuacutecej hybridizaacutecie) (obr 48) 2) Čipy ur čeneacute na analyacutezu mutaacutecii použije sa genoacutemovaacute DNA označenaacute jednou fluorescenčnou farbičkou na určenie jednonukleotidovej zmeny (SNP ndash Single Nukleotide Polymorphism) 3) Čipy na komparatiacutevnu genoacutemovuacute hybridizaacuteciu (aCGH array Comparative Genomic Hybridization) ndash použiacutevaneacute na zistenie zvyacutešenia alebo zniacuteženia množstva chromozoacutemovyacutech fragmentov obsahujuacutecich geacuteny zodpovedneacute za určiteacute ochorenie Na analyacutezu sa použije skuacutemanaacute gDNA a referenčnaacute (kontrolnaacute) DNA každaacute sa značiacute inou fluorescenčnou farbičkou (princiacutep ako pri analyacuteze expresie) (obr 49 50) 4) Čipy CGH - SNP kombinovaneacute čipy ur čeneacute na analyacutezu aj mutaacuteciiacute SNP aj na komparatiacutevnu genoacutemovuacute hybridizaacuteciu CGH

Mikročipy majuacute rozsiahle využitie napriacuteklad v identifikaacuteciiacute novyacutech geacutenov vo vyacuteskume ich funkciiacute expresie v rocircznych podmienkach pri diagnostike mnohyacutech ochoreniacute vo farmakogenomike vo vyacuteskume vplyvu toxiacutenov

Obr 48 Heatmapa geacutenovej expresie vybranyacutech geacutenov (mRNA) mikročip obsahuje 46000 cDNA proacuteb (poskytnuteacute Ing Helenou Gbelcovou PhD Uacutestav lekaacuterskej bioloacutegie genetiky a klinickej genetiky LF UK a UNB)

49

Obr 49 Princiacutep komparatiacutevnej genoacutemovej hybridizaacutecie (aCGH - array comparative genomic hybridization) Obr 50 A) Vyacutesledok komparatiacutevnej genoacutemovej hybridizaacutecie (aCGH - array comparative genomic hybridization) vzorky DNA izolovanej plodovej vody U plodu s abnormaacutelnym ultrasonografickyacutem vyšetreniacutem bola identifikovanaacute duplikaacutecia oblasti 3q261q29 (modryacute paacutes) a deleacutecia oblasti 5p1533p151 (červenyacute paacutes) Pre porovnanie chromozoacutem 1 bez aberaacutecie b) Ten istyacute pacient ale ineacute softveacuteroveacute spracovanie (poskytnuteacute RNDr Miroslavom Tomkom PhD Medirex)

50

Odporuacutečanaacute a použitaacute literatuacutera

Odborneacute knihy Klug W S Cummings M R Spencer Ch A Palladino M A Concepts of Genetics jedenaacuteste vydanie (2015) Carson S Molecular Biology Techniques tretie vydanie (2012) Strachan T Read A Human Molecular Genetics štvrteacute vydanie (2011) Sudbery P Sudbery I Human Molecular Genetics tretie vydanie (2009)

Internetoveacute straacutenky

wwwncbinlmnihgov wwwmlpacom wwwthermofishercom wwwilluminacom wwwpromegask wwwqiagencom wwwambioncom

Odborneacute člaacutenky Chacon-Cortes D Griffiths L R Methods for extracting genomic DNA from whole blood samples current perspectives Journal of Biorepository Science for Applied Medicine Volume 2 strany 1- 9 Viltrop T Krjutskov K Palta P Metspalu A Comparison of DNA extraction methods for multiplex polymerase chain reaction Anal Biochem 2010 Volume 398(2) strany 260-262 Ing Martin Čermaacutek Molekulaacuterna cytogenetika v problematike familiaacuternych maligniacutet Onkoloacutegia Volume 2 strany 77 - 83 Livak KJ Schmittgen TD Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method Methods 2001 Volume 25(4) strany 402 - 408 Bustin S A Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays J Mol Endocrinol 2000 Volume 25(2) strany169 - 193

MOLEKULAacuteRNE METOacuteDY AKTUAacuteLNE POUŽIacuteVANEacute V KLINICKEJ GENETIKE RNDr Andrea Pastoraacutekovaacute PhD RNDr Robert Petrovič PhD Vydala Univerzita Komenskeacuteho v Bratislave Lekaacuterska fakulta Rozsah 50 straacuten 246 AH prveacute vydanie ISBN 978-80-223-4231-5

2

Obsah Predhovor 3 1 Izolaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten 4 11 Izolaacutecia DNA 4 12 Izolaacutecia RNA 5 2 Stanovenie kvantity a kvality nukleovyacutech kyseliacuten 8 21 Spektrofotometrickaacute kvantifikaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten 8 22 Kvantifikaacutecia s použitiacutem fluorescenčnyacutech farbiacutev 8 221 Využitie migraacutecie nukleovej kyseliny v geacuteli s jej naacuteslednou fluorescenčnou

detekciou 8

222 Využitie kvantifikaacutecie množstva nukleovyacutech kyseliacuten použitiacutem real-time PCR metoacutedy

9

223 Kvantifikaacutecia fluorospektrofotometrom (fluorimetrom) 9 3 PCR (polymeraacutezovaacute reťazovaacute reakcia) 11 31 Najdocircležitejšie PCR komponenty 11 32 Variaacutecie PCR 13 33 Kvantitatiacutevna PCR (qPCR) 16 331 Kvantifikaacutecia pomocou qPCR 18 332 Určenie genotypu metoacutedou alelovej diskriminaacutecie a analyacutezou krivky topenia

(HRM)

20 4 Elektroforetickaacute separaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten 23 41 Vizualizaacutecia DNA 25 42 RFLP 25 43 VNTR a STR 27 5 MLPA 29 6 Sekvenovanie 33 61 Chemickaacute metoacuteda 33 62 Sangerova metoacuteda 33 63 Next Generation Sequencing (NGS) 35 631 Sekvenovanie druhej generaacutecie 35 632 Sekvenovanie tretej generaacutecie 36 7 Fragmentačnaacute analyacuteza DNA 37 8 Metoacutedy založeneacute na princiacutepe hybridizaacutecie 39 81 Southern blot 39 82 FISH (fluorescent in situ hybridization) 40 83 DNA Microarray (DNA mikročip biočip) 47

3

Predhovor

Genetika prekonala v poslednyacutech desaťročiach obrovskyacute pokrok Začiatok predstavoval zavedenie cytogenetickyacutech metoacuted pokračovanie v podobe osekvenovania celeacuteho ľudskeacuteho genoacutemu čo viedlo v suacutečasnosti k možnosti masiacutevneho paralelneacuteho sekvenovania jednotlivcov metoacutedou sekvenovania novej generaacutecie veduacuteceho k ziacuteskaniu raacutedovo tisiacutecov až milioacutenov sekvenciiacute naraz Cieľ ako aj spocircsob spracovania predloženeacuteho textu je zameranyacute na potreby pregraduaacutelneho a postgraduaacutelneho štuacutedia mediciacutenskej komunity Noveacute laboratoacuterne metoacutedy priacutestrojoveacute vybavenie a predovšetkyacutem molekulaacuterno-genetickyacute pokrok sa preniesol do mediciacutenskej praxe s prenikaniacutem do takmer všetkyacutech mediciacutenskych špecializaacuteciiacute Preto je nevyhnutneacute aby si študenti a lekaacuteri tieto noveacute poznatky a trendy osvojili a naacutesledne ich dokaacutezali využiacutevať v klinickej praxi Publikaacutecia sumarizuje a vysvetľuje molekulaacuterno-genetickeacute metoacutedy ktoreacute suacute v suacutečasnosti využiacutevaneacute za uacutečelom genetickej diagnostiky

Autori

4

1 Izolaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten 11 Izolaacutecia DNA

Prvuacute izolaacuteciu DNA uskutočnil v roku 1869 švajčiarsky vedec Friedrich Miescher Izolaacutecia DNA je kľuacutečovyacutem krokom pre množstvo naacuteslednyacutech aplikaacutecii v oblasti molekulovej bioloacutegie a lekaacuterskej genetiky Najčastejšiacutem a najdostupnejšiacutem materiaacutelom vhodnyacutem na izolaacuteciu ľudskej genoacutemovej DNA suacute leukocyty krvi DNA je možneacute ziacuteskať aj z inyacutech tkaniacutev a telesnyacutech tekutiacuten ako suacute napriacuteklad svaly koža kosti zuby sperma sliny moč plodovaacute voda atď Metoacuted izolaacutecie genoacutemovej DNA je viacero Vyacuteber zaacutevisiacute od technickeacuteho vybavenia laboratoacuteria časovyacutech a finančnyacutech možnostiacute ako aj od materiaacutelu z ktoreacuteho sa DNA izoluje od podmienok jej uskladnenia a od množstva potrebneacuteho na analyacutezu Najviac využiacutevanyacutem zdrojom DNA je perifeacuterna krv preto sa zameriame na extrakčneacute protokoly z tohto materiaacutelu Existujuacute viacereacute metoacutedy na izolaacuteciu DNA ktoreacute majuacute však spoločneacute kroky

1) rozrušenie bunkovej membraacuteny a lyacuteza buniek 2) denaturaacutecia nukleoproteiacutenoveacuteho komplexu 3) inaktivaacutecia nukleaacutez a ďalšiacutech bunkovyacutech enzyacutemov 4) DNA precipitaacutecia

Lyacuteza buniek sa dosahuje použitiacutem detergentov a enzyacutemov Sodnaacute soľ dodecylsulfaacutetu (SDS) TritonTMX-100 suacute priacuteklady bežnyacutech detergentov solubilizujuacutecich bunkovuacute membraacutenu Spolu k detergentom sa často pridaacutevajuacute enzyacutemy a to za uacutečelom štiepenia glykoproteiacutenov a inaktivaacutecie DNaacutez Bunkoveacute DNaacutezy suacute enzyacutemy ktoreacute štiepia DNA a tyacutem znehodnocujuacute a znižujuacute vyacuteťažok a kvalitu nukleovyacutech kyseliacuten

Precipitaacutecia DNA z roztoku prebieha pridaniacutem vysokej koncentraacutecie soli (napr octan amoacutenny) a za priacutetomnosti rozpuacutešťadiel (napr etanol v konečnej koncentraacutecii 70-80 alebo izopropanol v konečnej koncentraacutecii 40-50)

Niektoreacute protokoly pokračujuacute premytiacutem DNA precipitaacutetu 70 etanolom čiacutem docircjde k zbaveniu sa nadbytočnyacutech soliacute Nakoniec sa DNA rozpustiacute vo vode alebo v pufri napr TE (pozostaacutevajuacutecom z 10mM Tris 1mM EDTA-kyselina etyleacutendiamintetraoctovaacute) TE pufor sa použiacuteva pre dlhodobeacute uskladnenie DNA pretože zabraňuje degradaacutecii DNA nukleaacutezami nevhodnyacutem pH ťažkyacutemi kovmi a oxidaacuteciou voľnyacutemi radikaacutelmi Tris udržiava vhodneacute pH 7-8 a EDTA viaže dvojmocneacute ioacuteny (ako Mg2+ a Ca2+ ktoreacute suacute potrebneacute pre funkciu DNaacutez) ako aj braacuteni oxidačneacutemu poškodeniu ťažkyacutemi kovmi

Postupov izolaacutecie DNA je viacero vyacuteber zaacutevisiacute od naacutesledneacuteho použitia naacuterokov na kvantitu a kvalitu technickeacuteho vybavenia laboratoacuteria a potreby uskladnenia pre buduacutece použitie Suacute to najmauml

1) Priacuteprava a použitie hrubeacuteho lyzaacutetu kde je priacutetomnaacute DNA Taacuteto bdquoryacutechla a špinavaacuteldquo metoacuteda pozostaacuteva z lyacutezy buniek pri vysokej teplote (90degC 20minuacutet) alebo je uskutočnenaacute proteinaacutezou K Lyzaacutet sa použije priamo v ďalšiacutech aplikaacuteciaacutech Priacutetomnosť kontaminantov v lyzaacutete obmedzuje jeho použitie ako aj skladovanie DNA 2) Vysoľovacie metoacutedy začiacutenajuacute priacutepravou hrubeacuteho lyzaacutetu pokračujuacute tzv vysoľovaniacutem kedy sa proteiacuteny a ineacute kontaminanty precipitujuacute pri vysokej koncentraacutecii soli (octan draselnyacute octan amoacutenny) precipitaacutet je eliminovanyacute centrifugaacuteciou a DNA sa ziacuteskava z roztoku naacuteslednou alkoholovou precipitaacuteciou Vyacuteťažok DNA a jej čistota variacuteruje podľa použitej metodiky 3) Organickaacute extrakcia využiacuteva organickeacute rozpuacutešťadlaacute na odstraacutenenie kontaminantov z bunkoveacuteho lyzaacutetu Bunky suacute lyzovaneacute použitiacutem detergentov lyzaacutet sa zmieša so zmesou fenolu chloroformu a izoamylalkoholu Centrifugaacuteciou zmesi sa docieli oddelenie dvoch vrstiev organickej vrstvy (faacutezy) obsahujuacutecej kontaminanty a vodnej vrstvy (faacutezy) s DNA Zo ziacuteskanej vodnej faacutezy sa DNA izoluje najčastejšie alkoholovou precipitaacuteciou Organickaacute extrakcia bola veľmi využiacutevanaacute v laboratoacuteriaacutech v minulosti v suacutečasnosti je maacutelo použiacutevanaacute na rutinnuacute diagnostiku jednak pretože je časovo naacuteročnaacute

5

DNA mocircže obsahovať fenolchloroform ktoreacute inhibujuacute enzymatickeacute reakcie a taacuteto metoacuteda nie je vhodnaacute ani na izolaacuteciu v automatoch 4) Centrifugaacutecia v gradiente chloridu ceacutezneho (CsCl) umožňuje ziacuteskať genoacutemovuacute DNA vysokej kvality avšak taacuteto metoacuteda je časovo naacuteročnaacute praacutecna drahaacute (potrebnaacute ultracentrifuacutega) a nepoužiteľnaacute v automatoch nie je rutinne využiacutevanaacute Bunkovyacute lyzaacutet je precipitovanyacute alkoholom DNA roztok je zmiešanyacute s CsCl a etiacutediumbromidom nasleduje niekoľkohodinovaacute centrifugaacutecia v ultracentrifuacutege DNA je viditeľnaacute v podobe pruacutežku po jej odobratiacute sa extrahuje izopropanolom aby došlo k odstraacuteneniu etiacutediumbromidu a precipituje sa etanolom 5) Minikoloacutenovaacute (koloacutenkovaacute) purifikaacutecia využiacuteva schopnosť materiaacutelu v minikoloacutene (matrix matrica) adsorbovať DNA za určityacutech konkreacutetnych podmienok pH a koncentraacutecie soli (obr 1) Existujuacute viacereacute typy materiaacutelov viažucich DNA ktoreacute suacute na uacutečely izolaacutecie DNA umiestneneacute v minikoloacutene hydrofilneacute matrice viažuce vodiacutek v priacutetomnosti chaotropnyacutech činidiel matrice využiacutevajuacutece vyacutemenu ioacutenov (ioacutenomeničoveacute) matrice s určitou afinitou a veľkostnou selekciou

Vaumlčšina minikoloacutenovyacutech metoacuted maacute podobnyacute postup na začiatku prebehne lyacuteza buniek potom nasleduje DNA adsorbcia na matricu centrifugovateľnyacutech minikoloacuten premytie nukleovej kyseliny adsorbovanej na matricu v minikoloacutene čiacutem docircjde k zbaveniu sa kontaminantov a finaacutelna eluacutecia (uvoľnenie) DNA

Kremičitanoveacute (SiO2 Silika) matrice majuacute vynikajuacutecu schopnosť viazať DNA pretože suacute kladne nabiteacute a majuacute vysokuacute afinitu k negatiacutevne nabitej DNA V prostrediacute vysokej koncentraacutecie chaotropnyacutech soliacute docircjde k adsorpcii DNA na kremičitanovuacute matricu (silica geacutel) zatiaľ čo bunkoveacute proteiacuteny a ineacute metabolity zostanuacute v roztoku a naacutesledne suacute vymyteacute z koloacuteny DNA vhodnaacute na diagnostickeacute použitie je ziacuteskanaacute eluacuteciou zo silika matrice použitiacutem pufra s niacutezkou koncentraacuteciou soliacute (TE destilovanaacute voda) Existuje množstvo komerčne priacutestupnyacutech kitov (suacuteprav) ktoreacute obsahujuacute všetky potrebneacute chemikaacutelie a minikoloacuteny Izolaacutecia DNA prostredniacutectvom kitu založenom na silika materiaacuteli trvaacute od 40-60minuacutet pričom sa ziacuteska vysokokvalitnaacute DNA vo vysokom vyacuteťažku Dnes suacute k dispoziacutecii kity vhodneacute na poloautomatizovanuacute alebo plnoautomatizovanuacute izolaacuteciu DNA (obr 3)

Ďalšou možnosťou je použiť DNA izolačnyacute kit využiacutevajuacuteci magnetickeacute guľocircčky ktoreacute suacute pokryteacute materiaacutelom viažucim DNA (polymeacutery silika hydroxyapatit) DNA sa naviaže na magnetickeacute guľocircčky a prostredniacutectvom magnetickej sily magnetu je možneacute premyacutevať naviazanuacute DNA V tomto priacutepade nie je potrebneacute použiť centrifugaacuteciu

Obr 1 Minikoloacutena a postup izolaacutecie DNA

12 Izolaacutecia RNA

Ziacuteskanie RNA vysokej kvality je prvyacutem a často najkritickejšiacutem krokom pre molekulaacuterne techniky typu kvantifikaacutecie expresie určiteacuteho geacutenu metoacutedou real-time PCR (RT-qPCR) analyacutezy transkriptoacutemu sekvenovanovaniacutem ďalšej generaacutecie (NGS) analyacutezy RNA profilu mikročipmi northern analyacutezy a konštrukcie cDNA knižnice Pre dosiahnutie čo najcitlivejšiacutech a biologicky

6

najrelevantnejšiacutech vyacutesledkov je potrebneacute dodržať pracovneacute postupy pred počas a po RNA purifikaacutecii Pre optimalizaacuteciu RNA izolaacutecie a analyacutezy suacute docircležiteacute nasledovneacute kroky 1) manipulaacutecia so vzorkami určenyacutemi na RNA izolaacuteciu 2) vyacuteber metoacutedy izolaacutecie RNA 3) uskladnenie RNA

Klasickaacute izolaacutecia RNA prebieha vaumlčšinou v priacutetomnosti inhibiacutetorov ribonukleaacutez Ribonukleaacutezy (RNaacutezy) suacute bunkoveacute enzyacutemy degradujuacutece RNA Inhibiacutetory RNaacutez suacute silneacute denaturanty ktoreacute vo vzorke znižujuacute riziko RNA degradaacutecie (napr guanidiacutenoveacute soli dodecylsufaacutet sodnyacute - SDS chemikaacutelie obsahujuacutece fenol)

Pred vlastnou izolaacuteciou RNA je potrebneacute sterilizovať všetok materiaacutel (skuacutemavky špičky pipety vodu laboratoacuterny priestor) (obr 2) ktoryacute bude v kontakte so vzorkou určenou na izolaacuteciu RNA Kyacutem sa vzorka začne spracovaacutevať udržiava sa v tekutom dusiacuteku na suchom ľade alebo je vloženaacute do špeciaacutelnych stabilizačnyacutech roztokov (napr RNAlaterreg) alebo špeciaacutelnych skuacutemaviek so stabilizačnyacutem roztokom napr PAXgenereg Blood RNA Tube

Existuje niekoľko spocircsobov izolaacutecie RNA

1) Organickaacute extrakčnaacute metoacuteda je zlatyacutem štandardom izolaacutecie RNA Na začiatku izolaacutecie sa vzorka homogenizuje v roztoku obsahujuacutecom fenol (TRIzolreg RNAzolreg RT) naacutesledne sa centrifuguje Počas centrifugaacutecie dochaacutedza vo vzorke k separaacutecii troch vrstiev spodnej organickej faacutezy strednej faacutezy obsahujuacutecej denaturovaneacute proteiacuteny a genoacutemovuacute DNA a vrchnej vodnej faacutezy s RNA Po odobratiacute vrchnej faacutezy sa RNA z nej precipituje (vyzraacuteža) alkoholom a naacutesledne sa rehydratuje 2) Minikoloacutenovaacute metoacuteda (filtračnaacute) využiacuteva membraacuteny (zo sklenyacutech vlaacutekien silika alebo ioacutenomeničoveacute membraacuteny) vloženeacute do minikoloacuten Vzorka je lyzovanaacute v pufri obsahujuacutecom RNaacutezoveacute inhibiacutetory nukleoveacute kyseliny sa naviažu na membraacutenu keď lyzaacutet prechaacutedza membraacutenou počas centrifugaacutecie Membraacutena s naviazanou RNA je viackraacutet premyacutevanaacute RNA sa ziacuteska centrifugaacuteciou do novej skuacutemavky po eluacutecii vhodnyacutem elučnyacutem roztokom 3) Metoacuteda využiacutevajuacuteca magnetickeacute partikuly obsahujuacutece paramagnetickeacute vnuacutetro obklopeneacute obalom modifikovanyacutem tak aby viazal žiaduci objekt teda RNA Vzorka lyzovanaacute v roztoku obsahujuacutecom RNaacutezoveacute inhibiacutetory sa zmieša s magnetickyacutemi partikulami kedy docircjde k naviazaniu RNA na povrch magnetickyacutech partikuacutel Opakovanyacutem použitiacutem externeacuteho magnetickeacuteho poľa je možneacute vychytať magnetickeacute partikuly s naviazanou nukleovou kyselinou odstraacuteneniacutem magnetickeacuteho poľa zase uvoľniť a resupendovať v premyacutevaciacutech roztokoch Na zaacutever sa RNA uvoľniacute do elučneacuteho roztoku a magnetickeacute partikuly sa odstraacutenia 4) Priama lyacuteza sa použiacuteva na priacutepravu vzorky použitiacutem lyzačnyacutech roztokov ktoreacute lyzujuacute vzorku stabilizujuacute nukleoveacute kyseliny a takto pripravenaacute RNA mocircže byť použitaacute na ďalšie analyacutezy Priama lyacuteza teda nie je purifikačnaacute metoacuteda v pravom zmysle slova

Ziacuteskanuacute RNA je potrebneacute kvantifikova ť Ide o docircležityacute a nevyhnutnyacute krok ktoryacute predchaacutedza RNA analyacutezu Existujuacute viacereacute možnosti kvantifikaacutecie nukleovyacutech kyseliacuten ktoryacutem je venovanaacute samostatnaacute časť

Skladovanie RNA - RNA musiacute byť resuspendovanaacute resp eluovanaacute v roztoku bez RNaacutez na tento uacutečel suacute komerčne dostupneacute viacereacute roztoky na skladovanie RNA zabezpečujuacutece maximaacutelnu ochranu pred RNaacutezami RNA sa odporuacuteča skladovať pri teplote ndash 80degC v alikvoacutetoch (rozpipetovanaacute v menšiacutech množstvaacutech v mikroskuacutemavkaacutech) určenyacutech na jedno použitie

7

Obr 2 Laminaacuterny box na izolaacuteciu nukleovyacutech kyseliacuten praacutecu s DNA RNA atď Obr 3 Automatickyacute pipetovaciacute robot napr na izolaacuteciu 96 vzoriek DNA

8

2 Stanovenie kvantity a kvality nukleovyacutech kyseliacuten

Docircležiteacute je určenie koncentraacutecie a čistoty izolovanej DNA a RNA pretože analyacutezy ktoreacute nasledujuacute po izolaacutecii nukleovyacutech kyseliacuten často vyžadujuacute presneacute množstvo a čistotu nukleovyacutech kyseliacuten (NK bez priacutemesiacute) Metoacuted kvantifikaacutecie NK je niekoľko najpoužiacutevanejšie suacute spektrofotometrickaacute kvantifikaacutecia a kvantifikaacutecia UV fluorescenciou za priacutetomnosti farbičky

21 Spektrofotometrickaacute kvantifikaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten

Nukleoveacute kyseliny špecificky absorbujuacute ultrafialoveacute svetlo Vzorka s NK je v spektrofotometri (obr 6) vystavenaacute ultrafialoveacutemu svetlu o vlnovej dĺžke 260nm fotodetektor naacutesledne zmeria svetlo ktoreacute prejde vzorkou čiacutem viac svetla vzorka pohltiacute (absorbuje) tyacutem je vyššia koncentraacutecia nukleovej kyseliny vo vzorke Vyacutepočet koncentraacutecie NK zaacutevisiacute od toho či ide o DNA alebo RNA či je jednovlaacuteknovaacute alebo dvojvlaacuteknovaacute dsDNA c = A260002 [microgml] ssDNA c = A2600027 [microgml] RNA c = A2600025 [microgml]

Teda ak absorbancia dsDNA je 1 koncentraacutecia DNA vo vzorke je 50 microgml (pozn v priacutepade ak je draacuteha luacuteča 1cm)

Pokiaľ poznaacuteme sekvenciu napr pri synteacuteze primeru (ssDNA) mocircžeme z nej vypočiacutetať molekulovuacute hmotnosť a určiť priamo molaacuternu koncentraacuteciu nukleovej kyseliny (pmolmicrol) c = A260 lowast (100[15A + 071lowastC + 12lowastG + 084lowastT]) [pmolmicrol] A je počet adeniacutenov (v skutočnosti dATP) C je počet cytoziacutenov (dCTP) G je počet guaniacutenov (dGTP) a T počet tymiacutenov (dTTP)

Predpokladom pre spraacutevne určenie koncentraacutecie na zaacuteklade absorbancie je samozrejme čistota nukleovej kyseliny vo vzorke Čistota NK sa určuje podľa absorbčnej krivky popriacutepade zjednodušene na zaacuteklade pomeru absorbanciiacute pri 260 a 280 nm pretože proteiacuteny absorbujuacute svetlo vlnovej dĺžky 280nm Čistaacute DNA maacute pomer absorbanciiacute 260280 (A260280) pohybujuacutece sa okolo 18 čistaacute RNA maacute pomer absorbancii A260280 približne 2

Vzorku nukleovyacutech kyseliacuten mocircžu okrem proteiacutenov kontaminovať aj ďalšie laacutetky ako je fenol ktoryacute sa často využiacuteva pri izolaacutecii NK Takto izolovaneacute vzorky nukleovyacutech kyseliacuten nekontaminovaneacute fenolom by mali mať A260280 okolo 2 Ďalšie kontaminanty sa zisťujuacute absorbciou svetla pri 230 nm a 330 nm

22 Kvantifikaacutecia s použitiacutem fluorescenčnyacutech farbiacutev

Ďalšou možnosťou ako zmerať koncentraacuteciu nukleovyacutech kyseliacuten je zmeranie fluorescencie farbiva (napr etidiumbromid) ktoreacute sa viaže na nukleovuacute kyselinu a selektiacutevne svieti v priacutepade že je naviazaneacute na NK Metoacuteda využitia fluorescenčneacuteho farbiva naviazaneacuteho na NK sa použiacuteva v priacutepade ak je koncentraacutecia NK priacuteliš niacutezka na kvantifikaacuteciu spektrofotometrom ako aj v priacutepade že je NK kontaminovanaacute laacutetkou (kontaminantom) absorbujuacutecim svetlo vlnovej dĺžky 260nm 221 Využitie migraacutecie nukleovej kyseliny v geacuteli s jej naacuteslednou fluorescenčnou detekciou

Ak predpokladaacuteme niacutezku koncentraacuteciu NK na jej zistenie použijeme elektroforetickuacute

migraacuteciu NK v geacuteli (mocircže sa použiť agaroacutezovyacute alebo polyakrylamidovyacute geacutel) fluorescenčneacute farbivo je buď primiešaneacute do vzorky NK alebo priamo do geacutelu Spolu so vzorkou NK neznaacutemej koncentraacutecie migruje v geacuteli vo vedľajšej draacutehe vzorka NK so znaacutemou koncentraacuteciou Na zaacuteklade porovnania fluorescencie (po vystaveniacute geacutelu s NK svetlu o konkreacutetnej vlnovej dĺžke) vzorky so znaacutemou

9

koncentraacuteciu a vzorky neznaacutemej koncentraacutecie sa urobiacute odhad resp sa vyacutesledok kalkuluje počiacutetačovyacutem softveacuterom denzitometricky (obr 4)

222 Využitie kvantifikaacutecie množstva nukleovyacutech kyseliacuten použitiacutem real-time PCR metoacutedy

V priacutepade veľmi maleacuteho množstva NK ktoreacute nie je možneacute kvantifikovať ani geacutelovou elektroforeacutezou resp potrebujeme zistiť koncentraacuteciu NK veľmi presne u maleacuteho množstva NK (napr pre kriminalistiku) použije sa metoacuteda absoluacutetnej kvantifikaacutecie prostredniacutectvom real-time PCR (kvantifika čnej PCR qPCR) Princiacutep metoacutedy spočiacuteva v porovnaniacute amplifikaacutecie určiteacuteho uacuteseku nukleovej kyseliny vo vzorke neznaacutemej koncentraacutecii s amplifikaacuteciou tej istej sekvencie vo vzorke presne definovanej koncentraacutecie (obr 5) qPCR je možneacute kvantifikovať koncentraacuteciu raacutedovo v pgul 223 Kvantifikaacutecia fluorospektrofotometrom (fluori metrom)

Ak maacuteme dostatočneacute množstvo vzorky je možneacute na kvantifikaacuteciu použiť fluorospektrofotometer v tomto priacutepade je vzorka zmiešanaacute s fluorescenčnyacutem farbivom a je meranaacute emitovanaacute fluorescencia z ktorej sa vypočiacuteta koncentraacutecia

Moderneacute spektrofotometre a fluorimetre suacute konštruovaneacute tak aby na meranie bolo použiteacute minimaacutelne množstvo vzorky NK (napr pre priacutestroje NanoDrop je potrebnyacute len 05-1 microl vzorky) Pre porovnanie NanoDrop spektrofotometer (NanoDrop 2000c) je schopnyacute zmerať koncentraacutecie od 04 to 15 000 ngmicroL dsDNA NanoDrop fluorospektrometer 005 do 2000 pgmicroL Spektrofotometre a fluorofotometre suacute po meraniacute schopneacute vďaka softveacuteroveacutemu vybaveniu vypočiacutetať nielen koncentraacuteciu ale aj čistotu vzorky (httpwwwnanodropcom) Obr 4 Kvantifikaacutecia nukleovej kyseliny porovnaniacutem s fragmentom podobnej dĺžky a znaacutemej koncentraacutecie (po migraacutecii v agaroacutezovom geacuteli v jednosmernom elektrickom pruacutede a naacuteslednej fluorescenčnej detekcii) - odhad DNA v 3 draacutehe cca 100ng porovnaniacutem s 1000bp fragmentom štandardu molekulovyacutech hmotnostiacute (šmh)

10

Obr 5 Absoluacutetna kvantifikaacutecia DNA priacutestrojom real-time PCR cykleacuterom porovnaniacutem amplifikaacutecie uacuteseku DNA v skuacutemanej vzorke s amplifikaacuteciou vzorky so znaacutemou kvantitou Okrem amplifikaacutecie skuacutemanej vzorky je treba urobiť štandardnuacute krivku amplifikaacutecie vzorky znaacutemej koncentraacutecie z ktorej sa koncentraacutecia skuacutemanej vzorky odčiacuteta V kriminalistike sa bežne použiacuteva pridanie vnuacutetornej kontroly ku vzorke na určenie čistoty vzorky (v priacutetomnosti inhibiacutetorov nedocircjde k amplifikaacutecii žiadnej DNA) Vnuacutetornaacute kontrola je už priacutetomnaacute v kite čiže sa automaticky pridaacuteva pri priacuteprave vzoriek na qPCR amplifikaacuteciu sluacuteži na zistenie priacutetomnosti inhibiacutetorov v skuacutemanej vzorke teda v priacutepade že nedocircjde k amplifikaacutecii vo vzorke sluacuteži na rozliacutešenie či je koncentraacutecia DNA priacuteliš niacutezka alebo suacute vo vzorke priacutetomneacute inhibiacutetory Bežnaacute mediciacutenska molekulaacuterno-genetickaacute diagnostika nevyžaduje priacutetomnosť vnuacutetornej kontroly keďže nukleoveacute kyseliny suacute prevažne izolovaneacute kitmi z krvi čiže je zabezpečenaacute vysokaacute kvalita a čistota naizolovanej NK Obr 6 Spektrofotometer (NanoPhotometer) a ukaacutežka vyacutesledkou merania koncentraacutecie RNA izolovanej minikolonovou metoacutedou

11

3 PCR (polymeraacutezovaacute reťazovaacute reakcia)

Je metoacuteda vyvinutaacute v roku 1983 Karym Mullisom ocenenaacute v roku 1993 Nobelovou cenou za cheacutemiu Polymeraacutezovaacute reťazovaacute reakcia je založenaacute na schopnosti DNA polymeraacutezy syntetizovať noveacute vlaacutekno DNA podľa templaacutetoveacuteho vlaacutekna na zaacuteklade princiacutepu komplementarity DNA polymeraacuteza je schopnaacute pripaacutejať nukleotidy len k voľnej 3acuteOH skupine preto potrebuje primer (čiacutetaj prajmer) ku ktoreacutemu je schopnaacute pridaacutevať nukleotidy Primery suacute kraacutetke jednovlaacuteknoveacute oligonukleotidy ktoreacute umožňujuacute jednak DNA polymeraacuteze začať so synteacutezou noveacuteho vlaacutekna na druhej strane ohraničujuacute špecifickuacute oblasť ktoruacute chceme amplifikovať (namnožiť) Vyacutesledkom PCR reakcie je obrovskyacute počet koacutepii špecifickej sekvencie (obr 7) PCR v podstate napodobňuje replikaacuteciu DNA v in vitro podmienkach s rozdielom že nedochaacutedza k replikaacutecii celej DNA ale len vybraneacuteho primermi ohraničeneacuteho miesta

31 Najdocircležitejšie PCR komponenty

Templaacutetovaacute DNA je vzorka DNA obsahujuacuteca cieľovuacute sekvenciu Na začiatku reakcie docircjde pri vysokej teplote k denaturaacutecii a separaacutecii jednotlivyacutech vlaacutekien dvojvlaacuteknovej DNA

Enzyacutem DNA polymeraacuteza syntetizuje noveacute DNA vlaacutekno komplementaacuterne k cieľovej sekvencii Najčastejšie použiacutevanou a prvou DNA polymeraacutezou je Taq DNA polymeraacuteza (z termofilnej bakteacuterie Thermus aquaticus) zatiaľ čo Pfu DNA polymeraacuteza (z Pyrococcus furiosus) je preferovanaacute kvocircli tzv vysokej fidelite čo je schopnosť inkorporovať spraacutevnu baacutezu do novosyntetizovaneacuteho vlaacutekna DNA DNA polymeraacutezy musia mať dve vlastnosti schopnosť syntetizovať noveacute vlaacutekno DNA podľa templaacutetovej DNA a byť termostabilneacute čiže rezistentneacute na vysokeacute teploty (cca 100degC) V suacutečasnosti sa v laboratoacuteriaacutech často použiacutevajuacute rekombinantneacute polymeraacutezy s požadovanyacutemi vlastnosťami Napriacuteklad pre PCR ktorej produkt bude klonovanyacute je docircležiteacute použiť polymeraacutezu ktoraacute je schopnaacute opraviť vlastnuacute chybu v priacutepade inkorporaacutecie nespraacutevnej baacutezy pri synteacuteze noveacuteho reťazca Schopnosť opravovať nespraacutevne inkorporovaneacute baacutezy počas synteacutezy noveacuteho vlaacutekna DNA sa nazyacuteva tzv proofreading aktivita ktoraacute je zabezpečenaacute 3rarr5acute exonukleaacutezovou aktivitou takejto polymeraacutezy Pred vlastnou molekulaacuterno-genetickou diagnostikou je treba optimalizovať podmienky PCR reakcie pre konkreacutetnu DNA polymeraacutezu a pre špecifickeacute primery treba zistiť optimaacutelnu teplotu annealingu (hybridizaacutecie) primerov koncentraacutecie jednotlivyacutech zložiek PCR reakcie (napr MgCl2)

Primery suacute kraacutetke jednovlaacuteknoveacute DNA sekvencie komplementaacuterne k cieľovej sekvencii DNA polymeraacuteza začiacutena syntetizovať noveacute vlaacutekno z 3acutekonca primeru Docircležitou charakteristikou primerov je teplota topenia (Tm) t j teplota pri ktorej polovica DNA duplexov je disociovanaacute na jednovlaacuteknoveacute molekuly

Nukleotidy (dNTP deoxyribonukleotidtrifosfaacutety) suacute stavebneacute prvky pre novosyntetizovanuacute DNA molekulu

Veľmi praktickyacutem riešeniacutem pre molekulaacuterno-genetickeacute diagnostickeacute laboratoacuteria je tzv mastermix to je roztok v ktorom už je priacutetomneacute všetko potrebneacute pre priebeh PCR reakcie samozrejme okrem primerov a templaacutetovej DNA sekvencie PCR Master Mix (2X) od firmy ThermoFisher Scientific je jednyacutem z takyacutechto mixov obsahuje Taq DNA polymeraacutezu tlmivyacute roztok (pufor) MgCl2 a všetky deoxyribonukleotidy trifosfaacutety

Tabuľka č 1 uvaacutedza ako sa PCR reakcia z mastermixu pripravuje pre jednu vzorku Keďže v laboratoacuteriu sa zriedka robiacute PCR reakcia s jednou vzorkou treba si pripraviť tzv premix (tj PCR reakcie pre vaumlčšiacute počet vzoriek ale bez templaacutetovej DNA) ktoryacute sa rozdeliacute do mikroskuacutemaviek a až potom sa k nim pridaacute DNA resp cDNA

12

Tab 1 Priacuteprava PCR premixu

Celkovyacute objem jednej PCR reakcie 10 microl Počet vzoriek 8 2x PCR master mix 5 40

primer sense (10microM) 05 4

primer antisense (10microM) 05 4

H2O 35 28

DNA cDNA 05

rozpipetovať premix po 95microl do mikroskuacutemaviek až potom pridať do každej mikroskuacutemavky zvlaacutešť DNA cDNA

spolu objem 10 76

PCR amplif ikaacutecia je cyklickyacute proces pozostaacutevajuacuteci z troch krokov (obr 7) 1) denaturaacutecia dvojvlaacuteknovej DNA pri vysokej teplote (95degC) 2) hybridizaacutecia (annealing) primerov k špecifickej sekvencii DNA pri teplote vhodnej pre konkreacutetne primery 3) polymerizaacutecia (synteacuteza) novyacutech vlaacutekien DNA (72degC)

Obr 7 Princiacutep PCR

Tieto tri kroky sa opakujuacute 25 ndash 40 kraacutet pričom pri každom cykle sa počet molekuacutel zdvojnaacutesobiacute (vyacuteslednyacute počet cieľovej sekvencie je 2n+1 ak na začiatku bola jedna dvojvlaacuteknovaacute DNA a počet cyklov je n) PCR prebieha v termaacutelnom cykleacuteri (teplotnom cyklovači) je to priacutestroj (obr 8) kde je možneacute vykonať a naprogramovať celyacute termaacutelny priebeh PCR reakcie Tabuľka č 2 je priacutekladom termaacutelneho programu pre konkreacutetnu PCR reakciu

Po PCR reakcii je vyacuteslednyacute produkt možneacute vizualizovať elektroforeticky resp použiť na ďalšiu analyacutezu

13

Tab 2 Priacuteklad klasickeacuteho teplotneacuteho a časoveacuteho profilu PCR PCR Teplota Čas Opakovanie

95degC 2 minuacutety

95degC 15 sekuacutend

66degC 60 sekuacutend 30x

72degC 60 sekuacutend

72degC 5 minuacutet

Obr 8 Termaacutelny cykleacuter v procese a otvorenyacute s mikroskuacutemavkami

32 Variaacutecie PCR

Hot-start PCR využiacuteva DNA polymeraacutezu ktoruacute je treba aktivovať vysokou teplotou (napr 95degC 10 minuacutet) Vyacutehodou použiacutevania hot-start polymeraacutez je možnosť pracovať pri laboratoacuternej teplote keďže polymeraacuteza je pri bežnej teplote neaktiacutevna a tyacutem nemocircže docircjsť k vzniku nešpecifickyacutech produktov

Touchdown PCR maacute v počiatočnyacutech cykloch vyššiu teplotu annealingu (uacutečelom je zvyacutešiť

špecificitu PCR produktov na začiatku PCR) neskocircr sa teplota annealingu zniacuteži čo maacute za naacutesledok vyššiacute vyacuteťažok PCR produktu

Nested PCR maacute dva kroky a potrebuje dva paacutery primerov V prvom kroku sa prostredniacutectvom

prvej sady primerov amplifikuje dlhšiacute DNA fragment Ten sa použije ako templaacutet v druhom kroku s druhou sadou primerov s vyacuteslednyacutem kratšiacutem DNA produktom Nested PCR zvyšuje špecifickosť a citlivosť diagnostickyacutech PCR

Multiplex PCR je vlastne viac PCR reakciiacute prebiehajuacutecich v jednej skuacutemavke suacutečasne

V reakčnej zmesi je viac paacuterov primerov suacutečasne prebehne amplifikaacutecia viaceryacutech uacutesekov DNA takto dochaacutedza k šetreniu vzorky reakčnej zmesi a pracovneacuteho času

14

Real-time PCR je venovanaacute špeciaacutelna časť v skriptaacutech Sluacuteži na kvantifikaacuteciu PCR produktu v reaacutelnom čase na zaacuteklade merania fluorescencie okrem kvantifikaacutecie je využiacutevanaacute aj na určenie genotypov

RT-PCR je variaacutecia PCR umožňujuacuteca amplifikaacuteciu DNA sekvencie z vyacutechodiskovej RNA

sekvencie Najskocircr musiacute prebehnuacuteť prepis RNA do jednovlaacuteknovej cDNA prostredniacutectvom reverznej transkriptaacutezy naacutesledne sa cDNA použije pre PCR Selektiacutevnym použitiacutem primerov pri reverznej transkripcii mocircžeme uacutečelovo prepiacutesať buď celkovuacute RNA (primery - random hexameacutery) alebo len mRNA (primery - oligoT)

Alelovo-špecifickaacute PCR (AS-PCR) (obr 9) sluacuteži na detekciu konkreacutetnych mutaacuteciiacute

a jednonukleotidovyacutech polymorfizmov (SNP) Použije sa sada 3 primerov v dvoch kombinaacuteciaacutech PCR reakciiacute dva primery majuacute odlišnuacute sekvenciu na 3acute-koncoch jeden na detekciu wt (wild type) a druhyacute primer na detekciu mutantnej alely reakcia neprebehne ak miesto na templaacutetovej DNA nie je komplementaacuterne k 3acute-koncu primeru pretože DNA polymeraacuteza vyžaduje uacuteplnuacute hybridizaacuteciu primera na 3acute-konci Takto je možneacute rozliacutešiť priacutetomnosť štandardnej (wildtype ndash wt) a mutantnej alely resp SNP (obr 9) AS-PCR je znaacutema aj pod ďalšiacutemi naacutezvami ASO-PCR (allele-specific oligonucleotide PCR) ARMS (amplification-refractory mutation system)

Obr 9 Alelovo-špecifickaacute PCR (AS-PCR)

Mutageneacuteza prostredniacutectvom PCR (site directed mutagenesis) sa použiacuteva keď je potrebneacute vytvoriť mutaacuteciu v špecifickom mieste geacutenu primerprimery majuacute modifikovanuacute sekvenciu tak že obsahujuacute mutaacuteciu v strednej časti čo neovplyvniacute hybridizaacuteciu primerov s templaacutetovou DNA pričom vyacutesledkom je PCR produkt s cielene mutovanou DNA sekvenciou

Asymetrickaacute PCR sa použiacuteva na synteacutezu koacutepiiacute jedneacuteho vlaacutekna z templaacutetovej DNA a to

použitiacutem veľmi niacutezkej koncentraacutecie jedneacuteho primeru Sekvenačnaacute PCR je PCR v ktorej je použityacute len jeden primer a v reakčnej zmesi suacute okrem

všetkyacutech dNTP priacutetomneacute dideoxynukleotidtrifosfaacutety (ddNTP) značeneacute raacutedioaktiacutevne dnes však prevažne fluorescenčne každyacute typ ddNTP inou fluorescenčnou farbičkou Zaradenie niektoreacuteho zo štyroch ddNTP spocircsobiacute terminaacuteciu (zastavenie) predlžovania DNA reťazca fluorescenčneacute označenie ddNTP umožniacute detekciu dĺžky fragmentu a určenie sekvencie posledneacuteho nukleotidu Vyacuteslednyacute produkt sekvenačnej PCR sluacuteži na sekvenovanie Sekvenovaniu sa venuje samostatnaacute časť

MLPA (multiplex ligation-dependent probe amplification) ndash multiplexnaacute amplifikaacutecia proacuteb zaacutevislaacute od ligaacutecie je variaacutecia multiplexnej PCR umožňujuacuteca namnoženie viaceryacutech uacutesekov DNA za použitia iba jedneacuteho paacuteru primerov avšak s podmienkou vytvorenia sekvenčne špecifickej proacuteby ligaacuteciou sekvenčne špecifickyacutech oligonukleotidov MLPA je metoacuteda umožňujuacuteca detekciu počtu koacutepiiacute

15

až 50 nukleotidovyacutech sekvenciiacute v jednej reakcii Pomocou MLPA je možneacute ryacutechlo identifikovať amplifikaacutecie a deleacutecie veľkeacuteho počtu geacutenov či už z DNA alebo mRNA okrem toho MLPA mocircže byť použitaacute na analyacutezu CpG-metylaacutecie (MS-MLPA) Viac informaacutecii v samostatnej časti

SNaPshotreg Multiplex nazyacutevaneacute aj minisekvenovanie je multiplexnaacute reakcia v ktorej je každyacute primer predĺženyacute iba o jeden nukleotid (obr 10) V reakčnej zmesi nie suacute priacutetomneacute deoxyribonukleotidtrifosfaacutety ale len dideoxyribonukleotidtrifosfaacutety (ddATP ddCTP ddGTP ddTTP) každyacute označenyacute inou fluorescenčnou farbičkou Po integraacutecii ddNTP do DNA vlaacutekna je polymerizaacutecia ukončenaacute Jednovlaacuteknoveacute fragmenty (primery) predĺženeacute presne o jeden ddNTP suacute separovaneacute kapilaacuternou elektroforeacutezou v genetickom analyzaacutetore pričom je detegovanaacute ich fluorescencia a dĺžka (obr 11) Z vyacutesledneacuteho elektroforetogramu (obr 12) je možneacute určiť v jednej reakcii sekvenciu vo viac ako v 10 lokalitaacutech určiteacuteho fragmentu DNA SNaPshot Multiplex sa v molekulaacuterno-genetickom laboratoacuteriu využiacuteva na ryacutechlu detekciu viaceryacutech najčastejšie sa vyskytujuacutecich mutaacuteciiSNP geacutenu

Obr 10 Priacuteklad využitia metoacutedy SnaPshot s použitiacutem sady 13 primerov ktoreacute sa predĺžia len o 1 značenyacute dideoxynukleotid SNaPshot najčastejšiacutech mutaacuteciiacute geacutenu pre 21-hydroxylaacutezu (CYP21A2) ktoreacute spocircsobujuacute kongenitaacutelnu adrenaacutelnu hyperplaacuteziu A T G a C predstavujuacute fluorescenčne značeneacute dideoxynukleotidy

Obr 11 Vyacutesledok analyacutezy DNA pacienta metoacutedou minisekvenovania SnaPshot konkreacutetne použitiacutem sady 13 primerov rozlišujuacutecich najčastejšie bodoveacute mutaacutecie geacutenu pre 21-hydroxylaacutezu (CYP21A2) analyacutezou sa zistila mutaacutecia V281L v heterozygotnom stave (dva fragmenty modryacute a červenyacute)

16

Obr 12 SNaPshot analyacuteza geacutenu CYP21A2 u DNA izolovanej z plodovej vody metoacuteda deteguje najčastejšie bodoveacute mutaacutecie geacutenu pre 21-hydroxylaacutezu vyacutesledok prenataacutelnej analyacutezy = priacutetomnosť mutaacutecie In2G v hemizygotnom stave (keďže qPCR metoacutedou bola u plodu zistenaacute priacutetomnosť len jednej koacutepie geacutenu CYP21A2)

33 Kvantitatiacutevna PCR (qPCR)

Polymeraacutezovou reťazovou reakciou (PCR) docielime namnoženie (amplifikaacuteciu) určiteacuteho DNA uacuteseku (templaacutetu) PCR je katalyzovanaacute DNA polymeraacutezou za priacutetomnosti primerov dNTPs dvojmocnyacutech katioacutenov (ako Mg+2) a pufrovacieho roztoku

Real-time PCR ktoraacute je nazyacutevanaacute aj kvantitatiacutevna PCR (qPCR) umožňuje vizualizaacuteciu a kvantifikaacuteciu amplifikaacutecie DNA v reaacutelnom čase to je tak ako to bežiacute počas PCR qPCR využiacuteva fluorescenčneacute chemikaacutelie (farbivaacute) ktoryacutech emitovanuacute fluorescenciu zaznamenaacuteva optickyacute systeacutem počas každeacuteho PCR cyklu zaznamenanaacute fluorescencia je naacutesledne softveacuterovo spracovanaacute a vyhodnotenaacute

V suacutečasnosti sa využiacutevajuacute dva typy qPCR cheacutemie a to farbivaacute viažuce sa na DNA a fluorescenčne značeneacute proacuteby (obr 13)

Farbivaacute viažuce sa na DNA emitujuacute fluorescenciu v priacutepade ak suacute naviazaneacute na dvojvlaacuteknovuacute DNA proacuteby fluoreskujuacute v priacutepade keď molekula zhaacutešača (angl quencher - Q) sa nenachaacutedza v bliacutezkosti molekuly reporteacutera (R) napr hydrolyzujuacutece proacuteby fluoreskujuacute keď je molekula reporteacutera (R) prostredniacutectvom 5acuteexonukleaacutezovej aktivity DNA polymeraacutezy odstraacutenenaacute z bliacutezkosti molekuly zhaacutešača (Q)

Grafickyacute priebeh real ndash time PCR znaacutezorňuje amplifika čnaacute krivka (angl amplification plot) (obr 14) majuacuteca 4 faacutezy 1) Faacuteza I ndash dochaacutedza k zdvojnaacutesobeniu množstva amplikoacutenu po každom cykle ale naacuterast fluorescencie je pod detekčnyacutem limitom zaznamenaacutevanaacute fluorescencia (baseline) zodpovedaacute zaacutekladnej fluorescencii pozadia tzv šumu

17

2) Faacuteza II nazyacutevanaacute aj exponenciaacutelna faacuteza v ktorej sa fluorescencia zvyacuteši na uacuteroveň optickej detekcie bod resp cyklus kedy začiacutena exponenciaacutelna faacuteza je kľuacutečovyacute na určenie kvantity vstupneacuteho množstva templaacutetovej DNA nazyacuteva sa prahovyacute cyklus označuje sa Ct (angl treshold cycle) alebo Cq (quantification) Čiacutem nižšie je Ct (Cq) tyacutem vaumlčšiacute počet koacutepiiacute templaacutetovej DNA bolo v reakcii Ct hodnota je teda hlavnyacute uacutedaj s ktoryacutem sa pracuje vo vyacutepočtoch fluorescencia v tomto mieste sa nazyacuteva prahovaacute resp treshold 3) Faacuteza III - lineaacuterna faacuteza ndash charakterizuje ju postupneacute spotrebovaacutevanie komponentov reakcie na narastajuacutece množstvo amplikoacutenu 4) Faacuteza IV - plateau (čiacutetaj platoacute) ndash množstvo amplikoacutenu sa v docircsledku vyčerpania zložiek qPCR už nezvyšuje

Obr 13 Princiacutep real-time PCR Obr 14 Faacutezy real-time PCR

Ako štandardnaacute PCR aj qPCR maacute tri zaacutekladneacute kroky 1) Denaturaacutecia dvojvlaacuteknovej DNA na jednovlaacuteknovuacute DNA pri vysokej teplote (obyčajne 95degC) 2) Hybridizaacutecia primerov (annealing) ndash komplementaacuterne sekvencie sa spolu hybridizujuacute 3) Polymerizaacutecia pri 70-72degC kedy v docircsledku optimaacutelnej aktivity DNA polymeraacutezy dochaacutedza k predĺženiu primeru až o 100 baacutez za sekundu

18

Real-time PCR (obr 15) sa využiacuteva na kvantifikaacuteciu expresie geacutenov určenie počtu koacutepiiacute geacutenov určenie genotypu (genotypovanie) alelovou diskriminaacuteciou alebo analyacutezou krivky topenia tzv high resolution melt a multiplexnuacute real time PCR s možnosťou detekcie viaceryacutech cieľovgeacutenov

Multiplexnaacute real-time PCR sa využiacuteva na detekciu viaceryacutech cieľovgeacutenov v jednej reakcii suacutečasne Vyacutehodou multiplexovania je jednak uacutespora vzorky ako aj ziacuteskanie vaumlčšieho množstva informaacuteciiacute z rovnakeacuteho množstva materiaacutelu Nevyhnutnosťou multiplexnej qPCR suacute proacuteby značeneacute rocircznymi fluorescenčnyacutemi farbivami

Najdocircležitejšie zložky qPCR (real-time PCR komponenty) suacute DNA polymeraacuteza (reverznaacute transkriptaacuteza v priacutepade jednokrokovej kvantitatiacutevnej RT-PCT) dNTPs primery resp primeryproacuteby dvojmocneacute Mg templaacutet Na uľahčenie qPCR suacute v suacutečasnosti už komerčne dostupneacute takeacute reakčneacute zmesi ku ktoryacutem stačiacute pridať už len templaacutet (napr kity využiacutevajuacutece TaqManProacuteby) alebo kity s fluorescenčnyacutemi farbami viažucimi sa na dvojvlaacuteknovuacute DNA ku ktoryacutem sa do reakčnej zmesi okrem templaacutetu pridajuacute primery

Obr 15 Real-time PCR cykleacuter

331 Kvantifikaacutecia pomocou qPCR

Na kvantifikaacuteciu DNA pomocou qPCR sa požiacutevajuacute dve zaacutekladneacute metoacutedy - absoluacutetna kvantifikaacutecia a relatiacutevna kvantifikaacutecia

Absoluacutetna kvantifikaacutecia vychaacutedza zo štandardnej krivky (obr 16) ktoraacute sa ziacuteska po qPCR seacuterie riedeniacute DNA znaacutemej koncentraacutecie Kvantifikaacutecia neznaacutemej vzorky sa zistiacute interpolaacuteciou (odčiacutetaniacutem) Ct neznaacutemej vzorky zo štandardnej krivky (obr 16 17) Využiacutevaneacute napr v kriminalistike na stanovenie koncentraacutecie DNA vo vzorke

Relatiacutevna kvantifikaacutecia (obr 18 19) porovnaacuteva uacuteroveň expresie určiteacuteho geacutenu vo vzorke k expresii toho isteacuteho geacutenu v referenčnej (kontrolnej) vzorke alebo množstvo určiteacuteho geacutenu (počet koacutepiiacute) vo vzorke porovnaniacutem s množstvom geacutenu v kontrolnyacutech vzorkaacutech V raacutemci každej vzorky musiacute pred relatiacutevnou kvantifikaacuteciou docircjsť k tzv normalizaacutecii t j porovnanie expresie sledovaneacuteho geacutenu k expresii referenčneacuteho geacutenu (najčastejšie niacutem byacuteva tzv bdquohousekeepingldquo geacuten napr GAPDH aktiacuten tubuliacuten)

V priacutepade kvantifikaacutecie expresie určiteacuteho geacutenu metoacutedou real-time PCR (RT-qPCR) pred samotnou kvantifikaacuteciou cDNA musiacute byť taacuteto cDNA nasyntetizovanaacute prostredniacutectvom reverznej

19

transkripcie za použitia enzyacutemu reverznej transkriptaacutezy Kvantitatiacutevna PCR s reverznou transkripciou RT-qPCR mocircže byť dvojkrokovaacute alebo jednokrokovaacute Pri dvojkrokovej RT-qPCR treba pred qPCR syntetizovať cDNA vlaacutekno z RNA pomocou reverznej transkriptaacutezy - 1 krok druhyacutem krokom je samotnaacute real-time PCR Jednokrokovaacute RT-qPCR umožňuje uskutočniť obidve reakcie reverznuacute transkripciu a kvantitatiacutevnu PCR v jednej skuacutemavke čo zjednodušuje qPCR a redukuje možnosť kontaminaacutecie Obr 16 5-bodovaacute štandardnaacute krivka (amplifikaacutecia piatich koncentraacuteciiacute jednej vzorky konkreacutetne ide o 10-tkoveacute riedenie)

Obr 17 Ukaacutežka amplifikačnyacutech kriviek riedenia a z nich ziacuteskanej štandardnej krivky poukazuje na vysokuacute presnosť metoacutedy RT-PCR

20

Obr 18 Relatiacutevna kvantifikaacutecia - určenie počtu koacutepiiacute geacutenu CYP21A2 vo vzorke DNA izolovanej z perifeacuternej krvi pacientov mutaacutecie v geacutene CYP21A2 spocircsobujuacute kongenitaacutelnu adrenaacutelnu hyperplaacuteziu (CAH) Vyacutesledok analyacutezy všetci pacienti majuacute dve koacutepie geacutenu

Obr 19 Relatiacutevna kvantifikaacutecia - určenie počtu koacutepiiacute geacutenu CYP21A2 vo vzorke DNA izolovanej z plodovej vody mutaacutecie v geacutene CYP21A2 spocircsobujuacute kongenitaacutelnu adrenaacutelnu hyperplaacuteziu (CAH) Prenaacutetalnou diagnostikou (qPCR) sa zistila priacutetomnost jednej koacutepie CYP21A2 geacutenu 332 Určenie genotypu metoacutedou alelovej diskriminaacutecie a analyacutezou krivky topenia (HRM)

Určenie genotypu metoacutedou alelovej diskriminaacutecie (obr 20) sa uskutočňuje použitiacutem hydrolyzujuacutecich proacuteb (sond) je veľmi ryacutechla a senzitiacutevna (presnaacute) metoacuteda frekventovane využiacutevanaacute v laboratoacuteriaacutech Dva variantyalely suacute vyšetreneacute suacutečasne v jednej vzorke a v jednej reakčnej

21

skuacutemavke V reakcii suacute použiteacute dve proacuteby označeneacute rozdielnymi fluorescenčnyacutemi farbičkami emitujuacutecimi svetlo o rocircznej vlnovej dĺžke (najčastejšie jedna označenaacute FAM farbičkou a druhaacute proacuteba označenaacute VIC farbičkou) Počas amplifikaacutecie amplikoacutenu dochaacutedza k odstraacuteneniu zhaacutešača z bliacutezkosti farbičky ktoraacute potom emituje svetlo priacuteslušnej vlnovej dĺžky Vzorky so signaacutelom len jednej fluorescenčnej farbičky (FAM) a bez signaacutelu druhej farbičky (VIC) suacute homozygoti pre alelu 1 vzorky so signaacutelom len druhej farbičky (VIC) a bez signaacutelu prvej (FAM) suacute homozygoti pre alelu 2 v priacutepade ak vyšetrovanaacute vzorka bdquosvietildquo obidvoma farbami jednaacute sa o heterozygota

Obr 20 Určenie genotypu metoacutedou alelovej diskriminaacutecie ndash amplifikačnaacute krivka vzoriek DNA majuacutecich tri rocirczne genotypy A ndash jednotliveacute vzorky (plnaacute čiara predstavuje štandardnuacute alelu guličkovanaacute mutovanuacute alelu) B ndash 72 vzoriek C ndash scatter plot 72 vzoriek

Určenie genotypu analyacutezou krivky topenia tzv high resolution melt (HRM) (obr 21) umožňuje detekciu takmer všetkyacutech genetickyacutech variaacuteciiacute (SNP mutaacuteciiacute) Keďže taacuteto metoacuteda okrem štandardnyacutech podmienok reakcie vyžaduje len primery a farbičku (nie proacuteby) je veľmi jednoduchaacute a lacnejšia Po amplifikaacuteciiacute treba amplikoacuten pomaly zohrievať až kyacutem nedocircjde k denaturaacuteciiacute Teplota topenia amplikoacutenu vo vzorke zaacutevisiacute od DNA sekvencie čo umožňuje detegovať priacutetomnosť mutaacutecie resp SNP Tvar vyacuteslednyacutech kriviek topenia určuje teda genotyp

22

Obr 21 Určenie genotypu analyacutezou krivky topenia tzv metoacutedou high resolution melting (HRM) A ndash krivka topenia vzoriek DNA majuacutecich tri rocirczne genotypy B ndash graf rozdielnosti krivky topenia vzoriek DNA majuacutecich tri rocirczne genotypy

23

4 Elektroforetickaacute separaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten

Separaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten predstavuje rozdelenie molekuacutel DNA alebo RNA na zaacuteklade veľkosti zloženia a poradia baacutez Podobnyacutemi metoacutedami je možneacute separovať aj proteiacuteny

Elektroforeacuteza (ELFO) je technika použiacutevanaacute na separaacuteciu niekedy aj purifikaacuteciu makromolekuacutel ako suacute nukleoveacute kyseliny a proteiacuteny na zaacuteklade ich rozdielnej veľkosti naacuteboja alebo konformaacutecie Je to metoacuteda veľmi často využiacutevanaacute nielen v molekulovej genetike ale aj biocheacutemii Elektroforeacuteza využiacuteva schopnosť nabityacutech molekuacutel migrovať v jednosmernom elektrickom poli k opačneacutemu poacutelu Nukleoveacute kyseliny majuacute vďaka svojej fosfaacutetovej zložke negatiacutevny naacuteboj preto v jednosmernom elektrickom poli migrujuacute ku kladneacutemu poacutelu čiže k anoacutede Elektroforeacuteza prebieha v elektroforetickej aparatuacutere v geacuteloch (v nosiči) so sieťovitou štruktuacuterou ktoraacute umožňuje separaacuteciu molekuacutel Vzorka nukleovej kyseliny zmiešanaacute s tzv nanaacutešaciacutem tlmivyacutem roztokom s farbičkou sa nanesie do jamky v geacuteli ktoryacute je umiestnenyacute v elektroforetickej aparatuacutere v priacutetomnosti elektroforetickeacuteho pufra (TAE alebo TBE) (obr 22) Nanaacutešaciacute tlmivyacute roztoknanaacutešacia farbička umožňuje na zaacuteklade migraacutecie farbičky vidieť migraacuteciu vzorky v geacuteli a suacutečasne zvyacutešeniacutem hustoty vo vzorke umožniacute klesnuacuteť vzorke do jamky a tak zabraacuteniť jej vyplaveniu z geacutelu Draacuteha je časť geacutelu ktoryacutem putuje jedna vzorka od katoacutedy k anoacutede V draacutehe sa nachaacutedzajuacute oddeleneacute jednotliveacute fragmenty nukleovyacutech kyseliacuten určityacutech veľkostiacute viditeľneacute vo forme pruacutežkov (angl bands) Intenzita pruacutežku zaacutevisiacute od množstva molekuacutel danej veľkosti je ekvivalentnaacute hmotnosti Na určenie veľkosti fragmentov NK sa do jednej jamky nanesie štandard molekulovyacutech hmotnostiacute (angl ladder) ktoryacute maacute presne definovaneacute veľkosti fragmentov čo umožňuje odhadnuacuteť veľkosť aj hmotnosť neznaacutemych separovanyacutech fragmentov

Obr 22 Elektroforetickaacute separaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten v agaroacutezovom geacuteli (A) a vizualizaacutecia UV svetlom a GelRedtrade (B C)

24

Nukleoveacute kyseliny je možneacute elektroforeticky separovať 1) v geacuteloch agaroacutezovom (horizontaacutelna elektroforeacuteza) (obr 22) a polyakrylamidovom (vertikaacutelna elektroforeacuteza) 2) v špeciaacutelnych lineaacuternych polymeacuteroch kapilaacuternou elektroforeacutezou použitiacutem genetickeacuteho analyzaacutetora (obr 23)

Agaroacuteza je polysacharid ziacuteskanyacute z morskej riasy použiacuteva sa najčastejšie v koncentraacuteciiacute 05-2 čiacutem vyššia koncentraacutecia tyacutem je geacutel pevnejšiacute a schopnejšiacute rozliacutešiť menšie fragmenty NK Priacuteprava je jednoduchaacute odvaacuteži sa potrebneacute množstvo agaroacutezy ktoraacute sa zmieša s tlmivyacutem roztokom (pufrom) rozvariacute sa v mikrovlnnej ruacutere a naleje sa do špeciaacutelnej naacutedoby na vytvaacuteranie geacutelov kyacutem je geacutel tekutyacute vložiacute sa do neho tzv hrebeň na vytvorenie jamiek Agaroacuteza je netoxickaacute V bežnom agaroacutezovom geacuteli v zaacutevislosti od jeho koncentraacutecie je možneacute separovať DNA fragmenty dĺžky 200-50 000 bp Dnes suacute dostupneacute aj špeciaacutelne agaroacutezy napr MetaPhorreg Agarose schopneacute oddeliť fragment DNA dĺžky 20-800bp Separaacutecia v agaroacutezovom geacuteli prebieha v horizontaacutelnej aparatuacutere preto sa nazyacuteva aj horizontaacutelna elektroforeacuteza

Polyakrylamidovyacute geacutel (PAGE) vznikaacute polymerizaacuteciou akrylamidu v priacutetomnosti špeciaacutelnych chemickyacutech laacutetok (peroxodisiacuteran amoacutenny TEMED bisakrylamid) Jeho priacuteprava je preto odlišnaacute a aj naacuteročnejšia Polyakrylamidoveacute geacutely majuacute vysokuacute rozlišovaciu schopnosť (1bp) preto suacute PAGE geacutely vhodneacute aj na sekvenovanie DNA klasickyacutemi metoacutedami PAGE geacutel nie je vhodnyacute na separaacuteciu fragmentov dlhšiacutech ako 2kb Použiacuteva sa v koncentraacutecii 35 -20 s rozliacutešeniacutem fragmentov od 10bp-2000bp Akrylamid je neurotoxiacuten musiacute sa s niacutem pracovať veľmi opatrne PAGE elektroforeacuteza bežiacute vo vertikaacutelnej aparatuacutere preto sa volaacute aj vertikaacutelna elektroforeacuteza použiacuteva sa často aj na separaacuteciu proteiacutenov

Ryacutechlosť pohybu nukleovyacutech kyseliacuten (mobilita) určuje viacero faktorov 1) veľkosť NK ndash počet baacutezovyacutech paacuterov resp baacutez pričom menšie molekuly prechaacutedzajuacute geacutelom ryacutechlejšie pretože sa ľahšie pohybujuacute v geacuteli 2) konformaacutecia nukleovej kyseliny napr u rovnako veľkyacutech plazmidov kondenzovaneacute superšpiralizovaneacute plazmidy migrujuacute najryacutechlejšie rovnako veľkeacute lineaacuterne molekuly (toho isteacuteho plazmidu) bežia pomalšie a najpomalšie putujuacute relaxovaneacute kruhoveacute molekuly plazmidu 3) koncentraacutecia geacutelu určuje jeho rozlišovaciu schopnosť koncentrovanejšiacute geacutel je schopnyacute separovať kratšie fragmenty NK redšie geacutely suacute vhodneacute pre rozliacutešenie vaumlčšiacutech fragmentov 4) zloženie geacutelu je docircležiteacute pri analyacuteze sekundaacuternych štruktuacuter NK a proteiacutenov v nedenaturovanom stave sekundaacuterna štruktuacutera spomaľuje migraacuteciu NK a proteiacutenov Tento fakt využiacutevajuacute niektoreacute diagnostickeacute techniky (napr SSCP - Single Strand Conformation Polymorphism - polymorfismus konformaacutecie jednovlaacuteknovej DNA) umožňujuacutece detekciu zaacutemeny jedinej baacutezy ktoraacute spocircsobiacute odlišneacute vnuacutetromolekuloveacute paacuterovanie a vyacuteslednuacute konformaacuteciu molekuly Geacutely mocircžu teda byť denaturačneacute a nedenaturačneacute (natiacutevne) 5) napaumltie zdroja - čiacutem vyššie je napaumltie ktoreacute vytvaacutera elektrickeacute pole v elektroforetickej aparatuacutere tyacutem ryacutechlejšie fragmenty NK migrujuacute 6) zloženie roztokov a teploty

Elektroforetickyacute tlmivyacute roztok (pufor - elektrolyt) zabezpečuje stabilneacute elektroforetickeacute podmienky počas separaacutecie geacutel je v ňom ponorenyacute Obsahuje ioacuteny čo umožňuje vedenie elektrickeacuteho pruacutedu

Štandard molekulovyacutech hmotnostiacute (v laboratoacuteriaacutech nazyacutevanyacute ladder alebo marker) je zmes fragmentov DNA alebo RNA s presne definovanou veľkosťou ktoryacute sluacuteži na odhad veľkosti vyšetrovanyacutech fragmentov NK (obr 22) Pomocou špeciaacutelnych štandardov molekulovyacutech hmotnostiacute ktoryacutech fragmenty NK majuacute definovanuacute aj hmotnosť je možneacute odhadnuacuteť množstvo (hmotnosť - koncentraacuteciu) neznaacutemeho fragmentu

B C

25

41 Vizualizaacutecia DNA

Samotnaacute nukleovaacute kyselina je počas elektroforetickej separaacutecie neviditeľnaacute Vizualizaacuteciu NK umožňujuacute interkalačneacute činidlaacute ktoreacute suacute schopneacute naviazať sa na molekuly NK tyacutem že sa včlenia medzi susediace baacutezy Po ožiareniacute UV svetlom interkalačneacute činidlaacute naviazaneacute na NK fluoreskujuacute tak sa vizualizuje NK čiacutem intenziacutevnejšie fluoreskuje tyacutem viac NK je v geacutelipruacutežku priacutetomneacute Interkalačneacute činidlo sa buď primieša do geacutelu pri jeho priacuteprave čo umožniacute sledovať migraacuteciu fragmentov NK počas elektroforeacutezy a to po vybratiacute z ELFO aparatuacutery a po ožiareniacute UV svetlom alebo sa geacutel farbiacute po elektroforetickej separaacutecii V minulosti bol na zviditeľnenie NK najčastejšie použiacutevanyacute etidiumbromid kvocircli jeho mutageacutennym vlastnostiam sa v suacutečasnosti nahraacutedza menej mutageacutennymi a netoxickyacutemi činidlami ako suacute napr komerčne dostupneacute SYBRregSafe GelRedtrade GelGreentrade

Kapilaacuterna elektroforeacuteza NK prebieha v špeciaacutelnom priacutestroji genetickom analyzaacutetore (obr 23) ktoryacute musiacute mať zaacutekladneacute komponenty ako suacute elektroacutedy kapilaacutera zdroj vysokeacuteho napaumltia detektor prepojenie s počiacutetačom a softveacuteroveacute vybavenie priestor na vloženie vzoriek atď Genetickyacute analyzaacutetor predstavuje automatizovanyacute systeacutem umožňujuacuteci sekvenovanie určovanie dĺžky DNA fragmentov ndash fragmentačnuacute analyacutezu a kvantifikaacuteciu nukleovyacutech kyseliacuten V novšiacutech typoch genetickeacuteho analyzaacutetora je proces analyacutezy od vloženia vzoriek do stojana automatizovanyacute

Vzorka určenaacute na analyacutezu je elektrokineticky injektovanaacute do tenkej kapilaacutery naplnenej lineaacuternym polymeacuterom Vplyvom vysokeacuteho napaumltia sa negatiacutevne nabiteacute fragmenty DNA pohybujuacute v polymeacuteri k pozitiacutevne nabitej elektroacutede Kapilaacuterna elektroforeacuteza je tak citlivaacute že je schopnaacute detegovať jednobaacutezovyacute rozdiel DNA fragmentov DNA fragmenty musia byť pred kapilaacuternou elektroforeacutezou fluorescenčne označeneacute v kapilaacutere suacute separovaneacute na zaacuteklade veľkosti Kraacutetko pred dosiahnutiacutem kladne nabitej elektroacutedy docircjde po excitaacutecii laserovyacutem žiareniacutem k emisii žiarenia fluoroformi (farbičkami) tak že optickyacute detekčnyacute systeacutem zaznamenaacute fluorescenciu ktoraacute je naacutesledne softveacuterovo spracovanaacute a vyhodnotenaacute

Obr 23 Genetickyacute analyzaacutetor

42 RFLP

Metoacuteda polymorfizmu dĺžky restrik čnyacutech fragmentov (angl Restriction Fragment Length Polymorfism) bola prvou metoacutedou využiacutevanou na detekciu DNA variaacuteciiacute rocircznych biologickyacutech vzoriek Princiacutep metoacutedy spočiacuteva v priacutetomnosti polymorfizmov v DNA sekvencii rocircznych ľudiacute ktoreacute zapriacutečinia rozdielny profil (obrazec) DNA fragmentov po štiepeniacute jednou alebo viaceryacutemi restrikčnyacutemi endonukleaacutezami Restrikčneacute endonukleaacutezy (RE) suacute enzyacutemy ktoreacute štiepia DNA molekulu v oblasti špecifickej nukleotidovej sekvencie nazyacutevanej restrik čneacute miesto RE najčastejšie rozpoznaacutevajuacute a štiepia miesto veľkeacute 4-6 baacutez RE suacute priacutetomneacute u prokaryotov (bakteacuterie a archebakteacuterie) kde suacute suacutečasťou restrik čno-modifikačneacuteho systeacutemu akoby prokaryotickeacutej vrodenej imunity sluacutežia

26

na ochranu pred cudzou DNA (napr viacuterusovou) ktoruacute po rozpoznaniacute špecifickej sekvencie štiepia

Restrikčno-modifikačnyacute systeacutem maacute dve zložky 1) modifikačneacute enzyacutemy - metylaacutezy ktoreacute procesom metylaacutecie modifikujuacute určiteacute baacutezy svojej DNA čiacutem ich označia za vlastnuacute DNA takže takaacuteto DNA je potom rezistentnaacute voči štiepeniu restrikčnyacutemi endonukleaacutezami Najčastejšiacutem spocircsobom metylaacutecie u bakteacuteriiacute je metylaacutecia adeniacutenu na N6 pričom vznikne metyladeniacuten alebo cytoziacutenu na C5 metylcytoziacuten 2) restrikčneacute endonukleaacutezy štiepia špecifickeacute miesto dvojvlaacuteknovej DNA ktoreacute je tvoreneacute symetrickou sekvenciou zrkadlovo sa opakujuacutecich nukleotidov ndash tzv palindroacutem Restrikčneacute enzyacutemy sa použiacutevajuacute na štiepenie DNA sekvencie na mieste špecifickom pre tuacute ktoruacute restrikčnuacute endonukleaacutezu napr pri analyacuteze polymorfizmov dĺžky restrikčnyacutech fragmentov (RFLP) analyacuteze jednonukleotidovyacutech polymorfizmov (SNP) mutaacuteciiacute ako aj pri klonovaniacute DNA do vhodnyacutech vektorovyacutech DNA molekuacutel

Po štiepeniacute dvojvlaacuteknovej DNA restrikčnou endonukleaacutezou mocircžu vzniknuacuteť tri typy koncov - 5´-prečnievajuacutece konce (lepiveacute) 3´-prečnievajuacutece konce (lepiveacute) a tupeacute konce (obr 24)

Obr 24 Restrikčneacute štiepenie zanechaacutevajuacutece rocirczne konce tupeacute a lepiveacute

Restrikčneacute štiepenie je často použiacutevanou metoacutedou geacutenovyacutech manipulaacuteciiacute na konštrukciu

hybridnyacutech molekuacutel DNA s naacuteslednyacutem klonovaniacutem Priebeh RFLP analyacutezy je nasledovnyacute restrikčnaacute endonukleaacuteza sa pridaacute k DNA a zmes sa vo

vhodnyacutech reakčnyacutech podmienkach (pufor teplota) inkubuje niekoľko hodiacuten Počas inkubaacutecie docircjde k štiepeniu DNA na špecifickyacutech miestach DNA je potom elektroforeticky separovanaacute v geacuteli a naacutesledne vizualizovanaacute V minulosti po geacutelovej elektroforeacuteze nasledoval Southern blot (čiže prenos separovanyacutech fragmentov DNA z geacutelu na špeciaacutelnu membraacutenu) (obr 35) po ktorom nastala vizualizaacutecia raacutedioaktiacutevne značenou proacutebou V suacutečasnosti sa kvocircli praacutecnosti a zdravotnyacutem rizikaacutem od Southern blotu upuacutešťa a prechaacutedza sa na ryacutechlejšie menej praacutecne a zdravotne šetrnejšie metoacutedy priateľskejšie aj k životneacutemu prostrediu

RFLP bola prvou metoacutedou použiacutevanou na zistenie DNA profilu (DNA fingerprinting) mapovanie geacutenov zapriacutečiňujuacutece genetickeacute ochorenia a testovanie otcovstva Vaumlčšina RFLP markerov je vysoko lokusovo špecifickyacutech a kodominantnyacutech (obidve alely suacute detekovaneacute u heterozygota)

PCR-RFLP je laboratoacuterne priacutestupnejšia metoacuteda molekulaacuterno-genetickej diagnostiky keďže PCR umožňuje amplifikaacuteciu veľmi malyacutech množstiev DNA Alternatiacutevny naacutezov použiacutevanyacute v literatuacutere je CAPS z angl Cleaved Amplified Polymorphic Sequence assay Použitiacutem špecifickyacutech primerov docircjde PCR metoacutedou k amplifikaacutecii požadovaneacuteho uacuteseku DNA ten sa potom štiepi restrikčnou endonukleaacutezou vo vhodnyacutech podmienkach naacutesledne sa štiepne produkty elektroforeticky separujuacute a vizualizujuacute použitiacutem interkalačnyacutech farbiacutev a UV svetla (obr 25)

27

Obr 25 Princiacutep metoacutedy PCR-RFLP

43 VNTR a STR V geacutenome suacute priacutetomneacute dva typy tandemovyacutech (za sebou nasledujuacutecich) opakovaniacute

1) minisatelity ndash nazyacutevaneacute variabilnyacute počet tandemovyacutech opakovaniacute VNTR (variable number of tandem repeats) 2) mikrosatelity tiež kraacutetke tandemoveacute repetiacutecie STR (short tandem repeats)

Obidva tieto typy satelitnej DNA suacute rozmiestneneacute po celom genoacuteme suacute využiacutevaneacute hlavne vo forenznej genetike na identifikaacuteciu osocircb a určenie otcovstva popriacutepade materstva ale aj v mediciacutene na detekciu chromozoacutemovyacutech aneuploidiiacute Štruktuacutera obidvoch je podobnaacute Rozdiel medzi jednotlivyacutemi alelami je spocircsobenyacute rozdielnym počtom opakovaniacute opakujuacutecej sa sekvencie (motiacutevu) čo spocircsobiacute rocircznu dĺžku alel s rocircznym počtom tandemovyacutech opakovaniacute nazyacutevanuacute polymorfizmus dĺžky fragmentov

VNTR ndash variabilnyacute počet tandemovyacutech opakovaniacute pričom opakujuacuteca sa sekvencia maacute dĺžku od 6 do 100 baacutez pričom sa mocircže opakovať aj tisiacutece kraacutet alely tak mocircžu mať od 500do 30 000 baacutez VNTR boli v kombinaacutecii s RFLP (DNA fingerprinting ) prvyacutem polymorfizmom použiacutevanyacutem na zistenie DNA profilov a identifikaacuteciu osocircb v kriminalistickej praxi V suacutečasnosti jeho využitie v kriminalistike je kvocircli potrebe relatiacutevne veľkeacuteho množstva DNA nahradeneacute využitiacutem STR

STR - kraacutetke tandemoveacute repetiacutecie suacute v kriminalistike najčastejšie použiacutevanyacutem polymorfizmom STR lokusy suacute rozmiestneneacute po celom genoacuteme repetiacutecia obsahuje jednu až šesť baacutez pričom jej opakovaniacutem vznikne STR v rozsahu od 50 do 300bp V našom genoacuteme suacute tisiacutece STR ktoreacute mocircžu byť použiteacute pre forenznuacute analyacutezu V kriminalistike sa v suacutečasnosti na identifikaacuteciu osocircb použiacuteva 13 STR locusov ktoreacute patria k medzinaacuterodne uznaacutevanyacutem štandardom Z iniciatiacutevy FBI bola vytvorenaacute databaacuteza CODIS (Combined DNA Index System) každaacute krajina maacute svoju databaacutezu CODIS kde je možneacute vložiť a archivovať DNA profily jednotlivcov ako aj profily DNA ziacuteskanyacutech z miest kriminaacutelneho činu v databaacuteze je ich možneacute navzaacutejom porovnať a tak zistiť pocircvodcu trestneacuteho činu Medzinaacuterodnaacute jednotnosť v použiacutevaniacute CODIS STR lokusov umožňuje v priacutepade potreby vzaacutejomneacute porovnanie DNA profilov zistenyacutech na uacutezemiacute rocircznych štaacutetov CODIS STR lokusov je 13 a suacute to CSF1PO FGA TH01 TPOX VWA D3S1358 D5S818 D7S820 D8S1179 D13S317 D16S539 D18S51 a D21S11 Zistenie DNA profilu sa uskutočniacute multiplexnou PCR reakciou s fluorescenčne značenyacutemi primermi špecifickyacutemi pre konkreacutetny STR Naacutesledne suacute PCR produkty analyzovaneacute kapilaacuternou elektroforeacutezou genetickyacutem analyzaacutetorom ktoryacute rozliacuteši amplifikovaneacute fragmenty na zaacuteklade fluorescencie a dĺžky (fragmentačnaacute analyacuteza) (obr 26 Tab 3) DNA profil každeacuteho človeka je jedinečnyacute rovnakyacute profil mocircžu mať len jednovaječneacute dvojčataacute

28

Obr 26 Ukaacutežka DNA profilu človeka 15 STR lokusov s určeniacutem pohlavia pomocou lokusu pre amelogeniacuten (ženskeacute pohlavie - XX) maleacute oranžoveacute piacuteky predstavujuacute fragmenty veľkostneacuteho štandardu Tabuľka č 3 Zaacutepis DNA profilu človeka z obraacutezka č 26 15 STR lokusov s určeniacutem pohlavia pomocou lokusu pre amelogeniacuten System Alela 1 Alela 2

D3S1358 16 17

TH01 9 93 D21S11 28 28

D18S51 15 18

Penta E 7 14 D5S818 9 12

D13S317 8 11

D7S820 8 11 D16S539 11 12

CSF1PO 10 11

Penta D 11 12 vWA 15 18

D8S1179 13 16

TPOX 8 9 FGA 20 21

amel X X

29

5 MLPA

Multiplexnaacute amplifikaacutecia proacuteb zaacutevislaacute od ligaacutecie (z angl multiplex ligation-dependent probe amplification) je metoacuteda schopnaacute v jednej reakcii (v jednej skuacutemavke a vzorke) detegovať zmeny v počte až 50 nukleotidovyacutech sekvenciiacute Metoacutedou MLPA je možneacute ryacutechlo identifikovať amplifikaacutecie (duplikaacutecie) a deleacutecie veľkeacuteho počtu geacutenov či už použitiacutem DNA alebo mRNA krvnyacutech vzoriek alebo vzoriek z naacutedorov

Princiacutep MLPA spočiacuteva v multiplexnej amplifikaacutecii 50 špecifickyacutech nukleotidovyacutech sekvenciiacute použitiacutem jedneacuteho paacuteru primerov pričom jeden primer je fluorescenčne označenyacute Vyacutesledneacute PCR produkty suacute analyzovaneacute kapilaacuternou elektroforeacutezou (fragmentačnaacute analyacuteza) Dĺžka každeacuteho namnoženeacuteho produktu je jedinečnaacute narastaacute postupne o 6 alebo 9 nukleotidov pričom produkty PCR suacute 120 ndash 500 nukleotidov dlheacute Tento veľkostnyacute rozsah PCR fragmentov (dĺžka 120-500 nukleotidov s naacuterastom postupne o 6 alebo 9 nukleotidov) je optimaacutelny pre kapilaacuternu elektroforeacutezu MLPA multiplexnaacute PCR prebieha za použitia iba jedineacuteho paacuteru primerov ktoreacute amplifikujuacute špecifickeacute sekvencie Trik spočiacuteva v tom že nedochaacutedza k amplifikaacutecii DNA sekvencie ale MLPA proacuteb ktoreacute suacute pridaneacute k vzorkaacutem Každaacute MLPA proacuteba pozostaacuteva z dvoch oligonukleotidov (dve hemiproacuteby) pričom každyacute oligonukleotid obsahuje jednu zo sekvencie rozpoznaacutevanuacute PCR primermi Proacuteba vznikne jedine za predpokladu hybridizaacutecie dvoch oligonukleotidov (hemiproacuteb) k cieľovej sekvencii (geacutenu) a po ligaacutecii enzyacutemom ligaacutezou Iba ligovaneacute proacuteby suacute exponenciaacutelne amplifikovaneacute pomocou jedneacuteho paacuteru primerov Množstvo zligovanyacutech proacuteb teda zaacutevisiacute od množstva cieľovyacutech sekvenciiacute (geacutenov) vo vzorke

Postup MLPA analyacutezy je nasledovnyacute (obr27) K vzorke nukleovej kyseliny (DNA resp mRNA) sa pridaacute zmes 50 jedinečnyacutech proacuteb každaacute

proacuteba je komplementaacuterna k určitej cieľovej sekvencii NK vzorky Každaacute proacuteba však pozostaacuteva z dvoch oligonukleotidov hybridizujuacutecich vedľa seba zaacuteroveň každyacute oligonukleotid (hemiproacuteba) obsahuje pridanuacute sekvenciu rozpoznaacutevanuacute paacuterom PCR primerov Po hybridizaacuteciiacute oligonukleotidov (hemiproacuteb) dochaacutedza k ich ligaacutecii ligaacutezou Ligačnaacute reakcia je tak špecifickaacute že je schopnaacute rozliacutešiť sekvenciu liacutešiacu sa v jednom nukleotide Vyacuteslednyacute ligačnyacute produkt (proacuteba) obsahuje obidve sekvencie pre PCR primery na jednom fragmente čiže mocircže docircjsť k namnoženiu takeacutehoto fragmentu PCR reakciou V priacutepade ak nedocircjde k ligaacutecii priacuteslušnyacutech hemiproacuteb pretože hemiproacuteby nenaacutejdu cieľovuacute sekvenciu na DNA každaacute takaacuteto nezligovanaacute hemiproacuteba maacute len jednu sekvenciu rozpoznaacutevanuacute len jednyacutem PCR primerom v docircsledku čoho nemocircže prebehnuacuteť jej PCR amplifikaacutecia a počas fragmentačnej analyacutezy nie je detegovanaacute pretože negeneruje fluorescenčnyacute signaacutel

Pri MLPA analyacuteze je docircležiteacute okrem MLPA amplifikaacutecie vzorky urobiť aj MLPA amplifikaacuteciu referenčnej vzorky ku ktorej sa bude porovnaacutevať počet geacutenov (cieľovyacutech sekvenciiacute) Po kapilaacuternej elektroforeacuteze MLPA referenčnej a skuacutemanej vzorky porovnaniacutem obsahu nameranyacutech hodnocirct tzv piacutekov priacuteslušnyacutech proacuteb sa určiacute relatiacutevny počet koacutepiiacute v skuacutemanej vzorke

MLPA

1 DNA denaturaacutecia a hybridizaacutecia s MLPA proacutebami (hemiproacuteby)

2 Ligaacutecia (vytvorenie kompletnyacutech proacuteb)

3 PCR amplifikaacutecia proacuteb paacuterom primerov

4 Kapilaacuterna elektroforetickaacute separaacutecia PCR produktov

5 Analyacuteza daacutet

30

Obr 27 Princiacutep MLPA

Firma MRC-Holland v suacutečasnosti ponuacuteka stovky MLPA setov proacuteb ktoreacute suacute vhodneacute na 1) diagnostiku kongenitaacutelnych a dedičnyacutech ochoreniacute 2) zisťovanie profilu naacutedorov 3) zisťovanie metylačneacuteho profilu

MLPA je metoacuteda vhodnaacute na detekciu malyacutech prestavieb (BRCA1 BRCA2 MSH2 atď)

veľkyacutech chromozoacutemovyacutech prestavieb (Williamsov syndroacutem Prader-WilliAngelman syndroacutem atzď)

31

detekciu zmien v počte koacutepii geacutenov (obr 28 29) ako aj zistenie počtu kompletnyacutech chromozoacutemov (chromozoacutem 13 18 21 XY tiež aj z amniovej tekutiny) diagnostiku naacutedorov (zmeny počtu pri ALL CLL atď) kvantifikaacuteciu metylaacutecie (Prader-WilliAngelmanov syndroacutem Fragilnyacute X inaktivaacutecia naacutedorovyacutech supresorovyacutech geacutenov atď) mRNA analyacutezu geacutenov zuacutečastňujuacutecich sa apoptoacutezy alebo zaacutepalov

MS-MLPA (Methylation-Specific MLPA) je varianta MLPA určenaacute špeciaacutelne na analyacutezu aberantnyacutech metylaacutecii imprintovanyacutech oblastiacute ako aj detekciu metylačnyacutech zmien CpG ostrovčekov lokalizovanyacutech bliacutezko promoacutetora Rozdiel oproti štandardnej MLPA spočiacuteva v použitiacute metylačne senzitiacutevneho restrikčneacuteho enzyacutemu HhaI ktoryacute štiepi MS-MLPA proacuteby hybridizovaneacute k nemetylovanej sekvencii Každaacute DNA vzorka určenaacute pre MS-MLPA analyacutezu prejde dvoma reakciami v jednej mikroskuacutemavke štandardnou MLPA analyacutezou (bez štiepenia metylačne senzitiacutevnym enzyacutemom) a v druhej mikroskuacutemavke docircjde okrem ligaacutecie proacuteb aj k metylačne senzitiacutevnemu štiepeniu hybridizovanyacutech proacuteb s nemetylovanou DNA Amplifikujuacute sa len ligovaneacute proacuteby po PCR amplifikaacutecii sa fragmentačnou analyacutezou porovnaniacutem oboch reakciiacute zistia rozdiely v metylačnom profile vzorky k referenčnej vzorke

RT-MLPA (Reverse Transkriptase MLPA) je variaacutecia MLPA určenaacute pre zistenie mRNA profilu vzorky je alternatiacutevou k real-time PCR a mikročipom RT-MLPA nedeteguje mRNA množstvo priamo pretože použiacutevanaacute ligaacuteza nie je schopnaacute ligovať DNA oligonukleotidy keď suacute hybridizovaneacute s RNA Preto RT-MLPA začiacutena reverznou transkripciou so špeciaacutelne navrhnutyacutemi RT primermi tak aby vytvorili kraacutetke oligonukleotidy (cDNA) Potom reakcia pokračuje ako štandardnaacute MLPA

Obr 28 MLPA analyacuteza geacutenu DMD (koacutedujuacuteceho dystrofiacuten) mutaacutecie ktoreacuteho spocircsobujuacute Duchennovu svalovuacute dystrofiu u pacienta je priacutetomnaacute deleacutecia exoacutenu 45 v porovnaniacute s referenčnou vzorkou ndash kontrolou

32

Obr 29 MLPA analyacuteza geacutenu DMD (koacutedujuacuteceho dystrofiacuten) mutaacutecie ktoreacuteho spocircsobujuacute Duchennovu svalovuacute dystrofiu u pacienta suacute priacutetomneacute duplikaacutecie exoacutenov 41 42 43 44 45 (piacuteky vo vzorke pacienta sa porovnajuacute s piacutekmi v kontrole ndash referenčnej vzorke)

33

6 Sekvenovanie

Sekvenovaniacutem rozumieme určenie primaacuternej štruktuacutery DNA teda určenie poradia nukleotidov v reťazci DNA Začiatky moderneacuteho sekvenovania siahajuacute do roku 1977 kedy boli objaveneacute dve metoacutedy sekvenovania 1) chemickaacute metoacuteda Maxama a Gilberta 2) enzymatickaacute metoacuteda Sangera Nicklena a Coulsona

Princiacutep obidvoch metoacuted sekvenovania spočiacuteva v tom že sa vytvoriacute suacutebor DNA molekuacutel s rocircznou veľkosťou ktoreacute suacute zakončeneacute konkreacutetnym nukleotidom tieto DNA molekuly sa elektroforeticky separujuacute v geacuteloch s rozlišovacou schopnosťou 1 nukleotid 61 Chemickaacute metoacuteda

DNA molekuly sa na 5-konci raacutedioaktiacutevne označia raacutedioaktiacutevnym fosforom a naacutesledne sa chemicky modifikujuacute špecificky pre každuacute baacutezu DNA sa potom v modifikovanyacutech miestach štiepi čiacutem vzniknuacute rocirczne dlheacute fragmenty pričom podmienky suacute nastaveneacute tak aby sa DNA na každom mieste štiepila len raz Modifikaacutecia DNA a štiepenie prebehne v štyroch separaacutetnych reakciaacutech (skuacutemavkaacutech) takže po elektroforetickej separaacuteciiacute takto opracovanej DNA v štyroch draacutehach polyakrylamidoveacuteho geacutelu a naacuteslednej autoraacutediografii (podobne ako pri Southernovej hybridizaacutecii) je možneacute odčiacutetať nukleotidovuacute sekvenciu približne 100 nukleotidov od raacutedioaktiacutevneho označenia (v čase objavu Maxama a Gilberta) 62 Sangerova metoacuteda

Zaacuteklady metoacutedy boli popiacutesaneacute už v roku 1975 (metoacuteda plus a miacutenus) ale až vylepšenie použitiacutem dideoxynukleotidov (ddNTP) v roku 1977 došlo k zjednodušeniu sekvenovania Princiacutepom enzyacutemoveacuteho sekvenovania je terminaacutecia (zastavenie) polymerizaacutecie inkorporaacuteciou 2´ 3 -dideoxynukleotidov do novosyntetizujuacuteceho sa vlaacutekna DNA Keďže ddNTP neobsahujuacute hydroxylovuacute skupinu na 3 uhliacuteku riboacutezy nemocircžu sa zuacutečastniť na tvorbe fosfodiesterovej vaumlzby nemocircže sa pripojiť k nim ďalšiacute nukleotid čiže musiacute docircjsť k terminaacuteciiacute polymeraacutecie Reakcia prebieha v štyroch skuacutemavkaacutech s raacutedioaktiacutevne značenyacutem primerom V každej skuacutemavke suacute priacutetomneacute všetky štyri deoxynukleotidtrifosfaacutety (dNTP) ale pre každuacute skuacutemavku je špecifickyacute priacutedavok maleacuteho množstva jedneacuteho z dideoxynukleotidtrifosfaacutetov (v prvej skuacutemavke je ddATP v druhej ddCTP v tretej ddTTP a vo štvrtej ddGTP) Maleacute množstvo ddNTP spocircsobiacute že pri polymerizaacutecii dochaacutedza k prednostneacutemu zaradeniu štandardnyacutech dNTP do narastajuacuteceho reťazca a len občas sa inkorporuje ddNTP čiacutem sa zastaviacute synteacuteza reťazca V každej skuacutemavke tak vznikne suacutebor DNA fragmentov rocircznych veľkostiacute zakončenyacutech priacuteslušnyacutem ddNTP (v prvej skuacutemavke ddATP v druhej ddCTP v tretej ddTTP a vo štvrtej ddGTP) Po elektroforetickej separaacutecii v 4 draacutehach polyakrylamidoveacuteho geacutelu a autoraacutediografii sa z autoraacutediogramu odčiacuteta sekvencia

V suacutečasnosti je sekvenovanie do značnej miery automatizovaneacute pričom využiacuteva princiacutep Sangerovej enzyacutemovej metoacutedy s určityacutemi obmenami Uacutesek DNA ktoryacute treba sekvenovať sa prostredniacutectvom termostabilnyacutech DNA polymeraacutez namnožiacute PCR metoacutedou po ktorej nasleduje sekvenačnaacute reakcia (asymetrickaacute PCR) s fluorescenčne značenyacutemi ddNTP (každyacute druh označenyacute inyacutem fluorescenčnyacutem farbivom) Sekvenačnaacute reakcia prebieha v jednej skuacutemavke s jednyacutem primerom vznikne tak suacutebor jednovlaacuteknovyacutech DNA rocircznej dĺžky ktoreacute suacute na 3konci označeneacute ddNTP so špecifickyacutem fluorescenčnyacutem farbivom Taacuteto metoacuteda sekvenovania sa tiež nazyacuteva rdquodye-terminator cycle sequencingrdquo(obr 30) Po kapilaacuternej elektroforeacuteze vzorky v genetickom analyzaacutetore zaznamenaacutevaniacute fluorescencie jednotlivyacutech fragmentov CCD kamerou a softveacuterovom spracovaniacute sa ziacuteska sekvencia DNA (obr 31)

34

Obr 30 Princiacutep sekvenovania Sangerova dideoxy metoacuteda alebo tzv chain termination method (reťazec zastavujuacuteca metoacuteda) Obr 31 Určenie genotypu plodu a rodičov sekvenčnou analyacutezou DNA ziacuteskanej z plodovej vody (prenataacutelna diagnostika) a perifeacuternej krvi sekvenčnaacute analyacuteza geacutenu ASPA vyacutesledok u plodu priacutetomnaacute mutaacutecia c 914CgtA v homozygotnom stave (AA) rodičia heterozygoti (AC) Uvedenaacute mutaacutecia je v homozygotnom stave kauzaacutelnou priacutečinou Canavanovej choroby

Automatizovaneacute sekvenovanie prinaacuteša viacereacute vyacutehody oproti klasickej Sangerovej metoacutede vyššiu presnosť a ryacutechlosť v jednej sekvenačnej reakcii možnosť osekvenovať až 1200 nukleotidovyacute fragment maleacute množstvo templaacutetu potrebneacute na analyacutezu

35

63 Next Generation Sequencing (NGS)

NGS (sekvenovanie novej generaacutecie) maacute obrovskyacute potenciaacutel v analyacuteze genoacutemov pričom toto označenie zahŕňa viacereacute technologickeacute metoacutedy reprezentovaneacute niekoľkyacutemi firmami Princiacutepom je masiacutevne paralelneacute sekvenovanie čiacutem sa ziacuteskajuacute raacutedovo tisiacutece až milioacuteny sekvenciiacute naraz 631 Sekvenovanie druhej generaacutecie

Na začiatku sa analyzovanaacute DNA vo vaumlčšine priacutepadov fragmentuje (vznikne tak DNA

knižnica) na fragmenty sa pripoja kraacutetke sekvencie ndash adapteacutery naacutesledne sa tieto fragmenty rocircznymi priacutestupmi amplifikujuacute a určiacute sa ich sekvencia Vďaka čiastočnyacutem prekryvom je zo ziacuteskanyacutech sekvencii možneacute poskladať plynuluacute sekvenciu zodpovedajuacutecu pocircvodnej nefragmentovanej DNA

Pyrosekvenovanie je podobne ako Sangerova metoacuteda založenaacute na princiacutepe synteacutezy komplementaacuterneho vlaacutekna DNA avšak rozdiel je v tom že sa na detekciu inkorporaacutecie nukleotidu využiacuteva inyacute systeacutem tvorby luminiscenčneacuteho signaacutelu v priebehu reakcie Pyrosekvenovanie je umožneneacute vďaka aktivite 4 enzyacutemov - DNA polymeraacutezy ATP sulfurylaacutezy luciferaacutezy a apyraacutezy Reakčnaacute zmes obsahuje aj ďalšie komponenty - enzymatickeacute substraacutety adenoziacutenfosfosulfaacutet (APS) d-luciferiacuten sekvenovanyacute templaacutet a cyklicky postupne po jednom type pridaacutevaneacute nukleotidtrifosfaacutety Po zabudovaniacute nukleotidu do novovznikajuacuteceho reťazca docircjde k uvoľneniu pyrofosfaacutetu naacutesledne je využityacute ATP sulfurylaacutezou na synteacutezu ATP z APS počas ďalšej reakcie docircjde k využitiu ATP luciferaacutezou na premenu luciferiacutenu na oxyluciferiacuten čo spocircsobiacute svetelnyacute signaacutel a ten zaznamenaacute detekčnyacute systeacutem Poslednou enzymatickou reakciou je reakcia apyraacutezy ktoraacute odstraacuteni nezainkorporovaneacute nukleotidy a nevyužiteacute ATP aby sa celyacute proces mohol zopakovať s reakčnou zmesou obsahujuacutecou ďalšiacute nukleotidtrifosfaacutet (inyacute ako v predchaacutedzajuacutecej reakcii) Po každej reakcii detektor zaznamenaacuteva emisiu svetla na zaacuteklade intenzity svetla je možneacute určiť či bol vradenyacute priacuteslušnyacute nukleotidtrifosfaacutet či bol inkorporovanyacute jeden priacutepadne viac rovnakyacutech nukleotidtrifosfaacutetov

Zvyacutešenie vyacutekonu pyrosekvenovania umožnila tzv emulznaacute PCR v mikročasticiach a použitie platničky PicoTiterPlatereg toto sekvenovanie zaviedla firma Roche pod pojmom 454 pyrosekvenovanie v roku 2005 Na začiatku sa DNA fragmentuje na uacuteseky dlheacute 400-600 baacutez dvojvlaacuteknovaacute fragmentovanaacute DNA sa liguje s adapteacutermi prostredniacutectvom nich sa naviaže na mikročastice dvojvlaacuteknoveacute fragmenty sa oddelia mikročastice s naviazanyacutemi jednovlaacuteknovyacutemi fragmentami sa premiešajuacute so zmesou oleja a roztoku ktoryacute obsahuje všetky komponenty na uacutespešnuacute PCR Tyacutemto spocircsobom sa okolo každej mikročastice vytvoriacute vlastnyacute mikroreaktor v ktorom prebehne amplifikaacutecia fragmentu Po PCR reakcii sa mikročastice prenesuacute do platničky PicoTiterPlate v ktorej sa do jamky zmestiacute akuraacutet jedna mikročastica a reakčneacute komponenty pyrosekvenačnej reakcie PicoTiterPlatereg maacute 1 600 000 jamiek každaacute jamka maacute maximaacutelny objem 75 picolitra Platnička s mikročasticami sa vložiacute do sekvenačneacuteho systeacutemu ndash priacutestroja v ktorom sa celeacute pyrosekvenovanie uskutočniacute Chemiluminiscenčneacute signaacutely ktoryacutech počas sekvenovania vznikajuacute milioacuteny v priebehu hodiny suacute zachyteneacute CCD kamerou a analyzovaneacute softveacuterom

Firma Illumina predstavila inuacute technoloacutegiu PCR amplifikaacutecia a sekvenovanie sa uskutočňuje na skliacutečku (flow cell) Fragmentaacutecia DNA a pripojenie adapteacuterov prebieha za uacutečasti transpozoacutemov v procese nazvanom tagmentaacutecia Po hybridizaacutecii fragmentov DNA na skliacutečko prebehne v klastroch PCR amplifikaacutecia (tzv mostiacutekovaacute amplifikaacutecia) sekvenaacutecia prebieha za uacutečasti rozdielne fluorescenčne značenyacutech a chemicky modifikovanyacutech nukleotidov pričom každyacute nukleotid emituje fluorescenciu s inou vlnovou dĺžkou Na skliacutečku prebieha paralelne až 6 miliaacuterd sekvenaacutecii (obr 32)

Ďalšiacutemi možnosťami sekvenovania druhej generaacutecie je systeacutem SOLid (vyvinutyacute firmou Applied Biosystem dnes pod Thermo Fisher Scientific) a Ion Semiconductor Sequencing ndash polovodičoveacute ioacutenoveacute sekvenovanie (od firmy Ion Semiconductor Sequencing v suacutečasnosti Thermo Fisher Scientific)

36

Obr 32 Princiacutep sekvenovania novej generaacutecie od firmy Illumina PCR amplifikaacutecia a sekvenovanie sa uskutočňuje na skliacutečku (flow cell) paralelne prebieha až 6 miliaacuterd sekvenaacutecii

632 Sekvenovanie tretej generaacutecie

Pred sekvenovaniacutem netreba amplifikovať DNA PCR metoacutedou ale sekvencia sa ziacuteskava zachyteniacutem signaacutelu v reaacutelnom čase Medzi sekvenovanie tretej generaacutecie patriacute SMRT (Single Molecule Real-Time Sequencing) a Nanopore Sequencing

37

7 Fragmentačnaacute analyacuteza DNA

Je metoacuteda použiacutevanaacute na určenie veľkosti fragmentov DNA ziacuteskanyacutech PCR reakciou Dĺžka amplifikovanyacutech DNA fragmentov sa zistiacute ich porovnaniacutem s veľkostnyacutem štandardom (obr 33) ktoryacute je tvorenyacute DNA fragmentami znaacutemej dĺžky Veľkostnyacute štandard je pred kapilaacuternou elektroforeacutezou zmiešanyacute so vzorkou DNA fragmenty veľkostneacuteho štandardu suacute fluorescenčne označeneacute pričom použiteacute fluorescenčneacute farbivo je ineacute ako fluorescenčneacute farbivo použiteacute na označenie DNA fragmentov vo vyšetrovanej vzorke

Obr 33 Elektroforetogram veľkostneacuteho štandardu použiacutevaneacuteho na určenie veľkostiacute fragmentov analyzovanyacutech kapilaacuternou elektroforeacutezou v genetickom analyzaacutetore (GeneScantrade 500 LIZtrade dye Size Standard) dĺžka fragmentov v nukleotidoch (napr 50 nukleotidov)

Fragmentačnaacute analyacuteza pozostaacuteva z viaceryacutech krokov Prvyacutem je izolaacutecia DNA nasleduje PCR amplifikaacutecia počas ktorej sa novosyntetizovaneacute DNA fragmenty označia fluorescenčnyacutemi farbivami Vzorka s PCR produktom sa pripraviacute na kapilaacuternu elektroforeacutezu tak že sa zmieša s veľkostnyacutem štandardom (sluacuteži na určenie veľkosti fragmentov) a denaturačnou laacutetkou (formamid) nasleduje denaturaacutecia Pripraveneacute vzorky suacute injektovaneacute do priacutestroja (genetickyacute analyzaacutetor) kde v kapilaacutere naplnenej polymeacuterom v elektrickom poli migrujuacute fluorescenčne značeneacute fragmenty DNA na zaacuteklade veľkosti (kapilaacuterna elektroforeacuteza) Počas elektroforeacutezy genetickyacute analyzaacutetor zaznamenaacuteva fluorescenciu fragmentov Analyacutezou daacutet prostredniacutectvom špeciaacutelnych softveacuterov sa ziacuteskajuacute elektroforetogramy z ktoryacutech je možneacute zistiť veľkosť fragmentov ako aj typ fluorescencie (docircležiteacute ak suacute genetickeacute varianty rozliacutešiteľneacute rocircznou fluorescenciou napr SNaPshot) Fragmentačnaacute analyacuteza je suacutečasťou množstva molekulaacuterno-genetickyacutech metoacuted (pozri obr 12 26 28 29 34) ako suacute napr STR analyacuteza (Short Tandem Repeat) AFLP analyacuteza (Amplified Fragment Lenght Polymorfism) RFLPT-RFLP analyacuteza (Restriction Fragment Lenght PolymorfismTerminal Restricted Fragment Lenght Polymorfism) SSCP (Single Strand Conformation Polymorfism) VNTR (Variable Number of Tandem Repeat) analyacuteza straty heterozygotnosti (LOH loss of heterozygozity) MLPA (Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification) MSMSA (Methylation-Sensitive Mobility Shift Assay) SNP genotypovanie (SNaPshotreg) HiCEP (High-Coverage Expression Profiling)

38

Obr 34 Kvantitatiacutevna fragmentačnaacute PCR analyacuteza (QF-PCR) DNA izolovanej z plodovej vody vyacutesledok prenataacutelnej analyacutezy = priacutetomnosť troch piacutekov pre chromozoacutem 18 (u všetkyacutech fragmentov detegujuacutecich chromozoacutem 18 je pomer vyšetrovanyacutech markerov aberantnyacute 21 resp 111) čo znamenaacute trizoacutemiu chromozoacutemu 18 Edwardsov syndroacutem

39

8 Metoacutedy založeneacute na princiacutepe hybridizaacutecie

Nukleoveacute kyseliny majuacute schopnosť vytvaacuterať dvojvlaacuteknoveacute reťazce z jednovlaacuteknovyacutech molekuacutel na zaacuteklade komplementarity baacutez Komplementarita baacutez umožňuje replikaacuteciu DNA transkripciu RNA komplementarita baacutez zabezpečuje teda reprodukovateľnosť živej hmoty

Hybridizaacutecia je proces v ktorom na zaacuteklade komplementarity baacutez dochaacutedza k vytvoreniu dvojvlaacuteknovej nukleovej kyseliny z dvoch jednovlaacuteknovyacutech molekuacutel DNA alebo RNA alebo ich kombinaacuteciou DNA RNA pričom kratšia jednovlaacuteknovaacute nukleovaacute kyselina vystupuje ako sonda (proacuteba) Hybridizaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten je jeden z najpoužiacutevanejšiacutech naacutestrojov v molekulaacuternej bioloacutegii a genetike (hybridizaacutecia primerov alebo proacuteb sa využiacuteva v takmer každej metoacutede - v PCR RT-PCR qPCR RT-qPCR MLPA sekvenovaniacute fragmentačnej analyacuteze FISH DNA mikročipoch atď)

Denaturaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten je proces pri ktorom dochaacutedza k porušeniu vodiacutekovyacutech vaumlzieb medzi vlaacuteknami nukleovyacutech kyseliacuten (strata sekundaacuternej a terciaacutelnej štruktuacutery) tak že docircjde k ich uacuteplneacutemu oddeleniu vzniknuacute jednovlaacuteknoveacute reťazce Denaturaacutecia NK mocircže byť spocircsobenaacute vplyvom vysokyacutech teplocirct pH alebo chemickyacutech laacutetok (denaturačneacute činidlaacute) Renaturaacutecia je opačnyacute proces v ktorom na zaacuteklade komplementarity dochaacutedza k tvorbe dvojvlaacuteknovyacutech NK

Hybridiza čnaacute sonda (proacuteba) je jednovlaacuteknovaacute nukleovaacute kyselina určitej znaacutemej dĺžky a sekvencie (najčastejšie DNA pretože je stabilnejšia ako RNA) ktoraacute je značenaacute a sluacuteži na detekciu komplementaacuternych molekuacutel DNA alebo RNA v procese hybridizaacutecie V zaacutevislosti od podmienok hybridizaacutecie (stringencia) mocircže byť detegovanaacute sekvencia uacuteplne komplementaacuterna alebo v menej priacutesnych podmienkach mocircže mať sekvenčneacute odchyacutelky Proacuteba sluacuteži na vyhľadanie a zviditeľnenie cieľovyacutech NK Zviditeľnenie sa deje prostredniacutectvom označenia proacuteby ešte pred hybridizaacuteciou Značenie proacuteby mocircže byť raacutedioaktiacutevne a neraacutedioaktiacutevne (najčastejšie fluorescenčneacute)

Raacutedioaktiacutevne značeneacute proacuteby pomocou izotopov (32P) sa využiacutevali viac v minulosti v suacutečasnosti suacute kvocircli zdravotnyacutem rizikaacutem ohľaduplnosti k životneacutemu prostrediu ako aj kvocircli jednoduchšej manipulaacutecii použiacutevaneacute fluorescenčne značeneacute proacuteby Raacutedioaktiacutevne značeneacute sondy boli použiacutevaneacute hlavne metoacutedou Southernovej hybridizaacutecie (Southern blotting Southern blot) Citlivosť raacutedioaktiacutevne značenyacutech proacuteb je vyššia dosahuje schopnosť zachytiť 10 fg (femtogram 10-15) cieľovej DNA sekvencie 81 Southern blot

Metoacutedu objavil v roku 1975 britskyacute bioloacuteg Edwin Southern (preto Southern) Pri Southernovej hybridizaacutecii sa restrikčne štiepeneacute fragmenty DNA elektroforeticky separujuacute v geacuteli potom sa metoacutedou blottingu prenesuacute na nylonovuacute alebo nitroceluloacutezovuacute membraacutenu kde suacute naacutesledne hybridizovaneacute v roztoku obsahujuacutecom raacutedioaktiacutevne značenuacute sondu Priloženiacutem fotografickeacuteho filmu k membraacutene a vyvolaniacutem filmu autoraacutediografiou docircjde k zviditeľneniu lokaliacutet kde došlo k hybridizaacuteciiacute raacutedioaktiacutevne značenej sondy s fragmentom DNA (autoraacutediogram) Southern blot bol kľuacutečovou a prvou metoacutedou na identifikaacuteciu osocircb (DNA fingerprinting DNA pofiling) (obr 35)

Okrem Southern blotu existuje Northern blot na analyacutezu RNA (geacutenovej expresie) a Western blot na analyacutezu proteiacutenov postup je obdobnyacute ako pri Southern blote s obmenami špecifickyacutemi pre konkreacutetny blot Pri Northern blote sa použiacutevajuacute hybridizačneacute proacuteby ale pre vizualizaacuteciu proteiacutenov western blotom je potrebneacute použiť protilaacutetky s naacuteslednou vizualizaacuteciou Pomenovanie techniacutek je hra so sloviacutečkami (keďže paacuten Northern ani Western neobjavili takto nazvaneacute techniky)

Neraacutedioaktiacutevne značenie proacuteb použiacutevanyacutech v molekulaacuternej genetike mocircže byť nepriame (použitie haptenu) alebo priame Konečnaacute vizualizaacutecia je najčastejšie zabezpečenaacute fluoreskujuacutecimi farebnyacutemi značkami farbivami fluorochroacutemami (fluorofoacuterami) Pri priamom značeniacute je farbička kovalentne naviazanaacute na nukleotid a na zachytenie fluorescencie suacute potrebneacute špeciaacutelne priacutestroje umožňujuacutece excitaacuteciu farbičky ktoraacute potom emituje žiarenie určitej vlnovej dĺžky (emisneacute žiarenie) a to zachytiacute detekčnyacute systeacutem priacutestroja Využitie fluorochroacutemov v molekulaacuternej genetike je masiacutevne napr na vizualizaacuteciu NK elektroforeticky separovanyacutech v geacuteli kvantifikaacuteciu produktov PCR reakcie v priacutestroji real-time PCR cykleacuter sekvenovaniacute fragmentačnej analyacuteze FISH DNA mikročipoch atď

40

Obr 35 Princiacutep Southern blotu

82 FISH (fluorescenčnaacute in situ hybridizaacutecia)

FISH (fluorescent in situ hybridization fluorescenčnaacute in situ hybridizaacutecia) metoacuteda patriacute medzi molekulovo-cytogenetickeacute techniky Princiacutep FISH metoacutedy je založenyacute na hybridizaacuteciiacute fluorescenčne značenyacutech proacuteb ku komplementaacuternym uacutesekom vyšetrovanej DNA na podložnom skle (priamo na mieste - in situ) K denaturaacutecii dsDNA dochaacutedza buď vplyvom denaturačnyacutech činidiel alebo zvyacutešenou teplotou a naacuteslednou renaturaacuteciou dochaacutedza k naviazaniu sondy na komplementaacuterny uacutesek DNA Vyacutesledok hybridizaacutecie sa vizualizuje fluorescenčnyacutem mikroskopom vybavenyacutem vhodnyacutemi fluorescenčnyacutemi filtrami a vizuaacutelne zhodnotiacute skuacutesenyacutem odborniacutekom Fluorescencia sa v niektoryacutech priacutepadoch mocircže zaznamenať a hodnotiť aj pomocou softveacuteru (obr 36)

Pomocou FISH detegujeme numerickeacute aberaacutecie - zmeny v počte chromozoacutemov (napr trizoacutemia monozoacutemia chromozoacutemov) alebo štruktuacuterne aberaacutecie a prestavby (napr translokaacutecie inverzie deleacutecie duplikaacutecie amplifikaacutecie) FISH metoacuteda umožňuje identifikaacuteciu a detekciu každeacuteho ľudskeacuteho chromozoacutemu jeho zaradenie do karyotypu odhalenie malyacutech submikroskopickyacutech chromozoacutemovyacutech zmien a tiež mapovať poziacutecie jednotlivyacutech geacutenov na chromozoacuteme

41

Obr 36 Princiacutep štandardnej FISH a FISH maľovania celeacuteho chromozoacutemu

Veľkou vyacutehodou FISH metoacutedy je možnosť analyacutezy buniek v metafaacuteze aj v interfaacuteze kedy nie je nutnaacute kultivaacutecia buniek a tiež ryacutechle analyzovanie veľkeacuteho počtu buniek (stovky až tisiacutece) K ďalšiacutem vyacutehodaacutem patriacute bezpečnosť vysokaacute citlivosť dostatočnaacute stabilita relatiacutevne kraacutetky čas hybridizaacutecie a možnosť ryacutechleho vyhodnotenia Hybridizaacutecia pri vaumlčšine suacutečasne dodaacutevanyacutech sond trvaacute 10-12 hodin (na trhu suacute už dostupneacute aj sondy so skraacutetenyacutem časom hybridizaacutecie na 2-3 hodiny) Po hybridizaacuteciiacute nasleduje odmyacutevanie kedy pri priacuteslušnej teplote dochaacutedza k odmytiu nenaviazanyacutech a nespraacutevne hybridizovanyacutech sond Preparaacutet sa naacutesledne podfarbiacute a vyacutesledok sa zhodnotiacute vo fluorescenčnom mikroskope Na podfarbenie chromozoacutemov alebo jadier sa použiacuteva modreacute kontrastneacute farbivo DAPI (46-diamidino-2-fenylindol) ktoreacute maacute silneacute fluorescenčneacute vlastnosti dokaacuteže prechaacutedzať jadrovou membraacutenou a viazať sa na DNA Vyacutesledkom je modreacute zafarbenie ktoreacute vyacuteborne kontrastuje so signaacutelmi jednotlivyacutech sond

Limitujuacutecim faktorom FISH je možnosť identifikaacutecie len tyacutech uacutesekov DNA ku ktoryacutem suacute použiteacute sondy V jednej analyacuteze je možneacute použiť najviac 3 odlišne značeneacute sondy a tak zistiť priacutepadneacute abnormality len na 1 alebo na paacuter lokusoch Na relevantnuacute detekciu je potrebneacute mať vo vzorke 1-5 aberantnyacutech interfaacutezovyacutech jadier

FISH je možneacute uskutočniť na širokej škaacutele biologickeacuteho materiaacutelu na vzorkaacutech perifeacuternej krvi kostnej drene naacuteteroch choriovyacutech klkoch plodovej vode rocircznych druhov tkaniacutev natiacutevnych alebo zaliatych v parafiacutene na 1 bunke (predimplantačnaacute genetickaacute diagnostika PGD) (obr 37)

Využiacuteva sa na detekciu aberaacuteciiacute pri mnohyacutech onkologickyacutech ochoreniach (napr pri diagnoacuteze mnohopočetnyacute myeloacutem sa v suacutečasnosti po separaacutecii CD138+ buniek robiacute FISH s 5 sondami pre geacuteny IGH TP53 RB1 oblasť 1p321q21 a stanovuje sa hyperploidia chromozoacutemov 5 9 a 15) a tiež k spresneniu doplneniu a k overeniu bežneacuteho cytogenetickeacuteho vyšetrenia

Podľa miesta na chromozoacuteme na ktorom dochaacutedza k hybridizaacutecii sondy rozlišujeme 4 typy

DNA sond bull centromeacuteroveacute sondy ndash sa viažu na strednuacute časť chromozoacutemu ndash centromeacuteru sluacutežia k diagnostike zmien v počte chromozoacutemov k detekcii chromozoacutemov neznaacutemeho pocircvodu umožňujuacute interfaacuteznu FISH na nedeliacich sa bunkaacutech (obr 38-41)

42

Obr 37 Interfaacutezna FISH preimplantačnyacute genetickyacute skriacutening aneuploidiiacute ndash blastomeacutera 3-denneacuteho ľudskeacuteho embrya s normaacutelnym počtom chromozoacutemov 13 18 21 pohlavie XY použityacutech 5 sond pre chromozoacutemy 13 ndash orange 18 ndash aqua 21 ndash green X ndash blue a Y ndash yellow (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

Obr 38 Interfaacutezne jadro po hybridizaacutecii s centromeacuterovou sondou pre chromozoacutem 8 (Vysis Abbott) V pravom jadre je priacutetomnaacute trizoacutemia chromozoacutemu 8 (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex) Obr 39 Metafaacutezna (A) a interfaacutezna FISH (B) použitaacute centromeacuterovaacute sonda CEPX spectrum orangeCEPY spectrum green (Vysis Abbott) Sonda hybridizuje k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (červenyacute signaacutel) a Y (zelenyacute signaacutel) (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

43

Obr 40 Interfaacutezna FISH vyšetrenie spermiiacute použiteacute sondy CEPX greenCEPY orange (Aneuscore Metasystems) Sondy hybridizujuacute k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (zelenyacute signaacutel) Y (červenyacute signaacutel) vľavo ndash dve haploidneacute spermie (majuacutece jedna spermia X druhaacute Y chromozoacutem) vpravo ndash dve patologickeacute spermie obsahujuacutece gonozoacutemovyacute komplement XY (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

Obr 41 Interfaacutezna FISH vyšetrenie spermiiacute použiteacute sondy CEPX greenCEPY orange a CEP18 aqua (Aneuscore Metasystems) Sondy hybridizujuacute k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (zelenyacute signaacutel) Y (červenyacute signaacutel) a 18 (modryacute signaacutel) vľavo ndash normaacutelne haploidneacute ľudskeacute spermie - 1x chromozoacutem X alebo Y a jedenkraacutet chromozoacutem 18 v strede ndash patologickaacute spermia obsahujuacuteca gonozoacutemovyacute komplement XY a jeden chromozoacutem 18 vpravo ndash patologickaacute diploidnaacute spermia s chromozoacutemami X Y a dvoma chromozoacutemami 18 (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

bull lokusovo špecifickeacute sondy ndash hybridizaacutecia prebehne na konkreacutetnom mieste geacutenu (lokuse) (obr 42-44) použiacutevajuacute sa k vyšetreniu mikrodeleacuteciiacute (straty malyacutech častiacute chromozoacutemu pri mikrodelečnyacutech syndroacutemoch) k zisteniu amplifikaacutecie onkogeacutenov a niektoryacutech špecifickyacutech translokaacuteciiacute prestavby geacutenov umožňujuacute interfaacuteznu FISH na nedeliacich sa bunkaacutech bull subtelomeroveacute ndash vaumlzba na koncoveacute časti chromozoacutemu ndash telomeacutery bull celochromozoacutemoveacute alebo celomaľovacie sondy ndash sondy hybridizujuacute s mnohopočetnyacutemi chromozoacutemovyacutemi sekvenciami pričom sa fluorescenčne tak bdquovymaľujeldquo celyacute chromozoacutem (Obr 45) Použiacutevajuacute sa na vyšetrenie chromozoacutemovyacutech prestavieb k analyacuteze translokaacuteciiacute a k detekcii pocircvodu tzv marker chromozoacutemov (malyacutech nadpočetnyacutech chromozoacutemov neznaacutemeho pocircvodu) K použitiu sondy suacute potrebneacute metafaacutezne chromozoacutemy nepoužiacutevaju sa pre interfaacuteznu FISH

Pri konvenčnej chromozoacutemovej FISH suacute homogeacutenne DNA proacuteby hybridizovaneacute s fixovanyacutem metafaacuteznym alebo prometafaacuteznym chromozoacutemomchromozoacutemami na skliacutečku (Obr 36a) Maximaacutelna rozlišovacia schopnosť metafaacuteznej FISH je niekoľko megabaacutez (Obr 39a 45) využitiacutem viac

44

natiahnutyacutech prometafaacuteznych chromozoacutemov sa dosiahne 1 Mb rozliacutešenie Prostredniacutectvom fiber FISH konkreacutetne artificiaacutelne deproteinizovanej natiahnutej DNA pripravenej in situ z celyacutech buniek na mikroskopickom skliacutečku je možneacute vizualizovať individuaacutelne geacuteny maleacute DNA elementy na chromozoacuteme s rozliacutešeniacutem okolo 1000 bp

Obr 42 Interfaacutezne jadro po hybridizaacutecii s lokusovo-špecifickou sondou LSI 5q31 Spectrum Orange5p12 Spectrum Green (Vysis Abbott) Na ľavom obraacutezku suacute priacutetomneacute dva červeneacute (5q31) a dva zeleneacute signaacutely (5p12) v pravom jadre je priacutetomnaacute deleacutecia 5q31 oblasti chyacuteba jeden červenyacute signal (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

Obr 43 Interfaacutezna FISH použitaacute lokusovo-špecifickaacute sonda ndash translokačnaacute - XL BCRABL1 plus (Metasystems) dvojfarebnaacute dvojfuacutezna kde červenaacute označuje lokus ABL1 na chromozoacuteme 9 a zelenaacute oblasť BCR na chromozoacuteme 22 Sonda deteguje fuacuteziu protoonkogeacutenu ABL1 (9q34) a geacutenu BCR (22q11) v priacutepade že červenyacute a zelenyacute signaacutel suacute pri sebe (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

45

Obr 44 Interfaacutezna FISH Použitaacute lokusovo-špecifickaacute sonda- typ break apart pre IGH geacuten V docircsledku translokaacutecie došlo k rozskočeniu geacutenu pričom translokačneacuteho partnera nepoznaacuteme vieme určiť len percento v koľkyacutech jadraacutech je geacuten prestavanyacute (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex) Obr 45 Použiteacute celochromozoacutemoveacute sondy WCP 15 (červenyacute chromozoacutem) a WCP 17 (zelenyacute chromozoacutem) Na metafaacuteze je potvrdenaacute reciprokaacute translokaacutecia t(1517)(q2221) (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

FISH vizualizaacutecia celeacuteho chromozoacutemu maľovanie chromozoacutemu anglicky chromosome

painting je špeciaacutelnou aplikaacuteciou chromozoacutemovej FISH proacuteba je koktail veľkeacuteho počtu rocircznych fluorescenčne značenyacutech DNA fragmentov hybridizujuacutecich pozdĺž celeacuteho konkreacutetneho chromozoacutemu (obr 36b 45) bdquoChromosomepaintingldquo analyzuje metafaacutezne chromozoacutemy V minulosti bola FISH vizualizaacutecia celyacutech chromozoacutemov limitovanaacute malyacutem množstvom rocirczne sfarbenyacutech fluorochroacutemov

V suacutečasnosti je možneacute detegovať množstvo cieľovyacutech sekvenciiacute naraz čo sa využiacuteva pri celogenoacutemovej chromozoacutemovej vizualizaacutecii (whole-chromosomepainting - WCP) metoacutedou multiplex FISH (M-FISH multicolor FISH o br 46) alebo spektraacutelnej karyotypizaacutecie (SKY) kedy možno rozliacutešiť všetky ľudskeacute chromozoacutemy ndash teda 24 rocircznych chromozoacutemov M-FISH a SKY patria medzi metafaacutezne formy FISH diagnostiky ktoreacute umožňujuacute simultaacutennu vizualizaacuteciu všetkyacutech ľudskyacutech chromozoacutemov v rocircznych farbaacutech čo predstavuje uľahčenie analyacutezy karyotypu hlavne pri komplexnyacutech zmenaacutech a markeroch neznaacutemeho pocircvodu Obe techniky vychaacutedzajuacute z použitia

46

celochromozoacutemovyacutech sond značenyacutech kombinaacuteciou viaceryacutech fluorochroacutemov Rozdiel medzi M-FISH a SKY spočiacuteva v technike ziacuteskania konečneacuteho obrazu

Obr 46 Multicolor FISH - každyacute chromozoacutemovyacute paacuter je zafarbenyacute inou farbou pričom na ich zafarbenie postačuje kombinaacutecia 5 fluorochroacutemov Na vyhodnocovanie je potrebnaacute špeciaacutelna sada fluorescenčnyacutech filtrov pre jednotliveacute fluorochroacutemy a špeciaacutelnyacute softweacuter Vľavo-štandardnyacute karyotyp vpravo karyotyp s mutaacuteciami (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

V molekulovej cytogenetike suacute komerčne dostupneacute sety M-FISH proacuteb umožňujuacutece

viacfarebneacute pruacutežkovanie chromozoacutemov (banding) s vysokyacutem rozliacutešeniacutem (multicolor-banding mBAND FISH MCB) čo umožňuje identifikaacuteciu intrachromozoacutemovyacutech prestavieb (Obr 47) Nevyhnutnosťou mBAND-u je mať chromozoacutemy v metafaacuteze Taacuteto metoacuteda bola prvyacutekraacutet uskutočnenaacute na chromozoacuteme 5 v roku 1999 mBAND FISH umožňuje rozliacutešiť špecifickeacute oblasti chromozoacutemov na uacuterovni pruacutežku - bandu a sub-bandu s detekciou 550 bandov haploidneacuteho karyotypu

Obr 47 A - mBAND chromozoacutemu 11 - inverzia duplikovanej oblasti 11q223-q25 B - mBAND chromozoacutemu 3 - na kruhovom chromozoacuteme deleacutecia oblasti 3p263 C - mBAND chromozoacutemu 2 - potvrdenie inverzie duplikovanej časti chromozoacutemu (poskytnuteacute RNDr Dagmar Landlovou Medirex)

FISH metoacuteda a jej varianty (M-FISH mBAND SKY) majuacute v suacutečasnosti širokeacute využitie v

klinickej genetike v onkologickej genetike na detekciu aberaacuteciiacute v čase diagnoacutezy počas liečby po

47

liečbe monitorovanie po transplantaacutecii kostnej drene v prenataacutelnej a postnataacutelnej diagnostike pri detekcii submikroskopickyacutech deleacuteciiacute (napr DiGeorge syndroacutem - 22q112 delečnyacute syndroacutem PraderndashWilli syndroacutem- chromozoacutem 15q11-13) prostredniacutectvom FISH je možnaacute detekcia numerickyacutech zmien chromozoacutemov (trizoacutemia chromozoacutemu 21 pri Downovom syndroacuteme trizoacutemia chromozoacutemu 15 pri Patauovom syndroacuteme trizoacutemia chromozoacutemu 18 pri Edwardsovom syndroacuteme) rocirczne zmeny v počte pohlavnyacutech chromozoacutemov (monozoacutemia X pri Turnerovom syndroacuteme Klinefelterov syndroacutem s X chromozoacutemom naviac - XXY) podobne v predimplantačnej diagnostike

83 DNA Microarray (DNA mikro čip biočip) DNA mikročipovanie je technika využiacutevajuacuteca hybridizaacuteciu skuacutemanej nukleovej kyseliny

(cieľovaacute vzorka) s veľkyacutem množstvom oligonukleotidovyacutech proacuteb (desať tisiacutec až milioacuten) ktoreacute suacute prichyteneacute na pevnyacute podklad najčastejšie sklenyacute silikoacutenovyacute alebo nylonovyacute (doštička čip) Skuacutemanaacute nukleovaacute kyselina je pred hybridizaacuteciou fragmentovanaacute označenaacute fluorofoacuterom a denaturovanaacute Po kontakte čipu s cieľovou vzorkou ktoraacute je vlastne zmes označenyacutech oligonukleotidov značeneacute oligonukleotidy hybridizujuacute s oligonukleotidovyacutemi sekvenciami prichytenyacutemi na čipe Potom suacute na zaacuteklade fluorescencie detekovaneacute miesta kde došlo k hybridizaacutecii čiže vzorka obsahovala takuacuteto nukleotidovuacute sekvenciu Z jedneacuteho mikročipu sa ziacuteska obrovskeacute množstvo daacutet ktoreacute je vždy nutneacute softveacuterovo spracovať V dnešnej dobe existuje niekoľko firiem poskytujuacutecich komerčne mikročipy na objednaacutevku alebo si ich laboratoacuteria produkujuacute sami

Mikročipovanie prebieha nasledovne

1) Vytvorenie DNA čipu ndash tisiacutece rocircznych jednovlaacuteknovyacutech DNA oligonukleotidov znaacutemych sekvencii sa kovalentne naviažu na povrch doštičky vždy v určitej lokalite je niekoľko rovnakyacutech oligonukleotidov veľkosť takejto lokality je ˂ 200 microm Proacutebami mocircže byť DNA cDNA alebo syntetizovaneacute oligonukleotidy Už hotoveacute mikročipy ponuacutekajuacute viacereacute firmy (Affymetrix Agilent Technologies Eppendorf Illumina) alebo si ich jednotliveacute laboratoacuteria vyraacutebajuacute sami pomocou robotickyacutech zariadeniacute DNA čip sa vytvaacutera buď nanaacutešaniacutem kvapiek oligonukleotidov na podklad alebo synteacutezou oligonukleotidov in situ na čipe 2) Priacuteprava vzorky ndash nukleovaacute kyselina (mRNA DNA) sa purifikuje určiacute sa jej kvantita a kvalita (spektrofotometericky) fragmentuje resp v priacutepade mRNA sa syntetizuje cDNA v priacutepade potreby sa mocircže DNA amplifikovať PCR reakciou štiepiť restrikčnyacutemi endonukleaacutezami 3) Fluorescenčneacute označenie (zriedkavejšie raacutedioaktiacutevne) fragmentov DNA prebieha počas reverznej transkripcie alebo PCR amplifikaacutecie za uacutečasti fluorescenčne značenyacutech nukleotidov Keď sa analyzujuacute dve rocirczne vzorky napr zdraveacute tkanivo a naacutedoroveacute tkanivo označenie nukleovyacutech kyseliacuten v tyacutechto tkanivaacutech byacuteva rozdielne a to použitiacutem dvoch rocircznych fluorescenčnyacutech farbiacutev (napr zeleneacute a červeneacute) Pred hybridizaacuteciou je potrebneacute vzorku denaturovať čiacutem sa vytvoriacute zmes jednovlaacuteknovyacutech DNA označenyacutech značkou 4) Hybridizaacutecia s mikročipom ndash v špeciaacutelnom hybridizačnom roztoku hybridizujuacute komplementaacuterne sekvencie zo vzorky s priacuteslušnyacutemi oligonukleotidovyacutemi sondami naviazanyacutemi na čipe Potom sa čip obmyje aby došlo k odstraacuteneniu čiastočne hybridizovanyacutech nukleovyacutech kyseliacuten 5) Skenovanie mikročipu ndash skenerom čipov docircjde k ožiareniu čipu laserom pričom v mieste hybridizaacutecie fluorescenčne značenyacutech DNA fragmentov s proacutebou docircjde k emisii svetla určitej vlnovej dĺžky ktoruacute skener zaznamenaacute 6) Analyacuteza daacutet prebieha metoacutedami bioinformatiky spracovaniacutem softveacutermi sa zistiacute ktoreacute lokality čipu navzaacutejom hybridizovali v priacutepade použitia dvoch vzoriek kontrolnej a skuacutemanej je možneacute analyzovať ich relatiacutevnu intenzitu hybridizaacutecie (expresie určiteacuteho geacutenu)

Existujuacute štyri typy mikročipov 1) Čipy ur čeneacute na analyacutezu expresie (obsahujuacute cDNA proacuteby) pre tzv dvojkanaacutelovyacute experiment kedy je vzorka určenaacute k hybridizaacutecii na čipe ziacuteskanaacute zmiešaniacutem DNA fragmentov kontrolnej a skuacutemanej vzorky pričom fragmenty suacute rozdielne fluorescenčne označeneacute (napr zelenyacute fluorofoacuter pre kontrolnuacute vzorku a červenyacute pre skuacutemanuacute) Na zaacuteklade intenzity a typu fluorescencie sa deteguje expresia geacutenov typickaacute pre kontrolnuacute vzorku (napr zelenaacute fluorescencia) pre skuacutemanuacute vzorku (napr

48

červenaacute fluorescencia) a expresia podobnaacute u oboch vzoriek (žltaacute fluorescencia) neexprimovaneacute geacuteny (čierna fluorescencia) rocirczne odtiene (v zaacutevislosti od prevažujuacutecej hybridizaacutecie) (obr 48) 2) Čipy ur čeneacute na analyacutezu mutaacutecii použije sa genoacutemovaacute DNA označenaacute jednou fluorescenčnou farbičkou na určenie jednonukleotidovej zmeny (SNP ndash Single Nukleotide Polymorphism) 3) Čipy na komparatiacutevnu genoacutemovuacute hybridizaacuteciu (aCGH array Comparative Genomic Hybridization) ndash použiacutevaneacute na zistenie zvyacutešenia alebo zniacuteženia množstva chromozoacutemovyacutech fragmentov obsahujuacutecich geacuteny zodpovedneacute za určiteacute ochorenie Na analyacutezu sa použije skuacutemanaacute gDNA a referenčnaacute (kontrolnaacute) DNA každaacute sa značiacute inou fluorescenčnou farbičkou (princiacutep ako pri analyacuteze expresie) (obr 49 50) 4) Čipy CGH - SNP kombinovaneacute čipy ur čeneacute na analyacutezu aj mutaacuteciiacute SNP aj na komparatiacutevnu genoacutemovuacute hybridizaacuteciu CGH

Mikročipy majuacute rozsiahle využitie napriacuteklad v identifikaacuteciiacute novyacutech geacutenov vo vyacuteskume ich funkciiacute expresie v rocircznych podmienkach pri diagnostike mnohyacutech ochoreniacute vo farmakogenomike vo vyacuteskume vplyvu toxiacutenov

Obr 48 Heatmapa geacutenovej expresie vybranyacutech geacutenov (mRNA) mikročip obsahuje 46000 cDNA proacuteb (poskytnuteacute Ing Helenou Gbelcovou PhD Uacutestav lekaacuterskej bioloacutegie genetiky a klinickej genetiky LF UK a UNB)

49

Obr 49 Princiacutep komparatiacutevnej genoacutemovej hybridizaacutecie (aCGH - array comparative genomic hybridization) Obr 50 A) Vyacutesledok komparatiacutevnej genoacutemovej hybridizaacutecie (aCGH - array comparative genomic hybridization) vzorky DNA izolovanej plodovej vody U plodu s abnormaacutelnym ultrasonografickyacutem vyšetreniacutem bola identifikovanaacute duplikaacutecia oblasti 3q261q29 (modryacute paacutes) a deleacutecia oblasti 5p1533p151 (červenyacute paacutes) Pre porovnanie chromozoacutem 1 bez aberaacutecie b) Ten istyacute pacient ale ineacute softveacuteroveacute spracovanie (poskytnuteacute RNDr Miroslavom Tomkom PhD Medirex)

50

Odporuacutečanaacute a použitaacute literatuacutera

Odborneacute knihy Klug W S Cummings M R Spencer Ch A Palladino M A Concepts of Genetics jedenaacuteste vydanie (2015) Carson S Molecular Biology Techniques tretie vydanie (2012) Strachan T Read A Human Molecular Genetics štvrteacute vydanie (2011) Sudbery P Sudbery I Human Molecular Genetics tretie vydanie (2009)

Internetoveacute straacutenky

wwwncbinlmnihgov wwwmlpacom wwwthermofishercom wwwilluminacom wwwpromegask wwwqiagencom wwwambioncom

Odborneacute člaacutenky Chacon-Cortes D Griffiths L R Methods for extracting genomic DNA from whole blood samples current perspectives Journal of Biorepository Science for Applied Medicine Volume 2 strany 1- 9 Viltrop T Krjutskov K Palta P Metspalu A Comparison of DNA extraction methods for multiplex polymerase chain reaction Anal Biochem 2010 Volume 398(2) strany 260-262 Ing Martin Čermaacutek Molekulaacuterna cytogenetika v problematike familiaacuternych maligniacutet Onkoloacutegia Volume 2 strany 77 - 83 Livak KJ Schmittgen TD Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method Methods 2001 Volume 25(4) strany 402 - 408 Bustin S A Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays J Mol Endocrinol 2000 Volume 25(2) strany169 - 193

MOLEKULAacuteRNE METOacuteDY AKTUAacuteLNE POUŽIacuteVANEacute V KLINICKEJ GENETIKE RNDr Andrea Pastoraacutekovaacute PhD RNDr Robert Petrovič PhD Vydala Univerzita Komenskeacuteho v Bratislave Lekaacuterska fakulta Rozsah 50 straacuten 246 AH prveacute vydanie ISBN 978-80-223-4231-5

3

Predhovor

Genetika prekonala v poslednyacutech desaťročiach obrovskyacute pokrok Začiatok predstavoval zavedenie cytogenetickyacutech metoacuted pokračovanie v podobe osekvenovania celeacuteho ľudskeacuteho genoacutemu čo viedlo v suacutečasnosti k možnosti masiacutevneho paralelneacuteho sekvenovania jednotlivcov metoacutedou sekvenovania novej generaacutecie veduacuteceho k ziacuteskaniu raacutedovo tisiacutecov až milioacutenov sekvenciiacute naraz Cieľ ako aj spocircsob spracovania predloženeacuteho textu je zameranyacute na potreby pregraduaacutelneho a postgraduaacutelneho štuacutedia mediciacutenskej komunity Noveacute laboratoacuterne metoacutedy priacutestrojoveacute vybavenie a predovšetkyacutem molekulaacuterno-genetickyacute pokrok sa preniesol do mediciacutenskej praxe s prenikaniacutem do takmer všetkyacutech mediciacutenskych špecializaacuteciiacute Preto je nevyhnutneacute aby si študenti a lekaacuteri tieto noveacute poznatky a trendy osvojili a naacutesledne ich dokaacutezali využiacutevať v klinickej praxi Publikaacutecia sumarizuje a vysvetľuje molekulaacuterno-genetickeacute metoacutedy ktoreacute suacute v suacutečasnosti využiacutevaneacute za uacutečelom genetickej diagnostiky

Autori

4

1 Izolaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten 11 Izolaacutecia DNA

Prvuacute izolaacuteciu DNA uskutočnil v roku 1869 švajčiarsky vedec Friedrich Miescher Izolaacutecia DNA je kľuacutečovyacutem krokom pre množstvo naacuteslednyacutech aplikaacutecii v oblasti molekulovej bioloacutegie a lekaacuterskej genetiky Najčastejšiacutem a najdostupnejšiacutem materiaacutelom vhodnyacutem na izolaacuteciu ľudskej genoacutemovej DNA suacute leukocyty krvi DNA je možneacute ziacuteskať aj z inyacutech tkaniacutev a telesnyacutech tekutiacuten ako suacute napriacuteklad svaly koža kosti zuby sperma sliny moč plodovaacute voda atď Metoacuted izolaacutecie genoacutemovej DNA je viacero Vyacuteber zaacutevisiacute od technickeacuteho vybavenia laboratoacuteria časovyacutech a finančnyacutech možnostiacute ako aj od materiaacutelu z ktoreacuteho sa DNA izoluje od podmienok jej uskladnenia a od množstva potrebneacuteho na analyacutezu Najviac využiacutevanyacutem zdrojom DNA je perifeacuterna krv preto sa zameriame na extrakčneacute protokoly z tohto materiaacutelu Existujuacute viacereacute metoacutedy na izolaacuteciu DNA ktoreacute majuacute však spoločneacute kroky

1) rozrušenie bunkovej membraacuteny a lyacuteza buniek 2) denaturaacutecia nukleoproteiacutenoveacuteho komplexu 3) inaktivaacutecia nukleaacutez a ďalšiacutech bunkovyacutech enzyacutemov 4) DNA precipitaacutecia

Lyacuteza buniek sa dosahuje použitiacutem detergentov a enzyacutemov Sodnaacute soľ dodecylsulfaacutetu (SDS) TritonTMX-100 suacute priacuteklady bežnyacutech detergentov solubilizujuacutecich bunkovuacute membraacutenu Spolu k detergentom sa často pridaacutevajuacute enzyacutemy a to za uacutečelom štiepenia glykoproteiacutenov a inaktivaacutecie DNaacutez Bunkoveacute DNaacutezy suacute enzyacutemy ktoreacute štiepia DNA a tyacutem znehodnocujuacute a znižujuacute vyacuteťažok a kvalitu nukleovyacutech kyseliacuten

Precipitaacutecia DNA z roztoku prebieha pridaniacutem vysokej koncentraacutecie soli (napr octan amoacutenny) a za priacutetomnosti rozpuacutešťadiel (napr etanol v konečnej koncentraacutecii 70-80 alebo izopropanol v konečnej koncentraacutecii 40-50)

Niektoreacute protokoly pokračujuacute premytiacutem DNA precipitaacutetu 70 etanolom čiacutem docircjde k zbaveniu sa nadbytočnyacutech soliacute Nakoniec sa DNA rozpustiacute vo vode alebo v pufri napr TE (pozostaacutevajuacutecom z 10mM Tris 1mM EDTA-kyselina etyleacutendiamintetraoctovaacute) TE pufor sa použiacuteva pre dlhodobeacute uskladnenie DNA pretože zabraňuje degradaacutecii DNA nukleaacutezami nevhodnyacutem pH ťažkyacutemi kovmi a oxidaacuteciou voľnyacutemi radikaacutelmi Tris udržiava vhodneacute pH 7-8 a EDTA viaže dvojmocneacute ioacuteny (ako Mg2+ a Ca2+ ktoreacute suacute potrebneacute pre funkciu DNaacutez) ako aj braacuteni oxidačneacutemu poškodeniu ťažkyacutemi kovmi

Postupov izolaacutecie DNA je viacero vyacuteber zaacutevisiacute od naacutesledneacuteho použitia naacuterokov na kvantitu a kvalitu technickeacuteho vybavenia laboratoacuteria a potreby uskladnenia pre buduacutece použitie Suacute to najmauml

1) Priacuteprava a použitie hrubeacuteho lyzaacutetu kde je priacutetomnaacute DNA Taacuteto bdquoryacutechla a špinavaacuteldquo metoacuteda pozostaacuteva z lyacutezy buniek pri vysokej teplote (90degC 20minuacutet) alebo je uskutočnenaacute proteinaacutezou K Lyzaacutet sa použije priamo v ďalšiacutech aplikaacuteciaacutech Priacutetomnosť kontaminantov v lyzaacutete obmedzuje jeho použitie ako aj skladovanie DNA 2) Vysoľovacie metoacutedy začiacutenajuacute priacutepravou hrubeacuteho lyzaacutetu pokračujuacute tzv vysoľovaniacutem kedy sa proteiacuteny a ineacute kontaminanty precipitujuacute pri vysokej koncentraacutecii soli (octan draselnyacute octan amoacutenny) precipitaacutet je eliminovanyacute centrifugaacuteciou a DNA sa ziacuteskava z roztoku naacuteslednou alkoholovou precipitaacuteciou Vyacuteťažok DNA a jej čistota variacuteruje podľa použitej metodiky 3) Organickaacute extrakcia využiacuteva organickeacute rozpuacutešťadlaacute na odstraacutenenie kontaminantov z bunkoveacuteho lyzaacutetu Bunky suacute lyzovaneacute použitiacutem detergentov lyzaacutet sa zmieša so zmesou fenolu chloroformu a izoamylalkoholu Centrifugaacuteciou zmesi sa docieli oddelenie dvoch vrstiev organickej vrstvy (faacutezy) obsahujuacutecej kontaminanty a vodnej vrstvy (faacutezy) s DNA Zo ziacuteskanej vodnej faacutezy sa DNA izoluje najčastejšie alkoholovou precipitaacuteciou Organickaacute extrakcia bola veľmi využiacutevanaacute v laboratoacuteriaacutech v minulosti v suacutečasnosti je maacutelo použiacutevanaacute na rutinnuacute diagnostiku jednak pretože je časovo naacuteročnaacute

5

DNA mocircže obsahovať fenolchloroform ktoreacute inhibujuacute enzymatickeacute reakcie a taacuteto metoacuteda nie je vhodnaacute ani na izolaacuteciu v automatoch 4) Centrifugaacutecia v gradiente chloridu ceacutezneho (CsCl) umožňuje ziacuteskať genoacutemovuacute DNA vysokej kvality avšak taacuteto metoacuteda je časovo naacuteročnaacute praacutecna drahaacute (potrebnaacute ultracentrifuacutega) a nepoužiteľnaacute v automatoch nie je rutinne využiacutevanaacute Bunkovyacute lyzaacutet je precipitovanyacute alkoholom DNA roztok je zmiešanyacute s CsCl a etiacutediumbromidom nasleduje niekoľkohodinovaacute centrifugaacutecia v ultracentrifuacutege DNA je viditeľnaacute v podobe pruacutežku po jej odobratiacute sa extrahuje izopropanolom aby došlo k odstraacuteneniu etiacutediumbromidu a precipituje sa etanolom 5) Minikoloacutenovaacute (koloacutenkovaacute) purifikaacutecia využiacuteva schopnosť materiaacutelu v minikoloacutene (matrix matrica) adsorbovať DNA za určityacutech konkreacutetnych podmienok pH a koncentraacutecie soli (obr 1) Existujuacute viacereacute typy materiaacutelov viažucich DNA ktoreacute suacute na uacutečely izolaacutecie DNA umiestneneacute v minikoloacutene hydrofilneacute matrice viažuce vodiacutek v priacutetomnosti chaotropnyacutech činidiel matrice využiacutevajuacutece vyacutemenu ioacutenov (ioacutenomeničoveacute) matrice s určitou afinitou a veľkostnou selekciou

Vaumlčšina minikoloacutenovyacutech metoacuted maacute podobnyacute postup na začiatku prebehne lyacuteza buniek potom nasleduje DNA adsorbcia na matricu centrifugovateľnyacutech minikoloacuten premytie nukleovej kyseliny adsorbovanej na matricu v minikoloacutene čiacutem docircjde k zbaveniu sa kontaminantov a finaacutelna eluacutecia (uvoľnenie) DNA

Kremičitanoveacute (SiO2 Silika) matrice majuacute vynikajuacutecu schopnosť viazať DNA pretože suacute kladne nabiteacute a majuacute vysokuacute afinitu k negatiacutevne nabitej DNA V prostrediacute vysokej koncentraacutecie chaotropnyacutech soliacute docircjde k adsorpcii DNA na kremičitanovuacute matricu (silica geacutel) zatiaľ čo bunkoveacute proteiacuteny a ineacute metabolity zostanuacute v roztoku a naacutesledne suacute vymyteacute z koloacuteny DNA vhodnaacute na diagnostickeacute použitie je ziacuteskanaacute eluacuteciou zo silika matrice použitiacutem pufra s niacutezkou koncentraacuteciou soliacute (TE destilovanaacute voda) Existuje množstvo komerčne priacutestupnyacutech kitov (suacuteprav) ktoreacute obsahujuacute všetky potrebneacute chemikaacutelie a minikoloacuteny Izolaacutecia DNA prostredniacutectvom kitu založenom na silika materiaacuteli trvaacute od 40-60minuacutet pričom sa ziacuteska vysokokvalitnaacute DNA vo vysokom vyacuteťažku Dnes suacute k dispoziacutecii kity vhodneacute na poloautomatizovanuacute alebo plnoautomatizovanuacute izolaacuteciu DNA (obr 3)

Ďalšou možnosťou je použiť DNA izolačnyacute kit využiacutevajuacuteci magnetickeacute guľocircčky ktoreacute suacute pokryteacute materiaacutelom viažucim DNA (polymeacutery silika hydroxyapatit) DNA sa naviaže na magnetickeacute guľocircčky a prostredniacutectvom magnetickej sily magnetu je možneacute premyacutevať naviazanuacute DNA V tomto priacutepade nie je potrebneacute použiť centrifugaacuteciu

Obr 1 Minikoloacutena a postup izolaacutecie DNA

12 Izolaacutecia RNA

Ziacuteskanie RNA vysokej kvality je prvyacutem a často najkritickejšiacutem krokom pre molekulaacuterne techniky typu kvantifikaacutecie expresie určiteacuteho geacutenu metoacutedou real-time PCR (RT-qPCR) analyacutezy transkriptoacutemu sekvenovanovaniacutem ďalšej generaacutecie (NGS) analyacutezy RNA profilu mikročipmi northern analyacutezy a konštrukcie cDNA knižnice Pre dosiahnutie čo najcitlivejšiacutech a biologicky

6

najrelevantnejšiacutech vyacutesledkov je potrebneacute dodržať pracovneacute postupy pred počas a po RNA purifikaacutecii Pre optimalizaacuteciu RNA izolaacutecie a analyacutezy suacute docircležiteacute nasledovneacute kroky 1) manipulaacutecia so vzorkami určenyacutemi na RNA izolaacuteciu 2) vyacuteber metoacutedy izolaacutecie RNA 3) uskladnenie RNA

Klasickaacute izolaacutecia RNA prebieha vaumlčšinou v priacutetomnosti inhibiacutetorov ribonukleaacutez Ribonukleaacutezy (RNaacutezy) suacute bunkoveacute enzyacutemy degradujuacutece RNA Inhibiacutetory RNaacutez suacute silneacute denaturanty ktoreacute vo vzorke znižujuacute riziko RNA degradaacutecie (napr guanidiacutenoveacute soli dodecylsufaacutet sodnyacute - SDS chemikaacutelie obsahujuacutece fenol)

Pred vlastnou izolaacuteciou RNA je potrebneacute sterilizovať všetok materiaacutel (skuacutemavky špičky pipety vodu laboratoacuterny priestor) (obr 2) ktoryacute bude v kontakte so vzorkou určenou na izolaacuteciu RNA Kyacutem sa vzorka začne spracovaacutevať udržiava sa v tekutom dusiacuteku na suchom ľade alebo je vloženaacute do špeciaacutelnych stabilizačnyacutech roztokov (napr RNAlaterreg) alebo špeciaacutelnych skuacutemaviek so stabilizačnyacutem roztokom napr PAXgenereg Blood RNA Tube

Existuje niekoľko spocircsobov izolaacutecie RNA

1) Organickaacute extrakčnaacute metoacuteda je zlatyacutem štandardom izolaacutecie RNA Na začiatku izolaacutecie sa vzorka homogenizuje v roztoku obsahujuacutecom fenol (TRIzolreg RNAzolreg RT) naacutesledne sa centrifuguje Počas centrifugaacutecie dochaacutedza vo vzorke k separaacutecii troch vrstiev spodnej organickej faacutezy strednej faacutezy obsahujuacutecej denaturovaneacute proteiacuteny a genoacutemovuacute DNA a vrchnej vodnej faacutezy s RNA Po odobratiacute vrchnej faacutezy sa RNA z nej precipituje (vyzraacuteža) alkoholom a naacutesledne sa rehydratuje 2) Minikoloacutenovaacute metoacuteda (filtračnaacute) využiacuteva membraacuteny (zo sklenyacutech vlaacutekien silika alebo ioacutenomeničoveacute membraacuteny) vloženeacute do minikoloacuten Vzorka je lyzovanaacute v pufri obsahujuacutecom RNaacutezoveacute inhibiacutetory nukleoveacute kyseliny sa naviažu na membraacutenu keď lyzaacutet prechaacutedza membraacutenou počas centrifugaacutecie Membraacutena s naviazanou RNA je viackraacutet premyacutevanaacute RNA sa ziacuteska centrifugaacuteciou do novej skuacutemavky po eluacutecii vhodnyacutem elučnyacutem roztokom 3) Metoacuteda využiacutevajuacuteca magnetickeacute partikuly obsahujuacutece paramagnetickeacute vnuacutetro obklopeneacute obalom modifikovanyacutem tak aby viazal žiaduci objekt teda RNA Vzorka lyzovanaacute v roztoku obsahujuacutecom RNaacutezoveacute inhibiacutetory sa zmieša s magnetickyacutemi partikulami kedy docircjde k naviazaniu RNA na povrch magnetickyacutech partikuacutel Opakovanyacutem použitiacutem externeacuteho magnetickeacuteho poľa je možneacute vychytať magnetickeacute partikuly s naviazanou nukleovou kyselinou odstraacuteneniacutem magnetickeacuteho poľa zase uvoľniť a resupendovať v premyacutevaciacutech roztokoch Na zaacutever sa RNA uvoľniacute do elučneacuteho roztoku a magnetickeacute partikuly sa odstraacutenia 4) Priama lyacuteza sa použiacuteva na priacutepravu vzorky použitiacutem lyzačnyacutech roztokov ktoreacute lyzujuacute vzorku stabilizujuacute nukleoveacute kyseliny a takto pripravenaacute RNA mocircže byť použitaacute na ďalšie analyacutezy Priama lyacuteza teda nie je purifikačnaacute metoacuteda v pravom zmysle slova

Ziacuteskanuacute RNA je potrebneacute kvantifikova ť Ide o docircležityacute a nevyhnutnyacute krok ktoryacute predchaacutedza RNA analyacutezu Existujuacute viacereacute možnosti kvantifikaacutecie nukleovyacutech kyseliacuten ktoryacutem je venovanaacute samostatnaacute časť

Skladovanie RNA - RNA musiacute byť resuspendovanaacute resp eluovanaacute v roztoku bez RNaacutez na tento uacutečel suacute komerčne dostupneacute viacereacute roztoky na skladovanie RNA zabezpečujuacutece maximaacutelnu ochranu pred RNaacutezami RNA sa odporuacuteča skladovať pri teplote ndash 80degC v alikvoacutetoch (rozpipetovanaacute v menšiacutech množstvaacutech v mikroskuacutemavkaacutech) určenyacutech na jedno použitie

7

Obr 2 Laminaacuterny box na izolaacuteciu nukleovyacutech kyseliacuten praacutecu s DNA RNA atď Obr 3 Automatickyacute pipetovaciacute robot napr na izolaacuteciu 96 vzoriek DNA

8

2 Stanovenie kvantity a kvality nukleovyacutech kyseliacuten

Docircležiteacute je určenie koncentraacutecie a čistoty izolovanej DNA a RNA pretože analyacutezy ktoreacute nasledujuacute po izolaacutecii nukleovyacutech kyseliacuten často vyžadujuacute presneacute množstvo a čistotu nukleovyacutech kyseliacuten (NK bez priacutemesiacute) Metoacuted kvantifikaacutecie NK je niekoľko najpoužiacutevanejšie suacute spektrofotometrickaacute kvantifikaacutecia a kvantifikaacutecia UV fluorescenciou za priacutetomnosti farbičky

21 Spektrofotometrickaacute kvantifikaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten

Nukleoveacute kyseliny špecificky absorbujuacute ultrafialoveacute svetlo Vzorka s NK je v spektrofotometri (obr 6) vystavenaacute ultrafialoveacutemu svetlu o vlnovej dĺžke 260nm fotodetektor naacutesledne zmeria svetlo ktoreacute prejde vzorkou čiacutem viac svetla vzorka pohltiacute (absorbuje) tyacutem je vyššia koncentraacutecia nukleovej kyseliny vo vzorke Vyacutepočet koncentraacutecie NK zaacutevisiacute od toho či ide o DNA alebo RNA či je jednovlaacuteknovaacute alebo dvojvlaacuteknovaacute dsDNA c = A260002 [microgml] ssDNA c = A2600027 [microgml] RNA c = A2600025 [microgml]

Teda ak absorbancia dsDNA je 1 koncentraacutecia DNA vo vzorke je 50 microgml (pozn v priacutepade ak je draacuteha luacuteča 1cm)

Pokiaľ poznaacuteme sekvenciu napr pri synteacuteze primeru (ssDNA) mocircžeme z nej vypočiacutetať molekulovuacute hmotnosť a určiť priamo molaacuternu koncentraacuteciu nukleovej kyseliny (pmolmicrol) c = A260 lowast (100[15A + 071lowastC + 12lowastG + 084lowastT]) [pmolmicrol] A je počet adeniacutenov (v skutočnosti dATP) C je počet cytoziacutenov (dCTP) G je počet guaniacutenov (dGTP) a T počet tymiacutenov (dTTP)

Predpokladom pre spraacutevne určenie koncentraacutecie na zaacuteklade absorbancie je samozrejme čistota nukleovej kyseliny vo vzorke Čistota NK sa určuje podľa absorbčnej krivky popriacutepade zjednodušene na zaacuteklade pomeru absorbanciiacute pri 260 a 280 nm pretože proteiacuteny absorbujuacute svetlo vlnovej dĺžky 280nm Čistaacute DNA maacute pomer absorbanciiacute 260280 (A260280) pohybujuacutece sa okolo 18 čistaacute RNA maacute pomer absorbancii A260280 približne 2

Vzorku nukleovyacutech kyseliacuten mocircžu okrem proteiacutenov kontaminovať aj ďalšie laacutetky ako je fenol ktoryacute sa často využiacuteva pri izolaacutecii NK Takto izolovaneacute vzorky nukleovyacutech kyseliacuten nekontaminovaneacute fenolom by mali mať A260280 okolo 2 Ďalšie kontaminanty sa zisťujuacute absorbciou svetla pri 230 nm a 330 nm

22 Kvantifikaacutecia s použitiacutem fluorescenčnyacutech farbiacutev

Ďalšou možnosťou ako zmerať koncentraacuteciu nukleovyacutech kyseliacuten je zmeranie fluorescencie farbiva (napr etidiumbromid) ktoreacute sa viaže na nukleovuacute kyselinu a selektiacutevne svieti v priacutepade že je naviazaneacute na NK Metoacuteda využitia fluorescenčneacuteho farbiva naviazaneacuteho na NK sa použiacuteva v priacutepade ak je koncentraacutecia NK priacuteliš niacutezka na kvantifikaacuteciu spektrofotometrom ako aj v priacutepade že je NK kontaminovanaacute laacutetkou (kontaminantom) absorbujuacutecim svetlo vlnovej dĺžky 260nm 221 Využitie migraacutecie nukleovej kyseliny v geacuteli s jej naacuteslednou fluorescenčnou detekciou

Ak predpokladaacuteme niacutezku koncentraacuteciu NK na jej zistenie použijeme elektroforetickuacute

migraacuteciu NK v geacuteli (mocircže sa použiť agaroacutezovyacute alebo polyakrylamidovyacute geacutel) fluorescenčneacute farbivo je buď primiešaneacute do vzorky NK alebo priamo do geacutelu Spolu so vzorkou NK neznaacutemej koncentraacutecie migruje v geacuteli vo vedľajšej draacutehe vzorka NK so znaacutemou koncentraacuteciou Na zaacuteklade porovnania fluorescencie (po vystaveniacute geacutelu s NK svetlu o konkreacutetnej vlnovej dĺžke) vzorky so znaacutemou

9

koncentraacuteciu a vzorky neznaacutemej koncentraacutecie sa urobiacute odhad resp sa vyacutesledok kalkuluje počiacutetačovyacutem softveacuterom denzitometricky (obr 4)

222 Využitie kvantifikaacutecie množstva nukleovyacutech kyseliacuten použitiacutem real-time PCR metoacutedy

V priacutepade veľmi maleacuteho množstva NK ktoreacute nie je možneacute kvantifikovať ani geacutelovou elektroforeacutezou resp potrebujeme zistiť koncentraacuteciu NK veľmi presne u maleacuteho množstva NK (napr pre kriminalistiku) použije sa metoacuteda absoluacutetnej kvantifikaacutecie prostredniacutectvom real-time PCR (kvantifika čnej PCR qPCR) Princiacutep metoacutedy spočiacuteva v porovnaniacute amplifikaacutecie určiteacuteho uacuteseku nukleovej kyseliny vo vzorke neznaacutemej koncentraacutecii s amplifikaacuteciou tej istej sekvencie vo vzorke presne definovanej koncentraacutecie (obr 5) qPCR je možneacute kvantifikovať koncentraacuteciu raacutedovo v pgul 223 Kvantifikaacutecia fluorospektrofotometrom (fluori metrom)

Ak maacuteme dostatočneacute množstvo vzorky je možneacute na kvantifikaacuteciu použiť fluorospektrofotometer v tomto priacutepade je vzorka zmiešanaacute s fluorescenčnyacutem farbivom a je meranaacute emitovanaacute fluorescencia z ktorej sa vypočiacuteta koncentraacutecia

Moderneacute spektrofotometre a fluorimetre suacute konštruovaneacute tak aby na meranie bolo použiteacute minimaacutelne množstvo vzorky NK (napr pre priacutestroje NanoDrop je potrebnyacute len 05-1 microl vzorky) Pre porovnanie NanoDrop spektrofotometer (NanoDrop 2000c) je schopnyacute zmerať koncentraacutecie od 04 to 15 000 ngmicroL dsDNA NanoDrop fluorospektrometer 005 do 2000 pgmicroL Spektrofotometre a fluorofotometre suacute po meraniacute schopneacute vďaka softveacuteroveacutemu vybaveniu vypočiacutetať nielen koncentraacuteciu ale aj čistotu vzorky (httpwwwnanodropcom) Obr 4 Kvantifikaacutecia nukleovej kyseliny porovnaniacutem s fragmentom podobnej dĺžky a znaacutemej koncentraacutecie (po migraacutecii v agaroacutezovom geacuteli v jednosmernom elektrickom pruacutede a naacuteslednej fluorescenčnej detekcii) - odhad DNA v 3 draacutehe cca 100ng porovnaniacutem s 1000bp fragmentom štandardu molekulovyacutech hmotnostiacute (šmh)

10

Obr 5 Absoluacutetna kvantifikaacutecia DNA priacutestrojom real-time PCR cykleacuterom porovnaniacutem amplifikaacutecie uacuteseku DNA v skuacutemanej vzorke s amplifikaacuteciou vzorky so znaacutemou kvantitou Okrem amplifikaacutecie skuacutemanej vzorky je treba urobiť štandardnuacute krivku amplifikaacutecie vzorky znaacutemej koncentraacutecie z ktorej sa koncentraacutecia skuacutemanej vzorky odčiacuteta V kriminalistike sa bežne použiacuteva pridanie vnuacutetornej kontroly ku vzorke na určenie čistoty vzorky (v priacutetomnosti inhibiacutetorov nedocircjde k amplifikaacutecii žiadnej DNA) Vnuacutetornaacute kontrola je už priacutetomnaacute v kite čiže sa automaticky pridaacuteva pri priacuteprave vzoriek na qPCR amplifikaacuteciu sluacuteži na zistenie priacutetomnosti inhibiacutetorov v skuacutemanej vzorke teda v priacutepade že nedocircjde k amplifikaacutecii vo vzorke sluacuteži na rozliacutešenie či je koncentraacutecia DNA priacuteliš niacutezka alebo suacute vo vzorke priacutetomneacute inhibiacutetory Bežnaacute mediciacutenska molekulaacuterno-genetickaacute diagnostika nevyžaduje priacutetomnosť vnuacutetornej kontroly keďže nukleoveacute kyseliny suacute prevažne izolovaneacute kitmi z krvi čiže je zabezpečenaacute vysokaacute kvalita a čistota naizolovanej NK Obr 6 Spektrofotometer (NanoPhotometer) a ukaacutežka vyacutesledkou merania koncentraacutecie RNA izolovanej minikolonovou metoacutedou

11

3 PCR (polymeraacutezovaacute reťazovaacute reakcia)

Je metoacuteda vyvinutaacute v roku 1983 Karym Mullisom ocenenaacute v roku 1993 Nobelovou cenou za cheacutemiu Polymeraacutezovaacute reťazovaacute reakcia je založenaacute na schopnosti DNA polymeraacutezy syntetizovať noveacute vlaacutekno DNA podľa templaacutetoveacuteho vlaacutekna na zaacuteklade princiacutepu komplementarity DNA polymeraacuteza je schopnaacute pripaacutejať nukleotidy len k voľnej 3acuteOH skupine preto potrebuje primer (čiacutetaj prajmer) ku ktoreacutemu je schopnaacute pridaacutevať nukleotidy Primery suacute kraacutetke jednovlaacuteknoveacute oligonukleotidy ktoreacute umožňujuacute jednak DNA polymeraacuteze začať so synteacutezou noveacuteho vlaacutekna na druhej strane ohraničujuacute špecifickuacute oblasť ktoruacute chceme amplifikovať (namnožiť) Vyacutesledkom PCR reakcie je obrovskyacute počet koacutepii špecifickej sekvencie (obr 7) PCR v podstate napodobňuje replikaacuteciu DNA v in vitro podmienkach s rozdielom že nedochaacutedza k replikaacutecii celej DNA ale len vybraneacuteho primermi ohraničeneacuteho miesta

31 Najdocircležitejšie PCR komponenty

Templaacutetovaacute DNA je vzorka DNA obsahujuacuteca cieľovuacute sekvenciu Na začiatku reakcie docircjde pri vysokej teplote k denaturaacutecii a separaacutecii jednotlivyacutech vlaacutekien dvojvlaacuteknovej DNA

Enzyacutem DNA polymeraacuteza syntetizuje noveacute DNA vlaacutekno komplementaacuterne k cieľovej sekvencii Najčastejšie použiacutevanou a prvou DNA polymeraacutezou je Taq DNA polymeraacuteza (z termofilnej bakteacuterie Thermus aquaticus) zatiaľ čo Pfu DNA polymeraacuteza (z Pyrococcus furiosus) je preferovanaacute kvocircli tzv vysokej fidelite čo je schopnosť inkorporovať spraacutevnu baacutezu do novosyntetizovaneacuteho vlaacutekna DNA DNA polymeraacutezy musia mať dve vlastnosti schopnosť syntetizovať noveacute vlaacutekno DNA podľa templaacutetovej DNA a byť termostabilneacute čiže rezistentneacute na vysokeacute teploty (cca 100degC) V suacutečasnosti sa v laboratoacuteriaacutech často použiacutevajuacute rekombinantneacute polymeraacutezy s požadovanyacutemi vlastnosťami Napriacuteklad pre PCR ktorej produkt bude klonovanyacute je docircležiteacute použiť polymeraacutezu ktoraacute je schopnaacute opraviť vlastnuacute chybu v priacutepade inkorporaacutecie nespraacutevnej baacutezy pri synteacuteze noveacuteho reťazca Schopnosť opravovať nespraacutevne inkorporovaneacute baacutezy počas synteacutezy noveacuteho vlaacutekna DNA sa nazyacuteva tzv proofreading aktivita ktoraacute je zabezpečenaacute 3rarr5acute exonukleaacutezovou aktivitou takejto polymeraacutezy Pred vlastnou molekulaacuterno-genetickou diagnostikou je treba optimalizovať podmienky PCR reakcie pre konkreacutetnu DNA polymeraacutezu a pre špecifickeacute primery treba zistiť optimaacutelnu teplotu annealingu (hybridizaacutecie) primerov koncentraacutecie jednotlivyacutech zložiek PCR reakcie (napr MgCl2)

Primery suacute kraacutetke jednovlaacuteknoveacute DNA sekvencie komplementaacuterne k cieľovej sekvencii DNA polymeraacuteza začiacutena syntetizovať noveacute vlaacutekno z 3acutekonca primeru Docircležitou charakteristikou primerov je teplota topenia (Tm) t j teplota pri ktorej polovica DNA duplexov je disociovanaacute na jednovlaacuteknoveacute molekuly

Nukleotidy (dNTP deoxyribonukleotidtrifosfaacutety) suacute stavebneacute prvky pre novosyntetizovanuacute DNA molekulu

Veľmi praktickyacutem riešeniacutem pre molekulaacuterno-genetickeacute diagnostickeacute laboratoacuteria je tzv mastermix to je roztok v ktorom už je priacutetomneacute všetko potrebneacute pre priebeh PCR reakcie samozrejme okrem primerov a templaacutetovej DNA sekvencie PCR Master Mix (2X) od firmy ThermoFisher Scientific je jednyacutem z takyacutechto mixov obsahuje Taq DNA polymeraacutezu tlmivyacute roztok (pufor) MgCl2 a všetky deoxyribonukleotidy trifosfaacutety

Tabuľka č 1 uvaacutedza ako sa PCR reakcia z mastermixu pripravuje pre jednu vzorku Keďže v laboratoacuteriu sa zriedka robiacute PCR reakcia s jednou vzorkou treba si pripraviť tzv premix (tj PCR reakcie pre vaumlčšiacute počet vzoriek ale bez templaacutetovej DNA) ktoryacute sa rozdeliacute do mikroskuacutemaviek a až potom sa k nim pridaacute DNA resp cDNA

12

Tab 1 Priacuteprava PCR premixu

Celkovyacute objem jednej PCR reakcie 10 microl Počet vzoriek 8 2x PCR master mix 5 40

primer sense (10microM) 05 4

primer antisense (10microM) 05 4

H2O 35 28

DNA cDNA 05

rozpipetovať premix po 95microl do mikroskuacutemaviek až potom pridať do každej mikroskuacutemavky zvlaacutešť DNA cDNA

spolu objem 10 76

PCR amplif ikaacutecia je cyklickyacute proces pozostaacutevajuacuteci z troch krokov (obr 7) 1) denaturaacutecia dvojvlaacuteknovej DNA pri vysokej teplote (95degC) 2) hybridizaacutecia (annealing) primerov k špecifickej sekvencii DNA pri teplote vhodnej pre konkreacutetne primery 3) polymerizaacutecia (synteacuteza) novyacutech vlaacutekien DNA (72degC)

Obr 7 Princiacutep PCR

Tieto tri kroky sa opakujuacute 25 ndash 40 kraacutet pričom pri každom cykle sa počet molekuacutel zdvojnaacutesobiacute (vyacuteslednyacute počet cieľovej sekvencie je 2n+1 ak na začiatku bola jedna dvojvlaacuteknovaacute DNA a počet cyklov je n) PCR prebieha v termaacutelnom cykleacuteri (teplotnom cyklovači) je to priacutestroj (obr 8) kde je možneacute vykonať a naprogramovať celyacute termaacutelny priebeh PCR reakcie Tabuľka č 2 je priacutekladom termaacutelneho programu pre konkreacutetnu PCR reakciu

Po PCR reakcii je vyacuteslednyacute produkt možneacute vizualizovať elektroforeticky resp použiť na ďalšiu analyacutezu

13

Tab 2 Priacuteklad klasickeacuteho teplotneacuteho a časoveacuteho profilu PCR PCR Teplota Čas Opakovanie

95degC 2 minuacutety

95degC 15 sekuacutend

66degC 60 sekuacutend 30x

72degC 60 sekuacutend

72degC 5 minuacutet

Obr 8 Termaacutelny cykleacuter v procese a otvorenyacute s mikroskuacutemavkami

32 Variaacutecie PCR

Hot-start PCR využiacuteva DNA polymeraacutezu ktoruacute je treba aktivovať vysokou teplotou (napr 95degC 10 minuacutet) Vyacutehodou použiacutevania hot-start polymeraacutez je možnosť pracovať pri laboratoacuternej teplote keďže polymeraacuteza je pri bežnej teplote neaktiacutevna a tyacutem nemocircže docircjsť k vzniku nešpecifickyacutech produktov

Touchdown PCR maacute v počiatočnyacutech cykloch vyššiu teplotu annealingu (uacutečelom je zvyacutešiť

špecificitu PCR produktov na začiatku PCR) neskocircr sa teplota annealingu zniacuteži čo maacute za naacutesledok vyššiacute vyacuteťažok PCR produktu

Nested PCR maacute dva kroky a potrebuje dva paacutery primerov V prvom kroku sa prostredniacutectvom

prvej sady primerov amplifikuje dlhšiacute DNA fragment Ten sa použije ako templaacutet v druhom kroku s druhou sadou primerov s vyacuteslednyacutem kratšiacutem DNA produktom Nested PCR zvyšuje špecifickosť a citlivosť diagnostickyacutech PCR

Multiplex PCR je vlastne viac PCR reakciiacute prebiehajuacutecich v jednej skuacutemavke suacutečasne

V reakčnej zmesi je viac paacuterov primerov suacutečasne prebehne amplifikaacutecia viaceryacutech uacutesekov DNA takto dochaacutedza k šetreniu vzorky reakčnej zmesi a pracovneacuteho času

14

Real-time PCR je venovanaacute špeciaacutelna časť v skriptaacutech Sluacuteži na kvantifikaacuteciu PCR produktu v reaacutelnom čase na zaacuteklade merania fluorescencie okrem kvantifikaacutecie je využiacutevanaacute aj na určenie genotypov

RT-PCR je variaacutecia PCR umožňujuacuteca amplifikaacuteciu DNA sekvencie z vyacutechodiskovej RNA

sekvencie Najskocircr musiacute prebehnuacuteť prepis RNA do jednovlaacuteknovej cDNA prostredniacutectvom reverznej transkriptaacutezy naacutesledne sa cDNA použije pre PCR Selektiacutevnym použitiacutem primerov pri reverznej transkripcii mocircžeme uacutečelovo prepiacutesať buď celkovuacute RNA (primery - random hexameacutery) alebo len mRNA (primery - oligoT)

Alelovo-špecifickaacute PCR (AS-PCR) (obr 9) sluacuteži na detekciu konkreacutetnych mutaacuteciiacute

a jednonukleotidovyacutech polymorfizmov (SNP) Použije sa sada 3 primerov v dvoch kombinaacuteciaacutech PCR reakciiacute dva primery majuacute odlišnuacute sekvenciu na 3acute-koncoch jeden na detekciu wt (wild type) a druhyacute primer na detekciu mutantnej alely reakcia neprebehne ak miesto na templaacutetovej DNA nie je komplementaacuterne k 3acute-koncu primeru pretože DNA polymeraacuteza vyžaduje uacuteplnuacute hybridizaacuteciu primera na 3acute-konci Takto je možneacute rozliacutešiť priacutetomnosť štandardnej (wildtype ndash wt) a mutantnej alely resp SNP (obr 9) AS-PCR je znaacutema aj pod ďalšiacutemi naacutezvami ASO-PCR (allele-specific oligonucleotide PCR) ARMS (amplification-refractory mutation system)

Obr 9 Alelovo-špecifickaacute PCR (AS-PCR)

Mutageneacuteza prostredniacutectvom PCR (site directed mutagenesis) sa použiacuteva keď je potrebneacute vytvoriť mutaacuteciu v špecifickom mieste geacutenu primerprimery majuacute modifikovanuacute sekvenciu tak že obsahujuacute mutaacuteciu v strednej časti čo neovplyvniacute hybridizaacuteciu primerov s templaacutetovou DNA pričom vyacutesledkom je PCR produkt s cielene mutovanou DNA sekvenciou

Asymetrickaacute PCR sa použiacuteva na synteacutezu koacutepiiacute jedneacuteho vlaacutekna z templaacutetovej DNA a to

použitiacutem veľmi niacutezkej koncentraacutecie jedneacuteho primeru Sekvenačnaacute PCR je PCR v ktorej je použityacute len jeden primer a v reakčnej zmesi suacute okrem

všetkyacutech dNTP priacutetomneacute dideoxynukleotidtrifosfaacutety (ddNTP) značeneacute raacutedioaktiacutevne dnes však prevažne fluorescenčne každyacute typ ddNTP inou fluorescenčnou farbičkou Zaradenie niektoreacuteho zo štyroch ddNTP spocircsobiacute terminaacuteciu (zastavenie) predlžovania DNA reťazca fluorescenčneacute označenie ddNTP umožniacute detekciu dĺžky fragmentu a určenie sekvencie posledneacuteho nukleotidu Vyacuteslednyacute produkt sekvenačnej PCR sluacuteži na sekvenovanie Sekvenovaniu sa venuje samostatnaacute časť

MLPA (multiplex ligation-dependent probe amplification) ndash multiplexnaacute amplifikaacutecia proacuteb zaacutevislaacute od ligaacutecie je variaacutecia multiplexnej PCR umožňujuacuteca namnoženie viaceryacutech uacutesekov DNA za použitia iba jedneacuteho paacuteru primerov avšak s podmienkou vytvorenia sekvenčne špecifickej proacuteby ligaacuteciou sekvenčne špecifickyacutech oligonukleotidov MLPA je metoacuteda umožňujuacuteca detekciu počtu koacutepiiacute

15

až 50 nukleotidovyacutech sekvenciiacute v jednej reakcii Pomocou MLPA je možneacute ryacutechlo identifikovať amplifikaacutecie a deleacutecie veľkeacuteho počtu geacutenov či už z DNA alebo mRNA okrem toho MLPA mocircže byť použitaacute na analyacutezu CpG-metylaacutecie (MS-MLPA) Viac informaacutecii v samostatnej časti

SNaPshotreg Multiplex nazyacutevaneacute aj minisekvenovanie je multiplexnaacute reakcia v ktorej je každyacute primer predĺženyacute iba o jeden nukleotid (obr 10) V reakčnej zmesi nie suacute priacutetomneacute deoxyribonukleotidtrifosfaacutety ale len dideoxyribonukleotidtrifosfaacutety (ddATP ddCTP ddGTP ddTTP) každyacute označenyacute inou fluorescenčnou farbičkou Po integraacutecii ddNTP do DNA vlaacutekna je polymerizaacutecia ukončenaacute Jednovlaacuteknoveacute fragmenty (primery) predĺženeacute presne o jeden ddNTP suacute separovaneacute kapilaacuternou elektroforeacutezou v genetickom analyzaacutetore pričom je detegovanaacute ich fluorescencia a dĺžka (obr 11) Z vyacutesledneacuteho elektroforetogramu (obr 12) je možneacute určiť v jednej reakcii sekvenciu vo viac ako v 10 lokalitaacutech určiteacuteho fragmentu DNA SNaPshot Multiplex sa v molekulaacuterno-genetickom laboratoacuteriu využiacuteva na ryacutechlu detekciu viaceryacutech najčastejšie sa vyskytujuacutecich mutaacuteciiSNP geacutenu

Obr 10 Priacuteklad využitia metoacutedy SnaPshot s použitiacutem sady 13 primerov ktoreacute sa predĺžia len o 1 značenyacute dideoxynukleotid SNaPshot najčastejšiacutech mutaacuteciiacute geacutenu pre 21-hydroxylaacutezu (CYP21A2) ktoreacute spocircsobujuacute kongenitaacutelnu adrenaacutelnu hyperplaacuteziu A T G a C predstavujuacute fluorescenčne značeneacute dideoxynukleotidy

Obr 11 Vyacutesledok analyacutezy DNA pacienta metoacutedou minisekvenovania SnaPshot konkreacutetne použitiacutem sady 13 primerov rozlišujuacutecich najčastejšie bodoveacute mutaacutecie geacutenu pre 21-hydroxylaacutezu (CYP21A2) analyacutezou sa zistila mutaacutecia V281L v heterozygotnom stave (dva fragmenty modryacute a červenyacute)

16

Obr 12 SNaPshot analyacuteza geacutenu CYP21A2 u DNA izolovanej z plodovej vody metoacuteda deteguje najčastejšie bodoveacute mutaacutecie geacutenu pre 21-hydroxylaacutezu vyacutesledok prenataacutelnej analyacutezy = priacutetomnosť mutaacutecie In2G v hemizygotnom stave (keďže qPCR metoacutedou bola u plodu zistenaacute priacutetomnosť len jednej koacutepie geacutenu CYP21A2)

33 Kvantitatiacutevna PCR (qPCR)

Polymeraacutezovou reťazovou reakciou (PCR) docielime namnoženie (amplifikaacuteciu) určiteacuteho DNA uacuteseku (templaacutetu) PCR je katalyzovanaacute DNA polymeraacutezou za priacutetomnosti primerov dNTPs dvojmocnyacutech katioacutenov (ako Mg+2) a pufrovacieho roztoku

Real-time PCR ktoraacute je nazyacutevanaacute aj kvantitatiacutevna PCR (qPCR) umožňuje vizualizaacuteciu a kvantifikaacuteciu amplifikaacutecie DNA v reaacutelnom čase to je tak ako to bežiacute počas PCR qPCR využiacuteva fluorescenčneacute chemikaacutelie (farbivaacute) ktoryacutech emitovanuacute fluorescenciu zaznamenaacuteva optickyacute systeacutem počas každeacuteho PCR cyklu zaznamenanaacute fluorescencia je naacutesledne softveacuterovo spracovanaacute a vyhodnotenaacute

V suacutečasnosti sa využiacutevajuacute dva typy qPCR cheacutemie a to farbivaacute viažuce sa na DNA a fluorescenčne značeneacute proacuteby (obr 13)

Farbivaacute viažuce sa na DNA emitujuacute fluorescenciu v priacutepade ak suacute naviazaneacute na dvojvlaacuteknovuacute DNA proacuteby fluoreskujuacute v priacutepade keď molekula zhaacutešača (angl quencher - Q) sa nenachaacutedza v bliacutezkosti molekuly reporteacutera (R) napr hydrolyzujuacutece proacuteby fluoreskujuacute keď je molekula reporteacutera (R) prostredniacutectvom 5acuteexonukleaacutezovej aktivity DNA polymeraacutezy odstraacutenenaacute z bliacutezkosti molekuly zhaacutešača (Q)

Grafickyacute priebeh real ndash time PCR znaacutezorňuje amplifika čnaacute krivka (angl amplification plot) (obr 14) majuacuteca 4 faacutezy 1) Faacuteza I ndash dochaacutedza k zdvojnaacutesobeniu množstva amplikoacutenu po každom cykle ale naacuterast fluorescencie je pod detekčnyacutem limitom zaznamenaacutevanaacute fluorescencia (baseline) zodpovedaacute zaacutekladnej fluorescencii pozadia tzv šumu

17

2) Faacuteza II nazyacutevanaacute aj exponenciaacutelna faacuteza v ktorej sa fluorescencia zvyacuteši na uacuteroveň optickej detekcie bod resp cyklus kedy začiacutena exponenciaacutelna faacuteza je kľuacutečovyacute na určenie kvantity vstupneacuteho množstva templaacutetovej DNA nazyacuteva sa prahovyacute cyklus označuje sa Ct (angl treshold cycle) alebo Cq (quantification) Čiacutem nižšie je Ct (Cq) tyacutem vaumlčšiacute počet koacutepiiacute templaacutetovej DNA bolo v reakcii Ct hodnota je teda hlavnyacute uacutedaj s ktoryacutem sa pracuje vo vyacutepočtoch fluorescencia v tomto mieste sa nazyacuteva prahovaacute resp treshold 3) Faacuteza III - lineaacuterna faacuteza ndash charakterizuje ju postupneacute spotrebovaacutevanie komponentov reakcie na narastajuacutece množstvo amplikoacutenu 4) Faacuteza IV - plateau (čiacutetaj platoacute) ndash množstvo amplikoacutenu sa v docircsledku vyčerpania zložiek qPCR už nezvyšuje

Obr 13 Princiacutep real-time PCR Obr 14 Faacutezy real-time PCR

Ako štandardnaacute PCR aj qPCR maacute tri zaacutekladneacute kroky 1) Denaturaacutecia dvojvlaacuteknovej DNA na jednovlaacuteknovuacute DNA pri vysokej teplote (obyčajne 95degC) 2) Hybridizaacutecia primerov (annealing) ndash komplementaacuterne sekvencie sa spolu hybridizujuacute 3) Polymerizaacutecia pri 70-72degC kedy v docircsledku optimaacutelnej aktivity DNA polymeraacutezy dochaacutedza k predĺženiu primeru až o 100 baacutez za sekundu

18

Real-time PCR (obr 15) sa využiacuteva na kvantifikaacuteciu expresie geacutenov určenie počtu koacutepiiacute geacutenov určenie genotypu (genotypovanie) alelovou diskriminaacuteciou alebo analyacutezou krivky topenia tzv high resolution melt a multiplexnuacute real time PCR s možnosťou detekcie viaceryacutech cieľovgeacutenov

Multiplexnaacute real-time PCR sa využiacuteva na detekciu viaceryacutech cieľovgeacutenov v jednej reakcii suacutečasne Vyacutehodou multiplexovania je jednak uacutespora vzorky ako aj ziacuteskanie vaumlčšieho množstva informaacuteciiacute z rovnakeacuteho množstva materiaacutelu Nevyhnutnosťou multiplexnej qPCR suacute proacuteby značeneacute rocircznymi fluorescenčnyacutemi farbivami

Najdocircležitejšie zložky qPCR (real-time PCR komponenty) suacute DNA polymeraacuteza (reverznaacute transkriptaacuteza v priacutepade jednokrokovej kvantitatiacutevnej RT-PCT) dNTPs primery resp primeryproacuteby dvojmocneacute Mg templaacutet Na uľahčenie qPCR suacute v suacutečasnosti už komerčne dostupneacute takeacute reakčneacute zmesi ku ktoryacutem stačiacute pridať už len templaacutet (napr kity využiacutevajuacutece TaqManProacuteby) alebo kity s fluorescenčnyacutemi farbami viažucimi sa na dvojvlaacuteknovuacute DNA ku ktoryacutem sa do reakčnej zmesi okrem templaacutetu pridajuacute primery

Obr 15 Real-time PCR cykleacuter

331 Kvantifikaacutecia pomocou qPCR

Na kvantifikaacuteciu DNA pomocou qPCR sa požiacutevajuacute dve zaacutekladneacute metoacutedy - absoluacutetna kvantifikaacutecia a relatiacutevna kvantifikaacutecia

Absoluacutetna kvantifikaacutecia vychaacutedza zo štandardnej krivky (obr 16) ktoraacute sa ziacuteska po qPCR seacuterie riedeniacute DNA znaacutemej koncentraacutecie Kvantifikaacutecia neznaacutemej vzorky sa zistiacute interpolaacuteciou (odčiacutetaniacutem) Ct neznaacutemej vzorky zo štandardnej krivky (obr 16 17) Využiacutevaneacute napr v kriminalistike na stanovenie koncentraacutecie DNA vo vzorke

Relatiacutevna kvantifikaacutecia (obr 18 19) porovnaacuteva uacuteroveň expresie určiteacuteho geacutenu vo vzorke k expresii toho isteacuteho geacutenu v referenčnej (kontrolnej) vzorke alebo množstvo určiteacuteho geacutenu (počet koacutepiiacute) vo vzorke porovnaniacutem s množstvom geacutenu v kontrolnyacutech vzorkaacutech V raacutemci každej vzorky musiacute pred relatiacutevnou kvantifikaacuteciou docircjsť k tzv normalizaacutecii t j porovnanie expresie sledovaneacuteho geacutenu k expresii referenčneacuteho geacutenu (najčastejšie niacutem byacuteva tzv bdquohousekeepingldquo geacuten napr GAPDH aktiacuten tubuliacuten)

V priacutepade kvantifikaacutecie expresie určiteacuteho geacutenu metoacutedou real-time PCR (RT-qPCR) pred samotnou kvantifikaacuteciou cDNA musiacute byť taacuteto cDNA nasyntetizovanaacute prostredniacutectvom reverznej

19

transkripcie za použitia enzyacutemu reverznej transkriptaacutezy Kvantitatiacutevna PCR s reverznou transkripciou RT-qPCR mocircže byť dvojkrokovaacute alebo jednokrokovaacute Pri dvojkrokovej RT-qPCR treba pred qPCR syntetizovať cDNA vlaacutekno z RNA pomocou reverznej transkriptaacutezy - 1 krok druhyacutem krokom je samotnaacute real-time PCR Jednokrokovaacute RT-qPCR umožňuje uskutočniť obidve reakcie reverznuacute transkripciu a kvantitatiacutevnu PCR v jednej skuacutemavke čo zjednodušuje qPCR a redukuje možnosť kontaminaacutecie Obr 16 5-bodovaacute štandardnaacute krivka (amplifikaacutecia piatich koncentraacuteciiacute jednej vzorky konkreacutetne ide o 10-tkoveacute riedenie)

Obr 17 Ukaacutežka amplifikačnyacutech kriviek riedenia a z nich ziacuteskanej štandardnej krivky poukazuje na vysokuacute presnosť metoacutedy RT-PCR

20

Obr 18 Relatiacutevna kvantifikaacutecia - určenie počtu koacutepiiacute geacutenu CYP21A2 vo vzorke DNA izolovanej z perifeacuternej krvi pacientov mutaacutecie v geacutene CYP21A2 spocircsobujuacute kongenitaacutelnu adrenaacutelnu hyperplaacuteziu (CAH) Vyacutesledok analyacutezy všetci pacienti majuacute dve koacutepie geacutenu

Obr 19 Relatiacutevna kvantifikaacutecia - určenie počtu koacutepiiacute geacutenu CYP21A2 vo vzorke DNA izolovanej z plodovej vody mutaacutecie v geacutene CYP21A2 spocircsobujuacute kongenitaacutelnu adrenaacutelnu hyperplaacuteziu (CAH) Prenaacutetalnou diagnostikou (qPCR) sa zistila priacutetomnost jednej koacutepie CYP21A2 geacutenu 332 Určenie genotypu metoacutedou alelovej diskriminaacutecie a analyacutezou krivky topenia (HRM)

Určenie genotypu metoacutedou alelovej diskriminaacutecie (obr 20) sa uskutočňuje použitiacutem hydrolyzujuacutecich proacuteb (sond) je veľmi ryacutechla a senzitiacutevna (presnaacute) metoacuteda frekventovane využiacutevanaacute v laboratoacuteriaacutech Dva variantyalely suacute vyšetreneacute suacutečasne v jednej vzorke a v jednej reakčnej

21

skuacutemavke V reakcii suacute použiteacute dve proacuteby označeneacute rozdielnymi fluorescenčnyacutemi farbičkami emitujuacutecimi svetlo o rocircznej vlnovej dĺžke (najčastejšie jedna označenaacute FAM farbičkou a druhaacute proacuteba označenaacute VIC farbičkou) Počas amplifikaacutecie amplikoacutenu dochaacutedza k odstraacuteneniu zhaacutešača z bliacutezkosti farbičky ktoraacute potom emituje svetlo priacuteslušnej vlnovej dĺžky Vzorky so signaacutelom len jednej fluorescenčnej farbičky (FAM) a bez signaacutelu druhej farbičky (VIC) suacute homozygoti pre alelu 1 vzorky so signaacutelom len druhej farbičky (VIC) a bez signaacutelu prvej (FAM) suacute homozygoti pre alelu 2 v priacutepade ak vyšetrovanaacute vzorka bdquosvietildquo obidvoma farbami jednaacute sa o heterozygota

Obr 20 Určenie genotypu metoacutedou alelovej diskriminaacutecie ndash amplifikačnaacute krivka vzoriek DNA majuacutecich tri rocirczne genotypy A ndash jednotliveacute vzorky (plnaacute čiara predstavuje štandardnuacute alelu guličkovanaacute mutovanuacute alelu) B ndash 72 vzoriek C ndash scatter plot 72 vzoriek

Určenie genotypu analyacutezou krivky topenia tzv high resolution melt (HRM) (obr 21) umožňuje detekciu takmer všetkyacutech genetickyacutech variaacuteciiacute (SNP mutaacuteciiacute) Keďže taacuteto metoacuteda okrem štandardnyacutech podmienok reakcie vyžaduje len primery a farbičku (nie proacuteby) je veľmi jednoduchaacute a lacnejšia Po amplifikaacuteciiacute treba amplikoacuten pomaly zohrievať až kyacutem nedocircjde k denaturaacuteciiacute Teplota topenia amplikoacutenu vo vzorke zaacutevisiacute od DNA sekvencie čo umožňuje detegovať priacutetomnosť mutaacutecie resp SNP Tvar vyacuteslednyacutech kriviek topenia určuje teda genotyp

22

Obr 21 Určenie genotypu analyacutezou krivky topenia tzv metoacutedou high resolution melting (HRM) A ndash krivka topenia vzoriek DNA majuacutecich tri rocirczne genotypy B ndash graf rozdielnosti krivky topenia vzoriek DNA majuacutecich tri rocirczne genotypy

23

4 Elektroforetickaacute separaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten

Separaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten predstavuje rozdelenie molekuacutel DNA alebo RNA na zaacuteklade veľkosti zloženia a poradia baacutez Podobnyacutemi metoacutedami je možneacute separovať aj proteiacuteny

Elektroforeacuteza (ELFO) je technika použiacutevanaacute na separaacuteciu niekedy aj purifikaacuteciu makromolekuacutel ako suacute nukleoveacute kyseliny a proteiacuteny na zaacuteklade ich rozdielnej veľkosti naacuteboja alebo konformaacutecie Je to metoacuteda veľmi často využiacutevanaacute nielen v molekulovej genetike ale aj biocheacutemii Elektroforeacuteza využiacuteva schopnosť nabityacutech molekuacutel migrovať v jednosmernom elektrickom poli k opačneacutemu poacutelu Nukleoveacute kyseliny majuacute vďaka svojej fosfaacutetovej zložke negatiacutevny naacuteboj preto v jednosmernom elektrickom poli migrujuacute ku kladneacutemu poacutelu čiže k anoacutede Elektroforeacuteza prebieha v elektroforetickej aparatuacutere v geacuteloch (v nosiči) so sieťovitou štruktuacuterou ktoraacute umožňuje separaacuteciu molekuacutel Vzorka nukleovej kyseliny zmiešanaacute s tzv nanaacutešaciacutem tlmivyacutem roztokom s farbičkou sa nanesie do jamky v geacuteli ktoryacute je umiestnenyacute v elektroforetickej aparatuacutere v priacutetomnosti elektroforetickeacuteho pufra (TAE alebo TBE) (obr 22) Nanaacutešaciacute tlmivyacute roztoknanaacutešacia farbička umožňuje na zaacuteklade migraacutecie farbičky vidieť migraacuteciu vzorky v geacuteli a suacutečasne zvyacutešeniacutem hustoty vo vzorke umožniacute klesnuacuteť vzorke do jamky a tak zabraacuteniť jej vyplaveniu z geacutelu Draacuteha je časť geacutelu ktoryacutem putuje jedna vzorka od katoacutedy k anoacutede V draacutehe sa nachaacutedzajuacute oddeleneacute jednotliveacute fragmenty nukleovyacutech kyseliacuten určityacutech veľkostiacute viditeľneacute vo forme pruacutežkov (angl bands) Intenzita pruacutežku zaacutevisiacute od množstva molekuacutel danej veľkosti je ekvivalentnaacute hmotnosti Na určenie veľkosti fragmentov NK sa do jednej jamky nanesie štandard molekulovyacutech hmotnostiacute (angl ladder) ktoryacute maacute presne definovaneacute veľkosti fragmentov čo umožňuje odhadnuacuteť veľkosť aj hmotnosť neznaacutemych separovanyacutech fragmentov

Obr 22 Elektroforetickaacute separaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten v agaroacutezovom geacuteli (A) a vizualizaacutecia UV svetlom a GelRedtrade (B C)

24

Nukleoveacute kyseliny je možneacute elektroforeticky separovať 1) v geacuteloch agaroacutezovom (horizontaacutelna elektroforeacuteza) (obr 22) a polyakrylamidovom (vertikaacutelna elektroforeacuteza) 2) v špeciaacutelnych lineaacuternych polymeacuteroch kapilaacuternou elektroforeacutezou použitiacutem genetickeacuteho analyzaacutetora (obr 23)

Agaroacuteza je polysacharid ziacuteskanyacute z morskej riasy použiacuteva sa najčastejšie v koncentraacuteciiacute 05-2 čiacutem vyššia koncentraacutecia tyacutem je geacutel pevnejšiacute a schopnejšiacute rozliacutešiť menšie fragmenty NK Priacuteprava je jednoduchaacute odvaacuteži sa potrebneacute množstvo agaroacutezy ktoraacute sa zmieša s tlmivyacutem roztokom (pufrom) rozvariacute sa v mikrovlnnej ruacutere a naleje sa do špeciaacutelnej naacutedoby na vytvaacuteranie geacutelov kyacutem je geacutel tekutyacute vložiacute sa do neho tzv hrebeň na vytvorenie jamiek Agaroacuteza je netoxickaacute V bežnom agaroacutezovom geacuteli v zaacutevislosti od jeho koncentraacutecie je možneacute separovať DNA fragmenty dĺžky 200-50 000 bp Dnes suacute dostupneacute aj špeciaacutelne agaroacutezy napr MetaPhorreg Agarose schopneacute oddeliť fragment DNA dĺžky 20-800bp Separaacutecia v agaroacutezovom geacuteli prebieha v horizontaacutelnej aparatuacutere preto sa nazyacuteva aj horizontaacutelna elektroforeacuteza

Polyakrylamidovyacute geacutel (PAGE) vznikaacute polymerizaacuteciou akrylamidu v priacutetomnosti špeciaacutelnych chemickyacutech laacutetok (peroxodisiacuteran amoacutenny TEMED bisakrylamid) Jeho priacuteprava je preto odlišnaacute a aj naacuteročnejšia Polyakrylamidoveacute geacutely majuacute vysokuacute rozlišovaciu schopnosť (1bp) preto suacute PAGE geacutely vhodneacute aj na sekvenovanie DNA klasickyacutemi metoacutedami PAGE geacutel nie je vhodnyacute na separaacuteciu fragmentov dlhšiacutech ako 2kb Použiacuteva sa v koncentraacutecii 35 -20 s rozliacutešeniacutem fragmentov od 10bp-2000bp Akrylamid je neurotoxiacuten musiacute sa s niacutem pracovať veľmi opatrne PAGE elektroforeacuteza bežiacute vo vertikaacutelnej aparatuacutere preto sa volaacute aj vertikaacutelna elektroforeacuteza použiacuteva sa často aj na separaacuteciu proteiacutenov

Ryacutechlosť pohybu nukleovyacutech kyseliacuten (mobilita) určuje viacero faktorov 1) veľkosť NK ndash počet baacutezovyacutech paacuterov resp baacutez pričom menšie molekuly prechaacutedzajuacute geacutelom ryacutechlejšie pretože sa ľahšie pohybujuacute v geacuteli 2) konformaacutecia nukleovej kyseliny napr u rovnako veľkyacutech plazmidov kondenzovaneacute superšpiralizovaneacute plazmidy migrujuacute najryacutechlejšie rovnako veľkeacute lineaacuterne molekuly (toho isteacuteho plazmidu) bežia pomalšie a najpomalšie putujuacute relaxovaneacute kruhoveacute molekuly plazmidu 3) koncentraacutecia geacutelu určuje jeho rozlišovaciu schopnosť koncentrovanejšiacute geacutel je schopnyacute separovať kratšie fragmenty NK redšie geacutely suacute vhodneacute pre rozliacutešenie vaumlčšiacutech fragmentov 4) zloženie geacutelu je docircležiteacute pri analyacuteze sekundaacuternych štruktuacuter NK a proteiacutenov v nedenaturovanom stave sekundaacuterna štruktuacutera spomaľuje migraacuteciu NK a proteiacutenov Tento fakt využiacutevajuacute niektoreacute diagnostickeacute techniky (napr SSCP - Single Strand Conformation Polymorphism - polymorfismus konformaacutecie jednovlaacuteknovej DNA) umožňujuacutece detekciu zaacutemeny jedinej baacutezy ktoraacute spocircsobiacute odlišneacute vnuacutetromolekuloveacute paacuterovanie a vyacuteslednuacute konformaacuteciu molekuly Geacutely mocircžu teda byť denaturačneacute a nedenaturačneacute (natiacutevne) 5) napaumltie zdroja - čiacutem vyššie je napaumltie ktoreacute vytvaacutera elektrickeacute pole v elektroforetickej aparatuacutere tyacutem ryacutechlejšie fragmenty NK migrujuacute 6) zloženie roztokov a teploty

Elektroforetickyacute tlmivyacute roztok (pufor - elektrolyt) zabezpečuje stabilneacute elektroforetickeacute podmienky počas separaacutecie geacutel je v ňom ponorenyacute Obsahuje ioacuteny čo umožňuje vedenie elektrickeacuteho pruacutedu

Štandard molekulovyacutech hmotnostiacute (v laboratoacuteriaacutech nazyacutevanyacute ladder alebo marker) je zmes fragmentov DNA alebo RNA s presne definovanou veľkosťou ktoryacute sluacuteži na odhad veľkosti vyšetrovanyacutech fragmentov NK (obr 22) Pomocou špeciaacutelnych štandardov molekulovyacutech hmotnostiacute ktoryacutech fragmenty NK majuacute definovanuacute aj hmotnosť je možneacute odhadnuacuteť množstvo (hmotnosť - koncentraacuteciu) neznaacutemeho fragmentu

B C

25

41 Vizualizaacutecia DNA

Samotnaacute nukleovaacute kyselina je počas elektroforetickej separaacutecie neviditeľnaacute Vizualizaacuteciu NK umožňujuacute interkalačneacute činidlaacute ktoreacute suacute schopneacute naviazať sa na molekuly NK tyacutem že sa včlenia medzi susediace baacutezy Po ožiareniacute UV svetlom interkalačneacute činidlaacute naviazaneacute na NK fluoreskujuacute tak sa vizualizuje NK čiacutem intenziacutevnejšie fluoreskuje tyacutem viac NK je v geacutelipruacutežku priacutetomneacute Interkalačneacute činidlo sa buď primieša do geacutelu pri jeho priacuteprave čo umožniacute sledovať migraacuteciu fragmentov NK počas elektroforeacutezy a to po vybratiacute z ELFO aparatuacutery a po ožiareniacute UV svetlom alebo sa geacutel farbiacute po elektroforetickej separaacutecii V minulosti bol na zviditeľnenie NK najčastejšie použiacutevanyacute etidiumbromid kvocircli jeho mutageacutennym vlastnostiam sa v suacutečasnosti nahraacutedza menej mutageacutennymi a netoxickyacutemi činidlami ako suacute napr komerčne dostupneacute SYBRregSafe GelRedtrade GelGreentrade

Kapilaacuterna elektroforeacuteza NK prebieha v špeciaacutelnom priacutestroji genetickom analyzaacutetore (obr 23) ktoryacute musiacute mať zaacutekladneacute komponenty ako suacute elektroacutedy kapilaacutera zdroj vysokeacuteho napaumltia detektor prepojenie s počiacutetačom a softveacuteroveacute vybavenie priestor na vloženie vzoriek atď Genetickyacute analyzaacutetor predstavuje automatizovanyacute systeacutem umožňujuacuteci sekvenovanie určovanie dĺžky DNA fragmentov ndash fragmentačnuacute analyacutezu a kvantifikaacuteciu nukleovyacutech kyseliacuten V novšiacutech typoch genetickeacuteho analyzaacutetora je proces analyacutezy od vloženia vzoriek do stojana automatizovanyacute

Vzorka určenaacute na analyacutezu je elektrokineticky injektovanaacute do tenkej kapilaacutery naplnenej lineaacuternym polymeacuterom Vplyvom vysokeacuteho napaumltia sa negatiacutevne nabiteacute fragmenty DNA pohybujuacute v polymeacuteri k pozitiacutevne nabitej elektroacutede Kapilaacuterna elektroforeacuteza je tak citlivaacute že je schopnaacute detegovať jednobaacutezovyacute rozdiel DNA fragmentov DNA fragmenty musia byť pred kapilaacuternou elektroforeacutezou fluorescenčne označeneacute v kapilaacutere suacute separovaneacute na zaacuteklade veľkosti Kraacutetko pred dosiahnutiacutem kladne nabitej elektroacutedy docircjde po excitaacutecii laserovyacutem žiareniacutem k emisii žiarenia fluoroformi (farbičkami) tak že optickyacute detekčnyacute systeacutem zaznamenaacute fluorescenciu ktoraacute je naacutesledne softveacuterovo spracovanaacute a vyhodnotenaacute

Obr 23 Genetickyacute analyzaacutetor

42 RFLP

Metoacuteda polymorfizmu dĺžky restrik čnyacutech fragmentov (angl Restriction Fragment Length Polymorfism) bola prvou metoacutedou využiacutevanou na detekciu DNA variaacuteciiacute rocircznych biologickyacutech vzoriek Princiacutep metoacutedy spočiacuteva v priacutetomnosti polymorfizmov v DNA sekvencii rocircznych ľudiacute ktoreacute zapriacutečinia rozdielny profil (obrazec) DNA fragmentov po štiepeniacute jednou alebo viaceryacutemi restrikčnyacutemi endonukleaacutezami Restrikčneacute endonukleaacutezy (RE) suacute enzyacutemy ktoreacute štiepia DNA molekulu v oblasti špecifickej nukleotidovej sekvencie nazyacutevanej restrik čneacute miesto RE najčastejšie rozpoznaacutevajuacute a štiepia miesto veľkeacute 4-6 baacutez RE suacute priacutetomneacute u prokaryotov (bakteacuterie a archebakteacuterie) kde suacute suacutečasťou restrik čno-modifikačneacuteho systeacutemu akoby prokaryotickeacutej vrodenej imunity sluacutežia

26

na ochranu pred cudzou DNA (napr viacuterusovou) ktoruacute po rozpoznaniacute špecifickej sekvencie štiepia

Restrikčno-modifikačnyacute systeacutem maacute dve zložky 1) modifikačneacute enzyacutemy - metylaacutezy ktoreacute procesom metylaacutecie modifikujuacute určiteacute baacutezy svojej DNA čiacutem ich označia za vlastnuacute DNA takže takaacuteto DNA je potom rezistentnaacute voči štiepeniu restrikčnyacutemi endonukleaacutezami Najčastejšiacutem spocircsobom metylaacutecie u bakteacuteriiacute je metylaacutecia adeniacutenu na N6 pričom vznikne metyladeniacuten alebo cytoziacutenu na C5 metylcytoziacuten 2) restrikčneacute endonukleaacutezy štiepia špecifickeacute miesto dvojvlaacuteknovej DNA ktoreacute je tvoreneacute symetrickou sekvenciou zrkadlovo sa opakujuacutecich nukleotidov ndash tzv palindroacutem Restrikčneacute enzyacutemy sa použiacutevajuacute na štiepenie DNA sekvencie na mieste špecifickom pre tuacute ktoruacute restrikčnuacute endonukleaacutezu napr pri analyacuteze polymorfizmov dĺžky restrikčnyacutech fragmentov (RFLP) analyacuteze jednonukleotidovyacutech polymorfizmov (SNP) mutaacuteciiacute ako aj pri klonovaniacute DNA do vhodnyacutech vektorovyacutech DNA molekuacutel

Po štiepeniacute dvojvlaacuteknovej DNA restrikčnou endonukleaacutezou mocircžu vzniknuacuteť tri typy koncov - 5´-prečnievajuacutece konce (lepiveacute) 3´-prečnievajuacutece konce (lepiveacute) a tupeacute konce (obr 24)

Obr 24 Restrikčneacute štiepenie zanechaacutevajuacutece rocirczne konce tupeacute a lepiveacute

Restrikčneacute štiepenie je často použiacutevanou metoacutedou geacutenovyacutech manipulaacuteciiacute na konštrukciu

hybridnyacutech molekuacutel DNA s naacuteslednyacutem klonovaniacutem Priebeh RFLP analyacutezy je nasledovnyacute restrikčnaacute endonukleaacuteza sa pridaacute k DNA a zmes sa vo

vhodnyacutech reakčnyacutech podmienkach (pufor teplota) inkubuje niekoľko hodiacuten Počas inkubaacutecie docircjde k štiepeniu DNA na špecifickyacutech miestach DNA je potom elektroforeticky separovanaacute v geacuteli a naacutesledne vizualizovanaacute V minulosti po geacutelovej elektroforeacuteze nasledoval Southern blot (čiže prenos separovanyacutech fragmentov DNA z geacutelu na špeciaacutelnu membraacutenu) (obr 35) po ktorom nastala vizualizaacutecia raacutedioaktiacutevne značenou proacutebou V suacutečasnosti sa kvocircli praacutecnosti a zdravotnyacutem rizikaacutem od Southern blotu upuacutešťa a prechaacutedza sa na ryacutechlejšie menej praacutecne a zdravotne šetrnejšie metoacutedy priateľskejšie aj k životneacutemu prostrediu

RFLP bola prvou metoacutedou použiacutevanou na zistenie DNA profilu (DNA fingerprinting) mapovanie geacutenov zapriacutečiňujuacutece genetickeacute ochorenia a testovanie otcovstva Vaumlčšina RFLP markerov je vysoko lokusovo špecifickyacutech a kodominantnyacutech (obidve alely suacute detekovaneacute u heterozygota)

PCR-RFLP je laboratoacuterne priacutestupnejšia metoacuteda molekulaacuterno-genetickej diagnostiky keďže PCR umožňuje amplifikaacuteciu veľmi malyacutech množstiev DNA Alternatiacutevny naacutezov použiacutevanyacute v literatuacutere je CAPS z angl Cleaved Amplified Polymorphic Sequence assay Použitiacutem špecifickyacutech primerov docircjde PCR metoacutedou k amplifikaacutecii požadovaneacuteho uacuteseku DNA ten sa potom štiepi restrikčnou endonukleaacutezou vo vhodnyacutech podmienkach naacutesledne sa štiepne produkty elektroforeticky separujuacute a vizualizujuacute použitiacutem interkalačnyacutech farbiacutev a UV svetla (obr 25)

27

Obr 25 Princiacutep metoacutedy PCR-RFLP

43 VNTR a STR V geacutenome suacute priacutetomneacute dva typy tandemovyacutech (za sebou nasledujuacutecich) opakovaniacute

1) minisatelity ndash nazyacutevaneacute variabilnyacute počet tandemovyacutech opakovaniacute VNTR (variable number of tandem repeats) 2) mikrosatelity tiež kraacutetke tandemoveacute repetiacutecie STR (short tandem repeats)

Obidva tieto typy satelitnej DNA suacute rozmiestneneacute po celom genoacuteme suacute využiacutevaneacute hlavne vo forenznej genetike na identifikaacuteciu osocircb a určenie otcovstva popriacutepade materstva ale aj v mediciacutene na detekciu chromozoacutemovyacutech aneuploidiiacute Štruktuacutera obidvoch je podobnaacute Rozdiel medzi jednotlivyacutemi alelami je spocircsobenyacute rozdielnym počtom opakovaniacute opakujuacutecej sa sekvencie (motiacutevu) čo spocircsobiacute rocircznu dĺžku alel s rocircznym počtom tandemovyacutech opakovaniacute nazyacutevanuacute polymorfizmus dĺžky fragmentov

VNTR ndash variabilnyacute počet tandemovyacutech opakovaniacute pričom opakujuacuteca sa sekvencia maacute dĺžku od 6 do 100 baacutez pričom sa mocircže opakovať aj tisiacutece kraacutet alely tak mocircžu mať od 500do 30 000 baacutez VNTR boli v kombinaacutecii s RFLP (DNA fingerprinting ) prvyacutem polymorfizmom použiacutevanyacutem na zistenie DNA profilov a identifikaacuteciu osocircb v kriminalistickej praxi V suacutečasnosti jeho využitie v kriminalistike je kvocircli potrebe relatiacutevne veľkeacuteho množstva DNA nahradeneacute využitiacutem STR

STR - kraacutetke tandemoveacute repetiacutecie suacute v kriminalistike najčastejšie použiacutevanyacutem polymorfizmom STR lokusy suacute rozmiestneneacute po celom genoacuteme repetiacutecia obsahuje jednu až šesť baacutez pričom jej opakovaniacutem vznikne STR v rozsahu od 50 do 300bp V našom genoacuteme suacute tisiacutece STR ktoreacute mocircžu byť použiteacute pre forenznuacute analyacutezu V kriminalistike sa v suacutečasnosti na identifikaacuteciu osocircb použiacuteva 13 STR locusov ktoreacute patria k medzinaacuterodne uznaacutevanyacutem štandardom Z iniciatiacutevy FBI bola vytvorenaacute databaacuteza CODIS (Combined DNA Index System) každaacute krajina maacute svoju databaacutezu CODIS kde je možneacute vložiť a archivovať DNA profily jednotlivcov ako aj profily DNA ziacuteskanyacutech z miest kriminaacutelneho činu v databaacuteze je ich možneacute navzaacutejom porovnať a tak zistiť pocircvodcu trestneacuteho činu Medzinaacuterodnaacute jednotnosť v použiacutevaniacute CODIS STR lokusov umožňuje v priacutepade potreby vzaacutejomneacute porovnanie DNA profilov zistenyacutech na uacutezemiacute rocircznych štaacutetov CODIS STR lokusov je 13 a suacute to CSF1PO FGA TH01 TPOX VWA D3S1358 D5S818 D7S820 D8S1179 D13S317 D16S539 D18S51 a D21S11 Zistenie DNA profilu sa uskutočniacute multiplexnou PCR reakciou s fluorescenčne značenyacutemi primermi špecifickyacutemi pre konkreacutetny STR Naacutesledne suacute PCR produkty analyzovaneacute kapilaacuternou elektroforeacutezou genetickyacutem analyzaacutetorom ktoryacute rozliacuteši amplifikovaneacute fragmenty na zaacuteklade fluorescencie a dĺžky (fragmentačnaacute analyacuteza) (obr 26 Tab 3) DNA profil každeacuteho človeka je jedinečnyacute rovnakyacute profil mocircžu mať len jednovaječneacute dvojčataacute

28

Obr 26 Ukaacutežka DNA profilu človeka 15 STR lokusov s určeniacutem pohlavia pomocou lokusu pre amelogeniacuten (ženskeacute pohlavie - XX) maleacute oranžoveacute piacuteky predstavujuacute fragmenty veľkostneacuteho štandardu Tabuľka č 3 Zaacutepis DNA profilu človeka z obraacutezka č 26 15 STR lokusov s určeniacutem pohlavia pomocou lokusu pre amelogeniacuten System Alela 1 Alela 2

D3S1358 16 17

TH01 9 93 D21S11 28 28

D18S51 15 18

Penta E 7 14 D5S818 9 12

D13S317 8 11

D7S820 8 11 D16S539 11 12

CSF1PO 10 11

Penta D 11 12 vWA 15 18

D8S1179 13 16

TPOX 8 9 FGA 20 21

amel X X

29

5 MLPA

Multiplexnaacute amplifikaacutecia proacuteb zaacutevislaacute od ligaacutecie (z angl multiplex ligation-dependent probe amplification) je metoacuteda schopnaacute v jednej reakcii (v jednej skuacutemavke a vzorke) detegovať zmeny v počte až 50 nukleotidovyacutech sekvenciiacute Metoacutedou MLPA je možneacute ryacutechlo identifikovať amplifikaacutecie (duplikaacutecie) a deleacutecie veľkeacuteho počtu geacutenov či už použitiacutem DNA alebo mRNA krvnyacutech vzoriek alebo vzoriek z naacutedorov

Princiacutep MLPA spočiacuteva v multiplexnej amplifikaacutecii 50 špecifickyacutech nukleotidovyacutech sekvenciiacute použitiacutem jedneacuteho paacuteru primerov pričom jeden primer je fluorescenčne označenyacute Vyacutesledneacute PCR produkty suacute analyzovaneacute kapilaacuternou elektroforeacutezou (fragmentačnaacute analyacuteza) Dĺžka každeacuteho namnoženeacuteho produktu je jedinečnaacute narastaacute postupne o 6 alebo 9 nukleotidov pričom produkty PCR suacute 120 ndash 500 nukleotidov dlheacute Tento veľkostnyacute rozsah PCR fragmentov (dĺžka 120-500 nukleotidov s naacuterastom postupne o 6 alebo 9 nukleotidov) je optimaacutelny pre kapilaacuternu elektroforeacutezu MLPA multiplexnaacute PCR prebieha za použitia iba jedineacuteho paacuteru primerov ktoreacute amplifikujuacute špecifickeacute sekvencie Trik spočiacuteva v tom že nedochaacutedza k amplifikaacutecii DNA sekvencie ale MLPA proacuteb ktoreacute suacute pridaneacute k vzorkaacutem Každaacute MLPA proacuteba pozostaacuteva z dvoch oligonukleotidov (dve hemiproacuteby) pričom každyacute oligonukleotid obsahuje jednu zo sekvencie rozpoznaacutevanuacute PCR primermi Proacuteba vznikne jedine za predpokladu hybridizaacutecie dvoch oligonukleotidov (hemiproacuteb) k cieľovej sekvencii (geacutenu) a po ligaacutecii enzyacutemom ligaacutezou Iba ligovaneacute proacuteby suacute exponenciaacutelne amplifikovaneacute pomocou jedneacuteho paacuteru primerov Množstvo zligovanyacutech proacuteb teda zaacutevisiacute od množstva cieľovyacutech sekvenciiacute (geacutenov) vo vzorke

Postup MLPA analyacutezy je nasledovnyacute (obr27) K vzorke nukleovej kyseliny (DNA resp mRNA) sa pridaacute zmes 50 jedinečnyacutech proacuteb každaacute

proacuteba je komplementaacuterna k určitej cieľovej sekvencii NK vzorky Každaacute proacuteba však pozostaacuteva z dvoch oligonukleotidov hybridizujuacutecich vedľa seba zaacuteroveň každyacute oligonukleotid (hemiproacuteba) obsahuje pridanuacute sekvenciu rozpoznaacutevanuacute paacuterom PCR primerov Po hybridizaacuteciiacute oligonukleotidov (hemiproacuteb) dochaacutedza k ich ligaacutecii ligaacutezou Ligačnaacute reakcia je tak špecifickaacute že je schopnaacute rozliacutešiť sekvenciu liacutešiacu sa v jednom nukleotide Vyacuteslednyacute ligačnyacute produkt (proacuteba) obsahuje obidve sekvencie pre PCR primery na jednom fragmente čiže mocircže docircjsť k namnoženiu takeacutehoto fragmentu PCR reakciou V priacutepade ak nedocircjde k ligaacutecii priacuteslušnyacutech hemiproacuteb pretože hemiproacuteby nenaacutejdu cieľovuacute sekvenciu na DNA každaacute takaacuteto nezligovanaacute hemiproacuteba maacute len jednu sekvenciu rozpoznaacutevanuacute len jednyacutem PCR primerom v docircsledku čoho nemocircže prebehnuacuteť jej PCR amplifikaacutecia a počas fragmentačnej analyacutezy nie je detegovanaacute pretože negeneruje fluorescenčnyacute signaacutel

Pri MLPA analyacuteze je docircležiteacute okrem MLPA amplifikaacutecie vzorky urobiť aj MLPA amplifikaacuteciu referenčnej vzorky ku ktorej sa bude porovnaacutevať počet geacutenov (cieľovyacutech sekvenciiacute) Po kapilaacuternej elektroforeacuteze MLPA referenčnej a skuacutemanej vzorky porovnaniacutem obsahu nameranyacutech hodnocirct tzv piacutekov priacuteslušnyacutech proacuteb sa určiacute relatiacutevny počet koacutepiiacute v skuacutemanej vzorke

MLPA

1 DNA denaturaacutecia a hybridizaacutecia s MLPA proacutebami (hemiproacuteby)

2 Ligaacutecia (vytvorenie kompletnyacutech proacuteb)

3 PCR amplifikaacutecia proacuteb paacuterom primerov

4 Kapilaacuterna elektroforetickaacute separaacutecia PCR produktov

5 Analyacuteza daacutet

30

Obr 27 Princiacutep MLPA

Firma MRC-Holland v suacutečasnosti ponuacuteka stovky MLPA setov proacuteb ktoreacute suacute vhodneacute na 1) diagnostiku kongenitaacutelnych a dedičnyacutech ochoreniacute 2) zisťovanie profilu naacutedorov 3) zisťovanie metylačneacuteho profilu

MLPA je metoacuteda vhodnaacute na detekciu malyacutech prestavieb (BRCA1 BRCA2 MSH2 atď)

veľkyacutech chromozoacutemovyacutech prestavieb (Williamsov syndroacutem Prader-WilliAngelman syndroacutem atzď)

31

detekciu zmien v počte koacutepii geacutenov (obr 28 29) ako aj zistenie počtu kompletnyacutech chromozoacutemov (chromozoacutem 13 18 21 XY tiež aj z amniovej tekutiny) diagnostiku naacutedorov (zmeny počtu pri ALL CLL atď) kvantifikaacuteciu metylaacutecie (Prader-WilliAngelmanov syndroacutem Fragilnyacute X inaktivaacutecia naacutedorovyacutech supresorovyacutech geacutenov atď) mRNA analyacutezu geacutenov zuacutečastňujuacutecich sa apoptoacutezy alebo zaacutepalov

MS-MLPA (Methylation-Specific MLPA) je varianta MLPA určenaacute špeciaacutelne na analyacutezu aberantnyacutech metylaacutecii imprintovanyacutech oblastiacute ako aj detekciu metylačnyacutech zmien CpG ostrovčekov lokalizovanyacutech bliacutezko promoacutetora Rozdiel oproti štandardnej MLPA spočiacuteva v použitiacute metylačne senzitiacutevneho restrikčneacuteho enzyacutemu HhaI ktoryacute štiepi MS-MLPA proacuteby hybridizovaneacute k nemetylovanej sekvencii Každaacute DNA vzorka určenaacute pre MS-MLPA analyacutezu prejde dvoma reakciami v jednej mikroskuacutemavke štandardnou MLPA analyacutezou (bez štiepenia metylačne senzitiacutevnym enzyacutemom) a v druhej mikroskuacutemavke docircjde okrem ligaacutecie proacuteb aj k metylačne senzitiacutevnemu štiepeniu hybridizovanyacutech proacuteb s nemetylovanou DNA Amplifikujuacute sa len ligovaneacute proacuteby po PCR amplifikaacutecii sa fragmentačnou analyacutezou porovnaniacutem oboch reakciiacute zistia rozdiely v metylačnom profile vzorky k referenčnej vzorke

RT-MLPA (Reverse Transkriptase MLPA) je variaacutecia MLPA určenaacute pre zistenie mRNA profilu vzorky je alternatiacutevou k real-time PCR a mikročipom RT-MLPA nedeteguje mRNA množstvo priamo pretože použiacutevanaacute ligaacuteza nie je schopnaacute ligovať DNA oligonukleotidy keď suacute hybridizovaneacute s RNA Preto RT-MLPA začiacutena reverznou transkripciou so špeciaacutelne navrhnutyacutemi RT primermi tak aby vytvorili kraacutetke oligonukleotidy (cDNA) Potom reakcia pokračuje ako štandardnaacute MLPA

Obr 28 MLPA analyacuteza geacutenu DMD (koacutedujuacuteceho dystrofiacuten) mutaacutecie ktoreacuteho spocircsobujuacute Duchennovu svalovuacute dystrofiu u pacienta je priacutetomnaacute deleacutecia exoacutenu 45 v porovnaniacute s referenčnou vzorkou ndash kontrolou

32

Obr 29 MLPA analyacuteza geacutenu DMD (koacutedujuacuteceho dystrofiacuten) mutaacutecie ktoreacuteho spocircsobujuacute Duchennovu svalovuacute dystrofiu u pacienta suacute priacutetomneacute duplikaacutecie exoacutenov 41 42 43 44 45 (piacuteky vo vzorke pacienta sa porovnajuacute s piacutekmi v kontrole ndash referenčnej vzorke)

33

6 Sekvenovanie

Sekvenovaniacutem rozumieme určenie primaacuternej štruktuacutery DNA teda určenie poradia nukleotidov v reťazci DNA Začiatky moderneacuteho sekvenovania siahajuacute do roku 1977 kedy boli objaveneacute dve metoacutedy sekvenovania 1) chemickaacute metoacuteda Maxama a Gilberta 2) enzymatickaacute metoacuteda Sangera Nicklena a Coulsona

Princiacutep obidvoch metoacuted sekvenovania spočiacuteva v tom že sa vytvoriacute suacutebor DNA molekuacutel s rocircznou veľkosťou ktoreacute suacute zakončeneacute konkreacutetnym nukleotidom tieto DNA molekuly sa elektroforeticky separujuacute v geacuteloch s rozlišovacou schopnosťou 1 nukleotid 61 Chemickaacute metoacuteda

DNA molekuly sa na 5-konci raacutedioaktiacutevne označia raacutedioaktiacutevnym fosforom a naacutesledne sa chemicky modifikujuacute špecificky pre každuacute baacutezu DNA sa potom v modifikovanyacutech miestach štiepi čiacutem vzniknuacute rocirczne dlheacute fragmenty pričom podmienky suacute nastaveneacute tak aby sa DNA na každom mieste štiepila len raz Modifikaacutecia DNA a štiepenie prebehne v štyroch separaacutetnych reakciaacutech (skuacutemavkaacutech) takže po elektroforetickej separaacuteciiacute takto opracovanej DNA v štyroch draacutehach polyakrylamidoveacuteho geacutelu a naacuteslednej autoraacutediografii (podobne ako pri Southernovej hybridizaacutecii) je možneacute odčiacutetať nukleotidovuacute sekvenciu približne 100 nukleotidov od raacutedioaktiacutevneho označenia (v čase objavu Maxama a Gilberta) 62 Sangerova metoacuteda

Zaacuteklady metoacutedy boli popiacutesaneacute už v roku 1975 (metoacuteda plus a miacutenus) ale až vylepšenie použitiacutem dideoxynukleotidov (ddNTP) v roku 1977 došlo k zjednodušeniu sekvenovania Princiacutepom enzyacutemoveacuteho sekvenovania je terminaacutecia (zastavenie) polymerizaacutecie inkorporaacuteciou 2´ 3 -dideoxynukleotidov do novosyntetizujuacuteceho sa vlaacutekna DNA Keďže ddNTP neobsahujuacute hydroxylovuacute skupinu na 3 uhliacuteku riboacutezy nemocircžu sa zuacutečastniť na tvorbe fosfodiesterovej vaumlzby nemocircže sa pripojiť k nim ďalšiacute nukleotid čiže musiacute docircjsť k terminaacuteciiacute polymeraacutecie Reakcia prebieha v štyroch skuacutemavkaacutech s raacutedioaktiacutevne značenyacutem primerom V každej skuacutemavke suacute priacutetomneacute všetky štyri deoxynukleotidtrifosfaacutety (dNTP) ale pre každuacute skuacutemavku je špecifickyacute priacutedavok maleacuteho množstva jedneacuteho z dideoxynukleotidtrifosfaacutetov (v prvej skuacutemavke je ddATP v druhej ddCTP v tretej ddTTP a vo štvrtej ddGTP) Maleacute množstvo ddNTP spocircsobiacute že pri polymerizaacutecii dochaacutedza k prednostneacutemu zaradeniu štandardnyacutech dNTP do narastajuacuteceho reťazca a len občas sa inkorporuje ddNTP čiacutem sa zastaviacute synteacuteza reťazca V každej skuacutemavke tak vznikne suacutebor DNA fragmentov rocircznych veľkostiacute zakončenyacutech priacuteslušnyacutem ddNTP (v prvej skuacutemavke ddATP v druhej ddCTP v tretej ddTTP a vo štvrtej ddGTP) Po elektroforetickej separaacutecii v 4 draacutehach polyakrylamidoveacuteho geacutelu a autoraacutediografii sa z autoraacutediogramu odčiacuteta sekvencia

V suacutečasnosti je sekvenovanie do značnej miery automatizovaneacute pričom využiacuteva princiacutep Sangerovej enzyacutemovej metoacutedy s určityacutemi obmenami Uacutesek DNA ktoryacute treba sekvenovať sa prostredniacutectvom termostabilnyacutech DNA polymeraacutez namnožiacute PCR metoacutedou po ktorej nasleduje sekvenačnaacute reakcia (asymetrickaacute PCR) s fluorescenčne značenyacutemi ddNTP (každyacute druh označenyacute inyacutem fluorescenčnyacutem farbivom) Sekvenačnaacute reakcia prebieha v jednej skuacutemavke s jednyacutem primerom vznikne tak suacutebor jednovlaacuteknovyacutech DNA rocircznej dĺžky ktoreacute suacute na 3konci označeneacute ddNTP so špecifickyacutem fluorescenčnyacutem farbivom Taacuteto metoacuteda sekvenovania sa tiež nazyacuteva rdquodye-terminator cycle sequencingrdquo(obr 30) Po kapilaacuternej elektroforeacuteze vzorky v genetickom analyzaacutetore zaznamenaacutevaniacute fluorescencie jednotlivyacutech fragmentov CCD kamerou a softveacuterovom spracovaniacute sa ziacuteska sekvencia DNA (obr 31)

34

Obr 30 Princiacutep sekvenovania Sangerova dideoxy metoacuteda alebo tzv chain termination method (reťazec zastavujuacuteca metoacuteda) Obr 31 Určenie genotypu plodu a rodičov sekvenčnou analyacutezou DNA ziacuteskanej z plodovej vody (prenataacutelna diagnostika) a perifeacuternej krvi sekvenčnaacute analyacuteza geacutenu ASPA vyacutesledok u plodu priacutetomnaacute mutaacutecia c 914CgtA v homozygotnom stave (AA) rodičia heterozygoti (AC) Uvedenaacute mutaacutecia je v homozygotnom stave kauzaacutelnou priacutečinou Canavanovej choroby

Automatizovaneacute sekvenovanie prinaacuteša viacereacute vyacutehody oproti klasickej Sangerovej metoacutede vyššiu presnosť a ryacutechlosť v jednej sekvenačnej reakcii možnosť osekvenovať až 1200 nukleotidovyacute fragment maleacute množstvo templaacutetu potrebneacute na analyacutezu

35

63 Next Generation Sequencing (NGS)

NGS (sekvenovanie novej generaacutecie) maacute obrovskyacute potenciaacutel v analyacuteze genoacutemov pričom toto označenie zahŕňa viacereacute technologickeacute metoacutedy reprezentovaneacute niekoľkyacutemi firmami Princiacutepom je masiacutevne paralelneacute sekvenovanie čiacutem sa ziacuteskajuacute raacutedovo tisiacutece až milioacuteny sekvenciiacute naraz 631 Sekvenovanie druhej generaacutecie

Na začiatku sa analyzovanaacute DNA vo vaumlčšine priacutepadov fragmentuje (vznikne tak DNA

knižnica) na fragmenty sa pripoja kraacutetke sekvencie ndash adapteacutery naacutesledne sa tieto fragmenty rocircznymi priacutestupmi amplifikujuacute a určiacute sa ich sekvencia Vďaka čiastočnyacutem prekryvom je zo ziacuteskanyacutech sekvencii možneacute poskladať plynuluacute sekvenciu zodpovedajuacutecu pocircvodnej nefragmentovanej DNA

Pyrosekvenovanie je podobne ako Sangerova metoacuteda založenaacute na princiacutepe synteacutezy komplementaacuterneho vlaacutekna DNA avšak rozdiel je v tom že sa na detekciu inkorporaacutecie nukleotidu využiacuteva inyacute systeacutem tvorby luminiscenčneacuteho signaacutelu v priebehu reakcie Pyrosekvenovanie je umožneneacute vďaka aktivite 4 enzyacutemov - DNA polymeraacutezy ATP sulfurylaacutezy luciferaacutezy a apyraacutezy Reakčnaacute zmes obsahuje aj ďalšie komponenty - enzymatickeacute substraacutety adenoziacutenfosfosulfaacutet (APS) d-luciferiacuten sekvenovanyacute templaacutet a cyklicky postupne po jednom type pridaacutevaneacute nukleotidtrifosfaacutety Po zabudovaniacute nukleotidu do novovznikajuacuteceho reťazca docircjde k uvoľneniu pyrofosfaacutetu naacutesledne je využityacute ATP sulfurylaacutezou na synteacutezu ATP z APS počas ďalšej reakcie docircjde k využitiu ATP luciferaacutezou na premenu luciferiacutenu na oxyluciferiacuten čo spocircsobiacute svetelnyacute signaacutel a ten zaznamenaacute detekčnyacute systeacutem Poslednou enzymatickou reakciou je reakcia apyraacutezy ktoraacute odstraacuteni nezainkorporovaneacute nukleotidy a nevyužiteacute ATP aby sa celyacute proces mohol zopakovať s reakčnou zmesou obsahujuacutecou ďalšiacute nukleotidtrifosfaacutet (inyacute ako v predchaacutedzajuacutecej reakcii) Po každej reakcii detektor zaznamenaacuteva emisiu svetla na zaacuteklade intenzity svetla je možneacute určiť či bol vradenyacute priacuteslušnyacute nukleotidtrifosfaacutet či bol inkorporovanyacute jeden priacutepadne viac rovnakyacutech nukleotidtrifosfaacutetov

Zvyacutešenie vyacutekonu pyrosekvenovania umožnila tzv emulznaacute PCR v mikročasticiach a použitie platničky PicoTiterPlatereg toto sekvenovanie zaviedla firma Roche pod pojmom 454 pyrosekvenovanie v roku 2005 Na začiatku sa DNA fragmentuje na uacuteseky dlheacute 400-600 baacutez dvojvlaacuteknovaacute fragmentovanaacute DNA sa liguje s adapteacutermi prostredniacutectvom nich sa naviaže na mikročastice dvojvlaacuteknoveacute fragmenty sa oddelia mikročastice s naviazanyacutemi jednovlaacuteknovyacutemi fragmentami sa premiešajuacute so zmesou oleja a roztoku ktoryacute obsahuje všetky komponenty na uacutespešnuacute PCR Tyacutemto spocircsobom sa okolo každej mikročastice vytvoriacute vlastnyacute mikroreaktor v ktorom prebehne amplifikaacutecia fragmentu Po PCR reakcii sa mikročastice prenesuacute do platničky PicoTiterPlate v ktorej sa do jamky zmestiacute akuraacutet jedna mikročastica a reakčneacute komponenty pyrosekvenačnej reakcie PicoTiterPlatereg maacute 1 600 000 jamiek každaacute jamka maacute maximaacutelny objem 75 picolitra Platnička s mikročasticami sa vložiacute do sekvenačneacuteho systeacutemu ndash priacutestroja v ktorom sa celeacute pyrosekvenovanie uskutočniacute Chemiluminiscenčneacute signaacutely ktoryacutech počas sekvenovania vznikajuacute milioacuteny v priebehu hodiny suacute zachyteneacute CCD kamerou a analyzovaneacute softveacuterom

Firma Illumina predstavila inuacute technoloacutegiu PCR amplifikaacutecia a sekvenovanie sa uskutočňuje na skliacutečku (flow cell) Fragmentaacutecia DNA a pripojenie adapteacuterov prebieha za uacutečasti transpozoacutemov v procese nazvanom tagmentaacutecia Po hybridizaacutecii fragmentov DNA na skliacutečko prebehne v klastroch PCR amplifikaacutecia (tzv mostiacutekovaacute amplifikaacutecia) sekvenaacutecia prebieha za uacutečasti rozdielne fluorescenčne značenyacutech a chemicky modifikovanyacutech nukleotidov pričom každyacute nukleotid emituje fluorescenciu s inou vlnovou dĺžkou Na skliacutečku prebieha paralelne až 6 miliaacuterd sekvenaacutecii (obr 32)

Ďalšiacutemi možnosťami sekvenovania druhej generaacutecie je systeacutem SOLid (vyvinutyacute firmou Applied Biosystem dnes pod Thermo Fisher Scientific) a Ion Semiconductor Sequencing ndash polovodičoveacute ioacutenoveacute sekvenovanie (od firmy Ion Semiconductor Sequencing v suacutečasnosti Thermo Fisher Scientific)

36

Obr 32 Princiacutep sekvenovania novej generaacutecie od firmy Illumina PCR amplifikaacutecia a sekvenovanie sa uskutočňuje na skliacutečku (flow cell) paralelne prebieha až 6 miliaacuterd sekvenaacutecii

632 Sekvenovanie tretej generaacutecie

Pred sekvenovaniacutem netreba amplifikovať DNA PCR metoacutedou ale sekvencia sa ziacuteskava zachyteniacutem signaacutelu v reaacutelnom čase Medzi sekvenovanie tretej generaacutecie patriacute SMRT (Single Molecule Real-Time Sequencing) a Nanopore Sequencing

37

7 Fragmentačnaacute analyacuteza DNA

Je metoacuteda použiacutevanaacute na určenie veľkosti fragmentov DNA ziacuteskanyacutech PCR reakciou Dĺžka amplifikovanyacutech DNA fragmentov sa zistiacute ich porovnaniacutem s veľkostnyacutem štandardom (obr 33) ktoryacute je tvorenyacute DNA fragmentami znaacutemej dĺžky Veľkostnyacute štandard je pred kapilaacuternou elektroforeacutezou zmiešanyacute so vzorkou DNA fragmenty veľkostneacuteho štandardu suacute fluorescenčne označeneacute pričom použiteacute fluorescenčneacute farbivo je ineacute ako fluorescenčneacute farbivo použiteacute na označenie DNA fragmentov vo vyšetrovanej vzorke

Obr 33 Elektroforetogram veľkostneacuteho štandardu použiacutevaneacuteho na určenie veľkostiacute fragmentov analyzovanyacutech kapilaacuternou elektroforeacutezou v genetickom analyzaacutetore (GeneScantrade 500 LIZtrade dye Size Standard) dĺžka fragmentov v nukleotidoch (napr 50 nukleotidov)

Fragmentačnaacute analyacuteza pozostaacuteva z viaceryacutech krokov Prvyacutem je izolaacutecia DNA nasleduje PCR amplifikaacutecia počas ktorej sa novosyntetizovaneacute DNA fragmenty označia fluorescenčnyacutemi farbivami Vzorka s PCR produktom sa pripraviacute na kapilaacuternu elektroforeacutezu tak že sa zmieša s veľkostnyacutem štandardom (sluacuteži na určenie veľkosti fragmentov) a denaturačnou laacutetkou (formamid) nasleduje denaturaacutecia Pripraveneacute vzorky suacute injektovaneacute do priacutestroja (genetickyacute analyzaacutetor) kde v kapilaacutere naplnenej polymeacuterom v elektrickom poli migrujuacute fluorescenčne značeneacute fragmenty DNA na zaacuteklade veľkosti (kapilaacuterna elektroforeacuteza) Počas elektroforeacutezy genetickyacute analyzaacutetor zaznamenaacuteva fluorescenciu fragmentov Analyacutezou daacutet prostredniacutectvom špeciaacutelnych softveacuterov sa ziacuteskajuacute elektroforetogramy z ktoryacutech je možneacute zistiť veľkosť fragmentov ako aj typ fluorescencie (docircležiteacute ak suacute genetickeacute varianty rozliacutešiteľneacute rocircznou fluorescenciou napr SNaPshot) Fragmentačnaacute analyacuteza je suacutečasťou množstva molekulaacuterno-genetickyacutech metoacuted (pozri obr 12 26 28 29 34) ako suacute napr STR analyacuteza (Short Tandem Repeat) AFLP analyacuteza (Amplified Fragment Lenght Polymorfism) RFLPT-RFLP analyacuteza (Restriction Fragment Lenght PolymorfismTerminal Restricted Fragment Lenght Polymorfism) SSCP (Single Strand Conformation Polymorfism) VNTR (Variable Number of Tandem Repeat) analyacuteza straty heterozygotnosti (LOH loss of heterozygozity) MLPA (Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification) MSMSA (Methylation-Sensitive Mobility Shift Assay) SNP genotypovanie (SNaPshotreg) HiCEP (High-Coverage Expression Profiling)

38

Obr 34 Kvantitatiacutevna fragmentačnaacute PCR analyacuteza (QF-PCR) DNA izolovanej z plodovej vody vyacutesledok prenataacutelnej analyacutezy = priacutetomnosť troch piacutekov pre chromozoacutem 18 (u všetkyacutech fragmentov detegujuacutecich chromozoacutem 18 je pomer vyšetrovanyacutech markerov aberantnyacute 21 resp 111) čo znamenaacute trizoacutemiu chromozoacutemu 18 Edwardsov syndroacutem

39

8 Metoacutedy založeneacute na princiacutepe hybridizaacutecie

Nukleoveacute kyseliny majuacute schopnosť vytvaacuterať dvojvlaacuteknoveacute reťazce z jednovlaacuteknovyacutech molekuacutel na zaacuteklade komplementarity baacutez Komplementarita baacutez umožňuje replikaacuteciu DNA transkripciu RNA komplementarita baacutez zabezpečuje teda reprodukovateľnosť živej hmoty

Hybridizaacutecia je proces v ktorom na zaacuteklade komplementarity baacutez dochaacutedza k vytvoreniu dvojvlaacuteknovej nukleovej kyseliny z dvoch jednovlaacuteknovyacutech molekuacutel DNA alebo RNA alebo ich kombinaacuteciou DNA RNA pričom kratšia jednovlaacuteknovaacute nukleovaacute kyselina vystupuje ako sonda (proacuteba) Hybridizaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten je jeden z najpoužiacutevanejšiacutech naacutestrojov v molekulaacuternej bioloacutegii a genetike (hybridizaacutecia primerov alebo proacuteb sa využiacuteva v takmer každej metoacutede - v PCR RT-PCR qPCR RT-qPCR MLPA sekvenovaniacute fragmentačnej analyacuteze FISH DNA mikročipoch atď)

Denaturaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten je proces pri ktorom dochaacutedza k porušeniu vodiacutekovyacutech vaumlzieb medzi vlaacuteknami nukleovyacutech kyseliacuten (strata sekundaacuternej a terciaacutelnej štruktuacutery) tak že docircjde k ich uacuteplneacutemu oddeleniu vzniknuacute jednovlaacuteknoveacute reťazce Denaturaacutecia NK mocircže byť spocircsobenaacute vplyvom vysokyacutech teplocirct pH alebo chemickyacutech laacutetok (denaturačneacute činidlaacute) Renaturaacutecia je opačnyacute proces v ktorom na zaacuteklade komplementarity dochaacutedza k tvorbe dvojvlaacuteknovyacutech NK

Hybridiza čnaacute sonda (proacuteba) je jednovlaacuteknovaacute nukleovaacute kyselina určitej znaacutemej dĺžky a sekvencie (najčastejšie DNA pretože je stabilnejšia ako RNA) ktoraacute je značenaacute a sluacuteži na detekciu komplementaacuternych molekuacutel DNA alebo RNA v procese hybridizaacutecie V zaacutevislosti od podmienok hybridizaacutecie (stringencia) mocircže byť detegovanaacute sekvencia uacuteplne komplementaacuterna alebo v menej priacutesnych podmienkach mocircže mať sekvenčneacute odchyacutelky Proacuteba sluacuteži na vyhľadanie a zviditeľnenie cieľovyacutech NK Zviditeľnenie sa deje prostredniacutectvom označenia proacuteby ešte pred hybridizaacuteciou Značenie proacuteby mocircže byť raacutedioaktiacutevne a neraacutedioaktiacutevne (najčastejšie fluorescenčneacute)

Raacutedioaktiacutevne značeneacute proacuteby pomocou izotopov (32P) sa využiacutevali viac v minulosti v suacutečasnosti suacute kvocircli zdravotnyacutem rizikaacutem ohľaduplnosti k životneacutemu prostrediu ako aj kvocircli jednoduchšej manipulaacutecii použiacutevaneacute fluorescenčne značeneacute proacuteby Raacutedioaktiacutevne značeneacute sondy boli použiacutevaneacute hlavne metoacutedou Southernovej hybridizaacutecie (Southern blotting Southern blot) Citlivosť raacutedioaktiacutevne značenyacutech proacuteb je vyššia dosahuje schopnosť zachytiť 10 fg (femtogram 10-15) cieľovej DNA sekvencie 81 Southern blot

Metoacutedu objavil v roku 1975 britskyacute bioloacuteg Edwin Southern (preto Southern) Pri Southernovej hybridizaacutecii sa restrikčne štiepeneacute fragmenty DNA elektroforeticky separujuacute v geacuteli potom sa metoacutedou blottingu prenesuacute na nylonovuacute alebo nitroceluloacutezovuacute membraacutenu kde suacute naacutesledne hybridizovaneacute v roztoku obsahujuacutecom raacutedioaktiacutevne značenuacute sondu Priloženiacutem fotografickeacuteho filmu k membraacutene a vyvolaniacutem filmu autoraacutediografiou docircjde k zviditeľneniu lokaliacutet kde došlo k hybridizaacuteciiacute raacutedioaktiacutevne značenej sondy s fragmentom DNA (autoraacutediogram) Southern blot bol kľuacutečovou a prvou metoacutedou na identifikaacuteciu osocircb (DNA fingerprinting DNA pofiling) (obr 35)

Okrem Southern blotu existuje Northern blot na analyacutezu RNA (geacutenovej expresie) a Western blot na analyacutezu proteiacutenov postup je obdobnyacute ako pri Southern blote s obmenami špecifickyacutemi pre konkreacutetny blot Pri Northern blote sa použiacutevajuacute hybridizačneacute proacuteby ale pre vizualizaacuteciu proteiacutenov western blotom je potrebneacute použiť protilaacutetky s naacuteslednou vizualizaacuteciou Pomenovanie techniacutek je hra so sloviacutečkami (keďže paacuten Northern ani Western neobjavili takto nazvaneacute techniky)

Neraacutedioaktiacutevne značenie proacuteb použiacutevanyacutech v molekulaacuternej genetike mocircže byť nepriame (použitie haptenu) alebo priame Konečnaacute vizualizaacutecia je najčastejšie zabezpečenaacute fluoreskujuacutecimi farebnyacutemi značkami farbivami fluorochroacutemami (fluorofoacuterami) Pri priamom značeniacute je farbička kovalentne naviazanaacute na nukleotid a na zachytenie fluorescencie suacute potrebneacute špeciaacutelne priacutestroje umožňujuacutece excitaacuteciu farbičky ktoraacute potom emituje žiarenie určitej vlnovej dĺžky (emisneacute žiarenie) a to zachytiacute detekčnyacute systeacutem priacutestroja Využitie fluorochroacutemov v molekulaacuternej genetike je masiacutevne napr na vizualizaacuteciu NK elektroforeticky separovanyacutech v geacuteli kvantifikaacuteciu produktov PCR reakcie v priacutestroji real-time PCR cykleacuter sekvenovaniacute fragmentačnej analyacuteze FISH DNA mikročipoch atď

40

Obr 35 Princiacutep Southern blotu

82 FISH (fluorescenčnaacute in situ hybridizaacutecia)

FISH (fluorescent in situ hybridization fluorescenčnaacute in situ hybridizaacutecia) metoacuteda patriacute medzi molekulovo-cytogenetickeacute techniky Princiacutep FISH metoacutedy je založenyacute na hybridizaacuteciiacute fluorescenčne značenyacutech proacuteb ku komplementaacuternym uacutesekom vyšetrovanej DNA na podložnom skle (priamo na mieste - in situ) K denaturaacutecii dsDNA dochaacutedza buď vplyvom denaturačnyacutech činidiel alebo zvyacutešenou teplotou a naacuteslednou renaturaacuteciou dochaacutedza k naviazaniu sondy na komplementaacuterny uacutesek DNA Vyacutesledok hybridizaacutecie sa vizualizuje fluorescenčnyacutem mikroskopom vybavenyacutem vhodnyacutemi fluorescenčnyacutemi filtrami a vizuaacutelne zhodnotiacute skuacutesenyacutem odborniacutekom Fluorescencia sa v niektoryacutech priacutepadoch mocircže zaznamenať a hodnotiť aj pomocou softveacuteru (obr 36)

Pomocou FISH detegujeme numerickeacute aberaacutecie - zmeny v počte chromozoacutemov (napr trizoacutemia monozoacutemia chromozoacutemov) alebo štruktuacuterne aberaacutecie a prestavby (napr translokaacutecie inverzie deleacutecie duplikaacutecie amplifikaacutecie) FISH metoacuteda umožňuje identifikaacuteciu a detekciu každeacuteho ľudskeacuteho chromozoacutemu jeho zaradenie do karyotypu odhalenie malyacutech submikroskopickyacutech chromozoacutemovyacutech zmien a tiež mapovať poziacutecie jednotlivyacutech geacutenov na chromozoacuteme

41

Obr 36 Princiacutep štandardnej FISH a FISH maľovania celeacuteho chromozoacutemu

Veľkou vyacutehodou FISH metoacutedy je možnosť analyacutezy buniek v metafaacuteze aj v interfaacuteze kedy nie je nutnaacute kultivaacutecia buniek a tiež ryacutechle analyzovanie veľkeacuteho počtu buniek (stovky až tisiacutece) K ďalšiacutem vyacutehodaacutem patriacute bezpečnosť vysokaacute citlivosť dostatočnaacute stabilita relatiacutevne kraacutetky čas hybridizaacutecie a možnosť ryacutechleho vyhodnotenia Hybridizaacutecia pri vaumlčšine suacutečasne dodaacutevanyacutech sond trvaacute 10-12 hodin (na trhu suacute už dostupneacute aj sondy so skraacutetenyacutem časom hybridizaacutecie na 2-3 hodiny) Po hybridizaacuteciiacute nasleduje odmyacutevanie kedy pri priacuteslušnej teplote dochaacutedza k odmytiu nenaviazanyacutech a nespraacutevne hybridizovanyacutech sond Preparaacutet sa naacutesledne podfarbiacute a vyacutesledok sa zhodnotiacute vo fluorescenčnom mikroskope Na podfarbenie chromozoacutemov alebo jadier sa použiacuteva modreacute kontrastneacute farbivo DAPI (46-diamidino-2-fenylindol) ktoreacute maacute silneacute fluorescenčneacute vlastnosti dokaacuteže prechaacutedzať jadrovou membraacutenou a viazať sa na DNA Vyacutesledkom je modreacute zafarbenie ktoreacute vyacuteborne kontrastuje so signaacutelmi jednotlivyacutech sond

Limitujuacutecim faktorom FISH je možnosť identifikaacutecie len tyacutech uacutesekov DNA ku ktoryacutem suacute použiteacute sondy V jednej analyacuteze je možneacute použiť najviac 3 odlišne značeneacute sondy a tak zistiť priacutepadneacute abnormality len na 1 alebo na paacuter lokusoch Na relevantnuacute detekciu je potrebneacute mať vo vzorke 1-5 aberantnyacutech interfaacutezovyacutech jadier

FISH je možneacute uskutočniť na širokej škaacutele biologickeacuteho materiaacutelu na vzorkaacutech perifeacuternej krvi kostnej drene naacuteteroch choriovyacutech klkoch plodovej vode rocircznych druhov tkaniacutev natiacutevnych alebo zaliatych v parafiacutene na 1 bunke (predimplantačnaacute genetickaacute diagnostika PGD) (obr 37)

Využiacuteva sa na detekciu aberaacuteciiacute pri mnohyacutech onkologickyacutech ochoreniach (napr pri diagnoacuteze mnohopočetnyacute myeloacutem sa v suacutečasnosti po separaacutecii CD138+ buniek robiacute FISH s 5 sondami pre geacuteny IGH TP53 RB1 oblasť 1p321q21 a stanovuje sa hyperploidia chromozoacutemov 5 9 a 15) a tiež k spresneniu doplneniu a k overeniu bežneacuteho cytogenetickeacuteho vyšetrenia

Podľa miesta na chromozoacuteme na ktorom dochaacutedza k hybridizaacutecii sondy rozlišujeme 4 typy

DNA sond bull centromeacuteroveacute sondy ndash sa viažu na strednuacute časť chromozoacutemu ndash centromeacuteru sluacutežia k diagnostike zmien v počte chromozoacutemov k detekcii chromozoacutemov neznaacutemeho pocircvodu umožňujuacute interfaacuteznu FISH na nedeliacich sa bunkaacutech (obr 38-41)

42

Obr 37 Interfaacutezna FISH preimplantačnyacute genetickyacute skriacutening aneuploidiiacute ndash blastomeacutera 3-denneacuteho ľudskeacuteho embrya s normaacutelnym počtom chromozoacutemov 13 18 21 pohlavie XY použityacutech 5 sond pre chromozoacutemy 13 ndash orange 18 ndash aqua 21 ndash green X ndash blue a Y ndash yellow (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

Obr 38 Interfaacutezne jadro po hybridizaacutecii s centromeacuterovou sondou pre chromozoacutem 8 (Vysis Abbott) V pravom jadre je priacutetomnaacute trizoacutemia chromozoacutemu 8 (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex) Obr 39 Metafaacutezna (A) a interfaacutezna FISH (B) použitaacute centromeacuterovaacute sonda CEPX spectrum orangeCEPY spectrum green (Vysis Abbott) Sonda hybridizuje k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (červenyacute signaacutel) a Y (zelenyacute signaacutel) (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

43

Obr 40 Interfaacutezna FISH vyšetrenie spermiiacute použiteacute sondy CEPX greenCEPY orange (Aneuscore Metasystems) Sondy hybridizujuacute k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (zelenyacute signaacutel) Y (červenyacute signaacutel) vľavo ndash dve haploidneacute spermie (majuacutece jedna spermia X druhaacute Y chromozoacutem) vpravo ndash dve patologickeacute spermie obsahujuacutece gonozoacutemovyacute komplement XY (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

Obr 41 Interfaacutezna FISH vyšetrenie spermiiacute použiteacute sondy CEPX greenCEPY orange a CEP18 aqua (Aneuscore Metasystems) Sondy hybridizujuacute k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (zelenyacute signaacutel) Y (červenyacute signaacutel) a 18 (modryacute signaacutel) vľavo ndash normaacutelne haploidneacute ľudskeacute spermie - 1x chromozoacutem X alebo Y a jedenkraacutet chromozoacutem 18 v strede ndash patologickaacute spermia obsahujuacuteca gonozoacutemovyacute komplement XY a jeden chromozoacutem 18 vpravo ndash patologickaacute diploidnaacute spermia s chromozoacutemami X Y a dvoma chromozoacutemami 18 (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

bull lokusovo špecifickeacute sondy ndash hybridizaacutecia prebehne na konkreacutetnom mieste geacutenu (lokuse) (obr 42-44) použiacutevajuacute sa k vyšetreniu mikrodeleacuteciiacute (straty malyacutech častiacute chromozoacutemu pri mikrodelečnyacutech syndroacutemoch) k zisteniu amplifikaacutecie onkogeacutenov a niektoryacutech špecifickyacutech translokaacuteciiacute prestavby geacutenov umožňujuacute interfaacuteznu FISH na nedeliacich sa bunkaacutech bull subtelomeroveacute ndash vaumlzba na koncoveacute časti chromozoacutemu ndash telomeacutery bull celochromozoacutemoveacute alebo celomaľovacie sondy ndash sondy hybridizujuacute s mnohopočetnyacutemi chromozoacutemovyacutemi sekvenciami pričom sa fluorescenčne tak bdquovymaľujeldquo celyacute chromozoacutem (Obr 45) Použiacutevajuacute sa na vyšetrenie chromozoacutemovyacutech prestavieb k analyacuteze translokaacuteciiacute a k detekcii pocircvodu tzv marker chromozoacutemov (malyacutech nadpočetnyacutech chromozoacutemov neznaacutemeho pocircvodu) K použitiu sondy suacute potrebneacute metafaacutezne chromozoacutemy nepoužiacutevaju sa pre interfaacuteznu FISH

Pri konvenčnej chromozoacutemovej FISH suacute homogeacutenne DNA proacuteby hybridizovaneacute s fixovanyacutem metafaacuteznym alebo prometafaacuteznym chromozoacutemomchromozoacutemami na skliacutečku (Obr 36a) Maximaacutelna rozlišovacia schopnosť metafaacuteznej FISH je niekoľko megabaacutez (Obr 39a 45) využitiacutem viac

44

natiahnutyacutech prometafaacuteznych chromozoacutemov sa dosiahne 1 Mb rozliacutešenie Prostredniacutectvom fiber FISH konkreacutetne artificiaacutelne deproteinizovanej natiahnutej DNA pripravenej in situ z celyacutech buniek na mikroskopickom skliacutečku je možneacute vizualizovať individuaacutelne geacuteny maleacute DNA elementy na chromozoacuteme s rozliacutešeniacutem okolo 1000 bp

Obr 42 Interfaacutezne jadro po hybridizaacutecii s lokusovo-špecifickou sondou LSI 5q31 Spectrum Orange5p12 Spectrum Green (Vysis Abbott) Na ľavom obraacutezku suacute priacutetomneacute dva červeneacute (5q31) a dva zeleneacute signaacutely (5p12) v pravom jadre je priacutetomnaacute deleacutecia 5q31 oblasti chyacuteba jeden červenyacute signal (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

Obr 43 Interfaacutezna FISH použitaacute lokusovo-špecifickaacute sonda ndash translokačnaacute - XL BCRABL1 plus (Metasystems) dvojfarebnaacute dvojfuacutezna kde červenaacute označuje lokus ABL1 na chromozoacuteme 9 a zelenaacute oblasť BCR na chromozoacuteme 22 Sonda deteguje fuacuteziu protoonkogeacutenu ABL1 (9q34) a geacutenu BCR (22q11) v priacutepade že červenyacute a zelenyacute signaacutel suacute pri sebe (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

45

Obr 44 Interfaacutezna FISH Použitaacute lokusovo-špecifickaacute sonda- typ break apart pre IGH geacuten V docircsledku translokaacutecie došlo k rozskočeniu geacutenu pričom translokačneacuteho partnera nepoznaacuteme vieme určiť len percento v koľkyacutech jadraacutech je geacuten prestavanyacute (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex) Obr 45 Použiteacute celochromozoacutemoveacute sondy WCP 15 (červenyacute chromozoacutem) a WCP 17 (zelenyacute chromozoacutem) Na metafaacuteze je potvrdenaacute reciprokaacute translokaacutecia t(1517)(q2221) (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

FISH vizualizaacutecia celeacuteho chromozoacutemu maľovanie chromozoacutemu anglicky chromosome

painting je špeciaacutelnou aplikaacuteciou chromozoacutemovej FISH proacuteba je koktail veľkeacuteho počtu rocircznych fluorescenčne značenyacutech DNA fragmentov hybridizujuacutecich pozdĺž celeacuteho konkreacutetneho chromozoacutemu (obr 36b 45) bdquoChromosomepaintingldquo analyzuje metafaacutezne chromozoacutemy V minulosti bola FISH vizualizaacutecia celyacutech chromozoacutemov limitovanaacute malyacutem množstvom rocirczne sfarbenyacutech fluorochroacutemov

V suacutečasnosti je možneacute detegovať množstvo cieľovyacutech sekvenciiacute naraz čo sa využiacuteva pri celogenoacutemovej chromozoacutemovej vizualizaacutecii (whole-chromosomepainting - WCP) metoacutedou multiplex FISH (M-FISH multicolor FISH o br 46) alebo spektraacutelnej karyotypizaacutecie (SKY) kedy možno rozliacutešiť všetky ľudskeacute chromozoacutemy ndash teda 24 rocircznych chromozoacutemov M-FISH a SKY patria medzi metafaacutezne formy FISH diagnostiky ktoreacute umožňujuacute simultaacutennu vizualizaacuteciu všetkyacutech ľudskyacutech chromozoacutemov v rocircznych farbaacutech čo predstavuje uľahčenie analyacutezy karyotypu hlavne pri komplexnyacutech zmenaacutech a markeroch neznaacutemeho pocircvodu Obe techniky vychaacutedzajuacute z použitia

46

celochromozoacutemovyacutech sond značenyacutech kombinaacuteciou viaceryacutech fluorochroacutemov Rozdiel medzi M-FISH a SKY spočiacuteva v technike ziacuteskania konečneacuteho obrazu

Obr 46 Multicolor FISH - každyacute chromozoacutemovyacute paacuter je zafarbenyacute inou farbou pričom na ich zafarbenie postačuje kombinaacutecia 5 fluorochroacutemov Na vyhodnocovanie je potrebnaacute špeciaacutelna sada fluorescenčnyacutech filtrov pre jednotliveacute fluorochroacutemy a špeciaacutelnyacute softweacuter Vľavo-štandardnyacute karyotyp vpravo karyotyp s mutaacuteciami (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

V molekulovej cytogenetike suacute komerčne dostupneacute sety M-FISH proacuteb umožňujuacutece

viacfarebneacute pruacutežkovanie chromozoacutemov (banding) s vysokyacutem rozliacutešeniacutem (multicolor-banding mBAND FISH MCB) čo umožňuje identifikaacuteciu intrachromozoacutemovyacutech prestavieb (Obr 47) Nevyhnutnosťou mBAND-u je mať chromozoacutemy v metafaacuteze Taacuteto metoacuteda bola prvyacutekraacutet uskutočnenaacute na chromozoacuteme 5 v roku 1999 mBAND FISH umožňuje rozliacutešiť špecifickeacute oblasti chromozoacutemov na uacuterovni pruacutežku - bandu a sub-bandu s detekciou 550 bandov haploidneacuteho karyotypu

Obr 47 A - mBAND chromozoacutemu 11 - inverzia duplikovanej oblasti 11q223-q25 B - mBAND chromozoacutemu 3 - na kruhovom chromozoacuteme deleacutecia oblasti 3p263 C - mBAND chromozoacutemu 2 - potvrdenie inverzie duplikovanej časti chromozoacutemu (poskytnuteacute RNDr Dagmar Landlovou Medirex)

FISH metoacuteda a jej varianty (M-FISH mBAND SKY) majuacute v suacutečasnosti širokeacute využitie v

klinickej genetike v onkologickej genetike na detekciu aberaacuteciiacute v čase diagnoacutezy počas liečby po

47

liečbe monitorovanie po transplantaacutecii kostnej drene v prenataacutelnej a postnataacutelnej diagnostike pri detekcii submikroskopickyacutech deleacuteciiacute (napr DiGeorge syndroacutem - 22q112 delečnyacute syndroacutem PraderndashWilli syndroacutem- chromozoacutem 15q11-13) prostredniacutectvom FISH je možnaacute detekcia numerickyacutech zmien chromozoacutemov (trizoacutemia chromozoacutemu 21 pri Downovom syndroacuteme trizoacutemia chromozoacutemu 15 pri Patauovom syndroacuteme trizoacutemia chromozoacutemu 18 pri Edwardsovom syndroacuteme) rocirczne zmeny v počte pohlavnyacutech chromozoacutemov (monozoacutemia X pri Turnerovom syndroacuteme Klinefelterov syndroacutem s X chromozoacutemom naviac - XXY) podobne v predimplantačnej diagnostike

83 DNA Microarray (DNA mikro čip biočip) DNA mikročipovanie je technika využiacutevajuacuteca hybridizaacuteciu skuacutemanej nukleovej kyseliny

(cieľovaacute vzorka) s veľkyacutem množstvom oligonukleotidovyacutech proacuteb (desať tisiacutec až milioacuten) ktoreacute suacute prichyteneacute na pevnyacute podklad najčastejšie sklenyacute silikoacutenovyacute alebo nylonovyacute (doštička čip) Skuacutemanaacute nukleovaacute kyselina je pred hybridizaacuteciou fragmentovanaacute označenaacute fluorofoacuterom a denaturovanaacute Po kontakte čipu s cieľovou vzorkou ktoraacute je vlastne zmes označenyacutech oligonukleotidov značeneacute oligonukleotidy hybridizujuacute s oligonukleotidovyacutemi sekvenciami prichytenyacutemi na čipe Potom suacute na zaacuteklade fluorescencie detekovaneacute miesta kde došlo k hybridizaacutecii čiže vzorka obsahovala takuacuteto nukleotidovuacute sekvenciu Z jedneacuteho mikročipu sa ziacuteska obrovskeacute množstvo daacutet ktoreacute je vždy nutneacute softveacuterovo spracovať V dnešnej dobe existuje niekoľko firiem poskytujuacutecich komerčne mikročipy na objednaacutevku alebo si ich laboratoacuteria produkujuacute sami

Mikročipovanie prebieha nasledovne

1) Vytvorenie DNA čipu ndash tisiacutece rocircznych jednovlaacuteknovyacutech DNA oligonukleotidov znaacutemych sekvencii sa kovalentne naviažu na povrch doštičky vždy v určitej lokalite je niekoľko rovnakyacutech oligonukleotidov veľkosť takejto lokality je ˂ 200 microm Proacutebami mocircže byť DNA cDNA alebo syntetizovaneacute oligonukleotidy Už hotoveacute mikročipy ponuacutekajuacute viacereacute firmy (Affymetrix Agilent Technologies Eppendorf Illumina) alebo si ich jednotliveacute laboratoacuteria vyraacutebajuacute sami pomocou robotickyacutech zariadeniacute DNA čip sa vytvaacutera buď nanaacutešaniacutem kvapiek oligonukleotidov na podklad alebo synteacutezou oligonukleotidov in situ na čipe 2) Priacuteprava vzorky ndash nukleovaacute kyselina (mRNA DNA) sa purifikuje určiacute sa jej kvantita a kvalita (spektrofotometericky) fragmentuje resp v priacutepade mRNA sa syntetizuje cDNA v priacutepade potreby sa mocircže DNA amplifikovať PCR reakciou štiepiť restrikčnyacutemi endonukleaacutezami 3) Fluorescenčneacute označenie (zriedkavejšie raacutedioaktiacutevne) fragmentov DNA prebieha počas reverznej transkripcie alebo PCR amplifikaacutecie za uacutečasti fluorescenčne značenyacutech nukleotidov Keď sa analyzujuacute dve rocirczne vzorky napr zdraveacute tkanivo a naacutedoroveacute tkanivo označenie nukleovyacutech kyseliacuten v tyacutechto tkanivaacutech byacuteva rozdielne a to použitiacutem dvoch rocircznych fluorescenčnyacutech farbiacutev (napr zeleneacute a červeneacute) Pred hybridizaacuteciou je potrebneacute vzorku denaturovať čiacutem sa vytvoriacute zmes jednovlaacuteknovyacutech DNA označenyacutech značkou 4) Hybridizaacutecia s mikročipom ndash v špeciaacutelnom hybridizačnom roztoku hybridizujuacute komplementaacuterne sekvencie zo vzorky s priacuteslušnyacutemi oligonukleotidovyacutemi sondami naviazanyacutemi na čipe Potom sa čip obmyje aby došlo k odstraacuteneniu čiastočne hybridizovanyacutech nukleovyacutech kyseliacuten 5) Skenovanie mikročipu ndash skenerom čipov docircjde k ožiareniu čipu laserom pričom v mieste hybridizaacutecie fluorescenčne značenyacutech DNA fragmentov s proacutebou docircjde k emisii svetla určitej vlnovej dĺžky ktoruacute skener zaznamenaacute 6) Analyacuteza daacutet prebieha metoacutedami bioinformatiky spracovaniacutem softveacutermi sa zistiacute ktoreacute lokality čipu navzaacutejom hybridizovali v priacutepade použitia dvoch vzoriek kontrolnej a skuacutemanej je možneacute analyzovať ich relatiacutevnu intenzitu hybridizaacutecie (expresie určiteacuteho geacutenu)

Existujuacute štyri typy mikročipov 1) Čipy ur čeneacute na analyacutezu expresie (obsahujuacute cDNA proacuteby) pre tzv dvojkanaacutelovyacute experiment kedy je vzorka určenaacute k hybridizaacutecii na čipe ziacuteskanaacute zmiešaniacutem DNA fragmentov kontrolnej a skuacutemanej vzorky pričom fragmenty suacute rozdielne fluorescenčne označeneacute (napr zelenyacute fluorofoacuter pre kontrolnuacute vzorku a červenyacute pre skuacutemanuacute) Na zaacuteklade intenzity a typu fluorescencie sa deteguje expresia geacutenov typickaacute pre kontrolnuacute vzorku (napr zelenaacute fluorescencia) pre skuacutemanuacute vzorku (napr

48

červenaacute fluorescencia) a expresia podobnaacute u oboch vzoriek (žltaacute fluorescencia) neexprimovaneacute geacuteny (čierna fluorescencia) rocirczne odtiene (v zaacutevislosti od prevažujuacutecej hybridizaacutecie) (obr 48) 2) Čipy ur čeneacute na analyacutezu mutaacutecii použije sa genoacutemovaacute DNA označenaacute jednou fluorescenčnou farbičkou na určenie jednonukleotidovej zmeny (SNP ndash Single Nukleotide Polymorphism) 3) Čipy na komparatiacutevnu genoacutemovuacute hybridizaacuteciu (aCGH array Comparative Genomic Hybridization) ndash použiacutevaneacute na zistenie zvyacutešenia alebo zniacuteženia množstva chromozoacutemovyacutech fragmentov obsahujuacutecich geacuteny zodpovedneacute za určiteacute ochorenie Na analyacutezu sa použije skuacutemanaacute gDNA a referenčnaacute (kontrolnaacute) DNA každaacute sa značiacute inou fluorescenčnou farbičkou (princiacutep ako pri analyacuteze expresie) (obr 49 50) 4) Čipy CGH - SNP kombinovaneacute čipy ur čeneacute na analyacutezu aj mutaacuteciiacute SNP aj na komparatiacutevnu genoacutemovuacute hybridizaacuteciu CGH

Mikročipy majuacute rozsiahle využitie napriacuteklad v identifikaacuteciiacute novyacutech geacutenov vo vyacuteskume ich funkciiacute expresie v rocircznych podmienkach pri diagnostike mnohyacutech ochoreniacute vo farmakogenomike vo vyacuteskume vplyvu toxiacutenov

Obr 48 Heatmapa geacutenovej expresie vybranyacutech geacutenov (mRNA) mikročip obsahuje 46000 cDNA proacuteb (poskytnuteacute Ing Helenou Gbelcovou PhD Uacutestav lekaacuterskej bioloacutegie genetiky a klinickej genetiky LF UK a UNB)

49

Obr 49 Princiacutep komparatiacutevnej genoacutemovej hybridizaacutecie (aCGH - array comparative genomic hybridization) Obr 50 A) Vyacutesledok komparatiacutevnej genoacutemovej hybridizaacutecie (aCGH - array comparative genomic hybridization) vzorky DNA izolovanej plodovej vody U plodu s abnormaacutelnym ultrasonografickyacutem vyšetreniacutem bola identifikovanaacute duplikaacutecia oblasti 3q261q29 (modryacute paacutes) a deleacutecia oblasti 5p1533p151 (červenyacute paacutes) Pre porovnanie chromozoacutem 1 bez aberaacutecie b) Ten istyacute pacient ale ineacute softveacuteroveacute spracovanie (poskytnuteacute RNDr Miroslavom Tomkom PhD Medirex)

50

Odporuacutečanaacute a použitaacute literatuacutera

Odborneacute knihy Klug W S Cummings M R Spencer Ch A Palladino M A Concepts of Genetics jedenaacuteste vydanie (2015) Carson S Molecular Biology Techniques tretie vydanie (2012) Strachan T Read A Human Molecular Genetics štvrteacute vydanie (2011) Sudbery P Sudbery I Human Molecular Genetics tretie vydanie (2009)

Internetoveacute straacutenky

wwwncbinlmnihgov wwwmlpacom wwwthermofishercom wwwilluminacom wwwpromegask wwwqiagencom wwwambioncom

Odborneacute člaacutenky Chacon-Cortes D Griffiths L R Methods for extracting genomic DNA from whole blood samples current perspectives Journal of Biorepository Science for Applied Medicine Volume 2 strany 1- 9 Viltrop T Krjutskov K Palta P Metspalu A Comparison of DNA extraction methods for multiplex polymerase chain reaction Anal Biochem 2010 Volume 398(2) strany 260-262 Ing Martin Čermaacutek Molekulaacuterna cytogenetika v problematike familiaacuternych maligniacutet Onkoloacutegia Volume 2 strany 77 - 83 Livak KJ Schmittgen TD Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method Methods 2001 Volume 25(4) strany 402 - 408 Bustin S A Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays J Mol Endocrinol 2000 Volume 25(2) strany169 - 193

MOLEKULAacuteRNE METOacuteDY AKTUAacuteLNE POUŽIacuteVANEacute V KLINICKEJ GENETIKE RNDr Andrea Pastoraacutekovaacute PhD RNDr Robert Petrovič PhD Vydala Univerzita Komenskeacuteho v Bratislave Lekaacuterska fakulta Rozsah 50 straacuten 246 AH prveacute vydanie ISBN 978-80-223-4231-5

4

1 Izolaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten 11 Izolaacutecia DNA

Prvuacute izolaacuteciu DNA uskutočnil v roku 1869 švajčiarsky vedec Friedrich Miescher Izolaacutecia DNA je kľuacutečovyacutem krokom pre množstvo naacuteslednyacutech aplikaacutecii v oblasti molekulovej bioloacutegie a lekaacuterskej genetiky Najčastejšiacutem a najdostupnejšiacutem materiaacutelom vhodnyacutem na izolaacuteciu ľudskej genoacutemovej DNA suacute leukocyty krvi DNA je možneacute ziacuteskať aj z inyacutech tkaniacutev a telesnyacutech tekutiacuten ako suacute napriacuteklad svaly koža kosti zuby sperma sliny moč plodovaacute voda atď Metoacuted izolaacutecie genoacutemovej DNA je viacero Vyacuteber zaacutevisiacute od technickeacuteho vybavenia laboratoacuteria časovyacutech a finančnyacutech možnostiacute ako aj od materiaacutelu z ktoreacuteho sa DNA izoluje od podmienok jej uskladnenia a od množstva potrebneacuteho na analyacutezu Najviac využiacutevanyacutem zdrojom DNA je perifeacuterna krv preto sa zameriame na extrakčneacute protokoly z tohto materiaacutelu Existujuacute viacereacute metoacutedy na izolaacuteciu DNA ktoreacute majuacute však spoločneacute kroky

1) rozrušenie bunkovej membraacuteny a lyacuteza buniek 2) denaturaacutecia nukleoproteiacutenoveacuteho komplexu 3) inaktivaacutecia nukleaacutez a ďalšiacutech bunkovyacutech enzyacutemov 4) DNA precipitaacutecia

Lyacuteza buniek sa dosahuje použitiacutem detergentov a enzyacutemov Sodnaacute soľ dodecylsulfaacutetu (SDS) TritonTMX-100 suacute priacuteklady bežnyacutech detergentov solubilizujuacutecich bunkovuacute membraacutenu Spolu k detergentom sa často pridaacutevajuacute enzyacutemy a to za uacutečelom štiepenia glykoproteiacutenov a inaktivaacutecie DNaacutez Bunkoveacute DNaacutezy suacute enzyacutemy ktoreacute štiepia DNA a tyacutem znehodnocujuacute a znižujuacute vyacuteťažok a kvalitu nukleovyacutech kyseliacuten

Precipitaacutecia DNA z roztoku prebieha pridaniacutem vysokej koncentraacutecie soli (napr octan amoacutenny) a za priacutetomnosti rozpuacutešťadiel (napr etanol v konečnej koncentraacutecii 70-80 alebo izopropanol v konečnej koncentraacutecii 40-50)

Niektoreacute protokoly pokračujuacute premytiacutem DNA precipitaacutetu 70 etanolom čiacutem docircjde k zbaveniu sa nadbytočnyacutech soliacute Nakoniec sa DNA rozpustiacute vo vode alebo v pufri napr TE (pozostaacutevajuacutecom z 10mM Tris 1mM EDTA-kyselina etyleacutendiamintetraoctovaacute) TE pufor sa použiacuteva pre dlhodobeacute uskladnenie DNA pretože zabraňuje degradaacutecii DNA nukleaacutezami nevhodnyacutem pH ťažkyacutemi kovmi a oxidaacuteciou voľnyacutemi radikaacutelmi Tris udržiava vhodneacute pH 7-8 a EDTA viaže dvojmocneacute ioacuteny (ako Mg2+ a Ca2+ ktoreacute suacute potrebneacute pre funkciu DNaacutez) ako aj braacuteni oxidačneacutemu poškodeniu ťažkyacutemi kovmi

Postupov izolaacutecie DNA je viacero vyacuteber zaacutevisiacute od naacutesledneacuteho použitia naacuterokov na kvantitu a kvalitu technickeacuteho vybavenia laboratoacuteria a potreby uskladnenia pre buduacutece použitie Suacute to najmauml

1) Priacuteprava a použitie hrubeacuteho lyzaacutetu kde je priacutetomnaacute DNA Taacuteto bdquoryacutechla a špinavaacuteldquo metoacuteda pozostaacuteva z lyacutezy buniek pri vysokej teplote (90degC 20minuacutet) alebo je uskutočnenaacute proteinaacutezou K Lyzaacutet sa použije priamo v ďalšiacutech aplikaacuteciaacutech Priacutetomnosť kontaminantov v lyzaacutete obmedzuje jeho použitie ako aj skladovanie DNA 2) Vysoľovacie metoacutedy začiacutenajuacute priacutepravou hrubeacuteho lyzaacutetu pokračujuacute tzv vysoľovaniacutem kedy sa proteiacuteny a ineacute kontaminanty precipitujuacute pri vysokej koncentraacutecii soli (octan draselnyacute octan amoacutenny) precipitaacutet je eliminovanyacute centrifugaacuteciou a DNA sa ziacuteskava z roztoku naacuteslednou alkoholovou precipitaacuteciou Vyacuteťažok DNA a jej čistota variacuteruje podľa použitej metodiky 3) Organickaacute extrakcia využiacuteva organickeacute rozpuacutešťadlaacute na odstraacutenenie kontaminantov z bunkoveacuteho lyzaacutetu Bunky suacute lyzovaneacute použitiacutem detergentov lyzaacutet sa zmieša so zmesou fenolu chloroformu a izoamylalkoholu Centrifugaacuteciou zmesi sa docieli oddelenie dvoch vrstiev organickej vrstvy (faacutezy) obsahujuacutecej kontaminanty a vodnej vrstvy (faacutezy) s DNA Zo ziacuteskanej vodnej faacutezy sa DNA izoluje najčastejšie alkoholovou precipitaacuteciou Organickaacute extrakcia bola veľmi využiacutevanaacute v laboratoacuteriaacutech v minulosti v suacutečasnosti je maacutelo použiacutevanaacute na rutinnuacute diagnostiku jednak pretože je časovo naacuteročnaacute

5

DNA mocircže obsahovať fenolchloroform ktoreacute inhibujuacute enzymatickeacute reakcie a taacuteto metoacuteda nie je vhodnaacute ani na izolaacuteciu v automatoch 4) Centrifugaacutecia v gradiente chloridu ceacutezneho (CsCl) umožňuje ziacuteskať genoacutemovuacute DNA vysokej kvality avšak taacuteto metoacuteda je časovo naacuteročnaacute praacutecna drahaacute (potrebnaacute ultracentrifuacutega) a nepoužiteľnaacute v automatoch nie je rutinne využiacutevanaacute Bunkovyacute lyzaacutet je precipitovanyacute alkoholom DNA roztok je zmiešanyacute s CsCl a etiacutediumbromidom nasleduje niekoľkohodinovaacute centrifugaacutecia v ultracentrifuacutege DNA je viditeľnaacute v podobe pruacutežku po jej odobratiacute sa extrahuje izopropanolom aby došlo k odstraacuteneniu etiacutediumbromidu a precipituje sa etanolom 5) Minikoloacutenovaacute (koloacutenkovaacute) purifikaacutecia využiacuteva schopnosť materiaacutelu v minikoloacutene (matrix matrica) adsorbovať DNA za určityacutech konkreacutetnych podmienok pH a koncentraacutecie soli (obr 1) Existujuacute viacereacute typy materiaacutelov viažucich DNA ktoreacute suacute na uacutečely izolaacutecie DNA umiestneneacute v minikoloacutene hydrofilneacute matrice viažuce vodiacutek v priacutetomnosti chaotropnyacutech činidiel matrice využiacutevajuacutece vyacutemenu ioacutenov (ioacutenomeničoveacute) matrice s určitou afinitou a veľkostnou selekciou

Vaumlčšina minikoloacutenovyacutech metoacuted maacute podobnyacute postup na začiatku prebehne lyacuteza buniek potom nasleduje DNA adsorbcia na matricu centrifugovateľnyacutech minikoloacuten premytie nukleovej kyseliny adsorbovanej na matricu v minikoloacutene čiacutem docircjde k zbaveniu sa kontaminantov a finaacutelna eluacutecia (uvoľnenie) DNA

Kremičitanoveacute (SiO2 Silika) matrice majuacute vynikajuacutecu schopnosť viazať DNA pretože suacute kladne nabiteacute a majuacute vysokuacute afinitu k negatiacutevne nabitej DNA V prostrediacute vysokej koncentraacutecie chaotropnyacutech soliacute docircjde k adsorpcii DNA na kremičitanovuacute matricu (silica geacutel) zatiaľ čo bunkoveacute proteiacuteny a ineacute metabolity zostanuacute v roztoku a naacutesledne suacute vymyteacute z koloacuteny DNA vhodnaacute na diagnostickeacute použitie je ziacuteskanaacute eluacuteciou zo silika matrice použitiacutem pufra s niacutezkou koncentraacuteciou soliacute (TE destilovanaacute voda) Existuje množstvo komerčne priacutestupnyacutech kitov (suacuteprav) ktoreacute obsahujuacute všetky potrebneacute chemikaacutelie a minikoloacuteny Izolaacutecia DNA prostredniacutectvom kitu založenom na silika materiaacuteli trvaacute od 40-60minuacutet pričom sa ziacuteska vysokokvalitnaacute DNA vo vysokom vyacuteťažku Dnes suacute k dispoziacutecii kity vhodneacute na poloautomatizovanuacute alebo plnoautomatizovanuacute izolaacuteciu DNA (obr 3)

Ďalšou možnosťou je použiť DNA izolačnyacute kit využiacutevajuacuteci magnetickeacute guľocircčky ktoreacute suacute pokryteacute materiaacutelom viažucim DNA (polymeacutery silika hydroxyapatit) DNA sa naviaže na magnetickeacute guľocircčky a prostredniacutectvom magnetickej sily magnetu je možneacute premyacutevať naviazanuacute DNA V tomto priacutepade nie je potrebneacute použiť centrifugaacuteciu

Obr 1 Minikoloacutena a postup izolaacutecie DNA

12 Izolaacutecia RNA

Ziacuteskanie RNA vysokej kvality je prvyacutem a často najkritickejšiacutem krokom pre molekulaacuterne techniky typu kvantifikaacutecie expresie určiteacuteho geacutenu metoacutedou real-time PCR (RT-qPCR) analyacutezy transkriptoacutemu sekvenovanovaniacutem ďalšej generaacutecie (NGS) analyacutezy RNA profilu mikročipmi northern analyacutezy a konštrukcie cDNA knižnice Pre dosiahnutie čo najcitlivejšiacutech a biologicky

6

najrelevantnejšiacutech vyacutesledkov je potrebneacute dodržať pracovneacute postupy pred počas a po RNA purifikaacutecii Pre optimalizaacuteciu RNA izolaacutecie a analyacutezy suacute docircležiteacute nasledovneacute kroky 1) manipulaacutecia so vzorkami určenyacutemi na RNA izolaacuteciu 2) vyacuteber metoacutedy izolaacutecie RNA 3) uskladnenie RNA

Klasickaacute izolaacutecia RNA prebieha vaumlčšinou v priacutetomnosti inhibiacutetorov ribonukleaacutez Ribonukleaacutezy (RNaacutezy) suacute bunkoveacute enzyacutemy degradujuacutece RNA Inhibiacutetory RNaacutez suacute silneacute denaturanty ktoreacute vo vzorke znižujuacute riziko RNA degradaacutecie (napr guanidiacutenoveacute soli dodecylsufaacutet sodnyacute - SDS chemikaacutelie obsahujuacutece fenol)

Pred vlastnou izolaacuteciou RNA je potrebneacute sterilizovať všetok materiaacutel (skuacutemavky špičky pipety vodu laboratoacuterny priestor) (obr 2) ktoryacute bude v kontakte so vzorkou určenou na izolaacuteciu RNA Kyacutem sa vzorka začne spracovaacutevať udržiava sa v tekutom dusiacuteku na suchom ľade alebo je vloženaacute do špeciaacutelnych stabilizačnyacutech roztokov (napr RNAlaterreg) alebo špeciaacutelnych skuacutemaviek so stabilizačnyacutem roztokom napr PAXgenereg Blood RNA Tube

Existuje niekoľko spocircsobov izolaacutecie RNA

1) Organickaacute extrakčnaacute metoacuteda je zlatyacutem štandardom izolaacutecie RNA Na začiatku izolaacutecie sa vzorka homogenizuje v roztoku obsahujuacutecom fenol (TRIzolreg RNAzolreg RT) naacutesledne sa centrifuguje Počas centrifugaacutecie dochaacutedza vo vzorke k separaacutecii troch vrstiev spodnej organickej faacutezy strednej faacutezy obsahujuacutecej denaturovaneacute proteiacuteny a genoacutemovuacute DNA a vrchnej vodnej faacutezy s RNA Po odobratiacute vrchnej faacutezy sa RNA z nej precipituje (vyzraacuteža) alkoholom a naacutesledne sa rehydratuje 2) Minikoloacutenovaacute metoacuteda (filtračnaacute) využiacuteva membraacuteny (zo sklenyacutech vlaacutekien silika alebo ioacutenomeničoveacute membraacuteny) vloženeacute do minikoloacuten Vzorka je lyzovanaacute v pufri obsahujuacutecom RNaacutezoveacute inhibiacutetory nukleoveacute kyseliny sa naviažu na membraacutenu keď lyzaacutet prechaacutedza membraacutenou počas centrifugaacutecie Membraacutena s naviazanou RNA je viackraacutet premyacutevanaacute RNA sa ziacuteska centrifugaacuteciou do novej skuacutemavky po eluacutecii vhodnyacutem elučnyacutem roztokom 3) Metoacuteda využiacutevajuacuteca magnetickeacute partikuly obsahujuacutece paramagnetickeacute vnuacutetro obklopeneacute obalom modifikovanyacutem tak aby viazal žiaduci objekt teda RNA Vzorka lyzovanaacute v roztoku obsahujuacutecom RNaacutezoveacute inhibiacutetory sa zmieša s magnetickyacutemi partikulami kedy docircjde k naviazaniu RNA na povrch magnetickyacutech partikuacutel Opakovanyacutem použitiacutem externeacuteho magnetickeacuteho poľa je možneacute vychytať magnetickeacute partikuly s naviazanou nukleovou kyselinou odstraacuteneniacutem magnetickeacuteho poľa zase uvoľniť a resupendovať v premyacutevaciacutech roztokoch Na zaacutever sa RNA uvoľniacute do elučneacuteho roztoku a magnetickeacute partikuly sa odstraacutenia 4) Priama lyacuteza sa použiacuteva na priacutepravu vzorky použitiacutem lyzačnyacutech roztokov ktoreacute lyzujuacute vzorku stabilizujuacute nukleoveacute kyseliny a takto pripravenaacute RNA mocircže byť použitaacute na ďalšie analyacutezy Priama lyacuteza teda nie je purifikačnaacute metoacuteda v pravom zmysle slova

Ziacuteskanuacute RNA je potrebneacute kvantifikova ť Ide o docircležityacute a nevyhnutnyacute krok ktoryacute predchaacutedza RNA analyacutezu Existujuacute viacereacute možnosti kvantifikaacutecie nukleovyacutech kyseliacuten ktoryacutem je venovanaacute samostatnaacute časť

Skladovanie RNA - RNA musiacute byť resuspendovanaacute resp eluovanaacute v roztoku bez RNaacutez na tento uacutečel suacute komerčne dostupneacute viacereacute roztoky na skladovanie RNA zabezpečujuacutece maximaacutelnu ochranu pred RNaacutezami RNA sa odporuacuteča skladovať pri teplote ndash 80degC v alikvoacutetoch (rozpipetovanaacute v menšiacutech množstvaacutech v mikroskuacutemavkaacutech) určenyacutech na jedno použitie

7

Obr 2 Laminaacuterny box na izolaacuteciu nukleovyacutech kyseliacuten praacutecu s DNA RNA atď Obr 3 Automatickyacute pipetovaciacute robot napr na izolaacuteciu 96 vzoriek DNA

8

2 Stanovenie kvantity a kvality nukleovyacutech kyseliacuten

Docircležiteacute je určenie koncentraacutecie a čistoty izolovanej DNA a RNA pretože analyacutezy ktoreacute nasledujuacute po izolaacutecii nukleovyacutech kyseliacuten často vyžadujuacute presneacute množstvo a čistotu nukleovyacutech kyseliacuten (NK bez priacutemesiacute) Metoacuted kvantifikaacutecie NK je niekoľko najpoužiacutevanejšie suacute spektrofotometrickaacute kvantifikaacutecia a kvantifikaacutecia UV fluorescenciou za priacutetomnosti farbičky

21 Spektrofotometrickaacute kvantifikaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten

Nukleoveacute kyseliny špecificky absorbujuacute ultrafialoveacute svetlo Vzorka s NK je v spektrofotometri (obr 6) vystavenaacute ultrafialoveacutemu svetlu o vlnovej dĺžke 260nm fotodetektor naacutesledne zmeria svetlo ktoreacute prejde vzorkou čiacutem viac svetla vzorka pohltiacute (absorbuje) tyacutem je vyššia koncentraacutecia nukleovej kyseliny vo vzorke Vyacutepočet koncentraacutecie NK zaacutevisiacute od toho či ide o DNA alebo RNA či je jednovlaacuteknovaacute alebo dvojvlaacuteknovaacute dsDNA c = A260002 [microgml] ssDNA c = A2600027 [microgml] RNA c = A2600025 [microgml]

Teda ak absorbancia dsDNA je 1 koncentraacutecia DNA vo vzorke je 50 microgml (pozn v priacutepade ak je draacuteha luacuteča 1cm)

Pokiaľ poznaacuteme sekvenciu napr pri synteacuteze primeru (ssDNA) mocircžeme z nej vypočiacutetať molekulovuacute hmotnosť a určiť priamo molaacuternu koncentraacuteciu nukleovej kyseliny (pmolmicrol) c = A260 lowast (100[15A + 071lowastC + 12lowastG + 084lowastT]) [pmolmicrol] A je počet adeniacutenov (v skutočnosti dATP) C je počet cytoziacutenov (dCTP) G je počet guaniacutenov (dGTP) a T počet tymiacutenov (dTTP)

Predpokladom pre spraacutevne určenie koncentraacutecie na zaacuteklade absorbancie je samozrejme čistota nukleovej kyseliny vo vzorke Čistota NK sa určuje podľa absorbčnej krivky popriacutepade zjednodušene na zaacuteklade pomeru absorbanciiacute pri 260 a 280 nm pretože proteiacuteny absorbujuacute svetlo vlnovej dĺžky 280nm Čistaacute DNA maacute pomer absorbanciiacute 260280 (A260280) pohybujuacutece sa okolo 18 čistaacute RNA maacute pomer absorbancii A260280 približne 2

Vzorku nukleovyacutech kyseliacuten mocircžu okrem proteiacutenov kontaminovať aj ďalšie laacutetky ako je fenol ktoryacute sa často využiacuteva pri izolaacutecii NK Takto izolovaneacute vzorky nukleovyacutech kyseliacuten nekontaminovaneacute fenolom by mali mať A260280 okolo 2 Ďalšie kontaminanty sa zisťujuacute absorbciou svetla pri 230 nm a 330 nm

22 Kvantifikaacutecia s použitiacutem fluorescenčnyacutech farbiacutev

Ďalšou možnosťou ako zmerať koncentraacuteciu nukleovyacutech kyseliacuten je zmeranie fluorescencie farbiva (napr etidiumbromid) ktoreacute sa viaže na nukleovuacute kyselinu a selektiacutevne svieti v priacutepade že je naviazaneacute na NK Metoacuteda využitia fluorescenčneacuteho farbiva naviazaneacuteho na NK sa použiacuteva v priacutepade ak je koncentraacutecia NK priacuteliš niacutezka na kvantifikaacuteciu spektrofotometrom ako aj v priacutepade že je NK kontaminovanaacute laacutetkou (kontaminantom) absorbujuacutecim svetlo vlnovej dĺžky 260nm 221 Využitie migraacutecie nukleovej kyseliny v geacuteli s jej naacuteslednou fluorescenčnou detekciou

Ak predpokladaacuteme niacutezku koncentraacuteciu NK na jej zistenie použijeme elektroforetickuacute

migraacuteciu NK v geacuteli (mocircže sa použiť agaroacutezovyacute alebo polyakrylamidovyacute geacutel) fluorescenčneacute farbivo je buď primiešaneacute do vzorky NK alebo priamo do geacutelu Spolu so vzorkou NK neznaacutemej koncentraacutecie migruje v geacuteli vo vedľajšej draacutehe vzorka NK so znaacutemou koncentraacuteciou Na zaacuteklade porovnania fluorescencie (po vystaveniacute geacutelu s NK svetlu o konkreacutetnej vlnovej dĺžke) vzorky so znaacutemou

9

koncentraacuteciu a vzorky neznaacutemej koncentraacutecie sa urobiacute odhad resp sa vyacutesledok kalkuluje počiacutetačovyacutem softveacuterom denzitometricky (obr 4)

222 Využitie kvantifikaacutecie množstva nukleovyacutech kyseliacuten použitiacutem real-time PCR metoacutedy

V priacutepade veľmi maleacuteho množstva NK ktoreacute nie je možneacute kvantifikovať ani geacutelovou elektroforeacutezou resp potrebujeme zistiť koncentraacuteciu NK veľmi presne u maleacuteho množstva NK (napr pre kriminalistiku) použije sa metoacuteda absoluacutetnej kvantifikaacutecie prostredniacutectvom real-time PCR (kvantifika čnej PCR qPCR) Princiacutep metoacutedy spočiacuteva v porovnaniacute amplifikaacutecie určiteacuteho uacuteseku nukleovej kyseliny vo vzorke neznaacutemej koncentraacutecii s amplifikaacuteciou tej istej sekvencie vo vzorke presne definovanej koncentraacutecie (obr 5) qPCR je možneacute kvantifikovať koncentraacuteciu raacutedovo v pgul 223 Kvantifikaacutecia fluorospektrofotometrom (fluori metrom)

Ak maacuteme dostatočneacute množstvo vzorky je možneacute na kvantifikaacuteciu použiť fluorospektrofotometer v tomto priacutepade je vzorka zmiešanaacute s fluorescenčnyacutem farbivom a je meranaacute emitovanaacute fluorescencia z ktorej sa vypočiacuteta koncentraacutecia

Moderneacute spektrofotometre a fluorimetre suacute konštruovaneacute tak aby na meranie bolo použiteacute minimaacutelne množstvo vzorky NK (napr pre priacutestroje NanoDrop je potrebnyacute len 05-1 microl vzorky) Pre porovnanie NanoDrop spektrofotometer (NanoDrop 2000c) je schopnyacute zmerať koncentraacutecie od 04 to 15 000 ngmicroL dsDNA NanoDrop fluorospektrometer 005 do 2000 pgmicroL Spektrofotometre a fluorofotometre suacute po meraniacute schopneacute vďaka softveacuteroveacutemu vybaveniu vypočiacutetať nielen koncentraacuteciu ale aj čistotu vzorky (httpwwwnanodropcom) Obr 4 Kvantifikaacutecia nukleovej kyseliny porovnaniacutem s fragmentom podobnej dĺžky a znaacutemej koncentraacutecie (po migraacutecii v agaroacutezovom geacuteli v jednosmernom elektrickom pruacutede a naacuteslednej fluorescenčnej detekcii) - odhad DNA v 3 draacutehe cca 100ng porovnaniacutem s 1000bp fragmentom štandardu molekulovyacutech hmotnostiacute (šmh)

10

Obr 5 Absoluacutetna kvantifikaacutecia DNA priacutestrojom real-time PCR cykleacuterom porovnaniacutem amplifikaacutecie uacuteseku DNA v skuacutemanej vzorke s amplifikaacuteciou vzorky so znaacutemou kvantitou Okrem amplifikaacutecie skuacutemanej vzorky je treba urobiť štandardnuacute krivku amplifikaacutecie vzorky znaacutemej koncentraacutecie z ktorej sa koncentraacutecia skuacutemanej vzorky odčiacuteta V kriminalistike sa bežne použiacuteva pridanie vnuacutetornej kontroly ku vzorke na určenie čistoty vzorky (v priacutetomnosti inhibiacutetorov nedocircjde k amplifikaacutecii žiadnej DNA) Vnuacutetornaacute kontrola je už priacutetomnaacute v kite čiže sa automaticky pridaacuteva pri priacuteprave vzoriek na qPCR amplifikaacuteciu sluacuteži na zistenie priacutetomnosti inhibiacutetorov v skuacutemanej vzorke teda v priacutepade že nedocircjde k amplifikaacutecii vo vzorke sluacuteži na rozliacutešenie či je koncentraacutecia DNA priacuteliš niacutezka alebo suacute vo vzorke priacutetomneacute inhibiacutetory Bežnaacute mediciacutenska molekulaacuterno-genetickaacute diagnostika nevyžaduje priacutetomnosť vnuacutetornej kontroly keďže nukleoveacute kyseliny suacute prevažne izolovaneacute kitmi z krvi čiže je zabezpečenaacute vysokaacute kvalita a čistota naizolovanej NK Obr 6 Spektrofotometer (NanoPhotometer) a ukaacutežka vyacutesledkou merania koncentraacutecie RNA izolovanej minikolonovou metoacutedou

11

3 PCR (polymeraacutezovaacute reťazovaacute reakcia)

Je metoacuteda vyvinutaacute v roku 1983 Karym Mullisom ocenenaacute v roku 1993 Nobelovou cenou za cheacutemiu Polymeraacutezovaacute reťazovaacute reakcia je založenaacute na schopnosti DNA polymeraacutezy syntetizovať noveacute vlaacutekno DNA podľa templaacutetoveacuteho vlaacutekna na zaacuteklade princiacutepu komplementarity DNA polymeraacuteza je schopnaacute pripaacutejať nukleotidy len k voľnej 3acuteOH skupine preto potrebuje primer (čiacutetaj prajmer) ku ktoreacutemu je schopnaacute pridaacutevať nukleotidy Primery suacute kraacutetke jednovlaacuteknoveacute oligonukleotidy ktoreacute umožňujuacute jednak DNA polymeraacuteze začať so synteacutezou noveacuteho vlaacutekna na druhej strane ohraničujuacute špecifickuacute oblasť ktoruacute chceme amplifikovať (namnožiť) Vyacutesledkom PCR reakcie je obrovskyacute počet koacutepii špecifickej sekvencie (obr 7) PCR v podstate napodobňuje replikaacuteciu DNA v in vitro podmienkach s rozdielom že nedochaacutedza k replikaacutecii celej DNA ale len vybraneacuteho primermi ohraničeneacuteho miesta

31 Najdocircležitejšie PCR komponenty

Templaacutetovaacute DNA je vzorka DNA obsahujuacuteca cieľovuacute sekvenciu Na začiatku reakcie docircjde pri vysokej teplote k denaturaacutecii a separaacutecii jednotlivyacutech vlaacutekien dvojvlaacuteknovej DNA

Enzyacutem DNA polymeraacuteza syntetizuje noveacute DNA vlaacutekno komplementaacuterne k cieľovej sekvencii Najčastejšie použiacutevanou a prvou DNA polymeraacutezou je Taq DNA polymeraacuteza (z termofilnej bakteacuterie Thermus aquaticus) zatiaľ čo Pfu DNA polymeraacuteza (z Pyrococcus furiosus) je preferovanaacute kvocircli tzv vysokej fidelite čo je schopnosť inkorporovať spraacutevnu baacutezu do novosyntetizovaneacuteho vlaacutekna DNA DNA polymeraacutezy musia mať dve vlastnosti schopnosť syntetizovať noveacute vlaacutekno DNA podľa templaacutetovej DNA a byť termostabilneacute čiže rezistentneacute na vysokeacute teploty (cca 100degC) V suacutečasnosti sa v laboratoacuteriaacutech často použiacutevajuacute rekombinantneacute polymeraacutezy s požadovanyacutemi vlastnosťami Napriacuteklad pre PCR ktorej produkt bude klonovanyacute je docircležiteacute použiť polymeraacutezu ktoraacute je schopnaacute opraviť vlastnuacute chybu v priacutepade inkorporaacutecie nespraacutevnej baacutezy pri synteacuteze noveacuteho reťazca Schopnosť opravovať nespraacutevne inkorporovaneacute baacutezy počas synteacutezy noveacuteho vlaacutekna DNA sa nazyacuteva tzv proofreading aktivita ktoraacute je zabezpečenaacute 3rarr5acute exonukleaacutezovou aktivitou takejto polymeraacutezy Pred vlastnou molekulaacuterno-genetickou diagnostikou je treba optimalizovať podmienky PCR reakcie pre konkreacutetnu DNA polymeraacutezu a pre špecifickeacute primery treba zistiť optimaacutelnu teplotu annealingu (hybridizaacutecie) primerov koncentraacutecie jednotlivyacutech zložiek PCR reakcie (napr MgCl2)

Primery suacute kraacutetke jednovlaacuteknoveacute DNA sekvencie komplementaacuterne k cieľovej sekvencii DNA polymeraacuteza začiacutena syntetizovať noveacute vlaacutekno z 3acutekonca primeru Docircležitou charakteristikou primerov je teplota topenia (Tm) t j teplota pri ktorej polovica DNA duplexov je disociovanaacute na jednovlaacuteknoveacute molekuly

Nukleotidy (dNTP deoxyribonukleotidtrifosfaacutety) suacute stavebneacute prvky pre novosyntetizovanuacute DNA molekulu

Veľmi praktickyacutem riešeniacutem pre molekulaacuterno-genetickeacute diagnostickeacute laboratoacuteria je tzv mastermix to je roztok v ktorom už je priacutetomneacute všetko potrebneacute pre priebeh PCR reakcie samozrejme okrem primerov a templaacutetovej DNA sekvencie PCR Master Mix (2X) od firmy ThermoFisher Scientific je jednyacutem z takyacutechto mixov obsahuje Taq DNA polymeraacutezu tlmivyacute roztok (pufor) MgCl2 a všetky deoxyribonukleotidy trifosfaacutety

Tabuľka č 1 uvaacutedza ako sa PCR reakcia z mastermixu pripravuje pre jednu vzorku Keďže v laboratoacuteriu sa zriedka robiacute PCR reakcia s jednou vzorkou treba si pripraviť tzv premix (tj PCR reakcie pre vaumlčšiacute počet vzoriek ale bez templaacutetovej DNA) ktoryacute sa rozdeliacute do mikroskuacutemaviek a až potom sa k nim pridaacute DNA resp cDNA

12

Tab 1 Priacuteprava PCR premixu

Celkovyacute objem jednej PCR reakcie 10 microl Počet vzoriek 8 2x PCR master mix 5 40

primer sense (10microM) 05 4

primer antisense (10microM) 05 4

H2O 35 28

DNA cDNA 05

rozpipetovať premix po 95microl do mikroskuacutemaviek až potom pridať do každej mikroskuacutemavky zvlaacutešť DNA cDNA

spolu objem 10 76

PCR amplif ikaacutecia je cyklickyacute proces pozostaacutevajuacuteci z troch krokov (obr 7) 1) denaturaacutecia dvojvlaacuteknovej DNA pri vysokej teplote (95degC) 2) hybridizaacutecia (annealing) primerov k špecifickej sekvencii DNA pri teplote vhodnej pre konkreacutetne primery 3) polymerizaacutecia (synteacuteza) novyacutech vlaacutekien DNA (72degC)

Obr 7 Princiacutep PCR

Tieto tri kroky sa opakujuacute 25 ndash 40 kraacutet pričom pri každom cykle sa počet molekuacutel zdvojnaacutesobiacute (vyacuteslednyacute počet cieľovej sekvencie je 2n+1 ak na začiatku bola jedna dvojvlaacuteknovaacute DNA a počet cyklov je n) PCR prebieha v termaacutelnom cykleacuteri (teplotnom cyklovači) je to priacutestroj (obr 8) kde je možneacute vykonať a naprogramovať celyacute termaacutelny priebeh PCR reakcie Tabuľka č 2 je priacutekladom termaacutelneho programu pre konkreacutetnu PCR reakciu

Po PCR reakcii je vyacuteslednyacute produkt možneacute vizualizovať elektroforeticky resp použiť na ďalšiu analyacutezu

13

Tab 2 Priacuteklad klasickeacuteho teplotneacuteho a časoveacuteho profilu PCR PCR Teplota Čas Opakovanie

95degC 2 minuacutety

95degC 15 sekuacutend

66degC 60 sekuacutend 30x

72degC 60 sekuacutend

72degC 5 minuacutet

Obr 8 Termaacutelny cykleacuter v procese a otvorenyacute s mikroskuacutemavkami

32 Variaacutecie PCR

Hot-start PCR využiacuteva DNA polymeraacutezu ktoruacute je treba aktivovať vysokou teplotou (napr 95degC 10 minuacutet) Vyacutehodou použiacutevania hot-start polymeraacutez je možnosť pracovať pri laboratoacuternej teplote keďže polymeraacuteza je pri bežnej teplote neaktiacutevna a tyacutem nemocircže docircjsť k vzniku nešpecifickyacutech produktov

Touchdown PCR maacute v počiatočnyacutech cykloch vyššiu teplotu annealingu (uacutečelom je zvyacutešiť

špecificitu PCR produktov na začiatku PCR) neskocircr sa teplota annealingu zniacuteži čo maacute za naacutesledok vyššiacute vyacuteťažok PCR produktu

Nested PCR maacute dva kroky a potrebuje dva paacutery primerov V prvom kroku sa prostredniacutectvom

prvej sady primerov amplifikuje dlhšiacute DNA fragment Ten sa použije ako templaacutet v druhom kroku s druhou sadou primerov s vyacuteslednyacutem kratšiacutem DNA produktom Nested PCR zvyšuje špecifickosť a citlivosť diagnostickyacutech PCR

Multiplex PCR je vlastne viac PCR reakciiacute prebiehajuacutecich v jednej skuacutemavke suacutečasne

V reakčnej zmesi je viac paacuterov primerov suacutečasne prebehne amplifikaacutecia viaceryacutech uacutesekov DNA takto dochaacutedza k šetreniu vzorky reakčnej zmesi a pracovneacuteho času

14

Real-time PCR je venovanaacute špeciaacutelna časť v skriptaacutech Sluacuteži na kvantifikaacuteciu PCR produktu v reaacutelnom čase na zaacuteklade merania fluorescencie okrem kvantifikaacutecie je využiacutevanaacute aj na určenie genotypov

RT-PCR je variaacutecia PCR umožňujuacuteca amplifikaacuteciu DNA sekvencie z vyacutechodiskovej RNA

sekvencie Najskocircr musiacute prebehnuacuteť prepis RNA do jednovlaacuteknovej cDNA prostredniacutectvom reverznej transkriptaacutezy naacutesledne sa cDNA použije pre PCR Selektiacutevnym použitiacutem primerov pri reverznej transkripcii mocircžeme uacutečelovo prepiacutesať buď celkovuacute RNA (primery - random hexameacutery) alebo len mRNA (primery - oligoT)

Alelovo-špecifickaacute PCR (AS-PCR) (obr 9) sluacuteži na detekciu konkreacutetnych mutaacuteciiacute

a jednonukleotidovyacutech polymorfizmov (SNP) Použije sa sada 3 primerov v dvoch kombinaacuteciaacutech PCR reakciiacute dva primery majuacute odlišnuacute sekvenciu na 3acute-koncoch jeden na detekciu wt (wild type) a druhyacute primer na detekciu mutantnej alely reakcia neprebehne ak miesto na templaacutetovej DNA nie je komplementaacuterne k 3acute-koncu primeru pretože DNA polymeraacuteza vyžaduje uacuteplnuacute hybridizaacuteciu primera na 3acute-konci Takto je možneacute rozliacutešiť priacutetomnosť štandardnej (wildtype ndash wt) a mutantnej alely resp SNP (obr 9) AS-PCR je znaacutema aj pod ďalšiacutemi naacutezvami ASO-PCR (allele-specific oligonucleotide PCR) ARMS (amplification-refractory mutation system)

Obr 9 Alelovo-špecifickaacute PCR (AS-PCR)

Mutageneacuteza prostredniacutectvom PCR (site directed mutagenesis) sa použiacuteva keď je potrebneacute vytvoriť mutaacuteciu v špecifickom mieste geacutenu primerprimery majuacute modifikovanuacute sekvenciu tak že obsahujuacute mutaacuteciu v strednej časti čo neovplyvniacute hybridizaacuteciu primerov s templaacutetovou DNA pričom vyacutesledkom je PCR produkt s cielene mutovanou DNA sekvenciou

Asymetrickaacute PCR sa použiacuteva na synteacutezu koacutepiiacute jedneacuteho vlaacutekna z templaacutetovej DNA a to

použitiacutem veľmi niacutezkej koncentraacutecie jedneacuteho primeru Sekvenačnaacute PCR je PCR v ktorej je použityacute len jeden primer a v reakčnej zmesi suacute okrem

všetkyacutech dNTP priacutetomneacute dideoxynukleotidtrifosfaacutety (ddNTP) značeneacute raacutedioaktiacutevne dnes však prevažne fluorescenčne každyacute typ ddNTP inou fluorescenčnou farbičkou Zaradenie niektoreacuteho zo štyroch ddNTP spocircsobiacute terminaacuteciu (zastavenie) predlžovania DNA reťazca fluorescenčneacute označenie ddNTP umožniacute detekciu dĺžky fragmentu a určenie sekvencie posledneacuteho nukleotidu Vyacuteslednyacute produkt sekvenačnej PCR sluacuteži na sekvenovanie Sekvenovaniu sa venuje samostatnaacute časť

MLPA (multiplex ligation-dependent probe amplification) ndash multiplexnaacute amplifikaacutecia proacuteb zaacutevislaacute od ligaacutecie je variaacutecia multiplexnej PCR umožňujuacuteca namnoženie viaceryacutech uacutesekov DNA za použitia iba jedneacuteho paacuteru primerov avšak s podmienkou vytvorenia sekvenčne špecifickej proacuteby ligaacuteciou sekvenčne špecifickyacutech oligonukleotidov MLPA je metoacuteda umožňujuacuteca detekciu počtu koacutepiiacute

15

až 50 nukleotidovyacutech sekvenciiacute v jednej reakcii Pomocou MLPA je možneacute ryacutechlo identifikovať amplifikaacutecie a deleacutecie veľkeacuteho počtu geacutenov či už z DNA alebo mRNA okrem toho MLPA mocircže byť použitaacute na analyacutezu CpG-metylaacutecie (MS-MLPA) Viac informaacutecii v samostatnej časti

SNaPshotreg Multiplex nazyacutevaneacute aj minisekvenovanie je multiplexnaacute reakcia v ktorej je každyacute primer predĺženyacute iba o jeden nukleotid (obr 10) V reakčnej zmesi nie suacute priacutetomneacute deoxyribonukleotidtrifosfaacutety ale len dideoxyribonukleotidtrifosfaacutety (ddATP ddCTP ddGTP ddTTP) každyacute označenyacute inou fluorescenčnou farbičkou Po integraacutecii ddNTP do DNA vlaacutekna je polymerizaacutecia ukončenaacute Jednovlaacuteknoveacute fragmenty (primery) predĺženeacute presne o jeden ddNTP suacute separovaneacute kapilaacuternou elektroforeacutezou v genetickom analyzaacutetore pričom je detegovanaacute ich fluorescencia a dĺžka (obr 11) Z vyacutesledneacuteho elektroforetogramu (obr 12) je možneacute určiť v jednej reakcii sekvenciu vo viac ako v 10 lokalitaacutech určiteacuteho fragmentu DNA SNaPshot Multiplex sa v molekulaacuterno-genetickom laboratoacuteriu využiacuteva na ryacutechlu detekciu viaceryacutech najčastejšie sa vyskytujuacutecich mutaacuteciiSNP geacutenu

Obr 10 Priacuteklad využitia metoacutedy SnaPshot s použitiacutem sady 13 primerov ktoreacute sa predĺžia len o 1 značenyacute dideoxynukleotid SNaPshot najčastejšiacutech mutaacuteciiacute geacutenu pre 21-hydroxylaacutezu (CYP21A2) ktoreacute spocircsobujuacute kongenitaacutelnu adrenaacutelnu hyperplaacuteziu A T G a C predstavujuacute fluorescenčne značeneacute dideoxynukleotidy

Obr 11 Vyacutesledok analyacutezy DNA pacienta metoacutedou minisekvenovania SnaPshot konkreacutetne použitiacutem sady 13 primerov rozlišujuacutecich najčastejšie bodoveacute mutaacutecie geacutenu pre 21-hydroxylaacutezu (CYP21A2) analyacutezou sa zistila mutaacutecia V281L v heterozygotnom stave (dva fragmenty modryacute a červenyacute)

16

Obr 12 SNaPshot analyacuteza geacutenu CYP21A2 u DNA izolovanej z plodovej vody metoacuteda deteguje najčastejšie bodoveacute mutaacutecie geacutenu pre 21-hydroxylaacutezu vyacutesledok prenataacutelnej analyacutezy = priacutetomnosť mutaacutecie In2G v hemizygotnom stave (keďže qPCR metoacutedou bola u plodu zistenaacute priacutetomnosť len jednej koacutepie geacutenu CYP21A2)

33 Kvantitatiacutevna PCR (qPCR)

Polymeraacutezovou reťazovou reakciou (PCR) docielime namnoženie (amplifikaacuteciu) určiteacuteho DNA uacuteseku (templaacutetu) PCR je katalyzovanaacute DNA polymeraacutezou za priacutetomnosti primerov dNTPs dvojmocnyacutech katioacutenov (ako Mg+2) a pufrovacieho roztoku

Real-time PCR ktoraacute je nazyacutevanaacute aj kvantitatiacutevna PCR (qPCR) umožňuje vizualizaacuteciu a kvantifikaacuteciu amplifikaacutecie DNA v reaacutelnom čase to je tak ako to bežiacute počas PCR qPCR využiacuteva fluorescenčneacute chemikaacutelie (farbivaacute) ktoryacutech emitovanuacute fluorescenciu zaznamenaacuteva optickyacute systeacutem počas každeacuteho PCR cyklu zaznamenanaacute fluorescencia je naacutesledne softveacuterovo spracovanaacute a vyhodnotenaacute

V suacutečasnosti sa využiacutevajuacute dva typy qPCR cheacutemie a to farbivaacute viažuce sa na DNA a fluorescenčne značeneacute proacuteby (obr 13)

Farbivaacute viažuce sa na DNA emitujuacute fluorescenciu v priacutepade ak suacute naviazaneacute na dvojvlaacuteknovuacute DNA proacuteby fluoreskujuacute v priacutepade keď molekula zhaacutešača (angl quencher - Q) sa nenachaacutedza v bliacutezkosti molekuly reporteacutera (R) napr hydrolyzujuacutece proacuteby fluoreskujuacute keď je molekula reporteacutera (R) prostredniacutectvom 5acuteexonukleaacutezovej aktivity DNA polymeraacutezy odstraacutenenaacute z bliacutezkosti molekuly zhaacutešača (Q)

Grafickyacute priebeh real ndash time PCR znaacutezorňuje amplifika čnaacute krivka (angl amplification plot) (obr 14) majuacuteca 4 faacutezy 1) Faacuteza I ndash dochaacutedza k zdvojnaacutesobeniu množstva amplikoacutenu po každom cykle ale naacuterast fluorescencie je pod detekčnyacutem limitom zaznamenaacutevanaacute fluorescencia (baseline) zodpovedaacute zaacutekladnej fluorescencii pozadia tzv šumu

17

2) Faacuteza II nazyacutevanaacute aj exponenciaacutelna faacuteza v ktorej sa fluorescencia zvyacuteši na uacuteroveň optickej detekcie bod resp cyklus kedy začiacutena exponenciaacutelna faacuteza je kľuacutečovyacute na určenie kvantity vstupneacuteho množstva templaacutetovej DNA nazyacuteva sa prahovyacute cyklus označuje sa Ct (angl treshold cycle) alebo Cq (quantification) Čiacutem nižšie je Ct (Cq) tyacutem vaumlčšiacute počet koacutepiiacute templaacutetovej DNA bolo v reakcii Ct hodnota je teda hlavnyacute uacutedaj s ktoryacutem sa pracuje vo vyacutepočtoch fluorescencia v tomto mieste sa nazyacuteva prahovaacute resp treshold 3) Faacuteza III - lineaacuterna faacuteza ndash charakterizuje ju postupneacute spotrebovaacutevanie komponentov reakcie na narastajuacutece množstvo amplikoacutenu 4) Faacuteza IV - plateau (čiacutetaj platoacute) ndash množstvo amplikoacutenu sa v docircsledku vyčerpania zložiek qPCR už nezvyšuje

Obr 13 Princiacutep real-time PCR Obr 14 Faacutezy real-time PCR

Ako štandardnaacute PCR aj qPCR maacute tri zaacutekladneacute kroky 1) Denaturaacutecia dvojvlaacuteknovej DNA na jednovlaacuteknovuacute DNA pri vysokej teplote (obyčajne 95degC) 2) Hybridizaacutecia primerov (annealing) ndash komplementaacuterne sekvencie sa spolu hybridizujuacute 3) Polymerizaacutecia pri 70-72degC kedy v docircsledku optimaacutelnej aktivity DNA polymeraacutezy dochaacutedza k predĺženiu primeru až o 100 baacutez za sekundu

18

Real-time PCR (obr 15) sa využiacuteva na kvantifikaacuteciu expresie geacutenov určenie počtu koacutepiiacute geacutenov určenie genotypu (genotypovanie) alelovou diskriminaacuteciou alebo analyacutezou krivky topenia tzv high resolution melt a multiplexnuacute real time PCR s možnosťou detekcie viaceryacutech cieľovgeacutenov

Multiplexnaacute real-time PCR sa využiacuteva na detekciu viaceryacutech cieľovgeacutenov v jednej reakcii suacutečasne Vyacutehodou multiplexovania je jednak uacutespora vzorky ako aj ziacuteskanie vaumlčšieho množstva informaacuteciiacute z rovnakeacuteho množstva materiaacutelu Nevyhnutnosťou multiplexnej qPCR suacute proacuteby značeneacute rocircznymi fluorescenčnyacutemi farbivami

Najdocircležitejšie zložky qPCR (real-time PCR komponenty) suacute DNA polymeraacuteza (reverznaacute transkriptaacuteza v priacutepade jednokrokovej kvantitatiacutevnej RT-PCT) dNTPs primery resp primeryproacuteby dvojmocneacute Mg templaacutet Na uľahčenie qPCR suacute v suacutečasnosti už komerčne dostupneacute takeacute reakčneacute zmesi ku ktoryacutem stačiacute pridať už len templaacutet (napr kity využiacutevajuacutece TaqManProacuteby) alebo kity s fluorescenčnyacutemi farbami viažucimi sa na dvojvlaacuteknovuacute DNA ku ktoryacutem sa do reakčnej zmesi okrem templaacutetu pridajuacute primery

Obr 15 Real-time PCR cykleacuter

331 Kvantifikaacutecia pomocou qPCR

Na kvantifikaacuteciu DNA pomocou qPCR sa požiacutevajuacute dve zaacutekladneacute metoacutedy - absoluacutetna kvantifikaacutecia a relatiacutevna kvantifikaacutecia

Absoluacutetna kvantifikaacutecia vychaacutedza zo štandardnej krivky (obr 16) ktoraacute sa ziacuteska po qPCR seacuterie riedeniacute DNA znaacutemej koncentraacutecie Kvantifikaacutecia neznaacutemej vzorky sa zistiacute interpolaacuteciou (odčiacutetaniacutem) Ct neznaacutemej vzorky zo štandardnej krivky (obr 16 17) Využiacutevaneacute napr v kriminalistike na stanovenie koncentraacutecie DNA vo vzorke

Relatiacutevna kvantifikaacutecia (obr 18 19) porovnaacuteva uacuteroveň expresie určiteacuteho geacutenu vo vzorke k expresii toho isteacuteho geacutenu v referenčnej (kontrolnej) vzorke alebo množstvo určiteacuteho geacutenu (počet koacutepiiacute) vo vzorke porovnaniacutem s množstvom geacutenu v kontrolnyacutech vzorkaacutech V raacutemci každej vzorky musiacute pred relatiacutevnou kvantifikaacuteciou docircjsť k tzv normalizaacutecii t j porovnanie expresie sledovaneacuteho geacutenu k expresii referenčneacuteho geacutenu (najčastejšie niacutem byacuteva tzv bdquohousekeepingldquo geacuten napr GAPDH aktiacuten tubuliacuten)

V priacutepade kvantifikaacutecie expresie určiteacuteho geacutenu metoacutedou real-time PCR (RT-qPCR) pred samotnou kvantifikaacuteciou cDNA musiacute byť taacuteto cDNA nasyntetizovanaacute prostredniacutectvom reverznej

19

transkripcie za použitia enzyacutemu reverznej transkriptaacutezy Kvantitatiacutevna PCR s reverznou transkripciou RT-qPCR mocircže byť dvojkrokovaacute alebo jednokrokovaacute Pri dvojkrokovej RT-qPCR treba pred qPCR syntetizovať cDNA vlaacutekno z RNA pomocou reverznej transkriptaacutezy - 1 krok druhyacutem krokom je samotnaacute real-time PCR Jednokrokovaacute RT-qPCR umožňuje uskutočniť obidve reakcie reverznuacute transkripciu a kvantitatiacutevnu PCR v jednej skuacutemavke čo zjednodušuje qPCR a redukuje možnosť kontaminaacutecie Obr 16 5-bodovaacute štandardnaacute krivka (amplifikaacutecia piatich koncentraacuteciiacute jednej vzorky konkreacutetne ide o 10-tkoveacute riedenie)

Obr 17 Ukaacutežka amplifikačnyacutech kriviek riedenia a z nich ziacuteskanej štandardnej krivky poukazuje na vysokuacute presnosť metoacutedy RT-PCR

20

Obr 18 Relatiacutevna kvantifikaacutecia - určenie počtu koacutepiiacute geacutenu CYP21A2 vo vzorke DNA izolovanej z perifeacuternej krvi pacientov mutaacutecie v geacutene CYP21A2 spocircsobujuacute kongenitaacutelnu adrenaacutelnu hyperplaacuteziu (CAH) Vyacutesledok analyacutezy všetci pacienti majuacute dve koacutepie geacutenu

Obr 19 Relatiacutevna kvantifikaacutecia - určenie počtu koacutepiiacute geacutenu CYP21A2 vo vzorke DNA izolovanej z plodovej vody mutaacutecie v geacutene CYP21A2 spocircsobujuacute kongenitaacutelnu adrenaacutelnu hyperplaacuteziu (CAH) Prenaacutetalnou diagnostikou (qPCR) sa zistila priacutetomnost jednej koacutepie CYP21A2 geacutenu 332 Určenie genotypu metoacutedou alelovej diskriminaacutecie a analyacutezou krivky topenia (HRM)

Určenie genotypu metoacutedou alelovej diskriminaacutecie (obr 20) sa uskutočňuje použitiacutem hydrolyzujuacutecich proacuteb (sond) je veľmi ryacutechla a senzitiacutevna (presnaacute) metoacuteda frekventovane využiacutevanaacute v laboratoacuteriaacutech Dva variantyalely suacute vyšetreneacute suacutečasne v jednej vzorke a v jednej reakčnej

21

skuacutemavke V reakcii suacute použiteacute dve proacuteby označeneacute rozdielnymi fluorescenčnyacutemi farbičkami emitujuacutecimi svetlo o rocircznej vlnovej dĺžke (najčastejšie jedna označenaacute FAM farbičkou a druhaacute proacuteba označenaacute VIC farbičkou) Počas amplifikaacutecie amplikoacutenu dochaacutedza k odstraacuteneniu zhaacutešača z bliacutezkosti farbičky ktoraacute potom emituje svetlo priacuteslušnej vlnovej dĺžky Vzorky so signaacutelom len jednej fluorescenčnej farbičky (FAM) a bez signaacutelu druhej farbičky (VIC) suacute homozygoti pre alelu 1 vzorky so signaacutelom len druhej farbičky (VIC) a bez signaacutelu prvej (FAM) suacute homozygoti pre alelu 2 v priacutepade ak vyšetrovanaacute vzorka bdquosvietildquo obidvoma farbami jednaacute sa o heterozygota

Obr 20 Určenie genotypu metoacutedou alelovej diskriminaacutecie ndash amplifikačnaacute krivka vzoriek DNA majuacutecich tri rocirczne genotypy A ndash jednotliveacute vzorky (plnaacute čiara predstavuje štandardnuacute alelu guličkovanaacute mutovanuacute alelu) B ndash 72 vzoriek C ndash scatter plot 72 vzoriek

Určenie genotypu analyacutezou krivky topenia tzv high resolution melt (HRM) (obr 21) umožňuje detekciu takmer všetkyacutech genetickyacutech variaacuteciiacute (SNP mutaacuteciiacute) Keďže taacuteto metoacuteda okrem štandardnyacutech podmienok reakcie vyžaduje len primery a farbičku (nie proacuteby) je veľmi jednoduchaacute a lacnejšia Po amplifikaacuteciiacute treba amplikoacuten pomaly zohrievať až kyacutem nedocircjde k denaturaacuteciiacute Teplota topenia amplikoacutenu vo vzorke zaacutevisiacute od DNA sekvencie čo umožňuje detegovať priacutetomnosť mutaacutecie resp SNP Tvar vyacuteslednyacutech kriviek topenia určuje teda genotyp

22

Obr 21 Určenie genotypu analyacutezou krivky topenia tzv metoacutedou high resolution melting (HRM) A ndash krivka topenia vzoriek DNA majuacutecich tri rocirczne genotypy B ndash graf rozdielnosti krivky topenia vzoriek DNA majuacutecich tri rocirczne genotypy

23

4 Elektroforetickaacute separaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten

Separaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten predstavuje rozdelenie molekuacutel DNA alebo RNA na zaacuteklade veľkosti zloženia a poradia baacutez Podobnyacutemi metoacutedami je možneacute separovať aj proteiacuteny

Elektroforeacuteza (ELFO) je technika použiacutevanaacute na separaacuteciu niekedy aj purifikaacuteciu makromolekuacutel ako suacute nukleoveacute kyseliny a proteiacuteny na zaacuteklade ich rozdielnej veľkosti naacuteboja alebo konformaacutecie Je to metoacuteda veľmi často využiacutevanaacute nielen v molekulovej genetike ale aj biocheacutemii Elektroforeacuteza využiacuteva schopnosť nabityacutech molekuacutel migrovať v jednosmernom elektrickom poli k opačneacutemu poacutelu Nukleoveacute kyseliny majuacute vďaka svojej fosfaacutetovej zložke negatiacutevny naacuteboj preto v jednosmernom elektrickom poli migrujuacute ku kladneacutemu poacutelu čiže k anoacutede Elektroforeacuteza prebieha v elektroforetickej aparatuacutere v geacuteloch (v nosiči) so sieťovitou štruktuacuterou ktoraacute umožňuje separaacuteciu molekuacutel Vzorka nukleovej kyseliny zmiešanaacute s tzv nanaacutešaciacutem tlmivyacutem roztokom s farbičkou sa nanesie do jamky v geacuteli ktoryacute je umiestnenyacute v elektroforetickej aparatuacutere v priacutetomnosti elektroforetickeacuteho pufra (TAE alebo TBE) (obr 22) Nanaacutešaciacute tlmivyacute roztoknanaacutešacia farbička umožňuje na zaacuteklade migraacutecie farbičky vidieť migraacuteciu vzorky v geacuteli a suacutečasne zvyacutešeniacutem hustoty vo vzorke umožniacute klesnuacuteť vzorke do jamky a tak zabraacuteniť jej vyplaveniu z geacutelu Draacuteha je časť geacutelu ktoryacutem putuje jedna vzorka od katoacutedy k anoacutede V draacutehe sa nachaacutedzajuacute oddeleneacute jednotliveacute fragmenty nukleovyacutech kyseliacuten určityacutech veľkostiacute viditeľneacute vo forme pruacutežkov (angl bands) Intenzita pruacutežku zaacutevisiacute od množstva molekuacutel danej veľkosti je ekvivalentnaacute hmotnosti Na určenie veľkosti fragmentov NK sa do jednej jamky nanesie štandard molekulovyacutech hmotnostiacute (angl ladder) ktoryacute maacute presne definovaneacute veľkosti fragmentov čo umožňuje odhadnuacuteť veľkosť aj hmotnosť neznaacutemych separovanyacutech fragmentov

Obr 22 Elektroforetickaacute separaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten v agaroacutezovom geacuteli (A) a vizualizaacutecia UV svetlom a GelRedtrade (B C)

24

Nukleoveacute kyseliny je možneacute elektroforeticky separovať 1) v geacuteloch agaroacutezovom (horizontaacutelna elektroforeacuteza) (obr 22) a polyakrylamidovom (vertikaacutelna elektroforeacuteza) 2) v špeciaacutelnych lineaacuternych polymeacuteroch kapilaacuternou elektroforeacutezou použitiacutem genetickeacuteho analyzaacutetora (obr 23)

Agaroacuteza je polysacharid ziacuteskanyacute z morskej riasy použiacuteva sa najčastejšie v koncentraacuteciiacute 05-2 čiacutem vyššia koncentraacutecia tyacutem je geacutel pevnejšiacute a schopnejšiacute rozliacutešiť menšie fragmenty NK Priacuteprava je jednoduchaacute odvaacuteži sa potrebneacute množstvo agaroacutezy ktoraacute sa zmieša s tlmivyacutem roztokom (pufrom) rozvariacute sa v mikrovlnnej ruacutere a naleje sa do špeciaacutelnej naacutedoby na vytvaacuteranie geacutelov kyacutem je geacutel tekutyacute vložiacute sa do neho tzv hrebeň na vytvorenie jamiek Agaroacuteza je netoxickaacute V bežnom agaroacutezovom geacuteli v zaacutevislosti od jeho koncentraacutecie je možneacute separovať DNA fragmenty dĺžky 200-50 000 bp Dnes suacute dostupneacute aj špeciaacutelne agaroacutezy napr MetaPhorreg Agarose schopneacute oddeliť fragment DNA dĺžky 20-800bp Separaacutecia v agaroacutezovom geacuteli prebieha v horizontaacutelnej aparatuacutere preto sa nazyacuteva aj horizontaacutelna elektroforeacuteza

Polyakrylamidovyacute geacutel (PAGE) vznikaacute polymerizaacuteciou akrylamidu v priacutetomnosti špeciaacutelnych chemickyacutech laacutetok (peroxodisiacuteran amoacutenny TEMED bisakrylamid) Jeho priacuteprava je preto odlišnaacute a aj naacuteročnejšia Polyakrylamidoveacute geacutely majuacute vysokuacute rozlišovaciu schopnosť (1bp) preto suacute PAGE geacutely vhodneacute aj na sekvenovanie DNA klasickyacutemi metoacutedami PAGE geacutel nie je vhodnyacute na separaacuteciu fragmentov dlhšiacutech ako 2kb Použiacuteva sa v koncentraacutecii 35 -20 s rozliacutešeniacutem fragmentov od 10bp-2000bp Akrylamid je neurotoxiacuten musiacute sa s niacutem pracovať veľmi opatrne PAGE elektroforeacuteza bežiacute vo vertikaacutelnej aparatuacutere preto sa volaacute aj vertikaacutelna elektroforeacuteza použiacuteva sa často aj na separaacuteciu proteiacutenov

Ryacutechlosť pohybu nukleovyacutech kyseliacuten (mobilita) určuje viacero faktorov 1) veľkosť NK ndash počet baacutezovyacutech paacuterov resp baacutez pričom menšie molekuly prechaacutedzajuacute geacutelom ryacutechlejšie pretože sa ľahšie pohybujuacute v geacuteli 2) konformaacutecia nukleovej kyseliny napr u rovnako veľkyacutech plazmidov kondenzovaneacute superšpiralizovaneacute plazmidy migrujuacute najryacutechlejšie rovnako veľkeacute lineaacuterne molekuly (toho isteacuteho plazmidu) bežia pomalšie a najpomalšie putujuacute relaxovaneacute kruhoveacute molekuly plazmidu 3) koncentraacutecia geacutelu určuje jeho rozlišovaciu schopnosť koncentrovanejšiacute geacutel je schopnyacute separovať kratšie fragmenty NK redšie geacutely suacute vhodneacute pre rozliacutešenie vaumlčšiacutech fragmentov 4) zloženie geacutelu je docircležiteacute pri analyacuteze sekundaacuternych štruktuacuter NK a proteiacutenov v nedenaturovanom stave sekundaacuterna štruktuacutera spomaľuje migraacuteciu NK a proteiacutenov Tento fakt využiacutevajuacute niektoreacute diagnostickeacute techniky (napr SSCP - Single Strand Conformation Polymorphism - polymorfismus konformaacutecie jednovlaacuteknovej DNA) umožňujuacutece detekciu zaacutemeny jedinej baacutezy ktoraacute spocircsobiacute odlišneacute vnuacutetromolekuloveacute paacuterovanie a vyacuteslednuacute konformaacuteciu molekuly Geacutely mocircžu teda byť denaturačneacute a nedenaturačneacute (natiacutevne) 5) napaumltie zdroja - čiacutem vyššie je napaumltie ktoreacute vytvaacutera elektrickeacute pole v elektroforetickej aparatuacutere tyacutem ryacutechlejšie fragmenty NK migrujuacute 6) zloženie roztokov a teploty

Elektroforetickyacute tlmivyacute roztok (pufor - elektrolyt) zabezpečuje stabilneacute elektroforetickeacute podmienky počas separaacutecie geacutel je v ňom ponorenyacute Obsahuje ioacuteny čo umožňuje vedenie elektrickeacuteho pruacutedu

Štandard molekulovyacutech hmotnostiacute (v laboratoacuteriaacutech nazyacutevanyacute ladder alebo marker) je zmes fragmentov DNA alebo RNA s presne definovanou veľkosťou ktoryacute sluacuteži na odhad veľkosti vyšetrovanyacutech fragmentov NK (obr 22) Pomocou špeciaacutelnych štandardov molekulovyacutech hmotnostiacute ktoryacutech fragmenty NK majuacute definovanuacute aj hmotnosť je možneacute odhadnuacuteť množstvo (hmotnosť - koncentraacuteciu) neznaacutemeho fragmentu

B C

25

41 Vizualizaacutecia DNA

Samotnaacute nukleovaacute kyselina je počas elektroforetickej separaacutecie neviditeľnaacute Vizualizaacuteciu NK umožňujuacute interkalačneacute činidlaacute ktoreacute suacute schopneacute naviazať sa na molekuly NK tyacutem že sa včlenia medzi susediace baacutezy Po ožiareniacute UV svetlom interkalačneacute činidlaacute naviazaneacute na NK fluoreskujuacute tak sa vizualizuje NK čiacutem intenziacutevnejšie fluoreskuje tyacutem viac NK je v geacutelipruacutežku priacutetomneacute Interkalačneacute činidlo sa buď primieša do geacutelu pri jeho priacuteprave čo umožniacute sledovať migraacuteciu fragmentov NK počas elektroforeacutezy a to po vybratiacute z ELFO aparatuacutery a po ožiareniacute UV svetlom alebo sa geacutel farbiacute po elektroforetickej separaacutecii V minulosti bol na zviditeľnenie NK najčastejšie použiacutevanyacute etidiumbromid kvocircli jeho mutageacutennym vlastnostiam sa v suacutečasnosti nahraacutedza menej mutageacutennymi a netoxickyacutemi činidlami ako suacute napr komerčne dostupneacute SYBRregSafe GelRedtrade GelGreentrade

Kapilaacuterna elektroforeacuteza NK prebieha v špeciaacutelnom priacutestroji genetickom analyzaacutetore (obr 23) ktoryacute musiacute mať zaacutekladneacute komponenty ako suacute elektroacutedy kapilaacutera zdroj vysokeacuteho napaumltia detektor prepojenie s počiacutetačom a softveacuteroveacute vybavenie priestor na vloženie vzoriek atď Genetickyacute analyzaacutetor predstavuje automatizovanyacute systeacutem umožňujuacuteci sekvenovanie určovanie dĺžky DNA fragmentov ndash fragmentačnuacute analyacutezu a kvantifikaacuteciu nukleovyacutech kyseliacuten V novšiacutech typoch genetickeacuteho analyzaacutetora je proces analyacutezy od vloženia vzoriek do stojana automatizovanyacute

Vzorka určenaacute na analyacutezu je elektrokineticky injektovanaacute do tenkej kapilaacutery naplnenej lineaacuternym polymeacuterom Vplyvom vysokeacuteho napaumltia sa negatiacutevne nabiteacute fragmenty DNA pohybujuacute v polymeacuteri k pozitiacutevne nabitej elektroacutede Kapilaacuterna elektroforeacuteza je tak citlivaacute že je schopnaacute detegovať jednobaacutezovyacute rozdiel DNA fragmentov DNA fragmenty musia byť pred kapilaacuternou elektroforeacutezou fluorescenčne označeneacute v kapilaacutere suacute separovaneacute na zaacuteklade veľkosti Kraacutetko pred dosiahnutiacutem kladne nabitej elektroacutedy docircjde po excitaacutecii laserovyacutem žiareniacutem k emisii žiarenia fluoroformi (farbičkami) tak že optickyacute detekčnyacute systeacutem zaznamenaacute fluorescenciu ktoraacute je naacutesledne softveacuterovo spracovanaacute a vyhodnotenaacute

Obr 23 Genetickyacute analyzaacutetor

42 RFLP

Metoacuteda polymorfizmu dĺžky restrik čnyacutech fragmentov (angl Restriction Fragment Length Polymorfism) bola prvou metoacutedou využiacutevanou na detekciu DNA variaacuteciiacute rocircznych biologickyacutech vzoriek Princiacutep metoacutedy spočiacuteva v priacutetomnosti polymorfizmov v DNA sekvencii rocircznych ľudiacute ktoreacute zapriacutečinia rozdielny profil (obrazec) DNA fragmentov po štiepeniacute jednou alebo viaceryacutemi restrikčnyacutemi endonukleaacutezami Restrikčneacute endonukleaacutezy (RE) suacute enzyacutemy ktoreacute štiepia DNA molekulu v oblasti špecifickej nukleotidovej sekvencie nazyacutevanej restrik čneacute miesto RE najčastejšie rozpoznaacutevajuacute a štiepia miesto veľkeacute 4-6 baacutez RE suacute priacutetomneacute u prokaryotov (bakteacuterie a archebakteacuterie) kde suacute suacutečasťou restrik čno-modifikačneacuteho systeacutemu akoby prokaryotickeacutej vrodenej imunity sluacutežia

26

na ochranu pred cudzou DNA (napr viacuterusovou) ktoruacute po rozpoznaniacute špecifickej sekvencie štiepia

Restrikčno-modifikačnyacute systeacutem maacute dve zložky 1) modifikačneacute enzyacutemy - metylaacutezy ktoreacute procesom metylaacutecie modifikujuacute určiteacute baacutezy svojej DNA čiacutem ich označia za vlastnuacute DNA takže takaacuteto DNA je potom rezistentnaacute voči štiepeniu restrikčnyacutemi endonukleaacutezami Najčastejšiacutem spocircsobom metylaacutecie u bakteacuteriiacute je metylaacutecia adeniacutenu na N6 pričom vznikne metyladeniacuten alebo cytoziacutenu na C5 metylcytoziacuten 2) restrikčneacute endonukleaacutezy štiepia špecifickeacute miesto dvojvlaacuteknovej DNA ktoreacute je tvoreneacute symetrickou sekvenciou zrkadlovo sa opakujuacutecich nukleotidov ndash tzv palindroacutem Restrikčneacute enzyacutemy sa použiacutevajuacute na štiepenie DNA sekvencie na mieste špecifickom pre tuacute ktoruacute restrikčnuacute endonukleaacutezu napr pri analyacuteze polymorfizmov dĺžky restrikčnyacutech fragmentov (RFLP) analyacuteze jednonukleotidovyacutech polymorfizmov (SNP) mutaacuteciiacute ako aj pri klonovaniacute DNA do vhodnyacutech vektorovyacutech DNA molekuacutel

Po štiepeniacute dvojvlaacuteknovej DNA restrikčnou endonukleaacutezou mocircžu vzniknuacuteť tri typy koncov - 5´-prečnievajuacutece konce (lepiveacute) 3´-prečnievajuacutece konce (lepiveacute) a tupeacute konce (obr 24)

Obr 24 Restrikčneacute štiepenie zanechaacutevajuacutece rocirczne konce tupeacute a lepiveacute

Restrikčneacute štiepenie je často použiacutevanou metoacutedou geacutenovyacutech manipulaacuteciiacute na konštrukciu

hybridnyacutech molekuacutel DNA s naacuteslednyacutem klonovaniacutem Priebeh RFLP analyacutezy je nasledovnyacute restrikčnaacute endonukleaacuteza sa pridaacute k DNA a zmes sa vo

vhodnyacutech reakčnyacutech podmienkach (pufor teplota) inkubuje niekoľko hodiacuten Počas inkubaacutecie docircjde k štiepeniu DNA na špecifickyacutech miestach DNA je potom elektroforeticky separovanaacute v geacuteli a naacutesledne vizualizovanaacute V minulosti po geacutelovej elektroforeacuteze nasledoval Southern blot (čiže prenos separovanyacutech fragmentov DNA z geacutelu na špeciaacutelnu membraacutenu) (obr 35) po ktorom nastala vizualizaacutecia raacutedioaktiacutevne značenou proacutebou V suacutečasnosti sa kvocircli praacutecnosti a zdravotnyacutem rizikaacutem od Southern blotu upuacutešťa a prechaacutedza sa na ryacutechlejšie menej praacutecne a zdravotne šetrnejšie metoacutedy priateľskejšie aj k životneacutemu prostrediu

RFLP bola prvou metoacutedou použiacutevanou na zistenie DNA profilu (DNA fingerprinting) mapovanie geacutenov zapriacutečiňujuacutece genetickeacute ochorenia a testovanie otcovstva Vaumlčšina RFLP markerov je vysoko lokusovo špecifickyacutech a kodominantnyacutech (obidve alely suacute detekovaneacute u heterozygota)

PCR-RFLP je laboratoacuterne priacutestupnejšia metoacuteda molekulaacuterno-genetickej diagnostiky keďže PCR umožňuje amplifikaacuteciu veľmi malyacutech množstiev DNA Alternatiacutevny naacutezov použiacutevanyacute v literatuacutere je CAPS z angl Cleaved Amplified Polymorphic Sequence assay Použitiacutem špecifickyacutech primerov docircjde PCR metoacutedou k amplifikaacutecii požadovaneacuteho uacuteseku DNA ten sa potom štiepi restrikčnou endonukleaacutezou vo vhodnyacutech podmienkach naacutesledne sa štiepne produkty elektroforeticky separujuacute a vizualizujuacute použitiacutem interkalačnyacutech farbiacutev a UV svetla (obr 25)

27

Obr 25 Princiacutep metoacutedy PCR-RFLP

43 VNTR a STR V geacutenome suacute priacutetomneacute dva typy tandemovyacutech (za sebou nasledujuacutecich) opakovaniacute

1) minisatelity ndash nazyacutevaneacute variabilnyacute počet tandemovyacutech opakovaniacute VNTR (variable number of tandem repeats) 2) mikrosatelity tiež kraacutetke tandemoveacute repetiacutecie STR (short tandem repeats)

Obidva tieto typy satelitnej DNA suacute rozmiestneneacute po celom genoacuteme suacute využiacutevaneacute hlavne vo forenznej genetike na identifikaacuteciu osocircb a určenie otcovstva popriacutepade materstva ale aj v mediciacutene na detekciu chromozoacutemovyacutech aneuploidiiacute Štruktuacutera obidvoch je podobnaacute Rozdiel medzi jednotlivyacutemi alelami je spocircsobenyacute rozdielnym počtom opakovaniacute opakujuacutecej sa sekvencie (motiacutevu) čo spocircsobiacute rocircznu dĺžku alel s rocircznym počtom tandemovyacutech opakovaniacute nazyacutevanuacute polymorfizmus dĺžky fragmentov

VNTR ndash variabilnyacute počet tandemovyacutech opakovaniacute pričom opakujuacuteca sa sekvencia maacute dĺžku od 6 do 100 baacutez pričom sa mocircže opakovať aj tisiacutece kraacutet alely tak mocircžu mať od 500do 30 000 baacutez VNTR boli v kombinaacutecii s RFLP (DNA fingerprinting ) prvyacutem polymorfizmom použiacutevanyacutem na zistenie DNA profilov a identifikaacuteciu osocircb v kriminalistickej praxi V suacutečasnosti jeho využitie v kriminalistike je kvocircli potrebe relatiacutevne veľkeacuteho množstva DNA nahradeneacute využitiacutem STR

STR - kraacutetke tandemoveacute repetiacutecie suacute v kriminalistike najčastejšie použiacutevanyacutem polymorfizmom STR lokusy suacute rozmiestneneacute po celom genoacuteme repetiacutecia obsahuje jednu až šesť baacutez pričom jej opakovaniacutem vznikne STR v rozsahu od 50 do 300bp V našom genoacuteme suacute tisiacutece STR ktoreacute mocircžu byť použiteacute pre forenznuacute analyacutezu V kriminalistike sa v suacutečasnosti na identifikaacuteciu osocircb použiacuteva 13 STR locusov ktoreacute patria k medzinaacuterodne uznaacutevanyacutem štandardom Z iniciatiacutevy FBI bola vytvorenaacute databaacuteza CODIS (Combined DNA Index System) každaacute krajina maacute svoju databaacutezu CODIS kde je možneacute vložiť a archivovať DNA profily jednotlivcov ako aj profily DNA ziacuteskanyacutech z miest kriminaacutelneho činu v databaacuteze je ich možneacute navzaacutejom porovnať a tak zistiť pocircvodcu trestneacuteho činu Medzinaacuterodnaacute jednotnosť v použiacutevaniacute CODIS STR lokusov umožňuje v priacutepade potreby vzaacutejomneacute porovnanie DNA profilov zistenyacutech na uacutezemiacute rocircznych štaacutetov CODIS STR lokusov je 13 a suacute to CSF1PO FGA TH01 TPOX VWA D3S1358 D5S818 D7S820 D8S1179 D13S317 D16S539 D18S51 a D21S11 Zistenie DNA profilu sa uskutočniacute multiplexnou PCR reakciou s fluorescenčne značenyacutemi primermi špecifickyacutemi pre konkreacutetny STR Naacutesledne suacute PCR produkty analyzovaneacute kapilaacuternou elektroforeacutezou genetickyacutem analyzaacutetorom ktoryacute rozliacuteši amplifikovaneacute fragmenty na zaacuteklade fluorescencie a dĺžky (fragmentačnaacute analyacuteza) (obr 26 Tab 3) DNA profil každeacuteho človeka je jedinečnyacute rovnakyacute profil mocircžu mať len jednovaječneacute dvojčataacute

28

Obr 26 Ukaacutežka DNA profilu človeka 15 STR lokusov s určeniacutem pohlavia pomocou lokusu pre amelogeniacuten (ženskeacute pohlavie - XX) maleacute oranžoveacute piacuteky predstavujuacute fragmenty veľkostneacuteho štandardu Tabuľka č 3 Zaacutepis DNA profilu človeka z obraacutezka č 26 15 STR lokusov s určeniacutem pohlavia pomocou lokusu pre amelogeniacuten System Alela 1 Alela 2

D3S1358 16 17

TH01 9 93 D21S11 28 28

D18S51 15 18

Penta E 7 14 D5S818 9 12

D13S317 8 11

D7S820 8 11 D16S539 11 12

CSF1PO 10 11

Penta D 11 12 vWA 15 18

D8S1179 13 16

TPOX 8 9 FGA 20 21

amel X X

29

5 MLPA

Multiplexnaacute amplifikaacutecia proacuteb zaacutevislaacute od ligaacutecie (z angl multiplex ligation-dependent probe amplification) je metoacuteda schopnaacute v jednej reakcii (v jednej skuacutemavke a vzorke) detegovať zmeny v počte až 50 nukleotidovyacutech sekvenciiacute Metoacutedou MLPA je možneacute ryacutechlo identifikovať amplifikaacutecie (duplikaacutecie) a deleacutecie veľkeacuteho počtu geacutenov či už použitiacutem DNA alebo mRNA krvnyacutech vzoriek alebo vzoriek z naacutedorov

Princiacutep MLPA spočiacuteva v multiplexnej amplifikaacutecii 50 špecifickyacutech nukleotidovyacutech sekvenciiacute použitiacutem jedneacuteho paacuteru primerov pričom jeden primer je fluorescenčne označenyacute Vyacutesledneacute PCR produkty suacute analyzovaneacute kapilaacuternou elektroforeacutezou (fragmentačnaacute analyacuteza) Dĺžka každeacuteho namnoženeacuteho produktu je jedinečnaacute narastaacute postupne o 6 alebo 9 nukleotidov pričom produkty PCR suacute 120 ndash 500 nukleotidov dlheacute Tento veľkostnyacute rozsah PCR fragmentov (dĺžka 120-500 nukleotidov s naacuterastom postupne o 6 alebo 9 nukleotidov) je optimaacutelny pre kapilaacuternu elektroforeacutezu MLPA multiplexnaacute PCR prebieha za použitia iba jedineacuteho paacuteru primerov ktoreacute amplifikujuacute špecifickeacute sekvencie Trik spočiacuteva v tom že nedochaacutedza k amplifikaacutecii DNA sekvencie ale MLPA proacuteb ktoreacute suacute pridaneacute k vzorkaacutem Každaacute MLPA proacuteba pozostaacuteva z dvoch oligonukleotidov (dve hemiproacuteby) pričom každyacute oligonukleotid obsahuje jednu zo sekvencie rozpoznaacutevanuacute PCR primermi Proacuteba vznikne jedine za predpokladu hybridizaacutecie dvoch oligonukleotidov (hemiproacuteb) k cieľovej sekvencii (geacutenu) a po ligaacutecii enzyacutemom ligaacutezou Iba ligovaneacute proacuteby suacute exponenciaacutelne amplifikovaneacute pomocou jedneacuteho paacuteru primerov Množstvo zligovanyacutech proacuteb teda zaacutevisiacute od množstva cieľovyacutech sekvenciiacute (geacutenov) vo vzorke

Postup MLPA analyacutezy je nasledovnyacute (obr27) K vzorke nukleovej kyseliny (DNA resp mRNA) sa pridaacute zmes 50 jedinečnyacutech proacuteb každaacute

proacuteba je komplementaacuterna k určitej cieľovej sekvencii NK vzorky Každaacute proacuteba však pozostaacuteva z dvoch oligonukleotidov hybridizujuacutecich vedľa seba zaacuteroveň každyacute oligonukleotid (hemiproacuteba) obsahuje pridanuacute sekvenciu rozpoznaacutevanuacute paacuterom PCR primerov Po hybridizaacuteciiacute oligonukleotidov (hemiproacuteb) dochaacutedza k ich ligaacutecii ligaacutezou Ligačnaacute reakcia je tak špecifickaacute že je schopnaacute rozliacutešiť sekvenciu liacutešiacu sa v jednom nukleotide Vyacuteslednyacute ligačnyacute produkt (proacuteba) obsahuje obidve sekvencie pre PCR primery na jednom fragmente čiže mocircže docircjsť k namnoženiu takeacutehoto fragmentu PCR reakciou V priacutepade ak nedocircjde k ligaacutecii priacuteslušnyacutech hemiproacuteb pretože hemiproacuteby nenaacutejdu cieľovuacute sekvenciu na DNA každaacute takaacuteto nezligovanaacute hemiproacuteba maacute len jednu sekvenciu rozpoznaacutevanuacute len jednyacutem PCR primerom v docircsledku čoho nemocircže prebehnuacuteť jej PCR amplifikaacutecia a počas fragmentačnej analyacutezy nie je detegovanaacute pretože negeneruje fluorescenčnyacute signaacutel

Pri MLPA analyacuteze je docircležiteacute okrem MLPA amplifikaacutecie vzorky urobiť aj MLPA amplifikaacuteciu referenčnej vzorky ku ktorej sa bude porovnaacutevať počet geacutenov (cieľovyacutech sekvenciiacute) Po kapilaacuternej elektroforeacuteze MLPA referenčnej a skuacutemanej vzorky porovnaniacutem obsahu nameranyacutech hodnocirct tzv piacutekov priacuteslušnyacutech proacuteb sa určiacute relatiacutevny počet koacutepiiacute v skuacutemanej vzorke

MLPA

1 DNA denaturaacutecia a hybridizaacutecia s MLPA proacutebami (hemiproacuteby)

2 Ligaacutecia (vytvorenie kompletnyacutech proacuteb)

3 PCR amplifikaacutecia proacuteb paacuterom primerov

4 Kapilaacuterna elektroforetickaacute separaacutecia PCR produktov

5 Analyacuteza daacutet

30

Obr 27 Princiacutep MLPA

Firma MRC-Holland v suacutečasnosti ponuacuteka stovky MLPA setov proacuteb ktoreacute suacute vhodneacute na 1) diagnostiku kongenitaacutelnych a dedičnyacutech ochoreniacute 2) zisťovanie profilu naacutedorov 3) zisťovanie metylačneacuteho profilu

MLPA je metoacuteda vhodnaacute na detekciu malyacutech prestavieb (BRCA1 BRCA2 MSH2 atď)

veľkyacutech chromozoacutemovyacutech prestavieb (Williamsov syndroacutem Prader-WilliAngelman syndroacutem atzď)

31

detekciu zmien v počte koacutepii geacutenov (obr 28 29) ako aj zistenie počtu kompletnyacutech chromozoacutemov (chromozoacutem 13 18 21 XY tiež aj z amniovej tekutiny) diagnostiku naacutedorov (zmeny počtu pri ALL CLL atď) kvantifikaacuteciu metylaacutecie (Prader-WilliAngelmanov syndroacutem Fragilnyacute X inaktivaacutecia naacutedorovyacutech supresorovyacutech geacutenov atď) mRNA analyacutezu geacutenov zuacutečastňujuacutecich sa apoptoacutezy alebo zaacutepalov

MS-MLPA (Methylation-Specific MLPA) je varianta MLPA určenaacute špeciaacutelne na analyacutezu aberantnyacutech metylaacutecii imprintovanyacutech oblastiacute ako aj detekciu metylačnyacutech zmien CpG ostrovčekov lokalizovanyacutech bliacutezko promoacutetora Rozdiel oproti štandardnej MLPA spočiacuteva v použitiacute metylačne senzitiacutevneho restrikčneacuteho enzyacutemu HhaI ktoryacute štiepi MS-MLPA proacuteby hybridizovaneacute k nemetylovanej sekvencii Každaacute DNA vzorka určenaacute pre MS-MLPA analyacutezu prejde dvoma reakciami v jednej mikroskuacutemavke štandardnou MLPA analyacutezou (bez štiepenia metylačne senzitiacutevnym enzyacutemom) a v druhej mikroskuacutemavke docircjde okrem ligaacutecie proacuteb aj k metylačne senzitiacutevnemu štiepeniu hybridizovanyacutech proacuteb s nemetylovanou DNA Amplifikujuacute sa len ligovaneacute proacuteby po PCR amplifikaacutecii sa fragmentačnou analyacutezou porovnaniacutem oboch reakciiacute zistia rozdiely v metylačnom profile vzorky k referenčnej vzorke

RT-MLPA (Reverse Transkriptase MLPA) je variaacutecia MLPA určenaacute pre zistenie mRNA profilu vzorky je alternatiacutevou k real-time PCR a mikročipom RT-MLPA nedeteguje mRNA množstvo priamo pretože použiacutevanaacute ligaacuteza nie je schopnaacute ligovať DNA oligonukleotidy keď suacute hybridizovaneacute s RNA Preto RT-MLPA začiacutena reverznou transkripciou so špeciaacutelne navrhnutyacutemi RT primermi tak aby vytvorili kraacutetke oligonukleotidy (cDNA) Potom reakcia pokračuje ako štandardnaacute MLPA

Obr 28 MLPA analyacuteza geacutenu DMD (koacutedujuacuteceho dystrofiacuten) mutaacutecie ktoreacuteho spocircsobujuacute Duchennovu svalovuacute dystrofiu u pacienta je priacutetomnaacute deleacutecia exoacutenu 45 v porovnaniacute s referenčnou vzorkou ndash kontrolou

32

Obr 29 MLPA analyacuteza geacutenu DMD (koacutedujuacuteceho dystrofiacuten) mutaacutecie ktoreacuteho spocircsobujuacute Duchennovu svalovuacute dystrofiu u pacienta suacute priacutetomneacute duplikaacutecie exoacutenov 41 42 43 44 45 (piacuteky vo vzorke pacienta sa porovnajuacute s piacutekmi v kontrole ndash referenčnej vzorke)

33

6 Sekvenovanie

Sekvenovaniacutem rozumieme určenie primaacuternej štruktuacutery DNA teda určenie poradia nukleotidov v reťazci DNA Začiatky moderneacuteho sekvenovania siahajuacute do roku 1977 kedy boli objaveneacute dve metoacutedy sekvenovania 1) chemickaacute metoacuteda Maxama a Gilberta 2) enzymatickaacute metoacuteda Sangera Nicklena a Coulsona

Princiacutep obidvoch metoacuted sekvenovania spočiacuteva v tom že sa vytvoriacute suacutebor DNA molekuacutel s rocircznou veľkosťou ktoreacute suacute zakončeneacute konkreacutetnym nukleotidom tieto DNA molekuly sa elektroforeticky separujuacute v geacuteloch s rozlišovacou schopnosťou 1 nukleotid 61 Chemickaacute metoacuteda

DNA molekuly sa na 5-konci raacutedioaktiacutevne označia raacutedioaktiacutevnym fosforom a naacutesledne sa chemicky modifikujuacute špecificky pre každuacute baacutezu DNA sa potom v modifikovanyacutech miestach štiepi čiacutem vzniknuacute rocirczne dlheacute fragmenty pričom podmienky suacute nastaveneacute tak aby sa DNA na každom mieste štiepila len raz Modifikaacutecia DNA a štiepenie prebehne v štyroch separaacutetnych reakciaacutech (skuacutemavkaacutech) takže po elektroforetickej separaacuteciiacute takto opracovanej DNA v štyroch draacutehach polyakrylamidoveacuteho geacutelu a naacuteslednej autoraacutediografii (podobne ako pri Southernovej hybridizaacutecii) je možneacute odčiacutetať nukleotidovuacute sekvenciu približne 100 nukleotidov od raacutedioaktiacutevneho označenia (v čase objavu Maxama a Gilberta) 62 Sangerova metoacuteda

Zaacuteklady metoacutedy boli popiacutesaneacute už v roku 1975 (metoacuteda plus a miacutenus) ale až vylepšenie použitiacutem dideoxynukleotidov (ddNTP) v roku 1977 došlo k zjednodušeniu sekvenovania Princiacutepom enzyacutemoveacuteho sekvenovania je terminaacutecia (zastavenie) polymerizaacutecie inkorporaacuteciou 2´ 3 -dideoxynukleotidov do novosyntetizujuacuteceho sa vlaacutekna DNA Keďže ddNTP neobsahujuacute hydroxylovuacute skupinu na 3 uhliacuteku riboacutezy nemocircžu sa zuacutečastniť na tvorbe fosfodiesterovej vaumlzby nemocircže sa pripojiť k nim ďalšiacute nukleotid čiže musiacute docircjsť k terminaacuteciiacute polymeraacutecie Reakcia prebieha v štyroch skuacutemavkaacutech s raacutedioaktiacutevne značenyacutem primerom V každej skuacutemavke suacute priacutetomneacute všetky štyri deoxynukleotidtrifosfaacutety (dNTP) ale pre každuacute skuacutemavku je špecifickyacute priacutedavok maleacuteho množstva jedneacuteho z dideoxynukleotidtrifosfaacutetov (v prvej skuacutemavke je ddATP v druhej ddCTP v tretej ddTTP a vo štvrtej ddGTP) Maleacute množstvo ddNTP spocircsobiacute že pri polymerizaacutecii dochaacutedza k prednostneacutemu zaradeniu štandardnyacutech dNTP do narastajuacuteceho reťazca a len občas sa inkorporuje ddNTP čiacutem sa zastaviacute synteacuteza reťazca V každej skuacutemavke tak vznikne suacutebor DNA fragmentov rocircznych veľkostiacute zakončenyacutech priacuteslušnyacutem ddNTP (v prvej skuacutemavke ddATP v druhej ddCTP v tretej ddTTP a vo štvrtej ddGTP) Po elektroforetickej separaacutecii v 4 draacutehach polyakrylamidoveacuteho geacutelu a autoraacutediografii sa z autoraacutediogramu odčiacuteta sekvencia

V suacutečasnosti je sekvenovanie do značnej miery automatizovaneacute pričom využiacuteva princiacutep Sangerovej enzyacutemovej metoacutedy s určityacutemi obmenami Uacutesek DNA ktoryacute treba sekvenovať sa prostredniacutectvom termostabilnyacutech DNA polymeraacutez namnožiacute PCR metoacutedou po ktorej nasleduje sekvenačnaacute reakcia (asymetrickaacute PCR) s fluorescenčne značenyacutemi ddNTP (každyacute druh označenyacute inyacutem fluorescenčnyacutem farbivom) Sekvenačnaacute reakcia prebieha v jednej skuacutemavke s jednyacutem primerom vznikne tak suacutebor jednovlaacuteknovyacutech DNA rocircznej dĺžky ktoreacute suacute na 3konci označeneacute ddNTP so špecifickyacutem fluorescenčnyacutem farbivom Taacuteto metoacuteda sekvenovania sa tiež nazyacuteva rdquodye-terminator cycle sequencingrdquo(obr 30) Po kapilaacuternej elektroforeacuteze vzorky v genetickom analyzaacutetore zaznamenaacutevaniacute fluorescencie jednotlivyacutech fragmentov CCD kamerou a softveacuterovom spracovaniacute sa ziacuteska sekvencia DNA (obr 31)

34

Obr 30 Princiacutep sekvenovania Sangerova dideoxy metoacuteda alebo tzv chain termination method (reťazec zastavujuacuteca metoacuteda) Obr 31 Určenie genotypu plodu a rodičov sekvenčnou analyacutezou DNA ziacuteskanej z plodovej vody (prenataacutelna diagnostika) a perifeacuternej krvi sekvenčnaacute analyacuteza geacutenu ASPA vyacutesledok u plodu priacutetomnaacute mutaacutecia c 914CgtA v homozygotnom stave (AA) rodičia heterozygoti (AC) Uvedenaacute mutaacutecia je v homozygotnom stave kauzaacutelnou priacutečinou Canavanovej choroby

Automatizovaneacute sekvenovanie prinaacuteša viacereacute vyacutehody oproti klasickej Sangerovej metoacutede vyššiu presnosť a ryacutechlosť v jednej sekvenačnej reakcii možnosť osekvenovať až 1200 nukleotidovyacute fragment maleacute množstvo templaacutetu potrebneacute na analyacutezu

35

63 Next Generation Sequencing (NGS)

NGS (sekvenovanie novej generaacutecie) maacute obrovskyacute potenciaacutel v analyacuteze genoacutemov pričom toto označenie zahŕňa viacereacute technologickeacute metoacutedy reprezentovaneacute niekoľkyacutemi firmami Princiacutepom je masiacutevne paralelneacute sekvenovanie čiacutem sa ziacuteskajuacute raacutedovo tisiacutece až milioacuteny sekvenciiacute naraz 631 Sekvenovanie druhej generaacutecie

Na začiatku sa analyzovanaacute DNA vo vaumlčšine priacutepadov fragmentuje (vznikne tak DNA

knižnica) na fragmenty sa pripoja kraacutetke sekvencie ndash adapteacutery naacutesledne sa tieto fragmenty rocircznymi priacutestupmi amplifikujuacute a určiacute sa ich sekvencia Vďaka čiastočnyacutem prekryvom je zo ziacuteskanyacutech sekvencii možneacute poskladať plynuluacute sekvenciu zodpovedajuacutecu pocircvodnej nefragmentovanej DNA

Pyrosekvenovanie je podobne ako Sangerova metoacuteda založenaacute na princiacutepe synteacutezy komplementaacuterneho vlaacutekna DNA avšak rozdiel je v tom že sa na detekciu inkorporaacutecie nukleotidu využiacuteva inyacute systeacutem tvorby luminiscenčneacuteho signaacutelu v priebehu reakcie Pyrosekvenovanie je umožneneacute vďaka aktivite 4 enzyacutemov - DNA polymeraacutezy ATP sulfurylaacutezy luciferaacutezy a apyraacutezy Reakčnaacute zmes obsahuje aj ďalšie komponenty - enzymatickeacute substraacutety adenoziacutenfosfosulfaacutet (APS) d-luciferiacuten sekvenovanyacute templaacutet a cyklicky postupne po jednom type pridaacutevaneacute nukleotidtrifosfaacutety Po zabudovaniacute nukleotidu do novovznikajuacuteceho reťazca docircjde k uvoľneniu pyrofosfaacutetu naacutesledne je využityacute ATP sulfurylaacutezou na synteacutezu ATP z APS počas ďalšej reakcie docircjde k využitiu ATP luciferaacutezou na premenu luciferiacutenu na oxyluciferiacuten čo spocircsobiacute svetelnyacute signaacutel a ten zaznamenaacute detekčnyacute systeacutem Poslednou enzymatickou reakciou je reakcia apyraacutezy ktoraacute odstraacuteni nezainkorporovaneacute nukleotidy a nevyužiteacute ATP aby sa celyacute proces mohol zopakovať s reakčnou zmesou obsahujuacutecou ďalšiacute nukleotidtrifosfaacutet (inyacute ako v predchaacutedzajuacutecej reakcii) Po každej reakcii detektor zaznamenaacuteva emisiu svetla na zaacuteklade intenzity svetla je možneacute určiť či bol vradenyacute priacuteslušnyacute nukleotidtrifosfaacutet či bol inkorporovanyacute jeden priacutepadne viac rovnakyacutech nukleotidtrifosfaacutetov

Zvyacutešenie vyacutekonu pyrosekvenovania umožnila tzv emulznaacute PCR v mikročasticiach a použitie platničky PicoTiterPlatereg toto sekvenovanie zaviedla firma Roche pod pojmom 454 pyrosekvenovanie v roku 2005 Na začiatku sa DNA fragmentuje na uacuteseky dlheacute 400-600 baacutez dvojvlaacuteknovaacute fragmentovanaacute DNA sa liguje s adapteacutermi prostredniacutectvom nich sa naviaže na mikročastice dvojvlaacuteknoveacute fragmenty sa oddelia mikročastice s naviazanyacutemi jednovlaacuteknovyacutemi fragmentami sa premiešajuacute so zmesou oleja a roztoku ktoryacute obsahuje všetky komponenty na uacutespešnuacute PCR Tyacutemto spocircsobom sa okolo každej mikročastice vytvoriacute vlastnyacute mikroreaktor v ktorom prebehne amplifikaacutecia fragmentu Po PCR reakcii sa mikročastice prenesuacute do platničky PicoTiterPlate v ktorej sa do jamky zmestiacute akuraacutet jedna mikročastica a reakčneacute komponenty pyrosekvenačnej reakcie PicoTiterPlatereg maacute 1 600 000 jamiek každaacute jamka maacute maximaacutelny objem 75 picolitra Platnička s mikročasticami sa vložiacute do sekvenačneacuteho systeacutemu ndash priacutestroja v ktorom sa celeacute pyrosekvenovanie uskutočniacute Chemiluminiscenčneacute signaacutely ktoryacutech počas sekvenovania vznikajuacute milioacuteny v priebehu hodiny suacute zachyteneacute CCD kamerou a analyzovaneacute softveacuterom

Firma Illumina predstavila inuacute technoloacutegiu PCR amplifikaacutecia a sekvenovanie sa uskutočňuje na skliacutečku (flow cell) Fragmentaacutecia DNA a pripojenie adapteacuterov prebieha za uacutečasti transpozoacutemov v procese nazvanom tagmentaacutecia Po hybridizaacutecii fragmentov DNA na skliacutečko prebehne v klastroch PCR amplifikaacutecia (tzv mostiacutekovaacute amplifikaacutecia) sekvenaacutecia prebieha za uacutečasti rozdielne fluorescenčne značenyacutech a chemicky modifikovanyacutech nukleotidov pričom každyacute nukleotid emituje fluorescenciu s inou vlnovou dĺžkou Na skliacutečku prebieha paralelne až 6 miliaacuterd sekvenaacutecii (obr 32)

Ďalšiacutemi možnosťami sekvenovania druhej generaacutecie je systeacutem SOLid (vyvinutyacute firmou Applied Biosystem dnes pod Thermo Fisher Scientific) a Ion Semiconductor Sequencing ndash polovodičoveacute ioacutenoveacute sekvenovanie (od firmy Ion Semiconductor Sequencing v suacutečasnosti Thermo Fisher Scientific)

36

Obr 32 Princiacutep sekvenovania novej generaacutecie od firmy Illumina PCR amplifikaacutecia a sekvenovanie sa uskutočňuje na skliacutečku (flow cell) paralelne prebieha až 6 miliaacuterd sekvenaacutecii

632 Sekvenovanie tretej generaacutecie

Pred sekvenovaniacutem netreba amplifikovať DNA PCR metoacutedou ale sekvencia sa ziacuteskava zachyteniacutem signaacutelu v reaacutelnom čase Medzi sekvenovanie tretej generaacutecie patriacute SMRT (Single Molecule Real-Time Sequencing) a Nanopore Sequencing

37

7 Fragmentačnaacute analyacuteza DNA

Je metoacuteda použiacutevanaacute na určenie veľkosti fragmentov DNA ziacuteskanyacutech PCR reakciou Dĺžka amplifikovanyacutech DNA fragmentov sa zistiacute ich porovnaniacutem s veľkostnyacutem štandardom (obr 33) ktoryacute je tvorenyacute DNA fragmentami znaacutemej dĺžky Veľkostnyacute štandard je pred kapilaacuternou elektroforeacutezou zmiešanyacute so vzorkou DNA fragmenty veľkostneacuteho štandardu suacute fluorescenčne označeneacute pričom použiteacute fluorescenčneacute farbivo je ineacute ako fluorescenčneacute farbivo použiteacute na označenie DNA fragmentov vo vyšetrovanej vzorke

Obr 33 Elektroforetogram veľkostneacuteho štandardu použiacutevaneacuteho na určenie veľkostiacute fragmentov analyzovanyacutech kapilaacuternou elektroforeacutezou v genetickom analyzaacutetore (GeneScantrade 500 LIZtrade dye Size Standard) dĺžka fragmentov v nukleotidoch (napr 50 nukleotidov)

Fragmentačnaacute analyacuteza pozostaacuteva z viaceryacutech krokov Prvyacutem je izolaacutecia DNA nasleduje PCR amplifikaacutecia počas ktorej sa novosyntetizovaneacute DNA fragmenty označia fluorescenčnyacutemi farbivami Vzorka s PCR produktom sa pripraviacute na kapilaacuternu elektroforeacutezu tak že sa zmieša s veľkostnyacutem štandardom (sluacuteži na určenie veľkosti fragmentov) a denaturačnou laacutetkou (formamid) nasleduje denaturaacutecia Pripraveneacute vzorky suacute injektovaneacute do priacutestroja (genetickyacute analyzaacutetor) kde v kapilaacutere naplnenej polymeacuterom v elektrickom poli migrujuacute fluorescenčne značeneacute fragmenty DNA na zaacuteklade veľkosti (kapilaacuterna elektroforeacuteza) Počas elektroforeacutezy genetickyacute analyzaacutetor zaznamenaacuteva fluorescenciu fragmentov Analyacutezou daacutet prostredniacutectvom špeciaacutelnych softveacuterov sa ziacuteskajuacute elektroforetogramy z ktoryacutech je možneacute zistiť veľkosť fragmentov ako aj typ fluorescencie (docircležiteacute ak suacute genetickeacute varianty rozliacutešiteľneacute rocircznou fluorescenciou napr SNaPshot) Fragmentačnaacute analyacuteza je suacutečasťou množstva molekulaacuterno-genetickyacutech metoacuted (pozri obr 12 26 28 29 34) ako suacute napr STR analyacuteza (Short Tandem Repeat) AFLP analyacuteza (Amplified Fragment Lenght Polymorfism) RFLPT-RFLP analyacuteza (Restriction Fragment Lenght PolymorfismTerminal Restricted Fragment Lenght Polymorfism) SSCP (Single Strand Conformation Polymorfism) VNTR (Variable Number of Tandem Repeat) analyacuteza straty heterozygotnosti (LOH loss of heterozygozity) MLPA (Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification) MSMSA (Methylation-Sensitive Mobility Shift Assay) SNP genotypovanie (SNaPshotreg) HiCEP (High-Coverage Expression Profiling)

38

Obr 34 Kvantitatiacutevna fragmentačnaacute PCR analyacuteza (QF-PCR) DNA izolovanej z plodovej vody vyacutesledok prenataacutelnej analyacutezy = priacutetomnosť troch piacutekov pre chromozoacutem 18 (u všetkyacutech fragmentov detegujuacutecich chromozoacutem 18 je pomer vyšetrovanyacutech markerov aberantnyacute 21 resp 111) čo znamenaacute trizoacutemiu chromozoacutemu 18 Edwardsov syndroacutem

39

8 Metoacutedy založeneacute na princiacutepe hybridizaacutecie

Nukleoveacute kyseliny majuacute schopnosť vytvaacuterať dvojvlaacuteknoveacute reťazce z jednovlaacuteknovyacutech molekuacutel na zaacuteklade komplementarity baacutez Komplementarita baacutez umožňuje replikaacuteciu DNA transkripciu RNA komplementarita baacutez zabezpečuje teda reprodukovateľnosť živej hmoty

Hybridizaacutecia je proces v ktorom na zaacuteklade komplementarity baacutez dochaacutedza k vytvoreniu dvojvlaacuteknovej nukleovej kyseliny z dvoch jednovlaacuteknovyacutech molekuacutel DNA alebo RNA alebo ich kombinaacuteciou DNA RNA pričom kratšia jednovlaacuteknovaacute nukleovaacute kyselina vystupuje ako sonda (proacuteba) Hybridizaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten je jeden z najpoužiacutevanejšiacutech naacutestrojov v molekulaacuternej bioloacutegii a genetike (hybridizaacutecia primerov alebo proacuteb sa využiacuteva v takmer každej metoacutede - v PCR RT-PCR qPCR RT-qPCR MLPA sekvenovaniacute fragmentačnej analyacuteze FISH DNA mikročipoch atď)

Denaturaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten je proces pri ktorom dochaacutedza k porušeniu vodiacutekovyacutech vaumlzieb medzi vlaacuteknami nukleovyacutech kyseliacuten (strata sekundaacuternej a terciaacutelnej štruktuacutery) tak že docircjde k ich uacuteplneacutemu oddeleniu vzniknuacute jednovlaacuteknoveacute reťazce Denaturaacutecia NK mocircže byť spocircsobenaacute vplyvom vysokyacutech teplocirct pH alebo chemickyacutech laacutetok (denaturačneacute činidlaacute) Renaturaacutecia je opačnyacute proces v ktorom na zaacuteklade komplementarity dochaacutedza k tvorbe dvojvlaacuteknovyacutech NK

Hybridiza čnaacute sonda (proacuteba) je jednovlaacuteknovaacute nukleovaacute kyselina určitej znaacutemej dĺžky a sekvencie (najčastejšie DNA pretože je stabilnejšia ako RNA) ktoraacute je značenaacute a sluacuteži na detekciu komplementaacuternych molekuacutel DNA alebo RNA v procese hybridizaacutecie V zaacutevislosti od podmienok hybridizaacutecie (stringencia) mocircže byť detegovanaacute sekvencia uacuteplne komplementaacuterna alebo v menej priacutesnych podmienkach mocircže mať sekvenčneacute odchyacutelky Proacuteba sluacuteži na vyhľadanie a zviditeľnenie cieľovyacutech NK Zviditeľnenie sa deje prostredniacutectvom označenia proacuteby ešte pred hybridizaacuteciou Značenie proacuteby mocircže byť raacutedioaktiacutevne a neraacutedioaktiacutevne (najčastejšie fluorescenčneacute)

Raacutedioaktiacutevne značeneacute proacuteby pomocou izotopov (32P) sa využiacutevali viac v minulosti v suacutečasnosti suacute kvocircli zdravotnyacutem rizikaacutem ohľaduplnosti k životneacutemu prostrediu ako aj kvocircli jednoduchšej manipulaacutecii použiacutevaneacute fluorescenčne značeneacute proacuteby Raacutedioaktiacutevne značeneacute sondy boli použiacutevaneacute hlavne metoacutedou Southernovej hybridizaacutecie (Southern blotting Southern blot) Citlivosť raacutedioaktiacutevne značenyacutech proacuteb je vyššia dosahuje schopnosť zachytiť 10 fg (femtogram 10-15) cieľovej DNA sekvencie 81 Southern blot

Metoacutedu objavil v roku 1975 britskyacute bioloacuteg Edwin Southern (preto Southern) Pri Southernovej hybridizaacutecii sa restrikčne štiepeneacute fragmenty DNA elektroforeticky separujuacute v geacuteli potom sa metoacutedou blottingu prenesuacute na nylonovuacute alebo nitroceluloacutezovuacute membraacutenu kde suacute naacutesledne hybridizovaneacute v roztoku obsahujuacutecom raacutedioaktiacutevne značenuacute sondu Priloženiacutem fotografickeacuteho filmu k membraacutene a vyvolaniacutem filmu autoraacutediografiou docircjde k zviditeľneniu lokaliacutet kde došlo k hybridizaacuteciiacute raacutedioaktiacutevne značenej sondy s fragmentom DNA (autoraacutediogram) Southern blot bol kľuacutečovou a prvou metoacutedou na identifikaacuteciu osocircb (DNA fingerprinting DNA pofiling) (obr 35)

Okrem Southern blotu existuje Northern blot na analyacutezu RNA (geacutenovej expresie) a Western blot na analyacutezu proteiacutenov postup je obdobnyacute ako pri Southern blote s obmenami špecifickyacutemi pre konkreacutetny blot Pri Northern blote sa použiacutevajuacute hybridizačneacute proacuteby ale pre vizualizaacuteciu proteiacutenov western blotom je potrebneacute použiť protilaacutetky s naacuteslednou vizualizaacuteciou Pomenovanie techniacutek je hra so sloviacutečkami (keďže paacuten Northern ani Western neobjavili takto nazvaneacute techniky)

Neraacutedioaktiacutevne značenie proacuteb použiacutevanyacutech v molekulaacuternej genetike mocircže byť nepriame (použitie haptenu) alebo priame Konečnaacute vizualizaacutecia je najčastejšie zabezpečenaacute fluoreskujuacutecimi farebnyacutemi značkami farbivami fluorochroacutemami (fluorofoacuterami) Pri priamom značeniacute je farbička kovalentne naviazanaacute na nukleotid a na zachytenie fluorescencie suacute potrebneacute špeciaacutelne priacutestroje umožňujuacutece excitaacuteciu farbičky ktoraacute potom emituje žiarenie určitej vlnovej dĺžky (emisneacute žiarenie) a to zachytiacute detekčnyacute systeacutem priacutestroja Využitie fluorochroacutemov v molekulaacuternej genetike je masiacutevne napr na vizualizaacuteciu NK elektroforeticky separovanyacutech v geacuteli kvantifikaacuteciu produktov PCR reakcie v priacutestroji real-time PCR cykleacuter sekvenovaniacute fragmentačnej analyacuteze FISH DNA mikročipoch atď

40

Obr 35 Princiacutep Southern blotu

82 FISH (fluorescenčnaacute in situ hybridizaacutecia)

FISH (fluorescent in situ hybridization fluorescenčnaacute in situ hybridizaacutecia) metoacuteda patriacute medzi molekulovo-cytogenetickeacute techniky Princiacutep FISH metoacutedy je založenyacute na hybridizaacuteciiacute fluorescenčne značenyacutech proacuteb ku komplementaacuternym uacutesekom vyšetrovanej DNA na podložnom skle (priamo na mieste - in situ) K denaturaacutecii dsDNA dochaacutedza buď vplyvom denaturačnyacutech činidiel alebo zvyacutešenou teplotou a naacuteslednou renaturaacuteciou dochaacutedza k naviazaniu sondy na komplementaacuterny uacutesek DNA Vyacutesledok hybridizaacutecie sa vizualizuje fluorescenčnyacutem mikroskopom vybavenyacutem vhodnyacutemi fluorescenčnyacutemi filtrami a vizuaacutelne zhodnotiacute skuacutesenyacutem odborniacutekom Fluorescencia sa v niektoryacutech priacutepadoch mocircže zaznamenať a hodnotiť aj pomocou softveacuteru (obr 36)

Pomocou FISH detegujeme numerickeacute aberaacutecie - zmeny v počte chromozoacutemov (napr trizoacutemia monozoacutemia chromozoacutemov) alebo štruktuacuterne aberaacutecie a prestavby (napr translokaacutecie inverzie deleacutecie duplikaacutecie amplifikaacutecie) FISH metoacuteda umožňuje identifikaacuteciu a detekciu každeacuteho ľudskeacuteho chromozoacutemu jeho zaradenie do karyotypu odhalenie malyacutech submikroskopickyacutech chromozoacutemovyacutech zmien a tiež mapovať poziacutecie jednotlivyacutech geacutenov na chromozoacuteme

41

Obr 36 Princiacutep štandardnej FISH a FISH maľovania celeacuteho chromozoacutemu

Veľkou vyacutehodou FISH metoacutedy je možnosť analyacutezy buniek v metafaacuteze aj v interfaacuteze kedy nie je nutnaacute kultivaacutecia buniek a tiež ryacutechle analyzovanie veľkeacuteho počtu buniek (stovky až tisiacutece) K ďalšiacutem vyacutehodaacutem patriacute bezpečnosť vysokaacute citlivosť dostatočnaacute stabilita relatiacutevne kraacutetky čas hybridizaacutecie a možnosť ryacutechleho vyhodnotenia Hybridizaacutecia pri vaumlčšine suacutečasne dodaacutevanyacutech sond trvaacute 10-12 hodin (na trhu suacute už dostupneacute aj sondy so skraacutetenyacutem časom hybridizaacutecie na 2-3 hodiny) Po hybridizaacuteciiacute nasleduje odmyacutevanie kedy pri priacuteslušnej teplote dochaacutedza k odmytiu nenaviazanyacutech a nespraacutevne hybridizovanyacutech sond Preparaacutet sa naacutesledne podfarbiacute a vyacutesledok sa zhodnotiacute vo fluorescenčnom mikroskope Na podfarbenie chromozoacutemov alebo jadier sa použiacuteva modreacute kontrastneacute farbivo DAPI (46-diamidino-2-fenylindol) ktoreacute maacute silneacute fluorescenčneacute vlastnosti dokaacuteže prechaacutedzať jadrovou membraacutenou a viazať sa na DNA Vyacutesledkom je modreacute zafarbenie ktoreacute vyacuteborne kontrastuje so signaacutelmi jednotlivyacutech sond

Limitujuacutecim faktorom FISH je možnosť identifikaacutecie len tyacutech uacutesekov DNA ku ktoryacutem suacute použiteacute sondy V jednej analyacuteze je možneacute použiť najviac 3 odlišne značeneacute sondy a tak zistiť priacutepadneacute abnormality len na 1 alebo na paacuter lokusoch Na relevantnuacute detekciu je potrebneacute mať vo vzorke 1-5 aberantnyacutech interfaacutezovyacutech jadier

FISH je možneacute uskutočniť na širokej škaacutele biologickeacuteho materiaacutelu na vzorkaacutech perifeacuternej krvi kostnej drene naacuteteroch choriovyacutech klkoch plodovej vode rocircznych druhov tkaniacutev natiacutevnych alebo zaliatych v parafiacutene na 1 bunke (predimplantačnaacute genetickaacute diagnostika PGD) (obr 37)

Využiacuteva sa na detekciu aberaacuteciiacute pri mnohyacutech onkologickyacutech ochoreniach (napr pri diagnoacuteze mnohopočetnyacute myeloacutem sa v suacutečasnosti po separaacutecii CD138+ buniek robiacute FISH s 5 sondami pre geacuteny IGH TP53 RB1 oblasť 1p321q21 a stanovuje sa hyperploidia chromozoacutemov 5 9 a 15) a tiež k spresneniu doplneniu a k overeniu bežneacuteho cytogenetickeacuteho vyšetrenia

Podľa miesta na chromozoacuteme na ktorom dochaacutedza k hybridizaacutecii sondy rozlišujeme 4 typy

DNA sond bull centromeacuteroveacute sondy ndash sa viažu na strednuacute časť chromozoacutemu ndash centromeacuteru sluacutežia k diagnostike zmien v počte chromozoacutemov k detekcii chromozoacutemov neznaacutemeho pocircvodu umožňujuacute interfaacuteznu FISH na nedeliacich sa bunkaacutech (obr 38-41)

42

Obr 37 Interfaacutezna FISH preimplantačnyacute genetickyacute skriacutening aneuploidiiacute ndash blastomeacutera 3-denneacuteho ľudskeacuteho embrya s normaacutelnym počtom chromozoacutemov 13 18 21 pohlavie XY použityacutech 5 sond pre chromozoacutemy 13 ndash orange 18 ndash aqua 21 ndash green X ndash blue a Y ndash yellow (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

Obr 38 Interfaacutezne jadro po hybridizaacutecii s centromeacuterovou sondou pre chromozoacutem 8 (Vysis Abbott) V pravom jadre je priacutetomnaacute trizoacutemia chromozoacutemu 8 (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex) Obr 39 Metafaacutezna (A) a interfaacutezna FISH (B) použitaacute centromeacuterovaacute sonda CEPX spectrum orangeCEPY spectrum green (Vysis Abbott) Sonda hybridizuje k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (červenyacute signaacutel) a Y (zelenyacute signaacutel) (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

43

Obr 40 Interfaacutezna FISH vyšetrenie spermiiacute použiteacute sondy CEPX greenCEPY orange (Aneuscore Metasystems) Sondy hybridizujuacute k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (zelenyacute signaacutel) Y (červenyacute signaacutel) vľavo ndash dve haploidneacute spermie (majuacutece jedna spermia X druhaacute Y chromozoacutem) vpravo ndash dve patologickeacute spermie obsahujuacutece gonozoacutemovyacute komplement XY (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

Obr 41 Interfaacutezna FISH vyšetrenie spermiiacute použiteacute sondy CEPX greenCEPY orange a CEP18 aqua (Aneuscore Metasystems) Sondy hybridizujuacute k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (zelenyacute signaacutel) Y (červenyacute signaacutel) a 18 (modryacute signaacutel) vľavo ndash normaacutelne haploidneacute ľudskeacute spermie - 1x chromozoacutem X alebo Y a jedenkraacutet chromozoacutem 18 v strede ndash patologickaacute spermia obsahujuacuteca gonozoacutemovyacute komplement XY a jeden chromozoacutem 18 vpravo ndash patologickaacute diploidnaacute spermia s chromozoacutemami X Y a dvoma chromozoacutemami 18 (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

bull lokusovo špecifickeacute sondy ndash hybridizaacutecia prebehne na konkreacutetnom mieste geacutenu (lokuse) (obr 42-44) použiacutevajuacute sa k vyšetreniu mikrodeleacuteciiacute (straty malyacutech častiacute chromozoacutemu pri mikrodelečnyacutech syndroacutemoch) k zisteniu amplifikaacutecie onkogeacutenov a niektoryacutech špecifickyacutech translokaacuteciiacute prestavby geacutenov umožňujuacute interfaacuteznu FISH na nedeliacich sa bunkaacutech bull subtelomeroveacute ndash vaumlzba na koncoveacute časti chromozoacutemu ndash telomeacutery bull celochromozoacutemoveacute alebo celomaľovacie sondy ndash sondy hybridizujuacute s mnohopočetnyacutemi chromozoacutemovyacutemi sekvenciami pričom sa fluorescenčne tak bdquovymaľujeldquo celyacute chromozoacutem (Obr 45) Použiacutevajuacute sa na vyšetrenie chromozoacutemovyacutech prestavieb k analyacuteze translokaacuteciiacute a k detekcii pocircvodu tzv marker chromozoacutemov (malyacutech nadpočetnyacutech chromozoacutemov neznaacutemeho pocircvodu) K použitiu sondy suacute potrebneacute metafaacutezne chromozoacutemy nepoužiacutevaju sa pre interfaacuteznu FISH

Pri konvenčnej chromozoacutemovej FISH suacute homogeacutenne DNA proacuteby hybridizovaneacute s fixovanyacutem metafaacuteznym alebo prometafaacuteznym chromozoacutemomchromozoacutemami na skliacutečku (Obr 36a) Maximaacutelna rozlišovacia schopnosť metafaacuteznej FISH je niekoľko megabaacutez (Obr 39a 45) využitiacutem viac

44

natiahnutyacutech prometafaacuteznych chromozoacutemov sa dosiahne 1 Mb rozliacutešenie Prostredniacutectvom fiber FISH konkreacutetne artificiaacutelne deproteinizovanej natiahnutej DNA pripravenej in situ z celyacutech buniek na mikroskopickom skliacutečku je možneacute vizualizovať individuaacutelne geacuteny maleacute DNA elementy na chromozoacuteme s rozliacutešeniacutem okolo 1000 bp

Obr 42 Interfaacutezne jadro po hybridizaacutecii s lokusovo-špecifickou sondou LSI 5q31 Spectrum Orange5p12 Spectrum Green (Vysis Abbott) Na ľavom obraacutezku suacute priacutetomneacute dva červeneacute (5q31) a dva zeleneacute signaacutely (5p12) v pravom jadre je priacutetomnaacute deleacutecia 5q31 oblasti chyacuteba jeden červenyacute signal (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

Obr 43 Interfaacutezna FISH použitaacute lokusovo-špecifickaacute sonda ndash translokačnaacute - XL BCRABL1 plus (Metasystems) dvojfarebnaacute dvojfuacutezna kde červenaacute označuje lokus ABL1 na chromozoacuteme 9 a zelenaacute oblasť BCR na chromozoacuteme 22 Sonda deteguje fuacuteziu protoonkogeacutenu ABL1 (9q34) a geacutenu BCR (22q11) v priacutepade že červenyacute a zelenyacute signaacutel suacute pri sebe (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

45

Obr 44 Interfaacutezna FISH Použitaacute lokusovo-špecifickaacute sonda- typ break apart pre IGH geacuten V docircsledku translokaacutecie došlo k rozskočeniu geacutenu pričom translokačneacuteho partnera nepoznaacuteme vieme určiť len percento v koľkyacutech jadraacutech je geacuten prestavanyacute (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex) Obr 45 Použiteacute celochromozoacutemoveacute sondy WCP 15 (červenyacute chromozoacutem) a WCP 17 (zelenyacute chromozoacutem) Na metafaacuteze je potvrdenaacute reciprokaacute translokaacutecia t(1517)(q2221) (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

FISH vizualizaacutecia celeacuteho chromozoacutemu maľovanie chromozoacutemu anglicky chromosome

painting je špeciaacutelnou aplikaacuteciou chromozoacutemovej FISH proacuteba je koktail veľkeacuteho počtu rocircznych fluorescenčne značenyacutech DNA fragmentov hybridizujuacutecich pozdĺž celeacuteho konkreacutetneho chromozoacutemu (obr 36b 45) bdquoChromosomepaintingldquo analyzuje metafaacutezne chromozoacutemy V minulosti bola FISH vizualizaacutecia celyacutech chromozoacutemov limitovanaacute malyacutem množstvom rocirczne sfarbenyacutech fluorochroacutemov

V suacutečasnosti je možneacute detegovať množstvo cieľovyacutech sekvenciiacute naraz čo sa využiacuteva pri celogenoacutemovej chromozoacutemovej vizualizaacutecii (whole-chromosomepainting - WCP) metoacutedou multiplex FISH (M-FISH multicolor FISH o br 46) alebo spektraacutelnej karyotypizaacutecie (SKY) kedy možno rozliacutešiť všetky ľudskeacute chromozoacutemy ndash teda 24 rocircznych chromozoacutemov M-FISH a SKY patria medzi metafaacutezne formy FISH diagnostiky ktoreacute umožňujuacute simultaacutennu vizualizaacuteciu všetkyacutech ľudskyacutech chromozoacutemov v rocircznych farbaacutech čo predstavuje uľahčenie analyacutezy karyotypu hlavne pri komplexnyacutech zmenaacutech a markeroch neznaacutemeho pocircvodu Obe techniky vychaacutedzajuacute z použitia

46

celochromozoacutemovyacutech sond značenyacutech kombinaacuteciou viaceryacutech fluorochroacutemov Rozdiel medzi M-FISH a SKY spočiacuteva v technike ziacuteskania konečneacuteho obrazu

Obr 46 Multicolor FISH - každyacute chromozoacutemovyacute paacuter je zafarbenyacute inou farbou pričom na ich zafarbenie postačuje kombinaacutecia 5 fluorochroacutemov Na vyhodnocovanie je potrebnaacute špeciaacutelna sada fluorescenčnyacutech filtrov pre jednotliveacute fluorochroacutemy a špeciaacutelnyacute softweacuter Vľavo-štandardnyacute karyotyp vpravo karyotyp s mutaacuteciami (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

V molekulovej cytogenetike suacute komerčne dostupneacute sety M-FISH proacuteb umožňujuacutece

viacfarebneacute pruacutežkovanie chromozoacutemov (banding) s vysokyacutem rozliacutešeniacutem (multicolor-banding mBAND FISH MCB) čo umožňuje identifikaacuteciu intrachromozoacutemovyacutech prestavieb (Obr 47) Nevyhnutnosťou mBAND-u je mať chromozoacutemy v metafaacuteze Taacuteto metoacuteda bola prvyacutekraacutet uskutočnenaacute na chromozoacuteme 5 v roku 1999 mBAND FISH umožňuje rozliacutešiť špecifickeacute oblasti chromozoacutemov na uacuterovni pruacutežku - bandu a sub-bandu s detekciou 550 bandov haploidneacuteho karyotypu

Obr 47 A - mBAND chromozoacutemu 11 - inverzia duplikovanej oblasti 11q223-q25 B - mBAND chromozoacutemu 3 - na kruhovom chromozoacuteme deleacutecia oblasti 3p263 C - mBAND chromozoacutemu 2 - potvrdenie inverzie duplikovanej časti chromozoacutemu (poskytnuteacute RNDr Dagmar Landlovou Medirex)

FISH metoacuteda a jej varianty (M-FISH mBAND SKY) majuacute v suacutečasnosti širokeacute využitie v

klinickej genetike v onkologickej genetike na detekciu aberaacuteciiacute v čase diagnoacutezy počas liečby po

47

liečbe monitorovanie po transplantaacutecii kostnej drene v prenataacutelnej a postnataacutelnej diagnostike pri detekcii submikroskopickyacutech deleacuteciiacute (napr DiGeorge syndroacutem - 22q112 delečnyacute syndroacutem PraderndashWilli syndroacutem- chromozoacutem 15q11-13) prostredniacutectvom FISH je možnaacute detekcia numerickyacutech zmien chromozoacutemov (trizoacutemia chromozoacutemu 21 pri Downovom syndroacuteme trizoacutemia chromozoacutemu 15 pri Patauovom syndroacuteme trizoacutemia chromozoacutemu 18 pri Edwardsovom syndroacuteme) rocirczne zmeny v počte pohlavnyacutech chromozoacutemov (monozoacutemia X pri Turnerovom syndroacuteme Klinefelterov syndroacutem s X chromozoacutemom naviac - XXY) podobne v predimplantačnej diagnostike

83 DNA Microarray (DNA mikro čip biočip) DNA mikročipovanie je technika využiacutevajuacuteca hybridizaacuteciu skuacutemanej nukleovej kyseliny

(cieľovaacute vzorka) s veľkyacutem množstvom oligonukleotidovyacutech proacuteb (desať tisiacutec až milioacuten) ktoreacute suacute prichyteneacute na pevnyacute podklad najčastejšie sklenyacute silikoacutenovyacute alebo nylonovyacute (doštička čip) Skuacutemanaacute nukleovaacute kyselina je pred hybridizaacuteciou fragmentovanaacute označenaacute fluorofoacuterom a denaturovanaacute Po kontakte čipu s cieľovou vzorkou ktoraacute je vlastne zmes označenyacutech oligonukleotidov značeneacute oligonukleotidy hybridizujuacute s oligonukleotidovyacutemi sekvenciami prichytenyacutemi na čipe Potom suacute na zaacuteklade fluorescencie detekovaneacute miesta kde došlo k hybridizaacutecii čiže vzorka obsahovala takuacuteto nukleotidovuacute sekvenciu Z jedneacuteho mikročipu sa ziacuteska obrovskeacute množstvo daacutet ktoreacute je vždy nutneacute softveacuterovo spracovať V dnešnej dobe existuje niekoľko firiem poskytujuacutecich komerčne mikročipy na objednaacutevku alebo si ich laboratoacuteria produkujuacute sami

Mikročipovanie prebieha nasledovne

1) Vytvorenie DNA čipu ndash tisiacutece rocircznych jednovlaacuteknovyacutech DNA oligonukleotidov znaacutemych sekvencii sa kovalentne naviažu na povrch doštičky vždy v určitej lokalite je niekoľko rovnakyacutech oligonukleotidov veľkosť takejto lokality je ˂ 200 microm Proacutebami mocircže byť DNA cDNA alebo syntetizovaneacute oligonukleotidy Už hotoveacute mikročipy ponuacutekajuacute viacereacute firmy (Affymetrix Agilent Technologies Eppendorf Illumina) alebo si ich jednotliveacute laboratoacuteria vyraacutebajuacute sami pomocou robotickyacutech zariadeniacute DNA čip sa vytvaacutera buď nanaacutešaniacutem kvapiek oligonukleotidov na podklad alebo synteacutezou oligonukleotidov in situ na čipe 2) Priacuteprava vzorky ndash nukleovaacute kyselina (mRNA DNA) sa purifikuje určiacute sa jej kvantita a kvalita (spektrofotometericky) fragmentuje resp v priacutepade mRNA sa syntetizuje cDNA v priacutepade potreby sa mocircže DNA amplifikovať PCR reakciou štiepiť restrikčnyacutemi endonukleaacutezami 3) Fluorescenčneacute označenie (zriedkavejšie raacutedioaktiacutevne) fragmentov DNA prebieha počas reverznej transkripcie alebo PCR amplifikaacutecie za uacutečasti fluorescenčne značenyacutech nukleotidov Keď sa analyzujuacute dve rocirczne vzorky napr zdraveacute tkanivo a naacutedoroveacute tkanivo označenie nukleovyacutech kyseliacuten v tyacutechto tkanivaacutech byacuteva rozdielne a to použitiacutem dvoch rocircznych fluorescenčnyacutech farbiacutev (napr zeleneacute a červeneacute) Pred hybridizaacuteciou je potrebneacute vzorku denaturovať čiacutem sa vytvoriacute zmes jednovlaacuteknovyacutech DNA označenyacutech značkou 4) Hybridizaacutecia s mikročipom ndash v špeciaacutelnom hybridizačnom roztoku hybridizujuacute komplementaacuterne sekvencie zo vzorky s priacuteslušnyacutemi oligonukleotidovyacutemi sondami naviazanyacutemi na čipe Potom sa čip obmyje aby došlo k odstraacuteneniu čiastočne hybridizovanyacutech nukleovyacutech kyseliacuten 5) Skenovanie mikročipu ndash skenerom čipov docircjde k ožiareniu čipu laserom pričom v mieste hybridizaacutecie fluorescenčne značenyacutech DNA fragmentov s proacutebou docircjde k emisii svetla určitej vlnovej dĺžky ktoruacute skener zaznamenaacute 6) Analyacuteza daacutet prebieha metoacutedami bioinformatiky spracovaniacutem softveacutermi sa zistiacute ktoreacute lokality čipu navzaacutejom hybridizovali v priacutepade použitia dvoch vzoriek kontrolnej a skuacutemanej je možneacute analyzovať ich relatiacutevnu intenzitu hybridizaacutecie (expresie určiteacuteho geacutenu)

Existujuacute štyri typy mikročipov 1) Čipy ur čeneacute na analyacutezu expresie (obsahujuacute cDNA proacuteby) pre tzv dvojkanaacutelovyacute experiment kedy je vzorka určenaacute k hybridizaacutecii na čipe ziacuteskanaacute zmiešaniacutem DNA fragmentov kontrolnej a skuacutemanej vzorky pričom fragmenty suacute rozdielne fluorescenčne označeneacute (napr zelenyacute fluorofoacuter pre kontrolnuacute vzorku a červenyacute pre skuacutemanuacute) Na zaacuteklade intenzity a typu fluorescencie sa deteguje expresia geacutenov typickaacute pre kontrolnuacute vzorku (napr zelenaacute fluorescencia) pre skuacutemanuacute vzorku (napr

48

červenaacute fluorescencia) a expresia podobnaacute u oboch vzoriek (žltaacute fluorescencia) neexprimovaneacute geacuteny (čierna fluorescencia) rocirczne odtiene (v zaacutevislosti od prevažujuacutecej hybridizaacutecie) (obr 48) 2) Čipy ur čeneacute na analyacutezu mutaacutecii použije sa genoacutemovaacute DNA označenaacute jednou fluorescenčnou farbičkou na určenie jednonukleotidovej zmeny (SNP ndash Single Nukleotide Polymorphism) 3) Čipy na komparatiacutevnu genoacutemovuacute hybridizaacuteciu (aCGH array Comparative Genomic Hybridization) ndash použiacutevaneacute na zistenie zvyacutešenia alebo zniacuteženia množstva chromozoacutemovyacutech fragmentov obsahujuacutecich geacuteny zodpovedneacute za určiteacute ochorenie Na analyacutezu sa použije skuacutemanaacute gDNA a referenčnaacute (kontrolnaacute) DNA každaacute sa značiacute inou fluorescenčnou farbičkou (princiacutep ako pri analyacuteze expresie) (obr 49 50) 4) Čipy CGH - SNP kombinovaneacute čipy ur čeneacute na analyacutezu aj mutaacuteciiacute SNP aj na komparatiacutevnu genoacutemovuacute hybridizaacuteciu CGH

Mikročipy majuacute rozsiahle využitie napriacuteklad v identifikaacuteciiacute novyacutech geacutenov vo vyacuteskume ich funkciiacute expresie v rocircznych podmienkach pri diagnostike mnohyacutech ochoreniacute vo farmakogenomike vo vyacuteskume vplyvu toxiacutenov

Obr 48 Heatmapa geacutenovej expresie vybranyacutech geacutenov (mRNA) mikročip obsahuje 46000 cDNA proacuteb (poskytnuteacute Ing Helenou Gbelcovou PhD Uacutestav lekaacuterskej bioloacutegie genetiky a klinickej genetiky LF UK a UNB)

49

Obr 49 Princiacutep komparatiacutevnej genoacutemovej hybridizaacutecie (aCGH - array comparative genomic hybridization) Obr 50 A) Vyacutesledok komparatiacutevnej genoacutemovej hybridizaacutecie (aCGH - array comparative genomic hybridization) vzorky DNA izolovanej plodovej vody U plodu s abnormaacutelnym ultrasonografickyacutem vyšetreniacutem bola identifikovanaacute duplikaacutecia oblasti 3q261q29 (modryacute paacutes) a deleacutecia oblasti 5p1533p151 (červenyacute paacutes) Pre porovnanie chromozoacutem 1 bez aberaacutecie b) Ten istyacute pacient ale ineacute softveacuteroveacute spracovanie (poskytnuteacute RNDr Miroslavom Tomkom PhD Medirex)

50

Odporuacutečanaacute a použitaacute literatuacutera

Odborneacute knihy Klug W S Cummings M R Spencer Ch A Palladino M A Concepts of Genetics jedenaacuteste vydanie (2015) Carson S Molecular Biology Techniques tretie vydanie (2012) Strachan T Read A Human Molecular Genetics štvrteacute vydanie (2011) Sudbery P Sudbery I Human Molecular Genetics tretie vydanie (2009)

Internetoveacute straacutenky

wwwncbinlmnihgov wwwmlpacom wwwthermofishercom wwwilluminacom wwwpromegask wwwqiagencom wwwambioncom

Odborneacute člaacutenky Chacon-Cortes D Griffiths L R Methods for extracting genomic DNA from whole blood samples current perspectives Journal of Biorepository Science for Applied Medicine Volume 2 strany 1- 9 Viltrop T Krjutskov K Palta P Metspalu A Comparison of DNA extraction methods for multiplex polymerase chain reaction Anal Biochem 2010 Volume 398(2) strany 260-262 Ing Martin Čermaacutek Molekulaacuterna cytogenetika v problematike familiaacuternych maligniacutet Onkoloacutegia Volume 2 strany 77 - 83 Livak KJ Schmittgen TD Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method Methods 2001 Volume 25(4) strany 402 - 408 Bustin S A Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays J Mol Endocrinol 2000 Volume 25(2) strany169 - 193

MOLEKULAacuteRNE METOacuteDY AKTUAacuteLNE POUŽIacuteVANEacute V KLINICKEJ GENETIKE RNDr Andrea Pastoraacutekovaacute PhD RNDr Robert Petrovič PhD Vydala Univerzita Komenskeacuteho v Bratislave Lekaacuterska fakulta Rozsah 50 straacuten 246 AH prveacute vydanie ISBN 978-80-223-4231-5

5

DNA mocircže obsahovať fenolchloroform ktoreacute inhibujuacute enzymatickeacute reakcie a taacuteto metoacuteda nie je vhodnaacute ani na izolaacuteciu v automatoch 4) Centrifugaacutecia v gradiente chloridu ceacutezneho (CsCl) umožňuje ziacuteskať genoacutemovuacute DNA vysokej kvality avšak taacuteto metoacuteda je časovo naacuteročnaacute praacutecna drahaacute (potrebnaacute ultracentrifuacutega) a nepoužiteľnaacute v automatoch nie je rutinne využiacutevanaacute Bunkovyacute lyzaacutet je precipitovanyacute alkoholom DNA roztok je zmiešanyacute s CsCl a etiacutediumbromidom nasleduje niekoľkohodinovaacute centrifugaacutecia v ultracentrifuacutege DNA je viditeľnaacute v podobe pruacutežku po jej odobratiacute sa extrahuje izopropanolom aby došlo k odstraacuteneniu etiacutediumbromidu a precipituje sa etanolom 5) Minikoloacutenovaacute (koloacutenkovaacute) purifikaacutecia využiacuteva schopnosť materiaacutelu v minikoloacutene (matrix matrica) adsorbovať DNA za určityacutech konkreacutetnych podmienok pH a koncentraacutecie soli (obr 1) Existujuacute viacereacute typy materiaacutelov viažucich DNA ktoreacute suacute na uacutečely izolaacutecie DNA umiestneneacute v minikoloacutene hydrofilneacute matrice viažuce vodiacutek v priacutetomnosti chaotropnyacutech činidiel matrice využiacutevajuacutece vyacutemenu ioacutenov (ioacutenomeničoveacute) matrice s určitou afinitou a veľkostnou selekciou

Vaumlčšina minikoloacutenovyacutech metoacuted maacute podobnyacute postup na začiatku prebehne lyacuteza buniek potom nasleduje DNA adsorbcia na matricu centrifugovateľnyacutech minikoloacuten premytie nukleovej kyseliny adsorbovanej na matricu v minikoloacutene čiacutem docircjde k zbaveniu sa kontaminantov a finaacutelna eluacutecia (uvoľnenie) DNA

Kremičitanoveacute (SiO2 Silika) matrice majuacute vynikajuacutecu schopnosť viazať DNA pretože suacute kladne nabiteacute a majuacute vysokuacute afinitu k negatiacutevne nabitej DNA V prostrediacute vysokej koncentraacutecie chaotropnyacutech soliacute docircjde k adsorpcii DNA na kremičitanovuacute matricu (silica geacutel) zatiaľ čo bunkoveacute proteiacuteny a ineacute metabolity zostanuacute v roztoku a naacutesledne suacute vymyteacute z koloacuteny DNA vhodnaacute na diagnostickeacute použitie je ziacuteskanaacute eluacuteciou zo silika matrice použitiacutem pufra s niacutezkou koncentraacuteciou soliacute (TE destilovanaacute voda) Existuje množstvo komerčne priacutestupnyacutech kitov (suacuteprav) ktoreacute obsahujuacute všetky potrebneacute chemikaacutelie a minikoloacuteny Izolaacutecia DNA prostredniacutectvom kitu založenom na silika materiaacuteli trvaacute od 40-60minuacutet pričom sa ziacuteska vysokokvalitnaacute DNA vo vysokom vyacuteťažku Dnes suacute k dispoziacutecii kity vhodneacute na poloautomatizovanuacute alebo plnoautomatizovanuacute izolaacuteciu DNA (obr 3)

Ďalšou možnosťou je použiť DNA izolačnyacute kit využiacutevajuacuteci magnetickeacute guľocircčky ktoreacute suacute pokryteacute materiaacutelom viažucim DNA (polymeacutery silika hydroxyapatit) DNA sa naviaže na magnetickeacute guľocircčky a prostredniacutectvom magnetickej sily magnetu je možneacute premyacutevať naviazanuacute DNA V tomto priacutepade nie je potrebneacute použiť centrifugaacuteciu

Obr 1 Minikoloacutena a postup izolaacutecie DNA

12 Izolaacutecia RNA

Ziacuteskanie RNA vysokej kvality je prvyacutem a často najkritickejšiacutem krokom pre molekulaacuterne techniky typu kvantifikaacutecie expresie určiteacuteho geacutenu metoacutedou real-time PCR (RT-qPCR) analyacutezy transkriptoacutemu sekvenovanovaniacutem ďalšej generaacutecie (NGS) analyacutezy RNA profilu mikročipmi northern analyacutezy a konštrukcie cDNA knižnice Pre dosiahnutie čo najcitlivejšiacutech a biologicky

6

najrelevantnejšiacutech vyacutesledkov je potrebneacute dodržať pracovneacute postupy pred počas a po RNA purifikaacutecii Pre optimalizaacuteciu RNA izolaacutecie a analyacutezy suacute docircležiteacute nasledovneacute kroky 1) manipulaacutecia so vzorkami určenyacutemi na RNA izolaacuteciu 2) vyacuteber metoacutedy izolaacutecie RNA 3) uskladnenie RNA

Klasickaacute izolaacutecia RNA prebieha vaumlčšinou v priacutetomnosti inhibiacutetorov ribonukleaacutez Ribonukleaacutezy (RNaacutezy) suacute bunkoveacute enzyacutemy degradujuacutece RNA Inhibiacutetory RNaacutez suacute silneacute denaturanty ktoreacute vo vzorke znižujuacute riziko RNA degradaacutecie (napr guanidiacutenoveacute soli dodecylsufaacutet sodnyacute - SDS chemikaacutelie obsahujuacutece fenol)

Pred vlastnou izolaacuteciou RNA je potrebneacute sterilizovať všetok materiaacutel (skuacutemavky špičky pipety vodu laboratoacuterny priestor) (obr 2) ktoryacute bude v kontakte so vzorkou určenou na izolaacuteciu RNA Kyacutem sa vzorka začne spracovaacutevať udržiava sa v tekutom dusiacuteku na suchom ľade alebo je vloženaacute do špeciaacutelnych stabilizačnyacutech roztokov (napr RNAlaterreg) alebo špeciaacutelnych skuacutemaviek so stabilizačnyacutem roztokom napr PAXgenereg Blood RNA Tube

Existuje niekoľko spocircsobov izolaacutecie RNA

1) Organickaacute extrakčnaacute metoacuteda je zlatyacutem štandardom izolaacutecie RNA Na začiatku izolaacutecie sa vzorka homogenizuje v roztoku obsahujuacutecom fenol (TRIzolreg RNAzolreg RT) naacutesledne sa centrifuguje Počas centrifugaacutecie dochaacutedza vo vzorke k separaacutecii troch vrstiev spodnej organickej faacutezy strednej faacutezy obsahujuacutecej denaturovaneacute proteiacuteny a genoacutemovuacute DNA a vrchnej vodnej faacutezy s RNA Po odobratiacute vrchnej faacutezy sa RNA z nej precipituje (vyzraacuteža) alkoholom a naacutesledne sa rehydratuje 2) Minikoloacutenovaacute metoacuteda (filtračnaacute) využiacuteva membraacuteny (zo sklenyacutech vlaacutekien silika alebo ioacutenomeničoveacute membraacuteny) vloženeacute do minikoloacuten Vzorka je lyzovanaacute v pufri obsahujuacutecom RNaacutezoveacute inhibiacutetory nukleoveacute kyseliny sa naviažu na membraacutenu keď lyzaacutet prechaacutedza membraacutenou počas centrifugaacutecie Membraacutena s naviazanou RNA je viackraacutet premyacutevanaacute RNA sa ziacuteska centrifugaacuteciou do novej skuacutemavky po eluacutecii vhodnyacutem elučnyacutem roztokom 3) Metoacuteda využiacutevajuacuteca magnetickeacute partikuly obsahujuacutece paramagnetickeacute vnuacutetro obklopeneacute obalom modifikovanyacutem tak aby viazal žiaduci objekt teda RNA Vzorka lyzovanaacute v roztoku obsahujuacutecom RNaacutezoveacute inhibiacutetory sa zmieša s magnetickyacutemi partikulami kedy docircjde k naviazaniu RNA na povrch magnetickyacutech partikuacutel Opakovanyacutem použitiacutem externeacuteho magnetickeacuteho poľa je možneacute vychytať magnetickeacute partikuly s naviazanou nukleovou kyselinou odstraacuteneniacutem magnetickeacuteho poľa zase uvoľniť a resupendovať v premyacutevaciacutech roztokoch Na zaacutever sa RNA uvoľniacute do elučneacuteho roztoku a magnetickeacute partikuly sa odstraacutenia 4) Priama lyacuteza sa použiacuteva na priacutepravu vzorky použitiacutem lyzačnyacutech roztokov ktoreacute lyzujuacute vzorku stabilizujuacute nukleoveacute kyseliny a takto pripravenaacute RNA mocircže byť použitaacute na ďalšie analyacutezy Priama lyacuteza teda nie je purifikačnaacute metoacuteda v pravom zmysle slova

Ziacuteskanuacute RNA je potrebneacute kvantifikova ť Ide o docircležityacute a nevyhnutnyacute krok ktoryacute predchaacutedza RNA analyacutezu Existujuacute viacereacute možnosti kvantifikaacutecie nukleovyacutech kyseliacuten ktoryacutem je venovanaacute samostatnaacute časť

Skladovanie RNA - RNA musiacute byť resuspendovanaacute resp eluovanaacute v roztoku bez RNaacutez na tento uacutečel suacute komerčne dostupneacute viacereacute roztoky na skladovanie RNA zabezpečujuacutece maximaacutelnu ochranu pred RNaacutezami RNA sa odporuacuteča skladovať pri teplote ndash 80degC v alikvoacutetoch (rozpipetovanaacute v menšiacutech množstvaacutech v mikroskuacutemavkaacutech) určenyacutech na jedno použitie

7

Obr 2 Laminaacuterny box na izolaacuteciu nukleovyacutech kyseliacuten praacutecu s DNA RNA atď Obr 3 Automatickyacute pipetovaciacute robot napr na izolaacuteciu 96 vzoriek DNA

8

2 Stanovenie kvantity a kvality nukleovyacutech kyseliacuten

Docircležiteacute je určenie koncentraacutecie a čistoty izolovanej DNA a RNA pretože analyacutezy ktoreacute nasledujuacute po izolaacutecii nukleovyacutech kyseliacuten často vyžadujuacute presneacute množstvo a čistotu nukleovyacutech kyseliacuten (NK bez priacutemesiacute) Metoacuted kvantifikaacutecie NK je niekoľko najpoužiacutevanejšie suacute spektrofotometrickaacute kvantifikaacutecia a kvantifikaacutecia UV fluorescenciou za priacutetomnosti farbičky

21 Spektrofotometrickaacute kvantifikaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten

Nukleoveacute kyseliny špecificky absorbujuacute ultrafialoveacute svetlo Vzorka s NK je v spektrofotometri (obr 6) vystavenaacute ultrafialoveacutemu svetlu o vlnovej dĺžke 260nm fotodetektor naacutesledne zmeria svetlo ktoreacute prejde vzorkou čiacutem viac svetla vzorka pohltiacute (absorbuje) tyacutem je vyššia koncentraacutecia nukleovej kyseliny vo vzorke Vyacutepočet koncentraacutecie NK zaacutevisiacute od toho či ide o DNA alebo RNA či je jednovlaacuteknovaacute alebo dvojvlaacuteknovaacute dsDNA c = A260002 [microgml] ssDNA c = A2600027 [microgml] RNA c = A2600025 [microgml]

Teda ak absorbancia dsDNA je 1 koncentraacutecia DNA vo vzorke je 50 microgml (pozn v priacutepade ak je draacuteha luacuteča 1cm)

Pokiaľ poznaacuteme sekvenciu napr pri synteacuteze primeru (ssDNA) mocircžeme z nej vypočiacutetať molekulovuacute hmotnosť a určiť priamo molaacuternu koncentraacuteciu nukleovej kyseliny (pmolmicrol) c = A260 lowast (100[15A + 071lowastC + 12lowastG + 084lowastT]) [pmolmicrol] A je počet adeniacutenov (v skutočnosti dATP) C je počet cytoziacutenov (dCTP) G je počet guaniacutenov (dGTP) a T počet tymiacutenov (dTTP)

Predpokladom pre spraacutevne určenie koncentraacutecie na zaacuteklade absorbancie je samozrejme čistota nukleovej kyseliny vo vzorke Čistota NK sa určuje podľa absorbčnej krivky popriacutepade zjednodušene na zaacuteklade pomeru absorbanciiacute pri 260 a 280 nm pretože proteiacuteny absorbujuacute svetlo vlnovej dĺžky 280nm Čistaacute DNA maacute pomer absorbanciiacute 260280 (A260280) pohybujuacutece sa okolo 18 čistaacute RNA maacute pomer absorbancii A260280 približne 2

Vzorku nukleovyacutech kyseliacuten mocircžu okrem proteiacutenov kontaminovať aj ďalšie laacutetky ako je fenol ktoryacute sa často využiacuteva pri izolaacutecii NK Takto izolovaneacute vzorky nukleovyacutech kyseliacuten nekontaminovaneacute fenolom by mali mať A260280 okolo 2 Ďalšie kontaminanty sa zisťujuacute absorbciou svetla pri 230 nm a 330 nm

22 Kvantifikaacutecia s použitiacutem fluorescenčnyacutech farbiacutev

Ďalšou možnosťou ako zmerať koncentraacuteciu nukleovyacutech kyseliacuten je zmeranie fluorescencie farbiva (napr etidiumbromid) ktoreacute sa viaže na nukleovuacute kyselinu a selektiacutevne svieti v priacutepade že je naviazaneacute na NK Metoacuteda využitia fluorescenčneacuteho farbiva naviazaneacuteho na NK sa použiacuteva v priacutepade ak je koncentraacutecia NK priacuteliš niacutezka na kvantifikaacuteciu spektrofotometrom ako aj v priacutepade že je NK kontaminovanaacute laacutetkou (kontaminantom) absorbujuacutecim svetlo vlnovej dĺžky 260nm 221 Využitie migraacutecie nukleovej kyseliny v geacuteli s jej naacuteslednou fluorescenčnou detekciou

Ak predpokladaacuteme niacutezku koncentraacuteciu NK na jej zistenie použijeme elektroforetickuacute

migraacuteciu NK v geacuteli (mocircže sa použiť agaroacutezovyacute alebo polyakrylamidovyacute geacutel) fluorescenčneacute farbivo je buď primiešaneacute do vzorky NK alebo priamo do geacutelu Spolu so vzorkou NK neznaacutemej koncentraacutecie migruje v geacuteli vo vedľajšej draacutehe vzorka NK so znaacutemou koncentraacuteciou Na zaacuteklade porovnania fluorescencie (po vystaveniacute geacutelu s NK svetlu o konkreacutetnej vlnovej dĺžke) vzorky so znaacutemou

9

koncentraacuteciu a vzorky neznaacutemej koncentraacutecie sa urobiacute odhad resp sa vyacutesledok kalkuluje počiacutetačovyacutem softveacuterom denzitometricky (obr 4)

222 Využitie kvantifikaacutecie množstva nukleovyacutech kyseliacuten použitiacutem real-time PCR metoacutedy

V priacutepade veľmi maleacuteho množstva NK ktoreacute nie je možneacute kvantifikovať ani geacutelovou elektroforeacutezou resp potrebujeme zistiť koncentraacuteciu NK veľmi presne u maleacuteho množstva NK (napr pre kriminalistiku) použije sa metoacuteda absoluacutetnej kvantifikaacutecie prostredniacutectvom real-time PCR (kvantifika čnej PCR qPCR) Princiacutep metoacutedy spočiacuteva v porovnaniacute amplifikaacutecie určiteacuteho uacuteseku nukleovej kyseliny vo vzorke neznaacutemej koncentraacutecii s amplifikaacuteciou tej istej sekvencie vo vzorke presne definovanej koncentraacutecie (obr 5) qPCR je možneacute kvantifikovať koncentraacuteciu raacutedovo v pgul 223 Kvantifikaacutecia fluorospektrofotometrom (fluori metrom)

Ak maacuteme dostatočneacute množstvo vzorky je možneacute na kvantifikaacuteciu použiť fluorospektrofotometer v tomto priacutepade je vzorka zmiešanaacute s fluorescenčnyacutem farbivom a je meranaacute emitovanaacute fluorescencia z ktorej sa vypočiacuteta koncentraacutecia

Moderneacute spektrofotometre a fluorimetre suacute konštruovaneacute tak aby na meranie bolo použiteacute minimaacutelne množstvo vzorky NK (napr pre priacutestroje NanoDrop je potrebnyacute len 05-1 microl vzorky) Pre porovnanie NanoDrop spektrofotometer (NanoDrop 2000c) je schopnyacute zmerať koncentraacutecie od 04 to 15 000 ngmicroL dsDNA NanoDrop fluorospektrometer 005 do 2000 pgmicroL Spektrofotometre a fluorofotometre suacute po meraniacute schopneacute vďaka softveacuteroveacutemu vybaveniu vypočiacutetať nielen koncentraacuteciu ale aj čistotu vzorky (httpwwwnanodropcom) Obr 4 Kvantifikaacutecia nukleovej kyseliny porovnaniacutem s fragmentom podobnej dĺžky a znaacutemej koncentraacutecie (po migraacutecii v agaroacutezovom geacuteli v jednosmernom elektrickom pruacutede a naacuteslednej fluorescenčnej detekcii) - odhad DNA v 3 draacutehe cca 100ng porovnaniacutem s 1000bp fragmentom štandardu molekulovyacutech hmotnostiacute (šmh)

10

Obr 5 Absoluacutetna kvantifikaacutecia DNA priacutestrojom real-time PCR cykleacuterom porovnaniacutem amplifikaacutecie uacuteseku DNA v skuacutemanej vzorke s amplifikaacuteciou vzorky so znaacutemou kvantitou Okrem amplifikaacutecie skuacutemanej vzorky je treba urobiť štandardnuacute krivku amplifikaacutecie vzorky znaacutemej koncentraacutecie z ktorej sa koncentraacutecia skuacutemanej vzorky odčiacuteta V kriminalistike sa bežne použiacuteva pridanie vnuacutetornej kontroly ku vzorke na určenie čistoty vzorky (v priacutetomnosti inhibiacutetorov nedocircjde k amplifikaacutecii žiadnej DNA) Vnuacutetornaacute kontrola je už priacutetomnaacute v kite čiže sa automaticky pridaacuteva pri priacuteprave vzoriek na qPCR amplifikaacuteciu sluacuteži na zistenie priacutetomnosti inhibiacutetorov v skuacutemanej vzorke teda v priacutepade že nedocircjde k amplifikaacutecii vo vzorke sluacuteži na rozliacutešenie či je koncentraacutecia DNA priacuteliš niacutezka alebo suacute vo vzorke priacutetomneacute inhibiacutetory Bežnaacute mediciacutenska molekulaacuterno-genetickaacute diagnostika nevyžaduje priacutetomnosť vnuacutetornej kontroly keďže nukleoveacute kyseliny suacute prevažne izolovaneacute kitmi z krvi čiže je zabezpečenaacute vysokaacute kvalita a čistota naizolovanej NK Obr 6 Spektrofotometer (NanoPhotometer) a ukaacutežka vyacutesledkou merania koncentraacutecie RNA izolovanej minikolonovou metoacutedou

11

3 PCR (polymeraacutezovaacute reťazovaacute reakcia)

Je metoacuteda vyvinutaacute v roku 1983 Karym Mullisom ocenenaacute v roku 1993 Nobelovou cenou za cheacutemiu Polymeraacutezovaacute reťazovaacute reakcia je založenaacute na schopnosti DNA polymeraacutezy syntetizovať noveacute vlaacutekno DNA podľa templaacutetoveacuteho vlaacutekna na zaacuteklade princiacutepu komplementarity DNA polymeraacuteza je schopnaacute pripaacutejať nukleotidy len k voľnej 3acuteOH skupine preto potrebuje primer (čiacutetaj prajmer) ku ktoreacutemu je schopnaacute pridaacutevať nukleotidy Primery suacute kraacutetke jednovlaacuteknoveacute oligonukleotidy ktoreacute umožňujuacute jednak DNA polymeraacuteze začať so synteacutezou noveacuteho vlaacutekna na druhej strane ohraničujuacute špecifickuacute oblasť ktoruacute chceme amplifikovať (namnožiť) Vyacutesledkom PCR reakcie je obrovskyacute počet koacutepii špecifickej sekvencie (obr 7) PCR v podstate napodobňuje replikaacuteciu DNA v in vitro podmienkach s rozdielom že nedochaacutedza k replikaacutecii celej DNA ale len vybraneacuteho primermi ohraničeneacuteho miesta

31 Najdocircležitejšie PCR komponenty

Templaacutetovaacute DNA je vzorka DNA obsahujuacuteca cieľovuacute sekvenciu Na začiatku reakcie docircjde pri vysokej teplote k denaturaacutecii a separaacutecii jednotlivyacutech vlaacutekien dvojvlaacuteknovej DNA

Enzyacutem DNA polymeraacuteza syntetizuje noveacute DNA vlaacutekno komplementaacuterne k cieľovej sekvencii Najčastejšie použiacutevanou a prvou DNA polymeraacutezou je Taq DNA polymeraacuteza (z termofilnej bakteacuterie Thermus aquaticus) zatiaľ čo Pfu DNA polymeraacuteza (z Pyrococcus furiosus) je preferovanaacute kvocircli tzv vysokej fidelite čo je schopnosť inkorporovať spraacutevnu baacutezu do novosyntetizovaneacuteho vlaacutekna DNA DNA polymeraacutezy musia mať dve vlastnosti schopnosť syntetizovať noveacute vlaacutekno DNA podľa templaacutetovej DNA a byť termostabilneacute čiže rezistentneacute na vysokeacute teploty (cca 100degC) V suacutečasnosti sa v laboratoacuteriaacutech často použiacutevajuacute rekombinantneacute polymeraacutezy s požadovanyacutemi vlastnosťami Napriacuteklad pre PCR ktorej produkt bude klonovanyacute je docircležiteacute použiť polymeraacutezu ktoraacute je schopnaacute opraviť vlastnuacute chybu v priacutepade inkorporaacutecie nespraacutevnej baacutezy pri synteacuteze noveacuteho reťazca Schopnosť opravovať nespraacutevne inkorporovaneacute baacutezy počas synteacutezy noveacuteho vlaacutekna DNA sa nazyacuteva tzv proofreading aktivita ktoraacute je zabezpečenaacute 3rarr5acute exonukleaacutezovou aktivitou takejto polymeraacutezy Pred vlastnou molekulaacuterno-genetickou diagnostikou je treba optimalizovať podmienky PCR reakcie pre konkreacutetnu DNA polymeraacutezu a pre špecifickeacute primery treba zistiť optimaacutelnu teplotu annealingu (hybridizaacutecie) primerov koncentraacutecie jednotlivyacutech zložiek PCR reakcie (napr MgCl2)

Primery suacute kraacutetke jednovlaacuteknoveacute DNA sekvencie komplementaacuterne k cieľovej sekvencii DNA polymeraacuteza začiacutena syntetizovať noveacute vlaacutekno z 3acutekonca primeru Docircležitou charakteristikou primerov je teplota topenia (Tm) t j teplota pri ktorej polovica DNA duplexov je disociovanaacute na jednovlaacuteknoveacute molekuly

Nukleotidy (dNTP deoxyribonukleotidtrifosfaacutety) suacute stavebneacute prvky pre novosyntetizovanuacute DNA molekulu

Veľmi praktickyacutem riešeniacutem pre molekulaacuterno-genetickeacute diagnostickeacute laboratoacuteria je tzv mastermix to je roztok v ktorom už je priacutetomneacute všetko potrebneacute pre priebeh PCR reakcie samozrejme okrem primerov a templaacutetovej DNA sekvencie PCR Master Mix (2X) od firmy ThermoFisher Scientific je jednyacutem z takyacutechto mixov obsahuje Taq DNA polymeraacutezu tlmivyacute roztok (pufor) MgCl2 a všetky deoxyribonukleotidy trifosfaacutety

Tabuľka č 1 uvaacutedza ako sa PCR reakcia z mastermixu pripravuje pre jednu vzorku Keďže v laboratoacuteriu sa zriedka robiacute PCR reakcia s jednou vzorkou treba si pripraviť tzv premix (tj PCR reakcie pre vaumlčšiacute počet vzoriek ale bez templaacutetovej DNA) ktoryacute sa rozdeliacute do mikroskuacutemaviek a až potom sa k nim pridaacute DNA resp cDNA

12

Tab 1 Priacuteprava PCR premixu

Celkovyacute objem jednej PCR reakcie 10 microl Počet vzoriek 8 2x PCR master mix 5 40

primer sense (10microM) 05 4

primer antisense (10microM) 05 4

H2O 35 28

DNA cDNA 05

rozpipetovať premix po 95microl do mikroskuacutemaviek až potom pridať do každej mikroskuacutemavky zvlaacutešť DNA cDNA

spolu objem 10 76

PCR amplif ikaacutecia je cyklickyacute proces pozostaacutevajuacuteci z troch krokov (obr 7) 1) denaturaacutecia dvojvlaacuteknovej DNA pri vysokej teplote (95degC) 2) hybridizaacutecia (annealing) primerov k špecifickej sekvencii DNA pri teplote vhodnej pre konkreacutetne primery 3) polymerizaacutecia (synteacuteza) novyacutech vlaacutekien DNA (72degC)

Obr 7 Princiacutep PCR

Tieto tri kroky sa opakujuacute 25 ndash 40 kraacutet pričom pri každom cykle sa počet molekuacutel zdvojnaacutesobiacute (vyacuteslednyacute počet cieľovej sekvencie je 2n+1 ak na začiatku bola jedna dvojvlaacuteknovaacute DNA a počet cyklov je n) PCR prebieha v termaacutelnom cykleacuteri (teplotnom cyklovači) je to priacutestroj (obr 8) kde je možneacute vykonať a naprogramovať celyacute termaacutelny priebeh PCR reakcie Tabuľka č 2 je priacutekladom termaacutelneho programu pre konkreacutetnu PCR reakciu

Po PCR reakcii je vyacuteslednyacute produkt možneacute vizualizovať elektroforeticky resp použiť na ďalšiu analyacutezu

13

Tab 2 Priacuteklad klasickeacuteho teplotneacuteho a časoveacuteho profilu PCR PCR Teplota Čas Opakovanie

95degC 2 minuacutety

95degC 15 sekuacutend

66degC 60 sekuacutend 30x

72degC 60 sekuacutend

72degC 5 minuacutet

Obr 8 Termaacutelny cykleacuter v procese a otvorenyacute s mikroskuacutemavkami

32 Variaacutecie PCR

Hot-start PCR využiacuteva DNA polymeraacutezu ktoruacute je treba aktivovať vysokou teplotou (napr 95degC 10 minuacutet) Vyacutehodou použiacutevania hot-start polymeraacutez je možnosť pracovať pri laboratoacuternej teplote keďže polymeraacuteza je pri bežnej teplote neaktiacutevna a tyacutem nemocircže docircjsť k vzniku nešpecifickyacutech produktov

Touchdown PCR maacute v počiatočnyacutech cykloch vyššiu teplotu annealingu (uacutečelom je zvyacutešiť

špecificitu PCR produktov na začiatku PCR) neskocircr sa teplota annealingu zniacuteži čo maacute za naacutesledok vyššiacute vyacuteťažok PCR produktu

Nested PCR maacute dva kroky a potrebuje dva paacutery primerov V prvom kroku sa prostredniacutectvom

prvej sady primerov amplifikuje dlhšiacute DNA fragment Ten sa použije ako templaacutet v druhom kroku s druhou sadou primerov s vyacuteslednyacutem kratšiacutem DNA produktom Nested PCR zvyšuje špecifickosť a citlivosť diagnostickyacutech PCR

Multiplex PCR je vlastne viac PCR reakciiacute prebiehajuacutecich v jednej skuacutemavke suacutečasne

V reakčnej zmesi je viac paacuterov primerov suacutečasne prebehne amplifikaacutecia viaceryacutech uacutesekov DNA takto dochaacutedza k šetreniu vzorky reakčnej zmesi a pracovneacuteho času

14

Real-time PCR je venovanaacute špeciaacutelna časť v skriptaacutech Sluacuteži na kvantifikaacuteciu PCR produktu v reaacutelnom čase na zaacuteklade merania fluorescencie okrem kvantifikaacutecie je využiacutevanaacute aj na určenie genotypov

RT-PCR je variaacutecia PCR umožňujuacuteca amplifikaacuteciu DNA sekvencie z vyacutechodiskovej RNA

sekvencie Najskocircr musiacute prebehnuacuteť prepis RNA do jednovlaacuteknovej cDNA prostredniacutectvom reverznej transkriptaacutezy naacutesledne sa cDNA použije pre PCR Selektiacutevnym použitiacutem primerov pri reverznej transkripcii mocircžeme uacutečelovo prepiacutesať buď celkovuacute RNA (primery - random hexameacutery) alebo len mRNA (primery - oligoT)

Alelovo-špecifickaacute PCR (AS-PCR) (obr 9) sluacuteži na detekciu konkreacutetnych mutaacuteciiacute

a jednonukleotidovyacutech polymorfizmov (SNP) Použije sa sada 3 primerov v dvoch kombinaacuteciaacutech PCR reakciiacute dva primery majuacute odlišnuacute sekvenciu na 3acute-koncoch jeden na detekciu wt (wild type) a druhyacute primer na detekciu mutantnej alely reakcia neprebehne ak miesto na templaacutetovej DNA nie je komplementaacuterne k 3acute-koncu primeru pretože DNA polymeraacuteza vyžaduje uacuteplnuacute hybridizaacuteciu primera na 3acute-konci Takto je možneacute rozliacutešiť priacutetomnosť štandardnej (wildtype ndash wt) a mutantnej alely resp SNP (obr 9) AS-PCR je znaacutema aj pod ďalšiacutemi naacutezvami ASO-PCR (allele-specific oligonucleotide PCR) ARMS (amplification-refractory mutation system)

Obr 9 Alelovo-špecifickaacute PCR (AS-PCR)

Mutageneacuteza prostredniacutectvom PCR (site directed mutagenesis) sa použiacuteva keď je potrebneacute vytvoriť mutaacuteciu v špecifickom mieste geacutenu primerprimery majuacute modifikovanuacute sekvenciu tak že obsahujuacute mutaacuteciu v strednej časti čo neovplyvniacute hybridizaacuteciu primerov s templaacutetovou DNA pričom vyacutesledkom je PCR produkt s cielene mutovanou DNA sekvenciou

Asymetrickaacute PCR sa použiacuteva na synteacutezu koacutepiiacute jedneacuteho vlaacutekna z templaacutetovej DNA a to

použitiacutem veľmi niacutezkej koncentraacutecie jedneacuteho primeru Sekvenačnaacute PCR je PCR v ktorej je použityacute len jeden primer a v reakčnej zmesi suacute okrem

všetkyacutech dNTP priacutetomneacute dideoxynukleotidtrifosfaacutety (ddNTP) značeneacute raacutedioaktiacutevne dnes však prevažne fluorescenčne každyacute typ ddNTP inou fluorescenčnou farbičkou Zaradenie niektoreacuteho zo štyroch ddNTP spocircsobiacute terminaacuteciu (zastavenie) predlžovania DNA reťazca fluorescenčneacute označenie ddNTP umožniacute detekciu dĺžky fragmentu a určenie sekvencie posledneacuteho nukleotidu Vyacuteslednyacute produkt sekvenačnej PCR sluacuteži na sekvenovanie Sekvenovaniu sa venuje samostatnaacute časť

MLPA (multiplex ligation-dependent probe amplification) ndash multiplexnaacute amplifikaacutecia proacuteb zaacutevislaacute od ligaacutecie je variaacutecia multiplexnej PCR umožňujuacuteca namnoženie viaceryacutech uacutesekov DNA za použitia iba jedneacuteho paacuteru primerov avšak s podmienkou vytvorenia sekvenčne špecifickej proacuteby ligaacuteciou sekvenčne špecifickyacutech oligonukleotidov MLPA je metoacuteda umožňujuacuteca detekciu počtu koacutepiiacute

15

až 50 nukleotidovyacutech sekvenciiacute v jednej reakcii Pomocou MLPA je možneacute ryacutechlo identifikovať amplifikaacutecie a deleacutecie veľkeacuteho počtu geacutenov či už z DNA alebo mRNA okrem toho MLPA mocircže byť použitaacute na analyacutezu CpG-metylaacutecie (MS-MLPA) Viac informaacutecii v samostatnej časti

SNaPshotreg Multiplex nazyacutevaneacute aj minisekvenovanie je multiplexnaacute reakcia v ktorej je každyacute primer predĺženyacute iba o jeden nukleotid (obr 10) V reakčnej zmesi nie suacute priacutetomneacute deoxyribonukleotidtrifosfaacutety ale len dideoxyribonukleotidtrifosfaacutety (ddATP ddCTP ddGTP ddTTP) každyacute označenyacute inou fluorescenčnou farbičkou Po integraacutecii ddNTP do DNA vlaacutekna je polymerizaacutecia ukončenaacute Jednovlaacuteknoveacute fragmenty (primery) predĺženeacute presne o jeden ddNTP suacute separovaneacute kapilaacuternou elektroforeacutezou v genetickom analyzaacutetore pričom je detegovanaacute ich fluorescencia a dĺžka (obr 11) Z vyacutesledneacuteho elektroforetogramu (obr 12) je možneacute určiť v jednej reakcii sekvenciu vo viac ako v 10 lokalitaacutech určiteacuteho fragmentu DNA SNaPshot Multiplex sa v molekulaacuterno-genetickom laboratoacuteriu využiacuteva na ryacutechlu detekciu viaceryacutech najčastejšie sa vyskytujuacutecich mutaacuteciiSNP geacutenu

Obr 10 Priacuteklad využitia metoacutedy SnaPshot s použitiacutem sady 13 primerov ktoreacute sa predĺžia len o 1 značenyacute dideoxynukleotid SNaPshot najčastejšiacutech mutaacuteciiacute geacutenu pre 21-hydroxylaacutezu (CYP21A2) ktoreacute spocircsobujuacute kongenitaacutelnu adrenaacutelnu hyperplaacuteziu A T G a C predstavujuacute fluorescenčne značeneacute dideoxynukleotidy

Obr 11 Vyacutesledok analyacutezy DNA pacienta metoacutedou minisekvenovania SnaPshot konkreacutetne použitiacutem sady 13 primerov rozlišujuacutecich najčastejšie bodoveacute mutaacutecie geacutenu pre 21-hydroxylaacutezu (CYP21A2) analyacutezou sa zistila mutaacutecia V281L v heterozygotnom stave (dva fragmenty modryacute a červenyacute)

16

Obr 12 SNaPshot analyacuteza geacutenu CYP21A2 u DNA izolovanej z plodovej vody metoacuteda deteguje najčastejšie bodoveacute mutaacutecie geacutenu pre 21-hydroxylaacutezu vyacutesledok prenataacutelnej analyacutezy = priacutetomnosť mutaacutecie In2G v hemizygotnom stave (keďže qPCR metoacutedou bola u plodu zistenaacute priacutetomnosť len jednej koacutepie geacutenu CYP21A2)

33 Kvantitatiacutevna PCR (qPCR)

Polymeraacutezovou reťazovou reakciou (PCR) docielime namnoženie (amplifikaacuteciu) určiteacuteho DNA uacuteseku (templaacutetu) PCR je katalyzovanaacute DNA polymeraacutezou za priacutetomnosti primerov dNTPs dvojmocnyacutech katioacutenov (ako Mg+2) a pufrovacieho roztoku

Real-time PCR ktoraacute je nazyacutevanaacute aj kvantitatiacutevna PCR (qPCR) umožňuje vizualizaacuteciu a kvantifikaacuteciu amplifikaacutecie DNA v reaacutelnom čase to je tak ako to bežiacute počas PCR qPCR využiacuteva fluorescenčneacute chemikaacutelie (farbivaacute) ktoryacutech emitovanuacute fluorescenciu zaznamenaacuteva optickyacute systeacutem počas každeacuteho PCR cyklu zaznamenanaacute fluorescencia je naacutesledne softveacuterovo spracovanaacute a vyhodnotenaacute

V suacutečasnosti sa využiacutevajuacute dva typy qPCR cheacutemie a to farbivaacute viažuce sa na DNA a fluorescenčne značeneacute proacuteby (obr 13)

Farbivaacute viažuce sa na DNA emitujuacute fluorescenciu v priacutepade ak suacute naviazaneacute na dvojvlaacuteknovuacute DNA proacuteby fluoreskujuacute v priacutepade keď molekula zhaacutešača (angl quencher - Q) sa nenachaacutedza v bliacutezkosti molekuly reporteacutera (R) napr hydrolyzujuacutece proacuteby fluoreskujuacute keď je molekula reporteacutera (R) prostredniacutectvom 5acuteexonukleaacutezovej aktivity DNA polymeraacutezy odstraacutenenaacute z bliacutezkosti molekuly zhaacutešača (Q)

Grafickyacute priebeh real ndash time PCR znaacutezorňuje amplifika čnaacute krivka (angl amplification plot) (obr 14) majuacuteca 4 faacutezy 1) Faacuteza I ndash dochaacutedza k zdvojnaacutesobeniu množstva amplikoacutenu po každom cykle ale naacuterast fluorescencie je pod detekčnyacutem limitom zaznamenaacutevanaacute fluorescencia (baseline) zodpovedaacute zaacutekladnej fluorescencii pozadia tzv šumu

17

2) Faacuteza II nazyacutevanaacute aj exponenciaacutelna faacuteza v ktorej sa fluorescencia zvyacuteši na uacuteroveň optickej detekcie bod resp cyklus kedy začiacutena exponenciaacutelna faacuteza je kľuacutečovyacute na určenie kvantity vstupneacuteho množstva templaacutetovej DNA nazyacuteva sa prahovyacute cyklus označuje sa Ct (angl treshold cycle) alebo Cq (quantification) Čiacutem nižšie je Ct (Cq) tyacutem vaumlčšiacute počet koacutepiiacute templaacutetovej DNA bolo v reakcii Ct hodnota je teda hlavnyacute uacutedaj s ktoryacutem sa pracuje vo vyacutepočtoch fluorescencia v tomto mieste sa nazyacuteva prahovaacute resp treshold 3) Faacuteza III - lineaacuterna faacuteza ndash charakterizuje ju postupneacute spotrebovaacutevanie komponentov reakcie na narastajuacutece množstvo amplikoacutenu 4) Faacuteza IV - plateau (čiacutetaj platoacute) ndash množstvo amplikoacutenu sa v docircsledku vyčerpania zložiek qPCR už nezvyšuje

Obr 13 Princiacutep real-time PCR Obr 14 Faacutezy real-time PCR

Ako štandardnaacute PCR aj qPCR maacute tri zaacutekladneacute kroky 1) Denaturaacutecia dvojvlaacuteknovej DNA na jednovlaacuteknovuacute DNA pri vysokej teplote (obyčajne 95degC) 2) Hybridizaacutecia primerov (annealing) ndash komplementaacuterne sekvencie sa spolu hybridizujuacute 3) Polymerizaacutecia pri 70-72degC kedy v docircsledku optimaacutelnej aktivity DNA polymeraacutezy dochaacutedza k predĺženiu primeru až o 100 baacutez za sekundu

18

Real-time PCR (obr 15) sa využiacuteva na kvantifikaacuteciu expresie geacutenov určenie počtu koacutepiiacute geacutenov určenie genotypu (genotypovanie) alelovou diskriminaacuteciou alebo analyacutezou krivky topenia tzv high resolution melt a multiplexnuacute real time PCR s možnosťou detekcie viaceryacutech cieľovgeacutenov

Multiplexnaacute real-time PCR sa využiacuteva na detekciu viaceryacutech cieľovgeacutenov v jednej reakcii suacutečasne Vyacutehodou multiplexovania je jednak uacutespora vzorky ako aj ziacuteskanie vaumlčšieho množstva informaacuteciiacute z rovnakeacuteho množstva materiaacutelu Nevyhnutnosťou multiplexnej qPCR suacute proacuteby značeneacute rocircznymi fluorescenčnyacutemi farbivami

Najdocircležitejšie zložky qPCR (real-time PCR komponenty) suacute DNA polymeraacuteza (reverznaacute transkriptaacuteza v priacutepade jednokrokovej kvantitatiacutevnej RT-PCT) dNTPs primery resp primeryproacuteby dvojmocneacute Mg templaacutet Na uľahčenie qPCR suacute v suacutečasnosti už komerčne dostupneacute takeacute reakčneacute zmesi ku ktoryacutem stačiacute pridať už len templaacutet (napr kity využiacutevajuacutece TaqManProacuteby) alebo kity s fluorescenčnyacutemi farbami viažucimi sa na dvojvlaacuteknovuacute DNA ku ktoryacutem sa do reakčnej zmesi okrem templaacutetu pridajuacute primery

Obr 15 Real-time PCR cykleacuter

331 Kvantifikaacutecia pomocou qPCR

Na kvantifikaacuteciu DNA pomocou qPCR sa požiacutevajuacute dve zaacutekladneacute metoacutedy - absoluacutetna kvantifikaacutecia a relatiacutevna kvantifikaacutecia

Absoluacutetna kvantifikaacutecia vychaacutedza zo štandardnej krivky (obr 16) ktoraacute sa ziacuteska po qPCR seacuterie riedeniacute DNA znaacutemej koncentraacutecie Kvantifikaacutecia neznaacutemej vzorky sa zistiacute interpolaacuteciou (odčiacutetaniacutem) Ct neznaacutemej vzorky zo štandardnej krivky (obr 16 17) Využiacutevaneacute napr v kriminalistike na stanovenie koncentraacutecie DNA vo vzorke

Relatiacutevna kvantifikaacutecia (obr 18 19) porovnaacuteva uacuteroveň expresie určiteacuteho geacutenu vo vzorke k expresii toho isteacuteho geacutenu v referenčnej (kontrolnej) vzorke alebo množstvo určiteacuteho geacutenu (počet koacutepiiacute) vo vzorke porovnaniacutem s množstvom geacutenu v kontrolnyacutech vzorkaacutech V raacutemci každej vzorky musiacute pred relatiacutevnou kvantifikaacuteciou docircjsť k tzv normalizaacutecii t j porovnanie expresie sledovaneacuteho geacutenu k expresii referenčneacuteho geacutenu (najčastejšie niacutem byacuteva tzv bdquohousekeepingldquo geacuten napr GAPDH aktiacuten tubuliacuten)

V priacutepade kvantifikaacutecie expresie určiteacuteho geacutenu metoacutedou real-time PCR (RT-qPCR) pred samotnou kvantifikaacuteciou cDNA musiacute byť taacuteto cDNA nasyntetizovanaacute prostredniacutectvom reverznej

19

transkripcie za použitia enzyacutemu reverznej transkriptaacutezy Kvantitatiacutevna PCR s reverznou transkripciou RT-qPCR mocircže byť dvojkrokovaacute alebo jednokrokovaacute Pri dvojkrokovej RT-qPCR treba pred qPCR syntetizovať cDNA vlaacutekno z RNA pomocou reverznej transkriptaacutezy - 1 krok druhyacutem krokom je samotnaacute real-time PCR Jednokrokovaacute RT-qPCR umožňuje uskutočniť obidve reakcie reverznuacute transkripciu a kvantitatiacutevnu PCR v jednej skuacutemavke čo zjednodušuje qPCR a redukuje možnosť kontaminaacutecie Obr 16 5-bodovaacute štandardnaacute krivka (amplifikaacutecia piatich koncentraacuteciiacute jednej vzorky konkreacutetne ide o 10-tkoveacute riedenie)

Obr 17 Ukaacutežka amplifikačnyacutech kriviek riedenia a z nich ziacuteskanej štandardnej krivky poukazuje na vysokuacute presnosť metoacutedy RT-PCR

20

Obr 18 Relatiacutevna kvantifikaacutecia - určenie počtu koacutepiiacute geacutenu CYP21A2 vo vzorke DNA izolovanej z perifeacuternej krvi pacientov mutaacutecie v geacutene CYP21A2 spocircsobujuacute kongenitaacutelnu adrenaacutelnu hyperplaacuteziu (CAH) Vyacutesledok analyacutezy všetci pacienti majuacute dve koacutepie geacutenu

Obr 19 Relatiacutevna kvantifikaacutecia - určenie počtu koacutepiiacute geacutenu CYP21A2 vo vzorke DNA izolovanej z plodovej vody mutaacutecie v geacutene CYP21A2 spocircsobujuacute kongenitaacutelnu adrenaacutelnu hyperplaacuteziu (CAH) Prenaacutetalnou diagnostikou (qPCR) sa zistila priacutetomnost jednej koacutepie CYP21A2 geacutenu 332 Určenie genotypu metoacutedou alelovej diskriminaacutecie a analyacutezou krivky topenia (HRM)

Určenie genotypu metoacutedou alelovej diskriminaacutecie (obr 20) sa uskutočňuje použitiacutem hydrolyzujuacutecich proacuteb (sond) je veľmi ryacutechla a senzitiacutevna (presnaacute) metoacuteda frekventovane využiacutevanaacute v laboratoacuteriaacutech Dva variantyalely suacute vyšetreneacute suacutečasne v jednej vzorke a v jednej reakčnej

21

skuacutemavke V reakcii suacute použiteacute dve proacuteby označeneacute rozdielnymi fluorescenčnyacutemi farbičkami emitujuacutecimi svetlo o rocircznej vlnovej dĺžke (najčastejšie jedna označenaacute FAM farbičkou a druhaacute proacuteba označenaacute VIC farbičkou) Počas amplifikaacutecie amplikoacutenu dochaacutedza k odstraacuteneniu zhaacutešača z bliacutezkosti farbičky ktoraacute potom emituje svetlo priacuteslušnej vlnovej dĺžky Vzorky so signaacutelom len jednej fluorescenčnej farbičky (FAM) a bez signaacutelu druhej farbičky (VIC) suacute homozygoti pre alelu 1 vzorky so signaacutelom len druhej farbičky (VIC) a bez signaacutelu prvej (FAM) suacute homozygoti pre alelu 2 v priacutepade ak vyšetrovanaacute vzorka bdquosvietildquo obidvoma farbami jednaacute sa o heterozygota

Obr 20 Určenie genotypu metoacutedou alelovej diskriminaacutecie ndash amplifikačnaacute krivka vzoriek DNA majuacutecich tri rocirczne genotypy A ndash jednotliveacute vzorky (plnaacute čiara predstavuje štandardnuacute alelu guličkovanaacute mutovanuacute alelu) B ndash 72 vzoriek C ndash scatter plot 72 vzoriek

Určenie genotypu analyacutezou krivky topenia tzv high resolution melt (HRM) (obr 21) umožňuje detekciu takmer všetkyacutech genetickyacutech variaacuteciiacute (SNP mutaacuteciiacute) Keďže taacuteto metoacuteda okrem štandardnyacutech podmienok reakcie vyžaduje len primery a farbičku (nie proacuteby) je veľmi jednoduchaacute a lacnejšia Po amplifikaacuteciiacute treba amplikoacuten pomaly zohrievať až kyacutem nedocircjde k denaturaacuteciiacute Teplota topenia amplikoacutenu vo vzorke zaacutevisiacute od DNA sekvencie čo umožňuje detegovať priacutetomnosť mutaacutecie resp SNP Tvar vyacuteslednyacutech kriviek topenia určuje teda genotyp

22

Obr 21 Určenie genotypu analyacutezou krivky topenia tzv metoacutedou high resolution melting (HRM) A ndash krivka topenia vzoriek DNA majuacutecich tri rocirczne genotypy B ndash graf rozdielnosti krivky topenia vzoriek DNA majuacutecich tri rocirczne genotypy

23

4 Elektroforetickaacute separaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten

Separaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten predstavuje rozdelenie molekuacutel DNA alebo RNA na zaacuteklade veľkosti zloženia a poradia baacutez Podobnyacutemi metoacutedami je možneacute separovať aj proteiacuteny

Elektroforeacuteza (ELFO) je technika použiacutevanaacute na separaacuteciu niekedy aj purifikaacuteciu makromolekuacutel ako suacute nukleoveacute kyseliny a proteiacuteny na zaacuteklade ich rozdielnej veľkosti naacuteboja alebo konformaacutecie Je to metoacuteda veľmi často využiacutevanaacute nielen v molekulovej genetike ale aj biocheacutemii Elektroforeacuteza využiacuteva schopnosť nabityacutech molekuacutel migrovať v jednosmernom elektrickom poli k opačneacutemu poacutelu Nukleoveacute kyseliny majuacute vďaka svojej fosfaacutetovej zložke negatiacutevny naacuteboj preto v jednosmernom elektrickom poli migrujuacute ku kladneacutemu poacutelu čiže k anoacutede Elektroforeacuteza prebieha v elektroforetickej aparatuacutere v geacuteloch (v nosiči) so sieťovitou štruktuacuterou ktoraacute umožňuje separaacuteciu molekuacutel Vzorka nukleovej kyseliny zmiešanaacute s tzv nanaacutešaciacutem tlmivyacutem roztokom s farbičkou sa nanesie do jamky v geacuteli ktoryacute je umiestnenyacute v elektroforetickej aparatuacutere v priacutetomnosti elektroforetickeacuteho pufra (TAE alebo TBE) (obr 22) Nanaacutešaciacute tlmivyacute roztoknanaacutešacia farbička umožňuje na zaacuteklade migraacutecie farbičky vidieť migraacuteciu vzorky v geacuteli a suacutečasne zvyacutešeniacutem hustoty vo vzorke umožniacute klesnuacuteť vzorke do jamky a tak zabraacuteniť jej vyplaveniu z geacutelu Draacuteha je časť geacutelu ktoryacutem putuje jedna vzorka od katoacutedy k anoacutede V draacutehe sa nachaacutedzajuacute oddeleneacute jednotliveacute fragmenty nukleovyacutech kyseliacuten určityacutech veľkostiacute viditeľneacute vo forme pruacutežkov (angl bands) Intenzita pruacutežku zaacutevisiacute od množstva molekuacutel danej veľkosti je ekvivalentnaacute hmotnosti Na určenie veľkosti fragmentov NK sa do jednej jamky nanesie štandard molekulovyacutech hmotnostiacute (angl ladder) ktoryacute maacute presne definovaneacute veľkosti fragmentov čo umožňuje odhadnuacuteť veľkosť aj hmotnosť neznaacutemych separovanyacutech fragmentov

Obr 22 Elektroforetickaacute separaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten v agaroacutezovom geacuteli (A) a vizualizaacutecia UV svetlom a GelRedtrade (B C)

24

Nukleoveacute kyseliny je možneacute elektroforeticky separovať 1) v geacuteloch agaroacutezovom (horizontaacutelna elektroforeacuteza) (obr 22) a polyakrylamidovom (vertikaacutelna elektroforeacuteza) 2) v špeciaacutelnych lineaacuternych polymeacuteroch kapilaacuternou elektroforeacutezou použitiacutem genetickeacuteho analyzaacutetora (obr 23)

Agaroacuteza je polysacharid ziacuteskanyacute z morskej riasy použiacuteva sa najčastejšie v koncentraacuteciiacute 05-2 čiacutem vyššia koncentraacutecia tyacutem je geacutel pevnejšiacute a schopnejšiacute rozliacutešiť menšie fragmenty NK Priacuteprava je jednoduchaacute odvaacuteži sa potrebneacute množstvo agaroacutezy ktoraacute sa zmieša s tlmivyacutem roztokom (pufrom) rozvariacute sa v mikrovlnnej ruacutere a naleje sa do špeciaacutelnej naacutedoby na vytvaacuteranie geacutelov kyacutem je geacutel tekutyacute vložiacute sa do neho tzv hrebeň na vytvorenie jamiek Agaroacuteza je netoxickaacute V bežnom agaroacutezovom geacuteli v zaacutevislosti od jeho koncentraacutecie je možneacute separovať DNA fragmenty dĺžky 200-50 000 bp Dnes suacute dostupneacute aj špeciaacutelne agaroacutezy napr MetaPhorreg Agarose schopneacute oddeliť fragment DNA dĺžky 20-800bp Separaacutecia v agaroacutezovom geacuteli prebieha v horizontaacutelnej aparatuacutere preto sa nazyacuteva aj horizontaacutelna elektroforeacuteza

Polyakrylamidovyacute geacutel (PAGE) vznikaacute polymerizaacuteciou akrylamidu v priacutetomnosti špeciaacutelnych chemickyacutech laacutetok (peroxodisiacuteran amoacutenny TEMED bisakrylamid) Jeho priacuteprava je preto odlišnaacute a aj naacuteročnejšia Polyakrylamidoveacute geacutely majuacute vysokuacute rozlišovaciu schopnosť (1bp) preto suacute PAGE geacutely vhodneacute aj na sekvenovanie DNA klasickyacutemi metoacutedami PAGE geacutel nie je vhodnyacute na separaacuteciu fragmentov dlhšiacutech ako 2kb Použiacuteva sa v koncentraacutecii 35 -20 s rozliacutešeniacutem fragmentov od 10bp-2000bp Akrylamid je neurotoxiacuten musiacute sa s niacutem pracovať veľmi opatrne PAGE elektroforeacuteza bežiacute vo vertikaacutelnej aparatuacutere preto sa volaacute aj vertikaacutelna elektroforeacuteza použiacuteva sa často aj na separaacuteciu proteiacutenov

Ryacutechlosť pohybu nukleovyacutech kyseliacuten (mobilita) určuje viacero faktorov 1) veľkosť NK ndash počet baacutezovyacutech paacuterov resp baacutez pričom menšie molekuly prechaacutedzajuacute geacutelom ryacutechlejšie pretože sa ľahšie pohybujuacute v geacuteli 2) konformaacutecia nukleovej kyseliny napr u rovnako veľkyacutech plazmidov kondenzovaneacute superšpiralizovaneacute plazmidy migrujuacute najryacutechlejšie rovnako veľkeacute lineaacuterne molekuly (toho isteacuteho plazmidu) bežia pomalšie a najpomalšie putujuacute relaxovaneacute kruhoveacute molekuly plazmidu 3) koncentraacutecia geacutelu určuje jeho rozlišovaciu schopnosť koncentrovanejšiacute geacutel je schopnyacute separovať kratšie fragmenty NK redšie geacutely suacute vhodneacute pre rozliacutešenie vaumlčšiacutech fragmentov 4) zloženie geacutelu je docircležiteacute pri analyacuteze sekundaacuternych štruktuacuter NK a proteiacutenov v nedenaturovanom stave sekundaacuterna štruktuacutera spomaľuje migraacuteciu NK a proteiacutenov Tento fakt využiacutevajuacute niektoreacute diagnostickeacute techniky (napr SSCP - Single Strand Conformation Polymorphism - polymorfismus konformaacutecie jednovlaacuteknovej DNA) umožňujuacutece detekciu zaacutemeny jedinej baacutezy ktoraacute spocircsobiacute odlišneacute vnuacutetromolekuloveacute paacuterovanie a vyacuteslednuacute konformaacuteciu molekuly Geacutely mocircžu teda byť denaturačneacute a nedenaturačneacute (natiacutevne) 5) napaumltie zdroja - čiacutem vyššie je napaumltie ktoreacute vytvaacutera elektrickeacute pole v elektroforetickej aparatuacutere tyacutem ryacutechlejšie fragmenty NK migrujuacute 6) zloženie roztokov a teploty

Elektroforetickyacute tlmivyacute roztok (pufor - elektrolyt) zabezpečuje stabilneacute elektroforetickeacute podmienky počas separaacutecie geacutel je v ňom ponorenyacute Obsahuje ioacuteny čo umožňuje vedenie elektrickeacuteho pruacutedu

Štandard molekulovyacutech hmotnostiacute (v laboratoacuteriaacutech nazyacutevanyacute ladder alebo marker) je zmes fragmentov DNA alebo RNA s presne definovanou veľkosťou ktoryacute sluacuteži na odhad veľkosti vyšetrovanyacutech fragmentov NK (obr 22) Pomocou špeciaacutelnych štandardov molekulovyacutech hmotnostiacute ktoryacutech fragmenty NK majuacute definovanuacute aj hmotnosť je možneacute odhadnuacuteť množstvo (hmotnosť - koncentraacuteciu) neznaacutemeho fragmentu

B C

25

41 Vizualizaacutecia DNA

Samotnaacute nukleovaacute kyselina je počas elektroforetickej separaacutecie neviditeľnaacute Vizualizaacuteciu NK umožňujuacute interkalačneacute činidlaacute ktoreacute suacute schopneacute naviazať sa na molekuly NK tyacutem že sa včlenia medzi susediace baacutezy Po ožiareniacute UV svetlom interkalačneacute činidlaacute naviazaneacute na NK fluoreskujuacute tak sa vizualizuje NK čiacutem intenziacutevnejšie fluoreskuje tyacutem viac NK je v geacutelipruacutežku priacutetomneacute Interkalačneacute činidlo sa buď primieša do geacutelu pri jeho priacuteprave čo umožniacute sledovať migraacuteciu fragmentov NK počas elektroforeacutezy a to po vybratiacute z ELFO aparatuacutery a po ožiareniacute UV svetlom alebo sa geacutel farbiacute po elektroforetickej separaacutecii V minulosti bol na zviditeľnenie NK najčastejšie použiacutevanyacute etidiumbromid kvocircli jeho mutageacutennym vlastnostiam sa v suacutečasnosti nahraacutedza menej mutageacutennymi a netoxickyacutemi činidlami ako suacute napr komerčne dostupneacute SYBRregSafe GelRedtrade GelGreentrade

Kapilaacuterna elektroforeacuteza NK prebieha v špeciaacutelnom priacutestroji genetickom analyzaacutetore (obr 23) ktoryacute musiacute mať zaacutekladneacute komponenty ako suacute elektroacutedy kapilaacutera zdroj vysokeacuteho napaumltia detektor prepojenie s počiacutetačom a softveacuteroveacute vybavenie priestor na vloženie vzoriek atď Genetickyacute analyzaacutetor predstavuje automatizovanyacute systeacutem umožňujuacuteci sekvenovanie určovanie dĺžky DNA fragmentov ndash fragmentačnuacute analyacutezu a kvantifikaacuteciu nukleovyacutech kyseliacuten V novšiacutech typoch genetickeacuteho analyzaacutetora je proces analyacutezy od vloženia vzoriek do stojana automatizovanyacute

Vzorka určenaacute na analyacutezu je elektrokineticky injektovanaacute do tenkej kapilaacutery naplnenej lineaacuternym polymeacuterom Vplyvom vysokeacuteho napaumltia sa negatiacutevne nabiteacute fragmenty DNA pohybujuacute v polymeacuteri k pozitiacutevne nabitej elektroacutede Kapilaacuterna elektroforeacuteza je tak citlivaacute že je schopnaacute detegovať jednobaacutezovyacute rozdiel DNA fragmentov DNA fragmenty musia byť pred kapilaacuternou elektroforeacutezou fluorescenčne označeneacute v kapilaacutere suacute separovaneacute na zaacuteklade veľkosti Kraacutetko pred dosiahnutiacutem kladne nabitej elektroacutedy docircjde po excitaacutecii laserovyacutem žiareniacutem k emisii žiarenia fluoroformi (farbičkami) tak že optickyacute detekčnyacute systeacutem zaznamenaacute fluorescenciu ktoraacute je naacutesledne softveacuterovo spracovanaacute a vyhodnotenaacute

Obr 23 Genetickyacute analyzaacutetor

42 RFLP

Metoacuteda polymorfizmu dĺžky restrik čnyacutech fragmentov (angl Restriction Fragment Length Polymorfism) bola prvou metoacutedou využiacutevanou na detekciu DNA variaacuteciiacute rocircznych biologickyacutech vzoriek Princiacutep metoacutedy spočiacuteva v priacutetomnosti polymorfizmov v DNA sekvencii rocircznych ľudiacute ktoreacute zapriacutečinia rozdielny profil (obrazec) DNA fragmentov po štiepeniacute jednou alebo viaceryacutemi restrikčnyacutemi endonukleaacutezami Restrikčneacute endonukleaacutezy (RE) suacute enzyacutemy ktoreacute štiepia DNA molekulu v oblasti špecifickej nukleotidovej sekvencie nazyacutevanej restrik čneacute miesto RE najčastejšie rozpoznaacutevajuacute a štiepia miesto veľkeacute 4-6 baacutez RE suacute priacutetomneacute u prokaryotov (bakteacuterie a archebakteacuterie) kde suacute suacutečasťou restrik čno-modifikačneacuteho systeacutemu akoby prokaryotickeacutej vrodenej imunity sluacutežia

26

na ochranu pred cudzou DNA (napr viacuterusovou) ktoruacute po rozpoznaniacute špecifickej sekvencie štiepia

Restrikčno-modifikačnyacute systeacutem maacute dve zložky 1) modifikačneacute enzyacutemy - metylaacutezy ktoreacute procesom metylaacutecie modifikujuacute určiteacute baacutezy svojej DNA čiacutem ich označia za vlastnuacute DNA takže takaacuteto DNA je potom rezistentnaacute voči štiepeniu restrikčnyacutemi endonukleaacutezami Najčastejšiacutem spocircsobom metylaacutecie u bakteacuteriiacute je metylaacutecia adeniacutenu na N6 pričom vznikne metyladeniacuten alebo cytoziacutenu na C5 metylcytoziacuten 2) restrikčneacute endonukleaacutezy štiepia špecifickeacute miesto dvojvlaacuteknovej DNA ktoreacute je tvoreneacute symetrickou sekvenciou zrkadlovo sa opakujuacutecich nukleotidov ndash tzv palindroacutem Restrikčneacute enzyacutemy sa použiacutevajuacute na štiepenie DNA sekvencie na mieste špecifickom pre tuacute ktoruacute restrikčnuacute endonukleaacutezu napr pri analyacuteze polymorfizmov dĺžky restrikčnyacutech fragmentov (RFLP) analyacuteze jednonukleotidovyacutech polymorfizmov (SNP) mutaacuteciiacute ako aj pri klonovaniacute DNA do vhodnyacutech vektorovyacutech DNA molekuacutel

Po štiepeniacute dvojvlaacuteknovej DNA restrikčnou endonukleaacutezou mocircžu vzniknuacuteť tri typy koncov - 5´-prečnievajuacutece konce (lepiveacute) 3´-prečnievajuacutece konce (lepiveacute) a tupeacute konce (obr 24)

Obr 24 Restrikčneacute štiepenie zanechaacutevajuacutece rocirczne konce tupeacute a lepiveacute

Restrikčneacute štiepenie je často použiacutevanou metoacutedou geacutenovyacutech manipulaacuteciiacute na konštrukciu

hybridnyacutech molekuacutel DNA s naacuteslednyacutem klonovaniacutem Priebeh RFLP analyacutezy je nasledovnyacute restrikčnaacute endonukleaacuteza sa pridaacute k DNA a zmes sa vo

vhodnyacutech reakčnyacutech podmienkach (pufor teplota) inkubuje niekoľko hodiacuten Počas inkubaacutecie docircjde k štiepeniu DNA na špecifickyacutech miestach DNA je potom elektroforeticky separovanaacute v geacuteli a naacutesledne vizualizovanaacute V minulosti po geacutelovej elektroforeacuteze nasledoval Southern blot (čiže prenos separovanyacutech fragmentov DNA z geacutelu na špeciaacutelnu membraacutenu) (obr 35) po ktorom nastala vizualizaacutecia raacutedioaktiacutevne značenou proacutebou V suacutečasnosti sa kvocircli praacutecnosti a zdravotnyacutem rizikaacutem od Southern blotu upuacutešťa a prechaacutedza sa na ryacutechlejšie menej praacutecne a zdravotne šetrnejšie metoacutedy priateľskejšie aj k životneacutemu prostrediu

RFLP bola prvou metoacutedou použiacutevanou na zistenie DNA profilu (DNA fingerprinting) mapovanie geacutenov zapriacutečiňujuacutece genetickeacute ochorenia a testovanie otcovstva Vaumlčšina RFLP markerov je vysoko lokusovo špecifickyacutech a kodominantnyacutech (obidve alely suacute detekovaneacute u heterozygota)

PCR-RFLP je laboratoacuterne priacutestupnejšia metoacuteda molekulaacuterno-genetickej diagnostiky keďže PCR umožňuje amplifikaacuteciu veľmi malyacutech množstiev DNA Alternatiacutevny naacutezov použiacutevanyacute v literatuacutere je CAPS z angl Cleaved Amplified Polymorphic Sequence assay Použitiacutem špecifickyacutech primerov docircjde PCR metoacutedou k amplifikaacutecii požadovaneacuteho uacuteseku DNA ten sa potom štiepi restrikčnou endonukleaacutezou vo vhodnyacutech podmienkach naacutesledne sa štiepne produkty elektroforeticky separujuacute a vizualizujuacute použitiacutem interkalačnyacutech farbiacutev a UV svetla (obr 25)

27

Obr 25 Princiacutep metoacutedy PCR-RFLP

43 VNTR a STR V geacutenome suacute priacutetomneacute dva typy tandemovyacutech (za sebou nasledujuacutecich) opakovaniacute

1) minisatelity ndash nazyacutevaneacute variabilnyacute počet tandemovyacutech opakovaniacute VNTR (variable number of tandem repeats) 2) mikrosatelity tiež kraacutetke tandemoveacute repetiacutecie STR (short tandem repeats)

Obidva tieto typy satelitnej DNA suacute rozmiestneneacute po celom genoacuteme suacute využiacutevaneacute hlavne vo forenznej genetike na identifikaacuteciu osocircb a určenie otcovstva popriacutepade materstva ale aj v mediciacutene na detekciu chromozoacutemovyacutech aneuploidiiacute Štruktuacutera obidvoch je podobnaacute Rozdiel medzi jednotlivyacutemi alelami je spocircsobenyacute rozdielnym počtom opakovaniacute opakujuacutecej sa sekvencie (motiacutevu) čo spocircsobiacute rocircznu dĺžku alel s rocircznym počtom tandemovyacutech opakovaniacute nazyacutevanuacute polymorfizmus dĺžky fragmentov

VNTR ndash variabilnyacute počet tandemovyacutech opakovaniacute pričom opakujuacuteca sa sekvencia maacute dĺžku od 6 do 100 baacutez pričom sa mocircže opakovať aj tisiacutece kraacutet alely tak mocircžu mať od 500do 30 000 baacutez VNTR boli v kombinaacutecii s RFLP (DNA fingerprinting ) prvyacutem polymorfizmom použiacutevanyacutem na zistenie DNA profilov a identifikaacuteciu osocircb v kriminalistickej praxi V suacutečasnosti jeho využitie v kriminalistike je kvocircli potrebe relatiacutevne veľkeacuteho množstva DNA nahradeneacute využitiacutem STR

STR - kraacutetke tandemoveacute repetiacutecie suacute v kriminalistike najčastejšie použiacutevanyacutem polymorfizmom STR lokusy suacute rozmiestneneacute po celom genoacuteme repetiacutecia obsahuje jednu až šesť baacutez pričom jej opakovaniacutem vznikne STR v rozsahu od 50 do 300bp V našom genoacuteme suacute tisiacutece STR ktoreacute mocircžu byť použiteacute pre forenznuacute analyacutezu V kriminalistike sa v suacutečasnosti na identifikaacuteciu osocircb použiacuteva 13 STR locusov ktoreacute patria k medzinaacuterodne uznaacutevanyacutem štandardom Z iniciatiacutevy FBI bola vytvorenaacute databaacuteza CODIS (Combined DNA Index System) každaacute krajina maacute svoju databaacutezu CODIS kde je možneacute vložiť a archivovať DNA profily jednotlivcov ako aj profily DNA ziacuteskanyacutech z miest kriminaacutelneho činu v databaacuteze je ich možneacute navzaacutejom porovnať a tak zistiť pocircvodcu trestneacuteho činu Medzinaacuterodnaacute jednotnosť v použiacutevaniacute CODIS STR lokusov umožňuje v priacutepade potreby vzaacutejomneacute porovnanie DNA profilov zistenyacutech na uacutezemiacute rocircznych štaacutetov CODIS STR lokusov je 13 a suacute to CSF1PO FGA TH01 TPOX VWA D3S1358 D5S818 D7S820 D8S1179 D13S317 D16S539 D18S51 a D21S11 Zistenie DNA profilu sa uskutočniacute multiplexnou PCR reakciou s fluorescenčne značenyacutemi primermi špecifickyacutemi pre konkreacutetny STR Naacutesledne suacute PCR produkty analyzovaneacute kapilaacuternou elektroforeacutezou genetickyacutem analyzaacutetorom ktoryacute rozliacuteši amplifikovaneacute fragmenty na zaacuteklade fluorescencie a dĺžky (fragmentačnaacute analyacuteza) (obr 26 Tab 3) DNA profil každeacuteho človeka je jedinečnyacute rovnakyacute profil mocircžu mať len jednovaječneacute dvojčataacute

28

Obr 26 Ukaacutežka DNA profilu človeka 15 STR lokusov s určeniacutem pohlavia pomocou lokusu pre amelogeniacuten (ženskeacute pohlavie - XX) maleacute oranžoveacute piacuteky predstavujuacute fragmenty veľkostneacuteho štandardu Tabuľka č 3 Zaacutepis DNA profilu človeka z obraacutezka č 26 15 STR lokusov s určeniacutem pohlavia pomocou lokusu pre amelogeniacuten System Alela 1 Alela 2

D3S1358 16 17

TH01 9 93 D21S11 28 28

D18S51 15 18

Penta E 7 14 D5S818 9 12

D13S317 8 11

D7S820 8 11 D16S539 11 12

CSF1PO 10 11

Penta D 11 12 vWA 15 18

D8S1179 13 16

TPOX 8 9 FGA 20 21

amel X X

29

5 MLPA

Multiplexnaacute amplifikaacutecia proacuteb zaacutevislaacute od ligaacutecie (z angl multiplex ligation-dependent probe amplification) je metoacuteda schopnaacute v jednej reakcii (v jednej skuacutemavke a vzorke) detegovať zmeny v počte až 50 nukleotidovyacutech sekvenciiacute Metoacutedou MLPA je možneacute ryacutechlo identifikovať amplifikaacutecie (duplikaacutecie) a deleacutecie veľkeacuteho počtu geacutenov či už použitiacutem DNA alebo mRNA krvnyacutech vzoriek alebo vzoriek z naacutedorov

Princiacutep MLPA spočiacuteva v multiplexnej amplifikaacutecii 50 špecifickyacutech nukleotidovyacutech sekvenciiacute použitiacutem jedneacuteho paacuteru primerov pričom jeden primer je fluorescenčne označenyacute Vyacutesledneacute PCR produkty suacute analyzovaneacute kapilaacuternou elektroforeacutezou (fragmentačnaacute analyacuteza) Dĺžka každeacuteho namnoženeacuteho produktu je jedinečnaacute narastaacute postupne o 6 alebo 9 nukleotidov pričom produkty PCR suacute 120 ndash 500 nukleotidov dlheacute Tento veľkostnyacute rozsah PCR fragmentov (dĺžka 120-500 nukleotidov s naacuterastom postupne o 6 alebo 9 nukleotidov) je optimaacutelny pre kapilaacuternu elektroforeacutezu MLPA multiplexnaacute PCR prebieha za použitia iba jedineacuteho paacuteru primerov ktoreacute amplifikujuacute špecifickeacute sekvencie Trik spočiacuteva v tom že nedochaacutedza k amplifikaacutecii DNA sekvencie ale MLPA proacuteb ktoreacute suacute pridaneacute k vzorkaacutem Každaacute MLPA proacuteba pozostaacuteva z dvoch oligonukleotidov (dve hemiproacuteby) pričom každyacute oligonukleotid obsahuje jednu zo sekvencie rozpoznaacutevanuacute PCR primermi Proacuteba vznikne jedine za predpokladu hybridizaacutecie dvoch oligonukleotidov (hemiproacuteb) k cieľovej sekvencii (geacutenu) a po ligaacutecii enzyacutemom ligaacutezou Iba ligovaneacute proacuteby suacute exponenciaacutelne amplifikovaneacute pomocou jedneacuteho paacuteru primerov Množstvo zligovanyacutech proacuteb teda zaacutevisiacute od množstva cieľovyacutech sekvenciiacute (geacutenov) vo vzorke

Postup MLPA analyacutezy je nasledovnyacute (obr27) K vzorke nukleovej kyseliny (DNA resp mRNA) sa pridaacute zmes 50 jedinečnyacutech proacuteb každaacute

proacuteba je komplementaacuterna k určitej cieľovej sekvencii NK vzorky Každaacute proacuteba však pozostaacuteva z dvoch oligonukleotidov hybridizujuacutecich vedľa seba zaacuteroveň každyacute oligonukleotid (hemiproacuteba) obsahuje pridanuacute sekvenciu rozpoznaacutevanuacute paacuterom PCR primerov Po hybridizaacuteciiacute oligonukleotidov (hemiproacuteb) dochaacutedza k ich ligaacutecii ligaacutezou Ligačnaacute reakcia je tak špecifickaacute že je schopnaacute rozliacutešiť sekvenciu liacutešiacu sa v jednom nukleotide Vyacuteslednyacute ligačnyacute produkt (proacuteba) obsahuje obidve sekvencie pre PCR primery na jednom fragmente čiže mocircže docircjsť k namnoženiu takeacutehoto fragmentu PCR reakciou V priacutepade ak nedocircjde k ligaacutecii priacuteslušnyacutech hemiproacuteb pretože hemiproacuteby nenaacutejdu cieľovuacute sekvenciu na DNA každaacute takaacuteto nezligovanaacute hemiproacuteba maacute len jednu sekvenciu rozpoznaacutevanuacute len jednyacutem PCR primerom v docircsledku čoho nemocircže prebehnuacuteť jej PCR amplifikaacutecia a počas fragmentačnej analyacutezy nie je detegovanaacute pretože negeneruje fluorescenčnyacute signaacutel

Pri MLPA analyacuteze je docircležiteacute okrem MLPA amplifikaacutecie vzorky urobiť aj MLPA amplifikaacuteciu referenčnej vzorky ku ktorej sa bude porovnaacutevať počet geacutenov (cieľovyacutech sekvenciiacute) Po kapilaacuternej elektroforeacuteze MLPA referenčnej a skuacutemanej vzorky porovnaniacutem obsahu nameranyacutech hodnocirct tzv piacutekov priacuteslušnyacutech proacuteb sa určiacute relatiacutevny počet koacutepiiacute v skuacutemanej vzorke

MLPA

1 DNA denaturaacutecia a hybridizaacutecia s MLPA proacutebami (hemiproacuteby)

2 Ligaacutecia (vytvorenie kompletnyacutech proacuteb)

3 PCR amplifikaacutecia proacuteb paacuterom primerov

4 Kapilaacuterna elektroforetickaacute separaacutecia PCR produktov

5 Analyacuteza daacutet

30

Obr 27 Princiacutep MLPA

Firma MRC-Holland v suacutečasnosti ponuacuteka stovky MLPA setov proacuteb ktoreacute suacute vhodneacute na 1) diagnostiku kongenitaacutelnych a dedičnyacutech ochoreniacute 2) zisťovanie profilu naacutedorov 3) zisťovanie metylačneacuteho profilu

MLPA je metoacuteda vhodnaacute na detekciu malyacutech prestavieb (BRCA1 BRCA2 MSH2 atď)

veľkyacutech chromozoacutemovyacutech prestavieb (Williamsov syndroacutem Prader-WilliAngelman syndroacutem atzď)

31

detekciu zmien v počte koacutepii geacutenov (obr 28 29) ako aj zistenie počtu kompletnyacutech chromozoacutemov (chromozoacutem 13 18 21 XY tiež aj z amniovej tekutiny) diagnostiku naacutedorov (zmeny počtu pri ALL CLL atď) kvantifikaacuteciu metylaacutecie (Prader-WilliAngelmanov syndroacutem Fragilnyacute X inaktivaacutecia naacutedorovyacutech supresorovyacutech geacutenov atď) mRNA analyacutezu geacutenov zuacutečastňujuacutecich sa apoptoacutezy alebo zaacutepalov

MS-MLPA (Methylation-Specific MLPA) je varianta MLPA určenaacute špeciaacutelne na analyacutezu aberantnyacutech metylaacutecii imprintovanyacutech oblastiacute ako aj detekciu metylačnyacutech zmien CpG ostrovčekov lokalizovanyacutech bliacutezko promoacutetora Rozdiel oproti štandardnej MLPA spočiacuteva v použitiacute metylačne senzitiacutevneho restrikčneacuteho enzyacutemu HhaI ktoryacute štiepi MS-MLPA proacuteby hybridizovaneacute k nemetylovanej sekvencii Každaacute DNA vzorka určenaacute pre MS-MLPA analyacutezu prejde dvoma reakciami v jednej mikroskuacutemavke štandardnou MLPA analyacutezou (bez štiepenia metylačne senzitiacutevnym enzyacutemom) a v druhej mikroskuacutemavke docircjde okrem ligaacutecie proacuteb aj k metylačne senzitiacutevnemu štiepeniu hybridizovanyacutech proacuteb s nemetylovanou DNA Amplifikujuacute sa len ligovaneacute proacuteby po PCR amplifikaacutecii sa fragmentačnou analyacutezou porovnaniacutem oboch reakciiacute zistia rozdiely v metylačnom profile vzorky k referenčnej vzorke

RT-MLPA (Reverse Transkriptase MLPA) je variaacutecia MLPA určenaacute pre zistenie mRNA profilu vzorky je alternatiacutevou k real-time PCR a mikročipom RT-MLPA nedeteguje mRNA množstvo priamo pretože použiacutevanaacute ligaacuteza nie je schopnaacute ligovať DNA oligonukleotidy keď suacute hybridizovaneacute s RNA Preto RT-MLPA začiacutena reverznou transkripciou so špeciaacutelne navrhnutyacutemi RT primermi tak aby vytvorili kraacutetke oligonukleotidy (cDNA) Potom reakcia pokračuje ako štandardnaacute MLPA

Obr 28 MLPA analyacuteza geacutenu DMD (koacutedujuacuteceho dystrofiacuten) mutaacutecie ktoreacuteho spocircsobujuacute Duchennovu svalovuacute dystrofiu u pacienta je priacutetomnaacute deleacutecia exoacutenu 45 v porovnaniacute s referenčnou vzorkou ndash kontrolou

32

Obr 29 MLPA analyacuteza geacutenu DMD (koacutedujuacuteceho dystrofiacuten) mutaacutecie ktoreacuteho spocircsobujuacute Duchennovu svalovuacute dystrofiu u pacienta suacute priacutetomneacute duplikaacutecie exoacutenov 41 42 43 44 45 (piacuteky vo vzorke pacienta sa porovnajuacute s piacutekmi v kontrole ndash referenčnej vzorke)

33

6 Sekvenovanie

Sekvenovaniacutem rozumieme určenie primaacuternej štruktuacutery DNA teda určenie poradia nukleotidov v reťazci DNA Začiatky moderneacuteho sekvenovania siahajuacute do roku 1977 kedy boli objaveneacute dve metoacutedy sekvenovania 1) chemickaacute metoacuteda Maxama a Gilberta 2) enzymatickaacute metoacuteda Sangera Nicklena a Coulsona

Princiacutep obidvoch metoacuted sekvenovania spočiacuteva v tom že sa vytvoriacute suacutebor DNA molekuacutel s rocircznou veľkosťou ktoreacute suacute zakončeneacute konkreacutetnym nukleotidom tieto DNA molekuly sa elektroforeticky separujuacute v geacuteloch s rozlišovacou schopnosťou 1 nukleotid 61 Chemickaacute metoacuteda

DNA molekuly sa na 5-konci raacutedioaktiacutevne označia raacutedioaktiacutevnym fosforom a naacutesledne sa chemicky modifikujuacute špecificky pre každuacute baacutezu DNA sa potom v modifikovanyacutech miestach štiepi čiacutem vzniknuacute rocirczne dlheacute fragmenty pričom podmienky suacute nastaveneacute tak aby sa DNA na každom mieste štiepila len raz Modifikaacutecia DNA a štiepenie prebehne v štyroch separaacutetnych reakciaacutech (skuacutemavkaacutech) takže po elektroforetickej separaacuteciiacute takto opracovanej DNA v štyroch draacutehach polyakrylamidoveacuteho geacutelu a naacuteslednej autoraacutediografii (podobne ako pri Southernovej hybridizaacutecii) je možneacute odčiacutetať nukleotidovuacute sekvenciu približne 100 nukleotidov od raacutedioaktiacutevneho označenia (v čase objavu Maxama a Gilberta) 62 Sangerova metoacuteda

Zaacuteklady metoacutedy boli popiacutesaneacute už v roku 1975 (metoacuteda plus a miacutenus) ale až vylepšenie použitiacutem dideoxynukleotidov (ddNTP) v roku 1977 došlo k zjednodušeniu sekvenovania Princiacutepom enzyacutemoveacuteho sekvenovania je terminaacutecia (zastavenie) polymerizaacutecie inkorporaacuteciou 2´ 3 -dideoxynukleotidov do novosyntetizujuacuteceho sa vlaacutekna DNA Keďže ddNTP neobsahujuacute hydroxylovuacute skupinu na 3 uhliacuteku riboacutezy nemocircžu sa zuacutečastniť na tvorbe fosfodiesterovej vaumlzby nemocircže sa pripojiť k nim ďalšiacute nukleotid čiže musiacute docircjsť k terminaacuteciiacute polymeraacutecie Reakcia prebieha v štyroch skuacutemavkaacutech s raacutedioaktiacutevne značenyacutem primerom V každej skuacutemavke suacute priacutetomneacute všetky štyri deoxynukleotidtrifosfaacutety (dNTP) ale pre každuacute skuacutemavku je špecifickyacute priacutedavok maleacuteho množstva jedneacuteho z dideoxynukleotidtrifosfaacutetov (v prvej skuacutemavke je ddATP v druhej ddCTP v tretej ddTTP a vo štvrtej ddGTP) Maleacute množstvo ddNTP spocircsobiacute že pri polymerizaacutecii dochaacutedza k prednostneacutemu zaradeniu štandardnyacutech dNTP do narastajuacuteceho reťazca a len občas sa inkorporuje ddNTP čiacutem sa zastaviacute synteacuteza reťazca V každej skuacutemavke tak vznikne suacutebor DNA fragmentov rocircznych veľkostiacute zakončenyacutech priacuteslušnyacutem ddNTP (v prvej skuacutemavke ddATP v druhej ddCTP v tretej ddTTP a vo štvrtej ddGTP) Po elektroforetickej separaacutecii v 4 draacutehach polyakrylamidoveacuteho geacutelu a autoraacutediografii sa z autoraacutediogramu odčiacuteta sekvencia

V suacutečasnosti je sekvenovanie do značnej miery automatizovaneacute pričom využiacuteva princiacutep Sangerovej enzyacutemovej metoacutedy s určityacutemi obmenami Uacutesek DNA ktoryacute treba sekvenovať sa prostredniacutectvom termostabilnyacutech DNA polymeraacutez namnožiacute PCR metoacutedou po ktorej nasleduje sekvenačnaacute reakcia (asymetrickaacute PCR) s fluorescenčne značenyacutemi ddNTP (každyacute druh označenyacute inyacutem fluorescenčnyacutem farbivom) Sekvenačnaacute reakcia prebieha v jednej skuacutemavke s jednyacutem primerom vznikne tak suacutebor jednovlaacuteknovyacutech DNA rocircznej dĺžky ktoreacute suacute na 3konci označeneacute ddNTP so špecifickyacutem fluorescenčnyacutem farbivom Taacuteto metoacuteda sekvenovania sa tiež nazyacuteva rdquodye-terminator cycle sequencingrdquo(obr 30) Po kapilaacuternej elektroforeacuteze vzorky v genetickom analyzaacutetore zaznamenaacutevaniacute fluorescencie jednotlivyacutech fragmentov CCD kamerou a softveacuterovom spracovaniacute sa ziacuteska sekvencia DNA (obr 31)

34

Obr 30 Princiacutep sekvenovania Sangerova dideoxy metoacuteda alebo tzv chain termination method (reťazec zastavujuacuteca metoacuteda) Obr 31 Určenie genotypu plodu a rodičov sekvenčnou analyacutezou DNA ziacuteskanej z plodovej vody (prenataacutelna diagnostika) a perifeacuternej krvi sekvenčnaacute analyacuteza geacutenu ASPA vyacutesledok u plodu priacutetomnaacute mutaacutecia c 914CgtA v homozygotnom stave (AA) rodičia heterozygoti (AC) Uvedenaacute mutaacutecia je v homozygotnom stave kauzaacutelnou priacutečinou Canavanovej choroby

Automatizovaneacute sekvenovanie prinaacuteša viacereacute vyacutehody oproti klasickej Sangerovej metoacutede vyššiu presnosť a ryacutechlosť v jednej sekvenačnej reakcii možnosť osekvenovať až 1200 nukleotidovyacute fragment maleacute množstvo templaacutetu potrebneacute na analyacutezu

35

63 Next Generation Sequencing (NGS)

NGS (sekvenovanie novej generaacutecie) maacute obrovskyacute potenciaacutel v analyacuteze genoacutemov pričom toto označenie zahŕňa viacereacute technologickeacute metoacutedy reprezentovaneacute niekoľkyacutemi firmami Princiacutepom je masiacutevne paralelneacute sekvenovanie čiacutem sa ziacuteskajuacute raacutedovo tisiacutece až milioacuteny sekvenciiacute naraz 631 Sekvenovanie druhej generaacutecie

Na začiatku sa analyzovanaacute DNA vo vaumlčšine priacutepadov fragmentuje (vznikne tak DNA

knižnica) na fragmenty sa pripoja kraacutetke sekvencie ndash adapteacutery naacutesledne sa tieto fragmenty rocircznymi priacutestupmi amplifikujuacute a určiacute sa ich sekvencia Vďaka čiastočnyacutem prekryvom je zo ziacuteskanyacutech sekvencii možneacute poskladať plynuluacute sekvenciu zodpovedajuacutecu pocircvodnej nefragmentovanej DNA

Pyrosekvenovanie je podobne ako Sangerova metoacuteda založenaacute na princiacutepe synteacutezy komplementaacuterneho vlaacutekna DNA avšak rozdiel je v tom že sa na detekciu inkorporaacutecie nukleotidu využiacuteva inyacute systeacutem tvorby luminiscenčneacuteho signaacutelu v priebehu reakcie Pyrosekvenovanie je umožneneacute vďaka aktivite 4 enzyacutemov - DNA polymeraacutezy ATP sulfurylaacutezy luciferaacutezy a apyraacutezy Reakčnaacute zmes obsahuje aj ďalšie komponenty - enzymatickeacute substraacutety adenoziacutenfosfosulfaacutet (APS) d-luciferiacuten sekvenovanyacute templaacutet a cyklicky postupne po jednom type pridaacutevaneacute nukleotidtrifosfaacutety Po zabudovaniacute nukleotidu do novovznikajuacuteceho reťazca docircjde k uvoľneniu pyrofosfaacutetu naacutesledne je využityacute ATP sulfurylaacutezou na synteacutezu ATP z APS počas ďalšej reakcie docircjde k využitiu ATP luciferaacutezou na premenu luciferiacutenu na oxyluciferiacuten čo spocircsobiacute svetelnyacute signaacutel a ten zaznamenaacute detekčnyacute systeacutem Poslednou enzymatickou reakciou je reakcia apyraacutezy ktoraacute odstraacuteni nezainkorporovaneacute nukleotidy a nevyužiteacute ATP aby sa celyacute proces mohol zopakovať s reakčnou zmesou obsahujuacutecou ďalšiacute nukleotidtrifosfaacutet (inyacute ako v predchaacutedzajuacutecej reakcii) Po každej reakcii detektor zaznamenaacuteva emisiu svetla na zaacuteklade intenzity svetla je možneacute určiť či bol vradenyacute priacuteslušnyacute nukleotidtrifosfaacutet či bol inkorporovanyacute jeden priacutepadne viac rovnakyacutech nukleotidtrifosfaacutetov

Zvyacutešenie vyacutekonu pyrosekvenovania umožnila tzv emulznaacute PCR v mikročasticiach a použitie platničky PicoTiterPlatereg toto sekvenovanie zaviedla firma Roche pod pojmom 454 pyrosekvenovanie v roku 2005 Na začiatku sa DNA fragmentuje na uacuteseky dlheacute 400-600 baacutez dvojvlaacuteknovaacute fragmentovanaacute DNA sa liguje s adapteacutermi prostredniacutectvom nich sa naviaže na mikročastice dvojvlaacuteknoveacute fragmenty sa oddelia mikročastice s naviazanyacutemi jednovlaacuteknovyacutemi fragmentami sa premiešajuacute so zmesou oleja a roztoku ktoryacute obsahuje všetky komponenty na uacutespešnuacute PCR Tyacutemto spocircsobom sa okolo každej mikročastice vytvoriacute vlastnyacute mikroreaktor v ktorom prebehne amplifikaacutecia fragmentu Po PCR reakcii sa mikročastice prenesuacute do platničky PicoTiterPlate v ktorej sa do jamky zmestiacute akuraacutet jedna mikročastica a reakčneacute komponenty pyrosekvenačnej reakcie PicoTiterPlatereg maacute 1 600 000 jamiek každaacute jamka maacute maximaacutelny objem 75 picolitra Platnička s mikročasticami sa vložiacute do sekvenačneacuteho systeacutemu ndash priacutestroja v ktorom sa celeacute pyrosekvenovanie uskutočniacute Chemiluminiscenčneacute signaacutely ktoryacutech počas sekvenovania vznikajuacute milioacuteny v priebehu hodiny suacute zachyteneacute CCD kamerou a analyzovaneacute softveacuterom

Firma Illumina predstavila inuacute technoloacutegiu PCR amplifikaacutecia a sekvenovanie sa uskutočňuje na skliacutečku (flow cell) Fragmentaacutecia DNA a pripojenie adapteacuterov prebieha za uacutečasti transpozoacutemov v procese nazvanom tagmentaacutecia Po hybridizaacutecii fragmentov DNA na skliacutečko prebehne v klastroch PCR amplifikaacutecia (tzv mostiacutekovaacute amplifikaacutecia) sekvenaacutecia prebieha za uacutečasti rozdielne fluorescenčne značenyacutech a chemicky modifikovanyacutech nukleotidov pričom každyacute nukleotid emituje fluorescenciu s inou vlnovou dĺžkou Na skliacutečku prebieha paralelne až 6 miliaacuterd sekvenaacutecii (obr 32)

Ďalšiacutemi možnosťami sekvenovania druhej generaacutecie je systeacutem SOLid (vyvinutyacute firmou Applied Biosystem dnes pod Thermo Fisher Scientific) a Ion Semiconductor Sequencing ndash polovodičoveacute ioacutenoveacute sekvenovanie (od firmy Ion Semiconductor Sequencing v suacutečasnosti Thermo Fisher Scientific)

36

Obr 32 Princiacutep sekvenovania novej generaacutecie od firmy Illumina PCR amplifikaacutecia a sekvenovanie sa uskutočňuje na skliacutečku (flow cell) paralelne prebieha až 6 miliaacuterd sekvenaacutecii

632 Sekvenovanie tretej generaacutecie

Pred sekvenovaniacutem netreba amplifikovať DNA PCR metoacutedou ale sekvencia sa ziacuteskava zachyteniacutem signaacutelu v reaacutelnom čase Medzi sekvenovanie tretej generaacutecie patriacute SMRT (Single Molecule Real-Time Sequencing) a Nanopore Sequencing

37

7 Fragmentačnaacute analyacuteza DNA

Je metoacuteda použiacutevanaacute na určenie veľkosti fragmentov DNA ziacuteskanyacutech PCR reakciou Dĺžka amplifikovanyacutech DNA fragmentov sa zistiacute ich porovnaniacutem s veľkostnyacutem štandardom (obr 33) ktoryacute je tvorenyacute DNA fragmentami znaacutemej dĺžky Veľkostnyacute štandard je pred kapilaacuternou elektroforeacutezou zmiešanyacute so vzorkou DNA fragmenty veľkostneacuteho štandardu suacute fluorescenčne označeneacute pričom použiteacute fluorescenčneacute farbivo je ineacute ako fluorescenčneacute farbivo použiteacute na označenie DNA fragmentov vo vyšetrovanej vzorke

Obr 33 Elektroforetogram veľkostneacuteho štandardu použiacutevaneacuteho na určenie veľkostiacute fragmentov analyzovanyacutech kapilaacuternou elektroforeacutezou v genetickom analyzaacutetore (GeneScantrade 500 LIZtrade dye Size Standard) dĺžka fragmentov v nukleotidoch (napr 50 nukleotidov)

Fragmentačnaacute analyacuteza pozostaacuteva z viaceryacutech krokov Prvyacutem je izolaacutecia DNA nasleduje PCR amplifikaacutecia počas ktorej sa novosyntetizovaneacute DNA fragmenty označia fluorescenčnyacutemi farbivami Vzorka s PCR produktom sa pripraviacute na kapilaacuternu elektroforeacutezu tak že sa zmieša s veľkostnyacutem štandardom (sluacuteži na určenie veľkosti fragmentov) a denaturačnou laacutetkou (formamid) nasleduje denaturaacutecia Pripraveneacute vzorky suacute injektovaneacute do priacutestroja (genetickyacute analyzaacutetor) kde v kapilaacutere naplnenej polymeacuterom v elektrickom poli migrujuacute fluorescenčne značeneacute fragmenty DNA na zaacuteklade veľkosti (kapilaacuterna elektroforeacuteza) Počas elektroforeacutezy genetickyacute analyzaacutetor zaznamenaacuteva fluorescenciu fragmentov Analyacutezou daacutet prostredniacutectvom špeciaacutelnych softveacuterov sa ziacuteskajuacute elektroforetogramy z ktoryacutech je možneacute zistiť veľkosť fragmentov ako aj typ fluorescencie (docircležiteacute ak suacute genetickeacute varianty rozliacutešiteľneacute rocircznou fluorescenciou napr SNaPshot) Fragmentačnaacute analyacuteza je suacutečasťou množstva molekulaacuterno-genetickyacutech metoacuted (pozri obr 12 26 28 29 34) ako suacute napr STR analyacuteza (Short Tandem Repeat) AFLP analyacuteza (Amplified Fragment Lenght Polymorfism) RFLPT-RFLP analyacuteza (Restriction Fragment Lenght PolymorfismTerminal Restricted Fragment Lenght Polymorfism) SSCP (Single Strand Conformation Polymorfism) VNTR (Variable Number of Tandem Repeat) analyacuteza straty heterozygotnosti (LOH loss of heterozygozity) MLPA (Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification) MSMSA (Methylation-Sensitive Mobility Shift Assay) SNP genotypovanie (SNaPshotreg) HiCEP (High-Coverage Expression Profiling)

38

Obr 34 Kvantitatiacutevna fragmentačnaacute PCR analyacuteza (QF-PCR) DNA izolovanej z plodovej vody vyacutesledok prenataacutelnej analyacutezy = priacutetomnosť troch piacutekov pre chromozoacutem 18 (u všetkyacutech fragmentov detegujuacutecich chromozoacutem 18 je pomer vyšetrovanyacutech markerov aberantnyacute 21 resp 111) čo znamenaacute trizoacutemiu chromozoacutemu 18 Edwardsov syndroacutem

39

8 Metoacutedy založeneacute na princiacutepe hybridizaacutecie

Nukleoveacute kyseliny majuacute schopnosť vytvaacuterať dvojvlaacuteknoveacute reťazce z jednovlaacuteknovyacutech molekuacutel na zaacuteklade komplementarity baacutez Komplementarita baacutez umožňuje replikaacuteciu DNA transkripciu RNA komplementarita baacutez zabezpečuje teda reprodukovateľnosť živej hmoty

Hybridizaacutecia je proces v ktorom na zaacuteklade komplementarity baacutez dochaacutedza k vytvoreniu dvojvlaacuteknovej nukleovej kyseliny z dvoch jednovlaacuteknovyacutech molekuacutel DNA alebo RNA alebo ich kombinaacuteciou DNA RNA pričom kratšia jednovlaacuteknovaacute nukleovaacute kyselina vystupuje ako sonda (proacuteba) Hybridizaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten je jeden z najpoužiacutevanejšiacutech naacutestrojov v molekulaacuternej bioloacutegii a genetike (hybridizaacutecia primerov alebo proacuteb sa využiacuteva v takmer každej metoacutede - v PCR RT-PCR qPCR RT-qPCR MLPA sekvenovaniacute fragmentačnej analyacuteze FISH DNA mikročipoch atď)

Denaturaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten je proces pri ktorom dochaacutedza k porušeniu vodiacutekovyacutech vaumlzieb medzi vlaacuteknami nukleovyacutech kyseliacuten (strata sekundaacuternej a terciaacutelnej štruktuacutery) tak že docircjde k ich uacuteplneacutemu oddeleniu vzniknuacute jednovlaacuteknoveacute reťazce Denaturaacutecia NK mocircže byť spocircsobenaacute vplyvom vysokyacutech teplocirct pH alebo chemickyacutech laacutetok (denaturačneacute činidlaacute) Renaturaacutecia je opačnyacute proces v ktorom na zaacuteklade komplementarity dochaacutedza k tvorbe dvojvlaacuteknovyacutech NK

Hybridiza čnaacute sonda (proacuteba) je jednovlaacuteknovaacute nukleovaacute kyselina určitej znaacutemej dĺžky a sekvencie (najčastejšie DNA pretože je stabilnejšia ako RNA) ktoraacute je značenaacute a sluacuteži na detekciu komplementaacuternych molekuacutel DNA alebo RNA v procese hybridizaacutecie V zaacutevislosti od podmienok hybridizaacutecie (stringencia) mocircže byť detegovanaacute sekvencia uacuteplne komplementaacuterna alebo v menej priacutesnych podmienkach mocircže mať sekvenčneacute odchyacutelky Proacuteba sluacuteži na vyhľadanie a zviditeľnenie cieľovyacutech NK Zviditeľnenie sa deje prostredniacutectvom označenia proacuteby ešte pred hybridizaacuteciou Značenie proacuteby mocircže byť raacutedioaktiacutevne a neraacutedioaktiacutevne (najčastejšie fluorescenčneacute)

Raacutedioaktiacutevne značeneacute proacuteby pomocou izotopov (32P) sa využiacutevali viac v minulosti v suacutečasnosti suacute kvocircli zdravotnyacutem rizikaacutem ohľaduplnosti k životneacutemu prostrediu ako aj kvocircli jednoduchšej manipulaacutecii použiacutevaneacute fluorescenčne značeneacute proacuteby Raacutedioaktiacutevne značeneacute sondy boli použiacutevaneacute hlavne metoacutedou Southernovej hybridizaacutecie (Southern blotting Southern blot) Citlivosť raacutedioaktiacutevne značenyacutech proacuteb je vyššia dosahuje schopnosť zachytiť 10 fg (femtogram 10-15) cieľovej DNA sekvencie 81 Southern blot

Metoacutedu objavil v roku 1975 britskyacute bioloacuteg Edwin Southern (preto Southern) Pri Southernovej hybridizaacutecii sa restrikčne štiepeneacute fragmenty DNA elektroforeticky separujuacute v geacuteli potom sa metoacutedou blottingu prenesuacute na nylonovuacute alebo nitroceluloacutezovuacute membraacutenu kde suacute naacutesledne hybridizovaneacute v roztoku obsahujuacutecom raacutedioaktiacutevne značenuacute sondu Priloženiacutem fotografickeacuteho filmu k membraacutene a vyvolaniacutem filmu autoraacutediografiou docircjde k zviditeľneniu lokaliacutet kde došlo k hybridizaacuteciiacute raacutedioaktiacutevne značenej sondy s fragmentom DNA (autoraacutediogram) Southern blot bol kľuacutečovou a prvou metoacutedou na identifikaacuteciu osocircb (DNA fingerprinting DNA pofiling) (obr 35)

Okrem Southern blotu existuje Northern blot na analyacutezu RNA (geacutenovej expresie) a Western blot na analyacutezu proteiacutenov postup je obdobnyacute ako pri Southern blote s obmenami špecifickyacutemi pre konkreacutetny blot Pri Northern blote sa použiacutevajuacute hybridizačneacute proacuteby ale pre vizualizaacuteciu proteiacutenov western blotom je potrebneacute použiť protilaacutetky s naacuteslednou vizualizaacuteciou Pomenovanie techniacutek je hra so sloviacutečkami (keďže paacuten Northern ani Western neobjavili takto nazvaneacute techniky)

Neraacutedioaktiacutevne značenie proacuteb použiacutevanyacutech v molekulaacuternej genetike mocircže byť nepriame (použitie haptenu) alebo priame Konečnaacute vizualizaacutecia je najčastejšie zabezpečenaacute fluoreskujuacutecimi farebnyacutemi značkami farbivami fluorochroacutemami (fluorofoacuterami) Pri priamom značeniacute je farbička kovalentne naviazanaacute na nukleotid a na zachytenie fluorescencie suacute potrebneacute špeciaacutelne priacutestroje umožňujuacutece excitaacuteciu farbičky ktoraacute potom emituje žiarenie určitej vlnovej dĺžky (emisneacute žiarenie) a to zachytiacute detekčnyacute systeacutem priacutestroja Využitie fluorochroacutemov v molekulaacuternej genetike je masiacutevne napr na vizualizaacuteciu NK elektroforeticky separovanyacutech v geacuteli kvantifikaacuteciu produktov PCR reakcie v priacutestroji real-time PCR cykleacuter sekvenovaniacute fragmentačnej analyacuteze FISH DNA mikročipoch atď

40

Obr 35 Princiacutep Southern blotu

82 FISH (fluorescenčnaacute in situ hybridizaacutecia)

FISH (fluorescent in situ hybridization fluorescenčnaacute in situ hybridizaacutecia) metoacuteda patriacute medzi molekulovo-cytogenetickeacute techniky Princiacutep FISH metoacutedy je založenyacute na hybridizaacuteciiacute fluorescenčne značenyacutech proacuteb ku komplementaacuternym uacutesekom vyšetrovanej DNA na podložnom skle (priamo na mieste - in situ) K denaturaacutecii dsDNA dochaacutedza buď vplyvom denaturačnyacutech činidiel alebo zvyacutešenou teplotou a naacuteslednou renaturaacuteciou dochaacutedza k naviazaniu sondy na komplementaacuterny uacutesek DNA Vyacutesledok hybridizaacutecie sa vizualizuje fluorescenčnyacutem mikroskopom vybavenyacutem vhodnyacutemi fluorescenčnyacutemi filtrami a vizuaacutelne zhodnotiacute skuacutesenyacutem odborniacutekom Fluorescencia sa v niektoryacutech priacutepadoch mocircže zaznamenať a hodnotiť aj pomocou softveacuteru (obr 36)

Pomocou FISH detegujeme numerickeacute aberaacutecie - zmeny v počte chromozoacutemov (napr trizoacutemia monozoacutemia chromozoacutemov) alebo štruktuacuterne aberaacutecie a prestavby (napr translokaacutecie inverzie deleacutecie duplikaacutecie amplifikaacutecie) FISH metoacuteda umožňuje identifikaacuteciu a detekciu každeacuteho ľudskeacuteho chromozoacutemu jeho zaradenie do karyotypu odhalenie malyacutech submikroskopickyacutech chromozoacutemovyacutech zmien a tiež mapovať poziacutecie jednotlivyacutech geacutenov na chromozoacuteme

41

Obr 36 Princiacutep štandardnej FISH a FISH maľovania celeacuteho chromozoacutemu

Veľkou vyacutehodou FISH metoacutedy je možnosť analyacutezy buniek v metafaacuteze aj v interfaacuteze kedy nie je nutnaacute kultivaacutecia buniek a tiež ryacutechle analyzovanie veľkeacuteho počtu buniek (stovky až tisiacutece) K ďalšiacutem vyacutehodaacutem patriacute bezpečnosť vysokaacute citlivosť dostatočnaacute stabilita relatiacutevne kraacutetky čas hybridizaacutecie a možnosť ryacutechleho vyhodnotenia Hybridizaacutecia pri vaumlčšine suacutečasne dodaacutevanyacutech sond trvaacute 10-12 hodin (na trhu suacute už dostupneacute aj sondy so skraacutetenyacutem časom hybridizaacutecie na 2-3 hodiny) Po hybridizaacuteciiacute nasleduje odmyacutevanie kedy pri priacuteslušnej teplote dochaacutedza k odmytiu nenaviazanyacutech a nespraacutevne hybridizovanyacutech sond Preparaacutet sa naacutesledne podfarbiacute a vyacutesledok sa zhodnotiacute vo fluorescenčnom mikroskope Na podfarbenie chromozoacutemov alebo jadier sa použiacuteva modreacute kontrastneacute farbivo DAPI (46-diamidino-2-fenylindol) ktoreacute maacute silneacute fluorescenčneacute vlastnosti dokaacuteže prechaacutedzať jadrovou membraacutenou a viazať sa na DNA Vyacutesledkom je modreacute zafarbenie ktoreacute vyacuteborne kontrastuje so signaacutelmi jednotlivyacutech sond

Limitujuacutecim faktorom FISH je možnosť identifikaacutecie len tyacutech uacutesekov DNA ku ktoryacutem suacute použiteacute sondy V jednej analyacuteze je možneacute použiť najviac 3 odlišne značeneacute sondy a tak zistiť priacutepadneacute abnormality len na 1 alebo na paacuter lokusoch Na relevantnuacute detekciu je potrebneacute mať vo vzorke 1-5 aberantnyacutech interfaacutezovyacutech jadier

FISH je možneacute uskutočniť na širokej škaacutele biologickeacuteho materiaacutelu na vzorkaacutech perifeacuternej krvi kostnej drene naacuteteroch choriovyacutech klkoch plodovej vode rocircznych druhov tkaniacutev natiacutevnych alebo zaliatych v parafiacutene na 1 bunke (predimplantačnaacute genetickaacute diagnostika PGD) (obr 37)

Využiacuteva sa na detekciu aberaacuteciiacute pri mnohyacutech onkologickyacutech ochoreniach (napr pri diagnoacuteze mnohopočetnyacute myeloacutem sa v suacutečasnosti po separaacutecii CD138+ buniek robiacute FISH s 5 sondami pre geacuteny IGH TP53 RB1 oblasť 1p321q21 a stanovuje sa hyperploidia chromozoacutemov 5 9 a 15) a tiež k spresneniu doplneniu a k overeniu bežneacuteho cytogenetickeacuteho vyšetrenia

Podľa miesta na chromozoacuteme na ktorom dochaacutedza k hybridizaacutecii sondy rozlišujeme 4 typy

DNA sond bull centromeacuteroveacute sondy ndash sa viažu na strednuacute časť chromozoacutemu ndash centromeacuteru sluacutežia k diagnostike zmien v počte chromozoacutemov k detekcii chromozoacutemov neznaacutemeho pocircvodu umožňujuacute interfaacuteznu FISH na nedeliacich sa bunkaacutech (obr 38-41)

42

Obr 37 Interfaacutezna FISH preimplantačnyacute genetickyacute skriacutening aneuploidiiacute ndash blastomeacutera 3-denneacuteho ľudskeacuteho embrya s normaacutelnym počtom chromozoacutemov 13 18 21 pohlavie XY použityacutech 5 sond pre chromozoacutemy 13 ndash orange 18 ndash aqua 21 ndash green X ndash blue a Y ndash yellow (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

Obr 38 Interfaacutezne jadro po hybridizaacutecii s centromeacuterovou sondou pre chromozoacutem 8 (Vysis Abbott) V pravom jadre je priacutetomnaacute trizoacutemia chromozoacutemu 8 (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex) Obr 39 Metafaacutezna (A) a interfaacutezna FISH (B) použitaacute centromeacuterovaacute sonda CEPX spectrum orangeCEPY spectrum green (Vysis Abbott) Sonda hybridizuje k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (červenyacute signaacutel) a Y (zelenyacute signaacutel) (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

43

Obr 40 Interfaacutezna FISH vyšetrenie spermiiacute použiteacute sondy CEPX greenCEPY orange (Aneuscore Metasystems) Sondy hybridizujuacute k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (zelenyacute signaacutel) Y (červenyacute signaacutel) vľavo ndash dve haploidneacute spermie (majuacutece jedna spermia X druhaacute Y chromozoacutem) vpravo ndash dve patologickeacute spermie obsahujuacutece gonozoacutemovyacute komplement XY (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

Obr 41 Interfaacutezna FISH vyšetrenie spermiiacute použiteacute sondy CEPX greenCEPY orange a CEP18 aqua (Aneuscore Metasystems) Sondy hybridizujuacute k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (zelenyacute signaacutel) Y (červenyacute signaacutel) a 18 (modryacute signaacutel) vľavo ndash normaacutelne haploidneacute ľudskeacute spermie - 1x chromozoacutem X alebo Y a jedenkraacutet chromozoacutem 18 v strede ndash patologickaacute spermia obsahujuacuteca gonozoacutemovyacute komplement XY a jeden chromozoacutem 18 vpravo ndash patologickaacute diploidnaacute spermia s chromozoacutemami X Y a dvoma chromozoacutemami 18 (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

bull lokusovo špecifickeacute sondy ndash hybridizaacutecia prebehne na konkreacutetnom mieste geacutenu (lokuse) (obr 42-44) použiacutevajuacute sa k vyšetreniu mikrodeleacuteciiacute (straty malyacutech častiacute chromozoacutemu pri mikrodelečnyacutech syndroacutemoch) k zisteniu amplifikaacutecie onkogeacutenov a niektoryacutech špecifickyacutech translokaacuteciiacute prestavby geacutenov umožňujuacute interfaacuteznu FISH na nedeliacich sa bunkaacutech bull subtelomeroveacute ndash vaumlzba na koncoveacute časti chromozoacutemu ndash telomeacutery bull celochromozoacutemoveacute alebo celomaľovacie sondy ndash sondy hybridizujuacute s mnohopočetnyacutemi chromozoacutemovyacutemi sekvenciami pričom sa fluorescenčne tak bdquovymaľujeldquo celyacute chromozoacutem (Obr 45) Použiacutevajuacute sa na vyšetrenie chromozoacutemovyacutech prestavieb k analyacuteze translokaacuteciiacute a k detekcii pocircvodu tzv marker chromozoacutemov (malyacutech nadpočetnyacutech chromozoacutemov neznaacutemeho pocircvodu) K použitiu sondy suacute potrebneacute metafaacutezne chromozoacutemy nepoužiacutevaju sa pre interfaacuteznu FISH

Pri konvenčnej chromozoacutemovej FISH suacute homogeacutenne DNA proacuteby hybridizovaneacute s fixovanyacutem metafaacuteznym alebo prometafaacuteznym chromozoacutemomchromozoacutemami na skliacutečku (Obr 36a) Maximaacutelna rozlišovacia schopnosť metafaacuteznej FISH je niekoľko megabaacutez (Obr 39a 45) využitiacutem viac

44

natiahnutyacutech prometafaacuteznych chromozoacutemov sa dosiahne 1 Mb rozliacutešenie Prostredniacutectvom fiber FISH konkreacutetne artificiaacutelne deproteinizovanej natiahnutej DNA pripravenej in situ z celyacutech buniek na mikroskopickom skliacutečku je možneacute vizualizovať individuaacutelne geacuteny maleacute DNA elementy na chromozoacuteme s rozliacutešeniacutem okolo 1000 bp

Obr 42 Interfaacutezne jadro po hybridizaacutecii s lokusovo-špecifickou sondou LSI 5q31 Spectrum Orange5p12 Spectrum Green (Vysis Abbott) Na ľavom obraacutezku suacute priacutetomneacute dva červeneacute (5q31) a dva zeleneacute signaacutely (5p12) v pravom jadre je priacutetomnaacute deleacutecia 5q31 oblasti chyacuteba jeden červenyacute signal (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

Obr 43 Interfaacutezna FISH použitaacute lokusovo-špecifickaacute sonda ndash translokačnaacute - XL BCRABL1 plus (Metasystems) dvojfarebnaacute dvojfuacutezna kde červenaacute označuje lokus ABL1 na chromozoacuteme 9 a zelenaacute oblasť BCR na chromozoacuteme 22 Sonda deteguje fuacuteziu protoonkogeacutenu ABL1 (9q34) a geacutenu BCR (22q11) v priacutepade že červenyacute a zelenyacute signaacutel suacute pri sebe (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

45

Obr 44 Interfaacutezna FISH Použitaacute lokusovo-špecifickaacute sonda- typ break apart pre IGH geacuten V docircsledku translokaacutecie došlo k rozskočeniu geacutenu pričom translokačneacuteho partnera nepoznaacuteme vieme určiť len percento v koľkyacutech jadraacutech je geacuten prestavanyacute (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex) Obr 45 Použiteacute celochromozoacutemoveacute sondy WCP 15 (červenyacute chromozoacutem) a WCP 17 (zelenyacute chromozoacutem) Na metafaacuteze je potvrdenaacute reciprokaacute translokaacutecia t(1517)(q2221) (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

FISH vizualizaacutecia celeacuteho chromozoacutemu maľovanie chromozoacutemu anglicky chromosome

painting je špeciaacutelnou aplikaacuteciou chromozoacutemovej FISH proacuteba je koktail veľkeacuteho počtu rocircznych fluorescenčne značenyacutech DNA fragmentov hybridizujuacutecich pozdĺž celeacuteho konkreacutetneho chromozoacutemu (obr 36b 45) bdquoChromosomepaintingldquo analyzuje metafaacutezne chromozoacutemy V minulosti bola FISH vizualizaacutecia celyacutech chromozoacutemov limitovanaacute malyacutem množstvom rocirczne sfarbenyacutech fluorochroacutemov

V suacutečasnosti je možneacute detegovať množstvo cieľovyacutech sekvenciiacute naraz čo sa využiacuteva pri celogenoacutemovej chromozoacutemovej vizualizaacutecii (whole-chromosomepainting - WCP) metoacutedou multiplex FISH (M-FISH multicolor FISH o br 46) alebo spektraacutelnej karyotypizaacutecie (SKY) kedy možno rozliacutešiť všetky ľudskeacute chromozoacutemy ndash teda 24 rocircznych chromozoacutemov M-FISH a SKY patria medzi metafaacutezne formy FISH diagnostiky ktoreacute umožňujuacute simultaacutennu vizualizaacuteciu všetkyacutech ľudskyacutech chromozoacutemov v rocircznych farbaacutech čo predstavuje uľahčenie analyacutezy karyotypu hlavne pri komplexnyacutech zmenaacutech a markeroch neznaacutemeho pocircvodu Obe techniky vychaacutedzajuacute z použitia

46

celochromozoacutemovyacutech sond značenyacutech kombinaacuteciou viaceryacutech fluorochroacutemov Rozdiel medzi M-FISH a SKY spočiacuteva v technike ziacuteskania konečneacuteho obrazu

Obr 46 Multicolor FISH - každyacute chromozoacutemovyacute paacuter je zafarbenyacute inou farbou pričom na ich zafarbenie postačuje kombinaacutecia 5 fluorochroacutemov Na vyhodnocovanie je potrebnaacute špeciaacutelna sada fluorescenčnyacutech filtrov pre jednotliveacute fluorochroacutemy a špeciaacutelnyacute softweacuter Vľavo-štandardnyacute karyotyp vpravo karyotyp s mutaacuteciami (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

V molekulovej cytogenetike suacute komerčne dostupneacute sety M-FISH proacuteb umožňujuacutece

viacfarebneacute pruacutežkovanie chromozoacutemov (banding) s vysokyacutem rozliacutešeniacutem (multicolor-banding mBAND FISH MCB) čo umožňuje identifikaacuteciu intrachromozoacutemovyacutech prestavieb (Obr 47) Nevyhnutnosťou mBAND-u je mať chromozoacutemy v metafaacuteze Taacuteto metoacuteda bola prvyacutekraacutet uskutočnenaacute na chromozoacuteme 5 v roku 1999 mBAND FISH umožňuje rozliacutešiť špecifickeacute oblasti chromozoacutemov na uacuterovni pruacutežku - bandu a sub-bandu s detekciou 550 bandov haploidneacuteho karyotypu

Obr 47 A - mBAND chromozoacutemu 11 - inverzia duplikovanej oblasti 11q223-q25 B - mBAND chromozoacutemu 3 - na kruhovom chromozoacuteme deleacutecia oblasti 3p263 C - mBAND chromozoacutemu 2 - potvrdenie inverzie duplikovanej časti chromozoacutemu (poskytnuteacute RNDr Dagmar Landlovou Medirex)

FISH metoacuteda a jej varianty (M-FISH mBAND SKY) majuacute v suacutečasnosti širokeacute využitie v

klinickej genetike v onkologickej genetike na detekciu aberaacuteciiacute v čase diagnoacutezy počas liečby po

47

liečbe monitorovanie po transplantaacutecii kostnej drene v prenataacutelnej a postnataacutelnej diagnostike pri detekcii submikroskopickyacutech deleacuteciiacute (napr DiGeorge syndroacutem - 22q112 delečnyacute syndroacutem PraderndashWilli syndroacutem- chromozoacutem 15q11-13) prostredniacutectvom FISH je možnaacute detekcia numerickyacutech zmien chromozoacutemov (trizoacutemia chromozoacutemu 21 pri Downovom syndroacuteme trizoacutemia chromozoacutemu 15 pri Patauovom syndroacuteme trizoacutemia chromozoacutemu 18 pri Edwardsovom syndroacuteme) rocirczne zmeny v počte pohlavnyacutech chromozoacutemov (monozoacutemia X pri Turnerovom syndroacuteme Klinefelterov syndroacutem s X chromozoacutemom naviac - XXY) podobne v predimplantačnej diagnostike

83 DNA Microarray (DNA mikro čip biočip) DNA mikročipovanie je technika využiacutevajuacuteca hybridizaacuteciu skuacutemanej nukleovej kyseliny

(cieľovaacute vzorka) s veľkyacutem množstvom oligonukleotidovyacutech proacuteb (desať tisiacutec až milioacuten) ktoreacute suacute prichyteneacute na pevnyacute podklad najčastejšie sklenyacute silikoacutenovyacute alebo nylonovyacute (doštička čip) Skuacutemanaacute nukleovaacute kyselina je pred hybridizaacuteciou fragmentovanaacute označenaacute fluorofoacuterom a denaturovanaacute Po kontakte čipu s cieľovou vzorkou ktoraacute je vlastne zmes označenyacutech oligonukleotidov značeneacute oligonukleotidy hybridizujuacute s oligonukleotidovyacutemi sekvenciami prichytenyacutemi na čipe Potom suacute na zaacuteklade fluorescencie detekovaneacute miesta kde došlo k hybridizaacutecii čiže vzorka obsahovala takuacuteto nukleotidovuacute sekvenciu Z jedneacuteho mikročipu sa ziacuteska obrovskeacute množstvo daacutet ktoreacute je vždy nutneacute softveacuterovo spracovať V dnešnej dobe existuje niekoľko firiem poskytujuacutecich komerčne mikročipy na objednaacutevku alebo si ich laboratoacuteria produkujuacute sami

Mikročipovanie prebieha nasledovne

1) Vytvorenie DNA čipu ndash tisiacutece rocircznych jednovlaacuteknovyacutech DNA oligonukleotidov znaacutemych sekvencii sa kovalentne naviažu na povrch doštičky vždy v určitej lokalite je niekoľko rovnakyacutech oligonukleotidov veľkosť takejto lokality je ˂ 200 microm Proacutebami mocircže byť DNA cDNA alebo syntetizovaneacute oligonukleotidy Už hotoveacute mikročipy ponuacutekajuacute viacereacute firmy (Affymetrix Agilent Technologies Eppendorf Illumina) alebo si ich jednotliveacute laboratoacuteria vyraacutebajuacute sami pomocou robotickyacutech zariadeniacute DNA čip sa vytvaacutera buď nanaacutešaniacutem kvapiek oligonukleotidov na podklad alebo synteacutezou oligonukleotidov in situ na čipe 2) Priacuteprava vzorky ndash nukleovaacute kyselina (mRNA DNA) sa purifikuje určiacute sa jej kvantita a kvalita (spektrofotometericky) fragmentuje resp v priacutepade mRNA sa syntetizuje cDNA v priacutepade potreby sa mocircže DNA amplifikovať PCR reakciou štiepiť restrikčnyacutemi endonukleaacutezami 3) Fluorescenčneacute označenie (zriedkavejšie raacutedioaktiacutevne) fragmentov DNA prebieha počas reverznej transkripcie alebo PCR amplifikaacutecie za uacutečasti fluorescenčne značenyacutech nukleotidov Keď sa analyzujuacute dve rocirczne vzorky napr zdraveacute tkanivo a naacutedoroveacute tkanivo označenie nukleovyacutech kyseliacuten v tyacutechto tkanivaacutech byacuteva rozdielne a to použitiacutem dvoch rocircznych fluorescenčnyacutech farbiacutev (napr zeleneacute a červeneacute) Pred hybridizaacuteciou je potrebneacute vzorku denaturovať čiacutem sa vytvoriacute zmes jednovlaacuteknovyacutech DNA označenyacutech značkou 4) Hybridizaacutecia s mikročipom ndash v špeciaacutelnom hybridizačnom roztoku hybridizujuacute komplementaacuterne sekvencie zo vzorky s priacuteslušnyacutemi oligonukleotidovyacutemi sondami naviazanyacutemi na čipe Potom sa čip obmyje aby došlo k odstraacuteneniu čiastočne hybridizovanyacutech nukleovyacutech kyseliacuten 5) Skenovanie mikročipu ndash skenerom čipov docircjde k ožiareniu čipu laserom pričom v mieste hybridizaacutecie fluorescenčne značenyacutech DNA fragmentov s proacutebou docircjde k emisii svetla určitej vlnovej dĺžky ktoruacute skener zaznamenaacute 6) Analyacuteza daacutet prebieha metoacutedami bioinformatiky spracovaniacutem softveacutermi sa zistiacute ktoreacute lokality čipu navzaacutejom hybridizovali v priacutepade použitia dvoch vzoriek kontrolnej a skuacutemanej je možneacute analyzovať ich relatiacutevnu intenzitu hybridizaacutecie (expresie určiteacuteho geacutenu)

Existujuacute štyri typy mikročipov 1) Čipy ur čeneacute na analyacutezu expresie (obsahujuacute cDNA proacuteby) pre tzv dvojkanaacutelovyacute experiment kedy je vzorka určenaacute k hybridizaacutecii na čipe ziacuteskanaacute zmiešaniacutem DNA fragmentov kontrolnej a skuacutemanej vzorky pričom fragmenty suacute rozdielne fluorescenčne označeneacute (napr zelenyacute fluorofoacuter pre kontrolnuacute vzorku a červenyacute pre skuacutemanuacute) Na zaacuteklade intenzity a typu fluorescencie sa deteguje expresia geacutenov typickaacute pre kontrolnuacute vzorku (napr zelenaacute fluorescencia) pre skuacutemanuacute vzorku (napr

48

červenaacute fluorescencia) a expresia podobnaacute u oboch vzoriek (žltaacute fluorescencia) neexprimovaneacute geacuteny (čierna fluorescencia) rocirczne odtiene (v zaacutevislosti od prevažujuacutecej hybridizaacutecie) (obr 48) 2) Čipy ur čeneacute na analyacutezu mutaacutecii použije sa genoacutemovaacute DNA označenaacute jednou fluorescenčnou farbičkou na určenie jednonukleotidovej zmeny (SNP ndash Single Nukleotide Polymorphism) 3) Čipy na komparatiacutevnu genoacutemovuacute hybridizaacuteciu (aCGH array Comparative Genomic Hybridization) ndash použiacutevaneacute na zistenie zvyacutešenia alebo zniacuteženia množstva chromozoacutemovyacutech fragmentov obsahujuacutecich geacuteny zodpovedneacute za určiteacute ochorenie Na analyacutezu sa použije skuacutemanaacute gDNA a referenčnaacute (kontrolnaacute) DNA každaacute sa značiacute inou fluorescenčnou farbičkou (princiacutep ako pri analyacuteze expresie) (obr 49 50) 4) Čipy CGH - SNP kombinovaneacute čipy ur čeneacute na analyacutezu aj mutaacuteciiacute SNP aj na komparatiacutevnu genoacutemovuacute hybridizaacuteciu CGH

Mikročipy majuacute rozsiahle využitie napriacuteklad v identifikaacuteciiacute novyacutech geacutenov vo vyacuteskume ich funkciiacute expresie v rocircznych podmienkach pri diagnostike mnohyacutech ochoreniacute vo farmakogenomike vo vyacuteskume vplyvu toxiacutenov

Obr 48 Heatmapa geacutenovej expresie vybranyacutech geacutenov (mRNA) mikročip obsahuje 46000 cDNA proacuteb (poskytnuteacute Ing Helenou Gbelcovou PhD Uacutestav lekaacuterskej bioloacutegie genetiky a klinickej genetiky LF UK a UNB)

49

Obr 49 Princiacutep komparatiacutevnej genoacutemovej hybridizaacutecie (aCGH - array comparative genomic hybridization) Obr 50 A) Vyacutesledok komparatiacutevnej genoacutemovej hybridizaacutecie (aCGH - array comparative genomic hybridization) vzorky DNA izolovanej plodovej vody U plodu s abnormaacutelnym ultrasonografickyacutem vyšetreniacutem bola identifikovanaacute duplikaacutecia oblasti 3q261q29 (modryacute paacutes) a deleacutecia oblasti 5p1533p151 (červenyacute paacutes) Pre porovnanie chromozoacutem 1 bez aberaacutecie b) Ten istyacute pacient ale ineacute softveacuteroveacute spracovanie (poskytnuteacute RNDr Miroslavom Tomkom PhD Medirex)

50

Odporuacutečanaacute a použitaacute literatuacutera

Odborneacute knihy Klug W S Cummings M R Spencer Ch A Palladino M A Concepts of Genetics jedenaacuteste vydanie (2015) Carson S Molecular Biology Techniques tretie vydanie (2012) Strachan T Read A Human Molecular Genetics štvrteacute vydanie (2011) Sudbery P Sudbery I Human Molecular Genetics tretie vydanie (2009)

Internetoveacute straacutenky

wwwncbinlmnihgov wwwmlpacom wwwthermofishercom wwwilluminacom wwwpromegask wwwqiagencom wwwambioncom

Odborneacute člaacutenky Chacon-Cortes D Griffiths L R Methods for extracting genomic DNA from whole blood samples current perspectives Journal of Biorepository Science for Applied Medicine Volume 2 strany 1- 9 Viltrop T Krjutskov K Palta P Metspalu A Comparison of DNA extraction methods for multiplex polymerase chain reaction Anal Biochem 2010 Volume 398(2) strany 260-262 Ing Martin Čermaacutek Molekulaacuterna cytogenetika v problematike familiaacuternych maligniacutet Onkoloacutegia Volume 2 strany 77 - 83 Livak KJ Schmittgen TD Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method Methods 2001 Volume 25(4) strany 402 - 408 Bustin S A Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays J Mol Endocrinol 2000 Volume 25(2) strany169 - 193

MOLEKULAacuteRNE METOacuteDY AKTUAacuteLNE POUŽIacuteVANEacute V KLINICKEJ GENETIKE RNDr Andrea Pastoraacutekovaacute PhD RNDr Robert Petrovič PhD Vydala Univerzita Komenskeacuteho v Bratislave Lekaacuterska fakulta Rozsah 50 straacuten 246 AH prveacute vydanie ISBN 978-80-223-4231-5

6

najrelevantnejšiacutech vyacutesledkov je potrebneacute dodržať pracovneacute postupy pred počas a po RNA purifikaacutecii Pre optimalizaacuteciu RNA izolaacutecie a analyacutezy suacute docircležiteacute nasledovneacute kroky 1) manipulaacutecia so vzorkami určenyacutemi na RNA izolaacuteciu 2) vyacuteber metoacutedy izolaacutecie RNA 3) uskladnenie RNA

Klasickaacute izolaacutecia RNA prebieha vaumlčšinou v priacutetomnosti inhibiacutetorov ribonukleaacutez Ribonukleaacutezy (RNaacutezy) suacute bunkoveacute enzyacutemy degradujuacutece RNA Inhibiacutetory RNaacutez suacute silneacute denaturanty ktoreacute vo vzorke znižujuacute riziko RNA degradaacutecie (napr guanidiacutenoveacute soli dodecylsufaacutet sodnyacute - SDS chemikaacutelie obsahujuacutece fenol)

Pred vlastnou izolaacuteciou RNA je potrebneacute sterilizovať všetok materiaacutel (skuacutemavky špičky pipety vodu laboratoacuterny priestor) (obr 2) ktoryacute bude v kontakte so vzorkou určenou na izolaacuteciu RNA Kyacutem sa vzorka začne spracovaacutevať udržiava sa v tekutom dusiacuteku na suchom ľade alebo je vloženaacute do špeciaacutelnych stabilizačnyacutech roztokov (napr RNAlaterreg) alebo špeciaacutelnych skuacutemaviek so stabilizačnyacutem roztokom napr PAXgenereg Blood RNA Tube

Existuje niekoľko spocircsobov izolaacutecie RNA

1) Organickaacute extrakčnaacute metoacuteda je zlatyacutem štandardom izolaacutecie RNA Na začiatku izolaacutecie sa vzorka homogenizuje v roztoku obsahujuacutecom fenol (TRIzolreg RNAzolreg RT) naacutesledne sa centrifuguje Počas centrifugaacutecie dochaacutedza vo vzorke k separaacutecii troch vrstiev spodnej organickej faacutezy strednej faacutezy obsahujuacutecej denaturovaneacute proteiacuteny a genoacutemovuacute DNA a vrchnej vodnej faacutezy s RNA Po odobratiacute vrchnej faacutezy sa RNA z nej precipituje (vyzraacuteža) alkoholom a naacutesledne sa rehydratuje 2) Minikoloacutenovaacute metoacuteda (filtračnaacute) využiacuteva membraacuteny (zo sklenyacutech vlaacutekien silika alebo ioacutenomeničoveacute membraacuteny) vloženeacute do minikoloacuten Vzorka je lyzovanaacute v pufri obsahujuacutecom RNaacutezoveacute inhibiacutetory nukleoveacute kyseliny sa naviažu na membraacutenu keď lyzaacutet prechaacutedza membraacutenou počas centrifugaacutecie Membraacutena s naviazanou RNA je viackraacutet premyacutevanaacute RNA sa ziacuteska centrifugaacuteciou do novej skuacutemavky po eluacutecii vhodnyacutem elučnyacutem roztokom 3) Metoacuteda využiacutevajuacuteca magnetickeacute partikuly obsahujuacutece paramagnetickeacute vnuacutetro obklopeneacute obalom modifikovanyacutem tak aby viazal žiaduci objekt teda RNA Vzorka lyzovanaacute v roztoku obsahujuacutecom RNaacutezoveacute inhibiacutetory sa zmieša s magnetickyacutemi partikulami kedy docircjde k naviazaniu RNA na povrch magnetickyacutech partikuacutel Opakovanyacutem použitiacutem externeacuteho magnetickeacuteho poľa je možneacute vychytať magnetickeacute partikuly s naviazanou nukleovou kyselinou odstraacuteneniacutem magnetickeacuteho poľa zase uvoľniť a resupendovať v premyacutevaciacutech roztokoch Na zaacutever sa RNA uvoľniacute do elučneacuteho roztoku a magnetickeacute partikuly sa odstraacutenia 4) Priama lyacuteza sa použiacuteva na priacutepravu vzorky použitiacutem lyzačnyacutech roztokov ktoreacute lyzujuacute vzorku stabilizujuacute nukleoveacute kyseliny a takto pripravenaacute RNA mocircže byť použitaacute na ďalšie analyacutezy Priama lyacuteza teda nie je purifikačnaacute metoacuteda v pravom zmysle slova

Ziacuteskanuacute RNA je potrebneacute kvantifikova ť Ide o docircležityacute a nevyhnutnyacute krok ktoryacute predchaacutedza RNA analyacutezu Existujuacute viacereacute možnosti kvantifikaacutecie nukleovyacutech kyseliacuten ktoryacutem je venovanaacute samostatnaacute časť

Skladovanie RNA - RNA musiacute byť resuspendovanaacute resp eluovanaacute v roztoku bez RNaacutez na tento uacutečel suacute komerčne dostupneacute viacereacute roztoky na skladovanie RNA zabezpečujuacutece maximaacutelnu ochranu pred RNaacutezami RNA sa odporuacuteča skladovať pri teplote ndash 80degC v alikvoacutetoch (rozpipetovanaacute v menšiacutech množstvaacutech v mikroskuacutemavkaacutech) určenyacutech na jedno použitie

7

Obr 2 Laminaacuterny box na izolaacuteciu nukleovyacutech kyseliacuten praacutecu s DNA RNA atď Obr 3 Automatickyacute pipetovaciacute robot napr na izolaacuteciu 96 vzoriek DNA

8

2 Stanovenie kvantity a kvality nukleovyacutech kyseliacuten

Docircležiteacute je určenie koncentraacutecie a čistoty izolovanej DNA a RNA pretože analyacutezy ktoreacute nasledujuacute po izolaacutecii nukleovyacutech kyseliacuten často vyžadujuacute presneacute množstvo a čistotu nukleovyacutech kyseliacuten (NK bez priacutemesiacute) Metoacuted kvantifikaacutecie NK je niekoľko najpoužiacutevanejšie suacute spektrofotometrickaacute kvantifikaacutecia a kvantifikaacutecia UV fluorescenciou za priacutetomnosti farbičky

21 Spektrofotometrickaacute kvantifikaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten

Nukleoveacute kyseliny špecificky absorbujuacute ultrafialoveacute svetlo Vzorka s NK je v spektrofotometri (obr 6) vystavenaacute ultrafialoveacutemu svetlu o vlnovej dĺžke 260nm fotodetektor naacutesledne zmeria svetlo ktoreacute prejde vzorkou čiacutem viac svetla vzorka pohltiacute (absorbuje) tyacutem je vyššia koncentraacutecia nukleovej kyseliny vo vzorke Vyacutepočet koncentraacutecie NK zaacutevisiacute od toho či ide o DNA alebo RNA či je jednovlaacuteknovaacute alebo dvojvlaacuteknovaacute dsDNA c = A260002 [microgml] ssDNA c = A2600027 [microgml] RNA c = A2600025 [microgml]

Teda ak absorbancia dsDNA je 1 koncentraacutecia DNA vo vzorke je 50 microgml (pozn v priacutepade ak je draacuteha luacuteča 1cm)

Pokiaľ poznaacuteme sekvenciu napr pri synteacuteze primeru (ssDNA) mocircžeme z nej vypočiacutetať molekulovuacute hmotnosť a určiť priamo molaacuternu koncentraacuteciu nukleovej kyseliny (pmolmicrol) c = A260 lowast (100[15A + 071lowastC + 12lowastG + 084lowastT]) [pmolmicrol] A je počet adeniacutenov (v skutočnosti dATP) C je počet cytoziacutenov (dCTP) G je počet guaniacutenov (dGTP) a T počet tymiacutenov (dTTP)

Predpokladom pre spraacutevne určenie koncentraacutecie na zaacuteklade absorbancie je samozrejme čistota nukleovej kyseliny vo vzorke Čistota NK sa určuje podľa absorbčnej krivky popriacutepade zjednodušene na zaacuteklade pomeru absorbanciiacute pri 260 a 280 nm pretože proteiacuteny absorbujuacute svetlo vlnovej dĺžky 280nm Čistaacute DNA maacute pomer absorbanciiacute 260280 (A260280) pohybujuacutece sa okolo 18 čistaacute RNA maacute pomer absorbancii A260280 približne 2

Vzorku nukleovyacutech kyseliacuten mocircžu okrem proteiacutenov kontaminovať aj ďalšie laacutetky ako je fenol ktoryacute sa často využiacuteva pri izolaacutecii NK Takto izolovaneacute vzorky nukleovyacutech kyseliacuten nekontaminovaneacute fenolom by mali mať A260280 okolo 2 Ďalšie kontaminanty sa zisťujuacute absorbciou svetla pri 230 nm a 330 nm

22 Kvantifikaacutecia s použitiacutem fluorescenčnyacutech farbiacutev

Ďalšou možnosťou ako zmerať koncentraacuteciu nukleovyacutech kyseliacuten je zmeranie fluorescencie farbiva (napr etidiumbromid) ktoreacute sa viaže na nukleovuacute kyselinu a selektiacutevne svieti v priacutepade že je naviazaneacute na NK Metoacuteda využitia fluorescenčneacuteho farbiva naviazaneacuteho na NK sa použiacuteva v priacutepade ak je koncentraacutecia NK priacuteliš niacutezka na kvantifikaacuteciu spektrofotometrom ako aj v priacutepade že je NK kontaminovanaacute laacutetkou (kontaminantom) absorbujuacutecim svetlo vlnovej dĺžky 260nm 221 Využitie migraacutecie nukleovej kyseliny v geacuteli s jej naacuteslednou fluorescenčnou detekciou

Ak predpokladaacuteme niacutezku koncentraacuteciu NK na jej zistenie použijeme elektroforetickuacute

migraacuteciu NK v geacuteli (mocircže sa použiť agaroacutezovyacute alebo polyakrylamidovyacute geacutel) fluorescenčneacute farbivo je buď primiešaneacute do vzorky NK alebo priamo do geacutelu Spolu so vzorkou NK neznaacutemej koncentraacutecie migruje v geacuteli vo vedľajšej draacutehe vzorka NK so znaacutemou koncentraacuteciou Na zaacuteklade porovnania fluorescencie (po vystaveniacute geacutelu s NK svetlu o konkreacutetnej vlnovej dĺžke) vzorky so znaacutemou

9

koncentraacuteciu a vzorky neznaacutemej koncentraacutecie sa urobiacute odhad resp sa vyacutesledok kalkuluje počiacutetačovyacutem softveacuterom denzitometricky (obr 4)

222 Využitie kvantifikaacutecie množstva nukleovyacutech kyseliacuten použitiacutem real-time PCR metoacutedy

V priacutepade veľmi maleacuteho množstva NK ktoreacute nie je možneacute kvantifikovať ani geacutelovou elektroforeacutezou resp potrebujeme zistiť koncentraacuteciu NK veľmi presne u maleacuteho množstva NK (napr pre kriminalistiku) použije sa metoacuteda absoluacutetnej kvantifikaacutecie prostredniacutectvom real-time PCR (kvantifika čnej PCR qPCR) Princiacutep metoacutedy spočiacuteva v porovnaniacute amplifikaacutecie určiteacuteho uacuteseku nukleovej kyseliny vo vzorke neznaacutemej koncentraacutecii s amplifikaacuteciou tej istej sekvencie vo vzorke presne definovanej koncentraacutecie (obr 5) qPCR je možneacute kvantifikovať koncentraacuteciu raacutedovo v pgul 223 Kvantifikaacutecia fluorospektrofotometrom (fluori metrom)

Ak maacuteme dostatočneacute množstvo vzorky je možneacute na kvantifikaacuteciu použiť fluorospektrofotometer v tomto priacutepade je vzorka zmiešanaacute s fluorescenčnyacutem farbivom a je meranaacute emitovanaacute fluorescencia z ktorej sa vypočiacuteta koncentraacutecia

Moderneacute spektrofotometre a fluorimetre suacute konštruovaneacute tak aby na meranie bolo použiteacute minimaacutelne množstvo vzorky NK (napr pre priacutestroje NanoDrop je potrebnyacute len 05-1 microl vzorky) Pre porovnanie NanoDrop spektrofotometer (NanoDrop 2000c) je schopnyacute zmerať koncentraacutecie od 04 to 15 000 ngmicroL dsDNA NanoDrop fluorospektrometer 005 do 2000 pgmicroL Spektrofotometre a fluorofotometre suacute po meraniacute schopneacute vďaka softveacuteroveacutemu vybaveniu vypočiacutetať nielen koncentraacuteciu ale aj čistotu vzorky (httpwwwnanodropcom) Obr 4 Kvantifikaacutecia nukleovej kyseliny porovnaniacutem s fragmentom podobnej dĺžky a znaacutemej koncentraacutecie (po migraacutecii v agaroacutezovom geacuteli v jednosmernom elektrickom pruacutede a naacuteslednej fluorescenčnej detekcii) - odhad DNA v 3 draacutehe cca 100ng porovnaniacutem s 1000bp fragmentom štandardu molekulovyacutech hmotnostiacute (šmh)

10

Obr 5 Absoluacutetna kvantifikaacutecia DNA priacutestrojom real-time PCR cykleacuterom porovnaniacutem amplifikaacutecie uacuteseku DNA v skuacutemanej vzorke s amplifikaacuteciou vzorky so znaacutemou kvantitou Okrem amplifikaacutecie skuacutemanej vzorky je treba urobiť štandardnuacute krivku amplifikaacutecie vzorky znaacutemej koncentraacutecie z ktorej sa koncentraacutecia skuacutemanej vzorky odčiacuteta V kriminalistike sa bežne použiacuteva pridanie vnuacutetornej kontroly ku vzorke na určenie čistoty vzorky (v priacutetomnosti inhibiacutetorov nedocircjde k amplifikaacutecii žiadnej DNA) Vnuacutetornaacute kontrola je už priacutetomnaacute v kite čiže sa automaticky pridaacuteva pri priacuteprave vzoriek na qPCR amplifikaacuteciu sluacuteži na zistenie priacutetomnosti inhibiacutetorov v skuacutemanej vzorke teda v priacutepade že nedocircjde k amplifikaacutecii vo vzorke sluacuteži na rozliacutešenie či je koncentraacutecia DNA priacuteliš niacutezka alebo suacute vo vzorke priacutetomneacute inhibiacutetory Bežnaacute mediciacutenska molekulaacuterno-genetickaacute diagnostika nevyžaduje priacutetomnosť vnuacutetornej kontroly keďže nukleoveacute kyseliny suacute prevažne izolovaneacute kitmi z krvi čiže je zabezpečenaacute vysokaacute kvalita a čistota naizolovanej NK Obr 6 Spektrofotometer (NanoPhotometer) a ukaacutežka vyacutesledkou merania koncentraacutecie RNA izolovanej minikolonovou metoacutedou

11

3 PCR (polymeraacutezovaacute reťazovaacute reakcia)

Je metoacuteda vyvinutaacute v roku 1983 Karym Mullisom ocenenaacute v roku 1993 Nobelovou cenou za cheacutemiu Polymeraacutezovaacute reťazovaacute reakcia je založenaacute na schopnosti DNA polymeraacutezy syntetizovať noveacute vlaacutekno DNA podľa templaacutetoveacuteho vlaacutekna na zaacuteklade princiacutepu komplementarity DNA polymeraacuteza je schopnaacute pripaacutejať nukleotidy len k voľnej 3acuteOH skupine preto potrebuje primer (čiacutetaj prajmer) ku ktoreacutemu je schopnaacute pridaacutevať nukleotidy Primery suacute kraacutetke jednovlaacuteknoveacute oligonukleotidy ktoreacute umožňujuacute jednak DNA polymeraacuteze začať so synteacutezou noveacuteho vlaacutekna na druhej strane ohraničujuacute špecifickuacute oblasť ktoruacute chceme amplifikovať (namnožiť) Vyacutesledkom PCR reakcie je obrovskyacute počet koacutepii špecifickej sekvencie (obr 7) PCR v podstate napodobňuje replikaacuteciu DNA v in vitro podmienkach s rozdielom že nedochaacutedza k replikaacutecii celej DNA ale len vybraneacuteho primermi ohraničeneacuteho miesta

31 Najdocircležitejšie PCR komponenty

Templaacutetovaacute DNA je vzorka DNA obsahujuacuteca cieľovuacute sekvenciu Na začiatku reakcie docircjde pri vysokej teplote k denaturaacutecii a separaacutecii jednotlivyacutech vlaacutekien dvojvlaacuteknovej DNA

Enzyacutem DNA polymeraacuteza syntetizuje noveacute DNA vlaacutekno komplementaacuterne k cieľovej sekvencii Najčastejšie použiacutevanou a prvou DNA polymeraacutezou je Taq DNA polymeraacuteza (z termofilnej bakteacuterie Thermus aquaticus) zatiaľ čo Pfu DNA polymeraacuteza (z Pyrococcus furiosus) je preferovanaacute kvocircli tzv vysokej fidelite čo je schopnosť inkorporovať spraacutevnu baacutezu do novosyntetizovaneacuteho vlaacutekna DNA DNA polymeraacutezy musia mať dve vlastnosti schopnosť syntetizovať noveacute vlaacutekno DNA podľa templaacutetovej DNA a byť termostabilneacute čiže rezistentneacute na vysokeacute teploty (cca 100degC) V suacutečasnosti sa v laboratoacuteriaacutech často použiacutevajuacute rekombinantneacute polymeraacutezy s požadovanyacutemi vlastnosťami Napriacuteklad pre PCR ktorej produkt bude klonovanyacute je docircležiteacute použiť polymeraacutezu ktoraacute je schopnaacute opraviť vlastnuacute chybu v priacutepade inkorporaacutecie nespraacutevnej baacutezy pri synteacuteze noveacuteho reťazca Schopnosť opravovať nespraacutevne inkorporovaneacute baacutezy počas synteacutezy noveacuteho vlaacutekna DNA sa nazyacuteva tzv proofreading aktivita ktoraacute je zabezpečenaacute 3rarr5acute exonukleaacutezovou aktivitou takejto polymeraacutezy Pred vlastnou molekulaacuterno-genetickou diagnostikou je treba optimalizovať podmienky PCR reakcie pre konkreacutetnu DNA polymeraacutezu a pre špecifickeacute primery treba zistiť optimaacutelnu teplotu annealingu (hybridizaacutecie) primerov koncentraacutecie jednotlivyacutech zložiek PCR reakcie (napr MgCl2)

Primery suacute kraacutetke jednovlaacuteknoveacute DNA sekvencie komplementaacuterne k cieľovej sekvencii DNA polymeraacuteza začiacutena syntetizovať noveacute vlaacutekno z 3acutekonca primeru Docircležitou charakteristikou primerov je teplota topenia (Tm) t j teplota pri ktorej polovica DNA duplexov je disociovanaacute na jednovlaacuteknoveacute molekuly

Nukleotidy (dNTP deoxyribonukleotidtrifosfaacutety) suacute stavebneacute prvky pre novosyntetizovanuacute DNA molekulu

Veľmi praktickyacutem riešeniacutem pre molekulaacuterno-genetickeacute diagnostickeacute laboratoacuteria je tzv mastermix to je roztok v ktorom už je priacutetomneacute všetko potrebneacute pre priebeh PCR reakcie samozrejme okrem primerov a templaacutetovej DNA sekvencie PCR Master Mix (2X) od firmy ThermoFisher Scientific je jednyacutem z takyacutechto mixov obsahuje Taq DNA polymeraacutezu tlmivyacute roztok (pufor) MgCl2 a všetky deoxyribonukleotidy trifosfaacutety

Tabuľka č 1 uvaacutedza ako sa PCR reakcia z mastermixu pripravuje pre jednu vzorku Keďže v laboratoacuteriu sa zriedka robiacute PCR reakcia s jednou vzorkou treba si pripraviť tzv premix (tj PCR reakcie pre vaumlčšiacute počet vzoriek ale bez templaacutetovej DNA) ktoryacute sa rozdeliacute do mikroskuacutemaviek a až potom sa k nim pridaacute DNA resp cDNA

12

Tab 1 Priacuteprava PCR premixu

Celkovyacute objem jednej PCR reakcie 10 microl Počet vzoriek 8 2x PCR master mix 5 40

primer sense (10microM) 05 4

primer antisense (10microM) 05 4

H2O 35 28

DNA cDNA 05

rozpipetovať premix po 95microl do mikroskuacutemaviek až potom pridať do každej mikroskuacutemavky zvlaacutešť DNA cDNA

spolu objem 10 76

PCR amplif ikaacutecia je cyklickyacute proces pozostaacutevajuacuteci z troch krokov (obr 7) 1) denaturaacutecia dvojvlaacuteknovej DNA pri vysokej teplote (95degC) 2) hybridizaacutecia (annealing) primerov k špecifickej sekvencii DNA pri teplote vhodnej pre konkreacutetne primery 3) polymerizaacutecia (synteacuteza) novyacutech vlaacutekien DNA (72degC)

Obr 7 Princiacutep PCR

Tieto tri kroky sa opakujuacute 25 ndash 40 kraacutet pričom pri každom cykle sa počet molekuacutel zdvojnaacutesobiacute (vyacuteslednyacute počet cieľovej sekvencie je 2n+1 ak na začiatku bola jedna dvojvlaacuteknovaacute DNA a počet cyklov je n) PCR prebieha v termaacutelnom cykleacuteri (teplotnom cyklovači) je to priacutestroj (obr 8) kde je možneacute vykonať a naprogramovať celyacute termaacutelny priebeh PCR reakcie Tabuľka č 2 je priacutekladom termaacutelneho programu pre konkreacutetnu PCR reakciu

Po PCR reakcii je vyacuteslednyacute produkt možneacute vizualizovať elektroforeticky resp použiť na ďalšiu analyacutezu

13

Tab 2 Priacuteklad klasickeacuteho teplotneacuteho a časoveacuteho profilu PCR PCR Teplota Čas Opakovanie

95degC 2 minuacutety

95degC 15 sekuacutend

66degC 60 sekuacutend 30x

72degC 60 sekuacutend

72degC 5 minuacutet

Obr 8 Termaacutelny cykleacuter v procese a otvorenyacute s mikroskuacutemavkami

32 Variaacutecie PCR

Hot-start PCR využiacuteva DNA polymeraacutezu ktoruacute je treba aktivovať vysokou teplotou (napr 95degC 10 minuacutet) Vyacutehodou použiacutevania hot-start polymeraacutez je možnosť pracovať pri laboratoacuternej teplote keďže polymeraacuteza je pri bežnej teplote neaktiacutevna a tyacutem nemocircže docircjsť k vzniku nešpecifickyacutech produktov

Touchdown PCR maacute v počiatočnyacutech cykloch vyššiu teplotu annealingu (uacutečelom je zvyacutešiť

špecificitu PCR produktov na začiatku PCR) neskocircr sa teplota annealingu zniacuteži čo maacute za naacutesledok vyššiacute vyacuteťažok PCR produktu

Nested PCR maacute dva kroky a potrebuje dva paacutery primerov V prvom kroku sa prostredniacutectvom

prvej sady primerov amplifikuje dlhšiacute DNA fragment Ten sa použije ako templaacutet v druhom kroku s druhou sadou primerov s vyacuteslednyacutem kratšiacutem DNA produktom Nested PCR zvyšuje špecifickosť a citlivosť diagnostickyacutech PCR

Multiplex PCR je vlastne viac PCR reakciiacute prebiehajuacutecich v jednej skuacutemavke suacutečasne

V reakčnej zmesi je viac paacuterov primerov suacutečasne prebehne amplifikaacutecia viaceryacutech uacutesekov DNA takto dochaacutedza k šetreniu vzorky reakčnej zmesi a pracovneacuteho času

14

Real-time PCR je venovanaacute špeciaacutelna časť v skriptaacutech Sluacuteži na kvantifikaacuteciu PCR produktu v reaacutelnom čase na zaacuteklade merania fluorescencie okrem kvantifikaacutecie je využiacutevanaacute aj na určenie genotypov

RT-PCR je variaacutecia PCR umožňujuacuteca amplifikaacuteciu DNA sekvencie z vyacutechodiskovej RNA

sekvencie Najskocircr musiacute prebehnuacuteť prepis RNA do jednovlaacuteknovej cDNA prostredniacutectvom reverznej transkriptaacutezy naacutesledne sa cDNA použije pre PCR Selektiacutevnym použitiacutem primerov pri reverznej transkripcii mocircžeme uacutečelovo prepiacutesať buď celkovuacute RNA (primery - random hexameacutery) alebo len mRNA (primery - oligoT)

Alelovo-špecifickaacute PCR (AS-PCR) (obr 9) sluacuteži na detekciu konkreacutetnych mutaacuteciiacute

a jednonukleotidovyacutech polymorfizmov (SNP) Použije sa sada 3 primerov v dvoch kombinaacuteciaacutech PCR reakciiacute dva primery majuacute odlišnuacute sekvenciu na 3acute-koncoch jeden na detekciu wt (wild type) a druhyacute primer na detekciu mutantnej alely reakcia neprebehne ak miesto na templaacutetovej DNA nie je komplementaacuterne k 3acute-koncu primeru pretože DNA polymeraacuteza vyžaduje uacuteplnuacute hybridizaacuteciu primera na 3acute-konci Takto je možneacute rozliacutešiť priacutetomnosť štandardnej (wildtype ndash wt) a mutantnej alely resp SNP (obr 9) AS-PCR je znaacutema aj pod ďalšiacutemi naacutezvami ASO-PCR (allele-specific oligonucleotide PCR) ARMS (amplification-refractory mutation system)

Obr 9 Alelovo-špecifickaacute PCR (AS-PCR)

Mutageneacuteza prostredniacutectvom PCR (site directed mutagenesis) sa použiacuteva keď je potrebneacute vytvoriť mutaacuteciu v špecifickom mieste geacutenu primerprimery majuacute modifikovanuacute sekvenciu tak že obsahujuacute mutaacuteciu v strednej časti čo neovplyvniacute hybridizaacuteciu primerov s templaacutetovou DNA pričom vyacutesledkom je PCR produkt s cielene mutovanou DNA sekvenciou

Asymetrickaacute PCR sa použiacuteva na synteacutezu koacutepiiacute jedneacuteho vlaacutekna z templaacutetovej DNA a to

použitiacutem veľmi niacutezkej koncentraacutecie jedneacuteho primeru Sekvenačnaacute PCR je PCR v ktorej je použityacute len jeden primer a v reakčnej zmesi suacute okrem

všetkyacutech dNTP priacutetomneacute dideoxynukleotidtrifosfaacutety (ddNTP) značeneacute raacutedioaktiacutevne dnes však prevažne fluorescenčne každyacute typ ddNTP inou fluorescenčnou farbičkou Zaradenie niektoreacuteho zo štyroch ddNTP spocircsobiacute terminaacuteciu (zastavenie) predlžovania DNA reťazca fluorescenčneacute označenie ddNTP umožniacute detekciu dĺžky fragmentu a určenie sekvencie posledneacuteho nukleotidu Vyacuteslednyacute produkt sekvenačnej PCR sluacuteži na sekvenovanie Sekvenovaniu sa venuje samostatnaacute časť

MLPA (multiplex ligation-dependent probe amplification) ndash multiplexnaacute amplifikaacutecia proacuteb zaacutevislaacute od ligaacutecie je variaacutecia multiplexnej PCR umožňujuacuteca namnoženie viaceryacutech uacutesekov DNA za použitia iba jedneacuteho paacuteru primerov avšak s podmienkou vytvorenia sekvenčne špecifickej proacuteby ligaacuteciou sekvenčne špecifickyacutech oligonukleotidov MLPA je metoacuteda umožňujuacuteca detekciu počtu koacutepiiacute

15

až 50 nukleotidovyacutech sekvenciiacute v jednej reakcii Pomocou MLPA je možneacute ryacutechlo identifikovať amplifikaacutecie a deleacutecie veľkeacuteho počtu geacutenov či už z DNA alebo mRNA okrem toho MLPA mocircže byť použitaacute na analyacutezu CpG-metylaacutecie (MS-MLPA) Viac informaacutecii v samostatnej časti

SNaPshotreg Multiplex nazyacutevaneacute aj minisekvenovanie je multiplexnaacute reakcia v ktorej je každyacute primer predĺženyacute iba o jeden nukleotid (obr 10) V reakčnej zmesi nie suacute priacutetomneacute deoxyribonukleotidtrifosfaacutety ale len dideoxyribonukleotidtrifosfaacutety (ddATP ddCTP ddGTP ddTTP) každyacute označenyacute inou fluorescenčnou farbičkou Po integraacutecii ddNTP do DNA vlaacutekna je polymerizaacutecia ukončenaacute Jednovlaacuteknoveacute fragmenty (primery) predĺženeacute presne o jeden ddNTP suacute separovaneacute kapilaacuternou elektroforeacutezou v genetickom analyzaacutetore pričom je detegovanaacute ich fluorescencia a dĺžka (obr 11) Z vyacutesledneacuteho elektroforetogramu (obr 12) je možneacute určiť v jednej reakcii sekvenciu vo viac ako v 10 lokalitaacutech určiteacuteho fragmentu DNA SNaPshot Multiplex sa v molekulaacuterno-genetickom laboratoacuteriu využiacuteva na ryacutechlu detekciu viaceryacutech najčastejšie sa vyskytujuacutecich mutaacuteciiSNP geacutenu

Obr 10 Priacuteklad využitia metoacutedy SnaPshot s použitiacutem sady 13 primerov ktoreacute sa predĺžia len o 1 značenyacute dideoxynukleotid SNaPshot najčastejšiacutech mutaacuteciiacute geacutenu pre 21-hydroxylaacutezu (CYP21A2) ktoreacute spocircsobujuacute kongenitaacutelnu adrenaacutelnu hyperplaacuteziu A T G a C predstavujuacute fluorescenčne značeneacute dideoxynukleotidy

Obr 11 Vyacutesledok analyacutezy DNA pacienta metoacutedou minisekvenovania SnaPshot konkreacutetne použitiacutem sady 13 primerov rozlišujuacutecich najčastejšie bodoveacute mutaacutecie geacutenu pre 21-hydroxylaacutezu (CYP21A2) analyacutezou sa zistila mutaacutecia V281L v heterozygotnom stave (dva fragmenty modryacute a červenyacute)

16

Obr 12 SNaPshot analyacuteza geacutenu CYP21A2 u DNA izolovanej z plodovej vody metoacuteda deteguje najčastejšie bodoveacute mutaacutecie geacutenu pre 21-hydroxylaacutezu vyacutesledok prenataacutelnej analyacutezy = priacutetomnosť mutaacutecie In2G v hemizygotnom stave (keďže qPCR metoacutedou bola u plodu zistenaacute priacutetomnosť len jednej koacutepie geacutenu CYP21A2)

33 Kvantitatiacutevna PCR (qPCR)

Polymeraacutezovou reťazovou reakciou (PCR) docielime namnoženie (amplifikaacuteciu) určiteacuteho DNA uacuteseku (templaacutetu) PCR je katalyzovanaacute DNA polymeraacutezou za priacutetomnosti primerov dNTPs dvojmocnyacutech katioacutenov (ako Mg+2) a pufrovacieho roztoku

Real-time PCR ktoraacute je nazyacutevanaacute aj kvantitatiacutevna PCR (qPCR) umožňuje vizualizaacuteciu a kvantifikaacuteciu amplifikaacutecie DNA v reaacutelnom čase to je tak ako to bežiacute počas PCR qPCR využiacuteva fluorescenčneacute chemikaacutelie (farbivaacute) ktoryacutech emitovanuacute fluorescenciu zaznamenaacuteva optickyacute systeacutem počas každeacuteho PCR cyklu zaznamenanaacute fluorescencia je naacutesledne softveacuterovo spracovanaacute a vyhodnotenaacute

V suacutečasnosti sa využiacutevajuacute dva typy qPCR cheacutemie a to farbivaacute viažuce sa na DNA a fluorescenčne značeneacute proacuteby (obr 13)

Farbivaacute viažuce sa na DNA emitujuacute fluorescenciu v priacutepade ak suacute naviazaneacute na dvojvlaacuteknovuacute DNA proacuteby fluoreskujuacute v priacutepade keď molekula zhaacutešača (angl quencher - Q) sa nenachaacutedza v bliacutezkosti molekuly reporteacutera (R) napr hydrolyzujuacutece proacuteby fluoreskujuacute keď je molekula reporteacutera (R) prostredniacutectvom 5acuteexonukleaacutezovej aktivity DNA polymeraacutezy odstraacutenenaacute z bliacutezkosti molekuly zhaacutešača (Q)

Grafickyacute priebeh real ndash time PCR znaacutezorňuje amplifika čnaacute krivka (angl amplification plot) (obr 14) majuacuteca 4 faacutezy 1) Faacuteza I ndash dochaacutedza k zdvojnaacutesobeniu množstva amplikoacutenu po každom cykle ale naacuterast fluorescencie je pod detekčnyacutem limitom zaznamenaacutevanaacute fluorescencia (baseline) zodpovedaacute zaacutekladnej fluorescencii pozadia tzv šumu

17

2) Faacuteza II nazyacutevanaacute aj exponenciaacutelna faacuteza v ktorej sa fluorescencia zvyacuteši na uacuteroveň optickej detekcie bod resp cyklus kedy začiacutena exponenciaacutelna faacuteza je kľuacutečovyacute na určenie kvantity vstupneacuteho množstva templaacutetovej DNA nazyacuteva sa prahovyacute cyklus označuje sa Ct (angl treshold cycle) alebo Cq (quantification) Čiacutem nižšie je Ct (Cq) tyacutem vaumlčšiacute počet koacutepiiacute templaacutetovej DNA bolo v reakcii Ct hodnota je teda hlavnyacute uacutedaj s ktoryacutem sa pracuje vo vyacutepočtoch fluorescencia v tomto mieste sa nazyacuteva prahovaacute resp treshold 3) Faacuteza III - lineaacuterna faacuteza ndash charakterizuje ju postupneacute spotrebovaacutevanie komponentov reakcie na narastajuacutece množstvo amplikoacutenu 4) Faacuteza IV - plateau (čiacutetaj platoacute) ndash množstvo amplikoacutenu sa v docircsledku vyčerpania zložiek qPCR už nezvyšuje

Obr 13 Princiacutep real-time PCR Obr 14 Faacutezy real-time PCR

Ako štandardnaacute PCR aj qPCR maacute tri zaacutekladneacute kroky 1) Denaturaacutecia dvojvlaacuteknovej DNA na jednovlaacuteknovuacute DNA pri vysokej teplote (obyčajne 95degC) 2) Hybridizaacutecia primerov (annealing) ndash komplementaacuterne sekvencie sa spolu hybridizujuacute 3) Polymerizaacutecia pri 70-72degC kedy v docircsledku optimaacutelnej aktivity DNA polymeraacutezy dochaacutedza k predĺženiu primeru až o 100 baacutez za sekundu

18

Real-time PCR (obr 15) sa využiacuteva na kvantifikaacuteciu expresie geacutenov určenie počtu koacutepiiacute geacutenov určenie genotypu (genotypovanie) alelovou diskriminaacuteciou alebo analyacutezou krivky topenia tzv high resolution melt a multiplexnuacute real time PCR s možnosťou detekcie viaceryacutech cieľovgeacutenov

Multiplexnaacute real-time PCR sa využiacuteva na detekciu viaceryacutech cieľovgeacutenov v jednej reakcii suacutečasne Vyacutehodou multiplexovania je jednak uacutespora vzorky ako aj ziacuteskanie vaumlčšieho množstva informaacuteciiacute z rovnakeacuteho množstva materiaacutelu Nevyhnutnosťou multiplexnej qPCR suacute proacuteby značeneacute rocircznymi fluorescenčnyacutemi farbivami

Najdocircležitejšie zložky qPCR (real-time PCR komponenty) suacute DNA polymeraacuteza (reverznaacute transkriptaacuteza v priacutepade jednokrokovej kvantitatiacutevnej RT-PCT) dNTPs primery resp primeryproacuteby dvojmocneacute Mg templaacutet Na uľahčenie qPCR suacute v suacutečasnosti už komerčne dostupneacute takeacute reakčneacute zmesi ku ktoryacutem stačiacute pridať už len templaacutet (napr kity využiacutevajuacutece TaqManProacuteby) alebo kity s fluorescenčnyacutemi farbami viažucimi sa na dvojvlaacuteknovuacute DNA ku ktoryacutem sa do reakčnej zmesi okrem templaacutetu pridajuacute primery

Obr 15 Real-time PCR cykleacuter

331 Kvantifikaacutecia pomocou qPCR

Na kvantifikaacuteciu DNA pomocou qPCR sa požiacutevajuacute dve zaacutekladneacute metoacutedy - absoluacutetna kvantifikaacutecia a relatiacutevna kvantifikaacutecia

Absoluacutetna kvantifikaacutecia vychaacutedza zo štandardnej krivky (obr 16) ktoraacute sa ziacuteska po qPCR seacuterie riedeniacute DNA znaacutemej koncentraacutecie Kvantifikaacutecia neznaacutemej vzorky sa zistiacute interpolaacuteciou (odčiacutetaniacutem) Ct neznaacutemej vzorky zo štandardnej krivky (obr 16 17) Využiacutevaneacute napr v kriminalistike na stanovenie koncentraacutecie DNA vo vzorke

Relatiacutevna kvantifikaacutecia (obr 18 19) porovnaacuteva uacuteroveň expresie určiteacuteho geacutenu vo vzorke k expresii toho isteacuteho geacutenu v referenčnej (kontrolnej) vzorke alebo množstvo určiteacuteho geacutenu (počet koacutepiiacute) vo vzorke porovnaniacutem s množstvom geacutenu v kontrolnyacutech vzorkaacutech V raacutemci každej vzorky musiacute pred relatiacutevnou kvantifikaacuteciou docircjsť k tzv normalizaacutecii t j porovnanie expresie sledovaneacuteho geacutenu k expresii referenčneacuteho geacutenu (najčastejšie niacutem byacuteva tzv bdquohousekeepingldquo geacuten napr GAPDH aktiacuten tubuliacuten)

V priacutepade kvantifikaacutecie expresie určiteacuteho geacutenu metoacutedou real-time PCR (RT-qPCR) pred samotnou kvantifikaacuteciou cDNA musiacute byť taacuteto cDNA nasyntetizovanaacute prostredniacutectvom reverznej

19

transkripcie za použitia enzyacutemu reverznej transkriptaacutezy Kvantitatiacutevna PCR s reverznou transkripciou RT-qPCR mocircže byť dvojkrokovaacute alebo jednokrokovaacute Pri dvojkrokovej RT-qPCR treba pred qPCR syntetizovať cDNA vlaacutekno z RNA pomocou reverznej transkriptaacutezy - 1 krok druhyacutem krokom je samotnaacute real-time PCR Jednokrokovaacute RT-qPCR umožňuje uskutočniť obidve reakcie reverznuacute transkripciu a kvantitatiacutevnu PCR v jednej skuacutemavke čo zjednodušuje qPCR a redukuje možnosť kontaminaacutecie Obr 16 5-bodovaacute štandardnaacute krivka (amplifikaacutecia piatich koncentraacuteciiacute jednej vzorky konkreacutetne ide o 10-tkoveacute riedenie)

Obr 17 Ukaacutežka amplifikačnyacutech kriviek riedenia a z nich ziacuteskanej štandardnej krivky poukazuje na vysokuacute presnosť metoacutedy RT-PCR

20

Obr 18 Relatiacutevna kvantifikaacutecia - určenie počtu koacutepiiacute geacutenu CYP21A2 vo vzorke DNA izolovanej z perifeacuternej krvi pacientov mutaacutecie v geacutene CYP21A2 spocircsobujuacute kongenitaacutelnu adrenaacutelnu hyperplaacuteziu (CAH) Vyacutesledok analyacutezy všetci pacienti majuacute dve koacutepie geacutenu

Obr 19 Relatiacutevna kvantifikaacutecia - určenie počtu koacutepiiacute geacutenu CYP21A2 vo vzorke DNA izolovanej z plodovej vody mutaacutecie v geacutene CYP21A2 spocircsobujuacute kongenitaacutelnu adrenaacutelnu hyperplaacuteziu (CAH) Prenaacutetalnou diagnostikou (qPCR) sa zistila priacutetomnost jednej koacutepie CYP21A2 geacutenu 332 Určenie genotypu metoacutedou alelovej diskriminaacutecie a analyacutezou krivky topenia (HRM)

Určenie genotypu metoacutedou alelovej diskriminaacutecie (obr 20) sa uskutočňuje použitiacutem hydrolyzujuacutecich proacuteb (sond) je veľmi ryacutechla a senzitiacutevna (presnaacute) metoacuteda frekventovane využiacutevanaacute v laboratoacuteriaacutech Dva variantyalely suacute vyšetreneacute suacutečasne v jednej vzorke a v jednej reakčnej

21

skuacutemavke V reakcii suacute použiteacute dve proacuteby označeneacute rozdielnymi fluorescenčnyacutemi farbičkami emitujuacutecimi svetlo o rocircznej vlnovej dĺžke (najčastejšie jedna označenaacute FAM farbičkou a druhaacute proacuteba označenaacute VIC farbičkou) Počas amplifikaacutecie amplikoacutenu dochaacutedza k odstraacuteneniu zhaacutešača z bliacutezkosti farbičky ktoraacute potom emituje svetlo priacuteslušnej vlnovej dĺžky Vzorky so signaacutelom len jednej fluorescenčnej farbičky (FAM) a bez signaacutelu druhej farbičky (VIC) suacute homozygoti pre alelu 1 vzorky so signaacutelom len druhej farbičky (VIC) a bez signaacutelu prvej (FAM) suacute homozygoti pre alelu 2 v priacutepade ak vyšetrovanaacute vzorka bdquosvietildquo obidvoma farbami jednaacute sa o heterozygota

Obr 20 Určenie genotypu metoacutedou alelovej diskriminaacutecie ndash amplifikačnaacute krivka vzoriek DNA majuacutecich tri rocirczne genotypy A ndash jednotliveacute vzorky (plnaacute čiara predstavuje štandardnuacute alelu guličkovanaacute mutovanuacute alelu) B ndash 72 vzoriek C ndash scatter plot 72 vzoriek

Určenie genotypu analyacutezou krivky topenia tzv high resolution melt (HRM) (obr 21) umožňuje detekciu takmer všetkyacutech genetickyacutech variaacuteciiacute (SNP mutaacuteciiacute) Keďže taacuteto metoacuteda okrem štandardnyacutech podmienok reakcie vyžaduje len primery a farbičku (nie proacuteby) je veľmi jednoduchaacute a lacnejšia Po amplifikaacuteciiacute treba amplikoacuten pomaly zohrievať až kyacutem nedocircjde k denaturaacuteciiacute Teplota topenia amplikoacutenu vo vzorke zaacutevisiacute od DNA sekvencie čo umožňuje detegovať priacutetomnosť mutaacutecie resp SNP Tvar vyacuteslednyacutech kriviek topenia určuje teda genotyp

22

Obr 21 Určenie genotypu analyacutezou krivky topenia tzv metoacutedou high resolution melting (HRM) A ndash krivka topenia vzoriek DNA majuacutecich tri rocirczne genotypy B ndash graf rozdielnosti krivky topenia vzoriek DNA majuacutecich tri rocirczne genotypy

23

4 Elektroforetickaacute separaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten

Separaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten predstavuje rozdelenie molekuacutel DNA alebo RNA na zaacuteklade veľkosti zloženia a poradia baacutez Podobnyacutemi metoacutedami je možneacute separovať aj proteiacuteny

Elektroforeacuteza (ELFO) je technika použiacutevanaacute na separaacuteciu niekedy aj purifikaacuteciu makromolekuacutel ako suacute nukleoveacute kyseliny a proteiacuteny na zaacuteklade ich rozdielnej veľkosti naacuteboja alebo konformaacutecie Je to metoacuteda veľmi často využiacutevanaacute nielen v molekulovej genetike ale aj biocheacutemii Elektroforeacuteza využiacuteva schopnosť nabityacutech molekuacutel migrovať v jednosmernom elektrickom poli k opačneacutemu poacutelu Nukleoveacute kyseliny majuacute vďaka svojej fosfaacutetovej zložke negatiacutevny naacuteboj preto v jednosmernom elektrickom poli migrujuacute ku kladneacutemu poacutelu čiže k anoacutede Elektroforeacuteza prebieha v elektroforetickej aparatuacutere v geacuteloch (v nosiči) so sieťovitou štruktuacuterou ktoraacute umožňuje separaacuteciu molekuacutel Vzorka nukleovej kyseliny zmiešanaacute s tzv nanaacutešaciacutem tlmivyacutem roztokom s farbičkou sa nanesie do jamky v geacuteli ktoryacute je umiestnenyacute v elektroforetickej aparatuacutere v priacutetomnosti elektroforetickeacuteho pufra (TAE alebo TBE) (obr 22) Nanaacutešaciacute tlmivyacute roztoknanaacutešacia farbička umožňuje na zaacuteklade migraacutecie farbičky vidieť migraacuteciu vzorky v geacuteli a suacutečasne zvyacutešeniacutem hustoty vo vzorke umožniacute klesnuacuteť vzorke do jamky a tak zabraacuteniť jej vyplaveniu z geacutelu Draacuteha je časť geacutelu ktoryacutem putuje jedna vzorka od katoacutedy k anoacutede V draacutehe sa nachaacutedzajuacute oddeleneacute jednotliveacute fragmenty nukleovyacutech kyseliacuten určityacutech veľkostiacute viditeľneacute vo forme pruacutežkov (angl bands) Intenzita pruacutežku zaacutevisiacute od množstva molekuacutel danej veľkosti je ekvivalentnaacute hmotnosti Na určenie veľkosti fragmentov NK sa do jednej jamky nanesie štandard molekulovyacutech hmotnostiacute (angl ladder) ktoryacute maacute presne definovaneacute veľkosti fragmentov čo umožňuje odhadnuacuteť veľkosť aj hmotnosť neznaacutemych separovanyacutech fragmentov

Obr 22 Elektroforetickaacute separaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten v agaroacutezovom geacuteli (A) a vizualizaacutecia UV svetlom a GelRedtrade (B C)

24

Nukleoveacute kyseliny je možneacute elektroforeticky separovať 1) v geacuteloch agaroacutezovom (horizontaacutelna elektroforeacuteza) (obr 22) a polyakrylamidovom (vertikaacutelna elektroforeacuteza) 2) v špeciaacutelnych lineaacuternych polymeacuteroch kapilaacuternou elektroforeacutezou použitiacutem genetickeacuteho analyzaacutetora (obr 23)

Agaroacuteza je polysacharid ziacuteskanyacute z morskej riasy použiacuteva sa najčastejšie v koncentraacuteciiacute 05-2 čiacutem vyššia koncentraacutecia tyacutem je geacutel pevnejšiacute a schopnejšiacute rozliacutešiť menšie fragmenty NK Priacuteprava je jednoduchaacute odvaacuteži sa potrebneacute množstvo agaroacutezy ktoraacute sa zmieša s tlmivyacutem roztokom (pufrom) rozvariacute sa v mikrovlnnej ruacutere a naleje sa do špeciaacutelnej naacutedoby na vytvaacuteranie geacutelov kyacutem je geacutel tekutyacute vložiacute sa do neho tzv hrebeň na vytvorenie jamiek Agaroacuteza je netoxickaacute V bežnom agaroacutezovom geacuteli v zaacutevislosti od jeho koncentraacutecie je možneacute separovať DNA fragmenty dĺžky 200-50 000 bp Dnes suacute dostupneacute aj špeciaacutelne agaroacutezy napr MetaPhorreg Agarose schopneacute oddeliť fragment DNA dĺžky 20-800bp Separaacutecia v agaroacutezovom geacuteli prebieha v horizontaacutelnej aparatuacutere preto sa nazyacuteva aj horizontaacutelna elektroforeacuteza

Polyakrylamidovyacute geacutel (PAGE) vznikaacute polymerizaacuteciou akrylamidu v priacutetomnosti špeciaacutelnych chemickyacutech laacutetok (peroxodisiacuteran amoacutenny TEMED bisakrylamid) Jeho priacuteprava je preto odlišnaacute a aj naacuteročnejšia Polyakrylamidoveacute geacutely majuacute vysokuacute rozlišovaciu schopnosť (1bp) preto suacute PAGE geacutely vhodneacute aj na sekvenovanie DNA klasickyacutemi metoacutedami PAGE geacutel nie je vhodnyacute na separaacuteciu fragmentov dlhšiacutech ako 2kb Použiacuteva sa v koncentraacutecii 35 -20 s rozliacutešeniacutem fragmentov od 10bp-2000bp Akrylamid je neurotoxiacuten musiacute sa s niacutem pracovať veľmi opatrne PAGE elektroforeacuteza bežiacute vo vertikaacutelnej aparatuacutere preto sa volaacute aj vertikaacutelna elektroforeacuteza použiacuteva sa často aj na separaacuteciu proteiacutenov

Ryacutechlosť pohybu nukleovyacutech kyseliacuten (mobilita) určuje viacero faktorov 1) veľkosť NK ndash počet baacutezovyacutech paacuterov resp baacutez pričom menšie molekuly prechaacutedzajuacute geacutelom ryacutechlejšie pretože sa ľahšie pohybujuacute v geacuteli 2) konformaacutecia nukleovej kyseliny napr u rovnako veľkyacutech plazmidov kondenzovaneacute superšpiralizovaneacute plazmidy migrujuacute najryacutechlejšie rovnako veľkeacute lineaacuterne molekuly (toho isteacuteho plazmidu) bežia pomalšie a najpomalšie putujuacute relaxovaneacute kruhoveacute molekuly plazmidu 3) koncentraacutecia geacutelu určuje jeho rozlišovaciu schopnosť koncentrovanejšiacute geacutel je schopnyacute separovať kratšie fragmenty NK redšie geacutely suacute vhodneacute pre rozliacutešenie vaumlčšiacutech fragmentov 4) zloženie geacutelu je docircležiteacute pri analyacuteze sekundaacuternych štruktuacuter NK a proteiacutenov v nedenaturovanom stave sekundaacuterna štruktuacutera spomaľuje migraacuteciu NK a proteiacutenov Tento fakt využiacutevajuacute niektoreacute diagnostickeacute techniky (napr SSCP - Single Strand Conformation Polymorphism - polymorfismus konformaacutecie jednovlaacuteknovej DNA) umožňujuacutece detekciu zaacutemeny jedinej baacutezy ktoraacute spocircsobiacute odlišneacute vnuacutetromolekuloveacute paacuterovanie a vyacuteslednuacute konformaacuteciu molekuly Geacutely mocircžu teda byť denaturačneacute a nedenaturačneacute (natiacutevne) 5) napaumltie zdroja - čiacutem vyššie je napaumltie ktoreacute vytvaacutera elektrickeacute pole v elektroforetickej aparatuacutere tyacutem ryacutechlejšie fragmenty NK migrujuacute 6) zloženie roztokov a teploty

Elektroforetickyacute tlmivyacute roztok (pufor - elektrolyt) zabezpečuje stabilneacute elektroforetickeacute podmienky počas separaacutecie geacutel je v ňom ponorenyacute Obsahuje ioacuteny čo umožňuje vedenie elektrickeacuteho pruacutedu

Štandard molekulovyacutech hmotnostiacute (v laboratoacuteriaacutech nazyacutevanyacute ladder alebo marker) je zmes fragmentov DNA alebo RNA s presne definovanou veľkosťou ktoryacute sluacuteži na odhad veľkosti vyšetrovanyacutech fragmentov NK (obr 22) Pomocou špeciaacutelnych štandardov molekulovyacutech hmotnostiacute ktoryacutech fragmenty NK majuacute definovanuacute aj hmotnosť je možneacute odhadnuacuteť množstvo (hmotnosť - koncentraacuteciu) neznaacutemeho fragmentu

B C

25

41 Vizualizaacutecia DNA

Samotnaacute nukleovaacute kyselina je počas elektroforetickej separaacutecie neviditeľnaacute Vizualizaacuteciu NK umožňujuacute interkalačneacute činidlaacute ktoreacute suacute schopneacute naviazať sa na molekuly NK tyacutem že sa včlenia medzi susediace baacutezy Po ožiareniacute UV svetlom interkalačneacute činidlaacute naviazaneacute na NK fluoreskujuacute tak sa vizualizuje NK čiacutem intenziacutevnejšie fluoreskuje tyacutem viac NK je v geacutelipruacutežku priacutetomneacute Interkalačneacute činidlo sa buď primieša do geacutelu pri jeho priacuteprave čo umožniacute sledovať migraacuteciu fragmentov NK počas elektroforeacutezy a to po vybratiacute z ELFO aparatuacutery a po ožiareniacute UV svetlom alebo sa geacutel farbiacute po elektroforetickej separaacutecii V minulosti bol na zviditeľnenie NK najčastejšie použiacutevanyacute etidiumbromid kvocircli jeho mutageacutennym vlastnostiam sa v suacutečasnosti nahraacutedza menej mutageacutennymi a netoxickyacutemi činidlami ako suacute napr komerčne dostupneacute SYBRregSafe GelRedtrade GelGreentrade

Kapilaacuterna elektroforeacuteza NK prebieha v špeciaacutelnom priacutestroji genetickom analyzaacutetore (obr 23) ktoryacute musiacute mať zaacutekladneacute komponenty ako suacute elektroacutedy kapilaacutera zdroj vysokeacuteho napaumltia detektor prepojenie s počiacutetačom a softveacuteroveacute vybavenie priestor na vloženie vzoriek atď Genetickyacute analyzaacutetor predstavuje automatizovanyacute systeacutem umožňujuacuteci sekvenovanie určovanie dĺžky DNA fragmentov ndash fragmentačnuacute analyacutezu a kvantifikaacuteciu nukleovyacutech kyseliacuten V novšiacutech typoch genetickeacuteho analyzaacutetora je proces analyacutezy od vloženia vzoriek do stojana automatizovanyacute

Vzorka určenaacute na analyacutezu je elektrokineticky injektovanaacute do tenkej kapilaacutery naplnenej lineaacuternym polymeacuterom Vplyvom vysokeacuteho napaumltia sa negatiacutevne nabiteacute fragmenty DNA pohybujuacute v polymeacuteri k pozitiacutevne nabitej elektroacutede Kapilaacuterna elektroforeacuteza je tak citlivaacute že je schopnaacute detegovať jednobaacutezovyacute rozdiel DNA fragmentov DNA fragmenty musia byť pred kapilaacuternou elektroforeacutezou fluorescenčne označeneacute v kapilaacutere suacute separovaneacute na zaacuteklade veľkosti Kraacutetko pred dosiahnutiacutem kladne nabitej elektroacutedy docircjde po excitaacutecii laserovyacutem žiareniacutem k emisii žiarenia fluoroformi (farbičkami) tak že optickyacute detekčnyacute systeacutem zaznamenaacute fluorescenciu ktoraacute je naacutesledne softveacuterovo spracovanaacute a vyhodnotenaacute

Obr 23 Genetickyacute analyzaacutetor

42 RFLP

Metoacuteda polymorfizmu dĺžky restrik čnyacutech fragmentov (angl Restriction Fragment Length Polymorfism) bola prvou metoacutedou využiacutevanou na detekciu DNA variaacuteciiacute rocircznych biologickyacutech vzoriek Princiacutep metoacutedy spočiacuteva v priacutetomnosti polymorfizmov v DNA sekvencii rocircznych ľudiacute ktoreacute zapriacutečinia rozdielny profil (obrazec) DNA fragmentov po štiepeniacute jednou alebo viaceryacutemi restrikčnyacutemi endonukleaacutezami Restrikčneacute endonukleaacutezy (RE) suacute enzyacutemy ktoreacute štiepia DNA molekulu v oblasti špecifickej nukleotidovej sekvencie nazyacutevanej restrik čneacute miesto RE najčastejšie rozpoznaacutevajuacute a štiepia miesto veľkeacute 4-6 baacutez RE suacute priacutetomneacute u prokaryotov (bakteacuterie a archebakteacuterie) kde suacute suacutečasťou restrik čno-modifikačneacuteho systeacutemu akoby prokaryotickeacutej vrodenej imunity sluacutežia

26

na ochranu pred cudzou DNA (napr viacuterusovou) ktoruacute po rozpoznaniacute špecifickej sekvencie štiepia

Restrikčno-modifikačnyacute systeacutem maacute dve zložky 1) modifikačneacute enzyacutemy - metylaacutezy ktoreacute procesom metylaacutecie modifikujuacute určiteacute baacutezy svojej DNA čiacutem ich označia za vlastnuacute DNA takže takaacuteto DNA je potom rezistentnaacute voči štiepeniu restrikčnyacutemi endonukleaacutezami Najčastejšiacutem spocircsobom metylaacutecie u bakteacuteriiacute je metylaacutecia adeniacutenu na N6 pričom vznikne metyladeniacuten alebo cytoziacutenu na C5 metylcytoziacuten 2) restrikčneacute endonukleaacutezy štiepia špecifickeacute miesto dvojvlaacuteknovej DNA ktoreacute je tvoreneacute symetrickou sekvenciou zrkadlovo sa opakujuacutecich nukleotidov ndash tzv palindroacutem Restrikčneacute enzyacutemy sa použiacutevajuacute na štiepenie DNA sekvencie na mieste špecifickom pre tuacute ktoruacute restrikčnuacute endonukleaacutezu napr pri analyacuteze polymorfizmov dĺžky restrikčnyacutech fragmentov (RFLP) analyacuteze jednonukleotidovyacutech polymorfizmov (SNP) mutaacuteciiacute ako aj pri klonovaniacute DNA do vhodnyacutech vektorovyacutech DNA molekuacutel

Po štiepeniacute dvojvlaacuteknovej DNA restrikčnou endonukleaacutezou mocircžu vzniknuacuteť tri typy koncov - 5´-prečnievajuacutece konce (lepiveacute) 3´-prečnievajuacutece konce (lepiveacute) a tupeacute konce (obr 24)

Obr 24 Restrikčneacute štiepenie zanechaacutevajuacutece rocirczne konce tupeacute a lepiveacute

Restrikčneacute štiepenie je často použiacutevanou metoacutedou geacutenovyacutech manipulaacuteciiacute na konštrukciu

hybridnyacutech molekuacutel DNA s naacuteslednyacutem klonovaniacutem Priebeh RFLP analyacutezy je nasledovnyacute restrikčnaacute endonukleaacuteza sa pridaacute k DNA a zmes sa vo

vhodnyacutech reakčnyacutech podmienkach (pufor teplota) inkubuje niekoľko hodiacuten Počas inkubaacutecie docircjde k štiepeniu DNA na špecifickyacutech miestach DNA je potom elektroforeticky separovanaacute v geacuteli a naacutesledne vizualizovanaacute V minulosti po geacutelovej elektroforeacuteze nasledoval Southern blot (čiže prenos separovanyacutech fragmentov DNA z geacutelu na špeciaacutelnu membraacutenu) (obr 35) po ktorom nastala vizualizaacutecia raacutedioaktiacutevne značenou proacutebou V suacutečasnosti sa kvocircli praacutecnosti a zdravotnyacutem rizikaacutem od Southern blotu upuacutešťa a prechaacutedza sa na ryacutechlejšie menej praacutecne a zdravotne šetrnejšie metoacutedy priateľskejšie aj k životneacutemu prostrediu

RFLP bola prvou metoacutedou použiacutevanou na zistenie DNA profilu (DNA fingerprinting) mapovanie geacutenov zapriacutečiňujuacutece genetickeacute ochorenia a testovanie otcovstva Vaumlčšina RFLP markerov je vysoko lokusovo špecifickyacutech a kodominantnyacutech (obidve alely suacute detekovaneacute u heterozygota)

PCR-RFLP je laboratoacuterne priacutestupnejšia metoacuteda molekulaacuterno-genetickej diagnostiky keďže PCR umožňuje amplifikaacuteciu veľmi malyacutech množstiev DNA Alternatiacutevny naacutezov použiacutevanyacute v literatuacutere je CAPS z angl Cleaved Amplified Polymorphic Sequence assay Použitiacutem špecifickyacutech primerov docircjde PCR metoacutedou k amplifikaacutecii požadovaneacuteho uacuteseku DNA ten sa potom štiepi restrikčnou endonukleaacutezou vo vhodnyacutech podmienkach naacutesledne sa štiepne produkty elektroforeticky separujuacute a vizualizujuacute použitiacutem interkalačnyacutech farbiacutev a UV svetla (obr 25)

27

Obr 25 Princiacutep metoacutedy PCR-RFLP

43 VNTR a STR V geacutenome suacute priacutetomneacute dva typy tandemovyacutech (za sebou nasledujuacutecich) opakovaniacute

1) minisatelity ndash nazyacutevaneacute variabilnyacute počet tandemovyacutech opakovaniacute VNTR (variable number of tandem repeats) 2) mikrosatelity tiež kraacutetke tandemoveacute repetiacutecie STR (short tandem repeats)

Obidva tieto typy satelitnej DNA suacute rozmiestneneacute po celom genoacuteme suacute využiacutevaneacute hlavne vo forenznej genetike na identifikaacuteciu osocircb a určenie otcovstva popriacutepade materstva ale aj v mediciacutene na detekciu chromozoacutemovyacutech aneuploidiiacute Štruktuacutera obidvoch je podobnaacute Rozdiel medzi jednotlivyacutemi alelami je spocircsobenyacute rozdielnym počtom opakovaniacute opakujuacutecej sa sekvencie (motiacutevu) čo spocircsobiacute rocircznu dĺžku alel s rocircznym počtom tandemovyacutech opakovaniacute nazyacutevanuacute polymorfizmus dĺžky fragmentov

VNTR ndash variabilnyacute počet tandemovyacutech opakovaniacute pričom opakujuacuteca sa sekvencia maacute dĺžku od 6 do 100 baacutez pričom sa mocircže opakovať aj tisiacutece kraacutet alely tak mocircžu mať od 500do 30 000 baacutez VNTR boli v kombinaacutecii s RFLP (DNA fingerprinting ) prvyacutem polymorfizmom použiacutevanyacutem na zistenie DNA profilov a identifikaacuteciu osocircb v kriminalistickej praxi V suacutečasnosti jeho využitie v kriminalistike je kvocircli potrebe relatiacutevne veľkeacuteho množstva DNA nahradeneacute využitiacutem STR

STR - kraacutetke tandemoveacute repetiacutecie suacute v kriminalistike najčastejšie použiacutevanyacutem polymorfizmom STR lokusy suacute rozmiestneneacute po celom genoacuteme repetiacutecia obsahuje jednu až šesť baacutez pričom jej opakovaniacutem vznikne STR v rozsahu od 50 do 300bp V našom genoacuteme suacute tisiacutece STR ktoreacute mocircžu byť použiteacute pre forenznuacute analyacutezu V kriminalistike sa v suacutečasnosti na identifikaacuteciu osocircb použiacuteva 13 STR locusov ktoreacute patria k medzinaacuterodne uznaacutevanyacutem štandardom Z iniciatiacutevy FBI bola vytvorenaacute databaacuteza CODIS (Combined DNA Index System) každaacute krajina maacute svoju databaacutezu CODIS kde je možneacute vložiť a archivovať DNA profily jednotlivcov ako aj profily DNA ziacuteskanyacutech z miest kriminaacutelneho činu v databaacuteze je ich možneacute navzaacutejom porovnať a tak zistiť pocircvodcu trestneacuteho činu Medzinaacuterodnaacute jednotnosť v použiacutevaniacute CODIS STR lokusov umožňuje v priacutepade potreby vzaacutejomneacute porovnanie DNA profilov zistenyacutech na uacutezemiacute rocircznych štaacutetov CODIS STR lokusov je 13 a suacute to CSF1PO FGA TH01 TPOX VWA D3S1358 D5S818 D7S820 D8S1179 D13S317 D16S539 D18S51 a D21S11 Zistenie DNA profilu sa uskutočniacute multiplexnou PCR reakciou s fluorescenčne značenyacutemi primermi špecifickyacutemi pre konkreacutetny STR Naacutesledne suacute PCR produkty analyzovaneacute kapilaacuternou elektroforeacutezou genetickyacutem analyzaacutetorom ktoryacute rozliacuteši amplifikovaneacute fragmenty na zaacuteklade fluorescencie a dĺžky (fragmentačnaacute analyacuteza) (obr 26 Tab 3) DNA profil každeacuteho človeka je jedinečnyacute rovnakyacute profil mocircžu mať len jednovaječneacute dvojčataacute

28

Obr 26 Ukaacutežka DNA profilu človeka 15 STR lokusov s určeniacutem pohlavia pomocou lokusu pre amelogeniacuten (ženskeacute pohlavie - XX) maleacute oranžoveacute piacuteky predstavujuacute fragmenty veľkostneacuteho štandardu Tabuľka č 3 Zaacutepis DNA profilu človeka z obraacutezka č 26 15 STR lokusov s určeniacutem pohlavia pomocou lokusu pre amelogeniacuten System Alela 1 Alela 2

D3S1358 16 17

TH01 9 93 D21S11 28 28

D18S51 15 18

Penta E 7 14 D5S818 9 12

D13S317 8 11

D7S820 8 11 D16S539 11 12

CSF1PO 10 11

Penta D 11 12 vWA 15 18

D8S1179 13 16

TPOX 8 9 FGA 20 21

amel X X

29

5 MLPA

Multiplexnaacute amplifikaacutecia proacuteb zaacutevislaacute od ligaacutecie (z angl multiplex ligation-dependent probe amplification) je metoacuteda schopnaacute v jednej reakcii (v jednej skuacutemavke a vzorke) detegovať zmeny v počte až 50 nukleotidovyacutech sekvenciiacute Metoacutedou MLPA je možneacute ryacutechlo identifikovať amplifikaacutecie (duplikaacutecie) a deleacutecie veľkeacuteho počtu geacutenov či už použitiacutem DNA alebo mRNA krvnyacutech vzoriek alebo vzoriek z naacutedorov

Princiacutep MLPA spočiacuteva v multiplexnej amplifikaacutecii 50 špecifickyacutech nukleotidovyacutech sekvenciiacute použitiacutem jedneacuteho paacuteru primerov pričom jeden primer je fluorescenčne označenyacute Vyacutesledneacute PCR produkty suacute analyzovaneacute kapilaacuternou elektroforeacutezou (fragmentačnaacute analyacuteza) Dĺžka každeacuteho namnoženeacuteho produktu je jedinečnaacute narastaacute postupne o 6 alebo 9 nukleotidov pričom produkty PCR suacute 120 ndash 500 nukleotidov dlheacute Tento veľkostnyacute rozsah PCR fragmentov (dĺžka 120-500 nukleotidov s naacuterastom postupne o 6 alebo 9 nukleotidov) je optimaacutelny pre kapilaacuternu elektroforeacutezu MLPA multiplexnaacute PCR prebieha za použitia iba jedineacuteho paacuteru primerov ktoreacute amplifikujuacute špecifickeacute sekvencie Trik spočiacuteva v tom že nedochaacutedza k amplifikaacutecii DNA sekvencie ale MLPA proacuteb ktoreacute suacute pridaneacute k vzorkaacutem Každaacute MLPA proacuteba pozostaacuteva z dvoch oligonukleotidov (dve hemiproacuteby) pričom každyacute oligonukleotid obsahuje jednu zo sekvencie rozpoznaacutevanuacute PCR primermi Proacuteba vznikne jedine za predpokladu hybridizaacutecie dvoch oligonukleotidov (hemiproacuteb) k cieľovej sekvencii (geacutenu) a po ligaacutecii enzyacutemom ligaacutezou Iba ligovaneacute proacuteby suacute exponenciaacutelne amplifikovaneacute pomocou jedneacuteho paacuteru primerov Množstvo zligovanyacutech proacuteb teda zaacutevisiacute od množstva cieľovyacutech sekvenciiacute (geacutenov) vo vzorke

Postup MLPA analyacutezy je nasledovnyacute (obr27) K vzorke nukleovej kyseliny (DNA resp mRNA) sa pridaacute zmes 50 jedinečnyacutech proacuteb každaacute

proacuteba je komplementaacuterna k určitej cieľovej sekvencii NK vzorky Každaacute proacuteba však pozostaacuteva z dvoch oligonukleotidov hybridizujuacutecich vedľa seba zaacuteroveň každyacute oligonukleotid (hemiproacuteba) obsahuje pridanuacute sekvenciu rozpoznaacutevanuacute paacuterom PCR primerov Po hybridizaacuteciiacute oligonukleotidov (hemiproacuteb) dochaacutedza k ich ligaacutecii ligaacutezou Ligačnaacute reakcia je tak špecifickaacute že je schopnaacute rozliacutešiť sekvenciu liacutešiacu sa v jednom nukleotide Vyacuteslednyacute ligačnyacute produkt (proacuteba) obsahuje obidve sekvencie pre PCR primery na jednom fragmente čiže mocircže docircjsť k namnoženiu takeacutehoto fragmentu PCR reakciou V priacutepade ak nedocircjde k ligaacutecii priacuteslušnyacutech hemiproacuteb pretože hemiproacuteby nenaacutejdu cieľovuacute sekvenciu na DNA každaacute takaacuteto nezligovanaacute hemiproacuteba maacute len jednu sekvenciu rozpoznaacutevanuacute len jednyacutem PCR primerom v docircsledku čoho nemocircže prebehnuacuteť jej PCR amplifikaacutecia a počas fragmentačnej analyacutezy nie je detegovanaacute pretože negeneruje fluorescenčnyacute signaacutel

Pri MLPA analyacuteze je docircležiteacute okrem MLPA amplifikaacutecie vzorky urobiť aj MLPA amplifikaacuteciu referenčnej vzorky ku ktorej sa bude porovnaacutevať počet geacutenov (cieľovyacutech sekvenciiacute) Po kapilaacuternej elektroforeacuteze MLPA referenčnej a skuacutemanej vzorky porovnaniacutem obsahu nameranyacutech hodnocirct tzv piacutekov priacuteslušnyacutech proacuteb sa určiacute relatiacutevny počet koacutepiiacute v skuacutemanej vzorke

MLPA

1 DNA denaturaacutecia a hybridizaacutecia s MLPA proacutebami (hemiproacuteby)

2 Ligaacutecia (vytvorenie kompletnyacutech proacuteb)

3 PCR amplifikaacutecia proacuteb paacuterom primerov

4 Kapilaacuterna elektroforetickaacute separaacutecia PCR produktov

5 Analyacuteza daacutet

30

Obr 27 Princiacutep MLPA

Firma MRC-Holland v suacutečasnosti ponuacuteka stovky MLPA setov proacuteb ktoreacute suacute vhodneacute na 1) diagnostiku kongenitaacutelnych a dedičnyacutech ochoreniacute 2) zisťovanie profilu naacutedorov 3) zisťovanie metylačneacuteho profilu

MLPA je metoacuteda vhodnaacute na detekciu malyacutech prestavieb (BRCA1 BRCA2 MSH2 atď)

veľkyacutech chromozoacutemovyacutech prestavieb (Williamsov syndroacutem Prader-WilliAngelman syndroacutem atzď)

31

detekciu zmien v počte koacutepii geacutenov (obr 28 29) ako aj zistenie počtu kompletnyacutech chromozoacutemov (chromozoacutem 13 18 21 XY tiež aj z amniovej tekutiny) diagnostiku naacutedorov (zmeny počtu pri ALL CLL atď) kvantifikaacuteciu metylaacutecie (Prader-WilliAngelmanov syndroacutem Fragilnyacute X inaktivaacutecia naacutedorovyacutech supresorovyacutech geacutenov atď) mRNA analyacutezu geacutenov zuacutečastňujuacutecich sa apoptoacutezy alebo zaacutepalov

MS-MLPA (Methylation-Specific MLPA) je varianta MLPA určenaacute špeciaacutelne na analyacutezu aberantnyacutech metylaacutecii imprintovanyacutech oblastiacute ako aj detekciu metylačnyacutech zmien CpG ostrovčekov lokalizovanyacutech bliacutezko promoacutetora Rozdiel oproti štandardnej MLPA spočiacuteva v použitiacute metylačne senzitiacutevneho restrikčneacuteho enzyacutemu HhaI ktoryacute štiepi MS-MLPA proacuteby hybridizovaneacute k nemetylovanej sekvencii Každaacute DNA vzorka určenaacute pre MS-MLPA analyacutezu prejde dvoma reakciami v jednej mikroskuacutemavke štandardnou MLPA analyacutezou (bez štiepenia metylačne senzitiacutevnym enzyacutemom) a v druhej mikroskuacutemavke docircjde okrem ligaacutecie proacuteb aj k metylačne senzitiacutevnemu štiepeniu hybridizovanyacutech proacuteb s nemetylovanou DNA Amplifikujuacute sa len ligovaneacute proacuteby po PCR amplifikaacutecii sa fragmentačnou analyacutezou porovnaniacutem oboch reakciiacute zistia rozdiely v metylačnom profile vzorky k referenčnej vzorke

RT-MLPA (Reverse Transkriptase MLPA) je variaacutecia MLPA určenaacute pre zistenie mRNA profilu vzorky je alternatiacutevou k real-time PCR a mikročipom RT-MLPA nedeteguje mRNA množstvo priamo pretože použiacutevanaacute ligaacuteza nie je schopnaacute ligovať DNA oligonukleotidy keď suacute hybridizovaneacute s RNA Preto RT-MLPA začiacutena reverznou transkripciou so špeciaacutelne navrhnutyacutemi RT primermi tak aby vytvorili kraacutetke oligonukleotidy (cDNA) Potom reakcia pokračuje ako štandardnaacute MLPA

Obr 28 MLPA analyacuteza geacutenu DMD (koacutedujuacuteceho dystrofiacuten) mutaacutecie ktoreacuteho spocircsobujuacute Duchennovu svalovuacute dystrofiu u pacienta je priacutetomnaacute deleacutecia exoacutenu 45 v porovnaniacute s referenčnou vzorkou ndash kontrolou

32

Obr 29 MLPA analyacuteza geacutenu DMD (koacutedujuacuteceho dystrofiacuten) mutaacutecie ktoreacuteho spocircsobujuacute Duchennovu svalovuacute dystrofiu u pacienta suacute priacutetomneacute duplikaacutecie exoacutenov 41 42 43 44 45 (piacuteky vo vzorke pacienta sa porovnajuacute s piacutekmi v kontrole ndash referenčnej vzorke)

33

6 Sekvenovanie

Sekvenovaniacutem rozumieme určenie primaacuternej štruktuacutery DNA teda určenie poradia nukleotidov v reťazci DNA Začiatky moderneacuteho sekvenovania siahajuacute do roku 1977 kedy boli objaveneacute dve metoacutedy sekvenovania 1) chemickaacute metoacuteda Maxama a Gilberta 2) enzymatickaacute metoacuteda Sangera Nicklena a Coulsona

Princiacutep obidvoch metoacuted sekvenovania spočiacuteva v tom že sa vytvoriacute suacutebor DNA molekuacutel s rocircznou veľkosťou ktoreacute suacute zakončeneacute konkreacutetnym nukleotidom tieto DNA molekuly sa elektroforeticky separujuacute v geacuteloch s rozlišovacou schopnosťou 1 nukleotid 61 Chemickaacute metoacuteda

DNA molekuly sa na 5-konci raacutedioaktiacutevne označia raacutedioaktiacutevnym fosforom a naacutesledne sa chemicky modifikujuacute špecificky pre každuacute baacutezu DNA sa potom v modifikovanyacutech miestach štiepi čiacutem vzniknuacute rocirczne dlheacute fragmenty pričom podmienky suacute nastaveneacute tak aby sa DNA na každom mieste štiepila len raz Modifikaacutecia DNA a štiepenie prebehne v štyroch separaacutetnych reakciaacutech (skuacutemavkaacutech) takže po elektroforetickej separaacuteciiacute takto opracovanej DNA v štyroch draacutehach polyakrylamidoveacuteho geacutelu a naacuteslednej autoraacutediografii (podobne ako pri Southernovej hybridizaacutecii) je možneacute odčiacutetať nukleotidovuacute sekvenciu približne 100 nukleotidov od raacutedioaktiacutevneho označenia (v čase objavu Maxama a Gilberta) 62 Sangerova metoacuteda

Zaacuteklady metoacutedy boli popiacutesaneacute už v roku 1975 (metoacuteda plus a miacutenus) ale až vylepšenie použitiacutem dideoxynukleotidov (ddNTP) v roku 1977 došlo k zjednodušeniu sekvenovania Princiacutepom enzyacutemoveacuteho sekvenovania je terminaacutecia (zastavenie) polymerizaacutecie inkorporaacuteciou 2´ 3 -dideoxynukleotidov do novosyntetizujuacuteceho sa vlaacutekna DNA Keďže ddNTP neobsahujuacute hydroxylovuacute skupinu na 3 uhliacuteku riboacutezy nemocircžu sa zuacutečastniť na tvorbe fosfodiesterovej vaumlzby nemocircže sa pripojiť k nim ďalšiacute nukleotid čiže musiacute docircjsť k terminaacuteciiacute polymeraacutecie Reakcia prebieha v štyroch skuacutemavkaacutech s raacutedioaktiacutevne značenyacutem primerom V každej skuacutemavke suacute priacutetomneacute všetky štyri deoxynukleotidtrifosfaacutety (dNTP) ale pre každuacute skuacutemavku je špecifickyacute priacutedavok maleacuteho množstva jedneacuteho z dideoxynukleotidtrifosfaacutetov (v prvej skuacutemavke je ddATP v druhej ddCTP v tretej ddTTP a vo štvrtej ddGTP) Maleacute množstvo ddNTP spocircsobiacute že pri polymerizaacutecii dochaacutedza k prednostneacutemu zaradeniu štandardnyacutech dNTP do narastajuacuteceho reťazca a len občas sa inkorporuje ddNTP čiacutem sa zastaviacute synteacuteza reťazca V každej skuacutemavke tak vznikne suacutebor DNA fragmentov rocircznych veľkostiacute zakončenyacutech priacuteslušnyacutem ddNTP (v prvej skuacutemavke ddATP v druhej ddCTP v tretej ddTTP a vo štvrtej ddGTP) Po elektroforetickej separaacutecii v 4 draacutehach polyakrylamidoveacuteho geacutelu a autoraacutediografii sa z autoraacutediogramu odčiacuteta sekvencia

V suacutečasnosti je sekvenovanie do značnej miery automatizovaneacute pričom využiacuteva princiacutep Sangerovej enzyacutemovej metoacutedy s určityacutemi obmenami Uacutesek DNA ktoryacute treba sekvenovať sa prostredniacutectvom termostabilnyacutech DNA polymeraacutez namnožiacute PCR metoacutedou po ktorej nasleduje sekvenačnaacute reakcia (asymetrickaacute PCR) s fluorescenčne značenyacutemi ddNTP (každyacute druh označenyacute inyacutem fluorescenčnyacutem farbivom) Sekvenačnaacute reakcia prebieha v jednej skuacutemavke s jednyacutem primerom vznikne tak suacutebor jednovlaacuteknovyacutech DNA rocircznej dĺžky ktoreacute suacute na 3konci označeneacute ddNTP so špecifickyacutem fluorescenčnyacutem farbivom Taacuteto metoacuteda sekvenovania sa tiež nazyacuteva rdquodye-terminator cycle sequencingrdquo(obr 30) Po kapilaacuternej elektroforeacuteze vzorky v genetickom analyzaacutetore zaznamenaacutevaniacute fluorescencie jednotlivyacutech fragmentov CCD kamerou a softveacuterovom spracovaniacute sa ziacuteska sekvencia DNA (obr 31)

34

Obr 30 Princiacutep sekvenovania Sangerova dideoxy metoacuteda alebo tzv chain termination method (reťazec zastavujuacuteca metoacuteda) Obr 31 Určenie genotypu plodu a rodičov sekvenčnou analyacutezou DNA ziacuteskanej z plodovej vody (prenataacutelna diagnostika) a perifeacuternej krvi sekvenčnaacute analyacuteza geacutenu ASPA vyacutesledok u plodu priacutetomnaacute mutaacutecia c 914CgtA v homozygotnom stave (AA) rodičia heterozygoti (AC) Uvedenaacute mutaacutecia je v homozygotnom stave kauzaacutelnou priacutečinou Canavanovej choroby

Automatizovaneacute sekvenovanie prinaacuteša viacereacute vyacutehody oproti klasickej Sangerovej metoacutede vyššiu presnosť a ryacutechlosť v jednej sekvenačnej reakcii možnosť osekvenovať až 1200 nukleotidovyacute fragment maleacute množstvo templaacutetu potrebneacute na analyacutezu

35

63 Next Generation Sequencing (NGS)

NGS (sekvenovanie novej generaacutecie) maacute obrovskyacute potenciaacutel v analyacuteze genoacutemov pričom toto označenie zahŕňa viacereacute technologickeacute metoacutedy reprezentovaneacute niekoľkyacutemi firmami Princiacutepom je masiacutevne paralelneacute sekvenovanie čiacutem sa ziacuteskajuacute raacutedovo tisiacutece až milioacuteny sekvenciiacute naraz 631 Sekvenovanie druhej generaacutecie

Na začiatku sa analyzovanaacute DNA vo vaumlčšine priacutepadov fragmentuje (vznikne tak DNA

knižnica) na fragmenty sa pripoja kraacutetke sekvencie ndash adapteacutery naacutesledne sa tieto fragmenty rocircznymi priacutestupmi amplifikujuacute a určiacute sa ich sekvencia Vďaka čiastočnyacutem prekryvom je zo ziacuteskanyacutech sekvencii možneacute poskladať plynuluacute sekvenciu zodpovedajuacutecu pocircvodnej nefragmentovanej DNA

Pyrosekvenovanie je podobne ako Sangerova metoacuteda založenaacute na princiacutepe synteacutezy komplementaacuterneho vlaacutekna DNA avšak rozdiel je v tom že sa na detekciu inkorporaacutecie nukleotidu využiacuteva inyacute systeacutem tvorby luminiscenčneacuteho signaacutelu v priebehu reakcie Pyrosekvenovanie je umožneneacute vďaka aktivite 4 enzyacutemov - DNA polymeraacutezy ATP sulfurylaacutezy luciferaacutezy a apyraacutezy Reakčnaacute zmes obsahuje aj ďalšie komponenty - enzymatickeacute substraacutety adenoziacutenfosfosulfaacutet (APS) d-luciferiacuten sekvenovanyacute templaacutet a cyklicky postupne po jednom type pridaacutevaneacute nukleotidtrifosfaacutety Po zabudovaniacute nukleotidu do novovznikajuacuteceho reťazca docircjde k uvoľneniu pyrofosfaacutetu naacutesledne je využityacute ATP sulfurylaacutezou na synteacutezu ATP z APS počas ďalšej reakcie docircjde k využitiu ATP luciferaacutezou na premenu luciferiacutenu na oxyluciferiacuten čo spocircsobiacute svetelnyacute signaacutel a ten zaznamenaacute detekčnyacute systeacutem Poslednou enzymatickou reakciou je reakcia apyraacutezy ktoraacute odstraacuteni nezainkorporovaneacute nukleotidy a nevyužiteacute ATP aby sa celyacute proces mohol zopakovať s reakčnou zmesou obsahujuacutecou ďalšiacute nukleotidtrifosfaacutet (inyacute ako v predchaacutedzajuacutecej reakcii) Po každej reakcii detektor zaznamenaacuteva emisiu svetla na zaacuteklade intenzity svetla je možneacute určiť či bol vradenyacute priacuteslušnyacute nukleotidtrifosfaacutet či bol inkorporovanyacute jeden priacutepadne viac rovnakyacutech nukleotidtrifosfaacutetov

Zvyacutešenie vyacutekonu pyrosekvenovania umožnila tzv emulznaacute PCR v mikročasticiach a použitie platničky PicoTiterPlatereg toto sekvenovanie zaviedla firma Roche pod pojmom 454 pyrosekvenovanie v roku 2005 Na začiatku sa DNA fragmentuje na uacuteseky dlheacute 400-600 baacutez dvojvlaacuteknovaacute fragmentovanaacute DNA sa liguje s adapteacutermi prostredniacutectvom nich sa naviaže na mikročastice dvojvlaacuteknoveacute fragmenty sa oddelia mikročastice s naviazanyacutemi jednovlaacuteknovyacutemi fragmentami sa premiešajuacute so zmesou oleja a roztoku ktoryacute obsahuje všetky komponenty na uacutespešnuacute PCR Tyacutemto spocircsobom sa okolo každej mikročastice vytvoriacute vlastnyacute mikroreaktor v ktorom prebehne amplifikaacutecia fragmentu Po PCR reakcii sa mikročastice prenesuacute do platničky PicoTiterPlate v ktorej sa do jamky zmestiacute akuraacutet jedna mikročastica a reakčneacute komponenty pyrosekvenačnej reakcie PicoTiterPlatereg maacute 1 600 000 jamiek každaacute jamka maacute maximaacutelny objem 75 picolitra Platnička s mikročasticami sa vložiacute do sekvenačneacuteho systeacutemu ndash priacutestroja v ktorom sa celeacute pyrosekvenovanie uskutočniacute Chemiluminiscenčneacute signaacutely ktoryacutech počas sekvenovania vznikajuacute milioacuteny v priebehu hodiny suacute zachyteneacute CCD kamerou a analyzovaneacute softveacuterom

Firma Illumina predstavila inuacute technoloacutegiu PCR amplifikaacutecia a sekvenovanie sa uskutočňuje na skliacutečku (flow cell) Fragmentaacutecia DNA a pripojenie adapteacuterov prebieha za uacutečasti transpozoacutemov v procese nazvanom tagmentaacutecia Po hybridizaacutecii fragmentov DNA na skliacutečko prebehne v klastroch PCR amplifikaacutecia (tzv mostiacutekovaacute amplifikaacutecia) sekvenaacutecia prebieha za uacutečasti rozdielne fluorescenčne značenyacutech a chemicky modifikovanyacutech nukleotidov pričom každyacute nukleotid emituje fluorescenciu s inou vlnovou dĺžkou Na skliacutečku prebieha paralelne až 6 miliaacuterd sekvenaacutecii (obr 32)

Ďalšiacutemi možnosťami sekvenovania druhej generaacutecie je systeacutem SOLid (vyvinutyacute firmou Applied Biosystem dnes pod Thermo Fisher Scientific) a Ion Semiconductor Sequencing ndash polovodičoveacute ioacutenoveacute sekvenovanie (od firmy Ion Semiconductor Sequencing v suacutečasnosti Thermo Fisher Scientific)

36

Obr 32 Princiacutep sekvenovania novej generaacutecie od firmy Illumina PCR amplifikaacutecia a sekvenovanie sa uskutočňuje na skliacutečku (flow cell) paralelne prebieha až 6 miliaacuterd sekvenaacutecii

632 Sekvenovanie tretej generaacutecie

Pred sekvenovaniacutem netreba amplifikovať DNA PCR metoacutedou ale sekvencia sa ziacuteskava zachyteniacutem signaacutelu v reaacutelnom čase Medzi sekvenovanie tretej generaacutecie patriacute SMRT (Single Molecule Real-Time Sequencing) a Nanopore Sequencing

37

7 Fragmentačnaacute analyacuteza DNA

Je metoacuteda použiacutevanaacute na určenie veľkosti fragmentov DNA ziacuteskanyacutech PCR reakciou Dĺžka amplifikovanyacutech DNA fragmentov sa zistiacute ich porovnaniacutem s veľkostnyacutem štandardom (obr 33) ktoryacute je tvorenyacute DNA fragmentami znaacutemej dĺžky Veľkostnyacute štandard je pred kapilaacuternou elektroforeacutezou zmiešanyacute so vzorkou DNA fragmenty veľkostneacuteho štandardu suacute fluorescenčne označeneacute pričom použiteacute fluorescenčneacute farbivo je ineacute ako fluorescenčneacute farbivo použiteacute na označenie DNA fragmentov vo vyšetrovanej vzorke

Obr 33 Elektroforetogram veľkostneacuteho štandardu použiacutevaneacuteho na určenie veľkostiacute fragmentov analyzovanyacutech kapilaacuternou elektroforeacutezou v genetickom analyzaacutetore (GeneScantrade 500 LIZtrade dye Size Standard) dĺžka fragmentov v nukleotidoch (napr 50 nukleotidov)

Fragmentačnaacute analyacuteza pozostaacuteva z viaceryacutech krokov Prvyacutem je izolaacutecia DNA nasleduje PCR amplifikaacutecia počas ktorej sa novosyntetizovaneacute DNA fragmenty označia fluorescenčnyacutemi farbivami Vzorka s PCR produktom sa pripraviacute na kapilaacuternu elektroforeacutezu tak že sa zmieša s veľkostnyacutem štandardom (sluacuteži na určenie veľkosti fragmentov) a denaturačnou laacutetkou (formamid) nasleduje denaturaacutecia Pripraveneacute vzorky suacute injektovaneacute do priacutestroja (genetickyacute analyzaacutetor) kde v kapilaacutere naplnenej polymeacuterom v elektrickom poli migrujuacute fluorescenčne značeneacute fragmenty DNA na zaacuteklade veľkosti (kapilaacuterna elektroforeacuteza) Počas elektroforeacutezy genetickyacute analyzaacutetor zaznamenaacuteva fluorescenciu fragmentov Analyacutezou daacutet prostredniacutectvom špeciaacutelnych softveacuterov sa ziacuteskajuacute elektroforetogramy z ktoryacutech je možneacute zistiť veľkosť fragmentov ako aj typ fluorescencie (docircležiteacute ak suacute genetickeacute varianty rozliacutešiteľneacute rocircznou fluorescenciou napr SNaPshot) Fragmentačnaacute analyacuteza je suacutečasťou množstva molekulaacuterno-genetickyacutech metoacuted (pozri obr 12 26 28 29 34) ako suacute napr STR analyacuteza (Short Tandem Repeat) AFLP analyacuteza (Amplified Fragment Lenght Polymorfism) RFLPT-RFLP analyacuteza (Restriction Fragment Lenght PolymorfismTerminal Restricted Fragment Lenght Polymorfism) SSCP (Single Strand Conformation Polymorfism) VNTR (Variable Number of Tandem Repeat) analyacuteza straty heterozygotnosti (LOH loss of heterozygozity) MLPA (Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification) MSMSA (Methylation-Sensitive Mobility Shift Assay) SNP genotypovanie (SNaPshotreg) HiCEP (High-Coverage Expression Profiling)

38

Obr 34 Kvantitatiacutevna fragmentačnaacute PCR analyacuteza (QF-PCR) DNA izolovanej z plodovej vody vyacutesledok prenataacutelnej analyacutezy = priacutetomnosť troch piacutekov pre chromozoacutem 18 (u všetkyacutech fragmentov detegujuacutecich chromozoacutem 18 je pomer vyšetrovanyacutech markerov aberantnyacute 21 resp 111) čo znamenaacute trizoacutemiu chromozoacutemu 18 Edwardsov syndroacutem

39

8 Metoacutedy založeneacute na princiacutepe hybridizaacutecie

Nukleoveacute kyseliny majuacute schopnosť vytvaacuterať dvojvlaacuteknoveacute reťazce z jednovlaacuteknovyacutech molekuacutel na zaacuteklade komplementarity baacutez Komplementarita baacutez umožňuje replikaacuteciu DNA transkripciu RNA komplementarita baacutez zabezpečuje teda reprodukovateľnosť živej hmoty

Hybridizaacutecia je proces v ktorom na zaacuteklade komplementarity baacutez dochaacutedza k vytvoreniu dvojvlaacuteknovej nukleovej kyseliny z dvoch jednovlaacuteknovyacutech molekuacutel DNA alebo RNA alebo ich kombinaacuteciou DNA RNA pričom kratšia jednovlaacuteknovaacute nukleovaacute kyselina vystupuje ako sonda (proacuteba) Hybridizaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten je jeden z najpoužiacutevanejšiacutech naacutestrojov v molekulaacuternej bioloacutegii a genetike (hybridizaacutecia primerov alebo proacuteb sa využiacuteva v takmer každej metoacutede - v PCR RT-PCR qPCR RT-qPCR MLPA sekvenovaniacute fragmentačnej analyacuteze FISH DNA mikročipoch atď)

Denaturaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten je proces pri ktorom dochaacutedza k porušeniu vodiacutekovyacutech vaumlzieb medzi vlaacuteknami nukleovyacutech kyseliacuten (strata sekundaacuternej a terciaacutelnej štruktuacutery) tak že docircjde k ich uacuteplneacutemu oddeleniu vzniknuacute jednovlaacuteknoveacute reťazce Denaturaacutecia NK mocircže byť spocircsobenaacute vplyvom vysokyacutech teplocirct pH alebo chemickyacutech laacutetok (denaturačneacute činidlaacute) Renaturaacutecia je opačnyacute proces v ktorom na zaacuteklade komplementarity dochaacutedza k tvorbe dvojvlaacuteknovyacutech NK

Hybridiza čnaacute sonda (proacuteba) je jednovlaacuteknovaacute nukleovaacute kyselina určitej znaacutemej dĺžky a sekvencie (najčastejšie DNA pretože je stabilnejšia ako RNA) ktoraacute je značenaacute a sluacuteži na detekciu komplementaacuternych molekuacutel DNA alebo RNA v procese hybridizaacutecie V zaacutevislosti od podmienok hybridizaacutecie (stringencia) mocircže byť detegovanaacute sekvencia uacuteplne komplementaacuterna alebo v menej priacutesnych podmienkach mocircže mať sekvenčneacute odchyacutelky Proacuteba sluacuteži na vyhľadanie a zviditeľnenie cieľovyacutech NK Zviditeľnenie sa deje prostredniacutectvom označenia proacuteby ešte pred hybridizaacuteciou Značenie proacuteby mocircže byť raacutedioaktiacutevne a neraacutedioaktiacutevne (najčastejšie fluorescenčneacute)

Raacutedioaktiacutevne značeneacute proacuteby pomocou izotopov (32P) sa využiacutevali viac v minulosti v suacutečasnosti suacute kvocircli zdravotnyacutem rizikaacutem ohľaduplnosti k životneacutemu prostrediu ako aj kvocircli jednoduchšej manipulaacutecii použiacutevaneacute fluorescenčne značeneacute proacuteby Raacutedioaktiacutevne značeneacute sondy boli použiacutevaneacute hlavne metoacutedou Southernovej hybridizaacutecie (Southern blotting Southern blot) Citlivosť raacutedioaktiacutevne značenyacutech proacuteb je vyššia dosahuje schopnosť zachytiť 10 fg (femtogram 10-15) cieľovej DNA sekvencie 81 Southern blot

Metoacutedu objavil v roku 1975 britskyacute bioloacuteg Edwin Southern (preto Southern) Pri Southernovej hybridizaacutecii sa restrikčne štiepeneacute fragmenty DNA elektroforeticky separujuacute v geacuteli potom sa metoacutedou blottingu prenesuacute na nylonovuacute alebo nitroceluloacutezovuacute membraacutenu kde suacute naacutesledne hybridizovaneacute v roztoku obsahujuacutecom raacutedioaktiacutevne značenuacute sondu Priloženiacutem fotografickeacuteho filmu k membraacutene a vyvolaniacutem filmu autoraacutediografiou docircjde k zviditeľneniu lokaliacutet kde došlo k hybridizaacuteciiacute raacutedioaktiacutevne značenej sondy s fragmentom DNA (autoraacutediogram) Southern blot bol kľuacutečovou a prvou metoacutedou na identifikaacuteciu osocircb (DNA fingerprinting DNA pofiling) (obr 35)

Okrem Southern blotu existuje Northern blot na analyacutezu RNA (geacutenovej expresie) a Western blot na analyacutezu proteiacutenov postup je obdobnyacute ako pri Southern blote s obmenami špecifickyacutemi pre konkreacutetny blot Pri Northern blote sa použiacutevajuacute hybridizačneacute proacuteby ale pre vizualizaacuteciu proteiacutenov western blotom je potrebneacute použiť protilaacutetky s naacuteslednou vizualizaacuteciou Pomenovanie techniacutek je hra so sloviacutečkami (keďže paacuten Northern ani Western neobjavili takto nazvaneacute techniky)

Neraacutedioaktiacutevne značenie proacuteb použiacutevanyacutech v molekulaacuternej genetike mocircže byť nepriame (použitie haptenu) alebo priame Konečnaacute vizualizaacutecia je najčastejšie zabezpečenaacute fluoreskujuacutecimi farebnyacutemi značkami farbivami fluorochroacutemami (fluorofoacuterami) Pri priamom značeniacute je farbička kovalentne naviazanaacute na nukleotid a na zachytenie fluorescencie suacute potrebneacute špeciaacutelne priacutestroje umožňujuacutece excitaacuteciu farbičky ktoraacute potom emituje žiarenie určitej vlnovej dĺžky (emisneacute žiarenie) a to zachytiacute detekčnyacute systeacutem priacutestroja Využitie fluorochroacutemov v molekulaacuternej genetike je masiacutevne napr na vizualizaacuteciu NK elektroforeticky separovanyacutech v geacuteli kvantifikaacuteciu produktov PCR reakcie v priacutestroji real-time PCR cykleacuter sekvenovaniacute fragmentačnej analyacuteze FISH DNA mikročipoch atď

40

Obr 35 Princiacutep Southern blotu

82 FISH (fluorescenčnaacute in situ hybridizaacutecia)

FISH (fluorescent in situ hybridization fluorescenčnaacute in situ hybridizaacutecia) metoacuteda patriacute medzi molekulovo-cytogenetickeacute techniky Princiacutep FISH metoacutedy je založenyacute na hybridizaacuteciiacute fluorescenčne značenyacutech proacuteb ku komplementaacuternym uacutesekom vyšetrovanej DNA na podložnom skle (priamo na mieste - in situ) K denaturaacutecii dsDNA dochaacutedza buď vplyvom denaturačnyacutech činidiel alebo zvyacutešenou teplotou a naacuteslednou renaturaacuteciou dochaacutedza k naviazaniu sondy na komplementaacuterny uacutesek DNA Vyacutesledok hybridizaacutecie sa vizualizuje fluorescenčnyacutem mikroskopom vybavenyacutem vhodnyacutemi fluorescenčnyacutemi filtrami a vizuaacutelne zhodnotiacute skuacutesenyacutem odborniacutekom Fluorescencia sa v niektoryacutech priacutepadoch mocircže zaznamenať a hodnotiť aj pomocou softveacuteru (obr 36)

Pomocou FISH detegujeme numerickeacute aberaacutecie - zmeny v počte chromozoacutemov (napr trizoacutemia monozoacutemia chromozoacutemov) alebo štruktuacuterne aberaacutecie a prestavby (napr translokaacutecie inverzie deleacutecie duplikaacutecie amplifikaacutecie) FISH metoacuteda umožňuje identifikaacuteciu a detekciu každeacuteho ľudskeacuteho chromozoacutemu jeho zaradenie do karyotypu odhalenie malyacutech submikroskopickyacutech chromozoacutemovyacutech zmien a tiež mapovať poziacutecie jednotlivyacutech geacutenov na chromozoacuteme

41

Obr 36 Princiacutep štandardnej FISH a FISH maľovania celeacuteho chromozoacutemu

Veľkou vyacutehodou FISH metoacutedy je možnosť analyacutezy buniek v metafaacuteze aj v interfaacuteze kedy nie je nutnaacute kultivaacutecia buniek a tiež ryacutechle analyzovanie veľkeacuteho počtu buniek (stovky až tisiacutece) K ďalšiacutem vyacutehodaacutem patriacute bezpečnosť vysokaacute citlivosť dostatočnaacute stabilita relatiacutevne kraacutetky čas hybridizaacutecie a možnosť ryacutechleho vyhodnotenia Hybridizaacutecia pri vaumlčšine suacutečasne dodaacutevanyacutech sond trvaacute 10-12 hodin (na trhu suacute už dostupneacute aj sondy so skraacutetenyacutem časom hybridizaacutecie na 2-3 hodiny) Po hybridizaacuteciiacute nasleduje odmyacutevanie kedy pri priacuteslušnej teplote dochaacutedza k odmytiu nenaviazanyacutech a nespraacutevne hybridizovanyacutech sond Preparaacutet sa naacutesledne podfarbiacute a vyacutesledok sa zhodnotiacute vo fluorescenčnom mikroskope Na podfarbenie chromozoacutemov alebo jadier sa použiacuteva modreacute kontrastneacute farbivo DAPI (46-diamidino-2-fenylindol) ktoreacute maacute silneacute fluorescenčneacute vlastnosti dokaacuteže prechaacutedzať jadrovou membraacutenou a viazať sa na DNA Vyacutesledkom je modreacute zafarbenie ktoreacute vyacuteborne kontrastuje so signaacutelmi jednotlivyacutech sond

Limitujuacutecim faktorom FISH je možnosť identifikaacutecie len tyacutech uacutesekov DNA ku ktoryacutem suacute použiteacute sondy V jednej analyacuteze je možneacute použiť najviac 3 odlišne značeneacute sondy a tak zistiť priacutepadneacute abnormality len na 1 alebo na paacuter lokusoch Na relevantnuacute detekciu je potrebneacute mať vo vzorke 1-5 aberantnyacutech interfaacutezovyacutech jadier

FISH je možneacute uskutočniť na širokej škaacutele biologickeacuteho materiaacutelu na vzorkaacutech perifeacuternej krvi kostnej drene naacuteteroch choriovyacutech klkoch plodovej vode rocircznych druhov tkaniacutev natiacutevnych alebo zaliatych v parafiacutene na 1 bunke (predimplantačnaacute genetickaacute diagnostika PGD) (obr 37)

Využiacuteva sa na detekciu aberaacuteciiacute pri mnohyacutech onkologickyacutech ochoreniach (napr pri diagnoacuteze mnohopočetnyacute myeloacutem sa v suacutečasnosti po separaacutecii CD138+ buniek robiacute FISH s 5 sondami pre geacuteny IGH TP53 RB1 oblasť 1p321q21 a stanovuje sa hyperploidia chromozoacutemov 5 9 a 15) a tiež k spresneniu doplneniu a k overeniu bežneacuteho cytogenetickeacuteho vyšetrenia

Podľa miesta na chromozoacuteme na ktorom dochaacutedza k hybridizaacutecii sondy rozlišujeme 4 typy

DNA sond bull centromeacuteroveacute sondy ndash sa viažu na strednuacute časť chromozoacutemu ndash centromeacuteru sluacutežia k diagnostike zmien v počte chromozoacutemov k detekcii chromozoacutemov neznaacutemeho pocircvodu umožňujuacute interfaacuteznu FISH na nedeliacich sa bunkaacutech (obr 38-41)

42

Obr 37 Interfaacutezna FISH preimplantačnyacute genetickyacute skriacutening aneuploidiiacute ndash blastomeacutera 3-denneacuteho ľudskeacuteho embrya s normaacutelnym počtom chromozoacutemov 13 18 21 pohlavie XY použityacutech 5 sond pre chromozoacutemy 13 ndash orange 18 ndash aqua 21 ndash green X ndash blue a Y ndash yellow (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

Obr 38 Interfaacutezne jadro po hybridizaacutecii s centromeacuterovou sondou pre chromozoacutem 8 (Vysis Abbott) V pravom jadre je priacutetomnaacute trizoacutemia chromozoacutemu 8 (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex) Obr 39 Metafaacutezna (A) a interfaacutezna FISH (B) použitaacute centromeacuterovaacute sonda CEPX spectrum orangeCEPY spectrum green (Vysis Abbott) Sonda hybridizuje k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (červenyacute signaacutel) a Y (zelenyacute signaacutel) (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

43

Obr 40 Interfaacutezna FISH vyšetrenie spermiiacute použiteacute sondy CEPX greenCEPY orange (Aneuscore Metasystems) Sondy hybridizujuacute k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (zelenyacute signaacutel) Y (červenyacute signaacutel) vľavo ndash dve haploidneacute spermie (majuacutece jedna spermia X druhaacute Y chromozoacutem) vpravo ndash dve patologickeacute spermie obsahujuacutece gonozoacutemovyacute komplement XY (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

Obr 41 Interfaacutezna FISH vyšetrenie spermiiacute použiteacute sondy CEPX greenCEPY orange a CEP18 aqua (Aneuscore Metasystems) Sondy hybridizujuacute k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (zelenyacute signaacutel) Y (červenyacute signaacutel) a 18 (modryacute signaacutel) vľavo ndash normaacutelne haploidneacute ľudskeacute spermie - 1x chromozoacutem X alebo Y a jedenkraacutet chromozoacutem 18 v strede ndash patologickaacute spermia obsahujuacuteca gonozoacutemovyacute komplement XY a jeden chromozoacutem 18 vpravo ndash patologickaacute diploidnaacute spermia s chromozoacutemami X Y a dvoma chromozoacutemami 18 (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

bull lokusovo špecifickeacute sondy ndash hybridizaacutecia prebehne na konkreacutetnom mieste geacutenu (lokuse) (obr 42-44) použiacutevajuacute sa k vyšetreniu mikrodeleacuteciiacute (straty malyacutech častiacute chromozoacutemu pri mikrodelečnyacutech syndroacutemoch) k zisteniu amplifikaacutecie onkogeacutenov a niektoryacutech špecifickyacutech translokaacuteciiacute prestavby geacutenov umožňujuacute interfaacuteznu FISH na nedeliacich sa bunkaacutech bull subtelomeroveacute ndash vaumlzba na koncoveacute časti chromozoacutemu ndash telomeacutery bull celochromozoacutemoveacute alebo celomaľovacie sondy ndash sondy hybridizujuacute s mnohopočetnyacutemi chromozoacutemovyacutemi sekvenciami pričom sa fluorescenčne tak bdquovymaľujeldquo celyacute chromozoacutem (Obr 45) Použiacutevajuacute sa na vyšetrenie chromozoacutemovyacutech prestavieb k analyacuteze translokaacuteciiacute a k detekcii pocircvodu tzv marker chromozoacutemov (malyacutech nadpočetnyacutech chromozoacutemov neznaacutemeho pocircvodu) K použitiu sondy suacute potrebneacute metafaacutezne chromozoacutemy nepoužiacutevaju sa pre interfaacuteznu FISH

Pri konvenčnej chromozoacutemovej FISH suacute homogeacutenne DNA proacuteby hybridizovaneacute s fixovanyacutem metafaacuteznym alebo prometafaacuteznym chromozoacutemomchromozoacutemami na skliacutečku (Obr 36a) Maximaacutelna rozlišovacia schopnosť metafaacuteznej FISH je niekoľko megabaacutez (Obr 39a 45) využitiacutem viac

44

natiahnutyacutech prometafaacuteznych chromozoacutemov sa dosiahne 1 Mb rozliacutešenie Prostredniacutectvom fiber FISH konkreacutetne artificiaacutelne deproteinizovanej natiahnutej DNA pripravenej in situ z celyacutech buniek na mikroskopickom skliacutečku je možneacute vizualizovať individuaacutelne geacuteny maleacute DNA elementy na chromozoacuteme s rozliacutešeniacutem okolo 1000 bp

Obr 42 Interfaacutezne jadro po hybridizaacutecii s lokusovo-špecifickou sondou LSI 5q31 Spectrum Orange5p12 Spectrum Green (Vysis Abbott) Na ľavom obraacutezku suacute priacutetomneacute dva červeneacute (5q31) a dva zeleneacute signaacutely (5p12) v pravom jadre je priacutetomnaacute deleacutecia 5q31 oblasti chyacuteba jeden červenyacute signal (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

Obr 43 Interfaacutezna FISH použitaacute lokusovo-špecifickaacute sonda ndash translokačnaacute - XL BCRABL1 plus (Metasystems) dvojfarebnaacute dvojfuacutezna kde červenaacute označuje lokus ABL1 na chromozoacuteme 9 a zelenaacute oblasť BCR na chromozoacuteme 22 Sonda deteguje fuacuteziu protoonkogeacutenu ABL1 (9q34) a geacutenu BCR (22q11) v priacutepade že červenyacute a zelenyacute signaacutel suacute pri sebe (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

45

Obr 44 Interfaacutezna FISH Použitaacute lokusovo-špecifickaacute sonda- typ break apart pre IGH geacuten V docircsledku translokaacutecie došlo k rozskočeniu geacutenu pričom translokačneacuteho partnera nepoznaacuteme vieme určiť len percento v koľkyacutech jadraacutech je geacuten prestavanyacute (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex) Obr 45 Použiteacute celochromozoacutemoveacute sondy WCP 15 (červenyacute chromozoacutem) a WCP 17 (zelenyacute chromozoacutem) Na metafaacuteze je potvrdenaacute reciprokaacute translokaacutecia t(1517)(q2221) (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

FISH vizualizaacutecia celeacuteho chromozoacutemu maľovanie chromozoacutemu anglicky chromosome

painting je špeciaacutelnou aplikaacuteciou chromozoacutemovej FISH proacuteba je koktail veľkeacuteho počtu rocircznych fluorescenčne značenyacutech DNA fragmentov hybridizujuacutecich pozdĺž celeacuteho konkreacutetneho chromozoacutemu (obr 36b 45) bdquoChromosomepaintingldquo analyzuje metafaacutezne chromozoacutemy V minulosti bola FISH vizualizaacutecia celyacutech chromozoacutemov limitovanaacute malyacutem množstvom rocirczne sfarbenyacutech fluorochroacutemov

V suacutečasnosti je možneacute detegovať množstvo cieľovyacutech sekvenciiacute naraz čo sa využiacuteva pri celogenoacutemovej chromozoacutemovej vizualizaacutecii (whole-chromosomepainting - WCP) metoacutedou multiplex FISH (M-FISH multicolor FISH o br 46) alebo spektraacutelnej karyotypizaacutecie (SKY) kedy možno rozliacutešiť všetky ľudskeacute chromozoacutemy ndash teda 24 rocircznych chromozoacutemov M-FISH a SKY patria medzi metafaacutezne formy FISH diagnostiky ktoreacute umožňujuacute simultaacutennu vizualizaacuteciu všetkyacutech ľudskyacutech chromozoacutemov v rocircznych farbaacutech čo predstavuje uľahčenie analyacutezy karyotypu hlavne pri komplexnyacutech zmenaacutech a markeroch neznaacutemeho pocircvodu Obe techniky vychaacutedzajuacute z použitia

46

celochromozoacutemovyacutech sond značenyacutech kombinaacuteciou viaceryacutech fluorochroacutemov Rozdiel medzi M-FISH a SKY spočiacuteva v technike ziacuteskania konečneacuteho obrazu

Obr 46 Multicolor FISH - každyacute chromozoacutemovyacute paacuter je zafarbenyacute inou farbou pričom na ich zafarbenie postačuje kombinaacutecia 5 fluorochroacutemov Na vyhodnocovanie je potrebnaacute špeciaacutelna sada fluorescenčnyacutech filtrov pre jednotliveacute fluorochroacutemy a špeciaacutelnyacute softweacuter Vľavo-štandardnyacute karyotyp vpravo karyotyp s mutaacuteciami (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

V molekulovej cytogenetike suacute komerčne dostupneacute sety M-FISH proacuteb umožňujuacutece

viacfarebneacute pruacutežkovanie chromozoacutemov (banding) s vysokyacutem rozliacutešeniacutem (multicolor-banding mBAND FISH MCB) čo umožňuje identifikaacuteciu intrachromozoacutemovyacutech prestavieb (Obr 47) Nevyhnutnosťou mBAND-u je mať chromozoacutemy v metafaacuteze Taacuteto metoacuteda bola prvyacutekraacutet uskutočnenaacute na chromozoacuteme 5 v roku 1999 mBAND FISH umožňuje rozliacutešiť špecifickeacute oblasti chromozoacutemov na uacuterovni pruacutežku - bandu a sub-bandu s detekciou 550 bandov haploidneacuteho karyotypu

Obr 47 A - mBAND chromozoacutemu 11 - inverzia duplikovanej oblasti 11q223-q25 B - mBAND chromozoacutemu 3 - na kruhovom chromozoacuteme deleacutecia oblasti 3p263 C - mBAND chromozoacutemu 2 - potvrdenie inverzie duplikovanej časti chromozoacutemu (poskytnuteacute RNDr Dagmar Landlovou Medirex)

FISH metoacuteda a jej varianty (M-FISH mBAND SKY) majuacute v suacutečasnosti širokeacute využitie v

klinickej genetike v onkologickej genetike na detekciu aberaacuteciiacute v čase diagnoacutezy počas liečby po

47

liečbe monitorovanie po transplantaacutecii kostnej drene v prenataacutelnej a postnataacutelnej diagnostike pri detekcii submikroskopickyacutech deleacuteciiacute (napr DiGeorge syndroacutem - 22q112 delečnyacute syndroacutem PraderndashWilli syndroacutem- chromozoacutem 15q11-13) prostredniacutectvom FISH je možnaacute detekcia numerickyacutech zmien chromozoacutemov (trizoacutemia chromozoacutemu 21 pri Downovom syndroacuteme trizoacutemia chromozoacutemu 15 pri Patauovom syndroacuteme trizoacutemia chromozoacutemu 18 pri Edwardsovom syndroacuteme) rocirczne zmeny v počte pohlavnyacutech chromozoacutemov (monozoacutemia X pri Turnerovom syndroacuteme Klinefelterov syndroacutem s X chromozoacutemom naviac - XXY) podobne v predimplantačnej diagnostike

83 DNA Microarray (DNA mikro čip biočip) DNA mikročipovanie je technika využiacutevajuacuteca hybridizaacuteciu skuacutemanej nukleovej kyseliny

(cieľovaacute vzorka) s veľkyacutem množstvom oligonukleotidovyacutech proacuteb (desať tisiacutec až milioacuten) ktoreacute suacute prichyteneacute na pevnyacute podklad najčastejšie sklenyacute silikoacutenovyacute alebo nylonovyacute (doštička čip) Skuacutemanaacute nukleovaacute kyselina je pred hybridizaacuteciou fragmentovanaacute označenaacute fluorofoacuterom a denaturovanaacute Po kontakte čipu s cieľovou vzorkou ktoraacute je vlastne zmes označenyacutech oligonukleotidov značeneacute oligonukleotidy hybridizujuacute s oligonukleotidovyacutemi sekvenciami prichytenyacutemi na čipe Potom suacute na zaacuteklade fluorescencie detekovaneacute miesta kde došlo k hybridizaacutecii čiže vzorka obsahovala takuacuteto nukleotidovuacute sekvenciu Z jedneacuteho mikročipu sa ziacuteska obrovskeacute množstvo daacutet ktoreacute je vždy nutneacute softveacuterovo spracovať V dnešnej dobe existuje niekoľko firiem poskytujuacutecich komerčne mikročipy na objednaacutevku alebo si ich laboratoacuteria produkujuacute sami

Mikročipovanie prebieha nasledovne

1) Vytvorenie DNA čipu ndash tisiacutece rocircznych jednovlaacuteknovyacutech DNA oligonukleotidov znaacutemych sekvencii sa kovalentne naviažu na povrch doštičky vždy v určitej lokalite je niekoľko rovnakyacutech oligonukleotidov veľkosť takejto lokality je ˂ 200 microm Proacutebami mocircže byť DNA cDNA alebo syntetizovaneacute oligonukleotidy Už hotoveacute mikročipy ponuacutekajuacute viacereacute firmy (Affymetrix Agilent Technologies Eppendorf Illumina) alebo si ich jednotliveacute laboratoacuteria vyraacutebajuacute sami pomocou robotickyacutech zariadeniacute DNA čip sa vytvaacutera buď nanaacutešaniacutem kvapiek oligonukleotidov na podklad alebo synteacutezou oligonukleotidov in situ na čipe 2) Priacuteprava vzorky ndash nukleovaacute kyselina (mRNA DNA) sa purifikuje určiacute sa jej kvantita a kvalita (spektrofotometericky) fragmentuje resp v priacutepade mRNA sa syntetizuje cDNA v priacutepade potreby sa mocircže DNA amplifikovať PCR reakciou štiepiť restrikčnyacutemi endonukleaacutezami 3) Fluorescenčneacute označenie (zriedkavejšie raacutedioaktiacutevne) fragmentov DNA prebieha počas reverznej transkripcie alebo PCR amplifikaacutecie za uacutečasti fluorescenčne značenyacutech nukleotidov Keď sa analyzujuacute dve rocirczne vzorky napr zdraveacute tkanivo a naacutedoroveacute tkanivo označenie nukleovyacutech kyseliacuten v tyacutechto tkanivaacutech byacuteva rozdielne a to použitiacutem dvoch rocircznych fluorescenčnyacutech farbiacutev (napr zeleneacute a červeneacute) Pred hybridizaacuteciou je potrebneacute vzorku denaturovať čiacutem sa vytvoriacute zmes jednovlaacuteknovyacutech DNA označenyacutech značkou 4) Hybridizaacutecia s mikročipom ndash v špeciaacutelnom hybridizačnom roztoku hybridizujuacute komplementaacuterne sekvencie zo vzorky s priacuteslušnyacutemi oligonukleotidovyacutemi sondami naviazanyacutemi na čipe Potom sa čip obmyje aby došlo k odstraacuteneniu čiastočne hybridizovanyacutech nukleovyacutech kyseliacuten 5) Skenovanie mikročipu ndash skenerom čipov docircjde k ožiareniu čipu laserom pričom v mieste hybridizaacutecie fluorescenčne značenyacutech DNA fragmentov s proacutebou docircjde k emisii svetla určitej vlnovej dĺžky ktoruacute skener zaznamenaacute 6) Analyacuteza daacutet prebieha metoacutedami bioinformatiky spracovaniacutem softveacutermi sa zistiacute ktoreacute lokality čipu navzaacutejom hybridizovali v priacutepade použitia dvoch vzoriek kontrolnej a skuacutemanej je možneacute analyzovať ich relatiacutevnu intenzitu hybridizaacutecie (expresie určiteacuteho geacutenu)

Existujuacute štyri typy mikročipov 1) Čipy ur čeneacute na analyacutezu expresie (obsahujuacute cDNA proacuteby) pre tzv dvojkanaacutelovyacute experiment kedy je vzorka určenaacute k hybridizaacutecii na čipe ziacuteskanaacute zmiešaniacutem DNA fragmentov kontrolnej a skuacutemanej vzorky pričom fragmenty suacute rozdielne fluorescenčne označeneacute (napr zelenyacute fluorofoacuter pre kontrolnuacute vzorku a červenyacute pre skuacutemanuacute) Na zaacuteklade intenzity a typu fluorescencie sa deteguje expresia geacutenov typickaacute pre kontrolnuacute vzorku (napr zelenaacute fluorescencia) pre skuacutemanuacute vzorku (napr

48

červenaacute fluorescencia) a expresia podobnaacute u oboch vzoriek (žltaacute fluorescencia) neexprimovaneacute geacuteny (čierna fluorescencia) rocirczne odtiene (v zaacutevislosti od prevažujuacutecej hybridizaacutecie) (obr 48) 2) Čipy ur čeneacute na analyacutezu mutaacutecii použije sa genoacutemovaacute DNA označenaacute jednou fluorescenčnou farbičkou na určenie jednonukleotidovej zmeny (SNP ndash Single Nukleotide Polymorphism) 3) Čipy na komparatiacutevnu genoacutemovuacute hybridizaacuteciu (aCGH array Comparative Genomic Hybridization) ndash použiacutevaneacute na zistenie zvyacutešenia alebo zniacuteženia množstva chromozoacutemovyacutech fragmentov obsahujuacutecich geacuteny zodpovedneacute za určiteacute ochorenie Na analyacutezu sa použije skuacutemanaacute gDNA a referenčnaacute (kontrolnaacute) DNA každaacute sa značiacute inou fluorescenčnou farbičkou (princiacutep ako pri analyacuteze expresie) (obr 49 50) 4) Čipy CGH - SNP kombinovaneacute čipy ur čeneacute na analyacutezu aj mutaacuteciiacute SNP aj na komparatiacutevnu genoacutemovuacute hybridizaacuteciu CGH

Mikročipy majuacute rozsiahle využitie napriacuteklad v identifikaacuteciiacute novyacutech geacutenov vo vyacuteskume ich funkciiacute expresie v rocircznych podmienkach pri diagnostike mnohyacutech ochoreniacute vo farmakogenomike vo vyacuteskume vplyvu toxiacutenov

Obr 48 Heatmapa geacutenovej expresie vybranyacutech geacutenov (mRNA) mikročip obsahuje 46000 cDNA proacuteb (poskytnuteacute Ing Helenou Gbelcovou PhD Uacutestav lekaacuterskej bioloacutegie genetiky a klinickej genetiky LF UK a UNB)

49

Obr 49 Princiacutep komparatiacutevnej genoacutemovej hybridizaacutecie (aCGH - array comparative genomic hybridization) Obr 50 A) Vyacutesledok komparatiacutevnej genoacutemovej hybridizaacutecie (aCGH - array comparative genomic hybridization) vzorky DNA izolovanej plodovej vody U plodu s abnormaacutelnym ultrasonografickyacutem vyšetreniacutem bola identifikovanaacute duplikaacutecia oblasti 3q261q29 (modryacute paacutes) a deleacutecia oblasti 5p1533p151 (červenyacute paacutes) Pre porovnanie chromozoacutem 1 bez aberaacutecie b) Ten istyacute pacient ale ineacute softveacuteroveacute spracovanie (poskytnuteacute RNDr Miroslavom Tomkom PhD Medirex)

50

Odporuacutečanaacute a použitaacute literatuacutera

Odborneacute knihy Klug W S Cummings M R Spencer Ch A Palladino M A Concepts of Genetics jedenaacuteste vydanie (2015) Carson S Molecular Biology Techniques tretie vydanie (2012) Strachan T Read A Human Molecular Genetics štvrteacute vydanie (2011) Sudbery P Sudbery I Human Molecular Genetics tretie vydanie (2009)

Internetoveacute straacutenky

wwwncbinlmnihgov wwwmlpacom wwwthermofishercom wwwilluminacom wwwpromegask wwwqiagencom wwwambioncom

Odborneacute člaacutenky Chacon-Cortes D Griffiths L R Methods for extracting genomic DNA from whole blood samples current perspectives Journal of Biorepository Science for Applied Medicine Volume 2 strany 1- 9 Viltrop T Krjutskov K Palta P Metspalu A Comparison of DNA extraction methods for multiplex polymerase chain reaction Anal Biochem 2010 Volume 398(2) strany 260-262 Ing Martin Čermaacutek Molekulaacuterna cytogenetika v problematike familiaacuternych maligniacutet Onkoloacutegia Volume 2 strany 77 - 83 Livak KJ Schmittgen TD Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method Methods 2001 Volume 25(4) strany 402 - 408 Bustin S A Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays J Mol Endocrinol 2000 Volume 25(2) strany169 - 193

MOLEKULAacuteRNE METOacuteDY AKTUAacuteLNE POUŽIacuteVANEacute V KLINICKEJ GENETIKE RNDr Andrea Pastoraacutekovaacute PhD RNDr Robert Petrovič PhD Vydala Univerzita Komenskeacuteho v Bratislave Lekaacuterska fakulta Rozsah 50 straacuten 246 AH prveacute vydanie ISBN 978-80-223-4231-5

7

Obr 2 Laminaacuterny box na izolaacuteciu nukleovyacutech kyseliacuten praacutecu s DNA RNA atď Obr 3 Automatickyacute pipetovaciacute robot napr na izolaacuteciu 96 vzoriek DNA

8

2 Stanovenie kvantity a kvality nukleovyacutech kyseliacuten

Docircležiteacute je určenie koncentraacutecie a čistoty izolovanej DNA a RNA pretože analyacutezy ktoreacute nasledujuacute po izolaacutecii nukleovyacutech kyseliacuten často vyžadujuacute presneacute množstvo a čistotu nukleovyacutech kyseliacuten (NK bez priacutemesiacute) Metoacuted kvantifikaacutecie NK je niekoľko najpoužiacutevanejšie suacute spektrofotometrickaacute kvantifikaacutecia a kvantifikaacutecia UV fluorescenciou za priacutetomnosti farbičky

21 Spektrofotometrickaacute kvantifikaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten

Nukleoveacute kyseliny špecificky absorbujuacute ultrafialoveacute svetlo Vzorka s NK je v spektrofotometri (obr 6) vystavenaacute ultrafialoveacutemu svetlu o vlnovej dĺžke 260nm fotodetektor naacutesledne zmeria svetlo ktoreacute prejde vzorkou čiacutem viac svetla vzorka pohltiacute (absorbuje) tyacutem je vyššia koncentraacutecia nukleovej kyseliny vo vzorke Vyacutepočet koncentraacutecie NK zaacutevisiacute od toho či ide o DNA alebo RNA či je jednovlaacuteknovaacute alebo dvojvlaacuteknovaacute dsDNA c = A260002 [microgml] ssDNA c = A2600027 [microgml] RNA c = A2600025 [microgml]

Teda ak absorbancia dsDNA je 1 koncentraacutecia DNA vo vzorke je 50 microgml (pozn v priacutepade ak je draacuteha luacuteča 1cm)

Pokiaľ poznaacuteme sekvenciu napr pri synteacuteze primeru (ssDNA) mocircžeme z nej vypočiacutetať molekulovuacute hmotnosť a určiť priamo molaacuternu koncentraacuteciu nukleovej kyseliny (pmolmicrol) c = A260 lowast (100[15A + 071lowastC + 12lowastG + 084lowastT]) [pmolmicrol] A je počet adeniacutenov (v skutočnosti dATP) C je počet cytoziacutenov (dCTP) G je počet guaniacutenov (dGTP) a T počet tymiacutenov (dTTP)

Predpokladom pre spraacutevne určenie koncentraacutecie na zaacuteklade absorbancie je samozrejme čistota nukleovej kyseliny vo vzorke Čistota NK sa určuje podľa absorbčnej krivky popriacutepade zjednodušene na zaacuteklade pomeru absorbanciiacute pri 260 a 280 nm pretože proteiacuteny absorbujuacute svetlo vlnovej dĺžky 280nm Čistaacute DNA maacute pomer absorbanciiacute 260280 (A260280) pohybujuacutece sa okolo 18 čistaacute RNA maacute pomer absorbancii A260280 približne 2

Vzorku nukleovyacutech kyseliacuten mocircžu okrem proteiacutenov kontaminovať aj ďalšie laacutetky ako je fenol ktoryacute sa často využiacuteva pri izolaacutecii NK Takto izolovaneacute vzorky nukleovyacutech kyseliacuten nekontaminovaneacute fenolom by mali mať A260280 okolo 2 Ďalšie kontaminanty sa zisťujuacute absorbciou svetla pri 230 nm a 330 nm

22 Kvantifikaacutecia s použitiacutem fluorescenčnyacutech farbiacutev

Ďalšou možnosťou ako zmerať koncentraacuteciu nukleovyacutech kyseliacuten je zmeranie fluorescencie farbiva (napr etidiumbromid) ktoreacute sa viaže na nukleovuacute kyselinu a selektiacutevne svieti v priacutepade že je naviazaneacute na NK Metoacuteda využitia fluorescenčneacuteho farbiva naviazaneacuteho na NK sa použiacuteva v priacutepade ak je koncentraacutecia NK priacuteliš niacutezka na kvantifikaacuteciu spektrofotometrom ako aj v priacutepade že je NK kontaminovanaacute laacutetkou (kontaminantom) absorbujuacutecim svetlo vlnovej dĺžky 260nm 221 Využitie migraacutecie nukleovej kyseliny v geacuteli s jej naacuteslednou fluorescenčnou detekciou

Ak predpokladaacuteme niacutezku koncentraacuteciu NK na jej zistenie použijeme elektroforetickuacute

migraacuteciu NK v geacuteli (mocircže sa použiť agaroacutezovyacute alebo polyakrylamidovyacute geacutel) fluorescenčneacute farbivo je buď primiešaneacute do vzorky NK alebo priamo do geacutelu Spolu so vzorkou NK neznaacutemej koncentraacutecie migruje v geacuteli vo vedľajšej draacutehe vzorka NK so znaacutemou koncentraacuteciou Na zaacuteklade porovnania fluorescencie (po vystaveniacute geacutelu s NK svetlu o konkreacutetnej vlnovej dĺžke) vzorky so znaacutemou

9

koncentraacuteciu a vzorky neznaacutemej koncentraacutecie sa urobiacute odhad resp sa vyacutesledok kalkuluje počiacutetačovyacutem softveacuterom denzitometricky (obr 4)

222 Využitie kvantifikaacutecie množstva nukleovyacutech kyseliacuten použitiacutem real-time PCR metoacutedy

V priacutepade veľmi maleacuteho množstva NK ktoreacute nie je možneacute kvantifikovať ani geacutelovou elektroforeacutezou resp potrebujeme zistiť koncentraacuteciu NK veľmi presne u maleacuteho množstva NK (napr pre kriminalistiku) použije sa metoacuteda absoluacutetnej kvantifikaacutecie prostredniacutectvom real-time PCR (kvantifika čnej PCR qPCR) Princiacutep metoacutedy spočiacuteva v porovnaniacute amplifikaacutecie určiteacuteho uacuteseku nukleovej kyseliny vo vzorke neznaacutemej koncentraacutecii s amplifikaacuteciou tej istej sekvencie vo vzorke presne definovanej koncentraacutecie (obr 5) qPCR je možneacute kvantifikovať koncentraacuteciu raacutedovo v pgul 223 Kvantifikaacutecia fluorospektrofotometrom (fluori metrom)

Ak maacuteme dostatočneacute množstvo vzorky je možneacute na kvantifikaacuteciu použiť fluorospektrofotometer v tomto priacutepade je vzorka zmiešanaacute s fluorescenčnyacutem farbivom a je meranaacute emitovanaacute fluorescencia z ktorej sa vypočiacuteta koncentraacutecia

Moderneacute spektrofotometre a fluorimetre suacute konštruovaneacute tak aby na meranie bolo použiteacute minimaacutelne množstvo vzorky NK (napr pre priacutestroje NanoDrop je potrebnyacute len 05-1 microl vzorky) Pre porovnanie NanoDrop spektrofotometer (NanoDrop 2000c) je schopnyacute zmerať koncentraacutecie od 04 to 15 000 ngmicroL dsDNA NanoDrop fluorospektrometer 005 do 2000 pgmicroL Spektrofotometre a fluorofotometre suacute po meraniacute schopneacute vďaka softveacuteroveacutemu vybaveniu vypočiacutetať nielen koncentraacuteciu ale aj čistotu vzorky (httpwwwnanodropcom) Obr 4 Kvantifikaacutecia nukleovej kyseliny porovnaniacutem s fragmentom podobnej dĺžky a znaacutemej koncentraacutecie (po migraacutecii v agaroacutezovom geacuteli v jednosmernom elektrickom pruacutede a naacuteslednej fluorescenčnej detekcii) - odhad DNA v 3 draacutehe cca 100ng porovnaniacutem s 1000bp fragmentom štandardu molekulovyacutech hmotnostiacute (šmh)

10

Obr 5 Absoluacutetna kvantifikaacutecia DNA priacutestrojom real-time PCR cykleacuterom porovnaniacutem amplifikaacutecie uacuteseku DNA v skuacutemanej vzorke s amplifikaacuteciou vzorky so znaacutemou kvantitou Okrem amplifikaacutecie skuacutemanej vzorky je treba urobiť štandardnuacute krivku amplifikaacutecie vzorky znaacutemej koncentraacutecie z ktorej sa koncentraacutecia skuacutemanej vzorky odčiacuteta V kriminalistike sa bežne použiacuteva pridanie vnuacutetornej kontroly ku vzorke na určenie čistoty vzorky (v priacutetomnosti inhibiacutetorov nedocircjde k amplifikaacutecii žiadnej DNA) Vnuacutetornaacute kontrola je už priacutetomnaacute v kite čiže sa automaticky pridaacuteva pri priacuteprave vzoriek na qPCR amplifikaacuteciu sluacuteži na zistenie priacutetomnosti inhibiacutetorov v skuacutemanej vzorke teda v priacutepade že nedocircjde k amplifikaacutecii vo vzorke sluacuteži na rozliacutešenie či je koncentraacutecia DNA priacuteliš niacutezka alebo suacute vo vzorke priacutetomneacute inhibiacutetory Bežnaacute mediciacutenska molekulaacuterno-genetickaacute diagnostika nevyžaduje priacutetomnosť vnuacutetornej kontroly keďže nukleoveacute kyseliny suacute prevažne izolovaneacute kitmi z krvi čiže je zabezpečenaacute vysokaacute kvalita a čistota naizolovanej NK Obr 6 Spektrofotometer (NanoPhotometer) a ukaacutežka vyacutesledkou merania koncentraacutecie RNA izolovanej minikolonovou metoacutedou

11

3 PCR (polymeraacutezovaacute reťazovaacute reakcia)

Je metoacuteda vyvinutaacute v roku 1983 Karym Mullisom ocenenaacute v roku 1993 Nobelovou cenou za cheacutemiu Polymeraacutezovaacute reťazovaacute reakcia je založenaacute na schopnosti DNA polymeraacutezy syntetizovať noveacute vlaacutekno DNA podľa templaacutetoveacuteho vlaacutekna na zaacuteklade princiacutepu komplementarity DNA polymeraacuteza je schopnaacute pripaacutejať nukleotidy len k voľnej 3acuteOH skupine preto potrebuje primer (čiacutetaj prajmer) ku ktoreacutemu je schopnaacute pridaacutevať nukleotidy Primery suacute kraacutetke jednovlaacuteknoveacute oligonukleotidy ktoreacute umožňujuacute jednak DNA polymeraacuteze začať so synteacutezou noveacuteho vlaacutekna na druhej strane ohraničujuacute špecifickuacute oblasť ktoruacute chceme amplifikovať (namnožiť) Vyacutesledkom PCR reakcie je obrovskyacute počet koacutepii špecifickej sekvencie (obr 7) PCR v podstate napodobňuje replikaacuteciu DNA v in vitro podmienkach s rozdielom že nedochaacutedza k replikaacutecii celej DNA ale len vybraneacuteho primermi ohraničeneacuteho miesta

31 Najdocircležitejšie PCR komponenty

Templaacutetovaacute DNA je vzorka DNA obsahujuacuteca cieľovuacute sekvenciu Na začiatku reakcie docircjde pri vysokej teplote k denaturaacutecii a separaacutecii jednotlivyacutech vlaacutekien dvojvlaacuteknovej DNA

Enzyacutem DNA polymeraacuteza syntetizuje noveacute DNA vlaacutekno komplementaacuterne k cieľovej sekvencii Najčastejšie použiacutevanou a prvou DNA polymeraacutezou je Taq DNA polymeraacuteza (z termofilnej bakteacuterie Thermus aquaticus) zatiaľ čo Pfu DNA polymeraacuteza (z Pyrococcus furiosus) je preferovanaacute kvocircli tzv vysokej fidelite čo je schopnosť inkorporovať spraacutevnu baacutezu do novosyntetizovaneacuteho vlaacutekna DNA DNA polymeraacutezy musia mať dve vlastnosti schopnosť syntetizovať noveacute vlaacutekno DNA podľa templaacutetovej DNA a byť termostabilneacute čiže rezistentneacute na vysokeacute teploty (cca 100degC) V suacutečasnosti sa v laboratoacuteriaacutech často použiacutevajuacute rekombinantneacute polymeraacutezy s požadovanyacutemi vlastnosťami Napriacuteklad pre PCR ktorej produkt bude klonovanyacute je docircležiteacute použiť polymeraacutezu ktoraacute je schopnaacute opraviť vlastnuacute chybu v priacutepade inkorporaacutecie nespraacutevnej baacutezy pri synteacuteze noveacuteho reťazca Schopnosť opravovať nespraacutevne inkorporovaneacute baacutezy počas synteacutezy noveacuteho vlaacutekna DNA sa nazyacuteva tzv proofreading aktivita ktoraacute je zabezpečenaacute 3rarr5acute exonukleaacutezovou aktivitou takejto polymeraacutezy Pred vlastnou molekulaacuterno-genetickou diagnostikou je treba optimalizovať podmienky PCR reakcie pre konkreacutetnu DNA polymeraacutezu a pre špecifickeacute primery treba zistiť optimaacutelnu teplotu annealingu (hybridizaacutecie) primerov koncentraacutecie jednotlivyacutech zložiek PCR reakcie (napr MgCl2)

Primery suacute kraacutetke jednovlaacuteknoveacute DNA sekvencie komplementaacuterne k cieľovej sekvencii DNA polymeraacuteza začiacutena syntetizovať noveacute vlaacutekno z 3acutekonca primeru Docircležitou charakteristikou primerov je teplota topenia (Tm) t j teplota pri ktorej polovica DNA duplexov je disociovanaacute na jednovlaacuteknoveacute molekuly

Nukleotidy (dNTP deoxyribonukleotidtrifosfaacutety) suacute stavebneacute prvky pre novosyntetizovanuacute DNA molekulu

Veľmi praktickyacutem riešeniacutem pre molekulaacuterno-genetickeacute diagnostickeacute laboratoacuteria je tzv mastermix to je roztok v ktorom už je priacutetomneacute všetko potrebneacute pre priebeh PCR reakcie samozrejme okrem primerov a templaacutetovej DNA sekvencie PCR Master Mix (2X) od firmy ThermoFisher Scientific je jednyacutem z takyacutechto mixov obsahuje Taq DNA polymeraacutezu tlmivyacute roztok (pufor) MgCl2 a všetky deoxyribonukleotidy trifosfaacutety

Tabuľka č 1 uvaacutedza ako sa PCR reakcia z mastermixu pripravuje pre jednu vzorku Keďže v laboratoacuteriu sa zriedka robiacute PCR reakcia s jednou vzorkou treba si pripraviť tzv premix (tj PCR reakcie pre vaumlčšiacute počet vzoriek ale bez templaacutetovej DNA) ktoryacute sa rozdeliacute do mikroskuacutemaviek a až potom sa k nim pridaacute DNA resp cDNA

12

Tab 1 Priacuteprava PCR premixu

Celkovyacute objem jednej PCR reakcie 10 microl Počet vzoriek 8 2x PCR master mix 5 40

primer sense (10microM) 05 4

primer antisense (10microM) 05 4

H2O 35 28

DNA cDNA 05

rozpipetovať premix po 95microl do mikroskuacutemaviek až potom pridať do každej mikroskuacutemavky zvlaacutešť DNA cDNA

spolu objem 10 76

PCR amplif ikaacutecia je cyklickyacute proces pozostaacutevajuacuteci z troch krokov (obr 7) 1) denaturaacutecia dvojvlaacuteknovej DNA pri vysokej teplote (95degC) 2) hybridizaacutecia (annealing) primerov k špecifickej sekvencii DNA pri teplote vhodnej pre konkreacutetne primery 3) polymerizaacutecia (synteacuteza) novyacutech vlaacutekien DNA (72degC)

Obr 7 Princiacutep PCR

Tieto tri kroky sa opakujuacute 25 ndash 40 kraacutet pričom pri každom cykle sa počet molekuacutel zdvojnaacutesobiacute (vyacuteslednyacute počet cieľovej sekvencie je 2n+1 ak na začiatku bola jedna dvojvlaacuteknovaacute DNA a počet cyklov je n) PCR prebieha v termaacutelnom cykleacuteri (teplotnom cyklovači) je to priacutestroj (obr 8) kde je možneacute vykonať a naprogramovať celyacute termaacutelny priebeh PCR reakcie Tabuľka č 2 je priacutekladom termaacutelneho programu pre konkreacutetnu PCR reakciu

Po PCR reakcii je vyacuteslednyacute produkt možneacute vizualizovať elektroforeticky resp použiť na ďalšiu analyacutezu

13

Tab 2 Priacuteklad klasickeacuteho teplotneacuteho a časoveacuteho profilu PCR PCR Teplota Čas Opakovanie

95degC 2 minuacutety

95degC 15 sekuacutend

66degC 60 sekuacutend 30x

72degC 60 sekuacutend

72degC 5 minuacutet

Obr 8 Termaacutelny cykleacuter v procese a otvorenyacute s mikroskuacutemavkami

32 Variaacutecie PCR

Hot-start PCR využiacuteva DNA polymeraacutezu ktoruacute je treba aktivovať vysokou teplotou (napr 95degC 10 minuacutet) Vyacutehodou použiacutevania hot-start polymeraacutez je možnosť pracovať pri laboratoacuternej teplote keďže polymeraacuteza je pri bežnej teplote neaktiacutevna a tyacutem nemocircže docircjsť k vzniku nešpecifickyacutech produktov

Touchdown PCR maacute v počiatočnyacutech cykloch vyššiu teplotu annealingu (uacutečelom je zvyacutešiť

špecificitu PCR produktov na začiatku PCR) neskocircr sa teplota annealingu zniacuteži čo maacute za naacutesledok vyššiacute vyacuteťažok PCR produktu

Nested PCR maacute dva kroky a potrebuje dva paacutery primerov V prvom kroku sa prostredniacutectvom

prvej sady primerov amplifikuje dlhšiacute DNA fragment Ten sa použije ako templaacutet v druhom kroku s druhou sadou primerov s vyacuteslednyacutem kratšiacutem DNA produktom Nested PCR zvyšuje špecifickosť a citlivosť diagnostickyacutech PCR

Multiplex PCR je vlastne viac PCR reakciiacute prebiehajuacutecich v jednej skuacutemavke suacutečasne

V reakčnej zmesi je viac paacuterov primerov suacutečasne prebehne amplifikaacutecia viaceryacutech uacutesekov DNA takto dochaacutedza k šetreniu vzorky reakčnej zmesi a pracovneacuteho času

14

Real-time PCR je venovanaacute špeciaacutelna časť v skriptaacutech Sluacuteži na kvantifikaacuteciu PCR produktu v reaacutelnom čase na zaacuteklade merania fluorescencie okrem kvantifikaacutecie je využiacutevanaacute aj na určenie genotypov

RT-PCR je variaacutecia PCR umožňujuacuteca amplifikaacuteciu DNA sekvencie z vyacutechodiskovej RNA

sekvencie Najskocircr musiacute prebehnuacuteť prepis RNA do jednovlaacuteknovej cDNA prostredniacutectvom reverznej transkriptaacutezy naacutesledne sa cDNA použije pre PCR Selektiacutevnym použitiacutem primerov pri reverznej transkripcii mocircžeme uacutečelovo prepiacutesať buď celkovuacute RNA (primery - random hexameacutery) alebo len mRNA (primery - oligoT)

Alelovo-špecifickaacute PCR (AS-PCR) (obr 9) sluacuteži na detekciu konkreacutetnych mutaacuteciiacute

a jednonukleotidovyacutech polymorfizmov (SNP) Použije sa sada 3 primerov v dvoch kombinaacuteciaacutech PCR reakciiacute dva primery majuacute odlišnuacute sekvenciu na 3acute-koncoch jeden na detekciu wt (wild type) a druhyacute primer na detekciu mutantnej alely reakcia neprebehne ak miesto na templaacutetovej DNA nie je komplementaacuterne k 3acute-koncu primeru pretože DNA polymeraacuteza vyžaduje uacuteplnuacute hybridizaacuteciu primera na 3acute-konci Takto je možneacute rozliacutešiť priacutetomnosť štandardnej (wildtype ndash wt) a mutantnej alely resp SNP (obr 9) AS-PCR je znaacutema aj pod ďalšiacutemi naacutezvami ASO-PCR (allele-specific oligonucleotide PCR) ARMS (amplification-refractory mutation system)

Obr 9 Alelovo-špecifickaacute PCR (AS-PCR)

Mutageneacuteza prostredniacutectvom PCR (site directed mutagenesis) sa použiacuteva keď je potrebneacute vytvoriť mutaacuteciu v špecifickom mieste geacutenu primerprimery majuacute modifikovanuacute sekvenciu tak že obsahujuacute mutaacuteciu v strednej časti čo neovplyvniacute hybridizaacuteciu primerov s templaacutetovou DNA pričom vyacutesledkom je PCR produkt s cielene mutovanou DNA sekvenciou

Asymetrickaacute PCR sa použiacuteva na synteacutezu koacutepiiacute jedneacuteho vlaacutekna z templaacutetovej DNA a to

použitiacutem veľmi niacutezkej koncentraacutecie jedneacuteho primeru Sekvenačnaacute PCR je PCR v ktorej je použityacute len jeden primer a v reakčnej zmesi suacute okrem

všetkyacutech dNTP priacutetomneacute dideoxynukleotidtrifosfaacutety (ddNTP) značeneacute raacutedioaktiacutevne dnes však prevažne fluorescenčne každyacute typ ddNTP inou fluorescenčnou farbičkou Zaradenie niektoreacuteho zo štyroch ddNTP spocircsobiacute terminaacuteciu (zastavenie) predlžovania DNA reťazca fluorescenčneacute označenie ddNTP umožniacute detekciu dĺžky fragmentu a určenie sekvencie posledneacuteho nukleotidu Vyacuteslednyacute produkt sekvenačnej PCR sluacuteži na sekvenovanie Sekvenovaniu sa venuje samostatnaacute časť

MLPA (multiplex ligation-dependent probe amplification) ndash multiplexnaacute amplifikaacutecia proacuteb zaacutevislaacute od ligaacutecie je variaacutecia multiplexnej PCR umožňujuacuteca namnoženie viaceryacutech uacutesekov DNA za použitia iba jedneacuteho paacuteru primerov avšak s podmienkou vytvorenia sekvenčne špecifickej proacuteby ligaacuteciou sekvenčne špecifickyacutech oligonukleotidov MLPA je metoacuteda umožňujuacuteca detekciu počtu koacutepiiacute

15

až 50 nukleotidovyacutech sekvenciiacute v jednej reakcii Pomocou MLPA je možneacute ryacutechlo identifikovať amplifikaacutecie a deleacutecie veľkeacuteho počtu geacutenov či už z DNA alebo mRNA okrem toho MLPA mocircže byť použitaacute na analyacutezu CpG-metylaacutecie (MS-MLPA) Viac informaacutecii v samostatnej časti

SNaPshotreg Multiplex nazyacutevaneacute aj minisekvenovanie je multiplexnaacute reakcia v ktorej je každyacute primer predĺženyacute iba o jeden nukleotid (obr 10) V reakčnej zmesi nie suacute priacutetomneacute deoxyribonukleotidtrifosfaacutety ale len dideoxyribonukleotidtrifosfaacutety (ddATP ddCTP ddGTP ddTTP) každyacute označenyacute inou fluorescenčnou farbičkou Po integraacutecii ddNTP do DNA vlaacutekna je polymerizaacutecia ukončenaacute Jednovlaacuteknoveacute fragmenty (primery) predĺženeacute presne o jeden ddNTP suacute separovaneacute kapilaacuternou elektroforeacutezou v genetickom analyzaacutetore pričom je detegovanaacute ich fluorescencia a dĺžka (obr 11) Z vyacutesledneacuteho elektroforetogramu (obr 12) je možneacute určiť v jednej reakcii sekvenciu vo viac ako v 10 lokalitaacutech určiteacuteho fragmentu DNA SNaPshot Multiplex sa v molekulaacuterno-genetickom laboratoacuteriu využiacuteva na ryacutechlu detekciu viaceryacutech najčastejšie sa vyskytujuacutecich mutaacuteciiSNP geacutenu

Obr 10 Priacuteklad využitia metoacutedy SnaPshot s použitiacutem sady 13 primerov ktoreacute sa predĺžia len o 1 značenyacute dideoxynukleotid SNaPshot najčastejšiacutech mutaacuteciiacute geacutenu pre 21-hydroxylaacutezu (CYP21A2) ktoreacute spocircsobujuacute kongenitaacutelnu adrenaacutelnu hyperplaacuteziu A T G a C predstavujuacute fluorescenčne značeneacute dideoxynukleotidy

Obr 11 Vyacutesledok analyacutezy DNA pacienta metoacutedou minisekvenovania SnaPshot konkreacutetne použitiacutem sady 13 primerov rozlišujuacutecich najčastejšie bodoveacute mutaacutecie geacutenu pre 21-hydroxylaacutezu (CYP21A2) analyacutezou sa zistila mutaacutecia V281L v heterozygotnom stave (dva fragmenty modryacute a červenyacute)

16

Obr 12 SNaPshot analyacuteza geacutenu CYP21A2 u DNA izolovanej z plodovej vody metoacuteda deteguje najčastejšie bodoveacute mutaacutecie geacutenu pre 21-hydroxylaacutezu vyacutesledok prenataacutelnej analyacutezy = priacutetomnosť mutaacutecie In2G v hemizygotnom stave (keďže qPCR metoacutedou bola u plodu zistenaacute priacutetomnosť len jednej koacutepie geacutenu CYP21A2)

33 Kvantitatiacutevna PCR (qPCR)

Polymeraacutezovou reťazovou reakciou (PCR) docielime namnoženie (amplifikaacuteciu) určiteacuteho DNA uacuteseku (templaacutetu) PCR je katalyzovanaacute DNA polymeraacutezou za priacutetomnosti primerov dNTPs dvojmocnyacutech katioacutenov (ako Mg+2) a pufrovacieho roztoku

Real-time PCR ktoraacute je nazyacutevanaacute aj kvantitatiacutevna PCR (qPCR) umožňuje vizualizaacuteciu a kvantifikaacuteciu amplifikaacutecie DNA v reaacutelnom čase to je tak ako to bežiacute počas PCR qPCR využiacuteva fluorescenčneacute chemikaacutelie (farbivaacute) ktoryacutech emitovanuacute fluorescenciu zaznamenaacuteva optickyacute systeacutem počas každeacuteho PCR cyklu zaznamenanaacute fluorescencia je naacutesledne softveacuterovo spracovanaacute a vyhodnotenaacute

V suacutečasnosti sa využiacutevajuacute dva typy qPCR cheacutemie a to farbivaacute viažuce sa na DNA a fluorescenčne značeneacute proacuteby (obr 13)

Farbivaacute viažuce sa na DNA emitujuacute fluorescenciu v priacutepade ak suacute naviazaneacute na dvojvlaacuteknovuacute DNA proacuteby fluoreskujuacute v priacutepade keď molekula zhaacutešača (angl quencher - Q) sa nenachaacutedza v bliacutezkosti molekuly reporteacutera (R) napr hydrolyzujuacutece proacuteby fluoreskujuacute keď je molekula reporteacutera (R) prostredniacutectvom 5acuteexonukleaacutezovej aktivity DNA polymeraacutezy odstraacutenenaacute z bliacutezkosti molekuly zhaacutešača (Q)

Grafickyacute priebeh real ndash time PCR znaacutezorňuje amplifika čnaacute krivka (angl amplification plot) (obr 14) majuacuteca 4 faacutezy 1) Faacuteza I ndash dochaacutedza k zdvojnaacutesobeniu množstva amplikoacutenu po každom cykle ale naacuterast fluorescencie je pod detekčnyacutem limitom zaznamenaacutevanaacute fluorescencia (baseline) zodpovedaacute zaacutekladnej fluorescencii pozadia tzv šumu

17

2) Faacuteza II nazyacutevanaacute aj exponenciaacutelna faacuteza v ktorej sa fluorescencia zvyacuteši na uacuteroveň optickej detekcie bod resp cyklus kedy začiacutena exponenciaacutelna faacuteza je kľuacutečovyacute na určenie kvantity vstupneacuteho množstva templaacutetovej DNA nazyacuteva sa prahovyacute cyklus označuje sa Ct (angl treshold cycle) alebo Cq (quantification) Čiacutem nižšie je Ct (Cq) tyacutem vaumlčšiacute počet koacutepiiacute templaacutetovej DNA bolo v reakcii Ct hodnota je teda hlavnyacute uacutedaj s ktoryacutem sa pracuje vo vyacutepočtoch fluorescencia v tomto mieste sa nazyacuteva prahovaacute resp treshold 3) Faacuteza III - lineaacuterna faacuteza ndash charakterizuje ju postupneacute spotrebovaacutevanie komponentov reakcie na narastajuacutece množstvo amplikoacutenu 4) Faacuteza IV - plateau (čiacutetaj platoacute) ndash množstvo amplikoacutenu sa v docircsledku vyčerpania zložiek qPCR už nezvyšuje

Obr 13 Princiacutep real-time PCR Obr 14 Faacutezy real-time PCR

Ako štandardnaacute PCR aj qPCR maacute tri zaacutekladneacute kroky 1) Denaturaacutecia dvojvlaacuteknovej DNA na jednovlaacuteknovuacute DNA pri vysokej teplote (obyčajne 95degC) 2) Hybridizaacutecia primerov (annealing) ndash komplementaacuterne sekvencie sa spolu hybridizujuacute 3) Polymerizaacutecia pri 70-72degC kedy v docircsledku optimaacutelnej aktivity DNA polymeraacutezy dochaacutedza k predĺženiu primeru až o 100 baacutez za sekundu

18

Real-time PCR (obr 15) sa využiacuteva na kvantifikaacuteciu expresie geacutenov určenie počtu koacutepiiacute geacutenov určenie genotypu (genotypovanie) alelovou diskriminaacuteciou alebo analyacutezou krivky topenia tzv high resolution melt a multiplexnuacute real time PCR s možnosťou detekcie viaceryacutech cieľovgeacutenov

Multiplexnaacute real-time PCR sa využiacuteva na detekciu viaceryacutech cieľovgeacutenov v jednej reakcii suacutečasne Vyacutehodou multiplexovania je jednak uacutespora vzorky ako aj ziacuteskanie vaumlčšieho množstva informaacuteciiacute z rovnakeacuteho množstva materiaacutelu Nevyhnutnosťou multiplexnej qPCR suacute proacuteby značeneacute rocircznymi fluorescenčnyacutemi farbivami

Najdocircležitejšie zložky qPCR (real-time PCR komponenty) suacute DNA polymeraacuteza (reverznaacute transkriptaacuteza v priacutepade jednokrokovej kvantitatiacutevnej RT-PCT) dNTPs primery resp primeryproacuteby dvojmocneacute Mg templaacutet Na uľahčenie qPCR suacute v suacutečasnosti už komerčne dostupneacute takeacute reakčneacute zmesi ku ktoryacutem stačiacute pridať už len templaacutet (napr kity využiacutevajuacutece TaqManProacuteby) alebo kity s fluorescenčnyacutemi farbami viažucimi sa na dvojvlaacuteknovuacute DNA ku ktoryacutem sa do reakčnej zmesi okrem templaacutetu pridajuacute primery

Obr 15 Real-time PCR cykleacuter

331 Kvantifikaacutecia pomocou qPCR

Na kvantifikaacuteciu DNA pomocou qPCR sa požiacutevajuacute dve zaacutekladneacute metoacutedy - absoluacutetna kvantifikaacutecia a relatiacutevna kvantifikaacutecia

Absoluacutetna kvantifikaacutecia vychaacutedza zo štandardnej krivky (obr 16) ktoraacute sa ziacuteska po qPCR seacuterie riedeniacute DNA znaacutemej koncentraacutecie Kvantifikaacutecia neznaacutemej vzorky sa zistiacute interpolaacuteciou (odčiacutetaniacutem) Ct neznaacutemej vzorky zo štandardnej krivky (obr 16 17) Využiacutevaneacute napr v kriminalistike na stanovenie koncentraacutecie DNA vo vzorke

Relatiacutevna kvantifikaacutecia (obr 18 19) porovnaacuteva uacuteroveň expresie určiteacuteho geacutenu vo vzorke k expresii toho isteacuteho geacutenu v referenčnej (kontrolnej) vzorke alebo množstvo určiteacuteho geacutenu (počet koacutepiiacute) vo vzorke porovnaniacutem s množstvom geacutenu v kontrolnyacutech vzorkaacutech V raacutemci každej vzorky musiacute pred relatiacutevnou kvantifikaacuteciou docircjsť k tzv normalizaacutecii t j porovnanie expresie sledovaneacuteho geacutenu k expresii referenčneacuteho geacutenu (najčastejšie niacutem byacuteva tzv bdquohousekeepingldquo geacuten napr GAPDH aktiacuten tubuliacuten)

V priacutepade kvantifikaacutecie expresie určiteacuteho geacutenu metoacutedou real-time PCR (RT-qPCR) pred samotnou kvantifikaacuteciou cDNA musiacute byť taacuteto cDNA nasyntetizovanaacute prostredniacutectvom reverznej

19

transkripcie za použitia enzyacutemu reverznej transkriptaacutezy Kvantitatiacutevna PCR s reverznou transkripciou RT-qPCR mocircže byť dvojkrokovaacute alebo jednokrokovaacute Pri dvojkrokovej RT-qPCR treba pred qPCR syntetizovať cDNA vlaacutekno z RNA pomocou reverznej transkriptaacutezy - 1 krok druhyacutem krokom je samotnaacute real-time PCR Jednokrokovaacute RT-qPCR umožňuje uskutočniť obidve reakcie reverznuacute transkripciu a kvantitatiacutevnu PCR v jednej skuacutemavke čo zjednodušuje qPCR a redukuje možnosť kontaminaacutecie Obr 16 5-bodovaacute štandardnaacute krivka (amplifikaacutecia piatich koncentraacuteciiacute jednej vzorky konkreacutetne ide o 10-tkoveacute riedenie)

Obr 17 Ukaacutežka amplifikačnyacutech kriviek riedenia a z nich ziacuteskanej štandardnej krivky poukazuje na vysokuacute presnosť metoacutedy RT-PCR

20

Obr 18 Relatiacutevna kvantifikaacutecia - určenie počtu koacutepiiacute geacutenu CYP21A2 vo vzorke DNA izolovanej z perifeacuternej krvi pacientov mutaacutecie v geacutene CYP21A2 spocircsobujuacute kongenitaacutelnu adrenaacutelnu hyperplaacuteziu (CAH) Vyacutesledok analyacutezy všetci pacienti majuacute dve koacutepie geacutenu

Obr 19 Relatiacutevna kvantifikaacutecia - určenie počtu koacutepiiacute geacutenu CYP21A2 vo vzorke DNA izolovanej z plodovej vody mutaacutecie v geacutene CYP21A2 spocircsobujuacute kongenitaacutelnu adrenaacutelnu hyperplaacuteziu (CAH) Prenaacutetalnou diagnostikou (qPCR) sa zistila priacutetomnost jednej koacutepie CYP21A2 geacutenu 332 Určenie genotypu metoacutedou alelovej diskriminaacutecie a analyacutezou krivky topenia (HRM)

Určenie genotypu metoacutedou alelovej diskriminaacutecie (obr 20) sa uskutočňuje použitiacutem hydrolyzujuacutecich proacuteb (sond) je veľmi ryacutechla a senzitiacutevna (presnaacute) metoacuteda frekventovane využiacutevanaacute v laboratoacuteriaacutech Dva variantyalely suacute vyšetreneacute suacutečasne v jednej vzorke a v jednej reakčnej

21

skuacutemavke V reakcii suacute použiteacute dve proacuteby označeneacute rozdielnymi fluorescenčnyacutemi farbičkami emitujuacutecimi svetlo o rocircznej vlnovej dĺžke (najčastejšie jedna označenaacute FAM farbičkou a druhaacute proacuteba označenaacute VIC farbičkou) Počas amplifikaacutecie amplikoacutenu dochaacutedza k odstraacuteneniu zhaacutešača z bliacutezkosti farbičky ktoraacute potom emituje svetlo priacuteslušnej vlnovej dĺžky Vzorky so signaacutelom len jednej fluorescenčnej farbičky (FAM) a bez signaacutelu druhej farbičky (VIC) suacute homozygoti pre alelu 1 vzorky so signaacutelom len druhej farbičky (VIC) a bez signaacutelu prvej (FAM) suacute homozygoti pre alelu 2 v priacutepade ak vyšetrovanaacute vzorka bdquosvietildquo obidvoma farbami jednaacute sa o heterozygota

Obr 20 Určenie genotypu metoacutedou alelovej diskriminaacutecie ndash amplifikačnaacute krivka vzoriek DNA majuacutecich tri rocirczne genotypy A ndash jednotliveacute vzorky (plnaacute čiara predstavuje štandardnuacute alelu guličkovanaacute mutovanuacute alelu) B ndash 72 vzoriek C ndash scatter plot 72 vzoriek

Určenie genotypu analyacutezou krivky topenia tzv high resolution melt (HRM) (obr 21) umožňuje detekciu takmer všetkyacutech genetickyacutech variaacuteciiacute (SNP mutaacuteciiacute) Keďže taacuteto metoacuteda okrem štandardnyacutech podmienok reakcie vyžaduje len primery a farbičku (nie proacuteby) je veľmi jednoduchaacute a lacnejšia Po amplifikaacuteciiacute treba amplikoacuten pomaly zohrievať až kyacutem nedocircjde k denaturaacuteciiacute Teplota topenia amplikoacutenu vo vzorke zaacutevisiacute od DNA sekvencie čo umožňuje detegovať priacutetomnosť mutaacutecie resp SNP Tvar vyacuteslednyacutech kriviek topenia určuje teda genotyp

22

Obr 21 Určenie genotypu analyacutezou krivky topenia tzv metoacutedou high resolution melting (HRM) A ndash krivka topenia vzoriek DNA majuacutecich tri rocirczne genotypy B ndash graf rozdielnosti krivky topenia vzoriek DNA majuacutecich tri rocirczne genotypy

23

4 Elektroforetickaacute separaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten

Separaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten predstavuje rozdelenie molekuacutel DNA alebo RNA na zaacuteklade veľkosti zloženia a poradia baacutez Podobnyacutemi metoacutedami je možneacute separovať aj proteiacuteny

Elektroforeacuteza (ELFO) je technika použiacutevanaacute na separaacuteciu niekedy aj purifikaacuteciu makromolekuacutel ako suacute nukleoveacute kyseliny a proteiacuteny na zaacuteklade ich rozdielnej veľkosti naacuteboja alebo konformaacutecie Je to metoacuteda veľmi často využiacutevanaacute nielen v molekulovej genetike ale aj biocheacutemii Elektroforeacuteza využiacuteva schopnosť nabityacutech molekuacutel migrovať v jednosmernom elektrickom poli k opačneacutemu poacutelu Nukleoveacute kyseliny majuacute vďaka svojej fosfaacutetovej zložke negatiacutevny naacuteboj preto v jednosmernom elektrickom poli migrujuacute ku kladneacutemu poacutelu čiže k anoacutede Elektroforeacuteza prebieha v elektroforetickej aparatuacutere v geacuteloch (v nosiči) so sieťovitou štruktuacuterou ktoraacute umožňuje separaacuteciu molekuacutel Vzorka nukleovej kyseliny zmiešanaacute s tzv nanaacutešaciacutem tlmivyacutem roztokom s farbičkou sa nanesie do jamky v geacuteli ktoryacute je umiestnenyacute v elektroforetickej aparatuacutere v priacutetomnosti elektroforetickeacuteho pufra (TAE alebo TBE) (obr 22) Nanaacutešaciacute tlmivyacute roztoknanaacutešacia farbička umožňuje na zaacuteklade migraacutecie farbičky vidieť migraacuteciu vzorky v geacuteli a suacutečasne zvyacutešeniacutem hustoty vo vzorke umožniacute klesnuacuteť vzorke do jamky a tak zabraacuteniť jej vyplaveniu z geacutelu Draacuteha je časť geacutelu ktoryacutem putuje jedna vzorka od katoacutedy k anoacutede V draacutehe sa nachaacutedzajuacute oddeleneacute jednotliveacute fragmenty nukleovyacutech kyseliacuten určityacutech veľkostiacute viditeľneacute vo forme pruacutežkov (angl bands) Intenzita pruacutežku zaacutevisiacute od množstva molekuacutel danej veľkosti je ekvivalentnaacute hmotnosti Na určenie veľkosti fragmentov NK sa do jednej jamky nanesie štandard molekulovyacutech hmotnostiacute (angl ladder) ktoryacute maacute presne definovaneacute veľkosti fragmentov čo umožňuje odhadnuacuteť veľkosť aj hmotnosť neznaacutemych separovanyacutech fragmentov

Obr 22 Elektroforetickaacute separaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten v agaroacutezovom geacuteli (A) a vizualizaacutecia UV svetlom a GelRedtrade (B C)

24

Nukleoveacute kyseliny je možneacute elektroforeticky separovať 1) v geacuteloch agaroacutezovom (horizontaacutelna elektroforeacuteza) (obr 22) a polyakrylamidovom (vertikaacutelna elektroforeacuteza) 2) v špeciaacutelnych lineaacuternych polymeacuteroch kapilaacuternou elektroforeacutezou použitiacutem genetickeacuteho analyzaacutetora (obr 23)

Agaroacuteza je polysacharid ziacuteskanyacute z morskej riasy použiacuteva sa najčastejšie v koncentraacuteciiacute 05-2 čiacutem vyššia koncentraacutecia tyacutem je geacutel pevnejšiacute a schopnejšiacute rozliacutešiť menšie fragmenty NK Priacuteprava je jednoduchaacute odvaacuteži sa potrebneacute množstvo agaroacutezy ktoraacute sa zmieša s tlmivyacutem roztokom (pufrom) rozvariacute sa v mikrovlnnej ruacutere a naleje sa do špeciaacutelnej naacutedoby na vytvaacuteranie geacutelov kyacutem je geacutel tekutyacute vložiacute sa do neho tzv hrebeň na vytvorenie jamiek Agaroacuteza je netoxickaacute V bežnom agaroacutezovom geacuteli v zaacutevislosti od jeho koncentraacutecie je možneacute separovať DNA fragmenty dĺžky 200-50 000 bp Dnes suacute dostupneacute aj špeciaacutelne agaroacutezy napr MetaPhorreg Agarose schopneacute oddeliť fragment DNA dĺžky 20-800bp Separaacutecia v agaroacutezovom geacuteli prebieha v horizontaacutelnej aparatuacutere preto sa nazyacuteva aj horizontaacutelna elektroforeacuteza

Polyakrylamidovyacute geacutel (PAGE) vznikaacute polymerizaacuteciou akrylamidu v priacutetomnosti špeciaacutelnych chemickyacutech laacutetok (peroxodisiacuteran amoacutenny TEMED bisakrylamid) Jeho priacuteprava je preto odlišnaacute a aj naacuteročnejšia Polyakrylamidoveacute geacutely majuacute vysokuacute rozlišovaciu schopnosť (1bp) preto suacute PAGE geacutely vhodneacute aj na sekvenovanie DNA klasickyacutemi metoacutedami PAGE geacutel nie je vhodnyacute na separaacuteciu fragmentov dlhšiacutech ako 2kb Použiacuteva sa v koncentraacutecii 35 -20 s rozliacutešeniacutem fragmentov od 10bp-2000bp Akrylamid je neurotoxiacuten musiacute sa s niacutem pracovať veľmi opatrne PAGE elektroforeacuteza bežiacute vo vertikaacutelnej aparatuacutere preto sa volaacute aj vertikaacutelna elektroforeacuteza použiacuteva sa často aj na separaacuteciu proteiacutenov

Ryacutechlosť pohybu nukleovyacutech kyseliacuten (mobilita) určuje viacero faktorov 1) veľkosť NK ndash počet baacutezovyacutech paacuterov resp baacutez pričom menšie molekuly prechaacutedzajuacute geacutelom ryacutechlejšie pretože sa ľahšie pohybujuacute v geacuteli 2) konformaacutecia nukleovej kyseliny napr u rovnako veľkyacutech plazmidov kondenzovaneacute superšpiralizovaneacute plazmidy migrujuacute najryacutechlejšie rovnako veľkeacute lineaacuterne molekuly (toho isteacuteho plazmidu) bežia pomalšie a najpomalšie putujuacute relaxovaneacute kruhoveacute molekuly plazmidu 3) koncentraacutecia geacutelu určuje jeho rozlišovaciu schopnosť koncentrovanejšiacute geacutel je schopnyacute separovať kratšie fragmenty NK redšie geacutely suacute vhodneacute pre rozliacutešenie vaumlčšiacutech fragmentov 4) zloženie geacutelu je docircležiteacute pri analyacuteze sekundaacuternych štruktuacuter NK a proteiacutenov v nedenaturovanom stave sekundaacuterna štruktuacutera spomaľuje migraacuteciu NK a proteiacutenov Tento fakt využiacutevajuacute niektoreacute diagnostickeacute techniky (napr SSCP - Single Strand Conformation Polymorphism - polymorfismus konformaacutecie jednovlaacuteknovej DNA) umožňujuacutece detekciu zaacutemeny jedinej baacutezy ktoraacute spocircsobiacute odlišneacute vnuacutetromolekuloveacute paacuterovanie a vyacuteslednuacute konformaacuteciu molekuly Geacutely mocircžu teda byť denaturačneacute a nedenaturačneacute (natiacutevne) 5) napaumltie zdroja - čiacutem vyššie je napaumltie ktoreacute vytvaacutera elektrickeacute pole v elektroforetickej aparatuacutere tyacutem ryacutechlejšie fragmenty NK migrujuacute 6) zloženie roztokov a teploty

Elektroforetickyacute tlmivyacute roztok (pufor - elektrolyt) zabezpečuje stabilneacute elektroforetickeacute podmienky počas separaacutecie geacutel je v ňom ponorenyacute Obsahuje ioacuteny čo umožňuje vedenie elektrickeacuteho pruacutedu

Štandard molekulovyacutech hmotnostiacute (v laboratoacuteriaacutech nazyacutevanyacute ladder alebo marker) je zmes fragmentov DNA alebo RNA s presne definovanou veľkosťou ktoryacute sluacuteži na odhad veľkosti vyšetrovanyacutech fragmentov NK (obr 22) Pomocou špeciaacutelnych štandardov molekulovyacutech hmotnostiacute ktoryacutech fragmenty NK majuacute definovanuacute aj hmotnosť je možneacute odhadnuacuteť množstvo (hmotnosť - koncentraacuteciu) neznaacutemeho fragmentu

B C

25

41 Vizualizaacutecia DNA

Samotnaacute nukleovaacute kyselina je počas elektroforetickej separaacutecie neviditeľnaacute Vizualizaacuteciu NK umožňujuacute interkalačneacute činidlaacute ktoreacute suacute schopneacute naviazať sa na molekuly NK tyacutem že sa včlenia medzi susediace baacutezy Po ožiareniacute UV svetlom interkalačneacute činidlaacute naviazaneacute na NK fluoreskujuacute tak sa vizualizuje NK čiacutem intenziacutevnejšie fluoreskuje tyacutem viac NK je v geacutelipruacutežku priacutetomneacute Interkalačneacute činidlo sa buď primieša do geacutelu pri jeho priacuteprave čo umožniacute sledovať migraacuteciu fragmentov NK počas elektroforeacutezy a to po vybratiacute z ELFO aparatuacutery a po ožiareniacute UV svetlom alebo sa geacutel farbiacute po elektroforetickej separaacutecii V minulosti bol na zviditeľnenie NK najčastejšie použiacutevanyacute etidiumbromid kvocircli jeho mutageacutennym vlastnostiam sa v suacutečasnosti nahraacutedza menej mutageacutennymi a netoxickyacutemi činidlami ako suacute napr komerčne dostupneacute SYBRregSafe GelRedtrade GelGreentrade

Kapilaacuterna elektroforeacuteza NK prebieha v špeciaacutelnom priacutestroji genetickom analyzaacutetore (obr 23) ktoryacute musiacute mať zaacutekladneacute komponenty ako suacute elektroacutedy kapilaacutera zdroj vysokeacuteho napaumltia detektor prepojenie s počiacutetačom a softveacuteroveacute vybavenie priestor na vloženie vzoriek atď Genetickyacute analyzaacutetor predstavuje automatizovanyacute systeacutem umožňujuacuteci sekvenovanie určovanie dĺžky DNA fragmentov ndash fragmentačnuacute analyacutezu a kvantifikaacuteciu nukleovyacutech kyseliacuten V novšiacutech typoch genetickeacuteho analyzaacutetora je proces analyacutezy od vloženia vzoriek do stojana automatizovanyacute

Vzorka určenaacute na analyacutezu je elektrokineticky injektovanaacute do tenkej kapilaacutery naplnenej lineaacuternym polymeacuterom Vplyvom vysokeacuteho napaumltia sa negatiacutevne nabiteacute fragmenty DNA pohybujuacute v polymeacuteri k pozitiacutevne nabitej elektroacutede Kapilaacuterna elektroforeacuteza je tak citlivaacute že je schopnaacute detegovať jednobaacutezovyacute rozdiel DNA fragmentov DNA fragmenty musia byť pred kapilaacuternou elektroforeacutezou fluorescenčne označeneacute v kapilaacutere suacute separovaneacute na zaacuteklade veľkosti Kraacutetko pred dosiahnutiacutem kladne nabitej elektroacutedy docircjde po excitaacutecii laserovyacutem žiareniacutem k emisii žiarenia fluoroformi (farbičkami) tak že optickyacute detekčnyacute systeacutem zaznamenaacute fluorescenciu ktoraacute je naacutesledne softveacuterovo spracovanaacute a vyhodnotenaacute

Obr 23 Genetickyacute analyzaacutetor

42 RFLP

Metoacuteda polymorfizmu dĺžky restrik čnyacutech fragmentov (angl Restriction Fragment Length Polymorfism) bola prvou metoacutedou využiacutevanou na detekciu DNA variaacuteciiacute rocircznych biologickyacutech vzoriek Princiacutep metoacutedy spočiacuteva v priacutetomnosti polymorfizmov v DNA sekvencii rocircznych ľudiacute ktoreacute zapriacutečinia rozdielny profil (obrazec) DNA fragmentov po štiepeniacute jednou alebo viaceryacutemi restrikčnyacutemi endonukleaacutezami Restrikčneacute endonukleaacutezy (RE) suacute enzyacutemy ktoreacute štiepia DNA molekulu v oblasti špecifickej nukleotidovej sekvencie nazyacutevanej restrik čneacute miesto RE najčastejšie rozpoznaacutevajuacute a štiepia miesto veľkeacute 4-6 baacutez RE suacute priacutetomneacute u prokaryotov (bakteacuterie a archebakteacuterie) kde suacute suacutečasťou restrik čno-modifikačneacuteho systeacutemu akoby prokaryotickeacutej vrodenej imunity sluacutežia

26

na ochranu pred cudzou DNA (napr viacuterusovou) ktoruacute po rozpoznaniacute špecifickej sekvencie štiepia

Restrikčno-modifikačnyacute systeacutem maacute dve zložky 1) modifikačneacute enzyacutemy - metylaacutezy ktoreacute procesom metylaacutecie modifikujuacute určiteacute baacutezy svojej DNA čiacutem ich označia za vlastnuacute DNA takže takaacuteto DNA je potom rezistentnaacute voči štiepeniu restrikčnyacutemi endonukleaacutezami Najčastejšiacutem spocircsobom metylaacutecie u bakteacuteriiacute je metylaacutecia adeniacutenu na N6 pričom vznikne metyladeniacuten alebo cytoziacutenu na C5 metylcytoziacuten 2) restrikčneacute endonukleaacutezy štiepia špecifickeacute miesto dvojvlaacuteknovej DNA ktoreacute je tvoreneacute symetrickou sekvenciou zrkadlovo sa opakujuacutecich nukleotidov ndash tzv palindroacutem Restrikčneacute enzyacutemy sa použiacutevajuacute na štiepenie DNA sekvencie na mieste špecifickom pre tuacute ktoruacute restrikčnuacute endonukleaacutezu napr pri analyacuteze polymorfizmov dĺžky restrikčnyacutech fragmentov (RFLP) analyacuteze jednonukleotidovyacutech polymorfizmov (SNP) mutaacuteciiacute ako aj pri klonovaniacute DNA do vhodnyacutech vektorovyacutech DNA molekuacutel

Po štiepeniacute dvojvlaacuteknovej DNA restrikčnou endonukleaacutezou mocircžu vzniknuacuteť tri typy koncov - 5´-prečnievajuacutece konce (lepiveacute) 3´-prečnievajuacutece konce (lepiveacute) a tupeacute konce (obr 24)

Obr 24 Restrikčneacute štiepenie zanechaacutevajuacutece rocirczne konce tupeacute a lepiveacute

Restrikčneacute štiepenie je často použiacutevanou metoacutedou geacutenovyacutech manipulaacuteciiacute na konštrukciu

hybridnyacutech molekuacutel DNA s naacuteslednyacutem klonovaniacutem Priebeh RFLP analyacutezy je nasledovnyacute restrikčnaacute endonukleaacuteza sa pridaacute k DNA a zmes sa vo

vhodnyacutech reakčnyacutech podmienkach (pufor teplota) inkubuje niekoľko hodiacuten Počas inkubaacutecie docircjde k štiepeniu DNA na špecifickyacutech miestach DNA je potom elektroforeticky separovanaacute v geacuteli a naacutesledne vizualizovanaacute V minulosti po geacutelovej elektroforeacuteze nasledoval Southern blot (čiže prenos separovanyacutech fragmentov DNA z geacutelu na špeciaacutelnu membraacutenu) (obr 35) po ktorom nastala vizualizaacutecia raacutedioaktiacutevne značenou proacutebou V suacutečasnosti sa kvocircli praacutecnosti a zdravotnyacutem rizikaacutem od Southern blotu upuacutešťa a prechaacutedza sa na ryacutechlejšie menej praacutecne a zdravotne šetrnejšie metoacutedy priateľskejšie aj k životneacutemu prostrediu

RFLP bola prvou metoacutedou použiacutevanou na zistenie DNA profilu (DNA fingerprinting) mapovanie geacutenov zapriacutečiňujuacutece genetickeacute ochorenia a testovanie otcovstva Vaumlčšina RFLP markerov je vysoko lokusovo špecifickyacutech a kodominantnyacutech (obidve alely suacute detekovaneacute u heterozygota)

PCR-RFLP je laboratoacuterne priacutestupnejšia metoacuteda molekulaacuterno-genetickej diagnostiky keďže PCR umožňuje amplifikaacuteciu veľmi malyacutech množstiev DNA Alternatiacutevny naacutezov použiacutevanyacute v literatuacutere je CAPS z angl Cleaved Amplified Polymorphic Sequence assay Použitiacutem špecifickyacutech primerov docircjde PCR metoacutedou k amplifikaacutecii požadovaneacuteho uacuteseku DNA ten sa potom štiepi restrikčnou endonukleaacutezou vo vhodnyacutech podmienkach naacutesledne sa štiepne produkty elektroforeticky separujuacute a vizualizujuacute použitiacutem interkalačnyacutech farbiacutev a UV svetla (obr 25)

27

Obr 25 Princiacutep metoacutedy PCR-RFLP

43 VNTR a STR V geacutenome suacute priacutetomneacute dva typy tandemovyacutech (za sebou nasledujuacutecich) opakovaniacute

1) minisatelity ndash nazyacutevaneacute variabilnyacute počet tandemovyacutech opakovaniacute VNTR (variable number of tandem repeats) 2) mikrosatelity tiež kraacutetke tandemoveacute repetiacutecie STR (short tandem repeats)

Obidva tieto typy satelitnej DNA suacute rozmiestneneacute po celom genoacuteme suacute využiacutevaneacute hlavne vo forenznej genetike na identifikaacuteciu osocircb a určenie otcovstva popriacutepade materstva ale aj v mediciacutene na detekciu chromozoacutemovyacutech aneuploidiiacute Štruktuacutera obidvoch je podobnaacute Rozdiel medzi jednotlivyacutemi alelami je spocircsobenyacute rozdielnym počtom opakovaniacute opakujuacutecej sa sekvencie (motiacutevu) čo spocircsobiacute rocircznu dĺžku alel s rocircznym počtom tandemovyacutech opakovaniacute nazyacutevanuacute polymorfizmus dĺžky fragmentov

VNTR ndash variabilnyacute počet tandemovyacutech opakovaniacute pričom opakujuacuteca sa sekvencia maacute dĺžku od 6 do 100 baacutez pričom sa mocircže opakovať aj tisiacutece kraacutet alely tak mocircžu mať od 500do 30 000 baacutez VNTR boli v kombinaacutecii s RFLP (DNA fingerprinting ) prvyacutem polymorfizmom použiacutevanyacutem na zistenie DNA profilov a identifikaacuteciu osocircb v kriminalistickej praxi V suacutečasnosti jeho využitie v kriminalistike je kvocircli potrebe relatiacutevne veľkeacuteho množstva DNA nahradeneacute využitiacutem STR

STR - kraacutetke tandemoveacute repetiacutecie suacute v kriminalistike najčastejšie použiacutevanyacutem polymorfizmom STR lokusy suacute rozmiestneneacute po celom genoacuteme repetiacutecia obsahuje jednu až šesť baacutez pričom jej opakovaniacutem vznikne STR v rozsahu od 50 do 300bp V našom genoacuteme suacute tisiacutece STR ktoreacute mocircžu byť použiteacute pre forenznuacute analyacutezu V kriminalistike sa v suacutečasnosti na identifikaacuteciu osocircb použiacuteva 13 STR locusov ktoreacute patria k medzinaacuterodne uznaacutevanyacutem štandardom Z iniciatiacutevy FBI bola vytvorenaacute databaacuteza CODIS (Combined DNA Index System) každaacute krajina maacute svoju databaacutezu CODIS kde je možneacute vložiť a archivovať DNA profily jednotlivcov ako aj profily DNA ziacuteskanyacutech z miest kriminaacutelneho činu v databaacuteze je ich možneacute navzaacutejom porovnať a tak zistiť pocircvodcu trestneacuteho činu Medzinaacuterodnaacute jednotnosť v použiacutevaniacute CODIS STR lokusov umožňuje v priacutepade potreby vzaacutejomneacute porovnanie DNA profilov zistenyacutech na uacutezemiacute rocircznych štaacutetov CODIS STR lokusov je 13 a suacute to CSF1PO FGA TH01 TPOX VWA D3S1358 D5S818 D7S820 D8S1179 D13S317 D16S539 D18S51 a D21S11 Zistenie DNA profilu sa uskutočniacute multiplexnou PCR reakciou s fluorescenčne značenyacutemi primermi špecifickyacutemi pre konkreacutetny STR Naacutesledne suacute PCR produkty analyzovaneacute kapilaacuternou elektroforeacutezou genetickyacutem analyzaacutetorom ktoryacute rozliacuteši amplifikovaneacute fragmenty na zaacuteklade fluorescencie a dĺžky (fragmentačnaacute analyacuteza) (obr 26 Tab 3) DNA profil každeacuteho človeka je jedinečnyacute rovnakyacute profil mocircžu mať len jednovaječneacute dvojčataacute

28

Obr 26 Ukaacutežka DNA profilu človeka 15 STR lokusov s určeniacutem pohlavia pomocou lokusu pre amelogeniacuten (ženskeacute pohlavie - XX) maleacute oranžoveacute piacuteky predstavujuacute fragmenty veľkostneacuteho štandardu Tabuľka č 3 Zaacutepis DNA profilu človeka z obraacutezka č 26 15 STR lokusov s určeniacutem pohlavia pomocou lokusu pre amelogeniacuten System Alela 1 Alela 2

D3S1358 16 17

TH01 9 93 D21S11 28 28

D18S51 15 18

Penta E 7 14 D5S818 9 12

D13S317 8 11

D7S820 8 11 D16S539 11 12

CSF1PO 10 11

Penta D 11 12 vWA 15 18

D8S1179 13 16

TPOX 8 9 FGA 20 21

amel X X

29

5 MLPA

Multiplexnaacute amplifikaacutecia proacuteb zaacutevislaacute od ligaacutecie (z angl multiplex ligation-dependent probe amplification) je metoacuteda schopnaacute v jednej reakcii (v jednej skuacutemavke a vzorke) detegovať zmeny v počte až 50 nukleotidovyacutech sekvenciiacute Metoacutedou MLPA je možneacute ryacutechlo identifikovať amplifikaacutecie (duplikaacutecie) a deleacutecie veľkeacuteho počtu geacutenov či už použitiacutem DNA alebo mRNA krvnyacutech vzoriek alebo vzoriek z naacutedorov

Princiacutep MLPA spočiacuteva v multiplexnej amplifikaacutecii 50 špecifickyacutech nukleotidovyacutech sekvenciiacute použitiacutem jedneacuteho paacuteru primerov pričom jeden primer je fluorescenčne označenyacute Vyacutesledneacute PCR produkty suacute analyzovaneacute kapilaacuternou elektroforeacutezou (fragmentačnaacute analyacuteza) Dĺžka každeacuteho namnoženeacuteho produktu je jedinečnaacute narastaacute postupne o 6 alebo 9 nukleotidov pričom produkty PCR suacute 120 ndash 500 nukleotidov dlheacute Tento veľkostnyacute rozsah PCR fragmentov (dĺžka 120-500 nukleotidov s naacuterastom postupne o 6 alebo 9 nukleotidov) je optimaacutelny pre kapilaacuternu elektroforeacutezu MLPA multiplexnaacute PCR prebieha za použitia iba jedineacuteho paacuteru primerov ktoreacute amplifikujuacute špecifickeacute sekvencie Trik spočiacuteva v tom že nedochaacutedza k amplifikaacutecii DNA sekvencie ale MLPA proacuteb ktoreacute suacute pridaneacute k vzorkaacutem Každaacute MLPA proacuteba pozostaacuteva z dvoch oligonukleotidov (dve hemiproacuteby) pričom každyacute oligonukleotid obsahuje jednu zo sekvencie rozpoznaacutevanuacute PCR primermi Proacuteba vznikne jedine za predpokladu hybridizaacutecie dvoch oligonukleotidov (hemiproacuteb) k cieľovej sekvencii (geacutenu) a po ligaacutecii enzyacutemom ligaacutezou Iba ligovaneacute proacuteby suacute exponenciaacutelne amplifikovaneacute pomocou jedneacuteho paacuteru primerov Množstvo zligovanyacutech proacuteb teda zaacutevisiacute od množstva cieľovyacutech sekvenciiacute (geacutenov) vo vzorke

Postup MLPA analyacutezy je nasledovnyacute (obr27) K vzorke nukleovej kyseliny (DNA resp mRNA) sa pridaacute zmes 50 jedinečnyacutech proacuteb každaacute

proacuteba je komplementaacuterna k určitej cieľovej sekvencii NK vzorky Každaacute proacuteba však pozostaacuteva z dvoch oligonukleotidov hybridizujuacutecich vedľa seba zaacuteroveň každyacute oligonukleotid (hemiproacuteba) obsahuje pridanuacute sekvenciu rozpoznaacutevanuacute paacuterom PCR primerov Po hybridizaacuteciiacute oligonukleotidov (hemiproacuteb) dochaacutedza k ich ligaacutecii ligaacutezou Ligačnaacute reakcia je tak špecifickaacute že je schopnaacute rozliacutešiť sekvenciu liacutešiacu sa v jednom nukleotide Vyacuteslednyacute ligačnyacute produkt (proacuteba) obsahuje obidve sekvencie pre PCR primery na jednom fragmente čiže mocircže docircjsť k namnoženiu takeacutehoto fragmentu PCR reakciou V priacutepade ak nedocircjde k ligaacutecii priacuteslušnyacutech hemiproacuteb pretože hemiproacuteby nenaacutejdu cieľovuacute sekvenciu na DNA každaacute takaacuteto nezligovanaacute hemiproacuteba maacute len jednu sekvenciu rozpoznaacutevanuacute len jednyacutem PCR primerom v docircsledku čoho nemocircže prebehnuacuteť jej PCR amplifikaacutecia a počas fragmentačnej analyacutezy nie je detegovanaacute pretože negeneruje fluorescenčnyacute signaacutel

Pri MLPA analyacuteze je docircležiteacute okrem MLPA amplifikaacutecie vzorky urobiť aj MLPA amplifikaacuteciu referenčnej vzorky ku ktorej sa bude porovnaacutevať počet geacutenov (cieľovyacutech sekvenciiacute) Po kapilaacuternej elektroforeacuteze MLPA referenčnej a skuacutemanej vzorky porovnaniacutem obsahu nameranyacutech hodnocirct tzv piacutekov priacuteslušnyacutech proacuteb sa určiacute relatiacutevny počet koacutepiiacute v skuacutemanej vzorke

MLPA

1 DNA denaturaacutecia a hybridizaacutecia s MLPA proacutebami (hemiproacuteby)

2 Ligaacutecia (vytvorenie kompletnyacutech proacuteb)

3 PCR amplifikaacutecia proacuteb paacuterom primerov

4 Kapilaacuterna elektroforetickaacute separaacutecia PCR produktov

5 Analyacuteza daacutet

30

Obr 27 Princiacutep MLPA

Firma MRC-Holland v suacutečasnosti ponuacuteka stovky MLPA setov proacuteb ktoreacute suacute vhodneacute na 1) diagnostiku kongenitaacutelnych a dedičnyacutech ochoreniacute 2) zisťovanie profilu naacutedorov 3) zisťovanie metylačneacuteho profilu

MLPA je metoacuteda vhodnaacute na detekciu malyacutech prestavieb (BRCA1 BRCA2 MSH2 atď)

veľkyacutech chromozoacutemovyacutech prestavieb (Williamsov syndroacutem Prader-WilliAngelman syndroacutem atzď)

31

detekciu zmien v počte koacutepii geacutenov (obr 28 29) ako aj zistenie počtu kompletnyacutech chromozoacutemov (chromozoacutem 13 18 21 XY tiež aj z amniovej tekutiny) diagnostiku naacutedorov (zmeny počtu pri ALL CLL atď) kvantifikaacuteciu metylaacutecie (Prader-WilliAngelmanov syndroacutem Fragilnyacute X inaktivaacutecia naacutedorovyacutech supresorovyacutech geacutenov atď) mRNA analyacutezu geacutenov zuacutečastňujuacutecich sa apoptoacutezy alebo zaacutepalov

MS-MLPA (Methylation-Specific MLPA) je varianta MLPA určenaacute špeciaacutelne na analyacutezu aberantnyacutech metylaacutecii imprintovanyacutech oblastiacute ako aj detekciu metylačnyacutech zmien CpG ostrovčekov lokalizovanyacutech bliacutezko promoacutetora Rozdiel oproti štandardnej MLPA spočiacuteva v použitiacute metylačne senzitiacutevneho restrikčneacuteho enzyacutemu HhaI ktoryacute štiepi MS-MLPA proacuteby hybridizovaneacute k nemetylovanej sekvencii Každaacute DNA vzorka určenaacute pre MS-MLPA analyacutezu prejde dvoma reakciami v jednej mikroskuacutemavke štandardnou MLPA analyacutezou (bez štiepenia metylačne senzitiacutevnym enzyacutemom) a v druhej mikroskuacutemavke docircjde okrem ligaacutecie proacuteb aj k metylačne senzitiacutevnemu štiepeniu hybridizovanyacutech proacuteb s nemetylovanou DNA Amplifikujuacute sa len ligovaneacute proacuteby po PCR amplifikaacutecii sa fragmentačnou analyacutezou porovnaniacutem oboch reakciiacute zistia rozdiely v metylačnom profile vzorky k referenčnej vzorke

RT-MLPA (Reverse Transkriptase MLPA) je variaacutecia MLPA určenaacute pre zistenie mRNA profilu vzorky je alternatiacutevou k real-time PCR a mikročipom RT-MLPA nedeteguje mRNA množstvo priamo pretože použiacutevanaacute ligaacuteza nie je schopnaacute ligovať DNA oligonukleotidy keď suacute hybridizovaneacute s RNA Preto RT-MLPA začiacutena reverznou transkripciou so špeciaacutelne navrhnutyacutemi RT primermi tak aby vytvorili kraacutetke oligonukleotidy (cDNA) Potom reakcia pokračuje ako štandardnaacute MLPA

Obr 28 MLPA analyacuteza geacutenu DMD (koacutedujuacuteceho dystrofiacuten) mutaacutecie ktoreacuteho spocircsobujuacute Duchennovu svalovuacute dystrofiu u pacienta je priacutetomnaacute deleacutecia exoacutenu 45 v porovnaniacute s referenčnou vzorkou ndash kontrolou

32

Obr 29 MLPA analyacuteza geacutenu DMD (koacutedujuacuteceho dystrofiacuten) mutaacutecie ktoreacuteho spocircsobujuacute Duchennovu svalovuacute dystrofiu u pacienta suacute priacutetomneacute duplikaacutecie exoacutenov 41 42 43 44 45 (piacuteky vo vzorke pacienta sa porovnajuacute s piacutekmi v kontrole ndash referenčnej vzorke)

33

6 Sekvenovanie

Sekvenovaniacutem rozumieme určenie primaacuternej štruktuacutery DNA teda určenie poradia nukleotidov v reťazci DNA Začiatky moderneacuteho sekvenovania siahajuacute do roku 1977 kedy boli objaveneacute dve metoacutedy sekvenovania 1) chemickaacute metoacuteda Maxama a Gilberta 2) enzymatickaacute metoacuteda Sangera Nicklena a Coulsona

Princiacutep obidvoch metoacuted sekvenovania spočiacuteva v tom že sa vytvoriacute suacutebor DNA molekuacutel s rocircznou veľkosťou ktoreacute suacute zakončeneacute konkreacutetnym nukleotidom tieto DNA molekuly sa elektroforeticky separujuacute v geacuteloch s rozlišovacou schopnosťou 1 nukleotid 61 Chemickaacute metoacuteda

DNA molekuly sa na 5-konci raacutedioaktiacutevne označia raacutedioaktiacutevnym fosforom a naacutesledne sa chemicky modifikujuacute špecificky pre každuacute baacutezu DNA sa potom v modifikovanyacutech miestach štiepi čiacutem vzniknuacute rocirczne dlheacute fragmenty pričom podmienky suacute nastaveneacute tak aby sa DNA na každom mieste štiepila len raz Modifikaacutecia DNA a štiepenie prebehne v štyroch separaacutetnych reakciaacutech (skuacutemavkaacutech) takže po elektroforetickej separaacuteciiacute takto opracovanej DNA v štyroch draacutehach polyakrylamidoveacuteho geacutelu a naacuteslednej autoraacutediografii (podobne ako pri Southernovej hybridizaacutecii) je možneacute odčiacutetať nukleotidovuacute sekvenciu približne 100 nukleotidov od raacutedioaktiacutevneho označenia (v čase objavu Maxama a Gilberta) 62 Sangerova metoacuteda

Zaacuteklady metoacutedy boli popiacutesaneacute už v roku 1975 (metoacuteda plus a miacutenus) ale až vylepšenie použitiacutem dideoxynukleotidov (ddNTP) v roku 1977 došlo k zjednodušeniu sekvenovania Princiacutepom enzyacutemoveacuteho sekvenovania je terminaacutecia (zastavenie) polymerizaacutecie inkorporaacuteciou 2´ 3 -dideoxynukleotidov do novosyntetizujuacuteceho sa vlaacutekna DNA Keďže ddNTP neobsahujuacute hydroxylovuacute skupinu na 3 uhliacuteku riboacutezy nemocircžu sa zuacutečastniť na tvorbe fosfodiesterovej vaumlzby nemocircže sa pripojiť k nim ďalšiacute nukleotid čiže musiacute docircjsť k terminaacuteciiacute polymeraacutecie Reakcia prebieha v štyroch skuacutemavkaacutech s raacutedioaktiacutevne značenyacutem primerom V každej skuacutemavke suacute priacutetomneacute všetky štyri deoxynukleotidtrifosfaacutety (dNTP) ale pre každuacute skuacutemavku je špecifickyacute priacutedavok maleacuteho množstva jedneacuteho z dideoxynukleotidtrifosfaacutetov (v prvej skuacutemavke je ddATP v druhej ddCTP v tretej ddTTP a vo štvrtej ddGTP) Maleacute množstvo ddNTP spocircsobiacute že pri polymerizaacutecii dochaacutedza k prednostneacutemu zaradeniu štandardnyacutech dNTP do narastajuacuteceho reťazca a len občas sa inkorporuje ddNTP čiacutem sa zastaviacute synteacuteza reťazca V každej skuacutemavke tak vznikne suacutebor DNA fragmentov rocircznych veľkostiacute zakončenyacutech priacuteslušnyacutem ddNTP (v prvej skuacutemavke ddATP v druhej ddCTP v tretej ddTTP a vo štvrtej ddGTP) Po elektroforetickej separaacutecii v 4 draacutehach polyakrylamidoveacuteho geacutelu a autoraacutediografii sa z autoraacutediogramu odčiacuteta sekvencia

V suacutečasnosti je sekvenovanie do značnej miery automatizovaneacute pričom využiacuteva princiacutep Sangerovej enzyacutemovej metoacutedy s určityacutemi obmenami Uacutesek DNA ktoryacute treba sekvenovať sa prostredniacutectvom termostabilnyacutech DNA polymeraacutez namnožiacute PCR metoacutedou po ktorej nasleduje sekvenačnaacute reakcia (asymetrickaacute PCR) s fluorescenčne značenyacutemi ddNTP (každyacute druh označenyacute inyacutem fluorescenčnyacutem farbivom) Sekvenačnaacute reakcia prebieha v jednej skuacutemavke s jednyacutem primerom vznikne tak suacutebor jednovlaacuteknovyacutech DNA rocircznej dĺžky ktoreacute suacute na 3konci označeneacute ddNTP so špecifickyacutem fluorescenčnyacutem farbivom Taacuteto metoacuteda sekvenovania sa tiež nazyacuteva rdquodye-terminator cycle sequencingrdquo(obr 30) Po kapilaacuternej elektroforeacuteze vzorky v genetickom analyzaacutetore zaznamenaacutevaniacute fluorescencie jednotlivyacutech fragmentov CCD kamerou a softveacuterovom spracovaniacute sa ziacuteska sekvencia DNA (obr 31)

34

Obr 30 Princiacutep sekvenovania Sangerova dideoxy metoacuteda alebo tzv chain termination method (reťazec zastavujuacuteca metoacuteda) Obr 31 Určenie genotypu plodu a rodičov sekvenčnou analyacutezou DNA ziacuteskanej z plodovej vody (prenataacutelna diagnostika) a perifeacuternej krvi sekvenčnaacute analyacuteza geacutenu ASPA vyacutesledok u plodu priacutetomnaacute mutaacutecia c 914CgtA v homozygotnom stave (AA) rodičia heterozygoti (AC) Uvedenaacute mutaacutecia je v homozygotnom stave kauzaacutelnou priacutečinou Canavanovej choroby

Automatizovaneacute sekvenovanie prinaacuteša viacereacute vyacutehody oproti klasickej Sangerovej metoacutede vyššiu presnosť a ryacutechlosť v jednej sekvenačnej reakcii možnosť osekvenovať až 1200 nukleotidovyacute fragment maleacute množstvo templaacutetu potrebneacute na analyacutezu

35

63 Next Generation Sequencing (NGS)

NGS (sekvenovanie novej generaacutecie) maacute obrovskyacute potenciaacutel v analyacuteze genoacutemov pričom toto označenie zahŕňa viacereacute technologickeacute metoacutedy reprezentovaneacute niekoľkyacutemi firmami Princiacutepom je masiacutevne paralelneacute sekvenovanie čiacutem sa ziacuteskajuacute raacutedovo tisiacutece až milioacuteny sekvenciiacute naraz 631 Sekvenovanie druhej generaacutecie

Na začiatku sa analyzovanaacute DNA vo vaumlčšine priacutepadov fragmentuje (vznikne tak DNA

knižnica) na fragmenty sa pripoja kraacutetke sekvencie ndash adapteacutery naacutesledne sa tieto fragmenty rocircznymi priacutestupmi amplifikujuacute a určiacute sa ich sekvencia Vďaka čiastočnyacutem prekryvom je zo ziacuteskanyacutech sekvencii možneacute poskladať plynuluacute sekvenciu zodpovedajuacutecu pocircvodnej nefragmentovanej DNA

Pyrosekvenovanie je podobne ako Sangerova metoacuteda založenaacute na princiacutepe synteacutezy komplementaacuterneho vlaacutekna DNA avšak rozdiel je v tom že sa na detekciu inkorporaacutecie nukleotidu využiacuteva inyacute systeacutem tvorby luminiscenčneacuteho signaacutelu v priebehu reakcie Pyrosekvenovanie je umožneneacute vďaka aktivite 4 enzyacutemov - DNA polymeraacutezy ATP sulfurylaacutezy luciferaacutezy a apyraacutezy Reakčnaacute zmes obsahuje aj ďalšie komponenty - enzymatickeacute substraacutety adenoziacutenfosfosulfaacutet (APS) d-luciferiacuten sekvenovanyacute templaacutet a cyklicky postupne po jednom type pridaacutevaneacute nukleotidtrifosfaacutety Po zabudovaniacute nukleotidu do novovznikajuacuteceho reťazca docircjde k uvoľneniu pyrofosfaacutetu naacutesledne je využityacute ATP sulfurylaacutezou na synteacutezu ATP z APS počas ďalšej reakcie docircjde k využitiu ATP luciferaacutezou na premenu luciferiacutenu na oxyluciferiacuten čo spocircsobiacute svetelnyacute signaacutel a ten zaznamenaacute detekčnyacute systeacutem Poslednou enzymatickou reakciou je reakcia apyraacutezy ktoraacute odstraacuteni nezainkorporovaneacute nukleotidy a nevyužiteacute ATP aby sa celyacute proces mohol zopakovať s reakčnou zmesou obsahujuacutecou ďalšiacute nukleotidtrifosfaacutet (inyacute ako v predchaacutedzajuacutecej reakcii) Po každej reakcii detektor zaznamenaacuteva emisiu svetla na zaacuteklade intenzity svetla je možneacute určiť či bol vradenyacute priacuteslušnyacute nukleotidtrifosfaacutet či bol inkorporovanyacute jeden priacutepadne viac rovnakyacutech nukleotidtrifosfaacutetov

Zvyacutešenie vyacutekonu pyrosekvenovania umožnila tzv emulznaacute PCR v mikročasticiach a použitie platničky PicoTiterPlatereg toto sekvenovanie zaviedla firma Roche pod pojmom 454 pyrosekvenovanie v roku 2005 Na začiatku sa DNA fragmentuje na uacuteseky dlheacute 400-600 baacutez dvojvlaacuteknovaacute fragmentovanaacute DNA sa liguje s adapteacutermi prostredniacutectvom nich sa naviaže na mikročastice dvojvlaacuteknoveacute fragmenty sa oddelia mikročastice s naviazanyacutemi jednovlaacuteknovyacutemi fragmentami sa premiešajuacute so zmesou oleja a roztoku ktoryacute obsahuje všetky komponenty na uacutespešnuacute PCR Tyacutemto spocircsobom sa okolo každej mikročastice vytvoriacute vlastnyacute mikroreaktor v ktorom prebehne amplifikaacutecia fragmentu Po PCR reakcii sa mikročastice prenesuacute do platničky PicoTiterPlate v ktorej sa do jamky zmestiacute akuraacutet jedna mikročastica a reakčneacute komponenty pyrosekvenačnej reakcie PicoTiterPlatereg maacute 1 600 000 jamiek každaacute jamka maacute maximaacutelny objem 75 picolitra Platnička s mikročasticami sa vložiacute do sekvenačneacuteho systeacutemu ndash priacutestroja v ktorom sa celeacute pyrosekvenovanie uskutočniacute Chemiluminiscenčneacute signaacutely ktoryacutech počas sekvenovania vznikajuacute milioacuteny v priebehu hodiny suacute zachyteneacute CCD kamerou a analyzovaneacute softveacuterom

Firma Illumina predstavila inuacute technoloacutegiu PCR amplifikaacutecia a sekvenovanie sa uskutočňuje na skliacutečku (flow cell) Fragmentaacutecia DNA a pripojenie adapteacuterov prebieha za uacutečasti transpozoacutemov v procese nazvanom tagmentaacutecia Po hybridizaacutecii fragmentov DNA na skliacutečko prebehne v klastroch PCR amplifikaacutecia (tzv mostiacutekovaacute amplifikaacutecia) sekvenaacutecia prebieha za uacutečasti rozdielne fluorescenčne značenyacutech a chemicky modifikovanyacutech nukleotidov pričom každyacute nukleotid emituje fluorescenciu s inou vlnovou dĺžkou Na skliacutečku prebieha paralelne až 6 miliaacuterd sekvenaacutecii (obr 32)

Ďalšiacutemi možnosťami sekvenovania druhej generaacutecie je systeacutem SOLid (vyvinutyacute firmou Applied Biosystem dnes pod Thermo Fisher Scientific) a Ion Semiconductor Sequencing ndash polovodičoveacute ioacutenoveacute sekvenovanie (od firmy Ion Semiconductor Sequencing v suacutečasnosti Thermo Fisher Scientific)

36

Obr 32 Princiacutep sekvenovania novej generaacutecie od firmy Illumina PCR amplifikaacutecia a sekvenovanie sa uskutočňuje na skliacutečku (flow cell) paralelne prebieha až 6 miliaacuterd sekvenaacutecii

632 Sekvenovanie tretej generaacutecie

Pred sekvenovaniacutem netreba amplifikovať DNA PCR metoacutedou ale sekvencia sa ziacuteskava zachyteniacutem signaacutelu v reaacutelnom čase Medzi sekvenovanie tretej generaacutecie patriacute SMRT (Single Molecule Real-Time Sequencing) a Nanopore Sequencing

37

7 Fragmentačnaacute analyacuteza DNA

Je metoacuteda použiacutevanaacute na určenie veľkosti fragmentov DNA ziacuteskanyacutech PCR reakciou Dĺžka amplifikovanyacutech DNA fragmentov sa zistiacute ich porovnaniacutem s veľkostnyacutem štandardom (obr 33) ktoryacute je tvorenyacute DNA fragmentami znaacutemej dĺžky Veľkostnyacute štandard je pred kapilaacuternou elektroforeacutezou zmiešanyacute so vzorkou DNA fragmenty veľkostneacuteho štandardu suacute fluorescenčne označeneacute pričom použiteacute fluorescenčneacute farbivo je ineacute ako fluorescenčneacute farbivo použiteacute na označenie DNA fragmentov vo vyšetrovanej vzorke

Obr 33 Elektroforetogram veľkostneacuteho štandardu použiacutevaneacuteho na určenie veľkostiacute fragmentov analyzovanyacutech kapilaacuternou elektroforeacutezou v genetickom analyzaacutetore (GeneScantrade 500 LIZtrade dye Size Standard) dĺžka fragmentov v nukleotidoch (napr 50 nukleotidov)

Fragmentačnaacute analyacuteza pozostaacuteva z viaceryacutech krokov Prvyacutem je izolaacutecia DNA nasleduje PCR amplifikaacutecia počas ktorej sa novosyntetizovaneacute DNA fragmenty označia fluorescenčnyacutemi farbivami Vzorka s PCR produktom sa pripraviacute na kapilaacuternu elektroforeacutezu tak že sa zmieša s veľkostnyacutem štandardom (sluacuteži na určenie veľkosti fragmentov) a denaturačnou laacutetkou (formamid) nasleduje denaturaacutecia Pripraveneacute vzorky suacute injektovaneacute do priacutestroja (genetickyacute analyzaacutetor) kde v kapilaacutere naplnenej polymeacuterom v elektrickom poli migrujuacute fluorescenčne značeneacute fragmenty DNA na zaacuteklade veľkosti (kapilaacuterna elektroforeacuteza) Počas elektroforeacutezy genetickyacute analyzaacutetor zaznamenaacuteva fluorescenciu fragmentov Analyacutezou daacutet prostredniacutectvom špeciaacutelnych softveacuterov sa ziacuteskajuacute elektroforetogramy z ktoryacutech je možneacute zistiť veľkosť fragmentov ako aj typ fluorescencie (docircležiteacute ak suacute genetickeacute varianty rozliacutešiteľneacute rocircznou fluorescenciou napr SNaPshot) Fragmentačnaacute analyacuteza je suacutečasťou množstva molekulaacuterno-genetickyacutech metoacuted (pozri obr 12 26 28 29 34) ako suacute napr STR analyacuteza (Short Tandem Repeat) AFLP analyacuteza (Amplified Fragment Lenght Polymorfism) RFLPT-RFLP analyacuteza (Restriction Fragment Lenght PolymorfismTerminal Restricted Fragment Lenght Polymorfism) SSCP (Single Strand Conformation Polymorfism) VNTR (Variable Number of Tandem Repeat) analyacuteza straty heterozygotnosti (LOH loss of heterozygozity) MLPA (Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification) MSMSA (Methylation-Sensitive Mobility Shift Assay) SNP genotypovanie (SNaPshotreg) HiCEP (High-Coverage Expression Profiling)

38

Obr 34 Kvantitatiacutevna fragmentačnaacute PCR analyacuteza (QF-PCR) DNA izolovanej z plodovej vody vyacutesledok prenataacutelnej analyacutezy = priacutetomnosť troch piacutekov pre chromozoacutem 18 (u všetkyacutech fragmentov detegujuacutecich chromozoacutem 18 je pomer vyšetrovanyacutech markerov aberantnyacute 21 resp 111) čo znamenaacute trizoacutemiu chromozoacutemu 18 Edwardsov syndroacutem

39

8 Metoacutedy založeneacute na princiacutepe hybridizaacutecie

Nukleoveacute kyseliny majuacute schopnosť vytvaacuterať dvojvlaacuteknoveacute reťazce z jednovlaacuteknovyacutech molekuacutel na zaacuteklade komplementarity baacutez Komplementarita baacutez umožňuje replikaacuteciu DNA transkripciu RNA komplementarita baacutez zabezpečuje teda reprodukovateľnosť živej hmoty

Hybridizaacutecia je proces v ktorom na zaacuteklade komplementarity baacutez dochaacutedza k vytvoreniu dvojvlaacuteknovej nukleovej kyseliny z dvoch jednovlaacuteknovyacutech molekuacutel DNA alebo RNA alebo ich kombinaacuteciou DNA RNA pričom kratšia jednovlaacuteknovaacute nukleovaacute kyselina vystupuje ako sonda (proacuteba) Hybridizaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten je jeden z najpoužiacutevanejšiacutech naacutestrojov v molekulaacuternej bioloacutegii a genetike (hybridizaacutecia primerov alebo proacuteb sa využiacuteva v takmer každej metoacutede - v PCR RT-PCR qPCR RT-qPCR MLPA sekvenovaniacute fragmentačnej analyacuteze FISH DNA mikročipoch atď)

Denaturaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten je proces pri ktorom dochaacutedza k porušeniu vodiacutekovyacutech vaumlzieb medzi vlaacuteknami nukleovyacutech kyseliacuten (strata sekundaacuternej a terciaacutelnej štruktuacutery) tak že docircjde k ich uacuteplneacutemu oddeleniu vzniknuacute jednovlaacuteknoveacute reťazce Denaturaacutecia NK mocircže byť spocircsobenaacute vplyvom vysokyacutech teplocirct pH alebo chemickyacutech laacutetok (denaturačneacute činidlaacute) Renaturaacutecia je opačnyacute proces v ktorom na zaacuteklade komplementarity dochaacutedza k tvorbe dvojvlaacuteknovyacutech NK

Hybridiza čnaacute sonda (proacuteba) je jednovlaacuteknovaacute nukleovaacute kyselina určitej znaacutemej dĺžky a sekvencie (najčastejšie DNA pretože je stabilnejšia ako RNA) ktoraacute je značenaacute a sluacuteži na detekciu komplementaacuternych molekuacutel DNA alebo RNA v procese hybridizaacutecie V zaacutevislosti od podmienok hybridizaacutecie (stringencia) mocircže byť detegovanaacute sekvencia uacuteplne komplementaacuterna alebo v menej priacutesnych podmienkach mocircže mať sekvenčneacute odchyacutelky Proacuteba sluacuteži na vyhľadanie a zviditeľnenie cieľovyacutech NK Zviditeľnenie sa deje prostredniacutectvom označenia proacuteby ešte pred hybridizaacuteciou Značenie proacuteby mocircže byť raacutedioaktiacutevne a neraacutedioaktiacutevne (najčastejšie fluorescenčneacute)

Raacutedioaktiacutevne značeneacute proacuteby pomocou izotopov (32P) sa využiacutevali viac v minulosti v suacutečasnosti suacute kvocircli zdravotnyacutem rizikaacutem ohľaduplnosti k životneacutemu prostrediu ako aj kvocircli jednoduchšej manipulaacutecii použiacutevaneacute fluorescenčne značeneacute proacuteby Raacutedioaktiacutevne značeneacute sondy boli použiacutevaneacute hlavne metoacutedou Southernovej hybridizaacutecie (Southern blotting Southern blot) Citlivosť raacutedioaktiacutevne značenyacutech proacuteb je vyššia dosahuje schopnosť zachytiť 10 fg (femtogram 10-15) cieľovej DNA sekvencie 81 Southern blot

Metoacutedu objavil v roku 1975 britskyacute bioloacuteg Edwin Southern (preto Southern) Pri Southernovej hybridizaacutecii sa restrikčne štiepeneacute fragmenty DNA elektroforeticky separujuacute v geacuteli potom sa metoacutedou blottingu prenesuacute na nylonovuacute alebo nitroceluloacutezovuacute membraacutenu kde suacute naacutesledne hybridizovaneacute v roztoku obsahujuacutecom raacutedioaktiacutevne značenuacute sondu Priloženiacutem fotografickeacuteho filmu k membraacutene a vyvolaniacutem filmu autoraacutediografiou docircjde k zviditeľneniu lokaliacutet kde došlo k hybridizaacuteciiacute raacutedioaktiacutevne značenej sondy s fragmentom DNA (autoraacutediogram) Southern blot bol kľuacutečovou a prvou metoacutedou na identifikaacuteciu osocircb (DNA fingerprinting DNA pofiling) (obr 35)

Okrem Southern blotu existuje Northern blot na analyacutezu RNA (geacutenovej expresie) a Western blot na analyacutezu proteiacutenov postup je obdobnyacute ako pri Southern blote s obmenami špecifickyacutemi pre konkreacutetny blot Pri Northern blote sa použiacutevajuacute hybridizačneacute proacuteby ale pre vizualizaacuteciu proteiacutenov western blotom je potrebneacute použiť protilaacutetky s naacuteslednou vizualizaacuteciou Pomenovanie techniacutek je hra so sloviacutečkami (keďže paacuten Northern ani Western neobjavili takto nazvaneacute techniky)

Neraacutedioaktiacutevne značenie proacuteb použiacutevanyacutech v molekulaacuternej genetike mocircže byť nepriame (použitie haptenu) alebo priame Konečnaacute vizualizaacutecia je najčastejšie zabezpečenaacute fluoreskujuacutecimi farebnyacutemi značkami farbivami fluorochroacutemami (fluorofoacuterami) Pri priamom značeniacute je farbička kovalentne naviazanaacute na nukleotid a na zachytenie fluorescencie suacute potrebneacute špeciaacutelne priacutestroje umožňujuacutece excitaacuteciu farbičky ktoraacute potom emituje žiarenie určitej vlnovej dĺžky (emisneacute žiarenie) a to zachytiacute detekčnyacute systeacutem priacutestroja Využitie fluorochroacutemov v molekulaacuternej genetike je masiacutevne napr na vizualizaacuteciu NK elektroforeticky separovanyacutech v geacuteli kvantifikaacuteciu produktov PCR reakcie v priacutestroji real-time PCR cykleacuter sekvenovaniacute fragmentačnej analyacuteze FISH DNA mikročipoch atď

40

Obr 35 Princiacutep Southern blotu

82 FISH (fluorescenčnaacute in situ hybridizaacutecia)

FISH (fluorescent in situ hybridization fluorescenčnaacute in situ hybridizaacutecia) metoacuteda patriacute medzi molekulovo-cytogenetickeacute techniky Princiacutep FISH metoacutedy je založenyacute na hybridizaacuteciiacute fluorescenčne značenyacutech proacuteb ku komplementaacuternym uacutesekom vyšetrovanej DNA na podložnom skle (priamo na mieste - in situ) K denaturaacutecii dsDNA dochaacutedza buď vplyvom denaturačnyacutech činidiel alebo zvyacutešenou teplotou a naacuteslednou renaturaacuteciou dochaacutedza k naviazaniu sondy na komplementaacuterny uacutesek DNA Vyacutesledok hybridizaacutecie sa vizualizuje fluorescenčnyacutem mikroskopom vybavenyacutem vhodnyacutemi fluorescenčnyacutemi filtrami a vizuaacutelne zhodnotiacute skuacutesenyacutem odborniacutekom Fluorescencia sa v niektoryacutech priacutepadoch mocircže zaznamenať a hodnotiť aj pomocou softveacuteru (obr 36)

Pomocou FISH detegujeme numerickeacute aberaacutecie - zmeny v počte chromozoacutemov (napr trizoacutemia monozoacutemia chromozoacutemov) alebo štruktuacuterne aberaacutecie a prestavby (napr translokaacutecie inverzie deleacutecie duplikaacutecie amplifikaacutecie) FISH metoacuteda umožňuje identifikaacuteciu a detekciu každeacuteho ľudskeacuteho chromozoacutemu jeho zaradenie do karyotypu odhalenie malyacutech submikroskopickyacutech chromozoacutemovyacutech zmien a tiež mapovať poziacutecie jednotlivyacutech geacutenov na chromozoacuteme

41

Obr 36 Princiacutep štandardnej FISH a FISH maľovania celeacuteho chromozoacutemu

Veľkou vyacutehodou FISH metoacutedy je možnosť analyacutezy buniek v metafaacuteze aj v interfaacuteze kedy nie je nutnaacute kultivaacutecia buniek a tiež ryacutechle analyzovanie veľkeacuteho počtu buniek (stovky až tisiacutece) K ďalšiacutem vyacutehodaacutem patriacute bezpečnosť vysokaacute citlivosť dostatočnaacute stabilita relatiacutevne kraacutetky čas hybridizaacutecie a možnosť ryacutechleho vyhodnotenia Hybridizaacutecia pri vaumlčšine suacutečasne dodaacutevanyacutech sond trvaacute 10-12 hodin (na trhu suacute už dostupneacute aj sondy so skraacutetenyacutem časom hybridizaacutecie na 2-3 hodiny) Po hybridizaacuteciiacute nasleduje odmyacutevanie kedy pri priacuteslušnej teplote dochaacutedza k odmytiu nenaviazanyacutech a nespraacutevne hybridizovanyacutech sond Preparaacutet sa naacutesledne podfarbiacute a vyacutesledok sa zhodnotiacute vo fluorescenčnom mikroskope Na podfarbenie chromozoacutemov alebo jadier sa použiacuteva modreacute kontrastneacute farbivo DAPI (46-diamidino-2-fenylindol) ktoreacute maacute silneacute fluorescenčneacute vlastnosti dokaacuteže prechaacutedzať jadrovou membraacutenou a viazať sa na DNA Vyacutesledkom je modreacute zafarbenie ktoreacute vyacuteborne kontrastuje so signaacutelmi jednotlivyacutech sond

Limitujuacutecim faktorom FISH je možnosť identifikaacutecie len tyacutech uacutesekov DNA ku ktoryacutem suacute použiteacute sondy V jednej analyacuteze je možneacute použiť najviac 3 odlišne značeneacute sondy a tak zistiť priacutepadneacute abnormality len na 1 alebo na paacuter lokusoch Na relevantnuacute detekciu je potrebneacute mať vo vzorke 1-5 aberantnyacutech interfaacutezovyacutech jadier

FISH je možneacute uskutočniť na širokej škaacutele biologickeacuteho materiaacutelu na vzorkaacutech perifeacuternej krvi kostnej drene naacuteteroch choriovyacutech klkoch plodovej vode rocircznych druhov tkaniacutev natiacutevnych alebo zaliatych v parafiacutene na 1 bunke (predimplantačnaacute genetickaacute diagnostika PGD) (obr 37)

Využiacuteva sa na detekciu aberaacuteciiacute pri mnohyacutech onkologickyacutech ochoreniach (napr pri diagnoacuteze mnohopočetnyacute myeloacutem sa v suacutečasnosti po separaacutecii CD138+ buniek robiacute FISH s 5 sondami pre geacuteny IGH TP53 RB1 oblasť 1p321q21 a stanovuje sa hyperploidia chromozoacutemov 5 9 a 15) a tiež k spresneniu doplneniu a k overeniu bežneacuteho cytogenetickeacuteho vyšetrenia

Podľa miesta na chromozoacuteme na ktorom dochaacutedza k hybridizaacutecii sondy rozlišujeme 4 typy

DNA sond bull centromeacuteroveacute sondy ndash sa viažu na strednuacute časť chromozoacutemu ndash centromeacuteru sluacutežia k diagnostike zmien v počte chromozoacutemov k detekcii chromozoacutemov neznaacutemeho pocircvodu umožňujuacute interfaacuteznu FISH na nedeliacich sa bunkaacutech (obr 38-41)

42

Obr 37 Interfaacutezna FISH preimplantačnyacute genetickyacute skriacutening aneuploidiiacute ndash blastomeacutera 3-denneacuteho ľudskeacuteho embrya s normaacutelnym počtom chromozoacutemov 13 18 21 pohlavie XY použityacutech 5 sond pre chromozoacutemy 13 ndash orange 18 ndash aqua 21 ndash green X ndash blue a Y ndash yellow (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

Obr 38 Interfaacutezne jadro po hybridizaacutecii s centromeacuterovou sondou pre chromozoacutem 8 (Vysis Abbott) V pravom jadre je priacutetomnaacute trizoacutemia chromozoacutemu 8 (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex) Obr 39 Metafaacutezna (A) a interfaacutezna FISH (B) použitaacute centromeacuterovaacute sonda CEPX spectrum orangeCEPY spectrum green (Vysis Abbott) Sonda hybridizuje k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (červenyacute signaacutel) a Y (zelenyacute signaacutel) (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

43

Obr 40 Interfaacutezna FISH vyšetrenie spermiiacute použiteacute sondy CEPX greenCEPY orange (Aneuscore Metasystems) Sondy hybridizujuacute k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (zelenyacute signaacutel) Y (červenyacute signaacutel) vľavo ndash dve haploidneacute spermie (majuacutece jedna spermia X druhaacute Y chromozoacutem) vpravo ndash dve patologickeacute spermie obsahujuacutece gonozoacutemovyacute komplement XY (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

Obr 41 Interfaacutezna FISH vyšetrenie spermiiacute použiteacute sondy CEPX greenCEPY orange a CEP18 aqua (Aneuscore Metasystems) Sondy hybridizujuacute k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (zelenyacute signaacutel) Y (červenyacute signaacutel) a 18 (modryacute signaacutel) vľavo ndash normaacutelne haploidneacute ľudskeacute spermie - 1x chromozoacutem X alebo Y a jedenkraacutet chromozoacutem 18 v strede ndash patologickaacute spermia obsahujuacuteca gonozoacutemovyacute komplement XY a jeden chromozoacutem 18 vpravo ndash patologickaacute diploidnaacute spermia s chromozoacutemami X Y a dvoma chromozoacutemami 18 (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

bull lokusovo špecifickeacute sondy ndash hybridizaacutecia prebehne na konkreacutetnom mieste geacutenu (lokuse) (obr 42-44) použiacutevajuacute sa k vyšetreniu mikrodeleacuteciiacute (straty malyacutech častiacute chromozoacutemu pri mikrodelečnyacutech syndroacutemoch) k zisteniu amplifikaacutecie onkogeacutenov a niektoryacutech špecifickyacutech translokaacuteciiacute prestavby geacutenov umožňujuacute interfaacuteznu FISH na nedeliacich sa bunkaacutech bull subtelomeroveacute ndash vaumlzba na koncoveacute časti chromozoacutemu ndash telomeacutery bull celochromozoacutemoveacute alebo celomaľovacie sondy ndash sondy hybridizujuacute s mnohopočetnyacutemi chromozoacutemovyacutemi sekvenciami pričom sa fluorescenčne tak bdquovymaľujeldquo celyacute chromozoacutem (Obr 45) Použiacutevajuacute sa na vyšetrenie chromozoacutemovyacutech prestavieb k analyacuteze translokaacuteciiacute a k detekcii pocircvodu tzv marker chromozoacutemov (malyacutech nadpočetnyacutech chromozoacutemov neznaacutemeho pocircvodu) K použitiu sondy suacute potrebneacute metafaacutezne chromozoacutemy nepoužiacutevaju sa pre interfaacuteznu FISH

Pri konvenčnej chromozoacutemovej FISH suacute homogeacutenne DNA proacuteby hybridizovaneacute s fixovanyacutem metafaacuteznym alebo prometafaacuteznym chromozoacutemomchromozoacutemami na skliacutečku (Obr 36a) Maximaacutelna rozlišovacia schopnosť metafaacuteznej FISH je niekoľko megabaacutez (Obr 39a 45) využitiacutem viac

44

natiahnutyacutech prometafaacuteznych chromozoacutemov sa dosiahne 1 Mb rozliacutešenie Prostredniacutectvom fiber FISH konkreacutetne artificiaacutelne deproteinizovanej natiahnutej DNA pripravenej in situ z celyacutech buniek na mikroskopickom skliacutečku je možneacute vizualizovať individuaacutelne geacuteny maleacute DNA elementy na chromozoacuteme s rozliacutešeniacutem okolo 1000 bp

Obr 42 Interfaacutezne jadro po hybridizaacutecii s lokusovo-špecifickou sondou LSI 5q31 Spectrum Orange5p12 Spectrum Green (Vysis Abbott) Na ľavom obraacutezku suacute priacutetomneacute dva červeneacute (5q31) a dva zeleneacute signaacutely (5p12) v pravom jadre je priacutetomnaacute deleacutecia 5q31 oblasti chyacuteba jeden červenyacute signal (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

Obr 43 Interfaacutezna FISH použitaacute lokusovo-špecifickaacute sonda ndash translokačnaacute - XL BCRABL1 plus (Metasystems) dvojfarebnaacute dvojfuacutezna kde červenaacute označuje lokus ABL1 na chromozoacuteme 9 a zelenaacute oblasť BCR na chromozoacuteme 22 Sonda deteguje fuacuteziu protoonkogeacutenu ABL1 (9q34) a geacutenu BCR (22q11) v priacutepade že červenyacute a zelenyacute signaacutel suacute pri sebe (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

45

Obr 44 Interfaacutezna FISH Použitaacute lokusovo-špecifickaacute sonda- typ break apart pre IGH geacuten V docircsledku translokaacutecie došlo k rozskočeniu geacutenu pričom translokačneacuteho partnera nepoznaacuteme vieme určiť len percento v koľkyacutech jadraacutech je geacuten prestavanyacute (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex) Obr 45 Použiteacute celochromozoacutemoveacute sondy WCP 15 (červenyacute chromozoacutem) a WCP 17 (zelenyacute chromozoacutem) Na metafaacuteze je potvrdenaacute reciprokaacute translokaacutecia t(1517)(q2221) (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

FISH vizualizaacutecia celeacuteho chromozoacutemu maľovanie chromozoacutemu anglicky chromosome

painting je špeciaacutelnou aplikaacuteciou chromozoacutemovej FISH proacuteba je koktail veľkeacuteho počtu rocircznych fluorescenčne značenyacutech DNA fragmentov hybridizujuacutecich pozdĺž celeacuteho konkreacutetneho chromozoacutemu (obr 36b 45) bdquoChromosomepaintingldquo analyzuje metafaacutezne chromozoacutemy V minulosti bola FISH vizualizaacutecia celyacutech chromozoacutemov limitovanaacute malyacutem množstvom rocirczne sfarbenyacutech fluorochroacutemov

V suacutečasnosti je možneacute detegovať množstvo cieľovyacutech sekvenciiacute naraz čo sa využiacuteva pri celogenoacutemovej chromozoacutemovej vizualizaacutecii (whole-chromosomepainting - WCP) metoacutedou multiplex FISH (M-FISH multicolor FISH o br 46) alebo spektraacutelnej karyotypizaacutecie (SKY) kedy možno rozliacutešiť všetky ľudskeacute chromozoacutemy ndash teda 24 rocircznych chromozoacutemov M-FISH a SKY patria medzi metafaacutezne formy FISH diagnostiky ktoreacute umožňujuacute simultaacutennu vizualizaacuteciu všetkyacutech ľudskyacutech chromozoacutemov v rocircznych farbaacutech čo predstavuje uľahčenie analyacutezy karyotypu hlavne pri komplexnyacutech zmenaacutech a markeroch neznaacutemeho pocircvodu Obe techniky vychaacutedzajuacute z použitia

46

celochromozoacutemovyacutech sond značenyacutech kombinaacuteciou viaceryacutech fluorochroacutemov Rozdiel medzi M-FISH a SKY spočiacuteva v technike ziacuteskania konečneacuteho obrazu

Obr 46 Multicolor FISH - každyacute chromozoacutemovyacute paacuter je zafarbenyacute inou farbou pričom na ich zafarbenie postačuje kombinaacutecia 5 fluorochroacutemov Na vyhodnocovanie je potrebnaacute špeciaacutelna sada fluorescenčnyacutech filtrov pre jednotliveacute fluorochroacutemy a špeciaacutelnyacute softweacuter Vľavo-štandardnyacute karyotyp vpravo karyotyp s mutaacuteciami (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

V molekulovej cytogenetike suacute komerčne dostupneacute sety M-FISH proacuteb umožňujuacutece

viacfarebneacute pruacutežkovanie chromozoacutemov (banding) s vysokyacutem rozliacutešeniacutem (multicolor-banding mBAND FISH MCB) čo umožňuje identifikaacuteciu intrachromozoacutemovyacutech prestavieb (Obr 47) Nevyhnutnosťou mBAND-u je mať chromozoacutemy v metafaacuteze Taacuteto metoacuteda bola prvyacutekraacutet uskutočnenaacute na chromozoacuteme 5 v roku 1999 mBAND FISH umožňuje rozliacutešiť špecifickeacute oblasti chromozoacutemov na uacuterovni pruacutežku - bandu a sub-bandu s detekciou 550 bandov haploidneacuteho karyotypu

Obr 47 A - mBAND chromozoacutemu 11 - inverzia duplikovanej oblasti 11q223-q25 B - mBAND chromozoacutemu 3 - na kruhovom chromozoacuteme deleacutecia oblasti 3p263 C - mBAND chromozoacutemu 2 - potvrdenie inverzie duplikovanej časti chromozoacutemu (poskytnuteacute RNDr Dagmar Landlovou Medirex)

FISH metoacuteda a jej varianty (M-FISH mBAND SKY) majuacute v suacutečasnosti širokeacute využitie v

klinickej genetike v onkologickej genetike na detekciu aberaacuteciiacute v čase diagnoacutezy počas liečby po

47

liečbe monitorovanie po transplantaacutecii kostnej drene v prenataacutelnej a postnataacutelnej diagnostike pri detekcii submikroskopickyacutech deleacuteciiacute (napr DiGeorge syndroacutem - 22q112 delečnyacute syndroacutem PraderndashWilli syndroacutem- chromozoacutem 15q11-13) prostredniacutectvom FISH je možnaacute detekcia numerickyacutech zmien chromozoacutemov (trizoacutemia chromozoacutemu 21 pri Downovom syndroacuteme trizoacutemia chromozoacutemu 15 pri Patauovom syndroacuteme trizoacutemia chromozoacutemu 18 pri Edwardsovom syndroacuteme) rocirczne zmeny v počte pohlavnyacutech chromozoacutemov (monozoacutemia X pri Turnerovom syndroacuteme Klinefelterov syndroacutem s X chromozoacutemom naviac - XXY) podobne v predimplantačnej diagnostike

83 DNA Microarray (DNA mikro čip biočip) DNA mikročipovanie je technika využiacutevajuacuteca hybridizaacuteciu skuacutemanej nukleovej kyseliny

(cieľovaacute vzorka) s veľkyacutem množstvom oligonukleotidovyacutech proacuteb (desať tisiacutec až milioacuten) ktoreacute suacute prichyteneacute na pevnyacute podklad najčastejšie sklenyacute silikoacutenovyacute alebo nylonovyacute (doštička čip) Skuacutemanaacute nukleovaacute kyselina je pred hybridizaacuteciou fragmentovanaacute označenaacute fluorofoacuterom a denaturovanaacute Po kontakte čipu s cieľovou vzorkou ktoraacute je vlastne zmes označenyacutech oligonukleotidov značeneacute oligonukleotidy hybridizujuacute s oligonukleotidovyacutemi sekvenciami prichytenyacutemi na čipe Potom suacute na zaacuteklade fluorescencie detekovaneacute miesta kde došlo k hybridizaacutecii čiže vzorka obsahovala takuacuteto nukleotidovuacute sekvenciu Z jedneacuteho mikročipu sa ziacuteska obrovskeacute množstvo daacutet ktoreacute je vždy nutneacute softveacuterovo spracovať V dnešnej dobe existuje niekoľko firiem poskytujuacutecich komerčne mikročipy na objednaacutevku alebo si ich laboratoacuteria produkujuacute sami

Mikročipovanie prebieha nasledovne

1) Vytvorenie DNA čipu ndash tisiacutece rocircznych jednovlaacuteknovyacutech DNA oligonukleotidov znaacutemych sekvencii sa kovalentne naviažu na povrch doštičky vždy v určitej lokalite je niekoľko rovnakyacutech oligonukleotidov veľkosť takejto lokality je ˂ 200 microm Proacutebami mocircže byť DNA cDNA alebo syntetizovaneacute oligonukleotidy Už hotoveacute mikročipy ponuacutekajuacute viacereacute firmy (Affymetrix Agilent Technologies Eppendorf Illumina) alebo si ich jednotliveacute laboratoacuteria vyraacutebajuacute sami pomocou robotickyacutech zariadeniacute DNA čip sa vytvaacutera buď nanaacutešaniacutem kvapiek oligonukleotidov na podklad alebo synteacutezou oligonukleotidov in situ na čipe 2) Priacuteprava vzorky ndash nukleovaacute kyselina (mRNA DNA) sa purifikuje určiacute sa jej kvantita a kvalita (spektrofotometericky) fragmentuje resp v priacutepade mRNA sa syntetizuje cDNA v priacutepade potreby sa mocircže DNA amplifikovať PCR reakciou štiepiť restrikčnyacutemi endonukleaacutezami 3) Fluorescenčneacute označenie (zriedkavejšie raacutedioaktiacutevne) fragmentov DNA prebieha počas reverznej transkripcie alebo PCR amplifikaacutecie za uacutečasti fluorescenčne značenyacutech nukleotidov Keď sa analyzujuacute dve rocirczne vzorky napr zdraveacute tkanivo a naacutedoroveacute tkanivo označenie nukleovyacutech kyseliacuten v tyacutechto tkanivaacutech byacuteva rozdielne a to použitiacutem dvoch rocircznych fluorescenčnyacutech farbiacutev (napr zeleneacute a červeneacute) Pred hybridizaacuteciou je potrebneacute vzorku denaturovať čiacutem sa vytvoriacute zmes jednovlaacuteknovyacutech DNA označenyacutech značkou 4) Hybridizaacutecia s mikročipom ndash v špeciaacutelnom hybridizačnom roztoku hybridizujuacute komplementaacuterne sekvencie zo vzorky s priacuteslušnyacutemi oligonukleotidovyacutemi sondami naviazanyacutemi na čipe Potom sa čip obmyje aby došlo k odstraacuteneniu čiastočne hybridizovanyacutech nukleovyacutech kyseliacuten 5) Skenovanie mikročipu ndash skenerom čipov docircjde k ožiareniu čipu laserom pričom v mieste hybridizaacutecie fluorescenčne značenyacutech DNA fragmentov s proacutebou docircjde k emisii svetla určitej vlnovej dĺžky ktoruacute skener zaznamenaacute 6) Analyacuteza daacutet prebieha metoacutedami bioinformatiky spracovaniacutem softveacutermi sa zistiacute ktoreacute lokality čipu navzaacutejom hybridizovali v priacutepade použitia dvoch vzoriek kontrolnej a skuacutemanej je možneacute analyzovať ich relatiacutevnu intenzitu hybridizaacutecie (expresie určiteacuteho geacutenu)

Existujuacute štyri typy mikročipov 1) Čipy ur čeneacute na analyacutezu expresie (obsahujuacute cDNA proacuteby) pre tzv dvojkanaacutelovyacute experiment kedy je vzorka určenaacute k hybridizaacutecii na čipe ziacuteskanaacute zmiešaniacutem DNA fragmentov kontrolnej a skuacutemanej vzorky pričom fragmenty suacute rozdielne fluorescenčne označeneacute (napr zelenyacute fluorofoacuter pre kontrolnuacute vzorku a červenyacute pre skuacutemanuacute) Na zaacuteklade intenzity a typu fluorescencie sa deteguje expresia geacutenov typickaacute pre kontrolnuacute vzorku (napr zelenaacute fluorescencia) pre skuacutemanuacute vzorku (napr

48

červenaacute fluorescencia) a expresia podobnaacute u oboch vzoriek (žltaacute fluorescencia) neexprimovaneacute geacuteny (čierna fluorescencia) rocirczne odtiene (v zaacutevislosti od prevažujuacutecej hybridizaacutecie) (obr 48) 2) Čipy ur čeneacute na analyacutezu mutaacutecii použije sa genoacutemovaacute DNA označenaacute jednou fluorescenčnou farbičkou na určenie jednonukleotidovej zmeny (SNP ndash Single Nukleotide Polymorphism) 3) Čipy na komparatiacutevnu genoacutemovuacute hybridizaacuteciu (aCGH array Comparative Genomic Hybridization) ndash použiacutevaneacute na zistenie zvyacutešenia alebo zniacuteženia množstva chromozoacutemovyacutech fragmentov obsahujuacutecich geacuteny zodpovedneacute za určiteacute ochorenie Na analyacutezu sa použije skuacutemanaacute gDNA a referenčnaacute (kontrolnaacute) DNA každaacute sa značiacute inou fluorescenčnou farbičkou (princiacutep ako pri analyacuteze expresie) (obr 49 50) 4) Čipy CGH - SNP kombinovaneacute čipy ur čeneacute na analyacutezu aj mutaacuteciiacute SNP aj na komparatiacutevnu genoacutemovuacute hybridizaacuteciu CGH

Mikročipy majuacute rozsiahle využitie napriacuteklad v identifikaacuteciiacute novyacutech geacutenov vo vyacuteskume ich funkciiacute expresie v rocircznych podmienkach pri diagnostike mnohyacutech ochoreniacute vo farmakogenomike vo vyacuteskume vplyvu toxiacutenov

Obr 48 Heatmapa geacutenovej expresie vybranyacutech geacutenov (mRNA) mikročip obsahuje 46000 cDNA proacuteb (poskytnuteacute Ing Helenou Gbelcovou PhD Uacutestav lekaacuterskej bioloacutegie genetiky a klinickej genetiky LF UK a UNB)

49

Obr 49 Princiacutep komparatiacutevnej genoacutemovej hybridizaacutecie (aCGH - array comparative genomic hybridization) Obr 50 A) Vyacutesledok komparatiacutevnej genoacutemovej hybridizaacutecie (aCGH - array comparative genomic hybridization) vzorky DNA izolovanej plodovej vody U plodu s abnormaacutelnym ultrasonografickyacutem vyšetreniacutem bola identifikovanaacute duplikaacutecia oblasti 3q261q29 (modryacute paacutes) a deleacutecia oblasti 5p1533p151 (červenyacute paacutes) Pre porovnanie chromozoacutem 1 bez aberaacutecie b) Ten istyacute pacient ale ineacute softveacuteroveacute spracovanie (poskytnuteacute RNDr Miroslavom Tomkom PhD Medirex)

50

Odporuacutečanaacute a použitaacute literatuacutera

Odborneacute knihy Klug W S Cummings M R Spencer Ch A Palladino M A Concepts of Genetics jedenaacuteste vydanie (2015) Carson S Molecular Biology Techniques tretie vydanie (2012) Strachan T Read A Human Molecular Genetics štvrteacute vydanie (2011) Sudbery P Sudbery I Human Molecular Genetics tretie vydanie (2009)

Internetoveacute straacutenky

wwwncbinlmnihgov wwwmlpacom wwwthermofishercom wwwilluminacom wwwpromegask wwwqiagencom wwwambioncom

Odborneacute člaacutenky Chacon-Cortes D Griffiths L R Methods for extracting genomic DNA from whole blood samples current perspectives Journal of Biorepository Science for Applied Medicine Volume 2 strany 1- 9 Viltrop T Krjutskov K Palta P Metspalu A Comparison of DNA extraction methods for multiplex polymerase chain reaction Anal Biochem 2010 Volume 398(2) strany 260-262 Ing Martin Čermaacutek Molekulaacuterna cytogenetika v problematike familiaacuternych maligniacutet Onkoloacutegia Volume 2 strany 77 - 83 Livak KJ Schmittgen TD Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method Methods 2001 Volume 25(4) strany 402 - 408 Bustin S A Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays J Mol Endocrinol 2000 Volume 25(2) strany169 - 193

MOLEKULAacuteRNE METOacuteDY AKTUAacuteLNE POUŽIacuteVANEacute V KLINICKEJ GENETIKE RNDr Andrea Pastoraacutekovaacute PhD RNDr Robert Petrovič PhD Vydala Univerzita Komenskeacuteho v Bratislave Lekaacuterska fakulta Rozsah 50 straacuten 246 AH prveacute vydanie ISBN 978-80-223-4231-5

8

2 Stanovenie kvantity a kvality nukleovyacutech kyseliacuten

Docircležiteacute je určenie koncentraacutecie a čistoty izolovanej DNA a RNA pretože analyacutezy ktoreacute nasledujuacute po izolaacutecii nukleovyacutech kyseliacuten často vyžadujuacute presneacute množstvo a čistotu nukleovyacutech kyseliacuten (NK bez priacutemesiacute) Metoacuted kvantifikaacutecie NK je niekoľko najpoužiacutevanejšie suacute spektrofotometrickaacute kvantifikaacutecia a kvantifikaacutecia UV fluorescenciou za priacutetomnosti farbičky

21 Spektrofotometrickaacute kvantifikaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten

Nukleoveacute kyseliny špecificky absorbujuacute ultrafialoveacute svetlo Vzorka s NK je v spektrofotometri (obr 6) vystavenaacute ultrafialoveacutemu svetlu o vlnovej dĺžke 260nm fotodetektor naacutesledne zmeria svetlo ktoreacute prejde vzorkou čiacutem viac svetla vzorka pohltiacute (absorbuje) tyacutem je vyššia koncentraacutecia nukleovej kyseliny vo vzorke Vyacutepočet koncentraacutecie NK zaacutevisiacute od toho či ide o DNA alebo RNA či je jednovlaacuteknovaacute alebo dvojvlaacuteknovaacute dsDNA c = A260002 [microgml] ssDNA c = A2600027 [microgml] RNA c = A2600025 [microgml]

Teda ak absorbancia dsDNA je 1 koncentraacutecia DNA vo vzorke je 50 microgml (pozn v priacutepade ak je draacuteha luacuteča 1cm)

Pokiaľ poznaacuteme sekvenciu napr pri synteacuteze primeru (ssDNA) mocircžeme z nej vypočiacutetať molekulovuacute hmotnosť a určiť priamo molaacuternu koncentraacuteciu nukleovej kyseliny (pmolmicrol) c = A260 lowast (100[15A + 071lowastC + 12lowastG + 084lowastT]) [pmolmicrol] A je počet adeniacutenov (v skutočnosti dATP) C je počet cytoziacutenov (dCTP) G je počet guaniacutenov (dGTP) a T počet tymiacutenov (dTTP)

Predpokladom pre spraacutevne určenie koncentraacutecie na zaacuteklade absorbancie je samozrejme čistota nukleovej kyseliny vo vzorke Čistota NK sa určuje podľa absorbčnej krivky popriacutepade zjednodušene na zaacuteklade pomeru absorbanciiacute pri 260 a 280 nm pretože proteiacuteny absorbujuacute svetlo vlnovej dĺžky 280nm Čistaacute DNA maacute pomer absorbanciiacute 260280 (A260280) pohybujuacutece sa okolo 18 čistaacute RNA maacute pomer absorbancii A260280 približne 2

Vzorku nukleovyacutech kyseliacuten mocircžu okrem proteiacutenov kontaminovať aj ďalšie laacutetky ako je fenol ktoryacute sa často využiacuteva pri izolaacutecii NK Takto izolovaneacute vzorky nukleovyacutech kyseliacuten nekontaminovaneacute fenolom by mali mať A260280 okolo 2 Ďalšie kontaminanty sa zisťujuacute absorbciou svetla pri 230 nm a 330 nm

22 Kvantifikaacutecia s použitiacutem fluorescenčnyacutech farbiacutev

Ďalšou možnosťou ako zmerať koncentraacuteciu nukleovyacutech kyseliacuten je zmeranie fluorescencie farbiva (napr etidiumbromid) ktoreacute sa viaže na nukleovuacute kyselinu a selektiacutevne svieti v priacutepade že je naviazaneacute na NK Metoacuteda využitia fluorescenčneacuteho farbiva naviazaneacuteho na NK sa použiacuteva v priacutepade ak je koncentraacutecia NK priacuteliš niacutezka na kvantifikaacuteciu spektrofotometrom ako aj v priacutepade že je NK kontaminovanaacute laacutetkou (kontaminantom) absorbujuacutecim svetlo vlnovej dĺžky 260nm 221 Využitie migraacutecie nukleovej kyseliny v geacuteli s jej naacuteslednou fluorescenčnou detekciou

Ak predpokladaacuteme niacutezku koncentraacuteciu NK na jej zistenie použijeme elektroforetickuacute

migraacuteciu NK v geacuteli (mocircže sa použiť agaroacutezovyacute alebo polyakrylamidovyacute geacutel) fluorescenčneacute farbivo je buď primiešaneacute do vzorky NK alebo priamo do geacutelu Spolu so vzorkou NK neznaacutemej koncentraacutecie migruje v geacuteli vo vedľajšej draacutehe vzorka NK so znaacutemou koncentraacuteciou Na zaacuteklade porovnania fluorescencie (po vystaveniacute geacutelu s NK svetlu o konkreacutetnej vlnovej dĺžke) vzorky so znaacutemou

9

koncentraacuteciu a vzorky neznaacutemej koncentraacutecie sa urobiacute odhad resp sa vyacutesledok kalkuluje počiacutetačovyacutem softveacuterom denzitometricky (obr 4)

222 Využitie kvantifikaacutecie množstva nukleovyacutech kyseliacuten použitiacutem real-time PCR metoacutedy

V priacutepade veľmi maleacuteho množstva NK ktoreacute nie je možneacute kvantifikovať ani geacutelovou elektroforeacutezou resp potrebujeme zistiť koncentraacuteciu NK veľmi presne u maleacuteho množstva NK (napr pre kriminalistiku) použije sa metoacuteda absoluacutetnej kvantifikaacutecie prostredniacutectvom real-time PCR (kvantifika čnej PCR qPCR) Princiacutep metoacutedy spočiacuteva v porovnaniacute amplifikaacutecie určiteacuteho uacuteseku nukleovej kyseliny vo vzorke neznaacutemej koncentraacutecii s amplifikaacuteciou tej istej sekvencie vo vzorke presne definovanej koncentraacutecie (obr 5) qPCR je možneacute kvantifikovať koncentraacuteciu raacutedovo v pgul 223 Kvantifikaacutecia fluorospektrofotometrom (fluori metrom)

Ak maacuteme dostatočneacute množstvo vzorky je možneacute na kvantifikaacuteciu použiť fluorospektrofotometer v tomto priacutepade je vzorka zmiešanaacute s fluorescenčnyacutem farbivom a je meranaacute emitovanaacute fluorescencia z ktorej sa vypočiacuteta koncentraacutecia

Moderneacute spektrofotometre a fluorimetre suacute konštruovaneacute tak aby na meranie bolo použiteacute minimaacutelne množstvo vzorky NK (napr pre priacutestroje NanoDrop je potrebnyacute len 05-1 microl vzorky) Pre porovnanie NanoDrop spektrofotometer (NanoDrop 2000c) je schopnyacute zmerať koncentraacutecie od 04 to 15 000 ngmicroL dsDNA NanoDrop fluorospektrometer 005 do 2000 pgmicroL Spektrofotometre a fluorofotometre suacute po meraniacute schopneacute vďaka softveacuteroveacutemu vybaveniu vypočiacutetať nielen koncentraacuteciu ale aj čistotu vzorky (httpwwwnanodropcom) Obr 4 Kvantifikaacutecia nukleovej kyseliny porovnaniacutem s fragmentom podobnej dĺžky a znaacutemej koncentraacutecie (po migraacutecii v agaroacutezovom geacuteli v jednosmernom elektrickom pruacutede a naacuteslednej fluorescenčnej detekcii) - odhad DNA v 3 draacutehe cca 100ng porovnaniacutem s 1000bp fragmentom štandardu molekulovyacutech hmotnostiacute (šmh)

10

Obr 5 Absoluacutetna kvantifikaacutecia DNA priacutestrojom real-time PCR cykleacuterom porovnaniacutem amplifikaacutecie uacuteseku DNA v skuacutemanej vzorke s amplifikaacuteciou vzorky so znaacutemou kvantitou Okrem amplifikaacutecie skuacutemanej vzorky je treba urobiť štandardnuacute krivku amplifikaacutecie vzorky znaacutemej koncentraacutecie z ktorej sa koncentraacutecia skuacutemanej vzorky odčiacuteta V kriminalistike sa bežne použiacuteva pridanie vnuacutetornej kontroly ku vzorke na určenie čistoty vzorky (v priacutetomnosti inhibiacutetorov nedocircjde k amplifikaacutecii žiadnej DNA) Vnuacutetornaacute kontrola je už priacutetomnaacute v kite čiže sa automaticky pridaacuteva pri priacuteprave vzoriek na qPCR amplifikaacuteciu sluacuteži na zistenie priacutetomnosti inhibiacutetorov v skuacutemanej vzorke teda v priacutepade že nedocircjde k amplifikaacutecii vo vzorke sluacuteži na rozliacutešenie či je koncentraacutecia DNA priacuteliš niacutezka alebo suacute vo vzorke priacutetomneacute inhibiacutetory Bežnaacute mediciacutenska molekulaacuterno-genetickaacute diagnostika nevyžaduje priacutetomnosť vnuacutetornej kontroly keďže nukleoveacute kyseliny suacute prevažne izolovaneacute kitmi z krvi čiže je zabezpečenaacute vysokaacute kvalita a čistota naizolovanej NK Obr 6 Spektrofotometer (NanoPhotometer) a ukaacutežka vyacutesledkou merania koncentraacutecie RNA izolovanej minikolonovou metoacutedou

11

3 PCR (polymeraacutezovaacute reťazovaacute reakcia)

Je metoacuteda vyvinutaacute v roku 1983 Karym Mullisom ocenenaacute v roku 1993 Nobelovou cenou za cheacutemiu Polymeraacutezovaacute reťazovaacute reakcia je založenaacute na schopnosti DNA polymeraacutezy syntetizovať noveacute vlaacutekno DNA podľa templaacutetoveacuteho vlaacutekna na zaacuteklade princiacutepu komplementarity DNA polymeraacuteza je schopnaacute pripaacutejať nukleotidy len k voľnej 3acuteOH skupine preto potrebuje primer (čiacutetaj prajmer) ku ktoreacutemu je schopnaacute pridaacutevať nukleotidy Primery suacute kraacutetke jednovlaacuteknoveacute oligonukleotidy ktoreacute umožňujuacute jednak DNA polymeraacuteze začať so synteacutezou noveacuteho vlaacutekna na druhej strane ohraničujuacute špecifickuacute oblasť ktoruacute chceme amplifikovať (namnožiť) Vyacutesledkom PCR reakcie je obrovskyacute počet koacutepii špecifickej sekvencie (obr 7) PCR v podstate napodobňuje replikaacuteciu DNA v in vitro podmienkach s rozdielom že nedochaacutedza k replikaacutecii celej DNA ale len vybraneacuteho primermi ohraničeneacuteho miesta

31 Najdocircležitejšie PCR komponenty

Templaacutetovaacute DNA je vzorka DNA obsahujuacuteca cieľovuacute sekvenciu Na začiatku reakcie docircjde pri vysokej teplote k denaturaacutecii a separaacutecii jednotlivyacutech vlaacutekien dvojvlaacuteknovej DNA

Enzyacutem DNA polymeraacuteza syntetizuje noveacute DNA vlaacutekno komplementaacuterne k cieľovej sekvencii Najčastejšie použiacutevanou a prvou DNA polymeraacutezou je Taq DNA polymeraacuteza (z termofilnej bakteacuterie Thermus aquaticus) zatiaľ čo Pfu DNA polymeraacuteza (z Pyrococcus furiosus) je preferovanaacute kvocircli tzv vysokej fidelite čo je schopnosť inkorporovať spraacutevnu baacutezu do novosyntetizovaneacuteho vlaacutekna DNA DNA polymeraacutezy musia mať dve vlastnosti schopnosť syntetizovať noveacute vlaacutekno DNA podľa templaacutetovej DNA a byť termostabilneacute čiže rezistentneacute na vysokeacute teploty (cca 100degC) V suacutečasnosti sa v laboratoacuteriaacutech často použiacutevajuacute rekombinantneacute polymeraacutezy s požadovanyacutemi vlastnosťami Napriacuteklad pre PCR ktorej produkt bude klonovanyacute je docircležiteacute použiť polymeraacutezu ktoraacute je schopnaacute opraviť vlastnuacute chybu v priacutepade inkorporaacutecie nespraacutevnej baacutezy pri synteacuteze noveacuteho reťazca Schopnosť opravovať nespraacutevne inkorporovaneacute baacutezy počas synteacutezy noveacuteho vlaacutekna DNA sa nazyacuteva tzv proofreading aktivita ktoraacute je zabezpečenaacute 3rarr5acute exonukleaacutezovou aktivitou takejto polymeraacutezy Pred vlastnou molekulaacuterno-genetickou diagnostikou je treba optimalizovať podmienky PCR reakcie pre konkreacutetnu DNA polymeraacutezu a pre špecifickeacute primery treba zistiť optimaacutelnu teplotu annealingu (hybridizaacutecie) primerov koncentraacutecie jednotlivyacutech zložiek PCR reakcie (napr MgCl2)

Primery suacute kraacutetke jednovlaacuteknoveacute DNA sekvencie komplementaacuterne k cieľovej sekvencii DNA polymeraacuteza začiacutena syntetizovať noveacute vlaacutekno z 3acutekonca primeru Docircležitou charakteristikou primerov je teplota topenia (Tm) t j teplota pri ktorej polovica DNA duplexov je disociovanaacute na jednovlaacuteknoveacute molekuly

Nukleotidy (dNTP deoxyribonukleotidtrifosfaacutety) suacute stavebneacute prvky pre novosyntetizovanuacute DNA molekulu

Veľmi praktickyacutem riešeniacutem pre molekulaacuterno-genetickeacute diagnostickeacute laboratoacuteria je tzv mastermix to je roztok v ktorom už je priacutetomneacute všetko potrebneacute pre priebeh PCR reakcie samozrejme okrem primerov a templaacutetovej DNA sekvencie PCR Master Mix (2X) od firmy ThermoFisher Scientific je jednyacutem z takyacutechto mixov obsahuje Taq DNA polymeraacutezu tlmivyacute roztok (pufor) MgCl2 a všetky deoxyribonukleotidy trifosfaacutety

Tabuľka č 1 uvaacutedza ako sa PCR reakcia z mastermixu pripravuje pre jednu vzorku Keďže v laboratoacuteriu sa zriedka robiacute PCR reakcia s jednou vzorkou treba si pripraviť tzv premix (tj PCR reakcie pre vaumlčšiacute počet vzoriek ale bez templaacutetovej DNA) ktoryacute sa rozdeliacute do mikroskuacutemaviek a až potom sa k nim pridaacute DNA resp cDNA

12

Tab 1 Priacuteprava PCR premixu

Celkovyacute objem jednej PCR reakcie 10 microl Počet vzoriek 8 2x PCR master mix 5 40

primer sense (10microM) 05 4

primer antisense (10microM) 05 4

H2O 35 28

DNA cDNA 05

rozpipetovať premix po 95microl do mikroskuacutemaviek až potom pridať do každej mikroskuacutemavky zvlaacutešť DNA cDNA

spolu objem 10 76

PCR amplif ikaacutecia je cyklickyacute proces pozostaacutevajuacuteci z troch krokov (obr 7) 1) denaturaacutecia dvojvlaacuteknovej DNA pri vysokej teplote (95degC) 2) hybridizaacutecia (annealing) primerov k špecifickej sekvencii DNA pri teplote vhodnej pre konkreacutetne primery 3) polymerizaacutecia (synteacuteza) novyacutech vlaacutekien DNA (72degC)

Obr 7 Princiacutep PCR

Tieto tri kroky sa opakujuacute 25 ndash 40 kraacutet pričom pri každom cykle sa počet molekuacutel zdvojnaacutesobiacute (vyacuteslednyacute počet cieľovej sekvencie je 2n+1 ak na začiatku bola jedna dvojvlaacuteknovaacute DNA a počet cyklov je n) PCR prebieha v termaacutelnom cykleacuteri (teplotnom cyklovači) je to priacutestroj (obr 8) kde je možneacute vykonať a naprogramovať celyacute termaacutelny priebeh PCR reakcie Tabuľka č 2 je priacutekladom termaacutelneho programu pre konkreacutetnu PCR reakciu

Po PCR reakcii je vyacuteslednyacute produkt možneacute vizualizovať elektroforeticky resp použiť na ďalšiu analyacutezu

13

Tab 2 Priacuteklad klasickeacuteho teplotneacuteho a časoveacuteho profilu PCR PCR Teplota Čas Opakovanie

95degC 2 minuacutety

95degC 15 sekuacutend

66degC 60 sekuacutend 30x

72degC 60 sekuacutend

72degC 5 minuacutet

Obr 8 Termaacutelny cykleacuter v procese a otvorenyacute s mikroskuacutemavkami

32 Variaacutecie PCR

Hot-start PCR využiacuteva DNA polymeraacutezu ktoruacute je treba aktivovať vysokou teplotou (napr 95degC 10 minuacutet) Vyacutehodou použiacutevania hot-start polymeraacutez je možnosť pracovať pri laboratoacuternej teplote keďže polymeraacuteza je pri bežnej teplote neaktiacutevna a tyacutem nemocircže docircjsť k vzniku nešpecifickyacutech produktov

Touchdown PCR maacute v počiatočnyacutech cykloch vyššiu teplotu annealingu (uacutečelom je zvyacutešiť

špecificitu PCR produktov na začiatku PCR) neskocircr sa teplota annealingu zniacuteži čo maacute za naacutesledok vyššiacute vyacuteťažok PCR produktu

Nested PCR maacute dva kroky a potrebuje dva paacutery primerov V prvom kroku sa prostredniacutectvom

prvej sady primerov amplifikuje dlhšiacute DNA fragment Ten sa použije ako templaacutet v druhom kroku s druhou sadou primerov s vyacuteslednyacutem kratšiacutem DNA produktom Nested PCR zvyšuje špecifickosť a citlivosť diagnostickyacutech PCR

Multiplex PCR je vlastne viac PCR reakciiacute prebiehajuacutecich v jednej skuacutemavke suacutečasne

V reakčnej zmesi je viac paacuterov primerov suacutečasne prebehne amplifikaacutecia viaceryacutech uacutesekov DNA takto dochaacutedza k šetreniu vzorky reakčnej zmesi a pracovneacuteho času

14

Real-time PCR je venovanaacute špeciaacutelna časť v skriptaacutech Sluacuteži na kvantifikaacuteciu PCR produktu v reaacutelnom čase na zaacuteklade merania fluorescencie okrem kvantifikaacutecie je využiacutevanaacute aj na určenie genotypov

RT-PCR je variaacutecia PCR umožňujuacuteca amplifikaacuteciu DNA sekvencie z vyacutechodiskovej RNA

sekvencie Najskocircr musiacute prebehnuacuteť prepis RNA do jednovlaacuteknovej cDNA prostredniacutectvom reverznej transkriptaacutezy naacutesledne sa cDNA použije pre PCR Selektiacutevnym použitiacutem primerov pri reverznej transkripcii mocircžeme uacutečelovo prepiacutesať buď celkovuacute RNA (primery - random hexameacutery) alebo len mRNA (primery - oligoT)

Alelovo-špecifickaacute PCR (AS-PCR) (obr 9) sluacuteži na detekciu konkreacutetnych mutaacuteciiacute

a jednonukleotidovyacutech polymorfizmov (SNP) Použije sa sada 3 primerov v dvoch kombinaacuteciaacutech PCR reakciiacute dva primery majuacute odlišnuacute sekvenciu na 3acute-koncoch jeden na detekciu wt (wild type) a druhyacute primer na detekciu mutantnej alely reakcia neprebehne ak miesto na templaacutetovej DNA nie je komplementaacuterne k 3acute-koncu primeru pretože DNA polymeraacuteza vyžaduje uacuteplnuacute hybridizaacuteciu primera na 3acute-konci Takto je možneacute rozliacutešiť priacutetomnosť štandardnej (wildtype ndash wt) a mutantnej alely resp SNP (obr 9) AS-PCR je znaacutema aj pod ďalšiacutemi naacutezvami ASO-PCR (allele-specific oligonucleotide PCR) ARMS (amplification-refractory mutation system)

Obr 9 Alelovo-špecifickaacute PCR (AS-PCR)

Mutageneacuteza prostredniacutectvom PCR (site directed mutagenesis) sa použiacuteva keď je potrebneacute vytvoriť mutaacuteciu v špecifickom mieste geacutenu primerprimery majuacute modifikovanuacute sekvenciu tak že obsahujuacute mutaacuteciu v strednej časti čo neovplyvniacute hybridizaacuteciu primerov s templaacutetovou DNA pričom vyacutesledkom je PCR produkt s cielene mutovanou DNA sekvenciou

Asymetrickaacute PCR sa použiacuteva na synteacutezu koacutepiiacute jedneacuteho vlaacutekna z templaacutetovej DNA a to

použitiacutem veľmi niacutezkej koncentraacutecie jedneacuteho primeru Sekvenačnaacute PCR je PCR v ktorej je použityacute len jeden primer a v reakčnej zmesi suacute okrem

všetkyacutech dNTP priacutetomneacute dideoxynukleotidtrifosfaacutety (ddNTP) značeneacute raacutedioaktiacutevne dnes však prevažne fluorescenčne každyacute typ ddNTP inou fluorescenčnou farbičkou Zaradenie niektoreacuteho zo štyroch ddNTP spocircsobiacute terminaacuteciu (zastavenie) predlžovania DNA reťazca fluorescenčneacute označenie ddNTP umožniacute detekciu dĺžky fragmentu a určenie sekvencie posledneacuteho nukleotidu Vyacuteslednyacute produkt sekvenačnej PCR sluacuteži na sekvenovanie Sekvenovaniu sa venuje samostatnaacute časť

MLPA (multiplex ligation-dependent probe amplification) ndash multiplexnaacute amplifikaacutecia proacuteb zaacutevislaacute od ligaacutecie je variaacutecia multiplexnej PCR umožňujuacuteca namnoženie viaceryacutech uacutesekov DNA za použitia iba jedneacuteho paacuteru primerov avšak s podmienkou vytvorenia sekvenčne špecifickej proacuteby ligaacuteciou sekvenčne špecifickyacutech oligonukleotidov MLPA je metoacuteda umožňujuacuteca detekciu počtu koacutepiiacute

15

až 50 nukleotidovyacutech sekvenciiacute v jednej reakcii Pomocou MLPA je možneacute ryacutechlo identifikovať amplifikaacutecie a deleacutecie veľkeacuteho počtu geacutenov či už z DNA alebo mRNA okrem toho MLPA mocircže byť použitaacute na analyacutezu CpG-metylaacutecie (MS-MLPA) Viac informaacutecii v samostatnej časti

SNaPshotreg Multiplex nazyacutevaneacute aj minisekvenovanie je multiplexnaacute reakcia v ktorej je každyacute primer predĺženyacute iba o jeden nukleotid (obr 10) V reakčnej zmesi nie suacute priacutetomneacute deoxyribonukleotidtrifosfaacutety ale len dideoxyribonukleotidtrifosfaacutety (ddATP ddCTP ddGTP ddTTP) každyacute označenyacute inou fluorescenčnou farbičkou Po integraacutecii ddNTP do DNA vlaacutekna je polymerizaacutecia ukončenaacute Jednovlaacuteknoveacute fragmenty (primery) predĺženeacute presne o jeden ddNTP suacute separovaneacute kapilaacuternou elektroforeacutezou v genetickom analyzaacutetore pričom je detegovanaacute ich fluorescencia a dĺžka (obr 11) Z vyacutesledneacuteho elektroforetogramu (obr 12) je možneacute určiť v jednej reakcii sekvenciu vo viac ako v 10 lokalitaacutech určiteacuteho fragmentu DNA SNaPshot Multiplex sa v molekulaacuterno-genetickom laboratoacuteriu využiacuteva na ryacutechlu detekciu viaceryacutech najčastejšie sa vyskytujuacutecich mutaacuteciiSNP geacutenu

Obr 10 Priacuteklad využitia metoacutedy SnaPshot s použitiacutem sady 13 primerov ktoreacute sa predĺžia len o 1 značenyacute dideoxynukleotid SNaPshot najčastejšiacutech mutaacuteciiacute geacutenu pre 21-hydroxylaacutezu (CYP21A2) ktoreacute spocircsobujuacute kongenitaacutelnu adrenaacutelnu hyperplaacuteziu A T G a C predstavujuacute fluorescenčne značeneacute dideoxynukleotidy

Obr 11 Vyacutesledok analyacutezy DNA pacienta metoacutedou minisekvenovania SnaPshot konkreacutetne použitiacutem sady 13 primerov rozlišujuacutecich najčastejšie bodoveacute mutaacutecie geacutenu pre 21-hydroxylaacutezu (CYP21A2) analyacutezou sa zistila mutaacutecia V281L v heterozygotnom stave (dva fragmenty modryacute a červenyacute)

16

Obr 12 SNaPshot analyacuteza geacutenu CYP21A2 u DNA izolovanej z plodovej vody metoacuteda deteguje najčastejšie bodoveacute mutaacutecie geacutenu pre 21-hydroxylaacutezu vyacutesledok prenataacutelnej analyacutezy = priacutetomnosť mutaacutecie In2G v hemizygotnom stave (keďže qPCR metoacutedou bola u plodu zistenaacute priacutetomnosť len jednej koacutepie geacutenu CYP21A2)

33 Kvantitatiacutevna PCR (qPCR)

Polymeraacutezovou reťazovou reakciou (PCR) docielime namnoženie (amplifikaacuteciu) určiteacuteho DNA uacuteseku (templaacutetu) PCR je katalyzovanaacute DNA polymeraacutezou za priacutetomnosti primerov dNTPs dvojmocnyacutech katioacutenov (ako Mg+2) a pufrovacieho roztoku

Real-time PCR ktoraacute je nazyacutevanaacute aj kvantitatiacutevna PCR (qPCR) umožňuje vizualizaacuteciu a kvantifikaacuteciu amplifikaacutecie DNA v reaacutelnom čase to je tak ako to bežiacute počas PCR qPCR využiacuteva fluorescenčneacute chemikaacutelie (farbivaacute) ktoryacutech emitovanuacute fluorescenciu zaznamenaacuteva optickyacute systeacutem počas každeacuteho PCR cyklu zaznamenanaacute fluorescencia je naacutesledne softveacuterovo spracovanaacute a vyhodnotenaacute

V suacutečasnosti sa využiacutevajuacute dva typy qPCR cheacutemie a to farbivaacute viažuce sa na DNA a fluorescenčne značeneacute proacuteby (obr 13)

Farbivaacute viažuce sa na DNA emitujuacute fluorescenciu v priacutepade ak suacute naviazaneacute na dvojvlaacuteknovuacute DNA proacuteby fluoreskujuacute v priacutepade keď molekula zhaacutešača (angl quencher - Q) sa nenachaacutedza v bliacutezkosti molekuly reporteacutera (R) napr hydrolyzujuacutece proacuteby fluoreskujuacute keď je molekula reporteacutera (R) prostredniacutectvom 5acuteexonukleaacutezovej aktivity DNA polymeraacutezy odstraacutenenaacute z bliacutezkosti molekuly zhaacutešača (Q)

Grafickyacute priebeh real ndash time PCR znaacutezorňuje amplifika čnaacute krivka (angl amplification plot) (obr 14) majuacuteca 4 faacutezy 1) Faacuteza I ndash dochaacutedza k zdvojnaacutesobeniu množstva amplikoacutenu po každom cykle ale naacuterast fluorescencie je pod detekčnyacutem limitom zaznamenaacutevanaacute fluorescencia (baseline) zodpovedaacute zaacutekladnej fluorescencii pozadia tzv šumu

17

2) Faacuteza II nazyacutevanaacute aj exponenciaacutelna faacuteza v ktorej sa fluorescencia zvyacuteši na uacuteroveň optickej detekcie bod resp cyklus kedy začiacutena exponenciaacutelna faacuteza je kľuacutečovyacute na určenie kvantity vstupneacuteho množstva templaacutetovej DNA nazyacuteva sa prahovyacute cyklus označuje sa Ct (angl treshold cycle) alebo Cq (quantification) Čiacutem nižšie je Ct (Cq) tyacutem vaumlčšiacute počet koacutepiiacute templaacutetovej DNA bolo v reakcii Ct hodnota je teda hlavnyacute uacutedaj s ktoryacutem sa pracuje vo vyacutepočtoch fluorescencia v tomto mieste sa nazyacuteva prahovaacute resp treshold 3) Faacuteza III - lineaacuterna faacuteza ndash charakterizuje ju postupneacute spotrebovaacutevanie komponentov reakcie na narastajuacutece množstvo amplikoacutenu 4) Faacuteza IV - plateau (čiacutetaj platoacute) ndash množstvo amplikoacutenu sa v docircsledku vyčerpania zložiek qPCR už nezvyšuje

Obr 13 Princiacutep real-time PCR Obr 14 Faacutezy real-time PCR

Ako štandardnaacute PCR aj qPCR maacute tri zaacutekladneacute kroky 1) Denaturaacutecia dvojvlaacuteknovej DNA na jednovlaacuteknovuacute DNA pri vysokej teplote (obyčajne 95degC) 2) Hybridizaacutecia primerov (annealing) ndash komplementaacuterne sekvencie sa spolu hybridizujuacute 3) Polymerizaacutecia pri 70-72degC kedy v docircsledku optimaacutelnej aktivity DNA polymeraacutezy dochaacutedza k predĺženiu primeru až o 100 baacutez za sekundu

18

Real-time PCR (obr 15) sa využiacuteva na kvantifikaacuteciu expresie geacutenov určenie počtu koacutepiiacute geacutenov určenie genotypu (genotypovanie) alelovou diskriminaacuteciou alebo analyacutezou krivky topenia tzv high resolution melt a multiplexnuacute real time PCR s možnosťou detekcie viaceryacutech cieľovgeacutenov

Multiplexnaacute real-time PCR sa využiacuteva na detekciu viaceryacutech cieľovgeacutenov v jednej reakcii suacutečasne Vyacutehodou multiplexovania je jednak uacutespora vzorky ako aj ziacuteskanie vaumlčšieho množstva informaacuteciiacute z rovnakeacuteho množstva materiaacutelu Nevyhnutnosťou multiplexnej qPCR suacute proacuteby značeneacute rocircznymi fluorescenčnyacutemi farbivami

Najdocircležitejšie zložky qPCR (real-time PCR komponenty) suacute DNA polymeraacuteza (reverznaacute transkriptaacuteza v priacutepade jednokrokovej kvantitatiacutevnej RT-PCT) dNTPs primery resp primeryproacuteby dvojmocneacute Mg templaacutet Na uľahčenie qPCR suacute v suacutečasnosti už komerčne dostupneacute takeacute reakčneacute zmesi ku ktoryacutem stačiacute pridať už len templaacutet (napr kity využiacutevajuacutece TaqManProacuteby) alebo kity s fluorescenčnyacutemi farbami viažucimi sa na dvojvlaacuteknovuacute DNA ku ktoryacutem sa do reakčnej zmesi okrem templaacutetu pridajuacute primery

Obr 15 Real-time PCR cykleacuter

331 Kvantifikaacutecia pomocou qPCR

Na kvantifikaacuteciu DNA pomocou qPCR sa požiacutevajuacute dve zaacutekladneacute metoacutedy - absoluacutetna kvantifikaacutecia a relatiacutevna kvantifikaacutecia

Absoluacutetna kvantifikaacutecia vychaacutedza zo štandardnej krivky (obr 16) ktoraacute sa ziacuteska po qPCR seacuterie riedeniacute DNA znaacutemej koncentraacutecie Kvantifikaacutecia neznaacutemej vzorky sa zistiacute interpolaacuteciou (odčiacutetaniacutem) Ct neznaacutemej vzorky zo štandardnej krivky (obr 16 17) Využiacutevaneacute napr v kriminalistike na stanovenie koncentraacutecie DNA vo vzorke

Relatiacutevna kvantifikaacutecia (obr 18 19) porovnaacuteva uacuteroveň expresie určiteacuteho geacutenu vo vzorke k expresii toho isteacuteho geacutenu v referenčnej (kontrolnej) vzorke alebo množstvo určiteacuteho geacutenu (počet koacutepiiacute) vo vzorke porovnaniacutem s množstvom geacutenu v kontrolnyacutech vzorkaacutech V raacutemci každej vzorky musiacute pred relatiacutevnou kvantifikaacuteciou docircjsť k tzv normalizaacutecii t j porovnanie expresie sledovaneacuteho geacutenu k expresii referenčneacuteho geacutenu (najčastejšie niacutem byacuteva tzv bdquohousekeepingldquo geacuten napr GAPDH aktiacuten tubuliacuten)

V priacutepade kvantifikaacutecie expresie určiteacuteho geacutenu metoacutedou real-time PCR (RT-qPCR) pred samotnou kvantifikaacuteciou cDNA musiacute byť taacuteto cDNA nasyntetizovanaacute prostredniacutectvom reverznej

19

transkripcie za použitia enzyacutemu reverznej transkriptaacutezy Kvantitatiacutevna PCR s reverznou transkripciou RT-qPCR mocircže byť dvojkrokovaacute alebo jednokrokovaacute Pri dvojkrokovej RT-qPCR treba pred qPCR syntetizovať cDNA vlaacutekno z RNA pomocou reverznej transkriptaacutezy - 1 krok druhyacutem krokom je samotnaacute real-time PCR Jednokrokovaacute RT-qPCR umožňuje uskutočniť obidve reakcie reverznuacute transkripciu a kvantitatiacutevnu PCR v jednej skuacutemavke čo zjednodušuje qPCR a redukuje možnosť kontaminaacutecie Obr 16 5-bodovaacute štandardnaacute krivka (amplifikaacutecia piatich koncentraacuteciiacute jednej vzorky konkreacutetne ide o 10-tkoveacute riedenie)

Obr 17 Ukaacutežka amplifikačnyacutech kriviek riedenia a z nich ziacuteskanej štandardnej krivky poukazuje na vysokuacute presnosť metoacutedy RT-PCR

20

Obr 18 Relatiacutevna kvantifikaacutecia - určenie počtu koacutepiiacute geacutenu CYP21A2 vo vzorke DNA izolovanej z perifeacuternej krvi pacientov mutaacutecie v geacutene CYP21A2 spocircsobujuacute kongenitaacutelnu adrenaacutelnu hyperplaacuteziu (CAH) Vyacutesledok analyacutezy všetci pacienti majuacute dve koacutepie geacutenu

Obr 19 Relatiacutevna kvantifikaacutecia - určenie počtu koacutepiiacute geacutenu CYP21A2 vo vzorke DNA izolovanej z plodovej vody mutaacutecie v geacutene CYP21A2 spocircsobujuacute kongenitaacutelnu adrenaacutelnu hyperplaacuteziu (CAH) Prenaacutetalnou diagnostikou (qPCR) sa zistila priacutetomnost jednej koacutepie CYP21A2 geacutenu 332 Určenie genotypu metoacutedou alelovej diskriminaacutecie a analyacutezou krivky topenia (HRM)

Určenie genotypu metoacutedou alelovej diskriminaacutecie (obr 20) sa uskutočňuje použitiacutem hydrolyzujuacutecich proacuteb (sond) je veľmi ryacutechla a senzitiacutevna (presnaacute) metoacuteda frekventovane využiacutevanaacute v laboratoacuteriaacutech Dva variantyalely suacute vyšetreneacute suacutečasne v jednej vzorke a v jednej reakčnej

21

skuacutemavke V reakcii suacute použiteacute dve proacuteby označeneacute rozdielnymi fluorescenčnyacutemi farbičkami emitujuacutecimi svetlo o rocircznej vlnovej dĺžke (najčastejšie jedna označenaacute FAM farbičkou a druhaacute proacuteba označenaacute VIC farbičkou) Počas amplifikaacutecie amplikoacutenu dochaacutedza k odstraacuteneniu zhaacutešača z bliacutezkosti farbičky ktoraacute potom emituje svetlo priacuteslušnej vlnovej dĺžky Vzorky so signaacutelom len jednej fluorescenčnej farbičky (FAM) a bez signaacutelu druhej farbičky (VIC) suacute homozygoti pre alelu 1 vzorky so signaacutelom len druhej farbičky (VIC) a bez signaacutelu prvej (FAM) suacute homozygoti pre alelu 2 v priacutepade ak vyšetrovanaacute vzorka bdquosvietildquo obidvoma farbami jednaacute sa o heterozygota

Obr 20 Určenie genotypu metoacutedou alelovej diskriminaacutecie ndash amplifikačnaacute krivka vzoriek DNA majuacutecich tri rocirczne genotypy A ndash jednotliveacute vzorky (plnaacute čiara predstavuje štandardnuacute alelu guličkovanaacute mutovanuacute alelu) B ndash 72 vzoriek C ndash scatter plot 72 vzoriek

Určenie genotypu analyacutezou krivky topenia tzv high resolution melt (HRM) (obr 21) umožňuje detekciu takmer všetkyacutech genetickyacutech variaacuteciiacute (SNP mutaacuteciiacute) Keďže taacuteto metoacuteda okrem štandardnyacutech podmienok reakcie vyžaduje len primery a farbičku (nie proacuteby) je veľmi jednoduchaacute a lacnejšia Po amplifikaacuteciiacute treba amplikoacuten pomaly zohrievať až kyacutem nedocircjde k denaturaacuteciiacute Teplota topenia amplikoacutenu vo vzorke zaacutevisiacute od DNA sekvencie čo umožňuje detegovať priacutetomnosť mutaacutecie resp SNP Tvar vyacuteslednyacutech kriviek topenia určuje teda genotyp

22

Obr 21 Určenie genotypu analyacutezou krivky topenia tzv metoacutedou high resolution melting (HRM) A ndash krivka topenia vzoriek DNA majuacutecich tri rocirczne genotypy B ndash graf rozdielnosti krivky topenia vzoriek DNA majuacutecich tri rocirczne genotypy

23

4 Elektroforetickaacute separaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten

Separaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten predstavuje rozdelenie molekuacutel DNA alebo RNA na zaacuteklade veľkosti zloženia a poradia baacutez Podobnyacutemi metoacutedami je možneacute separovať aj proteiacuteny

Elektroforeacuteza (ELFO) je technika použiacutevanaacute na separaacuteciu niekedy aj purifikaacuteciu makromolekuacutel ako suacute nukleoveacute kyseliny a proteiacuteny na zaacuteklade ich rozdielnej veľkosti naacuteboja alebo konformaacutecie Je to metoacuteda veľmi často využiacutevanaacute nielen v molekulovej genetike ale aj biocheacutemii Elektroforeacuteza využiacuteva schopnosť nabityacutech molekuacutel migrovať v jednosmernom elektrickom poli k opačneacutemu poacutelu Nukleoveacute kyseliny majuacute vďaka svojej fosfaacutetovej zložke negatiacutevny naacuteboj preto v jednosmernom elektrickom poli migrujuacute ku kladneacutemu poacutelu čiže k anoacutede Elektroforeacuteza prebieha v elektroforetickej aparatuacutere v geacuteloch (v nosiči) so sieťovitou štruktuacuterou ktoraacute umožňuje separaacuteciu molekuacutel Vzorka nukleovej kyseliny zmiešanaacute s tzv nanaacutešaciacutem tlmivyacutem roztokom s farbičkou sa nanesie do jamky v geacuteli ktoryacute je umiestnenyacute v elektroforetickej aparatuacutere v priacutetomnosti elektroforetickeacuteho pufra (TAE alebo TBE) (obr 22) Nanaacutešaciacute tlmivyacute roztoknanaacutešacia farbička umožňuje na zaacuteklade migraacutecie farbičky vidieť migraacuteciu vzorky v geacuteli a suacutečasne zvyacutešeniacutem hustoty vo vzorke umožniacute klesnuacuteť vzorke do jamky a tak zabraacuteniť jej vyplaveniu z geacutelu Draacuteha je časť geacutelu ktoryacutem putuje jedna vzorka od katoacutedy k anoacutede V draacutehe sa nachaacutedzajuacute oddeleneacute jednotliveacute fragmenty nukleovyacutech kyseliacuten určityacutech veľkostiacute viditeľneacute vo forme pruacutežkov (angl bands) Intenzita pruacutežku zaacutevisiacute od množstva molekuacutel danej veľkosti je ekvivalentnaacute hmotnosti Na určenie veľkosti fragmentov NK sa do jednej jamky nanesie štandard molekulovyacutech hmotnostiacute (angl ladder) ktoryacute maacute presne definovaneacute veľkosti fragmentov čo umožňuje odhadnuacuteť veľkosť aj hmotnosť neznaacutemych separovanyacutech fragmentov

Obr 22 Elektroforetickaacute separaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten v agaroacutezovom geacuteli (A) a vizualizaacutecia UV svetlom a GelRedtrade (B C)

24

Nukleoveacute kyseliny je možneacute elektroforeticky separovať 1) v geacuteloch agaroacutezovom (horizontaacutelna elektroforeacuteza) (obr 22) a polyakrylamidovom (vertikaacutelna elektroforeacuteza) 2) v špeciaacutelnych lineaacuternych polymeacuteroch kapilaacuternou elektroforeacutezou použitiacutem genetickeacuteho analyzaacutetora (obr 23)

Agaroacuteza je polysacharid ziacuteskanyacute z morskej riasy použiacuteva sa najčastejšie v koncentraacuteciiacute 05-2 čiacutem vyššia koncentraacutecia tyacutem je geacutel pevnejšiacute a schopnejšiacute rozliacutešiť menšie fragmenty NK Priacuteprava je jednoduchaacute odvaacuteži sa potrebneacute množstvo agaroacutezy ktoraacute sa zmieša s tlmivyacutem roztokom (pufrom) rozvariacute sa v mikrovlnnej ruacutere a naleje sa do špeciaacutelnej naacutedoby na vytvaacuteranie geacutelov kyacutem je geacutel tekutyacute vložiacute sa do neho tzv hrebeň na vytvorenie jamiek Agaroacuteza je netoxickaacute V bežnom agaroacutezovom geacuteli v zaacutevislosti od jeho koncentraacutecie je možneacute separovať DNA fragmenty dĺžky 200-50 000 bp Dnes suacute dostupneacute aj špeciaacutelne agaroacutezy napr MetaPhorreg Agarose schopneacute oddeliť fragment DNA dĺžky 20-800bp Separaacutecia v agaroacutezovom geacuteli prebieha v horizontaacutelnej aparatuacutere preto sa nazyacuteva aj horizontaacutelna elektroforeacuteza

Polyakrylamidovyacute geacutel (PAGE) vznikaacute polymerizaacuteciou akrylamidu v priacutetomnosti špeciaacutelnych chemickyacutech laacutetok (peroxodisiacuteran amoacutenny TEMED bisakrylamid) Jeho priacuteprava je preto odlišnaacute a aj naacuteročnejšia Polyakrylamidoveacute geacutely majuacute vysokuacute rozlišovaciu schopnosť (1bp) preto suacute PAGE geacutely vhodneacute aj na sekvenovanie DNA klasickyacutemi metoacutedami PAGE geacutel nie je vhodnyacute na separaacuteciu fragmentov dlhšiacutech ako 2kb Použiacuteva sa v koncentraacutecii 35 -20 s rozliacutešeniacutem fragmentov od 10bp-2000bp Akrylamid je neurotoxiacuten musiacute sa s niacutem pracovať veľmi opatrne PAGE elektroforeacuteza bežiacute vo vertikaacutelnej aparatuacutere preto sa volaacute aj vertikaacutelna elektroforeacuteza použiacuteva sa často aj na separaacuteciu proteiacutenov

Ryacutechlosť pohybu nukleovyacutech kyseliacuten (mobilita) určuje viacero faktorov 1) veľkosť NK ndash počet baacutezovyacutech paacuterov resp baacutez pričom menšie molekuly prechaacutedzajuacute geacutelom ryacutechlejšie pretože sa ľahšie pohybujuacute v geacuteli 2) konformaacutecia nukleovej kyseliny napr u rovnako veľkyacutech plazmidov kondenzovaneacute superšpiralizovaneacute plazmidy migrujuacute najryacutechlejšie rovnako veľkeacute lineaacuterne molekuly (toho isteacuteho plazmidu) bežia pomalšie a najpomalšie putujuacute relaxovaneacute kruhoveacute molekuly plazmidu 3) koncentraacutecia geacutelu určuje jeho rozlišovaciu schopnosť koncentrovanejšiacute geacutel je schopnyacute separovať kratšie fragmenty NK redšie geacutely suacute vhodneacute pre rozliacutešenie vaumlčšiacutech fragmentov 4) zloženie geacutelu je docircležiteacute pri analyacuteze sekundaacuternych štruktuacuter NK a proteiacutenov v nedenaturovanom stave sekundaacuterna štruktuacutera spomaľuje migraacuteciu NK a proteiacutenov Tento fakt využiacutevajuacute niektoreacute diagnostickeacute techniky (napr SSCP - Single Strand Conformation Polymorphism - polymorfismus konformaacutecie jednovlaacuteknovej DNA) umožňujuacutece detekciu zaacutemeny jedinej baacutezy ktoraacute spocircsobiacute odlišneacute vnuacutetromolekuloveacute paacuterovanie a vyacuteslednuacute konformaacuteciu molekuly Geacutely mocircžu teda byť denaturačneacute a nedenaturačneacute (natiacutevne) 5) napaumltie zdroja - čiacutem vyššie je napaumltie ktoreacute vytvaacutera elektrickeacute pole v elektroforetickej aparatuacutere tyacutem ryacutechlejšie fragmenty NK migrujuacute 6) zloženie roztokov a teploty

Elektroforetickyacute tlmivyacute roztok (pufor - elektrolyt) zabezpečuje stabilneacute elektroforetickeacute podmienky počas separaacutecie geacutel je v ňom ponorenyacute Obsahuje ioacuteny čo umožňuje vedenie elektrickeacuteho pruacutedu

Štandard molekulovyacutech hmotnostiacute (v laboratoacuteriaacutech nazyacutevanyacute ladder alebo marker) je zmes fragmentov DNA alebo RNA s presne definovanou veľkosťou ktoryacute sluacuteži na odhad veľkosti vyšetrovanyacutech fragmentov NK (obr 22) Pomocou špeciaacutelnych štandardov molekulovyacutech hmotnostiacute ktoryacutech fragmenty NK majuacute definovanuacute aj hmotnosť je možneacute odhadnuacuteť množstvo (hmotnosť - koncentraacuteciu) neznaacutemeho fragmentu

B C

25

41 Vizualizaacutecia DNA

Samotnaacute nukleovaacute kyselina je počas elektroforetickej separaacutecie neviditeľnaacute Vizualizaacuteciu NK umožňujuacute interkalačneacute činidlaacute ktoreacute suacute schopneacute naviazať sa na molekuly NK tyacutem že sa včlenia medzi susediace baacutezy Po ožiareniacute UV svetlom interkalačneacute činidlaacute naviazaneacute na NK fluoreskujuacute tak sa vizualizuje NK čiacutem intenziacutevnejšie fluoreskuje tyacutem viac NK je v geacutelipruacutežku priacutetomneacute Interkalačneacute činidlo sa buď primieša do geacutelu pri jeho priacuteprave čo umožniacute sledovať migraacuteciu fragmentov NK počas elektroforeacutezy a to po vybratiacute z ELFO aparatuacutery a po ožiareniacute UV svetlom alebo sa geacutel farbiacute po elektroforetickej separaacutecii V minulosti bol na zviditeľnenie NK najčastejšie použiacutevanyacute etidiumbromid kvocircli jeho mutageacutennym vlastnostiam sa v suacutečasnosti nahraacutedza menej mutageacutennymi a netoxickyacutemi činidlami ako suacute napr komerčne dostupneacute SYBRregSafe GelRedtrade GelGreentrade

Kapilaacuterna elektroforeacuteza NK prebieha v špeciaacutelnom priacutestroji genetickom analyzaacutetore (obr 23) ktoryacute musiacute mať zaacutekladneacute komponenty ako suacute elektroacutedy kapilaacutera zdroj vysokeacuteho napaumltia detektor prepojenie s počiacutetačom a softveacuteroveacute vybavenie priestor na vloženie vzoriek atď Genetickyacute analyzaacutetor predstavuje automatizovanyacute systeacutem umožňujuacuteci sekvenovanie určovanie dĺžky DNA fragmentov ndash fragmentačnuacute analyacutezu a kvantifikaacuteciu nukleovyacutech kyseliacuten V novšiacutech typoch genetickeacuteho analyzaacutetora je proces analyacutezy od vloženia vzoriek do stojana automatizovanyacute

Vzorka určenaacute na analyacutezu je elektrokineticky injektovanaacute do tenkej kapilaacutery naplnenej lineaacuternym polymeacuterom Vplyvom vysokeacuteho napaumltia sa negatiacutevne nabiteacute fragmenty DNA pohybujuacute v polymeacuteri k pozitiacutevne nabitej elektroacutede Kapilaacuterna elektroforeacuteza je tak citlivaacute že je schopnaacute detegovať jednobaacutezovyacute rozdiel DNA fragmentov DNA fragmenty musia byť pred kapilaacuternou elektroforeacutezou fluorescenčne označeneacute v kapilaacutere suacute separovaneacute na zaacuteklade veľkosti Kraacutetko pred dosiahnutiacutem kladne nabitej elektroacutedy docircjde po excitaacutecii laserovyacutem žiareniacutem k emisii žiarenia fluoroformi (farbičkami) tak že optickyacute detekčnyacute systeacutem zaznamenaacute fluorescenciu ktoraacute je naacutesledne softveacuterovo spracovanaacute a vyhodnotenaacute

Obr 23 Genetickyacute analyzaacutetor

42 RFLP

Metoacuteda polymorfizmu dĺžky restrik čnyacutech fragmentov (angl Restriction Fragment Length Polymorfism) bola prvou metoacutedou využiacutevanou na detekciu DNA variaacuteciiacute rocircznych biologickyacutech vzoriek Princiacutep metoacutedy spočiacuteva v priacutetomnosti polymorfizmov v DNA sekvencii rocircznych ľudiacute ktoreacute zapriacutečinia rozdielny profil (obrazec) DNA fragmentov po štiepeniacute jednou alebo viaceryacutemi restrikčnyacutemi endonukleaacutezami Restrikčneacute endonukleaacutezy (RE) suacute enzyacutemy ktoreacute štiepia DNA molekulu v oblasti špecifickej nukleotidovej sekvencie nazyacutevanej restrik čneacute miesto RE najčastejšie rozpoznaacutevajuacute a štiepia miesto veľkeacute 4-6 baacutez RE suacute priacutetomneacute u prokaryotov (bakteacuterie a archebakteacuterie) kde suacute suacutečasťou restrik čno-modifikačneacuteho systeacutemu akoby prokaryotickeacutej vrodenej imunity sluacutežia

26

na ochranu pred cudzou DNA (napr viacuterusovou) ktoruacute po rozpoznaniacute špecifickej sekvencie štiepia

Restrikčno-modifikačnyacute systeacutem maacute dve zložky 1) modifikačneacute enzyacutemy - metylaacutezy ktoreacute procesom metylaacutecie modifikujuacute určiteacute baacutezy svojej DNA čiacutem ich označia za vlastnuacute DNA takže takaacuteto DNA je potom rezistentnaacute voči štiepeniu restrikčnyacutemi endonukleaacutezami Najčastejšiacutem spocircsobom metylaacutecie u bakteacuteriiacute je metylaacutecia adeniacutenu na N6 pričom vznikne metyladeniacuten alebo cytoziacutenu na C5 metylcytoziacuten 2) restrikčneacute endonukleaacutezy štiepia špecifickeacute miesto dvojvlaacuteknovej DNA ktoreacute je tvoreneacute symetrickou sekvenciou zrkadlovo sa opakujuacutecich nukleotidov ndash tzv palindroacutem Restrikčneacute enzyacutemy sa použiacutevajuacute na štiepenie DNA sekvencie na mieste špecifickom pre tuacute ktoruacute restrikčnuacute endonukleaacutezu napr pri analyacuteze polymorfizmov dĺžky restrikčnyacutech fragmentov (RFLP) analyacuteze jednonukleotidovyacutech polymorfizmov (SNP) mutaacuteciiacute ako aj pri klonovaniacute DNA do vhodnyacutech vektorovyacutech DNA molekuacutel

Po štiepeniacute dvojvlaacuteknovej DNA restrikčnou endonukleaacutezou mocircžu vzniknuacuteť tri typy koncov - 5´-prečnievajuacutece konce (lepiveacute) 3´-prečnievajuacutece konce (lepiveacute) a tupeacute konce (obr 24)

Obr 24 Restrikčneacute štiepenie zanechaacutevajuacutece rocirczne konce tupeacute a lepiveacute

Restrikčneacute štiepenie je často použiacutevanou metoacutedou geacutenovyacutech manipulaacuteciiacute na konštrukciu

hybridnyacutech molekuacutel DNA s naacuteslednyacutem klonovaniacutem Priebeh RFLP analyacutezy je nasledovnyacute restrikčnaacute endonukleaacuteza sa pridaacute k DNA a zmes sa vo

vhodnyacutech reakčnyacutech podmienkach (pufor teplota) inkubuje niekoľko hodiacuten Počas inkubaacutecie docircjde k štiepeniu DNA na špecifickyacutech miestach DNA je potom elektroforeticky separovanaacute v geacuteli a naacutesledne vizualizovanaacute V minulosti po geacutelovej elektroforeacuteze nasledoval Southern blot (čiže prenos separovanyacutech fragmentov DNA z geacutelu na špeciaacutelnu membraacutenu) (obr 35) po ktorom nastala vizualizaacutecia raacutedioaktiacutevne značenou proacutebou V suacutečasnosti sa kvocircli praacutecnosti a zdravotnyacutem rizikaacutem od Southern blotu upuacutešťa a prechaacutedza sa na ryacutechlejšie menej praacutecne a zdravotne šetrnejšie metoacutedy priateľskejšie aj k životneacutemu prostrediu

RFLP bola prvou metoacutedou použiacutevanou na zistenie DNA profilu (DNA fingerprinting) mapovanie geacutenov zapriacutečiňujuacutece genetickeacute ochorenia a testovanie otcovstva Vaumlčšina RFLP markerov je vysoko lokusovo špecifickyacutech a kodominantnyacutech (obidve alely suacute detekovaneacute u heterozygota)

PCR-RFLP je laboratoacuterne priacutestupnejšia metoacuteda molekulaacuterno-genetickej diagnostiky keďže PCR umožňuje amplifikaacuteciu veľmi malyacutech množstiev DNA Alternatiacutevny naacutezov použiacutevanyacute v literatuacutere je CAPS z angl Cleaved Amplified Polymorphic Sequence assay Použitiacutem špecifickyacutech primerov docircjde PCR metoacutedou k amplifikaacutecii požadovaneacuteho uacuteseku DNA ten sa potom štiepi restrikčnou endonukleaacutezou vo vhodnyacutech podmienkach naacutesledne sa štiepne produkty elektroforeticky separujuacute a vizualizujuacute použitiacutem interkalačnyacutech farbiacutev a UV svetla (obr 25)

27

Obr 25 Princiacutep metoacutedy PCR-RFLP

43 VNTR a STR V geacutenome suacute priacutetomneacute dva typy tandemovyacutech (za sebou nasledujuacutecich) opakovaniacute

1) minisatelity ndash nazyacutevaneacute variabilnyacute počet tandemovyacutech opakovaniacute VNTR (variable number of tandem repeats) 2) mikrosatelity tiež kraacutetke tandemoveacute repetiacutecie STR (short tandem repeats)

Obidva tieto typy satelitnej DNA suacute rozmiestneneacute po celom genoacuteme suacute využiacutevaneacute hlavne vo forenznej genetike na identifikaacuteciu osocircb a určenie otcovstva popriacutepade materstva ale aj v mediciacutene na detekciu chromozoacutemovyacutech aneuploidiiacute Štruktuacutera obidvoch je podobnaacute Rozdiel medzi jednotlivyacutemi alelami je spocircsobenyacute rozdielnym počtom opakovaniacute opakujuacutecej sa sekvencie (motiacutevu) čo spocircsobiacute rocircznu dĺžku alel s rocircznym počtom tandemovyacutech opakovaniacute nazyacutevanuacute polymorfizmus dĺžky fragmentov

VNTR ndash variabilnyacute počet tandemovyacutech opakovaniacute pričom opakujuacuteca sa sekvencia maacute dĺžku od 6 do 100 baacutez pričom sa mocircže opakovať aj tisiacutece kraacutet alely tak mocircžu mať od 500do 30 000 baacutez VNTR boli v kombinaacutecii s RFLP (DNA fingerprinting ) prvyacutem polymorfizmom použiacutevanyacutem na zistenie DNA profilov a identifikaacuteciu osocircb v kriminalistickej praxi V suacutečasnosti jeho využitie v kriminalistike je kvocircli potrebe relatiacutevne veľkeacuteho množstva DNA nahradeneacute využitiacutem STR

STR - kraacutetke tandemoveacute repetiacutecie suacute v kriminalistike najčastejšie použiacutevanyacutem polymorfizmom STR lokusy suacute rozmiestneneacute po celom genoacuteme repetiacutecia obsahuje jednu až šesť baacutez pričom jej opakovaniacutem vznikne STR v rozsahu od 50 do 300bp V našom genoacuteme suacute tisiacutece STR ktoreacute mocircžu byť použiteacute pre forenznuacute analyacutezu V kriminalistike sa v suacutečasnosti na identifikaacuteciu osocircb použiacuteva 13 STR locusov ktoreacute patria k medzinaacuterodne uznaacutevanyacutem štandardom Z iniciatiacutevy FBI bola vytvorenaacute databaacuteza CODIS (Combined DNA Index System) každaacute krajina maacute svoju databaacutezu CODIS kde je možneacute vložiť a archivovať DNA profily jednotlivcov ako aj profily DNA ziacuteskanyacutech z miest kriminaacutelneho činu v databaacuteze je ich možneacute navzaacutejom porovnať a tak zistiť pocircvodcu trestneacuteho činu Medzinaacuterodnaacute jednotnosť v použiacutevaniacute CODIS STR lokusov umožňuje v priacutepade potreby vzaacutejomneacute porovnanie DNA profilov zistenyacutech na uacutezemiacute rocircznych štaacutetov CODIS STR lokusov je 13 a suacute to CSF1PO FGA TH01 TPOX VWA D3S1358 D5S818 D7S820 D8S1179 D13S317 D16S539 D18S51 a D21S11 Zistenie DNA profilu sa uskutočniacute multiplexnou PCR reakciou s fluorescenčne značenyacutemi primermi špecifickyacutemi pre konkreacutetny STR Naacutesledne suacute PCR produkty analyzovaneacute kapilaacuternou elektroforeacutezou genetickyacutem analyzaacutetorom ktoryacute rozliacuteši amplifikovaneacute fragmenty na zaacuteklade fluorescencie a dĺžky (fragmentačnaacute analyacuteza) (obr 26 Tab 3) DNA profil každeacuteho človeka je jedinečnyacute rovnakyacute profil mocircžu mať len jednovaječneacute dvojčataacute

28

Obr 26 Ukaacutežka DNA profilu človeka 15 STR lokusov s určeniacutem pohlavia pomocou lokusu pre amelogeniacuten (ženskeacute pohlavie - XX) maleacute oranžoveacute piacuteky predstavujuacute fragmenty veľkostneacuteho štandardu Tabuľka č 3 Zaacutepis DNA profilu človeka z obraacutezka č 26 15 STR lokusov s určeniacutem pohlavia pomocou lokusu pre amelogeniacuten System Alela 1 Alela 2

D3S1358 16 17

TH01 9 93 D21S11 28 28

D18S51 15 18

Penta E 7 14 D5S818 9 12

D13S317 8 11

D7S820 8 11 D16S539 11 12

CSF1PO 10 11

Penta D 11 12 vWA 15 18

D8S1179 13 16

TPOX 8 9 FGA 20 21

amel X X

29

5 MLPA

Multiplexnaacute amplifikaacutecia proacuteb zaacutevislaacute od ligaacutecie (z angl multiplex ligation-dependent probe amplification) je metoacuteda schopnaacute v jednej reakcii (v jednej skuacutemavke a vzorke) detegovať zmeny v počte až 50 nukleotidovyacutech sekvenciiacute Metoacutedou MLPA je možneacute ryacutechlo identifikovať amplifikaacutecie (duplikaacutecie) a deleacutecie veľkeacuteho počtu geacutenov či už použitiacutem DNA alebo mRNA krvnyacutech vzoriek alebo vzoriek z naacutedorov

Princiacutep MLPA spočiacuteva v multiplexnej amplifikaacutecii 50 špecifickyacutech nukleotidovyacutech sekvenciiacute použitiacutem jedneacuteho paacuteru primerov pričom jeden primer je fluorescenčne označenyacute Vyacutesledneacute PCR produkty suacute analyzovaneacute kapilaacuternou elektroforeacutezou (fragmentačnaacute analyacuteza) Dĺžka každeacuteho namnoženeacuteho produktu je jedinečnaacute narastaacute postupne o 6 alebo 9 nukleotidov pričom produkty PCR suacute 120 ndash 500 nukleotidov dlheacute Tento veľkostnyacute rozsah PCR fragmentov (dĺžka 120-500 nukleotidov s naacuterastom postupne o 6 alebo 9 nukleotidov) je optimaacutelny pre kapilaacuternu elektroforeacutezu MLPA multiplexnaacute PCR prebieha za použitia iba jedineacuteho paacuteru primerov ktoreacute amplifikujuacute špecifickeacute sekvencie Trik spočiacuteva v tom že nedochaacutedza k amplifikaacutecii DNA sekvencie ale MLPA proacuteb ktoreacute suacute pridaneacute k vzorkaacutem Každaacute MLPA proacuteba pozostaacuteva z dvoch oligonukleotidov (dve hemiproacuteby) pričom každyacute oligonukleotid obsahuje jednu zo sekvencie rozpoznaacutevanuacute PCR primermi Proacuteba vznikne jedine za predpokladu hybridizaacutecie dvoch oligonukleotidov (hemiproacuteb) k cieľovej sekvencii (geacutenu) a po ligaacutecii enzyacutemom ligaacutezou Iba ligovaneacute proacuteby suacute exponenciaacutelne amplifikovaneacute pomocou jedneacuteho paacuteru primerov Množstvo zligovanyacutech proacuteb teda zaacutevisiacute od množstva cieľovyacutech sekvenciiacute (geacutenov) vo vzorke

Postup MLPA analyacutezy je nasledovnyacute (obr27) K vzorke nukleovej kyseliny (DNA resp mRNA) sa pridaacute zmes 50 jedinečnyacutech proacuteb každaacute

proacuteba je komplementaacuterna k určitej cieľovej sekvencii NK vzorky Každaacute proacuteba však pozostaacuteva z dvoch oligonukleotidov hybridizujuacutecich vedľa seba zaacuteroveň každyacute oligonukleotid (hemiproacuteba) obsahuje pridanuacute sekvenciu rozpoznaacutevanuacute paacuterom PCR primerov Po hybridizaacuteciiacute oligonukleotidov (hemiproacuteb) dochaacutedza k ich ligaacutecii ligaacutezou Ligačnaacute reakcia je tak špecifickaacute že je schopnaacute rozliacutešiť sekvenciu liacutešiacu sa v jednom nukleotide Vyacuteslednyacute ligačnyacute produkt (proacuteba) obsahuje obidve sekvencie pre PCR primery na jednom fragmente čiže mocircže docircjsť k namnoženiu takeacutehoto fragmentu PCR reakciou V priacutepade ak nedocircjde k ligaacutecii priacuteslušnyacutech hemiproacuteb pretože hemiproacuteby nenaacutejdu cieľovuacute sekvenciu na DNA každaacute takaacuteto nezligovanaacute hemiproacuteba maacute len jednu sekvenciu rozpoznaacutevanuacute len jednyacutem PCR primerom v docircsledku čoho nemocircže prebehnuacuteť jej PCR amplifikaacutecia a počas fragmentačnej analyacutezy nie je detegovanaacute pretože negeneruje fluorescenčnyacute signaacutel

Pri MLPA analyacuteze je docircležiteacute okrem MLPA amplifikaacutecie vzorky urobiť aj MLPA amplifikaacuteciu referenčnej vzorky ku ktorej sa bude porovnaacutevať počet geacutenov (cieľovyacutech sekvenciiacute) Po kapilaacuternej elektroforeacuteze MLPA referenčnej a skuacutemanej vzorky porovnaniacutem obsahu nameranyacutech hodnocirct tzv piacutekov priacuteslušnyacutech proacuteb sa určiacute relatiacutevny počet koacutepiiacute v skuacutemanej vzorke

MLPA

1 DNA denaturaacutecia a hybridizaacutecia s MLPA proacutebami (hemiproacuteby)

2 Ligaacutecia (vytvorenie kompletnyacutech proacuteb)

3 PCR amplifikaacutecia proacuteb paacuterom primerov

4 Kapilaacuterna elektroforetickaacute separaacutecia PCR produktov

5 Analyacuteza daacutet

30

Obr 27 Princiacutep MLPA

Firma MRC-Holland v suacutečasnosti ponuacuteka stovky MLPA setov proacuteb ktoreacute suacute vhodneacute na 1) diagnostiku kongenitaacutelnych a dedičnyacutech ochoreniacute 2) zisťovanie profilu naacutedorov 3) zisťovanie metylačneacuteho profilu

MLPA je metoacuteda vhodnaacute na detekciu malyacutech prestavieb (BRCA1 BRCA2 MSH2 atď)

veľkyacutech chromozoacutemovyacutech prestavieb (Williamsov syndroacutem Prader-WilliAngelman syndroacutem atzď)

31

detekciu zmien v počte koacutepii geacutenov (obr 28 29) ako aj zistenie počtu kompletnyacutech chromozoacutemov (chromozoacutem 13 18 21 XY tiež aj z amniovej tekutiny) diagnostiku naacutedorov (zmeny počtu pri ALL CLL atď) kvantifikaacuteciu metylaacutecie (Prader-WilliAngelmanov syndroacutem Fragilnyacute X inaktivaacutecia naacutedorovyacutech supresorovyacutech geacutenov atď) mRNA analyacutezu geacutenov zuacutečastňujuacutecich sa apoptoacutezy alebo zaacutepalov

MS-MLPA (Methylation-Specific MLPA) je varianta MLPA určenaacute špeciaacutelne na analyacutezu aberantnyacutech metylaacutecii imprintovanyacutech oblastiacute ako aj detekciu metylačnyacutech zmien CpG ostrovčekov lokalizovanyacutech bliacutezko promoacutetora Rozdiel oproti štandardnej MLPA spočiacuteva v použitiacute metylačne senzitiacutevneho restrikčneacuteho enzyacutemu HhaI ktoryacute štiepi MS-MLPA proacuteby hybridizovaneacute k nemetylovanej sekvencii Každaacute DNA vzorka určenaacute pre MS-MLPA analyacutezu prejde dvoma reakciami v jednej mikroskuacutemavke štandardnou MLPA analyacutezou (bez štiepenia metylačne senzitiacutevnym enzyacutemom) a v druhej mikroskuacutemavke docircjde okrem ligaacutecie proacuteb aj k metylačne senzitiacutevnemu štiepeniu hybridizovanyacutech proacuteb s nemetylovanou DNA Amplifikujuacute sa len ligovaneacute proacuteby po PCR amplifikaacutecii sa fragmentačnou analyacutezou porovnaniacutem oboch reakciiacute zistia rozdiely v metylačnom profile vzorky k referenčnej vzorke

RT-MLPA (Reverse Transkriptase MLPA) je variaacutecia MLPA určenaacute pre zistenie mRNA profilu vzorky je alternatiacutevou k real-time PCR a mikročipom RT-MLPA nedeteguje mRNA množstvo priamo pretože použiacutevanaacute ligaacuteza nie je schopnaacute ligovať DNA oligonukleotidy keď suacute hybridizovaneacute s RNA Preto RT-MLPA začiacutena reverznou transkripciou so špeciaacutelne navrhnutyacutemi RT primermi tak aby vytvorili kraacutetke oligonukleotidy (cDNA) Potom reakcia pokračuje ako štandardnaacute MLPA

Obr 28 MLPA analyacuteza geacutenu DMD (koacutedujuacuteceho dystrofiacuten) mutaacutecie ktoreacuteho spocircsobujuacute Duchennovu svalovuacute dystrofiu u pacienta je priacutetomnaacute deleacutecia exoacutenu 45 v porovnaniacute s referenčnou vzorkou ndash kontrolou

32

Obr 29 MLPA analyacuteza geacutenu DMD (koacutedujuacuteceho dystrofiacuten) mutaacutecie ktoreacuteho spocircsobujuacute Duchennovu svalovuacute dystrofiu u pacienta suacute priacutetomneacute duplikaacutecie exoacutenov 41 42 43 44 45 (piacuteky vo vzorke pacienta sa porovnajuacute s piacutekmi v kontrole ndash referenčnej vzorke)

33

6 Sekvenovanie

Sekvenovaniacutem rozumieme určenie primaacuternej štruktuacutery DNA teda určenie poradia nukleotidov v reťazci DNA Začiatky moderneacuteho sekvenovania siahajuacute do roku 1977 kedy boli objaveneacute dve metoacutedy sekvenovania 1) chemickaacute metoacuteda Maxama a Gilberta 2) enzymatickaacute metoacuteda Sangera Nicklena a Coulsona

Princiacutep obidvoch metoacuted sekvenovania spočiacuteva v tom že sa vytvoriacute suacutebor DNA molekuacutel s rocircznou veľkosťou ktoreacute suacute zakončeneacute konkreacutetnym nukleotidom tieto DNA molekuly sa elektroforeticky separujuacute v geacuteloch s rozlišovacou schopnosťou 1 nukleotid 61 Chemickaacute metoacuteda

DNA molekuly sa na 5-konci raacutedioaktiacutevne označia raacutedioaktiacutevnym fosforom a naacutesledne sa chemicky modifikujuacute špecificky pre každuacute baacutezu DNA sa potom v modifikovanyacutech miestach štiepi čiacutem vzniknuacute rocirczne dlheacute fragmenty pričom podmienky suacute nastaveneacute tak aby sa DNA na každom mieste štiepila len raz Modifikaacutecia DNA a štiepenie prebehne v štyroch separaacutetnych reakciaacutech (skuacutemavkaacutech) takže po elektroforetickej separaacuteciiacute takto opracovanej DNA v štyroch draacutehach polyakrylamidoveacuteho geacutelu a naacuteslednej autoraacutediografii (podobne ako pri Southernovej hybridizaacutecii) je možneacute odčiacutetať nukleotidovuacute sekvenciu približne 100 nukleotidov od raacutedioaktiacutevneho označenia (v čase objavu Maxama a Gilberta) 62 Sangerova metoacuteda

Zaacuteklady metoacutedy boli popiacutesaneacute už v roku 1975 (metoacuteda plus a miacutenus) ale až vylepšenie použitiacutem dideoxynukleotidov (ddNTP) v roku 1977 došlo k zjednodušeniu sekvenovania Princiacutepom enzyacutemoveacuteho sekvenovania je terminaacutecia (zastavenie) polymerizaacutecie inkorporaacuteciou 2´ 3 -dideoxynukleotidov do novosyntetizujuacuteceho sa vlaacutekna DNA Keďže ddNTP neobsahujuacute hydroxylovuacute skupinu na 3 uhliacuteku riboacutezy nemocircžu sa zuacutečastniť na tvorbe fosfodiesterovej vaumlzby nemocircže sa pripojiť k nim ďalšiacute nukleotid čiže musiacute docircjsť k terminaacuteciiacute polymeraacutecie Reakcia prebieha v štyroch skuacutemavkaacutech s raacutedioaktiacutevne značenyacutem primerom V každej skuacutemavke suacute priacutetomneacute všetky štyri deoxynukleotidtrifosfaacutety (dNTP) ale pre každuacute skuacutemavku je špecifickyacute priacutedavok maleacuteho množstva jedneacuteho z dideoxynukleotidtrifosfaacutetov (v prvej skuacutemavke je ddATP v druhej ddCTP v tretej ddTTP a vo štvrtej ddGTP) Maleacute množstvo ddNTP spocircsobiacute že pri polymerizaacutecii dochaacutedza k prednostneacutemu zaradeniu štandardnyacutech dNTP do narastajuacuteceho reťazca a len občas sa inkorporuje ddNTP čiacutem sa zastaviacute synteacuteza reťazca V každej skuacutemavke tak vznikne suacutebor DNA fragmentov rocircznych veľkostiacute zakončenyacutech priacuteslušnyacutem ddNTP (v prvej skuacutemavke ddATP v druhej ddCTP v tretej ddTTP a vo štvrtej ddGTP) Po elektroforetickej separaacutecii v 4 draacutehach polyakrylamidoveacuteho geacutelu a autoraacutediografii sa z autoraacutediogramu odčiacuteta sekvencia

V suacutečasnosti je sekvenovanie do značnej miery automatizovaneacute pričom využiacuteva princiacutep Sangerovej enzyacutemovej metoacutedy s určityacutemi obmenami Uacutesek DNA ktoryacute treba sekvenovať sa prostredniacutectvom termostabilnyacutech DNA polymeraacutez namnožiacute PCR metoacutedou po ktorej nasleduje sekvenačnaacute reakcia (asymetrickaacute PCR) s fluorescenčne značenyacutemi ddNTP (každyacute druh označenyacute inyacutem fluorescenčnyacutem farbivom) Sekvenačnaacute reakcia prebieha v jednej skuacutemavke s jednyacutem primerom vznikne tak suacutebor jednovlaacuteknovyacutech DNA rocircznej dĺžky ktoreacute suacute na 3konci označeneacute ddNTP so špecifickyacutem fluorescenčnyacutem farbivom Taacuteto metoacuteda sekvenovania sa tiež nazyacuteva rdquodye-terminator cycle sequencingrdquo(obr 30) Po kapilaacuternej elektroforeacuteze vzorky v genetickom analyzaacutetore zaznamenaacutevaniacute fluorescencie jednotlivyacutech fragmentov CCD kamerou a softveacuterovom spracovaniacute sa ziacuteska sekvencia DNA (obr 31)

34

Obr 30 Princiacutep sekvenovania Sangerova dideoxy metoacuteda alebo tzv chain termination method (reťazec zastavujuacuteca metoacuteda) Obr 31 Určenie genotypu plodu a rodičov sekvenčnou analyacutezou DNA ziacuteskanej z plodovej vody (prenataacutelna diagnostika) a perifeacuternej krvi sekvenčnaacute analyacuteza geacutenu ASPA vyacutesledok u plodu priacutetomnaacute mutaacutecia c 914CgtA v homozygotnom stave (AA) rodičia heterozygoti (AC) Uvedenaacute mutaacutecia je v homozygotnom stave kauzaacutelnou priacutečinou Canavanovej choroby

Automatizovaneacute sekvenovanie prinaacuteša viacereacute vyacutehody oproti klasickej Sangerovej metoacutede vyššiu presnosť a ryacutechlosť v jednej sekvenačnej reakcii možnosť osekvenovať až 1200 nukleotidovyacute fragment maleacute množstvo templaacutetu potrebneacute na analyacutezu

35

63 Next Generation Sequencing (NGS)

NGS (sekvenovanie novej generaacutecie) maacute obrovskyacute potenciaacutel v analyacuteze genoacutemov pričom toto označenie zahŕňa viacereacute technologickeacute metoacutedy reprezentovaneacute niekoľkyacutemi firmami Princiacutepom je masiacutevne paralelneacute sekvenovanie čiacutem sa ziacuteskajuacute raacutedovo tisiacutece až milioacuteny sekvenciiacute naraz 631 Sekvenovanie druhej generaacutecie

Na začiatku sa analyzovanaacute DNA vo vaumlčšine priacutepadov fragmentuje (vznikne tak DNA

knižnica) na fragmenty sa pripoja kraacutetke sekvencie ndash adapteacutery naacutesledne sa tieto fragmenty rocircznymi priacutestupmi amplifikujuacute a určiacute sa ich sekvencia Vďaka čiastočnyacutem prekryvom je zo ziacuteskanyacutech sekvencii možneacute poskladať plynuluacute sekvenciu zodpovedajuacutecu pocircvodnej nefragmentovanej DNA

Pyrosekvenovanie je podobne ako Sangerova metoacuteda založenaacute na princiacutepe synteacutezy komplementaacuterneho vlaacutekna DNA avšak rozdiel je v tom že sa na detekciu inkorporaacutecie nukleotidu využiacuteva inyacute systeacutem tvorby luminiscenčneacuteho signaacutelu v priebehu reakcie Pyrosekvenovanie je umožneneacute vďaka aktivite 4 enzyacutemov - DNA polymeraacutezy ATP sulfurylaacutezy luciferaacutezy a apyraacutezy Reakčnaacute zmes obsahuje aj ďalšie komponenty - enzymatickeacute substraacutety adenoziacutenfosfosulfaacutet (APS) d-luciferiacuten sekvenovanyacute templaacutet a cyklicky postupne po jednom type pridaacutevaneacute nukleotidtrifosfaacutety Po zabudovaniacute nukleotidu do novovznikajuacuteceho reťazca docircjde k uvoľneniu pyrofosfaacutetu naacutesledne je využityacute ATP sulfurylaacutezou na synteacutezu ATP z APS počas ďalšej reakcie docircjde k využitiu ATP luciferaacutezou na premenu luciferiacutenu na oxyluciferiacuten čo spocircsobiacute svetelnyacute signaacutel a ten zaznamenaacute detekčnyacute systeacutem Poslednou enzymatickou reakciou je reakcia apyraacutezy ktoraacute odstraacuteni nezainkorporovaneacute nukleotidy a nevyužiteacute ATP aby sa celyacute proces mohol zopakovať s reakčnou zmesou obsahujuacutecou ďalšiacute nukleotidtrifosfaacutet (inyacute ako v predchaacutedzajuacutecej reakcii) Po každej reakcii detektor zaznamenaacuteva emisiu svetla na zaacuteklade intenzity svetla je možneacute určiť či bol vradenyacute priacuteslušnyacute nukleotidtrifosfaacutet či bol inkorporovanyacute jeden priacutepadne viac rovnakyacutech nukleotidtrifosfaacutetov

Zvyacutešenie vyacutekonu pyrosekvenovania umožnila tzv emulznaacute PCR v mikročasticiach a použitie platničky PicoTiterPlatereg toto sekvenovanie zaviedla firma Roche pod pojmom 454 pyrosekvenovanie v roku 2005 Na začiatku sa DNA fragmentuje na uacuteseky dlheacute 400-600 baacutez dvojvlaacuteknovaacute fragmentovanaacute DNA sa liguje s adapteacutermi prostredniacutectvom nich sa naviaže na mikročastice dvojvlaacuteknoveacute fragmenty sa oddelia mikročastice s naviazanyacutemi jednovlaacuteknovyacutemi fragmentami sa premiešajuacute so zmesou oleja a roztoku ktoryacute obsahuje všetky komponenty na uacutespešnuacute PCR Tyacutemto spocircsobom sa okolo každej mikročastice vytvoriacute vlastnyacute mikroreaktor v ktorom prebehne amplifikaacutecia fragmentu Po PCR reakcii sa mikročastice prenesuacute do platničky PicoTiterPlate v ktorej sa do jamky zmestiacute akuraacutet jedna mikročastica a reakčneacute komponenty pyrosekvenačnej reakcie PicoTiterPlatereg maacute 1 600 000 jamiek každaacute jamka maacute maximaacutelny objem 75 picolitra Platnička s mikročasticami sa vložiacute do sekvenačneacuteho systeacutemu ndash priacutestroja v ktorom sa celeacute pyrosekvenovanie uskutočniacute Chemiluminiscenčneacute signaacutely ktoryacutech počas sekvenovania vznikajuacute milioacuteny v priebehu hodiny suacute zachyteneacute CCD kamerou a analyzovaneacute softveacuterom

Firma Illumina predstavila inuacute technoloacutegiu PCR amplifikaacutecia a sekvenovanie sa uskutočňuje na skliacutečku (flow cell) Fragmentaacutecia DNA a pripojenie adapteacuterov prebieha za uacutečasti transpozoacutemov v procese nazvanom tagmentaacutecia Po hybridizaacutecii fragmentov DNA na skliacutečko prebehne v klastroch PCR amplifikaacutecia (tzv mostiacutekovaacute amplifikaacutecia) sekvenaacutecia prebieha za uacutečasti rozdielne fluorescenčne značenyacutech a chemicky modifikovanyacutech nukleotidov pričom každyacute nukleotid emituje fluorescenciu s inou vlnovou dĺžkou Na skliacutečku prebieha paralelne až 6 miliaacuterd sekvenaacutecii (obr 32)

Ďalšiacutemi možnosťami sekvenovania druhej generaacutecie je systeacutem SOLid (vyvinutyacute firmou Applied Biosystem dnes pod Thermo Fisher Scientific) a Ion Semiconductor Sequencing ndash polovodičoveacute ioacutenoveacute sekvenovanie (od firmy Ion Semiconductor Sequencing v suacutečasnosti Thermo Fisher Scientific)

36

Obr 32 Princiacutep sekvenovania novej generaacutecie od firmy Illumina PCR amplifikaacutecia a sekvenovanie sa uskutočňuje na skliacutečku (flow cell) paralelne prebieha až 6 miliaacuterd sekvenaacutecii

632 Sekvenovanie tretej generaacutecie

Pred sekvenovaniacutem netreba amplifikovať DNA PCR metoacutedou ale sekvencia sa ziacuteskava zachyteniacutem signaacutelu v reaacutelnom čase Medzi sekvenovanie tretej generaacutecie patriacute SMRT (Single Molecule Real-Time Sequencing) a Nanopore Sequencing

37

7 Fragmentačnaacute analyacuteza DNA

Je metoacuteda použiacutevanaacute na určenie veľkosti fragmentov DNA ziacuteskanyacutech PCR reakciou Dĺžka amplifikovanyacutech DNA fragmentov sa zistiacute ich porovnaniacutem s veľkostnyacutem štandardom (obr 33) ktoryacute je tvorenyacute DNA fragmentami znaacutemej dĺžky Veľkostnyacute štandard je pred kapilaacuternou elektroforeacutezou zmiešanyacute so vzorkou DNA fragmenty veľkostneacuteho štandardu suacute fluorescenčne označeneacute pričom použiteacute fluorescenčneacute farbivo je ineacute ako fluorescenčneacute farbivo použiteacute na označenie DNA fragmentov vo vyšetrovanej vzorke

Obr 33 Elektroforetogram veľkostneacuteho štandardu použiacutevaneacuteho na určenie veľkostiacute fragmentov analyzovanyacutech kapilaacuternou elektroforeacutezou v genetickom analyzaacutetore (GeneScantrade 500 LIZtrade dye Size Standard) dĺžka fragmentov v nukleotidoch (napr 50 nukleotidov)

Fragmentačnaacute analyacuteza pozostaacuteva z viaceryacutech krokov Prvyacutem je izolaacutecia DNA nasleduje PCR amplifikaacutecia počas ktorej sa novosyntetizovaneacute DNA fragmenty označia fluorescenčnyacutemi farbivami Vzorka s PCR produktom sa pripraviacute na kapilaacuternu elektroforeacutezu tak že sa zmieša s veľkostnyacutem štandardom (sluacuteži na určenie veľkosti fragmentov) a denaturačnou laacutetkou (formamid) nasleduje denaturaacutecia Pripraveneacute vzorky suacute injektovaneacute do priacutestroja (genetickyacute analyzaacutetor) kde v kapilaacutere naplnenej polymeacuterom v elektrickom poli migrujuacute fluorescenčne značeneacute fragmenty DNA na zaacuteklade veľkosti (kapilaacuterna elektroforeacuteza) Počas elektroforeacutezy genetickyacute analyzaacutetor zaznamenaacuteva fluorescenciu fragmentov Analyacutezou daacutet prostredniacutectvom špeciaacutelnych softveacuterov sa ziacuteskajuacute elektroforetogramy z ktoryacutech je možneacute zistiť veľkosť fragmentov ako aj typ fluorescencie (docircležiteacute ak suacute genetickeacute varianty rozliacutešiteľneacute rocircznou fluorescenciou napr SNaPshot) Fragmentačnaacute analyacuteza je suacutečasťou množstva molekulaacuterno-genetickyacutech metoacuted (pozri obr 12 26 28 29 34) ako suacute napr STR analyacuteza (Short Tandem Repeat) AFLP analyacuteza (Amplified Fragment Lenght Polymorfism) RFLPT-RFLP analyacuteza (Restriction Fragment Lenght PolymorfismTerminal Restricted Fragment Lenght Polymorfism) SSCP (Single Strand Conformation Polymorfism) VNTR (Variable Number of Tandem Repeat) analyacuteza straty heterozygotnosti (LOH loss of heterozygozity) MLPA (Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification) MSMSA (Methylation-Sensitive Mobility Shift Assay) SNP genotypovanie (SNaPshotreg) HiCEP (High-Coverage Expression Profiling)

38

Obr 34 Kvantitatiacutevna fragmentačnaacute PCR analyacuteza (QF-PCR) DNA izolovanej z plodovej vody vyacutesledok prenataacutelnej analyacutezy = priacutetomnosť troch piacutekov pre chromozoacutem 18 (u všetkyacutech fragmentov detegujuacutecich chromozoacutem 18 je pomer vyšetrovanyacutech markerov aberantnyacute 21 resp 111) čo znamenaacute trizoacutemiu chromozoacutemu 18 Edwardsov syndroacutem

39

8 Metoacutedy založeneacute na princiacutepe hybridizaacutecie

Nukleoveacute kyseliny majuacute schopnosť vytvaacuterať dvojvlaacuteknoveacute reťazce z jednovlaacuteknovyacutech molekuacutel na zaacuteklade komplementarity baacutez Komplementarita baacutez umožňuje replikaacuteciu DNA transkripciu RNA komplementarita baacutez zabezpečuje teda reprodukovateľnosť živej hmoty

Hybridizaacutecia je proces v ktorom na zaacuteklade komplementarity baacutez dochaacutedza k vytvoreniu dvojvlaacuteknovej nukleovej kyseliny z dvoch jednovlaacuteknovyacutech molekuacutel DNA alebo RNA alebo ich kombinaacuteciou DNA RNA pričom kratšia jednovlaacuteknovaacute nukleovaacute kyselina vystupuje ako sonda (proacuteba) Hybridizaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten je jeden z najpoužiacutevanejšiacutech naacutestrojov v molekulaacuternej bioloacutegii a genetike (hybridizaacutecia primerov alebo proacuteb sa využiacuteva v takmer každej metoacutede - v PCR RT-PCR qPCR RT-qPCR MLPA sekvenovaniacute fragmentačnej analyacuteze FISH DNA mikročipoch atď)

Denaturaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten je proces pri ktorom dochaacutedza k porušeniu vodiacutekovyacutech vaumlzieb medzi vlaacuteknami nukleovyacutech kyseliacuten (strata sekundaacuternej a terciaacutelnej štruktuacutery) tak že docircjde k ich uacuteplneacutemu oddeleniu vzniknuacute jednovlaacuteknoveacute reťazce Denaturaacutecia NK mocircže byť spocircsobenaacute vplyvom vysokyacutech teplocirct pH alebo chemickyacutech laacutetok (denaturačneacute činidlaacute) Renaturaacutecia je opačnyacute proces v ktorom na zaacuteklade komplementarity dochaacutedza k tvorbe dvojvlaacuteknovyacutech NK

Hybridiza čnaacute sonda (proacuteba) je jednovlaacuteknovaacute nukleovaacute kyselina určitej znaacutemej dĺžky a sekvencie (najčastejšie DNA pretože je stabilnejšia ako RNA) ktoraacute je značenaacute a sluacuteži na detekciu komplementaacuternych molekuacutel DNA alebo RNA v procese hybridizaacutecie V zaacutevislosti od podmienok hybridizaacutecie (stringencia) mocircže byť detegovanaacute sekvencia uacuteplne komplementaacuterna alebo v menej priacutesnych podmienkach mocircže mať sekvenčneacute odchyacutelky Proacuteba sluacuteži na vyhľadanie a zviditeľnenie cieľovyacutech NK Zviditeľnenie sa deje prostredniacutectvom označenia proacuteby ešte pred hybridizaacuteciou Značenie proacuteby mocircže byť raacutedioaktiacutevne a neraacutedioaktiacutevne (najčastejšie fluorescenčneacute)

Raacutedioaktiacutevne značeneacute proacuteby pomocou izotopov (32P) sa využiacutevali viac v minulosti v suacutečasnosti suacute kvocircli zdravotnyacutem rizikaacutem ohľaduplnosti k životneacutemu prostrediu ako aj kvocircli jednoduchšej manipulaacutecii použiacutevaneacute fluorescenčne značeneacute proacuteby Raacutedioaktiacutevne značeneacute sondy boli použiacutevaneacute hlavne metoacutedou Southernovej hybridizaacutecie (Southern blotting Southern blot) Citlivosť raacutedioaktiacutevne značenyacutech proacuteb je vyššia dosahuje schopnosť zachytiť 10 fg (femtogram 10-15) cieľovej DNA sekvencie 81 Southern blot

Metoacutedu objavil v roku 1975 britskyacute bioloacuteg Edwin Southern (preto Southern) Pri Southernovej hybridizaacutecii sa restrikčne štiepeneacute fragmenty DNA elektroforeticky separujuacute v geacuteli potom sa metoacutedou blottingu prenesuacute na nylonovuacute alebo nitroceluloacutezovuacute membraacutenu kde suacute naacutesledne hybridizovaneacute v roztoku obsahujuacutecom raacutedioaktiacutevne značenuacute sondu Priloženiacutem fotografickeacuteho filmu k membraacutene a vyvolaniacutem filmu autoraacutediografiou docircjde k zviditeľneniu lokaliacutet kde došlo k hybridizaacuteciiacute raacutedioaktiacutevne značenej sondy s fragmentom DNA (autoraacutediogram) Southern blot bol kľuacutečovou a prvou metoacutedou na identifikaacuteciu osocircb (DNA fingerprinting DNA pofiling) (obr 35)

Okrem Southern blotu existuje Northern blot na analyacutezu RNA (geacutenovej expresie) a Western blot na analyacutezu proteiacutenov postup je obdobnyacute ako pri Southern blote s obmenami špecifickyacutemi pre konkreacutetny blot Pri Northern blote sa použiacutevajuacute hybridizačneacute proacuteby ale pre vizualizaacuteciu proteiacutenov western blotom je potrebneacute použiť protilaacutetky s naacuteslednou vizualizaacuteciou Pomenovanie techniacutek je hra so sloviacutečkami (keďže paacuten Northern ani Western neobjavili takto nazvaneacute techniky)

Neraacutedioaktiacutevne značenie proacuteb použiacutevanyacutech v molekulaacuternej genetike mocircže byť nepriame (použitie haptenu) alebo priame Konečnaacute vizualizaacutecia je najčastejšie zabezpečenaacute fluoreskujuacutecimi farebnyacutemi značkami farbivami fluorochroacutemami (fluorofoacuterami) Pri priamom značeniacute je farbička kovalentne naviazanaacute na nukleotid a na zachytenie fluorescencie suacute potrebneacute špeciaacutelne priacutestroje umožňujuacutece excitaacuteciu farbičky ktoraacute potom emituje žiarenie určitej vlnovej dĺžky (emisneacute žiarenie) a to zachytiacute detekčnyacute systeacutem priacutestroja Využitie fluorochroacutemov v molekulaacuternej genetike je masiacutevne napr na vizualizaacuteciu NK elektroforeticky separovanyacutech v geacuteli kvantifikaacuteciu produktov PCR reakcie v priacutestroji real-time PCR cykleacuter sekvenovaniacute fragmentačnej analyacuteze FISH DNA mikročipoch atď

40

Obr 35 Princiacutep Southern blotu

82 FISH (fluorescenčnaacute in situ hybridizaacutecia)

FISH (fluorescent in situ hybridization fluorescenčnaacute in situ hybridizaacutecia) metoacuteda patriacute medzi molekulovo-cytogenetickeacute techniky Princiacutep FISH metoacutedy je založenyacute na hybridizaacuteciiacute fluorescenčne značenyacutech proacuteb ku komplementaacuternym uacutesekom vyšetrovanej DNA na podložnom skle (priamo na mieste - in situ) K denaturaacutecii dsDNA dochaacutedza buď vplyvom denaturačnyacutech činidiel alebo zvyacutešenou teplotou a naacuteslednou renaturaacuteciou dochaacutedza k naviazaniu sondy na komplementaacuterny uacutesek DNA Vyacutesledok hybridizaacutecie sa vizualizuje fluorescenčnyacutem mikroskopom vybavenyacutem vhodnyacutemi fluorescenčnyacutemi filtrami a vizuaacutelne zhodnotiacute skuacutesenyacutem odborniacutekom Fluorescencia sa v niektoryacutech priacutepadoch mocircže zaznamenať a hodnotiť aj pomocou softveacuteru (obr 36)

Pomocou FISH detegujeme numerickeacute aberaacutecie - zmeny v počte chromozoacutemov (napr trizoacutemia monozoacutemia chromozoacutemov) alebo štruktuacuterne aberaacutecie a prestavby (napr translokaacutecie inverzie deleacutecie duplikaacutecie amplifikaacutecie) FISH metoacuteda umožňuje identifikaacuteciu a detekciu každeacuteho ľudskeacuteho chromozoacutemu jeho zaradenie do karyotypu odhalenie malyacutech submikroskopickyacutech chromozoacutemovyacutech zmien a tiež mapovať poziacutecie jednotlivyacutech geacutenov na chromozoacuteme

41

Obr 36 Princiacutep štandardnej FISH a FISH maľovania celeacuteho chromozoacutemu

Veľkou vyacutehodou FISH metoacutedy je možnosť analyacutezy buniek v metafaacuteze aj v interfaacuteze kedy nie je nutnaacute kultivaacutecia buniek a tiež ryacutechle analyzovanie veľkeacuteho počtu buniek (stovky až tisiacutece) K ďalšiacutem vyacutehodaacutem patriacute bezpečnosť vysokaacute citlivosť dostatočnaacute stabilita relatiacutevne kraacutetky čas hybridizaacutecie a možnosť ryacutechleho vyhodnotenia Hybridizaacutecia pri vaumlčšine suacutečasne dodaacutevanyacutech sond trvaacute 10-12 hodin (na trhu suacute už dostupneacute aj sondy so skraacutetenyacutem časom hybridizaacutecie na 2-3 hodiny) Po hybridizaacuteciiacute nasleduje odmyacutevanie kedy pri priacuteslušnej teplote dochaacutedza k odmytiu nenaviazanyacutech a nespraacutevne hybridizovanyacutech sond Preparaacutet sa naacutesledne podfarbiacute a vyacutesledok sa zhodnotiacute vo fluorescenčnom mikroskope Na podfarbenie chromozoacutemov alebo jadier sa použiacuteva modreacute kontrastneacute farbivo DAPI (46-diamidino-2-fenylindol) ktoreacute maacute silneacute fluorescenčneacute vlastnosti dokaacuteže prechaacutedzať jadrovou membraacutenou a viazať sa na DNA Vyacutesledkom je modreacute zafarbenie ktoreacute vyacuteborne kontrastuje so signaacutelmi jednotlivyacutech sond

Limitujuacutecim faktorom FISH je možnosť identifikaacutecie len tyacutech uacutesekov DNA ku ktoryacutem suacute použiteacute sondy V jednej analyacuteze je možneacute použiť najviac 3 odlišne značeneacute sondy a tak zistiť priacutepadneacute abnormality len na 1 alebo na paacuter lokusoch Na relevantnuacute detekciu je potrebneacute mať vo vzorke 1-5 aberantnyacutech interfaacutezovyacutech jadier

FISH je možneacute uskutočniť na širokej škaacutele biologickeacuteho materiaacutelu na vzorkaacutech perifeacuternej krvi kostnej drene naacuteteroch choriovyacutech klkoch plodovej vode rocircznych druhov tkaniacutev natiacutevnych alebo zaliatych v parafiacutene na 1 bunke (predimplantačnaacute genetickaacute diagnostika PGD) (obr 37)

Využiacuteva sa na detekciu aberaacuteciiacute pri mnohyacutech onkologickyacutech ochoreniach (napr pri diagnoacuteze mnohopočetnyacute myeloacutem sa v suacutečasnosti po separaacutecii CD138+ buniek robiacute FISH s 5 sondami pre geacuteny IGH TP53 RB1 oblasť 1p321q21 a stanovuje sa hyperploidia chromozoacutemov 5 9 a 15) a tiež k spresneniu doplneniu a k overeniu bežneacuteho cytogenetickeacuteho vyšetrenia

Podľa miesta na chromozoacuteme na ktorom dochaacutedza k hybridizaacutecii sondy rozlišujeme 4 typy

DNA sond bull centromeacuteroveacute sondy ndash sa viažu na strednuacute časť chromozoacutemu ndash centromeacuteru sluacutežia k diagnostike zmien v počte chromozoacutemov k detekcii chromozoacutemov neznaacutemeho pocircvodu umožňujuacute interfaacuteznu FISH na nedeliacich sa bunkaacutech (obr 38-41)

42

Obr 37 Interfaacutezna FISH preimplantačnyacute genetickyacute skriacutening aneuploidiiacute ndash blastomeacutera 3-denneacuteho ľudskeacuteho embrya s normaacutelnym počtom chromozoacutemov 13 18 21 pohlavie XY použityacutech 5 sond pre chromozoacutemy 13 ndash orange 18 ndash aqua 21 ndash green X ndash blue a Y ndash yellow (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

Obr 38 Interfaacutezne jadro po hybridizaacutecii s centromeacuterovou sondou pre chromozoacutem 8 (Vysis Abbott) V pravom jadre je priacutetomnaacute trizoacutemia chromozoacutemu 8 (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex) Obr 39 Metafaacutezna (A) a interfaacutezna FISH (B) použitaacute centromeacuterovaacute sonda CEPX spectrum orangeCEPY spectrum green (Vysis Abbott) Sonda hybridizuje k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (červenyacute signaacutel) a Y (zelenyacute signaacutel) (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

43

Obr 40 Interfaacutezna FISH vyšetrenie spermiiacute použiteacute sondy CEPX greenCEPY orange (Aneuscore Metasystems) Sondy hybridizujuacute k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (zelenyacute signaacutel) Y (červenyacute signaacutel) vľavo ndash dve haploidneacute spermie (majuacutece jedna spermia X druhaacute Y chromozoacutem) vpravo ndash dve patologickeacute spermie obsahujuacutece gonozoacutemovyacute komplement XY (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

Obr 41 Interfaacutezna FISH vyšetrenie spermiiacute použiteacute sondy CEPX greenCEPY orange a CEP18 aqua (Aneuscore Metasystems) Sondy hybridizujuacute k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (zelenyacute signaacutel) Y (červenyacute signaacutel) a 18 (modryacute signaacutel) vľavo ndash normaacutelne haploidneacute ľudskeacute spermie - 1x chromozoacutem X alebo Y a jedenkraacutet chromozoacutem 18 v strede ndash patologickaacute spermia obsahujuacuteca gonozoacutemovyacute komplement XY a jeden chromozoacutem 18 vpravo ndash patologickaacute diploidnaacute spermia s chromozoacutemami X Y a dvoma chromozoacutemami 18 (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

bull lokusovo špecifickeacute sondy ndash hybridizaacutecia prebehne na konkreacutetnom mieste geacutenu (lokuse) (obr 42-44) použiacutevajuacute sa k vyšetreniu mikrodeleacuteciiacute (straty malyacutech častiacute chromozoacutemu pri mikrodelečnyacutech syndroacutemoch) k zisteniu amplifikaacutecie onkogeacutenov a niektoryacutech špecifickyacutech translokaacuteciiacute prestavby geacutenov umožňujuacute interfaacuteznu FISH na nedeliacich sa bunkaacutech bull subtelomeroveacute ndash vaumlzba na koncoveacute časti chromozoacutemu ndash telomeacutery bull celochromozoacutemoveacute alebo celomaľovacie sondy ndash sondy hybridizujuacute s mnohopočetnyacutemi chromozoacutemovyacutemi sekvenciami pričom sa fluorescenčne tak bdquovymaľujeldquo celyacute chromozoacutem (Obr 45) Použiacutevajuacute sa na vyšetrenie chromozoacutemovyacutech prestavieb k analyacuteze translokaacuteciiacute a k detekcii pocircvodu tzv marker chromozoacutemov (malyacutech nadpočetnyacutech chromozoacutemov neznaacutemeho pocircvodu) K použitiu sondy suacute potrebneacute metafaacutezne chromozoacutemy nepoužiacutevaju sa pre interfaacuteznu FISH

Pri konvenčnej chromozoacutemovej FISH suacute homogeacutenne DNA proacuteby hybridizovaneacute s fixovanyacutem metafaacuteznym alebo prometafaacuteznym chromozoacutemomchromozoacutemami na skliacutečku (Obr 36a) Maximaacutelna rozlišovacia schopnosť metafaacuteznej FISH je niekoľko megabaacutez (Obr 39a 45) využitiacutem viac

44

natiahnutyacutech prometafaacuteznych chromozoacutemov sa dosiahne 1 Mb rozliacutešenie Prostredniacutectvom fiber FISH konkreacutetne artificiaacutelne deproteinizovanej natiahnutej DNA pripravenej in situ z celyacutech buniek na mikroskopickom skliacutečku je možneacute vizualizovať individuaacutelne geacuteny maleacute DNA elementy na chromozoacuteme s rozliacutešeniacutem okolo 1000 bp

Obr 42 Interfaacutezne jadro po hybridizaacutecii s lokusovo-špecifickou sondou LSI 5q31 Spectrum Orange5p12 Spectrum Green (Vysis Abbott) Na ľavom obraacutezku suacute priacutetomneacute dva červeneacute (5q31) a dva zeleneacute signaacutely (5p12) v pravom jadre je priacutetomnaacute deleacutecia 5q31 oblasti chyacuteba jeden červenyacute signal (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

Obr 43 Interfaacutezna FISH použitaacute lokusovo-špecifickaacute sonda ndash translokačnaacute - XL BCRABL1 plus (Metasystems) dvojfarebnaacute dvojfuacutezna kde červenaacute označuje lokus ABL1 na chromozoacuteme 9 a zelenaacute oblasť BCR na chromozoacuteme 22 Sonda deteguje fuacuteziu protoonkogeacutenu ABL1 (9q34) a geacutenu BCR (22q11) v priacutepade že červenyacute a zelenyacute signaacutel suacute pri sebe (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

45

Obr 44 Interfaacutezna FISH Použitaacute lokusovo-špecifickaacute sonda- typ break apart pre IGH geacuten V docircsledku translokaacutecie došlo k rozskočeniu geacutenu pričom translokačneacuteho partnera nepoznaacuteme vieme určiť len percento v koľkyacutech jadraacutech je geacuten prestavanyacute (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex) Obr 45 Použiteacute celochromozoacutemoveacute sondy WCP 15 (červenyacute chromozoacutem) a WCP 17 (zelenyacute chromozoacutem) Na metafaacuteze je potvrdenaacute reciprokaacute translokaacutecia t(1517)(q2221) (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

FISH vizualizaacutecia celeacuteho chromozoacutemu maľovanie chromozoacutemu anglicky chromosome

painting je špeciaacutelnou aplikaacuteciou chromozoacutemovej FISH proacuteba je koktail veľkeacuteho počtu rocircznych fluorescenčne značenyacutech DNA fragmentov hybridizujuacutecich pozdĺž celeacuteho konkreacutetneho chromozoacutemu (obr 36b 45) bdquoChromosomepaintingldquo analyzuje metafaacutezne chromozoacutemy V minulosti bola FISH vizualizaacutecia celyacutech chromozoacutemov limitovanaacute malyacutem množstvom rocirczne sfarbenyacutech fluorochroacutemov

V suacutečasnosti je možneacute detegovať množstvo cieľovyacutech sekvenciiacute naraz čo sa využiacuteva pri celogenoacutemovej chromozoacutemovej vizualizaacutecii (whole-chromosomepainting - WCP) metoacutedou multiplex FISH (M-FISH multicolor FISH o br 46) alebo spektraacutelnej karyotypizaacutecie (SKY) kedy možno rozliacutešiť všetky ľudskeacute chromozoacutemy ndash teda 24 rocircznych chromozoacutemov M-FISH a SKY patria medzi metafaacutezne formy FISH diagnostiky ktoreacute umožňujuacute simultaacutennu vizualizaacuteciu všetkyacutech ľudskyacutech chromozoacutemov v rocircznych farbaacutech čo predstavuje uľahčenie analyacutezy karyotypu hlavne pri komplexnyacutech zmenaacutech a markeroch neznaacutemeho pocircvodu Obe techniky vychaacutedzajuacute z použitia

46

celochromozoacutemovyacutech sond značenyacutech kombinaacuteciou viaceryacutech fluorochroacutemov Rozdiel medzi M-FISH a SKY spočiacuteva v technike ziacuteskania konečneacuteho obrazu

Obr 46 Multicolor FISH - každyacute chromozoacutemovyacute paacuter je zafarbenyacute inou farbou pričom na ich zafarbenie postačuje kombinaacutecia 5 fluorochroacutemov Na vyhodnocovanie je potrebnaacute špeciaacutelna sada fluorescenčnyacutech filtrov pre jednotliveacute fluorochroacutemy a špeciaacutelnyacute softweacuter Vľavo-štandardnyacute karyotyp vpravo karyotyp s mutaacuteciami (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

V molekulovej cytogenetike suacute komerčne dostupneacute sety M-FISH proacuteb umožňujuacutece

viacfarebneacute pruacutežkovanie chromozoacutemov (banding) s vysokyacutem rozliacutešeniacutem (multicolor-banding mBAND FISH MCB) čo umožňuje identifikaacuteciu intrachromozoacutemovyacutech prestavieb (Obr 47) Nevyhnutnosťou mBAND-u je mať chromozoacutemy v metafaacuteze Taacuteto metoacuteda bola prvyacutekraacutet uskutočnenaacute na chromozoacuteme 5 v roku 1999 mBAND FISH umožňuje rozliacutešiť špecifickeacute oblasti chromozoacutemov na uacuterovni pruacutežku - bandu a sub-bandu s detekciou 550 bandov haploidneacuteho karyotypu

Obr 47 A - mBAND chromozoacutemu 11 - inverzia duplikovanej oblasti 11q223-q25 B - mBAND chromozoacutemu 3 - na kruhovom chromozoacuteme deleacutecia oblasti 3p263 C - mBAND chromozoacutemu 2 - potvrdenie inverzie duplikovanej časti chromozoacutemu (poskytnuteacute RNDr Dagmar Landlovou Medirex)

FISH metoacuteda a jej varianty (M-FISH mBAND SKY) majuacute v suacutečasnosti širokeacute využitie v

klinickej genetike v onkologickej genetike na detekciu aberaacuteciiacute v čase diagnoacutezy počas liečby po

47

liečbe monitorovanie po transplantaacutecii kostnej drene v prenataacutelnej a postnataacutelnej diagnostike pri detekcii submikroskopickyacutech deleacuteciiacute (napr DiGeorge syndroacutem - 22q112 delečnyacute syndroacutem PraderndashWilli syndroacutem- chromozoacutem 15q11-13) prostredniacutectvom FISH je možnaacute detekcia numerickyacutech zmien chromozoacutemov (trizoacutemia chromozoacutemu 21 pri Downovom syndroacuteme trizoacutemia chromozoacutemu 15 pri Patauovom syndroacuteme trizoacutemia chromozoacutemu 18 pri Edwardsovom syndroacuteme) rocirczne zmeny v počte pohlavnyacutech chromozoacutemov (monozoacutemia X pri Turnerovom syndroacuteme Klinefelterov syndroacutem s X chromozoacutemom naviac - XXY) podobne v predimplantačnej diagnostike

83 DNA Microarray (DNA mikro čip biočip) DNA mikročipovanie je technika využiacutevajuacuteca hybridizaacuteciu skuacutemanej nukleovej kyseliny

(cieľovaacute vzorka) s veľkyacutem množstvom oligonukleotidovyacutech proacuteb (desať tisiacutec až milioacuten) ktoreacute suacute prichyteneacute na pevnyacute podklad najčastejšie sklenyacute silikoacutenovyacute alebo nylonovyacute (doštička čip) Skuacutemanaacute nukleovaacute kyselina je pred hybridizaacuteciou fragmentovanaacute označenaacute fluorofoacuterom a denaturovanaacute Po kontakte čipu s cieľovou vzorkou ktoraacute je vlastne zmes označenyacutech oligonukleotidov značeneacute oligonukleotidy hybridizujuacute s oligonukleotidovyacutemi sekvenciami prichytenyacutemi na čipe Potom suacute na zaacuteklade fluorescencie detekovaneacute miesta kde došlo k hybridizaacutecii čiže vzorka obsahovala takuacuteto nukleotidovuacute sekvenciu Z jedneacuteho mikročipu sa ziacuteska obrovskeacute množstvo daacutet ktoreacute je vždy nutneacute softveacuterovo spracovať V dnešnej dobe existuje niekoľko firiem poskytujuacutecich komerčne mikročipy na objednaacutevku alebo si ich laboratoacuteria produkujuacute sami

Mikročipovanie prebieha nasledovne

1) Vytvorenie DNA čipu ndash tisiacutece rocircznych jednovlaacuteknovyacutech DNA oligonukleotidov znaacutemych sekvencii sa kovalentne naviažu na povrch doštičky vždy v určitej lokalite je niekoľko rovnakyacutech oligonukleotidov veľkosť takejto lokality je ˂ 200 microm Proacutebami mocircže byť DNA cDNA alebo syntetizovaneacute oligonukleotidy Už hotoveacute mikročipy ponuacutekajuacute viacereacute firmy (Affymetrix Agilent Technologies Eppendorf Illumina) alebo si ich jednotliveacute laboratoacuteria vyraacutebajuacute sami pomocou robotickyacutech zariadeniacute DNA čip sa vytvaacutera buď nanaacutešaniacutem kvapiek oligonukleotidov na podklad alebo synteacutezou oligonukleotidov in situ na čipe 2) Priacuteprava vzorky ndash nukleovaacute kyselina (mRNA DNA) sa purifikuje určiacute sa jej kvantita a kvalita (spektrofotometericky) fragmentuje resp v priacutepade mRNA sa syntetizuje cDNA v priacutepade potreby sa mocircže DNA amplifikovať PCR reakciou štiepiť restrikčnyacutemi endonukleaacutezami 3) Fluorescenčneacute označenie (zriedkavejšie raacutedioaktiacutevne) fragmentov DNA prebieha počas reverznej transkripcie alebo PCR amplifikaacutecie za uacutečasti fluorescenčne značenyacutech nukleotidov Keď sa analyzujuacute dve rocirczne vzorky napr zdraveacute tkanivo a naacutedoroveacute tkanivo označenie nukleovyacutech kyseliacuten v tyacutechto tkanivaacutech byacuteva rozdielne a to použitiacutem dvoch rocircznych fluorescenčnyacutech farbiacutev (napr zeleneacute a červeneacute) Pred hybridizaacuteciou je potrebneacute vzorku denaturovať čiacutem sa vytvoriacute zmes jednovlaacuteknovyacutech DNA označenyacutech značkou 4) Hybridizaacutecia s mikročipom ndash v špeciaacutelnom hybridizačnom roztoku hybridizujuacute komplementaacuterne sekvencie zo vzorky s priacuteslušnyacutemi oligonukleotidovyacutemi sondami naviazanyacutemi na čipe Potom sa čip obmyje aby došlo k odstraacuteneniu čiastočne hybridizovanyacutech nukleovyacutech kyseliacuten 5) Skenovanie mikročipu ndash skenerom čipov docircjde k ožiareniu čipu laserom pričom v mieste hybridizaacutecie fluorescenčne značenyacutech DNA fragmentov s proacutebou docircjde k emisii svetla určitej vlnovej dĺžky ktoruacute skener zaznamenaacute 6) Analyacuteza daacutet prebieha metoacutedami bioinformatiky spracovaniacutem softveacutermi sa zistiacute ktoreacute lokality čipu navzaacutejom hybridizovali v priacutepade použitia dvoch vzoriek kontrolnej a skuacutemanej je možneacute analyzovať ich relatiacutevnu intenzitu hybridizaacutecie (expresie určiteacuteho geacutenu)

Existujuacute štyri typy mikročipov 1) Čipy ur čeneacute na analyacutezu expresie (obsahujuacute cDNA proacuteby) pre tzv dvojkanaacutelovyacute experiment kedy je vzorka určenaacute k hybridizaacutecii na čipe ziacuteskanaacute zmiešaniacutem DNA fragmentov kontrolnej a skuacutemanej vzorky pričom fragmenty suacute rozdielne fluorescenčne označeneacute (napr zelenyacute fluorofoacuter pre kontrolnuacute vzorku a červenyacute pre skuacutemanuacute) Na zaacuteklade intenzity a typu fluorescencie sa deteguje expresia geacutenov typickaacute pre kontrolnuacute vzorku (napr zelenaacute fluorescencia) pre skuacutemanuacute vzorku (napr

48

červenaacute fluorescencia) a expresia podobnaacute u oboch vzoriek (žltaacute fluorescencia) neexprimovaneacute geacuteny (čierna fluorescencia) rocirczne odtiene (v zaacutevislosti od prevažujuacutecej hybridizaacutecie) (obr 48) 2) Čipy ur čeneacute na analyacutezu mutaacutecii použije sa genoacutemovaacute DNA označenaacute jednou fluorescenčnou farbičkou na určenie jednonukleotidovej zmeny (SNP ndash Single Nukleotide Polymorphism) 3) Čipy na komparatiacutevnu genoacutemovuacute hybridizaacuteciu (aCGH array Comparative Genomic Hybridization) ndash použiacutevaneacute na zistenie zvyacutešenia alebo zniacuteženia množstva chromozoacutemovyacutech fragmentov obsahujuacutecich geacuteny zodpovedneacute za určiteacute ochorenie Na analyacutezu sa použije skuacutemanaacute gDNA a referenčnaacute (kontrolnaacute) DNA každaacute sa značiacute inou fluorescenčnou farbičkou (princiacutep ako pri analyacuteze expresie) (obr 49 50) 4) Čipy CGH - SNP kombinovaneacute čipy ur čeneacute na analyacutezu aj mutaacuteciiacute SNP aj na komparatiacutevnu genoacutemovuacute hybridizaacuteciu CGH

Mikročipy majuacute rozsiahle využitie napriacuteklad v identifikaacuteciiacute novyacutech geacutenov vo vyacuteskume ich funkciiacute expresie v rocircznych podmienkach pri diagnostike mnohyacutech ochoreniacute vo farmakogenomike vo vyacuteskume vplyvu toxiacutenov

Obr 48 Heatmapa geacutenovej expresie vybranyacutech geacutenov (mRNA) mikročip obsahuje 46000 cDNA proacuteb (poskytnuteacute Ing Helenou Gbelcovou PhD Uacutestav lekaacuterskej bioloacutegie genetiky a klinickej genetiky LF UK a UNB)

49

Obr 49 Princiacutep komparatiacutevnej genoacutemovej hybridizaacutecie (aCGH - array comparative genomic hybridization) Obr 50 A) Vyacutesledok komparatiacutevnej genoacutemovej hybridizaacutecie (aCGH - array comparative genomic hybridization) vzorky DNA izolovanej plodovej vody U plodu s abnormaacutelnym ultrasonografickyacutem vyšetreniacutem bola identifikovanaacute duplikaacutecia oblasti 3q261q29 (modryacute paacutes) a deleacutecia oblasti 5p1533p151 (červenyacute paacutes) Pre porovnanie chromozoacutem 1 bez aberaacutecie b) Ten istyacute pacient ale ineacute softveacuteroveacute spracovanie (poskytnuteacute RNDr Miroslavom Tomkom PhD Medirex)

50

Odporuacutečanaacute a použitaacute literatuacutera

Odborneacute knihy Klug W S Cummings M R Spencer Ch A Palladino M A Concepts of Genetics jedenaacuteste vydanie (2015) Carson S Molecular Biology Techniques tretie vydanie (2012) Strachan T Read A Human Molecular Genetics štvrteacute vydanie (2011) Sudbery P Sudbery I Human Molecular Genetics tretie vydanie (2009)

Internetoveacute straacutenky

wwwncbinlmnihgov wwwmlpacom wwwthermofishercom wwwilluminacom wwwpromegask wwwqiagencom wwwambioncom

Odborneacute člaacutenky Chacon-Cortes D Griffiths L R Methods for extracting genomic DNA from whole blood samples current perspectives Journal of Biorepository Science for Applied Medicine Volume 2 strany 1- 9 Viltrop T Krjutskov K Palta P Metspalu A Comparison of DNA extraction methods for multiplex polymerase chain reaction Anal Biochem 2010 Volume 398(2) strany 260-262 Ing Martin Čermaacutek Molekulaacuterna cytogenetika v problematike familiaacuternych maligniacutet Onkoloacutegia Volume 2 strany 77 - 83 Livak KJ Schmittgen TD Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method Methods 2001 Volume 25(4) strany 402 - 408 Bustin S A Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays J Mol Endocrinol 2000 Volume 25(2) strany169 - 193

MOLEKULAacuteRNE METOacuteDY AKTUAacuteLNE POUŽIacuteVANEacute V KLINICKEJ GENETIKE RNDr Andrea Pastoraacutekovaacute PhD RNDr Robert Petrovič PhD Vydala Univerzita Komenskeacuteho v Bratislave Lekaacuterska fakulta Rozsah 50 straacuten 246 AH prveacute vydanie ISBN 978-80-223-4231-5

9

koncentraacuteciu a vzorky neznaacutemej koncentraacutecie sa urobiacute odhad resp sa vyacutesledok kalkuluje počiacutetačovyacutem softveacuterom denzitometricky (obr 4)

222 Využitie kvantifikaacutecie množstva nukleovyacutech kyseliacuten použitiacutem real-time PCR metoacutedy

V priacutepade veľmi maleacuteho množstva NK ktoreacute nie je možneacute kvantifikovať ani geacutelovou elektroforeacutezou resp potrebujeme zistiť koncentraacuteciu NK veľmi presne u maleacuteho množstva NK (napr pre kriminalistiku) použije sa metoacuteda absoluacutetnej kvantifikaacutecie prostredniacutectvom real-time PCR (kvantifika čnej PCR qPCR) Princiacutep metoacutedy spočiacuteva v porovnaniacute amplifikaacutecie určiteacuteho uacuteseku nukleovej kyseliny vo vzorke neznaacutemej koncentraacutecii s amplifikaacuteciou tej istej sekvencie vo vzorke presne definovanej koncentraacutecie (obr 5) qPCR je možneacute kvantifikovať koncentraacuteciu raacutedovo v pgul 223 Kvantifikaacutecia fluorospektrofotometrom (fluori metrom)

Ak maacuteme dostatočneacute množstvo vzorky je možneacute na kvantifikaacuteciu použiť fluorospektrofotometer v tomto priacutepade je vzorka zmiešanaacute s fluorescenčnyacutem farbivom a je meranaacute emitovanaacute fluorescencia z ktorej sa vypočiacuteta koncentraacutecia

Moderneacute spektrofotometre a fluorimetre suacute konštruovaneacute tak aby na meranie bolo použiteacute minimaacutelne množstvo vzorky NK (napr pre priacutestroje NanoDrop je potrebnyacute len 05-1 microl vzorky) Pre porovnanie NanoDrop spektrofotometer (NanoDrop 2000c) je schopnyacute zmerať koncentraacutecie od 04 to 15 000 ngmicroL dsDNA NanoDrop fluorospektrometer 005 do 2000 pgmicroL Spektrofotometre a fluorofotometre suacute po meraniacute schopneacute vďaka softveacuteroveacutemu vybaveniu vypočiacutetať nielen koncentraacuteciu ale aj čistotu vzorky (httpwwwnanodropcom) Obr 4 Kvantifikaacutecia nukleovej kyseliny porovnaniacutem s fragmentom podobnej dĺžky a znaacutemej koncentraacutecie (po migraacutecii v agaroacutezovom geacuteli v jednosmernom elektrickom pruacutede a naacuteslednej fluorescenčnej detekcii) - odhad DNA v 3 draacutehe cca 100ng porovnaniacutem s 1000bp fragmentom štandardu molekulovyacutech hmotnostiacute (šmh)

10

Obr 5 Absoluacutetna kvantifikaacutecia DNA priacutestrojom real-time PCR cykleacuterom porovnaniacutem amplifikaacutecie uacuteseku DNA v skuacutemanej vzorke s amplifikaacuteciou vzorky so znaacutemou kvantitou Okrem amplifikaacutecie skuacutemanej vzorky je treba urobiť štandardnuacute krivku amplifikaacutecie vzorky znaacutemej koncentraacutecie z ktorej sa koncentraacutecia skuacutemanej vzorky odčiacuteta V kriminalistike sa bežne použiacuteva pridanie vnuacutetornej kontroly ku vzorke na určenie čistoty vzorky (v priacutetomnosti inhibiacutetorov nedocircjde k amplifikaacutecii žiadnej DNA) Vnuacutetornaacute kontrola je už priacutetomnaacute v kite čiže sa automaticky pridaacuteva pri priacuteprave vzoriek na qPCR amplifikaacuteciu sluacuteži na zistenie priacutetomnosti inhibiacutetorov v skuacutemanej vzorke teda v priacutepade že nedocircjde k amplifikaacutecii vo vzorke sluacuteži na rozliacutešenie či je koncentraacutecia DNA priacuteliš niacutezka alebo suacute vo vzorke priacutetomneacute inhibiacutetory Bežnaacute mediciacutenska molekulaacuterno-genetickaacute diagnostika nevyžaduje priacutetomnosť vnuacutetornej kontroly keďže nukleoveacute kyseliny suacute prevažne izolovaneacute kitmi z krvi čiže je zabezpečenaacute vysokaacute kvalita a čistota naizolovanej NK Obr 6 Spektrofotometer (NanoPhotometer) a ukaacutežka vyacutesledkou merania koncentraacutecie RNA izolovanej minikolonovou metoacutedou

11

3 PCR (polymeraacutezovaacute reťazovaacute reakcia)

Je metoacuteda vyvinutaacute v roku 1983 Karym Mullisom ocenenaacute v roku 1993 Nobelovou cenou za cheacutemiu Polymeraacutezovaacute reťazovaacute reakcia je založenaacute na schopnosti DNA polymeraacutezy syntetizovať noveacute vlaacutekno DNA podľa templaacutetoveacuteho vlaacutekna na zaacuteklade princiacutepu komplementarity DNA polymeraacuteza je schopnaacute pripaacutejať nukleotidy len k voľnej 3acuteOH skupine preto potrebuje primer (čiacutetaj prajmer) ku ktoreacutemu je schopnaacute pridaacutevať nukleotidy Primery suacute kraacutetke jednovlaacuteknoveacute oligonukleotidy ktoreacute umožňujuacute jednak DNA polymeraacuteze začať so synteacutezou noveacuteho vlaacutekna na druhej strane ohraničujuacute špecifickuacute oblasť ktoruacute chceme amplifikovať (namnožiť) Vyacutesledkom PCR reakcie je obrovskyacute počet koacutepii špecifickej sekvencie (obr 7) PCR v podstate napodobňuje replikaacuteciu DNA v in vitro podmienkach s rozdielom že nedochaacutedza k replikaacutecii celej DNA ale len vybraneacuteho primermi ohraničeneacuteho miesta

31 Najdocircležitejšie PCR komponenty

Templaacutetovaacute DNA je vzorka DNA obsahujuacuteca cieľovuacute sekvenciu Na začiatku reakcie docircjde pri vysokej teplote k denaturaacutecii a separaacutecii jednotlivyacutech vlaacutekien dvojvlaacuteknovej DNA

Enzyacutem DNA polymeraacuteza syntetizuje noveacute DNA vlaacutekno komplementaacuterne k cieľovej sekvencii Najčastejšie použiacutevanou a prvou DNA polymeraacutezou je Taq DNA polymeraacuteza (z termofilnej bakteacuterie Thermus aquaticus) zatiaľ čo Pfu DNA polymeraacuteza (z Pyrococcus furiosus) je preferovanaacute kvocircli tzv vysokej fidelite čo je schopnosť inkorporovať spraacutevnu baacutezu do novosyntetizovaneacuteho vlaacutekna DNA DNA polymeraacutezy musia mať dve vlastnosti schopnosť syntetizovať noveacute vlaacutekno DNA podľa templaacutetovej DNA a byť termostabilneacute čiže rezistentneacute na vysokeacute teploty (cca 100degC) V suacutečasnosti sa v laboratoacuteriaacutech často použiacutevajuacute rekombinantneacute polymeraacutezy s požadovanyacutemi vlastnosťami Napriacuteklad pre PCR ktorej produkt bude klonovanyacute je docircležiteacute použiť polymeraacutezu ktoraacute je schopnaacute opraviť vlastnuacute chybu v priacutepade inkorporaacutecie nespraacutevnej baacutezy pri synteacuteze noveacuteho reťazca Schopnosť opravovať nespraacutevne inkorporovaneacute baacutezy počas synteacutezy noveacuteho vlaacutekna DNA sa nazyacuteva tzv proofreading aktivita ktoraacute je zabezpečenaacute 3rarr5acute exonukleaacutezovou aktivitou takejto polymeraacutezy Pred vlastnou molekulaacuterno-genetickou diagnostikou je treba optimalizovať podmienky PCR reakcie pre konkreacutetnu DNA polymeraacutezu a pre špecifickeacute primery treba zistiť optimaacutelnu teplotu annealingu (hybridizaacutecie) primerov koncentraacutecie jednotlivyacutech zložiek PCR reakcie (napr MgCl2)

Primery suacute kraacutetke jednovlaacuteknoveacute DNA sekvencie komplementaacuterne k cieľovej sekvencii DNA polymeraacuteza začiacutena syntetizovať noveacute vlaacutekno z 3acutekonca primeru Docircležitou charakteristikou primerov je teplota topenia (Tm) t j teplota pri ktorej polovica DNA duplexov je disociovanaacute na jednovlaacuteknoveacute molekuly

Nukleotidy (dNTP deoxyribonukleotidtrifosfaacutety) suacute stavebneacute prvky pre novosyntetizovanuacute DNA molekulu

Veľmi praktickyacutem riešeniacutem pre molekulaacuterno-genetickeacute diagnostickeacute laboratoacuteria je tzv mastermix to je roztok v ktorom už je priacutetomneacute všetko potrebneacute pre priebeh PCR reakcie samozrejme okrem primerov a templaacutetovej DNA sekvencie PCR Master Mix (2X) od firmy ThermoFisher Scientific je jednyacutem z takyacutechto mixov obsahuje Taq DNA polymeraacutezu tlmivyacute roztok (pufor) MgCl2 a všetky deoxyribonukleotidy trifosfaacutety

Tabuľka č 1 uvaacutedza ako sa PCR reakcia z mastermixu pripravuje pre jednu vzorku Keďže v laboratoacuteriu sa zriedka robiacute PCR reakcia s jednou vzorkou treba si pripraviť tzv premix (tj PCR reakcie pre vaumlčšiacute počet vzoriek ale bez templaacutetovej DNA) ktoryacute sa rozdeliacute do mikroskuacutemaviek a až potom sa k nim pridaacute DNA resp cDNA

12

Tab 1 Priacuteprava PCR premixu

Celkovyacute objem jednej PCR reakcie 10 microl Počet vzoriek 8 2x PCR master mix 5 40

primer sense (10microM) 05 4

primer antisense (10microM) 05 4

H2O 35 28

DNA cDNA 05

rozpipetovať premix po 95microl do mikroskuacutemaviek až potom pridať do každej mikroskuacutemavky zvlaacutešť DNA cDNA

spolu objem 10 76

PCR amplif ikaacutecia je cyklickyacute proces pozostaacutevajuacuteci z troch krokov (obr 7) 1) denaturaacutecia dvojvlaacuteknovej DNA pri vysokej teplote (95degC) 2) hybridizaacutecia (annealing) primerov k špecifickej sekvencii DNA pri teplote vhodnej pre konkreacutetne primery 3) polymerizaacutecia (synteacuteza) novyacutech vlaacutekien DNA (72degC)

Obr 7 Princiacutep PCR

Tieto tri kroky sa opakujuacute 25 ndash 40 kraacutet pričom pri každom cykle sa počet molekuacutel zdvojnaacutesobiacute (vyacuteslednyacute počet cieľovej sekvencie je 2n+1 ak na začiatku bola jedna dvojvlaacuteknovaacute DNA a počet cyklov je n) PCR prebieha v termaacutelnom cykleacuteri (teplotnom cyklovači) je to priacutestroj (obr 8) kde je možneacute vykonať a naprogramovať celyacute termaacutelny priebeh PCR reakcie Tabuľka č 2 je priacutekladom termaacutelneho programu pre konkreacutetnu PCR reakciu

Po PCR reakcii je vyacuteslednyacute produkt možneacute vizualizovať elektroforeticky resp použiť na ďalšiu analyacutezu

13

Tab 2 Priacuteklad klasickeacuteho teplotneacuteho a časoveacuteho profilu PCR PCR Teplota Čas Opakovanie

95degC 2 minuacutety

95degC 15 sekuacutend

66degC 60 sekuacutend 30x

72degC 60 sekuacutend

72degC 5 minuacutet

Obr 8 Termaacutelny cykleacuter v procese a otvorenyacute s mikroskuacutemavkami

32 Variaacutecie PCR

Hot-start PCR využiacuteva DNA polymeraacutezu ktoruacute je treba aktivovať vysokou teplotou (napr 95degC 10 minuacutet) Vyacutehodou použiacutevania hot-start polymeraacutez je možnosť pracovať pri laboratoacuternej teplote keďže polymeraacuteza je pri bežnej teplote neaktiacutevna a tyacutem nemocircže docircjsť k vzniku nešpecifickyacutech produktov

Touchdown PCR maacute v počiatočnyacutech cykloch vyššiu teplotu annealingu (uacutečelom je zvyacutešiť

špecificitu PCR produktov na začiatku PCR) neskocircr sa teplota annealingu zniacuteži čo maacute za naacutesledok vyššiacute vyacuteťažok PCR produktu

Nested PCR maacute dva kroky a potrebuje dva paacutery primerov V prvom kroku sa prostredniacutectvom

prvej sady primerov amplifikuje dlhšiacute DNA fragment Ten sa použije ako templaacutet v druhom kroku s druhou sadou primerov s vyacuteslednyacutem kratšiacutem DNA produktom Nested PCR zvyšuje špecifickosť a citlivosť diagnostickyacutech PCR

Multiplex PCR je vlastne viac PCR reakciiacute prebiehajuacutecich v jednej skuacutemavke suacutečasne

V reakčnej zmesi je viac paacuterov primerov suacutečasne prebehne amplifikaacutecia viaceryacutech uacutesekov DNA takto dochaacutedza k šetreniu vzorky reakčnej zmesi a pracovneacuteho času

14

Real-time PCR je venovanaacute špeciaacutelna časť v skriptaacutech Sluacuteži na kvantifikaacuteciu PCR produktu v reaacutelnom čase na zaacuteklade merania fluorescencie okrem kvantifikaacutecie je využiacutevanaacute aj na určenie genotypov

RT-PCR je variaacutecia PCR umožňujuacuteca amplifikaacuteciu DNA sekvencie z vyacutechodiskovej RNA

sekvencie Najskocircr musiacute prebehnuacuteť prepis RNA do jednovlaacuteknovej cDNA prostredniacutectvom reverznej transkriptaacutezy naacutesledne sa cDNA použije pre PCR Selektiacutevnym použitiacutem primerov pri reverznej transkripcii mocircžeme uacutečelovo prepiacutesať buď celkovuacute RNA (primery - random hexameacutery) alebo len mRNA (primery - oligoT)

Alelovo-špecifickaacute PCR (AS-PCR) (obr 9) sluacuteži na detekciu konkreacutetnych mutaacuteciiacute

a jednonukleotidovyacutech polymorfizmov (SNP) Použije sa sada 3 primerov v dvoch kombinaacuteciaacutech PCR reakciiacute dva primery majuacute odlišnuacute sekvenciu na 3acute-koncoch jeden na detekciu wt (wild type) a druhyacute primer na detekciu mutantnej alely reakcia neprebehne ak miesto na templaacutetovej DNA nie je komplementaacuterne k 3acute-koncu primeru pretože DNA polymeraacuteza vyžaduje uacuteplnuacute hybridizaacuteciu primera na 3acute-konci Takto je možneacute rozliacutešiť priacutetomnosť štandardnej (wildtype ndash wt) a mutantnej alely resp SNP (obr 9) AS-PCR je znaacutema aj pod ďalšiacutemi naacutezvami ASO-PCR (allele-specific oligonucleotide PCR) ARMS (amplification-refractory mutation system)

Obr 9 Alelovo-špecifickaacute PCR (AS-PCR)

Mutageneacuteza prostredniacutectvom PCR (site directed mutagenesis) sa použiacuteva keď je potrebneacute vytvoriť mutaacuteciu v špecifickom mieste geacutenu primerprimery majuacute modifikovanuacute sekvenciu tak že obsahujuacute mutaacuteciu v strednej časti čo neovplyvniacute hybridizaacuteciu primerov s templaacutetovou DNA pričom vyacutesledkom je PCR produkt s cielene mutovanou DNA sekvenciou

Asymetrickaacute PCR sa použiacuteva na synteacutezu koacutepiiacute jedneacuteho vlaacutekna z templaacutetovej DNA a to

použitiacutem veľmi niacutezkej koncentraacutecie jedneacuteho primeru Sekvenačnaacute PCR je PCR v ktorej je použityacute len jeden primer a v reakčnej zmesi suacute okrem

všetkyacutech dNTP priacutetomneacute dideoxynukleotidtrifosfaacutety (ddNTP) značeneacute raacutedioaktiacutevne dnes však prevažne fluorescenčne každyacute typ ddNTP inou fluorescenčnou farbičkou Zaradenie niektoreacuteho zo štyroch ddNTP spocircsobiacute terminaacuteciu (zastavenie) predlžovania DNA reťazca fluorescenčneacute označenie ddNTP umožniacute detekciu dĺžky fragmentu a určenie sekvencie posledneacuteho nukleotidu Vyacuteslednyacute produkt sekvenačnej PCR sluacuteži na sekvenovanie Sekvenovaniu sa venuje samostatnaacute časť

MLPA (multiplex ligation-dependent probe amplification) ndash multiplexnaacute amplifikaacutecia proacuteb zaacutevislaacute od ligaacutecie je variaacutecia multiplexnej PCR umožňujuacuteca namnoženie viaceryacutech uacutesekov DNA za použitia iba jedneacuteho paacuteru primerov avšak s podmienkou vytvorenia sekvenčne špecifickej proacuteby ligaacuteciou sekvenčne špecifickyacutech oligonukleotidov MLPA je metoacuteda umožňujuacuteca detekciu počtu koacutepiiacute

15

až 50 nukleotidovyacutech sekvenciiacute v jednej reakcii Pomocou MLPA je možneacute ryacutechlo identifikovať amplifikaacutecie a deleacutecie veľkeacuteho počtu geacutenov či už z DNA alebo mRNA okrem toho MLPA mocircže byť použitaacute na analyacutezu CpG-metylaacutecie (MS-MLPA) Viac informaacutecii v samostatnej časti

SNaPshotreg Multiplex nazyacutevaneacute aj minisekvenovanie je multiplexnaacute reakcia v ktorej je každyacute primer predĺženyacute iba o jeden nukleotid (obr 10) V reakčnej zmesi nie suacute priacutetomneacute deoxyribonukleotidtrifosfaacutety ale len dideoxyribonukleotidtrifosfaacutety (ddATP ddCTP ddGTP ddTTP) každyacute označenyacute inou fluorescenčnou farbičkou Po integraacutecii ddNTP do DNA vlaacutekna je polymerizaacutecia ukončenaacute Jednovlaacuteknoveacute fragmenty (primery) predĺženeacute presne o jeden ddNTP suacute separovaneacute kapilaacuternou elektroforeacutezou v genetickom analyzaacutetore pričom je detegovanaacute ich fluorescencia a dĺžka (obr 11) Z vyacutesledneacuteho elektroforetogramu (obr 12) je možneacute určiť v jednej reakcii sekvenciu vo viac ako v 10 lokalitaacutech určiteacuteho fragmentu DNA SNaPshot Multiplex sa v molekulaacuterno-genetickom laboratoacuteriu využiacuteva na ryacutechlu detekciu viaceryacutech najčastejšie sa vyskytujuacutecich mutaacuteciiSNP geacutenu

Obr 10 Priacuteklad využitia metoacutedy SnaPshot s použitiacutem sady 13 primerov ktoreacute sa predĺžia len o 1 značenyacute dideoxynukleotid SNaPshot najčastejšiacutech mutaacuteciiacute geacutenu pre 21-hydroxylaacutezu (CYP21A2) ktoreacute spocircsobujuacute kongenitaacutelnu adrenaacutelnu hyperplaacuteziu A T G a C predstavujuacute fluorescenčne značeneacute dideoxynukleotidy

Obr 11 Vyacutesledok analyacutezy DNA pacienta metoacutedou minisekvenovania SnaPshot konkreacutetne použitiacutem sady 13 primerov rozlišujuacutecich najčastejšie bodoveacute mutaacutecie geacutenu pre 21-hydroxylaacutezu (CYP21A2) analyacutezou sa zistila mutaacutecia V281L v heterozygotnom stave (dva fragmenty modryacute a červenyacute)

16

Obr 12 SNaPshot analyacuteza geacutenu CYP21A2 u DNA izolovanej z plodovej vody metoacuteda deteguje najčastejšie bodoveacute mutaacutecie geacutenu pre 21-hydroxylaacutezu vyacutesledok prenataacutelnej analyacutezy = priacutetomnosť mutaacutecie In2G v hemizygotnom stave (keďže qPCR metoacutedou bola u plodu zistenaacute priacutetomnosť len jednej koacutepie geacutenu CYP21A2)

33 Kvantitatiacutevna PCR (qPCR)

Polymeraacutezovou reťazovou reakciou (PCR) docielime namnoženie (amplifikaacuteciu) určiteacuteho DNA uacuteseku (templaacutetu) PCR je katalyzovanaacute DNA polymeraacutezou za priacutetomnosti primerov dNTPs dvojmocnyacutech katioacutenov (ako Mg+2) a pufrovacieho roztoku

Real-time PCR ktoraacute je nazyacutevanaacute aj kvantitatiacutevna PCR (qPCR) umožňuje vizualizaacuteciu a kvantifikaacuteciu amplifikaacutecie DNA v reaacutelnom čase to je tak ako to bežiacute počas PCR qPCR využiacuteva fluorescenčneacute chemikaacutelie (farbivaacute) ktoryacutech emitovanuacute fluorescenciu zaznamenaacuteva optickyacute systeacutem počas každeacuteho PCR cyklu zaznamenanaacute fluorescencia je naacutesledne softveacuterovo spracovanaacute a vyhodnotenaacute

V suacutečasnosti sa využiacutevajuacute dva typy qPCR cheacutemie a to farbivaacute viažuce sa na DNA a fluorescenčne značeneacute proacuteby (obr 13)

Farbivaacute viažuce sa na DNA emitujuacute fluorescenciu v priacutepade ak suacute naviazaneacute na dvojvlaacuteknovuacute DNA proacuteby fluoreskujuacute v priacutepade keď molekula zhaacutešača (angl quencher - Q) sa nenachaacutedza v bliacutezkosti molekuly reporteacutera (R) napr hydrolyzujuacutece proacuteby fluoreskujuacute keď je molekula reporteacutera (R) prostredniacutectvom 5acuteexonukleaacutezovej aktivity DNA polymeraacutezy odstraacutenenaacute z bliacutezkosti molekuly zhaacutešača (Q)

Grafickyacute priebeh real ndash time PCR znaacutezorňuje amplifika čnaacute krivka (angl amplification plot) (obr 14) majuacuteca 4 faacutezy 1) Faacuteza I ndash dochaacutedza k zdvojnaacutesobeniu množstva amplikoacutenu po každom cykle ale naacuterast fluorescencie je pod detekčnyacutem limitom zaznamenaacutevanaacute fluorescencia (baseline) zodpovedaacute zaacutekladnej fluorescencii pozadia tzv šumu

17

2) Faacuteza II nazyacutevanaacute aj exponenciaacutelna faacuteza v ktorej sa fluorescencia zvyacuteši na uacuteroveň optickej detekcie bod resp cyklus kedy začiacutena exponenciaacutelna faacuteza je kľuacutečovyacute na určenie kvantity vstupneacuteho množstva templaacutetovej DNA nazyacuteva sa prahovyacute cyklus označuje sa Ct (angl treshold cycle) alebo Cq (quantification) Čiacutem nižšie je Ct (Cq) tyacutem vaumlčšiacute počet koacutepiiacute templaacutetovej DNA bolo v reakcii Ct hodnota je teda hlavnyacute uacutedaj s ktoryacutem sa pracuje vo vyacutepočtoch fluorescencia v tomto mieste sa nazyacuteva prahovaacute resp treshold 3) Faacuteza III - lineaacuterna faacuteza ndash charakterizuje ju postupneacute spotrebovaacutevanie komponentov reakcie na narastajuacutece množstvo amplikoacutenu 4) Faacuteza IV - plateau (čiacutetaj platoacute) ndash množstvo amplikoacutenu sa v docircsledku vyčerpania zložiek qPCR už nezvyšuje

Obr 13 Princiacutep real-time PCR Obr 14 Faacutezy real-time PCR

Ako štandardnaacute PCR aj qPCR maacute tri zaacutekladneacute kroky 1) Denaturaacutecia dvojvlaacuteknovej DNA na jednovlaacuteknovuacute DNA pri vysokej teplote (obyčajne 95degC) 2) Hybridizaacutecia primerov (annealing) ndash komplementaacuterne sekvencie sa spolu hybridizujuacute 3) Polymerizaacutecia pri 70-72degC kedy v docircsledku optimaacutelnej aktivity DNA polymeraacutezy dochaacutedza k predĺženiu primeru až o 100 baacutez za sekundu

18

Real-time PCR (obr 15) sa využiacuteva na kvantifikaacuteciu expresie geacutenov určenie počtu koacutepiiacute geacutenov určenie genotypu (genotypovanie) alelovou diskriminaacuteciou alebo analyacutezou krivky topenia tzv high resolution melt a multiplexnuacute real time PCR s možnosťou detekcie viaceryacutech cieľovgeacutenov

Multiplexnaacute real-time PCR sa využiacuteva na detekciu viaceryacutech cieľovgeacutenov v jednej reakcii suacutečasne Vyacutehodou multiplexovania je jednak uacutespora vzorky ako aj ziacuteskanie vaumlčšieho množstva informaacuteciiacute z rovnakeacuteho množstva materiaacutelu Nevyhnutnosťou multiplexnej qPCR suacute proacuteby značeneacute rocircznymi fluorescenčnyacutemi farbivami

Najdocircležitejšie zložky qPCR (real-time PCR komponenty) suacute DNA polymeraacuteza (reverznaacute transkriptaacuteza v priacutepade jednokrokovej kvantitatiacutevnej RT-PCT) dNTPs primery resp primeryproacuteby dvojmocneacute Mg templaacutet Na uľahčenie qPCR suacute v suacutečasnosti už komerčne dostupneacute takeacute reakčneacute zmesi ku ktoryacutem stačiacute pridať už len templaacutet (napr kity využiacutevajuacutece TaqManProacuteby) alebo kity s fluorescenčnyacutemi farbami viažucimi sa na dvojvlaacuteknovuacute DNA ku ktoryacutem sa do reakčnej zmesi okrem templaacutetu pridajuacute primery

Obr 15 Real-time PCR cykleacuter

331 Kvantifikaacutecia pomocou qPCR

Na kvantifikaacuteciu DNA pomocou qPCR sa požiacutevajuacute dve zaacutekladneacute metoacutedy - absoluacutetna kvantifikaacutecia a relatiacutevna kvantifikaacutecia

Absoluacutetna kvantifikaacutecia vychaacutedza zo štandardnej krivky (obr 16) ktoraacute sa ziacuteska po qPCR seacuterie riedeniacute DNA znaacutemej koncentraacutecie Kvantifikaacutecia neznaacutemej vzorky sa zistiacute interpolaacuteciou (odčiacutetaniacutem) Ct neznaacutemej vzorky zo štandardnej krivky (obr 16 17) Využiacutevaneacute napr v kriminalistike na stanovenie koncentraacutecie DNA vo vzorke

Relatiacutevna kvantifikaacutecia (obr 18 19) porovnaacuteva uacuteroveň expresie určiteacuteho geacutenu vo vzorke k expresii toho isteacuteho geacutenu v referenčnej (kontrolnej) vzorke alebo množstvo určiteacuteho geacutenu (počet koacutepiiacute) vo vzorke porovnaniacutem s množstvom geacutenu v kontrolnyacutech vzorkaacutech V raacutemci každej vzorky musiacute pred relatiacutevnou kvantifikaacuteciou docircjsť k tzv normalizaacutecii t j porovnanie expresie sledovaneacuteho geacutenu k expresii referenčneacuteho geacutenu (najčastejšie niacutem byacuteva tzv bdquohousekeepingldquo geacuten napr GAPDH aktiacuten tubuliacuten)

V priacutepade kvantifikaacutecie expresie určiteacuteho geacutenu metoacutedou real-time PCR (RT-qPCR) pred samotnou kvantifikaacuteciou cDNA musiacute byť taacuteto cDNA nasyntetizovanaacute prostredniacutectvom reverznej

19

transkripcie za použitia enzyacutemu reverznej transkriptaacutezy Kvantitatiacutevna PCR s reverznou transkripciou RT-qPCR mocircže byť dvojkrokovaacute alebo jednokrokovaacute Pri dvojkrokovej RT-qPCR treba pred qPCR syntetizovať cDNA vlaacutekno z RNA pomocou reverznej transkriptaacutezy - 1 krok druhyacutem krokom je samotnaacute real-time PCR Jednokrokovaacute RT-qPCR umožňuje uskutočniť obidve reakcie reverznuacute transkripciu a kvantitatiacutevnu PCR v jednej skuacutemavke čo zjednodušuje qPCR a redukuje možnosť kontaminaacutecie Obr 16 5-bodovaacute štandardnaacute krivka (amplifikaacutecia piatich koncentraacuteciiacute jednej vzorky konkreacutetne ide o 10-tkoveacute riedenie)

Obr 17 Ukaacutežka amplifikačnyacutech kriviek riedenia a z nich ziacuteskanej štandardnej krivky poukazuje na vysokuacute presnosť metoacutedy RT-PCR

20

Obr 18 Relatiacutevna kvantifikaacutecia - určenie počtu koacutepiiacute geacutenu CYP21A2 vo vzorke DNA izolovanej z perifeacuternej krvi pacientov mutaacutecie v geacutene CYP21A2 spocircsobujuacute kongenitaacutelnu adrenaacutelnu hyperplaacuteziu (CAH) Vyacutesledok analyacutezy všetci pacienti majuacute dve koacutepie geacutenu

Obr 19 Relatiacutevna kvantifikaacutecia - určenie počtu koacutepiiacute geacutenu CYP21A2 vo vzorke DNA izolovanej z plodovej vody mutaacutecie v geacutene CYP21A2 spocircsobujuacute kongenitaacutelnu adrenaacutelnu hyperplaacuteziu (CAH) Prenaacutetalnou diagnostikou (qPCR) sa zistila priacutetomnost jednej koacutepie CYP21A2 geacutenu 332 Určenie genotypu metoacutedou alelovej diskriminaacutecie a analyacutezou krivky topenia (HRM)

Určenie genotypu metoacutedou alelovej diskriminaacutecie (obr 20) sa uskutočňuje použitiacutem hydrolyzujuacutecich proacuteb (sond) je veľmi ryacutechla a senzitiacutevna (presnaacute) metoacuteda frekventovane využiacutevanaacute v laboratoacuteriaacutech Dva variantyalely suacute vyšetreneacute suacutečasne v jednej vzorke a v jednej reakčnej

21

skuacutemavke V reakcii suacute použiteacute dve proacuteby označeneacute rozdielnymi fluorescenčnyacutemi farbičkami emitujuacutecimi svetlo o rocircznej vlnovej dĺžke (najčastejšie jedna označenaacute FAM farbičkou a druhaacute proacuteba označenaacute VIC farbičkou) Počas amplifikaacutecie amplikoacutenu dochaacutedza k odstraacuteneniu zhaacutešača z bliacutezkosti farbičky ktoraacute potom emituje svetlo priacuteslušnej vlnovej dĺžky Vzorky so signaacutelom len jednej fluorescenčnej farbičky (FAM) a bez signaacutelu druhej farbičky (VIC) suacute homozygoti pre alelu 1 vzorky so signaacutelom len druhej farbičky (VIC) a bez signaacutelu prvej (FAM) suacute homozygoti pre alelu 2 v priacutepade ak vyšetrovanaacute vzorka bdquosvietildquo obidvoma farbami jednaacute sa o heterozygota

Obr 20 Určenie genotypu metoacutedou alelovej diskriminaacutecie ndash amplifikačnaacute krivka vzoriek DNA majuacutecich tri rocirczne genotypy A ndash jednotliveacute vzorky (plnaacute čiara predstavuje štandardnuacute alelu guličkovanaacute mutovanuacute alelu) B ndash 72 vzoriek C ndash scatter plot 72 vzoriek

Určenie genotypu analyacutezou krivky topenia tzv high resolution melt (HRM) (obr 21) umožňuje detekciu takmer všetkyacutech genetickyacutech variaacuteciiacute (SNP mutaacuteciiacute) Keďže taacuteto metoacuteda okrem štandardnyacutech podmienok reakcie vyžaduje len primery a farbičku (nie proacuteby) je veľmi jednoduchaacute a lacnejšia Po amplifikaacuteciiacute treba amplikoacuten pomaly zohrievať až kyacutem nedocircjde k denaturaacuteciiacute Teplota topenia amplikoacutenu vo vzorke zaacutevisiacute od DNA sekvencie čo umožňuje detegovať priacutetomnosť mutaacutecie resp SNP Tvar vyacuteslednyacutech kriviek topenia určuje teda genotyp

22

Obr 21 Určenie genotypu analyacutezou krivky topenia tzv metoacutedou high resolution melting (HRM) A ndash krivka topenia vzoriek DNA majuacutecich tri rocirczne genotypy B ndash graf rozdielnosti krivky topenia vzoriek DNA majuacutecich tri rocirczne genotypy

23

4 Elektroforetickaacute separaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten

Separaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten predstavuje rozdelenie molekuacutel DNA alebo RNA na zaacuteklade veľkosti zloženia a poradia baacutez Podobnyacutemi metoacutedami je možneacute separovať aj proteiacuteny

Elektroforeacuteza (ELFO) je technika použiacutevanaacute na separaacuteciu niekedy aj purifikaacuteciu makromolekuacutel ako suacute nukleoveacute kyseliny a proteiacuteny na zaacuteklade ich rozdielnej veľkosti naacuteboja alebo konformaacutecie Je to metoacuteda veľmi často využiacutevanaacute nielen v molekulovej genetike ale aj biocheacutemii Elektroforeacuteza využiacuteva schopnosť nabityacutech molekuacutel migrovať v jednosmernom elektrickom poli k opačneacutemu poacutelu Nukleoveacute kyseliny majuacute vďaka svojej fosfaacutetovej zložke negatiacutevny naacuteboj preto v jednosmernom elektrickom poli migrujuacute ku kladneacutemu poacutelu čiže k anoacutede Elektroforeacuteza prebieha v elektroforetickej aparatuacutere v geacuteloch (v nosiči) so sieťovitou štruktuacuterou ktoraacute umožňuje separaacuteciu molekuacutel Vzorka nukleovej kyseliny zmiešanaacute s tzv nanaacutešaciacutem tlmivyacutem roztokom s farbičkou sa nanesie do jamky v geacuteli ktoryacute je umiestnenyacute v elektroforetickej aparatuacutere v priacutetomnosti elektroforetickeacuteho pufra (TAE alebo TBE) (obr 22) Nanaacutešaciacute tlmivyacute roztoknanaacutešacia farbička umožňuje na zaacuteklade migraacutecie farbičky vidieť migraacuteciu vzorky v geacuteli a suacutečasne zvyacutešeniacutem hustoty vo vzorke umožniacute klesnuacuteť vzorke do jamky a tak zabraacuteniť jej vyplaveniu z geacutelu Draacuteha je časť geacutelu ktoryacutem putuje jedna vzorka od katoacutedy k anoacutede V draacutehe sa nachaacutedzajuacute oddeleneacute jednotliveacute fragmenty nukleovyacutech kyseliacuten určityacutech veľkostiacute viditeľneacute vo forme pruacutežkov (angl bands) Intenzita pruacutežku zaacutevisiacute od množstva molekuacutel danej veľkosti je ekvivalentnaacute hmotnosti Na určenie veľkosti fragmentov NK sa do jednej jamky nanesie štandard molekulovyacutech hmotnostiacute (angl ladder) ktoryacute maacute presne definovaneacute veľkosti fragmentov čo umožňuje odhadnuacuteť veľkosť aj hmotnosť neznaacutemych separovanyacutech fragmentov

Obr 22 Elektroforetickaacute separaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten v agaroacutezovom geacuteli (A) a vizualizaacutecia UV svetlom a GelRedtrade (B C)

24

Nukleoveacute kyseliny je možneacute elektroforeticky separovať 1) v geacuteloch agaroacutezovom (horizontaacutelna elektroforeacuteza) (obr 22) a polyakrylamidovom (vertikaacutelna elektroforeacuteza) 2) v špeciaacutelnych lineaacuternych polymeacuteroch kapilaacuternou elektroforeacutezou použitiacutem genetickeacuteho analyzaacutetora (obr 23)

Agaroacuteza je polysacharid ziacuteskanyacute z morskej riasy použiacuteva sa najčastejšie v koncentraacuteciiacute 05-2 čiacutem vyššia koncentraacutecia tyacutem je geacutel pevnejšiacute a schopnejšiacute rozliacutešiť menšie fragmenty NK Priacuteprava je jednoduchaacute odvaacuteži sa potrebneacute množstvo agaroacutezy ktoraacute sa zmieša s tlmivyacutem roztokom (pufrom) rozvariacute sa v mikrovlnnej ruacutere a naleje sa do špeciaacutelnej naacutedoby na vytvaacuteranie geacutelov kyacutem je geacutel tekutyacute vložiacute sa do neho tzv hrebeň na vytvorenie jamiek Agaroacuteza je netoxickaacute V bežnom agaroacutezovom geacuteli v zaacutevislosti od jeho koncentraacutecie je možneacute separovať DNA fragmenty dĺžky 200-50 000 bp Dnes suacute dostupneacute aj špeciaacutelne agaroacutezy napr MetaPhorreg Agarose schopneacute oddeliť fragment DNA dĺžky 20-800bp Separaacutecia v agaroacutezovom geacuteli prebieha v horizontaacutelnej aparatuacutere preto sa nazyacuteva aj horizontaacutelna elektroforeacuteza

Polyakrylamidovyacute geacutel (PAGE) vznikaacute polymerizaacuteciou akrylamidu v priacutetomnosti špeciaacutelnych chemickyacutech laacutetok (peroxodisiacuteran amoacutenny TEMED bisakrylamid) Jeho priacuteprava je preto odlišnaacute a aj naacuteročnejšia Polyakrylamidoveacute geacutely majuacute vysokuacute rozlišovaciu schopnosť (1bp) preto suacute PAGE geacutely vhodneacute aj na sekvenovanie DNA klasickyacutemi metoacutedami PAGE geacutel nie je vhodnyacute na separaacuteciu fragmentov dlhšiacutech ako 2kb Použiacuteva sa v koncentraacutecii 35 -20 s rozliacutešeniacutem fragmentov od 10bp-2000bp Akrylamid je neurotoxiacuten musiacute sa s niacutem pracovať veľmi opatrne PAGE elektroforeacuteza bežiacute vo vertikaacutelnej aparatuacutere preto sa volaacute aj vertikaacutelna elektroforeacuteza použiacuteva sa často aj na separaacuteciu proteiacutenov

Ryacutechlosť pohybu nukleovyacutech kyseliacuten (mobilita) určuje viacero faktorov 1) veľkosť NK ndash počet baacutezovyacutech paacuterov resp baacutez pričom menšie molekuly prechaacutedzajuacute geacutelom ryacutechlejšie pretože sa ľahšie pohybujuacute v geacuteli 2) konformaacutecia nukleovej kyseliny napr u rovnako veľkyacutech plazmidov kondenzovaneacute superšpiralizovaneacute plazmidy migrujuacute najryacutechlejšie rovnako veľkeacute lineaacuterne molekuly (toho isteacuteho plazmidu) bežia pomalšie a najpomalšie putujuacute relaxovaneacute kruhoveacute molekuly plazmidu 3) koncentraacutecia geacutelu určuje jeho rozlišovaciu schopnosť koncentrovanejšiacute geacutel je schopnyacute separovať kratšie fragmenty NK redšie geacutely suacute vhodneacute pre rozliacutešenie vaumlčšiacutech fragmentov 4) zloženie geacutelu je docircležiteacute pri analyacuteze sekundaacuternych štruktuacuter NK a proteiacutenov v nedenaturovanom stave sekundaacuterna štruktuacutera spomaľuje migraacuteciu NK a proteiacutenov Tento fakt využiacutevajuacute niektoreacute diagnostickeacute techniky (napr SSCP - Single Strand Conformation Polymorphism - polymorfismus konformaacutecie jednovlaacuteknovej DNA) umožňujuacutece detekciu zaacutemeny jedinej baacutezy ktoraacute spocircsobiacute odlišneacute vnuacutetromolekuloveacute paacuterovanie a vyacuteslednuacute konformaacuteciu molekuly Geacutely mocircžu teda byť denaturačneacute a nedenaturačneacute (natiacutevne) 5) napaumltie zdroja - čiacutem vyššie je napaumltie ktoreacute vytvaacutera elektrickeacute pole v elektroforetickej aparatuacutere tyacutem ryacutechlejšie fragmenty NK migrujuacute 6) zloženie roztokov a teploty

Elektroforetickyacute tlmivyacute roztok (pufor - elektrolyt) zabezpečuje stabilneacute elektroforetickeacute podmienky počas separaacutecie geacutel je v ňom ponorenyacute Obsahuje ioacuteny čo umožňuje vedenie elektrickeacuteho pruacutedu

Štandard molekulovyacutech hmotnostiacute (v laboratoacuteriaacutech nazyacutevanyacute ladder alebo marker) je zmes fragmentov DNA alebo RNA s presne definovanou veľkosťou ktoryacute sluacuteži na odhad veľkosti vyšetrovanyacutech fragmentov NK (obr 22) Pomocou špeciaacutelnych štandardov molekulovyacutech hmotnostiacute ktoryacutech fragmenty NK majuacute definovanuacute aj hmotnosť je možneacute odhadnuacuteť množstvo (hmotnosť - koncentraacuteciu) neznaacutemeho fragmentu

B C

25

41 Vizualizaacutecia DNA

Samotnaacute nukleovaacute kyselina je počas elektroforetickej separaacutecie neviditeľnaacute Vizualizaacuteciu NK umožňujuacute interkalačneacute činidlaacute ktoreacute suacute schopneacute naviazať sa na molekuly NK tyacutem že sa včlenia medzi susediace baacutezy Po ožiareniacute UV svetlom interkalačneacute činidlaacute naviazaneacute na NK fluoreskujuacute tak sa vizualizuje NK čiacutem intenziacutevnejšie fluoreskuje tyacutem viac NK je v geacutelipruacutežku priacutetomneacute Interkalačneacute činidlo sa buď primieša do geacutelu pri jeho priacuteprave čo umožniacute sledovať migraacuteciu fragmentov NK počas elektroforeacutezy a to po vybratiacute z ELFO aparatuacutery a po ožiareniacute UV svetlom alebo sa geacutel farbiacute po elektroforetickej separaacutecii V minulosti bol na zviditeľnenie NK najčastejšie použiacutevanyacute etidiumbromid kvocircli jeho mutageacutennym vlastnostiam sa v suacutečasnosti nahraacutedza menej mutageacutennymi a netoxickyacutemi činidlami ako suacute napr komerčne dostupneacute SYBRregSafe GelRedtrade GelGreentrade

Kapilaacuterna elektroforeacuteza NK prebieha v špeciaacutelnom priacutestroji genetickom analyzaacutetore (obr 23) ktoryacute musiacute mať zaacutekladneacute komponenty ako suacute elektroacutedy kapilaacutera zdroj vysokeacuteho napaumltia detektor prepojenie s počiacutetačom a softveacuteroveacute vybavenie priestor na vloženie vzoriek atď Genetickyacute analyzaacutetor predstavuje automatizovanyacute systeacutem umožňujuacuteci sekvenovanie určovanie dĺžky DNA fragmentov ndash fragmentačnuacute analyacutezu a kvantifikaacuteciu nukleovyacutech kyseliacuten V novšiacutech typoch genetickeacuteho analyzaacutetora je proces analyacutezy od vloženia vzoriek do stojana automatizovanyacute

Vzorka určenaacute na analyacutezu je elektrokineticky injektovanaacute do tenkej kapilaacutery naplnenej lineaacuternym polymeacuterom Vplyvom vysokeacuteho napaumltia sa negatiacutevne nabiteacute fragmenty DNA pohybujuacute v polymeacuteri k pozitiacutevne nabitej elektroacutede Kapilaacuterna elektroforeacuteza je tak citlivaacute že je schopnaacute detegovať jednobaacutezovyacute rozdiel DNA fragmentov DNA fragmenty musia byť pred kapilaacuternou elektroforeacutezou fluorescenčne označeneacute v kapilaacutere suacute separovaneacute na zaacuteklade veľkosti Kraacutetko pred dosiahnutiacutem kladne nabitej elektroacutedy docircjde po excitaacutecii laserovyacutem žiareniacutem k emisii žiarenia fluoroformi (farbičkami) tak že optickyacute detekčnyacute systeacutem zaznamenaacute fluorescenciu ktoraacute je naacutesledne softveacuterovo spracovanaacute a vyhodnotenaacute

Obr 23 Genetickyacute analyzaacutetor

42 RFLP

Metoacuteda polymorfizmu dĺžky restrik čnyacutech fragmentov (angl Restriction Fragment Length Polymorfism) bola prvou metoacutedou využiacutevanou na detekciu DNA variaacuteciiacute rocircznych biologickyacutech vzoriek Princiacutep metoacutedy spočiacuteva v priacutetomnosti polymorfizmov v DNA sekvencii rocircznych ľudiacute ktoreacute zapriacutečinia rozdielny profil (obrazec) DNA fragmentov po štiepeniacute jednou alebo viaceryacutemi restrikčnyacutemi endonukleaacutezami Restrikčneacute endonukleaacutezy (RE) suacute enzyacutemy ktoreacute štiepia DNA molekulu v oblasti špecifickej nukleotidovej sekvencie nazyacutevanej restrik čneacute miesto RE najčastejšie rozpoznaacutevajuacute a štiepia miesto veľkeacute 4-6 baacutez RE suacute priacutetomneacute u prokaryotov (bakteacuterie a archebakteacuterie) kde suacute suacutečasťou restrik čno-modifikačneacuteho systeacutemu akoby prokaryotickeacutej vrodenej imunity sluacutežia

26

na ochranu pred cudzou DNA (napr viacuterusovou) ktoruacute po rozpoznaniacute špecifickej sekvencie štiepia

Restrikčno-modifikačnyacute systeacutem maacute dve zložky 1) modifikačneacute enzyacutemy - metylaacutezy ktoreacute procesom metylaacutecie modifikujuacute určiteacute baacutezy svojej DNA čiacutem ich označia za vlastnuacute DNA takže takaacuteto DNA je potom rezistentnaacute voči štiepeniu restrikčnyacutemi endonukleaacutezami Najčastejšiacutem spocircsobom metylaacutecie u bakteacuteriiacute je metylaacutecia adeniacutenu na N6 pričom vznikne metyladeniacuten alebo cytoziacutenu na C5 metylcytoziacuten 2) restrikčneacute endonukleaacutezy štiepia špecifickeacute miesto dvojvlaacuteknovej DNA ktoreacute je tvoreneacute symetrickou sekvenciou zrkadlovo sa opakujuacutecich nukleotidov ndash tzv palindroacutem Restrikčneacute enzyacutemy sa použiacutevajuacute na štiepenie DNA sekvencie na mieste špecifickom pre tuacute ktoruacute restrikčnuacute endonukleaacutezu napr pri analyacuteze polymorfizmov dĺžky restrikčnyacutech fragmentov (RFLP) analyacuteze jednonukleotidovyacutech polymorfizmov (SNP) mutaacuteciiacute ako aj pri klonovaniacute DNA do vhodnyacutech vektorovyacutech DNA molekuacutel

Po štiepeniacute dvojvlaacuteknovej DNA restrikčnou endonukleaacutezou mocircžu vzniknuacuteť tri typy koncov - 5´-prečnievajuacutece konce (lepiveacute) 3´-prečnievajuacutece konce (lepiveacute) a tupeacute konce (obr 24)

Obr 24 Restrikčneacute štiepenie zanechaacutevajuacutece rocirczne konce tupeacute a lepiveacute

Restrikčneacute štiepenie je často použiacutevanou metoacutedou geacutenovyacutech manipulaacuteciiacute na konštrukciu

hybridnyacutech molekuacutel DNA s naacuteslednyacutem klonovaniacutem Priebeh RFLP analyacutezy je nasledovnyacute restrikčnaacute endonukleaacuteza sa pridaacute k DNA a zmes sa vo

vhodnyacutech reakčnyacutech podmienkach (pufor teplota) inkubuje niekoľko hodiacuten Počas inkubaacutecie docircjde k štiepeniu DNA na špecifickyacutech miestach DNA je potom elektroforeticky separovanaacute v geacuteli a naacutesledne vizualizovanaacute V minulosti po geacutelovej elektroforeacuteze nasledoval Southern blot (čiže prenos separovanyacutech fragmentov DNA z geacutelu na špeciaacutelnu membraacutenu) (obr 35) po ktorom nastala vizualizaacutecia raacutedioaktiacutevne značenou proacutebou V suacutečasnosti sa kvocircli praacutecnosti a zdravotnyacutem rizikaacutem od Southern blotu upuacutešťa a prechaacutedza sa na ryacutechlejšie menej praacutecne a zdravotne šetrnejšie metoacutedy priateľskejšie aj k životneacutemu prostrediu

RFLP bola prvou metoacutedou použiacutevanou na zistenie DNA profilu (DNA fingerprinting) mapovanie geacutenov zapriacutečiňujuacutece genetickeacute ochorenia a testovanie otcovstva Vaumlčšina RFLP markerov je vysoko lokusovo špecifickyacutech a kodominantnyacutech (obidve alely suacute detekovaneacute u heterozygota)

PCR-RFLP je laboratoacuterne priacutestupnejšia metoacuteda molekulaacuterno-genetickej diagnostiky keďže PCR umožňuje amplifikaacuteciu veľmi malyacutech množstiev DNA Alternatiacutevny naacutezov použiacutevanyacute v literatuacutere je CAPS z angl Cleaved Amplified Polymorphic Sequence assay Použitiacutem špecifickyacutech primerov docircjde PCR metoacutedou k amplifikaacutecii požadovaneacuteho uacuteseku DNA ten sa potom štiepi restrikčnou endonukleaacutezou vo vhodnyacutech podmienkach naacutesledne sa štiepne produkty elektroforeticky separujuacute a vizualizujuacute použitiacutem interkalačnyacutech farbiacutev a UV svetla (obr 25)

27

Obr 25 Princiacutep metoacutedy PCR-RFLP

43 VNTR a STR V geacutenome suacute priacutetomneacute dva typy tandemovyacutech (za sebou nasledujuacutecich) opakovaniacute

1) minisatelity ndash nazyacutevaneacute variabilnyacute počet tandemovyacutech opakovaniacute VNTR (variable number of tandem repeats) 2) mikrosatelity tiež kraacutetke tandemoveacute repetiacutecie STR (short tandem repeats)

Obidva tieto typy satelitnej DNA suacute rozmiestneneacute po celom genoacuteme suacute využiacutevaneacute hlavne vo forenznej genetike na identifikaacuteciu osocircb a určenie otcovstva popriacutepade materstva ale aj v mediciacutene na detekciu chromozoacutemovyacutech aneuploidiiacute Štruktuacutera obidvoch je podobnaacute Rozdiel medzi jednotlivyacutemi alelami je spocircsobenyacute rozdielnym počtom opakovaniacute opakujuacutecej sa sekvencie (motiacutevu) čo spocircsobiacute rocircznu dĺžku alel s rocircznym počtom tandemovyacutech opakovaniacute nazyacutevanuacute polymorfizmus dĺžky fragmentov

VNTR ndash variabilnyacute počet tandemovyacutech opakovaniacute pričom opakujuacuteca sa sekvencia maacute dĺžku od 6 do 100 baacutez pričom sa mocircže opakovať aj tisiacutece kraacutet alely tak mocircžu mať od 500do 30 000 baacutez VNTR boli v kombinaacutecii s RFLP (DNA fingerprinting ) prvyacutem polymorfizmom použiacutevanyacutem na zistenie DNA profilov a identifikaacuteciu osocircb v kriminalistickej praxi V suacutečasnosti jeho využitie v kriminalistike je kvocircli potrebe relatiacutevne veľkeacuteho množstva DNA nahradeneacute využitiacutem STR

STR - kraacutetke tandemoveacute repetiacutecie suacute v kriminalistike najčastejšie použiacutevanyacutem polymorfizmom STR lokusy suacute rozmiestneneacute po celom genoacuteme repetiacutecia obsahuje jednu až šesť baacutez pričom jej opakovaniacutem vznikne STR v rozsahu od 50 do 300bp V našom genoacuteme suacute tisiacutece STR ktoreacute mocircžu byť použiteacute pre forenznuacute analyacutezu V kriminalistike sa v suacutečasnosti na identifikaacuteciu osocircb použiacuteva 13 STR locusov ktoreacute patria k medzinaacuterodne uznaacutevanyacutem štandardom Z iniciatiacutevy FBI bola vytvorenaacute databaacuteza CODIS (Combined DNA Index System) každaacute krajina maacute svoju databaacutezu CODIS kde je možneacute vložiť a archivovať DNA profily jednotlivcov ako aj profily DNA ziacuteskanyacutech z miest kriminaacutelneho činu v databaacuteze je ich možneacute navzaacutejom porovnať a tak zistiť pocircvodcu trestneacuteho činu Medzinaacuterodnaacute jednotnosť v použiacutevaniacute CODIS STR lokusov umožňuje v priacutepade potreby vzaacutejomneacute porovnanie DNA profilov zistenyacutech na uacutezemiacute rocircznych štaacutetov CODIS STR lokusov je 13 a suacute to CSF1PO FGA TH01 TPOX VWA D3S1358 D5S818 D7S820 D8S1179 D13S317 D16S539 D18S51 a D21S11 Zistenie DNA profilu sa uskutočniacute multiplexnou PCR reakciou s fluorescenčne značenyacutemi primermi špecifickyacutemi pre konkreacutetny STR Naacutesledne suacute PCR produkty analyzovaneacute kapilaacuternou elektroforeacutezou genetickyacutem analyzaacutetorom ktoryacute rozliacuteši amplifikovaneacute fragmenty na zaacuteklade fluorescencie a dĺžky (fragmentačnaacute analyacuteza) (obr 26 Tab 3) DNA profil každeacuteho človeka je jedinečnyacute rovnakyacute profil mocircžu mať len jednovaječneacute dvojčataacute

28

Obr 26 Ukaacutežka DNA profilu človeka 15 STR lokusov s určeniacutem pohlavia pomocou lokusu pre amelogeniacuten (ženskeacute pohlavie - XX) maleacute oranžoveacute piacuteky predstavujuacute fragmenty veľkostneacuteho štandardu Tabuľka č 3 Zaacutepis DNA profilu človeka z obraacutezka č 26 15 STR lokusov s určeniacutem pohlavia pomocou lokusu pre amelogeniacuten System Alela 1 Alela 2

D3S1358 16 17

TH01 9 93 D21S11 28 28

D18S51 15 18

Penta E 7 14 D5S818 9 12

D13S317 8 11

D7S820 8 11 D16S539 11 12

CSF1PO 10 11

Penta D 11 12 vWA 15 18

D8S1179 13 16

TPOX 8 9 FGA 20 21

amel X X

29

5 MLPA

Multiplexnaacute amplifikaacutecia proacuteb zaacutevislaacute od ligaacutecie (z angl multiplex ligation-dependent probe amplification) je metoacuteda schopnaacute v jednej reakcii (v jednej skuacutemavke a vzorke) detegovať zmeny v počte až 50 nukleotidovyacutech sekvenciiacute Metoacutedou MLPA je možneacute ryacutechlo identifikovať amplifikaacutecie (duplikaacutecie) a deleacutecie veľkeacuteho počtu geacutenov či už použitiacutem DNA alebo mRNA krvnyacutech vzoriek alebo vzoriek z naacutedorov

Princiacutep MLPA spočiacuteva v multiplexnej amplifikaacutecii 50 špecifickyacutech nukleotidovyacutech sekvenciiacute použitiacutem jedneacuteho paacuteru primerov pričom jeden primer je fluorescenčne označenyacute Vyacutesledneacute PCR produkty suacute analyzovaneacute kapilaacuternou elektroforeacutezou (fragmentačnaacute analyacuteza) Dĺžka každeacuteho namnoženeacuteho produktu je jedinečnaacute narastaacute postupne o 6 alebo 9 nukleotidov pričom produkty PCR suacute 120 ndash 500 nukleotidov dlheacute Tento veľkostnyacute rozsah PCR fragmentov (dĺžka 120-500 nukleotidov s naacuterastom postupne o 6 alebo 9 nukleotidov) je optimaacutelny pre kapilaacuternu elektroforeacutezu MLPA multiplexnaacute PCR prebieha za použitia iba jedineacuteho paacuteru primerov ktoreacute amplifikujuacute špecifickeacute sekvencie Trik spočiacuteva v tom že nedochaacutedza k amplifikaacutecii DNA sekvencie ale MLPA proacuteb ktoreacute suacute pridaneacute k vzorkaacutem Každaacute MLPA proacuteba pozostaacuteva z dvoch oligonukleotidov (dve hemiproacuteby) pričom každyacute oligonukleotid obsahuje jednu zo sekvencie rozpoznaacutevanuacute PCR primermi Proacuteba vznikne jedine za predpokladu hybridizaacutecie dvoch oligonukleotidov (hemiproacuteb) k cieľovej sekvencii (geacutenu) a po ligaacutecii enzyacutemom ligaacutezou Iba ligovaneacute proacuteby suacute exponenciaacutelne amplifikovaneacute pomocou jedneacuteho paacuteru primerov Množstvo zligovanyacutech proacuteb teda zaacutevisiacute od množstva cieľovyacutech sekvenciiacute (geacutenov) vo vzorke

Postup MLPA analyacutezy je nasledovnyacute (obr27) K vzorke nukleovej kyseliny (DNA resp mRNA) sa pridaacute zmes 50 jedinečnyacutech proacuteb každaacute

proacuteba je komplementaacuterna k určitej cieľovej sekvencii NK vzorky Každaacute proacuteba však pozostaacuteva z dvoch oligonukleotidov hybridizujuacutecich vedľa seba zaacuteroveň každyacute oligonukleotid (hemiproacuteba) obsahuje pridanuacute sekvenciu rozpoznaacutevanuacute paacuterom PCR primerov Po hybridizaacuteciiacute oligonukleotidov (hemiproacuteb) dochaacutedza k ich ligaacutecii ligaacutezou Ligačnaacute reakcia je tak špecifickaacute že je schopnaacute rozliacutešiť sekvenciu liacutešiacu sa v jednom nukleotide Vyacuteslednyacute ligačnyacute produkt (proacuteba) obsahuje obidve sekvencie pre PCR primery na jednom fragmente čiže mocircže docircjsť k namnoženiu takeacutehoto fragmentu PCR reakciou V priacutepade ak nedocircjde k ligaacutecii priacuteslušnyacutech hemiproacuteb pretože hemiproacuteby nenaacutejdu cieľovuacute sekvenciu na DNA každaacute takaacuteto nezligovanaacute hemiproacuteba maacute len jednu sekvenciu rozpoznaacutevanuacute len jednyacutem PCR primerom v docircsledku čoho nemocircže prebehnuacuteť jej PCR amplifikaacutecia a počas fragmentačnej analyacutezy nie je detegovanaacute pretože negeneruje fluorescenčnyacute signaacutel

Pri MLPA analyacuteze je docircležiteacute okrem MLPA amplifikaacutecie vzorky urobiť aj MLPA amplifikaacuteciu referenčnej vzorky ku ktorej sa bude porovnaacutevať počet geacutenov (cieľovyacutech sekvenciiacute) Po kapilaacuternej elektroforeacuteze MLPA referenčnej a skuacutemanej vzorky porovnaniacutem obsahu nameranyacutech hodnocirct tzv piacutekov priacuteslušnyacutech proacuteb sa určiacute relatiacutevny počet koacutepiiacute v skuacutemanej vzorke

MLPA

1 DNA denaturaacutecia a hybridizaacutecia s MLPA proacutebami (hemiproacuteby)

2 Ligaacutecia (vytvorenie kompletnyacutech proacuteb)

3 PCR amplifikaacutecia proacuteb paacuterom primerov

4 Kapilaacuterna elektroforetickaacute separaacutecia PCR produktov

5 Analyacuteza daacutet

30

Obr 27 Princiacutep MLPA

Firma MRC-Holland v suacutečasnosti ponuacuteka stovky MLPA setov proacuteb ktoreacute suacute vhodneacute na 1) diagnostiku kongenitaacutelnych a dedičnyacutech ochoreniacute 2) zisťovanie profilu naacutedorov 3) zisťovanie metylačneacuteho profilu

MLPA je metoacuteda vhodnaacute na detekciu malyacutech prestavieb (BRCA1 BRCA2 MSH2 atď)

veľkyacutech chromozoacutemovyacutech prestavieb (Williamsov syndroacutem Prader-WilliAngelman syndroacutem atzď)

31

detekciu zmien v počte koacutepii geacutenov (obr 28 29) ako aj zistenie počtu kompletnyacutech chromozoacutemov (chromozoacutem 13 18 21 XY tiež aj z amniovej tekutiny) diagnostiku naacutedorov (zmeny počtu pri ALL CLL atď) kvantifikaacuteciu metylaacutecie (Prader-WilliAngelmanov syndroacutem Fragilnyacute X inaktivaacutecia naacutedorovyacutech supresorovyacutech geacutenov atď) mRNA analyacutezu geacutenov zuacutečastňujuacutecich sa apoptoacutezy alebo zaacutepalov

MS-MLPA (Methylation-Specific MLPA) je varianta MLPA určenaacute špeciaacutelne na analyacutezu aberantnyacutech metylaacutecii imprintovanyacutech oblastiacute ako aj detekciu metylačnyacutech zmien CpG ostrovčekov lokalizovanyacutech bliacutezko promoacutetora Rozdiel oproti štandardnej MLPA spočiacuteva v použitiacute metylačne senzitiacutevneho restrikčneacuteho enzyacutemu HhaI ktoryacute štiepi MS-MLPA proacuteby hybridizovaneacute k nemetylovanej sekvencii Každaacute DNA vzorka určenaacute pre MS-MLPA analyacutezu prejde dvoma reakciami v jednej mikroskuacutemavke štandardnou MLPA analyacutezou (bez štiepenia metylačne senzitiacutevnym enzyacutemom) a v druhej mikroskuacutemavke docircjde okrem ligaacutecie proacuteb aj k metylačne senzitiacutevnemu štiepeniu hybridizovanyacutech proacuteb s nemetylovanou DNA Amplifikujuacute sa len ligovaneacute proacuteby po PCR amplifikaacutecii sa fragmentačnou analyacutezou porovnaniacutem oboch reakciiacute zistia rozdiely v metylačnom profile vzorky k referenčnej vzorke

RT-MLPA (Reverse Transkriptase MLPA) je variaacutecia MLPA určenaacute pre zistenie mRNA profilu vzorky je alternatiacutevou k real-time PCR a mikročipom RT-MLPA nedeteguje mRNA množstvo priamo pretože použiacutevanaacute ligaacuteza nie je schopnaacute ligovať DNA oligonukleotidy keď suacute hybridizovaneacute s RNA Preto RT-MLPA začiacutena reverznou transkripciou so špeciaacutelne navrhnutyacutemi RT primermi tak aby vytvorili kraacutetke oligonukleotidy (cDNA) Potom reakcia pokračuje ako štandardnaacute MLPA

Obr 28 MLPA analyacuteza geacutenu DMD (koacutedujuacuteceho dystrofiacuten) mutaacutecie ktoreacuteho spocircsobujuacute Duchennovu svalovuacute dystrofiu u pacienta je priacutetomnaacute deleacutecia exoacutenu 45 v porovnaniacute s referenčnou vzorkou ndash kontrolou

32

Obr 29 MLPA analyacuteza geacutenu DMD (koacutedujuacuteceho dystrofiacuten) mutaacutecie ktoreacuteho spocircsobujuacute Duchennovu svalovuacute dystrofiu u pacienta suacute priacutetomneacute duplikaacutecie exoacutenov 41 42 43 44 45 (piacuteky vo vzorke pacienta sa porovnajuacute s piacutekmi v kontrole ndash referenčnej vzorke)

33

6 Sekvenovanie

Sekvenovaniacutem rozumieme určenie primaacuternej štruktuacutery DNA teda určenie poradia nukleotidov v reťazci DNA Začiatky moderneacuteho sekvenovania siahajuacute do roku 1977 kedy boli objaveneacute dve metoacutedy sekvenovania 1) chemickaacute metoacuteda Maxama a Gilberta 2) enzymatickaacute metoacuteda Sangera Nicklena a Coulsona

Princiacutep obidvoch metoacuted sekvenovania spočiacuteva v tom že sa vytvoriacute suacutebor DNA molekuacutel s rocircznou veľkosťou ktoreacute suacute zakončeneacute konkreacutetnym nukleotidom tieto DNA molekuly sa elektroforeticky separujuacute v geacuteloch s rozlišovacou schopnosťou 1 nukleotid 61 Chemickaacute metoacuteda

DNA molekuly sa na 5-konci raacutedioaktiacutevne označia raacutedioaktiacutevnym fosforom a naacutesledne sa chemicky modifikujuacute špecificky pre každuacute baacutezu DNA sa potom v modifikovanyacutech miestach štiepi čiacutem vzniknuacute rocirczne dlheacute fragmenty pričom podmienky suacute nastaveneacute tak aby sa DNA na každom mieste štiepila len raz Modifikaacutecia DNA a štiepenie prebehne v štyroch separaacutetnych reakciaacutech (skuacutemavkaacutech) takže po elektroforetickej separaacuteciiacute takto opracovanej DNA v štyroch draacutehach polyakrylamidoveacuteho geacutelu a naacuteslednej autoraacutediografii (podobne ako pri Southernovej hybridizaacutecii) je možneacute odčiacutetať nukleotidovuacute sekvenciu približne 100 nukleotidov od raacutedioaktiacutevneho označenia (v čase objavu Maxama a Gilberta) 62 Sangerova metoacuteda

Zaacuteklady metoacutedy boli popiacutesaneacute už v roku 1975 (metoacuteda plus a miacutenus) ale až vylepšenie použitiacutem dideoxynukleotidov (ddNTP) v roku 1977 došlo k zjednodušeniu sekvenovania Princiacutepom enzyacutemoveacuteho sekvenovania je terminaacutecia (zastavenie) polymerizaacutecie inkorporaacuteciou 2´ 3 -dideoxynukleotidov do novosyntetizujuacuteceho sa vlaacutekna DNA Keďže ddNTP neobsahujuacute hydroxylovuacute skupinu na 3 uhliacuteku riboacutezy nemocircžu sa zuacutečastniť na tvorbe fosfodiesterovej vaumlzby nemocircže sa pripojiť k nim ďalšiacute nukleotid čiže musiacute docircjsť k terminaacuteciiacute polymeraacutecie Reakcia prebieha v štyroch skuacutemavkaacutech s raacutedioaktiacutevne značenyacutem primerom V každej skuacutemavke suacute priacutetomneacute všetky štyri deoxynukleotidtrifosfaacutety (dNTP) ale pre každuacute skuacutemavku je špecifickyacute priacutedavok maleacuteho množstva jedneacuteho z dideoxynukleotidtrifosfaacutetov (v prvej skuacutemavke je ddATP v druhej ddCTP v tretej ddTTP a vo štvrtej ddGTP) Maleacute množstvo ddNTP spocircsobiacute že pri polymerizaacutecii dochaacutedza k prednostneacutemu zaradeniu štandardnyacutech dNTP do narastajuacuteceho reťazca a len občas sa inkorporuje ddNTP čiacutem sa zastaviacute synteacuteza reťazca V každej skuacutemavke tak vznikne suacutebor DNA fragmentov rocircznych veľkostiacute zakončenyacutech priacuteslušnyacutem ddNTP (v prvej skuacutemavke ddATP v druhej ddCTP v tretej ddTTP a vo štvrtej ddGTP) Po elektroforetickej separaacutecii v 4 draacutehach polyakrylamidoveacuteho geacutelu a autoraacutediografii sa z autoraacutediogramu odčiacuteta sekvencia

V suacutečasnosti je sekvenovanie do značnej miery automatizovaneacute pričom využiacuteva princiacutep Sangerovej enzyacutemovej metoacutedy s určityacutemi obmenami Uacutesek DNA ktoryacute treba sekvenovať sa prostredniacutectvom termostabilnyacutech DNA polymeraacutez namnožiacute PCR metoacutedou po ktorej nasleduje sekvenačnaacute reakcia (asymetrickaacute PCR) s fluorescenčne značenyacutemi ddNTP (každyacute druh označenyacute inyacutem fluorescenčnyacutem farbivom) Sekvenačnaacute reakcia prebieha v jednej skuacutemavke s jednyacutem primerom vznikne tak suacutebor jednovlaacuteknovyacutech DNA rocircznej dĺžky ktoreacute suacute na 3konci označeneacute ddNTP so špecifickyacutem fluorescenčnyacutem farbivom Taacuteto metoacuteda sekvenovania sa tiež nazyacuteva rdquodye-terminator cycle sequencingrdquo(obr 30) Po kapilaacuternej elektroforeacuteze vzorky v genetickom analyzaacutetore zaznamenaacutevaniacute fluorescencie jednotlivyacutech fragmentov CCD kamerou a softveacuterovom spracovaniacute sa ziacuteska sekvencia DNA (obr 31)

34

Obr 30 Princiacutep sekvenovania Sangerova dideoxy metoacuteda alebo tzv chain termination method (reťazec zastavujuacuteca metoacuteda) Obr 31 Určenie genotypu plodu a rodičov sekvenčnou analyacutezou DNA ziacuteskanej z plodovej vody (prenataacutelna diagnostika) a perifeacuternej krvi sekvenčnaacute analyacuteza geacutenu ASPA vyacutesledok u plodu priacutetomnaacute mutaacutecia c 914CgtA v homozygotnom stave (AA) rodičia heterozygoti (AC) Uvedenaacute mutaacutecia je v homozygotnom stave kauzaacutelnou priacutečinou Canavanovej choroby

Automatizovaneacute sekvenovanie prinaacuteša viacereacute vyacutehody oproti klasickej Sangerovej metoacutede vyššiu presnosť a ryacutechlosť v jednej sekvenačnej reakcii možnosť osekvenovať až 1200 nukleotidovyacute fragment maleacute množstvo templaacutetu potrebneacute na analyacutezu

35

63 Next Generation Sequencing (NGS)

NGS (sekvenovanie novej generaacutecie) maacute obrovskyacute potenciaacutel v analyacuteze genoacutemov pričom toto označenie zahŕňa viacereacute technologickeacute metoacutedy reprezentovaneacute niekoľkyacutemi firmami Princiacutepom je masiacutevne paralelneacute sekvenovanie čiacutem sa ziacuteskajuacute raacutedovo tisiacutece až milioacuteny sekvenciiacute naraz 631 Sekvenovanie druhej generaacutecie

Na začiatku sa analyzovanaacute DNA vo vaumlčšine priacutepadov fragmentuje (vznikne tak DNA

knižnica) na fragmenty sa pripoja kraacutetke sekvencie ndash adapteacutery naacutesledne sa tieto fragmenty rocircznymi priacutestupmi amplifikujuacute a určiacute sa ich sekvencia Vďaka čiastočnyacutem prekryvom je zo ziacuteskanyacutech sekvencii možneacute poskladať plynuluacute sekvenciu zodpovedajuacutecu pocircvodnej nefragmentovanej DNA

Pyrosekvenovanie je podobne ako Sangerova metoacuteda založenaacute na princiacutepe synteacutezy komplementaacuterneho vlaacutekna DNA avšak rozdiel je v tom že sa na detekciu inkorporaacutecie nukleotidu využiacuteva inyacute systeacutem tvorby luminiscenčneacuteho signaacutelu v priebehu reakcie Pyrosekvenovanie je umožneneacute vďaka aktivite 4 enzyacutemov - DNA polymeraacutezy ATP sulfurylaacutezy luciferaacutezy a apyraacutezy Reakčnaacute zmes obsahuje aj ďalšie komponenty - enzymatickeacute substraacutety adenoziacutenfosfosulfaacutet (APS) d-luciferiacuten sekvenovanyacute templaacutet a cyklicky postupne po jednom type pridaacutevaneacute nukleotidtrifosfaacutety Po zabudovaniacute nukleotidu do novovznikajuacuteceho reťazca docircjde k uvoľneniu pyrofosfaacutetu naacutesledne je využityacute ATP sulfurylaacutezou na synteacutezu ATP z APS počas ďalšej reakcie docircjde k využitiu ATP luciferaacutezou na premenu luciferiacutenu na oxyluciferiacuten čo spocircsobiacute svetelnyacute signaacutel a ten zaznamenaacute detekčnyacute systeacutem Poslednou enzymatickou reakciou je reakcia apyraacutezy ktoraacute odstraacuteni nezainkorporovaneacute nukleotidy a nevyužiteacute ATP aby sa celyacute proces mohol zopakovať s reakčnou zmesou obsahujuacutecou ďalšiacute nukleotidtrifosfaacutet (inyacute ako v predchaacutedzajuacutecej reakcii) Po každej reakcii detektor zaznamenaacuteva emisiu svetla na zaacuteklade intenzity svetla je možneacute určiť či bol vradenyacute priacuteslušnyacute nukleotidtrifosfaacutet či bol inkorporovanyacute jeden priacutepadne viac rovnakyacutech nukleotidtrifosfaacutetov

Zvyacutešenie vyacutekonu pyrosekvenovania umožnila tzv emulznaacute PCR v mikročasticiach a použitie platničky PicoTiterPlatereg toto sekvenovanie zaviedla firma Roche pod pojmom 454 pyrosekvenovanie v roku 2005 Na začiatku sa DNA fragmentuje na uacuteseky dlheacute 400-600 baacutez dvojvlaacuteknovaacute fragmentovanaacute DNA sa liguje s adapteacutermi prostredniacutectvom nich sa naviaže na mikročastice dvojvlaacuteknoveacute fragmenty sa oddelia mikročastice s naviazanyacutemi jednovlaacuteknovyacutemi fragmentami sa premiešajuacute so zmesou oleja a roztoku ktoryacute obsahuje všetky komponenty na uacutespešnuacute PCR Tyacutemto spocircsobom sa okolo každej mikročastice vytvoriacute vlastnyacute mikroreaktor v ktorom prebehne amplifikaacutecia fragmentu Po PCR reakcii sa mikročastice prenesuacute do platničky PicoTiterPlate v ktorej sa do jamky zmestiacute akuraacutet jedna mikročastica a reakčneacute komponenty pyrosekvenačnej reakcie PicoTiterPlatereg maacute 1 600 000 jamiek každaacute jamka maacute maximaacutelny objem 75 picolitra Platnička s mikročasticami sa vložiacute do sekvenačneacuteho systeacutemu ndash priacutestroja v ktorom sa celeacute pyrosekvenovanie uskutočniacute Chemiluminiscenčneacute signaacutely ktoryacutech počas sekvenovania vznikajuacute milioacuteny v priebehu hodiny suacute zachyteneacute CCD kamerou a analyzovaneacute softveacuterom

Firma Illumina predstavila inuacute technoloacutegiu PCR amplifikaacutecia a sekvenovanie sa uskutočňuje na skliacutečku (flow cell) Fragmentaacutecia DNA a pripojenie adapteacuterov prebieha za uacutečasti transpozoacutemov v procese nazvanom tagmentaacutecia Po hybridizaacutecii fragmentov DNA na skliacutečko prebehne v klastroch PCR amplifikaacutecia (tzv mostiacutekovaacute amplifikaacutecia) sekvenaacutecia prebieha za uacutečasti rozdielne fluorescenčne značenyacutech a chemicky modifikovanyacutech nukleotidov pričom každyacute nukleotid emituje fluorescenciu s inou vlnovou dĺžkou Na skliacutečku prebieha paralelne až 6 miliaacuterd sekvenaacutecii (obr 32)

Ďalšiacutemi možnosťami sekvenovania druhej generaacutecie je systeacutem SOLid (vyvinutyacute firmou Applied Biosystem dnes pod Thermo Fisher Scientific) a Ion Semiconductor Sequencing ndash polovodičoveacute ioacutenoveacute sekvenovanie (od firmy Ion Semiconductor Sequencing v suacutečasnosti Thermo Fisher Scientific)

36

Obr 32 Princiacutep sekvenovania novej generaacutecie od firmy Illumina PCR amplifikaacutecia a sekvenovanie sa uskutočňuje na skliacutečku (flow cell) paralelne prebieha až 6 miliaacuterd sekvenaacutecii

632 Sekvenovanie tretej generaacutecie

Pred sekvenovaniacutem netreba amplifikovať DNA PCR metoacutedou ale sekvencia sa ziacuteskava zachyteniacutem signaacutelu v reaacutelnom čase Medzi sekvenovanie tretej generaacutecie patriacute SMRT (Single Molecule Real-Time Sequencing) a Nanopore Sequencing

37

7 Fragmentačnaacute analyacuteza DNA

Je metoacuteda použiacutevanaacute na určenie veľkosti fragmentov DNA ziacuteskanyacutech PCR reakciou Dĺžka amplifikovanyacutech DNA fragmentov sa zistiacute ich porovnaniacutem s veľkostnyacutem štandardom (obr 33) ktoryacute je tvorenyacute DNA fragmentami znaacutemej dĺžky Veľkostnyacute štandard je pred kapilaacuternou elektroforeacutezou zmiešanyacute so vzorkou DNA fragmenty veľkostneacuteho štandardu suacute fluorescenčne označeneacute pričom použiteacute fluorescenčneacute farbivo je ineacute ako fluorescenčneacute farbivo použiteacute na označenie DNA fragmentov vo vyšetrovanej vzorke

Obr 33 Elektroforetogram veľkostneacuteho štandardu použiacutevaneacuteho na určenie veľkostiacute fragmentov analyzovanyacutech kapilaacuternou elektroforeacutezou v genetickom analyzaacutetore (GeneScantrade 500 LIZtrade dye Size Standard) dĺžka fragmentov v nukleotidoch (napr 50 nukleotidov)

Fragmentačnaacute analyacuteza pozostaacuteva z viaceryacutech krokov Prvyacutem je izolaacutecia DNA nasleduje PCR amplifikaacutecia počas ktorej sa novosyntetizovaneacute DNA fragmenty označia fluorescenčnyacutemi farbivami Vzorka s PCR produktom sa pripraviacute na kapilaacuternu elektroforeacutezu tak že sa zmieša s veľkostnyacutem štandardom (sluacuteži na určenie veľkosti fragmentov) a denaturačnou laacutetkou (formamid) nasleduje denaturaacutecia Pripraveneacute vzorky suacute injektovaneacute do priacutestroja (genetickyacute analyzaacutetor) kde v kapilaacutere naplnenej polymeacuterom v elektrickom poli migrujuacute fluorescenčne značeneacute fragmenty DNA na zaacuteklade veľkosti (kapilaacuterna elektroforeacuteza) Počas elektroforeacutezy genetickyacute analyzaacutetor zaznamenaacuteva fluorescenciu fragmentov Analyacutezou daacutet prostredniacutectvom špeciaacutelnych softveacuterov sa ziacuteskajuacute elektroforetogramy z ktoryacutech je možneacute zistiť veľkosť fragmentov ako aj typ fluorescencie (docircležiteacute ak suacute genetickeacute varianty rozliacutešiteľneacute rocircznou fluorescenciou napr SNaPshot) Fragmentačnaacute analyacuteza je suacutečasťou množstva molekulaacuterno-genetickyacutech metoacuted (pozri obr 12 26 28 29 34) ako suacute napr STR analyacuteza (Short Tandem Repeat) AFLP analyacuteza (Amplified Fragment Lenght Polymorfism) RFLPT-RFLP analyacuteza (Restriction Fragment Lenght PolymorfismTerminal Restricted Fragment Lenght Polymorfism) SSCP (Single Strand Conformation Polymorfism) VNTR (Variable Number of Tandem Repeat) analyacuteza straty heterozygotnosti (LOH loss of heterozygozity) MLPA (Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification) MSMSA (Methylation-Sensitive Mobility Shift Assay) SNP genotypovanie (SNaPshotreg) HiCEP (High-Coverage Expression Profiling)

38

Obr 34 Kvantitatiacutevna fragmentačnaacute PCR analyacuteza (QF-PCR) DNA izolovanej z plodovej vody vyacutesledok prenataacutelnej analyacutezy = priacutetomnosť troch piacutekov pre chromozoacutem 18 (u všetkyacutech fragmentov detegujuacutecich chromozoacutem 18 je pomer vyšetrovanyacutech markerov aberantnyacute 21 resp 111) čo znamenaacute trizoacutemiu chromozoacutemu 18 Edwardsov syndroacutem

39

8 Metoacutedy založeneacute na princiacutepe hybridizaacutecie

Nukleoveacute kyseliny majuacute schopnosť vytvaacuterať dvojvlaacuteknoveacute reťazce z jednovlaacuteknovyacutech molekuacutel na zaacuteklade komplementarity baacutez Komplementarita baacutez umožňuje replikaacuteciu DNA transkripciu RNA komplementarita baacutez zabezpečuje teda reprodukovateľnosť živej hmoty

Hybridizaacutecia je proces v ktorom na zaacuteklade komplementarity baacutez dochaacutedza k vytvoreniu dvojvlaacuteknovej nukleovej kyseliny z dvoch jednovlaacuteknovyacutech molekuacutel DNA alebo RNA alebo ich kombinaacuteciou DNA RNA pričom kratšia jednovlaacuteknovaacute nukleovaacute kyselina vystupuje ako sonda (proacuteba) Hybridizaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten je jeden z najpoužiacutevanejšiacutech naacutestrojov v molekulaacuternej bioloacutegii a genetike (hybridizaacutecia primerov alebo proacuteb sa využiacuteva v takmer každej metoacutede - v PCR RT-PCR qPCR RT-qPCR MLPA sekvenovaniacute fragmentačnej analyacuteze FISH DNA mikročipoch atď)

Denaturaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten je proces pri ktorom dochaacutedza k porušeniu vodiacutekovyacutech vaumlzieb medzi vlaacuteknami nukleovyacutech kyseliacuten (strata sekundaacuternej a terciaacutelnej štruktuacutery) tak že docircjde k ich uacuteplneacutemu oddeleniu vzniknuacute jednovlaacuteknoveacute reťazce Denaturaacutecia NK mocircže byť spocircsobenaacute vplyvom vysokyacutech teplocirct pH alebo chemickyacutech laacutetok (denaturačneacute činidlaacute) Renaturaacutecia je opačnyacute proces v ktorom na zaacuteklade komplementarity dochaacutedza k tvorbe dvojvlaacuteknovyacutech NK

Hybridiza čnaacute sonda (proacuteba) je jednovlaacuteknovaacute nukleovaacute kyselina určitej znaacutemej dĺžky a sekvencie (najčastejšie DNA pretože je stabilnejšia ako RNA) ktoraacute je značenaacute a sluacuteži na detekciu komplementaacuternych molekuacutel DNA alebo RNA v procese hybridizaacutecie V zaacutevislosti od podmienok hybridizaacutecie (stringencia) mocircže byť detegovanaacute sekvencia uacuteplne komplementaacuterna alebo v menej priacutesnych podmienkach mocircže mať sekvenčneacute odchyacutelky Proacuteba sluacuteži na vyhľadanie a zviditeľnenie cieľovyacutech NK Zviditeľnenie sa deje prostredniacutectvom označenia proacuteby ešte pred hybridizaacuteciou Značenie proacuteby mocircže byť raacutedioaktiacutevne a neraacutedioaktiacutevne (najčastejšie fluorescenčneacute)

Raacutedioaktiacutevne značeneacute proacuteby pomocou izotopov (32P) sa využiacutevali viac v minulosti v suacutečasnosti suacute kvocircli zdravotnyacutem rizikaacutem ohľaduplnosti k životneacutemu prostrediu ako aj kvocircli jednoduchšej manipulaacutecii použiacutevaneacute fluorescenčne značeneacute proacuteby Raacutedioaktiacutevne značeneacute sondy boli použiacutevaneacute hlavne metoacutedou Southernovej hybridizaacutecie (Southern blotting Southern blot) Citlivosť raacutedioaktiacutevne značenyacutech proacuteb je vyššia dosahuje schopnosť zachytiť 10 fg (femtogram 10-15) cieľovej DNA sekvencie 81 Southern blot

Metoacutedu objavil v roku 1975 britskyacute bioloacuteg Edwin Southern (preto Southern) Pri Southernovej hybridizaacutecii sa restrikčne štiepeneacute fragmenty DNA elektroforeticky separujuacute v geacuteli potom sa metoacutedou blottingu prenesuacute na nylonovuacute alebo nitroceluloacutezovuacute membraacutenu kde suacute naacutesledne hybridizovaneacute v roztoku obsahujuacutecom raacutedioaktiacutevne značenuacute sondu Priloženiacutem fotografickeacuteho filmu k membraacutene a vyvolaniacutem filmu autoraacutediografiou docircjde k zviditeľneniu lokaliacutet kde došlo k hybridizaacuteciiacute raacutedioaktiacutevne značenej sondy s fragmentom DNA (autoraacutediogram) Southern blot bol kľuacutečovou a prvou metoacutedou na identifikaacuteciu osocircb (DNA fingerprinting DNA pofiling) (obr 35)

Okrem Southern blotu existuje Northern blot na analyacutezu RNA (geacutenovej expresie) a Western blot na analyacutezu proteiacutenov postup je obdobnyacute ako pri Southern blote s obmenami špecifickyacutemi pre konkreacutetny blot Pri Northern blote sa použiacutevajuacute hybridizačneacute proacuteby ale pre vizualizaacuteciu proteiacutenov western blotom je potrebneacute použiť protilaacutetky s naacuteslednou vizualizaacuteciou Pomenovanie techniacutek je hra so sloviacutečkami (keďže paacuten Northern ani Western neobjavili takto nazvaneacute techniky)

Neraacutedioaktiacutevne značenie proacuteb použiacutevanyacutech v molekulaacuternej genetike mocircže byť nepriame (použitie haptenu) alebo priame Konečnaacute vizualizaacutecia je najčastejšie zabezpečenaacute fluoreskujuacutecimi farebnyacutemi značkami farbivami fluorochroacutemami (fluorofoacuterami) Pri priamom značeniacute je farbička kovalentne naviazanaacute na nukleotid a na zachytenie fluorescencie suacute potrebneacute špeciaacutelne priacutestroje umožňujuacutece excitaacuteciu farbičky ktoraacute potom emituje žiarenie určitej vlnovej dĺžky (emisneacute žiarenie) a to zachytiacute detekčnyacute systeacutem priacutestroja Využitie fluorochroacutemov v molekulaacuternej genetike je masiacutevne napr na vizualizaacuteciu NK elektroforeticky separovanyacutech v geacuteli kvantifikaacuteciu produktov PCR reakcie v priacutestroji real-time PCR cykleacuter sekvenovaniacute fragmentačnej analyacuteze FISH DNA mikročipoch atď

40

Obr 35 Princiacutep Southern blotu

82 FISH (fluorescenčnaacute in situ hybridizaacutecia)

FISH (fluorescent in situ hybridization fluorescenčnaacute in situ hybridizaacutecia) metoacuteda patriacute medzi molekulovo-cytogenetickeacute techniky Princiacutep FISH metoacutedy je založenyacute na hybridizaacuteciiacute fluorescenčne značenyacutech proacuteb ku komplementaacuternym uacutesekom vyšetrovanej DNA na podložnom skle (priamo na mieste - in situ) K denaturaacutecii dsDNA dochaacutedza buď vplyvom denaturačnyacutech činidiel alebo zvyacutešenou teplotou a naacuteslednou renaturaacuteciou dochaacutedza k naviazaniu sondy na komplementaacuterny uacutesek DNA Vyacutesledok hybridizaacutecie sa vizualizuje fluorescenčnyacutem mikroskopom vybavenyacutem vhodnyacutemi fluorescenčnyacutemi filtrami a vizuaacutelne zhodnotiacute skuacutesenyacutem odborniacutekom Fluorescencia sa v niektoryacutech priacutepadoch mocircže zaznamenať a hodnotiť aj pomocou softveacuteru (obr 36)

Pomocou FISH detegujeme numerickeacute aberaacutecie - zmeny v počte chromozoacutemov (napr trizoacutemia monozoacutemia chromozoacutemov) alebo štruktuacuterne aberaacutecie a prestavby (napr translokaacutecie inverzie deleacutecie duplikaacutecie amplifikaacutecie) FISH metoacuteda umožňuje identifikaacuteciu a detekciu každeacuteho ľudskeacuteho chromozoacutemu jeho zaradenie do karyotypu odhalenie malyacutech submikroskopickyacutech chromozoacutemovyacutech zmien a tiež mapovať poziacutecie jednotlivyacutech geacutenov na chromozoacuteme

41

Obr 36 Princiacutep štandardnej FISH a FISH maľovania celeacuteho chromozoacutemu

Veľkou vyacutehodou FISH metoacutedy je možnosť analyacutezy buniek v metafaacuteze aj v interfaacuteze kedy nie je nutnaacute kultivaacutecia buniek a tiež ryacutechle analyzovanie veľkeacuteho počtu buniek (stovky až tisiacutece) K ďalšiacutem vyacutehodaacutem patriacute bezpečnosť vysokaacute citlivosť dostatočnaacute stabilita relatiacutevne kraacutetky čas hybridizaacutecie a možnosť ryacutechleho vyhodnotenia Hybridizaacutecia pri vaumlčšine suacutečasne dodaacutevanyacutech sond trvaacute 10-12 hodin (na trhu suacute už dostupneacute aj sondy so skraacutetenyacutem časom hybridizaacutecie na 2-3 hodiny) Po hybridizaacuteciiacute nasleduje odmyacutevanie kedy pri priacuteslušnej teplote dochaacutedza k odmytiu nenaviazanyacutech a nespraacutevne hybridizovanyacutech sond Preparaacutet sa naacutesledne podfarbiacute a vyacutesledok sa zhodnotiacute vo fluorescenčnom mikroskope Na podfarbenie chromozoacutemov alebo jadier sa použiacuteva modreacute kontrastneacute farbivo DAPI (46-diamidino-2-fenylindol) ktoreacute maacute silneacute fluorescenčneacute vlastnosti dokaacuteže prechaacutedzať jadrovou membraacutenou a viazať sa na DNA Vyacutesledkom je modreacute zafarbenie ktoreacute vyacuteborne kontrastuje so signaacutelmi jednotlivyacutech sond

Limitujuacutecim faktorom FISH je možnosť identifikaacutecie len tyacutech uacutesekov DNA ku ktoryacutem suacute použiteacute sondy V jednej analyacuteze je možneacute použiť najviac 3 odlišne značeneacute sondy a tak zistiť priacutepadneacute abnormality len na 1 alebo na paacuter lokusoch Na relevantnuacute detekciu je potrebneacute mať vo vzorke 1-5 aberantnyacutech interfaacutezovyacutech jadier

FISH je možneacute uskutočniť na širokej škaacutele biologickeacuteho materiaacutelu na vzorkaacutech perifeacuternej krvi kostnej drene naacuteteroch choriovyacutech klkoch plodovej vode rocircznych druhov tkaniacutev natiacutevnych alebo zaliatych v parafiacutene na 1 bunke (predimplantačnaacute genetickaacute diagnostika PGD) (obr 37)

Využiacuteva sa na detekciu aberaacuteciiacute pri mnohyacutech onkologickyacutech ochoreniach (napr pri diagnoacuteze mnohopočetnyacute myeloacutem sa v suacutečasnosti po separaacutecii CD138+ buniek robiacute FISH s 5 sondami pre geacuteny IGH TP53 RB1 oblasť 1p321q21 a stanovuje sa hyperploidia chromozoacutemov 5 9 a 15) a tiež k spresneniu doplneniu a k overeniu bežneacuteho cytogenetickeacuteho vyšetrenia

Podľa miesta na chromozoacuteme na ktorom dochaacutedza k hybridizaacutecii sondy rozlišujeme 4 typy

DNA sond bull centromeacuteroveacute sondy ndash sa viažu na strednuacute časť chromozoacutemu ndash centromeacuteru sluacutežia k diagnostike zmien v počte chromozoacutemov k detekcii chromozoacutemov neznaacutemeho pocircvodu umožňujuacute interfaacuteznu FISH na nedeliacich sa bunkaacutech (obr 38-41)

42

Obr 37 Interfaacutezna FISH preimplantačnyacute genetickyacute skriacutening aneuploidiiacute ndash blastomeacutera 3-denneacuteho ľudskeacuteho embrya s normaacutelnym počtom chromozoacutemov 13 18 21 pohlavie XY použityacutech 5 sond pre chromozoacutemy 13 ndash orange 18 ndash aqua 21 ndash green X ndash blue a Y ndash yellow (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

Obr 38 Interfaacutezne jadro po hybridizaacutecii s centromeacuterovou sondou pre chromozoacutem 8 (Vysis Abbott) V pravom jadre je priacutetomnaacute trizoacutemia chromozoacutemu 8 (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex) Obr 39 Metafaacutezna (A) a interfaacutezna FISH (B) použitaacute centromeacuterovaacute sonda CEPX spectrum orangeCEPY spectrum green (Vysis Abbott) Sonda hybridizuje k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (červenyacute signaacutel) a Y (zelenyacute signaacutel) (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

43

Obr 40 Interfaacutezna FISH vyšetrenie spermiiacute použiteacute sondy CEPX greenCEPY orange (Aneuscore Metasystems) Sondy hybridizujuacute k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (zelenyacute signaacutel) Y (červenyacute signaacutel) vľavo ndash dve haploidneacute spermie (majuacutece jedna spermia X druhaacute Y chromozoacutem) vpravo ndash dve patologickeacute spermie obsahujuacutece gonozoacutemovyacute komplement XY (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

Obr 41 Interfaacutezna FISH vyšetrenie spermiiacute použiteacute sondy CEPX greenCEPY orange a CEP18 aqua (Aneuscore Metasystems) Sondy hybridizujuacute k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (zelenyacute signaacutel) Y (červenyacute signaacutel) a 18 (modryacute signaacutel) vľavo ndash normaacutelne haploidneacute ľudskeacute spermie - 1x chromozoacutem X alebo Y a jedenkraacutet chromozoacutem 18 v strede ndash patologickaacute spermia obsahujuacuteca gonozoacutemovyacute komplement XY a jeden chromozoacutem 18 vpravo ndash patologickaacute diploidnaacute spermia s chromozoacutemami X Y a dvoma chromozoacutemami 18 (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

bull lokusovo špecifickeacute sondy ndash hybridizaacutecia prebehne na konkreacutetnom mieste geacutenu (lokuse) (obr 42-44) použiacutevajuacute sa k vyšetreniu mikrodeleacuteciiacute (straty malyacutech častiacute chromozoacutemu pri mikrodelečnyacutech syndroacutemoch) k zisteniu amplifikaacutecie onkogeacutenov a niektoryacutech špecifickyacutech translokaacuteciiacute prestavby geacutenov umožňujuacute interfaacuteznu FISH na nedeliacich sa bunkaacutech bull subtelomeroveacute ndash vaumlzba na koncoveacute časti chromozoacutemu ndash telomeacutery bull celochromozoacutemoveacute alebo celomaľovacie sondy ndash sondy hybridizujuacute s mnohopočetnyacutemi chromozoacutemovyacutemi sekvenciami pričom sa fluorescenčne tak bdquovymaľujeldquo celyacute chromozoacutem (Obr 45) Použiacutevajuacute sa na vyšetrenie chromozoacutemovyacutech prestavieb k analyacuteze translokaacuteciiacute a k detekcii pocircvodu tzv marker chromozoacutemov (malyacutech nadpočetnyacutech chromozoacutemov neznaacutemeho pocircvodu) K použitiu sondy suacute potrebneacute metafaacutezne chromozoacutemy nepoužiacutevaju sa pre interfaacuteznu FISH

Pri konvenčnej chromozoacutemovej FISH suacute homogeacutenne DNA proacuteby hybridizovaneacute s fixovanyacutem metafaacuteznym alebo prometafaacuteznym chromozoacutemomchromozoacutemami na skliacutečku (Obr 36a) Maximaacutelna rozlišovacia schopnosť metafaacuteznej FISH je niekoľko megabaacutez (Obr 39a 45) využitiacutem viac

44

natiahnutyacutech prometafaacuteznych chromozoacutemov sa dosiahne 1 Mb rozliacutešenie Prostredniacutectvom fiber FISH konkreacutetne artificiaacutelne deproteinizovanej natiahnutej DNA pripravenej in situ z celyacutech buniek na mikroskopickom skliacutečku je možneacute vizualizovať individuaacutelne geacuteny maleacute DNA elementy na chromozoacuteme s rozliacutešeniacutem okolo 1000 bp

Obr 42 Interfaacutezne jadro po hybridizaacutecii s lokusovo-špecifickou sondou LSI 5q31 Spectrum Orange5p12 Spectrum Green (Vysis Abbott) Na ľavom obraacutezku suacute priacutetomneacute dva červeneacute (5q31) a dva zeleneacute signaacutely (5p12) v pravom jadre je priacutetomnaacute deleacutecia 5q31 oblasti chyacuteba jeden červenyacute signal (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

Obr 43 Interfaacutezna FISH použitaacute lokusovo-špecifickaacute sonda ndash translokačnaacute - XL BCRABL1 plus (Metasystems) dvojfarebnaacute dvojfuacutezna kde červenaacute označuje lokus ABL1 na chromozoacuteme 9 a zelenaacute oblasť BCR na chromozoacuteme 22 Sonda deteguje fuacuteziu protoonkogeacutenu ABL1 (9q34) a geacutenu BCR (22q11) v priacutepade že červenyacute a zelenyacute signaacutel suacute pri sebe (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

45

Obr 44 Interfaacutezna FISH Použitaacute lokusovo-špecifickaacute sonda- typ break apart pre IGH geacuten V docircsledku translokaacutecie došlo k rozskočeniu geacutenu pričom translokačneacuteho partnera nepoznaacuteme vieme určiť len percento v koľkyacutech jadraacutech je geacuten prestavanyacute (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex) Obr 45 Použiteacute celochromozoacutemoveacute sondy WCP 15 (červenyacute chromozoacutem) a WCP 17 (zelenyacute chromozoacutem) Na metafaacuteze je potvrdenaacute reciprokaacute translokaacutecia t(1517)(q2221) (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

FISH vizualizaacutecia celeacuteho chromozoacutemu maľovanie chromozoacutemu anglicky chromosome

painting je špeciaacutelnou aplikaacuteciou chromozoacutemovej FISH proacuteba je koktail veľkeacuteho počtu rocircznych fluorescenčne značenyacutech DNA fragmentov hybridizujuacutecich pozdĺž celeacuteho konkreacutetneho chromozoacutemu (obr 36b 45) bdquoChromosomepaintingldquo analyzuje metafaacutezne chromozoacutemy V minulosti bola FISH vizualizaacutecia celyacutech chromozoacutemov limitovanaacute malyacutem množstvom rocirczne sfarbenyacutech fluorochroacutemov

V suacutečasnosti je možneacute detegovať množstvo cieľovyacutech sekvenciiacute naraz čo sa využiacuteva pri celogenoacutemovej chromozoacutemovej vizualizaacutecii (whole-chromosomepainting - WCP) metoacutedou multiplex FISH (M-FISH multicolor FISH o br 46) alebo spektraacutelnej karyotypizaacutecie (SKY) kedy možno rozliacutešiť všetky ľudskeacute chromozoacutemy ndash teda 24 rocircznych chromozoacutemov M-FISH a SKY patria medzi metafaacutezne formy FISH diagnostiky ktoreacute umožňujuacute simultaacutennu vizualizaacuteciu všetkyacutech ľudskyacutech chromozoacutemov v rocircznych farbaacutech čo predstavuje uľahčenie analyacutezy karyotypu hlavne pri komplexnyacutech zmenaacutech a markeroch neznaacutemeho pocircvodu Obe techniky vychaacutedzajuacute z použitia

46

celochromozoacutemovyacutech sond značenyacutech kombinaacuteciou viaceryacutech fluorochroacutemov Rozdiel medzi M-FISH a SKY spočiacuteva v technike ziacuteskania konečneacuteho obrazu

Obr 46 Multicolor FISH - každyacute chromozoacutemovyacute paacuter je zafarbenyacute inou farbou pričom na ich zafarbenie postačuje kombinaacutecia 5 fluorochroacutemov Na vyhodnocovanie je potrebnaacute špeciaacutelna sada fluorescenčnyacutech filtrov pre jednotliveacute fluorochroacutemy a špeciaacutelnyacute softweacuter Vľavo-štandardnyacute karyotyp vpravo karyotyp s mutaacuteciami (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

V molekulovej cytogenetike suacute komerčne dostupneacute sety M-FISH proacuteb umožňujuacutece

viacfarebneacute pruacutežkovanie chromozoacutemov (banding) s vysokyacutem rozliacutešeniacutem (multicolor-banding mBAND FISH MCB) čo umožňuje identifikaacuteciu intrachromozoacutemovyacutech prestavieb (Obr 47) Nevyhnutnosťou mBAND-u je mať chromozoacutemy v metafaacuteze Taacuteto metoacuteda bola prvyacutekraacutet uskutočnenaacute na chromozoacuteme 5 v roku 1999 mBAND FISH umožňuje rozliacutešiť špecifickeacute oblasti chromozoacutemov na uacuterovni pruacutežku - bandu a sub-bandu s detekciou 550 bandov haploidneacuteho karyotypu

Obr 47 A - mBAND chromozoacutemu 11 - inverzia duplikovanej oblasti 11q223-q25 B - mBAND chromozoacutemu 3 - na kruhovom chromozoacuteme deleacutecia oblasti 3p263 C - mBAND chromozoacutemu 2 - potvrdenie inverzie duplikovanej časti chromozoacutemu (poskytnuteacute RNDr Dagmar Landlovou Medirex)

FISH metoacuteda a jej varianty (M-FISH mBAND SKY) majuacute v suacutečasnosti širokeacute využitie v

klinickej genetike v onkologickej genetike na detekciu aberaacuteciiacute v čase diagnoacutezy počas liečby po

47

liečbe monitorovanie po transplantaacutecii kostnej drene v prenataacutelnej a postnataacutelnej diagnostike pri detekcii submikroskopickyacutech deleacuteciiacute (napr DiGeorge syndroacutem - 22q112 delečnyacute syndroacutem PraderndashWilli syndroacutem- chromozoacutem 15q11-13) prostredniacutectvom FISH je možnaacute detekcia numerickyacutech zmien chromozoacutemov (trizoacutemia chromozoacutemu 21 pri Downovom syndroacuteme trizoacutemia chromozoacutemu 15 pri Patauovom syndroacuteme trizoacutemia chromozoacutemu 18 pri Edwardsovom syndroacuteme) rocirczne zmeny v počte pohlavnyacutech chromozoacutemov (monozoacutemia X pri Turnerovom syndroacuteme Klinefelterov syndroacutem s X chromozoacutemom naviac - XXY) podobne v predimplantačnej diagnostike

83 DNA Microarray (DNA mikro čip biočip) DNA mikročipovanie je technika využiacutevajuacuteca hybridizaacuteciu skuacutemanej nukleovej kyseliny

(cieľovaacute vzorka) s veľkyacutem množstvom oligonukleotidovyacutech proacuteb (desať tisiacutec až milioacuten) ktoreacute suacute prichyteneacute na pevnyacute podklad najčastejšie sklenyacute silikoacutenovyacute alebo nylonovyacute (doštička čip) Skuacutemanaacute nukleovaacute kyselina je pred hybridizaacuteciou fragmentovanaacute označenaacute fluorofoacuterom a denaturovanaacute Po kontakte čipu s cieľovou vzorkou ktoraacute je vlastne zmes označenyacutech oligonukleotidov značeneacute oligonukleotidy hybridizujuacute s oligonukleotidovyacutemi sekvenciami prichytenyacutemi na čipe Potom suacute na zaacuteklade fluorescencie detekovaneacute miesta kde došlo k hybridizaacutecii čiže vzorka obsahovala takuacuteto nukleotidovuacute sekvenciu Z jedneacuteho mikročipu sa ziacuteska obrovskeacute množstvo daacutet ktoreacute je vždy nutneacute softveacuterovo spracovať V dnešnej dobe existuje niekoľko firiem poskytujuacutecich komerčne mikročipy na objednaacutevku alebo si ich laboratoacuteria produkujuacute sami

Mikročipovanie prebieha nasledovne

1) Vytvorenie DNA čipu ndash tisiacutece rocircznych jednovlaacuteknovyacutech DNA oligonukleotidov znaacutemych sekvencii sa kovalentne naviažu na povrch doštičky vždy v určitej lokalite je niekoľko rovnakyacutech oligonukleotidov veľkosť takejto lokality je ˂ 200 microm Proacutebami mocircže byť DNA cDNA alebo syntetizovaneacute oligonukleotidy Už hotoveacute mikročipy ponuacutekajuacute viacereacute firmy (Affymetrix Agilent Technologies Eppendorf Illumina) alebo si ich jednotliveacute laboratoacuteria vyraacutebajuacute sami pomocou robotickyacutech zariadeniacute DNA čip sa vytvaacutera buď nanaacutešaniacutem kvapiek oligonukleotidov na podklad alebo synteacutezou oligonukleotidov in situ na čipe 2) Priacuteprava vzorky ndash nukleovaacute kyselina (mRNA DNA) sa purifikuje určiacute sa jej kvantita a kvalita (spektrofotometericky) fragmentuje resp v priacutepade mRNA sa syntetizuje cDNA v priacutepade potreby sa mocircže DNA amplifikovať PCR reakciou štiepiť restrikčnyacutemi endonukleaacutezami 3) Fluorescenčneacute označenie (zriedkavejšie raacutedioaktiacutevne) fragmentov DNA prebieha počas reverznej transkripcie alebo PCR amplifikaacutecie za uacutečasti fluorescenčne značenyacutech nukleotidov Keď sa analyzujuacute dve rocirczne vzorky napr zdraveacute tkanivo a naacutedoroveacute tkanivo označenie nukleovyacutech kyseliacuten v tyacutechto tkanivaacutech byacuteva rozdielne a to použitiacutem dvoch rocircznych fluorescenčnyacutech farbiacutev (napr zeleneacute a červeneacute) Pred hybridizaacuteciou je potrebneacute vzorku denaturovať čiacutem sa vytvoriacute zmes jednovlaacuteknovyacutech DNA označenyacutech značkou 4) Hybridizaacutecia s mikročipom ndash v špeciaacutelnom hybridizačnom roztoku hybridizujuacute komplementaacuterne sekvencie zo vzorky s priacuteslušnyacutemi oligonukleotidovyacutemi sondami naviazanyacutemi na čipe Potom sa čip obmyje aby došlo k odstraacuteneniu čiastočne hybridizovanyacutech nukleovyacutech kyseliacuten 5) Skenovanie mikročipu ndash skenerom čipov docircjde k ožiareniu čipu laserom pričom v mieste hybridizaacutecie fluorescenčne značenyacutech DNA fragmentov s proacutebou docircjde k emisii svetla určitej vlnovej dĺžky ktoruacute skener zaznamenaacute 6) Analyacuteza daacutet prebieha metoacutedami bioinformatiky spracovaniacutem softveacutermi sa zistiacute ktoreacute lokality čipu navzaacutejom hybridizovali v priacutepade použitia dvoch vzoriek kontrolnej a skuacutemanej je možneacute analyzovať ich relatiacutevnu intenzitu hybridizaacutecie (expresie určiteacuteho geacutenu)

Existujuacute štyri typy mikročipov 1) Čipy ur čeneacute na analyacutezu expresie (obsahujuacute cDNA proacuteby) pre tzv dvojkanaacutelovyacute experiment kedy je vzorka určenaacute k hybridizaacutecii na čipe ziacuteskanaacute zmiešaniacutem DNA fragmentov kontrolnej a skuacutemanej vzorky pričom fragmenty suacute rozdielne fluorescenčne označeneacute (napr zelenyacute fluorofoacuter pre kontrolnuacute vzorku a červenyacute pre skuacutemanuacute) Na zaacuteklade intenzity a typu fluorescencie sa deteguje expresia geacutenov typickaacute pre kontrolnuacute vzorku (napr zelenaacute fluorescencia) pre skuacutemanuacute vzorku (napr

48

červenaacute fluorescencia) a expresia podobnaacute u oboch vzoriek (žltaacute fluorescencia) neexprimovaneacute geacuteny (čierna fluorescencia) rocirczne odtiene (v zaacutevislosti od prevažujuacutecej hybridizaacutecie) (obr 48) 2) Čipy ur čeneacute na analyacutezu mutaacutecii použije sa genoacutemovaacute DNA označenaacute jednou fluorescenčnou farbičkou na určenie jednonukleotidovej zmeny (SNP ndash Single Nukleotide Polymorphism) 3) Čipy na komparatiacutevnu genoacutemovuacute hybridizaacuteciu (aCGH array Comparative Genomic Hybridization) ndash použiacutevaneacute na zistenie zvyacutešenia alebo zniacuteženia množstva chromozoacutemovyacutech fragmentov obsahujuacutecich geacuteny zodpovedneacute za určiteacute ochorenie Na analyacutezu sa použije skuacutemanaacute gDNA a referenčnaacute (kontrolnaacute) DNA každaacute sa značiacute inou fluorescenčnou farbičkou (princiacutep ako pri analyacuteze expresie) (obr 49 50) 4) Čipy CGH - SNP kombinovaneacute čipy ur čeneacute na analyacutezu aj mutaacuteciiacute SNP aj na komparatiacutevnu genoacutemovuacute hybridizaacuteciu CGH

Mikročipy majuacute rozsiahle využitie napriacuteklad v identifikaacuteciiacute novyacutech geacutenov vo vyacuteskume ich funkciiacute expresie v rocircznych podmienkach pri diagnostike mnohyacutech ochoreniacute vo farmakogenomike vo vyacuteskume vplyvu toxiacutenov

Obr 48 Heatmapa geacutenovej expresie vybranyacutech geacutenov (mRNA) mikročip obsahuje 46000 cDNA proacuteb (poskytnuteacute Ing Helenou Gbelcovou PhD Uacutestav lekaacuterskej bioloacutegie genetiky a klinickej genetiky LF UK a UNB)

49

Obr 49 Princiacutep komparatiacutevnej genoacutemovej hybridizaacutecie (aCGH - array comparative genomic hybridization) Obr 50 A) Vyacutesledok komparatiacutevnej genoacutemovej hybridizaacutecie (aCGH - array comparative genomic hybridization) vzorky DNA izolovanej plodovej vody U plodu s abnormaacutelnym ultrasonografickyacutem vyšetreniacutem bola identifikovanaacute duplikaacutecia oblasti 3q261q29 (modryacute paacutes) a deleacutecia oblasti 5p1533p151 (červenyacute paacutes) Pre porovnanie chromozoacutem 1 bez aberaacutecie b) Ten istyacute pacient ale ineacute softveacuteroveacute spracovanie (poskytnuteacute RNDr Miroslavom Tomkom PhD Medirex)

50

Odporuacutečanaacute a použitaacute literatuacutera

Odborneacute knihy Klug W S Cummings M R Spencer Ch A Palladino M A Concepts of Genetics jedenaacuteste vydanie (2015) Carson S Molecular Biology Techniques tretie vydanie (2012) Strachan T Read A Human Molecular Genetics štvrteacute vydanie (2011) Sudbery P Sudbery I Human Molecular Genetics tretie vydanie (2009)

Internetoveacute straacutenky

wwwncbinlmnihgov wwwmlpacom wwwthermofishercom wwwilluminacom wwwpromegask wwwqiagencom wwwambioncom

Odborneacute člaacutenky Chacon-Cortes D Griffiths L R Methods for extracting genomic DNA from whole blood samples current perspectives Journal of Biorepository Science for Applied Medicine Volume 2 strany 1- 9 Viltrop T Krjutskov K Palta P Metspalu A Comparison of DNA extraction methods for multiplex polymerase chain reaction Anal Biochem 2010 Volume 398(2) strany 260-262 Ing Martin Čermaacutek Molekulaacuterna cytogenetika v problematike familiaacuternych maligniacutet Onkoloacutegia Volume 2 strany 77 - 83 Livak KJ Schmittgen TD Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method Methods 2001 Volume 25(4) strany 402 - 408 Bustin S A Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays J Mol Endocrinol 2000 Volume 25(2) strany169 - 193

MOLEKULAacuteRNE METOacuteDY AKTUAacuteLNE POUŽIacuteVANEacute V KLINICKEJ GENETIKE RNDr Andrea Pastoraacutekovaacute PhD RNDr Robert Petrovič PhD Vydala Univerzita Komenskeacuteho v Bratislave Lekaacuterska fakulta Rozsah 50 straacuten 246 AH prveacute vydanie ISBN 978-80-223-4231-5

10

Obr 5 Absoluacutetna kvantifikaacutecia DNA priacutestrojom real-time PCR cykleacuterom porovnaniacutem amplifikaacutecie uacuteseku DNA v skuacutemanej vzorke s amplifikaacuteciou vzorky so znaacutemou kvantitou Okrem amplifikaacutecie skuacutemanej vzorky je treba urobiť štandardnuacute krivku amplifikaacutecie vzorky znaacutemej koncentraacutecie z ktorej sa koncentraacutecia skuacutemanej vzorky odčiacuteta V kriminalistike sa bežne použiacuteva pridanie vnuacutetornej kontroly ku vzorke na určenie čistoty vzorky (v priacutetomnosti inhibiacutetorov nedocircjde k amplifikaacutecii žiadnej DNA) Vnuacutetornaacute kontrola je už priacutetomnaacute v kite čiže sa automaticky pridaacuteva pri priacuteprave vzoriek na qPCR amplifikaacuteciu sluacuteži na zistenie priacutetomnosti inhibiacutetorov v skuacutemanej vzorke teda v priacutepade že nedocircjde k amplifikaacutecii vo vzorke sluacuteži na rozliacutešenie či je koncentraacutecia DNA priacuteliš niacutezka alebo suacute vo vzorke priacutetomneacute inhibiacutetory Bežnaacute mediciacutenska molekulaacuterno-genetickaacute diagnostika nevyžaduje priacutetomnosť vnuacutetornej kontroly keďže nukleoveacute kyseliny suacute prevažne izolovaneacute kitmi z krvi čiže je zabezpečenaacute vysokaacute kvalita a čistota naizolovanej NK Obr 6 Spektrofotometer (NanoPhotometer) a ukaacutežka vyacutesledkou merania koncentraacutecie RNA izolovanej minikolonovou metoacutedou

11

3 PCR (polymeraacutezovaacute reťazovaacute reakcia)

Je metoacuteda vyvinutaacute v roku 1983 Karym Mullisom ocenenaacute v roku 1993 Nobelovou cenou za cheacutemiu Polymeraacutezovaacute reťazovaacute reakcia je založenaacute na schopnosti DNA polymeraacutezy syntetizovať noveacute vlaacutekno DNA podľa templaacutetoveacuteho vlaacutekna na zaacuteklade princiacutepu komplementarity DNA polymeraacuteza je schopnaacute pripaacutejať nukleotidy len k voľnej 3acuteOH skupine preto potrebuje primer (čiacutetaj prajmer) ku ktoreacutemu je schopnaacute pridaacutevať nukleotidy Primery suacute kraacutetke jednovlaacuteknoveacute oligonukleotidy ktoreacute umožňujuacute jednak DNA polymeraacuteze začať so synteacutezou noveacuteho vlaacutekna na druhej strane ohraničujuacute špecifickuacute oblasť ktoruacute chceme amplifikovať (namnožiť) Vyacutesledkom PCR reakcie je obrovskyacute počet koacutepii špecifickej sekvencie (obr 7) PCR v podstate napodobňuje replikaacuteciu DNA v in vitro podmienkach s rozdielom že nedochaacutedza k replikaacutecii celej DNA ale len vybraneacuteho primermi ohraničeneacuteho miesta

31 Najdocircležitejšie PCR komponenty

Templaacutetovaacute DNA je vzorka DNA obsahujuacuteca cieľovuacute sekvenciu Na začiatku reakcie docircjde pri vysokej teplote k denaturaacutecii a separaacutecii jednotlivyacutech vlaacutekien dvojvlaacuteknovej DNA

Enzyacutem DNA polymeraacuteza syntetizuje noveacute DNA vlaacutekno komplementaacuterne k cieľovej sekvencii Najčastejšie použiacutevanou a prvou DNA polymeraacutezou je Taq DNA polymeraacuteza (z termofilnej bakteacuterie Thermus aquaticus) zatiaľ čo Pfu DNA polymeraacuteza (z Pyrococcus furiosus) je preferovanaacute kvocircli tzv vysokej fidelite čo je schopnosť inkorporovať spraacutevnu baacutezu do novosyntetizovaneacuteho vlaacutekna DNA DNA polymeraacutezy musia mať dve vlastnosti schopnosť syntetizovať noveacute vlaacutekno DNA podľa templaacutetovej DNA a byť termostabilneacute čiže rezistentneacute na vysokeacute teploty (cca 100degC) V suacutečasnosti sa v laboratoacuteriaacutech často použiacutevajuacute rekombinantneacute polymeraacutezy s požadovanyacutemi vlastnosťami Napriacuteklad pre PCR ktorej produkt bude klonovanyacute je docircležiteacute použiť polymeraacutezu ktoraacute je schopnaacute opraviť vlastnuacute chybu v priacutepade inkorporaacutecie nespraacutevnej baacutezy pri synteacuteze noveacuteho reťazca Schopnosť opravovať nespraacutevne inkorporovaneacute baacutezy počas synteacutezy noveacuteho vlaacutekna DNA sa nazyacuteva tzv proofreading aktivita ktoraacute je zabezpečenaacute 3rarr5acute exonukleaacutezovou aktivitou takejto polymeraacutezy Pred vlastnou molekulaacuterno-genetickou diagnostikou je treba optimalizovať podmienky PCR reakcie pre konkreacutetnu DNA polymeraacutezu a pre špecifickeacute primery treba zistiť optimaacutelnu teplotu annealingu (hybridizaacutecie) primerov koncentraacutecie jednotlivyacutech zložiek PCR reakcie (napr MgCl2)

Primery suacute kraacutetke jednovlaacuteknoveacute DNA sekvencie komplementaacuterne k cieľovej sekvencii DNA polymeraacuteza začiacutena syntetizovať noveacute vlaacutekno z 3acutekonca primeru Docircležitou charakteristikou primerov je teplota topenia (Tm) t j teplota pri ktorej polovica DNA duplexov je disociovanaacute na jednovlaacuteknoveacute molekuly

Nukleotidy (dNTP deoxyribonukleotidtrifosfaacutety) suacute stavebneacute prvky pre novosyntetizovanuacute DNA molekulu

Veľmi praktickyacutem riešeniacutem pre molekulaacuterno-genetickeacute diagnostickeacute laboratoacuteria je tzv mastermix to je roztok v ktorom už je priacutetomneacute všetko potrebneacute pre priebeh PCR reakcie samozrejme okrem primerov a templaacutetovej DNA sekvencie PCR Master Mix (2X) od firmy ThermoFisher Scientific je jednyacutem z takyacutechto mixov obsahuje Taq DNA polymeraacutezu tlmivyacute roztok (pufor) MgCl2 a všetky deoxyribonukleotidy trifosfaacutety

Tabuľka č 1 uvaacutedza ako sa PCR reakcia z mastermixu pripravuje pre jednu vzorku Keďže v laboratoacuteriu sa zriedka robiacute PCR reakcia s jednou vzorkou treba si pripraviť tzv premix (tj PCR reakcie pre vaumlčšiacute počet vzoriek ale bez templaacutetovej DNA) ktoryacute sa rozdeliacute do mikroskuacutemaviek a až potom sa k nim pridaacute DNA resp cDNA

12

Tab 1 Priacuteprava PCR premixu

Celkovyacute objem jednej PCR reakcie 10 microl Počet vzoriek 8 2x PCR master mix 5 40

primer sense (10microM) 05 4

primer antisense (10microM) 05 4

H2O 35 28

DNA cDNA 05

rozpipetovať premix po 95microl do mikroskuacutemaviek až potom pridať do každej mikroskuacutemavky zvlaacutešť DNA cDNA

spolu objem 10 76

PCR amplif ikaacutecia je cyklickyacute proces pozostaacutevajuacuteci z troch krokov (obr 7) 1) denaturaacutecia dvojvlaacuteknovej DNA pri vysokej teplote (95degC) 2) hybridizaacutecia (annealing) primerov k špecifickej sekvencii DNA pri teplote vhodnej pre konkreacutetne primery 3) polymerizaacutecia (synteacuteza) novyacutech vlaacutekien DNA (72degC)

Obr 7 Princiacutep PCR

Tieto tri kroky sa opakujuacute 25 ndash 40 kraacutet pričom pri každom cykle sa počet molekuacutel zdvojnaacutesobiacute (vyacuteslednyacute počet cieľovej sekvencie je 2n+1 ak na začiatku bola jedna dvojvlaacuteknovaacute DNA a počet cyklov je n) PCR prebieha v termaacutelnom cykleacuteri (teplotnom cyklovači) je to priacutestroj (obr 8) kde je možneacute vykonať a naprogramovať celyacute termaacutelny priebeh PCR reakcie Tabuľka č 2 je priacutekladom termaacutelneho programu pre konkreacutetnu PCR reakciu

Po PCR reakcii je vyacuteslednyacute produkt možneacute vizualizovať elektroforeticky resp použiť na ďalšiu analyacutezu

13

Tab 2 Priacuteklad klasickeacuteho teplotneacuteho a časoveacuteho profilu PCR PCR Teplota Čas Opakovanie

95degC 2 minuacutety

95degC 15 sekuacutend

66degC 60 sekuacutend 30x

72degC 60 sekuacutend

72degC 5 minuacutet

Obr 8 Termaacutelny cykleacuter v procese a otvorenyacute s mikroskuacutemavkami

32 Variaacutecie PCR

Hot-start PCR využiacuteva DNA polymeraacutezu ktoruacute je treba aktivovať vysokou teplotou (napr 95degC 10 minuacutet) Vyacutehodou použiacutevania hot-start polymeraacutez je možnosť pracovať pri laboratoacuternej teplote keďže polymeraacuteza je pri bežnej teplote neaktiacutevna a tyacutem nemocircže docircjsť k vzniku nešpecifickyacutech produktov

Touchdown PCR maacute v počiatočnyacutech cykloch vyššiu teplotu annealingu (uacutečelom je zvyacutešiť

špecificitu PCR produktov na začiatku PCR) neskocircr sa teplota annealingu zniacuteži čo maacute za naacutesledok vyššiacute vyacuteťažok PCR produktu

Nested PCR maacute dva kroky a potrebuje dva paacutery primerov V prvom kroku sa prostredniacutectvom

prvej sady primerov amplifikuje dlhšiacute DNA fragment Ten sa použije ako templaacutet v druhom kroku s druhou sadou primerov s vyacuteslednyacutem kratšiacutem DNA produktom Nested PCR zvyšuje špecifickosť a citlivosť diagnostickyacutech PCR

Multiplex PCR je vlastne viac PCR reakciiacute prebiehajuacutecich v jednej skuacutemavke suacutečasne

V reakčnej zmesi je viac paacuterov primerov suacutečasne prebehne amplifikaacutecia viaceryacutech uacutesekov DNA takto dochaacutedza k šetreniu vzorky reakčnej zmesi a pracovneacuteho času

14

Real-time PCR je venovanaacute špeciaacutelna časť v skriptaacutech Sluacuteži na kvantifikaacuteciu PCR produktu v reaacutelnom čase na zaacuteklade merania fluorescencie okrem kvantifikaacutecie je využiacutevanaacute aj na určenie genotypov

RT-PCR je variaacutecia PCR umožňujuacuteca amplifikaacuteciu DNA sekvencie z vyacutechodiskovej RNA

sekvencie Najskocircr musiacute prebehnuacuteť prepis RNA do jednovlaacuteknovej cDNA prostredniacutectvom reverznej transkriptaacutezy naacutesledne sa cDNA použije pre PCR Selektiacutevnym použitiacutem primerov pri reverznej transkripcii mocircžeme uacutečelovo prepiacutesať buď celkovuacute RNA (primery - random hexameacutery) alebo len mRNA (primery - oligoT)

Alelovo-špecifickaacute PCR (AS-PCR) (obr 9) sluacuteži na detekciu konkreacutetnych mutaacuteciiacute

a jednonukleotidovyacutech polymorfizmov (SNP) Použije sa sada 3 primerov v dvoch kombinaacuteciaacutech PCR reakciiacute dva primery majuacute odlišnuacute sekvenciu na 3acute-koncoch jeden na detekciu wt (wild type) a druhyacute primer na detekciu mutantnej alely reakcia neprebehne ak miesto na templaacutetovej DNA nie je komplementaacuterne k 3acute-koncu primeru pretože DNA polymeraacuteza vyžaduje uacuteplnuacute hybridizaacuteciu primera na 3acute-konci Takto je možneacute rozliacutešiť priacutetomnosť štandardnej (wildtype ndash wt) a mutantnej alely resp SNP (obr 9) AS-PCR je znaacutema aj pod ďalšiacutemi naacutezvami ASO-PCR (allele-specific oligonucleotide PCR) ARMS (amplification-refractory mutation system)

Obr 9 Alelovo-špecifickaacute PCR (AS-PCR)

Mutageneacuteza prostredniacutectvom PCR (site directed mutagenesis) sa použiacuteva keď je potrebneacute vytvoriť mutaacuteciu v špecifickom mieste geacutenu primerprimery majuacute modifikovanuacute sekvenciu tak že obsahujuacute mutaacuteciu v strednej časti čo neovplyvniacute hybridizaacuteciu primerov s templaacutetovou DNA pričom vyacutesledkom je PCR produkt s cielene mutovanou DNA sekvenciou

Asymetrickaacute PCR sa použiacuteva na synteacutezu koacutepiiacute jedneacuteho vlaacutekna z templaacutetovej DNA a to

použitiacutem veľmi niacutezkej koncentraacutecie jedneacuteho primeru Sekvenačnaacute PCR je PCR v ktorej je použityacute len jeden primer a v reakčnej zmesi suacute okrem

všetkyacutech dNTP priacutetomneacute dideoxynukleotidtrifosfaacutety (ddNTP) značeneacute raacutedioaktiacutevne dnes však prevažne fluorescenčne každyacute typ ddNTP inou fluorescenčnou farbičkou Zaradenie niektoreacuteho zo štyroch ddNTP spocircsobiacute terminaacuteciu (zastavenie) predlžovania DNA reťazca fluorescenčneacute označenie ddNTP umožniacute detekciu dĺžky fragmentu a určenie sekvencie posledneacuteho nukleotidu Vyacuteslednyacute produkt sekvenačnej PCR sluacuteži na sekvenovanie Sekvenovaniu sa venuje samostatnaacute časť

MLPA (multiplex ligation-dependent probe amplification) ndash multiplexnaacute amplifikaacutecia proacuteb zaacutevislaacute od ligaacutecie je variaacutecia multiplexnej PCR umožňujuacuteca namnoženie viaceryacutech uacutesekov DNA za použitia iba jedneacuteho paacuteru primerov avšak s podmienkou vytvorenia sekvenčne špecifickej proacuteby ligaacuteciou sekvenčne špecifickyacutech oligonukleotidov MLPA je metoacuteda umožňujuacuteca detekciu počtu koacutepiiacute

15

až 50 nukleotidovyacutech sekvenciiacute v jednej reakcii Pomocou MLPA je možneacute ryacutechlo identifikovať amplifikaacutecie a deleacutecie veľkeacuteho počtu geacutenov či už z DNA alebo mRNA okrem toho MLPA mocircže byť použitaacute na analyacutezu CpG-metylaacutecie (MS-MLPA) Viac informaacutecii v samostatnej časti

SNaPshotreg Multiplex nazyacutevaneacute aj minisekvenovanie je multiplexnaacute reakcia v ktorej je každyacute primer predĺženyacute iba o jeden nukleotid (obr 10) V reakčnej zmesi nie suacute priacutetomneacute deoxyribonukleotidtrifosfaacutety ale len dideoxyribonukleotidtrifosfaacutety (ddATP ddCTP ddGTP ddTTP) každyacute označenyacute inou fluorescenčnou farbičkou Po integraacutecii ddNTP do DNA vlaacutekna je polymerizaacutecia ukončenaacute Jednovlaacuteknoveacute fragmenty (primery) predĺženeacute presne o jeden ddNTP suacute separovaneacute kapilaacuternou elektroforeacutezou v genetickom analyzaacutetore pričom je detegovanaacute ich fluorescencia a dĺžka (obr 11) Z vyacutesledneacuteho elektroforetogramu (obr 12) je možneacute určiť v jednej reakcii sekvenciu vo viac ako v 10 lokalitaacutech určiteacuteho fragmentu DNA SNaPshot Multiplex sa v molekulaacuterno-genetickom laboratoacuteriu využiacuteva na ryacutechlu detekciu viaceryacutech najčastejšie sa vyskytujuacutecich mutaacuteciiSNP geacutenu

Obr 10 Priacuteklad využitia metoacutedy SnaPshot s použitiacutem sady 13 primerov ktoreacute sa predĺžia len o 1 značenyacute dideoxynukleotid SNaPshot najčastejšiacutech mutaacuteciiacute geacutenu pre 21-hydroxylaacutezu (CYP21A2) ktoreacute spocircsobujuacute kongenitaacutelnu adrenaacutelnu hyperplaacuteziu A T G a C predstavujuacute fluorescenčne značeneacute dideoxynukleotidy

Obr 11 Vyacutesledok analyacutezy DNA pacienta metoacutedou minisekvenovania SnaPshot konkreacutetne použitiacutem sady 13 primerov rozlišujuacutecich najčastejšie bodoveacute mutaacutecie geacutenu pre 21-hydroxylaacutezu (CYP21A2) analyacutezou sa zistila mutaacutecia V281L v heterozygotnom stave (dva fragmenty modryacute a červenyacute)

16

Obr 12 SNaPshot analyacuteza geacutenu CYP21A2 u DNA izolovanej z plodovej vody metoacuteda deteguje najčastejšie bodoveacute mutaacutecie geacutenu pre 21-hydroxylaacutezu vyacutesledok prenataacutelnej analyacutezy = priacutetomnosť mutaacutecie In2G v hemizygotnom stave (keďže qPCR metoacutedou bola u plodu zistenaacute priacutetomnosť len jednej koacutepie geacutenu CYP21A2)

33 Kvantitatiacutevna PCR (qPCR)

Polymeraacutezovou reťazovou reakciou (PCR) docielime namnoženie (amplifikaacuteciu) určiteacuteho DNA uacuteseku (templaacutetu) PCR je katalyzovanaacute DNA polymeraacutezou za priacutetomnosti primerov dNTPs dvojmocnyacutech katioacutenov (ako Mg+2) a pufrovacieho roztoku

Real-time PCR ktoraacute je nazyacutevanaacute aj kvantitatiacutevna PCR (qPCR) umožňuje vizualizaacuteciu a kvantifikaacuteciu amplifikaacutecie DNA v reaacutelnom čase to je tak ako to bežiacute počas PCR qPCR využiacuteva fluorescenčneacute chemikaacutelie (farbivaacute) ktoryacutech emitovanuacute fluorescenciu zaznamenaacuteva optickyacute systeacutem počas každeacuteho PCR cyklu zaznamenanaacute fluorescencia je naacutesledne softveacuterovo spracovanaacute a vyhodnotenaacute

V suacutečasnosti sa využiacutevajuacute dva typy qPCR cheacutemie a to farbivaacute viažuce sa na DNA a fluorescenčne značeneacute proacuteby (obr 13)

Farbivaacute viažuce sa na DNA emitujuacute fluorescenciu v priacutepade ak suacute naviazaneacute na dvojvlaacuteknovuacute DNA proacuteby fluoreskujuacute v priacutepade keď molekula zhaacutešača (angl quencher - Q) sa nenachaacutedza v bliacutezkosti molekuly reporteacutera (R) napr hydrolyzujuacutece proacuteby fluoreskujuacute keď je molekula reporteacutera (R) prostredniacutectvom 5acuteexonukleaacutezovej aktivity DNA polymeraacutezy odstraacutenenaacute z bliacutezkosti molekuly zhaacutešača (Q)

Grafickyacute priebeh real ndash time PCR znaacutezorňuje amplifika čnaacute krivka (angl amplification plot) (obr 14) majuacuteca 4 faacutezy 1) Faacuteza I ndash dochaacutedza k zdvojnaacutesobeniu množstva amplikoacutenu po každom cykle ale naacuterast fluorescencie je pod detekčnyacutem limitom zaznamenaacutevanaacute fluorescencia (baseline) zodpovedaacute zaacutekladnej fluorescencii pozadia tzv šumu

17

2) Faacuteza II nazyacutevanaacute aj exponenciaacutelna faacuteza v ktorej sa fluorescencia zvyacuteši na uacuteroveň optickej detekcie bod resp cyklus kedy začiacutena exponenciaacutelna faacuteza je kľuacutečovyacute na určenie kvantity vstupneacuteho množstva templaacutetovej DNA nazyacuteva sa prahovyacute cyklus označuje sa Ct (angl treshold cycle) alebo Cq (quantification) Čiacutem nižšie je Ct (Cq) tyacutem vaumlčšiacute počet koacutepiiacute templaacutetovej DNA bolo v reakcii Ct hodnota je teda hlavnyacute uacutedaj s ktoryacutem sa pracuje vo vyacutepočtoch fluorescencia v tomto mieste sa nazyacuteva prahovaacute resp treshold 3) Faacuteza III - lineaacuterna faacuteza ndash charakterizuje ju postupneacute spotrebovaacutevanie komponentov reakcie na narastajuacutece množstvo amplikoacutenu 4) Faacuteza IV - plateau (čiacutetaj platoacute) ndash množstvo amplikoacutenu sa v docircsledku vyčerpania zložiek qPCR už nezvyšuje

Obr 13 Princiacutep real-time PCR Obr 14 Faacutezy real-time PCR

Ako štandardnaacute PCR aj qPCR maacute tri zaacutekladneacute kroky 1) Denaturaacutecia dvojvlaacuteknovej DNA na jednovlaacuteknovuacute DNA pri vysokej teplote (obyčajne 95degC) 2) Hybridizaacutecia primerov (annealing) ndash komplementaacuterne sekvencie sa spolu hybridizujuacute 3) Polymerizaacutecia pri 70-72degC kedy v docircsledku optimaacutelnej aktivity DNA polymeraacutezy dochaacutedza k predĺženiu primeru až o 100 baacutez za sekundu

18

Real-time PCR (obr 15) sa využiacuteva na kvantifikaacuteciu expresie geacutenov určenie počtu koacutepiiacute geacutenov určenie genotypu (genotypovanie) alelovou diskriminaacuteciou alebo analyacutezou krivky topenia tzv high resolution melt a multiplexnuacute real time PCR s možnosťou detekcie viaceryacutech cieľovgeacutenov

Multiplexnaacute real-time PCR sa využiacuteva na detekciu viaceryacutech cieľovgeacutenov v jednej reakcii suacutečasne Vyacutehodou multiplexovania je jednak uacutespora vzorky ako aj ziacuteskanie vaumlčšieho množstva informaacuteciiacute z rovnakeacuteho množstva materiaacutelu Nevyhnutnosťou multiplexnej qPCR suacute proacuteby značeneacute rocircznymi fluorescenčnyacutemi farbivami

Najdocircležitejšie zložky qPCR (real-time PCR komponenty) suacute DNA polymeraacuteza (reverznaacute transkriptaacuteza v priacutepade jednokrokovej kvantitatiacutevnej RT-PCT) dNTPs primery resp primeryproacuteby dvojmocneacute Mg templaacutet Na uľahčenie qPCR suacute v suacutečasnosti už komerčne dostupneacute takeacute reakčneacute zmesi ku ktoryacutem stačiacute pridať už len templaacutet (napr kity využiacutevajuacutece TaqManProacuteby) alebo kity s fluorescenčnyacutemi farbami viažucimi sa na dvojvlaacuteknovuacute DNA ku ktoryacutem sa do reakčnej zmesi okrem templaacutetu pridajuacute primery

Obr 15 Real-time PCR cykleacuter

331 Kvantifikaacutecia pomocou qPCR

Na kvantifikaacuteciu DNA pomocou qPCR sa požiacutevajuacute dve zaacutekladneacute metoacutedy - absoluacutetna kvantifikaacutecia a relatiacutevna kvantifikaacutecia

Absoluacutetna kvantifikaacutecia vychaacutedza zo štandardnej krivky (obr 16) ktoraacute sa ziacuteska po qPCR seacuterie riedeniacute DNA znaacutemej koncentraacutecie Kvantifikaacutecia neznaacutemej vzorky sa zistiacute interpolaacuteciou (odčiacutetaniacutem) Ct neznaacutemej vzorky zo štandardnej krivky (obr 16 17) Využiacutevaneacute napr v kriminalistike na stanovenie koncentraacutecie DNA vo vzorke

Relatiacutevna kvantifikaacutecia (obr 18 19) porovnaacuteva uacuteroveň expresie určiteacuteho geacutenu vo vzorke k expresii toho isteacuteho geacutenu v referenčnej (kontrolnej) vzorke alebo množstvo určiteacuteho geacutenu (počet koacutepiiacute) vo vzorke porovnaniacutem s množstvom geacutenu v kontrolnyacutech vzorkaacutech V raacutemci každej vzorky musiacute pred relatiacutevnou kvantifikaacuteciou docircjsť k tzv normalizaacutecii t j porovnanie expresie sledovaneacuteho geacutenu k expresii referenčneacuteho geacutenu (najčastejšie niacutem byacuteva tzv bdquohousekeepingldquo geacuten napr GAPDH aktiacuten tubuliacuten)

V priacutepade kvantifikaacutecie expresie určiteacuteho geacutenu metoacutedou real-time PCR (RT-qPCR) pred samotnou kvantifikaacuteciou cDNA musiacute byť taacuteto cDNA nasyntetizovanaacute prostredniacutectvom reverznej

19

transkripcie za použitia enzyacutemu reverznej transkriptaacutezy Kvantitatiacutevna PCR s reverznou transkripciou RT-qPCR mocircže byť dvojkrokovaacute alebo jednokrokovaacute Pri dvojkrokovej RT-qPCR treba pred qPCR syntetizovať cDNA vlaacutekno z RNA pomocou reverznej transkriptaacutezy - 1 krok druhyacutem krokom je samotnaacute real-time PCR Jednokrokovaacute RT-qPCR umožňuje uskutočniť obidve reakcie reverznuacute transkripciu a kvantitatiacutevnu PCR v jednej skuacutemavke čo zjednodušuje qPCR a redukuje možnosť kontaminaacutecie Obr 16 5-bodovaacute štandardnaacute krivka (amplifikaacutecia piatich koncentraacuteciiacute jednej vzorky konkreacutetne ide o 10-tkoveacute riedenie)

Obr 17 Ukaacutežka amplifikačnyacutech kriviek riedenia a z nich ziacuteskanej štandardnej krivky poukazuje na vysokuacute presnosť metoacutedy RT-PCR

20

Obr 18 Relatiacutevna kvantifikaacutecia - určenie počtu koacutepiiacute geacutenu CYP21A2 vo vzorke DNA izolovanej z perifeacuternej krvi pacientov mutaacutecie v geacutene CYP21A2 spocircsobujuacute kongenitaacutelnu adrenaacutelnu hyperplaacuteziu (CAH) Vyacutesledok analyacutezy všetci pacienti majuacute dve koacutepie geacutenu

Obr 19 Relatiacutevna kvantifikaacutecia - určenie počtu koacutepiiacute geacutenu CYP21A2 vo vzorke DNA izolovanej z plodovej vody mutaacutecie v geacutene CYP21A2 spocircsobujuacute kongenitaacutelnu adrenaacutelnu hyperplaacuteziu (CAH) Prenaacutetalnou diagnostikou (qPCR) sa zistila priacutetomnost jednej koacutepie CYP21A2 geacutenu 332 Určenie genotypu metoacutedou alelovej diskriminaacutecie a analyacutezou krivky topenia (HRM)

Určenie genotypu metoacutedou alelovej diskriminaacutecie (obr 20) sa uskutočňuje použitiacutem hydrolyzujuacutecich proacuteb (sond) je veľmi ryacutechla a senzitiacutevna (presnaacute) metoacuteda frekventovane využiacutevanaacute v laboratoacuteriaacutech Dva variantyalely suacute vyšetreneacute suacutečasne v jednej vzorke a v jednej reakčnej

21

skuacutemavke V reakcii suacute použiteacute dve proacuteby označeneacute rozdielnymi fluorescenčnyacutemi farbičkami emitujuacutecimi svetlo o rocircznej vlnovej dĺžke (najčastejšie jedna označenaacute FAM farbičkou a druhaacute proacuteba označenaacute VIC farbičkou) Počas amplifikaacutecie amplikoacutenu dochaacutedza k odstraacuteneniu zhaacutešača z bliacutezkosti farbičky ktoraacute potom emituje svetlo priacuteslušnej vlnovej dĺžky Vzorky so signaacutelom len jednej fluorescenčnej farbičky (FAM) a bez signaacutelu druhej farbičky (VIC) suacute homozygoti pre alelu 1 vzorky so signaacutelom len druhej farbičky (VIC) a bez signaacutelu prvej (FAM) suacute homozygoti pre alelu 2 v priacutepade ak vyšetrovanaacute vzorka bdquosvietildquo obidvoma farbami jednaacute sa o heterozygota

Obr 20 Určenie genotypu metoacutedou alelovej diskriminaacutecie ndash amplifikačnaacute krivka vzoriek DNA majuacutecich tri rocirczne genotypy A ndash jednotliveacute vzorky (plnaacute čiara predstavuje štandardnuacute alelu guličkovanaacute mutovanuacute alelu) B ndash 72 vzoriek C ndash scatter plot 72 vzoriek

Určenie genotypu analyacutezou krivky topenia tzv high resolution melt (HRM) (obr 21) umožňuje detekciu takmer všetkyacutech genetickyacutech variaacuteciiacute (SNP mutaacuteciiacute) Keďže taacuteto metoacuteda okrem štandardnyacutech podmienok reakcie vyžaduje len primery a farbičku (nie proacuteby) je veľmi jednoduchaacute a lacnejšia Po amplifikaacuteciiacute treba amplikoacuten pomaly zohrievať až kyacutem nedocircjde k denaturaacuteciiacute Teplota topenia amplikoacutenu vo vzorke zaacutevisiacute od DNA sekvencie čo umožňuje detegovať priacutetomnosť mutaacutecie resp SNP Tvar vyacuteslednyacutech kriviek topenia určuje teda genotyp

22

Obr 21 Určenie genotypu analyacutezou krivky topenia tzv metoacutedou high resolution melting (HRM) A ndash krivka topenia vzoriek DNA majuacutecich tri rocirczne genotypy B ndash graf rozdielnosti krivky topenia vzoriek DNA majuacutecich tri rocirczne genotypy

23

4 Elektroforetickaacute separaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten

Separaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten predstavuje rozdelenie molekuacutel DNA alebo RNA na zaacuteklade veľkosti zloženia a poradia baacutez Podobnyacutemi metoacutedami je možneacute separovať aj proteiacuteny

Elektroforeacuteza (ELFO) je technika použiacutevanaacute na separaacuteciu niekedy aj purifikaacuteciu makromolekuacutel ako suacute nukleoveacute kyseliny a proteiacuteny na zaacuteklade ich rozdielnej veľkosti naacuteboja alebo konformaacutecie Je to metoacuteda veľmi často využiacutevanaacute nielen v molekulovej genetike ale aj biocheacutemii Elektroforeacuteza využiacuteva schopnosť nabityacutech molekuacutel migrovať v jednosmernom elektrickom poli k opačneacutemu poacutelu Nukleoveacute kyseliny majuacute vďaka svojej fosfaacutetovej zložke negatiacutevny naacuteboj preto v jednosmernom elektrickom poli migrujuacute ku kladneacutemu poacutelu čiže k anoacutede Elektroforeacuteza prebieha v elektroforetickej aparatuacutere v geacuteloch (v nosiči) so sieťovitou štruktuacuterou ktoraacute umožňuje separaacuteciu molekuacutel Vzorka nukleovej kyseliny zmiešanaacute s tzv nanaacutešaciacutem tlmivyacutem roztokom s farbičkou sa nanesie do jamky v geacuteli ktoryacute je umiestnenyacute v elektroforetickej aparatuacutere v priacutetomnosti elektroforetickeacuteho pufra (TAE alebo TBE) (obr 22) Nanaacutešaciacute tlmivyacute roztoknanaacutešacia farbička umožňuje na zaacuteklade migraacutecie farbičky vidieť migraacuteciu vzorky v geacuteli a suacutečasne zvyacutešeniacutem hustoty vo vzorke umožniacute klesnuacuteť vzorke do jamky a tak zabraacuteniť jej vyplaveniu z geacutelu Draacuteha je časť geacutelu ktoryacutem putuje jedna vzorka od katoacutedy k anoacutede V draacutehe sa nachaacutedzajuacute oddeleneacute jednotliveacute fragmenty nukleovyacutech kyseliacuten určityacutech veľkostiacute viditeľneacute vo forme pruacutežkov (angl bands) Intenzita pruacutežku zaacutevisiacute od množstva molekuacutel danej veľkosti je ekvivalentnaacute hmotnosti Na určenie veľkosti fragmentov NK sa do jednej jamky nanesie štandard molekulovyacutech hmotnostiacute (angl ladder) ktoryacute maacute presne definovaneacute veľkosti fragmentov čo umožňuje odhadnuacuteť veľkosť aj hmotnosť neznaacutemych separovanyacutech fragmentov

Obr 22 Elektroforetickaacute separaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten v agaroacutezovom geacuteli (A) a vizualizaacutecia UV svetlom a GelRedtrade (B C)

24

Nukleoveacute kyseliny je možneacute elektroforeticky separovať 1) v geacuteloch agaroacutezovom (horizontaacutelna elektroforeacuteza) (obr 22) a polyakrylamidovom (vertikaacutelna elektroforeacuteza) 2) v špeciaacutelnych lineaacuternych polymeacuteroch kapilaacuternou elektroforeacutezou použitiacutem genetickeacuteho analyzaacutetora (obr 23)

Agaroacuteza je polysacharid ziacuteskanyacute z morskej riasy použiacuteva sa najčastejšie v koncentraacuteciiacute 05-2 čiacutem vyššia koncentraacutecia tyacutem je geacutel pevnejšiacute a schopnejšiacute rozliacutešiť menšie fragmenty NK Priacuteprava je jednoduchaacute odvaacuteži sa potrebneacute množstvo agaroacutezy ktoraacute sa zmieša s tlmivyacutem roztokom (pufrom) rozvariacute sa v mikrovlnnej ruacutere a naleje sa do špeciaacutelnej naacutedoby na vytvaacuteranie geacutelov kyacutem je geacutel tekutyacute vložiacute sa do neho tzv hrebeň na vytvorenie jamiek Agaroacuteza je netoxickaacute V bežnom agaroacutezovom geacuteli v zaacutevislosti od jeho koncentraacutecie je možneacute separovať DNA fragmenty dĺžky 200-50 000 bp Dnes suacute dostupneacute aj špeciaacutelne agaroacutezy napr MetaPhorreg Agarose schopneacute oddeliť fragment DNA dĺžky 20-800bp Separaacutecia v agaroacutezovom geacuteli prebieha v horizontaacutelnej aparatuacutere preto sa nazyacuteva aj horizontaacutelna elektroforeacuteza

Polyakrylamidovyacute geacutel (PAGE) vznikaacute polymerizaacuteciou akrylamidu v priacutetomnosti špeciaacutelnych chemickyacutech laacutetok (peroxodisiacuteran amoacutenny TEMED bisakrylamid) Jeho priacuteprava je preto odlišnaacute a aj naacuteročnejšia Polyakrylamidoveacute geacutely majuacute vysokuacute rozlišovaciu schopnosť (1bp) preto suacute PAGE geacutely vhodneacute aj na sekvenovanie DNA klasickyacutemi metoacutedami PAGE geacutel nie je vhodnyacute na separaacuteciu fragmentov dlhšiacutech ako 2kb Použiacuteva sa v koncentraacutecii 35 -20 s rozliacutešeniacutem fragmentov od 10bp-2000bp Akrylamid je neurotoxiacuten musiacute sa s niacutem pracovať veľmi opatrne PAGE elektroforeacuteza bežiacute vo vertikaacutelnej aparatuacutere preto sa volaacute aj vertikaacutelna elektroforeacuteza použiacuteva sa často aj na separaacuteciu proteiacutenov

Ryacutechlosť pohybu nukleovyacutech kyseliacuten (mobilita) určuje viacero faktorov 1) veľkosť NK ndash počet baacutezovyacutech paacuterov resp baacutez pričom menšie molekuly prechaacutedzajuacute geacutelom ryacutechlejšie pretože sa ľahšie pohybujuacute v geacuteli 2) konformaacutecia nukleovej kyseliny napr u rovnako veľkyacutech plazmidov kondenzovaneacute superšpiralizovaneacute plazmidy migrujuacute najryacutechlejšie rovnako veľkeacute lineaacuterne molekuly (toho isteacuteho plazmidu) bežia pomalšie a najpomalšie putujuacute relaxovaneacute kruhoveacute molekuly plazmidu 3) koncentraacutecia geacutelu určuje jeho rozlišovaciu schopnosť koncentrovanejšiacute geacutel je schopnyacute separovať kratšie fragmenty NK redšie geacutely suacute vhodneacute pre rozliacutešenie vaumlčšiacutech fragmentov 4) zloženie geacutelu je docircležiteacute pri analyacuteze sekundaacuternych štruktuacuter NK a proteiacutenov v nedenaturovanom stave sekundaacuterna štruktuacutera spomaľuje migraacuteciu NK a proteiacutenov Tento fakt využiacutevajuacute niektoreacute diagnostickeacute techniky (napr SSCP - Single Strand Conformation Polymorphism - polymorfismus konformaacutecie jednovlaacuteknovej DNA) umožňujuacutece detekciu zaacutemeny jedinej baacutezy ktoraacute spocircsobiacute odlišneacute vnuacutetromolekuloveacute paacuterovanie a vyacuteslednuacute konformaacuteciu molekuly Geacutely mocircžu teda byť denaturačneacute a nedenaturačneacute (natiacutevne) 5) napaumltie zdroja - čiacutem vyššie je napaumltie ktoreacute vytvaacutera elektrickeacute pole v elektroforetickej aparatuacutere tyacutem ryacutechlejšie fragmenty NK migrujuacute 6) zloženie roztokov a teploty

Elektroforetickyacute tlmivyacute roztok (pufor - elektrolyt) zabezpečuje stabilneacute elektroforetickeacute podmienky počas separaacutecie geacutel je v ňom ponorenyacute Obsahuje ioacuteny čo umožňuje vedenie elektrickeacuteho pruacutedu

Štandard molekulovyacutech hmotnostiacute (v laboratoacuteriaacutech nazyacutevanyacute ladder alebo marker) je zmes fragmentov DNA alebo RNA s presne definovanou veľkosťou ktoryacute sluacuteži na odhad veľkosti vyšetrovanyacutech fragmentov NK (obr 22) Pomocou špeciaacutelnych štandardov molekulovyacutech hmotnostiacute ktoryacutech fragmenty NK majuacute definovanuacute aj hmotnosť je možneacute odhadnuacuteť množstvo (hmotnosť - koncentraacuteciu) neznaacutemeho fragmentu

B C

25

41 Vizualizaacutecia DNA

Samotnaacute nukleovaacute kyselina je počas elektroforetickej separaacutecie neviditeľnaacute Vizualizaacuteciu NK umožňujuacute interkalačneacute činidlaacute ktoreacute suacute schopneacute naviazať sa na molekuly NK tyacutem že sa včlenia medzi susediace baacutezy Po ožiareniacute UV svetlom interkalačneacute činidlaacute naviazaneacute na NK fluoreskujuacute tak sa vizualizuje NK čiacutem intenziacutevnejšie fluoreskuje tyacutem viac NK je v geacutelipruacutežku priacutetomneacute Interkalačneacute činidlo sa buď primieša do geacutelu pri jeho priacuteprave čo umožniacute sledovať migraacuteciu fragmentov NK počas elektroforeacutezy a to po vybratiacute z ELFO aparatuacutery a po ožiareniacute UV svetlom alebo sa geacutel farbiacute po elektroforetickej separaacutecii V minulosti bol na zviditeľnenie NK najčastejšie použiacutevanyacute etidiumbromid kvocircli jeho mutageacutennym vlastnostiam sa v suacutečasnosti nahraacutedza menej mutageacutennymi a netoxickyacutemi činidlami ako suacute napr komerčne dostupneacute SYBRregSafe GelRedtrade GelGreentrade

Kapilaacuterna elektroforeacuteza NK prebieha v špeciaacutelnom priacutestroji genetickom analyzaacutetore (obr 23) ktoryacute musiacute mať zaacutekladneacute komponenty ako suacute elektroacutedy kapilaacutera zdroj vysokeacuteho napaumltia detektor prepojenie s počiacutetačom a softveacuteroveacute vybavenie priestor na vloženie vzoriek atď Genetickyacute analyzaacutetor predstavuje automatizovanyacute systeacutem umožňujuacuteci sekvenovanie určovanie dĺžky DNA fragmentov ndash fragmentačnuacute analyacutezu a kvantifikaacuteciu nukleovyacutech kyseliacuten V novšiacutech typoch genetickeacuteho analyzaacutetora je proces analyacutezy od vloženia vzoriek do stojana automatizovanyacute

Vzorka určenaacute na analyacutezu je elektrokineticky injektovanaacute do tenkej kapilaacutery naplnenej lineaacuternym polymeacuterom Vplyvom vysokeacuteho napaumltia sa negatiacutevne nabiteacute fragmenty DNA pohybujuacute v polymeacuteri k pozitiacutevne nabitej elektroacutede Kapilaacuterna elektroforeacuteza je tak citlivaacute že je schopnaacute detegovať jednobaacutezovyacute rozdiel DNA fragmentov DNA fragmenty musia byť pred kapilaacuternou elektroforeacutezou fluorescenčne označeneacute v kapilaacutere suacute separovaneacute na zaacuteklade veľkosti Kraacutetko pred dosiahnutiacutem kladne nabitej elektroacutedy docircjde po excitaacutecii laserovyacutem žiareniacutem k emisii žiarenia fluoroformi (farbičkami) tak že optickyacute detekčnyacute systeacutem zaznamenaacute fluorescenciu ktoraacute je naacutesledne softveacuterovo spracovanaacute a vyhodnotenaacute

Obr 23 Genetickyacute analyzaacutetor

42 RFLP

Metoacuteda polymorfizmu dĺžky restrik čnyacutech fragmentov (angl Restriction Fragment Length Polymorfism) bola prvou metoacutedou využiacutevanou na detekciu DNA variaacuteciiacute rocircznych biologickyacutech vzoriek Princiacutep metoacutedy spočiacuteva v priacutetomnosti polymorfizmov v DNA sekvencii rocircznych ľudiacute ktoreacute zapriacutečinia rozdielny profil (obrazec) DNA fragmentov po štiepeniacute jednou alebo viaceryacutemi restrikčnyacutemi endonukleaacutezami Restrikčneacute endonukleaacutezy (RE) suacute enzyacutemy ktoreacute štiepia DNA molekulu v oblasti špecifickej nukleotidovej sekvencie nazyacutevanej restrik čneacute miesto RE najčastejšie rozpoznaacutevajuacute a štiepia miesto veľkeacute 4-6 baacutez RE suacute priacutetomneacute u prokaryotov (bakteacuterie a archebakteacuterie) kde suacute suacutečasťou restrik čno-modifikačneacuteho systeacutemu akoby prokaryotickeacutej vrodenej imunity sluacutežia

26

na ochranu pred cudzou DNA (napr viacuterusovou) ktoruacute po rozpoznaniacute špecifickej sekvencie štiepia

Restrikčno-modifikačnyacute systeacutem maacute dve zložky 1) modifikačneacute enzyacutemy - metylaacutezy ktoreacute procesom metylaacutecie modifikujuacute určiteacute baacutezy svojej DNA čiacutem ich označia za vlastnuacute DNA takže takaacuteto DNA je potom rezistentnaacute voči štiepeniu restrikčnyacutemi endonukleaacutezami Najčastejšiacutem spocircsobom metylaacutecie u bakteacuteriiacute je metylaacutecia adeniacutenu na N6 pričom vznikne metyladeniacuten alebo cytoziacutenu na C5 metylcytoziacuten 2) restrikčneacute endonukleaacutezy štiepia špecifickeacute miesto dvojvlaacuteknovej DNA ktoreacute je tvoreneacute symetrickou sekvenciou zrkadlovo sa opakujuacutecich nukleotidov ndash tzv palindroacutem Restrikčneacute enzyacutemy sa použiacutevajuacute na štiepenie DNA sekvencie na mieste špecifickom pre tuacute ktoruacute restrikčnuacute endonukleaacutezu napr pri analyacuteze polymorfizmov dĺžky restrikčnyacutech fragmentov (RFLP) analyacuteze jednonukleotidovyacutech polymorfizmov (SNP) mutaacuteciiacute ako aj pri klonovaniacute DNA do vhodnyacutech vektorovyacutech DNA molekuacutel

Po štiepeniacute dvojvlaacuteknovej DNA restrikčnou endonukleaacutezou mocircžu vzniknuacuteť tri typy koncov - 5´-prečnievajuacutece konce (lepiveacute) 3´-prečnievajuacutece konce (lepiveacute) a tupeacute konce (obr 24)

Obr 24 Restrikčneacute štiepenie zanechaacutevajuacutece rocirczne konce tupeacute a lepiveacute

Restrikčneacute štiepenie je často použiacutevanou metoacutedou geacutenovyacutech manipulaacuteciiacute na konštrukciu

hybridnyacutech molekuacutel DNA s naacuteslednyacutem klonovaniacutem Priebeh RFLP analyacutezy je nasledovnyacute restrikčnaacute endonukleaacuteza sa pridaacute k DNA a zmes sa vo

vhodnyacutech reakčnyacutech podmienkach (pufor teplota) inkubuje niekoľko hodiacuten Počas inkubaacutecie docircjde k štiepeniu DNA na špecifickyacutech miestach DNA je potom elektroforeticky separovanaacute v geacuteli a naacutesledne vizualizovanaacute V minulosti po geacutelovej elektroforeacuteze nasledoval Southern blot (čiže prenos separovanyacutech fragmentov DNA z geacutelu na špeciaacutelnu membraacutenu) (obr 35) po ktorom nastala vizualizaacutecia raacutedioaktiacutevne značenou proacutebou V suacutečasnosti sa kvocircli praacutecnosti a zdravotnyacutem rizikaacutem od Southern blotu upuacutešťa a prechaacutedza sa na ryacutechlejšie menej praacutecne a zdravotne šetrnejšie metoacutedy priateľskejšie aj k životneacutemu prostrediu

RFLP bola prvou metoacutedou použiacutevanou na zistenie DNA profilu (DNA fingerprinting) mapovanie geacutenov zapriacutečiňujuacutece genetickeacute ochorenia a testovanie otcovstva Vaumlčšina RFLP markerov je vysoko lokusovo špecifickyacutech a kodominantnyacutech (obidve alely suacute detekovaneacute u heterozygota)

PCR-RFLP je laboratoacuterne priacutestupnejšia metoacuteda molekulaacuterno-genetickej diagnostiky keďže PCR umožňuje amplifikaacuteciu veľmi malyacutech množstiev DNA Alternatiacutevny naacutezov použiacutevanyacute v literatuacutere je CAPS z angl Cleaved Amplified Polymorphic Sequence assay Použitiacutem špecifickyacutech primerov docircjde PCR metoacutedou k amplifikaacutecii požadovaneacuteho uacuteseku DNA ten sa potom štiepi restrikčnou endonukleaacutezou vo vhodnyacutech podmienkach naacutesledne sa štiepne produkty elektroforeticky separujuacute a vizualizujuacute použitiacutem interkalačnyacutech farbiacutev a UV svetla (obr 25)

27

Obr 25 Princiacutep metoacutedy PCR-RFLP

43 VNTR a STR V geacutenome suacute priacutetomneacute dva typy tandemovyacutech (za sebou nasledujuacutecich) opakovaniacute

1) minisatelity ndash nazyacutevaneacute variabilnyacute počet tandemovyacutech opakovaniacute VNTR (variable number of tandem repeats) 2) mikrosatelity tiež kraacutetke tandemoveacute repetiacutecie STR (short tandem repeats)

Obidva tieto typy satelitnej DNA suacute rozmiestneneacute po celom genoacuteme suacute využiacutevaneacute hlavne vo forenznej genetike na identifikaacuteciu osocircb a určenie otcovstva popriacutepade materstva ale aj v mediciacutene na detekciu chromozoacutemovyacutech aneuploidiiacute Štruktuacutera obidvoch je podobnaacute Rozdiel medzi jednotlivyacutemi alelami je spocircsobenyacute rozdielnym počtom opakovaniacute opakujuacutecej sa sekvencie (motiacutevu) čo spocircsobiacute rocircznu dĺžku alel s rocircznym počtom tandemovyacutech opakovaniacute nazyacutevanuacute polymorfizmus dĺžky fragmentov

VNTR ndash variabilnyacute počet tandemovyacutech opakovaniacute pričom opakujuacuteca sa sekvencia maacute dĺžku od 6 do 100 baacutez pričom sa mocircže opakovať aj tisiacutece kraacutet alely tak mocircžu mať od 500do 30 000 baacutez VNTR boli v kombinaacutecii s RFLP (DNA fingerprinting ) prvyacutem polymorfizmom použiacutevanyacutem na zistenie DNA profilov a identifikaacuteciu osocircb v kriminalistickej praxi V suacutečasnosti jeho využitie v kriminalistike je kvocircli potrebe relatiacutevne veľkeacuteho množstva DNA nahradeneacute využitiacutem STR

STR - kraacutetke tandemoveacute repetiacutecie suacute v kriminalistike najčastejšie použiacutevanyacutem polymorfizmom STR lokusy suacute rozmiestneneacute po celom genoacuteme repetiacutecia obsahuje jednu až šesť baacutez pričom jej opakovaniacutem vznikne STR v rozsahu od 50 do 300bp V našom genoacuteme suacute tisiacutece STR ktoreacute mocircžu byť použiteacute pre forenznuacute analyacutezu V kriminalistike sa v suacutečasnosti na identifikaacuteciu osocircb použiacuteva 13 STR locusov ktoreacute patria k medzinaacuterodne uznaacutevanyacutem štandardom Z iniciatiacutevy FBI bola vytvorenaacute databaacuteza CODIS (Combined DNA Index System) každaacute krajina maacute svoju databaacutezu CODIS kde je možneacute vložiť a archivovať DNA profily jednotlivcov ako aj profily DNA ziacuteskanyacutech z miest kriminaacutelneho činu v databaacuteze je ich možneacute navzaacutejom porovnať a tak zistiť pocircvodcu trestneacuteho činu Medzinaacuterodnaacute jednotnosť v použiacutevaniacute CODIS STR lokusov umožňuje v priacutepade potreby vzaacutejomneacute porovnanie DNA profilov zistenyacutech na uacutezemiacute rocircznych štaacutetov CODIS STR lokusov je 13 a suacute to CSF1PO FGA TH01 TPOX VWA D3S1358 D5S818 D7S820 D8S1179 D13S317 D16S539 D18S51 a D21S11 Zistenie DNA profilu sa uskutočniacute multiplexnou PCR reakciou s fluorescenčne značenyacutemi primermi špecifickyacutemi pre konkreacutetny STR Naacutesledne suacute PCR produkty analyzovaneacute kapilaacuternou elektroforeacutezou genetickyacutem analyzaacutetorom ktoryacute rozliacuteši amplifikovaneacute fragmenty na zaacuteklade fluorescencie a dĺžky (fragmentačnaacute analyacuteza) (obr 26 Tab 3) DNA profil každeacuteho človeka je jedinečnyacute rovnakyacute profil mocircžu mať len jednovaječneacute dvojčataacute

28

Obr 26 Ukaacutežka DNA profilu človeka 15 STR lokusov s určeniacutem pohlavia pomocou lokusu pre amelogeniacuten (ženskeacute pohlavie - XX) maleacute oranžoveacute piacuteky predstavujuacute fragmenty veľkostneacuteho štandardu Tabuľka č 3 Zaacutepis DNA profilu človeka z obraacutezka č 26 15 STR lokusov s určeniacutem pohlavia pomocou lokusu pre amelogeniacuten System Alela 1 Alela 2

D3S1358 16 17

TH01 9 93 D21S11 28 28

D18S51 15 18

Penta E 7 14 D5S818 9 12

D13S317 8 11

D7S820 8 11 D16S539 11 12

CSF1PO 10 11

Penta D 11 12 vWA 15 18

D8S1179 13 16

TPOX 8 9 FGA 20 21

amel X X

29

5 MLPA

Multiplexnaacute amplifikaacutecia proacuteb zaacutevislaacute od ligaacutecie (z angl multiplex ligation-dependent probe amplification) je metoacuteda schopnaacute v jednej reakcii (v jednej skuacutemavke a vzorke) detegovať zmeny v počte až 50 nukleotidovyacutech sekvenciiacute Metoacutedou MLPA je možneacute ryacutechlo identifikovať amplifikaacutecie (duplikaacutecie) a deleacutecie veľkeacuteho počtu geacutenov či už použitiacutem DNA alebo mRNA krvnyacutech vzoriek alebo vzoriek z naacutedorov

Princiacutep MLPA spočiacuteva v multiplexnej amplifikaacutecii 50 špecifickyacutech nukleotidovyacutech sekvenciiacute použitiacutem jedneacuteho paacuteru primerov pričom jeden primer je fluorescenčne označenyacute Vyacutesledneacute PCR produkty suacute analyzovaneacute kapilaacuternou elektroforeacutezou (fragmentačnaacute analyacuteza) Dĺžka každeacuteho namnoženeacuteho produktu je jedinečnaacute narastaacute postupne o 6 alebo 9 nukleotidov pričom produkty PCR suacute 120 ndash 500 nukleotidov dlheacute Tento veľkostnyacute rozsah PCR fragmentov (dĺžka 120-500 nukleotidov s naacuterastom postupne o 6 alebo 9 nukleotidov) je optimaacutelny pre kapilaacuternu elektroforeacutezu MLPA multiplexnaacute PCR prebieha za použitia iba jedineacuteho paacuteru primerov ktoreacute amplifikujuacute špecifickeacute sekvencie Trik spočiacuteva v tom že nedochaacutedza k amplifikaacutecii DNA sekvencie ale MLPA proacuteb ktoreacute suacute pridaneacute k vzorkaacutem Každaacute MLPA proacuteba pozostaacuteva z dvoch oligonukleotidov (dve hemiproacuteby) pričom každyacute oligonukleotid obsahuje jednu zo sekvencie rozpoznaacutevanuacute PCR primermi Proacuteba vznikne jedine za predpokladu hybridizaacutecie dvoch oligonukleotidov (hemiproacuteb) k cieľovej sekvencii (geacutenu) a po ligaacutecii enzyacutemom ligaacutezou Iba ligovaneacute proacuteby suacute exponenciaacutelne amplifikovaneacute pomocou jedneacuteho paacuteru primerov Množstvo zligovanyacutech proacuteb teda zaacutevisiacute od množstva cieľovyacutech sekvenciiacute (geacutenov) vo vzorke

Postup MLPA analyacutezy je nasledovnyacute (obr27) K vzorke nukleovej kyseliny (DNA resp mRNA) sa pridaacute zmes 50 jedinečnyacutech proacuteb každaacute

proacuteba je komplementaacuterna k určitej cieľovej sekvencii NK vzorky Každaacute proacuteba však pozostaacuteva z dvoch oligonukleotidov hybridizujuacutecich vedľa seba zaacuteroveň každyacute oligonukleotid (hemiproacuteba) obsahuje pridanuacute sekvenciu rozpoznaacutevanuacute paacuterom PCR primerov Po hybridizaacuteciiacute oligonukleotidov (hemiproacuteb) dochaacutedza k ich ligaacutecii ligaacutezou Ligačnaacute reakcia je tak špecifickaacute že je schopnaacute rozliacutešiť sekvenciu liacutešiacu sa v jednom nukleotide Vyacuteslednyacute ligačnyacute produkt (proacuteba) obsahuje obidve sekvencie pre PCR primery na jednom fragmente čiže mocircže docircjsť k namnoženiu takeacutehoto fragmentu PCR reakciou V priacutepade ak nedocircjde k ligaacutecii priacuteslušnyacutech hemiproacuteb pretože hemiproacuteby nenaacutejdu cieľovuacute sekvenciu na DNA každaacute takaacuteto nezligovanaacute hemiproacuteba maacute len jednu sekvenciu rozpoznaacutevanuacute len jednyacutem PCR primerom v docircsledku čoho nemocircže prebehnuacuteť jej PCR amplifikaacutecia a počas fragmentačnej analyacutezy nie je detegovanaacute pretože negeneruje fluorescenčnyacute signaacutel

Pri MLPA analyacuteze je docircležiteacute okrem MLPA amplifikaacutecie vzorky urobiť aj MLPA amplifikaacuteciu referenčnej vzorky ku ktorej sa bude porovnaacutevať počet geacutenov (cieľovyacutech sekvenciiacute) Po kapilaacuternej elektroforeacuteze MLPA referenčnej a skuacutemanej vzorky porovnaniacutem obsahu nameranyacutech hodnocirct tzv piacutekov priacuteslušnyacutech proacuteb sa určiacute relatiacutevny počet koacutepiiacute v skuacutemanej vzorke

MLPA

1 DNA denaturaacutecia a hybridizaacutecia s MLPA proacutebami (hemiproacuteby)

2 Ligaacutecia (vytvorenie kompletnyacutech proacuteb)

3 PCR amplifikaacutecia proacuteb paacuterom primerov

4 Kapilaacuterna elektroforetickaacute separaacutecia PCR produktov

5 Analyacuteza daacutet

30

Obr 27 Princiacutep MLPA

Firma MRC-Holland v suacutečasnosti ponuacuteka stovky MLPA setov proacuteb ktoreacute suacute vhodneacute na 1) diagnostiku kongenitaacutelnych a dedičnyacutech ochoreniacute 2) zisťovanie profilu naacutedorov 3) zisťovanie metylačneacuteho profilu

MLPA je metoacuteda vhodnaacute na detekciu malyacutech prestavieb (BRCA1 BRCA2 MSH2 atď)

veľkyacutech chromozoacutemovyacutech prestavieb (Williamsov syndroacutem Prader-WilliAngelman syndroacutem atzď)

31

detekciu zmien v počte koacutepii geacutenov (obr 28 29) ako aj zistenie počtu kompletnyacutech chromozoacutemov (chromozoacutem 13 18 21 XY tiež aj z amniovej tekutiny) diagnostiku naacutedorov (zmeny počtu pri ALL CLL atď) kvantifikaacuteciu metylaacutecie (Prader-WilliAngelmanov syndroacutem Fragilnyacute X inaktivaacutecia naacutedorovyacutech supresorovyacutech geacutenov atď) mRNA analyacutezu geacutenov zuacutečastňujuacutecich sa apoptoacutezy alebo zaacutepalov

MS-MLPA (Methylation-Specific MLPA) je varianta MLPA určenaacute špeciaacutelne na analyacutezu aberantnyacutech metylaacutecii imprintovanyacutech oblastiacute ako aj detekciu metylačnyacutech zmien CpG ostrovčekov lokalizovanyacutech bliacutezko promoacutetora Rozdiel oproti štandardnej MLPA spočiacuteva v použitiacute metylačne senzitiacutevneho restrikčneacuteho enzyacutemu HhaI ktoryacute štiepi MS-MLPA proacuteby hybridizovaneacute k nemetylovanej sekvencii Každaacute DNA vzorka určenaacute pre MS-MLPA analyacutezu prejde dvoma reakciami v jednej mikroskuacutemavke štandardnou MLPA analyacutezou (bez štiepenia metylačne senzitiacutevnym enzyacutemom) a v druhej mikroskuacutemavke docircjde okrem ligaacutecie proacuteb aj k metylačne senzitiacutevnemu štiepeniu hybridizovanyacutech proacuteb s nemetylovanou DNA Amplifikujuacute sa len ligovaneacute proacuteby po PCR amplifikaacutecii sa fragmentačnou analyacutezou porovnaniacutem oboch reakciiacute zistia rozdiely v metylačnom profile vzorky k referenčnej vzorke

RT-MLPA (Reverse Transkriptase MLPA) je variaacutecia MLPA určenaacute pre zistenie mRNA profilu vzorky je alternatiacutevou k real-time PCR a mikročipom RT-MLPA nedeteguje mRNA množstvo priamo pretože použiacutevanaacute ligaacuteza nie je schopnaacute ligovať DNA oligonukleotidy keď suacute hybridizovaneacute s RNA Preto RT-MLPA začiacutena reverznou transkripciou so špeciaacutelne navrhnutyacutemi RT primermi tak aby vytvorili kraacutetke oligonukleotidy (cDNA) Potom reakcia pokračuje ako štandardnaacute MLPA

Obr 28 MLPA analyacuteza geacutenu DMD (koacutedujuacuteceho dystrofiacuten) mutaacutecie ktoreacuteho spocircsobujuacute Duchennovu svalovuacute dystrofiu u pacienta je priacutetomnaacute deleacutecia exoacutenu 45 v porovnaniacute s referenčnou vzorkou ndash kontrolou

32

Obr 29 MLPA analyacuteza geacutenu DMD (koacutedujuacuteceho dystrofiacuten) mutaacutecie ktoreacuteho spocircsobujuacute Duchennovu svalovuacute dystrofiu u pacienta suacute priacutetomneacute duplikaacutecie exoacutenov 41 42 43 44 45 (piacuteky vo vzorke pacienta sa porovnajuacute s piacutekmi v kontrole ndash referenčnej vzorke)

33

6 Sekvenovanie

Sekvenovaniacutem rozumieme určenie primaacuternej štruktuacutery DNA teda určenie poradia nukleotidov v reťazci DNA Začiatky moderneacuteho sekvenovania siahajuacute do roku 1977 kedy boli objaveneacute dve metoacutedy sekvenovania 1) chemickaacute metoacuteda Maxama a Gilberta 2) enzymatickaacute metoacuteda Sangera Nicklena a Coulsona

Princiacutep obidvoch metoacuted sekvenovania spočiacuteva v tom že sa vytvoriacute suacutebor DNA molekuacutel s rocircznou veľkosťou ktoreacute suacute zakončeneacute konkreacutetnym nukleotidom tieto DNA molekuly sa elektroforeticky separujuacute v geacuteloch s rozlišovacou schopnosťou 1 nukleotid 61 Chemickaacute metoacuteda

DNA molekuly sa na 5-konci raacutedioaktiacutevne označia raacutedioaktiacutevnym fosforom a naacutesledne sa chemicky modifikujuacute špecificky pre každuacute baacutezu DNA sa potom v modifikovanyacutech miestach štiepi čiacutem vzniknuacute rocirczne dlheacute fragmenty pričom podmienky suacute nastaveneacute tak aby sa DNA na každom mieste štiepila len raz Modifikaacutecia DNA a štiepenie prebehne v štyroch separaacutetnych reakciaacutech (skuacutemavkaacutech) takže po elektroforetickej separaacuteciiacute takto opracovanej DNA v štyroch draacutehach polyakrylamidoveacuteho geacutelu a naacuteslednej autoraacutediografii (podobne ako pri Southernovej hybridizaacutecii) je možneacute odčiacutetať nukleotidovuacute sekvenciu približne 100 nukleotidov od raacutedioaktiacutevneho označenia (v čase objavu Maxama a Gilberta) 62 Sangerova metoacuteda

Zaacuteklady metoacutedy boli popiacutesaneacute už v roku 1975 (metoacuteda plus a miacutenus) ale až vylepšenie použitiacutem dideoxynukleotidov (ddNTP) v roku 1977 došlo k zjednodušeniu sekvenovania Princiacutepom enzyacutemoveacuteho sekvenovania je terminaacutecia (zastavenie) polymerizaacutecie inkorporaacuteciou 2´ 3 -dideoxynukleotidov do novosyntetizujuacuteceho sa vlaacutekna DNA Keďže ddNTP neobsahujuacute hydroxylovuacute skupinu na 3 uhliacuteku riboacutezy nemocircžu sa zuacutečastniť na tvorbe fosfodiesterovej vaumlzby nemocircže sa pripojiť k nim ďalšiacute nukleotid čiže musiacute docircjsť k terminaacuteciiacute polymeraacutecie Reakcia prebieha v štyroch skuacutemavkaacutech s raacutedioaktiacutevne značenyacutem primerom V každej skuacutemavke suacute priacutetomneacute všetky štyri deoxynukleotidtrifosfaacutety (dNTP) ale pre každuacute skuacutemavku je špecifickyacute priacutedavok maleacuteho množstva jedneacuteho z dideoxynukleotidtrifosfaacutetov (v prvej skuacutemavke je ddATP v druhej ddCTP v tretej ddTTP a vo štvrtej ddGTP) Maleacute množstvo ddNTP spocircsobiacute že pri polymerizaacutecii dochaacutedza k prednostneacutemu zaradeniu štandardnyacutech dNTP do narastajuacuteceho reťazca a len občas sa inkorporuje ddNTP čiacutem sa zastaviacute synteacuteza reťazca V každej skuacutemavke tak vznikne suacutebor DNA fragmentov rocircznych veľkostiacute zakončenyacutech priacuteslušnyacutem ddNTP (v prvej skuacutemavke ddATP v druhej ddCTP v tretej ddTTP a vo štvrtej ddGTP) Po elektroforetickej separaacutecii v 4 draacutehach polyakrylamidoveacuteho geacutelu a autoraacutediografii sa z autoraacutediogramu odčiacuteta sekvencia

V suacutečasnosti je sekvenovanie do značnej miery automatizovaneacute pričom využiacuteva princiacutep Sangerovej enzyacutemovej metoacutedy s určityacutemi obmenami Uacutesek DNA ktoryacute treba sekvenovať sa prostredniacutectvom termostabilnyacutech DNA polymeraacutez namnožiacute PCR metoacutedou po ktorej nasleduje sekvenačnaacute reakcia (asymetrickaacute PCR) s fluorescenčne značenyacutemi ddNTP (každyacute druh označenyacute inyacutem fluorescenčnyacutem farbivom) Sekvenačnaacute reakcia prebieha v jednej skuacutemavke s jednyacutem primerom vznikne tak suacutebor jednovlaacuteknovyacutech DNA rocircznej dĺžky ktoreacute suacute na 3konci označeneacute ddNTP so špecifickyacutem fluorescenčnyacutem farbivom Taacuteto metoacuteda sekvenovania sa tiež nazyacuteva rdquodye-terminator cycle sequencingrdquo(obr 30) Po kapilaacuternej elektroforeacuteze vzorky v genetickom analyzaacutetore zaznamenaacutevaniacute fluorescencie jednotlivyacutech fragmentov CCD kamerou a softveacuterovom spracovaniacute sa ziacuteska sekvencia DNA (obr 31)

34

Obr 30 Princiacutep sekvenovania Sangerova dideoxy metoacuteda alebo tzv chain termination method (reťazec zastavujuacuteca metoacuteda) Obr 31 Určenie genotypu plodu a rodičov sekvenčnou analyacutezou DNA ziacuteskanej z plodovej vody (prenataacutelna diagnostika) a perifeacuternej krvi sekvenčnaacute analyacuteza geacutenu ASPA vyacutesledok u plodu priacutetomnaacute mutaacutecia c 914CgtA v homozygotnom stave (AA) rodičia heterozygoti (AC) Uvedenaacute mutaacutecia je v homozygotnom stave kauzaacutelnou priacutečinou Canavanovej choroby

Automatizovaneacute sekvenovanie prinaacuteša viacereacute vyacutehody oproti klasickej Sangerovej metoacutede vyššiu presnosť a ryacutechlosť v jednej sekvenačnej reakcii možnosť osekvenovať až 1200 nukleotidovyacute fragment maleacute množstvo templaacutetu potrebneacute na analyacutezu

35

63 Next Generation Sequencing (NGS)

NGS (sekvenovanie novej generaacutecie) maacute obrovskyacute potenciaacutel v analyacuteze genoacutemov pričom toto označenie zahŕňa viacereacute technologickeacute metoacutedy reprezentovaneacute niekoľkyacutemi firmami Princiacutepom je masiacutevne paralelneacute sekvenovanie čiacutem sa ziacuteskajuacute raacutedovo tisiacutece až milioacuteny sekvenciiacute naraz 631 Sekvenovanie druhej generaacutecie

Na začiatku sa analyzovanaacute DNA vo vaumlčšine priacutepadov fragmentuje (vznikne tak DNA

knižnica) na fragmenty sa pripoja kraacutetke sekvencie ndash adapteacutery naacutesledne sa tieto fragmenty rocircznymi priacutestupmi amplifikujuacute a určiacute sa ich sekvencia Vďaka čiastočnyacutem prekryvom je zo ziacuteskanyacutech sekvencii možneacute poskladať plynuluacute sekvenciu zodpovedajuacutecu pocircvodnej nefragmentovanej DNA

Pyrosekvenovanie je podobne ako Sangerova metoacuteda založenaacute na princiacutepe synteacutezy komplementaacuterneho vlaacutekna DNA avšak rozdiel je v tom že sa na detekciu inkorporaacutecie nukleotidu využiacuteva inyacute systeacutem tvorby luminiscenčneacuteho signaacutelu v priebehu reakcie Pyrosekvenovanie je umožneneacute vďaka aktivite 4 enzyacutemov - DNA polymeraacutezy ATP sulfurylaacutezy luciferaacutezy a apyraacutezy Reakčnaacute zmes obsahuje aj ďalšie komponenty - enzymatickeacute substraacutety adenoziacutenfosfosulfaacutet (APS) d-luciferiacuten sekvenovanyacute templaacutet a cyklicky postupne po jednom type pridaacutevaneacute nukleotidtrifosfaacutety Po zabudovaniacute nukleotidu do novovznikajuacuteceho reťazca docircjde k uvoľneniu pyrofosfaacutetu naacutesledne je využityacute ATP sulfurylaacutezou na synteacutezu ATP z APS počas ďalšej reakcie docircjde k využitiu ATP luciferaacutezou na premenu luciferiacutenu na oxyluciferiacuten čo spocircsobiacute svetelnyacute signaacutel a ten zaznamenaacute detekčnyacute systeacutem Poslednou enzymatickou reakciou je reakcia apyraacutezy ktoraacute odstraacuteni nezainkorporovaneacute nukleotidy a nevyužiteacute ATP aby sa celyacute proces mohol zopakovať s reakčnou zmesou obsahujuacutecou ďalšiacute nukleotidtrifosfaacutet (inyacute ako v predchaacutedzajuacutecej reakcii) Po každej reakcii detektor zaznamenaacuteva emisiu svetla na zaacuteklade intenzity svetla je možneacute určiť či bol vradenyacute priacuteslušnyacute nukleotidtrifosfaacutet či bol inkorporovanyacute jeden priacutepadne viac rovnakyacutech nukleotidtrifosfaacutetov

Zvyacutešenie vyacutekonu pyrosekvenovania umožnila tzv emulznaacute PCR v mikročasticiach a použitie platničky PicoTiterPlatereg toto sekvenovanie zaviedla firma Roche pod pojmom 454 pyrosekvenovanie v roku 2005 Na začiatku sa DNA fragmentuje na uacuteseky dlheacute 400-600 baacutez dvojvlaacuteknovaacute fragmentovanaacute DNA sa liguje s adapteacutermi prostredniacutectvom nich sa naviaže na mikročastice dvojvlaacuteknoveacute fragmenty sa oddelia mikročastice s naviazanyacutemi jednovlaacuteknovyacutemi fragmentami sa premiešajuacute so zmesou oleja a roztoku ktoryacute obsahuje všetky komponenty na uacutespešnuacute PCR Tyacutemto spocircsobom sa okolo každej mikročastice vytvoriacute vlastnyacute mikroreaktor v ktorom prebehne amplifikaacutecia fragmentu Po PCR reakcii sa mikročastice prenesuacute do platničky PicoTiterPlate v ktorej sa do jamky zmestiacute akuraacutet jedna mikročastica a reakčneacute komponenty pyrosekvenačnej reakcie PicoTiterPlatereg maacute 1 600 000 jamiek každaacute jamka maacute maximaacutelny objem 75 picolitra Platnička s mikročasticami sa vložiacute do sekvenačneacuteho systeacutemu ndash priacutestroja v ktorom sa celeacute pyrosekvenovanie uskutočniacute Chemiluminiscenčneacute signaacutely ktoryacutech počas sekvenovania vznikajuacute milioacuteny v priebehu hodiny suacute zachyteneacute CCD kamerou a analyzovaneacute softveacuterom

Firma Illumina predstavila inuacute technoloacutegiu PCR amplifikaacutecia a sekvenovanie sa uskutočňuje na skliacutečku (flow cell) Fragmentaacutecia DNA a pripojenie adapteacuterov prebieha za uacutečasti transpozoacutemov v procese nazvanom tagmentaacutecia Po hybridizaacutecii fragmentov DNA na skliacutečko prebehne v klastroch PCR amplifikaacutecia (tzv mostiacutekovaacute amplifikaacutecia) sekvenaacutecia prebieha za uacutečasti rozdielne fluorescenčne značenyacutech a chemicky modifikovanyacutech nukleotidov pričom každyacute nukleotid emituje fluorescenciu s inou vlnovou dĺžkou Na skliacutečku prebieha paralelne až 6 miliaacuterd sekvenaacutecii (obr 32)

Ďalšiacutemi možnosťami sekvenovania druhej generaacutecie je systeacutem SOLid (vyvinutyacute firmou Applied Biosystem dnes pod Thermo Fisher Scientific) a Ion Semiconductor Sequencing ndash polovodičoveacute ioacutenoveacute sekvenovanie (od firmy Ion Semiconductor Sequencing v suacutečasnosti Thermo Fisher Scientific)

36

Obr 32 Princiacutep sekvenovania novej generaacutecie od firmy Illumina PCR amplifikaacutecia a sekvenovanie sa uskutočňuje na skliacutečku (flow cell) paralelne prebieha až 6 miliaacuterd sekvenaacutecii

632 Sekvenovanie tretej generaacutecie

Pred sekvenovaniacutem netreba amplifikovať DNA PCR metoacutedou ale sekvencia sa ziacuteskava zachyteniacutem signaacutelu v reaacutelnom čase Medzi sekvenovanie tretej generaacutecie patriacute SMRT (Single Molecule Real-Time Sequencing) a Nanopore Sequencing

37

7 Fragmentačnaacute analyacuteza DNA

Je metoacuteda použiacutevanaacute na určenie veľkosti fragmentov DNA ziacuteskanyacutech PCR reakciou Dĺžka amplifikovanyacutech DNA fragmentov sa zistiacute ich porovnaniacutem s veľkostnyacutem štandardom (obr 33) ktoryacute je tvorenyacute DNA fragmentami znaacutemej dĺžky Veľkostnyacute štandard je pred kapilaacuternou elektroforeacutezou zmiešanyacute so vzorkou DNA fragmenty veľkostneacuteho štandardu suacute fluorescenčne označeneacute pričom použiteacute fluorescenčneacute farbivo je ineacute ako fluorescenčneacute farbivo použiteacute na označenie DNA fragmentov vo vyšetrovanej vzorke

Obr 33 Elektroforetogram veľkostneacuteho štandardu použiacutevaneacuteho na určenie veľkostiacute fragmentov analyzovanyacutech kapilaacuternou elektroforeacutezou v genetickom analyzaacutetore (GeneScantrade 500 LIZtrade dye Size Standard) dĺžka fragmentov v nukleotidoch (napr 50 nukleotidov)

Fragmentačnaacute analyacuteza pozostaacuteva z viaceryacutech krokov Prvyacutem je izolaacutecia DNA nasleduje PCR amplifikaacutecia počas ktorej sa novosyntetizovaneacute DNA fragmenty označia fluorescenčnyacutemi farbivami Vzorka s PCR produktom sa pripraviacute na kapilaacuternu elektroforeacutezu tak že sa zmieša s veľkostnyacutem štandardom (sluacuteži na určenie veľkosti fragmentov) a denaturačnou laacutetkou (formamid) nasleduje denaturaacutecia Pripraveneacute vzorky suacute injektovaneacute do priacutestroja (genetickyacute analyzaacutetor) kde v kapilaacutere naplnenej polymeacuterom v elektrickom poli migrujuacute fluorescenčne značeneacute fragmenty DNA na zaacuteklade veľkosti (kapilaacuterna elektroforeacuteza) Počas elektroforeacutezy genetickyacute analyzaacutetor zaznamenaacuteva fluorescenciu fragmentov Analyacutezou daacutet prostredniacutectvom špeciaacutelnych softveacuterov sa ziacuteskajuacute elektroforetogramy z ktoryacutech je možneacute zistiť veľkosť fragmentov ako aj typ fluorescencie (docircležiteacute ak suacute genetickeacute varianty rozliacutešiteľneacute rocircznou fluorescenciou napr SNaPshot) Fragmentačnaacute analyacuteza je suacutečasťou množstva molekulaacuterno-genetickyacutech metoacuted (pozri obr 12 26 28 29 34) ako suacute napr STR analyacuteza (Short Tandem Repeat) AFLP analyacuteza (Amplified Fragment Lenght Polymorfism) RFLPT-RFLP analyacuteza (Restriction Fragment Lenght PolymorfismTerminal Restricted Fragment Lenght Polymorfism) SSCP (Single Strand Conformation Polymorfism) VNTR (Variable Number of Tandem Repeat) analyacuteza straty heterozygotnosti (LOH loss of heterozygozity) MLPA (Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification) MSMSA (Methylation-Sensitive Mobility Shift Assay) SNP genotypovanie (SNaPshotreg) HiCEP (High-Coverage Expression Profiling)

38

Obr 34 Kvantitatiacutevna fragmentačnaacute PCR analyacuteza (QF-PCR) DNA izolovanej z plodovej vody vyacutesledok prenataacutelnej analyacutezy = priacutetomnosť troch piacutekov pre chromozoacutem 18 (u všetkyacutech fragmentov detegujuacutecich chromozoacutem 18 je pomer vyšetrovanyacutech markerov aberantnyacute 21 resp 111) čo znamenaacute trizoacutemiu chromozoacutemu 18 Edwardsov syndroacutem

39

8 Metoacutedy založeneacute na princiacutepe hybridizaacutecie

Nukleoveacute kyseliny majuacute schopnosť vytvaacuterať dvojvlaacuteknoveacute reťazce z jednovlaacuteknovyacutech molekuacutel na zaacuteklade komplementarity baacutez Komplementarita baacutez umožňuje replikaacuteciu DNA transkripciu RNA komplementarita baacutez zabezpečuje teda reprodukovateľnosť živej hmoty

Hybridizaacutecia je proces v ktorom na zaacuteklade komplementarity baacutez dochaacutedza k vytvoreniu dvojvlaacuteknovej nukleovej kyseliny z dvoch jednovlaacuteknovyacutech molekuacutel DNA alebo RNA alebo ich kombinaacuteciou DNA RNA pričom kratšia jednovlaacuteknovaacute nukleovaacute kyselina vystupuje ako sonda (proacuteba) Hybridizaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten je jeden z najpoužiacutevanejšiacutech naacutestrojov v molekulaacuternej bioloacutegii a genetike (hybridizaacutecia primerov alebo proacuteb sa využiacuteva v takmer každej metoacutede - v PCR RT-PCR qPCR RT-qPCR MLPA sekvenovaniacute fragmentačnej analyacuteze FISH DNA mikročipoch atď)

Denaturaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten je proces pri ktorom dochaacutedza k porušeniu vodiacutekovyacutech vaumlzieb medzi vlaacuteknami nukleovyacutech kyseliacuten (strata sekundaacuternej a terciaacutelnej štruktuacutery) tak že docircjde k ich uacuteplneacutemu oddeleniu vzniknuacute jednovlaacuteknoveacute reťazce Denaturaacutecia NK mocircže byť spocircsobenaacute vplyvom vysokyacutech teplocirct pH alebo chemickyacutech laacutetok (denaturačneacute činidlaacute) Renaturaacutecia je opačnyacute proces v ktorom na zaacuteklade komplementarity dochaacutedza k tvorbe dvojvlaacuteknovyacutech NK

Hybridiza čnaacute sonda (proacuteba) je jednovlaacuteknovaacute nukleovaacute kyselina určitej znaacutemej dĺžky a sekvencie (najčastejšie DNA pretože je stabilnejšia ako RNA) ktoraacute je značenaacute a sluacuteži na detekciu komplementaacuternych molekuacutel DNA alebo RNA v procese hybridizaacutecie V zaacutevislosti od podmienok hybridizaacutecie (stringencia) mocircže byť detegovanaacute sekvencia uacuteplne komplementaacuterna alebo v menej priacutesnych podmienkach mocircže mať sekvenčneacute odchyacutelky Proacuteba sluacuteži na vyhľadanie a zviditeľnenie cieľovyacutech NK Zviditeľnenie sa deje prostredniacutectvom označenia proacuteby ešte pred hybridizaacuteciou Značenie proacuteby mocircže byť raacutedioaktiacutevne a neraacutedioaktiacutevne (najčastejšie fluorescenčneacute)

Raacutedioaktiacutevne značeneacute proacuteby pomocou izotopov (32P) sa využiacutevali viac v minulosti v suacutečasnosti suacute kvocircli zdravotnyacutem rizikaacutem ohľaduplnosti k životneacutemu prostrediu ako aj kvocircli jednoduchšej manipulaacutecii použiacutevaneacute fluorescenčne značeneacute proacuteby Raacutedioaktiacutevne značeneacute sondy boli použiacutevaneacute hlavne metoacutedou Southernovej hybridizaacutecie (Southern blotting Southern blot) Citlivosť raacutedioaktiacutevne značenyacutech proacuteb je vyššia dosahuje schopnosť zachytiť 10 fg (femtogram 10-15) cieľovej DNA sekvencie 81 Southern blot

Metoacutedu objavil v roku 1975 britskyacute bioloacuteg Edwin Southern (preto Southern) Pri Southernovej hybridizaacutecii sa restrikčne štiepeneacute fragmenty DNA elektroforeticky separujuacute v geacuteli potom sa metoacutedou blottingu prenesuacute na nylonovuacute alebo nitroceluloacutezovuacute membraacutenu kde suacute naacutesledne hybridizovaneacute v roztoku obsahujuacutecom raacutedioaktiacutevne značenuacute sondu Priloženiacutem fotografickeacuteho filmu k membraacutene a vyvolaniacutem filmu autoraacutediografiou docircjde k zviditeľneniu lokaliacutet kde došlo k hybridizaacuteciiacute raacutedioaktiacutevne značenej sondy s fragmentom DNA (autoraacutediogram) Southern blot bol kľuacutečovou a prvou metoacutedou na identifikaacuteciu osocircb (DNA fingerprinting DNA pofiling) (obr 35)

Okrem Southern blotu existuje Northern blot na analyacutezu RNA (geacutenovej expresie) a Western blot na analyacutezu proteiacutenov postup je obdobnyacute ako pri Southern blote s obmenami špecifickyacutemi pre konkreacutetny blot Pri Northern blote sa použiacutevajuacute hybridizačneacute proacuteby ale pre vizualizaacuteciu proteiacutenov western blotom je potrebneacute použiť protilaacutetky s naacuteslednou vizualizaacuteciou Pomenovanie techniacutek je hra so sloviacutečkami (keďže paacuten Northern ani Western neobjavili takto nazvaneacute techniky)

Neraacutedioaktiacutevne značenie proacuteb použiacutevanyacutech v molekulaacuternej genetike mocircže byť nepriame (použitie haptenu) alebo priame Konečnaacute vizualizaacutecia je najčastejšie zabezpečenaacute fluoreskujuacutecimi farebnyacutemi značkami farbivami fluorochroacutemami (fluorofoacuterami) Pri priamom značeniacute je farbička kovalentne naviazanaacute na nukleotid a na zachytenie fluorescencie suacute potrebneacute špeciaacutelne priacutestroje umožňujuacutece excitaacuteciu farbičky ktoraacute potom emituje žiarenie určitej vlnovej dĺžky (emisneacute žiarenie) a to zachytiacute detekčnyacute systeacutem priacutestroja Využitie fluorochroacutemov v molekulaacuternej genetike je masiacutevne napr na vizualizaacuteciu NK elektroforeticky separovanyacutech v geacuteli kvantifikaacuteciu produktov PCR reakcie v priacutestroji real-time PCR cykleacuter sekvenovaniacute fragmentačnej analyacuteze FISH DNA mikročipoch atď

40

Obr 35 Princiacutep Southern blotu

82 FISH (fluorescenčnaacute in situ hybridizaacutecia)

FISH (fluorescent in situ hybridization fluorescenčnaacute in situ hybridizaacutecia) metoacuteda patriacute medzi molekulovo-cytogenetickeacute techniky Princiacutep FISH metoacutedy je založenyacute na hybridizaacuteciiacute fluorescenčne značenyacutech proacuteb ku komplementaacuternym uacutesekom vyšetrovanej DNA na podložnom skle (priamo na mieste - in situ) K denaturaacutecii dsDNA dochaacutedza buď vplyvom denaturačnyacutech činidiel alebo zvyacutešenou teplotou a naacuteslednou renaturaacuteciou dochaacutedza k naviazaniu sondy na komplementaacuterny uacutesek DNA Vyacutesledok hybridizaacutecie sa vizualizuje fluorescenčnyacutem mikroskopom vybavenyacutem vhodnyacutemi fluorescenčnyacutemi filtrami a vizuaacutelne zhodnotiacute skuacutesenyacutem odborniacutekom Fluorescencia sa v niektoryacutech priacutepadoch mocircže zaznamenať a hodnotiť aj pomocou softveacuteru (obr 36)

Pomocou FISH detegujeme numerickeacute aberaacutecie - zmeny v počte chromozoacutemov (napr trizoacutemia monozoacutemia chromozoacutemov) alebo štruktuacuterne aberaacutecie a prestavby (napr translokaacutecie inverzie deleacutecie duplikaacutecie amplifikaacutecie) FISH metoacuteda umožňuje identifikaacuteciu a detekciu každeacuteho ľudskeacuteho chromozoacutemu jeho zaradenie do karyotypu odhalenie malyacutech submikroskopickyacutech chromozoacutemovyacutech zmien a tiež mapovať poziacutecie jednotlivyacutech geacutenov na chromozoacuteme

41

Obr 36 Princiacutep štandardnej FISH a FISH maľovania celeacuteho chromozoacutemu

Veľkou vyacutehodou FISH metoacutedy je možnosť analyacutezy buniek v metafaacuteze aj v interfaacuteze kedy nie je nutnaacute kultivaacutecia buniek a tiež ryacutechle analyzovanie veľkeacuteho počtu buniek (stovky až tisiacutece) K ďalšiacutem vyacutehodaacutem patriacute bezpečnosť vysokaacute citlivosť dostatočnaacute stabilita relatiacutevne kraacutetky čas hybridizaacutecie a možnosť ryacutechleho vyhodnotenia Hybridizaacutecia pri vaumlčšine suacutečasne dodaacutevanyacutech sond trvaacute 10-12 hodin (na trhu suacute už dostupneacute aj sondy so skraacutetenyacutem časom hybridizaacutecie na 2-3 hodiny) Po hybridizaacuteciiacute nasleduje odmyacutevanie kedy pri priacuteslušnej teplote dochaacutedza k odmytiu nenaviazanyacutech a nespraacutevne hybridizovanyacutech sond Preparaacutet sa naacutesledne podfarbiacute a vyacutesledok sa zhodnotiacute vo fluorescenčnom mikroskope Na podfarbenie chromozoacutemov alebo jadier sa použiacuteva modreacute kontrastneacute farbivo DAPI (46-diamidino-2-fenylindol) ktoreacute maacute silneacute fluorescenčneacute vlastnosti dokaacuteže prechaacutedzať jadrovou membraacutenou a viazať sa na DNA Vyacutesledkom je modreacute zafarbenie ktoreacute vyacuteborne kontrastuje so signaacutelmi jednotlivyacutech sond

Limitujuacutecim faktorom FISH je možnosť identifikaacutecie len tyacutech uacutesekov DNA ku ktoryacutem suacute použiteacute sondy V jednej analyacuteze je možneacute použiť najviac 3 odlišne značeneacute sondy a tak zistiť priacutepadneacute abnormality len na 1 alebo na paacuter lokusoch Na relevantnuacute detekciu je potrebneacute mať vo vzorke 1-5 aberantnyacutech interfaacutezovyacutech jadier

FISH je možneacute uskutočniť na širokej škaacutele biologickeacuteho materiaacutelu na vzorkaacutech perifeacuternej krvi kostnej drene naacuteteroch choriovyacutech klkoch plodovej vode rocircznych druhov tkaniacutev natiacutevnych alebo zaliatych v parafiacutene na 1 bunke (predimplantačnaacute genetickaacute diagnostika PGD) (obr 37)

Využiacuteva sa na detekciu aberaacuteciiacute pri mnohyacutech onkologickyacutech ochoreniach (napr pri diagnoacuteze mnohopočetnyacute myeloacutem sa v suacutečasnosti po separaacutecii CD138+ buniek robiacute FISH s 5 sondami pre geacuteny IGH TP53 RB1 oblasť 1p321q21 a stanovuje sa hyperploidia chromozoacutemov 5 9 a 15) a tiež k spresneniu doplneniu a k overeniu bežneacuteho cytogenetickeacuteho vyšetrenia

Podľa miesta na chromozoacuteme na ktorom dochaacutedza k hybridizaacutecii sondy rozlišujeme 4 typy

DNA sond bull centromeacuteroveacute sondy ndash sa viažu na strednuacute časť chromozoacutemu ndash centromeacuteru sluacutežia k diagnostike zmien v počte chromozoacutemov k detekcii chromozoacutemov neznaacutemeho pocircvodu umožňujuacute interfaacuteznu FISH na nedeliacich sa bunkaacutech (obr 38-41)

42

Obr 37 Interfaacutezna FISH preimplantačnyacute genetickyacute skriacutening aneuploidiiacute ndash blastomeacutera 3-denneacuteho ľudskeacuteho embrya s normaacutelnym počtom chromozoacutemov 13 18 21 pohlavie XY použityacutech 5 sond pre chromozoacutemy 13 ndash orange 18 ndash aqua 21 ndash green X ndash blue a Y ndash yellow (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

Obr 38 Interfaacutezne jadro po hybridizaacutecii s centromeacuterovou sondou pre chromozoacutem 8 (Vysis Abbott) V pravom jadre je priacutetomnaacute trizoacutemia chromozoacutemu 8 (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex) Obr 39 Metafaacutezna (A) a interfaacutezna FISH (B) použitaacute centromeacuterovaacute sonda CEPX spectrum orangeCEPY spectrum green (Vysis Abbott) Sonda hybridizuje k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (červenyacute signaacutel) a Y (zelenyacute signaacutel) (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

43

Obr 40 Interfaacutezna FISH vyšetrenie spermiiacute použiteacute sondy CEPX greenCEPY orange (Aneuscore Metasystems) Sondy hybridizujuacute k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (zelenyacute signaacutel) Y (červenyacute signaacutel) vľavo ndash dve haploidneacute spermie (majuacutece jedna spermia X druhaacute Y chromozoacutem) vpravo ndash dve patologickeacute spermie obsahujuacutece gonozoacutemovyacute komplement XY (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

Obr 41 Interfaacutezna FISH vyšetrenie spermiiacute použiteacute sondy CEPX greenCEPY orange a CEP18 aqua (Aneuscore Metasystems) Sondy hybridizujuacute k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (zelenyacute signaacutel) Y (červenyacute signaacutel) a 18 (modryacute signaacutel) vľavo ndash normaacutelne haploidneacute ľudskeacute spermie - 1x chromozoacutem X alebo Y a jedenkraacutet chromozoacutem 18 v strede ndash patologickaacute spermia obsahujuacuteca gonozoacutemovyacute komplement XY a jeden chromozoacutem 18 vpravo ndash patologickaacute diploidnaacute spermia s chromozoacutemami X Y a dvoma chromozoacutemami 18 (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

bull lokusovo špecifickeacute sondy ndash hybridizaacutecia prebehne na konkreacutetnom mieste geacutenu (lokuse) (obr 42-44) použiacutevajuacute sa k vyšetreniu mikrodeleacuteciiacute (straty malyacutech častiacute chromozoacutemu pri mikrodelečnyacutech syndroacutemoch) k zisteniu amplifikaacutecie onkogeacutenov a niektoryacutech špecifickyacutech translokaacuteciiacute prestavby geacutenov umožňujuacute interfaacuteznu FISH na nedeliacich sa bunkaacutech bull subtelomeroveacute ndash vaumlzba na koncoveacute časti chromozoacutemu ndash telomeacutery bull celochromozoacutemoveacute alebo celomaľovacie sondy ndash sondy hybridizujuacute s mnohopočetnyacutemi chromozoacutemovyacutemi sekvenciami pričom sa fluorescenčne tak bdquovymaľujeldquo celyacute chromozoacutem (Obr 45) Použiacutevajuacute sa na vyšetrenie chromozoacutemovyacutech prestavieb k analyacuteze translokaacuteciiacute a k detekcii pocircvodu tzv marker chromozoacutemov (malyacutech nadpočetnyacutech chromozoacutemov neznaacutemeho pocircvodu) K použitiu sondy suacute potrebneacute metafaacutezne chromozoacutemy nepoužiacutevaju sa pre interfaacuteznu FISH

Pri konvenčnej chromozoacutemovej FISH suacute homogeacutenne DNA proacuteby hybridizovaneacute s fixovanyacutem metafaacuteznym alebo prometafaacuteznym chromozoacutemomchromozoacutemami na skliacutečku (Obr 36a) Maximaacutelna rozlišovacia schopnosť metafaacuteznej FISH je niekoľko megabaacutez (Obr 39a 45) využitiacutem viac

44

natiahnutyacutech prometafaacuteznych chromozoacutemov sa dosiahne 1 Mb rozliacutešenie Prostredniacutectvom fiber FISH konkreacutetne artificiaacutelne deproteinizovanej natiahnutej DNA pripravenej in situ z celyacutech buniek na mikroskopickom skliacutečku je možneacute vizualizovať individuaacutelne geacuteny maleacute DNA elementy na chromozoacuteme s rozliacutešeniacutem okolo 1000 bp

Obr 42 Interfaacutezne jadro po hybridizaacutecii s lokusovo-špecifickou sondou LSI 5q31 Spectrum Orange5p12 Spectrum Green (Vysis Abbott) Na ľavom obraacutezku suacute priacutetomneacute dva červeneacute (5q31) a dva zeleneacute signaacutely (5p12) v pravom jadre je priacutetomnaacute deleacutecia 5q31 oblasti chyacuteba jeden červenyacute signal (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

Obr 43 Interfaacutezna FISH použitaacute lokusovo-špecifickaacute sonda ndash translokačnaacute - XL BCRABL1 plus (Metasystems) dvojfarebnaacute dvojfuacutezna kde červenaacute označuje lokus ABL1 na chromozoacuteme 9 a zelenaacute oblasť BCR na chromozoacuteme 22 Sonda deteguje fuacuteziu protoonkogeacutenu ABL1 (9q34) a geacutenu BCR (22q11) v priacutepade že červenyacute a zelenyacute signaacutel suacute pri sebe (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

45

Obr 44 Interfaacutezna FISH Použitaacute lokusovo-špecifickaacute sonda- typ break apart pre IGH geacuten V docircsledku translokaacutecie došlo k rozskočeniu geacutenu pričom translokačneacuteho partnera nepoznaacuteme vieme určiť len percento v koľkyacutech jadraacutech je geacuten prestavanyacute (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex) Obr 45 Použiteacute celochromozoacutemoveacute sondy WCP 15 (červenyacute chromozoacutem) a WCP 17 (zelenyacute chromozoacutem) Na metafaacuteze je potvrdenaacute reciprokaacute translokaacutecia t(1517)(q2221) (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

FISH vizualizaacutecia celeacuteho chromozoacutemu maľovanie chromozoacutemu anglicky chromosome

painting je špeciaacutelnou aplikaacuteciou chromozoacutemovej FISH proacuteba je koktail veľkeacuteho počtu rocircznych fluorescenčne značenyacutech DNA fragmentov hybridizujuacutecich pozdĺž celeacuteho konkreacutetneho chromozoacutemu (obr 36b 45) bdquoChromosomepaintingldquo analyzuje metafaacutezne chromozoacutemy V minulosti bola FISH vizualizaacutecia celyacutech chromozoacutemov limitovanaacute malyacutem množstvom rocirczne sfarbenyacutech fluorochroacutemov

V suacutečasnosti je možneacute detegovať množstvo cieľovyacutech sekvenciiacute naraz čo sa využiacuteva pri celogenoacutemovej chromozoacutemovej vizualizaacutecii (whole-chromosomepainting - WCP) metoacutedou multiplex FISH (M-FISH multicolor FISH o br 46) alebo spektraacutelnej karyotypizaacutecie (SKY) kedy možno rozliacutešiť všetky ľudskeacute chromozoacutemy ndash teda 24 rocircznych chromozoacutemov M-FISH a SKY patria medzi metafaacutezne formy FISH diagnostiky ktoreacute umožňujuacute simultaacutennu vizualizaacuteciu všetkyacutech ľudskyacutech chromozoacutemov v rocircznych farbaacutech čo predstavuje uľahčenie analyacutezy karyotypu hlavne pri komplexnyacutech zmenaacutech a markeroch neznaacutemeho pocircvodu Obe techniky vychaacutedzajuacute z použitia

46

celochromozoacutemovyacutech sond značenyacutech kombinaacuteciou viaceryacutech fluorochroacutemov Rozdiel medzi M-FISH a SKY spočiacuteva v technike ziacuteskania konečneacuteho obrazu

Obr 46 Multicolor FISH - každyacute chromozoacutemovyacute paacuter je zafarbenyacute inou farbou pričom na ich zafarbenie postačuje kombinaacutecia 5 fluorochroacutemov Na vyhodnocovanie je potrebnaacute špeciaacutelna sada fluorescenčnyacutech filtrov pre jednotliveacute fluorochroacutemy a špeciaacutelnyacute softweacuter Vľavo-štandardnyacute karyotyp vpravo karyotyp s mutaacuteciami (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

V molekulovej cytogenetike suacute komerčne dostupneacute sety M-FISH proacuteb umožňujuacutece

viacfarebneacute pruacutežkovanie chromozoacutemov (banding) s vysokyacutem rozliacutešeniacutem (multicolor-banding mBAND FISH MCB) čo umožňuje identifikaacuteciu intrachromozoacutemovyacutech prestavieb (Obr 47) Nevyhnutnosťou mBAND-u je mať chromozoacutemy v metafaacuteze Taacuteto metoacuteda bola prvyacutekraacutet uskutočnenaacute na chromozoacuteme 5 v roku 1999 mBAND FISH umožňuje rozliacutešiť špecifickeacute oblasti chromozoacutemov na uacuterovni pruacutežku - bandu a sub-bandu s detekciou 550 bandov haploidneacuteho karyotypu

Obr 47 A - mBAND chromozoacutemu 11 - inverzia duplikovanej oblasti 11q223-q25 B - mBAND chromozoacutemu 3 - na kruhovom chromozoacuteme deleacutecia oblasti 3p263 C - mBAND chromozoacutemu 2 - potvrdenie inverzie duplikovanej časti chromozoacutemu (poskytnuteacute RNDr Dagmar Landlovou Medirex)

FISH metoacuteda a jej varianty (M-FISH mBAND SKY) majuacute v suacutečasnosti širokeacute využitie v

klinickej genetike v onkologickej genetike na detekciu aberaacuteciiacute v čase diagnoacutezy počas liečby po

47

liečbe monitorovanie po transplantaacutecii kostnej drene v prenataacutelnej a postnataacutelnej diagnostike pri detekcii submikroskopickyacutech deleacuteciiacute (napr DiGeorge syndroacutem - 22q112 delečnyacute syndroacutem PraderndashWilli syndroacutem- chromozoacutem 15q11-13) prostredniacutectvom FISH je možnaacute detekcia numerickyacutech zmien chromozoacutemov (trizoacutemia chromozoacutemu 21 pri Downovom syndroacuteme trizoacutemia chromozoacutemu 15 pri Patauovom syndroacuteme trizoacutemia chromozoacutemu 18 pri Edwardsovom syndroacuteme) rocirczne zmeny v počte pohlavnyacutech chromozoacutemov (monozoacutemia X pri Turnerovom syndroacuteme Klinefelterov syndroacutem s X chromozoacutemom naviac - XXY) podobne v predimplantačnej diagnostike

83 DNA Microarray (DNA mikro čip biočip) DNA mikročipovanie je technika využiacutevajuacuteca hybridizaacuteciu skuacutemanej nukleovej kyseliny

(cieľovaacute vzorka) s veľkyacutem množstvom oligonukleotidovyacutech proacuteb (desať tisiacutec až milioacuten) ktoreacute suacute prichyteneacute na pevnyacute podklad najčastejšie sklenyacute silikoacutenovyacute alebo nylonovyacute (doštička čip) Skuacutemanaacute nukleovaacute kyselina je pred hybridizaacuteciou fragmentovanaacute označenaacute fluorofoacuterom a denaturovanaacute Po kontakte čipu s cieľovou vzorkou ktoraacute je vlastne zmes označenyacutech oligonukleotidov značeneacute oligonukleotidy hybridizujuacute s oligonukleotidovyacutemi sekvenciami prichytenyacutemi na čipe Potom suacute na zaacuteklade fluorescencie detekovaneacute miesta kde došlo k hybridizaacutecii čiže vzorka obsahovala takuacuteto nukleotidovuacute sekvenciu Z jedneacuteho mikročipu sa ziacuteska obrovskeacute množstvo daacutet ktoreacute je vždy nutneacute softveacuterovo spracovať V dnešnej dobe existuje niekoľko firiem poskytujuacutecich komerčne mikročipy na objednaacutevku alebo si ich laboratoacuteria produkujuacute sami

Mikročipovanie prebieha nasledovne

1) Vytvorenie DNA čipu ndash tisiacutece rocircznych jednovlaacuteknovyacutech DNA oligonukleotidov znaacutemych sekvencii sa kovalentne naviažu na povrch doštičky vždy v určitej lokalite je niekoľko rovnakyacutech oligonukleotidov veľkosť takejto lokality je ˂ 200 microm Proacutebami mocircže byť DNA cDNA alebo syntetizovaneacute oligonukleotidy Už hotoveacute mikročipy ponuacutekajuacute viacereacute firmy (Affymetrix Agilent Technologies Eppendorf Illumina) alebo si ich jednotliveacute laboratoacuteria vyraacutebajuacute sami pomocou robotickyacutech zariadeniacute DNA čip sa vytvaacutera buď nanaacutešaniacutem kvapiek oligonukleotidov na podklad alebo synteacutezou oligonukleotidov in situ na čipe 2) Priacuteprava vzorky ndash nukleovaacute kyselina (mRNA DNA) sa purifikuje určiacute sa jej kvantita a kvalita (spektrofotometericky) fragmentuje resp v priacutepade mRNA sa syntetizuje cDNA v priacutepade potreby sa mocircže DNA amplifikovať PCR reakciou štiepiť restrikčnyacutemi endonukleaacutezami 3) Fluorescenčneacute označenie (zriedkavejšie raacutedioaktiacutevne) fragmentov DNA prebieha počas reverznej transkripcie alebo PCR amplifikaacutecie za uacutečasti fluorescenčne značenyacutech nukleotidov Keď sa analyzujuacute dve rocirczne vzorky napr zdraveacute tkanivo a naacutedoroveacute tkanivo označenie nukleovyacutech kyseliacuten v tyacutechto tkanivaacutech byacuteva rozdielne a to použitiacutem dvoch rocircznych fluorescenčnyacutech farbiacutev (napr zeleneacute a červeneacute) Pred hybridizaacuteciou je potrebneacute vzorku denaturovať čiacutem sa vytvoriacute zmes jednovlaacuteknovyacutech DNA označenyacutech značkou 4) Hybridizaacutecia s mikročipom ndash v špeciaacutelnom hybridizačnom roztoku hybridizujuacute komplementaacuterne sekvencie zo vzorky s priacuteslušnyacutemi oligonukleotidovyacutemi sondami naviazanyacutemi na čipe Potom sa čip obmyje aby došlo k odstraacuteneniu čiastočne hybridizovanyacutech nukleovyacutech kyseliacuten 5) Skenovanie mikročipu ndash skenerom čipov docircjde k ožiareniu čipu laserom pričom v mieste hybridizaacutecie fluorescenčne značenyacutech DNA fragmentov s proacutebou docircjde k emisii svetla určitej vlnovej dĺžky ktoruacute skener zaznamenaacute 6) Analyacuteza daacutet prebieha metoacutedami bioinformatiky spracovaniacutem softveacutermi sa zistiacute ktoreacute lokality čipu navzaacutejom hybridizovali v priacutepade použitia dvoch vzoriek kontrolnej a skuacutemanej je možneacute analyzovať ich relatiacutevnu intenzitu hybridizaacutecie (expresie určiteacuteho geacutenu)

Existujuacute štyri typy mikročipov 1) Čipy ur čeneacute na analyacutezu expresie (obsahujuacute cDNA proacuteby) pre tzv dvojkanaacutelovyacute experiment kedy je vzorka určenaacute k hybridizaacutecii na čipe ziacuteskanaacute zmiešaniacutem DNA fragmentov kontrolnej a skuacutemanej vzorky pričom fragmenty suacute rozdielne fluorescenčne označeneacute (napr zelenyacute fluorofoacuter pre kontrolnuacute vzorku a červenyacute pre skuacutemanuacute) Na zaacuteklade intenzity a typu fluorescencie sa deteguje expresia geacutenov typickaacute pre kontrolnuacute vzorku (napr zelenaacute fluorescencia) pre skuacutemanuacute vzorku (napr

48

červenaacute fluorescencia) a expresia podobnaacute u oboch vzoriek (žltaacute fluorescencia) neexprimovaneacute geacuteny (čierna fluorescencia) rocirczne odtiene (v zaacutevislosti od prevažujuacutecej hybridizaacutecie) (obr 48) 2) Čipy ur čeneacute na analyacutezu mutaacutecii použije sa genoacutemovaacute DNA označenaacute jednou fluorescenčnou farbičkou na určenie jednonukleotidovej zmeny (SNP ndash Single Nukleotide Polymorphism) 3) Čipy na komparatiacutevnu genoacutemovuacute hybridizaacuteciu (aCGH array Comparative Genomic Hybridization) ndash použiacutevaneacute na zistenie zvyacutešenia alebo zniacuteženia množstva chromozoacutemovyacutech fragmentov obsahujuacutecich geacuteny zodpovedneacute za určiteacute ochorenie Na analyacutezu sa použije skuacutemanaacute gDNA a referenčnaacute (kontrolnaacute) DNA každaacute sa značiacute inou fluorescenčnou farbičkou (princiacutep ako pri analyacuteze expresie) (obr 49 50) 4) Čipy CGH - SNP kombinovaneacute čipy ur čeneacute na analyacutezu aj mutaacuteciiacute SNP aj na komparatiacutevnu genoacutemovuacute hybridizaacuteciu CGH

Mikročipy majuacute rozsiahle využitie napriacuteklad v identifikaacuteciiacute novyacutech geacutenov vo vyacuteskume ich funkciiacute expresie v rocircznych podmienkach pri diagnostike mnohyacutech ochoreniacute vo farmakogenomike vo vyacuteskume vplyvu toxiacutenov

Obr 48 Heatmapa geacutenovej expresie vybranyacutech geacutenov (mRNA) mikročip obsahuje 46000 cDNA proacuteb (poskytnuteacute Ing Helenou Gbelcovou PhD Uacutestav lekaacuterskej bioloacutegie genetiky a klinickej genetiky LF UK a UNB)

49

Obr 49 Princiacutep komparatiacutevnej genoacutemovej hybridizaacutecie (aCGH - array comparative genomic hybridization) Obr 50 A) Vyacutesledok komparatiacutevnej genoacutemovej hybridizaacutecie (aCGH - array comparative genomic hybridization) vzorky DNA izolovanej plodovej vody U plodu s abnormaacutelnym ultrasonografickyacutem vyšetreniacutem bola identifikovanaacute duplikaacutecia oblasti 3q261q29 (modryacute paacutes) a deleacutecia oblasti 5p1533p151 (červenyacute paacutes) Pre porovnanie chromozoacutem 1 bez aberaacutecie b) Ten istyacute pacient ale ineacute softveacuteroveacute spracovanie (poskytnuteacute RNDr Miroslavom Tomkom PhD Medirex)

50

Odporuacutečanaacute a použitaacute literatuacutera

Odborneacute knihy Klug W S Cummings M R Spencer Ch A Palladino M A Concepts of Genetics jedenaacuteste vydanie (2015) Carson S Molecular Biology Techniques tretie vydanie (2012) Strachan T Read A Human Molecular Genetics štvrteacute vydanie (2011) Sudbery P Sudbery I Human Molecular Genetics tretie vydanie (2009)

Internetoveacute straacutenky

wwwncbinlmnihgov wwwmlpacom wwwthermofishercom wwwilluminacom wwwpromegask wwwqiagencom wwwambioncom

Odborneacute člaacutenky Chacon-Cortes D Griffiths L R Methods for extracting genomic DNA from whole blood samples current perspectives Journal of Biorepository Science for Applied Medicine Volume 2 strany 1- 9 Viltrop T Krjutskov K Palta P Metspalu A Comparison of DNA extraction methods for multiplex polymerase chain reaction Anal Biochem 2010 Volume 398(2) strany 260-262 Ing Martin Čermaacutek Molekulaacuterna cytogenetika v problematike familiaacuternych maligniacutet Onkoloacutegia Volume 2 strany 77 - 83 Livak KJ Schmittgen TD Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method Methods 2001 Volume 25(4) strany 402 - 408 Bustin S A Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays J Mol Endocrinol 2000 Volume 25(2) strany169 - 193

MOLEKULAacuteRNE METOacuteDY AKTUAacuteLNE POUŽIacuteVANEacute V KLINICKEJ GENETIKE RNDr Andrea Pastoraacutekovaacute PhD RNDr Robert Petrovič PhD Vydala Univerzita Komenskeacuteho v Bratislave Lekaacuterska fakulta Rozsah 50 straacuten 246 AH prveacute vydanie ISBN 978-80-223-4231-5

11

3 PCR (polymeraacutezovaacute reťazovaacute reakcia)

Je metoacuteda vyvinutaacute v roku 1983 Karym Mullisom ocenenaacute v roku 1993 Nobelovou cenou za cheacutemiu Polymeraacutezovaacute reťazovaacute reakcia je založenaacute na schopnosti DNA polymeraacutezy syntetizovať noveacute vlaacutekno DNA podľa templaacutetoveacuteho vlaacutekna na zaacuteklade princiacutepu komplementarity DNA polymeraacuteza je schopnaacute pripaacutejať nukleotidy len k voľnej 3acuteOH skupine preto potrebuje primer (čiacutetaj prajmer) ku ktoreacutemu je schopnaacute pridaacutevať nukleotidy Primery suacute kraacutetke jednovlaacuteknoveacute oligonukleotidy ktoreacute umožňujuacute jednak DNA polymeraacuteze začať so synteacutezou noveacuteho vlaacutekna na druhej strane ohraničujuacute špecifickuacute oblasť ktoruacute chceme amplifikovať (namnožiť) Vyacutesledkom PCR reakcie je obrovskyacute počet koacutepii špecifickej sekvencie (obr 7) PCR v podstate napodobňuje replikaacuteciu DNA v in vitro podmienkach s rozdielom že nedochaacutedza k replikaacutecii celej DNA ale len vybraneacuteho primermi ohraničeneacuteho miesta

31 Najdocircležitejšie PCR komponenty

Templaacutetovaacute DNA je vzorka DNA obsahujuacuteca cieľovuacute sekvenciu Na začiatku reakcie docircjde pri vysokej teplote k denaturaacutecii a separaacutecii jednotlivyacutech vlaacutekien dvojvlaacuteknovej DNA

Enzyacutem DNA polymeraacuteza syntetizuje noveacute DNA vlaacutekno komplementaacuterne k cieľovej sekvencii Najčastejšie použiacutevanou a prvou DNA polymeraacutezou je Taq DNA polymeraacuteza (z termofilnej bakteacuterie Thermus aquaticus) zatiaľ čo Pfu DNA polymeraacuteza (z Pyrococcus furiosus) je preferovanaacute kvocircli tzv vysokej fidelite čo je schopnosť inkorporovať spraacutevnu baacutezu do novosyntetizovaneacuteho vlaacutekna DNA DNA polymeraacutezy musia mať dve vlastnosti schopnosť syntetizovať noveacute vlaacutekno DNA podľa templaacutetovej DNA a byť termostabilneacute čiže rezistentneacute na vysokeacute teploty (cca 100degC) V suacutečasnosti sa v laboratoacuteriaacutech často použiacutevajuacute rekombinantneacute polymeraacutezy s požadovanyacutemi vlastnosťami Napriacuteklad pre PCR ktorej produkt bude klonovanyacute je docircležiteacute použiť polymeraacutezu ktoraacute je schopnaacute opraviť vlastnuacute chybu v priacutepade inkorporaacutecie nespraacutevnej baacutezy pri synteacuteze noveacuteho reťazca Schopnosť opravovať nespraacutevne inkorporovaneacute baacutezy počas synteacutezy noveacuteho vlaacutekna DNA sa nazyacuteva tzv proofreading aktivita ktoraacute je zabezpečenaacute 3rarr5acute exonukleaacutezovou aktivitou takejto polymeraacutezy Pred vlastnou molekulaacuterno-genetickou diagnostikou je treba optimalizovať podmienky PCR reakcie pre konkreacutetnu DNA polymeraacutezu a pre špecifickeacute primery treba zistiť optimaacutelnu teplotu annealingu (hybridizaacutecie) primerov koncentraacutecie jednotlivyacutech zložiek PCR reakcie (napr MgCl2)

Primery suacute kraacutetke jednovlaacuteknoveacute DNA sekvencie komplementaacuterne k cieľovej sekvencii DNA polymeraacuteza začiacutena syntetizovať noveacute vlaacutekno z 3acutekonca primeru Docircležitou charakteristikou primerov je teplota topenia (Tm) t j teplota pri ktorej polovica DNA duplexov je disociovanaacute na jednovlaacuteknoveacute molekuly

Nukleotidy (dNTP deoxyribonukleotidtrifosfaacutety) suacute stavebneacute prvky pre novosyntetizovanuacute DNA molekulu

Veľmi praktickyacutem riešeniacutem pre molekulaacuterno-genetickeacute diagnostickeacute laboratoacuteria je tzv mastermix to je roztok v ktorom už je priacutetomneacute všetko potrebneacute pre priebeh PCR reakcie samozrejme okrem primerov a templaacutetovej DNA sekvencie PCR Master Mix (2X) od firmy ThermoFisher Scientific je jednyacutem z takyacutechto mixov obsahuje Taq DNA polymeraacutezu tlmivyacute roztok (pufor) MgCl2 a všetky deoxyribonukleotidy trifosfaacutety

Tabuľka č 1 uvaacutedza ako sa PCR reakcia z mastermixu pripravuje pre jednu vzorku Keďže v laboratoacuteriu sa zriedka robiacute PCR reakcia s jednou vzorkou treba si pripraviť tzv premix (tj PCR reakcie pre vaumlčšiacute počet vzoriek ale bez templaacutetovej DNA) ktoryacute sa rozdeliacute do mikroskuacutemaviek a až potom sa k nim pridaacute DNA resp cDNA

12

Tab 1 Priacuteprava PCR premixu

Celkovyacute objem jednej PCR reakcie 10 microl Počet vzoriek 8 2x PCR master mix 5 40

primer sense (10microM) 05 4

primer antisense (10microM) 05 4

H2O 35 28

DNA cDNA 05

rozpipetovať premix po 95microl do mikroskuacutemaviek až potom pridať do každej mikroskuacutemavky zvlaacutešť DNA cDNA

spolu objem 10 76

PCR amplif ikaacutecia je cyklickyacute proces pozostaacutevajuacuteci z troch krokov (obr 7) 1) denaturaacutecia dvojvlaacuteknovej DNA pri vysokej teplote (95degC) 2) hybridizaacutecia (annealing) primerov k špecifickej sekvencii DNA pri teplote vhodnej pre konkreacutetne primery 3) polymerizaacutecia (synteacuteza) novyacutech vlaacutekien DNA (72degC)

Obr 7 Princiacutep PCR

Tieto tri kroky sa opakujuacute 25 ndash 40 kraacutet pričom pri každom cykle sa počet molekuacutel zdvojnaacutesobiacute (vyacuteslednyacute počet cieľovej sekvencie je 2n+1 ak na začiatku bola jedna dvojvlaacuteknovaacute DNA a počet cyklov je n) PCR prebieha v termaacutelnom cykleacuteri (teplotnom cyklovači) je to priacutestroj (obr 8) kde je možneacute vykonať a naprogramovať celyacute termaacutelny priebeh PCR reakcie Tabuľka č 2 je priacutekladom termaacutelneho programu pre konkreacutetnu PCR reakciu

Po PCR reakcii je vyacuteslednyacute produkt možneacute vizualizovať elektroforeticky resp použiť na ďalšiu analyacutezu

13

Tab 2 Priacuteklad klasickeacuteho teplotneacuteho a časoveacuteho profilu PCR PCR Teplota Čas Opakovanie

95degC 2 minuacutety

95degC 15 sekuacutend

66degC 60 sekuacutend 30x

72degC 60 sekuacutend

72degC 5 minuacutet

Obr 8 Termaacutelny cykleacuter v procese a otvorenyacute s mikroskuacutemavkami

32 Variaacutecie PCR

Hot-start PCR využiacuteva DNA polymeraacutezu ktoruacute je treba aktivovať vysokou teplotou (napr 95degC 10 minuacutet) Vyacutehodou použiacutevania hot-start polymeraacutez je možnosť pracovať pri laboratoacuternej teplote keďže polymeraacuteza je pri bežnej teplote neaktiacutevna a tyacutem nemocircže docircjsť k vzniku nešpecifickyacutech produktov

Touchdown PCR maacute v počiatočnyacutech cykloch vyššiu teplotu annealingu (uacutečelom je zvyacutešiť

špecificitu PCR produktov na začiatku PCR) neskocircr sa teplota annealingu zniacuteži čo maacute za naacutesledok vyššiacute vyacuteťažok PCR produktu

Nested PCR maacute dva kroky a potrebuje dva paacutery primerov V prvom kroku sa prostredniacutectvom

prvej sady primerov amplifikuje dlhšiacute DNA fragment Ten sa použije ako templaacutet v druhom kroku s druhou sadou primerov s vyacuteslednyacutem kratšiacutem DNA produktom Nested PCR zvyšuje špecifickosť a citlivosť diagnostickyacutech PCR

Multiplex PCR je vlastne viac PCR reakciiacute prebiehajuacutecich v jednej skuacutemavke suacutečasne

V reakčnej zmesi je viac paacuterov primerov suacutečasne prebehne amplifikaacutecia viaceryacutech uacutesekov DNA takto dochaacutedza k šetreniu vzorky reakčnej zmesi a pracovneacuteho času

14

Real-time PCR je venovanaacute špeciaacutelna časť v skriptaacutech Sluacuteži na kvantifikaacuteciu PCR produktu v reaacutelnom čase na zaacuteklade merania fluorescencie okrem kvantifikaacutecie je využiacutevanaacute aj na určenie genotypov

RT-PCR je variaacutecia PCR umožňujuacuteca amplifikaacuteciu DNA sekvencie z vyacutechodiskovej RNA

sekvencie Najskocircr musiacute prebehnuacuteť prepis RNA do jednovlaacuteknovej cDNA prostredniacutectvom reverznej transkriptaacutezy naacutesledne sa cDNA použije pre PCR Selektiacutevnym použitiacutem primerov pri reverznej transkripcii mocircžeme uacutečelovo prepiacutesať buď celkovuacute RNA (primery - random hexameacutery) alebo len mRNA (primery - oligoT)

Alelovo-špecifickaacute PCR (AS-PCR) (obr 9) sluacuteži na detekciu konkreacutetnych mutaacuteciiacute

a jednonukleotidovyacutech polymorfizmov (SNP) Použije sa sada 3 primerov v dvoch kombinaacuteciaacutech PCR reakciiacute dva primery majuacute odlišnuacute sekvenciu na 3acute-koncoch jeden na detekciu wt (wild type) a druhyacute primer na detekciu mutantnej alely reakcia neprebehne ak miesto na templaacutetovej DNA nie je komplementaacuterne k 3acute-koncu primeru pretože DNA polymeraacuteza vyžaduje uacuteplnuacute hybridizaacuteciu primera na 3acute-konci Takto je možneacute rozliacutešiť priacutetomnosť štandardnej (wildtype ndash wt) a mutantnej alely resp SNP (obr 9) AS-PCR je znaacutema aj pod ďalšiacutemi naacutezvami ASO-PCR (allele-specific oligonucleotide PCR) ARMS (amplification-refractory mutation system)

Obr 9 Alelovo-špecifickaacute PCR (AS-PCR)

Mutageneacuteza prostredniacutectvom PCR (site directed mutagenesis) sa použiacuteva keď je potrebneacute vytvoriť mutaacuteciu v špecifickom mieste geacutenu primerprimery majuacute modifikovanuacute sekvenciu tak že obsahujuacute mutaacuteciu v strednej časti čo neovplyvniacute hybridizaacuteciu primerov s templaacutetovou DNA pričom vyacutesledkom je PCR produkt s cielene mutovanou DNA sekvenciou

Asymetrickaacute PCR sa použiacuteva na synteacutezu koacutepiiacute jedneacuteho vlaacutekna z templaacutetovej DNA a to

použitiacutem veľmi niacutezkej koncentraacutecie jedneacuteho primeru Sekvenačnaacute PCR je PCR v ktorej je použityacute len jeden primer a v reakčnej zmesi suacute okrem

všetkyacutech dNTP priacutetomneacute dideoxynukleotidtrifosfaacutety (ddNTP) značeneacute raacutedioaktiacutevne dnes však prevažne fluorescenčne každyacute typ ddNTP inou fluorescenčnou farbičkou Zaradenie niektoreacuteho zo štyroch ddNTP spocircsobiacute terminaacuteciu (zastavenie) predlžovania DNA reťazca fluorescenčneacute označenie ddNTP umožniacute detekciu dĺžky fragmentu a určenie sekvencie posledneacuteho nukleotidu Vyacuteslednyacute produkt sekvenačnej PCR sluacuteži na sekvenovanie Sekvenovaniu sa venuje samostatnaacute časť

MLPA (multiplex ligation-dependent probe amplification) ndash multiplexnaacute amplifikaacutecia proacuteb zaacutevislaacute od ligaacutecie je variaacutecia multiplexnej PCR umožňujuacuteca namnoženie viaceryacutech uacutesekov DNA za použitia iba jedneacuteho paacuteru primerov avšak s podmienkou vytvorenia sekvenčne špecifickej proacuteby ligaacuteciou sekvenčne špecifickyacutech oligonukleotidov MLPA je metoacuteda umožňujuacuteca detekciu počtu koacutepiiacute

15

až 50 nukleotidovyacutech sekvenciiacute v jednej reakcii Pomocou MLPA je možneacute ryacutechlo identifikovať amplifikaacutecie a deleacutecie veľkeacuteho počtu geacutenov či už z DNA alebo mRNA okrem toho MLPA mocircže byť použitaacute na analyacutezu CpG-metylaacutecie (MS-MLPA) Viac informaacutecii v samostatnej časti

SNaPshotreg Multiplex nazyacutevaneacute aj minisekvenovanie je multiplexnaacute reakcia v ktorej je každyacute primer predĺženyacute iba o jeden nukleotid (obr 10) V reakčnej zmesi nie suacute priacutetomneacute deoxyribonukleotidtrifosfaacutety ale len dideoxyribonukleotidtrifosfaacutety (ddATP ddCTP ddGTP ddTTP) každyacute označenyacute inou fluorescenčnou farbičkou Po integraacutecii ddNTP do DNA vlaacutekna je polymerizaacutecia ukončenaacute Jednovlaacuteknoveacute fragmenty (primery) predĺženeacute presne o jeden ddNTP suacute separovaneacute kapilaacuternou elektroforeacutezou v genetickom analyzaacutetore pričom je detegovanaacute ich fluorescencia a dĺžka (obr 11) Z vyacutesledneacuteho elektroforetogramu (obr 12) je možneacute určiť v jednej reakcii sekvenciu vo viac ako v 10 lokalitaacutech určiteacuteho fragmentu DNA SNaPshot Multiplex sa v molekulaacuterno-genetickom laboratoacuteriu využiacuteva na ryacutechlu detekciu viaceryacutech najčastejšie sa vyskytujuacutecich mutaacuteciiSNP geacutenu

Obr 10 Priacuteklad využitia metoacutedy SnaPshot s použitiacutem sady 13 primerov ktoreacute sa predĺžia len o 1 značenyacute dideoxynukleotid SNaPshot najčastejšiacutech mutaacuteciiacute geacutenu pre 21-hydroxylaacutezu (CYP21A2) ktoreacute spocircsobujuacute kongenitaacutelnu adrenaacutelnu hyperplaacuteziu A T G a C predstavujuacute fluorescenčne značeneacute dideoxynukleotidy

Obr 11 Vyacutesledok analyacutezy DNA pacienta metoacutedou minisekvenovania SnaPshot konkreacutetne použitiacutem sady 13 primerov rozlišujuacutecich najčastejšie bodoveacute mutaacutecie geacutenu pre 21-hydroxylaacutezu (CYP21A2) analyacutezou sa zistila mutaacutecia V281L v heterozygotnom stave (dva fragmenty modryacute a červenyacute)

16

Obr 12 SNaPshot analyacuteza geacutenu CYP21A2 u DNA izolovanej z plodovej vody metoacuteda deteguje najčastejšie bodoveacute mutaacutecie geacutenu pre 21-hydroxylaacutezu vyacutesledok prenataacutelnej analyacutezy = priacutetomnosť mutaacutecie In2G v hemizygotnom stave (keďže qPCR metoacutedou bola u plodu zistenaacute priacutetomnosť len jednej koacutepie geacutenu CYP21A2)

33 Kvantitatiacutevna PCR (qPCR)

Polymeraacutezovou reťazovou reakciou (PCR) docielime namnoženie (amplifikaacuteciu) určiteacuteho DNA uacuteseku (templaacutetu) PCR je katalyzovanaacute DNA polymeraacutezou za priacutetomnosti primerov dNTPs dvojmocnyacutech katioacutenov (ako Mg+2) a pufrovacieho roztoku

Real-time PCR ktoraacute je nazyacutevanaacute aj kvantitatiacutevna PCR (qPCR) umožňuje vizualizaacuteciu a kvantifikaacuteciu amplifikaacutecie DNA v reaacutelnom čase to je tak ako to bežiacute počas PCR qPCR využiacuteva fluorescenčneacute chemikaacutelie (farbivaacute) ktoryacutech emitovanuacute fluorescenciu zaznamenaacuteva optickyacute systeacutem počas každeacuteho PCR cyklu zaznamenanaacute fluorescencia je naacutesledne softveacuterovo spracovanaacute a vyhodnotenaacute

V suacutečasnosti sa využiacutevajuacute dva typy qPCR cheacutemie a to farbivaacute viažuce sa na DNA a fluorescenčne značeneacute proacuteby (obr 13)

Farbivaacute viažuce sa na DNA emitujuacute fluorescenciu v priacutepade ak suacute naviazaneacute na dvojvlaacuteknovuacute DNA proacuteby fluoreskujuacute v priacutepade keď molekula zhaacutešača (angl quencher - Q) sa nenachaacutedza v bliacutezkosti molekuly reporteacutera (R) napr hydrolyzujuacutece proacuteby fluoreskujuacute keď je molekula reporteacutera (R) prostredniacutectvom 5acuteexonukleaacutezovej aktivity DNA polymeraacutezy odstraacutenenaacute z bliacutezkosti molekuly zhaacutešača (Q)

Grafickyacute priebeh real ndash time PCR znaacutezorňuje amplifika čnaacute krivka (angl amplification plot) (obr 14) majuacuteca 4 faacutezy 1) Faacuteza I ndash dochaacutedza k zdvojnaacutesobeniu množstva amplikoacutenu po každom cykle ale naacuterast fluorescencie je pod detekčnyacutem limitom zaznamenaacutevanaacute fluorescencia (baseline) zodpovedaacute zaacutekladnej fluorescencii pozadia tzv šumu

17

2) Faacuteza II nazyacutevanaacute aj exponenciaacutelna faacuteza v ktorej sa fluorescencia zvyacuteši na uacuteroveň optickej detekcie bod resp cyklus kedy začiacutena exponenciaacutelna faacuteza je kľuacutečovyacute na určenie kvantity vstupneacuteho množstva templaacutetovej DNA nazyacuteva sa prahovyacute cyklus označuje sa Ct (angl treshold cycle) alebo Cq (quantification) Čiacutem nižšie je Ct (Cq) tyacutem vaumlčšiacute počet koacutepiiacute templaacutetovej DNA bolo v reakcii Ct hodnota je teda hlavnyacute uacutedaj s ktoryacutem sa pracuje vo vyacutepočtoch fluorescencia v tomto mieste sa nazyacuteva prahovaacute resp treshold 3) Faacuteza III - lineaacuterna faacuteza ndash charakterizuje ju postupneacute spotrebovaacutevanie komponentov reakcie na narastajuacutece množstvo amplikoacutenu 4) Faacuteza IV - plateau (čiacutetaj platoacute) ndash množstvo amplikoacutenu sa v docircsledku vyčerpania zložiek qPCR už nezvyšuje

Obr 13 Princiacutep real-time PCR Obr 14 Faacutezy real-time PCR

Ako štandardnaacute PCR aj qPCR maacute tri zaacutekladneacute kroky 1) Denaturaacutecia dvojvlaacuteknovej DNA na jednovlaacuteknovuacute DNA pri vysokej teplote (obyčajne 95degC) 2) Hybridizaacutecia primerov (annealing) ndash komplementaacuterne sekvencie sa spolu hybridizujuacute 3) Polymerizaacutecia pri 70-72degC kedy v docircsledku optimaacutelnej aktivity DNA polymeraacutezy dochaacutedza k predĺženiu primeru až o 100 baacutez za sekundu

18

Real-time PCR (obr 15) sa využiacuteva na kvantifikaacuteciu expresie geacutenov určenie počtu koacutepiiacute geacutenov určenie genotypu (genotypovanie) alelovou diskriminaacuteciou alebo analyacutezou krivky topenia tzv high resolution melt a multiplexnuacute real time PCR s možnosťou detekcie viaceryacutech cieľovgeacutenov

Multiplexnaacute real-time PCR sa využiacuteva na detekciu viaceryacutech cieľovgeacutenov v jednej reakcii suacutečasne Vyacutehodou multiplexovania je jednak uacutespora vzorky ako aj ziacuteskanie vaumlčšieho množstva informaacuteciiacute z rovnakeacuteho množstva materiaacutelu Nevyhnutnosťou multiplexnej qPCR suacute proacuteby značeneacute rocircznymi fluorescenčnyacutemi farbivami

Najdocircležitejšie zložky qPCR (real-time PCR komponenty) suacute DNA polymeraacuteza (reverznaacute transkriptaacuteza v priacutepade jednokrokovej kvantitatiacutevnej RT-PCT) dNTPs primery resp primeryproacuteby dvojmocneacute Mg templaacutet Na uľahčenie qPCR suacute v suacutečasnosti už komerčne dostupneacute takeacute reakčneacute zmesi ku ktoryacutem stačiacute pridať už len templaacutet (napr kity využiacutevajuacutece TaqManProacuteby) alebo kity s fluorescenčnyacutemi farbami viažucimi sa na dvojvlaacuteknovuacute DNA ku ktoryacutem sa do reakčnej zmesi okrem templaacutetu pridajuacute primery

Obr 15 Real-time PCR cykleacuter

331 Kvantifikaacutecia pomocou qPCR

Na kvantifikaacuteciu DNA pomocou qPCR sa požiacutevajuacute dve zaacutekladneacute metoacutedy - absoluacutetna kvantifikaacutecia a relatiacutevna kvantifikaacutecia

Absoluacutetna kvantifikaacutecia vychaacutedza zo štandardnej krivky (obr 16) ktoraacute sa ziacuteska po qPCR seacuterie riedeniacute DNA znaacutemej koncentraacutecie Kvantifikaacutecia neznaacutemej vzorky sa zistiacute interpolaacuteciou (odčiacutetaniacutem) Ct neznaacutemej vzorky zo štandardnej krivky (obr 16 17) Využiacutevaneacute napr v kriminalistike na stanovenie koncentraacutecie DNA vo vzorke

Relatiacutevna kvantifikaacutecia (obr 18 19) porovnaacuteva uacuteroveň expresie určiteacuteho geacutenu vo vzorke k expresii toho isteacuteho geacutenu v referenčnej (kontrolnej) vzorke alebo množstvo určiteacuteho geacutenu (počet koacutepiiacute) vo vzorke porovnaniacutem s množstvom geacutenu v kontrolnyacutech vzorkaacutech V raacutemci každej vzorky musiacute pred relatiacutevnou kvantifikaacuteciou docircjsť k tzv normalizaacutecii t j porovnanie expresie sledovaneacuteho geacutenu k expresii referenčneacuteho geacutenu (najčastejšie niacutem byacuteva tzv bdquohousekeepingldquo geacuten napr GAPDH aktiacuten tubuliacuten)

V priacutepade kvantifikaacutecie expresie určiteacuteho geacutenu metoacutedou real-time PCR (RT-qPCR) pred samotnou kvantifikaacuteciou cDNA musiacute byť taacuteto cDNA nasyntetizovanaacute prostredniacutectvom reverznej

19

transkripcie za použitia enzyacutemu reverznej transkriptaacutezy Kvantitatiacutevna PCR s reverznou transkripciou RT-qPCR mocircže byť dvojkrokovaacute alebo jednokrokovaacute Pri dvojkrokovej RT-qPCR treba pred qPCR syntetizovať cDNA vlaacutekno z RNA pomocou reverznej transkriptaacutezy - 1 krok druhyacutem krokom je samotnaacute real-time PCR Jednokrokovaacute RT-qPCR umožňuje uskutočniť obidve reakcie reverznuacute transkripciu a kvantitatiacutevnu PCR v jednej skuacutemavke čo zjednodušuje qPCR a redukuje možnosť kontaminaacutecie Obr 16 5-bodovaacute štandardnaacute krivka (amplifikaacutecia piatich koncentraacuteciiacute jednej vzorky konkreacutetne ide o 10-tkoveacute riedenie)

Obr 17 Ukaacutežka amplifikačnyacutech kriviek riedenia a z nich ziacuteskanej štandardnej krivky poukazuje na vysokuacute presnosť metoacutedy RT-PCR

20

Obr 18 Relatiacutevna kvantifikaacutecia - určenie počtu koacutepiiacute geacutenu CYP21A2 vo vzorke DNA izolovanej z perifeacuternej krvi pacientov mutaacutecie v geacutene CYP21A2 spocircsobujuacute kongenitaacutelnu adrenaacutelnu hyperplaacuteziu (CAH) Vyacutesledok analyacutezy všetci pacienti majuacute dve koacutepie geacutenu

Obr 19 Relatiacutevna kvantifikaacutecia - určenie počtu koacutepiiacute geacutenu CYP21A2 vo vzorke DNA izolovanej z plodovej vody mutaacutecie v geacutene CYP21A2 spocircsobujuacute kongenitaacutelnu adrenaacutelnu hyperplaacuteziu (CAH) Prenaacutetalnou diagnostikou (qPCR) sa zistila priacutetomnost jednej koacutepie CYP21A2 geacutenu 332 Určenie genotypu metoacutedou alelovej diskriminaacutecie a analyacutezou krivky topenia (HRM)

Určenie genotypu metoacutedou alelovej diskriminaacutecie (obr 20) sa uskutočňuje použitiacutem hydrolyzujuacutecich proacuteb (sond) je veľmi ryacutechla a senzitiacutevna (presnaacute) metoacuteda frekventovane využiacutevanaacute v laboratoacuteriaacutech Dva variantyalely suacute vyšetreneacute suacutečasne v jednej vzorke a v jednej reakčnej

21

skuacutemavke V reakcii suacute použiteacute dve proacuteby označeneacute rozdielnymi fluorescenčnyacutemi farbičkami emitujuacutecimi svetlo o rocircznej vlnovej dĺžke (najčastejšie jedna označenaacute FAM farbičkou a druhaacute proacuteba označenaacute VIC farbičkou) Počas amplifikaacutecie amplikoacutenu dochaacutedza k odstraacuteneniu zhaacutešača z bliacutezkosti farbičky ktoraacute potom emituje svetlo priacuteslušnej vlnovej dĺžky Vzorky so signaacutelom len jednej fluorescenčnej farbičky (FAM) a bez signaacutelu druhej farbičky (VIC) suacute homozygoti pre alelu 1 vzorky so signaacutelom len druhej farbičky (VIC) a bez signaacutelu prvej (FAM) suacute homozygoti pre alelu 2 v priacutepade ak vyšetrovanaacute vzorka bdquosvietildquo obidvoma farbami jednaacute sa o heterozygota

Obr 20 Určenie genotypu metoacutedou alelovej diskriminaacutecie ndash amplifikačnaacute krivka vzoriek DNA majuacutecich tri rocirczne genotypy A ndash jednotliveacute vzorky (plnaacute čiara predstavuje štandardnuacute alelu guličkovanaacute mutovanuacute alelu) B ndash 72 vzoriek C ndash scatter plot 72 vzoriek

Určenie genotypu analyacutezou krivky topenia tzv high resolution melt (HRM) (obr 21) umožňuje detekciu takmer všetkyacutech genetickyacutech variaacuteciiacute (SNP mutaacuteciiacute) Keďže taacuteto metoacuteda okrem štandardnyacutech podmienok reakcie vyžaduje len primery a farbičku (nie proacuteby) je veľmi jednoduchaacute a lacnejšia Po amplifikaacuteciiacute treba amplikoacuten pomaly zohrievať až kyacutem nedocircjde k denaturaacuteciiacute Teplota topenia amplikoacutenu vo vzorke zaacutevisiacute od DNA sekvencie čo umožňuje detegovať priacutetomnosť mutaacutecie resp SNP Tvar vyacuteslednyacutech kriviek topenia určuje teda genotyp

22

Obr 21 Určenie genotypu analyacutezou krivky topenia tzv metoacutedou high resolution melting (HRM) A ndash krivka topenia vzoriek DNA majuacutecich tri rocirczne genotypy B ndash graf rozdielnosti krivky topenia vzoriek DNA majuacutecich tri rocirczne genotypy

23

4 Elektroforetickaacute separaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten

Separaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten predstavuje rozdelenie molekuacutel DNA alebo RNA na zaacuteklade veľkosti zloženia a poradia baacutez Podobnyacutemi metoacutedami je možneacute separovať aj proteiacuteny

Elektroforeacuteza (ELFO) je technika použiacutevanaacute na separaacuteciu niekedy aj purifikaacuteciu makromolekuacutel ako suacute nukleoveacute kyseliny a proteiacuteny na zaacuteklade ich rozdielnej veľkosti naacuteboja alebo konformaacutecie Je to metoacuteda veľmi často využiacutevanaacute nielen v molekulovej genetike ale aj biocheacutemii Elektroforeacuteza využiacuteva schopnosť nabityacutech molekuacutel migrovať v jednosmernom elektrickom poli k opačneacutemu poacutelu Nukleoveacute kyseliny majuacute vďaka svojej fosfaacutetovej zložke negatiacutevny naacuteboj preto v jednosmernom elektrickom poli migrujuacute ku kladneacutemu poacutelu čiže k anoacutede Elektroforeacuteza prebieha v elektroforetickej aparatuacutere v geacuteloch (v nosiči) so sieťovitou štruktuacuterou ktoraacute umožňuje separaacuteciu molekuacutel Vzorka nukleovej kyseliny zmiešanaacute s tzv nanaacutešaciacutem tlmivyacutem roztokom s farbičkou sa nanesie do jamky v geacuteli ktoryacute je umiestnenyacute v elektroforetickej aparatuacutere v priacutetomnosti elektroforetickeacuteho pufra (TAE alebo TBE) (obr 22) Nanaacutešaciacute tlmivyacute roztoknanaacutešacia farbička umožňuje na zaacuteklade migraacutecie farbičky vidieť migraacuteciu vzorky v geacuteli a suacutečasne zvyacutešeniacutem hustoty vo vzorke umožniacute klesnuacuteť vzorke do jamky a tak zabraacuteniť jej vyplaveniu z geacutelu Draacuteha je časť geacutelu ktoryacutem putuje jedna vzorka od katoacutedy k anoacutede V draacutehe sa nachaacutedzajuacute oddeleneacute jednotliveacute fragmenty nukleovyacutech kyseliacuten určityacutech veľkostiacute viditeľneacute vo forme pruacutežkov (angl bands) Intenzita pruacutežku zaacutevisiacute od množstva molekuacutel danej veľkosti je ekvivalentnaacute hmotnosti Na určenie veľkosti fragmentov NK sa do jednej jamky nanesie štandard molekulovyacutech hmotnostiacute (angl ladder) ktoryacute maacute presne definovaneacute veľkosti fragmentov čo umožňuje odhadnuacuteť veľkosť aj hmotnosť neznaacutemych separovanyacutech fragmentov

Obr 22 Elektroforetickaacute separaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten v agaroacutezovom geacuteli (A) a vizualizaacutecia UV svetlom a GelRedtrade (B C)

24

Nukleoveacute kyseliny je možneacute elektroforeticky separovať 1) v geacuteloch agaroacutezovom (horizontaacutelna elektroforeacuteza) (obr 22) a polyakrylamidovom (vertikaacutelna elektroforeacuteza) 2) v špeciaacutelnych lineaacuternych polymeacuteroch kapilaacuternou elektroforeacutezou použitiacutem genetickeacuteho analyzaacutetora (obr 23)

Agaroacuteza je polysacharid ziacuteskanyacute z morskej riasy použiacuteva sa najčastejšie v koncentraacuteciiacute 05-2 čiacutem vyššia koncentraacutecia tyacutem je geacutel pevnejšiacute a schopnejšiacute rozliacutešiť menšie fragmenty NK Priacuteprava je jednoduchaacute odvaacuteži sa potrebneacute množstvo agaroacutezy ktoraacute sa zmieša s tlmivyacutem roztokom (pufrom) rozvariacute sa v mikrovlnnej ruacutere a naleje sa do špeciaacutelnej naacutedoby na vytvaacuteranie geacutelov kyacutem je geacutel tekutyacute vložiacute sa do neho tzv hrebeň na vytvorenie jamiek Agaroacuteza je netoxickaacute V bežnom agaroacutezovom geacuteli v zaacutevislosti od jeho koncentraacutecie je možneacute separovať DNA fragmenty dĺžky 200-50 000 bp Dnes suacute dostupneacute aj špeciaacutelne agaroacutezy napr MetaPhorreg Agarose schopneacute oddeliť fragment DNA dĺžky 20-800bp Separaacutecia v agaroacutezovom geacuteli prebieha v horizontaacutelnej aparatuacutere preto sa nazyacuteva aj horizontaacutelna elektroforeacuteza

Polyakrylamidovyacute geacutel (PAGE) vznikaacute polymerizaacuteciou akrylamidu v priacutetomnosti špeciaacutelnych chemickyacutech laacutetok (peroxodisiacuteran amoacutenny TEMED bisakrylamid) Jeho priacuteprava je preto odlišnaacute a aj naacuteročnejšia Polyakrylamidoveacute geacutely majuacute vysokuacute rozlišovaciu schopnosť (1bp) preto suacute PAGE geacutely vhodneacute aj na sekvenovanie DNA klasickyacutemi metoacutedami PAGE geacutel nie je vhodnyacute na separaacuteciu fragmentov dlhšiacutech ako 2kb Použiacuteva sa v koncentraacutecii 35 -20 s rozliacutešeniacutem fragmentov od 10bp-2000bp Akrylamid je neurotoxiacuten musiacute sa s niacutem pracovať veľmi opatrne PAGE elektroforeacuteza bežiacute vo vertikaacutelnej aparatuacutere preto sa volaacute aj vertikaacutelna elektroforeacuteza použiacuteva sa často aj na separaacuteciu proteiacutenov

Ryacutechlosť pohybu nukleovyacutech kyseliacuten (mobilita) určuje viacero faktorov 1) veľkosť NK ndash počet baacutezovyacutech paacuterov resp baacutez pričom menšie molekuly prechaacutedzajuacute geacutelom ryacutechlejšie pretože sa ľahšie pohybujuacute v geacuteli 2) konformaacutecia nukleovej kyseliny napr u rovnako veľkyacutech plazmidov kondenzovaneacute superšpiralizovaneacute plazmidy migrujuacute najryacutechlejšie rovnako veľkeacute lineaacuterne molekuly (toho isteacuteho plazmidu) bežia pomalšie a najpomalšie putujuacute relaxovaneacute kruhoveacute molekuly plazmidu 3) koncentraacutecia geacutelu určuje jeho rozlišovaciu schopnosť koncentrovanejšiacute geacutel je schopnyacute separovať kratšie fragmenty NK redšie geacutely suacute vhodneacute pre rozliacutešenie vaumlčšiacutech fragmentov 4) zloženie geacutelu je docircležiteacute pri analyacuteze sekundaacuternych štruktuacuter NK a proteiacutenov v nedenaturovanom stave sekundaacuterna štruktuacutera spomaľuje migraacuteciu NK a proteiacutenov Tento fakt využiacutevajuacute niektoreacute diagnostickeacute techniky (napr SSCP - Single Strand Conformation Polymorphism - polymorfismus konformaacutecie jednovlaacuteknovej DNA) umožňujuacutece detekciu zaacutemeny jedinej baacutezy ktoraacute spocircsobiacute odlišneacute vnuacutetromolekuloveacute paacuterovanie a vyacuteslednuacute konformaacuteciu molekuly Geacutely mocircžu teda byť denaturačneacute a nedenaturačneacute (natiacutevne) 5) napaumltie zdroja - čiacutem vyššie je napaumltie ktoreacute vytvaacutera elektrickeacute pole v elektroforetickej aparatuacutere tyacutem ryacutechlejšie fragmenty NK migrujuacute 6) zloženie roztokov a teploty

Elektroforetickyacute tlmivyacute roztok (pufor - elektrolyt) zabezpečuje stabilneacute elektroforetickeacute podmienky počas separaacutecie geacutel je v ňom ponorenyacute Obsahuje ioacuteny čo umožňuje vedenie elektrickeacuteho pruacutedu

Štandard molekulovyacutech hmotnostiacute (v laboratoacuteriaacutech nazyacutevanyacute ladder alebo marker) je zmes fragmentov DNA alebo RNA s presne definovanou veľkosťou ktoryacute sluacuteži na odhad veľkosti vyšetrovanyacutech fragmentov NK (obr 22) Pomocou špeciaacutelnych štandardov molekulovyacutech hmotnostiacute ktoryacutech fragmenty NK majuacute definovanuacute aj hmotnosť je možneacute odhadnuacuteť množstvo (hmotnosť - koncentraacuteciu) neznaacutemeho fragmentu

B C

25

41 Vizualizaacutecia DNA

Samotnaacute nukleovaacute kyselina je počas elektroforetickej separaacutecie neviditeľnaacute Vizualizaacuteciu NK umožňujuacute interkalačneacute činidlaacute ktoreacute suacute schopneacute naviazať sa na molekuly NK tyacutem že sa včlenia medzi susediace baacutezy Po ožiareniacute UV svetlom interkalačneacute činidlaacute naviazaneacute na NK fluoreskujuacute tak sa vizualizuje NK čiacutem intenziacutevnejšie fluoreskuje tyacutem viac NK je v geacutelipruacutežku priacutetomneacute Interkalačneacute činidlo sa buď primieša do geacutelu pri jeho priacuteprave čo umožniacute sledovať migraacuteciu fragmentov NK počas elektroforeacutezy a to po vybratiacute z ELFO aparatuacutery a po ožiareniacute UV svetlom alebo sa geacutel farbiacute po elektroforetickej separaacutecii V minulosti bol na zviditeľnenie NK najčastejšie použiacutevanyacute etidiumbromid kvocircli jeho mutageacutennym vlastnostiam sa v suacutečasnosti nahraacutedza menej mutageacutennymi a netoxickyacutemi činidlami ako suacute napr komerčne dostupneacute SYBRregSafe GelRedtrade GelGreentrade

Kapilaacuterna elektroforeacuteza NK prebieha v špeciaacutelnom priacutestroji genetickom analyzaacutetore (obr 23) ktoryacute musiacute mať zaacutekladneacute komponenty ako suacute elektroacutedy kapilaacutera zdroj vysokeacuteho napaumltia detektor prepojenie s počiacutetačom a softveacuteroveacute vybavenie priestor na vloženie vzoriek atď Genetickyacute analyzaacutetor predstavuje automatizovanyacute systeacutem umožňujuacuteci sekvenovanie určovanie dĺžky DNA fragmentov ndash fragmentačnuacute analyacutezu a kvantifikaacuteciu nukleovyacutech kyseliacuten V novšiacutech typoch genetickeacuteho analyzaacutetora je proces analyacutezy od vloženia vzoriek do stojana automatizovanyacute

Vzorka určenaacute na analyacutezu je elektrokineticky injektovanaacute do tenkej kapilaacutery naplnenej lineaacuternym polymeacuterom Vplyvom vysokeacuteho napaumltia sa negatiacutevne nabiteacute fragmenty DNA pohybujuacute v polymeacuteri k pozitiacutevne nabitej elektroacutede Kapilaacuterna elektroforeacuteza je tak citlivaacute že je schopnaacute detegovať jednobaacutezovyacute rozdiel DNA fragmentov DNA fragmenty musia byť pred kapilaacuternou elektroforeacutezou fluorescenčne označeneacute v kapilaacutere suacute separovaneacute na zaacuteklade veľkosti Kraacutetko pred dosiahnutiacutem kladne nabitej elektroacutedy docircjde po excitaacutecii laserovyacutem žiareniacutem k emisii žiarenia fluoroformi (farbičkami) tak že optickyacute detekčnyacute systeacutem zaznamenaacute fluorescenciu ktoraacute je naacutesledne softveacuterovo spracovanaacute a vyhodnotenaacute

Obr 23 Genetickyacute analyzaacutetor

42 RFLP

Metoacuteda polymorfizmu dĺžky restrik čnyacutech fragmentov (angl Restriction Fragment Length Polymorfism) bola prvou metoacutedou využiacutevanou na detekciu DNA variaacuteciiacute rocircznych biologickyacutech vzoriek Princiacutep metoacutedy spočiacuteva v priacutetomnosti polymorfizmov v DNA sekvencii rocircznych ľudiacute ktoreacute zapriacutečinia rozdielny profil (obrazec) DNA fragmentov po štiepeniacute jednou alebo viaceryacutemi restrikčnyacutemi endonukleaacutezami Restrikčneacute endonukleaacutezy (RE) suacute enzyacutemy ktoreacute štiepia DNA molekulu v oblasti špecifickej nukleotidovej sekvencie nazyacutevanej restrik čneacute miesto RE najčastejšie rozpoznaacutevajuacute a štiepia miesto veľkeacute 4-6 baacutez RE suacute priacutetomneacute u prokaryotov (bakteacuterie a archebakteacuterie) kde suacute suacutečasťou restrik čno-modifikačneacuteho systeacutemu akoby prokaryotickeacutej vrodenej imunity sluacutežia

26

na ochranu pred cudzou DNA (napr viacuterusovou) ktoruacute po rozpoznaniacute špecifickej sekvencie štiepia

Restrikčno-modifikačnyacute systeacutem maacute dve zložky 1) modifikačneacute enzyacutemy - metylaacutezy ktoreacute procesom metylaacutecie modifikujuacute určiteacute baacutezy svojej DNA čiacutem ich označia za vlastnuacute DNA takže takaacuteto DNA je potom rezistentnaacute voči štiepeniu restrikčnyacutemi endonukleaacutezami Najčastejšiacutem spocircsobom metylaacutecie u bakteacuteriiacute je metylaacutecia adeniacutenu na N6 pričom vznikne metyladeniacuten alebo cytoziacutenu na C5 metylcytoziacuten 2) restrikčneacute endonukleaacutezy štiepia špecifickeacute miesto dvojvlaacuteknovej DNA ktoreacute je tvoreneacute symetrickou sekvenciou zrkadlovo sa opakujuacutecich nukleotidov ndash tzv palindroacutem Restrikčneacute enzyacutemy sa použiacutevajuacute na štiepenie DNA sekvencie na mieste špecifickom pre tuacute ktoruacute restrikčnuacute endonukleaacutezu napr pri analyacuteze polymorfizmov dĺžky restrikčnyacutech fragmentov (RFLP) analyacuteze jednonukleotidovyacutech polymorfizmov (SNP) mutaacuteciiacute ako aj pri klonovaniacute DNA do vhodnyacutech vektorovyacutech DNA molekuacutel

Po štiepeniacute dvojvlaacuteknovej DNA restrikčnou endonukleaacutezou mocircžu vzniknuacuteť tri typy koncov - 5´-prečnievajuacutece konce (lepiveacute) 3´-prečnievajuacutece konce (lepiveacute) a tupeacute konce (obr 24)

Obr 24 Restrikčneacute štiepenie zanechaacutevajuacutece rocirczne konce tupeacute a lepiveacute

Restrikčneacute štiepenie je často použiacutevanou metoacutedou geacutenovyacutech manipulaacuteciiacute na konštrukciu

hybridnyacutech molekuacutel DNA s naacuteslednyacutem klonovaniacutem Priebeh RFLP analyacutezy je nasledovnyacute restrikčnaacute endonukleaacuteza sa pridaacute k DNA a zmes sa vo

vhodnyacutech reakčnyacutech podmienkach (pufor teplota) inkubuje niekoľko hodiacuten Počas inkubaacutecie docircjde k štiepeniu DNA na špecifickyacutech miestach DNA je potom elektroforeticky separovanaacute v geacuteli a naacutesledne vizualizovanaacute V minulosti po geacutelovej elektroforeacuteze nasledoval Southern blot (čiže prenos separovanyacutech fragmentov DNA z geacutelu na špeciaacutelnu membraacutenu) (obr 35) po ktorom nastala vizualizaacutecia raacutedioaktiacutevne značenou proacutebou V suacutečasnosti sa kvocircli praacutecnosti a zdravotnyacutem rizikaacutem od Southern blotu upuacutešťa a prechaacutedza sa na ryacutechlejšie menej praacutecne a zdravotne šetrnejšie metoacutedy priateľskejšie aj k životneacutemu prostrediu

RFLP bola prvou metoacutedou použiacutevanou na zistenie DNA profilu (DNA fingerprinting) mapovanie geacutenov zapriacutečiňujuacutece genetickeacute ochorenia a testovanie otcovstva Vaumlčšina RFLP markerov je vysoko lokusovo špecifickyacutech a kodominantnyacutech (obidve alely suacute detekovaneacute u heterozygota)

PCR-RFLP je laboratoacuterne priacutestupnejšia metoacuteda molekulaacuterno-genetickej diagnostiky keďže PCR umožňuje amplifikaacuteciu veľmi malyacutech množstiev DNA Alternatiacutevny naacutezov použiacutevanyacute v literatuacutere je CAPS z angl Cleaved Amplified Polymorphic Sequence assay Použitiacutem špecifickyacutech primerov docircjde PCR metoacutedou k amplifikaacutecii požadovaneacuteho uacuteseku DNA ten sa potom štiepi restrikčnou endonukleaacutezou vo vhodnyacutech podmienkach naacutesledne sa štiepne produkty elektroforeticky separujuacute a vizualizujuacute použitiacutem interkalačnyacutech farbiacutev a UV svetla (obr 25)

27

Obr 25 Princiacutep metoacutedy PCR-RFLP

43 VNTR a STR V geacutenome suacute priacutetomneacute dva typy tandemovyacutech (za sebou nasledujuacutecich) opakovaniacute

1) minisatelity ndash nazyacutevaneacute variabilnyacute počet tandemovyacutech opakovaniacute VNTR (variable number of tandem repeats) 2) mikrosatelity tiež kraacutetke tandemoveacute repetiacutecie STR (short tandem repeats)

Obidva tieto typy satelitnej DNA suacute rozmiestneneacute po celom genoacuteme suacute využiacutevaneacute hlavne vo forenznej genetike na identifikaacuteciu osocircb a určenie otcovstva popriacutepade materstva ale aj v mediciacutene na detekciu chromozoacutemovyacutech aneuploidiiacute Štruktuacutera obidvoch je podobnaacute Rozdiel medzi jednotlivyacutemi alelami je spocircsobenyacute rozdielnym počtom opakovaniacute opakujuacutecej sa sekvencie (motiacutevu) čo spocircsobiacute rocircznu dĺžku alel s rocircznym počtom tandemovyacutech opakovaniacute nazyacutevanuacute polymorfizmus dĺžky fragmentov

VNTR ndash variabilnyacute počet tandemovyacutech opakovaniacute pričom opakujuacuteca sa sekvencia maacute dĺžku od 6 do 100 baacutez pričom sa mocircže opakovať aj tisiacutece kraacutet alely tak mocircžu mať od 500do 30 000 baacutez VNTR boli v kombinaacutecii s RFLP (DNA fingerprinting ) prvyacutem polymorfizmom použiacutevanyacutem na zistenie DNA profilov a identifikaacuteciu osocircb v kriminalistickej praxi V suacutečasnosti jeho využitie v kriminalistike je kvocircli potrebe relatiacutevne veľkeacuteho množstva DNA nahradeneacute využitiacutem STR

STR - kraacutetke tandemoveacute repetiacutecie suacute v kriminalistike najčastejšie použiacutevanyacutem polymorfizmom STR lokusy suacute rozmiestneneacute po celom genoacuteme repetiacutecia obsahuje jednu až šesť baacutez pričom jej opakovaniacutem vznikne STR v rozsahu od 50 do 300bp V našom genoacuteme suacute tisiacutece STR ktoreacute mocircžu byť použiteacute pre forenznuacute analyacutezu V kriminalistike sa v suacutečasnosti na identifikaacuteciu osocircb použiacuteva 13 STR locusov ktoreacute patria k medzinaacuterodne uznaacutevanyacutem štandardom Z iniciatiacutevy FBI bola vytvorenaacute databaacuteza CODIS (Combined DNA Index System) každaacute krajina maacute svoju databaacutezu CODIS kde je možneacute vložiť a archivovať DNA profily jednotlivcov ako aj profily DNA ziacuteskanyacutech z miest kriminaacutelneho činu v databaacuteze je ich možneacute navzaacutejom porovnať a tak zistiť pocircvodcu trestneacuteho činu Medzinaacuterodnaacute jednotnosť v použiacutevaniacute CODIS STR lokusov umožňuje v priacutepade potreby vzaacutejomneacute porovnanie DNA profilov zistenyacutech na uacutezemiacute rocircznych štaacutetov CODIS STR lokusov je 13 a suacute to CSF1PO FGA TH01 TPOX VWA D3S1358 D5S818 D7S820 D8S1179 D13S317 D16S539 D18S51 a D21S11 Zistenie DNA profilu sa uskutočniacute multiplexnou PCR reakciou s fluorescenčne značenyacutemi primermi špecifickyacutemi pre konkreacutetny STR Naacutesledne suacute PCR produkty analyzovaneacute kapilaacuternou elektroforeacutezou genetickyacutem analyzaacutetorom ktoryacute rozliacuteši amplifikovaneacute fragmenty na zaacuteklade fluorescencie a dĺžky (fragmentačnaacute analyacuteza) (obr 26 Tab 3) DNA profil každeacuteho človeka je jedinečnyacute rovnakyacute profil mocircžu mať len jednovaječneacute dvojčataacute

28

Obr 26 Ukaacutežka DNA profilu človeka 15 STR lokusov s určeniacutem pohlavia pomocou lokusu pre amelogeniacuten (ženskeacute pohlavie - XX) maleacute oranžoveacute piacuteky predstavujuacute fragmenty veľkostneacuteho štandardu Tabuľka č 3 Zaacutepis DNA profilu človeka z obraacutezka č 26 15 STR lokusov s určeniacutem pohlavia pomocou lokusu pre amelogeniacuten System Alela 1 Alela 2

D3S1358 16 17

TH01 9 93 D21S11 28 28

D18S51 15 18

Penta E 7 14 D5S818 9 12

D13S317 8 11

D7S820 8 11 D16S539 11 12

CSF1PO 10 11

Penta D 11 12 vWA 15 18

D8S1179 13 16

TPOX 8 9 FGA 20 21

amel X X

29

5 MLPA

Multiplexnaacute amplifikaacutecia proacuteb zaacutevislaacute od ligaacutecie (z angl multiplex ligation-dependent probe amplification) je metoacuteda schopnaacute v jednej reakcii (v jednej skuacutemavke a vzorke) detegovať zmeny v počte až 50 nukleotidovyacutech sekvenciiacute Metoacutedou MLPA je možneacute ryacutechlo identifikovať amplifikaacutecie (duplikaacutecie) a deleacutecie veľkeacuteho počtu geacutenov či už použitiacutem DNA alebo mRNA krvnyacutech vzoriek alebo vzoriek z naacutedorov

Princiacutep MLPA spočiacuteva v multiplexnej amplifikaacutecii 50 špecifickyacutech nukleotidovyacutech sekvenciiacute použitiacutem jedneacuteho paacuteru primerov pričom jeden primer je fluorescenčne označenyacute Vyacutesledneacute PCR produkty suacute analyzovaneacute kapilaacuternou elektroforeacutezou (fragmentačnaacute analyacuteza) Dĺžka každeacuteho namnoženeacuteho produktu je jedinečnaacute narastaacute postupne o 6 alebo 9 nukleotidov pričom produkty PCR suacute 120 ndash 500 nukleotidov dlheacute Tento veľkostnyacute rozsah PCR fragmentov (dĺžka 120-500 nukleotidov s naacuterastom postupne o 6 alebo 9 nukleotidov) je optimaacutelny pre kapilaacuternu elektroforeacutezu MLPA multiplexnaacute PCR prebieha za použitia iba jedineacuteho paacuteru primerov ktoreacute amplifikujuacute špecifickeacute sekvencie Trik spočiacuteva v tom že nedochaacutedza k amplifikaacutecii DNA sekvencie ale MLPA proacuteb ktoreacute suacute pridaneacute k vzorkaacutem Každaacute MLPA proacuteba pozostaacuteva z dvoch oligonukleotidov (dve hemiproacuteby) pričom každyacute oligonukleotid obsahuje jednu zo sekvencie rozpoznaacutevanuacute PCR primermi Proacuteba vznikne jedine za predpokladu hybridizaacutecie dvoch oligonukleotidov (hemiproacuteb) k cieľovej sekvencii (geacutenu) a po ligaacutecii enzyacutemom ligaacutezou Iba ligovaneacute proacuteby suacute exponenciaacutelne amplifikovaneacute pomocou jedneacuteho paacuteru primerov Množstvo zligovanyacutech proacuteb teda zaacutevisiacute od množstva cieľovyacutech sekvenciiacute (geacutenov) vo vzorke

Postup MLPA analyacutezy je nasledovnyacute (obr27) K vzorke nukleovej kyseliny (DNA resp mRNA) sa pridaacute zmes 50 jedinečnyacutech proacuteb každaacute

proacuteba je komplementaacuterna k určitej cieľovej sekvencii NK vzorky Každaacute proacuteba však pozostaacuteva z dvoch oligonukleotidov hybridizujuacutecich vedľa seba zaacuteroveň každyacute oligonukleotid (hemiproacuteba) obsahuje pridanuacute sekvenciu rozpoznaacutevanuacute paacuterom PCR primerov Po hybridizaacuteciiacute oligonukleotidov (hemiproacuteb) dochaacutedza k ich ligaacutecii ligaacutezou Ligačnaacute reakcia je tak špecifickaacute že je schopnaacute rozliacutešiť sekvenciu liacutešiacu sa v jednom nukleotide Vyacuteslednyacute ligačnyacute produkt (proacuteba) obsahuje obidve sekvencie pre PCR primery na jednom fragmente čiže mocircže docircjsť k namnoženiu takeacutehoto fragmentu PCR reakciou V priacutepade ak nedocircjde k ligaacutecii priacuteslušnyacutech hemiproacuteb pretože hemiproacuteby nenaacutejdu cieľovuacute sekvenciu na DNA každaacute takaacuteto nezligovanaacute hemiproacuteba maacute len jednu sekvenciu rozpoznaacutevanuacute len jednyacutem PCR primerom v docircsledku čoho nemocircže prebehnuacuteť jej PCR amplifikaacutecia a počas fragmentačnej analyacutezy nie je detegovanaacute pretože negeneruje fluorescenčnyacute signaacutel

Pri MLPA analyacuteze je docircležiteacute okrem MLPA amplifikaacutecie vzorky urobiť aj MLPA amplifikaacuteciu referenčnej vzorky ku ktorej sa bude porovnaacutevať počet geacutenov (cieľovyacutech sekvenciiacute) Po kapilaacuternej elektroforeacuteze MLPA referenčnej a skuacutemanej vzorky porovnaniacutem obsahu nameranyacutech hodnocirct tzv piacutekov priacuteslušnyacutech proacuteb sa určiacute relatiacutevny počet koacutepiiacute v skuacutemanej vzorke

MLPA

1 DNA denaturaacutecia a hybridizaacutecia s MLPA proacutebami (hemiproacuteby)

2 Ligaacutecia (vytvorenie kompletnyacutech proacuteb)

3 PCR amplifikaacutecia proacuteb paacuterom primerov

4 Kapilaacuterna elektroforetickaacute separaacutecia PCR produktov

5 Analyacuteza daacutet

30

Obr 27 Princiacutep MLPA

Firma MRC-Holland v suacutečasnosti ponuacuteka stovky MLPA setov proacuteb ktoreacute suacute vhodneacute na 1) diagnostiku kongenitaacutelnych a dedičnyacutech ochoreniacute 2) zisťovanie profilu naacutedorov 3) zisťovanie metylačneacuteho profilu

MLPA je metoacuteda vhodnaacute na detekciu malyacutech prestavieb (BRCA1 BRCA2 MSH2 atď)

veľkyacutech chromozoacutemovyacutech prestavieb (Williamsov syndroacutem Prader-WilliAngelman syndroacutem atzď)

31

detekciu zmien v počte koacutepii geacutenov (obr 28 29) ako aj zistenie počtu kompletnyacutech chromozoacutemov (chromozoacutem 13 18 21 XY tiež aj z amniovej tekutiny) diagnostiku naacutedorov (zmeny počtu pri ALL CLL atď) kvantifikaacuteciu metylaacutecie (Prader-WilliAngelmanov syndroacutem Fragilnyacute X inaktivaacutecia naacutedorovyacutech supresorovyacutech geacutenov atď) mRNA analyacutezu geacutenov zuacutečastňujuacutecich sa apoptoacutezy alebo zaacutepalov

MS-MLPA (Methylation-Specific MLPA) je varianta MLPA určenaacute špeciaacutelne na analyacutezu aberantnyacutech metylaacutecii imprintovanyacutech oblastiacute ako aj detekciu metylačnyacutech zmien CpG ostrovčekov lokalizovanyacutech bliacutezko promoacutetora Rozdiel oproti štandardnej MLPA spočiacuteva v použitiacute metylačne senzitiacutevneho restrikčneacuteho enzyacutemu HhaI ktoryacute štiepi MS-MLPA proacuteby hybridizovaneacute k nemetylovanej sekvencii Každaacute DNA vzorka určenaacute pre MS-MLPA analyacutezu prejde dvoma reakciami v jednej mikroskuacutemavke štandardnou MLPA analyacutezou (bez štiepenia metylačne senzitiacutevnym enzyacutemom) a v druhej mikroskuacutemavke docircjde okrem ligaacutecie proacuteb aj k metylačne senzitiacutevnemu štiepeniu hybridizovanyacutech proacuteb s nemetylovanou DNA Amplifikujuacute sa len ligovaneacute proacuteby po PCR amplifikaacutecii sa fragmentačnou analyacutezou porovnaniacutem oboch reakciiacute zistia rozdiely v metylačnom profile vzorky k referenčnej vzorke

RT-MLPA (Reverse Transkriptase MLPA) je variaacutecia MLPA určenaacute pre zistenie mRNA profilu vzorky je alternatiacutevou k real-time PCR a mikročipom RT-MLPA nedeteguje mRNA množstvo priamo pretože použiacutevanaacute ligaacuteza nie je schopnaacute ligovať DNA oligonukleotidy keď suacute hybridizovaneacute s RNA Preto RT-MLPA začiacutena reverznou transkripciou so špeciaacutelne navrhnutyacutemi RT primermi tak aby vytvorili kraacutetke oligonukleotidy (cDNA) Potom reakcia pokračuje ako štandardnaacute MLPA

Obr 28 MLPA analyacuteza geacutenu DMD (koacutedujuacuteceho dystrofiacuten) mutaacutecie ktoreacuteho spocircsobujuacute Duchennovu svalovuacute dystrofiu u pacienta je priacutetomnaacute deleacutecia exoacutenu 45 v porovnaniacute s referenčnou vzorkou ndash kontrolou

32

Obr 29 MLPA analyacuteza geacutenu DMD (koacutedujuacuteceho dystrofiacuten) mutaacutecie ktoreacuteho spocircsobujuacute Duchennovu svalovuacute dystrofiu u pacienta suacute priacutetomneacute duplikaacutecie exoacutenov 41 42 43 44 45 (piacuteky vo vzorke pacienta sa porovnajuacute s piacutekmi v kontrole ndash referenčnej vzorke)

33

6 Sekvenovanie

Sekvenovaniacutem rozumieme určenie primaacuternej štruktuacutery DNA teda určenie poradia nukleotidov v reťazci DNA Začiatky moderneacuteho sekvenovania siahajuacute do roku 1977 kedy boli objaveneacute dve metoacutedy sekvenovania 1) chemickaacute metoacuteda Maxama a Gilberta 2) enzymatickaacute metoacuteda Sangera Nicklena a Coulsona

Princiacutep obidvoch metoacuted sekvenovania spočiacuteva v tom že sa vytvoriacute suacutebor DNA molekuacutel s rocircznou veľkosťou ktoreacute suacute zakončeneacute konkreacutetnym nukleotidom tieto DNA molekuly sa elektroforeticky separujuacute v geacuteloch s rozlišovacou schopnosťou 1 nukleotid 61 Chemickaacute metoacuteda

DNA molekuly sa na 5-konci raacutedioaktiacutevne označia raacutedioaktiacutevnym fosforom a naacutesledne sa chemicky modifikujuacute špecificky pre každuacute baacutezu DNA sa potom v modifikovanyacutech miestach štiepi čiacutem vzniknuacute rocirczne dlheacute fragmenty pričom podmienky suacute nastaveneacute tak aby sa DNA na každom mieste štiepila len raz Modifikaacutecia DNA a štiepenie prebehne v štyroch separaacutetnych reakciaacutech (skuacutemavkaacutech) takže po elektroforetickej separaacuteciiacute takto opracovanej DNA v štyroch draacutehach polyakrylamidoveacuteho geacutelu a naacuteslednej autoraacutediografii (podobne ako pri Southernovej hybridizaacutecii) je možneacute odčiacutetať nukleotidovuacute sekvenciu približne 100 nukleotidov od raacutedioaktiacutevneho označenia (v čase objavu Maxama a Gilberta) 62 Sangerova metoacuteda

Zaacuteklady metoacutedy boli popiacutesaneacute už v roku 1975 (metoacuteda plus a miacutenus) ale až vylepšenie použitiacutem dideoxynukleotidov (ddNTP) v roku 1977 došlo k zjednodušeniu sekvenovania Princiacutepom enzyacutemoveacuteho sekvenovania je terminaacutecia (zastavenie) polymerizaacutecie inkorporaacuteciou 2´ 3 -dideoxynukleotidov do novosyntetizujuacuteceho sa vlaacutekna DNA Keďže ddNTP neobsahujuacute hydroxylovuacute skupinu na 3 uhliacuteku riboacutezy nemocircžu sa zuacutečastniť na tvorbe fosfodiesterovej vaumlzby nemocircže sa pripojiť k nim ďalšiacute nukleotid čiže musiacute docircjsť k terminaacuteciiacute polymeraacutecie Reakcia prebieha v štyroch skuacutemavkaacutech s raacutedioaktiacutevne značenyacutem primerom V každej skuacutemavke suacute priacutetomneacute všetky štyri deoxynukleotidtrifosfaacutety (dNTP) ale pre každuacute skuacutemavku je špecifickyacute priacutedavok maleacuteho množstva jedneacuteho z dideoxynukleotidtrifosfaacutetov (v prvej skuacutemavke je ddATP v druhej ddCTP v tretej ddTTP a vo štvrtej ddGTP) Maleacute množstvo ddNTP spocircsobiacute že pri polymerizaacutecii dochaacutedza k prednostneacutemu zaradeniu štandardnyacutech dNTP do narastajuacuteceho reťazca a len občas sa inkorporuje ddNTP čiacutem sa zastaviacute synteacuteza reťazca V každej skuacutemavke tak vznikne suacutebor DNA fragmentov rocircznych veľkostiacute zakončenyacutech priacuteslušnyacutem ddNTP (v prvej skuacutemavke ddATP v druhej ddCTP v tretej ddTTP a vo štvrtej ddGTP) Po elektroforetickej separaacutecii v 4 draacutehach polyakrylamidoveacuteho geacutelu a autoraacutediografii sa z autoraacutediogramu odčiacuteta sekvencia

V suacutečasnosti je sekvenovanie do značnej miery automatizovaneacute pričom využiacuteva princiacutep Sangerovej enzyacutemovej metoacutedy s určityacutemi obmenami Uacutesek DNA ktoryacute treba sekvenovať sa prostredniacutectvom termostabilnyacutech DNA polymeraacutez namnožiacute PCR metoacutedou po ktorej nasleduje sekvenačnaacute reakcia (asymetrickaacute PCR) s fluorescenčne značenyacutemi ddNTP (každyacute druh označenyacute inyacutem fluorescenčnyacutem farbivom) Sekvenačnaacute reakcia prebieha v jednej skuacutemavke s jednyacutem primerom vznikne tak suacutebor jednovlaacuteknovyacutech DNA rocircznej dĺžky ktoreacute suacute na 3konci označeneacute ddNTP so špecifickyacutem fluorescenčnyacutem farbivom Taacuteto metoacuteda sekvenovania sa tiež nazyacuteva rdquodye-terminator cycle sequencingrdquo(obr 30) Po kapilaacuternej elektroforeacuteze vzorky v genetickom analyzaacutetore zaznamenaacutevaniacute fluorescencie jednotlivyacutech fragmentov CCD kamerou a softveacuterovom spracovaniacute sa ziacuteska sekvencia DNA (obr 31)

34

Obr 30 Princiacutep sekvenovania Sangerova dideoxy metoacuteda alebo tzv chain termination method (reťazec zastavujuacuteca metoacuteda) Obr 31 Určenie genotypu plodu a rodičov sekvenčnou analyacutezou DNA ziacuteskanej z plodovej vody (prenataacutelna diagnostika) a perifeacuternej krvi sekvenčnaacute analyacuteza geacutenu ASPA vyacutesledok u plodu priacutetomnaacute mutaacutecia c 914CgtA v homozygotnom stave (AA) rodičia heterozygoti (AC) Uvedenaacute mutaacutecia je v homozygotnom stave kauzaacutelnou priacutečinou Canavanovej choroby

Automatizovaneacute sekvenovanie prinaacuteša viacereacute vyacutehody oproti klasickej Sangerovej metoacutede vyššiu presnosť a ryacutechlosť v jednej sekvenačnej reakcii možnosť osekvenovať až 1200 nukleotidovyacute fragment maleacute množstvo templaacutetu potrebneacute na analyacutezu

35

63 Next Generation Sequencing (NGS)

NGS (sekvenovanie novej generaacutecie) maacute obrovskyacute potenciaacutel v analyacuteze genoacutemov pričom toto označenie zahŕňa viacereacute technologickeacute metoacutedy reprezentovaneacute niekoľkyacutemi firmami Princiacutepom je masiacutevne paralelneacute sekvenovanie čiacutem sa ziacuteskajuacute raacutedovo tisiacutece až milioacuteny sekvenciiacute naraz 631 Sekvenovanie druhej generaacutecie

Na začiatku sa analyzovanaacute DNA vo vaumlčšine priacutepadov fragmentuje (vznikne tak DNA

knižnica) na fragmenty sa pripoja kraacutetke sekvencie ndash adapteacutery naacutesledne sa tieto fragmenty rocircznymi priacutestupmi amplifikujuacute a určiacute sa ich sekvencia Vďaka čiastočnyacutem prekryvom je zo ziacuteskanyacutech sekvencii možneacute poskladať plynuluacute sekvenciu zodpovedajuacutecu pocircvodnej nefragmentovanej DNA

Pyrosekvenovanie je podobne ako Sangerova metoacuteda založenaacute na princiacutepe synteacutezy komplementaacuterneho vlaacutekna DNA avšak rozdiel je v tom že sa na detekciu inkorporaacutecie nukleotidu využiacuteva inyacute systeacutem tvorby luminiscenčneacuteho signaacutelu v priebehu reakcie Pyrosekvenovanie je umožneneacute vďaka aktivite 4 enzyacutemov - DNA polymeraacutezy ATP sulfurylaacutezy luciferaacutezy a apyraacutezy Reakčnaacute zmes obsahuje aj ďalšie komponenty - enzymatickeacute substraacutety adenoziacutenfosfosulfaacutet (APS) d-luciferiacuten sekvenovanyacute templaacutet a cyklicky postupne po jednom type pridaacutevaneacute nukleotidtrifosfaacutety Po zabudovaniacute nukleotidu do novovznikajuacuteceho reťazca docircjde k uvoľneniu pyrofosfaacutetu naacutesledne je využityacute ATP sulfurylaacutezou na synteacutezu ATP z APS počas ďalšej reakcie docircjde k využitiu ATP luciferaacutezou na premenu luciferiacutenu na oxyluciferiacuten čo spocircsobiacute svetelnyacute signaacutel a ten zaznamenaacute detekčnyacute systeacutem Poslednou enzymatickou reakciou je reakcia apyraacutezy ktoraacute odstraacuteni nezainkorporovaneacute nukleotidy a nevyužiteacute ATP aby sa celyacute proces mohol zopakovať s reakčnou zmesou obsahujuacutecou ďalšiacute nukleotidtrifosfaacutet (inyacute ako v predchaacutedzajuacutecej reakcii) Po každej reakcii detektor zaznamenaacuteva emisiu svetla na zaacuteklade intenzity svetla je možneacute určiť či bol vradenyacute priacuteslušnyacute nukleotidtrifosfaacutet či bol inkorporovanyacute jeden priacutepadne viac rovnakyacutech nukleotidtrifosfaacutetov

Zvyacutešenie vyacutekonu pyrosekvenovania umožnila tzv emulznaacute PCR v mikročasticiach a použitie platničky PicoTiterPlatereg toto sekvenovanie zaviedla firma Roche pod pojmom 454 pyrosekvenovanie v roku 2005 Na začiatku sa DNA fragmentuje na uacuteseky dlheacute 400-600 baacutez dvojvlaacuteknovaacute fragmentovanaacute DNA sa liguje s adapteacutermi prostredniacutectvom nich sa naviaže na mikročastice dvojvlaacuteknoveacute fragmenty sa oddelia mikročastice s naviazanyacutemi jednovlaacuteknovyacutemi fragmentami sa premiešajuacute so zmesou oleja a roztoku ktoryacute obsahuje všetky komponenty na uacutespešnuacute PCR Tyacutemto spocircsobom sa okolo každej mikročastice vytvoriacute vlastnyacute mikroreaktor v ktorom prebehne amplifikaacutecia fragmentu Po PCR reakcii sa mikročastice prenesuacute do platničky PicoTiterPlate v ktorej sa do jamky zmestiacute akuraacutet jedna mikročastica a reakčneacute komponenty pyrosekvenačnej reakcie PicoTiterPlatereg maacute 1 600 000 jamiek každaacute jamka maacute maximaacutelny objem 75 picolitra Platnička s mikročasticami sa vložiacute do sekvenačneacuteho systeacutemu ndash priacutestroja v ktorom sa celeacute pyrosekvenovanie uskutočniacute Chemiluminiscenčneacute signaacutely ktoryacutech počas sekvenovania vznikajuacute milioacuteny v priebehu hodiny suacute zachyteneacute CCD kamerou a analyzovaneacute softveacuterom

Firma Illumina predstavila inuacute technoloacutegiu PCR amplifikaacutecia a sekvenovanie sa uskutočňuje na skliacutečku (flow cell) Fragmentaacutecia DNA a pripojenie adapteacuterov prebieha za uacutečasti transpozoacutemov v procese nazvanom tagmentaacutecia Po hybridizaacutecii fragmentov DNA na skliacutečko prebehne v klastroch PCR amplifikaacutecia (tzv mostiacutekovaacute amplifikaacutecia) sekvenaacutecia prebieha za uacutečasti rozdielne fluorescenčne značenyacutech a chemicky modifikovanyacutech nukleotidov pričom každyacute nukleotid emituje fluorescenciu s inou vlnovou dĺžkou Na skliacutečku prebieha paralelne až 6 miliaacuterd sekvenaacutecii (obr 32)

Ďalšiacutemi možnosťami sekvenovania druhej generaacutecie je systeacutem SOLid (vyvinutyacute firmou Applied Biosystem dnes pod Thermo Fisher Scientific) a Ion Semiconductor Sequencing ndash polovodičoveacute ioacutenoveacute sekvenovanie (od firmy Ion Semiconductor Sequencing v suacutečasnosti Thermo Fisher Scientific)

36

Obr 32 Princiacutep sekvenovania novej generaacutecie od firmy Illumina PCR amplifikaacutecia a sekvenovanie sa uskutočňuje na skliacutečku (flow cell) paralelne prebieha až 6 miliaacuterd sekvenaacutecii

632 Sekvenovanie tretej generaacutecie

Pred sekvenovaniacutem netreba amplifikovať DNA PCR metoacutedou ale sekvencia sa ziacuteskava zachyteniacutem signaacutelu v reaacutelnom čase Medzi sekvenovanie tretej generaacutecie patriacute SMRT (Single Molecule Real-Time Sequencing) a Nanopore Sequencing

37

7 Fragmentačnaacute analyacuteza DNA

Je metoacuteda použiacutevanaacute na určenie veľkosti fragmentov DNA ziacuteskanyacutech PCR reakciou Dĺžka amplifikovanyacutech DNA fragmentov sa zistiacute ich porovnaniacutem s veľkostnyacutem štandardom (obr 33) ktoryacute je tvorenyacute DNA fragmentami znaacutemej dĺžky Veľkostnyacute štandard je pred kapilaacuternou elektroforeacutezou zmiešanyacute so vzorkou DNA fragmenty veľkostneacuteho štandardu suacute fluorescenčne označeneacute pričom použiteacute fluorescenčneacute farbivo je ineacute ako fluorescenčneacute farbivo použiteacute na označenie DNA fragmentov vo vyšetrovanej vzorke

Obr 33 Elektroforetogram veľkostneacuteho štandardu použiacutevaneacuteho na určenie veľkostiacute fragmentov analyzovanyacutech kapilaacuternou elektroforeacutezou v genetickom analyzaacutetore (GeneScantrade 500 LIZtrade dye Size Standard) dĺžka fragmentov v nukleotidoch (napr 50 nukleotidov)

Fragmentačnaacute analyacuteza pozostaacuteva z viaceryacutech krokov Prvyacutem je izolaacutecia DNA nasleduje PCR amplifikaacutecia počas ktorej sa novosyntetizovaneacute DNA fragmenty označia fluorescenčnyacutemi farbivami Vzorka s PCR produktom sa pripraviacute na kapilaacuternu elektroforeacutezu tak že sa zmieša s veľkostnyacutem štandardom (sluacuteži na určenie veľkosti fragmentov) a denaturačnou laacutetkou (formamid) nasleduje denaturaacutecia Pripraveneacute vzorky suacute injektovaneacute do priacutestroja (genetickyacute analyzaacutetor) kde v kapilaacutere naplnenej polymeacuterom v elektrickom poli migrujuacute fluorescenčne značeneacute fragmenty DNA na zaacuteklade veľkosti (kapilaacuterna elektroforeacuteza) Počas elektroforeacutezy genetickyacute analyzaacutetor zaznamenaacuteva fluorescenciu fragmentov Analyacutezou daacutet prostredniacutectvom špeciaacutelnych softveacuterov sa ziacuteskajuacute elektroforetogramy z ktoryacutech je možneacute zistiť veľkosť fragmentov ako aj typ fluorescencie (docircležiteacute ak suacute genetickeacute varianty rozliacutešiteľneacute rocircznou fluorescenciou napr SNaPshot) Fragmentačnaacute analyacuteza je suacutečasťou množstva molekulaacuterno-genetickyacutech metoacuted (pozri obr 12 26 28 29 34) ako suacute napr STR analyacuteza (Short Tandem Repeat) AFLP analyacuteza (Amplified Fragment Lenght Polymorfism) RFLPT-RFLP analyacuteza (Restriction Fragment Lenght PolymorfismTerminal Restricted Fragment Lenght Polymorfism) SSCP (Single Strand Conformation Polymorfism) VNTR (Variable Number of Tandem Repeat) analyacuteza straty heterozygotnosti (LOH loss of heterozygozity) MLPA (Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification) MSMSA (Methylation-Sensitive Mobility Shift Assay) SNP genotypovanie (SNaPshotreg) HiCEP (High-Coverage Expression Profiling)

38

Obr 34 Kvantitatiacutevna fragmentačnaacute PCR analyacuteza (QF-PCR) DNA izolovanej z plodovej vody vyacutesledok prenataacutelnej analyacutezy = priacutetomnosť troch piacutekov pre chromozoacutem 18 (u všetkyacutech fragmentov detegujuacutecich chromozoacutem 18 je pomer vyšetrovanyacutech markerov aberantnyacute 21 resp 111) čo znamenaacute trizoacutemiu chromozoacutemu 18 Edwardsov syndroacutem

39

8 Metoacutedy založeneacute na princiacutepe hybridizaacutecie

Nukleoveacute kyseliny majuacute schopnosť vytvaacuterať dvojvlaacuteknoveacute reťazce z jednovlaacuteknovyacutech molekuacutel na zaacuteklade komplementarity baacutez Komplementarita baacutez umožňuje replikaacuteciu DNA transkripciu RNA komplementarita baacutez zabezpečuje teda reprodukovateľnosť živej hmoty

Hybridizaacutecia je proces v ktorom na zaacuteklade komplementarity baacutez dochaacutedza k vytvoreniu dvojvlaacuteknovej nukleovej kyseliny z dvoch jednovlaacuteknovyacutech molekuacutel DNA alebo RNA alebo ich kombinaacuteciou DNA RNA pričom kratšia jednovlaacuteknovaacute nukleovaacute kyselina vystupuje ako sonda (proacuteba) Hybridizaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten je jeden z najpoužiacutevanejšiacutech naacutestrojov v molekulaacuternej bioloacutegii a genetike (hybridizaacutecia primerov alebo proacuteb sa využiacuteva v takmer každej metoacutede - v PCR RT-PCR qPCR RT-qPCR MLPA sekvenovaniacute fragmentačnej analyacuteze FISH DNA mikročipoch atď)

Denaturaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten je proces pri ktorom dochaacutedza k porušeniu vodiacutekovyacutech vaumlzieb medzi vlaacuteknami nukleovyacutech kyseliacuten (strata sekundaacuternej a terciaacutelnej štruktuacutery) tak že docircjde k ich uacuteplneacutemu oddeleniu vzniknuacute jednovlaacuteknoveacute reťazce Denaturaacutecia NK mocircže byť spocircsobenaacute vplyvom vysokyacutech teplocirct pH alebo chemickyacutech laacutetok (denaturačneacute činidlaacute) Renaturaacutecia je opačnyacute proces v ktorom na zaacuteklade komplementarity dochaacutedza k tvorbe dvojvlaacuteknovyacutech NK

Hybridiza čnaacute sonda (proacuteba) je jednovlaacuteknovaacute nukleovaacute kyselina určitej znaacutemej dĺžky a sekvencie (najčastejšie DNA pretože je stabilnejšia ako RNA) ktoraacute je značenaacute a sluacuteži na detekciu komplementaacuternych molekuacutel DNA alebo RNA v procese hybridizaacutecie V zaacutevislosti od podmienok hybridizaacutecie (stringencia) mocircže byť detegovanaacute sekvencia uacuteplne komplementaacuterna alebo v menej priacutesnych podmienkach mocircže mať sekvenčneacute odchyacutelky Proacuteba sluacuteži na vyhľadanie a zviditeľnenie cieľovyacutech NK Zviditeľnenie sa deje prostredniacutectvom označenia proacuteby ešte pred hybridizaacuteciou Značenie proacuteby mocircže byť raacutedioaktiacutevne a neraacutedioaktiacutevne (najčastejšie fluorescenčneacute)

Raacutedioaktiacutevne značeneacute proacuteby pomocou izotopov (32P) sa využiacutevali viac v minulosti v suacutečasnosti suacute kvocircli zdravotnyacutem rizikaacutem ohľaduplnosti k životneacutemu prostrediu ako aj kvocircli jednoduchšej manipulaacutecii použiacutevaneacute fluorescenčne značeneacute proacuteby Raacutedioaktiacutevne značeneacute sondy boli použiacutevaneacute hlavne metoacutedou Southernovej hybridizaacutecie (Southern blotting Southern blot) Citlivosť raacutedioaktiacutevne značenyacutech proacuteb je vyššia dosahuje schopnosť zachytiť 10 fg (femtogram 10-15) cieľovej DNA sekvencie 81 Southern blot

Metoacutedu objavil v roku 1975 britskyacute bioloacuteg Edwin Southern (preto Southern) Pri Southernovej hybridizaacutecii sa restrikčne štiepeneacute fragmenty DNA elektroforeticky separujuacute v geacuteli potom sa metoacutedou blottingu prenesuacute na nylonovuacute alebo nitroceluloacutezovuacute membraacutenu kde suacute naacutesledne hybridizovaneacute v roztoku obsahujuacutecom raacutedioaktiacutevne značenuacute sondu Priloženiacutem fotografickeacuteho filmu k membraacutene a vyvolaniacutem filmu autoraacutediografiou docircjde k zviditeľneniu lokaliacutet kde došlo k hybridizaacuteciiacute raacutedioaktiacutevne značenej sondy s fragmentom DNA (autoraacutediogram) Southern blot bol kľuacutečovou a prvou metoacutedou na identifikaacuteciu osocircb (DNA fingerprinting DNA pofiling) (obr 35)

Okrem Southern blotu existuje Northern blot na analyacutezu RNA (geacutenovej expresie) a Western blot na analyacutezu proteiacutenov postup je obdobnyacute ako pri Southern blote s obmenami špecifickyacutemi pre konkreacutetny blot Pri Northern blote sa použiacutevajuacute hybridizačneacute proacuteby ale pre vizualizaacuteciu proteiacutenov western blotom je potrebneacute použiť protilaacutetky s naacuteslednou vizualizaacuteciou Pomenovanie techniacutek je hra so sloviacutečkami (keďže paacuten Northern ani Western neobjavili takto nazvaneacute techniky)

Neraacutedioaktiacutevne značenie proacuteb použiacutevanyacutech v molekulaacuternej genetike mocircže byť nepriame (použitie haptenu) alebo priame Konečnaacute vizualizaacutecia je najčastejšie zabezpečenaacute fluoreskujuacutecimi farebnyacutemi značkami farbivami fluorochroacutemami (fluorofoacuterami) Pri priamom značeniacute je farbička kovalentne naviazanaacute na nukleotid a na zachytenie fluorescencie suacute potrebneacute špeciaacutelne priacutestroje umožňujuacutece excitaacuteciu farbičky ktoraacute potom emituje žiarenie určitej vlnovej dĺžky (emisneacute žiarenie) a to zachytiacute detekčnyacute systeacutem priacutestroja Využitie fluorochroacutemov v molekulaacuternej genetike je masiacutevne napr na vizualizaacuteciu NK elektroforeticky separovanyacutech v geacuteli kvantifikaacuteciu produktov PCR reakcie v priacutestroji real-time PCR cykleacuter sekvenovaniacute fragmentačnej analyacuteze FISH DNA mikročipoch atď

40

Obr 35 Princiacutep Southern blotu

82 FISH (fluorescenčnaacute in situ hybridizaacutecia)

FISH (fluorescent in situ hybridization fluorescenčnaacute in situ hybridizaacutecia) metoacuteda patriacute medzi molekulovo-cytogenetickeacute techniky Princiacutep FISH metoacutedy je založenyacute na hybridizaacuteciiacute fluorescenčne značenyacutech proacuteb ku komplementaacuternym uacutesekom vyšetrovanej DNA na podložnom skle (priamo na mieste - in situ) K denaturaacutecii dsDNA dochaacutedza buď vplyvom denaturačnyacutech činidiel alebo zvyacutešenou teplotou a naacuteslednou renaturaacuteciou dochaacutedza k naviazaniu sondy na komplementaacuterny uacutesek DNA Vyacutesledok hybridizaacutecie sa vizualizuje fluorescenčnyacutem mikroskopom vybavenyacutem vhodnyacutemi fluorescenčnyacutemi filtrami a vizuaacutelne zhodnotiacute skuacutesenyacutem odborniacutekom Fluorescencia sa v niektoryacutech priacutepadoch mocircže zaznamenať a hodnotiť aj pomocou softveacuteru (obr 36)

Pomocou FISH detegujeme numerickeacute aberaacutecie - zmeny v počte chromozoacutemov (napr trizoacutemia monozoacutemia chromozoacutemov) alebo štruktuacuterne aberaacutecie a prestavby (napr translokaacutecie inverzie deleacutecie duplikaacutecie amplifikaacutecie) FISH metoacuteda umožňuje identifikaacuteciu a detekciu každeacuteho ľudskeacuteho chromozoacutemu jeho zaradenie do karyotypu odhalenie malyacutech submikroskopickyacutech chromozoacutemovyacutech zmien a tiež mapovať poziacutecie jednotlivyacutech geacutenov na chromozoacuteme

41

Obr 36 Princiacutep štandardnej FISH a FISH maľovania celeacuteho chromozoacutemu

Veľkou vyacutehodou FISH metoacutedy je možnosť analyacutezy buniek v metafaacuteze aj v interfaacuteze kedy nie je nutnaacute kultivaacutecia buniek a tiež ryacutechle analyzovanie veľkeacuteho počtu buniek (stovky až tisiacutece) K ďalšiacutem vyacutehodaacutem patriacute bezpečnosť vysokaacute citlivosť dostatočnaacute stabilita relatiacutevne kraacutetky čas hybridizaacutecie a možnosť ryacutechleho vyhodnotenia Hybridizaacutecia pri vaumlčšine suacutečasne dodaacutevanyacutech sond trvaacute 10-12 hodin (na trhu suacute už dostupneacute aj sondy so skraacutetenyacutem časom hybridizaacutecie na 2-3 hodiny) Po hybridizaacuteciiacute nasleduje odmyacutevanie kedy pri priacuteslušnej teplote dochaacutedza k odmytiu nenaviazanyacutech a nespraacutevne hybridizovanyacutech sond Preparaacutet sa naacutesledne podfarbiacute a vyacutesledok sa zhodnotiacute vo fluorescenčnom mikroskope Na podfarbenie chromozoacutemov alebo jadier sa použiacuteva modreacute kontrastneacute farbivo DAPI (46-diamidino-2-fenylindol) ktoreacute maacute silneacute fluorescenčneacute vlastnosti dokaacuteže prechaacutedzať jadrovou membraacutenou a viazať sa na DNA Vyacutesledkom je modreacute zafarbenie ktoreacute vyacuteborne kontrastuje so signaacutelmi jednotlivyacutech sond

Limitujuacutecim faktorom FISH je možnosť identifikaacutecie len tyacutech uacutesekov DNA ku ktoryacutem suacute použiteacute sondy V jednej analyacuteze je možneacute použiť najviac 3 odlišne značeneacute sondy a tak zistiť priacutepadneacute abnormality len na 1 alebo na paacuter lokusoch Na relevantnuacute detekciu je potrebneacute mať vo vzorke 1-5 aberantnyacutech interfaacutezovyacutech jadier

FISH je možneacute uskutočniť na širokej škaacutele biologickeacuteho materiaacutelu na vzorkaacutech perifeacuternej krvi kostnej drene naacuteteroch choriovyacutech klkoch plodovej vode rocircznych druhov tkaniacutev natiacutevnych alebo zaliatych v parafiacutene na 1 bunke (predimplantačnaacute genetickaacute diagnostika PGD) (obr 37)

Využiacuteva sa na detekciu aberaacuteciiacute pri mnohyacutech onkologickyacutech ochoreniach (napr pri diagnoacuteze mnohopočetnyacute myeloacutem sa v suacutečasnosti po separaacutecii CD138+ buniek robiacute FISH s 5 sondami pre geacuteny IGH TP53 RB1 oblasť 1p321q21 a stanovuje sa hyperploidia chromozoacutemov 5 9 a 15) a tiež k spresneniu doplneniu a k overeniu bežneacuteho cytogenetickeacuteho vyšetrenia

Podľa miesta na chromozoacuteme na ktorom dochaacutedza k hybridizaacutecii sondy rozlišujeme 4 typy

DNA sond bull centromeacuteroveacute sondy ndash sa viažu na strednuacute časť chromozoacutemu ndash centromeacuteru sluacutežia k diagnostike zmien v počte chromozoacutemov k detekcii chromozoacutemov neznaacutemeho pocircvodu umožňujuacute interfaacuteznu FISH na nedeliacich sa bunkaacutech (obr 38-41)

42

Obr 37 Interfaacutezna FISH preimplantačnyacute genetickyacute skriacutening aneuploidiiacute ndash blastomeacutera 3-denneacuteho ľudskeacuteho embrya s normaacutelnym počtom chromozoacutemov 13 18 21 pohlavie XY použityacutech 5 sond pre chromozoacutemy 13 ndash orange 18 ndash aqua 21 ndash green X ndash blue a Y ndash yellow (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

Obr 38 Interfaacutezne jadro po hybridizaacutecii s centromeacuterovou sondou pre chromozoacutem 8 (Vysis Abbott) V pravom jadre je priacutetomnaacute trizoacutemia chromozoacutemu 8 (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex) Obr 39 Metafaacutezna (A) a interfaacutezna FISH (B) použitaacute centromeacuterovaacute sonda CEPX spectrum orangeCEPY spectrum green (Vysis Abbott) Sonda hybridizuje k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (červenyacute signaacutel) a Y (zelenyacute signaacutel) (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

43

Obr 40 Interfaacutezna FISH vyšetrenie spermiiacute použiteacute sondy CEPX greenCEPY orange (Aneuscore Metasystems) Sondy hybridizujuacute k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (zelenyacute signaacutel) Y (červenyacute signaacutel) vľavo ndash dve haploidneacute spermie (majuacutece jedna spermia X druhaacute Y chromozoacutem) vpravo ndash dve patologickeacute spermie obsahujuacutece gonozoacutemovyacute komplement XY (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

Obr 41 Interfaacutezna FISH vyšetrenie spermiiacute použiteacute sondy CEPX greenCEPY orange a CEP18 aqua (Aneuscore Metasystems) Sondy hybridizujuacute k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (zelenyacute signaacutel) Y (červenyacute signaacutel) a 18 (modryacute signaacutel) vľavo ndash normaacutelne haploidneacute ľudskeacute spermie - 1x chromozoacutem X alebo Y a jedenkraacutet chromozoacutem 18 v strede ndash patologickaacute spermia obsahujuacuteca gonozoacutemovyacute komplement XY a jeden chromozoacutem 18 vpravo ndash patologickaacute diploidnaacute spermia s chromozoacutemami X Y a dvoma chromozoacutemami 18 (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

bull lokusovo špecifickeacute sondy ndash hybridizaacutecia prebehne na konkreacutetnom mieste geacutenu (lokuse) (obr 42-44) použiacutevajuacute sa k vyšetreniu mikrodeleacuteciiacute (straty malyacutech častiacute chromozoacutemu pri mikrodelečnyacutech syndroacutemoch) k zisteniu amplifikaacutecie onkogeacutenov a niektoryacutech špecifickyacutech translokaacuteciiacute prestavby geacutenov umožňujuacute interfaacuteznu FISH na nedeliacich sa bunkaacutech bull subtelomeroveacute ndash vaumlzba na koncoveacute časti chromozoacutemu ndash telomeacutery bull celochromozoacutemoveacute alebo celomaľovacie sondy ndash sondy hybridizujuacute s mnohopočetnyacutemi chromozoacutemovyacutemi sekvenciami pričom sa fluorescenčne tak bdquovymaľujeldquo celyacute chromozoacutem (Obr 45) Použiacutevajuacute sa na vyšetrenie chromozoacutemovyacutech prestavieb k analyacuteze translokaacuteciiacute a k detekcii pocircvodu tzv marker chromozoacutemov (malyacutech nadpočetnyacutech chromozoacutemov neznaacutemeho pocircvodu) K použitiu sondy suacute potrebneacute metafaacutezne chromozoacutemy nepoužiacutevaju sa pre interfaacuteznu FISH

Pri konvenčnej chromozoacutemovej FISH suacute homogeacutenne DNA proacuteby hybridizovaneacute s fixovanyacutem metafaacuteznym alebo prometafaacuteznym chromozoacutemomchromozoacutemami na skliacutečku (Obr 36a) Maximaacutelna rozlišovacia schopnosť metafaacuteznej FISH je niekoľko megabaacutez (Obr 39a 45) využitiacutem viac

44

natiahnutyacutech prometafaacuteznych chromozoacutemov sa dosiahne 1 Mb rozliacutešenie Prostredniacutectvom fiber FISH konkreacutetne artificiaacutelne deproteinizovanej natiahnutej DNA pripravenej in situ z celyacutech buniek na mikroskopickom skliacutečku je možneacute vizualizovať individuaacutelne geacuteny maleacute DNA elementy na chromozoacuteme s rozliacutešeniacutem okolo 1000 bp

Obr 42 Interfaacutezne jadro po hybridizaacutecii s lokusovo-špecifickou sondou LSI 5q31 Spectrum Orange5p12 Spectrum Green (Vysis Abbott) Na ľavom obraacutezku suacute priacutetomneacute dva červeneacute (5q31) a dva zeleneacute signaacutely (5p12) v pravom jadre je priacutetomnaacute deleacutecia 5q31 oblasti chyacuteba jeden červenyacute signal (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

Obr 43 Interfaacutezna FISH použitaacute lokusovo-špecifickaacute sonda ndash translokačnaacute - XL BCRABL1 plus (Metasystems) dvojfarebnaacute dvojfuacutezna kde červenaacute označuje lokus ABL1 na chromozoacuteme 9 a zelenaacute oblasť BCR na chromozoacuteme 22 Sonda deteguje fuacuteziu protoonkogeacutenu ABL1 (9q34) a geacutenu BCR (22q11) v priacutepade že červenyacute a zelenyacute signaacutel suacute pri sebe (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

45

Obr 44 Interfaacutezna FISH Použitaacute lokusovo-špecifickaacute sonda- typ break apart pre IGH geacuten V docircsledku translokaacutecie došlo k rozskočeniu geacutenu pričom translokačneacuteho partnera nepoznaacuteme vieme určiť len percento v koľkyacutech jadraacutech je geacuten prestavanyacute (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex) Obr 45 Použiteacute celochromozoacutemoveacute sondy WCP 15 (červenyacute chromozoacutem) a WCP 17 (zelenyacute chromozoacutem) Na metafaacuteze je potvrdenaacute reciprokaacute translokaacutecia t(1517)(q2221) (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

FISH vizualizaacutecia celeacuteho chromozoacutemu maľovanie chromozoacutemu anglicky chromosome

painting je špeciaacutelnou aplikaacuteciou chromozoacutemovej FISH proacuteba je koktail veľkeacuteho počtu rocircznych fluorescenčne značenyacutech DNA fragmentov hybridizujuacutecich pozdĺž celeacuteho konkreacutetneho chromozoacutemu (obr 36b 45) bdquoChromosomepaintingldquo analyzuje metafaacutezne chromozoacutemy V minulosti bola FISH vizualizaacutecia celyacutech chromozoacutemov limitovanaacute malyacutem množstvom rocirczne sfarbenyacutech fluorochroacutemov

V suacutečasnosti je možneacute detegovať množstvo cieľovyacutech sekvenciiacute naraz čo sa využiacuteva pri celogenoacutemovej chromozoacutemovej vizualizaacutecii (whole-chromosomepainting - WCP) metoacutedou multiplex FISH (M-FISH multicolor FISH o br 46) alebo spektraacutelnej karyotypizaacutecie (SKY) kedy možno rozliacutešiť všetky ľudskeacute chromozoacutemy ndash teda 24 rocircznych chromozoacutemov M-FISH a SKY patria medzi metafaacutezne formy FISH diagnostiky ktoreacute umožňujuacute simultaacutennu vizualizaacuteciu všetkyacutech ľudskyacutech chromozoacutemov v rocircznych farbaacutech čo predstavuje uľahčenie analyacutezy karyotypu hlavne pri komplexnyacutech zmenaacutech a markeroch neznaacutemeho pocircvodu Obe techniky vychaacutedzajuacute z použitia

46

celochromozoacutemovyacutech sond značenyacutech kombinaacuteciou viaceryacutech fluorochroacutemov Rozdiel medzi M-FISH a SKY spočiacuteva v technike ziacuteskania konečneacuteho obrazu

Obr 46 Multicolor FISH - každyacute chromozoacutemovyacute paacuter je zafarbenyacute inou farbou pričom na ich zafarbenie postačuje kombinaacutecia 5 fluorochroacutemov Na vyhodnocovanie je potrebnaacute špeciaacutelna sada fluorescenčnyacutech filtrov pre jednotliveacute fluorochroacutemy a špeciaacutelnyacute softweacuter Vľavo-štandardnyacute karyotyp vpravo karyotyp s mutaacuteciami (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

V molekulovej cytogenetike suacute komerčne dostupneacute sety M-FISH proacuteb umožňujuacutece

viacfarebneacute pruacutežkovanie chromozoacutemov (banding) s vysokyacutem rozliacutešeniacutem (multicolor-banding mBAND FISH MCB) čo umožňuje identifikaacuteciu intrachromozoacutemovyacutech prestavieb (Obr 47) Nevyhnutnosťou mBAND-u je mať chromozoacutemy v metafaacuteze Taacuteto metoacuteda bola prvyacutekraacutet uskutočnenaacute na chromozoacuteme 5 v roku 1999 mBAND FISH umožňuje rozliacutešiť špecifickeacute oblasti chromozoacutemov na uacuterovni pruacutežku - bandu a sub-bandu s detekciou 550 bandov haploidneacuteho karyotypu

Obr 47 A - mBAND chromozoacutemu 11 - inverzia duplikovanej oblasti 11q223-q25 B - mBAND chromozoacutemu 3 - na kruhovom chromozoacuteme deleacutecia oblasti 3p263 C - mBAND chromozoacutemu 2 - potvrdenie inverzie duplikovanej časti chromozoacutemu (poskytnuteacute RNDr Dagmar Landlovou Medirex)

FISH metoacuteda a jej varianty (M-FISH mBAND SKY) majuacute v suacutečasnosti širokeacute využitie v

klinickej genetike v onkologickej genetike na detekciu aberaacuteciiacute v čase diagnoacutezy počas liečby po

47

liečbe monitorovanie po transplantaacutecii kostnej drene v prenataacutelnej a postnataacutelnej diagnostike pri detekcii submikroskopickyacutech deleacuteciiacute (napr DiGeorge syndroacutem - 22q112 delečnyacute syndroacutem PraderndashWilli syndroacutem- chromozoacutem 15q11-13) prostredniacutectvom FISH je možnaacute detekcia numerickyacutech zmien chromozoacutemov (trizoacutemia chromozoacutemu 21 pri Downovom syndroacuteme trizoacutemia chromozoacutemu 15 pri Patauovom syndroacuteme trizoacutemia chromozoacutemu 18 pri Edwardsovom syndroacuteme) rocirczne zmeny v počte pohlavnyacutech chromozoacutemov (monozoacutemia X pri Turnerovom syndroacuteme Klinefelterov syndroacutem s X chromozoacutemom naviac - XXY) podobne v predimplantačnej diagnostike

83 DNA Microarray (DNA mikro čip biočip) DNA mikročipovanie je technika využiacutevajuacuteca hybridizaacuteciu skuacutemanej nukleovej kyseliny

(cieľovaacute vzorka) s veľkyacutem množstvom oligonukleotidovyacutech proacuteb (desať tisiacutec až milioacuten) ktoreacute suacute prichyteneacute na pevnyacute podklad najčastejšie sklenyacute silikoacutenovyacute alebo nylonovyacute (doštička čip) Skuacutemanaacute nukleovaacute kyselina je pred hybridizaacuteciou fragmentovanaacute označenaacute fluorofoacuterom a denaturovanaacute Po kontakte čipu s cieľovou vzorkou ktoraacute je vlastne zmes označenyacutech oligonukleotidov značeneacute oligonukleotidy hybridizujuacute s oligonukleotidovyacutemi sekvenciami prichytenyacutemi na čipe Potom suacute na zaacuteklade fluorescencie detekovaneacute miesta kde došlo k hybridizaacutecii čiže vzorka obsahovala takuacuteto nukleotidovuacute sekvenciu Z jedneacuteho mikročipu sa ziacuteska obrovskeacute množstvo daacutet ktoreacute je vždy nutneacute softveacuterovo spracovať V dnešnej dobe existuje niekoľko firiem poskytujuacutecich komerčne mikročipy na objednaacutevku alebo si ich laboratoacuteria produkujuacute sami

Mikročipovanie prebieha nasledovne

1) Vytvorenie DNA čipu ndash tisiacutece rocircznych jednovlaacuteknovyacutech DNA oligonukleotidov znaacutemych sekvencii sa kovalentne naviažu na povrch doštičky vždy v určitej lokalite je niekoľko rovnakyacutech oligonukleotidov veľkosť takejto lokality je ˂ 200 microm Proacutebami mocircže byť DNA cDNA alebo syntetizovaneacute oligonukleotidy Už hotoveacute mikročipy ponuacutekajuacute viacereacute firmy (Affymetrix Agilent Technologies Eppendorf Illumina) alebo si ich jednotliveacute laboratoacuteria vyraacutebajuacute sami pomocou robotickyacutech zariadeniacute DNA čip sa vytvaacutera buď nanaacutešaniacutem kvapiek oligonukleotidov na podklad alebo synteacutezou oligonukleotidov in situ na čipe 2) Priacuteprava vzorky ndash nukleovaacute kyselina (mRNA DNA) sa purifikuje určiacute sa jej kvantita a kvalita (spektrofotometericky) fragmentuje resp v priacutepade mRNA sa syntetizuje cDNA v priacutepade potreby sa mocircže DNA amplifikovať PCR reakciou štiepiť restrikčnyacutemi endonukleaacutezami 3) Fluorescenčneacute označenie (zriedkavejšie raacutedioaktiacutevne) fragmentov DNA prebieha počas reverznej transkripcie alebo PCR amplifikaacutecie za uacutečasti fluorescenčne značenyacutech nukleotidov Keď sa analyzujuacute dve rocirczne vzorky napr zdraveacute tkanivo a naacutedoroveacute tkanivo označenie nukleovyacutech kyseliacuten v tyacutechto tkanivaacutech byacuteva rozdielne a to použitiacutem dvoch rocircznych fluorescenčnyacutech farbiacutev (napr zeleneacute a červeneacute) Pred hybridizaacuteciou je potrebneacute vzorku denaturovať čiacutem sa vytvoriacute zmes jednovlaacuteknovyacutech DNA označenyacutech značkou 4) Hybridizaacutecia s mikročipom ndash v špeciaacutelnom hybridizačnom roztoku hybridizujuacute komplementaacuterne sekvencie zo vzorky s priacuteslušnyacutemi oligonukleotidovyacutemi sondami naviazanyacutemi na čipe Potom sa čip obmyje aby došlo k odstraacuteneniu čiastočne hybridizovanyacutech nukleovyacutech kyseliacuten 5) Skenovanie mikročipu ndash skenerom čipov docircjde k ožiareniu čipu laserom pričom v mieste hybridizaacutecie fluorescenčne značenyacutech DNA fragmentov s proacutebou docircjde k emisii svetla určitej vlnovej dĺžky ktoruacute skener zaznamenaacute 6) Analyacuteza daacutet prebieha metoacutedami bioinformatiky spracovaniacutem softveacutermi sa zistiacute ktoreacute lokality čipu navzaacutejom hybridizovali v priacutepade použitia dvoch vzoriek kontrolnej a skuacutemanej je možneacute analyzovať ich relatiacutevnu intenzitu hybridizaacutecie (expresie určiteacuteho geacutenu)

Existujuacute štyri typy mikročipov 1) Čipy ur čeneacute na analyacutezu expresie (obsahujuacute cDNA proacuteby) pre tzv dvojkanaacutelovyacute experiment kedy je vzorka určenaacute k hybridizaacutecii na čipe ziacuteskanaacute zmiešaniacutem DNA fragmentov kontrolnej a skuacutemanej vzorky pričom fragmenty suacute rozdielne fluorescenčne označeneacute (napr zelenyacute fluorofoacuter pre kontrolnuacute vzorku a červenyacute pre skuacutemanuacute) Na zaacuteklade intenzity a typu fluorescencie sa deteguje expresia geacutenov typickaacute pre kontrolnuacute vzorku (napr zelenaacute fluorescencia) pre skuacutemanuacute vzorku (napr

48

červenaacute fluorescencia) a expresia podobnaacute u oboch vzoriek (žltaacute fluorescencia) neexprimovaneacute geacuteny (čierna fluorescencia) rocirczne odtiene (v zaacutevislosti od prevažujuacutecej hybridizaacutecie) (obr 48) 2) Čipy ur čeneacute na analyacutezu mutaacutecii použije sa genoacutemovaacute DNA označenaacute jednou fluorescenčnou farbičkou na určenie jednonukleotidovej zmeny (SNP ndash Single Nukleotide Polymorphism) 3) Čipy na komparatiacutevnu genoacutemovuacute hybridizaacuteciu (aCGH array Comparative Genomic Hybridization) ndash použiacutevaneacute na zistenie zvyacutešenia alebo zniacuteženia množstva chromozoacutemovyacutech fragmentov obsahujuacutecich geacuteny zodpovedneacute za určiteacute ochorenie Na analyacutezu sa použije skuacutemanaacute gDNA a referenčnaacute (kontrolnaacute) DNA každaacute sa značiacute inou fluorescenčnou farbičkou (princiacutep ako pri analyacuteze expresie) (obr 49 50) 4) Čipy CGH - SNP kombinovaneacute čipy ur čeneacute na analyacutezu aj mutaacuteciiacute SNP aj na komparatiacutevnu genoacutemovuacute hybridizaacuteciu CGH

Mikročipy majuacute rozsiahle využitie napriacuteklad v identifikaacuteciiacute novyacutech geacutenov vo vyacuteskume ich funkciiacute expresie v rocircznych podmienkach pri diagnostike mnohyacutech ochoreniacute vo farmakogenomike vo vyacuteskume vplyvu toxiacutenov

Obr 48 Heatmapa geacutenovej expresie vybranyacutech geacutenov (mRNA) mikročip obsahuje 46000 cDNA proacuteb (poskytnuteacute Ing Helenou Gbelcovou PhD Uacutestav lekaacuterskej bioloacutegie genetiky a klinickej genetiky LF UK a UNB)

49

Obr 49 Princiacutep komparatiacutevnej genoacutemovej hybridizaacutecie (aCGH - array comparative genomic hybridization) Obr 50 A) Vyacutesledok komparatiacutevnej genoacutemovej hybridizaacutecie (aCGH - array comparative genomic hybridization) vzorky DNA izolovanej plodovej vody U plodu s abnormaacutelnym ultrasonografickyacutem vyšetreniacutem bola identifikovanaacute duplikaacutecia oblasti 3q261q29 (modryacute paacutes) a deleacutecia oblasti 5p1533p151 (červenyacute paacutes) Pre porovnanie chromozoacutem 1 bez aberaacutecie b) Ten istyacute pacient ale ineacute softveacuteroveacute spracovanie (poskytnuteacute RNDr Miroslavom Tomkom PhD Medirex)

50

Odporuacutečanaacute a použitaacute literatuacutera

Odborneacute knihy Klug W S Cummings M R Spencer Ch A Palladino M A Concepts of Genetics jedenaacuteste vydanie (2015) Carson S Molecular Biology Techniques tretie vydanie (2012) Strachan T Read A Human Molecular Genetics štvrteacute vydanie (2011) Sudbery P Sudbery I Human Molecular Genetics tretie vydanie (2009)

Internetoveacute straacutenky

wwwncbinlmnihgov wwwmlpacom wwwthermofishercom wwwilluminacom wwwpromegask wwwqiagencom wwwambioncom

Odborneacute člaacutenky Chacon-Cortes D Griffiths L R Methods for extracting genomic DNA from whole blood samples current perspectives Journal of Biorepository Science for Applied Medicine Volume 2 strany 1- 9 Viltrop T Krjutskov K Palta P Metspalu A Comparison of DNA extraction methods for multiplex polymerase chain reaction Anal Biochem 2010 Volume 398(2) strany 260-262 Ing Martin Čermaacutek Molekulaacuterna cytogenetika v problematike familiaacuternych maligniacutet Onkoloacutegia Volume 2 strany 77 - 83 Livak KJ Schmittgen TD Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method Methods 2001 Volume 25(4) strany 402 - 408 Bustin S A Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays J Mol Endocrinol 2000 Volume 25(2) strany169 - 193

MOLEKULAacuteRNE METOacuteDY AKTUAacuteLNE POUŽIacuteVANEacute V KLINICKEJ GENETIKE RNDr Andrea Pastoraacutekovaacute PhD RNDr Robert Petrovič PhD Vydala Univerzita Komenskeacuteho v Bratislave Lekaacuterska fakulta Rozsah 50 straacuten 246 AH prveacute vydanie ISBN 978-80-223-4231-5

12

Tab 1 Priacuteprava PCR premixu

Celkovyacute objem jednej PCR reakcie 10 microl Počet vzoriek 8 2x PCR master mix 5 40

primer sense (10microM) 05 4

primer antisense (10microM) 05 4

H2O 35 28

DNA cDNA 05

rozpipetovať premix po 95microl do mikroskuacutemaviek až potom pridať do každej mikroskuacutemavky zvlaacutešť DNA cDNA

spolu objem 10 76

PCR amplif ikaacutecia je cyklickyacute proces pozostaacutevajuacuteci z troch krokov (obr 7) 1) denaturaacutecia dvojvlaacuteknovej DNA pri vysokej teplote (95degC) 2) hybridizaacutecia (annealing) primerov k špecifickej sekvencii DNA pri teplote vhodnej pre konkreacutetne primery 3) polymerizaacutecia (synteacuteza) novyacutech vlaacutekien DNA (72degC)

Obr 7 Princiacutep PCR

Tieto tri kroky sa opakujuacute 25 ndash 40 kraacutet pričom pri každom cykle sa počet molekuacutel zdvojnaacutesobiacute (vyacuteslednyacute počet cieľovej sekvencie je 2n+1 ak na začiatku bola jedna dvojvlaacuteknovaacute DNA a počet cyklov je n) PCR prebieha v termaacutelnom cykleacuteri (teplotnom cyklovači) je to priacutestroj (obr 8) kde je možneacute vykonať a naprogramovať celyacute termaacutelny priebeh PCR reakcie Tabuľka č 2 je priacutekladom termaacutelneho programu pre konkreacutetnu PCR reakciu

Po PCR reakcii je vyacuteslednyacute produkt možneacute vizualizovať elektroforeticky resp použiť na ďalšiu analyacutezu

13

Tab 2 Priacuteklad klasickeacuteho teplotneacuteho a časoveacuteho profilu PCR PCR Teplota Čas Opakovanie

95degC 2 minuacutety

95degC 15 sekuacutend

66degC 60 sekuacutend 30x

72degC 60 sekuacutend

72degC 5 minuacutet

Obr 8 Termaacutelny cykleacuter v procese a otvorenyacute s mikroskuacutemavkami

32 Variaacutecie PCR

Hot-start PCR využiacuteva DNA polymeraacutezu ktoruacute je treba aktivovať vysokou teplotou (napr 95degC 10 minuacutet) Vyacutehodou použiacutevania hot-start polymeraacutez je možnosť pracovať pri laboratoacuternej teplote keďže polymeraacuteza je pri bežnej teplote neaktiacutevna a tyacutem nemocircže docircjsť k vzniku nešpecifickyacutech produktov

Touchdown PCR maacute v počiatočnyacutech cykloch vyššiu teplotu annealingu (uacutečelom je zvyacutešiť

špecificitu PCR produktov na začiatku PCR) neskocircr sa teplota annealingu zniacuteži čo maacute za naacutesledok vyššiacute vyacuteťažok PCR produktu

Nested PCR maacute dva kroky a potrebuje dva paacutery primerov V prvom kroku sa prostredniacutectvom

prvej sady primerov amplifikuje dlhšiacute DNA fragment Ten sa použije ako templaacutet v druhom kroku s druhou sadou primerov s vyacuteslednyacutem kratšiacutem DNA produktom Nested PCR zvyšuje špecifickosť a citlivosť diagnostickyacutech PCR

Multiplex PCR je vlastne viac PCR reakciiacute prebiehajuacutecich v jednej skuacutemavke suacutečasne

V reakčnej zmesi je viac paacuterov primerov suacutečasne prebehne amplifikaacutecia viaceryacutech uacutesekov DNA takto dochaacutedza k šetreniu vzorky reakčnej zmesi a pracovneacuteho času

14

Real-time PCR je venovanaacute špeciaacutelna časť v skriptaacutech Sluacuteži na kvantifikaacuteciu PCR produktu v reaacutelnom čase na zaacuteklade merania fluorescencie okrem kvantifikaacutecie je využiacutevanaacute aj na určenie genotypov

RT-PCR je variaacutecia PCR umožňujuacuteca amplifikaacuteciu DNA sekvencie z vyacutechodiskovej RNA

sekvencie Najskocircr musiacute prebehnuacuteť prepis RNA do jednovlaacuteknovej cDNA prostredniacutectvom reverznej transkriptaacutezy naacutesledne sa cDNA použije pre PCR Selektiacutevnym použitiacutem primerov pri reverznej transkripcii mocircžeme uacutečelovo prepiacutesať buď celkovuacute RNA (primery - random hexameacutery) alebo len mRNA (primery - oligoT)

Alelovo-špecifickaacute PCR (AS-PCR) (obr 9) sluacuteži na detekciu konkreacutetnych mutaacuteciiacute

a jednonukleotidovyacutech polymorfizmov (SNP) Použije sa sada 3 primerov v dvoch kombinaacuteciaacutech PCR reakciiacute dva primery majuacute odlišnuacute sekvenciu na 3acute-koncoch jeden na detekciu wt (wild type) a druhyacute primer na detekciu mutantnej alely reakcia neprebehne ak miesto na templaacutetovej DNA nie je komplementaacuterne k 3acute-koncu primeru pretože DNA polymeraacuteza vyžaduje uacuteplnuacute hybridizaacuteciu primera na 3acute-konci Takto je možneacute rozliacutešiť priacutetomnosť štandardnej (wildtype ndash wt) a mutantnej alely resp SNP (obr 9) AS-PCR je znaacutema aj pod ďalšiacutemi naacutezvami ASO-PCR (allele-specific oligonucleotide PCR) ARMS (amplification-refractory mutation system)

Obr 9 Alelovo-špecifickaacute PCR (AS-PCR)

Mutageneacuteza prostredniacutectvom PCR (site directed mutagenesis) sa použiacuteva keď je potrebneacute vytvoriť mutaacuteciu v špecifickom mieste geacutenu primerprimery majuacute modifikovanuacute sekvenciu tak že obsahujuacute mutaacuteciu v strednej časti čo neovplyvniacute hybridizaacuteciu primerov s templaacutetovou DNA pričom vyacutesledkom je PCR produkt s cielene mutovanou DNA sekvenciou

Asymetrickaacute PCR sa použiacuteva na synteacutezu koacutepiiacute jedneacuteho vlaacutekna z templaacutetovej DNA a to

použitiacutem veľmi niacutezkej koncentraacutecie jedneacuteho primeru Sekvenačnaacute PCR je PCR v ktorej je použityacute len jeden primer a v reakčnej zmesi suacute okrem

všetkyacutech dNTP priacutetomneacute dideoxynukleotidtrifosfaacutety (ddNTP) značeneacute raacutedioaktiacutevne dnes však prevažne fluorescenčne každyacute typ ddNTP inou fluorescenčnou farbičkou Zaradenie niektoreacuteho zo štyroch ddNTP spocircsobiacute terminaacuteciu (zastavenie) predlžovania DNA reťazca fluorescenčneacute označenie ddNTP umožniacute detekciu dĺžky fragmentu a určenie sekvencie posledneacuteho nukleotidu Vyacuteslednyacute produkt sekvenačnej PCR sluacuteži na sekvenovanie Sekvenovaniu sa venuje samostatnaacute časť

MLPA (multiplex ligation-dependent probe amplification) ndash multiplexnaacute amplifikaacutecia proacuteb zaacutevislaacute od ligaacutecie je variaacutecia multiplexnej PCR umožňujuacuteca namnoženie viaceryacutech uacutesekov DNA za použitia iba jedneacuteho paacuteru primerov avšak s podmienkou vytvorenia sekvenčne špecifickej proacuteby ligaacuteciou sekvenčne špecifickyacutech oligonukleotidov MLPA je metoacuteda umožňujuacuteca detekciu počtu koacutepiiacute

15

až 50 nukleotidovyacutech sekvenciiacute v jednej reakcii Pomocou MLPA je možneacute ryacutechlo identifikovať amplifikaacutecie a deleacutecie veľkeacuteho počtu geacutenov či už z DNA alebo mRNA okrem toho MLPA mocircže byť použitaacute na analyacutezu CpG-metylaacutecie (MS-MLPA) Viac informaacutecii v samostatnej časti

SNaPshotreg Multiplex nazyacutevaneacute aj minisekvenovanie je multiplexnaacute reakcia v ktorej je každyacute primer predĺženyacute iba o jeden nukleotid (obr 10) V reakčnej zmesi nie suacute priacutetomneacute deoxyribonukleotidtrifosfaacutety ale len dideoxyribonukleotidtrifosfaacutety (ddATP ddCTP ddGTP ddTTP) každyacute označenyacute inou fluorescenčnou farbičkou Po integraacutecii ddNTP do DNA vlaacutekna je polymerizaacutecia ukončenaacute Jednovlaacuteknoveacute fragmenty (primery) predĺženeacute presne o jeden ddNTP suacute separovaneacute kapilaacuternou elektroforeacutezou v genetickom analyzaacutetore pričom je detegovanaacute ich fluorescencia a dĺžka (obr 11) Z vyacutesledneacuteho elektroforetogramu (obr 12) je možneacute určiť v jednej reakcii sekvenciu vo viac ako v 10 lokalitaacutech určiteacuteho fragmentu DNA SNaPshot Multiplex sa v molekulaacuterno-genetickom laboratoacuteriu využiacuteva na ryacutechlu detekciu viaceryacutech najčastejšie sa vyskytujuacutecich mutaacuteciiSNP geacutenu

Obr 10 Priacuteklad využitia metoacutedy SnaPshot s použitiacutem sady 13 primerov ktoreacute sa predĺžia len o 1 značenyacute dideoxynukleotid SNaPshot najčastejšiacutech mutaacuteciiacute geacutenu pre 21-hydroxylaacutezu (CYP21A2) ktoreacute spocircsobujuacute kongenitaacutelnu adrenaacutelnu hyperplaacuteziu A T G a C predstavujuacute fluorescenčne značeneacute dideoxynukleotidy

Obr 11 Vyacutesledok analyacutezy DNA pacienta metoacutedou minisekvenovania SnaPshot konkreacutetne použitiacutem sady 13 primerov rozlišujuacutecich najčastejšie bodoveacute mutaacutecie geacutenu pre 21-hydroxylaacutezu (CYP21A2) analyacutezou sa zistila mutaacutecia V281L v heterozygotnom stave (dva fragmenty modryacute a červenyacute)

16

Obr 12 SNaPshot analyacuteza geacutenu CYP21A2 u DNA izolovanej z plodovej vody metoacuteda deteguje najčastejšie bodoveacute mutaacutecie geacutenu pre 21-hydroxylaacutezu vyacutesledok prenataacutelnej analyacutezy = priacutetomnosť mutaacutecie In2G v hemizygotnom stave (keďže qPCR metoacutedou bola u plodu zistenaacute priacutetomnosť len jednej koacutepie geacutenu CYP21A2)

33 Kvantitatiacutevna PCR (qPCR)

Polymeraacutezovou reťazovou reakciou (PCR) docielime namnoženie (amplifikaacuteciu) určiteacuteho DNA uacuteseku (templaacutetu) PCR je katalyzovanaacute DNA polymeraacutezou za priacutetomnosti primerov dNTPs dvojmocnyacutech katioacutenov (ako Mg+2) a pufrovacieho roztoku

Real-time PCR ktoraacute je nazyacutevanaacute aj kvantitatiacutevna PCR (qPCR) umožňuje vizualizaacuteciu a kvantifikaacuteciu amplifikaacutecie DNA v reaacutelnom čase to je tak ako to bežiacute počas PCR qPCR využiacuteva fluorescenčneacute chemikaacutelie (farbivaacute) ktoryacutech emitovanuacute fluorescenciu zaznamenaacuteva optickyacute systeacutem počas každeacuteho PCR cyklu zaznamenanaacute fluorescencia je naacutesledne softveacuterovo spracovanaacute a vyhodnotenaacute

V suacutečasnosti sa využiacutevajuacute dva typy qPCR cheacutemie a to farbivaacute viažuce sa na DNA a fluorescenčne značeneacute proacuteby (obr 13)

Farbivaacute viažuce sa na DNA emitujuacute fluorescenciu v priacutepade ak suacute naviazaneacute na dvojvlaacuteknovuacute DNA proacuteby fluoreskujuacute v priacutepade keď molekula zhaacutešača (angl quencher - Q) sa nenachaacutedza v bliacutezkosti molekuly reporteacutera (R) napr hydrolyzujuacutece proacuteby fluoreskujuacute keď je molekula reporteacutera (R) prostredniacutectvom 5acuteexonukleaacutezovej aktivity DNA polymeraacutezy odstraacutenenaacute z bliacutezkosti molekuly zhaacutešača (Q)

Grafickyacute priebeh real ndash time PCR znaacutezorňuje amplifika čnaacute krivka (angl amplification plot) (obr 14) majuacuteca 4 faacutezy 1) Faacuteza I ndash dochaacutedza k zdvojnaacutesobeniu množstva amplikoacutenu po každom cykle ale naacuterast fluorescencie je pod detekčnyacutem limitom zaznamenaacutevanaacute fluorescencia (baseline) zodpovedaacute zaacutekladnej fluorescencii pozadia tzv šumu

17

2) Faacuteza II nazyacutevanaacute aj exponenciaacutelna faacuteza v ktorej sa fluorescencia zvyacuteši na uacuteroveň optickej detekcie bod resp cyklus kedy začiacutena exponenciaacutelna faacuteza je kľuacutečovyacute na určenie kvantity vstupneacuteho množstva templaacutetovej DNA nazyacuteva sa prahovyacute cyklus označuje sa Ct (angl treshold cycle) alebo Cq (quantification) Čiacutem nižšie je Ct (Cq) tyacutem vaumlčšiacute počet koacutepiiacute templaacutetovej DNA bolo v reakcii Ct hodnota je teda hlavnyacute uacutedaj s ktoryacutem sa pracuje vo vyacutepočtoch fluorescencia v tomto mieste sa nazyacuteva prahovaacute resp treshold 3) Faacuteza III - lineaacuterna faacuteza ndash charakterizuje ju postupneacute spotrebovaacutevanie komponentov reakcie na narastajuacutece množstvo amplikoacutenu 4) Faacuteza IV - plateau (čiacutetaj platoacute) ndash množstvo amplikoacutenu sa v docircsledku vyčerpania zložiek qPCR už nezvyšuje

Obr 13 Princiacutep real-time PCR Obr 14 Faacutezy real-time PCR

Ako štandardnaacute PCR aj qPCR maacute tri zaacutekladneacute kroky 1) Denaturaacutecia dvojvlaacuteknovej DNA na jednovlaacuteknovuacute DNA pri vysokej teplote (obyčajne 95degC) 2) Hybridizaacutecia primerov (annealing) ndash komplementaacuterne sekvencie sa spolu hybridizujuacute 3) Polymerizaacutecia pri 70-72degC kedy v docircsledku optimaacutelnej aktivity DNA polymeraacutezy dochaacutedza k predĺženiu primeru až o 100 baacutez za sekundu

18

Real-time PCR (obr 15) sa využiacuteva na kvantifikaacuteciu expresie geacutenov určenie počtu koacutepiiacute geacutenov určenie genotypu (genotypovanie) alelovou diskriminaacuteciou alebo analyacutezou krivky topenia tzv high resolution melt a multiplexnuacute real time PCR s možnosťou detekcie viaceryacutech cieľovgeacutenov

Multiplexnaacute real-time PCR sa využiacuteva na detekciu viaceryacutech cieľovgeacutenov v jednej reakcii suacutečasne Vyacutehodou multiplexovania je jednak uacutespora vzorky ako aj ziacuteskanie vaumlčšieho množstva informaacuteciiacute z rovnakeacuteho množstva materiaacutelu Nevyhnutnosťou multiplexnej qPCR suacute proacuteby značeneacute rocircznymi fluorescenčnyacutemi farbivami

Najdocircležitejšie zložky qPCR (real-time PCR komponenty) suacute DNA polymeraacuteza (reverznaacute transkriptaacuteza v priacutepade jednokrokovej kvantitatiacutevnej RT-PCT) dNTPs primery resp primeryproacuteby dvojmocneacute Mg templaacutet Na uľahčenie qPCR suacute v suacutečasnosti už komerčne dostupneacute takeacute reakčneacute zmesi ku ktoryacutem stačiacute pridať už len templaacutet (napr kity využiacutevajuacutece TaqManProacuteby) alebo kity s fluorescenčnyacutemi farbami viažucimi sa na dvojvlaacuteknovuacute DNA ku ktoryacutem sa do reakčnej zmesi okrem templaacutetu pridajuacute primery

Obr 15 Real-time PCR cykleacuter

331 Kvantifikaacutecia pomocou qPCR

Na kvantifikaacuteciu DNA pomocou qPCR sa požiacutevajuacute dve zaacutekladneacute metoacutedy - absoluacutetna kvantifikaacutecia a relatiacutevna kvantifikaacutecia

Absoluacutetna kvantifikaacutecia vychaacutedza zo štandardnej krivky (obr 16) ktoraacute sa ziacuteska po qPCR seacuterie riedeniacute DNA znaacutemej koncentraacutecie Kvantifikaacutecia neznaacutemej vzorky sa zistiacute interpolaacuteciou (odčiacutetaniacutem) Ct neznaacutemej vzorky zo štandardnej krivky (obr 16 17) Využiacutevaneacute napr v kriminalistike na stanovenie koncentraacutecie DNA vo vzorke

Relatiacutevna kvantifikaacutecia (obr 18 19) porovnaacuteva uacuteroveň expresie určiteacuteho geacutenu vo vzorke k expresii toho isteacuteho geacutenu v referenčnej (kontrolnej) vzorke alebo množstvo určiteacuteho geacutenu (počet koacutepiiacute) vo vzorke porovnaniacutem s množstvom geacutenu v kontrolnyacutech vzorkaacutech V raacutemci každej vzorky musiacute pred relatiacutevnou kvantifikaacuteciou docircjsť k tzv normalizaacutecii t j porovnanie expresie sledovaneacuteho geacutenu k expresii referenčneacuteho geacutenu (najčastejšie niacutem byacuteva tzv bdquohousekeepingldquo geacuten napr GAPDH aktiacuten tubuliacuten)

V priacutepade kvantifikaacutecie expresie určiteacuteho geacutenu metoacutedou real-time PCR (RT-qPCR) pred samotnou kvantifikaacuteciou cDNA musiacute byť taacuteto cDNA nasyntetizovanaacute prostredniacutectvom reverznej

19

transkripcie za použitia enzyacutemu reverznej transkriptaacutezy Kvantitatiacutevna PCR s reverznou transkripciou RT-qPCR mocircže byť dvojkrokovaacute alebo jednokrokovaacute Pri dvojkrokovej RT-qPCR treba pred qPCR syntetizovať cDNA vlaacutekno z RNA pomocou reverznej transkriptaacutezy - 1 krok druhyacutem krokom je samotnaacute real-time PCR Jednokrokovaacute RT-qPCR umožňuje uskutočniť obidve reakcie reverznuacute transkripciu a kvantitatiacutevnu PCR v jednej skuacutemavke čo zjednodušuje qPCR a redukuje možnosť kontaminaacutecie Obr 16 5-bodovaacute štandardnaacute krivka (amplifikaacutecia piatich koncentraacuteciiacute jednej vzorky konkreacutetne ide o 10-tkoveacute riedenie)

Obr 17 Ukaacutežka amplifikačnyacutech kriviek riedenia a z nich ziacuteskanej štandardnej krivky poukazuje na vysokuacute presnosť metoacutedy RT-PCR

20

Obr 18 Relatiacutevna kvantifikaacutecia - určenie počtu koacutepiiacute geacutenu CYP21A2 vo vzorke DNA izolovanej z perifeacuternej krvi pacientov mutaacutecie v geacutene CYP21A2 spocircsobujuacute kongenitaacutelnu adrenaacutelnu hyperplaacuteziu (CAH) Vyacutesledok analyacutezy všetci pacienti majuacute dve koacutepie geacutenu

Obr 19 Relatiacutevna kvantifikaacutecia - určenie počtu koacutepiiacute geacutenu CYP21A2 vo vzorke DNA izolovanej z plodovej vody mutaacutecie v geacutene CYP21A2 spocircsobujuacute kongenitaacutelnu adrenaacutelnu hyperplaacuteziu (CAH) Prenaacutetalnou diagnostikou (qPCR) sa zistila priacutetomnost jednej koacutepie CYP21A2 geacutenu 332 Určenie genotypu metoacutedou alelovej diskriminaacutecie a analyacutezou krivky topenia (HRM)

Určenie genotypu metoacutedou alelovej diskriminaacutecie (obr 20) sa uskutočňuje použitiacutem hydrolyzujuacutecich proacuteb (sond) je veľmi ryacutechla a senzitiacutevna (presnaacute) metoacuteda frekventovane využiacutevanaacute v laboratoacuteriaacutech Dva variantyalely suacute vyšetreneacute suacutečasne v jednej vzorke a v jednej reakčnej

21

skuacutemavke V reakcii suacute použiteacute dve proacuteby označeneacute rozdielnymi fluorescenčnyacutemi farbičkami emitujuacutecimi svetlo o rocircznej vlnovej dĺžke (najčastejšie jedna označenaacute FAM farbičkou a druhaacute proacuteba označenaacute VIC farbičkou) Počas amplifikaacutecie amplikoacutenu dochaacutedza k odstraacuteneniu zhaacutešača z bliacutezkosti farbičky ktoraacute potom emituje svetlo priacuteslušnej vlnovej dĺžky Vzorky so signaacutelom len jednej fluorescenčnej farbičky (FAM) a bez signaacutelu druhej farbičky (VIC) suacute homozygoti pre alelu 1 vzorky so signaacutelom len druhej farbičky (VIC) a bez signaacutelu prvej (FAM) suacute homozygoti pre alelu 2 v priacutepade ak vyšetrovanaacute vzorka bdquosvietildquo obidvoma farbami jednaacute sa o heterozygota

Obr 20 Určenie genotypu metoacutedou alelovej diskriminaacutecie ndash amplifikačnaacute krivka vzoriek DNA majuacutecich tri rocirczne genotypy A ndash jednotliveacute vzorky (plnaacute čiara predstavuje štandardnuacute alelu guličkovanaacute mutovanuacute alelu) B ndash 72 vzoriek C ndash scatter plot 72 vzoriek

Určenie genotypu analyacutezou krivky topenia tzv high resolution melt (HRM) (obr 21) umožňuje detekciu takmer všetkyacutech genetickyacutech variaacuteciiacute (SNP mutaacuteciiacute) Keďže taacuteto metoacuteda okrem štandardnyacutech podmienok reakcie vyžaduje len primery a farbičku (nie proacuteby) je veľmi jednoduchaacute a lacnejšia Po amplifikaacuteciiacute treba amplikoacuten pomaly zohrievať až kyacutem nedocircjde k denaturaacuteciiacute Teplota topenia amplikoacutenu vo vzorke zaacutevisiacute od DNA sekvencie čo umožňuje detegovať priacutetomnosť mutaacutecie resp SNP Tvar vyacuteslednyacutech kriviek topenia určuje teda genotyp

22

Obr 21 Určenie genotypu analyacutezou krivky topenia tzv metoacutedou high resolution melting (HRM) A ndash krivka topenia vzoriek DNA majuacutecich tri rocirczne genotypy B ndash graf rozdielnosti krivky topenia vzoriek DNA majuacutecich tri rocirczne genotypy

23

4 Elektroforetickaacute separaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten

Separaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten predstavuje rozdelenie molekuacutel DNA alebo RNA na zaacuteklade veľkosti zloženia a poradia baacutez Podobnyacutemi metoacutedami je možneacute separovať aj proteiacuteny

Elektroforeacuteza (ELFO) je technika použiacutevanaacute na separaacuteciu niekedy aj purifikaacuteciu makromolekuacutel ako suacute nukleoveacute kyseliny a proteiacuteny na zaacuteklade ich rozdielnej veľkosti naacuteboja alebo konformaacutecie Je to metoacuteda veľmi často využiacutevanaacute nielen v molekulovej genetike ale aj biocheacutemii Elektroforeacuteza využiacuteva schopnosť nabityacutech molekuacutel migrovať v jednosmernom elektrickom poli k opačneacutemu poacutelu Nukleoveacute kyseliny majuacute vďaka svojej fosfaacutetovej zložke negatiacutevny naacuteboj preto v jednosmernom elektrickom poli migrujuacute ku kladneacutemu poacutelu čiže k anoacutede Elektroforeacuteza prebieha v elektroforetickej aparatuacutere v geacuteloch (v nosiči) so sieťovitou štruktuacuterou ktoraacute umožňuje separaacuteciu molekuacutel Vzorka nukleovej kyseliny zmiešanaacute s tzv nanaacutešaciacutem tlmivyacutem roztokom s farbičkou sa nanesie do jamky v geacuteli ktoryacute je umiestnenyacute v elektroforetickej aparatuacutere v priacutetomnosti elektroforetickeacuteho pufra (TAE alebo TBE) (obr 22) Nanaacutešaciacute tlmivyacute roztoknanaacutešacia farbička umožňuje na zaacuteklade migraacutecie farbičky vidieť migraacuteciu vzorky v geacuteli a suacutečasne zvyacutešeniacutem hustoty vo vzorke umožniacute klesnuacuteť vzorke do jamky a tak zabraacuteniť jej vyplaveniu z geacutelu Draacuteha je časť geacutelu ktoryacutem putuje jedna vzorka od katoacutedy k anoacutede V draacutehe sa nachaacutedzajuacute oddeleneacute jednotliveacute fragmenty nukleovyacutech kyseliacuten určityacutech veľkostiacute viditeľneacute vo forme pruacutežkov (angl bands) Intenzita pruacutežku zaacutevisiacute od množstva molekuacutel danej veľkosti je ekvivalentnaacute hmotnosti Na určenie veľkosti fragmentov NK sa do jednej jamky nanesie štandard molekulovyacutech hmotnostiacute (angl ladder) ktoryacute maacute presne definovaneacute veľkosti fragmentov čo umožňuje odhadnuacuteť veľkosť aj hmotnosť neznaacutemych separovanyacutech fragmentov

Obr 22 Elektroforetickaacute separaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten v agaroacutezovom geacuteli (A) a vizualizaacutecia UV svetlom a GelRedtrade (B C)

24

Nukleoveacute kyseliny je možneacute elektroforeticky separovať 1) v geacuteloch agaroacutezovom (horizontaacutelna elektroforeacuteza) (obr 22) a polyakrylamidovom (vertikaacutelna elektroforeacuteza) 2) v špeciaacutelnych lineaacuternych polymeacuteroch kapilaacuternou elektroforeacutezou použitiacutem genetickeacuteho analyzaacutetora (obr 23)

Agaroacuteza je polysacharid ziacuteskanyacute z morskej riasy použiacuteva sa najčastejšie v koncentraacuteciiacute 05-2 čiacutem vyššia koncentraacutecia tyacutem je geacutel pevnejšiacute a schopnejšiacute rozliacutešiť menšie fragmenty NK Priacuteprava je jednoduchaacute odvaacuteži sa potrebneacute množstvo agaroacutezy ktoraacute sa zmieša s tlmivyacutem roztokom (pufrom) rozvariacute sa v mikrovlnnej ruacutere a naleje sa do špeciaacutelnej naacutedoby na vytvaacuteranie geacutelov kyacutem je geacutel tekutyacute vložiacute sa do neho tzv hrebeň na vytvorenie jamiek Agaroacuteza je netoxickaacute V bežnom agaroacutezovom geacuteli v zaacutevislosti od jeho koncentraacutecie je možneacute separovať DNA fragmenty dĺžky 200-50 000 bp Dnes suacute dostupneacute aj špeciaacutelne agaroacutezy napr MetaPhorreg Agarose schopneacute oddeliť fragment DNA dĺžky 20-800bp Separaacutecia v agaroacutezovom geacuteli prebieha v horizontaacutelnej aparatuacutere preto sa nazyacuteva aj horizontaacutelna elektroforeacuteza

Polyakrylamidovyacute geacutel (PAGE) vznikaacute polymerizaacuteciou akrylamidu v priacutetomnosti špeciaacutelnych chemickyacutech laacutetok (peroxodisiacuteran amoacutenny TEMED bisakrylamid) Jeho priacuteprava je preto odlišnaacute a aj naacuteročnejšia Polyakrylamidoveacute geacutely majuacute vysokuacute rozlišovaciu schopnosť (1bp) preto suacute PAGE geacutely vhodneacute aj na sekvenovanie DNA klasickyacutemi metoacutedami PAGE geacutel nie je vhodnyacute na separaacuteciu fragmentov dlhšiacutech ako 2kb Použiacuteva sa v koncentraacutecii 35 -20 s rozliacutešeniacutem fragmentov od 10bp-2000bp Akrylamid je neurotoxiacuten musiacute sa s niacutem pracovať veľmi opatrne PAGE elektroforeacuteza bežiacute vo vertikaacutelnej aparatuacutere preto sa volaacute aj vertikaacutelna elektroforeacuteza použiacuteva sa často aj na separaacuteciu proteiacutenov

Ryacutechlosť pohybu nukleovyacutech kyseliacuten (mobilita) určuje viacero faktorov 1) veľkosť NK ndash počet baacutezovyacutech paacuterov resp baacutez pričom menšie molekuly prechaacutedzajuacute geacutelom ryacutechlejšie pretože sa ľahšie pohybujuacute v geacuteli 2) konformaacutecia nukleovej kyseliny napr u rovnako veľkyacutech plazmidov kondenzovaneacute superšpiralizovaneacute plazmidy migrujuacute najryacutechlejšie rovnako veľkeacute lineaacuterne molekuly (toho isteacuteho plazmidu) bežia pomalšie a najpomalšie putujuacute relaxovaneacute kruhoveacute molekuly plazmidu 3) koncentraacutecia geacutelu určuje jeho rozlišovaciu schopnosť koncentrovanejšiacute geacutel je schopnyacute separovať kratšie fragmenty NK redšie geacutely suacute vhodneacute pre rozliacutešenie vaumlčšiacutech fragmentov 4) zloženie geacutelu je docircležiteacute pri analyacuteze sekundaacuternych štruktuacuter NK a proteiacutenov v nedenaturovanom stave sekundaacuterna štruktuacutera spomaľuje migraacuteciu NK a proteiacutenov Tento fakt využiacutevajuacute niektoreacute diagnostickeacute techniky (napr SSCP - Single Strand Conformation Polymorphism - polymorfismus konformaacutecie jednovlaacuteknovej DNA) umožňujuacutece detekciu zaacutemeny jedinej baacutezy ktoraacute spocircsobiacute odlišneacute vnuacutetromolekuloveacute paacuterovanie a vyacuteslednuacute konformaacuteciu molekuly Geacutely mocircžu teda byť denaturačneacute a nedenaturačneacute (natiacutevne) 5) napaumltie zdroja - čiacutem vyššie je napaumltie ktoreacute vytvaacutera elektrickeacute pole v elektroforetickej aparatuacutere tyacutem ryacutechlejšie fragmenty NK migrujuacute 6) zloženie roztokov a teploty

Elektroforetickyacute tlmivyacute roztok (pufor - elektrolyt) zabezpečuje stabilneacute elektroforetickeacute podmienky počas separaacutecie geacutel je v ňom ponorenyacute Obsahuje ioacuteny čo umožňuje vedenie elektrickeacuteho pruacutedu

Štandard molekulovyacutech hmotnostiacute (v laboratoacuteriaacutech nazyacutevanyacute ladder alebo marker) je zmes fragmentov DNA alebo RNA s presne definovanou veľkosťou ktoryacute sluacuteži na odhad veľkosti vyšetrovanyacutech fragmentov NK (obr 22) Pomocou špeciaacutelnych štandardov molekulovyacutech hmotnostiacute ktoryacutech fragmenty NK majuacute definovanuacute aj hmotnosť je možneacute odhadnuacuteť množstvo (hmotnosť - koncentraacuteciu) neznaacutemeho fragmentu

B C

25

41 Vizualizaacutecia DNA

Samotnaacute nukleovaacute kyselina je počas elektroforetickej separaacutecie neviditeľnaacute Vizualizaacuteciu NK umožňujuacute interkalačneacute činidlaacute ktoreacute suacute schopneacute naviazať sa na molekuly NK tyacutem že sa včlenia medzi susediace baacutezy Po ožiareniacute UV svetlom interkalačneacute činidlaacute naviazaneacute na NK fluoreskujuacute tak sa vizualizuje NK čiacutem intenziacutevnejšie fluoreskuje tyacutem viac NK je v geacutelipruacutežku priacutetomneacute Interkalačneacute činidlo sa buď primieša do geacutelu pri jeho priacuteprave čo umožniacute sledovať migraacuteciu fragmentov NK počas elektroforeacutezy a to po vybratiacute z ELFO aparatuacutery a po ožiareniacute UV svetlom alebo sa geacutel farbiacute po elektroforetickej separaacutecii V minulosti bol na zviditeľnenie NK najčastejšie použiacutevanyacute etidiumbromid kvocircli jeho mutageacutennym vlastnostiam sa v suacutečasnosti nahraacutedza menej mutageacutennymi a netoxickyacutemi činidlami ako suacute napr komerčne dostupneacute SYBRregSafe GelRedtrade GelGreentrade

Kapilaacuterna elektroforeacuteza NK prebieha v špeciaacutelnom priacutestroji genetickom analyzaacutetore (obr 23) ktoryacute musiacute mať zaacutekladneacute komponenty ako suacute elektroacutedy kapilaacutera zdroj vysokeacuteho napaumltia detektor prepojenie s počiacutetačom a softveacuteroveacute vybavenie priestor na vloženie vzoriek atď Genetickyacute analyzaacutetor predstavuje automatizovanyacute systeacutem umožňujuacuteci sekvenovanie určovanie dĺžky DNA fragmentov ndash fragmentačnuacute analyacutezu a kvantifikaacuteciu nukleovyacutech kyseliacuten V novšiacutech typoch genetickeacuteho analyzaacutetora je proces analyacutezy od vloženia vzoriek do stojana automatizovanyacute

Vzorka určenaacute na analyacutezu je elektrokineticky injektovanaacute do tenkej kapilaacutery naplnenej lineaacuternym polymeacuterom Vplyvom vysokeacuteho napaumltia sa negatiacutevne nabiteacute fragmenty DNA pohybujuacute v polymeacuteri k pozitiacutevne nabitej elektroacutede Kapilaacuterna elektroforeacuteza je tak citlivaacute že je schopnaacute detegovať jednobaacutezovyacute rozdiel DNA fragmentov DNA fragmenty musia byť pred kapilaacuternou elektroforeacutezou fluorescenčne označeneacute v kapilaacutere suacute separovaneacute na zaacuteklade veľkosti Kraacutetko pred dosiahnutiacutem kladne nabitej elektroacutedy docircjde po excitaacutecii laserovyacutem žiareniacutem k emisii žiarenia fluoroformi (farbičkami) tak že optickyacute detekčnyacute systeacutem zaznamenaacute fluorescenciu ktoraacute je naacutesledne softveacuterovo spracovanaacute a vyhodnotenaacute

Obr 23 Genetickyacute analyzaacutetor

42 RFLP

Metoacuteda polymorfizmu dĺžky restrik čnyacutech fragmentov (angl Restriction Fragment Length Polymorfism) bola prvou metoacutedou využiacutevanou na detekciu DNA variaacuteciiacute rocircznych biologickyacutech vzoriek Princiacutep metoacutedy spočiacuteva v priacutetomnosti polymorfizmov v DNA sekvencii rocircznych ľudiacute ktoreacute zapriacutečinia rozdielny profil (obrazec) DNA fragmentov po štiepeniacute jednou alebo viaceryacutemi restrikčnyacutemi endonukleaacutezami Restrikčneacute endonukleaacutezy (RE) suacute enzyacutemy ktoreacute štiepia DNA molekulu v oblasti špecifickej nukleotidovej sekvencie nazyacutevanej restrik čneacute miesto RE najčastejšie rozpoznaacutevajuacute a štiepia miesto veľkeacute 4-6 baacutez RE suacute priacutetomneacute u prokaryotov (bakteacuterie a archebakteacuterie) kde suacute suacutečasťou restrik čno-modifikačneacuteho systeacutemu akoby prokaryotickeacutej vrodenej imunity sluacutežia

26

na ochranu pred cudzou DNA (napr viacuterusovou) ktoruacute po rozpoznaniacute špecifickej sekvencie štiepia

Restrikčno-modifikačnyacute systeacutem maacute dve zložky 1) modifikačneacute enzyacutemy - metylaacutezy ktoreacute procesom metylaacutecie modifikujuacute určiteacute baacutezy svojej DNA čiacutem ich označia za vlastnuacute DNA takže takaacuteto DNA je potom rezistentnaacute voči štiepeniu restrikčnyacutemi endonukleaacutezami Najčastejšiacutem spocircsobom metylaacutecie u bakteacuteriiacute je metylaacutecia adeniacutenu na N6 pričom vznikne metyladeniacuten alebo cytoziacutenu na C5 metylcytoziacuten 2) restrikčneacute endonukleaacutezy štiepia špecifickeacute miesto dvojvlaacuteknovej DNA ktoreacute je tvoreneacute symetrickou sekvenciou zrkadlovo sa opakujuacutecich nukleotidov ndash tzv palindroacutem Restrikčneacute enzyacutemy sa použiacutevajuacute na štiepenie DNA sekvencie na mieste špecifickom pre tuacute ktoruacute restrikčnuacute endonukleaacutezu napr pri analyacuteze polymorfizmov dĺžky restrikčnyacutech fragmentov (RFLP) analyacuteze jednonukleotidovyacutech polymorfizmov (SNP) mutaacuteciiacute ako aj pri klonovaniacute DNA do vhodnyacutech vektorovyacutech DNA molekuacutel

Po štiepeniacute dvojvlaacuteknovej DNA restrikčnou endonukleaacutezou mocircžu vzniknuacuteť tri typy koncov - 5´-prečnievajuacutece konce (lepiveacute) 3´-prečnievajuacutece konce (lepiveacute) a tupeacute konce (obr 24)

Obr 24 Restrikčneacute štiepenie zanechaacutevajuacutece rocirczne konce tupeacute a lepiveacute

Restrikčneacute štiepenie je často použiacutevanou metoacutedou geacutenovyacutech manipulaacuteciiacute na konštrukciu

hybridnyacutech molekuacutel DNA s naacuteslednyacutem klonovaniacutem Priebeh RFLP analyacutezy je nasledovnyacute restrikčnaacute endonukleaacuteza sa pridaacute k DNA a zmes sa vo

vhodnyacutech reakčnyacutech podmienkach (pufor teplota) inkubuje niekoľko hodiacuten Počas inkubaacutecie docircjde k štiepeniu DNA na špecifickyacutech miestach DNA je potom elektroforeticky separovanaacute v geacuteli a naacutesledne vizualizovanaacute V minulosti po geacutelovej elektroforeacuteze nasledoval Southern blot (čiže prenos separovanyacutech fragmentov DNA z geacutelu na špeciaacutelnu membraacutenu) (obr 35) po ktorom nastala vizualizaacutecia raacutedioaktiacutevne značenou proacutebou V suacutečasnosti sa kvocircli praacutecnosti a zdravotnyacutem rizikaacutem od Southern blotu upuacutešťa a prechaacutedza sa na ryacutechlejšie menej praacutecne a zdravotne šetrnejšie metoacutedy priateľskejšie aj k životneacutemu prostrediu

RFLP bola prvou metoacutedou použiacutevanou na zistenie DNA profilu (DNA fingerprinting) mapovanie geacutenov zapriacutečiňujuacutece genetickeacute ochorenia a testovanie otcovstva Vaumlčšina RFLP markerov je vysoko lokusovo špecifickyacutech a kodominantnyacutech (obidve alely suacute detekovaneacute u heterozygota)

PCR-RFLP je laboratoacuterne priacutestupnejšia metoacuteda molekulaacuterno-genetickej diagnostiky keďže PCR umožňuje amplifikaacuteciu veľmi malyacutech množstiev DNA Alternatiacutevny naacutezov použiacutevanyacute v literatuacutere je CAPS z angl Cleaved Amplified Polymorphic Sequence assay Použitiacutem špecifickyacutech primerov docircjde PCR metoacutedou k amplifikaacutecii požadovaneacuteho uacuteseku DNA ten sa potom štiepi restrikčnou endonukleaacutezou vo vhodnyacutech podmienkach naacutesledne sa štiepne produkty elektroforeticky separujuacute a vizualizujuacute použitiacutem interkalačnyacutech farbiacutev a UV svetla (obr 25)

27

Obr 25 Princiacutep metoacutedy PCR-RFLP

43 VNTR a STR V geacutenome suacute priacutetomneacute dva typy tandemovyacutech (za sebou nasledujuacutecich) opakovaniacute

1) minisatelity ndash nazyacutevaneacute variabilnyacute počet tandemovyacutech opakovaniacute VNTR (variable number of tandem repeats) 2) mikrosatelity tiež kraacutetke tandemoveacute repetiacutecie STR (short tandem repeats)

Obidva tieto typy satelitnej DNA suacute rozmiestneneacute po celom genoacuteme suacute využiacutevaneacute hlavne vo forenznej genetike na identifikaacuteciu osocircb a určenie otcovstva popriacutepade materstva ale aj v mediciacutene na detekciu chromozoacutemovyacutech aneuploidiiacute Štruktuacutera obidvoch je podobnaacute Rozdiel medzi jednotlivyacutemi alelami je spocircsobenyacute rozdielnym počtom opakovaniacute opakujuacutecej sa sekvencie (motiacutevu) čo spocircsobiacute rocircznu dĺžku alel s rocircznym počtom tandemovyacutech opakovaniacute nazyacutevanuacute polymorfizmus dĺžky fragmentov

VNTR ndash variabilnyacute počet tandemovyacutech opakovaniacute pričom opakujuacuteca sa sekvencia maacute dĺžku od 6 do 100 baacutez pričom sa mocircže opakovať aj tisiacutece kraacutet alely tak mocircžu mať od 500do 30 000 baacutez VNTR boli v kombinaacutecii s RFLP (DNA fingerprinting ) prvyacutem polymorfizmom použiacutevanyacutem na zistenie DNA profilov a identifikaacuteciu osocircb v kriminalistickej praxi V suacutečasnosti jeho využitie v kriminalistike je kvocircli potrebe relatiacutevne veľkeacuteho množstva DNA nahradeneacute využitiacutem STR

STR - kraacutetke tandemoveacute repetiacutecie suacute v kriminalistike najčastejšie použiacutevanyacutem polymorfizmom STR lokusy suacute rozmiestneneacute po celom genoacuteme repetiacutecia obsahuje jednu až šesť baacutez pričom jej opakovaniacutem vznikne STR v rozsahu od 50 do 300bp V našom genoacuteme suacute tisiacutece STR ktoreacute mocircžu byť použiteacute pre forenznuacute analyacutezu V kriminalistike sa v suacutečasnosti na identifikaacuteciu osocircb použiacuteva 13 STR locusov ktoreacute patria k medzinaacuterodne uznaacutevanyacutem štandardom Z iniciatiacutevy FBI bola vytvorenaacute databaacuteza CODIS (Combined DNA Index System) každaacute krajina maacute svoju databaacutezu CODIS kde je možneacute vložiť a archivovať DNA profily jednotlivcov ako aj profily DNA ziacuteskanyacutech z miest kriminaacutelneho činu v databaacuteze je ich možneacute navzaacutejom porovnať a tak zistiť pocircvodcu trestneacuteho činu Medzinaacuterodnaacute jednotnosť v použiacutevaniacute CODIS STR lokusov umožňuje v priacutepade potreby vzaacutejomneacute porovnanie DNA profilov zistenyacutech na uacutezemiacute rocircznych štaacutetov CODIS STR lokusov je 13 a suacute to CSF1PO FGA TH01 TPOX VWA D3S1358 D5S818 D7S820 D8S1179 D13S317 D16S539 D18S51 a D21S11 Zistenie DNA profilu sa uskutočniacute multiplexnou PCR reakciou s fluorescenčne značenyacutemi primermi špecifickyacutemi pre konkreacutetny STR Naacutesledne suacute PCR produkty analyzovaneacute kapilaacuternou elektroforeacutezou genetickyacutem analyzaacutetorom ktoryacute rozliacuteši amplifikovaneacute fragmenty na zaacuteklade fluorescencie a dĺžky (fragmentačnaacute analyacuteza) (obr 26 Tab 3) DNA profil každeacuteho človeka je jedinečnyacute rovnakyacute profil mocircžu mať len jednovaječneacute dvojčataacute

28

Obr 26 Ukaacutežka DNA profilu človeka 15 STR lokusov s určeniacutem pohlavia pomocou lokusu pre amelogeniacuten (ženskeacute pohlavie - XX) maleacute oranžoveacute piacuteky predstavujuacute fragmenty veľkostneacuteho štandardu Tabuľka č 3 Zaacutepis DNA profilu človeka z obraacutezka č 26 15 STR lokusov s určeniacutem pohlavia pomocou lokusu pre amelogeniacuten System Alela 1 Alela 2

D3S1358 16 17

TH01 9 93 D21S11 28 28

D18S51 15 18

Penta E 7 14 D5S818 9 12

D13S317 8 11

D7S820 8 11 D16S539 11 12

CSF1PO 10 11

Penta D 11 12 vWA 15 18

D8S1179 13 16

TPOX 8 9 FGA 20 21

amel X X

29

5 MLPA

Multiplexnaacute amplifikaacutecia proacuteb zaacutevislaacute od ligaacutecie (z angl multiplex ligation-dependent probe amplification) je metoacuteda schopnaacute v jednej reakcii (v jednej skuacutemavke a vzorke) detegovať zmeny v počte až 50 nukleotidovyacutech sekvenciiacute Metoacutedou MLPA je možneacute ryacutechlo identifikovať amplifikaacutecie (duplikaacutecie) a deleacutecie veľkeacuteho počtu geacutenov či už použitiacutem DNA alebo mRNA krvnyacutech vzoriek alebo vzoriek z naacutedorov

Princiacutep MLPA spočiacuteva v multiplexnej amplifikaacutecii 50 špecifickyacutech nukleotidovyacutech sekvenciiacute použitiacutem jedneacuteho paacuteru primerov pričom jeden primer je fluorescenčne označenyacute Vyacutesledneacute PCR produkty suacute analyzovaneacute kapilaacuternou elektroforeacutezou (fragmentačnaacute analyacuteza) Dĺžka každeacuteho namnoženeacuteho produktu je jedinečnaacute narastaacute postupne o 6 alebo 9 nukleotidov pričom produkty PCR suacute 120 ndash 500 nukleotidov dlheacute Tento veľkostnyacute rozsah PCR fragmentov (dĺžka 120-500 nukleotidov s naacuterastom postupne o 6 alebo 9 nukleotidov) je optimaacutelny pre kapilaacuternu elektroforeacutezu MLPA multiplexnaacute PCR prebieha za použitia iba jedineacuteho paacuteru primerov ktoreacute amplifikujuacute špecifickeacute sekvencie Trik spočiacuteva v tom že nedochaacutedza k amplifikaacutecii DNA sekvencie ale MLPA proacuteb ktoreacute suacute pridaneacute k vzorkaacutem Každaacute MLPA proacuteba pozostaacuteva z dvoch oligonukleotidov (dve hemiproacuteby) pričom každyacute oligonukleotid obsahuje jednu zo sekvencie rozpoznaacutevanuacute PCR primermi Proacuteba vznikne jedine za predpokladu hybridizaacutecie dvoch oligonukleotidov (hemiproacuteb) k cieľovej sekvencii (geacutenu) a po ligaacutecii enzyacutemom ligaacutezou Iba ligovaneacute proacuteby suacute exponenciaacutelne amplifikovaneacute pomocou jedneacuteho paacuteru primerov Množstvo zligovanyacutech proacuteb teda zaacutevisiacute od množstva cieľovyacutech sekvenciiacute (geacutenov) vo vzorke

Postup MLPA analyacutezy je nasledovnyacute (obr27) K vzorke nukleovej kyseliny (DNA resp mRNA) sa pridaacute zmes 50 jedinečnyacutech proacuteb každaacute

proacuteba je komplementaacuterna k určitej cieľovej sekvencii NK vzorky Každaacute proacuteba však pozostaacuteva z dvoch oligonukleotidov hybridizujuacutecich vedľa seba zaacuteroveň každyacute oligonukleotid (hemiproacuteba) obsahuje pridanuacute sekvenciu rozpoznaacutevanuacute paacuterom PCR primerov Po hybridizaacuteciiacute oligonukleotidov (hemiproacuteb) dochaacutedza k ich ligaacutecii ligaacutezou Ligačnaacute reakcia je tak špecifickaacute že je schopnaacute rozliacutešiť sekvenciu liacutešiacu sa v jednom nukleotide Vyacuteslednyacute ligačnyacute produkt (proacuteba) obsahuje obidve sekvencie pre PCR primery na jednom fragmente čiže mocircže docircjsť k namnoženiu takeacutehoto fragmentu PCR reakciou V priacutepade ak nedocircjde k ligaacutecii priacuteslušnyacutech hemiproacuteb pretože hemiproacuteby nenaacutejdu cieľovuacute sekvenciu na DNA každaacute takaacuteto nezligovanaacute hemiproacuteba maacute len jednu sekvenciu rozpoznaacutevanuacute len jednyacutem PCR primerom v docircsledku čoho nemocircže prebehnuacuteť jej PCR amplifikaacutecia a počas fragmentačnej analyacutezy nie je detegovanaacute pretože negeneruje fluorescenčnyacute signaacutel

Pri MLPA analyacuteze je docircležiteacute okrem MLPA amplifikaacutecie vzorky urobiť aj MLPA amplifikaacuteciu referenčnej vzorky ku ktorej sa bude porovnaacutevať počet geacutenov (cieľovyacutech sekvenciiacute) Po kapilaacuternej elektroforeacuteze MLPA referenčnej a skuacutemanej vzorky porovnaniacutem obsahu nameranyacutech hodnocirct tzv piacutekov priacuteslušnyacutech proacuteb sa určiacute relatiacutevny počet koacutepiiacute v skuacutemanej vzorke

MLPA

1 DNA denaturaacutecia a hybridizaacutecia s MLPA proacutebami (hemiproacuteby)

2 Ligaacutecia (vytvorenie kompletnyacutech proacuteb)

3 PCR amplifikaacutecia proacuteb paacuterom primerov

4 Kapilaacuterna elektroforetickaacute separaacutecia PCR produktov

5 Analyacuteza daacutet

30

Obr 27 Princiacutep MLPA

Firma MRC-Holland v suacutečasnosti ponuacuteka stovky MLPA setov proacuteb ktoreacute suacute vhodneacute na 1) diagnostiku kongenitaacutelnych a dedičnyacutech ochoreniacute 2) zisťovanie profilu naacutedorov 3) zisťovanie metylačneacuteho profilu

MLPA je metoacuteda vhodnaacute na detekciu malyacutech prestavieb (BRCA1 BRCA2 MSH2 atď)

veľkyacutech chromozoacutemovyacutech prestavieb (Williamsov syndroacutem Prader-WilliAngelman syndroacutem atzď)

31

detekciu zmien v počte koacutepii geacutenov (obr 28 29) ako aj zistenie počtu kompletnyacutech chromozoacutemov (chromozoacutem 13 18 21 XY tiež aj z amniovej tekutiny) diagnostiku naacutedorov (zmeny počtu pri ALL CLL atď) kvantifikaacuteciu metylaacutecie (Prader-WilliAngelmanov syndroacutem Fragilnyacute X inaktivaacutecia naacutedorovyacutech supresorovyacutech geacutenov atď) mRNA analyacutezu geacutenov zuacutečastňujuacutecich sa apoptoacutezy alebo zaacutepalov

MS-MLPA (Methylation-Specific MLPA) je varianta MLPA určenaacute špeciaacutelne na analyacutezu aberantnyacutech metylaacutecii imprintovanyacutech oblastiacute ako aj detekciu metylačnyacutech zmien CpG ostrovčekov lokalizovanyacutech bliacutezko promoacutetora Rozdiel oproti štandardnej MLPA spočiacuteva v použitiacute metylačne senzitiacutevneho restrikčneacuteho enzyacutemu HhaI ktoryacute štiepi MS-MLPA proacuteby hybridizovaneacute k nemetylovanej sekvencii Každaacute DNA vzorka určenaacute pre MS-MLPA analyacutezu prejde dvoma reakciami v jednej mikroskuacutemavke štandardnou MLPA analyacutezou (bez štiepenia metylačne senzitiacutevnym enzyacutemom) a v druhej mikroskuacutemavke docircjde okrem ligaacutecie proacuteb aj k metylačne senzitiacutevnemu štiepeniu hybridizovanyacutech proacuteb s nemetylovanou DNA Amplifikujuacute sa len ligovaneacute proacuteby po PCR amplifikaacutecii sa fragmentačnou analyacutezou porovnaniacutem oboch reakciiacute zistia rozdiely v metylačnom profile vzorky k referenčnej vzorke

RT-MLPA (Reverse Transkriptase MLPA) je variaacutecia MLPA určenaacute pre zistenie mRNA profilu vzorky je alternatiacutevou k real-time PCR a mikročipom RT-MLPA nedeteguje mRNA množstvo priamo pretože použiacutevanaacute ligaacuteza nie je schopnaacute ligovať DNA oligonukleotidy keď suacute hybridizovaneacute s RNA Preto RT-MLPA začiacutena reverznou transkripciou so špeciaacutelne navrhnutyacutemi RT primermi tak aby vytvorili kraacutetke oligonukleotidy (cDNA) Potom reakcia pokračuje ako štandardnaacute MLPA

Obr 28 MLPA analyacuteza geacutenu DMD (koacutedujuacuteceho dystrofiacuten) mutaacutecie ktoreacuteho spocircsobujuacute Duchennovu svalovuacute dystrofiu u pacienta je priacutetomnaacute deleacutecia exoacutenu 45 v porovnaniacute s referenčnou vzorkou ndash kontrolou

32

Obr 29 MLPA analyacuteza geacutenu DMD (koacutedujuacuteceho dystrofiacuten) mutaacutecie ktoreacuteho spocircsobujuacute Duchennovu svalovuacute dystrofiu u pacienta suacute priacutetomneacute duplikaacutecie exoacutenov 41 42 43 44 45 (piacuteky vo vzorke pacienta sa porovnajuacute s piacutekmi v kontrole ndash referenčnej vzorke)

33

6 Sekvenovanie

Sekvenovaniacutem rozumieme určenie primaacuternej štruktuacutery DNA teda určenie poradia nukleotidov v reťazci DNA Začiatky moderneacuteho sekvenovania siahajuacute do roku 1977 kedy boli objaveneacute dve metoacutedy sekvenovania 1) chemickaacute metoacuteda Maxama a Gilberta 2) enzymatickaacute metoacuteda Sangera Nicklena a Coulsona

Princiacutep obidvoch metoacuted sekvenovania spočiacuteva v tom že sa vytvoriacute suacutebor DNA molekuacutel s rocircznou veľkosťou ktoreacute suacute zakončeneacute konkreacutetnym nukleotidom tieto DNA molekuly sa elektroforeticky separujuacute v geacuteloch s rozlišovacou schopnosťou 1 nukleotid 61 Chemickaacute metoacuteda

DNA molekuly sa na 5-konci raacutedioaktiacutevne označia raacutedioaktiacutevnym fosforom a naacutesledne sa chemicky modifikujuacute špecificky pre každuacute baacutezu DNA sa potom v modifikovanyacutech miestach štiepi čiacutem vzniknuacute rocirczne dlheacute fragmenty pričom podmienky suacute nastaveneacute tak aby sa DNA na každom mieste štiepila len raz Modifikaacutecia DNA a štiepenie prebehne v štyroch separaacutetnych reakciaacutech (skuacutemavkaacutech) takže po elektroforetickej separaacuteciiacute takto opracovanej DNA v štyroch draacutehach polyakrylamidoveacuteho geacutelu a naacuteslednej autoraacutediografii (podobne ako pri Southernovej hybridizaacutecii) je možneacute odčiacutetať nukleotidovuacute sekvenciu približne 100 nukleotidov od raacutedioaktiacutevneho označenia (v čase objavu Maxama a Gilberta) 62 Sangerova metoacuteda

Zaacuteklady metoacutedy boli popiacutesaneacute už v roku 1975 (metoacuteda plus a miacutenus) ale až vylepšenie použitiacutem dideoxynukleotidov (ddNTP) v roku 1977 došlo k zjednodušeniu sekvenovania Princiacutepom enzyacutemoveacuteho sekvenovania je terminaacutecia (zastavenie) polymerizaacutecie inkorporaacuteciou 2´ 3 -dideoxynukleotidov do novosyntetizujuacuteceho sa vlaacutekna DNA Keďže ddNTP neobsahujuacute hydroxylovuacute skupinu na 3 uhliacuteku riboacutezy nemocircžu sa zuacutečastniť na tvorbe fosfodiesterovej vaumlzby nemocircže sa pripojiť k nim ďalšiacute nukleotid čiže musiacute docircjsť k terminaacuteciiacute polymeraacutecie Reakcia prebieha v štyroch skuacutemavkaacutech s raacutedioaktiacutevne značenyacutem primerom V každej skuacutemavke suacute priacutetomneacute všetky štyri deoxynukleotidtrifosfaacutety (dNTP) ale pre každuacute skuacutemavku je špecifickyacute priacutedavok maleacuteho množstva jedneacuteho z dideoxynukleotidtrifosfaacutetov (v prvej skuacutemavke je ddATP v druhej ddCTP v tretej ddTTP a vo štvrtej ddGTP) Maleacute množstvo ddNTP spocircsobiacute že pri polymerizaacutecii dochaacutedza k prednostneacutemu zaradeniu štandardnyacutech dNTP do narastajuacuteceho reťazca a len občas sa inkorporuje ddNTP čiacutem sa zastaviacute synteacuteza reťazca V každej skuacutemavke tak vznikne suacutebor DNA fragmentov rocircznych veľkostiacute zakončenyacutech priacuteslušnyacutem ddNTP (v prvej skuacutemavke ddATP v druhej ddCTP v tretej ddTTP a vo štvrtej ddGTP) Po elektroforetickej separaacutecii v 4 draacutehach polyakrylamidoveacuteho geacutelu a autoraacutediografii sa z autoraacutediogramu odčiacuteta sekvencia

V suacutečasnosti je sekvenovanie do značnej miery automatizovaneacute pričom využiacuteva princiacutep Sangerovej enzyacutemovej metoacutedy s určityacutemi obmenami Uacutesek DNA ktoryacute treba sekvenovať sa prostredniacutectvom termostabilnyacutech DNA polymeraacutez namnožiacute PCR metoacutedou po ktorej nasleduje sekvenačnaacute reakcia (asymetrickaacute PCR) s fluorescenčne značenyacutemi ddNTP (každyacute druh označenyacute inyacutem fluorescenčnyacutem farbivom) Sekvenačnaacute reakcia prebieha v jednej skuacutemavke s jednyacutem primerom vznikne tak suacutebor jednovlaacuteknovyacutech DNA rocircznej dĺžky ktoreacute suacute na 3konci označeneacute ddNTP so špecifickyacutem fluorescenčnyacutem farbivom Taacuteto metoacuteda sekvenovania sa tiež nazyacuteva rdquodye-terminator cycle sequencingrdquo(obr 30) Po kapilaacuternej elektroforeacuteze vzorky v genetickom analyzaacutetore zaznamenaacutevaniacute fluorescencie jednotlivyacutech fragmentov CCD kamerou a softveacuterovom spracovaniacute sa ziacuteska sekvencia DNA (obr 31)

34

Obr 30 Princiacutep sekvenovania Sangerova dideoxy metoacuteda alebo tzv chain termination method (reťazec zastavujuacuteca metoacuteda) Obr 31 Určenie genotypu plodu a rodičov sekvenčnou analyacutezou DNA ziacuteskanej z plodovej vody (prenataacutelna diagnostika) a perifeacuternej krvi sekvenčnaacute analyacuteza geacutenu ASPA vyacutesledok u plodu priacutetomnaacute mutaacutecia c 914CgtA v homozygotnom stave (AA) rodičia heterozygoti (AC) Uvedenaacute mutaacutecia je v homozygotnom stave kauzaacutelnou priacutečinou Canavanovej choroby

Automatizovaneacute sekvenovanie prinaacuteša viacereacute vyacutehody oproti klasickej Sangerovej metoacutede vyššiu presnosť a ryacutechlosť v jednej sekvenačnej reakcii možnosť osekvenovať až 1200 nukleotidovyacute fragment maleacute množstvo templaacutetu potrebneacute na analyacutezu

35

63 Next Generation Sequencing (NGS)

NGS (sekvenovanie novej generaacutecie) maacute obrovskyacute potenciaacutel v analyacuteze genoacutemov pričom toto označenie zahŕňa viacereacute technologickeacute metoacutedy reprezentovaneacute niekoľkyacutemi firmami Princiacutepom je masiacutevne paralelneacute sekvenovanie čiacutem sa ziacuteskajuacute raacutedovo tisiacutece až milioacuteny sekvenciiacute naraz 631 Sekvenovanie druhej generaacutecie

Na začiatku sa analyzovanaacute DNA vo vaumlčšine priacutepadov fragmentuje (vznikne tak DNA

knižnica) na fragmenty sa pripoja kraacutetke sekvencie ndash adapteacutery naacutesledne sa tieto fragmenty rocircznymi priacutestupmi amplifikujuacute a určiacute sa ich sekvencia Vďaka čiastočnyacutem prekryvom je zo ziacuteskanyacutech sekvencii možneacute poskladať plynuluacute sekvenciu zodpovedajuacutecu pocircvodnej nefragmentovanej DNA

Pyrosekvenovanie je podobne ako Sangerova metoacuteda založenaacute na princiacutepe synteacutezy komplementaacuterneho vlaacutekna DNA avšak rozdiel je v tom že sa na detekciu inkorporaacutecie nukleotidu využiacuteva inyacute systeacutem tvorby luminiscenčneacuteho signaacutelu v priebehu reakcie Pyrosekvenovanie je umožneneacute vďaka aktivite 4 enzyacutemov - DNA polymeraacutezy ATP sulfurylaacutezy luciferaacutezy a apyraacutezy Reakčnaacute zmes obsahuje aj ďalšie komponenty - enzymatickeacute substraacutety adenoziacutenfosfosulfaacutet (APS) d-luciferiacuten sekvenovanyacute templaacutet a cyklicky postupne po jednom type pridaacutevaneacute nukleotidtrifosfaacutety Po zabudovaniacute nukleotidu do novovznikajuacuteceho reťazca docircjde k uvoľneniu pyrofosfaacutetu naacutesledne je využityacute ATP sulfurylaacutezou na synteacutezu ATP z APS počas ďalšej reakcie docircjde k využitiu ATP luciferaacutezou na premenu luciferiacutenu na oxyluciferiacuten čo spocircsobiacute svetelnyacute signaacutel a ten zaznamenaacute detekčnyacute systeacutem Poslednou enzymatickou reakciou je reakcia apyraacutezy ktoraacute odstraacuteni nezainkorporovaneacute nukleotidy a nevyužiteacute ATP aby sa celyacute proces mohol zopakovať s reakčnou zmesou obsahujuacutecou ďalšiacute nukleotidtrifosfaacutet (inyacute ako v predchaacutedzajuacutecej reakcii) Po každej reakcii detektor zaznamenaacuteva emisiu svetla na zaacuteklade intenzity svetla je možneacute určiť či bol vradenyacute priacuteslušnyacute nukleotidtrifosfaacutet či bol inkorporovanyacute jeden priacutepadne viac rovnakyacutech nukleotidtrifosfaacutetov

Zvyacutešenie vyacutekonu pyrosekvenovania umožnila tzv emulznaacute PCR v mikročasticiach a použitie platničky PicoTiterPlatereg toto sekvenovanie zaviedla firma Roche pod pojmom 454 pyrosekvenovanie v roku 2005 Na začiatku sa DNA fragmentuje na uacuteseky dlheacute 400-600 baacutez dvojvlaacuteknovaacute fragmentovanaacute DNA sa liguje s adapteacutermi prostredniacutectvom nich sa naviaže na mikročastice dvojvlaacuteknoveacute fragmenty sa oddelia mikročastice s naviazanyacutemi jednovlaacuteknovyacutemi fragmentami sa premiešajuacute so zmesou oleja a roztoku ktoryacute obsahuje všetky komponenty na uacutespešnuacute PCR Tyacutemto spocircsobom sa okolo každej mikročastice vytvoriacute vlastnyacute mikroreaktor v ktorom prebehne amplifikaacutecia fragmentu Po PCR reakcii sa mikročastice prenesuacute do platničky PicoTiterPlate v ktorej sa do jamky zmestiacute akuraacutet jedna mikročastica a reakčneacute komponenty pyrosekvenačnej reakcie PicoTiterPlatereg maacute 1 600 000 jamiek každaacute jamka maacute maximaacutelny objem 75 picolitra Platnička s mikročasticami sa vložiacute do sekvenačneacuteho systeacutemu ndash priacutestroja v ktorom sa celeacute pyrosekvenovanie uskutočniacute Chemiluminiscenčneacute signaacutely ktoryacutech počas sekvenovania vznikajuacute milioacuteny v priebehu hodiny suacute zachyteneacute CCD kamerou a analyzovaneacute softveacuterom

Firma Illumina predstavila inuacute technoloacutegiu PCR amplifikaacutecia a sekvenovanie sa uskutočňuje na skliacutečku (flow cell) Fragmentaacutecia DNA a pripojenie adapteacuterov prebieha za uacutečasti transpozoacutemov v procese nazvanom tagmentaacutecia Po hybridizaacutecii fragmentov DNA na skliacutečko prebehne v klastroch PCR amplifikaacutecia (tzv mostiacutekovaacute amplifikaacutecia) sekvenaacutecia prebieha za uacutečasti rozdielne fluorescenčne značenyacutech a chemicky modifikovanyacutech nukleotidov pričom každyacute nukleotid emituje fluorescenciu s inou vlnovou dĺžkou Na skliacutečku prebieha paralelne až 6 miliaacuterd sekvenaacutecii (obr 32)

Ďalšiacutemi možnosťami sekvenovania druhej generaacutecie je systeacutem SOLid (vyvinutyacute firmou Applied Biosystem dnes pod Thermo Fisher Scientific) a Ion Semiconductor Sequencing ndash polovodičoveacute ioacutenoveacute sekvenovanie (od firmy Ion Semiconductor Sequencing v suacutečasnosti Thermo Fisher Scientific)

36

Obr 32 Princiacutep sekvenovania novej generaacutecie od firmy Illumina PCR amplifikaacutecia a sekvenovanie sa uskutočňuje na skliacutečku (flow cell) paralelne prebieha až 6 miliaacuterd sekvenaacutecii

632 Sekvenovanie tretej generaacutecie

Pred sekvenovaniacutem netreba amplifikovať DNA PCR metoacutedou ale sekvencia sa ziacuteskava zachyteniacutem signaacutelu v reaacutelnom čase Medzi sekvenovanie tretej generaacutecie patriacute SMRT (Single Molecule Real-Time Sequencing) a Nanopore Sequencing

37

7 Fragmentačnaacute analyacuteza DNA

Je metoacuteda použiacutevanaacute na určenie veľkosti fragmentov DNA ziacuteskanyacutech PCR reakciou Dĺžka amplifikovanyacutech DNA fragmentov sa zistiacute ich porovnaniacutem s veľkostnyacutem štandardom (obr 33) ktoryacute je tvorenyacute DNA fragmentami znaacutemej dĺžky Veľkostnyacute štandard je pred kapilaacuternou elektroforeacutezou zmiešanyacute so vzorkou DNA fragmenty veľkostneacuteho štandardu suacute fluorescenčne označeneacute pričom použiteacute fluorescenčneacute farbivo je ineacute ako fluorescenčneacute farbivo použiteacute na označenie DNA fragmentov vo vyšetrovanej vzorke

Obr 33 Elektroforetogram veľkostneacuteho štandardu použiacutevaneacuteho na určenie veľkostiacute fragmentov analyzovanyacutech kapilaacuternou elektroforeacutezou v genetickom analyzaacutetore (GeneScantrade 500 LIZtrade dye Size Standard) dĺžka fragmentov v nukleotidoch (napr 50 nukleotidov)

Fragmentačnaacute analyacuteza pozostaacuteva z viaceryacutech krokov Prvyacutem je izolaacutecia DNA nasleduje PCR amplifikaacutecia počas ktorej sa novosyntetizovaneacute DNA fragmenty označia fluorescenčnyacutemi farbivami Vzorka s PCR produktom sa pripraviacute na kapilaacuternu elektroforeacutezu tak že sa zmieša s veľkostnyacutem štandardom (sluacuteži na určenie veľkosti fragmentov) a denaturačnou laacutetkou (formamid) nasleduje denaturaacutecia Pripraveneacute vzorky suacute injektovaneacute do priacutestroja (genetickyacute analyzaacutetor) kde v kapilaacutere naplnenej polymeacuterom v elektrickom poli migrujuacute fluorescenčne značeneacute fragmenty DNA na zaacuteklade veľkosti (kapilaacuterna elektroforeacuteza) Počas elektroforeacutezy genetickyacute analyzaacutetor zaznamenaacuteva fluorescenciu fragmentov Analyacutezou daacutet prostredniacutectvom špeciaacutelnych softveacuterov sa ziacuteskajuacute elektroforetogramy z ktoryacutech je možneacute zistiť veľkosť fragmentov ako aj typ fluorescencie (docircležiteacute ak suacute genetickeacute varianty rozliacutešiteľneacute rocircznou fluorescenciou napr SNaPshot) Fragmentačnaacute analyacuteza je suacutečasťou množstva molekulaacuterno-genetickyacutech metoacuted (pozri obr 12 26 28 29 34) ako suacute napr STR analyacuteza (Short Tandem Repeat) AFLP analyacuteza (Amplified Fragment Lenght Polymorfism) RFLPT-RFLP analyacuteza (Restriction Fragment Lenght PolymorfismTerminal Restricted Fragment Lenght Polymorfism) SSCP (Single Strand Conformation Polymorfism) VNTR (Variable Number of Tandem Repeat) analyacuteza straty heterozygotnosti (LOH loss of heterozygozity) MLPA (Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification) MSMSA (Methylation-Sensitive Mobility Shift Assay) SNP genotypovanie (SNaPshotreg) HiCEP (High-Coverage Expression Profiling)

38

Obr 34 Kvantitatiacutevna fragmentačnaacute PCR analyacuteza (QF-PCR) DNA izolovanej z plodovej vody vyacutesledok prenataacutelnej analyacutezy = priacutetomnosť troch piacutekov pre chromozoacutem 18 (u všetkyacutech fragmentov detegujuacutecich chromozoacutem 18 je pomer vyšetrovanyacutech markerov aberantnyacute 21 resp 111) čo znamenaacute trizoacutemiu chromozoacutemu 18 Edwardsov syndroacutem

39

8 Metoacutedy založeneacute na princiacutepe hybridizaacutecie

Nukleoveacute kyseliny majuacute schopnosť vytvaacuterať dvojvlaacuteknoveacute reťazce z jednovlaacuteknovyacutech molekuacutel na zaacuteklade komplementarity baacutez Komplementarita baacutez umožňuje replikaacuteciu DNA transkripciu RNA komplementarita baacutez zabezpečuje teda reprodukovateľnosť živej hmoty

Hybridizaacutecia je proces v ktorom na zaacuteklade komplementarity baacutez dochaacutedza k vytvoreniu dvojvlaacuteknovej nukleovej kyseliny z dvoch jednovlaacuteknovyacutech molekuacutel DNA alebo RNA alebo ich kombinaacuteciou DNA RNA pričom kratšia jednovlaacuteknovaacute nukleovaacute kyselina vystupuje ako sonda (proacuteba) Hybridizaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten je jeden z najpoužiacutevanejšiacutech naacutestrojov v molekulaacuternej bioloacutegii a genetike (hybridizaacutecia primerov alebo proacuteb sa využiacuteva v takmer každej metoacutede - v PCR RT-PCR qPCR RT-qPCR MLPA sekvenovaniacute fragmentačnej analyacuteze FISH DNA mikročipoch atď)

Denaturaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten je proces pri ktorom dochaacutedza k porušeniu vodiacutekovyacutech vaumlzieb medzi vlaacuteknami nukleovyacutech kyseliacuten (strata sekundaacuternej a terciaacutelnej štruktuacutery) tak že docircjde k ich uacuteplneacutemu oddeleniu vzniknuacute jednovlaacuteknoveacute reťazce Denaturaacutecia NK mocircže byť spocircsobenaacute vplyvom vysokyacutech teplocirct pH alebo chemickyacutech laacutetok (denaturačneacute činidlaacute) Renaturaacutecia je opačnyacute proces v ktorom na zaacuteklade komplementarity dochaacutedza k tvorbe dvojvlaacuteknovyacutech NK

Hybridiza čnaacute sonda (proacuteba) je jednovlaacuteknovaacute nukleovaacute kyselina určitej znaacutemej dĺžky a sekvencie (najčastejšie DNA pretože je stabilnejšia ako RNA) ktoraacute je značenaacute a sluacuteži na detekciu komplementaacuternych molekuacutel DNA alebo RNA v procese hybridizaacutecie V zaacutevislosti od podmienok hybridizaacutecie (stringencia) mocircže byť detegovanaacute sekvencia uacuteplne komplementaacuterna alebo v menej priacutesnych podmienkach mocircže mať sekvenčneacute odchyacutelky Proacuteba sluacuteži na vyhľadanie a zviditeľnenie cieľovyacutech NK Zviditeľnenie sa deje prostredniacutectvom označenia proacuteby ešte pred hybridizaacuteciou Značenie proacuteby mocircže byť raacutedioaktiacutevne a neraacutedioaktiacutevne (najčastejšie fluorescenčneacute)

Raacutedioaktiacutevne značeneacute proacuteby pomocou izotopov (32P) sa využiacutevali viac v minulosti v suacutečasnosti suacute kvocircli zdravotnyacutem rizikaacutem ohľaduplnosti k životneacutemu prostrediu ako aj kvocircli jednoduchšej manipulaacutecii použiacutevaneacute fluorescenčne značeneacute proacuteby Raacutedioaktiacutevne značeneacute sondy boli použiacutevaneacute hlavne metoacutedou Southernovej hybridizaacutecie (Southern blotting Southern blot) Citlivosť raacutedioaktiacutevne značenyacutech proacuteb je vyššia dosahuje schopnosť zachytiť 10 fg (femtogram 10-15) cieľovej DNA sekvencie 81 Southern blot

Metoacutedu objavil v roku 1975 britskyacute bioloacuteg Edwin Southern (preto Southern) Pri Southernovej hybridizaacutecii sa restrikčne štiepeneacute fragmenty DNA elektroforeticky separujuacute v geacuteli potom sa metoacutedou blottingu prenesuacute na nylonovuacute alebo nitroceluloacutezovuacute membraacutenu kde suacute naacutesledne hybridizovaneacute v roztoku obsahujuacutecom raacutedioaktiacutevne značenuacute sondu Priloženiacutem fotografickeacuteho filmu k membraacutene a vyvolaniacutem filmu autoraacutediografiou docircjde k zviditeľneniu lokaliacutet kde došlo k hybridizaacuteciiacute raacutedioaktiacutevne značenej sondy s fragmentom DNA (autoraacutediogram) Southern blot bol kľuacutečovou a prvou metoacutedou na identifikaacuteciu osocircb (DNA fingerprinting DNA pofiling) (obr 35)

Okrem Southern blotu existuje Northern blot na analyacutezu RNA (geacutenovej expresie) a Western blot na analyacutezu proteiacutenov postup je obdobnyacute ako pri Southern blote s obmenami špecifickyacutemi pre konkreacutetny blot Pri Northern blote sa použiacutevajuacute hybridizačneacute proacuteby ale pre vizualizaacuteciu proteiacutenov western blotom je potrebneacute použiť protilaacutetky s naacuteslednou vizualizaacuteciou Pomenovanie techniacutek je hra so sloviacutečkami (keďže paacuten Northern ani Western neobjavili takto nazvaneacute techniky)

Neraacutedioaktiacutevne značenie proacuteb použiacutevanyacutech v molekulaacuternej genetike mocircže byť nepriame (použitie haptenu) alebo priame Konečnaacute vizualizaacutecia je najčastejšie zabezpečenaacute fluoreskujuacutecimi farebnyacutemi značkami farbivami fluorochroacutemami (fluorofoacuterami) Pri priamom značeniacute je farbička kovalentne naviazanaacute na nukleotid a na zachytenie fluorescencie suacute potrebneacute špeciaacutelne priacutestroje umožňujuacutece excitaacuteciu farbičky ktoraacute potom emituje žiarenie určitej vlnovej dĺžky (emisneacute žiarenie) a to zachytiacute detekčnyacute systeacutem priacutestroja Využitie fluorochroacutemov v molekulaacuternej genetike je masiacutevne napr na vizualizaacuteciu NK elektroforeticky separovanyacutech v geacuteli kvantifikaacuteciu produktov PCR reakcie v priacutestroji real-time PCR cykleacuter sekvenovaniacute fragmentačnej analyacuteze FISH DNA mikročipoch atď

40

Obr 35 Princiacutep Southern blotu

82 FISH (fluorescenčnaacute in situ hybridizaacutecia)

FISH (fluorescent in situ hybridization fluorescenčnaacute in situ hybridizaacutecia) metoacuteda patriacute medzi molekulovo-cytogenetickeacute techniky Princiacutep FISH metoacutedy je založenyacute na hybridizaacuteciiacute fluorescenčne značenyacutech proacuteb ku komplementaacuternym uacutesekom vyšetrovanej DNA na podložnom skle (priamo na mieste - in situ) K denaturaacutecii dsDNA dochaacutedza buď vplyvom denaturačnyacutech činidiel alebo zvyacutešenou teplotou a naacuteslednou renaturaacuteciou dochaacutedza k naviazaniu sondy na komplementaacuterny uacutesek DNA Vyacutesledok hybridizaacutecie sa vizualizuje fluorescenčnyacutem mikroskopom vybavenyacutem vhodnyacutemi fluorescenčnyacutemi filtrami a vizuaacutelne zhodnotiacute skuacutesenyacutem odborniacutekom Fluorescencia sa v niektoryacutech priacutepadoch mocircže zaznamenať a hodnotiť aj pomocou softveacuteru (obr 36)

Pomocou FISH detegujeme numerickeacute aberaacutecie - zmeny v počte chromozoacutemov (napr trizoacutemia monozoacutemia chromozoacutemov) alebo štruktuacuterne aberaacutecie a prestavby (napr translokaacutecie inverzie deleacutecie duplikaacutecie amplifikaacutecie) FISH metoacuteda umožňuje identifikaacuteciu a detekciu každeacuteho ľudskeacuteho chromozoacutemu jeho zaradenie do karyotypu odhalenie malyacutech submikroskopickyacutech chromozoacutemovyacutech zmien a tiež mapovať poziacutecie jednotlivyacutech geacutenov na chromozoacuteme

41

Obr 36 Princiacutep štandardnej FISH a FISH maľovania celeacuteho chromozoacutemu

Veľkou vyacutehodou FISH metoacutedy je možnosť analyacutezy buniek v metafaacuteze aj v interfaacuteze kedy nie je nutnaacute kultivaacutecia buniek a tiež ryacutechle analyzovanie veľkeacuteho počtu buniek (stovky až tisiacutece) K ďalšiacutem vyacutehodaacutem patriacute bezpečnosť vysokaacute citlivosť dostatočnaacute stabilita relatiacutevne kraacutetky čas hybridizaacutecie a možnosť ryacutechleho vyhodnotenia Hybridizaacutecia pri vaumlčšine suacutečasne dodaacutevanyacutech sond trvaacute 10-12 hodin (na trhu suacute už dostupneacute aj sondy so skraacutetenyacutem časom hybridizaacutecie na 2-3 hodiny) Po hybridizaacuteciiacute nasleduje odmyacutevanie kedy pri priacuteslušnej teplote dochaacutedza k odmytiu nenaviazanyacutech a nespraacutevne hybridizovanyacutech sond Preparaacutet sa naacutesledne podfarbiacute a vyacutesledok sa zhodnotiacute vo fluorescenčnom mikroskope Na podfarbenie chromozoacutemov alebo jadier sa použiacuteva modreacute kontrastneacute farbivo DAPI (46-diamidino-2-fenylindol) ktoreacute maacute silneacute fluorescenčneacute vlastnosti dokaacuteže prechaacutedzať jadrovou membraacutenou a viazať sa na DNA Vyacutesledkom je modreacute zafarbenie ktoreacute vyacuteborne kontrastuje so signaacutelmi jednotlivyacutech sond

Limitujuacutecim faktorom FISH je možnosť identifikaacutecie len tyacutech uacutesekov DNA ku ktoryacutem suacute použiteacute sondy V jednej analyacuteze je možneacute použiť najviac 3 odlišne značeneacute sondy a tak zistiť priacutepadneacute abnormality len na 1 alebo na paacuter lokusoch Na relevantnuacute detekciu je potrebneacute mať vo vzorke 1-5 aberantnyacutech interfaacutezovyacutech jadier

FISH je možneacute uskutočniť na širokej škaacutele biologickeacuteho materiaacutelu na vzorkaacutech perifeacuternej krvi kostnej drene naacuteteroch choriovyacutech klkoch plodovej vode rocircznych druhov tkaniacutev natiacutevnych alebo zaliatych v parafiacutene na 1 bunke (predimplantačnaacute genetickaacute diagnostika PGD) (obr 37)

Využiacuteva sa na detekciu aberaacuteciiacute pri mnohyacutech onkologickyacutech ochoreniach (napr pri diagnoacuteze mnohopočetnyacute myeloacutem sa v suacutečasnosti po separaacutecii CD138+ buniek robiacute FISH s 5 sondami pre geacuteny IGH TP53 RB1 oblasť 1p321q21 a stanovuje sa hyperploidia chromozoacutemov 5 9 a 15) a tiež k spresneniu doplneniu a k overeniu bežneacuteho cytogenetickeacuteho vyšetrenia

Podľa miesta na chromozoacuteme na ktorom dochaacutedza k hybridizaacutecii sondy rozlišujeme 4 typy

DNA sond bull centromeacuteroveacute sondy ndash sa viažu na strednuacute časť chromozoacutemu ndash centromeacuteru sluacutežia k diagnostike zmien v počte chromozoacutemov k detekcii chromozoacutemov neznaacutemeho pocircvodu umožňujuacute interfaacuteznu FISH na nedeliacich sa bunkaacutech (obr 38-41)

42

Obr 37 Interfaacutezna FISH preimplantačnyacute genetickyacute skriacutening aneuploidiiacute ndash blastomeacutera 3-denneacuteho ľudskeacuteho embrya s normaacutelnym počtom chromozoacutemov 13 18 21 pohlavie XY použityacutech 5 sond pre chromozoacutemy 13 ndash orange 18 ndash aqua 21 ndash green X ndash blue a Y ndash yellow (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

Obr 38 Interfaacutezne jadro po hybridizaacutecii s centromeacuterovou sondou pre chromozoacutem 8 (Vysis Abbott) V pravom jadre je priacutetomnaacute trizoacutemia chromozoacutemu 8 (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex) Obr 39 Metafaacutezna (A) a interfaacutezna FISH (B) použitaacute centromeacuterovaacute sonda CEPX spectrum orangeCEPY spectrum green (Vysis Abbott) Sonda hybridizuje k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (červenyacute signaacutel) a Y (zelenyacute signaacutel) (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

43

Obr 40 Interfaacutezna FISH vyšetrenie spermiiacute použiteacute sondy CEPX greenCEPY orange (Aneuscore Metasystems) Sondy hybridizujuacute k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (zelenyacute signaacutel) Y (červenyacute signaacutel) vľavo ndash dve haploidneacute spermie (majuacutece jedna spermia X druhaacute Y chromozoacutem) vpravo ndash dve patologickeacute spermie obsahujuacutece gonozoacutemovyacute komplement XY (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

Obr 41 Interfaacutezna FISH vyšetrenie spermiiacute použiteacute sondy CEPX greenCEPY orange a CEP18 aqua (Aneuscore Metasystems) Sondy hybridizujuacute k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (zelenyacute signaacutel) Y (červenyacute signaacutel) a 18 (modryacute signaacutel) vľavo ndash normaacutelne haploidneacute ľudskeacute spermie - 1x chromozoacutem X alebo Y a jedenkraacutet chromozoacutem 18 v strede ndash patologickaacute spermia obsahujuacuteca gonozoacutemovyacute komplement XY a jeden chromozoacutem 18 vpravo ndash patologickaacute diploidnaacute spermia s chromozoacutemami X Y a dvoma chromozoacutemami 18 (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

bull lokusovo špecifickeacute sondy ndash hybridizaacutecia prebehne na konkreacutetnom mieste geacutenu (lokuse) (obr 42-44) použiacutevajuacute sa k vyšetreniu mikrodeleacuteciiacute (straty malyacutech častiacute chromozoacutemu pri mikrodelečnyacutech syndroacutemoch) k zisteniu amplifikaacutecie onkogeacutenov a niektoryacutech špecifickyacutech translokaacuteciiacute prestavby geacutenov umožňujuacute interfaacuteznu FISH na nedeliacich sa bunkaacutech bull subtelomeroveacute ndash vaumlzba na koncoveacute časti chromozoacutemu ndash telomeacutery bull celochromozoacutemoveacute alebo celomaľovacie sondy ndash sondy hybridizujuacute s mnohopočetnyacutemi chromozoacutemovyacutemi sekvenciami pričom sa fluorescenčne tak bdquovymaľujeldquo celyacute chromozoacutem (Obr 45) Použiacutevajuacute sa na vyšetrenie chromozoacutemovyacutech prestavieb k analyacuteze translokaacuteciiacute a k detekcii pocircvodu tzv marker chromozoacutemov (malyacutech nadpočetnyacutech chromozoacutemov neznaacutemeho pocircvodu) K použitiu sondy suacute potrebneacute metafaacutezne chromozoacutemy nepoužiacutevaju sa pre interfaacuteznu FISH

Pri konvenčnej chromozoacutemovej FISH suacute homogeacutenne DNA proacuteby hybridizovaneacute s fixovanyacutem metafaacuteznym alebo prometafaacuteznym chromozoacutemomchromozoacutemami na skliacutečku (Obr 36a) Maximaacutelna rozlišovacia schopnosť metafaacuteznej FISH je niekoľko megabaacutez (Obr 39a 45) využitiacutem viac

44

natiahnutyacutech prometafaacuteznych chromozoacutemov sa dosiahne 1 Mb rozliacutešenie Prostredniacutectvom fiber FISH konkreacutetne artificiaacutelne deproteinizovanej natiahnutej DNA pripravenej in situ z celyacutech buniek na mikroskopickom skliacutečku je možneacute vizualizovať individuaacutelne geacuteny maleacute DNA elementy na chromozoacuteme s rozliacutešeniacutem okolo 1000 bp

Obr 42 Interfaacutezne jadro po hybridizaacutecii s lokusovo-špecifickou sondou LSI 5q31 Spectrum Orange5p12 Spectrum Green (Vysis Abbott) Na ľavom obraacutezku suacute priacutetomneacute dva červeneacute (5q31) a dva zeleneacute signaacutely (5p12) v pravom jadre je priacutetomnaacute deleacutecia 5q31 oblasti chyacuteba jeden červenyacute signal (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

Obr 43 Interfaacutezna FISH použitaacute lokusovo-špecifickaacute sonda ndash translokačnaacute - XL BCRABL1 plus (Metasystems) dvojfarebnaacute dvojfuacutezna kde červenaacute označuje lokus ABL1 na chromozoacuteme 9 a zelenaacute oblasť BCR na chromozoacuteme 22 Sonda deteguje fuacuteziu protoonkogeacutenu ABL1 (9q34) a geacutenu BCR (22q11) v priacutepade že červenyacute a zelenyacute signaacutel suacute pri sebe (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

45

Obr 44 Interfaacutezna FISH Použitaacute lokusovo-špecifickaacute sonda- typ break apart pre IGH geacuten V docircsledku translokaacutecie došlo k rozskočeniu geacutenu pričom translokačneacuteho partnera nepoznaacuteme vieme určiť len percento v koľkyacutech jadraacutech je geacuten prestavanyacute (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex) Obr 45 Použiteacute celochromozoacutemoveacute sondy WCP 15 (červenyacute chromozoacutem) a WCP 17 (zelenyacute chromozoacutem) Na metafaacuteze je potvrdenaacute reciprokaacute translokaacutecia t(1517)(q2221) (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

FISH vizualizaacutecia celeacuteho chromozoacutemu maľovanie chromozoacutemu anglicky chromosome

painting je špeciaacutelnou aplikaacuteciou chromozoacutemovej FISH proacuteba je koktail veľkeacuteho počtu rocircznych fluorescenčne značenyacutech DNA fragmentov hybridizujuacutecich pozdĺž celeacuteho konkreacutetneho chromozoacutemu (obr 36b 45) bdquoChromosomepaintingldquo analyzuje metafaacutezne chromozoacutemy V minulosti bola FISH vizualizaacutecia celyacutech chromozoacutemov limitovanaacute malyacutem množstvom rocirczne sfarbenyacutech fluorochroacutemov

V suacutečasnosti je možneacute detegovať množstvo cieľovyacutech sekvenciiacute naraz čo sa využiacuteva pri celogenoacutemovej chromozoacutemovej vizualizaacutecii (whole-chromosomepainting - WCP) metoacutedou multiplex FISH (M-FISH multicolor FISH o br 46) alebo spektraacutelnej karyotypizaacutecie (SKY) kedy možno rozliacutešiť všetky ľudskeacute chromozoacutemy ndash teda 24 rocircznych chromozoacutemov M-FISH a SKY patria medzi metafaacutezne formy FISH diagnostiky ktoreacute umožňujuacute simultaacutennu vizualizaacuteciu všetkyacutech ľudskyacutech chromozoacutemov v rocircznych farbaacutech čo predstavuje uľahčenie analyacutezy karyotypu hlavne pri komplexnyacutech zmenaacutech a markeroch neznaacutemeho pocircvodu Obe techniky vychaacutedzajuacute z použitia

46

celochromozoacutemovyacutech sond značenyacutech kombinaacuteciou viaceryacutech fluorochroacutemov Rozdiel medzi M-FISH a SKY spočiacuteva v technike ziacuteskania konečneacuteho obrazu

Obr 46 Multicolor FISH - každyacute chromozoacutemovyacute paacuter je zafarbenyacute inou farbou pričom na ich zafarbenie postačuje kombinaacutecia 5 fluorochroacutemov Na vyhodnocovanie je potrebnaacute špeciaacutelna sada fluorescenčnyacutech filtrov pre jednotliveacute fluorochroacutemy a špeciaacutelnyacute softweacuter Vľavo-štandardnyacute karyotyp vpravo karyotyp s mutaacuteciami (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

V molekulovej cytogenetike suacute komerčne dostupneacute sety M-FISH proacuteb umožňujuacutece

viacfarebneacute pruacutežkovanie chromozoacutemov (banding) s vysokyacutem rozliacutešeniacutem (multicolor-banding mBAND FISH MCB) čo umožňuje identifikaacuteciu intrachromozoacutemovyacutech prestavieb (Obr 47) Nevyhnutnosťou mBAND-u je mať chromozoacutemy v metafaacuteze Taacuteto metoacuteda bola prvyacutekraacutet uskutočnenaacute na chromozoacuteme 5 v roku 1999 mBAND FISH umožňuje rozliacutešiť špecifickeacute oblasti chromozoacutemov na uacuterovni pruacutežku - bandu a sub-bandu s detekciou 550 bandov haploidneacuteho karyotypu

Obr 47 A - mBAND chromozoacutemu 11 - inverzia duplikovanej oblasti 11q223-q25 B - mBAND chromozoacutemu 3 - na kruhovom chromozoacuteme deleacutecia oblasti 3p263 C - mBAND chromozoacutemu 2 - potvrdenie inverzie duplikovanej časti chromozoacutemu (poskytnuteacute RNDr Dagmar Landlovou Medirex)

FISH metoacuteda a jej varianty (M-FISH mBAND SKY) majuacute v suacutečasnosti širokeacute využitie v

klinickej genetike v onkologickej genetike na detekciu aberaacuteciiacute v čase diagnoacutezy počas liečby po

47

liečbe monitorovanie po transplantaacutecii kostnej drene v prenataacutelnej a postnataacutelnej diagnostike pri detekcii submikroskopickyacutech deleacuteciiacute (napr DiGeorge syndroacutem - 22q112 delečnyacute syndroacutem PraderndashWilli syndroacutem- chromozoacutem 15q11-13) prostredniacutectvom FISH je možnaacute detekcia numerickyacutech zmien chromozoacutemov (trizoacutemia chromozoacutemu 21 pri Downovom syndroacuteme trizoacutemia chromozoacutemu 15 pri Patauovom syndroacuteme trizoacutemia chromozoacutemu 18 pri Edwardsovom syndroacuteme) rocirczne zmeny v počte pohlavnyacutech chromozoacutemov (monozoacutemia X pri Turnerovom syndroacuteme Klinefelterov syndroacutem s X chromozoacutemom naviac - XXY) podobne v predimplantačnej diagnostike

83 DNA Microarray (DNA mikro čip biočip) DNA mikročipovanie je technika využiacutevajuacuteca hybridizaacuteciu skuacutemanej nukleovej kyseliny

(cieľovaacute vzorka) s veľkyacutem množstvom oligonukleotidovyacutech proacuteb (desať tisiacutec až milioacuten) ktoreacute suacute prichyteneacute na pevnyacute podklad najčastejšie sklenyacute silikoacutenovyacute alebo nylonovyacute (doštička čip) Skuacutemanaacute nukleovaacute kyselina je pred hybridizaacuteciou fragmentovanaacute označenaacute fluorofoacuterom a denaturovanaacute Po kontakte čipu s cieľovou vzorkou ktoraacute je vlastne zmes označenyacutech oligonukleotidov značeneacute oligonukleotidy hybridizujuacute s oligonukleotidovyacutemi sekvenciami prichytenyacutemi na čipe Potom suacute na zaacuteklade fluorescencie detekovaneacute miesta kde došlo k hybridizaacutecii čiže vzorka obsahovala takuacuteto nukleotidovuacute sekvenciu Z jedneacuteho mikročipu sa ziacuteska obrovskeacute množstvo daacutet ktoreacute je vždy nutneacute softveacuterovo spracovať V dnešnej dobe existuje niekoľko firiem poskytujuacutecich komerčne mikročipy na objednaacutevku alebo si ich laboratoacuteria produkujuacute sami

Mikročipovanie prebieha nasledovne

1) Vytvorenie DNA čipu ndash tisiacutece rocircznych jednovlaacuteknovyacutech DNA oligonukleotidov znaacutemych sekvencii sa kovalentne naviažu na povrch doštičky vždy v určitej lokalite je niekoľko rovnakyacutech oligonukleotidov veľkosť takejto lokality je ˂ 200 microm Proacutebami mocircže byť DNA cDNA alebo syntetizovaneacute oligonukleotidy Už hotoveacute mikročipy ponuacutekajuacute viacereacute firmy (Affymetrix Agilent Technologies Eppendorf Illumina) alebo si ich jednotliveacute laboratoacuteria vyraacutebajuacute sami pomocou robotickyacutech zariadeniacute DNA čip sa vytvaacutera buď nanaacutešaniacutem kvapiek oligonukleotidov na podklad alebo synteacutezou oligonukleotidov in situ na čipe 2) Priacuteprava vzorky ndash nukleovaacute kyselina (mRNA DNA) sa purifikuje určiacute sa jej kvantita a kvalita (spektrofotometericky) fragmentuje resp v priacutepade mRNA sa syntetizuje cDNA v priacutepade potreby sa mocircže DNA amplifikovať PCR reakciou štiepiť restrikčnyacutemi endonukleaacutezami 3) Fluorescenčneacute označenie (zriedkavejšie raacutedioaktiacutevne) fragmentov DNA prebieha počas reverznej transkripcie alebo PCR amplifikaacutecie za uacutečasti fluorescenčne značenyacutech nukleotidov Keď sa analyzujuacute dve rocirczne vzorky napr zdraveacute tkanivo a naacutedoroveacute tkanivo označenie nukleovyacutech kyseliacuten v tyacutechto tkanivaacutech byacuteva rozdielne a to použitiacutem dvoch rocircznych fluorescenčnyacutech farbiacutev (napr zeleneacute a červeneacute) Pred hybridizaacuteciou je potrebneacute vzorku denaturovať čiacutem sa vytvoriacute zmes jednovlaacuteknovyacutech DNA označenyacutech značkou 4) Hybridizaacutecia s mikročipom ndash v špeciaacutelnom hybridizačnom roztoku hybridizujuacute komplementaacuterne sekvencie zo vzorky s priacuteslušnyacutemi oligonukleotidovyacutemi sondami naviazanyacutemi na čipe Potom sa čip obmyje aby došlo k odstraacuteneniu čiastočne hybridizovanyacutech nukleovyacutech kyseliacuten 5) Skenovanie mikročipu ndash skenerom čipov docircjde k ožiareniu čipu laserom pričom v mieste hybridizaacutecie fluorescenčne značenyacutech DNA fragmentov s proacutebou docircjde k emisii svetla určitej vlnovej dĺžky ktoruacute skener zaznamenaacute 6) Analyacuteza daacutet prebieha metoacutedami bioinformatiky spracovaniacutem softveacutermi sa zistiacute ktoreacute lokality čipu navzaacutejom hybridizovali v priacutepade použitia dvoch vzoriek kontrolnej a skuacutemanej je možneacute analyzovať ich relatiacutevnu intenzitu hybridizaacutecie (expresie určiteacuteho geacutenu)

Existujuacute štyri typy mikročipov 1) Čipy ur čeneacute na analyacutezu expresie (obsahujuacute cDNA proacuteby) pre tzv dvojkanaacutelovyacute experiment kedy je vzorka určenaacute k hybridizaacutecii na čipe ziacuteskanaacute zmiešaniacutem DNA fragmentov kontrolnej a skuacutemanej vzorky pričom fragmenty suacute rozdielne fluorescenčne označeneacute (napr zelenyacute fluorofoacuter pre kontrolnuacute vzorku a červenyacute pre skuacutemanuacute) Na zaacuteklade intenzity a typu fluorescencie sa deteguje expresia geacutenov typickaacute pre kontrolnuacute vzorku (napr zelenaacute fluorescencia) pre skuacutemanuacute vzorku (napr

48

červenaacute fluorescencia) a expresia podobnaacute u oboch vzoriek (žltaacute fluorescencia) neexprimovaneacute geacuteny (čierna fluorescencia) rocirczne odtiene (v zaacutevislosti od prevažujuacutecej hybridizaacutecie) (obr 48) 2) Čipy ur čeneacute na analyacutezu mutaacutecii použije sa genoacutemovaacute DNA označenaacute jednou fluorescenčnou farbičkou na určenie jednonukleotidovej zmeny (SNP ndash Single Nukleotide Polymorphism) 3) Čipy na komparatiacutevnu genoacutemovuacute hybridizaacuteciu (aCGH array Comparative Genomic Hybridization) ndash použiacutevaneacute na zistenie zvyacutešenia alebo zniacuteženia množstva chromozoacutemovyacutech fragmentov obsahujuacutecich geacuteny zodpovedneacute za určiteacute ochorenie Na analyacutezu sa použije skuacutemanaacute gDNA a referenčnaacute (kontrolnaacute) DNA každaacute sa značiacute inou fluorescenčnou farbičkou (princiacutep ako pri analyacuteze expresie) (obr 49 50) 4) Čipy CGH - SNP kombinovaneacute čipy ur čeneacute na analyacutezu aj mutaacuteciiacute SNP aj na komparatiacutevnu genoacutemovuacute hybridizaacuteciu CGH

Mikročipy majuacute rozsiahle využitie napriacuteklad v identifikaacuteciiacute novyacutech geacutenov vo vyacuteskume ich funkciiacute expresie v rocircznych podmienkach pri diagnostike mnohyacutech ochoreniacute vo farmakogenomike vo vyacuteskume vplyvu toxiacutenov

Obr 48 Heatmapa geacutenovej expresie vybranyacutech geacutenov (mRNA) mikročip obsahuje 46000 cDNA proacuteb (poskytnuteacute Ing Helenou Gbelcovou PhD Uacutestav lekaacuterskej bioloacutegie genetiky a klinickej genetiky LF UK a UNB)

49

Obr 49 Princiacutep komparatiacutevnej genoacutemovej hybridizaacutecie (aCGH - array comparative genomic hybridization) Obr 50 A) Vyacutesledok komparatiacutevnej genoacutemovej hybridizaacutecie (aCGH - array comparative genomic hybridization) vzorky DNA izolovanej plodovej vody U plodu s abnormaacutelnym ultrasonografickyacutem vyšetreniacutem bola identifikovanaacute duplikaacutecia oblasti 3q261q29 (modryacute paacutes) a deleacutecia oblasti 5p1533p151 (červenyacute paacutes) Pre porovnanie chromozoacutem 1 bez aberaacutecie b) Ten istyacute pacient ale ineacute softveacuteroveacute spracovanie (poskytnuteacute RNDr Miroslavom Tomkom PhD Medirex)

50

Odporuacutečanaacute a použitaacute literatuacutera

Odborneacute knihy Klug W S Cummings M R Spencer Ch A Palladino M A Concepts of Genetics jedenaacuteste vydanie (2015) Carson S Molecular Biology Techniques tretie vydanie (2012) Strachan T Read A Human Molecular Genetics štvrteacute vydanie (2011) Sudbery P Sudbery I Human Molecular Genetics tretie vydanie (2009)

Internetoveacute straacutenky

wwwncbinlmnihgov wwwmlpacom wwwthermofishercom wwwilluminacom wwwpromegask wwwqiagencom wwwambioncom

Odborneacute člaacutenky Chacon-Cortes D Griffiths L R Methods for extracting genomic DNA from whole blood samples current perspectives Journal of Biorepository Science for Applied Medicine Volume 2 strany 1- 9 Viltrop T Krjutskov K Palta P Metspalu A Comparison of DNA extraction methods for multiplex polymerase chain reaction Anal Biochem 2010 Volume 398(2) strany 260-262 Ing Martin Čermaacutek Molekulaacuterna cytogenetika v problematike familiaacuternych maligniacutet Onkoloacutegia Volume 2 strany 77 - 83 Livak KJ Schmittgen TD Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method Methods 2001 Volume 25(4) strany 402 - 408 Bustin S A Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays J Mol Endocrinol 2000 Volume 25(2) strany169 - 193

MOLEKULAacuteRNE METOacuteDY AKTUAacuteLNE POUŽIacuteVANEacute V KLINICKEJ GENETIKE RNDr Andrea Pastoraacutekovaacute PhD RNDr Robert Petrovič PhD Vydala Univerzita Komenskeacuteho v Bratislave Lekaacuterska fakulta Rozsah 50 straacuten 246 AH prveacute vydanie ISBN 978-80-223-4231-5

13

Tab 2 Priacuteklad klasickeacuteho teplotneacuteho a časoveacuteho profilu PCR PCR Teplota Čas Opakovanie

95degC 2 minuacutety

95degC 15 sekuacutend

66degC 60 sekuacutend 30x

72degC 60 sekuacutend

72degC 5 minuacutet

Obr 8 Termaacutelny cykleacuter v procese a otvorenyacute s mikroskuacutemavkami

32 Variaacutecie PCR

Hot-start PCR využiacuteva DNA polymeraacutezu ktoruacute je treba aktivovať vysokou teplotou (napr 95degC 10 minuacutet) Vyacutehodou použiacutevania hot-start polymeraacutez je možnosť pracovať pri laboratoacuternej teplote keďže polymeraacuteza je pri bežnej teplote neaktiacutevna a tyacutem nemocircže docircjsť k vzniku nešpecifickyacutech produktov

Touchdown PCR maacute v počiatočnyacutech cykloch vyššiu teplotu annealingu (uacutečelom je zvyacutešiť

špecificitu PCR produktov na začiatku PCR) neskocircr sa teplota annealingu zniacuteži čo maacute za naacutesledok vyššiacute vyacuteťažok PCR produktu

Nested PCR maacute dva kroky a potrebuje dva paacutery primerov V prvom kroku sa prostredniacutectvom

prvej sady primerov amplifikuje dlhšiacute DNA fragment Ten sa použije ako templaacutet v druhom kroku s druhou sadou primerov s vyacuteslednyacutem kratšiacutem DNA produktom Nested PCR zvyšuje špecifickosť a citlivosť diagnostickyacutech PCR

Multiplex PCR je vlastne viac PCR reakciiacute prebiehajuacutecich v jednej skuacutemavke suacutečasne

V reakčnej zmesi je viac paacuterov primerov suacutečasne prebehne amplifikaacutecia viaceryacutech uacutesekov DNA takto dochaacutedza k šetreniu vzorky reakčnej zmesi a pracovneacuteho času

14

Real-time PCR je venovanaacute špeciaacutelna časť v skriptaacutech Sluacuteži na kvantifikaacuteciu PCR produktu v reaacutelnom čase na zaacuteklade merania fluorescencie okrem kvantifikaacutecie je využiacutevanaacute aj na určenie genotypov

RT-PCR je variaacutecia PCR umožňujuacuteca amplifikaacuteciu DNA sekvencie z vyacutechodiskovej RNA

sekvencie Najskocircr musiacute prebehnuacuteť prepis RNA do jednovlaacuteknovej cDNA prostredniacutectvom reverznej transkriptaacutezy naacutesledne sa cDNA použije pre PCR Selektiacutevnym použitiacutem primerov pri reverznej transkripcii mocircžeme uacutečelovo prepiacutesať buď celkovuacute RNA (primery - random hexameacutery) alebo len mRNA (primery - oligoT)

Alelovo-špecifickaacute PCR (AS-PCR) (obr 9) sluacuteži na detekciu konkreacutetnych mutaacuteciiacute

a jednonukleotidovyacutech polymorfizmov (SNP) Použije sa sada 3 primerov v dvoch kombinaacuteciaacutech PCR reakciiacute dva primery majuacute odlišnuacute sekvenciu na 3acute-koncoch jeden na detekciu wt (wild type) a druhyacute primer na detekciu mutantnej alely reakcia neprebehne ak miesto na templaacutetovej DNA nie je komplementaacuterne k 3acute-koncu primeru pretože DNA polymeraacuteza vyžaduje uacuteplnuacute hybridizaacuteciu primera na 3acute-konci Takto je možneacute rozliacutešiť priacutetomnosť štandardnej (wildtype ndash wt) a mutantnej alely resp SNP (obr 9) AS-PCR je znaacutema aj pod ďalšiacutemi naacutezvami ASO-PCR (allele-specific oligonucleotide PCR) ARMS (amplification-refractory mutation system)

Obr 9 Alelovo-špecifickaacute PCR (AS-PCR)

Mutageneacuteza prostredniacutectvom PCR (site directed mutagenesis) sa použiacuteva keď je potrebneacute vytvoriť mutaacuteciu v špecifickom mieste geacutenu primerprimery majuacute modifikovanuacute sekvenciu tak že obsahujuacute mutaacuteciu v strednej časti čo neovplyvniacute hybridizaacuteciu primerov s templaacutetovou DNA pričom vyacutesledkom je PCR produkt s cielene mutovanou DNA sekvenciou

Asymetrickaacute PCR sa použiacuteva na synteacutezu koacutepiiacute jedneacuteho vlaacutekna z templaacutetovej DNA a to

použitiacutem veľmi niacutezkej koncentraacutecie jedneacuteho primeru Sekvenačnaacute PCR je PCR v ktorej je použityacute len jeden primer a v reakčnej zmesi suacute okrem

všetkyacutech dNTP priacutetomneacute dideoxynukleotidtrifosfaacutety (ddNTP) značeneacute raacutedioaktiacutevne dnes však prevažne fluorescenčne každyacute typ ddNTP inou fluorescenčnou farbičkou Zaradenie niektoreacuteho zo štyroch ddNTP spocircsobiacute terminaacuteciu (zastavenie) predlžovania DNA reťazca fluorescenčneacute označenie ddNTP umožniacute detekciu dĺžky fragmentu a určenie sekvencie posledneacuteho nukleotidu Vyacuteslednyacute produkt sekvenačnej PCR sluacuteži na sekvenovanie Sekvenovaniu sa venuje samostatnaacute časť

MLPA (multiplex ligation-dependent probe amplification) ndash multiplexnaacute amplifikaacutecia proacuteb zaacutevislaacute od ligaacutecie je variaacutecia multiplexnej PCR umožňujuacuteca namnoženie viaceryacutech uacutesekov DNA za použitia iba jedneacuteho paacuteru primerov avšak s podmienkou vytvorenia sekvenčne špecifickej proacuteby ligaacuteciou sekvenčne špecifickyacutech oligonukleotidov MLPA je metoacuteda umožňujuacuteca detekciu počtu koacutepiiacute

15

až 50 nukleotidovyacutech sekvenciiacute v jednej reakcii Pomocou MLPA je možneacute ryacutechlo identifikovať amplifikaacutecie a deleacutecie veľkeacuteho počtu geacutenov či už z DNA alebo mRNA okrem toho MLPA mocircže byť použitaacute na analyacutezu CpG-metylaacutecie (MS-MLPA) Viac informaacutecii v samostatnej časti

SNaPshotreg Multiplex nazyacutevaneacute aj minisekvenovanie je multiplexnaacute reakcia v ktorej je každyacute primer predĺženyacute iba o jeden nukleotid (obr 10) V reakčnej zmesi nie suacute priacutetomneacute deoxyribonukleotidtrifosfaacutety ale len dideoxyribonukleotidtrifosfaacutety (ddATP ddCTP ddGTP ddTTP) každyacute označenyacute inou fluorescenčnou farbičkou Po integraacutecii ddNTP do DNA vlaacutekna je polymerizaacutecia ukončenaacute Jednovlaacuteknoveacute fragmenty (primery) predĺženeacute presne o jeden ddNTP suacute separovaneacute kapilaacuternou elektroforeacutezou v genetickom analyzaacutetore pričom je detegovanaacute ich fluorescencia a dĺžka (obr 11) Z vyacutesledneacuteho elektroforetogramu (obr 12) je možneacute určiť v jednej reakcii sekvenciu vo viac ako v 10 lokalitaacutech určiteacuteho fragmentu DNA SNaPshot Multiplex sa v molekulaacuterno-genetickom laboratoacuteriu využiacuteva na ryacutechlu detekciu viaceryacutech najčastejšie sa vyskytujuacutecich mutaacuteciiSNP geacutenu

Obr 10 Priacuteklad využitia metoacutedy SnaPshot s použitiacutem sady 13 primerov ktoreacute sa predĺžia len o 1 značenyacute dideoxynukleotid SNaPshot najčastejšiacutech mutaacuteciiacute geacutenu pre 21-hydroxylaacutezu (CYP21A2) ktoreacute spocircsobujuacute kongenitaacutelnu adrenaacutelnu hyperplaacuteziu A T G a C predstavujuacute fluorescenčne značeneacute dideoxynukleotidy

Obr 11 Vyacutesledok analyacutezy DNA pacienta metoacutedou minisekvenovania SnaPshot konkreacutetne použitiacutem sady 13 primerov rozlišujuacutecich najčastejšie bodoveacute mutaacutecie geacutenu pre 21-hydroxylaacutezu (CYP21A2) analyacutezou sa zistila mutaacutecia V281L v heterozygotnom stave (dva fragmenty modryacute a červenyacute)

16

Obr 12 SNaPshot analyacuteza geacutenu CYP21A2 u DNA izolovanej z plodovej vody metoacuteda deteguje najčastejšie bodoveacute mutaacutecie geacutenu pre 21-hydroxylaacutezu vyacutesledok prenataacutelnej analyacutezy = priacutetomnosť mutaacutecie In2G v hemizygotnom stave (keďže qPCR metoacutedou bola u plodu zistenaacute priacutetomnosť len jednej koacutepie geacutenu CYP21A2)

33 Kvantitatiacutevna PCR (qPCR)

Polymeraacutezovou reťazovou reakciou (PCR) docielime namnoženie (amplifikaacuteciu) určiteacuteho DNA uacuteseku (templaacutetu) PCR je katalyzovanaacute DNA polymeraacutezou za priacutetomnosti primerov dNTPs dvojmocnyacutech katioacutenov (ako Mg+2) a pufrovacieho roztoku

Real-time PCR ktoraacute je nazyacutevanaacute aj kvantitatiacutevna PCR (qPCR) umožňuje vizualizaacuteciu a kvantifikaacuteciu amplifikaacutecie DNA v reaacutelnom čase to je tak ako to bežiacute počas PCR qPCR využiacuteva fluorescenčneacute chemikaacutelie (farbivaacute) ktoryacutech emitovanuacute fluorescenciu zaznamenaacuteva optickyacute systeacutem počas každeacuteho PCR cyklu zaznamenanaacute fluorescencia je naacutesledne softveacuterovo spracovanaacute a vyhodnotenaacute

V suacutečasnosti sa využiacutevajuacute dva typy qPCR cheacutemie a to farbivaacute viažuce sa na DNA a fluorescenčne značeneacute proacuteby (obr 13)

Farbivaacute viažuce sa na DNA emitujuacute fluorescenciu v priacutepade ak suacute naviazaneacute na dvojvlaacuteknovuacute DNA proacuteby fluoreskujuacute v priacutepade keď molekula zhaacutešača (angl quencher - Q) sa nenachaacutedza v bliacutezkosti molekuly reporteacutera (R) napr hydrolyzujuacutece proacuteby fluoreskujuacute keď je molekula reporteacutera (R) prostredniacutectvom 5acuteexonukleaacutezovej aktivity DNA polymeraacutezy odstraacutenenaacute z bliacutezkosti molekuly zhaacutešača (Q)

Grafickyacute priebeh real ndash time PCR znaacutezorňuje amplifika čnaacute krivka (angl amplification plot) (obr 14) majuacuteca 4 faacutezy 1) Faacuteza I ndash dochaacutedza k zdvojnaacutesobeniu množstva amplikoacutenu po každom cykle ale naacuterast fluorescencie je pod detekčnyacutem limitom zaznamenaacutevanaacute fluorescencia (baseline) zodpovedaacute zaacutekladnej fluorescencii pozadia tzv šumu

17

2) Faacuteza II nazyacutevanaacute aj exponenciaacutelna faacuteza v ktorej sa fluorescencia zvyacuteši na uacuteroveň optickej detekcie bod resp cyklus kedy začiacutena exponenciaacutelna faacuteza je kľuacutečovyacute na určenie kvantity vstupneacuteho množstva templaacutetovej DNA nazyacuteva sa prahovyacute cyklus označuje sa Ct (angl treshold cycle) alebo Cq (quantification) Čiacutem nižšie je Ct (Cq) tyacutem vaumlčšiacute počet koacutepiiacute templaacutetovej DNA bolo v reakcii Ct hodnota je teda hlavnyacute uacutedaj s ktoryacutem sa pracuje vo vyacutepočtoch fluorescencia v tomto mieste sa nazyacuteva prahovaacute resp treshold 3) Faacuteza III - lineaacuterna faacuteza ndash charakterizuje ju postupneacute spotrebovaacutevanie komponentov reakcie na narastajuacutece množstvo amplikoacutenu 4) Faacuteza IV - plateau (čiacutetaj platoacute) ndash množstvo amplikoacutenu sa v docircsledku vyčerpania zložiek qPCR už nezvyšuje

Obr 13 Princiacutep real-time PCR Obr 14 Faacutezy real-time PCR

Ako štandardnaacute PCR aj qPCR maacute tri zaacutekladneacute kroky 1) Denaturaacutecia dvojvlaacuteknovej DNA na jednovlaacuteknovuacute DNA pri vysokej teplote (obyčajne 95degC) 2) Hybridizaacutecia primerov (annealing) ndash komplementaacuterne sekvencie sa spolu hybridizujuacute 3) Polymerizaacutecia pri 70-72degC kedy v docircsledku optimaacutelnej aktivity DNA polymeraacutezy dochaacutedza k predĺženiu primeru až o 100 baacutez za sekundu

18

Real-time PCR (obr 15) sa využiacuteva na kvantifikaacuteciu expresie geacutenov určenie počtu koacutepiiacute geacutenov určenie genotypu (genotypovanie) alelovou diskriminaacuteciou alebo analyacutezou krivky topenia tzv high resolution melt a multiplexnuacute real time PCR s možnosťou detekcie viaceryacutech cieľovgeacutenov

Multiplexnaacute real-time PCR sa využiacuteva na detekciu viaceryacutech cieľovgeacutenov v jednej reakcii suacutečasne Vyacutehodou multiplexovania je jednak uacutespora vzorky ako aj ziacuteskanie vaumlčšieho množstva informaacuteciiacute z rovnakeacuteho množstva materiaacutelu Nevyhnutnosťou multiplexnej qPCR suacute proacuteby značeneacute rocircznymi fluorescenčnyacutemi farbivami

Najdocircležitejšie zložky qPCR (real-time PCR komponenty) suacute DNA polymeraacuteza (reverznaacute transkriptaacuteza v priacutepade jednokrokovej kvantitatiacutevnej RT-PCT) dNTPs primery resp primeryproacuteby dvojmocneacute Mg templaacutet Na uľahčenie qPCR suacute v suacutečasnosti už komerčne dostupneacute takeacute reakčneacute zmesi ku ktoryacutem stačiacute pridať už len templaacutet (napr kity využiacutevajuacutece TaqManProacuteby) alebo kity s fluorescenčnyacutemi farbami viažucimi sa na dvojvlaacuteknovuacute DNA ku ktoryacutem sa do reakčnej zmesi okrem templaacutetu pridajuacute primery

Obr 15 Real-time PCR cykleacuter

331 Kvantifikaacutecia pomocou qPCR

Na kvantifikaacuteciu DNA pomocou qPCR sa požiacutevajuacute dve zaacutekladneacute metoacutedy - absoluacutetna kvantifikaacutecia a relatiacutevna kvantifikaacutecia

Absoluacutetna kvantifikaacutecia vychaacutedza zo štandardnej krivky (obr 16) ktoraacute sa ziacuteska po qPCR seacuterie riedeniacute DNA znaacutemej koncentraacutecie Kvantifikaacutecia neznaacutemej vzorky sa zistiacute interpolaacuteciou (odčiacutetaniacutem) Ct neznaacutemej vzorky zo štandardnej krivky (obr 16 17) Využiacutevaneacute napr v kriminalistike na stanovenie koncentraacutecie DNA vo vzorke

Relatiacutevna kvantifikaacutecia (obr 18 19) porovnaacuteva uacuteroveň expresie určiteacuteho geacutenu vo vzorke k expresii toho isteacuteho geacutenu v referenčnej (kontrolnej) vzorke alebo množstvo určiteacuteho geacutenu (počet koacutepiiacute) vo vzorke porovnaniacutem s množstvom geacutenu v kontrolnyacutech vzorkaacutech V raacutemci každej vzorky musiacute pred relatiacutevnou kvantifikaacuteciou docircjsť k tzv normalizaacutecii t j porovnanie expresie sledovaneacuteho geacutenu k expresii referenčneacuteho geacutenu (najčastejšie niacutem byacuteva tzv bdquohousekeepingldquo geacuten napr GAPDH aktiacuten tubuliacuten)

V priacutepade kvantifikaacutecie expresie určiteacuteho geacutenu metoacutedou real-time PCR (RT-qPCR) pred samotnou kvantifikaacuteciou cDNA musiacute byť taacuteto cDNA nasyntetizovanaacute prostredniacutectvom reverznej

19

transkripcie za použitia enzyacutemu reverznej transkriptaacutezy Kvantitatiacutevna PCR s reverznou transkripciou RT-qPCR mocircže byť dvojkrokovaacute alebo jednokrokovaacute Pri dvojkrokovej RT-qPCR treba pred qPCR syntetizovať cDNA vlaacutekno z RNA pomocou reverznej transkriptaacutezy - 1 krok druhyacutem krokom je samotnaacute real-time PCR Jednokrokovaacute RT-qPCR umožňuje uskutočniť obidve reakcie reverznuacute transkripciu a kvantitatiacutevnu PCR v jednej skuacutemavke čo zjednodušuje qPCR a redukuje možnosť kontaminaacutecie Obr 16 5-bodovaacute štandardnaacute krivka (amplifikaacutecia piatich koncentraacuteciiacute jednej vzorky konkreacutetne ide o 10-tkoveacute riedenie)

Obr 17 Ukaacutežka amplifikačnyacutech kriviek riedenia a z nich ziacuteskanej štandardnej krivky poukazuje na vysokuacute presnosť metoacutedy RT-PCR

20

Obr 18 Relatiacutevna kvantifikaacutecia - určenie počtu koacutepiiacute geacutenu CYP21A2 vo vzorke DNA izolovanej z perifeacuternej krvi pacientov mutaacutecie v geacutene CYP21A2 spocircsobujuacute kongenitaacutelnu adrenaacutelnu hyperplaacuteziu (CAH) Vyacutesledok analyacutezy všetci pacienti majuacute dve koacutepie geacutenu

Obr 19 Relatiacutevna kvantifikaacutecia - určenie počtu koacutepiiacute geacutenu CYP21A2 vo vzorke DNA izolovanej z plodovej vody mutaacutecie v geacutene CYP21A2 spocircsobujuacute kongenitaacutelnu adrenaacutelnu hyperplaacuteziu (CAH) Prenaacutetalnou diagnostikou (qPCR) sa zistila priacutetomnost jednej koacutepie CYP21A2 geacutenu 332 Určenie genotypu metoacutedou alelovej diskriminaacutecie a analyacutezou krivky topenia (HRM)

Určenie genotypu metoacutedou alelovej diskriminaacutecie (obr 20) sa uskutočňuje použitiacutem hydrolyzujuacutecich proacuteb (sond) je veľmi ryacutechla a senzitiacutevna (presnaacute) metoacuteda frekventovane využiacutevanaacute v laboratoacuteriaacutech Dva variantyalely suacute vyšetreneacute suacutečasne v jednej vzorke a v jednej reakčnej

21

skuacutemavke V reakcii suacute použiteacute dve proacuteby označeneacute rozdielnymi fluorescenčnyacutemi farbičkami emitujuacutecimi svetlo o rocircznej vlnovej dĺžke (najčastejšie jedna označenaacute FAM farbičkou a druhaacute proacuteba označenaacute VIC farbičkou) Počas amplifikaacutecie amplikoacutenu dochaacutedza k odstraacuteneniu zhaacutešača z bliacutezkosti farbičky ktoraacute potom emituje svetlo priacuteslušnej vlnovej dĺžky Vzorky so signaacutelom len jednej fluorescenčnej farbičky (FAM) a bez signaacutelu druhej farbičky (VIC) suacute homozygoti pre alelu 1 vzorky so signaacutelom len druhej farbičky (VIC) a bez signaacutelu prvej (FAM) suacute homozygoti pre alelu 2 v priacutepade ak vyšetrovanaacute vzorka bdquosvietildquo obidvoma farbami jednaacute sa o heterozygota

Obr 20 Určenie genotypu metoacutedou alelovej diskriminaacutecie ndash amplifikačnaacute krivka vzoriek DNA majuacutecich tri rocirczne genotypy A ndash jednotliveacute vzorky (plnaacute čiara predstavuje štandardnuacute alelu guličkovanaacute mutovanuacute alelu) B ndash 72 vzoriek C ndash scatter plot 72 vzoriek

Určenie genotypu analyacutezou krivky topenia tzv high resolution melt (HRM) (obr 21) umožňuje detekciu takmer všetkyacutech genetickyacutech variaacuteciiacute (SNP mutaacuteciiacute) Keďže taacuteto metoacuteda okrem štandardnyacutech podmienok reakcie vyžaduje len primery a farbičku (nie proacuteby) je veľmi jednoduchaacute a lacnejšia Po amplifikaacuteciiacute treba amplikoacuten pomaly zohrievať až kyacutem nedocircjde k denaturaacuteciiacute Teplota topenia amplikoacutenu vo vzorke zaacutevisiacute od DNA sekvencie čo umožňuje detegovať priacutetomnosť mutaacutecie resp SNP Tvar vyacuteslednyacutech kriviek topenia určuje teda genotyp

22

Obr 21 Určenie genotypu analyacutezou krivky topenia tzv metoacutedou high resolution melting (HRM) A ndash krivka topenia vzoriek DNA majuacutecich tri rocirczne genotypy B ndash graf rozdielnosti krivky topenia vzoriek DNA majuacutecich tri rocirczne genotypy

23

4 Elektroforetickaacute separaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten

Separaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten predstavuje rozdelenie molekuacutel DNA alebo RNA na zaacuteklade veľkosti zloženia a poradia baacutez Podobnyacutemi metoacutedami je možneacute separovať aj proteiacuteny

Elektroforeacuteza (ELFO) je technika použiacutevanaacute na separaacuteciu niekedy aj purifikaacuteciu makromolekuacutel ako suacute nukleoveacute kyseliny a proteiacuteny na zaacuteklade ich rozdielnej veľkosti naacuteboja alebo konformaacutecie Je to metoacuteda veľmi často využiacutevanaacute nielen v molekulovej genetike ale aj biocheacutemii Elektroforeacuteza využiacuteva schopnosť nabityacutech molekuacutel migrovať v jednosmernom elektrickom poli k opačneacutemu poacutelu Nukleoveacute kyseliny majuacute vďaka svojej fosfaacutetovej zložke negatiacutevny naacuteboj preto v jednosmernom elektrickom poli migrujuacute ku kladneacutemu poacutelu čiže k anoacutede Elektroforeacuteza prebieha v elektroforetickej aparatuacutere v geacuteloch (v nosiči) so sieťovitou štruktuacuterou ktoraacute umožňuje separaacuteciu molekuacutel Vzorka nukleovej kyseliny zmiešanaacute s tzv nanaacutešaciacutem tlmivyacutem roztokom s farbičkou sa nanesie do jamky v geacuteli ktoryacute je umiestnenyacute v elektroforetickej aparatuacutere v priacutetomnosti elektroforetickeacuteho pufra (TAE alebo TBE) (obr 22) Nanaacutešaciacute tlmivyacute roztoknanaacutešacia farbička umožňuje na zaacuteklade migraacutecie farbičky vidieť migraacuteciu vzorky v geacuteli a suacutečasne zvyacutešeniacutem hustoty vo vzorke umožniacute klesnuacuteť vzorke do jamky a tak zabraacuteniť jej vyplaveniu z geacutelu Draacuteha je časť geacutelu ktoryacutem putuje jedna vzorka od katoacutedy k anoacutede V draacutehe sa nachaacutedzajuacute oddeleneacute jednotliveacute fragmenty nukleovyacutech kyseliacuten určityacutech veľkostiacute viditeľneacute vo forme pruacutežkov (angl bands) Intenzita pruacutežku zaacutevisiacute od množstva molekuacutel danej veľkosti je ekvivalentnaacute hmotnosti Na určenie veľkosti fragmentov NK sa do jednej jamky nanesie štandard molekulovyacutech hmotnostiacute (angl ladder) ktoryacute maacute presne definovaneacute veľkosti fragmentov čo umožňuje odhadnuacuteť veľkosť aj hmotnosť neznaacutemych separovanyacutech fragmentov

Obr 22 Elektroforetickaacute separaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten v agaroacutezovom geacuteli (A) a vizualizaacutecia UV svetlom a GelRedtrade (B C)

24

Nukleoveacute kyseliny je možneacute elektroforeticky separovať 1) v geacuteloch agaroacutezovom (horizontaacutelna elektroforeacuteza) (obr 22) a polyakrylamidovom (vertikaacutelna elektroforeacuteza) 2) v špeciaacutelnych lineaacuternych polymeacuteroch kapilaacuternou elektroforeacutezou použitiacutem genetickeacuteho analyzaacutetora (obr 23)

Agaroacuteza je polysacharid ziacuteskanyacute z morskej riasy použiacuteva sa najčastejšie v koncentraacuteciiacute 05-2 čiacutem vyššia koncentraacutecia tyacutem je geacutel pevnejšiacute a schopnejšiacute rozliacutešiť menšie fragmenty NK Priacuteprava je jednoduchaacute odvaacuteži sa potrebneacute množstvo agaroacutezy ktoraacute sa zmieša s tlmivyacutem roztokom (pufrom) rozvariacute sa v mikrovlnnej ruacutere a naleje sa do špeciaacutelnej naacutedoby na vytvaacuteranie geacutelov kyacutem je geacutel tekutyacute vložiacute sa do neho tzv hrebeň na vytvorenie jamiek Agaroacuteza je netoxickaacute V bežnom agaroacutezovom geacuteli v zaacutevislosti od jeho koncentraacutecie je možneacute separovať DNA fragmenty dĺžky 200-50 000 bp Dnes suacute dostupneacute aj špeciaacutelne agaroacutezy napr MetaPhorreg Agarose schopneacute oddeliť fragment DNA dĺžky 20-800bp Separaacutecia v agaroacutezovom geacuteli prebieha v horizontaacutelnej aparatuacutere preto sa nazyacuteva aj horizontaacutelna elektroforeacuteza

Polyakrylamidovyacute geacutel (PAGE) vznikaacute polymerizaacuteciou akrylamidu v priacutetomnosti špeciaacutelnych chemickyacutech laacutetok (peroxodisiacuteran amoacutenny TEMED bisakrylamid) Jeho priacuteprava je preto odlišnaacute a aj naacuteročnejšia Polyakrylamidoveacute geacutely majuacute vysokuacute rozlišovaciu schopnosť (1bp) preto suacute PAGE geacutely vhodneacute aj na sekvenovanie DNA klasickyacutemi metoacutedami PAGE geacutel nie je vhodnyacute na separaacuteciu fragmentov dlhšiacutech ako 2kb Použiacuteva sa v koncentraacutecii 35 -20 s rozliacutešeniacutem fragmentov od 10bp-2000bp Akrylamid je neurotoxiacuten musiacute sa s niacutem pracovať veľmi opatrne PAGE elektroforeacuteza bežiacute vo vertikaacutelnej aparatuacutere preto sa volaacute aj vertikaacutelna elektroforeacuteza použiacuteva sa často aj na separaacuteciu proteiacutenov

Ryacutechlosť pohybu nukleovyacutech kyseliacuten (mobilita) určuje viacero faktorov 1) veľkosť NK ndash počet baacutezovyacutech paacuterov resp baacutez pričom menšie molekuly prechaacutedzajuacute geacutelom ryacutechlejšie pretože sa ľahšie pohybujuacute v geacuteli 2) konformaacutecia nukleovej kyseliny napr u rovnako veľkyacutech plazmidov kondenzovaneacute superšpiralizovaneacute plazmidy migrujuacute najryacutechlejšie rovnako veľkeacute lineaacuterne molekuly (toho isteacuteho plazmidu) bežia pomalšie a najpomalšie putujuacute relaxovaneacute kruhoveacute molekuly plazmidu 3) koncentraacutecia geacutelu určuje jeho rozlišovaciu schopnosť koncentrovanejšiacute geacutel je schopnyacute separovať kratšie fragmenty NK redšie geacutely suacute vhodneacute pre rozliacutešenie vaumlčšiacutech fragmentov 4) zloženie geacutelu je docircležiteacute pri analyacuteze sekundaacuternych štruktuacuter NK a proteiacutenov v nedenaturovanom stave sekundaacuterna štruktuacutera spomaľuje migraacuteciu NK a proteiacutenov Tento fakt využiacutevajuacute niektoreacute diagnostickeacute techniky (napr SSCP - Single Strand Conformation Polymorphism - polymorfismus konformaacutecie jednovlaacuteknovej DNA) umožňujuacutece detekciu zaacutemeny jedinej baacutezy ktoraacute spocircsobiacute odlišneacute vnuacutetromolekuloveacute paacuterovanie a vyacuteslednuacute konformaacuteciu molekuly Geacutely mocircžu teda byť denaturačneacute a nedenaturačneacute (natiacutevne) 5) napaumltie zdroja - čiacutem vyššie je napaumltie ktoreacute vytvaacutera elektrickeacute pole v elektroforetickej aparatuacutere tyacutem ryacutechlejšie fragmenty NK migrujuacute 6) zloženie roztokov a teploty

Elektroforetickyacute tlmivyacute roztok (pufor - elektrolyt) zabezpečuje stabilneacute elektroforetickeacute podmienky počas separaacutecie geacutel je v ňom ponorenyacute Obsahuje ioacuteny čo umožňuje vedenie elektrickeacuteho pruacutedu

Štandard molekulovyacutech hmotnostiacute (v laboratoacuteriaacutech nazyacutevanyacute ladder alebo marker) je zmes fragmentov DNA alebo RNA s presne definovanou veľkosťou ktoryacute sluacuteži na odhad veľkosti vyšetrovanyacutech fragmentov NK (obr 22) Pomocou špeciaacutelnych štandardov molekulovyacutech hmotnostiacute ktoryacutech fragmenty NK majuacute definovanuacute aj hmotnosť je možneacute odhadnuacuteť množstvo (hmotnosť - koncentraacuteciu) neznaacutemeho fragmentu

B C

25

41 Vizualizaacutecia DNA

Samotnaacute nukleovaacute kyselina je počas elektroforetickej separaacutecie neviditeľnaacute Vizualizaacuteciu NK umožňujuacute interkalačneacute činidlaacute ktoreacute suacute schopneacute naviazať sa na molekuly NK tyacutem že sa včlenia medzi susediace baacutezy Po ožiareniacute UV svetlom interkalačneacute činidlaacute naviazaneacute na NK fluoreskujuacute tak sa vizualizuje NK čiacutem intenziacutevnejšie fluoreskuje tyacutem viac NK je v geacutelipruacutežku priacutetomneacute Interkalačneacute činidlo sa buď primieša do geacutelu pri jeho priacuteprave čo umožniacute sledovať migraacuteciu fragmentov NK počas elektroforeacutezy a to po vybratiacute z ELFO aparatuacutery a po ožiareniacute UV svetlom alebo sa geacutel farbiacute po elektroforetickej separaacutecii V minulosti bol na zviditeľnenie NK najčastejšie použiacutevanyacute etidiumbromid kvocircli jeho mutageacutennym vlastnostiam sa v suacutečasnosti nahraacutedza menej mutageacutennymi a netoxickyacutemi činidlami ako suacute napr komerčne dostupneacute SYBRregSafe GelRedtrade GelGreentrade

Kapilaacuterna elektroforeacuteza NK prebieha v špeciaacutelnom priacutestroji genetickom analyzaacutetore (obr 23) ktoryacute musiacute mať zaacutekladneacute komponenty ako suacute elektroacutedy kapilaacutera zdroj vysokeacuteho napaumltia detektor prepojenie s počiacutetačom a softveacuteroveacute vybavenie priestor na vloženie vzoriek atď Genetickyacute analyzaacutetor predstavuje automatizovanyacute systeacutem umožňujuacuteci sekvenovanie určovanie dĺžky DNA fragmentov ndash fragmentačnuacute analyacutezu a kvantifikaacuteciu nukleovyacutech kyseliacuten V novšiacutech typoch genetickeacuteho analyzaacutetora je proces analyacutezy od vloženia vzoriek do stojana automatizovanyacute

Vzorka určenaacute na analyacutezu je elektrokineticky injektovanaacute do tenkej kapilaacutery naplnenej lineaacuternym polymeacuterom Vplyvom vysokeacuteho napaumltia sa negatiacutevne nabiteacute fragmenty DNA pohybujuacute v polymeacuteri k pozitiacutevne nabitej elektroacutede Kapilaacuterna elektroforeacuteza je tak citlivaacute že je schopnaacute detegovať jednobaacutezovyacute rozdiel DNA fragmentov DNA fragmenty musia byť pred kapilaacuternou elektroforeacutezou fluorescenčne označeneacute v kapilaacutere suacute separovaneacute na zaacuteklade veľkosti Kraacutetko pred dosiahnutiacutem kladne nabitej elektroacutedy docircjde po excitaacutecii laserovyacutem žiareniacutem k emisii žiarenia fluoroformi (farbičkami) tak že optickyacute detekčnyacute systeacutem zaznamenaacute fluorescenciu ktoraacute je naacutesledne softveacuterovo spracovanaacute a vyhodnotenaacute

Obr 23 Genetickyacute analyzaacutetor

42 RFLP

Metoacuteda polymorfizmu dĺžky restrik čnyacutech fragmentov (angl Restriction Fragment Length Polymorfism) bola prvou metoacutedou využiacutevanou na detekciu DNA variaacuteciiacute rocircznych biologickyacutech vzoriek Princiacutep metoacutedy spočiacuteva v priacutetomnosti polymorfizmov v DNA sekvencii rocircznych ľudiacute ktoreacute zapriacutečinia rozdielny profil (obrazec) DNA fragmentov po štiepeniacute jednou alebo viaceryacutemi restrikčnyacutemi endonukleaacutezami Restrikčneacute endonukleaacutezy (RE) suacute enzyacutemy ktoreacute štiepia DNA molekulu v oblasti špecifickej nukleotidovej sekvencie nazyacutevanej restrik čneacute miesto RE najčastejšie rozpoznaacutevajuacute a štiepia miesto veľkeacute 4-6 baacutez RE suacute priacutetomneacute u prokaryotov (bakteacuterie a archebakteacuterie) kde suacute suacutečasťou restrik čno-modifikačneacuteho systeacutemu akoby prokaryotickeacutej vrodenej imunity sluacutežia

26

na ochranu pred cudzou DNA (napr viacuterusovou) ktoruacute po rozpoznaniacute špecifickej sekvencie štiepia

Restrikčno-modifikačnyacute systeacutem maacute dve zložky 1) modifikačneacute enzyacutemy - metylaacutezy ktoreacute procesom metylaacutecie modifikujuacute určiteacute baacutezy svojej DNA čiacutem ich označia za vlastnuacute DNA takže takaacuteto DNA je potom rezistentnaacute voči štiepeniu restrikčnyacutemi endonukleaacutezami Najčastejšiacutem spocircsobom metylaacutecie u bakteacuteriiacute je metylaacutecia adeniacutenu na N6 pričom vznikne metyladeniacuten alebo cytoziacutenu na C5 metylcytoziacuten 2) restrikčneacute endonukleaacutezy štiepia špecifickeacute miesto dvojvlaacuteknovej DNA ktoreacute je tvoreneacute symetrickou sekvenciou zrkadlovo sa opakujuacutecich nukleotidov ndash tzv palindroacutem Restrikčneacute enzyacutemy sa použiacutevajuacute na štiepenie DNA sekvencie na mieste špecifickom pre tuacute ktoruacute restrikčnuacute endonukleaacutezu napr pri analyacuteze polymorfizmov dĺžky restrikčnyacutech fragmentov (RFLP) analyacuteze jednonukleotidovyacutech polymorfizmov (SNP) mutaacuteciiacute ako aj pri klonovaniacute DNA do vhodnyacutech vektorovyacutech DNA molekuacutel

Po štiepeniacute dvojvlaacuteknovej DNA restrikčnou endonukleaacutezou mocircžu vzniknuacuteť tri typy koncov - 5´-prečnievajuacutece konce (lepiveacute) 3´-prečnievajuacutece konce (lepiveacute) a tupeacute konce (obr 24)

Obr 24 Restrikčneacute štiepenie zanechaacutevajuacutece rocirczne konce tupeacute a lepiveacute

Restrikčneacute štiepenie je často použiacutevanou metoacutedou geacutenovyacutech manipulaacuteciiacute na konštrukciu

hybridnyacutech molekuacutel DNA s naacuteslednyacutem klonovaniacutem Priebeh RFLP analyacutezy je nasledovnyacute restrikčnaacute endonukleaacuteza sa pridaacute k DNA a zmes sa vo

vhodnyacutech reakčnyacutech podmienkach (pufor teplota) inkubuje niekoľko hodiacuten Počas inkubaacutecie docircjde k štiepeniu DNA na špecifickyacutech miestach DNA je potom elektroforeticky separovanaacute v geacuteli a naacutesledne vizualizovanaacute V minulosti po geacutelovej elektroforeacuteze nasledoval Southern blot (čiže prenos separovanyacutech fragmentov DNA z geacutelu na špeciaacutelnu membraacutenu) (obr 35) po ktorom nastala vizualizaacutecia raacutedioaktiacutevne značenou proacutebou V suacutečasnosti sa kvocircli praacutecnosti a zdravotnyacutem rizikaacutem od Southern blotu upuacutešťa a prechaacutedza sa na ryacutechlejšie menej praacutecne a zdravotne šetrnejšie metoacutedy priateľskejšie aj k životneacutemu prostrediu

RFLP bola prvou metoacutedou použiacutevanou na zistenie DNA profilu (DNA fingerprinting) mapovanie geacutenov zapriacutečiňujuacutece genetickeacute ochorenia a testovanie otcovstva Vaumlčšina RFLP markerov je vysoko lokusovo špecifickyacutech a kodominantnyacutech (obidve alely suacute detekovaneacute u heterozygota)

PCR-RFLP je laboratoacuterne priacutestupnejšia metoacuteda molekulaacuterno-genetickej diagnostiky keďže PCR umožňuje amplifikaacuteciu veľmi malyacutech množstiev DNA Alternatiacutevny naacutezov použiacutevanyacute v literatuacutere je CAPS z angl Cleaved Amplified Polymorphic Sequence assay Použitiacutem špecifickyacutech primerov docircjde PCR metoacutedou k amplifikaacutecii požadovaneacuteho uacuteseku DNA ten sa potom štiepi restrikčnou endonukleaacutezou vo vhodnyacutech podmienkach naacutesledne sa štiepne produkty elektroforeticky separujuacute a vizualizujuacute použitiacutem interkalačnyacutech farbiacutev a UV svetla (obr 25)

27

Obr 25 Princiacutep metoacutedy PCR-RFLP

43 VNTR a STR V geacutenome suacute priacutetomneacute dva typy tandemovyacutech (za sebou nasledujuacutecich) opakovaniacute

1) minisatelity ndash nazyacutevaneacute variabilnyacute počet tandemovyacutech opakovaniacute VNTR (variable number of tandem repeats) 2) mikrosatelity tiež kraacutetke tandemoveacute repetiacutecie STR (short tandem repeats)

Obidva tieto typy satelitnej DNA suacute rozmiestneneacute po celom genoacuteme suacute využiacutevaneacute hlavne vo forenznej genetike na identifikaacuteciu osocircb a určenie otcovstva popriacutepade materstva ale aj v mediciacutene na detekciu chromozoacutemovyacutech aneuploidiiacute Štruktuacutera obidvoch je podobnaacute Rozdiel medzi jednotlivyacutemi alelami je spocircsobenyacute rozdielnym počtom opakovaniacute opakujuacutecej sa sekvencie (motiacutevu) čo spocircsobiacute rocircznu dĺžku alel s rocircznym počtom tandemovyacutech opakovaniacute nazyacutevanuacute polymorfizmus dĺžky fragmentov

VNTR ndash variabilnyacute počet tandemovyacutech opakovaniacute pričom opakujuacuteca sa sekvencia maacute dĺžku od 6 do 100 baacutez pričom sa mocircže opakovať aj tisiacutece kraacutet alely tak mocircžu mať od 500do 30 000 baacutez VNTR boli v kombinaacutecii s RFLP (DNA fingerprinting ) prvyacutem polymorfizmom použiacutevanyacutem na zistenie DNA profilov a identifikaacuteciu osocircb v kriminalistickej praxi V suacutečasnosti jeho využitie v kriminalistike je kvocircli potrebe relatiacutevne veľkeacuteho množstva DNA nahradeneacute využitiacutem STR

STR - kraacutetke tandemoveacute repetiacutecie suacute v kriminalistike najčastejšie použiacutevanyacutem polymorfizmom STR lokusy suacute rozmiestneneacute po celom genoacuteme repetiacutecia obsahuje jednu až šesť baacutez pričom jej opakovaniacutem vznikne STR v rozsahu od 50 do 300bp V našom genoacuteme suacute tisiacutece STR ktoreacute mocircžu byť použiteacute pre forenznuacute analyacutezu V kriminalistike sa v suacutečasnosti na identifikaacuteciu osocircb použiacuteva 13 STR locusov ktoreacute patria k medzinaacuterodne uznaacutevanyacutem štandardom Z iniciatiacutevy FBI bola vytvorenaacute databaacuteza CODIS (Combined DNA Index System) každaacute krajina maacute svoju databaacutezu CODIS kde je možneacute vložiť a archivovať DNA profily jednotlivcov ako aj profily DNA ziacuteskanyacutech z miest kriminaacutelneho činu v databaacuteze je ich možneacute navzaacutejom porovnať a tak zistiť pocircvodcu trestneacuteho činu Medzinaacuterodnaacute jednotnosť v použiacutevaniacute CODIS STR lokusov umožňuje v priacutepade potreby vzaacutejomneacute porovnanie DNA profilov zistenyacutech na uacutezemiacute rocircznych štaacutetov CODIS STR lokusov je 13 a suacute to CSF1PO FGA TH01 TPOX VWA D3S1358 D5S818 D7S820 D8S1179 D13S317 D16S539 D18S51 a D21S11 Zistenie DNA profilu sa uskutočniacute multiplexnou PCR reakciou s fluorescenčne značenyacutemi primermi špecifickyacutemi pre konkreacutetny STR Naacutesledne suacute PCR produkty analyzovaneacute kapilaacuternou elektroforeacutezou genetickyacutem analyzaacutetorom ktoryacute rozliacuteši amplifikovaneacute fragmenty na zaacuteklade fluorescencie a dĺžky (fragmentačnaacute analyacuteza) (obr 26 Tab 3) DNA profil každeacuteho človeka je jedinečnyacute rovnakyacute profil mocircžu mať len jednovaječneacute dvojčataacute

28

Obr 26 Ukaacutežka DNA profilu človeka 15 STR lokusov s určeniacutem pohlavia pomocou lokusu pre amelogeniacuten (ženskeacute pohlavie - XX) maleacute oranžoveacute piacuteky predstavujuacute fragmenty veľkostneacuteho štandardu Tabuľka č 3 Zaacutepis DNA profilu človeka z obraacutezka č 26 15 STR lokusov s určeniacutem pohlavia pomocou lokusu pre amelogeniacuten System Alela 1 Alela 2

D3S1358 16 17

TH01 9 93 D21S11 28 28

D18S51 15 18

Penta E 7 14 D5S818 9 12

D13S317 8 11

D7S820 8 11 D16S539 11 12

CSF1PO 10 11

Penta D 11 12 vWA 15 18

D8S1179 13 16

TPOX 8 9 FGA 20 21

amel X X

29

5 MLPA

Multiplexnaacute amplifikaacutecia proacuteb zaacutevislaacute od ligaacutecie (z angl multiplex ligation-dependent probe amplification) je metoacuteda schopnaacute v jednej reakcii (v jednej skuacutemavke a vzorke) detegovať zmeny v počte až 50 nukleotidovyacutech sekvenciiacute Metoacutedou MLPA je možneacute ryacutechlo identifikovať amplifikaacutecie (duplikaacutecie) a deleacutecie veľkeacuteho počtu geacutenov či už použitiacutem DNA alebo mRNA krvnyacutech vzoriek alebo vzoriek z naacutedorov

Princiacutep MLPA spočiacuteva v multiplexnej amplifikaacutecii 50 špecifickyacutech nukleotidovyacutech sekvenciiacute použitiacutem jedneacuteho paacuteru primerov pričom jeden primer je fluorescenčne označenyacute Vyacutesledneacute PCR produkty suacute analyzovaneacute kapilaacuternou elektroforeacutezou (fragmentačnaacute analyacuteza) Dĺžka každeacuteho namnoženeacuteho produktu je jedinečnaacute narastaacute postupne o 6 alebo 9 nukleotidov pričom produkty PCR suacute 120 ndash 500 nukleotidov dlheacute Tento veľkostnyacute rozsah PCR fragmentov (dĺžka 120-500 nukleotidov s naacuterastom postupne o 6 alebo 9 nukleotidov) je optimaacutelny pre kapilaacuternu elektroforeacutezu MLPA multiplexnaacute PCR prebieha za použitia iba jedineacuteho paacuteru primerov ktoreacute amplifikujuacute špecifickeacute sekvencie Trik spočiacuteva v tom že nedochaacutedza k amplifikaacutecii DNA sekvencie ale MLPA proacuteb ktoreacute suacute pridaneacute k vzorkaacutem Každaacute MLPA proacuteba pozostaacuteva z dvoch oligonukleotidov (dve hemiproacuteby) pričom každyacute oligonukleotid obsahuje jednu zo sekvencie rozpoznaacutevanuacute PCR primermi Proacuteba vznikne jedine za predpokladu hybridizaacutecie dvoch oligonukleotidov (hemiproacuteb) k cieľovej sekvencii (geacutenu) a po ligaacutecii enzyacutemom ligaacutezou Iba ligovaneacute proacuteby suacute exponenciaacutelne amplifikovaneacute pomocou jedneacuteho paacuteru primerov Množstvo zligovanyacutech proacuteb teda zaacutevisiacute od množstva cieľovyacutech sekvenciiacute (geacutenov) vo vzorke

Postup MLPA analyacutezy je nasledovnyacute (obr27) K vzorke nukleovej kyseliny (DNA resp mRNA) sa pridaacute zmes 50 jedinečnyacutech proacuteb každaacute

proacuteba je komplementaacuterna k určitej cieľovej sekvencii NK vzorky Každaacute proacuteba však pozostaacuteva z dvoch oligonukleotidov hybridizujuacutecich vedľa seba zaacuteroveň každyacute oligonukleotid (hemiproacuteba) obsahuje pridanuacute sekvenciu rozpoznaacutevanuacute paacuterom PCR primerov Po hybridizaacuteciiacute oligonukleotidov (hemiproacuteb) dochaacutedza k ich ligaacutecii ligaacutezou Ligačnaacute reakcia je tak špecifickaacute že je schopnaacute rozliacutešiť sekvenciu liacutešiacu sa v jednom nukleotide Vyacuteslednyacute ligačnyacute produkt (proacuteba) obsahuje obidve sekvencie pre PCR primery na jednom fragmente čiže mocircže docircjsť k namnoženiu takeacutehoto fragmentu PCR reakciou V priacutepade ak nedocircjde k ligaacutecii priacuteslušnyacutech hemiproacuteb pretože hemiproacuteby nenaacutejdu cieľovuacute sekvenciu na DNA každaacute takaacuteto nezligovanaacute hemiproacuteba maacute len jednu sekvenciu rozpoznaacutevanuacute len jednyacutem PCR primerom v docircsledku čoho nemocircže prebehnuacuteť jej PCR amplifikaacutecia a počas fragmentačnej analyacutezy nie je detegovanaacute pretože negeneruje fluorescenčnyacute signaacutel

Pri MLPA analyacuteze je docircležiteacute okrem MLPA amplifikaacutecie vzorky urobiť aj MLPA amplifikaacuteciu referenčnej vzorky ku ktorej sa bude porovnaacutevať počet geacutenov (cieľovyacutech sekvenciiacute) Po kapilaacuternej elektroforeacuteze MLPA referenčnej a skuacutemanej vzorky porovnaniacutem obsahu nameranyacutech hodnocirct tzv piacutekov priacuteslušnyacutech proacuteb sa určiacute relatiacutevny počet koacutepiiacute v skuacutemanej vzorke

MLPA

1 DNA denaturaacutecia a hybridizaacutecia s MLPA proacutebami (hemiproacuteby)

2 Ligaacutecia (vytvorenie kompletnyacutech proacuteb)

3 PCR amplifikaacutecia proacuteb paacuterom primerov

4 Kapilaacuterna elektroforetickaacute separaacutecia PCR produktov

5 Analyacuteza daacutet

30

Obr 27 Princiacutep MLPA

Firma MRC-Holland v suacutečasnosti ponuacuteka stovky MLPA setov proacuteb ktoreacute suacute vhodneacute na 1) diagnostiku kongenitaacutelnych a dedičnyacutech ochoreniacute 2) zisťovanie profilu naacutedorov 3) zisťovanie metylačneacuteho profilu

MLPA je metoacuteda vhodnaacute na detekciu malyacutech prestavieb (BRCA1 BRCA2 MSH2 atď)

veľkyacutech chromozoacutemovyacutech prestavieb (Williamsov syndroacutem Prader-WilliAngelman syndroacutem atzď)

31

detekciu zmien v počte koacutepii geacutenov (obr 28 29) ako aj zistenie počtu kompletnyacutech chromozoacutemov (chromozoacutem 13 18 21 XY tiež aj z amniovej tekutiny) diagnostiku naacutedorov (zmeny počtu pri ALL CLL atď) kvantifikaacuteciu metylaacutecie (Prader-WilliAngelmanov syndroacutem Fragilnyacute X inaktivaacutecia naacutedorovyacutech supresorovyacutech geacutenov atď) mRNA analyacutezu geacutenov zuacutečastňujuacutecich sa apoptoacutezy alebo zaacutepalov

MS-MLPA (Methylation-Specific MLPA) je varianta MLPA určenaacute špeciaacutelne na analyacutezu aberantnyacutech metylaacutecii imprintovanyacutech oblastiacute ako aj detekciu metylačnyacutech zmien CpG ostrovčekov lokalizovanyacutech bliacutezko promoacutetora Rozdiel oproti štandardnej MLPA spočiacuteva v použitiacute metylačne senzitiacutevneho restrikčneacuteho enzyacutemu HhaI ktoryacute štiepi MS-MLPA proacuteby hybridizovaneacute k nemetylovanej sekvencii Každaacute DNA vzorka určenaacute pre MS-MLPA analyacutezu prejde dvoma reakciami v jednej mikroskuacutemavke štandardnou MLPA analyacutezou (bez štiepenia metylačne senzitiacutevnym enzyacutemom) a v druhej mikroskuacutemavke docircjde okrem ligaacutecie proacuteb aj k metylačne senzitiacutevnemu štiepeniu hybridizovanyacutech proacuteb s nemetylovanou DNA Amplifikujuacute sa len ligovaneacute proacuteby po PCR amplifikaacutecii sa fragmentačnou analyacutezou porovnaniacutem oboch reakciiacute zistia rozdiely v metylačnom profile vzorky k referenčnej vzorke

RT-MLPA (Reverse Transkriptase MLPA) je variaacutecia MLPA určenaacute pre zistenie mRNA profilu vzorky je alternatiacutevou k real-time PCR a mikročipom RT-MLPA nedeteguje mRNA množstvo priamo pretože použiacutevanaacute ligaacuteza nie je schopnaacute ligovať DNA oligonukleotidy keď suacute hybridizovaneacute s RNA Preto RT-MLPA začiacutena reverznou transkripciou so špeciaacutelne navrhnutyacutemi RT primermi tak aby vytvorili kraacutetke oligonukleotidy (cDNA) Potom reakcia pokračuje ako štandardnaacute MLPA

Obr 28 MLPA analyacuteza geacutenu DMD (koacutedujuacuteceho dystrofiacuten) mutaacutecie ktoreacuteho spocircsobujuacute Duchennovu svalovuacute dystrofiu u pacienta je priacutetomnaacute deleacutecia exoacutenu 45 v porovnaniacute s referenčnou vzorkou ndash kontrolou

32

Obr 29 MLPA analyacuteza geacutenu DMD (koacutedujuacuteceho dystrofiacuten) mutaacutecie ktoreacuteho spocircsobujuacute Duchennovu svalovuacute dystrofiu u pacienta suacute priacutetomneacute duplikaacutecie exoacutenov 41 42 43 44 45 (piacuteky vo vzorke pacienta sa porovnajuacute s piacutekmi v kontrole ndash referenčnej vzorke)

33

6 Sekvenovanie

Sekvenovaniacutem rozumieme určenie primaacuternej štruktuacutery DNA teda určenie poradia nukleotidov v reťazci DNA Začiatky moderneacuteho sekvenovania siahajuacute do roku 1977 kedy boli objaveneacute dve metoacutedy sekvenovania 1) chemickaacute metoacuteda Maxama a Gilberta 2) enzymatickaacute metoacuteda Sangera Nicklena a Coulsona

Princiacutep obidvoch metoacuted sekvenovania spočiacuteva v tom že sa vytvoriacute suacutebor DNA molekuacutel s rocircznou veľkosťou ktoreacute suacute zakončeneacute konkreacutetnym nukleotidom tieto DNA molekuly sa elektroforeticky separujuacute v geacuteloch s rozlišovacou schopnosťou 1 nukleotid 61 Chemickaacute metoacuteda

DNA molekuly sa na 5-konci raacutedioaktiacutevne označia raacutedioaktiacutevnym fosforom a naacutesledne sa chemicky modifikujuacute špecificky pre každuacute baacutezu DNA sa potom v modifikovanyacutech miestach štiepi čiacutem vzniknuacute rocirczne dlheacute fragmenty pričom podmienky suacute nastaveneacute tak aby sa DNA na každom mieste štiepila len raz Modifikaacutecia DNA a štiepenie prebehne v štyroch separaacutetnych reakciaacutech (skuacutemavkaacutech) takže po elektroforetickej separaacuteciiacute takto opracovanej DNA v štyroch draacutehach polyakrylamidoveacuteho geacutelu a naacuteslednej autoraacutediografii (podobne ako pri Southernovej hybridizaacutecii) je možneacute odčiacutetať nukleotidovuacute sekvenciu približne 100 nukleotidov od raacutedioaktiacutevneho označenia (v čase objavu Maxama a Gilberta) 62 Sangerova metoacuteda

Zaacuteklady metoacutedy boli popiacutesaneacute už v roku 1975 (metoacuteda plus a miacutenus) ale až vylepšenie použitiacutem dideoxynukleotidov (ddNTP) v roku 1977 došlo k zjednodušeniu sekvenovania Princiacutepom enzyacutemoveacuteho sekvenovania je terminaacutecia (zastavenie) polymerizaacutecie inkorporaacuteciou 2´ 3 -dideoxynukleotidov do novosyntetizujuacuteceho sa vlaacutekna DNA Keďže ddNTP neobsahujuacute hydroxylovuacute skupinu na 3 uhliacuteku riboacutezy nemocircžu sa zuacutečastniť na tvorbe fosfodiesterovej vaumlzby nemocircže sa pripojiť k nim ďalšiacute nukleotid čiže musiacute docircjsť k terminaacuteciiacute polymeraacutecie Reakcia prebieha v štyroch skuacutemavkaacutech s raacutedioaktiacutevne značenyacutem primerom V každej skuacutemavke suacute priacutetomneacute všetky štyri deoxynukleotidtrifosfaacutety (dNTP) ale pre každuacute skuacutemavku je špecifickyacute priacutedavok maleacuteho množstva jedneacuteho z dideoxynukleotidtrifosfaacutetov (v prvej skuacutemavke je ddATP v druhej ddCTP v tretej ddTTP a vo štvrtej ddGTP) Maleacute množstvo ddNTP spocircsobiacute že pri polymerizaacutecii dochaacutedza k prednostneacutemu zaradeniu štandardnyacutech dNTP do narastajuacuteceho reťazca a len občas sa inkorporuje ddNTP čiacutem sa zastaviacute synteacuteza reťazca V každej skuacutemavke tak vznikne suacutebor DNA fragmentov rocircznych veľkostiacute zakončenyacutech priacuteslušnyacutem ddNTP (v prvej skuacutemavke ddATP v druhej ddCTP v tretej ddTTP a vo štvrtej ddGTP) Po elektroforetickej separaacutecii v 4 draacutehach polyakrylamidoveacuteho geacutelu a autoraacutediografii sa z autoraacutediogramu odčiacuteta sekvencia

V suacutečasnosti je sekvenovanie do značnej miery automatizovaneacute pričom využiacuteva princiacutep Sangerovej enzyacutemovej metoacutedy s určityacutemi obmenami Uacutesek DNA ktoryacute treba sekvenovať sa prostredniacutectvom termostabilnyacutech DNA polymeraacutez namnožiacute PCR metoacutedou po ktorej nasleduje sekvenačnaacute reakcia (asymetrickaacute PCR) s fluorescenčne značenyacutemi ddNTP (každyacute druh označenyacute inyacutem fluorescenčnyacutem farbivom) Sekvenačnaacute reakcia prebieha v jednej skuacutemavke s jednyacutem primerom vznikne tak suacutebor jednovlaacuteknovyacutech DNA rocircznej dĺžky ktoreacute suacute na 3konci označeneacute ddNTP so špecifickyacutem fluorescenčnyacutem farbivom Taacuteto metoacuteda sekvenovania sa tiež nazyacuteva rdquodye-terminator cycle sequencingrdquo(obr 30) Po kapilaacuternej elektroforeacuteze vzorky v genetickom analyzaacutetore zaznamenaacutevaniacute fluorescencie jednotlivyacutech fragmentov CCD kamerou a softveacuterovom spracovaniacute sa ziacuteska sekvencia DNA (obr 31)

34

Obr 30 Princiacutep sekvenovania Sangerova dideoxy metoacuteda alebo tzv chain termination method (reťazec zastavujuacuteca metoacuteda) Obr 31 Určenie genotypu plodu a rodičov sekvenčnou analyacutezou DNA ziacuteskanej z plodovej vody (prenataacutelna diagnostika) a perifeacuternej krvi sekvenčnaacute analyacuteza geacutenu ASPA vyacutesledok u plodu priacutetomnaacute mutaacutecia c 914CgtA v homozygotnom stave (AA) rodičia heterozygoti (AC) Uvedenaacute mutaacutecia je v homozygotnom stave kauzaacutelnou priacutečinou Canavanovej choroby

Automatizovaneacute sekvenovanie prinaacuteša viacereacute vyacutehody oproti klasickej Sangerovej metoacutede vyššiu presnosť a ryacutechlosť v jednej sekvenačnej reakcii možnosť osekvenovať až 1200 nukleotidovyacute fragment maleacute množstvo templaacutetu potrebneacute na analyacutezu

35

63 Next Generation Sequencing (NGS)

NGS (sekvenovanie novej generaacutecie) maacute obrovskyacute potenciaacutel v analyacuteze genoacutemov pričom toto označenie zahŕňa viacereacute technologickeacute metoacutedy reprezentovaneacute niekoľkyacutemi firmami Princiacutepom je masiacutevne paralelneacute sekvenovanie čiacutem sa ziacuteskajuacute raacutedovo tisiacutece až milioacuteny sekvenciiacute naraz 631 Sekvenovanie druhej generaacutecie

Na začiatku sa analyzovanaacute DNA vo vaumlčšine priacutepadov fragmentuje (vznikne tak DNA

knižnica) na fragmenty sa pripoja kraacutetke sekvencie ndash adapteacutery naacutesledne sa tieto fragmenty rocircznymi priacutestupmi amplifikujuacute a určiacute sa ich sekvencia Vďaka čiastočnyacutem prekryvom je zo ziacuteskanyacutech sekvencii možneacute poskladať plynuluacute sekvenciu zodpovedajuacutecu pocircvodnej nefragmentovanej DNA

Pyrosekvenovanie je podobne ako Sangerova metoacuteda založenaacute na princiacutepe synteacutezy komplementaacuterneho vlaacutekna DNA avšak rozdiel je v tom že sa na detekciu inkorporaacutecie nukleotidu využiacuteva inyacute systeacutem tvorby luminiscenčneacuteho signaacutelu v priebehu reakcie Pyrosekvenovanie je umožneneacute vďaka aktivite 4 enzyacutemov - DNA polymeraacutezy ATP sulfurylaacutezy luciferaacutezy a apyraacutezy Reakčnaacute zmes obsahuje aj ďalšie komponenty - enzymatickeacute substraacutety adenoziacutenfosfosulfaacutet (APS) d-luciferiacuten sekvenovanyacute templaacutet a cyklicky postupne po jednom type pridaacutevaneacute nukleotidtrifosfaacutety Po zabudovaniacute nukleotidu do novovznikajuacuteceho reťazca docircjde k uvoľneniu pyrofosfaacutetu naacutesledne je využityacute ATP sulfurylaacutezou na synteacutezu ATP z APS počas ďalšej reakcie docircjde k využitiu ATP luciferaacutezou na premenu luciferiacutenu na oxyluciferiacuten čo spocircsobiacute svetelnyacute signaacutel a ten zaznamenaacute detekčnyacute systeacutem Poslednou enzymatickou reakciou je reakcia apyraacutezy ktoraacute odstraacuteni nezainkorporovaneacute nukleotidy a nevyužiteacute ATP aby sa celyacute proces mohol zopakovať s reakčnou zmesou obsahujuacutecou ďalšiacute nukleotidtrifosfaacutet (inyacute ako v predchaacutedzajuacutecej reakcii) Po každej reakcii detektor zaznamenaacuteva emisiu svetla na zaacuteklade intenzity svetla je možneacute určiť či bol vradenyacute priacuteslušnyacute nukleotidtrifosfaacutet či bol inkorporovanyacute jeden priacutepadne viac rovnakyacutech nukleotidtrifosfaacutetov

Zvyacutešenie vyacutekonu pyrosekvenovania umožnila tzv emulznaacute PCR v mikročasticiach a použitie platničky PicoTiterPlatereg toto sekvenovanie zaviedla firma Roche pod pojmom 454 pyrosekvenovanie v roku 2005 Na začiatku sa DNA fragmentuje na uacuteseky dlheacute 400-600 baacutez dvojvlaacuteknovaacute fragmentovanaacute DNA sa liguje s adapteacutermi prostredniacutectvom nich sa naviaže na mikročastice dvojvlaacuteknoveacute fragmenty sa oddelia mikročastice s naviazanyacutemi jednovlaacuteknovyacutemi fragmentami sa premiešajuacute so zmesou oleja a roztoku ktoryacute obsahuje všetky komponenty na uacutespešnuacute PCR Tyacutemto spocircsobom sa okolo každej mikročastice vytvoriacute vlastnyacute mikroreaktor v ktorom prebehne amplifikaacutecia fragmentu Po PCR reakcii sa mikročastice prenesuacute do platničky PicoTiterPlate v ktorej sa do jamky zmestiacute akuraacutet jedna mikročastica a reakčneacute komponenty pyrosekvenačnej reakcie PicoTiterPlatereg maacute 1 600 000 jamiek každaacute jamka maacute maximaacutelny objem 75 picolitra Platnička s mikročasticami sa vložiacute do sekvenačneacuteho systeacutemu ndash priacutestroja v ktorom sa celeacute pyrosekvenovanie uskutočniacute Chemiluminiscenčneacute signaacutely ktoryacutech počas sekvenovania vznikajuacute milioacuteny v priebehu hodiny suacute zachyteneacute CCD kamerou a analyzovaneacute softveacuterom

Firma Illumina predstavila inuacute technoloacutegiu PCR amplifikaacutecia a sekvenovanie sa uskutočňuje na skliacutečku (flow cell) Fragmentaacutecia DNA a pripojenie adapteacuterov prebieha za uacutečasti transpozoacutemov v procese nazvanom tagmentaacutecia Po hybridizaacutecii fragmentov DNA na skliacutečko prebehne v klastroch PCR amplifikaacutecia (tzv mostiacutekovaacute amplifikaacutecia) sekvenaacutecia prebieha za uacutečasti rozdielne fluorescenčne značenyacutech a chemicky modifikovanyacutech nukleotidov pričom každyacute nukleotid emituje fluorescenciu s inou vlnovou dĺžkou Na skliacutečku prebieha paralelne až 6 miliaacuterd sekvenaacutecii (obr 32)

Ďalšiacutemi možnosťami sekvenovania druhej generaacutecie je systeacutem SOLid (vyvinutyacute firmou Applied Biosystem dnes pod Thermo Fisher Scientific) a Ion Semiconductor Sequencing ndash polovodičoveacute ioacutenoveacute sekvenovanie (od firmy Ion Semiconductor Sequencing v suacutečasnosti Thermo Fisher Scientific)

36

Obr 32 Princiacutep sekvenovania novej generaacutecie od firmy Illumina PCR amplifikaacutecia a sekvenovanie sa uskutočňuje na skliacutečku (flow cell) paralelne prebieha až 6 miliaacuterd sekvenaacutecii

632 Sekvenovanie tretej generaacutecie

Pred sekvenovaniacutem netreba amplifikovať DNA PCR metoacutedou ale sekvencia sa ziacuteskava zachyteniacutem signaacutelu v reaacutelnom čase Medzi sekvenovanie tretej generaacutecie patriacute SMRT (Single Molecule Real-Time Sequencing) a Nanopore Sequencing

37

7 Fragmentačnaacute analyacuteza DNA

Je metoacuteda použiacutevanaacute na určenie veľkosti fragmentov DNA ziacuteskanyacutech PCR reakciou Dĺžka amplifikovanyacutech DNA fragmentov sa zistiacute ich porovnaniacutem s veľkostnyacutem štandardom (obr 33) ktoryacute je tvorenyacute DNA fragmentami znaacutemej dĺžky Veľkostnyacute štandard je pred kapilaacuternou elektroforeacutezou zmiešanyacute so vzorkou DNA fragmenty veľkostneacuteho štandardu suacute fluorescenčne označeneacute pričom použiteacute fluorescenčneacute farbivo je ineacute ako fluorescenčneacute farbivo použiteacute na označenie DNA fragmentov vo vyšetrovanej vzorke

Obr 33 Elektroforetogram veľkostneacuteho štandardu použiacutevaneacuteho na určenie veľkostiacute fragmentov analyzovanyacutech kapilaacuternou elektroforeacutezou v genetickom analyzaacutetore (GeneScantrade 500 LIZtrade dye Size Standard) dĺžka fragmentov v nukleotidoch (napr 50 nukleotidov)

Fragmentačnaacute analyacuteza pozostaacuteva z viaceryacutech krokov Prvyacutem je izolaacutecia DNA nasleduje PCR amplifikaacutecia počas ktorej sa novosyntetizovaneacute DNA fragmenty označia fluorescenčnyacutemi farbivami Vzorka s PCR produktom sa pripraviacute na kapilaacuternu elektroforeacutezu tak že sa zmieša s veľkostnyacutem štandardom (sluacuteži na určenie veľkosti fragmentov) a denaturačnou laacutetkou (formamid) nasleduje denaturaacutecia Pripraveneacute vzorky suacute injektovaneacute do priacutestroja (genetickyacute analyzaacutetor) kde v kapilaacutere naplnenej polymeacuterom v elektrickom poli migrujuacute fluorescenčne značeneacute fragmenty DNA na zaacuteklade veľkosti (kapilaacuterna elektroforeacuteza) Počas elektroforeacutezy genetickyacute analyzaacutetor zaznamenaacuteva fluorescenciu fragmentov Analyacutezou daacutet prostredniacutectvom špeciaacutelnych softveacuterov sa ziacuteskajuacute elektroforetogramy z ktoryacutech je možneacute zistiť veľkosť fragmentov ako aj typ fluorescencie (docircležiteacute ak suacute genetickeacute varianty rozliacutešiteľneacute rocircznou fluorescenciou napr SNaPshot) Fragmentačnaacute analyacuteza je suacutečasťou množstva molekulaacuterno-genetickyacutech metoacuted (pozri obr 12 26 28 29 34) ako suacute napr STR analyacuteza (Short Tandem Repeat) AFLP analyacuteza (Amplified Fragment Lenght Polymorfism) RFLPT-RFLP analyacuteza (Restriction Fragment Lenght PolymorfismTerminal Restricted Fragment Lenght Polymorfism) SSCP (Single Strand Conformation Polymorfism) VNTR (Variable Number of Tandem Repeat) analyacuteza straty heterozygotnosti (LOH loss of heterozygozity) MLPA (Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification) MSMSA (Methylation-Sensitive Mobility Shift Assay) SNP genotypovanie (SNaPshotreg) HiCEP (High-Coverage Expression Profiling)

38

Obr 34 Kvantitatiacutevna fragmentačnaacute PCR analyacuteza (QF-PCR) DNA izolovanej z plodovej vody vyacutesledok prenataacutelnej analyacutezy = priacutetomnosť troch piacutekov pre chromozoacutem 18 (u všetkyacutech fragmentov detegujuacutecich chromozoacutem 18 je pomer vyšetrovanyacutech markerov aberantnyacute 21 resp 111) čo znamenaacute trizoacutemiu chromozoacutemu 18 Edwardsov syndroacutem

39

8 Metoacutedy založeneacute na princiacutepe hybridizaacutecie

Nukleoveacute kyseliny majuacute schopnosť vytvaacuterať dvojvlaacuteknoveacute reťazce z jednovlaacuteknovyacutech molekuacutel na zaacuteklade komplementarity baacutez Komplementarita baacutez umožňuje replikaacuteciu DNA transkripciu RNA komplementarita baacutez zabezpečuje teda reprodukovateľnosť živej hmoty

Hybridizaacutecia je proces v ktorom na zaacuteklade komplementarity baacutez dochaacutedza k vytvoreniu dvojvlaacuteknovej nukleovej kyseliny z dvoch jednovlaacuteknovyacutech molekuacutel DNA alebo RNA alebo ich kombinaacuteciou DNA RNA pričom kratšia jednovlaacuteknovaacute nukleovaacute kyselina vystupuje ako sonda (proacuteba) Hybridizaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten je jeden z najpoužiacutevanejšiacutech naacutestrojov v molekulaacuternej bioloacutegii a genetike (hybridizaacutecia primerov alebo proacuteb sa využiacuteva v takmer každej metoacutede - v PCR RT-PCR qPCR RT-qPCR MLPA sekvenovaniacute fragmentačnej analyacuteze FISH DNA mikročipoch atď)

Denaturaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten je proces pri ktorom dochaacutedza k porušeniu vodiacutekovyacutech vaumlzieb medzi vlaacuteknami nukleovyacutech kyseliacuten (strata sekundaacuternej a terciaacutelnej štruktuacutery) tak že docircjde k ich uacuteplneacutemu oddeleniu vzniknuacute jednovlaacuteknoveacute reťazce Denaturaacutecia NK mocircže byť spocircsobenaacute vplyvom vysokyacutech teplocirct pH alebo chemickyacutech laacutetok (denaturačneacute činidlaacute) Renaturaacutecia je opačnyacute proces v ktorom na zaacuteklade komplementarity dochaacutedza k tvorbe dvojvlaacuteknovyacutech NK

Hybridiza čnaacute sonda (proacuteba) je jednovlaacuteknovaacute nukleovaacute kyselina určitej znaacutemej dĺžky a sekvencie (najčastejšie DNA pretože je stabilnejšia ako RNA) ktoraacute je značenaacute a sluacuteži na detekciu komplementaacuternych molekuacutel DNA alebo RNA v procese hybridizaacutecie V zaacutevislosti od podmienok hybridizaacutecie (stringencia) mocircže byť detegovanaacute sekvencia uacuteplne komplementaacuterna alebo v menej priacutesnych podmienkach mocircže mať sekvenčneacute odchyacutelky Proacuteba sluacuteži na vyhľadanie a zviditeľnenie cieľovyacutech NK Zviditeľnenie sa deje prostredniacutectvom označenia proacuteby ešte pred hybridizaacuteciou Značenie proacuteby mocircže byť raacutedioaktiacutevne a neraacutedioaktiacutevne (najčastejšie fluorescenčneacute)

Raacutedioaktiacutevne značeneacute proacuteby pomocou izotopov (32P) sa využiacutevali viac v minulosti v suacutečasnosti suacute kvocircli zdravotnyacutem rizikaacutem ohľaduplnosti k životneacutemu prostrediu ako aj kvocircli jednoduchšej manipulaacutecii použiacutevaneacute fluorescenčne značeneacute proacuteby Raacutedioaktiacutevne značeneacute sondy boli použiacutevaneacute hlavne metoacutedou Southernovej hybridizaacutecie (Southern blotting Southern blot) Citlivosť raacutedioaktiacutevne značenyacutech proacuteb je vyššia dosahuje schopnosť zachytiť 10 fg (femtogram 10-15) cieľovej DNA sekvencie 81 Southern blot

Metoacutedu objavil v roku 1975 britskyacute bioloacuteg Edwin Southern (preto Southern) Pri Southernovej hybridizaacutecii sa restrikčne štiepeneacute fragmenty DNA elektroforeticky separujuacute v geacuteli potom sa metoacutedou blottingu prenesuacute na nylonovuacute alebo nitroceluloacutezovuacute membraacutenu kde suacute naacutesledne hybridizovaneacute v roztoku obsahujuacutecom raacutedioaktiacutevne značenuacute sondu Priloženiacutem fotografickeacuteho filmu k membraacutene a vyvolaniacutem filmu autoraacutediografiou docircjde k zviditeľneniu lokaliacutet kde došlo k hybridizaacuteciiacute raacutedioaktiacutevne značenej sondy s fragmentom DNA (autoraacutediogram) Southern blot bol kľuacutečovou a prvou metoacutedou na identifikaacuteciu osocircb (DNA fingerprinting DNA pofiling) (obr 35)

Okrem Southern blotu existuje Northern blot na analyacutezu RNA (geacutenovej expresie) a Western blot na analyacutezu proteiacutenov postup je obdobnyacute ako pri Southern blote s obmenami špecifickyacutemi pre konkreacutetny blot Pri Northern blote sa použiacutevajuacute hybridizačneacute proacuteby ale pre vizualizaacuteciu proteiacutenov western blotom je potrebneacute použiť protilaacutetky s naacuteslednou vizualizaacuteciou Pomenovanie techniacutek je hra so sloviacutečkami (keďže paacuten Northern ani Western neobjavili takto nazvaneacute techniky)

Neraacutedioaktiacutevne značenie proacuteb použiacutevanyacutech v molekulaacuternej genetike mocircže byť nepriame (použitie haptenu) alebo priame Konečnaacute vizualizaacutecia je najčastejšie zabezpečenaacute fluoreskujuacutecimi farebnyacutemi značkami farbivami fluorochroacutemami (fluorofoacuterami) Pri priamom značeniacute je farbička kovalentne naviazanaacute na nukleotid a na zachytenie fluorescencie suacute potrebneacute špeciaacutelne priacutestroje umožňujuacutece excitaacuteciu farbičky ktoraacute potom emituje žiarenie určitej vlnovej dĺžky (emisneacute žiarenie) a to zachytiacute detekčnyacute systeacutem priacutestroja Využitie fluorochroacutemov v molekulaacuternej genetike je masiacutevne napr na vizualizaacuteciu NK elektroforeticky separovanyacutech v geacuteli kvantifikaacuteciu produktov PCR reakcie v priacutestroji real-time PCR cykleacuter sekvenovaniacute fragmentačnej analyacuteze FISH DNA mikročipoch atď

40

Obr 35 Princiacutep Southern blotu

82 FISH (fluorescenčnaacute in situ hybridizaacutecia)

FISH (fluorescent in situ hybridization fluorescenčnaacute in situ hybridizaacutecia) metoacuteda patriacute medzi molekulovo-cytogenetickeacute techniky Princiacutep FISH metoacutedy je založenyacute na hybridizaacuteciiacute fluorescenčne značenyacutech proacuteb ku komplementaacuternym uacutesekom vyšetrovanej DNA na podložnom skle (priamo na mieste - in situ) K denaturaacutecii dsDNA dochaacutedza buď vplyvom denaturačnyacutech činidiel alebo zvyacutešenou teplotou a naacuteslednou renaturaacuteciou dochaacutedza k naviazaniu sondy na komplementaacuterny uacutesek DNA Vyacutesledok hybridizaacutecie sa vizualizuje fluorescenčnyacutem mikroskopom vybavenyacutem vhodnyacutemi fluorescenčnyacutemi filtrami a vizuaacutelne zhodnotiacute skuacutesenyacutem odborniacutekom Fluorescencia sa v niektoryacutech priacutepadoch mocircže zaznamenať a hodnotiť aj pomocou softveacuteru (obr 36)

Pomocou FISH detegujeme numerickeacute aberaacutecie - zmeny v počte chromozoacutemov (napr trizoacutemia monozoacutemia chromozoacutemov) alebo štruktuacuterne aberaacutecie a prestavby (napr translokaacutecie inverzie deleacutecie duplikaacutecie amplifikaacutecie) FISH metoacuteda umožňuje identifikaacuteciu a detekciu každeacuteho ľudskeacuteho chromozoacutemu jeho zaradenie do karyotypu odhalenie malyacutech submikroskopickyacutech chromozoacutemovyacutech zmien a tiež mapovať poziacutecie jednotlivyacutech geacutenov na chromozoacuteme

41

Obr 36 Princiacutep štandardnej FISH a FISH maľovania celeacuteho chromozoacutemu

Veľkou vyacutehodou FISH metoacutedy je možnosť analyacutezy buniek v metafaacuteze aj v interfaacuteze kedy nie je nutnaacute kultivaacutecia buniek a tiež ryacutechle analyzovanie veľkeacuteho počtu buniek (stovky až tisiacutece) K ďalšiacutem vyacutehodaacutem patriacute bezpečnosť vysokaacute citlivosť dostatočnaacute stabilita relatiacutevne kraacutetky čas hybridizaacutecie a možnosť ryacutechleho vyhodnotenia Hybridizaacutecia pri vaumlčšine suacutečasne dodaacutevanyacutech sond trvaacute 10-12 hodin (na trhu suacute už dostupneacute aj sondy so skraacutetenyacutem časom hybridizaacutecie na 2-3 hodiny) Po hybridizaacuteciiacute nasleduje odmyacutevanie kedy pri priacuteslušnej teplote dochaacutedza k odmytiu nenaviazanyacutech a nespraacutevne hybridizovanyacutech sond Preparaacutet sa naacutesledne podfarbiacute a vyacutesledok sa zhodnotiacute vo fluorescenčnom mikroskope Na podfarbenie chromozoacutemov alebo jadier sa použiacuteva modreacute kontrastneacute farbivo DAPI (46-diamidino-2-fenylindol) ktoreacute maacute silneacute fluorescenčneacute vlastnosti dokaacuteže prechaacutedzať jadrovou membraacutenou a viazať sa na DNA Vyacutesledkom je modreacute zafarbenie ktoreacute vyacuteborne kontrastuje so signaacutelmi jednotlivyacutech sond

Limitujuacutecim faktorom FISH je možnosť identifikaacutecie len tyacutech uacutesekov DNA ku ktoryacutem suacute použiteacute sondy V jednej analyacuteze je možneacute použiť najviac 3 odlišne značeneacute sondy a tak zistiť priacutepadneacute abnormality len na 1 alebo na paacuter lokusoch Na relevantnuacute detekciu je potrebneacute mať vo vzorke 1-5 aberantnyacutech interfaacutezovyacutech jadier

FISH je možneacute uskutočniť na širokej škaacutele biologickeacuteho materiaacutelu na vzorkaacutech perifeacuternej krvi kostnej drene naacuteteroch choriovyacutech klkoch plodovej vode rocircznych druhov tkaniacutev natiacutevnych alebo zaliatych v parafiacutene na 1 bunke (predimplantačnaacute genetickaacute diagnostika PGD) (obr 37)

Využiacuteva sa na detekciu aberaacuteciiacute pri mnohyacutech onkologickyacutech ochoreniach (napr pri diagnoacuteze mnohopočetnyacute myeloacutem sa v suacutečasnosti po separaacutecii CD138+ buniek robiacute FISH s 5 sondami pre geacuteny IGH TP53 RB1 oblasť 1p321q21 a stanovuje sa hyperploidia chromozoacutemov 5 9 a 15) a tiež k spresneniu doplneniu a k overeniu bežneacuteho cytogenetickeacuteho vyšetrenia

Podľa miesta na chromozoacuteme na ktorom dochaacutedza k hybridizaacutecii sondy rozlišujeme 4 typy

DNA sond bull centromeacuteroveacute sondy ndash sa viažu na strednuacute časť chromozoacutemu ndash centromeacuteru sluacutežia k diagnostike zmien v počte chromozoacutemov k detekcii chromozoacutemov neznaacutemeho pocircvodu umožňujuacute interfaacuteznu FISH na nedeliacich sa bunkaacutech (obr 38-41)

42

Obr 37 Interfaacutezna FISH preimplantačnyacute genetickyacute skriacutening aneuploidiiacute ndash blastomeacutera 3-denneacuteho ľudskeacuteho embrya s normaacutelnym počtom chromozoacutemov 13 18 21 pohlavie XY použityacutech 5 sond pre chromozoacutemy 13 ndash orange 18 ndash aqua 21 ndash green X ndash blue a Y ndash yellow (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

Obr 38 Interfaacutezne jadro po hybridizaacutecii s centromeacuterovou sondou pre chromozoacutem 8 (Vysis Abbott) V pravom jadre je priacutetomnaacute trizoacutemia chromozoacutemu 8 (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex) Obr 39 Metafaacutezna (A) a interfaacutezna FISH (B) použitaacute centromeacuterovaacute sonda CEPX spectrum orangeCEPY spectrum green (Vysis Abbott) Sonda hybridizuje k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (červenyacute signaacutel) a Y (zelenyacute signaacutel) (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

43

Obr 40 Interfaacutezna FISH vyšetrenie spermiiacute použiteacute sondy CEPX greenCEPY orange (Aneuscore Metasystems) Sondy hybridizujuacute k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (zelenyacute signaacutel) Y (červenyacute signaacutel) vľavo ndash dve haploidneacute spermie (majuacutece jedna spermia X druhaacute Y chromozoacutem) vpravo ndash dve patologickeacute spermie obsahujuacutece gonozoacutemovyacute komplement XY (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

Obr 41 Interfaacutezna FISH vyšetrenie spermiiacute použiteacute sondy CEPX greenCEPY orange a CEP18 aqua (Aneuscore Metasystems) Sondy hybridizujuacute k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (zelenyacute signaacutel) Y (červenyacute signaacutel) a 18 (modryacute signaacutel) vľavo ndash normaacutelne haploidneacute ľudskeacute spermie - 1x chromozoacutem X alebo Y a jedenkraacutet chromozoacutem 18 v strede ndash patologickaacute spermia obsahujuacuteca gonozoacutemovyacute komplement XY a jeden chromozoacutem 18 vpravo ndash patologickaacute diploidnaacute spermia s chromozoacutemami X Y a dvoma chromozoacutemami 18 (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

bull lokusovo špecifickeacute sondy ndash hybridizaacutecia prebehne na konkreacutetnom mieste geacutenu (lokuse) (obr 42-44) použiacutevajuacute sa k vyšetreniu mikrodeleacuteciiacute (straty malyacutech častiacute chromozoacutemu pri mikrodelečnyacutech syndroacutemoch) k zisteniu amplifikaacutecie onkogeacutenov a niektoryacutech špecifickyacutech translokaacuteciiacute prestavby geacutenov umožňujuacute interfaacuteznu FISH na nedeliacich sa bunkaacutech bull subtelomeroveacute ndash vaumlzba na koncoveacute časti chromozoacutemu ndash telomeacutery bull celochromozoacutemoveacute alebo celomaľovacie sondy ndash sondy hybridizujuacute s mnohopočetnyacutemi chromozoacutemovyacutemi sekvenciami pričom sa fluorescenčne tak bdquovymaľujeldquo celyacute chromozoacutem (Obr 45) Použiacutevajuacute sa na vyšetrenie chromozoacutemovyacutech prestavieb k analyacuteze translokaacuteciiacute a k detekcii pocircvodu tzv marker chromozoacutemov (malyacutech nadpočetnyacutech chromozoacutemov neznaacutemeho pocircvodu) K použitiu sondy suacute potrebneacute metafaacutezne chromozoacutemy nepoužiacutevaju sa pre interfaacuteznu FISH

Pri konvenčnej chromozoacutemovej FISH suacute homogeacutenne DNA proacuteby hybridizovaneacute s fixovanyacutem metafaacuteznym alebo prometafaacuteznym chromozoacutemomchromozoacutemami na skliacutečku (Obr 36a) Maximaacutelna rozlišovacia schopnosť metafaacuteznej FISH je niekoľko megabaacutez (Obr 39a 45) využitiacutem viac

44

natiahnutyacutech prometafaacuteznych chromozoacutemov sa dosiahne 1 Mb rozliacutešenie Prostredniacutectvom fiber FISH konkreacutetne artificiaacutelne deproteinizovanej natiahnutej DNA pripravenej in situ z celyacutech buniek na mikroskopickom skliacutečku je možneacute vizualizovať individuaacutelne geacuteny maleacute DNA elementy na chromozoacuteme s rozliacutešeniacutem okolo 1000 bp

Obr 42 Interfaacutezne jadro po hybridizaacutecii s lokusovo-špecifickou sondou LSI 5q31 Spectrum Orange5p12 Spectrum Green (Vysis Abbott) Na ľavom obraacutezku suacute priacutetomneacute dva červeneacute (5q31) a dva zeleneacute signaacutely (5p12) v pravom jadre je priacutetomnaacute deleacutecia 5q31 oblasti chyacuteba jeden červenyacute signal (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

Obr 43 Interfaacutezna FISH použitaacute lokusovo-špecifickaacute sonda ndash translokačnaacute - XL BCRABL1 plus (Metasystems) dvojfarebnaacute dvojfuacutezna kde červenaacute označuje lokus ABL1 na chromozoacuteme 9 a zelenaacute oblasť BCR na chromozoacuteme 22 Sonda deteguje fuacuteziu protoonkogeacutenu ABL1 (9q34) a geacutenu BCR (22q11) v priacutepade že červenyacute a zelenyacute signaacutel suacute pri sebe (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

45

Obr 44 Interfaacutezna FISH Použitaacute lokusovo-špecifickaacute sonda- typ break apart pre IGH geacuten V docircsledku translokaacutecie došlo k rozskočeniu geacutenu pričom translokačneacuteho partnera nepoznaacuteme vieme určiť len percento v koľkyacutech jadraacutech je geacuten prestavanyacute (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex) Obr 45 Použiteacute celochromozoacutemoveacute sondy WCP 15 (červenyacute chromozoacutem) a WCP 17 (zelenyacute chromozoacutem) Na metafaacuteze je potvrdenaacute reciprokaacute translokaacutecia t(1517)(q2221) (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

FISH vizualizaacutecia celeacuteho chromozoacutemu maľovanie chromozoacutemu anglicky chromosome

painting je špeciaacutelnou aplikaacuteciou chromozoacutemovej FISH proacuteba je koktail veľkeacuteho počtu rocircznych fluorescenčne značenyacutech DNA fragmentov hybridizujuacutecich pozdĺž celeacuteho konkreacutetneho chromozoacutemu (obr 36b 45) bdquoChromosomepaintingldquo analyzuje metafaacutezne chromozoacutemy V minulosti bola FISH vizualizaacutecia celyacutech chromozoacutemov limitovanaacute malyacutem množstvom rocirczne sfarbenyacutech fluorochroacutemov

V suacutečasnosti je možneacute detegovať množstvo cieľovyacutech sekvenciiacute naraz čo sa využiacuteva pri celogenoacutemovej chromozoacutemovej vizualizaacutecii (whole-chromosomepainting - WCP) metoacutedou multiplex FISH (M-FISH multicolor FISH o br 46) alebo spektraacutelnej karyotypizaacutecie (SKY) kedy možno rozliacutešiť všetky ľudskeacute chromozoacutemy ndash teda 24 rocircznych chromozoacutemov M-FISH a SKY patria medzi metafaacutezne formy FISH diagnostiky ktoreacute umožňujuacute simultaacutennu vizualizaacuteciu všetkyacutech ľudskyacutech chromozoacutemov v rocircznych farbaacutech čo predstavuje uľahčenie analyacutezy karyotypu hlavne pri komplexnyacutech zmenaacutech a markeroch neznaacutemeho pocircvodu Obe techniky vychaacutedzajuacute z použitia

46

celochromozoacutemovyacutech sond značenyacutech kombinaacuteciou viaceryacutech fluorochroacutemov Rozdiel medzi M-FISH a SKY spočiacuteva v technike ziacuteskania konečneacuteho obrazu

Obr 46 Multicolor FISH - každyacute chromozoacutemovyacute paacuter je zafarbenyacute inou farbou pričom na ich zafarbenie postačuje kombinaacutecia 5 fluorochroacutemov Na vyhodnocovanie je potrebnaacute špeciaacutelna sada fluorescenčnyacutech filtrov pre jednotliveacute fluorochroacutemy a špeciaacutelnyacute softweacuter Vľavo-štandardnyacute karyotyp vpravo karyotyp s mutaacuteciami (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

V molekulovej cytogenetike suacute komerčne dostupneacute sety M-FISH proacuteb umožňujuacutece

viacfarebneacute pruacutežkovanie chromozoacutemov (banding) s vysokyacutem rozliacutešeniacutem (multicolor-banding mBAND FISH MCB) čo umožňuje identifikaacuteciu intrachromozoacutemovyacutech prestavieb (Obr 47) Nevyhnutnosťou mBAND-u je mať chromozoacutemy v metafaacuteze Taacuteto metoacuteda bola prvyacutekraacutet uskutočnenaacute na chromozoacuteme 5 v roku 1999 mBAND FISH umožňuje rozliacutešiť špecifickeacute oblasti chromozoacutemov na uacuterovni pruacutežku - bandu a sub-bandu s detekciou 550 bandov haploidneacuteho karyotypu

Obr 47 A - mBAND chromozoacutemu 11 - inverzia duplikovanej oblasti 11q223-q25 B - mBAND chromozoacutemu 3 - na kruhovom chromozoacuteme deleacutecia oblasti 3p263 C - mBAND chromozoacutemu 2 - potvrdenie inverzie duplikovanej časti chromozoacutemu (poskytnuteacute RNDr Dagmar Landlovou Medirex)

FISH metoacuteda a jej varianty (M-FISH mBAND SKY) majuacute v suacutečasnosti širokeacute využitie v

klinickej genetike v onkologickej genetike na detekciu aberaacuteciiacute v čase diagnoacutezy počas liečby po

47

liečbe monitorovanie po transplantaacutecii kostnej drene v prenataacutelnej a postnataacutelnej diagnostike pri detekcii submikroskopickyacutech deleacuteciiacute (napr DiGeorge syndroacutem - 22q112 delečnyacute syndroacutem PraderndashWilli syndroacutem- chromozoacutem 15q11-13) prostredniacutectvom FISH je možnaacute detekcia numerickyacutech zmien chromozoacutemov (trizoacutemia chromozoacutemu 21 pri Downovom syndroacuteme trizoacutemia chromozoacutemu 15 pri Patauovom syndroacuteme trizoacutemia chromozoacutemu 18 pri Edwardsovom syndroacuteme) rocirczne zmeny v počte pohlavnyacutech chromozoacutemov (monozoacutemia X pri Turnerovom syndroacuteme Klinefelterov syndroacutem s X chromozoacutemom naviac - XXY) podobne v predimplantačnej diagnostike

83 DNA Microarray (DNA mikro čip biočip) DNA mikročipovanie je technika využiacutevajuacuteca hybridizaacuteciu skuacutemanej nukleovej kyseliny

(cieľovaacute vzorka) s veľkyacutem množstvom oligonukleotidovyacutech proacuteb (desať tisiacutec až milioacuten) ktoreacute suacute prichyteneacute na pevnyacute podklad najčastejšie sklenyacute silikoacutenovyacute alebo nylonovyacute (doštička čip) Skuacutemanaacute nukleovaacute kyselina je pred hybridizaacuteciou fragmentovanaacute označenaacute fluorofoacuterom a denaturovanaacute Po kontakte čipu s cieľovou vzorkou ktoraacute je vlastne zmes označenyacutech oligonukleotidov značeneacute oligonukleotidy hybridizujuacute s oligonukleotidovyacutemi sekvenciami prichytenyacutemi na čipe Potom suacute na zaacuteklade fluorescencie detekovaneacute miesta kde došlo k hybridizaacutecii čiže vzorka obsahovala takuacuteto nukleotidovuacute sekvenciu Z jedneacuteho mikročipu sa ziacuteska obrovskeacute množstvo daacutet ktoreacute je vždy nutneacute softveacuterovo spracovať V dnešnej dobe existuje niekoľko firiem poskytujuacutecich komerčne mikročipy na objednaacutevku alebo si ich laboratoacuteria produkujuacute sami

Mikročipovanie prebieha nasledovne

1) Vytvorenie DNA čipu ndash tisiacutece rocircznych jednovlaacuteknovyacutech DNA oligonukleotidov znaacutemych sekvencii sa kovalentne naviažu na povrch doštičky vždy v určitej lokalite je niekoľko rovnakyacutech oligonukleotidov veľkosť takejto lokality je ˂ 200 microm Proacutebami mocircže byť DNA cDNA alebo syntetizovaneacute oligonukleotidy Už hotoveacute mikročipy ponuacutekajuacute viacereacute firmy (Affymetrix Agilent Technologies Eppendorf Illumina) alebo si ich jednotliveacute laboratoacuteria vyraacutebajuacute sami pomocou robotickyacutech zariadeniacute DNA čip sa vytvaacutera buď nanaacutešaniacutem kvapiek oligonukleotidov na podklad alebo synteacutezou oligonukleotidov in situ na čipe 2) Priacuteprava vzorky ndash nukleovaacute kyselina (mRNA DNA) sa purifikuje určiacute sa jej kvantita a kvalita (spektrofotometericky) fragmentuje resp v priacutepade mRNA sa syntetizuje cDNA v priacutepade potreby sa mocircže DNA amplifikovať PCR reakciou štiepiť restrikčnyacutemi endonukleaacutezami 3) Fluorescenčneacute označenie (zriedkavejšie raacutedioaktiacutevne) fragmentov DNA prebieha počas reverznej transkripcie alebo PCR amplifikaacutecie za uacutečasti fluorescenčne značenyacutech nukleotidov Keď sa analyzujuacute dve rocirczne vzorky napr zdraveacute tkanivo a naacutedoroveacute tkanivo označenie nukleovyacutech kyseliacuten v tyacutechto tkanivaacutech byacuteva rozdielne a to použitiacutem dvoch rocircznych fluorescenčnyacutech farbiacutev (napr zeleneacute a červeneacute) Pred hybridizaacuteciou je potrebneacute vzorku denaturovať čiacutem sa vytvoriacute zmes jednovlaacuteknovyacutech DNA označenyacutech značkou 4) Hybridizaacutecia s mikročipom ndash v špeciaacutelnom hybridizačnom roztoku hybridizujuacute komplementaacuterne sekvencie zo vzorky s priacuteslušnyacutemi oligonukleotidovyacutemi sondami naviazanyacutemi na čipe Potom sa čip obmyje aby došlo k odstraacuteneniu čiastočne hybridizovanyacutech nukleovyacutech kyseliacuten 5) Skenovanie mikročipu ndash skenerom čipov docircjde k ožiareniu čipu laserom pričom v mieste hybridizaacutecie fluorescenčne značenyacutech DNA fragmentov s proacutebou docircjde k emisii svetla určitej vlnovej dĺžky ktoruacute skener zaznamenaacute 6) Analyacuteza daacutet prebieha metoacutedami bioinformatiky spracovaniacutem softveacutermi sa zistiacute ktoreacute lokality čipu navzaacutejom hybridizovali v priacutepade použitia dvoch vzoriek kontrolnej a skuacutemanej je možneacute analyzovať ich relatiacutevnu intenzitu hybridizaacutecie (expresie určiteacuteho geacutenu)

Existujuacute štyri typy mikročipov 1) Čipy ur čeneacute na analyacutezu expresie (obsahujuacute cDNA proacuteby) pre tzv dvojkanaacutelovyacute experiment kedy je vzorka určenaacute k hybridizaacutecii na čipe ziacuteskanaacute zmiešaniacutem DNA fragmentov kontrolnej a skuacutemanej vzorky pričom fragmenty suacute rozdielne fluorescenčne označeneacute (napr zelenyacute fluorofoacuter pre kontrolnuacute vzorku a červenyacute pre skuacutemanuacute) Na zaacuteklade intenzity a typu fluorescencie sa deteguje expresia geacutenov typickaacute pre kontrolnuacute vzorku (napr zelenaacute fluorescencia) pre skuacutemanuacute vzorku (napr

48

červenaacute fluorescencia) a expresia podobnaacute u oboch vzoriek (žltaacute fluorescencia) neexprimovaneacute geacuteny (čierna fluorescencia) rocirczne odtiene (v zaacutevislosti od prevažujuacutecej hybridizaacutecie) (obr 48) 2) Čipy ur čeneacute na analyacutezu mutaacutecii použije sa genoacutemovaacute DNA označenaacute jednou fluorescenčnou farbičkou na určenie jednonukleotidovej zmeny (SNP ndash Single Nukleotide Polymorphism) 3) Čipy na komparatiacutevnu genoacutemovuacute hybridizaacuteciu (aCGH array Comparative Genomic Hybridization) ndash použiacutevaneacute na zistenie zvyacutešenia alebo zniacuteženia množstva chromozoacutemovyacutech fragmentov obsahujuacutecich geacuteny zodpovedneacute za určiteacute ochorenie Na analyacutezu sa použije skuacutemanaacute gDNA a referenčnaacute (kontrolnaacute) DNA každaacute sa značiacute inou fluorescenčnou farbičkou (princiacutep ako pri analyacuteze expresie) (obr 49 50) 4) Čipy CGH - SNP kombinovaneacute čipy ur čeneacute na analyacutezu aj mutaacuteciiacute SNP aj na komparatiacutevnu genoacutemovuacute hybridizaacuteciu CGH

Mikročipy majuacute rozsiahle využitie napriacuteklad v identifikaacuteciiacute novyacutech geacutenov vo vyacuteskume ich funkciiacute expresie v rocircznych podmienkach pri diagnostike mnohyacutech ochoreniacute vo farmakogenomike vo vyacuteskume vplyvu toxiacutenov

Obr 48 Heatmapa geacutenovej expresie vybranyacutech geacutenov (mRNA) mikročip obsahuje 46000 cDNA proacuteb (poskytnuteacute Ing Helenou Gbelcovou PhD Uacutestav lekaacuterskej bioloacutegie genetiky a klinickej genetiky LF UK a UNB)

49

Obr 49 Princiacutep komparatiacutevnej genoacutemovej hybridizaacutecie (aCGH - array comparative genomic hybridization) Obr 50 A) Vyacutesledok komparatiacutevnej genoacutemovej hybridizaacutecie (aCGH - array comparative genomic hybridization) vzorky DNA izolovanej plodovej vody U plodu s abnormaacutelnym ultrasonografickyacutem vyšetreniacutem bola identifikovanaacute duplikaacutecia oblasti 3q261q29 (modryacute paacutes) a deleacutecia oblasti 5p1533p151 (červenyacute paacutes) Pre porovnanie chromozoacutem 1 bez aberaacutecie b) Ten istyacute pacient ale ineacute softveacuteroveacute spracovanie (poskytnuteacute RNDr Miroslavom Tomkom PhD Medirex)

50

Odporuacutečanaacute a použitaacute literatuacutera

Odborneacute knihy Klug W S Cummings M R Spencer Ch A Palladino M A Concepts of Genetics jedenaacuteste vydanie (2015) Carson S Molecular Biology Techniques tretie vydanie (2012) Strachan T Read A Human Molecular Genetics štvrteacute vydanie (2011) Sudbery P Sudbery I Human Molecular Genetics tretie vydanie (2009)

Internetoveacute straacutenky

wwwncbinlmnihgov wwwmlpacom wwwthermofishercom wwwilluminacom wwwpromegask wwwqiagencom wwwambioncom

Odborneacute člaacutenky Chacon-Cortes D Griffiths L R Methods for extracting genomic DNA from whole blood samples current perspectives Journal of Biorepository Science for Applied Medicine Volume 2 strany 1- 9 Viltrop T Krjutskov K Palta P Metspalu A Comparison of DNA extraction methods for multiplex polymerase chain reaction Anal Biochem 2010 Volume 398(2) strany 260-262 Ing Martin Čermaacutek Molekulaacuterna cytogenetika v problematike familiaacuternych maligniacutet Onkoloacutegia Volume 2 strany 77 - 83 Livak KJ Schmittgen TD Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method Methods 2001 Volume 25(4) strany 402 - 408 Bustin S A Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays J Mol Endocrinol 2000 Volume 25(2) strany169 - 193

MOLEKULAacuteRNE METOacuteDY AKTUAacuteLNE POUŽIacuteVANEacute V KLINICKEJ GENETIKE RNDr Andrea Pastoraacutekovaacute PhD RNDr Robert Petrovič PhD Vydala Univerzita Komenskeacuteho v Bratislave Lekaacuterska fakulta Rozsah 50 straacuten 246 AH prveacute vydanie ISBN 978-80-223-4231-5

14

Real-time PCR je venovanaacute špeciaacutelna časť v skriptaacutech Sluacuteži na kvantifikaacuteciu PCR produktu v reaacutelnom čase na zaacuteklade merania fluorescencie okrem kvantifikaacutecie je využiacutevanaacute aj na určenie genotypov

RT-PCR je variaacutecia PCR umožňujuacuteca amplifikaacuteciu DNA sekvencie z vyacutechodiskovej RNA

sekvencie Najskocircr musiacute prebehnuacuteť prepis RNA do jednovlaacuteknovej cDNA prostredniacutectvom reverznej transkriptaacutezy naacutesledne sa cDNA použije pre PCR Selektiacutevnym použitiacutem primerov pri reverznej transkripcii mocircžeme uacutečelovo prepiacutesať buď celkovuacute RNA (primery - random hexameacutery) alebo len mRNA (primery - oligoT)

Alelovo-špecifickaacute PCR (AS-PCR) (obr 9) sluacuteži na detekciu konkreacutetnych mutaacuteciiacute

a jednonukleotidovyacutech polymorfizmov (SNP) Použije sa sada 3 primerov v dvoch kombinaacuteciaacutech PCR reakciiacute dva primery majuacute odlišnuacute sekvenciu na 3acute-koncoch jeden na detekciu wt (wild type) a druhyacute primer na detekciu mutantnej alely reakcia neprebehne ak miesto na templaacutetovej DNA nie je komplementaacuterne k 3acute-koncu primeru pretože DNA polymeraacuteza vyžaduje uacuteplnuacute hybridizaacuteciu primera na 3acute-konci Takto je možneacute rozliacutešiť priacutetomnosť štandardnej (wildtype ndash wt) a mutantnej alely resp SNP (obr 9) AS-PCR je znaacutema aj pod ďalšiacutemi naacutezvami ASO-PCR (allele-specific oligonucleotide PCR) ARMS (amplification-refractory mutation system)

Obr 9 Alelovo-špecifickaacute PCR (AS-PCR)

Mutageneacuteza prostredniacutectvom PCR (site directed mutagenesis) sa použiacuteva keď je potrebneacute vytvoriť mutaacuteciu v špecifickom mieste geacutenu primerprimery majuacute modifikovanuacute sekvenciu tak že obsahujuacute mutaacuteciu v strednej časti čo neovplyvniacute hybridizaacuteciu primerov s templaacutetovou DNA pričom vyacutesledkom je PCR produkt s cielene mutovanou DNA sekvenciou

Asymetrickaacute PCR sa použiacuteva na synteacutezu koacutepiiacute jedneacuteho vlaacutekna z templaacutetovej DNA a to

použitiacutem veľmi niacutezkej koncentraacutecie jedneacuteho primeru Sekvenačnaacute PCR je PCR v ktorej je použityacute len jeden primer a v reakčnej zmesi suacute okrem

všetkyacutech dNTP priacutetomneacute dideoxynukleotidtrifosfaacutety (ddNTP) značeneacute raacutedioaktiacutevne dnes však prevažne fluorescenčne každyacute typ ddNTP inou fluorescenčnou farbičkou Zaradenie niektoreacuteho zo štyroch ddNTP spocircsobiacute terminaacuteciu (zastavenie) predlžovania DNA reťazca fluorescenčneacute označenie ddNTP umožniacute detekciu dĺžky fragmentu a určenie sekvencie posledneacuteho nukleotidu Vyacuteslednyacute produkt sekvenačnej PCR sluacuteži na sekvenovanie Sekvenovaniu sa venuje samostatnaacute časť

MLPA (multiplex ligation-dependent probe amplification) ndash multiplexnaacute amplifikaacutecia proacuteb zaacutevislaacute od ligaacutecie je variaacutecia multiplexnej PCR umožňujuacuteca namnoženie viaceryacutech uacutesekov DNA za použitia iba jedneacuteho paacuteru primerov avšak s podmienkou vytvorenia sekvenčne špecifickej proacuteby ligaacuteciou sekvenčne špecifickyacutech oligonukleotidov MLPA je metoacuteda umožňujuacuteca detekciu počtu koacutepiiacute

15

až 50 nukleotidovyacutech sekvenciiacute v jednej reakcii Pomocou MLPA je možneacute ryacutechlo identifikovať amplifikaacutecie a deleacutecie veľkeacuteho počtu geacutenov či už z DNA alebo mRNA okrem toho MLPA mocircže byť použitaacute na analyacutezu CpG-metylaacutecie (MS-MLPA) Viac informaacutecii v samostatnej časti

SNaPshotreg Multiplex nazyacutevaneacute aj minisekvenovanie je multiplexnaacute reakcia v ktorej je každyacute primer predĺženyacute iba o jeden nukleotid (obr 10) V reakčnej zmesi nie suacute priacutetomneacute deoxyribonukleotidtrifosfaacutety ale len dideoxyribonukleotidtrifosfaacutety (ddATP ddCTP ddGTP ddTTP) každyacute označenyacute inou fluorescenčnou farbičkou Po integraacutecii ddNTP do DNA vlaacutekna je polymerizaacutecia ukončenaacute Jednovlaacuteknoveacute fragmenty (primery) predĺženeacute presne o jeden ddNTP suacute separovaneacute kapilaacuternou elektroforeacutezou v genetickom analyzaacutetore pričom je detegovanaacute ich fluorescencia a dĺžka (obr 11) Z vyacutesledneacuteho elektroforetogramu (obr 12) je možneacute určiť v jednej reakcii sekvenciu vo viac ako v 10 lokalitaacutech určiteacuteho fragmentu DNA SNaPshot Multiplex sa v molekulaacuterno-genetickom laboratoacuteriu využiacuteva na ryacutechlu detekciu viaceryacutech najčastejšie sa vyskytujuacutecich mutaacuteciiSNP geacutenu

Obr 10 Priacuteklad využitia metoacutedy SnaPshot s použitiacutem sady 13 primerov ktoreacute sa predĺžia len o 1 značenyacute dideoxynukleotid SNaPshot najčastejšiacutech mutaacuteciiacute geacutenu pre 21-hydroxylaacutezu (CYP21A2) ktoreacute spocircsobujuacute kongenitaacutelnu adrenaacutelnu hyperplaacuteziu A T G a C predstavujuacute fluorescenčne značeneacute dideoxynukleotidy

Obr 11 Vyacutesledok analyacutezy DNA pacienta metoacutedou minisekvenovania SnaPshot konkreacutetne použitiacutem sady 13 primerov rozlišujuacutecich najčastejšie bodoveacute mutaacutecie geacutenu pre 21-hydroxylaacutezu (CYP21A2) analyacutezou sa zistila mutaacutecia V281L v heterozygotnom stave (dva fragmenty modryacute a červenyacute)

16

Obr 12 SNaPshot analyacuteza geacutenu CYP21A2 u DNA izolovanej z plodovej vody metoacuteda deteguje najčastejšie bodoveacute mutaacutecie geacutenu pre 21-hydroxylaacutezu vyacutesledok prenataacutelnej analyacutezy = priacutetomnosť mutaacutecie In2G v hemizygotnom stave (keďže qPCR metoacutedou bola u plodu zistenaacute priacutetomnosť len jednej koacutepie geacutenu CYP21A2)

33 Kvantitatiacutevna PCR (qPCR)

Polymeraacutezovou reťazovou reakciou (PCR) docielime namnoženie (amplifikaacuteciu) určiteacuteho DNA uacuteseku (templaacutetu) PCR je katalyzovanaacute DNA polymeraacutezou za priacutetomnosti primerov dNTPs dvojmocnyacutech katioacutenov (ako Mg+2) a pufrovacieho roztoku

Real-time PCR ktoraacute je nazyacutevanaacute aj kvantitatiacutevna PCR (qPCR) umožňuje vizualizaacuteciu a kvantifikaacuteciu amplifikaacutecie DNA v reaacutelnom čase to je tak ako to bežiacute počas PCR qPCR využiacuteva fluorescenčneacute chemikaacutelie (farbivaacute) ktoryacutech emitovanuacute fluorescenciu zaznamenaacuteva optickyacute systeacutem počas každeacuteho PCR cyklu zaznamenanaacute fluorescencia je naacutesledne softveacuterovo spracovanaacute a vyhodnotenaacute

V suacutečasnosti sa využiacutevajuacute dva typy qPCR cheacutemie a to farbivaacute viažuce sa na DNA a fluorescenčne značeneacute proacuteby (obr 13)

Farbivaacute viažuce sa na DNA emitujuacute fluorescenciu v priacutepade ak suacute naviazaneacute na dvojvlaacuteknovuacute DNA proacuteby fluoreskujuacute v priacutepade keď molekula zhaacutešača (angl quencher - Q) sa nenachaacutedza v bliacutezkosti molekuly reporteacutera (R) napr hydrolyzujuacutece proacuteby fluoreskujuacute keď je molekula reporteacutera (R) prostredniacutectvom 5acuteexonukleaacutezovej aktivity DNA polymeraacutezy odstraacutenenaacute z bliacutezkosti molekuly zhaacutešača (Q)

Grafickyacute priebeh real ndash time PCR znaacutezorňuje amplifika čnaacute krivka (angl amplification plot) (obr 14) majuacuteca 4 faacutezy 1) Faacuteza I ndash dochaacutedza k zdvojnaacutesobeniu množstva amplikoacutenu po každom cykle ale naacuterast fluorescencie je pod detekčnyacutem limitom zaznamenaacutevanaacute fluorescencia (baseline) zodpovedaacute zaacutekladnej fluorescencii pozadia tzv šumu

17

2) Faacuteza II nazyacutevanaacute aj exponenciaacutelna faacuteza v ktorej sa fluorescencia zvyacuteši na uacuteroveň optickej detekcie bod resp cyklus kedy začiacutena exponenciaacutelna faacuteza je kľuacutečovyacute na určenie kvantity vstupneacuteho množstva templaacutetovej DNA nazyacuteva sa prahovyacute cyklus označuje sa Ct (angl treshold cycle) alebo Cq (quantification) Čiacutem nižšie je Ct (Cq) tyacutem vaumlčšiacute počet koacutepiiacute templaacutetovej DNA bolo v reakcii Ct hodnota je teda hlavnyacute uacutedaj s ktoryacutem sa pracuje vo vyacutepočtoch fluorescencia v tomto mieste sa nazyacuteva prahovaacute resp treshold 3) Faacuteza III - lineaacuterna faacuteza ndash charakterizuje ju postupneacute spotrebovaacutevanie komponentov reakcie na narastajuacutece množstvo amplikoacutenu 4) Faacuteza IV - plateau (čiacutetaj platoacute) ndash množstvo amplikoacutenu sa v docircsledku vyčerpania zložiek qPCR už nezvyšuje

Obr 13 Princiacutep real-time PCR Obr 14 Faacutezy real-time PCR

Ako štandardnaacute PCR aj qPCR maacute tri zaacutekladneacute kroky 1) Denaturaacutecia dvojvlaacuteknovej DNA na jednovlaacuteknovuacute DNA pri vysokej teplote (obyčajne 95degC) 2) Hybridizaacutecia primerov (annealing) ndash komplementaacuterne sekvencie sa spolu hybridizujuacute 3) Polymerizaacutecia pri 70-72degC kedy v docircsledku optimaacutelnej aktivity DNA polymeraacutezy dochaacutedza k predĺženiu primeru až o 100 baacutez za sekundu

18

Real-time PCR (obr 15) sa využiacuteva na kvantifikaacuteciu expresie geacutenov určenie počtu koacutepiiacute geacutenov určenie genotypu (genotypovanie) alelovou diskriminaacuteciou alebo analyacutezou krivky topenia tzv high resolution melt a multiplexnuacute real time PCR s možnosťou detekcie viaceryacutech cieľovgeacutenov

Multiplexnaacute real-time PCR sa využiacuteva na detekciu viaceryacutech cieľovgeacutenov v jednej reakcii suacutečasne Vyacutehodou multiplexovania je jednak uacutespora vzorky ako aj ziacuteskanie vaumlčšieho množstva informaacuteciiacute z rovnakeacuteho množstva materiaacutelu Nevyhnutnosťou multiplexnej qPCR suacute proacuteby značeneacute rocircznymi fluorescenčnyacutemi farbivami

Najdocircležitejšie zložky qPCR (real-time PCR komponenty) suacute DNA polymeraacuteza (reverznaacute transkriptaacuteza v priacutepade jednokrokovej kvantitatiacutevnej RT-PCT) dNTPs primery resp primeryproacuteby dvojmocneacute Mg templaacutet Na uľahčenie qPCR suacute v suacutečasnosti už komerčne dostupneacute takeacute reakčneacute zmesi ku ktoryacutem stačiacute pridať už len templaacutet (napr kity využiacutevajuacutece TaqManProacuteby) alebo kity s fluorescenčnyacutemi farbami viažucimi sa na dvojvlaacuteknovuacute DNA ku ktoryacutem sa do reakčnej zmesi okrem templaacutetu pridajuacute primery

Obr 15 Real-time PCR cykleacuter

331 Kvantifikaacutecia pomocou qPCR

Na kvantifikaacuteciu DNA pomocou qPCR sa požiacutevajuacute dve zaacutekladneacute metoacutedy - absoluacutetna kvantifikaacutecia a relatiacutevna kvantifikaacutecia

Absoluacutetna kvantifikaacutecia vychaacutedza zo štandardnej krivky (obr 16) ktoraacute sa ziacuteska po qPCR seacuterie riedeniacute DNA znaacutemej koncentraacutecie Kvantifikaacutecia neznaacutemej vzorky sa zistiacute interpolaacuteciou (odčiacutetaniacutem) Ct neznaacutemej vzorky zo štandardnej krivky (obr 16 17) Využiacutevaneacute napr v kriminalistike na stanovenie koncentraacutecie DNA vo vzorke

Relatiacutevna kvantifikaacutecia (obr 18 19) porovnaacuteva uacuteroveň expresie určiteacuteho geacutenu vo vzorke k expresii toho isteacuteho geacutenu v referenčnej (kontrolnej) vzorke alebo množstvo určiteacuteho geacutenu (počet koacutepiiacute) vo vzorke porovnaniacutem s množstvom geacutenu v kontrolnyacutech vzorkaacutech V raacutemci každej vzorky musiacute pred relatiacutevnou kvantifikaacuteciou docircjsť k tzv normalizaacutecii t j porovnanie expresie sledovaneacuteho geacutenu k expresii referenčneacuteho geacutenu (najčastejšie niacutem byacuteva tzv bdquohousekeepingldquo geacuten napr GAPDH aktiacuten tubuliacuten)

V priacutepade kvantifikaacutecie expresie určiteacuteho geacutenu metoacutedou real-time PCR (RT-qPCR) pred samotnou kvantifikaacuteciou cDNA musiacute byť taacuteto cDNA nasyntetizovanaacute prostredniacutectvom reverznej

19

transkripcie za použitia enzyacutemu reverznej transkriptaacutezy Kvantitatiacutevna PCR s reverznou transkripciou RT-qPCR mocircže byť dvojkrokovaacute alebo jednokrokovaacute Pri dvojkrokovej RT-qPCR treba pred qPCR syntetizovať cDNA vlaacutekno z RNA pomocou reverznej transkriptaacutezy - 1 krok druhyacutem krokom je samotnaacute real-time PCR Jednokrokovaacute RT-qPCR umožňuje uskutočniť obidve reakcie reverznuacute transkripciu a kvantitatiacutevnu PCR v jednej skuacutemavke čo zjednodušuje qPCR a redukuje možnosť kontaminaacutecie Obr 16 5-bodovaacute štandardnaacute krivka (amplifikaacutecia piatich koncentraacuteciiacute jednej vzorky konkreacutetne ide o 10-tkoveacute riedenie)

Obr 17 Ukaacutežka amplifikačnyacutech kriviek riedenia a z nich ziacuteskanej štandardnej krivky poukazuje na vysokuacute presnosť metoacutedy RT-PCR

20

Obr 18 Relatiacutevna kvantifikaacutecia - určenie počtu koacutepiiacute geacutenu CYP21A2 vo vzorke DNA izolovanej z perifeacuternej krvi pacientov mutaacutecie v geacutene CYP21A2 spocircsobujuacute kongenitaacutelnu adrenaacutelnu hyperplaacuteziu (CAH) Vyacutesledok analyacutezy všetci pacienti majuacute dve koacutepie geacutenu

Obr 19 Relatiacutevna kvantifikaacutecia - určenie počtu koacutepiiacute geacutenu CYP21A2 vo vzorke DNA izolovanej z plodovej vody mutaacutecie v geacutene CYP21A2 spocircsobujuacute kongenitaacutelnu adrenaacutelnu hyperplaacuteziu (CAH) Prenaacutetalnou diagnostikou (qPCR) sa zistila priacutetomnost jednej koacutepie CYP21A2 geacutenu 332 Určenie genotypu metoacutedou alelovej diskriminaacutecie a analyacutezou krivky topenia (HRM)

Určenie genotypu metoacutedou alelovej diskriminaacutecie (obr 20) sa uskutočňuje použitiacutem hydrolyzujuacutecich proacuteb (sond) je veľmi ryacutechla a senzitiacutevna (presnaacute) metoacuteda frekventovane využiacutevanaacute v laboratoacuteriaacutech Dva variantyalely suacute vyšetreneacute suacutečasne v jednej vzorke a v jednej reakčnej

21

skuacutemavke V reakcii suacute použiteacute dve proacuteby označeneacute rozdielnymi fluorescenčnyacutemi farbičkami emitujuacutecimi svetlo o rocircznej vlnovej dĺžke (najčastejšie jedna označenaacute FAM farbičkou a druhaacute proacuteba označenaacute VIC farbičkou) Počas amplifikaacutecie amplikoacutenu dochaacutedza k odstraacuteneniu zhaacutešača z bliacutezkosti farbičky ktoraacute potom emituje svetlo priacuteslušnej vlnovej dĺžky Vzorky so signaacutelom len jednej fluorescenčnej farbičky (FAM) a bez signaacutelu druhej farbičky (VIC) suacute homozygoti pre alelu 1 vzorky so signaacutelom len druhej farbičky (VIC) a bez signaacutelu prvej (FAM) suacute homozygoti pre alelu 2 v priacutepade ak vyšetrovanaacute vzorka bdquosvietildquo obidvoma farbami jednaacute sa o heterozygota

Obr 20 Určenie genotypu metoacutedou alelovej diskriminaacutecie ndash amplifikačnaacute krivka vzoriek DNA majuacutecich tri rocirczne genotypy A ndash jednotliveacute vzorky (plnaacute čiara predstavuje štandardnuacute alelu guličkovanaacute mutovanuacute alelu) B ndash 72 vzoriek C ndash scatter plot 72 vzoriek

Určenie genotypu analyacutezou krivky topenia tzv high resolution melt (HRM) (obr 21) umožňuje detekciu takmer všetkyacutech genetickyacutech variaacuteciiacute (SNP mutaacuteciiacute) Keďže taacuteto metoacuteda okrem štandardnyacutech podmienok reakcie vyžaduje len primery a farbičku (nie proacuteby) je veľmi jednoduchaacute a lacnejšia Po amplifikaacuteciiacute treba amplikoacuten pomaly zohrievať až kyacutem nedocircjde k denaturaacuteciiacute Teplota topenia amplikoacutenu vo vzorke zaacutevisiacute od DNA sekvencie čo umožňuje detegovať priacutetomnosť mutaacutecie resp SNP Tvar vyacuteslednyacutech kriviek topenia určuje teda genotyp

22

Obr 21 Určenie genotypu analyacutezou krivky topenia tzv metoacutedou high resolution melting (HRM) A ndash krivka topenia vzoriek DNA majuacutecich tri rocirczne genotypy B ndash graf rozdielnosti krivky topenia vzoriek DNA majuacutecich tri rocirczne genotypy

23

4 Elektroforetickaacute separaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten

Separaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten predstavuje rozdelenie molekuacutel DNA alebo RNA na zaacuteklade veľkosti zloženia a poradia baacutez Podobnyacutemi metoacutedami je možneacute separovať aj proteiacuteny

Elektroforeacuteza (ELFO) je technika použiacutevanaacute na separaacuteciu niekedy aj purifikaacuteciu makromolekuacutel ako suacute nukleoveacute kyseliny a proteiacuteny na zaacuteklade ich rozdielnej veľkosti naacuteboja alebo konformaacutecie Je to metoacuteda veľmi často využiacutevanaacute nielen v molekulovej genetike ale aj biocheacutemii Elektroforeacuteza využiacuteva schopnosť nabityacutech molekuacutel migrovať v jednosmernom elektrickom poli k opačneacutemu poacutelu Nukleoveacute kyseliny majuacute vďaka svojej fosfaacutetovej zložke negatiacutevny naacuteboj preto v jednosmernom elektrickom poli migrujuacute ku kladneacutemu poacutelu čiže k anoacutede Elektroforeacuteza prebieha v elektroforetickej aparatuacutere v geacuteloch (v nosiči) so sieťovitou štruktuacuterou ktoraacute umožňuje separaacuteciu molekuacutel Vzorka nukleovej kyseliny zmiešanaacute s tzv nanaacutešaciacutem tlmivyacutem roztokom s farbičkou sa nanesie do jamky v geacuteli ktoryacute je umiestnenyacute v elektroforetickej aparatuacutere v priacutetomnosti elektroforetickeacuteho pufra (TAE alebo TBE) (obr 22) Nanaacutešaciacute tlmivyacute roztoknanaacutešacia farbička umožňuje na zaacuteklade migraacutecie farbičky vidieť migraacuteciu vzorky v geacuteli a suacutečasne zvyacutešeniacutem hustoty vo vzorke umožniacute klesnuacuteť vzorke do jamky a tak zabraacuteniť jej vyplaveniu z geacutelu Draacuteha je časť geacutelu ktoryacutem putuje jedna vzorka od katoacutedy k anoacutede V draacutehe sa nachaacutedzajuacute oddeleneacute jednotliveacute fragmenty nukleovyacutech kyseliacuten určityacutech veľkostiacute viditeľneacute vo forme pruacutežkov (angl bands) Intenzita pruacutežku zaacutevisiacute od množstva molekuacutel danej veľkosti je ekvivalentnaacute hmotnosti Na určenie veľkosti fragmentov NK sa do jednej jamky nanesie štandard molekulovyacutech hmotnostiacute (angl ladder) ktoryacute maacute presne definovaneacute veľkosti fragmentov čo umožňuje odhadnuacuteť veľkosť aj hmotnosť neznaacutemych separovanyacutech fragmentov

Obr 22 Elektroforetickaacute separaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten v agaroacutezovom geacuteli (A) a vizualizaacutecia UV svetlom a GelRedtrade (B C)

24

Nukleoveacute kyseliny je možneacute elektroforeticky separovať 1) v geacuteloch agaroacutezovom (horizontaacutelna elektroforeacuteza) (obr 22) a polyakrylamidovom (vertikaacutelna elektroforeacuteza) 2) v špeciaacutelnych lineaacuternych polymeacuteroch kapilaacuternou elektroforeacutezou použitiacutem genetickeacuteho analyzaacutetora (obr 23)

Agaroacuteza je polysacharid ziacuteskanyacute z morskej riasy použiacuteva sa najčastejšie v koncentraacuteciiacute 05-2 čiacutem vyššia koncentraacutecia tyacutem je geacutel pevnejšiacute a schopnejšiacute rozliacutešiť menšie fragmenty NK Priacuteprava je jednoduchaacute odvaacuteži sa potrebneacute množstvo agaroacutezy ktoraacute sa zmieša s tlmivyacutem roztokom (pufrom) rozvariacute sa v mikrovlnnej ruacutere a naleje sa do špeciaacutelnej naacutedoby na vytvaacuteranie geacutelov kyacutem je geacutel tekutyacute vložiacute sa do neho tzv hrebeň na vytvorenie jamiek Agaroacuteza je netoxickaacute V bežnom agaroacutezovom geacuteli v zaacutevislosti od jeho koncentraacutecie je možneacute separovať DNA fragmenty dĺžky 200-50 000 bp Dnes suacute dostupneacute aj špeciaacutelne agaroacutezy napr MetaPhorreg Agarose schopneacute oddeliť fragment DNA dĺžky 20-800bp Separaacutecia v agaroacutezovom geacuteli prebieha v horizontaacutelnej aparatuacutere preto sa nazyacuteva aj horizontaacutelna elektroforeacuteza

Polyakrylamidovyacute geacutel (PAGE) vznikaacute polymerizaacuteciou akrylamidu v priacutetomnosti špeciaacutelnych chemickyacutech laacutetok (peroxodisiacuteran amoacutenny TEMED bisakrylamid) Jeho priacuteprava je preto odlišnaacute a aj naacuteročnejšia Polyakrylamidoveacute geacutely majuacute vysokuacute rozlišovaciu schopnosť (1bp) preto suacute PAGE geacutely vhodneacute aj na sekvenovanie DNA klasickyacutemi metoacutedami PAGE geacutel nie je vhodnyacute na separaacuteciu fragmentov dlhšiacutech ako 2kb Použiacuteva sa v koncentraacutecii 35 -20 s rozliacutešeniacutem fragmentov od 10bp-2000bp Akrylamid je neurotoxiacuten musiacute sa s niacutem pracovať veľmi opatrne PAGE elektroforeacuteza bežiacute vo vertikaacutelnej aparatuacutere preto sa volaacute aj vertikaacutelna elektroforeacuteza použiacuteva sa často aj na separaacuteciu proteiacutenov

Ryacutechlosť pohybu nukleovyacutech kyseliacuten (mobilita) určuje viacero faktorov 1) veľkosť NK ndash počet baacutezovyacutech paacuterov resp baacutez pričom menšie molekuly prechaacutedzajuacute geacutelom ryacutechlejšie pretože sa ľahšie pohybujuacute v geacuteli 2) konformaacutecia nukleovej kyseliny napr u rovnako veľkyacutech plazmidov kondenzovaneacute superšpiralizovaneacute plazmidy migrujuacute najryacutechlejšie rovnako veľkeacute lineaacuterne molekuly (toho isteacuteho plazmidu) bežia pomalšie a najpomalšie putujuacute relaxovaneacute kruhoveacute molekuly plazmidu 3) koncentraacutecia geacutelu určuje jeho rozlišovaciu schopnosť koncentrovanejšiacute geacutel je schopnyacute separovať kratšie fragmenty NK redšie geacutely suacute vhodneacute pre rozliacutešenie vaumlčšiacutech fragmentov 4) zloženie geacutelu je docircležiteacute pri analyacuteze sekundaacuternych štruktuacuter NK a proteiacutenov v nedenaturovanom stave sekundaacuterna štruktuacutera spomaľuje migraacuteciu NK a proteiacutenov Tento fakt využiacutevajuacute niektoreacute diagnostickeacute techniky (napr SSCP - Single Strand Conformation Polymorphism - polymorfismus konformaacutecie jednovlaacuteknovej DNA) umožňujuacutece detekciu zaacutemeny jedinej baacutezy ktoraacute spocircsobiacute odlišneacute vnuacutetromolekuloveacute paacuterovanie a vyacuteslednuacute konformaacuteciu molekuly Geacutely mocircžu teda byť denaturačneacute a nedenaturačneacute (natiacutevne) 5) napaumltie zdroja - čiacutem vyššie je napaumltie ktoreacute vytvaacutera elektrickeacute pole v elektroforetickej aparatuacutere tyacutem ryacutechlejšie fragmenty NK migrujuacute 6) zloženie roztokov a teploty

Elektroforetickyacute tlmivyacute roztok (pufor - elektrolyt) zabezpečuje stabilneacute elektroforetickeacute podmienky počas separaacutecie geacutel je v ňom ponorenyacute Obsahuje ioacuteny čo umožňuje vedenie elektrickeacuteho pruacutedu

Štandard molekulovyacutech hmotnostiacute (v laboratoacuteriaacutech nazyacutevanyacute ladder alebo marker) je zmes fragmentov DNA alebo RNA s presne definovanou veľkosťou ktoryacute sluacuteži na odhad veľkosti vyšetrovanyacutech fragmentov NK (obr 22) Pomocou špeciaacutelnych štandardov molekulovyacutech hmotnostiacute ktoryacutech fragmenty NK majuacute definovanuacute aj hmotnosť je možneacute odhadnuacuteť množstvo (hmotnosť - koncentraacuteciu) neznaacutemeho fragmentu

B C

25

41 Vizualizaacutecia DNA

Samotnaacute nukleovaacute kyselina je počas elektroforetickej separaacutecie neviditeľnaacute Vizualizaacuteciu NK umožňujuacute interkalačneacute činidlaacute ktoreacute suacute schopneacute naviazať sa na molekuly NK tyacutem že sa včlenia medzi susediace baacutezy Po ožiareniacute UV svetlom interkalačneacute činidlaacute naviazaneacute na NK fluoreskujuacute tak sa vizualizuje NK čiacutem intenziacutevnejšie fluoreskuje tyacutem viac NK je v geacutelipruacutežku priacutetomneacute Interkalačneacute činidlo sa buď primieša do geacutelu pri jeho priacuteprave čo umožniacute sledovať migraacuteciu fragmentov NK počas elektroforeacutezy a to po vybratiacute z ELFO aparatuacutery a po ožiareniacute UV svetlom alebo sa geacutel farbiacute po elektroforetickej separaacutecii V minulosti bol na zviditeľnenie NK najčastejšie použiacutevanyacute etidiumbromid kvocircli jeho mutageacutennym vlastnostiam sa v suacutečasnosti nahraacutedza menej mutageacutennymi a netoxickyacutemi činidlami ako suacute napr komerčne dostupneacute SYBRregSafe GelRedtrade GelGreentrade

Kapilaacuterna elektroforeacuteza NK prebieha v špeciaacutelnom priacutestroji genetickom analyzaacutetore (obr 23) ktoryacute musiacute mať zaacutekladneacute komponenty ako suacute elektroacutedy kapilaacutera zdroj vysokeacuteho napaumltia detektor prepojenie s počiacutetačom a softveacuteroveacute vybavenie priestor na vloženie vzoriek atď Genetickyacute analyzaacutetor predstavuje automatizovanyacute systeacutem umožňujuacuteci sekvenovanie určovanie dĺžky DNA fragmentov ndash fragmentačnuacute analyacutezu a kvantifikaacuteciu nukleovyacutech kyseliacuten V novšiacutech typoch genetickeacuteho analyzaacutetora je proces analyacutezy od vloženia vzoriek do stojana automatizovanyacute

Vzorka určenaacute na analyacutezu je elektrokineticky injektovanaacute do tenkej kapilaacutery naplnenej lineaacuternym polymeacuterom Vplyvom vysokeacuteho napaumltia sa negatiacutevne nabiteacute fragmenty DNA pohybujuacute v polymeacuteri k pozitiacutevne nabitej elektroacutede Kapilaacuterna elektroforeacuteza je tak citlivaacute že je schopnaacute detegovať jednobaacutezovyacute rozdiel DNA fragmentov DNA fragmenty musia byť pred kapilaacuternou elektroforeacutezou fluorescenčne označeneacute v kapilaacutere suacute separovaneacute na zaacuteklade veľkosti Kraacutetko pred dosiahnutiacutem kladne nabitej elektroacutedy docircjde po excitaacutecii laserovyacutem žiareniacutem k emisii žiarenia fluoroformi (farbičkami) tak že optickyacute detekčnyacute systeacutem zaznamenaacute fluorescenciu ktoraacute je naacutesledne softveacuterovo spracovanaacute a vyhodnotenaacute

Obr 23 Genetickyacute analyzaacutetor

42 RFLP

Metoacuteda polymorfizmu dĺžky restrik čnyacutech fragmentov (angl Restriction Fragment Length Polymorfism) bola prvou metoacutedou využiacutevanou na detekciu DNA variaacuteciiacute rocircznych biologickyacutech vzoriek Princiacutep metoacutedy spočiacuteva v priacutetomnosti polymorfizmov v DNA sekvencii rocircznych ľudiacute ktoreacute zapriacutečinia rozdielny profil (obrazec) DNA fragmentov po štiepeniacute jednou alebo viaceryacutemi restrikčnyacutemi endonukleaacutezami Restrikčneacute endonukleaacutezy (RE) suacute enzyacutemy ktoreacute štiepia DNA molekulu v oblasti špecifickej nukleotidovej sekvencie nazyacutevanej restrik čneacute miesto RE najčastejšie rozpoznaacutevajuacute a štiepia miesto veľkeacute 4-6 baacutez RE suacute priacutetomneacute u prokaryotov (bakteacuterie a archebakteacuterie) kde suacute suacutečasťou restrik čno-modifikačneacuteho systeacutemu akoby prokaryotickeacutej vrodenej imunity sluacutežia

26

na ochranu pred cudzou DNA (napr viacuterusovou) ktoruacute po rozpoznaniacute špecifickej sekvencie štiepia

Restrikčno-modifikačnyacute systeacutem maacute dve zložky 1) modifikačneacute enzyacutemy - metylaacutezy ktoreacute procesom metylaacutecie modifikujuacute určiteacute baacutezy svojej DNA čiacutem ich označia za vlastnuacute DNA takže takaacuteto DNA je potom rezistentnaacute voči štiepeniu restrikčnyacutemi endonukleaacutezami Najčastejšiacutem spocircsobom metylaacutecie u bakteacuteriiacute je metylaacutecia adeniacutenu na N6 pričom vznikne metyladeniacuten alebo cytoziacutenu na C5 metylcytoziacuten 2) restrikčneacute endonukleaacutezy štiepia špecifickeacute miesto dvojvlaacuteknovej DNA ktoreacute je tvoreneacute symetrickou sekvenciou zrkadlovo sa opakujuacutecich nukleotidov ndash tzv palindroacutem Restrikčneacute enzyacutemy sa použiacutevajuacute na štiepenie DNA sekvencie na mieste špecifickom pre tuacute ktoruacute restrikčnuacute endonukleaacutezu napr pri analyacuteze polymorfizmov dĺžky restrikčnyacutech fragmentov (RFLP) analyacuteze jednonukleotidovyacutech polymorfizmov (SNP) mutaacuteciiacute ako aj pri klonovaniacute DNA do vhodnyacutech vektorovyacutech DNA molekuacutel

Po štiepeniacute dvojvlaacuteknovej DNA restrikčnou endonukleaacutezou mocircžu vzniknuacuteť tri typy koncov - 5´-prečnievajuacutece konce (lepiveacute) 3´-prečnievajuacutece konce (lepiveacute) a tupeacute konce (obr 24)

Obr 24 Restrikčneacute štiepenie zanechaacutevajuacutece rocirczne konce tupeacute a lepiveacute

Restrikčneacute štiepenie je často použiacutevanou metoacutedou geacutenovyacutech manipulaacuteciiacute na konštrukciu

hybridnyacutech molekuacutel DNA s naacuteslednyacutem klonovaniacutem Priebeh RFLP analyacutezy je nasledovnyacute restrikčnaacute endonukleaacuteza sa pridaacute k DNA a zmes sa vo

vhodnyacutech reakčnyacutech podmienkach (pufor teplota) inkubuje niekoľko hodiacuten Počas inkubaacutecie docircjde k štiepeniu DNA na špecifickyacutech miestach DNA je potom elektroforeticky separovanaacute v geacuteli a naacutesledne vizualizovanaacute V minulosti po geacutelovej elektroforeacuteze nasledoval Southern blot (čiže prenos separovanyacutech fragmentov DNA z geacutelu na špeciaacutelnu membraacutenu) (obr 35) po ktorom nastala vizualizaacutecia raacutedioaktiacutevne značenou proacutebou V suacutečasnosti sa kvocircli praacutecnosti a zdravotnyacutem rizikaacutem od Southern blotu upuacutešťa a prechaacutedza sa na ryacutechlejšie menej praacutecne a zdravotne šetrnejšie metoacutedy priateľskejšie aj k životneacutemu prostrediu

RFLP bola prvou metoacutedou použiacutevanou na zistenie DNA profilu (DNA fingerprinting) mapovanie geacutenov zapriacutečiňujuacutece genetickeacute ochorenia a testovanie otcovstva Vaumlčšina RFLP markerov je vysoko lokusovo špecifickyacutech a kodominantnyacutech (obidve alely suacute detekovaneacute u heterozygota)

PCR-RFLP je laboratoacuterne priacutestupnejšia metoacuteda molekulaacuterno-genetickej diagnostiky keďže PCR umožňuje amplifikaacuteciu veľmi malyacutech množstiev DNA Alternatiacutevny naacutezov použiacutevanyacute v literatuacutere je CAPS z angl Cleaved Amplified Polymorphic Sequence assay Použitiacutem špecifickyacutech primerov docircjde PCR metoacutedou k amplifikaacutecii požadovaneacuteho uacuteseku DNA ten sa potom štiepi restrikčnou endonukleaacutezou vo vhodnyacutech podmienkach naacutesledne sa štiepne produkty elektroforeticky separujuacute a vizualizujuacute použitiacutem interkalačnyacutech farbiacutev a UV svetla (obr 25)

27

Obr 25 Princiacutep metoacutedy PCR-RFLP

43 VNTR a STR V geacutenome suacute priacutetomneacute dva typy tandemovyacutech (za sebou nasledujuacutecich) opakovaniacute

1) minisatelity ndash nazyacutevaneacute variabilnyacute počet tandemovyacutech opakovaniacute VNTR (variable number of tandem repeats) 2) mikrosatelity tiež kraacutetke tandemoveacute repetiacutecie STR (short tandem repeats)

Obidva tieto typy satelitnej DNA suacute rozmiestneneacute po celom genoacuteme suacute využiacutevaneacute hlavne vo forenznej genetike na identifikaacuteciu osocircb a určenie otcovstva popriacutepade materstva ale aj v mediciacutene na detekciu chromozoacutemovyacutech aneuploidiiacute Štruktuacutera obidvoch je podobnaacute Rozdiel medzi jednotlivyacutemi alelami je spocircsobenyacute rozdielnym počtom opakovaniacute opakujuacutecej sa sekvencie (motiacutevu) čo spocircsobiacute rocircznu dĺžku alel s rocircznym počtom tandemovyacutech opakovaniacute nazyacutevanuacute polymorfizmus dĺžky fragmentov

VNTR ndash variabilnyacute počet tandemovyacutech opakovaniacute pričom opakujuacuteca sa sekvencia maacute dĺžku od 6 do 100 baacutez pričom sa mocircže opakovať aj tisiacutece kraacutet alely tak mocircžu mať od 500do 30 000 baacutez VNTR boli v kombinaacutecii s RFLP (DNA fingerprinting ) prvyacutem polymorfizmom použiacutevanyacutem na zistenie DNA profilov a identifikaacuteciu osocircb v kriminalistickej praxi V suacutečasnosti jeho využitie v kriminalistike je kvocircli potrebe relatiacutevne veľkeacuteho množstva DNA nahradeneacute využitiacutem STR

STR - kraacutetke tandemoveacute repetiacutecie suacute v kriminalistike najčastejšie použiacutevanyacutem polymorfizmom STR lokusy suacute rozmiestneneacute po celom genoacuteme repetiacutecia obsahuje jednu až šesť baacutez pričom jej opakovaniacutem vznikne STR v rozsahu od 50 do 300bp V našom genoacuteme suacute tisiacutece STR ktoreacute mocircžu byť použiteacute pre forenznuacute analyacutezu V kriminalistike sa v suacutečasnosti na identifikaacuteciu osocircb použiacuteva 13 STR locusov ktoreacute patria k medzinaacuterodne uznaacutevanyacutem štandardom Z iniciatiacutevy FBI bola vytvorenaacute databaacuteza CODIS (Combined DNA Index System) každaacute krajina maacute svoju databaacutezu CODIS kde je možneacute vložiť a archivovať DNA profily jednotlivcov ako aj profily DNA ziacuteskanyacutech z miest kriminaacutelneho činu v databaacuteze je ich možneacute navzaacutejom porovnať a tak zistiť pocircvodcu trestneacuteho činu Medzinaacuterodnaacute jednotnosť v použiacutevaniacute CODIS STR lokusov umožňuje v priacutepade potreby vzaacutejomneacute porovnanie DNA profilov zistenyacutech na uacutezemiacute rocircznych štaacutetov CODIS STR lokusov je 13 a suacute to CSF1PO FGA TH01 TPOX VWA D3S1358 D5S818 D7S820 D8S1179 D13S317 D16S539 D18S51 a D21S11 Zistenie DNA profilu sa uskutočniacute multiplexnou PCR reakciou s fluorescenčne značenyacutemi primermi špecifickyacutemi pre konkreacutetny STR Naacutesledne suacute PCR produkty analyzovaneacute kapilaacuternou elektroforeacutezou genetickyacutem analyzaacutetorom ktoryacute rozliacuteši amplifikovaneacute fragmenty na zaacuteklade fluorescencie a dĺžky (fragmentačnaacute analyacuteza) (obr 26 Tab 3) DNA profil každeacuteho človeka je jedinečnyacute rovnakyacute profil mocircžu mať len jednovaječneacute dvojčataacute

28

Obr 26 Ukaacutežka DNA profilu človeka 15 STR lokusov s určeniacutem pohlavia pomocou lokusu pre amelogeniacuten (ženskeacute pohlavie - XX) maleacute oranžoveacute piacuteky predstavujuacute fragmenty veľkostneacuteho štandardu Tabuľka č 3 Zaacutepis DNA profilu človeka z obraacutezka č 26 15 STR lokusov s určeniacutem pohlavia pomocou lokusu pre amelogeniacuten System Alela 1 Alela 2

D3S1358 16 17

TH01 9 93 D21S11 28 28

D18S51 15 18

Penta E 7 14 D5S818 9 12

D13S317 8 11

D7S820 8 11 D16S539 11 12

CSF1PO 10 11

Penta D 11 12 vWA 15 18

D8S1179 13 16

TPOX 8 9 FGA 20 21

amel X X

29

5 MLPA

Multiplexnaacute amplifikaacutecia proacuteb zaacutevislaacute od ligaacutecie (z angl multiplex ligation-dependent probe amplification) je metoacuteda schopnaacute v jednej reakcii (v jednej skuacutemavke a vzorke) detegovať zmeny v počte až 50 nukleotidovyacutech sekvenciiacute Metoacutedou MLPA je možneacute ryacutechlo identifikovať amplifikaacutecie (duplikaacutecie) a deleacutecie veľkeacuteho počtu geacutenov či už použitiacutem DNA alebo mRNA krvnyacutech vzoriek alebo vzoriek z naacutedorov

Princiacutep MLPA spočiacuteva v multiplexnej amplifikaacutecii 50 špecifickyacutech nukleotidovyacutech sekvenciiacute použitiacutem jedneacuteho paacuteru primerov pričom jeden primer je fluorescenčne označenyacute Vyacutesledneacute PCR produkty suacute analyzovaneacute kapilaacuternou elektroforeacutezou (fragmentačnaacute analyacuteza) Dĺžka každeacuteho namnoženeacuteho produktu je jedinečnaacute narastaacute postupne o 6 alebo 9 nukleotidov pričom produkty PCR suacute 120 ndash 500 nukleotidov dlheacute Tento veľkostnyacute rozsah PCR fragmentov (dĺžka 120-500 nukleotidov s naacuterastom postupne o 6 alebo 9 nukleotidov) je optimaacutelny pre kapilaacuternu elektroforeacutezu MLPA multiplexnaacute PCR prebieha za použitia iba jedineacuteho paacuteru primerov ktoreacute amplifikujuacute špecifickeacute sekvencie Trik spočiacuteva v tom že nedochaacutedza k amplifikaacutecii DNA sekvencie ale MLPA proacuteb ktoreacute suacute pridaneacute k vzorkaacutem Každaacute MLPA proacuteba pozostaacuteva z dvoch oligonukleotidov (dve hemiproacuteby) pričom každyacute oligonukleotid obsahuje jednu zo sekvencie rozpoznaacutevanuacute PCR primermi Proacuteba vznikne jedine za predpokladu hybridizaacutecie dvoch oligonukleotidov (hemiproacuteb) k cieľovej sekvencii (geacutenu) a po ligaacutecii enzyacutemom ligaacutezou Iba ligovaneacute proacuteby suacute exponenciaacutelne amplifikovaneacute pomocou jedneacuteho paacuteru primerov Množstvo zligovanyacutech proacuteb teda zaacutevisiacute od množstva cieľovyacutech sekvenciiacute (geacutenov) vo vzorke

Postup MLPA analyacutezy je nasledovnyacute (obr27) K vzorke nukleovej kyseliny (DNA resp mRNA) sa pridaacute zmes 50 jedinečnyacutech proacuteb každaacute

proacuteba je komplementaacuterna k určitej cieľovej sekvencii NK vzorky Každaacute proacuteba však pozostaacuteva z dvoch oligonukleotidov hybridizujuacutecich vedľa seba zaacuteroveň každyacute oligonukleotid (hemiproacuteba) obsahuje pridanuacute sekvenciu rozpoznaacutevanuacute paacuterom PCR primerov Po hybridizaacuteciiacute oligonukleotidov (hemiproacuteb) dochaacutedza k ich ligaacutecii ligaacutezou Ligačnaacute reakcia je tak špecifickaacute že je schopnaacute rozliacutešiť sekvenciu liacutešiacu sa v jednom nukleotide Vyacuteslednyacute ligačnyacute produkt (proacuteba) obsahuje obidve sekvencie pre PCR primery na jednom fragmente čiže mocircže docircjsť k namnoženiu takeacutehoto fragmentu PCR reakciou V priacutepade ak nedocircjde k ligaacutecii priacuteslušnyacutech hemiproacuteb pretože hemiproacuteby nenaacutejdu cieľovuacute sekvenciu na DNA každaacute takaacuteto nezligovanaacute hemiproacuteba maacute len jednu sekvenciu rozpoznaacutevanuacute len jednyacutem PCR primerom v docircsledku čoho nemocircže prebehnuacuteť jej PCR amplifikaacutecia a počas fragmentačnej analyacutezy nie je detegovanaacute pretože negeneruje fluorescenčnyacute signaacutel

Pri MLPA analyacuteze je docircležiteacute okrem MLPA amplifikaacutecie vzorky urobiť aj MLPA amplifikaacuteciu referenčnej vzorky ku ktorej sa bude porovnaacutevať počet geacutenov (cieľovyacutech sekvenciiacute) Po kapilaacuternej elektroforeacuteze MLPA referenčnej a skuacutemanej vzorky porovnaniacutem obsahu nameranyacutech hodnocirct tzv piacutekov priacuteslušnyacutech proacuteb sa určiacute relatiacutevny počet koacutepiiacute v skuacutemanej vzorke

MLPA

1 DNA denaturaacutecia a hybridizaacutecia s MLPA proacutebami (hemiproacuteby)

2 Ligaacutecia (vytvorenie kompletnyacutech proacuteb)

3 PCR amplifikaacutecia proacuteb paacuterom primerov

4 Kapilaacuterna elektroforetickaacute separaacutecia PCR produktov

5 Analyacuteza daacutet

30

Obr 27 Princiacutep MLPA

Firma MRC-Holland v suacutečasnosti ponuacuteka stovky MLPA setov proacuteb ktoreacute suacute vhodneacute na 1) diagnostiku kongenitaacutelnych a dedičnyacutech ochoreniacute 2) zisťovanie profilu naacutedorov 3) zisťovanie metylačneacuteho profilu

MLPA je metoacuteda vhodnaacute na detekciu malyacutech prestavieb (BRCA1 BRCA2 MSH2 atď)

veľkyacutech chromozoacutemovyacutech prestavieb (Williamsov syndroacutem Prader-WilliAngelman syndroacutem atzď)

31

detekciu zmien v počte koacutepii geacutenov (obr 28 29) ako aj zistenie počtu kompletnyacutech chromozoacutemov (chromozoacutem 13 18 21 XY tiež aj z amniovej tekutiny) diagnostiku naacutedorov (zmeny počtu pri ALL CLL atď) kvantifikaacuteciu metylaacutecie (Prader-WilliAngelmanov syndroacutem Fragilnyacute X inaktivaacutecia naacutedorovyacutech supresorovyacutech geacutenov atď) mRNA analyacutezu geacutenov zuacutečastňujuacutecich sa apoptoacutezy alebo zaacutepalov

MS-MLPA (Methylation-Specific MLPA) je varianta MLPA určenaacute špeciaacutelne na analyacutezu aberantnyacutech metylaacutecii imprintovanyacutech oblastiacute ako aj detekciu metylačnyacutech zmien CpG ostrovčekov lokalizovanyacutech bliacutezko promoacutetora Rozdiel oproti štandardnej MLPA spočiacuteva v použitiacute metylačne senzitiacutevneho restrikčneacuteho enzyacutemu HhaI ktoryacute štiepi MS-MLPA proacuteby hybridizovaneacute k nemetylovanej sekvencii Každaacute DNA vzorka určenaacute pre MS-MLPA analyacutezu prejde dvoma reakciami v jednej mikroskuacutemavke štandardnou MLPA analyacutezou (bez štiepenia metylačne senzitiacutevnym enzyacutemom) a v druhej mikroskuacutemavke docircjde okrem ligaacutecie proacuteb aj k metylačne senzitiacutevnemu štiepeniu hybridizovanyacutech proacuteb s nemetylovanou DNA Amplifikujuacute sa len ligovaneacute proacuteby po PCR amplifikaacutecii sa fragmentačnou analyacutezou porovnaniacutem oboch reakciiacute zistia rozdiely v metylačnom profile vzorky k referenčnej vzorke

RT-MLPA (Reverse Transkriptase MLPA) je variaacutecia MLPA určenaacute pre zistenie mRNA profilu vzorky je alternatiacutevou k real-time PCR a mikročipom RT-MLPA nedeteguje mRNA množstvo priamo pretože použiacutevanaacute ligaacuteza nie je schopnaacute ligovať DNA oligonukleotidy keď suacute hybridizovaneacute s RNA Preto RT-MLPA začiacutena reverznou transkripciou so špeciaacutelne navrhnutyacutemi RT primermi tak aby vytvorili kraacutetke oligonukleotidy (cDNA) Potom reakcia pokračuje ako štandardnaacute MLPA

Obr 28 MLPA analyacuteza geacutenu DMD (koacutedujuacuteceho dystrofiacuten) mutaacutecie ktoreacuteho spocircsobujuacute Duchennovu svalovuacute dystrofiu u pacienta je priacutetomnaacute deleacutecia exoacutenu 45 v porovnaniacute s referenčnou vzorkou ndash kontrolou

32

Obr 29 MLPA analyacuteza geacutenu DMD (koacutedujuacuteceho dystrofiacuten) mutaacutecie ktoreacuteho spocircsobujuacute Duchennovu svalovuacute dystrofiu u pacienta suacute priacutetomneacute duplikaacutecie exoacutenov 41 42 43 44 45 (piacuteky vo vzorke pacienta sa porovnajuacute s piacutekmi v kontrole ndash referenčnej vzorke)

33

6 Sekvenovanie

Sekvenovaniacutem rozumieme určenie primaacuternej štruktuacutery DNA teda určenie poradia nukleotidov v reťazci DNA Začiatky moderneacuteho sekvenovania siahajuacute do roku 1977 kedy boli objaveneacute dve metoacutedy sekvenovania 1) chemickaacute metoacuteda Maxama a Gilberta 2) enzymatickaacute metoacuteda Sangera Nicklena a Coulsona

Princiacutep obidvoch metoacuted sekvenovania spočiacuteva v tom že sa vytvoriacute suacutebor DNA molekuacutel s rocircznou veľkosťou ktoreacute suacute zakončeneacute konkreacutetnym nukleotidom tieto DNA molekuly sa elektroforeticky separujuacute v geacuteloch s rozlišovacou schopnosťou 1 nukleotid 61 Chemickaacute metoacuteda

DNA molekuly sa na 5-konci raacutedioaktiacutevne označia raacutedioaktiacutevnym fosforom a naacutesledne sa chemicky modifikujuacute špecificky pre každuacute baacutezu DNA sa potom v modifikovanyacutech miestach štiepi čiacutem vzniknuacute rocirczne dlheacute fragmenty pričom podmienky suacute nastaveneacute tak aby sa DNA na každom mieste štiepila len raz Modifikaacutecia DNA a štiepenie prebehne v štyroch separaacutetnych reakciaacutech (skuacutemavkaacutech) takže po elektroforetickej separaacuteciiacute takto opracovanej DNA v štyroch draacutehach polyakrylamidoveacuteho geacutelu a naacuteslednej autoraacutediografii (podobne ako pri Southernovej hybridizaacutecii) je možneacute odčiacutetať nukleotidovuacute sekvenciu približne 100 nukleotidov od raacutedioaktiacutevneho označenia (v čase objavu Maxama a Gilberta) 62 Sangerova metoacuteda

Zaacuteklady metoacutedy boli popiacutesaneacute už v roku 1975 (metoacuteda plus a miacutenus) ale až vylepšenie použitiacutem dideoxynukleotidov (ddNTP) v roku 1977 došlo k zjednodušeniu sekvenovania Princiacutepom enzyacutemoveacuteho sekvenovania je terminaacutecia (zastavenie) polymerizaacutecie inkorporaacuteciou 2´ 3 -dideoxynukleotidov do novosyntetizujuacuteceho sa vlaacutekna DNA Keďže ddNTP neobsahujuacute hydroxylovuacute skupinu na 3 uhliacuteku riboacutezy nemocircžu sa zuacutečastniť na tvorbe fosfodiesterovej vaumlzby nemocircže sa pripojiť k nim ďalšiacute nukleotid čiže musiacute docircjsť k terminaacuteciiacute polymeraacutecie Reakcia prebieha v štyroch skuacutemavkaacutech s raacutedioaktiacutevne značenyacutem primerom V každej skuacutemavke suacute priacutetomneacute všetky štyri deoxynukleotidtrifosfaacutety (dNTP) ale pre každuacute skuacutemavku je špecifickyacute priacutedavok maleacuteho množstva jedneacuteho z dideoxynukleotidtrifosfaacutetov (v prvej skuacutemavke je ddATP v druhej ddCTP v tretej ddTTP a vo štvrtej ddGTP) Maleacute množstvo ddNTP spocircsobiacute že pri polymerizaacutecii dochaacutedza k prednostneacutemu zaradeniu štandardnyacutech dNTP do narastajuacuteceho reťazca a len občas sa inkorporuje ddNTP čiacutem sa zastaviacute synteacuteza reťazca V každej skuacutemavke tak vznikne suacutebor DNA fragmentov rocircznych veľkostiacute zakončenyacutech priacuteslušnyacutem ddNTP (v prvej skuacutemavke ddATP v druhej ddCTP v tretej ddTTP a vo štvrtej ddGTP) Po elektroforetickej separaacutecii v 4 draacutehach polyakrylamidoveacuteho geacutelu a autoraacutediografii sa z autoraacutediogramu odčiacuteta sekvencia

V suacutečasnosti je sekvenovanie do značnej miery automatizovaneacute pričom využiacuteva princiacutep Sangerovej enzyacutemovej metoacutedy s určityacutemi obmenami Uacutesek DNA ktoryacute treba sekvenovať sa prostredniacutectvom termostabilnyacutech DNA polymeraacutez namnožiacute PCR metoacutedou po ktorej nasleduje sekvenačnaacute reakcia (asymetrickaacute PCR) s fluorescenčne značenyacutemi ddNTP (každyacute druh označenyacute inyacutem fluorescenčnyacutem farbivom) Sekvenačnaacute reakcia prebieha v jednej skuacutemavke s jednyacutem primerom vznikne tak suacutebor jednovlaacuteknovyacutech DNA rocircznej dĺžky ktoreacute suacute na 3konci označeneacute ddNTP so špecifickyacutem fluorescenčnyacutem farbivom Taacuteto metoacuteda sekvenovania sa tiež nazyacuteva rdquodye-terminator cycle sequencingrdquo(obr 30) Po kapilaacuternej elektroforeacuteze vzorky v genetickom analyzaacutetore zaznamenaacutevaniacute fluorescencie jednotlivyacutech fragmentov CCD kamerou a softveacuterovom spracovaniacute sa ziacuteska sekvencia DNA (obr 31)

34

Obr 30 Princiacutep sekvenovania Sangerova dideoxy metoacuteda alebo tzv chain termination method (reťazec zastavujuacuteca metoacuteda) Obr 31 Určenie genotypu plodu a rodičov sekvenčnou analyacutezou DNA ziacuteskanej z plodovej vody (prenataacutelna diagnostika) a perifeacuternej krvi sekvenčnaacute analyacuteza geacutenu ASPA vyacutesledok u plodu priacutetomnaacute mutaacutecia c 914CgtA v homozygotnom stave (AA) rodičia heterozygoti (AC) Uvedenaacute mutaacutecia je v homozygotnom stave kauzaacutelnou priacutečinou Canavanovej choroby

Automatizovaneacute sekvenovanie prinaacuteša viacereacute vyacutehody oproti klasickej Sangerovej metoacutede vyššiu presnosť a ryacutechlosť v jednej sekvenačnej reakcii možnosť osekvenovať až 1200 nukleotidovyacute fragment maleacute množstvo templaacutetu potrebneacute na analyacutezu

35

63 Next Generation Sequencing (NGS)

NGS (sekvenovanie novej generaacutecie) maacute obrovskyacute potenciaacutel v analyacuteze genoacutemov pričom toto označenie zahŕňa viacereacute technologickeacute metoacutedy reprezentovaneacute niekoľkyacutemi firmami Princiacutepom je masiacutevne paralelneacute sekvenovanie čiacutem sa ziacuteskajuacute raacutedovo tisiacutece až milioacuteny sekvenciiacute naraz 631 Sekvenovanie druhej generaacutecie

Na začiatku sa analyzovanaacute DNA vo vaumlčšine priacutepadov fragmentuje (vznikne tak DNA

knižnica) na fragmenty sa pripoja kraacutetke sekvencie ndash adapteacutery naacutesledne sa tieto fragmenty rocircznymi priacutestupmi amplifikujuacute a určiacute sa ich sekvencia Vďaka čiastočnyacutem prekryvom je zo ziacuteskanyacutech sekvencii možneacute poskladať plynuluacute sekvenciu zodpovedajuacutecu pocircvodnej nefragmentovanej DNA

Pyrosekvenovanie je podobne ako Sangerova metoacuteda založenaacute na princiacutepe synteacutezy komplementaacuterneho vlaacutekna DNA avšak rozdiel je v tom že sa na detekciu inkorporaacutecie nukleotidu využiacuteva inyacute systeacutem tvorby luminiscenčneacuteho signaacutelu v priebehu reakcie Pyrosekvenovanie je umožneneacute vďaka aktivite 4 enzyacutemov - DNA polymeraacutezy ATP sulfurylaacutezy luciferaacutezy a apyraacutezy Reakčnaacute zmes obsahuje aj ďalšie komponenty - enzymatickeacute substraacutety adenoziacutenfosfosulfaacutet (APS) d-luciferiacuten sekvenovanyacute templaacutet a cyklicky postupne po jednom type pridaacutevaneacute nukleotidtrifosfaacutety Po zabudovaniacute nukleotidu do novovznikajuacuteceho reťazca docircjde k uvoľneniu pyrofosfaacutetu naacutesledne je využityacute ATP sulfurylaacutezou na synteacutezu ATP z APS počas ďalšej reakcie docircjde k využitiu ATP luciferaacutezou na premenu luciferiacutenu na oxyluciferiacuten čo spocircsobiacute svetelnyacute signaacutel a ten zaznamenaacute detekčnyacute systeacutem Poslednou enzymatickou reakciou je reakcia apyraacutezy ktoraacute odstraacuteni nezainkorporovaneacute nukleotidy a nevyužiteacute ATP aby sa celyacute proces mohol zopakovať s reakčnou zmesou obsahujuacutecou ďalšiacute nukleotidtrifosfaacutet (inyacute ako v predchaacutedzajuacutecej reakcii) Po každej reakcii detektor zaznamenaacuteva emisiu svetla na zaacuteklade intenzity svetla je možneacute určiť či bol vradenyacute priacuteslušnyacute nukleotidtrifosfaacutet či bol inkorporovanyacute jeden priacutepadne viac rovnakyacutech nukleotidtrifosfaacutetov

Zvyacutešenie vyacutekonu pyrosekvenovania umožnila tzv emulznaacute PCR v mikročasticiach a použitie platničky PicoTiterPlatereg toto sekvenovanie zaviedla firma Roche pod pojmom 454 pyrosekvenovanie v roku 2005 Na začiatku sa DNA fragmentuje na uacuteseky dlheacute 400-600 baacutez dvojvlaacuteknovaacute fragmentovanaacute DNA sa liguje s adapteacutermi prostredniacutectvom nich sa naviaže na mikročastice dvojvlaacuteknoveacute fragmenty sa oddelia mikročastice s naviazanyacutemi jednovlaacuteknovyacutemi fragmentami sa premiešajuacute so zmesou oleja a roztoku ktoryacute obsahuje všetky komponenty na uacutespešnuacute PCR Tyacutemto spocircsobom sa okolo každej mikročastice vytvoriacute vlastnyacute mikroreaktor v ktorom prebehne amplifikaacutecia fragmentu Po PCR reakcii sa mikročastice prenesuacute do platničky PicoTiterPlate v ktorej sa do jamky zmestiacute akuraacutet jedna mikročastica a reakčneacute komponenty pyrosekvenačnej reakcie PicoTiterPlatereg maacute 1 600 000 jamiek každaacute jamka maacute maximaacutelny objem 75 picolitra Platnička s mikročasticami sa vložiacute do sekvenačneacuteho systeacutemu ndash priacutestroja v ktorom sa celeacute pyrosekvenovanie uskutočniacute Chemiluminiscenčneacute signaacutely ktoryacutech počas sekvenovania vznikajuacute milioacuteny v priebehu hodiny suacute zachyteneacute CCD kamerou a analyzovaneacute softveacuterom

Firma Illumina predstavila inuacute technoloacutegiu PCR amplifikaacutecia a sekvenovanie sa uskutočňuje na skliacutečku (flow cell) Fragmentaacutecia DNA a pripojenie adapteacuterov prebieha za uacutečasti transpozoacutemov v procese nazvanom tagmentaacutecia Po hybridizaacutecii fragmentov DNA na skliacutečko prebehne v klastroch PCR amplifikaacutecia (tzv mostiacutekovaacute amplifikaacutecia) sekvenaacutecia prebieha za uacutečasti rozdielne fluorescenčne značenyacutech a chemicky modifikovanyacutech nukleotidov pričom každyacute nukleotid emituje fluorescenciu s inou vlnovou dĺžkou Na skliacutečku prebieha paralelne až 6 miliaacuterd sekvenaacutecii (obr 32)

Ďalšiacutemi možnosťami sekvenovania druhej generaacutecie je systeacutem SOLid (vyvinutyacute firmou Applied Biosystem dnes pod Thermo Fisher Scientific) a Ion Semiconductor Sequencing ndash polovodičoveacute ioacutenoveacute sekvenovanie (od firmy Ion Semiconductor Sequencing v suacutečasnosti Thermo Fisher Scientific)

36

Obr 32 Princiacutep sekvenovania novej generaacutecie od firmy Illumina PCR amplifikaacutecia a sekvenovanie sa uskutočňuje na skliacutečku (flow cell) paralelne prebieha až 6 miliaacuterd sekvenaacutecii

632 Sekvenovanie tretej generaacutecie

Pred sekvenovaniacutem netreba amplifikovať DNA PCR metoacutedou ale sekvencia sa ziacuteskava zachyteniacutem signaacutelu v reaacutelnom čase Medzi sekvenovanie tretej generaacutecie patriacute SMRT (Single Molecule Real-Time Sequencing) a Nanopore Sequencing

37

7 Fragmentačnaacute analyacuteza DNA

Je metoacuteda použiacutevanaacute na určenie veľkosti fragmentov DNA ziacuteskanyacutech PCR reakciou Dĺžka amplifikovanyacutech DNA fragmentov sa zistiacute ich porovnaniacutem s veľkostnyacutem štandardom (obr 33) ktoryacute je tvorenyacute DNA fragmentami znaacutemej dĺžky Veľkostnyacute štandard je pred kapilaacuternou elektroforeacutezou zmiešanyacute so vzorkou DNA fragmenty veľkostneacuteho štandardu suacute fluorescenčne označeneacute pričom použiteacute fluorescenčneacute farbivo je ineacute ako fluorescenčneacute farbivo použiteacute na označenie DNA fragmentov vo vyšetrovanej vzorke

Obr 33 Elektroforetogram veľkostneacuteho štandardu použiacutevaneacuteho na určenie veľkostiacute fragmentov analyzovanyacutech kapilaacuternou elektroforeacutezou v genetickom analyzaacutetore (GeneScantrade 500 LIZtrade dye Size Standard) dĺžka fragmentov v nukleotidoch (napr 50 nukleotidov)

Fragmentačnaacute analyacuteza pozostaacuteva z viaceryacutech krokov Prvyacutem je izolaacutecia DNA nasleduje PCR amplifikaacutecia počas ktorej sa novosyntetizovaneacute DNA fragmenty označia fluorescenčnyacutemi farbivami Vzorka s PCR produktom sa pripraviacute na kapilaacuternu elektroforeacutezu tak že sa zmieša s veľkostnyacutem štandardom (sluacuteži na určenie veľkosti fragmentov) a denaturačnou laacutetkou (formamid) nasleduje denaturaacutecia Pripraveneacute vzorky suacute injektovaneacute do priacutestroja (genetickyacute analyzaacutetor) kde v kapilaacutere naplnenej polymeacuterom v elektrickom poli migrujuacute fluorescenčne značeneacute fragmenty DNA na zaacuteklade veľkosti (kapilaacuterna elektroforeacuteza) Počas elektroforeacutezy genetickyacute analyzaacutetor zaznamenaacuteva fluorescenciu fragmentov Analyacutezou daacutet prostredniacutectvom špeciaacutelnych softveacuterov sa ziacuteskajuacute elektroforetogramy z ktoryacutech je možneacute zistiť veľkosť fragmentov ako aj typ fluorescencie (docircležiteacute ak suacute genetickeacute varianty rozliacutešiteľneacute rocircznou fluorescenciou napr SNaPshot) Fragmentačnaacute analyacuteza je suacutečasťou množstva molekulaacuterno-genetickyacutech metoacuted (pozri obr 12 26 28 29 34) ako suacute napr STR analyacuteza (Short Tandem Repeat) AFLP analyacuteza (Amplified Fragment Lenght Polymorfism) RFLPT-RFLP analyacuteza (Restriction Fragment Lenght PolymorfismTerminal Restricted Fragment Lenght Polymorfism) SSCP (Single Strand Conformation Polymorfism) VNTR (Variable Number of Tandem Repeat) analyacuteza straty heterozygotnosti (LOH loss of heterozygozity) MLPA (Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification) MSMSA (Methylation-Sensitive Mobility Shift Assay) SNP genotypovanie (SNaPshotreg) HiCEP (High-Coverage Expression Profiling)

38

Obr 34 Kvantitatiacutevna fragmentačnaacute PCR analyacuteza (QF-PCR) DNA izolovanej z plodovej vody vyacutesledok prenataacutelnej analyacutezy = priacutetomnosť troch piacutekov pre chromozoacutem 18 (u všetkyacutech fragmentov detegujuacutecich chromozoacutem 18 je pomer vyšetrovanyacutech markerov aberantnyacute 21 resp 111) čo znamenaacute trizoacutemiu chromozoacutemu 18 Edwardsov syndroacutem

39

8 Metoacutedy založeneacute na princiacutepe hybridizaacutecie

Nukleoveacute kyseliny majuacute schopnosť vytvaacuterať dvojvlaacuteknoveacute reťazce z jednovlaacuteknovyacutech molekuacutel na zaacuteklade komplementarity baacutez Komplementarita baacutez umožňuje replikaacuteciu DNA transkripciu RNA komplementarita baacutez zabezpečuje teda reprodukovateľnosť živej hmoty

Hybridizaacutecia je proces v ktorom na zaacuteklade komplementarity baacutez dochaacutedza k vytvoreniu dvojvlaacuteknovej nukleovej kyseliny z dvoch jednovlaacuteknovyacutech molekuacutel DNA alebo RNA alebo ich kombinaacuteciou DNA RNA pričom kratšia jednovlaacuteknovaacute nukleovaacute kyselina vystupuje ako sonda (proacuteba) Hybridizaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten je jeden z najpoužiacutevanejšiacutech naacutestrojov v molekulaacuternej bioloacutegii a genetike (hybridizaacutecia primerov alebo proacuteb sa využiacuteva v takmer každej metoacutede - v PCR RT-PCR qPCR RT-qPCR MLPA sekvenovaniacute fragmentačnej analyacuteze FISH DNA mikročipoch atď)

Denaturaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten je proces pri ktorom dochaacutedza k porušeniu vodiacutekovyacutech vaumlzieb medzi vlaacuteknami nukleovyacutech kyseliacuten (strata sekundaacuternej a terciaacutelnej štruktuacutery) tak že docircjde k ich uacuteplneacutemu oddeleniu vzniknuacute jednovlaacuteknoveacute reťazce Denaturaacutecia NK mocircže byť spocircsobenaacute vplyvom vysokyacutech teplocirct pH alebo chemickyacutech laacutetok (denaturačneacute činidlaacute) Renaturaacutecia je opačnyacute proces v ktorom na zaacuteklade komplementarity dochaacutedza k tvorbe dvojvlaacuteknovyacutech NK

Hybridiza čnaacute sonda (proacuteba) je jednovlaacuteknovaacute nukleovaacute kyselina určitej znaacutemej dĺžky a sekvencie (najčastejšie DNA pretože je stabilnejšia ako RNA) ktoraacute je značenaacute a sluacuteži na detekciu komplementaacuternych molekuacutel DNA alebo RNA v procese hybridizaacutecie V zaacutevislosti od podmienok hybridizaacutecie (stringencia) mocircže byť detegovanaacute sekvencia uacuteplne komplementaacuterna alebo v menej priacutesnych podmienkach mocircže mať sekvenčneacute odchyacutelky Proacuteba sluacuteži na vyhľadanie a zviditeľnenie cieľovyacutech NK Zviditeľnenie sa deje prostredniacutectvom označenia proacuteby ešte pred hybridizaacuteciou Značenie proacuteby mocircže byť raacutedioaktiacutevne a neraacutedioaktiacutevne (najčastejšie fluorescenčneacute)

Raacutedioaktiacutevne značeneacute proacuteby pomocou izotopov (32P) sa využiacutevali viac v minulosti v suacutečasnosti suacute kvocircli zdravotnyacutem rizikaacutem ohľaduplnosti k životneacutemu prostrediu ako aj kvocircli jednoduchšej manipulaacutecii použiacutevaneacute fluorescenčne značeneacute proacuteby Raacutedioaktiacutevne značeneacute sondy boli použiacutevaneacute hlavne metoacutedou Southernovej hybridizaacutecie (Southern blotting Southern blot) Citlivosť raacutedioaktiacutevne značenyacutech proacuteb je vyššia dosahuje schopnosť zachytiť 10 fg (femtogram 10-15) cieľovej DNA sekvencie 81 Southern blot

Metoacutedu objavil v roku 1975 britskyacute bioloacuteg Edwin Southern (preto Southern) Pri Southernovej hybridizaacutecii sa restrikčne štiepeneacute fragmenty DNA elektroforeticky separujuacute v geacuteli potom sa metoacutedou blottingu prenesuacute na nylonovuacute alebo nitroceluloacutezovuacute membraacutenu kde suacute naacutesledne hybridizovaneacute v roztoku obsahujuacutecom raacutedioaktiacutevne značenuacute sondu Priloženiacutem fotografickeacuteho filmu k membraacutene a vyvolaniacutem filmu autoraacutediografiou docircjde k zviditeľneniu lokaliacutet kde došlo k hybridizaacuteciiacute raacutedioaktiacutevne značenej sondy s fragmentom DNA (autoraacutediogram) Southern blot bol kľuacutečovou a prvou metoacutedou na identifikaacuteciu osocircb (DNA fingerprinting DNA pofiling) (obr 35)

Okrem Southern blotu existuje Northern blot na analyacutezu RNA (geacutenovej expresie) a Western blot na analyacutezu proteiacutenov postup je obdobnyacute ako pri Southern blote s obmenami špecifickyacutemi pre konkreacutetny blot Pri Northern blote sa použiacutevajuacute hybridizačneacute proacuteby ale pre vizualizaacuteciu proteiacutenov western blotom je potrebneacute použiť protilaacutetky s naacuteslednou vizualizaacuteciou Pomenovanie techniacutek je hra so sloviacutečkami (keďže paacuten Northern ani Western neobjavili takto nazvaneacute techniky)

Neraacutedioaktiacutevne značenie proacuteb použiacutevanyacutech v molekulaacuternej genetike mocircže byť nepriame (použitie haptenu) alebo priame Konečnaacute vizualizaacutecia je najčastejšie zabezpečenaacute fluoreskujuacutecimi farebnyacutemi značkami farbivami fluorochroacutemami (fluorofoacuterami) Pri priamom značeniacute je farbička kovalentne naviazanaacute na nukleotid a na zachytenie fluorescencie suacute potrebneacute špeciaacutelne priacutestroje umožňujuacutece excitaacuteciu farbičky ktoraacute potom emituje žiarenie určitej vlnovej dĺžky (emisneacute žiarenie) a to zachytiacute detekčnyacute systeacutem priacutestroja Využitie fluorochroacutemov v molekulaacuternej genetike je masiacutevne napr na vizualizaacuteciu NK elektroforeticky separovanyacutech v geacuteli kvantifikaacuteciu produktov PCR reakcie v priacutestroji real-time PCR cykleacuter sekvenovaniacute fragmentačnej analyacuteze FISH DNA mikročipoch atď

40

Obr 35 Princiacutep Southern blotu

82 FISH (fluorescenčnaacute in situ hybridizaacutecia)

FISH (fluorescent in situ hybridization fluorescenčnaacute in situ hybridizaacutecia) metoacuteda patriacute medzi molekulovo-cytogenetickeacute techniky Princiacutep FISH metoacutedy je založenyacute na hybridizaacuteciiacute fluorescenčne značenyacutech proacuteb ku komplementaacuternym uacutesekom vyšetrovanej DNA na podložnom skle (priamo na mieste - in situ) K denaturaacutecii dsDNA dochaacutedza buď vplyvom denaturačnyacutech činidiel alebo zvyacutešenou teplotou a naacuteslednou renaturaacuteciou dochaacutedza k naviazaniu sondy na komplementaacuterny uacutesek DNA Vyacutesledok hybridizaacutecie sa vizualizuje fluorescenčnyacutem mikroskopom vybavenyacutem vhodnyacutemi fluorescenčnyacutemi filtrami a vizuaacutelne zhodnotiacute skuacutesenyacutem odborniacutekom Fluorescencia sa v niektoryacutech priacutepadoch mocircže zaznamenať a hodnotiť aj pomocou softveacuteru (obr 36)

Pomocou FISH detegujeme numerickeacute aberaacutecie - zmeny v počte chromozoacutemov (napr trizoacutemia monozoacutemia chromozoacutemov) alebo štruktuacuterne aberaacutecie a prestavby (napr translokaacutecie inverzie deleacutecie duplikaacutecie amplifikaacutecie) FISH metoacuteda umožňuje identifikaacuteciu a detekciu každeacuteho ľudskeacuteho chromozoacutemu jeho zaradenie do karyotypu odhalenie malyacutech submikroskopickyacutech chromozoacutemovyacutech zmien a tiež mapovať poziacutecie jednotlivyacutech geacutenov na chromozoacuteme

41

Obr 36 Princiacutep štandardnej FISH a FISH maľovania celeacuteho chromozoacutemu

Veľkou vyacutehodou FISH metoacutedy je možnosť analyacutezy buniek v metafaacuteze aj v interfaacuteze kedy nie je nutnaacute kultivaacutecia buniek a tiež ryacutechle analyzovanie veľkeacuteho počtu buniek (stovky až tisiacutece) K ďalšiacutem vyacutehodaacutem patriacute bezpečnosť vysokaacute citlivosť dostatočnaacute stabilita relatiacutevne kraacutetky čas hybridizaacutecie a možnosť ryacutechleho vyhodnotenia Hybridizaacutecia pri vaumlčšine suacutečasne dodaacutevanyacutech sond trvaacute 10-12 hodin (na trhu suacute už dostupneacute aj sondy so skraacutetenyacutem časom hybridizaacutecie na 2-3 hodiny) Po hybridizaacuteciiacute nasleduje odmyacutevanie kedy pri priacuteslušnej teplote dochaacutedza k odmytiu nenaviazanyacutech a nespraacutevne hybridizovanyacutech sond Preparaacutet sa naacutesledne podfarbiacute a vyacutesledok sa zhodnotiacute vo fluorescenčnom mikroskope Na podfarbenie chromozoacutemov alebo jadier sa použiacuteva modreacute kontrastneacute farbivo DAPI (46-diamidino-2-fenylindol) ktoreacute maacute silneacute fluorescenčneacute vlastnosti dokaacuteže prechaacutedzať jadrovou membraacutenou a viazať sa na DNA Vyacutesledkom je modreacute zafarbenie ktoreacute vyacuteborne kontrastuje so signaacutelmi jednotlivyacutech sond

Limitujuacutecim faktorom FISH je možnosť identifikaacutecie len tyacutech uacutesekov DNA ku ktoryacutem suacute použiteacute sondy V jednej analyacuteze je možneacute použiť najviac 3 odlišne značeneacute sondy a tak zistiť priacutepadneacute abnormality len na 1 alebo na paacuter lokusoch Na relevantnuacute detekciu je potrebneacute mať vo vzorke 1-5 aberantnyacutech interfaacutezovyacutech jadier

FISH je možneacute uskutočniť na širokej škaacutele biologickeacuteho materiaacutelu na vzorkaacutech perifeacuternej krvi kostnej drene naacuteteroch choriovyacutech klkoch plodovej vode rocircznych druhov tkaniacutev natiacutevnych alebo zaliatych v parafiacutene na 1 bunke (predimplantačnaacute genetickaacute diagnostika PGD) (obr 37)

Využiacuteva sa na detekciu aberaacuteciiacute pri mnohyacutech onkologickyacutech ochoreniach (napr pri diagnoacuteze mnohopočetnyacute myeloacutem sa v suacutečasnosti po separaacutecii CD138+ buniek robiacute FISH s 5 sondami pre geacuteny IGH TP53 RB1 oblasť 1p321q21 a stanovuje sa hyperploidia chromozoacutemov 5 9 a 15) a tiež k spresneniu doplneniu a k overeniu bežneacuteho cytogenetickeacuteho vyšetrenia

Podľa miesta na chromozoacuteme na ktorom dochaacutedza k hybridizaacutecii sondy rozlišujeme 4 typy

DNA sond bull centromeacuteroveacute sondy ndash sa viažu na strednuacute časť chromozoacutemu ndash centromeacuteru sluacutežia k diagnostike zmien v počte chromozoacutemov k detekcii chromozoacutemov neznaacutemeho pocircvodu umožňujuacute interfaacuteznu FISH na nedeliacich sa bunkaacutech (obr 38-41)

42

Obr 37 Interfaacutezna FISH preimplantačnyacute genetickyacute skriacutening aneuploidiiacute ndash blastomeacutera 3-denneacuteho ľudskeacuteho embrya s normaacutelnym počtom chromozoacutemov 13 18 21 pohlavie XY použityacutech 5 sond pre chromozoacutemy 13 ndash orange 18 ndash aqua 21 ndash green X ndash blue a Y ndash yellow (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

Obr 38 Interfaacutezne jadro po hybridizaacutecii s centromeacuterovou sondou pre chromozoacutem 8 (Vysis Abbott) V pravom jadre je priacutetomnaacute trizoacutemia chromozoacutemu 8 (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex) Obr 39 Metafaacutezna (A) a interfaacutezna FISH (B) použitaacute centromeacuterovaacute sonda CEPX spectrum orangeCEPY spectrum green (Vysis Abbott) Sonda hybridizuje k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (červenyacute signaacutel) a Y (zelenyacute signaacutel) (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

43

Obr 40 Interfaacutezna FISH vyšetrenie spermiiacute použiteacute sondy CEPX greenCEPY orange (Aneuscore Metasystems) Sondy hybridizujuacute k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (zelenyacute signaacutel) Y (červenyacute signaacutel) vľavo ndash dve haploidneacute spermie (majuacutece jedna spermia X druhaacute Y chromozoacutem) vpravo ndash dve patologickeacute spermie obsahujuacutece gonozoacutemovyacute komplement XY (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

Obr 41 Interfaacutezna FISH vyšetrenie spermiiacute použiteacute sondy CEPX greenCEPY orange a CEP18 aqua (Aneuscore Metasystems) Sondy hybridizujuacute k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (zelenyacute signaacutel) Y (červenyacute signaacutel) a 18 (modryacute signaacutel) vľavo ndash normaacutelne haploidneacute ľudskeacute spermie - 1x chromozoacutem X alebo Y a jedenkraacutet chromozoacutem 18 v strede ndash patologickaacute spermia obsahujuacuteca gonozoacutemovyacute komplement XY a jeden chromozoacutem 18 vpravo ndash patologickaacute diploidnaacute spermia s chromozoacutemami X Y a dvoma chromozoacutemami 18 (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

bull lokusovo špecifickeacute sondy ndash hybridizaacutecia prebehne na konkreacutetnom mieste geacutenu (lokuse) (obr 42-44) použiacutevajuacute sa k vyšetreniu mikrodeleacuteciiacute (straty malyacutech častiacute chromozoacutemu pri mikrodelečnyacutech syndroacutemoch) k zisteniu amplifikaacutecie onkogeacutenov a niektoryacutech špecifickyacutech translokaacuteciiacute prestavby geacutenov umožňujuacute interfaacuteznu FISH na nedeliacich sa bunkaacutech bull subtelomeroveacute ndash vaumlzba na koncoveacute časti chromozoacutemu ndash telomeacutery bull celochromozoacutemoveacute alebo celomaľovacie sondy ndash sondy hybridizujuacute s mnohopočetnyacutemi chromozoacutemovyacutemi sekvenciami pričom sa fluorescenčne tak bdquovymaľujeldquo celyacute chromozoacutem (Obr 45) Použiacutevajuacute sa na vyšetrenie chromozoacutemovyacutech prestavieb k analyacuteze translokaacuteciiacute a k detekcii pocircvodu tzv marker chromozoacutemov (malyacutech nadpočetnyacutech chromozoacutemov neznaacutemeho pocircvodu) K použitiu sondy suacute potrebneacute metafaacutezne chromozoacutemy nepoužiacutevaju sa pre interfaacuteznu FISH

Pri konvenčnej chromozoacutemovej FISH suacute homogeacutenne DNA proacuteby hybridizovaneacute s fixovanyacutem metafaacuteznym alebo prometafaacuteznym chromozoacutemomchromozoacutemami na skliacutečku (Obr 36a) Maximaacutelna rozlišovacia schopnosť metafaacuteznej FISH je niekoľko megabaacutez (Obr 39a 45) využitiacutem viac

44

natiahnutyacutech prometafaacuteznych chromozoacutemov sa dosiahne 1 Mb rozliacutešenie Prostredniacutectvom fiber FISH konkreacutetne artificiaacutelne deproteinizovanej natiahnutej DNA pripravenej in situ z celyacutech buniek na mikroskopickom skliacutečku je možneacute vizualizovať individuaacutelne geacuteny maleacute DNA elementy na chromozoacuteme s rozliacutešeniacutem okolo 1000 bp

Obr 42 Interfaacutezne jadro po hybridizaacutecii s lokusovo-špecifickou sondou LSI 5q31 Spectrum Orange5p12 Spectrum Green (Vysis Abbott) Na ľavom obraacutezku suacute priacutetomneacute dva červeneacute (5q31) a dva zeleneacute signaacutely (5p12) v pravom jadre je priacutetomnaacute deleacutecia 5q31 oblasti chyacuteba jeden červenyacute signal (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

Obr 43 Interfaacutezna FISH použitaacute lokusovo-špecifickaacute sonda ndash translokačnaacute - XL BCRABL1 plus (Metasystems) dvojfarebnaacute dvojfuacutezna kde červenaacute označuje lokus ABL1 na chromozoacuteme 9 a zelenaacute oblasť BCR na chromozoacuteme 22 Sonda deteguje fuacuteziu protoonkogeacutenu ABL1 (9q34) a geacutenu BCR (22q11) v priacutepade že červenyacute a zelenyacute signaacutel suacute pri sebe (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

45

Obr 44 Interfaacutezna FISH Použitaacute lokusovo-špecifickaacute sonda- typ break apart pre IGH geacuten V docircsledku translokaacutecie došlo k rozskočeniu geacutenu pričom translokačneacuteho partnera nepoznaacuteme vieme určiť len percento v koľkyacutech jadraacutech je geacuten prestavanyacute (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex) Obr 45 Použiteacute celochromozoacutemoveacute sondy WCP 15 (červenyacute chromozoacutem) a WCP 17 (zelenyacute chromozoacutem) Na metafaacuteze je potvrdenaacute reciprokaacute translokaacutecia t(1517)(q2221) (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

FISH vizualizaacutecia celeacuteho chromozoacutemu maľovanie chromozoacutemu anglicky chromosome

painting je špeciaacutelnou aplikaacuteciou chromozoacutemovej FISH proacuteba je koktail veľkeacuteho počtu rocircznych fluorescenčne značenyacutech DNA fragmentov hybridizujuacutecich pozdĺž celeacuteho konkreacutetneho chromozoacutemu (obr 36b 45) bdquoChromosomepaintingldquo analyzuje metafaacutezne chromozoacutemy V minulosti bola FISH vizualizaacutecia celyacutech chromozoacutemov limitovanaacute malyacutem množstvom rocirczne sfarbenyacutech fluorochroacutemov

V suacutečasnosti je možneacute detegovať množstvo cieľovyacutech sekvenciiacute naraz čo sa využiacuteva pri celogenoacutemovej chromozoacutemovej vizualizaacutecii (whole-chromosomepainting - WCP) metoacutedou multiplex FISH (M-FISH multicolor FISH o br 46) alebo spektraacutelnej karyotypizaacutecie (SKY) kedy možno rozliacutešiť všetky ľudskeacute chromozoacutemy ndash teda 24 rocircznych chromozoacutemov M-FISH a SKY patria medzi metafaacutezne formy FISH diagnostiky ktoreacute umožňujuacute simultaacutennu vizualizaacuteciu všetkyacutech ľudskyacutech chromozoacutemov v rocircznych farbaacutech čo predstavuje uľahčenie analyacutezy karyotypu hlavne pri komplexnyacutech zmenaacutech a markeroch neznaacutemeho pocircvodu Obe techniky vychaacutedzajuacute z použitia

46

celochromozoacutemovyacutech sond značenyacutech kombinaacuteciou viaceryacutech fluorochroacutemov Rozdiel medzi M-FISH a SKY spočiacuteva v technike ziacuteskania konečneacuteho obrazu

Obr 46 Multicolor FISH - každyacute chromozoacutemovyacute paacuter je zafarbenyacute inou farbou pričom na ich zafarbenie postačuje kombinaacutecia 5 fluorochroacutemov Na vyhodnocovanie je potrebnaacute špeciaacutelna sada fluorescenčnyacutech filtrov pre jednotliveacute fluorochroacutemy a špeciaacutelnyacute softweacuter Vľavo-štandardnyacute karyotyp vpravo karyotyp s mutaacuteciami (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

V molekulovej cytogenetike suacute komerčne dostupneacute sety M-FISH proacuteb umožňujuacutece

viacfarebneacute pruacutežkovanie chromozoacutemov (banding) s vysokyacutem rozliacutešeniacutem (multicolor-banding mBAND FISH MCB) čo umožňuje identifikaacuteciu intrachromozoacutemovyacutech prestavieb (Obr 47) Nevyhnutnosťou mBAND-u je mať chromozoacutemy v metafaacuteze Taacuteto metoacuteda bola prvyacutekraacutet uskutočnenaacute na chromozoacuteme 5 v roku 1999 mBAND FISH umožňuje rozliacutešiť špecifickeacute oblasti chromozoacutemov na uacuterovni pruacutežku - bandu a sub-bandu s detekciou 550 bandov haploidneacuteho karyotypu

Obr 47 A - mBAND chromozoacutemu 11 - inverzia duplikovanej oblasti 11q223-q25 B - mBAND chromozoacutemu 3 - na kruhovom chromozoacuteme deleacutecia oblasti 3p263 C - mBAND chromozoacutemu 2 - potvrdenie inverzie duplikovanej časti chromozoacutemu (poskytnuteacute RNDr Dagmar Landlovou Medirex)

FISH metoacuteda a jej varianty (M-FISH mBAND SKY) majuacute v suacutečasnosti širokeacute využitie v

klinickej genetike v onkologickej genetike na detekciu aberaacuteciiacute v čase diagnoacutezy počas liečby po

47

liečbe monitorovanie po transplantaacutecii kostnej drene v prenataacutelnej a postnataacutelnej diagnostike pri detekcii submikroskopickyacutech deleacuteciiacute (napr DiGeorge syndroacutem - 22q112 delečnyacute syndroacutem PraderndashWilli syndroacutem- chromozoacutem 15q11-13) prostredniacutectvom FISH je možnaacute detekcia numerickyacutech zmien chromozoacutemov (trizoacutemia chromozoacutemu 21 pri Downovom syndroacuteme trizoacutemia chromozoacutemu 15 pri Patauovom syndroacuteme trizoacutemia chromozoacutemu 18 pri Edwardsovom syndroacuteme) rocirczne zmeny v počte pohlavnyacutech chromozoacutemov (monozoacutemia X pri Turnerovom syndroacuteme Klinefelterov syndroacutem s X chromozoacutemom naviac - XXY) podobne v predimplantačnej diagnostike

83 DNA Microarray (DNA mikro čip biočip) DNA mikročipovanie je technika využiacutevajuacuteca hybridizaacuteciu skuacutemanej nukleovej kyseliny

(cieľovaacute vzorka) s veľkyacutem množstvom oligonukleotidovyacutech proacuteb (desať tisiacutec až milioacuten) ktoreacute suacute prichyteneacute na pevnyacute podklad najčastejšie sklenyacute silikoacutenovyacute alebo nylonovyacute (doštička čip) Skuacutemanaacute nukleovaacute kyselina je pred hybridizaacuteciou fragmentovanaacute označenaacute fluorofoacuterom a denaturovanaacute Po kontakte čipu s cieľovou vzorkou ktoraacute je vlastne zmes označenyacutech oligonukleotidov značeneacute oligonukleotidy hybridizujuacute s oligonukleotidovyacutemi sekvenciami prichytenyacutemi na čipe Potom suacute na zaacuteklade fluorescencie detekovaneacute miesta kde došlo k hybridizaacutecii čiže vzorka obsahovala takuacuteto nukleotidovuacute sekvenciu Z jedneacuteho mikročipu sa ziacuteska obrovskeacute množstvo daacutet ktoreacute je vždy nutneacute softveacuterovo spracovať V dnešnej dobe existuje niekoľko firiem poskytujuacutecich komerčne mikročipy na objednaacutevku alebo si ich laboratoacuteria produkujuacute sami

Mikročipovanie prebieha nasledovne

1) Vytvorenie DNA čipu ndash tisiacutece rocircznych jednovlaacuteknovyacutech DNA oligonukleotidov znaacutemych sekvencii sa kovalentne naviažu na povrch doštičky vždy v určitej lokalite je niekoľko rovnakyacutech oligonukleotidov veľkosť takejto lokality je ˂ 200 microm Proacutebami mocircže byť DNA cDNA alebo syntetizovaneacute oligonukleotidy Už hotoveacute mikročipy ponuacutekajuacute viacereacute firmy (Affymetrix Agilent Technologies Eppendorf Illumina) alebo si ich jednotliveacute laboratoacuteria vyraacutebajuacute sami pomocou robotickyacutech zariadeniacute DNA čip sa vytvaacutera buď nanaacutešaniacutem kvapiek oligonukleotidov na podklad alebo synteacutezou oligonukleotidov in situ na čipe 2) Priacuteprava vzorky ndash nukleovaacute kyselina (mRNA DNA) sa purifikuje určiacute sa jej kvantita a kvalita (spektrofotometericky) fragmentuje resp v priacutepade mRNA sa syntetizuje cDNA v priacutepade potreby sa mocircže DNA amplifikovať PCR reakciou štiepiť restrikčnyacutemi endonukleaacutezami 3) Fluorescenčneacute označenie (zriedkavejšie raacutedioaktiacutevne) fragmentov DNA prebieha počas reverznej transkripcie alebo PCR amplifikaacutecie za uacutečasti fluorescenčne značenyacutech nukleotidov Keď sa analyzujuacute dve rocirczne vzorky napr zdraveacute tkanivo a naacutedoroveacute tkanivo označenie nukleovyacutech kyseliacuten v tyacutechto tkanivaacutech byacuteva rozdielne a to použitiacutem dvoch rocircznych fluorescenčnyacutech farbiacutev (napr zeleneacute a červeneacute) Pred hybridizaacuteciou je potrebneacute vzorku denaturovať čiacutem sa vytvoriacute zmes jednovlaacuteknovyacutech DNA označenyacutech značkou 4) Hybridizaacutecia s mikročipom ndash v špeciaacutelnom hybridizačnom roztoku hybridizujuacute komplementaacuterne sekvencie zo vzorky s priacuteslušnyacutemi oligonukleotidovyacutemi sondami naviazanyacutemi na čipe Potom sa čip obmyje aby došlo k odstraacuteneniu čiastočne hybridizovanyacutech nukleovyacutech kyseliacuten 5) Skenovanie mikročipu ndash skenerom čipov docircjde k ožiareniu čipu laserom pričom v mieste hybridizaacutecie fluorescenčne značenyacutech DNA fragmentov s proacutebou docircjde k emisii svetla určitej vlnovej dĺžky ktoruacute skener zaznamenaacute 6) Analyacuteza daacutet prebieha metoacutedami bioinformatiky spracovaniacutem softveacutermi sa zistiacute ktoreacute lokality čipu navzaacutejom hybridizovali v priacutepade použitia dvoch vzoriek kontrolnej a skuacutemanej je možneacute analyzovať ich relatiacutevnu intenzitu hybridizaacutecie (expresie určiteacuteho geacutenu)

Existujuacute štyri typy mikročipov 1) Čipy ur čeneacute na analyacutezu expresie (obsahujuacute cDNA proacuteby) pre tzv dvojkanaacutelovyacute experiment kedy je vzorka určenaacute k hybridizaacutecii na čipe ziacuteskanaacute zmiešaniacutem DNA fragmentov kontrolnej a skuacutemanej vzorky pričom fragmenty suacute rozdielne fluorescenčne označeneacute (napr zelenyacute fluorofoacuter pre kontrolnuacute vzorku a červenyacute pre skuacutemanuacute) Na zaacuteklade intenzity a typu fluorescencie sa deteguje expresia geacutenov typickaacute pre kontrolnuacute vzorku (napr zelenaacute fluorescencia) pre skuacutemanuacute vzorku (napr

48

červenaacute fluorescencia) a expresia podobnaacute u oboch vzoriek (žltaacute fluorescencia) neexprimovaneacute geacuteny (čierna fluorescencia) rocirczne odtiene (v zaacutevislosti od prevažujuacutecej hybridizaacutecie) (obr 48) 2) Čipy ur čeneacute na analyacutezu mutaacutecii použije sa genoacutemovaacute DNA označenaacute jednou fluorescenčnou farbičkou na určenie jednonukleotidovej zmeny (SNP ndash Single Nukleotide Polymorphism) 3) Čipy na komparatiacutevnu genoacutemovuacute hybridizaacuteciu (aCGH array Comparative Genomic Hybridization) ndash použiacutevaneacute na zistenie zvyacutešenia alebo zniacuteženia množstva chromozoacutemovyacutech fragmentov obsahujuacutecich geacuteny zodpovedneacute za určiteacute ochorenie Na analyacutezu sa použije skuacutemanaacute gDNA a referenčnaacute (kontrolnaacute) DNA každaacute sa značiacute inou fluorescenčnou farbičkou (princiacutep ako pri analyacuteze expresie) (obr 49 50) 4) Čipy CGH - SNP kombinovaneacute čipy ur čeneacute na analyacutezu aj mutaacuteciiacute SNP aj na komparatiacutevnu genoacutemovuacute hybridizaacuteciu CGH

Mikročipy majuacute rozsiahle využitie napriacuteklad v identifikaacuteciiacute novyacutech geacutenov vo vyacuteskume ich funkciiacute expresie v rocircznych podmienkach pri diagnostike mnohyacutech ochoreniacute vo farmakogenomike vo vyacuteskume vplyvu toxiacutenov

Obr 48 Heatmapa geacutenovej expresie vybranyacutech geacutenov (mRNA) mikročip obsahuje 46000 cDNA proacuteb (poskytnuteacute Ing Helenou Gbelcovou PhD Uacutestav lekaacuterskej bioloacutegie genetiky a klinickej genetiky LF UK a UNB)

49

Obr 49 Princiacutep komparatiacutevnej genoacutemovej hybridizaacutecie (aCGH - array comparative genomic hybridization) Obr 50 A) Vyacutesledok komparatiacutevnej genoacutemovej hybridizaacutecie (aCGH - array comparative genomic hybridization) vzorky DNA izolovanej plodovej vody U plodu s abnormaacutelnym ultrasonografickyacutem vyšetreniacutem bola identifikovanaacute duplikaacutecia oblasti 3q261q29 (modryacute paacutes) a deleacutecia oblasti 5p1533p151 (červenyacute paacutes) Pre porovnanie chromozoacutem 1 bez aberaacutecie b) Ten istyacute pacient ale ineacute softveacuteroveacute spracovanie (poskytnuteacute RNDr Miroslavom Tomkom PhD Medirex)

50

Odporuacutečanaacute a použitaacute literatuacutera

Odborneacute knihy Klug W S Cummings M R Spencer Ch A Palladino M A Concepts of Genetics jedenaacuteste vydanie (2015) Carson S Molecular Biology Techniques tretie vydanie (2012) Strachan T Read A Human Molecular Genetics štvrteacute vydanie (2011) Sudbery P Sudbery I Human Molecular Genetics tretie vydanie (2009)

Internetoveacute straacutenky

wwwncbinlmnihgov wwwmlpacom wwwthermofishercom wwwilluminacom wwwpromegask wwwqiagencom wwwambioncom

Odborneacute člaacutenky Chacon-Cortes D Griffiths L R Methods for extracting genomic DNA from whole blood samples current perspectives Journal of Biorepository Science for Applied Medicine Volume 2 strany 1- 9 Viltrop T Krjutskov K Palta P Metspalu A Comparison of DNA extraction methods for multiplex polymerase chain reaction Anal Biochem 2010 Volume 398(2) strany 260-262 Ing Martin Čermaacutek Molekulaacuterna cytogenetika v problematike familiaacuternych maligniacutet Onkoloacutegia Volume 2 strany 77 - 83 Livak KJ Schmittgen TD Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method Methods 2001 Volume 25(4) strany 402 - 408 Bustin S A Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays J Mol Endocrinol 2000 Volume 25(2) strany169 - 193

MOLEKULAacuteRNE METOacuteDY AKTUAacuteLNE POUŽIacuteVANEacute V KLINICKEJ GENETIKE RNDr Andrea Pastoraacutekovaacute PhD RNDr Robert Petrovič PhD Vydala Univerzita Komenskeacuteho v Bratislave Lekaacuterska fakulta Rozsah 50 straacuten 246 AH prveacute vydanie ISBN 978-80-223-4231-5

15

až 50 nukleotidovyacutech sekvenciiacute v jednej reakcii Pomocou MLPA je možneacute ryacutechlo identifikovať amplifikaacutecie a deleacutecie veľkeacuteho počtu geacutenov či už z DNA alebo mRNA okrem toho MLPA mocircže byť použitaacute na analyacutezu CpG-metylaacutecie (MS-MLPA) Viac informaacutecii v samostatnej časti

SNaPshotreg Multiplex nazyacutevaneacute aj minisekvenovanie je multiplexnaacute reakcia v ktorej je každyacute primer predĺženyacute iba o jeden nukleotid (obr 10) V reakčnej zmesi nie suacute priacutetomneacute deoxyribonukleotidtrifosfaacutety ale len dideoxyribonukleotidtrifosfaacutety (ddATP ddCTP ddGTP ddTTP) každyacute označenyacute inou fluorescenčnou farbičkou Po integraacutecii ddNTP do DNA vlaacutekna je polymerizaacutecia ukončenaacute Jednovlaacuteknoveacute fragmenty (primery) predĺženeacute presne o jeden ddNTP suacute separovaneacute kapilaacuternou elektroforeacutezou v genetickom analyzaacutetore pričom je detegovanaacute ich fluorescencia a dĺžka (obr 11) Z vyacutesledneacuteho elektroforetogramu (obr 12) je možneacute určiť v jednej reakcii sekvenciu vo viac ako v 10 lokalitaacutech určiteacuteho fragmentu DNA SNaPshot Multiplex sa v molekulaacuterno-genetickom laboratoacuteriu využiacuteva na ryacutechlu detekciu viaceryacutech najčastejšie sa vyskytujuacutecich mutaacuteciiSNP geacutenu

Obr 10 Priacuteklad využitia metoacutedy SnaPshot s použitiacutem sady 13 primerov ktoreacute sa predĺžia len o 1 značenyacute dideoxynukleotid SNaPshot najčastejšiacutech mutaacuteciiacute geacutenu pre 21-hydroxylaacutezu (CYP21A2) ktoreacute spocircsobujuacute kongenitaacutelnu adrenaacutelnu hyperplaacuteziu A T G a C predstavujuacute fluorescenčne značeneacute dideoxynukleotidy

Obr 11 Vyacutesledok analyacutezy DNA pacienta metoacutedou minisekvenovania SnaPshot konkreacutetne použitiacutem sady 13 primerov rozlišujuacutecich najčastejšie bodoveacute mutaacutecie geacutenu pre 21-hydroxylaacutezu (CYP21A2) analyacutezou sa zistila mutaacutecia V281L v heterozygotnom stave (dva fragmenty modryacute a červenyacute)

16

Obr 12 SNaPshot analyacuteza geacutenu CYP21A2 u DNA izolovanej z plodovej vody metoacuteda deteguje najčastejšie bodoveacute mutaacutecie geacutenu pre 21-hydroxylaacutezu vyacutesledok prenataacutelnej analyacutezy = priacutetomnosť mutaacutecie In2G v hemizygotnom stave (keďže qPCR metoacutedou bola u plodu zistenaacute priacutetomnosť len jednej koacutepie geacutenu CYP21A2)

33 Kvantitatiacutevna PCR (qPCR)

Polymeraacutezovou reťazovou reakciou (PCR) docielime namnoženie (amplifikaacuteciu) určiteacuteho DNA uacuteseku (templaacutetu) PCR je katalyzovanaacute DNA polymeraacutezou za priacutetomnosti primerov dNTPs dvojmocnyacutech katioacutenov (ako Mg+2) a pufrovacieho roztoku

Real-time PCR ktoraacute je nazyacutevanaacute aj kvantitatiacutevna PCR (qPCR) umožňuje vizualizaacuteciu a kvantifikaacuteciu amplifikaacutecie DNA v reaacutelnom čase to je tak ako to bežiacute počas PCR qPCR využiacuteva fluorescenčneacute chemikaacutelie (farbivaacute) ktoryacutech emitovanuacute fluorescenciu zaznamenaacuteva optickyacute systeacutem počas každeacuteho PCR cyklu zaznamenanaacute fluorescencia je naacutesledne softveacuterovo spracovanaacute a vyhodnotenaacute

V suacutečasnosti sa využiacutevajuacute dva typy qPCR cheacutemie a to farbivaacute viažuce sa na DNA a fluorescenčne značeneacute proacuteby (obr 13)

Farbivaacute viažuce sa na DNA emitujuacute fluorescenciu v priacutepade ak suacute naviazaneacute na dvojvlaacuteknovuacute DNA proacuteby fluoreskujuacute v priacutepade keď molekula zhaacutešača (angl quencher - Q) sa nenachaacutedza v bliacutezkosti molekuly reporteacutera (R) napr hydrolyzujuacutece proacuteby fluoreskujuacute keď je molekula reporteacutera (R) prostredniacutectvom 5acuteexonukleaacutezovej aktivity DNA polymeraacutezy odstraacutenenaacute z bliacutezkosti molekuly zhaacutešača (Q)

Grafickyacute priebeh real ndash time PCR znaacutezorňuje amplifika čnaacute krivka (angl amplification plot) (obr 14) majuacuteca 4 faacutezy 1) Faacuteza I ndash dochaacutedza k zdvojnaacutesobeniu množstva amplikoacutenu po každom cykle ale naacuterast fluorescencie je pod detekčnyacutem limitom zaznamenaacutevanaacute fluorescencia (baseline) zodpovedaacute zaacutekladnej fluorescencii pozadia tzv šumu

17

2) Faacuteza II nazyacutevanaacute aj exponenciaacutelna faacuteza v ktorej sa fluorescencia zvyacuteši na uacuteroveň optickej detekcie bod resp cyklus kedy začiacutena exponenciaacutelna faacuteza je kľuacutečovyacute na určenie kvantity vstupneacuteho množstva templaacutetovej DNA nazyacuteva sa prahovyacute cyklus označuje sa Ct (angl treshold cycle) alebo Cq (quantification) Čiacutem nižšie je Ct (Cq) tyacutem vaumlčšiacute počet koacutepiiacute templaacutetovej DNA bolo v reakcii Ct hodnota je teda hlavnyacute uacutedaj s ktoryacutem sa pracuje vo vyacutepočtoch fluorescencia v tomto mieste sa nazyacuteva prahovaacute resp treshold 3) Faacuteza III - lineaacuterna faacuteza ndash charakterizuje ju postupneacute spotrebovaacutevanie komponentov reakcie na narastajuacutece množstvo amplikoacutenu 4) Faacuteza IV - plateau (čiacutetaj platoacute) ndash množstvo amplikoacutenu sa v docircsledku vyčerpania zložiek qPCR už nezvyšuje

Obr 13 Princiacutep real-time PCR Obr 14 Faacutezy real-time PCR

Ako štandardnaacute PCR aj qPCR maacute tri zaacutekladneacute kroky 1) Denaturaacutecia dvojvlaacuteknovej DNA na jednovlaacuteknovuacute DNA pri vysokej teplote (obyčajne 95degC) 2) Hybridizaacutecia primerov (annealing) ndash komplementaacuterne sekvencie sa spolu hybridizujuacute 3) Polymerizaacutecia pri 70-72degC kedy v docircsledku optimaacutelnej aktivity DNA polymeraacutezy dochaacutedza k predĺženiu primeru až o 100 baacutez za sekundu

18

Real-time PCR (obr 15) sa využiacuteva na kvantifikaacuteciu expresie geacutenov určenie počtu koacutepiiacute geacutenov určenie genotypu (genotypovanie) alelovou diskriminaacuteciou alebo analyacutezou krivky topenia tzv high resolution melt a multiplexnuacute real time PCR s možnosťou detekcie viaceryacutech cieľovgeacutenov

Multiplexnaacute real-time PCR sa využiacuteva na detekciu viaceryacutech cieľovgeacutenov v jednej reakcii suacutečasne Vyacutehodou multiplexovania je jednak uacutespora vzorky ako aj ziacuteskanie vaumlčšieho množstva informaacuteciiacute z rovnakeacuteho množstva materiaacutelu Nevyhnutnosťou multiplexnej qPCR suacute proacuteby značeneacute rocircznymi fluorescenčnyacutemi farbivami

Najdocircležitejšie zložky qPCR (real-time PCR komponenty) suacute DNA polymeraacuteza (reverznaacute transkriptaacuteza v priacutepade jednokrokovej kvantitatiacutevnej RT-PCT) dNTPs primery resp primeryproacuteby dvojmocneacute Mg templaacutet Na uľahčenie qPCR suacute v suacutečasnosti už komerčne dostupneacute takeacute reakčneacute zmesi ku ktoryacutem stačiacute pridať už len templaacutet (napr kity využiacutevajuacutece TaqManProacuteby) alebo kity s fluorescenčnyacutemi farbami viažucimi sa na dvojvlaacuteknovuacute DNA ku ktoryacutem sa do reakčnej zmesi okrem templaacutetu pridajuacute primery

Obr 15 Real-time PCR cykleacuter

331 Kvantifikaacutecia pomocou qPCR

Na kvantifikaacuteciu DNA pomocou qPCR sa požiacutevajuacute dve zaacutekladneacute metoacutedy - absoluacutetna kvantifikaacutecia a relatiacutevna kvantifikaacutecia

Absoluacutetna kvantifikaacutecia vychaacutedza zo štandardnej krivky (obr 16) ktoraacute sa ziacuteska po qPCR seacuterie riedeniacute DNA znaacutemej koncentraacutecie Kvantifikaacutecia neznaacutemej vzorky sa zistiacute interpolaacuteciou (odčiacutetaniacutem) Ct neznaacutemej vzorky zo štandardnej krivky (obr 16 17) Využiacutevaneacute napr v kriminalistike na stanovenie koncentraacutecie DNA vo vzorke

Relatiacutevna kvantifikaacutecia (obr 18 19) porovnaacuteva uacuteroveň expresie určiteacuteho geacutenu vo vzorke k expresii toho isteacuteho geacutenu v referenčnej (kontrolnej) vzorke alebo množstvo určiteacuteho geacutenu (počet koacutepiiacute) vo vzorke porovnaniacutem s množstvom geacutenu v kontrolnyacutech vzorkaacutech V raacutemci každej vzorky musiacute pred relatiacutevnou kvantifikaacuteciou docircjsť k tzv normalizaacutecii t j porovnanie expresie sledovaneacuteho geacutenu k expresii referenčneacuteho geacutenu (najčastejšie niacutem byacuteva tzv bdquohousekeepingldquo geacuten napr GAPDH aktiacuten tubuliacuten)

V priacutepade kvantifikaacutecie expresie určiteacuteho geacutenu metoacutedou real-time PCR (RT-qPCR) pred samotnou kvantifikaacuteciou cDNA musiacute byť taacuteto cDNA nasyntetizovanaacute prostredniacutectvom reverznej

19

transkripcie za použitia enzyacutemu reverznej transkriptaacutezy Kvantitatiacutevna PCR s reverznou transkripciou RT-qPCR mocircže byť dvojkrokovaacute alebo jednokrokovaacute Pri dvojkrokovej RT-qPCR treba pred qPCR syntetizovať cDNA vlaacutekno z RNA pomocou reverznej transkriptaacutezy - 1 krok druhyacutem krokom je samotnaacute real-time PCR Jednokrokovaacute RT-qPCR umožňuje uskutočniť obidve reakcie reverznuacute transkripciu a kvantitatiacutevnu PCR v jednej skuacutemavke čo zjednodušuje qPCR a redukuje možnosť kontaminaacutecie Obr 16 5-bodovaacute štandardnaacute krivka (amplifikaacutecia piatich koncentraacuteciiacute jednej vzorky konkreacutetne ide o 10-tkoveacute riedenie)

Obr 17 Ukaacutežka amplifikačnyacutech kriviek riedenia a z nich ziacuteskanej štandardnej krivky poukazuje na vysokuacute presnosť metoacutedy RT-PCR

20

Obr 18 Relatiacutevna kvantifikaacutecia - určenie počtu koacutepiiacute geacutenu CYP21A2 vo vzorke DNA izolovanej z perifeacuternej krvi pacientov mutaacutecie v geacutene CYP21A2 spocircsobujuacute kongenitaacutelnu adrenaacutelnu hyperplaacuteziu (CAH) Vyacutesledok analyacutezy všetci pacienti majuacute dve koacutepie geacutenu

Obr 19 Relatiacutevna kvantifikaacutecia - určenie počtu koacutepiiacute geacutenu CYP21A2 vo vzorke DNA izolovanej z plodovej vody mutaacutecie v geacutene CYP21A2 spocircsobujuacute kongenitaacutelnu adrenaacutelnu hyperplaacuteziu (CAH) Prenaacutetalnou diagnostikou (qPCR) sa zistila priacutetomnost jednej koacutepie CYP21A2 geacutenu 332 Určenie genotypu metoacutedou alelovej diskriminaacutecie a analyacutezou krivky topenia (HRM)

Určenie genotypu metoacutedou alelovej diskriminaacutecie (obr 20) sa uskutočňuje použitiacutem hydrolyzujuacutecich proacuteb (sond) je veľmi ryacutechla a senzitiacutevna (presnaacute) metoacuteda frekventovane využiacutevanaacute v laboratoacuteriaacutech Dva variantyalely suacute vyšetreneacute suacutečasne v jednej vzorke a v jednej reakčnej

21

skuacutemavke V reakcii suacute použiteacute dve proacuteby označeneacute rozdielnymi fluorescenčnyacutemi farbičkami emitujuacutecimi svetlo o rocircznej vlnovej dĺžke (najčastejšie jedna označenaacute FAM farbičkou a druhaacute proacuteba označenaacute VIC farbičkou) Počas amplifikaacutecie amplikoacutenu dochaacutedza k odstraacuteneniu zhaacutešača z bliacutezkosti farbičky ktoraacute potom emituje svetlo priacuteslušnej vlnovej dĺžky Vzorky so signaacutelom len jednej fluorescenčnej farbičky (FAM) a bez signaacutelu druhej farbičky (VIC) suacute homozygoti pre alelu 1 vzorky so signaacutelom len druhej farbičky (VIC) a bez signaacutelu prvej (FAM) suacute homozygoti pre alelu 2 v priacutepade ak vyšetrovanaacute vzorka bdquosvietildquo obidvoma farbami jednaacute sa o heterozygota

Obr 20 Určenie genotypu metoacutedou alelovej diskriminaacutecie ndash amplifikačnaacute krivka vzoriek DNA majuacutecich tri rocirczne genotypy A ndash jednotliveacute vzorky (plnaacute čiara predstavuje štandardnuacute alelu guličkovanaacute mutovanuacute alelu) B ndash 72 vzoriek C ndash scatter plot 72 vzoriek

Určenie genotypu analyacutezou krivky topenia tzv high resolution melt (HRM) (obr 21) umožňuje detekciu takmer všetkyacutech genetickyacutech variaacuteciiacute (SNP mutaacuteciiacute) Keďže taacuteto metoacuteda okrem štandardnyacutech podmienok reakcie vyžaduje len primery a farbičku (nie proacuteby) je veľmi jednoduchaacute a lacnejšia Po amplifikaacuteciiacute treba amplikoacuten pomaly zohrievať až kyacutem nedocircjde k denaturaacuteciiacute Teplota topenia amplikoacutenu vo vzorke zaacutevisiacute od DNA sekvencie čo umožňuje detegovať priacutetomnosť mutaacutecie resp SNP Tvar vyacuteslednyacutech kriviek topenia určuje teda genotyp

22

Obr 21 Určenie genotypu analyacutezou krivky topenia tzv metoacutedou high resolution melting (HRM) A ndash krivka topenia vzoriek DNA majuacutecich tri rocirczne genotypy B ndash graf rozdielnosti krivky topenia vzoriek DNA majuacutecich tri rocirczne genotypy

23

4 Elektroforetickaacute separaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten

Separaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten predstavuje rozdelenie molekuacutel DNA alebo RNA na zaacuteklade veľkosti zloženia a poradia baacutez Podobnyacutemi metoacutedami je možneacute separovať aj proteiacuteny

Elektroforeacuteza (ELFO) je technika použiacutevanaacute na separaacuteciu niekedy aj purifikaacuteciu makromolekuacutel ako suacute nukleoveacute kyseliny a proteiacuteny na zaacuteklade ich rozdielnej veľkosti naacuteboja alebo konformaacutecie Je to metoacuteda veľmi často využiacutevanaacute nielen v molekulovej genetike ale aj biocheacutemii Elektroforeacuteza využiacuteva schopnosť nabityacutech molekuacutel migrovať v jednosmernom elektrickom poli k opačneacutemu poacutelu Nukleoveacute kyseliny majuacute vďaka svojej fosfaacutetovej zložke negatiacutevny naacuteboj preto v jednosmernom elektrickom poli migrujuacute ku kladneacutemu poacutelu čiže k anoacutede Elektroforeacuteza prebieha v elektroforetickej aparatuacutere v geacuteloch (v nosiči) so sieťovitou štruktuacuterou ktoraacute umožňuje separaacuteciu molekuacutel Vzorka nukleovej kyseliny zmiešanaacute s tzv nanaacutešaciacutem tlmivyacutem roztokom s farbičkou sa nanesie do jamky v geacuteli ktoryacute je umiestnenyacute v elektroforetickej aparatuacutere v priacutetomnosti elektroforetickeacuteho pufra (TAE alebo TBE) (obr 22) Nanaacutešaciacute tlmivyacute roztoknanaacutešacia farbička umožňuje na zaacuteklade migraacutecie farbičky vidieť migraacuteciu vzorky v geacuteli a suacutečasne zvyacutešeniacutem hustoty vo vzorke umožniacute klesnuacuteť vzorke do jamky a tak zabraacuteniť jej vyplaveniu z geacutelu Draacuteha je časť geacutelu ktoryacutem putuje jedna vzorka od katoacutedy k anoacutede V draacutehe sa nachaacutedzajuacute oddeleneacute jednotliveacute fragmenty nukleovyacutech kyseliacuten určityacutech veľkostiacute viditeľneacute vo forme pruacutežkov (angl bands) Intenzita pruacutežku zaacutevisiacute od množstva molekuacutel danej veľkosti je ekvivalentnaacute hmotnosti Na určenie veľkosti fragmentov NK sa do jednej jamky nanesie štandard molekulovyacutech hmotnostiacute (angl ladder) ktoryacute maacute presne definovaneacute veľkosti fragmentov čo umožňuje odhadnuacuteť veľkosť aj hmotnosť neznaacutemych separovanyacutech fragmentov

Obr 22 Elektroforetickaacute separaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten v agaroacutezovom geacuteli (A) a vizualizaacutecia UV svetlom a GelRedtrade (B C)

24

Nukleoveacute kyseliny je možneacute elektroforeticky separovať 1) v geacuteloch agaroacutezovom (horizontaacutelna elektroforeacuteza) (obr 22) a polyakrylamidovom (vertikaacutelna elektroforeacuteza) 2) v špeciaacutelnych lineaacuternych polymeacuteroch kapilaacuternou elektroforeacutezou použitiacutem genetickeacuteho analyzaacutetora (obr 23)

Agaroacuteza je polysacharid ziacuteskanyacute z morskej riasy použiacuteva sa najčastejšie v koncentraacuteciiacute 05-2 čiacutem vyššia koncentraacutecia tyacutem je geacutel pevnejšiacute a schopnejšiacute rozliacutešiť menšie fragmenty NK Priacuteprava je jednoduchaacute odvaacuteži sa potrebneacute množstvo agaroacutezy ktoraacute sa zmieša s tlmivyacutem roztokom (pufrom) rozvariacute sa v mikrovlnnej ruacutere a naleje sa do špeciaacutelnej naacutedoby na vytvaacuteranie geacutelov kyacutem je geacutel tekutyacute vložiacute sa do neho tzv hrebeň na vytvorenie jamiek Agaroacuteza je netoxickaacute V bežnom agaroacutezovom geacuteli v zaacutevislosti od jeho koncentraacutecie je možneacute separovať DNA fragmenty dĺžky 200-50 000 bp Dnes suacute dostupneacute aj špeciaacutelne agaroacutezy napr MetaPhorreg Agarose schopneacute oddeliť fragment DNA dĺžky 20-800bp Separaacutecia v agaroacutezovom geacuteli prebieha v horizontaacutelnej aparatuacutere preto sa nazyacuteva aj horizontaacutelna elektroforeacuteza

Polyakrylamidovyacute geacutel (PAGE) vznikaacute polymerizaacuteciou akrylamidu v priacutetomnosti špeciaacutelnych chemickyacutech laacutetok (peroxodisiacuteran amoacutenny TEMED bisakrylamid) Jeho priacuteprava je preto odlišnaacute a aj naacuteročnejšia Polyakrylamidoveacute geacutely majuacute vysokuacute rozlišovaciu schopnosť (1bp) preto suacute PAGE geacutely vhodneacute aj na sekvenovanie DNA klasickyacutemi metoacutedami PAGE geacutel nie je vhodnyacute na separaacuteciu fragmentov dlhšiacutech ako 2kb Použiacuteva sa v koncentraacutecii 35 -20 s rozliacutešeniacutem fragmentov od 10bp-2000bp Akrylamid je neurotoxiacuten musiacute sa s niacutem pracovať veľmi opatrne PAGE elektroforeacuteza bežiacute vo vertikaacutelnej aparatuacutere preto sa volaacute aj vertikaacutelna elektroforeacuteza použiacuteva sa často aj na separaacuteciu proteiacutenov

Ryacutechlosť pohybu nukleovyacutech kyseliacuten (mobilita) určuje viacero faktorov 1) veľkosť NK ndash počet baacutezovyacutech paacuterov resp baacutez pričom menšie molekuly prechaacutedzajuacute geacutelom ryacutechlejšie pretože sa ľahšie pohybujuacute v geacuteli 2) konformaacutecia nukleovej kyseliny napr u rovnako veľkyacutech plazmidov kondenzovaneacute superšpiralizovaneacute plazmidy migrujuacute najryacutechlejšie rovnako veľkeacute lineaacuterne molekuly (toho isteacuteho plazmidu) bežia pomalšie a najpomalšie putujuacute relaxovaneacute kruhoveacute molekuly plazmidu 3) koncentraacutecia geacutelu určuje jeho rozlišovaciu schopnosť koncentrovanejšiacute geacutel je schopnyacute separovať kratšie fragmenty NK redšie geacutely suacute vhodneacute pre rozliacutešenie vaumlčšiacutech fragmentov 4) zloženie geacutelu je docircležiteacute pri analyacuteze sekundaacuternych štruktuacuter NK a proteiacutenov v nedenaturovanom stave sekundaacuterna štruktuacutera spomaľuje migraacuteciu NK a proteiacutenov Tento fakt využiacutevajuacute niektoreacute diagnostickeacute techniky (napr SSCP - Single Strand Conformation Polymorphism - polymorfismus konformaacutecie jednovlaacuteknovej DNA) umožňujuacutece detekciu zaacutemeny jedinej baacutezy ktoraacute spocircsobiacute odlišneacute vnuacutetromolekuloveacute paacuterovanie a vyacuteslednuacute konformaacuteciu molekuly Geacutely mocircžu teda byť denaturačneacute a nedenaturačneacute (natiacutevne) 5) napaumltie zdroja - čiacutem vyššie je napaumltie ktoreacute vytvaacutera elektrickeacute pole v elektroforetickej aparatuacutere tyacutem ryacutechlejšie fragmenty NK migrujuacute 6) zloženie roztokov a teploty

Elektroforetickyacute tlmivyacute roztok (pufor - elektrolyt) zabezpečuje stabilneacute elektroforetickeacute podmienky počas separaacutecie geacutel je v ňom ponorenyacute Obsahuje ioacuteny čo umožňuje vedenie elektrickeacuteho pruacutedu

Štandard molekulovyacutech hmotnostiacute (v laboratoacuteriaacutech nazyacutevanyacute ladder alebo marker) je zmes fragmentov DNA alebo RNA s presne definovanou veľkosťou ktoryacute sluacuteži na odhad veľkosti vyšetrovanyacutech fragmentov NK (obr 22) Pomocou špeciaacutelnych štandardov molekulovyacutech hmotnostiacute ktoryacutech fragmenty NK majuacute definovanuacute aj hmotnosť je možneacute odhadnuacuteť množstvo (hmotnosť - koncentraacuteciu) neznaacutemeho fragmentu

B C

25

41 Vizualizaacutecia DNA

Samotnaacute nukleovaacute kyselina je počas elektroforetickej separaacutecie neviditeľnaacute Vizualizaacuteciu NK umožňujuacute interkalačneacute činidlaacute ktoreacute suacute schopneacute naviazať sa na molekuly NK tyacutem že sa včlenia medzi susediace baacutezy Po ožiareniacute UV svetlom interkalačneacute činidlaacute naviazaneacute na NK fluoreskujuacute tak sa vizualizuje NK čiacutem intenziacutevnejšie fluoreskuje tyacutem viac NK je v geacutelipruacutežku priacutetomneacute Interkalačneacute činidlo sa buď primieša do geacutelu pri jeho priacuteprave čo umožniacute sledovať migraacuteciu fragmentov NK počas elektroforeacutezy a to po vybratiacute z ELFO aparatuacutery a po ožiareniacute UV svetlom alebo sa geacutel farbiacute po elektroforetickej separaacutecii V minulosti bol na zviditeľnenie NK najčastejšie použiacutevanyacute etidiumbromid kvocircli jeho mutageacutennym vlastnostiam sa v suacutečasnosti nahraacutedza menej mutageacutennymi a netoxickyacutemi činidlami ako suacute napr komerčne dostupneacute SYBRregSafe GelRedtrade GelGreentrade

Kapilaacuterna elektroforeacuteza NK prebieha v špeciaacutelnom priacutestroji genetickom analyzaacutetore (obr 23) ktoryacute musiacute mať zaacutekladneacute komponenty ako suacute elektroacutedy kapilaacutera zdroj vysokeacuteho napaumltia detektor prepojenie s počiacutetačom a softveacuteroveacute vybavenie priestor na vloženie vzoriek atď Genetickyacute analyzaacutetor predstavuje automatizovanyacute systeacutem umožňujuacuteci sekvenovanie určovanie dĺžky DNA fragmentov ndash fragmentačnuacute analyacutezu a kvantifikaacuteciu nukleovyacutech kyseliacuten V novšiacutech typoch genetickeacuteho analyzaacutetora je proces analyacutezy od vloženia vzoriek do stojana automatizovanyacute

Vzorka určenaacute na analyacutezu je elektrokineticky injektovanaacute do tenkej kapilaacutery naplnenej lineaacuternym polymeacuterom Vplyvom vysokeacuteho napaumltia sa negatiacutevne nabiteacute fragmenty DNA pohybujuacute v polymeacuteri k pozitiacutevne nabitej elektroacutede Kapilaacuterna elektroforeacuteza je tak citlivaacute že je schopnaacute detegovať jednobaacutezovyacute rozdiel DNA fragmentov DNA fragmenty musia byť pred kapilaacuternou elektroforeacutezou fluorescenčne označeneacute v kapilaacutere suacute separovaneacute na zaacuteklade veľkosti Kraacutetko pred dosiahnutiacutem kladne nabitej elektroacutedy docircjde po excitaacutecii laserovyacutem žiareniacutem k emisii žiarenia fluoroformi (farbičkami) tak že optickyacute detekčnyacute systeacutem zaznamenaacute fluorescenciu ktoraacute je naacutesledne softveacuterovo spracovanaacute a vyhodnotenaacute

Obr 23 Genetickyacute analyzaacutetor

42 RFLP

Metoacuteda polymorfizmu dĺžky restrik čnyacutech fragmentov (angl Restriction Fragment Length Polymorfism) bola prvou metoacutedou využiacutevanou na detekciu DNA variaacuteciiacute rocircznych biologickyacutech vzoriek Princiacutep metoacutedy spočiacuteva v priacutetomnosti polymorfizmov v DNA sekvencii rocircznych ľudiacute ktoreacute zapriacutečinia rozdielny profil (obrazec) DNA fragmentov po štiepeniacute jednou alebo viaceryacutemi restrikčnyacutemi endonukleaacutezami Restrikčneacute endonukleaacutezy (RE) suacute enzyacutemy ktoreacute štiepia DNA molekulu v oblasti špecifickej nukleotidovej sekvencie nazyacutevanej restrik čneacute miesto RE najčastejšie rozpoznaacutevajuacute a štiepia miesto veľkeacute 4-6 baacutez RE suacute priacutetomneacute u prokaryotov (bakteacuterie a archebakteacuterie) kde suacute suacutečasťou restrik čno-modifikačneacuteho systeacutemu akoby prokaryotickeacutej vrodenej imunity sluacutežia

26

na ochranu pred cudzou DNA (napr viacuterusovou) ktoruacute po rozpoznaniacute špecifickej sekvencie štiepia

Restrikčno-modifikačnyacute systeacutem maacute dve zložky 1) modifikačneacute enzyacutemy - metylaacutezy ktoreacute procesom metylaacutecie modifikujuacute určiteacute baacutezy svojej DNA čiacutem ich označia za vlastnuacute DNA takže takaacuteto DNA je potom rezistentnaacute voči štiepeniu restrikčnyacutemi endonukleaacutezami Najčastejšiacutem spocircsobom metylaacutecie u bakteacuteriiacute je metylaacutecia adeniacutenu na N6 pričom vznikne metyladeniacuten alebo cytoziacutenu na C5 metylcytoziacuten 2) restrikčneacute endonukleaacutezy štiepia špecifickeacute miesto dvojvlaacuteknovej DNA ktoreacute je tvoreneacute symetrickou sekvenciou zrkadlovo sa opakujuacutecich nukleotidov ndash tzv palindroacutem Restrikčneacute enzyacutemy sa použiacutevajuacute na štiepenie DNA sekvencie na mieste špecifickom pre tuacute ktoruacute restrikčnuacute endonukleaacutezu napr pri analyacuteze polymorfizmov dĺžky restrikčnyacutech fragmentov (RFLP) analyacuteze jednonukleotidovyacutech polymorfizmov (SNP) mutaacuteciiacute ako aj pri klonovaniacute DNA do vhodnyacutech vektorovyacutech DNA molekuacutel

Po štiepeniacute dvojvlaacuteknovej DNA restrikčnou endonukleaacutezou mocircžu vzniknuacuteť tri typy koncov - 5´-prečnievajuacutece konce (lepiveacute) 3´-prečnievajuacutece konce (lepiveacute) a tupeacute konce (obr 24)

Obr 24 Restrikčneacute štiepenie zanechaacutevajuacutece rocirczne konce tupeacute a lepiveacute

Restrikčneacute štiepenie je často použiacutevanou metoacutedou geacutenovyacutech manipulaacuteciiacute na konštrukciu

hybridnyacutech molekuacutel DNA s naacuteslednyacutem klonovaniacutem Priebeh RFLP analyacutezy je nasledovnyacute restrikčnaacute endonukleaacuteza sa pridaacute k DNA a zmes sa vo

vhodnyacutech reakčnyacutech podmienkach (pufor teplota) inkubuje niekoľko hodiacuten Počas inkubaacutecie docircjde k štiepeniu DNA na špecifickyacutech miestach DNA je potom elektroforeticky separovanaacute v geacuteli a naacutesledne vizualizovanaacute V minulosti po geacutelovej elektroforeacuteze nasledoval Southern blot (čiže prenos separovanyacutech fragmentov DNA z geacutelu na špeciaacutelnu membraacutenu) (obr 35) po ktorom nastala vizualizaacutecia raacutedioaktiacutevne značenou proacutebou V suacutečasnosti sa kvocircli praacutecnosti a zdravotnyacutem rizikaacutem od Southern blotu upuacutešťa a prechaacutedza sa na ryacutechlejšie menej praacutecne a zdravotne šetrnejšie metoacutedy priateľskejšie aj k životneacutemu prostrediu

RFLP bola prvou metoacutedou použiacutevanou na zistenie DNA profilu (DNA fingerprinting) mapovanie geacutenov zapriacutečiňujuacutece genetickeacute ochorenia a testovanie otcovstva Vaumlčšina RFLP markerov je vysoko lokusovo špecifickyacutech a kodominantnyacutech (obidve alely suacute detekovaneacute u heterozygota)

PCR-RFLP je laboratoacuterne priacutestupnejšia metoacuteda molekulaacuterno-genetickej diagnostiky keďže PCR umožňuje amplifikaacuteciu veľmi malyacutech množstiev DNA Alternatiacutevny naacutezov použiacutevanyacute v literatuacutere je CAPS z angl Cleaved Amplified Polymorphic Sequence assay Použitiacutem špecifickyacutech primerov docircjde PCR metoacutedou k amplifikaacutecii požadovaneacuteho uacuteseku DNA ten sa potom štiepi restrikčnou endonukleaacutezou vo vhodnyacutech podmienkach naacutesledne sa štiepne produkty elektroforeticky separujuacute a vizualizujuacute použitiacutem interkalačnyacutech farbiacutev a UV svetla (obr 25)

27

Obr 25 Princiacutep metoacutedy PCR-RFLP

43 VNTR a STR V geacutenome suacute priacutetomneacute dva typy tandemovyacutech (za sebou nasledujuacutecich) opakovaniacute

1) minisatelity ndash nazyacutevaneacute variabilnyacute počet tandemovyacutech opakovaniacute VNTR (variable number of tandem repeats) 2) mikrosatelity tiež kraacutetke tandemoveacute repetiacutecie STR (short tandem repeats)

Obidva tieto typy satelitnej DNA suacute rozmiestneneacute po celom genoacuteme suacute využiacutevaneacute hlavne vo forenznej genetike na identifikaacuteciu osocircb a určenie otcovstva popriacutepade materstva ale aj v mediciacutene na detekciu chromozoacutemovyacutech aneuploidiiacute Štruktuacutera obidvoch je podobnaacute Rozdiel medzi jednotlivyacutemi alelami je spocircsobenyacute rozdielnym počtom opakovaniacute opakujuacutecej sa sekvencie (motiacutevu) čo spocircsobiacute rocircznu dĺžku alel s rocircznym počtom tandemovyacutech opakovaniacute nazyacutevanuacute polymorfizmus dĺžky fragmentov

VNTR ndash variabilnyacute počet tandemovyacutech opakovaniacute pričom opakujuacuteca sa sekvencia maacute dĺžku od 6 do 100 baacutez pričom sa mocircže opakovať aj tisiacutece kraacutet alely tak mocircžu mať od 500do 30 000 baacutez VNTR boli v kombinaacutecii s RFLP (DNA fingerprinting ) prvyacutem polymorfizmom použiacutevanyacutem na zistenie DNA profilov a identifikaacuteciu osocircb v kriminalistickej praxi V suacutečasnosti jeho využitie v kriminalistike je kvocircli potrebe relatiacutevne veľkeacuteho množstva DNA nahradeneacute využitiacutem STR

STR - kraacutetke tandemoveacute repetiacutecie suacute v kriminalistike najčastejšie použiacutevanyacutem polymorfizmom STR lokusy suacute rozmiestneneacute po celom genoacuteme repetiacutecia obsahuje jednu až šesť baacutez pričom jej opakovaniacutem vznikne STR v rozsahu od 50 do 300bp V našom genoacuteme suacute tisiacutece STR ktoreacute mocircžu byť použiteacute pre forenznuacute analyacutezu V kriminalistike sa v suacutečasnosti na identifikaacuteciu osocircb použiacuteva 13 STR locusov ktoreacute patria k medzinaacuterodne uznaacutevanyacutem štandardom Z iniciatiacutevy FBI bola vytvorenaacute databaacuteza CODIS (Combined DNA Index System) každaacute krajina maacute svoju databaacutezu CODIS kde je možneacute vložiť a archivovať DNA profily jednotlivcov ako aj profily DNA ziacuteskanyacutech z miest kriminaacutelneho činu v databaacuteze je ich možneacute navzaacutejom porovnať a tak zistiť pocircvodcu trestneacuteho činu Medzinaacuterodnaacute jednotnosť v použiacutevaniacute CODIS STR lokusov umožňuje v priacutepade potreby vzaacutejomneacute porovnanie DNA profilov zistenyacutech na uacutezemiacute rocircznych štaacutetov CODIS STR lokusov je 13 a suacute to CSF1PO FGA TH01 TPOX VWA D3S1358 D5S818 D7S820 D8S1179 D13S317 D16S539 D18S51 a D21S11 Zistenie DNA profilu sa uskutočniacute multiplexnou PCR reakciou s fluorescenčne značenyacutemi primermi špecifickyacutemi pre konkreacutetny STR Naacutesledne suacute PCR produkty analyzovaneacute kapilaacuternou elektroforeacutezou genetickyacutem analyzaacutetorom ktoryacute rozliacuteši amplifikovaneacute fragmenty na zaacuteklade fluorescencie a dĺžky (fragmentačnaacute analyacuteza) (obr 26 Tab 3) DNA profil každeacuteho človeka je jedinečnyacute rovnakyacute profil mocircžu mať len jednovaječneacute dvojčataacute

28

Obr 26 Ukaacutežka DNA profilu človeka 15 STR lokusov s určeniacutem pohlavia pomocou lokusu pre amelogeniacuten (ženskeacute pohlavie - XX) maleacute oranžoveacute piacuteky predstavujuacute fragmenty veľkostneacuteho štandardu Tabuľka č 3 Zaacutepis DNA profilu človeka z obraacutezka č 26 15 STR lokusov s určeniacutem pohlavia pomocou lokusu pre amelogeniacuten System Alela 1 Alela 2

D3S1358 16 17

TH01 9 93 D21S11 28 28

D18S51 15 18

Penta E 7 14 D5S818 9 12

D13S317 8 11

D7S820 8 11 D16S539 11 12

CSF1PO 10 11

Penta D 11 12 vWA 15 18

D8S1179 13 16

TPOX 8 9 FGA 20 21

amel X X

29

5 MLPA

Multiplexnaacute amplifikaacutecia proacuteb zaacutevislaacute od ligaacutecie (z angl multiplex ligation-dependent probe amplification) je metoacuteda schopnaacute v jednej reakcii (v jednej skuacutemavke a vzorke) detegovať zmeny v počte až 50 nukleotidovyacutech sekvenciiacute Metoacutedou MLPA je možneacute ryacutechlo identifikovať amplifikaacutecie (duplikaacutecie) a deleacutecie veľkeacuteho počtu geacutenov či už použitiacutem DNA alebo mRNA krvnyacutech vzoriek alebo vzoriek z naacutedorov

Princiacutep MLPA spočiacuteva v multiplexnej amplifikaacutecii 50 špecifickyacutech nukleotidovyacutech sekvenciiacute použitiacutem jedneacuteho paacuteru primerov pričom jeden primer je fluorescenčne označenyacute Vyacutesledneacute PCR produkty suacute analyzovaneacute kapilaacuternou elektroforeacutezou (fragmentačnaacute analyacuteza) Dĺžka každeacuteho namnoženeacuteho produktu je jedinečnaacute narastaacute postupne o 6 alebo 9 nukleotidov pričom produkty PCR suacute 120 ndash 500 nukleotidov dlheacute Tento veľkostnyacute rozsah PCR fragmentov (dĺžka 120-500 nukleotidov s naacuterastom postupne o 6 alebo 9 nukleotidov) je optimaacutelny pre kapilaacuternu elektroforeacutezu MLPA multiplexnaacute PCR prebieha za použitia iba jedineacuteho paacuteru primerov ktoreacute amplifikujuacute špecifickeacute sekvencie Trik spočiacuteva v tom že nedochaacutedza k amplifikaacutecii DNA sekvencie ale MLPA proacuteb ktoreacute suacute pridaneacute k vzorkaacutem Každaacute MLPA proacuteba pozostaacuteva z dvoch oligonukleotidov (dve hemiproacuteby) pričom každyacute oligonukleotid obsahuje jednu zo sekvencie rozpoznaacutevanuacute PCR primermi Proacuteba vznikne jedine za predpokladu hybridizaacutecie dvoch oligonukleotidov (hemiproacuteb) k cieľovej sekvencii (geacutenu) a po ligaacutecii enzyacutemom ligaacutezou Iba ligovaneacute proacuteby suacute exponenciaacutelne amplifikovaneacute pomocou jedneacuteho paacuteru primerov Množstvo zligovanyacutech proacuteb teda zaacutevisiacute od množstva cieľovyacutech sekvenciiacute (geacutenov) vo vzorke

Postup MLPA analyacutezy je nasledovnyacute (obr27) K vzorke nukleovej kyseliny (DNA resp mRNA) sa pridaacute zmes 50 jedinečnyacutech proacuteb každaacute

proacuteba je komplementaacuterna k určitej cieľovej sekvencii NK vzorky Každaacute proacuteba však pozostaacuteva z dvoch oligonukleotidov hybridizujuacutecich vedľa seba zaacuteroveň každyacute oligonukleotid (hemiproacuteba) obsahuje pridanuacute sekvenciu rozpoznaacutevanuacute paacuterom PCR primerov Po hybridizaacuteciiacute oligonukleotidov (hemiproacuteb) dochaacutedza k ich ligaacutecii ligaacutezou Ligačnaacute reakcia je tak špecifickaacute že je schopnaacute rozliacutešiť sekvenciu liacutešiacu sa v jednom nukleotide Vyacuteslednyacute ligačnyacute produkt (proacuteba) obsahuje obidve sekvencie pre PCR primery na jednom fragmente čiže mocircže docircjsť k namnoženiu takeacutehoto fragmentu PCR reakciou V priacutepade ak nedocircjde k ligaacutecii priacuteslušnyacutech hemiproacuteb pretože hemiproacuteby nenaacutejdu cieľovuacute sekvenciu na DNA každaacute takaacuteto nezligovanaacute hemiproacuteba maacute len jednu sekvenciu rozpoznaacutevanuacute len jednyacutem PCR primerom v docircsledku čoho nemocircže prebehnuacuteť jej PCR amplifikaacutecia a počas fragmentačnej analyacutezy nie je detegovanaacute pretože negeneruje fluorescenčnyacute signaacutel

Pri MLPA analyacuteze je docircležiteacute okrem MLPA amplifikaacutecie vzorky urobiť aj MLPA amplifikaacuteciu referenčnej vzorky ku ktorej sa bude porovnaacutevať počet geacutenov (cieľovyacutech sekvenciiacute) Po kapilaacuternej elektroforeacuteze MLPA referenčnej a skuacutemanej vzorky porovnaniacutem obsahu nameranyacutech hodnocirct tzv piacutekov priacuteslušnyacutech proacuteb sa určiacute relatiacutevny počet koacutepiiacute v skuacutemanej vzorke

MLPA

1 DNA denaturaacutecia a hybridizaacutecia s MLPA proacutebami (hemiproacuteby)

2 Ligaacutecia (vytvorenie kompletnyacutech proacuteb)

3 PCR amplifikaacutecia proacuteb paacuterom primerov

4 Kapilaacuterna elektroforetickaacute separaacutecia PCR produktov

5 Analyacuteza daacutet

30

Obr 27 Princiacutep MLPA

Firma MRC-Holland v suacutečasnosti ponuacuteka stovky MLPA setov proacuteb ktoreacute suacute vhodneacute na 1) diagnostiku kongenitaacutelnych a dedičnyacutech ochoreniacute 2) zisťovanie profilu naacutedorov 3) zisťovanie metylačneacuteho profilu

MLPA je metoacuteda vhodnaacute na detekciu malyacutech prestavieb (BRCA1 BRCA2 MSH2 atď)

veľkyacutech chromozoacutemovyacutech prestavieb (Williamsov syndroacutem Prader-WilliAngelman syndroacutem atzď)

31

detekciu zmien v počte koacutepii geacutenov (obr 28 29) ako aj zistenie počtu kompletnyacutech chromozoacutemov (chromozoacutem 13 18 21 XY tiež aj z amniovej tekutiny) diagnostiku naacutedorov (zmeny počtu pri ALL CLL atď) kvantifikaacuteciu metylaacutecie (Prader-WilliAngelmanov syndroacutem Fragilnyacute X inaktivaacutecia naacutedorovyacutech supresorovyacutech geacutenov atď) mRNA analyacutezu geacutenov zuacutečastňujuacutecich sa apoptoacutezy alebo zaacutepalov

MS-MLPA (Methylation-Specific MLPA) je varianta MLPA určenaacute špeciaacutelne na analyacutezu aberantnyacutech metylaacutecii imprintovanyacutech oblastiacute ako aj detekciu metylačnyacutech zmien CpG ostrovčekov lokalizovanyacutech bliacutezko promoacutetora Rozdiel oproti štandardnej MLPA spočiacuteva v použitiacute metylačne senzitiacutevneho restrikčneacuteho enzyacutemu HhaI ktoryacute štiepi MS-MLPA proacuteby hybridizovaneacute k nemetylovanej sekvencii Každaacute DNA vzorka určenaacute pre MS-MLPA analyacutezu prejde dvoma reakciami v jednej mikroskuacutemavke štandardnou MLPA analyacutezou (bez štiepenia metylačne senzitiacutevnym enzyacutemom) a v druhej mikroskuacutemavke docircjde okrem ligaacutecie proacuteb aj k metylačne senzitiacutevnemu štiepeniu hybridizovanyacutech proacuteb s nemetylovanou DNA Amplifikujuacute sa len ligovaneacute proacuteby po PCR amplifikaacutecii sa fragmentačnou analyacutezou porovnaniacutem oboch reakciiacute zistia rozdiely v metylačnom profile vzorky k referenčnej vzorke

RT-MLPA (Reverse Transkriptase MLPA) je variaacutecia MLPA určenaacute pre zistenie mRNA profilu vzorky je alternatiacutevou k real-time PCR a mikročipom RT-MLPA nedeteguje mRNA množstvo priamo pretože použiacutevanaacute ligaacuteza nie je schopnaacute ligovať DNA oligonukleotidy keď suacute hybridizovaneacute s RNA Preto RT-MLPA začiacutena reverznou transkripciou so špeciaacutelne navrhnutyacutemi RT primermi tak aby vytvorili kraacutetke oligonukleotidy (cDNA) Potom reakcia pokračuje ako štandardnaacute MLPA

Obr 28 MLPA analyacuteza geacutenu DMD (koacutedujuacuteceho dystrofiacuten) mutaacutecie ktoreacuteho spocircsobujuacute Duchennovu svalovuacute dystrofiu u pacienta je priacutetomnaacute deleacutecia exoacutenu 45 v porovnaniacute s referenčnou vzorkou ndash kontrolou

32

Obr 29 MLPA analyacuteza geacutenu DMD (koacutedujuacuteceho dystrofiacuten) mutaacutecie ktoreacuteho spocircsobujuacute Duchennovu svalovuacute dystrofiu u pacienta suacute priacutetomneacute duplikaacutecie exoacutenov 41 42 43 44 45 (piacuteky vo vzorke pacienta sa porovnajuacute s piacutekmi v kontrole ndash referenčnej vzorke)

33

6 Sekvenovanie

Sekvenovaniacutem rozumieme určenie primaacuternej štruktuacutery DNA teda určenie poradia nukleotidov v reťazci DNA Začiatky moderneacuteho sekvenovania siahajuacute do roku 1977 kedy boli objaveneacute dve metoacutedy sekvenovania 1) chemickaacute metoacuteda Maxama a Gilberta 2) enzymatickaacute metoacuteda Sangera Nicklena a Coulsona

Princiacutep obidvoch metoacuted sekvenovania spočiacuteva v tom že sa vytvoriacute suacutebor DNA molekuacutel s rocircznou veľkosťou ktoreacute suacute zakončeneacute konkreacutetnym nukleotidom tieto DNA molekuly sa elektroforeticky separujuacute v geacuteloch s rozlišovacou schopnosťou 1 nukleotid 61 Chemickaacute metoacuteda

DNA molekuly sa na 5-konci raacutedioaktiacutevne označia raacutedioaktiacutevnym fosforom a naacutesledne sa chemicky modifikujuacute špecificky pre každuacute baacutezu DNA sa potom v modifikovanyacutech miestach štiepi čiacutem vzniknuacute rocirczne dlheacute fragmenty pričom podmienky suacute nastaveneacute tak aby sa DNA na každom mieste štiepila len raz Modifikaacutecia DNA a štiepenie prebehne v štyroch separaacutetnych reakciaacutech (skuacutemavkaacutech) takže po elektroforetickej separaacuteciiacute takto opracovanej DNA v štyroch draacutehach polyakrylamidoveacuteho geacutelu a naacuteslednej autoraacutediografii (podobne ako pri Southernovej hybridizaacutecii) je možneacute odčiacutetať nukleotidovuacute sekvenciu približne 100 nukleotidov od raacutedioaktiacutevneho označenia (v čase objavu Maxama a Gilberta) 62 Sangerova metoacuteda

Zaacuteklady metoacutedy boli popiacutesaneacute už v roku 1975 (metoacuteda plus a miacutenus) ale až vylepšenie použitiacutem dideoxynukleotidov (ddNTP) v roku 1977 došlo k zjednodušeniu sekvenovania Princiacutepom enzyacutemoveacuteho sekvenovania je terminaacutecia (zastavenie) polymerizaacutecie inkorporaacuteciou 2´ 3 -dideoxynukleotidov do novosyntetizujuacuteceho sa vlaacutekna DNA Keďže ddNTP neobsahujuacute hydroxylovuacute skupinu na 3 uhliacuteku riboacutezy nemocircžu sa zuacutečastniť na tvorbe fosfodiesterovej vaumlzby nemocircže sa pripojiť k nim ďalšiacute nukleotid čiže musiacute docircjsť k terminaacuteciiacute polymeraacutecie Reakcia prebieha v štyroch skuacutemavkaacutech s raacutedioaktiacutevne značenyacutem primerom V každej skuacutemavke suacute priacutetomneacute všetky štyri deoxynukleotidtrifosfaacutety (dNTP) ale pre každuacute skuacutemavku je špecifickyacute priacutedavok maleacuteho množstva jedneacuteho z dideoxynukleotidtrifosfaacutetov (v prvej skuacutemavke je ddATP v druhej ddCTP v tretej ddTTP a vo štvrtej ddGTP) Maleacute množstvo ddNTP spocircsobiacute že pri polymerizaacutecii dochaacutedza k prednostneacutemu zaradeniu štandardnyacutech dNTP do narastajuacuteceho reťazca a len občas sa inkorporuje ddNTP čiacutem sa zastaviacute synteacuteza reťazca V každej skuacutemavke tak vznikne suacutebor DNA fragmentov rocircznych veľkostiacute zakončenyacutech priacuteslušnyacutem ddNTP (v prvej skuacutemavke ddATP v druhej ddCTP v tretej ddTTP a vo štvrtej ddGTP) Po elektroforetickej separaacutecii v 4 draacutehach polyakrylamidoveacuteho geacutelu a autoraacutediografii sa z autoraacutediogramu odčiacuteta sekvencia

V suacutečasnosti je sekvenovanie do značnej miery automatizovaneacute pričom využiacuteva princiacutep Sangerovej enzyacutemovej metoacutedy s určityacutemi obmenami Uacutesek DNA ktoryacute treba sekvenovať sa prostredniacutectvom termostabilnyacutech DNA polymeraacutez namnožiacute PCR metoacutedou po ktorej nasleduje sekvenačnaacute reakcia (asymetrickaacute PCR) s fluorescenčne značenyacutemi ddNTP (každyacute druh označenyacute inyacutem fluorescenčnyacutem farbivom) Sekvenačnaacute reakcia prebieha v jednej skuacutemavke s jednyacutem primerom vznikne tak suacutebor jednovlaacuteknovyacutech DNA rocircznej dĺžky ktoreacute suacute na 3konci označeneacute ddNTP so špecifickyacutem fluorescenčnyacutem farbivom Taacuteto metoacuteda sekvenovania sa tiež nazyacuteva rdquodye-terminator cycle sequencingrdquo(obr 30) Po kapilaacuternej elektroforeacuteze vzorky v genetickom analyzaacutetore zaznamenaacutevaniacute fluorescencie jednotlivyacutech fragmentov CCD kamerou a softveacuterovom spracovaniacute sa ziacuteska sekvencia DNA (obr 31)

34

Obr 30 Princiacutep sekvenovania Sangerova dideoxy metoacuteda alebo tzv chain termination method (reťazec zastavujuacuteca metoacuteda) Obr 31 Určenie genotypu plodu a rodičov sekvenčnou analyacutezou DNA ziacuteskanej z plodovej vody (prenataacutelna diagnostika) a perifeacuternej krvi sekvenčnaacute analyacuteza geacutenu ASPA vyacutesledok u plodu priacutetomnaacute mutaacutecia c 914CgtA v homozygotnom stave (AA) rodičia heterozygoti (AC) Uvedenaacute mutaacutecia je v homozygotnom stave kauzaacutelnou priacutečinou Canavanovej choroby

Automatizovaneacute sekvenovanie prinaacuteša viacereacute vyacutehody oproti klasickej Sangerovej metoacutede vyššiu presnosť a ryacutechlosť v jednej sekvenačnej reakcii možnosť osekvenovať až 1200 nukleotidovyacute fragment maleacute množstvo templaacutetu potrebneacute na analyacutezu

35

63 Next Generation Sequencing (NGS)

NGS (sekvenovanie novej generaacutecie) maacute obrovskyacute potenciaacutel v analyacuteze genoacutemov pričom toto označenie zahŕňa viacereacute technologickeacute metoacutedy reprezentovaneacute niekoľkyacutemi firmami Princiacutepom je masiacutevne paralelneacute sekvenovanie čiacutem sa ziacuteskajuacute raacutedovo tisiacutece až milioacuteny sekvenciiacute naraz 631 Sekvenovanie druhej generaacutecie

Na začiatku sa analyzovanaacute DNA vo vaumlčšine priacutepadov fragmentuje (vznikne tak DNA

knižnica) na fragmenty sa pripoja kraacutetke sekvencie ndash adapteacutery naacutesledne sa tieto fragmenty rocircznymi priacutestupmi amplifikujuacute a určiacute sa ich sekvencia Vďaka čiastočnyacutem prekryvom je zo ziacuteskanyacutech sekvencii možneacute poskladať plynuluacute sekvenciu zodpovedajuacutecu pocircvodnej nefragmentovanej DNA

Pyrosekvenovanie je podobne ako Sangerova metoacuteda založenaacute na princiacutepe synteacutezy komplementaacuterneho vlaacutekna DNA avšak rozdiel je v tom že sa na detekciu inkorporaacutecie nukleotidu využiacuteva inyacute systeacutem tvorby luminiscenčneacuteho signaacutelu v priebehu reakcie Pyrosekvenovanie je umožneneacute vďaka aktivite 4 enzyacutemov - DNA polymeraacutezy ATP sulfurylaacutezy luciferaacutezy a apyraacutezy Reakčnaacute zmes obsahuje aj ďalšie komponenty - enzymatickeacute substraacutety adenoziacutenfosfosulfaacutet (APS) d-luciferiacuten sekvenovanyacute templaacutet a cyklicky postupne po jednom type pridaacutevaneacute nukleotidtrifosfaacutety Po zabudovaniacute nukleotidu do novovznikajuacuteceho reťazca docircjde k uvoľneniu pyrofosfaacutetu naacutesledne je využityacute ATP sulfurylaacutezou na synteacutezu ATP z APS počas ďalšej reakcie docircjde k využitiu ATP luciferaacutezou na premenu luciferiacutenu na oxyluciferiacuten čo spocircsobiacute svetelnyacute signaacutel a ten zaznamenaacute detekčnyacute systeacutem Poslednou enzymatickou reakciou je reakcia apyraacutezy ktoraacute odstraacuteni nezainkorporovaneacute nukleotidy a nevyužiteacute ATP aby sa celyacute proces mohol zopakovať s reakčnou zmesou obsahujuacutecou ďalšiacute nukleotidtrifosfaacutet (inyacute ako v predchaacutedzajuacutecej reakcii) Po každej reakcii detektor zaznamenaacuteva emisiu svetla na zaacuteklade intenzity svetla je možneacute určiť či bol vradenyacute priacuteslušnyacute nukleotidtrifosfaacutet či bol inkorporovanyacute jeden priacutepadne viac rovnakyacutech nukleotidtrifosfaacutetov

Zvyacutešenie vyacutekonu pyrosekvenovania umožnila tzv emulznaacute PCR v mikročasticiach a použitie platničky PicoTiterPlatereg toto sekvenovanie zaviedla firma Roche pod pojmom 454 pyrosekvenovanie v roku 2005 Na začiatku sa DNA fragmentuje na uacuteseky dlheacute 400-600 baacutez dvojvlaacuteknovaacute fragmentovanaacute DNA sa liguje s adapteacutermi prostredniacutectvom nich sa naviaže na mikročastice dvojvlaacuteknoveacute fragmenty sa oddelia mikročastice s naviazanyacutemi jednovlaacuteknovyacutemi fragmentami sa premiešajuacute so zmesou oleja a roztoku ktoryacute obsahuje všetky komponenty na uacutespešnuacute PCR Tyacutemto spocircsobom sa okolo každej mikročastice vytvoriacute vlastnyacute mikroreaktor v ktorom prebehne amplifikaacutecia fragmentu Po PCR reakcii sa mikročastice prenesuacute do platničky PicoTiterPlate v ktorej sa do jamky zmestiacute akuraacutet jedna mikročastica a reakčneacute komponenty pyrosekvenačnej reakcie PicoTiterPlatereg maacute 1 600 000 jamiek každaacute jamka maacute maximaacutelny objem 75 picolitra Platnička s mikročasticami sa vložiacute do sekvenačneacuteho systeacutemu ndash priacutestroja v ktorom sa celeacute pyrosekvenovanie uskutočniacute Chemiluminiscenčneacute signaacutely ktoryacutech počas sekvenovania vznikajuacute milioacuteny v priebehu hodiny suacute zachyteneacute CCD kamerou a analyzovaneacute softveacuterom

Firma Illumina predstavila inuacute technoloacutegiu PCR amplifikaacutecia a sekvenovanie sa uskutočňuje na skliacutečku (flow cell) Fragmentaacutecia DNA a pripojenie adapteacuterov prebieha za uacutečasti transpozoacutemov v procese nazvanom tagmentaacutecia Po hybridizaacutecii fragmentov DNA na skliacutečko prebehne v klastroch PCR amplifikaacutecia (tzv mostiacutekovaacute amplifikaacutecia) sekvenaacutecia prebieha za uacutečasti rozdielne fluorescenčne značenyacutech a chemicky modifikovanyacutech nukleotidov pričom každyacute nukleotid emituje fluorescenciu s inou vlnovou dĺžkou Na skliacutečku prebieha paralelne až 6 miliaacuterd sekvenaacutecii (obr 32)

Ďalšiacutemi možnosťami sekvenovania druhej generaacutecie je systeacutem SOLid (vyvinutyacute firmou Applied Biosystem dnes pod Thermo Fisher Scientific) a Ion Semiconductor Sequencing ndash polovodičoveacute ioacutenoveacute sekvenovanie (od firmy Ion Semiconductor Sequencing v suacutečasnosti Thermo Fisher Scientific)

36

Obr 32 Princiacutep sekvenovania novej generaacutecie od firmy Illumina PCR amplifikaacutecia a sekvenovanie sa uskutočňuje na skliacutečku (flow cell) paralelne prebieha až 6 miliaacuterd sekvenaacutecii

632 Sekvenovanie tretej generaacutecie

Pred sekvenovaniacutem netreba amplifikovať DNA PCR metoacutedou ale sekvencia sa ziacuteskava zachyteniacutem signaacutelu v reaacutelnom čase Medzi sekvenovanie tretej generaacutecie patriacute SMRT (Single Molecule Real-Time Sequencing) a Nanopore Sequencing

37

7 Fragmentačnaacute analyacuteza DNA

Je metoacuteda použiacutevanaacute na určenie veľkosti fragmentov DNA ziacuteskanyacutech PCR reakciou Dĺžka amplifikovanyacutech DNA fragmentov sa zistiacute ich porovnaniacutem s veľkostnyacutem štandardom (obr 33) ktoryacute je tvorenyacute DNA fragmentami znaacutemej dĺžky Veľkostnyacute štandard je pred kapilaacuternou elektroforeacutezou zmiešanyacute so vzorkou DNA fragmenty veľkostneacuteho štandardu suacute fluorescenčne označeneacute pričom použiteacute fluorescenčneacute farbivo je ineacute ako fluorescenčneacute farbivo použiteacute na označenie DNA fragmentov vo vyšetrovanej vzorke

Obr 33 Elektroforetogram veľkostneacuteho štandardu použiacutevaneacuteho na určenie veľkostiacute fragmentov analyzovanyacutech kapilaacuternou elektroforeacutezou v genetickom analyzaacutetore (GeneScantrade 500 LIZtrade dye Size Standard) dĺžka fragmentov v nukleotidoch (napr 50 nukleotidov)

Fragmentačnaacute analyacuteza pozostaacuteva z viaceryacutech krokov Prvyacutem je izolaacutecia DNA nasleduje PCR amplifikaacutecia počas ktorej sa novosyntetizovaneacute DNA fragmenty označia fluorescenčnyacutemi farbivami Vzorka s PCR produktom sa pripraviacute na kapilaacuternu elektroforeacutezu tak že sa zmieša s veľkostnyacutem štandardom (sluacuteži na určenie veľkosti fragmentov) a denaturačnou laacutetkou (formamid) nasleduje denaturaacutecia Pripraveneacute vzorky suacute injektovaneacute do priacutestroja (genetickyacute analyzaacutetor) kde v kapilaacutere naplnenej polymeacuterom v elektrickom poli migrujuacute fluorescenčne značeneacute fragmenty DNA na zaacuteklade veľkosti (kapilaacuterna elektroforeacuteza) Počas elektroforeacutezy genetickyacute analyzaacutetor zaznamenaacuteva fluorescenciu fragmentov Analyacutezou daacutet prostredniacutectvom špeciaacutelnych softveacuterov sa ziacuteskajuacute elektroforetogramy z ktoryacutech je možneacute zistiť veľkosť fragmentov ako aj typ fluorescencie (docircležiteacute ak suacute genetickeacute varianty rozliacutešiteľneacute rocircznou fluorescenciou napr SNaPshot) Fragmentačnaacute analyacuteza je suacutečasťou množstva molekulaacuterno-genetickyacutech metoacuted (pozri obr 12 26 28 29 34) ako suacute napr STR analyacuteza (Short Tandem Repeat) AFLP analyacuteza (Amplified Fragment Lenght Polymorfism) RFLPT-RFLP analyacuteza (Restriction Fragment Lenght PolymorfismTerminal Restricted Fragment Lenght Polymorfism) SSCP (Single Strand Conformation Polymorfism) VNTR (Variable Number of Tandem Repeat) analyacuteza straty heterozygotnosti (LOH loss of heterozygozity) MLPA (Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification) MSMSA (Methylation-Sensitive Mobility Shift Assay) SNP genotypovanie (SNaPshotreg) HiCEP (High-Coverage Expression Profiling)

38

Obr 34 Kvantitatiacutevna fragmentačnaacute PCR analyacuteza (QF-PCR) DNA izolovanej z plodovej vody vyacutesledok prenataacutelnej analyacutezy = priacutetomnosť troch piacutekov pre chromozoacutem 18 (u všetkyacutech fragmentov detegujuacutecich chromozoacutem 18 je pomer vyšetrovanyacutech markerov aberantnyacute 21 resp 111) čo znamenaacute trizoacutemiu chromozoacutemu 18 Edwardsov syndroacutem

39

8 Metoacutedy založeneacute na princiacutepe hybridizaacutecie

Nukleoveacute kyseliny majuacute schopnosť vytvaacuterať dvojvlaacuteknoveacute reťazce z jednovlaacuteknovyacutech molekuacutel na zaacuteklade komplementarity baacutez Komplementarita baacutez umožňuje replikaacuteciu DNA transkripciu RNA komplementarita baacutez zabezpečuje teda reprodukovateľnosť živej hmoty

Hybridizaacutecia je proces v ktorom na zaacuteklade komplementarity baacutez dochaacutedza k vytvoreniu dvojvlaacuteknovej nukleovej kyseliny z dvoch jednovlaacuteknovyacutech molekuacutel DNA alebo RNA alebo ich kombinaacuteciou DNA RNA pričom kratšia jednovlaacuteknovaacute nukleovaacute kyselina vystupuje ako sonda (proacuteba) Hybridizaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten je jeden z najpoužiacutevanejšiacutech naacutestrojov v molekulaacuternej bioloacutegii a genetike (hybridizaacutecia primerov alebo proacuteb sa využiacuteva v takmer každej metoacutede - v PCR RT-PCR qPCR RT-qPCR MLPA sekvenovaniacute fragmentačnej analyacuteze FISH DNA mikročipoch atď)

Denaturaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten je proces pri ktorom dochaacutedza k porušeniu vodiacutekovyacutech vaumlzieb medzi vlaacuteknami nukleovyacutech kyseliacuten (strata sekundaacuternej a terciaacutelnej štruktuacutery) tak že docircjde k ich uacuteplneacutemu oddeleniu vzniknuacute jednovlaacuteknoveacute reťazce Denaturaacutecia NK mocircže byť spocircsobenaacute vplyvom vysokyacutech teplocirct pH alebo chemickyacutech laacutetok (denaturačneacute činidlaacute) Renaturaacutecia je opačnyacute proces v ktorom na zaacuteklade komplementarity dochaacutedza k tvorbe dvojvlaacuteknovyacutech NK

Hybridiza čnaacute sonda (proacuteba) je jednovlaacuteknovaacute nukleovaacute kyselina určitej znaacutemej dĺžky a sekvencie (najčastejšie DNA pretože je stabilnejšia ako RNA) ktoraacute je značenaacute a sluacuteži na detekciu komplementaacuternych molekuacutel DNA alebo RNA v procese hybridizaacutecie V zaacutevislosti od podmienok hybridizaacutecie (stringencia) mocircže byť detegovanaacute sekvencia uacuteplne komplementaacuterna alebo v menej priacutesnych podmienkach mocircže mať sekvenčneacute odchyacutelky Proacuteba sluacuteži na vyhľadanie a zviditeľnenie cieľovyacutech NK Zviditeľnenie sa deje prostredniacutectvom označenia proacuteby ešte pred hybridizaacuteciou Značenie proacuteby mocircže byť raacutedioaktiacutevne a neraacutedioaktiacutevne (najčastejšie fluorescenčneacute)

Raacutedioaktiacutevne značeneacute proacuteby pomocou izotopov (32P) sa využiacutevali viac v minulosti v suacutečasnosti suacute kvocircli zdravotnyacutem rizikaacutem ohľaduplnosti k životneacutemu prostrediu ako aj kvocircli jednoduchšej manipulaacutecii použiacutevaneacute fluorescenčne značeneacute proacuteby Raacutedioaktiacutevne značeneacute sondy boli použiacutevaneacute hlavne metoacutedou Southernovej hybridizaacutecie (Southern blotting Southern blot) Citlivosť raacutedioaktiacutevne značenyacutech proacuteb je vyššia dosahuje schopnosť zachytiť 10 fg (femtogram 10-15) cieľovej DNA sekvencie 81 Southern blot

Metoacutedu objavil v roku 1975 britskyacute bioloacuteg Edwin Southern (preto Southern) Pri Southernovej hybridizaacutecii sa restrikčne štiepeneacute fragmenty DNA elektroforeticky separujuacute v geacuteli potom sa metoacutedou blottingu prenesuacute na nylonovuacute alebo nitroceluloacutezovuacute membraacutenu kde suacute naacutesledne hybridizovaneacute v roztoku obsahujuacutecom raacutedioaktiacutevne značenuacute sondu Priloženiacutem fotografickeacuteho filmu k membraacutene a vyvolaniacutem filmu autoraacutediografiou docircjde k zviditeľneniu lokaliacutet kde došlo k hybridizaacuteciiacute raacutedioaktiacutevne značenej sondy s fragmentom DNA (autoraacutediogram) Southern blot bol kľuacutečovou a prvou metoacutedou na identifikaacuteciu osocircb (DNA fingerprinting DNA pofiling) (obr 35)

Okrem Southern blotu existuje Northern blot na analyacutezu RNA (geacutenovej expresie) a Western blot na analyacutezu proteiacutenov postup je obdobnyacute ako pri Southern blote s obmenami špecifickyacutemi pre konkreacutetny blot Pri Northern blote sa použiacutevajuacute hybridizačneacute proacuteby ale pre vizualizaacuteciu proteiacutenov western blotom je potrebneacute použiť protilaacutetky s naacuteslednou vizualizaacuteciou Pomenovanie techniacutek je hra so sloviacutečkami (keďže paacuten Northern ani Western neobjavili takto nazvaneacute techniky)

Neraacutedioaktiacutevne značenie proacuteb použiacutevanyacutech v molekulaacuternej genetike mocircže byť nepriame (použitie haptenu) alebo priame Konečnaacute vizualizaacutecia je najčastejšie zabezpečenaacute fluoreskujuacutecimi farebnyacutemi značkami farbivami fluorochroacutemami (fluorofoacuterami) Pri priamom značeniacute je farbička kovalentne naviazanaacute na nukleotid a na zachytenie fluorescencie suacute potrebneacute špeciaacutelne priacutestroje umožňujuacutece excitaacuteciu farbičky ktoraacute potom emituje žiarenie určitej vlnovej dĺžky (emisneacute žiarenie) a to zachytiacute detekčnyacute systeacutem priacutestroja Využitie fluorochroacutemov v molekulaacuternej genetike je masiacutevne napr na vizualizaacuteciu NK elektroforeticky separovanyacutech v geacuteli kvantifikaacuteciu produktov PCR reakcie v priacutestroji real-time PCR cykleacuter sekvenovaniacute fragmentačnej analyacuteze FISH DNA mikročipoch atď

40

Obr 35 Princiacutep Southern blotu

82 FISH (fluorescenčnaacute in situ hybridizaacutecia)

FISH (fluorescent in situ hybridization fluorescenčnaacute in situ hybridizaacutecia) metoacuteda patriacute medzi molekulovo-cytogenetickeacute techniky Princiacutep FISH metoacutedy je založenyacute na hybridizaacuteciiacute fluorescenčne značenyacutech proacuteb ku komplementaacuternym uacutesekom vyšetrovanej DNA na podložnom skle (priamo na mieste - in situ) K denaturaacutecii dsDNA dochaacutedza buď vplyvom denaturačnyacutech činidiel alebo zvyacutešenou teplotou a naacuteslednou renaturaacuteciou dochaacutedza k naviazaniu sondy na komplementaacuterny uacutesek DNA Vyacutesledok hybridizaacutecie sa vizualizuje fluorescenčnyacutem mikroskopom vybavenyacutem vhodnyacutemi fluorescenčnyacutemi filtrami a vizuaacutelne zhodnotiacute skuacutesenyacutem odborniacutekom Fluorescencia sa v niektoryacutech priacutepadoch mocircže zaznamenať a hodnotiť aj pomocou softveacuteru (obr 36)

Pomocou FISH detegujeme numerickeacute aberaacutecie - zmeny v počte chromozoacutemov (napr trizoacutemia monozoacutemia chromozoacutemov) alebo štruktuacuterne aberaacutecie a prestavby (napr translokaacutecie inverzie deleacutecie duplikaacutecie amplifikaacutecie) FISH metoacuteda umožňuje identifikaacuteciu a detekciu každeacuteho ľudskeacuteho chromozoacutemu jeho zaradenie do karyotypu odhalenie malyacutech submikroskopickyacutech chromozoacutemovyacutech zmien a tiež mapovať poziacutecie jednotlivyacutech geacutenov na chromozoacuteme

41

Obr 36 Princiacutep štandardnej FISH a FISH maľovania celeacuteho chromozoacutemu

Veľkou vyacutehodou FISH metoacutedy je možnosť analyacutezy buniek v metafaacuteze aj v interfaacuteze kedy nie je nutnaacute kultivaacutecia buniek a tiež ryacutechle analyzovanie veľkeacuteho počtu buniek (stovky až tisiacutece) K ďalšiacutem vyacutehodaacutem patriacute bezpečnosť vysokaacute citlivosť dostatočnaacute stabilita relatiacutevne kraacutetky čas hybridizaacutecie a možnosť ryacutechleho vyhodnotenia Hybridizaacutecia pri vaumlčšine suacutečasne dodaacutevanyacutech sond trvaacute 10-12 hodin (na trhu suacute už dostupneacute aj sondy so skraacutetenyacutem časom hybridizaacutecie na 2-3 hodiny) Po hybridizaacuteciiacute nasleduje odmyacutevanie kedy pri priacuteslušnej teplote dochaacutedza k odmytiu nenaviazanyacutech a nespraacutevne hybridizovanyacutech sond Preparaacutet sa naacutesledne podfarbiacute a vyacutesledok sa zhodnotiacute vo fluorescenčnom mikroskope Na podfarbenie chromozoacutemov alebo jadier sa použiacuteva modreacute kontrastneacute farbivo DAPI (46-diamidino-2-fenylindol) ktoreacute maacute silneacute fluorescenčneacute vlastnosti dokaacuteže prechaacutedzať jadrovou membraacutenou a viazať sa na DNA Vyacutesledkom je modreacute zafarbenie ktoreacute vyacuteborne kontrastuje so signaacutelmi jednotlivyacutech sond

Limitujuacutecim faktorom FISH je možnosť identifikaacutecie len tyacutech uacutesekov DNA ku ktoryacutem suacute použiteacute sondy V jednej analyacuteze je možneacute použiť najviac 3 odlišne značeneacute sondy a tak zistiť priacutepadneacute abnormality len na 1 alebo na paacuter lokusoch Na relevantnuacute detekciu je potrebneacute mať vo vzorke 1-5 aberantnyacutech interfaacutezovyacutech jadier

FISH je možneacute uskutočniť na širokej škaacutele biologickeacuteho materiaacutelu na vzorkaacutech perifeacuternej krvi kostnej drene naacuteteroch choriovyacutech klkoch plodovej vode rocircznych druhov tkaniacutev natiacutevnych alebo zaliatych v parafiacutene na 1 bunke (predimplantačnaacute genetickaacute diagnostika PGD) (obr 37)

Využiacuteva sa na detekciu aberaacuteciiacute pri mnohyacutech onkologickyacutech ochoreniach (napr pri diagnoacuteze mnohopočetnyacute myeloacutem sa v suacutečasnosti po separaacutecii CD138+ buniek robiacute FISH s 5 sondami pre geacuteny IGH TP53 RB1 oblasť 1p321q21 a stanovuje sa hyperploidia chromozoacutemov 5 9 a 15) a tiež k spresneniu doplneniu a k overeniu bežneacuteho cytogenetickeacuteho vyšetrenia

Podľa miesta na chromozoacuteme na ktorom dochaacutedza k hybridizaacutecii sondy rozlišujeme 4 typy

DNA sond bull centromeacuteroveacute sondy ndash sa viažu na strednuacute časť chromozoacutemu ndash centromeacuteru sluacutežia k diagnostike zmien v počte chromozoacutemov k detekcii chromozoacutemov neznaacutemeho pocircvodu umožňujuacute interfaacuteznu FISH na nedeliacich sa bunkaacutech (obr 38-41)

42

Obr 37 Interfaacutezna FISH preimplantačnyacute genetickyacute skriacutening aneuploidiiacute ndash blastomeacutera 3-denneacuteho ľudskeacuteho embrya s normaacutelnym počtom chromozoacutemov 13 18 21 pohlavie XY použityacutech 5 sond pre chromozoacutemy 13 ndash orange 18 ndash aqua 21 ndash green X ndash blue a Y ndash yellow (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

Obr 38 Interfaacutezne jadro po hybridizaacutecii s centromeacuterovou sondou pre chromozoacutem 8 (Vysis Abbott) V pravom jadre je priacutetomnaacute trizoacutemia chromozoacutemu 8 (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex) Obr 39 Metafaacutezna (A) a interfaacutezna FISH (B) použitaacute centromeacuterovaacute sonda CEPX spectrum orangeCEPY spectrum green (Vysis Abbott) Sonda hybridizuje k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (červenyacute signaacutel) a Y (zelenyacute signaacutel) (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

43

Obr 40 Interfaacutezna FISH vyšetrenie spermiiacute použiteacute sondy CEPX greenCEPY orange (Aneuscore Metasystems) Sondy hybridizujuacute k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (zelenyacute signaacutel) Y (červenyacute signaacutel) vľavo ndash dve haploidneacute spermie (majuacutece jedna spermia X druhaacute Y chromozoacutem) vpravo ndash dve patologickeacute spermie obsahujuacutece gonozoacutemovyacute komplement XY (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

Obr 41 Interfaacutezna FISH vyšetrenie spermiiacute použiteacute sondy CEPX greenCEPY orange a CEP18 aqua (Aneuscore Metasystems) Sondy hybridizujuacute k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (zelenyacute signaacutel) Y (červenyacute signaacutel) a 18 (modryacute signaacutel) vľavo ndash normaacutelne haploidneacute ľudskeacute spermie - 1x chromozoacutem X alebo Y a jedenkraacutet chromozoacutem 18 v strede ndash patologickaacute spermia obsahujuacuteca gonozoacutemovyacute komplement XY a jeden chromozoacutem 18 vpravo ndash patologickaacute diploidnaacute spermia s chromozoacutemami X Y a dvoma chromozoacutemami 18 (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

bull lokusovo špecifickeacute sondy ndash hybridizaacutecia prebehne na konkreacutetnom mieste geacutenu (lokuse) (obr 42-44) použiacutevajuacute sa k vyšetreniu mikrodeleacuteciiacute (straty malyacutech častiacute chromozoacutemu pri mikrodelečnyacutech syndroacutemoch) k zisteniu amplifikaacutecie onkogeacutenov a niektoryacutech špecifickyacutech translokaacuteciiacute prestavby geacutenov umožňujuacute interfaacuteznu FISH na nedeliacich sa bunkaacutech bull subtelomeroveacute ndash vaumlzba na koncoveacute časti chromozoacutemu ndash telomeacutery bull celochromozoacutemoveacute alebo celomaľovacie sondy ndash sondy hybridizujuacute s mnohopočetnyacutemi chromozoacutemovyacutemi sekvenciami pričom sa fluorescenčne tak bdquovymaľujeldquo celyacute chromozoacutem (Obr 45) Použiacutevajuacute sa na vyšetrenie chromozoacutemovyacutech prestavieb k analyacuteze translokaacuteciiacute a k detekcii pocircvodu tzv marker chromozoacutemov (malyacutech nadpočetnyacutech chromozoacutemov neznaacutemeho pocircvodu) K použitiu sondy suacute potrebneacute metafaacutezne chromozoacutemy nepoužiacutevaju sa pre interfaacuteznu FISH

Pri konvenčnej chromozoacutemovej FISH suacute homogeacutenne DNA proacuteby hybridizovaneacute s fixovanyacutem metafaacuteznym alebo prometafaacuteznym chromozoacutemomchromozoacutemami na skliacutečku (Obr 36a) Maximaacutelna rozlišovacia schopnosť metafaacuteznej FISH je niekoľko megabaacutez (Obr 39a 45) využitiacutem viac

44

natiahnutyacutech prometafaacuteznych chromozoacutemov sa dosiahne 1 Mb rozliacutešenie Prostredniacutectvom fiber FISH konkreacutetne artificiaacutelne deproteinizovanej natiahnutej DNA pripravenej in situ z celyacutech buniek na mikroskopickom skliacutečku je možneacute vizualizovať individuaacutelne geacuteny maleacute DNA elementy na chromozoacuteme s rozliacutešeniacutem okolo 1000 bp

Obr 42 Interfaacutezne jadro po hybridizaacutecii s lokusovo-špecifickou sondou LSI 5q31 Spectrum Orange5p12 Spectrum Green (Vysis Abbott) Na ľavom obraacutezku suacute priacutetomneacute dva červeneacute (5q31) a dva zeleneacute signaacutely (5p12) v pravom jadre je priacutetomnaacute deleacutecia 5q31 oblasti chyacuteba jeden červenyacute signal (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

Obr 43 Interfaacutezna FISH použitaacute lokusovo-špecifickaacute sonda ndash translokačnaacute - XL BCRABL1 plus (Metasystems) dvojfarebnaacute dvojfuacutezna kde červenaacute označuje lokus ABL1 na chromozoacuteme 9 a zelenaacute oblasť BCR na chromozoacuteme 22 Sonda deteguje fuacuteziu protoonkogeacutenu ABL1 (9q34) a geacutenu BCR (22q11) v priacutepade že červenyacute a zelenyacute signaacutel suacute pri sebe (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

45

Obr 44 Interfaacutezna FISH Použitaacute lokusovo-špecifickaacute sonda- typ break apart pre IGH geacuten V docircsledku translokaacutecie došlo k rozskočeniu geacutenu pričom translokačneacuteho partnera nepoznaacuteme vieme určiť len percento v koľkyacutech jadraacutech je geacuten prestavanyacute (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex) Obr 45 Použiteacute celochromozoacutemoveacute sondy WCP 15 (červenyacute chromozoacutem) a WCP 17 (zelenyacute chromozoacutem) Na metafaacuteze je potvrdenaacute reciprokaacute translokaacutecia t(1517)(q2221) (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

FISH vizualizaacutecia celeacuteho chromozoacutemu maľovanie chromozoacutemu anglicky chromosome

painting je špeciaacutelnou aplikaacuteciou chromozoacutemovej FISH proacuteba je koktail veľkeacuteho počtu rocircznych fluorescenčne značenyacutech DNA fragmentov hybridizujuacutecich pozdĺž celeacuteho konkreacutetneho chromozoacutemu (obr 36b 45) bdquoChromosomepaintingldquo analyzuje metafaacutezne chromozoacutemy V minulosti bola FISH vizualizaacutecia celyacutech chromozoacutemov limitovanaacute malyacutem množstvom rocirczne sfarbenyacutech fluorochroacutemov

V suacutečasnosti je možneacute detegovať množstvo cieľovyacutech sekvenciiacute naraz čo sa využiacuteva pri celogenoacutemovej chromozoacutemovej vizualizaacutecii (whole-chromosomepainting - WCP) metoacutedou multiplex FISH (M-FISH multicolor FISH o br 46) alebo spektraacutelnej karyotypizaacutecie (SKY) kedy možno rozliacutešiť všetky ľudskeacute chromozoacutemy ndash teda 24 rocircznych chromozoacutemov M-FISH a SKY patria medzi metafaacutezne formy FISH diagnostiky ktoreacute umožňujuacute simultaacutennu vizualizaacuteciu všetkyacutech ľudskyacutech chromozoacutemov v rocircznych farbaacutech čo predstavuje uľahčenie analyacutezy karyotypu hlavne pri komplexnyacutech zmenaacutech a markeroch neznaacutemeho pocircvodu Obe techniky vychaacutedzajuacute z použitia

46

celochromozoacutemovyacutech sond značenyacutech kombinaacuteciou viaceryacutech fluorochroacutemov Rozdiel medzi M-FISH a SKY spočiacuteva v technike ziacuteskania konečneacuteho obrazu

Obr 46 Multicolor FISH - každyacute chromozoacutemovyacute paacuter je zafarbenyacute inou farbou pričom na ich zafarbenie postačuje kombinaacutecia 5 fluorochroacutemov Na vyhodnocovanie je potrebnaacute špeciaacutelna sada fluorescenčnyacutech filtrov pre jednotliveacute fluorochroacutemy a špeciaacutelnyacute softweacuter Vľavo-štandardnyacute karyotyp vpravo karyotyp s mutaacuteciami (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

V molekulovej cytogenetike suacute komerčne dostupneacute sety M-FISH proacuteb umožňujuacutece

viacfarebneacute pruacutežkovanie chromozoacutemov (banding) s vysokyacutem rozliacutešeniacutem (multicolor-banding mBAND FISH MCB) čo umožňuje identifikaacuteciu intrachromozoacutemovyacutech prestavieb (Obr 47) Nevyhnutnosťou mBAND-u je mať chromozoacutemy v metafaacuteze Taacuteto metoacuteda bola prvyacutekraacutet uskutočnenaacute na chromozoacuteme 5 v roku 1999 mBAND FISH umožňuje rozliacutešiť špecifickeacute oblasti chromozoacutemov na uacuterovni pruacutežku - bandu a sub-bandu s detekciou 550 bandov haploidneacuteho karyotypu

Obr 47 A - mBAND chromozoacutemu 11 - inverzia duplikovanej oblasti 11q223-q25 B - mBAND chromozoacutemu 3 - na kruhovom chromozoacuteme deleacutecia oblasti 3p263 C - mBAND chromozoacutemu 2 - potvrdenie inverzie duplikovanej časti chromozoacutemu (poskytnuteacute RNDr Dagmar Landlovou Medirex)

FISH metoacuteda a jej varianty (M-FISH mBAND SKY) majuacute v suacutečasnosti širokeacute využitie v

klinickej genetike v onkologickej genetike na detekciu aberaacuteciiacute v čase diagnoacutezy počas liečby po

47

liečbe monitorovanie po transplantaacutecii kostnej drene v prenataacutelnej a postnataacutelnej diagnostike pri detekcii submikroskopickyacutech deleacuteciiacute (napr DiGeorge syndroacutem - 22q112 delečnyacute syndroacutem PraderndashWilli syndroacutem- chromozoacutem 15q11-13) prostredniacutectvom FISH je možnaacute detekcia numerickyacutech zmien chromozoacutemov (trizoacutemia chromozoacutemu 21 pri Downovom syndroacuteme trizoacutemia chromozoacutemu 15 pri Patauovom syndroacuteme trizoacutemia chromozoacutemu 18 pri Edwardsovom syndroacuteme) rocirczne zmeny v počte pohlavnyacutech chromozoacutemov (monozoacutemia X pri Turnerovom syndroacuteme Klinefelterov syndroacutem s X chromozoacutemom naviac - XXY) podobne v predimplantačnej diagnostike

83 DNA Microarray (DNA mikro čip biočip) DNA mikročipovanie je technika využiacutevajuacuteca hybridizaacuteciu skuacutemanej nukleovej kyseliny

(cieľovaacute vzorka) s veľkyacutem množstvom oligonukleotidovyacutech proacuteb (desať tisiacutec až milioacuten) ktoreacute suacute prichyteneacute na pevnyacute podklad najčastejšie sklenyacute silikoacutenovyacute alebo nylonovyacute (doštička čip) Skuacutemanaacute nukleovaacute kyselina je pred hybridizaacuteciou fragmentovanaacute označenaacute fluorofoacuterom a denaturovanaacute Po kontakte čipu s cieľovou vzorkou ktoraacute je vlastne zmes označenyacutech oligonukleotidov značeneacute oligonukleotidy hybridizujuacute s oligonukleotidovyacutemi sekvenciami prichytenyacutemi na čipe Potom suacute na zaacuteklade fluorescencie detekovaneacute miesta kde došlo k hybridizaacutecii čiže vzorka obsahovala takuacuteto nukleotidovuacute sekvenciu Z jedneacuteho mikročipu sa ziacuteska obrovskeacute množstvo daacutet ktoreacute je vždy nutneacute softveacuterovo spracovať V dnešnej dobe existuje niekoľko firiem poskytujuacutecich komerčne mikročipy na objednaacutevku alebo si ich laboratoacuteria produkujuacute sami

Mikročipovanie prebieha nasledovne

1) Vytvorenie DNA čipu ndash tisiacutece rocircznych jednovlaacuteknovyacutech DNA oligonukleotidov znaacutemych sekvencii sa kovalentne naviažu na povrch doštičky vždy v určitej lokalite je niekoľko rovnakyacutech oligonukleotidov veľkosť takejto lokality je ˂ 200 microm Proacutebami mocircže byť DNA cDNA alebo syntetizovaneacute oligonukleotidy Už hotoveacute mikročipy ponuacutekajuacute viacereacute firmy (Affymetrix Agilent Technologies Eppendorf Illumina) alebo si ich jednotliveacute laboratoacuteria vyraacutebajuacute sami pomocou robotickyacutech zariadeniacute DNA čip sa vytvaacutera buď nanaacutešaniacutem kvapiek oligonukleotidov na podklad alebo synteacutezou oligonukleotidov in situ na čipe 2) Priacuteprava vzorky ndash nukleovaacute kyselina (mRNA DNA) sa purifikuje určiacute sa jej kvantita a kvalita (spektrofotometericky) fragmentuje resp v priacutepade mRNA sa syntetizuje cDNA v priacutepade potreby sa mocircže DNA amplifikovať PCR reakciou štiepiť restrikčnyacutemi endonukleaacutezami 3) Fluorescenčneacute označenie (zriedkavejšie raacutedioaktiacutevne) fragmentov DNA prebieha počas reverznej transkripcie alebo PCR amplifikaacutecie za uacutečasti fluorescenčne značenyacutech nukleotidov Keď sa analyzujuacute dve rocirczne vzorky napr zdraveacute tkanivo a naacutedoroveacute tkanivo označenie nukleovyacutech kyseliacuten v tyacutechto tkanivaacutech byacuteva rozdielne a to použitiacutem dvoch rocircznych fluorescenčnyacutech farbiacutev (napr zeleneacute a červeneacute) Pred hybridizaacuteciou je potrebneacute vzorku denaturovať čiacutem sa vytvoriacute zmes jednovlaacuteknovyacutech DNA označenyacutech značkou 4) Hybridizaacutecia s mikročipom ndash v špeciaacutelnom hybridizačnom roztoku hybridizujuacute komplementaacuterne sekvencie zo vzorky s priacuteslušnyacutemi oligonukleotidovyacutemi sondami naviazanyacutemi na čipe Potom sa čip obmyje aby došlo k odstraacuteneniu čiastočne hybridizovanyacutech nukleovyacutech kyseliacuten 5) Skenovanie mikročipu ndash skenerom čipov docircjde k ožiareniu čipu laserom pričom v mieste hybridizaacutecie fluorescenčne značenyacutech DNA fragmentov s proacutebou docircjde k emisii svetla určitej vlnovej dĺžky ktoruacute skener zaznamenaacute 6) Analyacuteza daacutet prebieha metoacutedami bioinformatiky spracovaniacutem softveacutermi sa zistiacute ktoreacute lokality čipu navzaacutejom hybridizovali v priacutepade použitia dvoch vzoriek kontrolnej a skuacutemanej je možneacute analyzovať ich relatiacutevnu intenzitu hybridizaacutecie (expresie určiteacuteho geacutenu)

Existujuacute štyri typy mikročipov 1) Čipy ur čeneacute na analyacutezu expresie (obsahujuacute cDNA proacuteby) pre tzv dvojkanaacutelovyacute experiment kedy je vzorka určenaacute k hybridizaacutecii na čipe ziacuteskanaacute zmiešaniacutem DNA fragmentov kontrolnej a skuacutemanej vzorky pričom fragmenty suacute rozdielne fluorescenčne označeneacute (napr zelenyacute fluorofoacuter pre kontrolnuacute vzorku a červenyacute pre skuacutemanuacute) Na zaacuteklade intenzity a typu fluorescencie sa deteguje expresia geacutenov typickaacute pre kontrolnuacute vzorku (napr zelenaacute fluorescencia) pre skuacutemanuacute vzorku (napr

48

červenaacute fluorescencia) a expresia podobnaacute u oboch vzoriek (žltaacute fluorescencia) neexprimovaneacute geacuteny (čierna fluorescencia) rocirczne odtiene (v zaacutevislosti od prevažujuacutecej hybridizaacutecie) (obr 48) 2) Čipy ur čeneacute na analyacutezu mutaacutecii použije sa genoacutemovaacute DNA označenaacute jednou fluorescenčnou farbičkou na určenie jednonukleotidovej zmeny (SNP ndash Single Nukleotide Polymorphism) 3) Čipy na komparatiacutevnu genoacutemovuacute hybridizaacuteciu (aCGH array Comparative Genomic Hybridization) ndash použiacutevaneacute na zistenie zvyacutešenia alebo zniacuteženia množstva chromozoacutemovyacutech fragmentov obsahujuacutecich geacuteny zodpovedneacute za určiteacute ochorenie Na analyacutezu sa použije skuacutemanaacute gDNA a referenčnaacute (kontrolnaacute) DNA každaacute sa značiacute inou fluorescenčnou farbičkou (princiacutep ako pri analyacuteze expresie) (obr 49 50) 4) Čipy CGH - SNP kombinovaneacute čipy ur čeneacute na analyacutezu aj mutaacuteciiacute SNP aj na komparatiacutevnu genoacutemovuacute hybridizaacuteciu CGH

Mikročipy majuacute rozsiahle využitie napriacuteklad v identifikaacuteciiacute novyacutech geacutenov vo vyacuteskume ich funkciiacute expresie v rocircznych podmienkach pri diagnostike mnohyacutech ochoreniacute vo farmakogenomike vo vyacuteskume vplyvu toxiacutenov

Obr 48 Heatmapa geacutenovej expresie vybranyacutech geacutenov (mRNA) mikročip obsahuje 46000 cDNA proacuteb (poskytnuteacute Ing Helenou Gbelcovou PhD Uacutestav lekaacuterskej bioloacutegie genetiky a klinickej genetiky LF UK a UNB)

49

Obr 49 Princiacutep komparatiacutevnej genoacutemovej hybridizaacutecie (aCGH - array comparative genomic hybridization) Obr 50 A) Vyacutesledok komparatiacutevnej genoacutemovej hybridizaacutecie (aCGH - array comparative genomic hybridization) vzorky DNA izolovanej plodovej vody U plodu s abnormaacutelnym ultrasonografickyacutem vyšetreniacutem bola identifikovanaacute duplikaacutecia oblasti 3q261q29 (modryacute paacutes) a deleacutecia oblasti 5p1533p151 (červenyacute paacutes) Pre porovnanie chromozoacutem 1 bez aberaacutecie b) Ten istyacute pacient ale ineacute softveacuteroveacute spracovanie (poskytnuteacute RNDr Miroslavom Tomkom PhD Medirex)

50

Odporuacutečanaacute a použitaacute literatuacutera

Odborneacute knihy Klug W S Cummings M R Spencer Ch A Palladino M A Concepts of Genetics jedenaacuteste vydanie (2015) Carson S Molecular Biology Techniques tretie vydanie (2012) Strachan T Read A Human Molecular Genetics štvrteacute vydanie (2011) Sudbery P Sudbery I Human Molecular Genetics tretie vydanie (2009)

Internetoveacute straacutenky

wwwncbinlmnihgov wwwmlpacom wwwthermofishercom wwwilluminacom wwwpromegask wwwqiagencom wwwambioncom

Odborneacute člaacutenky Chacon-Cortes D Griffiths L R Methods for extracting genomic DNA from whole blood samples current perspectives Journal of Biorepository Science for Applied Medicine Volume 2 strany 1- 9 Viltrop T Krjutskov K Palta P Metspalu A Comparison of DNA extraction methods for multiplex polymerase chain reaction Anal Biochem 2010 Volume 398(2) strany 260-262 Ing Martin Čermaacutek Molekulaacuterna cytogenetika v problematike familiaacuternych maligniacutet Onkoloacutegia Volume 2 strany 77 - 83 Livak KJ Schmittgen TD Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method Methods 2001 Volume 25(4) strany 402 - 408 Bustin S A Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays J Mol Endocrinol 2000 Volume 25(2) strany169 - 193

MOLEKULAacuteRNE METOacuteDY AKTUAacuteLNE POUŽIacuteVANEacute V KLINICKEJ GENETIKE RNDr Andrea Pastoraacutekovaacute PhD RNDr Robert Petrovič PhD Vydala Univerzita Komenskeacuteho v Bratislave Lekaacuterska fakulta Rozsah 50 straacuten 246 AH prveacute vydanie ISBN 978-80-223-4231-5

16

Obr 12 SNaPshot analyacuteza geacutenu CYP21A2 u DNA izolovanej z plodovej vody metoacuteda deteguje najčastejšie bodoveacute mutaacutecie geacutenu pre 21-hydroxylaacutezu vyacutesledok prenataacutelnej analyacutezy = priacutetomnosť mutaacutecie In2G v hemizygotnom stave (keďže qPCR metoacutedou bola u plodu zistenaacute priacutetomnosť len jednej koacutepie geacutenu CYP21A2)

33 Kvantitatiacutevna PCR (qPCR)

Polymeraacutezovou reťazovou reakciou (PCR) docielime namnoženie (amplifikaacuteciu) určiteacuteho DNA uacuteseku (templaacutetu) PCR je katalyzovanaacute DNA polymeraacutezou za priacutetomnosti primerov dNTPs dvojmocnyacutech katioacutenov (ako Mg+2) a pufrovacieho roztoku

Real-time PCR ktoraacute je nazyacutevanaacute aj kvantitatiacutevna PCR (qPCR) umožňuje vizualizaacuteciu a kvantifikaacuteciu amplifikaacutecie DNA v reaacutelnom čase to je tak ako to bežiacute počas PCR qPCR využiacuteva fluorescenčneacute chemikaacutelie (farbivaacute) ktoryacutech emitovanuacute fluorescenciu zaznamenaacuteva optickyacute systeacutem počas každeacuteho PCR cyklu zaznamenanaacute fluorescencia je naacutesledne softveacuterovo spracovanaacute a vyhodnotenaacute

V suacutečasnosti sa využiacutevajuacute dva typy qPCR cheacutemie a to farbivaacute viažuce sa na DNA a fluorescenčne značeneacute proacuteby (obr 13)

Farbivaacute viažuce sa na DNA emitujuacute fluorescenciu v priacutepade ak suacute naviazaneacute na dvojvlaacuteknovuacute DNA proacuteby fluoreskujuacute v priacutepade keď molekula zhaacutešača (angl quencher - Q) sa nenachaacutedza v bliacutezkosti molekuly reporteacutera (R) napr hydrolyzujuacutece proacuteby fluoreskujuacute keď je molekula reporteacutera (R) prostredniacutectvom 5acuteexonukleaacutezovej aktivity DNA polymeraacutezy odstraacutenenaacute z bliacutezkosti molekuly zhaacutešača (Q)

Grafickyacute priebeh real ndash time PCR znaacutezorňuje amplifika čnaacute krivka (angl amplification plot) (obr 14) majuacuteca 4 faacutezy 1) Faacuteza I ndash dochaacutedza k zdvojnaacutesobeniu množstva amplikoacutenu po každom cykle ale naacuterast fluorescencie je pod detekčnyacutem limitom zaznamenaacutevanaacute fluorescencia (baseline) zodpovedaacute zaacutekladnej fluorescencii pozadia tzv šumu

17

2) Faacuteza II nazyacutevanaacute aj exponenciaacutelna faacuteza v ktorej sa fluorescencia zvyacuteši na uacuteroveň optickej detekcie bod resp cyklus kedy začiacutena exponenciaacutelna faacuteza je kľuacutečovyacute na určenie kvantity vstupneacuteho množstva templaacutetovej DNA nazyacuteva sa prahovyacute cyklus označuje sa Ct (angl treshold cycle) alebo Cq (quantification) Čiacutem nižšie je Ct (Cq) tyacutem vaumlčšiacute počet koacutepiiacute templaacutetovej DNA bolo v reakcii Ct hodnota je teda hlavnyacute uacutedaj s ktoryacutem sa pracuje vo vyacutepočtoch fluorescencia v tomto mieste sa nazyacuteva prahovaacute resp treshold 3) Faacuteza III - lineaacuterna faacuteza ndash charakterizuje ju postupneacute spotrebovaacutevanie komponentov reakcie na narastajuacutece množstvo amplikoacutenu 4) Faacuteza IV - plateau (čiacutetaj platoacute) ndash množstvo amplikoacutenu sa v docircsledku vyčerpania zložiek qPCR už nezvyšuje

Obr 13 Princiacutep real-time PCR Obr 14 Faacutezy real-time PCR

Ako štandardnaacute PCR aj qPCR maacute tri zaacutekladneacute kroky 1) Denaturaacutecia dvojvlaacuteknovej DNA na jednovlaacuteknovuacute DNA pri vysokej teplote (obyčajne 95degC) 2) Hybridizaacutecia primerov (annealing) ndash komplementaacuterne sekvencie sa spolu hybridizujuacute 3) Polymerizaacutecia pri 70-72degC kedy v docircsledku optimaacutelnej aktivity DNA polymeraacutezy dochaacutedza k predĺženiu primeru až o 100 baacutez za sekundu

18

Real-time PCR (obr 15) sa využiacuteva na kvantifikaacuteciu expresie geacutenov určenie počtu koacutepiiacute geacutenov určenie genotypu (genotypovanie) alelovou diskriminaacuteciou alebo analyacutezou krivky topenia tzv high resolution melt a multiplexnuacute real time PCR s možnosťou detekcie viaceryacutech cieľovgeacutenov

Multiplexnaacute real-time PCR sa využiacuteva na detekciu viaceryacutech cieľovgeacutenov v jednej reakcii suacutečasne Vyacutehodou multiplexovania je jednak uacutespora vzorky ako aj ziacuteskanie vaumlčšieho množstva informaacuteciiacute z rovnakeacuteho množstva materiaacutelu Nevyhnutnosťou multiplexnej qPCR suacute proacuteby značeneacute rocircznymi fluorescenčnyacutemi farbivami

Najdocircležitejšie zložky qPCR (real-time PCR komponenty) suacute DNA polymeraacuteza (reverznaacute transkriptaacuteza v priacutepade jednokrokovej kvantitatiacutevnej RT-PCT) dNTPs primery resp primeryproacuteby dvojmocneacute Mg templaacutet Na uľahčenie qPCR suacute v suacutečasnosti už komerčne dostupneacute takeacute reakčneacute zmesi ku ktoryacutem stačiacute pridať už len templaacutet (napr kity využiacutevajuacutece TaqManProacuteby) alebo kity s fluorescenčnyacutemi farbami viažucimi sa na dvojvlaacuteknovuacute DNA ku ktoryacutem sa do reakčnej zmesi okrem templaacutetu pridajuacute primery

Obr 15 Real-time PCR cykleacuter

331 Kvantifikaacutecia pomocou qPCR

Na kvantifikaacuteciu DNA pomocou qPCR sa požiacutevajuacute dve zaacutekladneacute metoacutedy - absoluacutetna kvantifikaacutecia a relatiacutevna kvantifikaacutecia

Absoluacutetna kvantifikaacutecia vychaacutedza zo štandardnej krivky (obr 16) ktoraacute sa ziacuteska po qPCR seacuterie riedeniacute DNA znaacutemej koncentraacutecie Kvantifikaacutecia neznaacutemej vzorky sa zistiacute interpolaacuteciou (odčiacutetaniacutem) Ct neznaacutemej vzorky zo štandardnej krivky (obr 16 17) Využiacutevaneacute napr v kriminalistike na stanovenie koncentraacutecie DNA vo vzorke

Relatiacutevna kvantifikaacutecia (obr 18 19) porovnaacuteva uacuteroveň expresie určiteacuteho geacutenu vo vzorke k expresii toho isteacuteho geacutenu v referenčnej (kontrolnej) vzorke alebo množstvo určiteacuteho geacutenu (počet koacutepiiacute) vo vzorke porovnaniacutem s množstvom geacutenu v kontrolnyacutech vzorkaacutech V raacutemci každej vzorky musiacute pred relatiacutevnou kvantifikaacuteciou docircjsť k tzv normalizaacutecii t j porovnanie expresie sledovaneacuteho geacutenu k expresii referenčneacuteho geacutenu (najčastejšie niacutem byacuteva tzv bdquohousekeepingldquo geacuten napr GAPDH aktiacuten tubuliacuten)

V priacutepade kvantifikaacutecie expresie určiteacuteho geacutenu metoacutedou real-time PCR (RT-qPCR) pred samotnou kvantifikaacuteciou cDNA musiacute byť taacuteto cDNA nasyntetizovanaacute prostredniacutectvom reverznej

19

transkripcie za použitia enzyacutemu reverznej transkriptaacutezy Kvantitatiacutevna PCR s reverznou transkripciou RT-qPCR mocircže byť dvojkrokovaacute alebo jednokrokovaacute Pri dvojkrokovej RT-qPCR treba pred qPCR syntetizovať cDNA vlaacutekno z RNA pomocou reverznej transkriptaacutezy - 1 krok druhyacutem krokom je samotnaacute real-time PCR Jednokrokovaacute RT-qPCR umožňuje uskutočniť obidve reakcie reverznuacute transkripciu a kvantitatiacutevnu PCR v jednej skuacutemavke čo zjednodušuje qPCR a redukuje možnosť kontaminaacutecie Obr 16 5-bodovaacute štandardnaacute krivka (amplifikaacutecia piatich koncentraacuteciiacute jednej vzorky konkreacutetne ide o 10-tkoveacute riedenie)

Obr 17 Ukaacutežka amplifikačnyacutech kriviek riedenia a z nich ziacuteskanej štandardnej krivky poukazuje na vysokuacute presnosť metoacutedy RT-PCR

20

Obr 18 Relatiacutevna kvantifikaacutecia - určenie počtu koacutepiiacute geacutenu CYP21A2 vo vzorke DNA izolovanej z perifeacuternej krvi pacientov mutaacutecie v geacutene CYP21A2 spocircsobujuacute kongenitaacutelnu adrenaacutelnu hyperplaacuteziu (CAH) Vyacutesledok analyacutezy všetci pacienti majuacute dve koacutepie geacutenu

Obr 19 Relatiacutevna kvantifikaacutecia - určenie počtu koacutepiiacute geacutenu CYP21A2 vo vzorke DNA izolovanej z plodovej vody mutaacutecie v geacutene CYP21A2 spocircsobujuacute kongenitaacutelnu adrenaacutelnu hyperplaacuteziu (CAH) Prenaacutetalnou diagnostikou (qPCR) sa zistila priacutetomnost jednej koacutepie CYP21A2 geacutenu 332 Určenie genotypu metoacutedou alelovej diskriminaacutecie a analyacutezou krivky topenia (HRM)

Určenie genotypu metoacutedou alelovej diskriminaacutecie (obr 20) sa uskutočňuje použitiacutem hydrolyzujuacutecich proacuteb (sond) je veľmi ryacutechla a senzitiacutevna (presnaacute) metoacuteda frekventovane využiacutevanaacute v laboratoacuteriaacutech Dva variantyalely suacute vyšetreneacute suacutečasne v jednej vzorke a v jednej reakčnej

21

skuacutemavke V reakcii suacute použiteacute dve proacuteby označeneacute rozdielnymi fluorescenčnyacutemi farbičkami emitujuacutecimi svetlo o rocircznej vlnovej dĺžke (najčastejšie jedna označenaacute FAM farbičkou a druhaacute proacuteba označenaacute VIC farbičkou) Počas amplifikaacutecie amplikoacutenu dochaacutedza k odstraacuteneniu zhaacutešača z bliacutezkosti farbičky ktoraacute potom emituje svetlo priacuteslušnej vlnovej dĺžky Vzorky so signaacutelom len jednej fluorescenčnej farbičky (FAM) a bez signaacutelu druhej farbičky (VIC) suacute homozygoti pre alelu 1 vzorky so signaacutelom len druhej farbičky (VIC) a bez signaacutelu prvej (FAM) suacute homozygoti pre alelu 2 v priacutepade ak vyšetrovanaacute vzorka bdquosvietildquo obidvoma farbami jednaacute sa o heterozygota

Obr 20 Určenie genotypu metoacutedou alelovej diskriminaacutecie ndash amplifikačnaacute krivka vzoriek DNA majuacutecich tri rocirczne genotypy A ndash jednotliveacute vzorky (plnaacute čiara predstavuje štandardnuacute alelu guličkovanaacute mutovanuacute alelu) B ndash 72 vzoriek C ndash scatter plot 72 vzoriek

Určenie genotypu analyacutezou krivky topenia tzv high resolution melt (HRM) (obr 21) umožňuje detekciu takmer všetkyacutech genetickyacutech variaacuteciiacute (SNP mutaacuteciiacute) Keďže taacuteto metoacuteda okrem štandardnyacutech podmienok reakcie vyžaduje len primery a farbičku (nie proacuteby) je veľmi jednoduchaacute a lacnejšia Po amplifikaacuteciiacute treba amplikoacuten pomaly zohrievať až kyacutem nedocircjde k denaturaacuteciiacute Teplota topenia amplikoacutenu vo vzorke zaacutevisiacute od DNA sekvencie čo umožňuje detegovať priacutetomnosť mutaacutecie resp SNP Tvar vyacuteslednyacutech kriviek topenia určuje teda genotyp

22

Obr 21 Určenie genotypu analyacutezou krivky topenia tzv metoacutedou high resolution melting (HRM) A ndash krivka topenia vzoriek DNA majuacutecich tri rocirczne genotypy B ndash graf rozdielnosti krivky topenia vzoriek DNA majuacutecich tri rocirczne genotypy

23

4 Elektroforetickaacute separaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten

Separaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten predstavuje rozdelenie molekuacutel DNA alebo RNA na zaacuteklade veľkosti zloženia a poradia baacutez Podobnyacutemi metoacutedami je možneacute separovať aj proteiacuteny

Elektroforeacuteza (ELFO) je technika použiacutevanaacute na separaacuteciu niekedy aj purifikaacuteciu makromolekuacutel ako suacute nukleoveacute kyseliny a proteiacuteny na zaacuteklade ich rozdielnej veľkosti naacuteboja alebo konformaacutecie Je to metoacuteda veľmi často využiacutevanaacute nielen v molekulovej genetike ale aj biocheacutemii Elektroforeacuteza využiacuteva schopnosť nabityacutech molekuacutel migrovať v jednosmernom elektrickom poli k opačneacutemu poacutelu Nukleoveacute kyseliny majuacute vďaka svojej fosfaacutetovej zložke negatiacutevny naacuteboj preto v jednosmernom elektrickom poli migrujuacute ku kladneacutemu poacutelu čiže k anoacutede Elektroforeacuteza prebieha v elektroforetickej aparatuacutere v geacuteloch (v nosiči) so sieťovitou štruktuacuterou ktoraacute umožňuje separaacuteciu molekuacutel Vzorka nukleovej kyseliny zmiešanaacute s tzv nanaacutešaciacutem tlmivyacutem roztokom s farbičkou sa nanesie do jamky v geacuteli ktoryacute je umiestnenyacute v elektroforetickej aparatuacutere v priacutetomnosti elektroforetickeacuteho pufra (TAE alebo TBE) (obr 22) Nanaacutešaciacute tlmivyacute roztoknanaacutešacia farbička umožňuje na zaacuteklade migraacutecie farbičky vidieť migraacuteciu vzorky v geacuteli a suacutečasne zvyacutešeniacutem hustoty vo vzorke umožniacute klesnuacuteť vzorke do jamky a tak zabraacuteniť jej vyplaveniu z geacutelu Draacuteha je časť geacutelu ktoryacutem putuje jedna vzorka od katoacutedy k anoacutede V draacutehe sa nachaacutedzajuacute oddeleneacute jednotliveacute fragmenty nukleovyacutech kyseliacuten určityacutech veľkostiacute viditeľneacute vo forme pruacutežkov (angl bands) Intenzita pruacutežku zaacutevisiacute od množstva molekuacutel danej veľkosti je ekvivalentnaacute hmotnosti Na určenie veľkosti fragmentov NK sa do jednej jamky nanesie štandard molekulovyacutech hmotnostiacute (angl ladder) ktoryacute maacute presne definovaneacute veľkosti fragmentov čo umožňuje odhadnuacuteť veľkosť aj hmotnosť neznaacutemych separovanyacutech fragmentov

Obr 22 Elektroforetickaacute separaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten v agaroacutezovom geacuteli (A) a vizualizaacutecia UV svetlom a GelRedtrade (B C)

24

Nukleoveacute kyseliny je možneacute elektroforeticky separovať 1) v geacuteloch agaroacutezovom (horizontaacutelna elektroforeacuteza) (obr 22) a polyakrylamidovom (vertikaacutelna elektroforeacuteza) 2) v špeciaacutelnych lineaacuternych polymeacuteroch kapilaacuternou elektroforeacutezou použitiacutem genetickeacuteho analyzaacutetora (obr 23)

Agaroacuteza je polysacharid ziacuteskanyacute z morskej riasy použiacuteva sa najčastejšie v koncentraacuteciiacute 05-2 čiacutem vyššia koncentraacutecia tyacutem je geacutel pevnejšiacute a schopnejšiacute rozliacutešiť menšie fragmenty NK Priacuteprava je jednoduchaacute odvaacuteži sa potrebneacute množstvo agaroacutezy ktoraacute sa zmieša s tlmivyacutem roztokom (pufrom) rozvariacute sa v mikrovlnnej ruacutere a naleje sa do špeciaacutelnej naacutedoby na vytvaacuteranie geacutelov kyacutem je geacutel tekutyacute vložiacute sa do neho tzv hrebeň na vytvorenie jamiek Agaroacuteza je netoxickaacute V bežnom agaroacutezovom geacuteli v zaacutevislosti od jeho koncentraacutecie je možneacute separovať DNA fragmenty dĺžky 200-50 000 bp Dnes suacute dostupneacute aj špeciaacutelne agaroacutezy napr MetaPhorreg Agarose schopneacute oddeliť fragment DNA dĺžky 20-800bp Separaacutecia v agaroacutezovom geacuteli prebieha v horizontaacutelnej aparatuacutere preto sa nazyacuteva aj horizontaacutelna elektroforeacuteza

Polyakrylamidovyacute geacutel (PAGE) vznikaacute polymerizaacuteciou akrylamidu v priacutetomnosti špeciaacutelnych chemickyacutech laacutetok (peroxodisiacuteran amoacutenny TEMED bisakrylamid) Jeho priacuteprava je preto odlišnaacute a aj naacuteročnejšia Polyakrylamidoveacute geacutely majuacute vysokuacute rozlišovaciu schopnosť (1bp) preto suacute PAGE geacutely vhodneacute aj na sekvenovanie DNA klasickyacutemi metoacutedami PAGE geacutel nie je vhodnyacute na separaacuteciu fragmentov dlhšiacutech ako 2kb Použiacuteva sa v koncentraacutecii 35 -20 s rozliacutešeniacutem fragmentov od 10bp-2000bp Akrylamid je neurotoxiacuten musiacute sa s niacutem pracovať veľmi opatrne PAGE elektroforeacuteza bežiacute vo vertikaacutelnej aparatuacutere preto sa volaacute aj vertikaacutelna elektroforeacuteza použiacuteva sa často aj na separaacuteciu proteiacutenov

Ryacutechlosť pohybu nukleovyacutech kyseliacuten (mobilita) určuje viacero faktorov 1) veľkosť NK ndash počet baacutezovyacutech paacuterov resp baacutez pričom menšie molekuly prechaacutedzajuacute geacutelom ryacutechlejšie pretože sa ľahšie pohybujuacute v geacuteli 2) konformaacutecia nukleovej kyseliny napr u rovnako veľkyacutech plazmidov kondenzovaneacute superšpiralizovaneacute plazmidy migrujuacute najryacutechlejšie rovnako veľkeacute lineaacuterne molekuly (toho isteacuteho plazmidu) bežia pomalšie a najpomalšie putujuacute relaxovaneacute kruhoveacute molekuly plazmidu 3) koncentraacutecia geacutelu určuje jeho rozlišovaciu schopnosť koncentrovanejšiacute geacutel je schopnyacute separovať kratšie fragmenty NK redšie geacutely suacute vhodneacute pre rozliacutešenie vaumlčšiacutech fragmentov 4) zloženie geacutelu je docircležiteacute pri analyacuteze sekundaacuternych štruktuacuter NK a proteiacutenov v nedenaturovanom stave sekundaacuterna štruktuacutera spomaľuje migraacuteciu NK a proteiacutenov Tento fakt využiacutevajuacute niektoreacute diagnostickeacute techniky (napr SSCP - Single Strand Conformation Polymorphism - polymorfismus konformaacutecie jednovlaacuteknovej DNA) umožňujuacutece detekciu zaacutemeny jedinej baacutezy ktoraacute spocircsobiacute odlišneacute vnuacutetromolekuloveacute paacuterovanie a vyacuteslednuacute konformaacuteciu molekuly Geacutely mocircžu teda byť denaturačneacute a nedenaturačneacute (natiacutevne) 5) napaumltie zdroja - čiacutem vyššie je napaumltie ktoreacute vytvaacutera elektrickeacute pole v elektroforetickej aparatuacutere tyacutem ryacutechlejšie fragmenty NK migrujuacute 6) zloženie roztokov a teploty

Elektroforetickyacute tlmivyacute roztok (pufor - elektrolyt) zabezpečuje stabilneacute elektroforetickeacute podmienky počas separaacutecie geacutel je v ňom ponorenyacute Obsahuje ioacuteny čo umožňuje vedenie elektrickeacuteho pruacutedu

Štandard molekulovyacutech hmotnostiacute (v laboratoacuteriaacutech nazyacutevanyacute ladder alebo marker) je zmes fragmentov DNA alebo RNA s presne definovanou veľkosťou ktoryacute sluacuteži na odhad veľkosti vyšetrovanyacutech fragmentov NK (obr 22) Pomocou špeciaacutelnych štandardov molekulovyacutech hmotnostiacute ktoryacutech fragmenty NK majuacute definovanuacute aj hmotnosť je možneacute odhadnuacuteť množstvo (hmotnosť - koncentraacuteciu) neznaacutemeho fragmentu

B C

25

41 Vizualizaacutecia DNA

Samotnaacute nukleovaacute kyselina je počas elektroforetickej separaacutecie neviditeľnaacute Vizualizaacuteciu NK umožňujuacute interkalačneacute činidlaacute ktoreacute suacute schopneacute naviazať sa na molekuly NK tyacutem že sa včlenia medzi susediace baacutezy Po ožiareniacute UV svetlom interkalačneacute činidlaacute naviazaneacute na NK fluoreskujuacute tak sa vizualizuje NK čiacutem intenziacutevnejšie fluoreskuje tyacutem viac NK je v geacutelipruacutežku priacutetomneacute Interkalačneacute činidlo sa buď primieša do geacutelu pri jeho priacuteprave čo umožniacute sledovať migraacuteciu fragmentov NK počas elektroforeacutezy a to po vybratiacute z ELFO aparatuacutery a po ožiareniacute UV svetlom alebo sa geacutel farbiacute po elektroforetickej separaacutecii V minulosti bol na zviditeľnenie NK najčastejšie použiacutevanyacute etidiumbromid kvocircli jeho mutageacutennym vlastnostiam sa v suacutečasnosti nahraacutedza menej mutageacutennymi a netoxickyacutemi činidlami ako suacute napr komerčne dostupneacute SYBRregSafe GelRedtrade GelGreentrade

Kapilaacuterna elektroforeacuteza NK prebieha v špeciaacutelnom priacutestroji genetickom analyzaacutetore (obr 23) ktoryacute musiacute mať zaacutekladneacute komponenty ako suacute elektroacutedy kapilaacutera zdroj vysokeacuteho napaumltia detektor prepojenie s počiacutetačom a softveacuteroveacute vybavenie priestor na vloženie vzoriek atď Genetickyacute analyzaacutetor predstavuje automatizovanyacute systeacutem umožňujuacuteci sekvenovanie určovanie dĺžky DNA fragmentov ndash fragmentačnuacute analyacutezu a kvantifikaacuteciu nukleovyacutech kyseliacuten V novšiacutech typoch genetickeacuteho analyzaacutetora je proces analyacutezy od vloženia vzoriek do stojana automatizovanyacute

Vzorka určenaacute na analyacutezu je elektrokineticky injektovanaacute do tenkej kapilaacutery naplnenej lineaacuternym polymeacuterom Vplyvom vysokeacuteho napaumltia sa negatiacutevne nabiteacute fragmenty DNA pohybujuacute v polymeacuteri k pozitiacutevne nabitej elektroacutede Kapilaacuterna elektroforeacuteza je tak citlivaacute že je schopnaacute detegovať jednobaacutezovyacute rozdiel DNA fragmentov DNA fragmenty musia byť pred kapilaacuternou elektroforeacutezou fluorescenčne označeneacute v kapilaacutere suacute separovaneacute na zaacuteklade veľkosti Kraacutetko pred dosiahnutiacutem kladne nabitej elektroacutedy docircjde po excitaacutecii laserovyacutem žiareniacutem k emisii žiarenia fluoroformi (farbičkami) tak že optickyacute detekčnyacute systeacutem zaznamenaacute fluorescenciu ktoraacute je naacutesledne softveacuterovo spracovanaacute a vyhodnotenaacute

Obr 23 Genetickyacute analyzaacutetor

42 RFLP

Metoacuteda polymorfizmu dĺžky restrik čnyacutech fragmentov (angl Restriction Fragment Length Polymorfism) bola prvou metoacutedou využiacutevanou na detekciu DNA variaacuteciiacute rocircznych biologickyacutech vzoriek Princiacutep metoacutedy spočiacuteva v priacutetomnosti polymorfizmov v DNA sekvencii rocircznych ľudiacute ktoreacute zapriacutečinia rozdielny profil (obrazec) DNA fragmentov po štiepeniacute jednou alebo viaceryacutemi restrikčnyacutemi endonukleaacutezami Restrikčneacute endonukleaacutezy (RE) suacute enzyacutemy ktoreacute štiepia DNA molekulu v oblasti špecifickej nukleotidovej sekvencie nazyacutevanej restrik čneacute miesto RE najčastejšie rozpoznaacutevajuacute a štiepia miesto veľkeacute 4-6 baacutez RE suacute priacutetomneacute u prokaryotov (bakteacuterie a archebakteacuterie) kde suacute suacutečasťou restrik čno-modifikačneacuteho systeacutemu akoby prokaryotickeacutej vrodenej imunity sluacutežia

26

na ochranu pred cudzou DNA (napr viacuterusovou) ktoruacute po rozpoznaniacute špecifickej sekvencie štiepia

Restrikčno-modifikačnyacute systeacutem maacute dve zložky 1) modifikačneacute enzyacutemy - metylaacutezy ktoreacute procesom metylaacutecie modifikujuacute určiteacute baacutezy svojej DNA čiacutem ich označia za vlastnuacute DNA takže takaacuteto DNA je potom rezistentnaacute voči štiepeniu restrikčnyacutemi endonukleaacutezami Najčastejšiacutem spocircsobom metylaacutecie u bakteacuteriiacute je metylaacutecia adeniacutenu na N6 pričom vznikne metyladeniacuten alebo cytoziacutenu na C5 metylcytoziacuten 2) restrikčneacute endonukleaacutezy štiepia špecifickeacute miesto dvojvlaacuteknovej DNA ktoreacute je tvoreneacute symetrickou sekvenciou zrkadlovo sa opakujuacutecich nukleotidov ndash tzv palindroacutem Restrikčneacute enzyacutemy sa použiacutevajuacute na štiepenie DNA sekvencie na mieste špecifickom pre tuacute ktoruacute restrikčnuacute endonukleaacutezu napr pri analyacuteze polymorfizmov dĺžky restrikčnyacutech fragmentov (RFLP) analyacuteze jednonukleotidovyacutech polymorfizmov (SNP) mutaacuteciiacute ako aj pri klonovaniacute DNA do vhodnyacutech vektorovyacutech DNA molekuacutel

Po štiepeniacute dvojvlaacuteknovej DNA restrikčnou endonukleaacutezou mocircžu vzniknuacuteť tri typy koncov - 5´-prečnievajuacutece konce (lepiveacute) 3´-prečnievajuacutece konce (lepiveacute) a tupeacute konce (obr 24)

Obr 24 Restrikčneacute štiepenie zanechaacutevajuacutece rocirczne konce tupeacute a lepiveacute

Restrikčneacute štiepenie je často použiacutevanou metoacutedou geacutenovyacutech manipulaacuteciiacute na konštrukciu

hybridnyacutech molekuacutel DNA s naacuteslednyacutem klonovaniacutem Priebeh RFLP analyacutezy je nasledovnyacute restrikčnaacute endonukleaacuteza sa pridaacute k DNA a zmes sa vo

vhodnyacutech reakčnyacutech podmienkach (pufor teplota) inkubuje niekoľko hodiacuten Počas inkubaacutecie docircjde k štiepeniu DNA na špecifickyacutech miestach DNA je potom elektroforeticky separovanaacute v geacuteli a naacutesledne vizualizovanaacute V minulosti po geacutelovej elektroforeacuteze nasledoval Southern blot (čiže prenos separovanyacutech fragmentov DNA z geacutelu na špeciaacutelnu membraacutenu) (obr 35) po ktorom nastala vizualizaacutecia raacutedioaktiacutevne značenou proacutebou V suacutečasnosti sa kvocircli praacutecnosti a zdravotnyacutem rizikaacutem od Southern blotu upuacutešťa a prechaacutedza sa na ryacutechlejšie menej praacutecne a zdravotne šetrnejšie metoacutedy priateľskejšie aj k životneacutemu prostrediu

RFLP bola prvou metoacutedou použiacutevanou na zistenie DNA profilu (DNA fingerprinting) mapovanie geacutenov zapriacutečiňujuacutece genetickeacute ochorenia a testovanie otcovstva Vaumlčšina RFLP markerov je vysoko lokusovo špecifickyacutech a kodominantnyacutech (obidve alely suacute detekovaneacute u heterozygota)

PCR-RFLP je laboratoacuterne priacutestupnejšia metoacuteda molekulaacuterno-genetickej diagnostiky keďže PCR umožňuje amplifikaacuteciu veľmi malyacutech množstiev DNA Alternatiacutevny naacutezov použiacutevanyacute v literatuacutere je CAPS z angl Cleaved Amplified Polymorphic Sequence assay Použitiacutem špecifickyacutech primerov docircjde PCR metoacutedou k amplifikaacutecii požadovaneacuteho uacuteseku DNA ten sa potom štiepi restrikčnou endonukleaacutezou vo vhodnyacutech podmienkach naacutesledne sa štiepne produkty elektroforeticky separujuacute a vizualizujuacute použitiacutem interkalačnyacutech farbiacutev a UV svetla (obr 25)

27

Obr 25 Princiacutep metoacutedy PCR-RFLP

43 VNTR a STR V geacutenome suacute priacutetomneacute dva typy tandemovyacutech (za sebou nasledujuacutecich) opakovaniacute

1) minisatelity ndash nazyacutevaneacute variabilnyacute počet tandemovyacutech opakovaniacute VNTR (variable number of tandem repeats) 2) mikrosatelity tiež kraacutetke tandemoveacute repetiacutecie STR (short tandem repeats)

Obidva tieto typy satelitnej DNA suacute rozmiestneneacute po celom genoacuteme suacute využiacutevaneacute hlavne vo forenznej genetike na identifikaacuteciu osocircb a určenie otcovstva popriacutepade materstva ale aj v mediciacutene na detekciu chromozoacutemovyacutech aneuploidiiacute Štruktuacutera obidvoch je podobnaacute Rozdiel medzi jednotlivyacutemi alelami je spocircsobenyacute rozdielnym počtom opakovaniacute opakujuacutecej sa sekvencie (motiacutevu) čo spocircsobiacute rocircznu dĺžku alel s rocircznym počtom tandemovyacutech opakovaniacute nazyacutevanuacute polymorfizmus dĺžky fragmentov

VNTR ndash variabilnyacute počet tandemovyacutech opakovaniacute pričom opakujuacuteca sa sekvencia maacute dĺžku od 6 do 100 baacutez pričom sa mocircže opakovať aj tisiacutece kraacutet alely tak mocircžu mať od 500do 30 000 baacutez VNTR boli v kombinaacutecii s RFLP (DNA fingerprinting ) prvyacutem polymorfizmom použiacutevanyacutem na zistenie DNA profilov a identifikaacuteciu osocircb v kriminalistickej praxi V suacutečasnosti jeho využitie v kriminalistike je kvocircli potrebe relatiacutevne veľkeacuteho množstva DNA nahradeneacute využitiacutem STR

STR - kraacutetke tandemoveacute repetiacutecie suacute v kriminalistike najčastejšie použiacutevanyacutem polymorfizmom STR lokusy suacute rozmiestneneacute po celom genoacuteme repetiacutecia obsahuje jednu až šesť baacutez pričom jej opakovaniacutem vznikne STR v rozsahu od 50 do 300bp V našom genoacuteme suacute tisiacutece STR ktoreacute mocircžu byť použiteacute pre forenznuacute analyacutezu V kriminalistike sa v suacutečasnosti na identifikaacuteciu osocircb použiacuteva 13 STR locusov ktoreacute patria k medzinaacuterodne uznaacutevanyacutem štandardom Z iniciatiacutevy FBI bola vytvorenaacute databaacuteza CODIS (Combined DNA Index System) každaacute krajina maacute svoju databaacutezu CODIS kde je možneacute vložiť a archivovať DNA profily jednotlivcov ako aj profily DNA ziacuteskanyacutech z miest kriminaacutelneho činu v databaacuteze je ich možneacute navzaacutejom porovnať a tak zistiť pocircvodcu trestneacuteho činu Medzinaacuterodnaacute jednotnosť v použiacutevaniacute CODIS STR lokusov umožňuje v priacutepade potreby vzaacutejomneacute porovnanie DNA profilov zistenyacutech na uacutezemiacute rocircznych štaacutetov CODIS STR lokusov je 13 a suacute to CSF1PO FGA TH01 TPOX VWA D3S1358 D5S818 D7S820 D8S1179 D13S317 D16S539 D18S51 a D21S11 Zistenie DNA profilu sa uskutočniacute multiplexnou PCR reakciou s fluorescenčne značenyacutemi primermi špecifickyacutemi pre konkreacutetny STR Naacutesledne suacute PCR produkty analyzovaneacute kapilaacuternou elektroforeacutezou genetickyacutem analyzaacutetorom ktoryacute rozliacuteši amplifikovaneacute fragmenty na zaacuteklade fluorescencie a dĺžky (fragmentačnaacute analyacuteza) (obr 26 Tab 3) DNA profil každeacuteho človeka je jedinečnyacute rovnakyacute profil mocircžu mať len jednovaječneacute dvojčataacute

28

Obr 26 Ukaacutežka DNA profilu človeka 15 STR lokusov s určeniacutem pohlavia pomocou lokusu pre amelogeniacuten (ženskeacute pohlavie - XX) maleacute oranžoveacute piacuteky predstavujuacute fragmenty veľkostneacuteho štandardu Tabuľka č 3 Zaacutepis DNA profilu človeka z obraacutezka č 26 15 STR lokusov s určeniacutem pohlavia pomocou lokusu pre amelogeniacuten System Alela 1 Alela 2

D3S1358 16 17

TH01 9 93 D21S11 28 28

D18S51 15 18

Penta E 7 14 D5S818 9 12

D13S317 8 11

D7S820 8 11 D16S539 11 12

CSF1PO 10 11

Penta D 11 12 vWA 15 18

D8S1179 13 16

TPOX 8 9 FGA 20 21

amel X X

29

5 MLPA

Multiplexnaacute amplifikaacutecia proacuteb zaacutevislaacute od ligaacutecie (z angl multiplex ligation-dependent probe amplification) je metoacuteda schopnaacute v jednej reakcii (v jednej skuacutemavke a vzorke) detegovať zmeny v počte až 50 nukleotidovyacutech sekvenciiacute Metoacutedou MLPA je možneacute ryacutechlo identifikovať amplifikaacutecie (duplikaacutecie) a deleacutecie veľkeacuteho počtu geacutenov či už použitiacutem DNA alebo mRNA krvnyacutech vzoriek alebo vzoriek z naacutedorov

Princiacutep MLPA spočiacuteva v multiplexnej amplifikaacutecii 50 špecifickyacutech nukleotidovyacutech sekvenciiacute použitiacutem jedneacuteho paacuteru primerov pričom jeden primer je fluorescenčne označenyacute Vyacutesledneacute PCR produkty suacute analyzovaneacute kapilaacuternou elektroforeacutezou (fragmentačnaacute analyacuteza) Dĺžka každeacuteho namnoženeacuteho produktu je jedinečnaacute narastaacute postupne o 6 alebo 9 nukleotidov pričom produkty PCR suacute 120 ndash 500 nukleotidov dlheacute Tento veľkostnyacute rozsah PCR fragmentov (dĺžka 120-500 nukleotidov s naacuterastom postupne o 6 alebo 9 nukleotidov) je optimaacutelny pre kapilaacuternu elektroforeacutezu MLPA multiplexnaacute PCR prebieha za použitia iba jedineacuteho paacuteru primerov ktoreacute amplifikujuacute špecifickeacute sekvencie Trik spočiacuteva v tom že nedochaacutedza k amplifikaacutecii DNA sekvencie ale MLPA proacuteb ktoreacute suacute pridaneacute k vzorkaacutem Každaacute MLPA proacuteba pozostaacuteva z dvoch oligonukleotidov (dve hemiproacuteby) pričom každyacute oligonukleotid obsahuje jednu zo sekvencie rozpoznaacutevanuacute PCR primermi Proacuteba vznikne jedine za predpokladu hybridizaacutecie dvoch oligonukleotidov (hemiproacuteb) k cieľovej sekvencii (geacutenu) a po ligaacutecii enzyacutemom ligaacutezou Iba ligovaneacute proacuteby suacute exponenciaacutelne amplifikovaneacute pomocou jedneacuteho paacuteru primerov Množstvo zligovanyacutech proacuteb teda zaacutevisiacute od množstva cieľovyacutech sekvenciiacute (geacutenov) vo vzorke

Postup MLPA analyacutezy je nasledovnyacute (obr27) K vzorke nukleovej kyseliny (DNA resp mRNA) sa pridaacute zmes 50 jedinečnyacutech proacuteb každaacute

proacuteba je komplementaacuterna k určitej cieľovej sekvencii NK vzorky Každaacute proacuteba však pozostaacuteva z dvoch oligonukleotidov hybridizujuacutecich vedľa seba zaacuteroveň každyacute oligonukleotid (hemiproacuteba) obsahuje pridanuacute sekvenciu rozpoznaacutevanuacute paacuterom PCR primerov Po hybridizaacuteciiacute oligonukleotidov (hemiproacuteb) dochaacutedza k ich ligaacutecii ligaacutezou Ligačnaacute reakcia je tak špecifickaacute že je schopnaacute rozliacutešiť sekvenciu liacutešiacu sa v jednom nukleotide Vyacuteslednyacute ligačnyacute produkt (proacuteba) obsahuje obidve sekvencie pre PCR primery na jednom fragmente čiže mocircže docircjsť k namnoženiu takeacutehoto fragmentu PCR reakciou V priacutepade ak nedocircjde k ligaacutecii priacuteslušnyacutech hemiproacuteb pretože hemiproacuteby nenaacutejdu cieľovuacute sekvenciu na DNA každaacute takaacuteto nezligovanaacute hemiproacuteba maacute len jednu sekvenciu rozpoznaacutevanuacute len jednyacutem PCR primerom v docircsledku čoho nemocircže prebehnuacuteť jej PCR amplifikaacutecia a počas fragmentačnej analyacutezy nie je detegovanaacute pretože negeneruje fluorescenčnyacute signaacutel

Pri MLPA analyacuteze je docircležiteacute okrem MLPA amplifikaacutecie vzorky urobiť aj MLPA amplifikaacuteciu referenčnej vzorky ku ktorej sa bude porovnaacutevať počet geacutenov (cieľovyacutech sekvenciiacute) Po kapilaacuternej elektroforeacuteze MLPA referenčnej a skuacutemanej vzorky porovnaniacutem obsahu nameranyacutech hodnocirct tzv piacutekov priacuteslušnyacutech proacuteb sa určiacute relatiacutevny počet koacutepiiacute v skuacutemanej vzorke

MLPA

1 DNA denaturaacutecia a hybridizaacutecia s MLPA proacutebami (hemiproacuteby)

2 Ligaacutecia (vytvorenie kompletnyacutech proacuteb)

3 PCR amplifikaacutecia proacuteb paacuterom primerov

4 Kapilaacuterna elektroforetickaacute separaacutecia PCR produktov

5 Analyacuteza daacutet

30

Obr 27 Princiacutep MLPA

Firma MRC-Holland v suacutečasnosti ponuacuteka stovky MLPA setov proacuteb ktoreacute suacute vhodneacute na 1) diagnostiku kongenitaacutelnych a dedičnyacutech ochoreniacute 2) zisťovanie profilu naacutedorov 3) zisťovanie metylačneacuteho profilu

MLPA je metoacuteda vhodnaacute na detekciu malyacutech prestavieb (BRCA1 BRCA2 MSH2 atď)

veľkyacutech chromozoacutemovyacutech prestavieb (Williamsov syndroacutem Prader-WilliAngelman syndroacutem atzď)

31

detekciu zmien v počte koacutepii geacutenov (obr 28 29) ako aj zistenie počtu kompletnyacutech chromozoacutemov (chromozoacutem 13 18 21 XY tiež aj z amniovej tekutiny) diagnostiku naacutedorov (zmeny počtu pri ALL CLL atď) kvantifikaacuteciu metylaacutecie (Prader-WilliAngelmanov syndroacutem Fragilnyacute X inaktivaacutecia naacutedorovyacutech supresorovyacutech geacutenov atď) mRNA analyacutezu geacutenov zuacutečastňujuacutecich sa apoptoacutezy alebo zaacutepalov

MS-MLPA (Methylation-Specific MLPA) je varianta MLPA určenaacute špeciaacutelne na analyacutezu aberantnyacutech metylaacutecii imprintovanyacutech oblastiacute ako aj detekciu metylačnyacutech zmien CpG ostrovčekov lokalizovanyacutech bliacutezko promoacutetora Rozdiel oproti štandardnej MLPA spočiacuteva v použitiacute metylačne senzitiacutevneho restrikčneacuteho enzyacutemu HhaI ktoryacute štiepi MS-MLPA proacuteby hybridizovaneacute k nemetylovanej sekvencii Každaacute DNA vzorka určenaacute pre MS-MLPA analyacutezu prejde dvoma reakciami v jednej mikroskuacutemavke štandardnou MLPA analyacutezou (bez štiepenia metylačne senzitiacutevnym enzyacutemom) a v druhej mikroskuacutemavke docircjde okrem ligaacutecie proacuteb aj k metylačne senzitiacutevnemu štiepeniu hybridizovanyacutech proacuteb s nemetylovanou DNA Amplifikujuacute sa len ligovaneacute proacuteby po PCR amplifikaacutecii sa fragmentačnou analyacutezou porovnaniacutem oboch reakciiacute zistia rozdiely v metylačnom profile vzorky k referenčnej vzorke

RT-MLPA (Reverse Transkriptase MLPA) je variaacutecia MLPA určenaacute pre zistenie mRNA profilu vzorky je alternatiacutevou k real-time PCR a mikročipom RT-MLPA nedeteguje mRNA množstvo priamo pretože použiacutevanaacute ligaacuteza nie je schopnaacute ligovať DNA oligonukleotidy keď suacute hybridizovaneacute s RNA Preto RT-MLPA začiacutena reverznou transkripciou so špeciaacutelne navrhnutyacutemi RT primermi tak aby vytvorili kraacutetke oligonukleotidy (cDNA) Potom reakcia pokračuje ako štandardnaacute MLPA

Obr 28 MLPA analyacuteza geacutenu DMD (koacutedujuacuteceho dystrofiacuten) mutaacutecie ktoreacuteho spocircsobujuacute Duchennovu svalovuacute dystrofiu u pacienta je priacutetomnaacute deleacutecia exoacutenu 45 v porovnaniacute s referenčnou vzorkou ndash kontrolou

32

Obr 29 MLPA analyacuteza geacutenu DMD (koacutedujuacuteceho dystrofiacuten) mutaacutecie ktoreacuteho spocircsobujuacute Duchennovu svalovuacute dystrofiu u pacienta suacute priacutetomneacute duplikaacutecie exoacutenov 41 42 43 44 45 (piacuteky vo vzorke pacienta sa porovnajuacute s piacutekmi v kontrole ndash referenčnej vzorke)

33

6 Sekvenovanie

Sekvenovaniacutem rozumieme určenie primaacuternej štruktuacutery DNA teda určenie poradia nukleotidov v reťazci DNA Začiatky moderneacuteho sekvenovania siahajuacute do roku 1977 kedy boli objaveneacute dve metoacutedy sekvenovania 1) chemickaacute metoacuteda Maxama a Gilberta 2) enzymatickaacute metoacuteda Sangera Nicklena a Coulsona

Princiacutep obidvoch metoacuted sekvenovania spočiacuteva v tom že sa vytvoriacute suacutebor DNA molekuacutel s rocircznou veľkosťou ktoreacute suacute zakončeneacute konkreacutetnym nukleotidom tieto DNA molekuly sa elektroforeticky separujuacute v geacuteloch s rozlišovacou schopnosťou 1 nukleotid 61 Chemickaacute metoacuteda

DNA molekuly sa na 5-konci raacutedioaktiacutevne označia raacutedioaktiacutevnym fosforom a naacutesledne sa chemicky modifikujuacute špecificky pre každuacute baacutezu DNA sa potom v modifikovanyacutech miestach štiepi čiacutem vzniknuacute rocirczne dlheacute fragmenty pričom podmienky suacute nastaveneacute tak aby sa DNA na každom mieste štiepila len raz Modifikaacutecia DNA a štiepenie prebehne v štyroch separaacutetnych reakciaacutech (skuacutemavkaacutech) takže po elektroforetickej separaacuteciiacute takto opracovanej DNA v štyroch draacutehach polyakrylamidoveacuteho geacutelu a naacuteslednej autoraacutediografii (podobne ako pri Southernovej hybridizaacutecii) je možneacute odčiacutetať nukleotidovuacute sekvenciu približne 100 nukleotidov od raacutedioaktiacutevneho označenia (v čase objavu Maxama a Gilberta) 62 Sangerova metoacuteda

Zaacuteklady metoacutedy boli popiacutesaneacute už v roku 1975 (metoacuteda plus a miacutenus) ale až vylepšenie použitiacutem dideoxynukleotidov (ddNTP) v roku 1977 došlo k zjednodušeniu sekvenovania Princiacutepom enzyacutemoveacuteho sekvenovania je terminaacutecia (zastavenie) polymerizaacutecie inkorporaacuteciou 2´ 3 -dideoxynukleotidov do novosyntetizujuacuteceho sa vlaacutekna DNA Keďže ddNTP neobsahujuacute hydroxylovuacute skupinu na 3 uhliacuteku riboacutezy nemocircžu sa zuacutečastniť na tvorbe fosfodiesterovej vaumlzby nemocircže sa pripojiť k nim ďalšiacute nukleotid čiže musiacute docircjsť k terminaacuteciiacute polymeraacutecie Reakcia prebieha v štyroch skuacutemavkaacutech s raacutedioaktiacutevne značenyacutem primerom V každej skuacutemavke suacute priacutetomneacute všetky štyri deoxynukleotidtrifosfaacutety (dNTP) ale pre každuacute skuacutemavku je špecifickyacute priacutedavok maleacuteho množstva jedneacuteho z dideoxynukleotidtrifosfaacutetov (v prvej skuacutemavke je ddATP v druhej ddCTP v tretej ddTTP a vo štvrtej ddGTP) Maleacute množstvo ddNTP spocircsobiacute že pri polymerizaacutecii dochaacutedza k prednostneacutemu zaradeniu štandardnyacutech dNTP do narastajuacuteceho reťazca a len občas sa inkorporuje ddNTP čiacutem sa zastaviacute synteacuteza reťazca V každej skuacutemavke tak vznikne suacutebor DNA fragmentov rocircznych veľkostiacute zakončenyacutech priacuteslušnyacutem ddNTP (v prvej skuacutemavke ddATP v druhej ddCTP v tretej ddTTP a vo štvrtej ddGTP) Po elektroforetickej separaacutecii v 4 draacutehach polyakrylamidoveacuteho geacutelu a autoraacutediografii sa z autoraacutediogramu odčiacuteta sekvencia

V suacutečasnosti je sekvenovanie do značnej miery automatizovaneacute pričom využiacuteva princiacutep Sangerovej enzyacutemovej metoacutedy s určityacutemi obmenami Uacutesek DNA ktoryacute treba sekvenovať sa prostredniacutectvom termostabilnyacutech DNA polymeraacutez namnožiacute PCR metoacutedou po ktorej nasleduje sekvenačnaacute reakcia (asymetrickaacute PCR) s fluorescenčne značenyacutemi ddNTP (každyacute druh označenyacute inyacutem fluorescenčnyacutem farbivom) Sekvenačnaacute reakcia prebieha v jednej skuacutemavke s jednyacutem primerom vznikne tak suacutebor jednovlaacuteknovyacutech DNA rocircznej dĺžky ktoreacute suacute na 3konci označeneacute ddNTP so špecifickyacutem fluorescenčnyacutem farbivom Taacuteto metoacuteda sekvenovania sa tiež nazyacuteva rdquodye-terminator cycle sequencingrdquo(obr 30) Po kapilaacuternej elektroforeacuteze vzorky v genetickom analyzaacutetore zaznamenaacutevaniacute fluorescencie jednotlivyacutech fragmentov CCD kamerou a softveacuterovom spracovaniacute sa ziacuteska sekvencia DNA (obr 31)

34

Obr 30 Princiacutep sekvenovania Sangerova dideoxy metoacuteda alebo tzv chain termination method (reťazec zastavujuacuteca metoacuteda) Obr 31 Určenie genotypu plodu a rodičov sekvenčnou analyacutezou DNA ziacuteskanej z plodovej vody (prenataacutelna diagnostika) a perifeacuternej krvi sekvenčnaacute analyacuteza geacutenu ASPA vyacutesledok u plodu priacutetomnaacute mutaacutecia c 914CgtA v homozygotnom stave (AA) rodičia heterozygoti (AC) Uvedenaacute mutaacutecia je v homozygotnom stave kauzaacutelnou priacutečinou Canavanovej choroby

Automatizovaneacute sekvenovanie prinaacuteša viacereacute vyacutehody oproti klasickej Sangerovej metoacutede vyššiu presnosť a ryacutechlosť v jednej sekvenačnej reakcii možnosť osekvenovať až 1200 nukleotidovyacute fragment maleacute množstvo templaacutetu potrebneacute na analyacutezu

35

63 Next Generation Sequencing (NGS)

NGS (sekvenovanie novej generaacutecie) maacute obrovskyacute potenciaacutel v analyacuteze genoacutemov pričom toto označenie zahŕňa viacereacute technologickeacute metoacutedy reprezentovaneacute niekoľkyacutemi firmami Princiacutepom je masiacutevne paralelneacute sekvenovanie čiacutem sa ziacuteskajuacute raacutedovo tisiacutece až milioacuteny sekvenciiacute naraz 631 Sekvenovanie druhej generaacutecie

Na začiatku sa analyzovanaacute DNA vo vaumlčšine priacutepadov fragmentuje (vznikne tak DNA

knižnica) na fragmenty sa pripoja kraacutetke sekvencie ndash adapteacutery naacutesledne sa tieto fragmenty rocircznymi priacutestupmi amplifikujuacute a určiacute sa ich sekvencia Vďaka čiastočnyacutem prekryvom je zo ziacuteskanyacutech sekvencii možneacute poskladať plynuluacute sekvenciu zodpovedajuacutecu pocircvodnej nefragmentovanej DNA

Pyrosekvenovanie je podobne ako Sangerova metoacuteda založenaacute na princiacutepe synteacutezy komplementaacuterneho vlaacutekna DNA avšak rozdiel je v tom že sa na detekciu inkorporaacutecie nukleotidu využiacuteva inyacute systeacutem tvorby luminiscenčneacuteho signaacutelu v priebehu reakcie Pyrosekvenovanie je umožneneacute vďaka aktivite 4 enzyacutemov - DNA polymeraacutezy ATP sulfurylaacutezy luciferaacutezy a apyraacutezy Reakčnaacute zmes obsahuje aj ďalšie komponenty - enzymatickeacute substraacutety adenoziacutenfosfosulfaacutet (APS) d-luciferiacuten sekvenovanyacute templaacutet a cyklicky postupne po jednom type pridaacutevaneacute nukleotidtrifosfaacutety Po zabudovaniacute nukleotidu do novovznikajuacuteceho reťazca docircjde k uvoľneniu pyrofosfaacutetu naacutesledne je využityacute ATP sulfurylaacutezou na synteacutezu ATP z APS počas ďalšej reakcie docircjde k využitiu ATP luciferaacutezou na premenu luciferiacutenu na oxyluciferiacuten čo spocircsobiacute svetelnyacute signaacutel a ten zaznamenaacute detekčnyacute systeacutem Poslednou enzymatickou reakciou je reakcia apyraacutezy ktoraacute odstraacuteni nezainkorporovaneacute nukleotidy a nevyužiteacute ATP aby sa celyacute proces mohol zopakovať s reakčnou zmesou obsahujuacutecou ďalšiacute nukleotidtrifosfaacutet (inyacute ako v predchaacutedzajuacutecej reakcii) Po každej reakcii detektor zaznamenaacuteva emisiu svetla na zaacuteklade intenzity svetla je možneacute určiť či bol vradenyacute priacuteslušnyacute nukleotidtrifosfaacutet či bol inkorporovanyacute jeden priacutepadne viac rovnakyacutech nukleotidtrifosfaacutetov

Zvyacutešenie vyacutekonu pyrosekvenovania umožnila tzv emulznaacute PCR v mikročasticiach a použitie platničky PicoTiterPlatereg toto sekvenovanie zaviedla firma Roche pod pojmom 454 pyrosekvenovanie v roku 2005 Na začiatku sa DNA fragmentuje na uacuteseky dlheacute 400-600 baacutez dvojvlaacuteknovaacute fragmentovanaacute DNA sa liguje s adapteacutermi prostredniacutectvom nich sa naviaže na mikročastice dvojvlaacuteknoveacute fragmenty sa oddelia mikročastice s naviazanyacutemi jednovlaacuteknovyacutemi fragmentami sa premiešajuacute so zmesou oleja a roztoku ktoryacute obsahuje všetky komponenty na uacutespešnuacute PCR Tyacutemto spocircsobom sa okolo každej mikročastice vytvoriacute vlastnyacute mikroreaktor v ktorom prebehne amplifikaacutecia fragmentu Po PCR reakcii sa mikročastice prenesuacute do platničky PicoTiterPlate v ktorej sa do jamky zmestiacute akuraacutet jedna mikročastica a reakčneacute komponenty pyrosekvenačnej reakcie PicoTiterPlatereg maacute 1 600 000 jamiek každaacute jamka maacute maximaacutelny objem 75 picolitra Platnička s mikročasticami sa vložiacute do sekvenačneacuteho systeacutemu ndash priacutestroja v ktorom sa celeacute pyrosekvenovanie uskutočniacute Chemiluminiscenčneacute signaacutely ktoryacutech počas sekvenovania vznikajuacute milioacuteny v priebehu hodiny suacute zachyteneacute CCD kamerou a analyzovaneacute softveacuterom

Firma Illumina predstavila inuacute technoloacutegiu PCR amplifikaacutecia a sekvenovanie sa uskutočňuje na skliacutečku (flow cell) Fragmentaacutecia DNA a pripojenie adapteacuterov prebieha za uacutečasti transpozoacutemov v procese nazvanom tagmentaacutecia Po hybridizaacutecii fragmentov DNA na skliacutečko prebehne v klastroch PCR amplifikaacutecia (tzv mostiacutekovaacute amplifikaacutecia) sekvenaacutecia prebieha za uacutečasti rozdielne fluorescenčne značenyacutech a chemicky modifikovanyacutech nukleotidov pričom každyacute nukleotid emituje fluorescenciu s inou vlnovou dĺžkou Na skliacutečku prebieha paralelne až 6 miliaacuterd sekvenaacutecii (obr 32)

Ďalšiacutemi možnosťami sekvenovania druhej generaacutecie je systeacutem SOLid (vyvinutyacute firmou Applied Biosystem dnes pod Thermo Fisher Scientific) a Ion Semiconductor Sequencing ndash polovodičoveacute ioacutenoveacute sekvenovanie (od firmy Ion Semiconductor Sequencing v suacutečasnosti Thermo Fisher Scientific)

36

Obr 32 Princiacutep sekvenovania novej generaacutecie od firmy Illumina PCR amplifikaacutecia a sekvenovanie sa uskutočňuje na skliacutečku (flow cell) paralelne prebieha až 6 miliaacuterd sekvenaacutecii

632 Sekvenovanie tretej generaacutecie

Pred sekvenovaniacutem netreba amplifikovať DNA PCR metoacutedou ale sekvencia sa ziacuteskava zachyteniacutem signaacutelu v reaacutelnom čase Medzi sekvenovanie tretej generaacutecie patriacute SMRT (Single Molecule Real-Time Sequencing) a Nanopore Sequencing

37

7 Fragmentačnaacute analyacuteza DNA

Je metoacuteda použiacutevanaacute na určenie veľkosti fragmentov DNA ziacuteskanyacutech PCR reakciou Dĺžka amplifikovanyacutech DNA fragmentov sa zistiacute ich porovnaniacutem s veľkostnyacutem štandardom (obr 33) ktoryacute je tvorenyacute DNA fragmentami znaacutemej dĺžky Veľkostnyacute štandard je pred kapilaacuternou elektroforeacutezou zmiešanyacute so vzorkou DNA fragmenty veľkostneacuteho štandardu suacute fluorescenčne označeneacute pričom použiteacute fluorescenčneacute farbivo je ineacute ako fluorescenčneacute farbivo použiteacute na označenie DNA fragmentov vo vyšetrovanej vzorke

Obr 33 Elektroforetogram veľkostneacuteho štandardu použiacutevaneacuteho na určenie veľkostiacute fragmentov analyzovanyacutech kapilaacuternou elektroforeacutezou v genetickom analyzaacutetore (GeneScantrade 500 LIZtrade dye Size Standard) dĺžka fragmentov v nukleotidoch (napr 50 nukleotidov)

Fragmentačnaacute analyacuteza pozostaacuteva z viaceryacutech krokov Prvyacutem je izolaacutecia DNA nasleduje PCR amplifikaacutecia počas ktorej sa novosyntetizovaneacute DNA fragmenty označia fluorescenčnyacutemi farbivami Vzorka s PCR produktom sa pripraviacute na kapilaacuternu elektroforeacutezu tak že sa zmieša s veľkostnyacutem štandardom (sluacuteži na určenie veľkosti fragmentov) a denaturačnou laacutetkou (formamid) nasleduje denaturaacutecia Pripraveneacute vzorky suacute injektovaneacute do priacutestroja (genetickyacute analyzaacutetor) kde v kapilaacutere naplnenej polymeacuterom v elektrickom poli migrujuacute fluorescenčne značeneacute fragmenty DNA na zaacuteklade veľkosti (kapilaacuterna elektroforeacuteza) Počas elektroforeacutezy genetickyacute analyzaacutetor zaznamenaacuteva fluorescenciu fragmentov Analyacutezou daacutet prostredniacutectvom špeciaacutelnych softveacuterov sa ziacuteskajuacute elektroforetogramy z ktoryacutech je možneacute zistiť veľkosť fragmentov ako aj typ fluorescencie (docircležiteacute ak suacute genetickeacute varianty rozliacutešiteľneacute rocircznou fluorescenciou napr SNaPshot) Fragmentačnaacute analyacuteza je suacutečasťou množstva molekulaacuterno-genetickyacutech metoacuted (pozri obr 12 26 28 29 34) ako suacute napr STR analyacuteza (Short Tandem Repeat) AFLP analyacuteza (Amplified Fragment Lenght Polymorfism) RFLPT-RFLP analyacuteza (Restriction Fragment Lenght PolymorfismTerminal Restricted Fragment Lenght Polymorfism) SSCP (Single Strand Conformation Polymorfism) VNTR (Variable Number of Tandem Repeat) analyacuteza straty heterozygotnosti (LOH loss of heterozygozity) MLPA (Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification) MSMSA (Methylation-Sensitive Mobility Shift Assay) SNP genotypovanie (SNaPshotreg) HiCEP (High-Coverage Expression Profiling)

38

Obr 34 Kvantitatiacutevna fragmentačnaacute PCR analyacuteza (QF-PCR) DNA izolovanej z plodovej vody vyacutesledok prenataacutelnej analyacutezy = priacutetomnosť troch piacutekov pre chromozoacutem 18 (u všetkyacutech fragmentov detegujuacutecich chromozoacutem 18 je pomer vyšetrovanyacutech markerov aberantnyacute 21 resp 111) čo znamenaacute trizoacutemiu chromozoacutemu 18 Edwardsov syndroacutem

39

8 Metoacutedy založeneacute na princiacutepe hybridizaacutecie

Nukleoveacute kyseliny majuacute schopnosť vytvaacuterať dvojvlaacuteknoveacute reťazce z jednovlaacuteknovyacutech molekuacutel na zaacuteklade komplementarity baacutez Komplementarita baacutez umožňuje replikaacuteciu DNA transkripciu RNA komplementarita baacutez zabezpečuje teda reprodukovateľnosť živej hmoty

Hybridizaacutecia je proces v ktorom na zaacuteklade komplementarity baacutez dochaacutedza k vytvoreniu dvojvlaacuteknovej nukleovej kyseliny z dvoch jednovlaacuteknovyacutech molekuacutel DNA alebo RNA alebo ich kombinaacuteciou DNA RNA pričom kratšia jednovlaacuteknovaacute nukleovaacute kyselina vystupuje ako sonda (proacuteba) Hybridizaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten je jeden z najpoužiacutevanejšiacutech naacutestrojov v molekulaacuternej bioloacutegii a genetike (hybridizaacutecia primerov alebo proacuteb sa využiacuteva v takmer každej metoacutede - v PCR RT-PCR qPCR RT-qPCR MLPA sekvenovaniacute fragmentačnej analyacuteze FISH DNA mikročipoch atď)

Denaturaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten je proces pri ktorom dochaacutedza k porušeniu vodiacutekovyacutech vaumlzieb medzi vlaacuteknami nukleovyacutech kyseliacuten (strata sekundaacuternej a terciaacutelnej štruktuacutery) tak že docircjde k ich uacuteplneacutemu oddeleniu vzniknuacute jednovlaacuteknoveacute reťazce Denaturaacutecia NK mocircže byť spocircsobenaacute vplyvom vysokyacutech teplocirct pH alebo chemickyacutech laacutetok (denaturačneacute činidlaacute) Renaturaacutecia je opačnyacute proces v ktorom na zaacuteklade komplementarity dochaacutedza k tvorbe dvojvlaacuteknovyacutech NK

Hybridiza čnaacute sonda (proacuteba) je jednovlaacuteknovaacute nukleovaacute kyselina určitej znaacutemej dĺžky a sekvencie (najčastejšie DNA pretože je stabilnejšia ako RNA) ktoraacute je značenaacute a sluacuteži na detekciu komplementaacuternych molekuacutel DNA alebo RNA v procese hybridizaacutecie V zaacutevislosti od podmienok hybridizaacutecie (stringencia) mocircže byť detegovanaacute sekvencia uacuteplne komplementaacuterna alebo v menej priacutesnych podmienkach mocircže mať sekvenčneacute odchyacutelky Proacuteba sluacuteži na vyhľadanie a zviditeľnenie cieľovyacutech NK Zviditeľnenie sa deje prostredniacutectvom označenia proacuteby ešte pred hybridizaacuteciou Značenie proacuteby mocircže byť raacutedioaktiacutevne a neraacutedioaktiacutevne (najčastejšie fluorescenčneacute)

Raacutedioaktiacutevne značeneacute proacuteby pomocou izotopov (32P) sa využiacutevali viac v minulosti v suacutečasnosti suacute kvocircli zdravotnyacutem rizikaacutem ohľaduplnosti k životneacutemu prostrediu ako aj kvocircli jednoduchšej manipulaacutecii použiacutevaneacute fluorescenčne značeneacute proacuteby Raacutedioaktiacutevne značeneacute sondy boli použiacutevaneacute hlavne metoacutedou Southernovej hybridizaacutecie (Southern blotting Southern blot) Citlivosť raacutedioaktiacutevne značenyacutech proacuteb je vyššia dosahuje schopnosť zachytiť 10 fg (femtogram 10-15) cieľovej DNA sekvencie 81 Southern blot

Metoacutedu objavil v roku 1975 britskyacute bioloacuteg Edwin Southern (preto Southern) Pri Southernovej hybridizaacutecii sa restrikčne štiepeneacute fragmenty DNA elektroforeticky separujuacute v geacuteli potom sa metoacutedou blottingu prenesuacute na nylonovuacute alebo nitroceluloacutezovuacute membraacutenu kde suacute naacutesledne hybridizovaneacute v roztoku obsahujuacutecom raacutedioaktiacutevne značenuacute sondu Priloženiacutem fotografickeacuteho filmu k membraacutene a vyvolaniacutem filmu autoraacutediografiou docircjde k zviditeľneniu lokaliacutet kde došlo k hybridizaacuteciiacute raacutedioaktiacutevne značenej sondy s fragmentom DNA (autoraacutediogram) Southern blot bol kľuacutečovou a prvou metoacutedou na identifikaacuteciu osocircb (DNA fingerprinting DNA pofiling) (obr 35)

Okrem Southern blotu existuje Northern blot na analyacutezu RNA (geacutenovej expresie) a Western blot na analyacutezu proteiacutenov postup je obdobnyacute ako pri Southern blote s obmenami špecifickyacutemi pre konkreacutetny blot Pri Northern blote sa použiacutevajuacute hybridizačneacute proacuteby ale pre vizualizaacuteciu proteiacutenov western blotom je potrebneacute použiť protilaacutetky s naacuteslednou vizualizaacuteciou Pomenovanie techniacutek je hra so sloviacutečkami (keďže paacuten Northern ani Western neobjavili takto nazvaneacute techniky)

Neraacutedioaktiacutevne značenie proacuteb použiacutevanyacutech v molekulaacuternej genetike mocircže byť nepriame (použitie haptenu) alebo priame Konečnaacute vizualizaacutecia je najčastejšie zabezpečenaacute fluoreskujuacutecimi farebnyacutemi značkami farbivami fluorochroacutemami (fluorofoacuterami) Pri priamom značeniacute je farbička kovalentne naviazanaacute na nukleotid a na zachytenie fluorescencie suacute potrebneacute špeciaacutelne priacutestroje umožňujuacutece excitaacuteciu farbičky ktoraacute potom emituje žiarenie určitej vlnovej dĺžky (emisneacute žiarenie) a to zachytiacute detekčnyacute systeacutem priacutestroja Využitie fluorochroacutemov v molekulaacuternej genetike je masiacutevne napr na vizualizaacuteciu NK elektroforeticky separovanyacutech v geacuteli kvantifikaacuteciu produktov PCR reakcie v priacutestroji real-time PCR cykleacuter sekvenovaniacute fragmentačnej analyacuteze FISH DNA mikročipoch atď

40

Obr 35 Princiacutep Southern blotu

82 FISH (fluorescenčnaacute in situ hybridizaacutecia)

FISH (fluorescent in situ hybridization fluorescenčnaacute in situ hybridizaacutecia) metoacuteda patriacute medzi molekulovo-cytogenetickeacute techniky Princiacutep FISH metoacutedy je založenyacute na hybridizaacuteciiacute fluorescenčne značenyacutech proacuteb ku komplementaacuternym uacutesekom vyšetrovanej DNA na podložnom skle (priamo na mieste - in situ) K denaturaacutecii dsDNA dochaacutedza buď vplyvom denaturačnyacutech činidiel alebo zvyacutešenou teplotou a naacuteslednou renaturaacuteciou dochaacutedza k naviazaniu sondy na komplementaacuterny uacutesek DNA Vyacutesledok hybridizaacutecie sa vizualizuje fluorescenčnyacutem mikroskopom vybavenyacutem vhodnyacutemi fluorescenčnyacutemi filtrami a vizuaacutelne zhodnotiacute skuacutesenyacutem odborniacutekom Fluorescencia sa v niektoryacutech priacutepadoch mocircže zaznamenať a hodnotiť aj pomocou softveacuteru (obr 36)

Pomocou FISH detegujeme numerickeacute aberaacutecie - zmeny v počte chromozoacutemov (napr trizoacutemia monozoacutemia chromozoacutemov) alebo štruktuacuterne aberaacutecie a prestavby (napr translokaacutecie inverzie deleacutecie duplikaacutecie amplifikaacutecie) FISH metoacuteda umožňuje identifikaacuteciu a detekciu každeacuteho ľudskeacuteho chromozoacutemu jeho zaradenie do karyotypu odhalenie malyacutech submikroskopickyacutech chromozoacutemovyacutech zmien a tiež mapovať poziacutecie jednotlivyacutech geacutenov na chromozoacuteme

41

Obr 36 Princiacutep štandardnej FISH a FISH maľovania celeacuteho chromozoacutemu

Veľkou vyacutehodou FISH metoacutedy je možnosť analyacutezy buniek v metafaacuteze aj v interfaacuteze kedy nie je nutnaacute kultivaacutecia buniek a tiež ryacutechle analyzovanie veľkeacuteho počtu buniek (stovky až tisiacutece) K ďalšiacutem vyacutehodaacutem patriacute bezpečnosť vysokaacute citlivosť dostatočnaacute stabilita relatiacutevne kraacutetky čas hybridizaacutecie a možnosť ryacutechleho vyhodnotenia Hybridizaacutecia pri vaumlčšine suacutečasne dodaacutevanyacutech sond trvaacute 10-12 hodin (na trhu suacute už dostupneacute aj sondy so skraacutetenyacutem časom hybridizaacutecie na 2-3 hodiny) Po hybridizaacuteciiacute nasleduje odmyacutevanie kedy pri priacuteslušnej teplote dochaacutedza k odmytiu nenaviazanyacutech a nespraacutevne hybridizovanyacutech sond Preparaacutet sa naacutesledne podfarbiacute a vyacutesledok sa zhodnotiacute vo fluorescenčnom mikroskope Na podfarbenie chromozoacutemov alebo jadier sa použiacuteva modreacute kontrastneacute farbivo DAPI (46-diamidino-2-fenylindol) ktoreacute maacute silneacute fluorescenčneacute vlastnosti dokaacuteže prechaacutedzať jadrovou membraacutenou a viazať sa na DNA Vyacutesledkom je modreacute zafarbenie ktoreacute vyacuteborne kontrastuje so signaacutelmi jednotlivyacutech sond

Limitujuacutecim faktorom FISH je možnosť identifikaacutecie len tyacutech uacutesekov DNA ku ktoryacutem suacute použiteacute sondy V jednej analyacuteze je možneacute použiť najviac 3 odlišne značeneacute sondy a tak zistiť priacutepadneacute abnormality len na 1 alebo na paacuter lokusoch Na relevantnuacute detekciu je potrebneacute mať vo vzorke 1-5 aberantnyacutech interfaacutezovyacutech jadier

FISH je možneacute uskutočniť na širokej škaacutele biologickeacuteho materiaacutelu na vzorkaacutech perifeacuternej krvi kostnej drene naacuteteroch choriovyacutech klkoch plodovej vode rocircznych druhov tkaniacutev natiacutevnych alebo zaliatych v parafiacutene na 1 bunke (predimplantačnaacute genetickaacute diagnostika PGD) (obr 37)

Využiacuteva sa na detekciu aberaacuteciiacute pri mnohyacutech onkologickyacutech ochoreniach (napr pri diagnoacuteze mnohopočetnyacute myeloacutem sa v suacutečasnosti po separaacutecii CD138+ buniek robiacute FISH s 5 sondami pre geacuteny IGH TP53 RB1 oblasť 1p321q21 a stanovuje sa hyperploidia chromozoacutemov 5 9 a 15) a tiež k spresneniu doplneniu a k overeniu bežneacuteho cytogenetickeacuteho vyšetrenia

Podľa miesta na chromozoacuteme na ktorom dochaacutedza k hybridizaacutecii sondy rozlišujeme 4 typy

DNA sond bull centromeacuteroveacute sondy ndash sa viažu na strednuacute časť chromozoacutemu ndash centromeacuteru sluacutežia k diagnostike zmien v počte chromozoacutemov k detekcii chromozoacutemov neznaacutemeho pocircvodu umožňujuacute interfaacuteznu FISH na nedeliacich sa bunkaacutech (obr 38-41)

42

Obr 37 Interfaacutezna FISH preimplantačnyacute genetickyacute skriacutening aneuploidiiacute ndash blastomeacutera 3-denneacuteho ľudskeacuteho embrya s normaacutelnym počtom chromozoacutemov 13 18 21 pohlavie XY použityacutech 5 sond pre chromozoacutemy 13 ndash orange 18 ndash aqua 21 ndash green X ndash blue a Y ndash yellow (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

Obr 38 Interfaacutezne jadro po hybridizaacutecii s centromeacuterovou sondou pre chromozoacutem 8 (Vysis Abbott) V pravom jadre je priacutetomnaacute trizoacutemia chromozoacutemu 8 (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex) Obr 39 Metafaacutezna (A) a interfaacutezna FISH (B) použitaacute centromeacuterovaacute sonda CEPX spectrum orangeCEPY spectrum green (Vysis Abbott) Sonda hybridizuje k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (červenyacute signaacutel) a Y (zelenyacute signaacutel) (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

43

Obr 40 Interfaacutezna FISH vyšetrenie spermiiacute použiteacute sondy CEPX greenCEPY orange (Aneuscore Metasystems) Sondy hybridizujuacute k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (zelenyacute signaacutel) Y (červenyacute signaacutel) vľavo ndash dve haploidneacute spermie (majuacutece jedna spermia X druhaacute Y chromozoacutem) vpravo ndash dve patologickeacute spermie obsahujuacutece gonozoacutemovyacute komplement XY (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

Obr 41 Interfaacutezna FISH vyšetrenie spermiiacute použiteacute sondy CEPX greenCEPY orange a CEP18 aqua (Aneuscore Metasystems) Sondy hybridizujuacute k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (zelenyacute signaacutel) Y (červenyacute signaacutel) a 18 (modryacute signaacutel) vľavo ndash normaacutelne haploidneacute ľudskeacute spermie - 1x chromozoacutem X alebo Y a jedenkraacutet chromozoacutem 18 v strede ndash patologickaacute spermia obsahujuacuteca gonozoacutemovyacute komplement XY a jeden chromozoacutem 18 vpravo ndash patologickaacute diploidnaacute spermia s chromozoacutemami X Y a dvoma chromozoacutemami 18 (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

bull lokusovo špecifickeacute sondy ndash hybridizaacutecia prebehne na konkreacutetnom mieste geacutenu (lokuse) (obr 42-44) použiacutevajuacute sa k vyšetreniu mikrodeleacuteciiacute (straty malyacutech častiacute chromozoacutemu pri mikrodelečnyacutech syndroacutemoch) k zisteniu amplifikaacutecie onkogeacutenov a niektoryacutech špecifickyacutech translokaacuteciiacute prestavby geacutenov umožňujuacute interfaacuteznu FISH na nedeliacich sa bunkaacutech bull subtelomeroveacute ndash vaumlzba na koncoveacute časti chromozoacutemu ndash telomeacutery bull celochromozoacutemoveacute alebo celomaľovacie sondy ndash sondy hybridizujuacute s mnohopočetnyacutemi chromozoacutemovyacutemi sekvenciami pričom sa fluorescenčne tak bdquovymaľujeldquo celyacute chromozoacutem (Obr 45) Použiacutevajuacute sa na vyšetrenie chromozoacutemovyacutech prestavieb k analyacuteze translokaacuteciiacute a k detekcii pocircvodu tzv marker chromozoacutemov (malyacutech nadpočetnyacutech chromozoacutemov neznaacutemeho pocircvodu) K použitiu sondy suacute potrebneacute metafaacutezne chromozoacutemy nepoužiacutevaju sa pre interfaacuteznu FISH

Pri konvenčnej chromozoacutemovej FISH suacute homogeacutenne DNA proacuteby hybridizovaneacute s fixovanyacutem metafaacuteznym alebo prometafaacuteznym chromozoacutemomchromozoacutemami na skliacutečku (Obr 36a) Maximaacutelna rozlišovacia schopnosť metafaacuteznej FISH je niekoľko megabaacutez (Obr 39a 45) využitiacutem viac

44

natiahnutyacutech prometafaacuteznych chromozoacutemov sa dosiahne 1 Mb rozliacutešenie Prostredniacutectvom fiber FISH konkreacutetne artificiaacutelne deproteinizovanej natiahnutej DNA pripravenej in situ z celyacutech buniek na mikroskopickom skliacutečku je možneacute vizualizovať individuaacutelne geacuteny maleacute DNA elementy na chromozoacuteme s rozliacutešeniacutem okolo 1000 bp

Obr 42 Interfaacutezne jadro po hybridizaacutecii s lokusovo-špecifickou sondou LSI 5q31 Spectrum Orange5p12 Spectrum Green (Vysis Abbott) Na ľavom obraacutezku suacute priacutetomneacute dva červeneacute (5q31) a dva zeleneacute signaacutely (5p12) v pravom jadre je priacutetomnaacute deleacutecia 5q31 oblasti chyacuteba jeden červenyacute signal (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

Obr 43 Interfaacutezna FISH použitaacute lokusovo-špecifickaacute sonda ndash translokačnaacute - XL BCRABL1 plus (Metasystems) dvojfarebnaacute dvojfuacutezna kde červenaacute označuje lokus ABL1 na chromozoacuteme 9 a zelenaacute oblasť BCR na chromozoacuteme 22 Sonda deteguje fuacuteziu protoonkogeacutenu ABL1 (9q34) a geacutenu BCR (22q11) v priacutepade že červenyacute a zelenyacute signaacutel suacute pri sebe (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

45

Obr 44 Interfaacutezna FISH Použitaacute lokusovo-špecifickaacute sonda- typ break apart pre IGH geacuten V docircsledku translokaacutecie došlo k rozskočeniu geacutenu pričom translokačneacuteho partnera nepoznaacuteme vieme určiť len percento v koľkyacutech jadraacutech je geacuten prestavanyacute (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex) Obr 45 Použiteacute celochromozoacutemoveacute sondy WCP 15 (červenyacute chromozoacutem) a WCP 17 (zelenyacute chromozoacutem) Na metafaacuteze je potvrdenaacute reciprokaacute translokaacutecia t(1517)(q2221) (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

FISH vizualizaacutecia celeacuteho chromozoacutemu maľovanie chromozoacutemu anglicky chromosome

painting je špeciaacutelnou aplikaacuteciou chromozoacutemovej FISH proacuteba je koktail veľkeacuteho počtu rocircznych fluorescenčne značenyacutech DNA fragmentov hybridizujuacutecich pozdĺž celeacuteho konkreacutetneho chromozoacutemu (obr 36b 45) bdquoChromosomepaintingldquo analyzuje metafaacutezne chromozoacutemy V minulosti bola FISH vizualizaacutecia celyacutech chromozoacutemov limitovanaacute malyacutem množstvom rocirczne sfarbenyacutech fluorochroacutemov

V suacutečasnosti je možneacute detegovať množstvo cieľovyacutech sekvenciiacute naraz čo sa využiacuteva pri celogenoacutemovej chromozoacutemovej vizualizaacutecii (whole-chromosomepainting - WCP) metoacutedou multiplex FISH (M-FISH multicolor FISH o br 46) alebo spektraacutelnej karyotypizaacutecie (SKY) kedy možno rozliacutešiť všetky ľudskeacute chromozoacutemy ndash teda 24 rocircznych chromozoacutemov M-FISH a SKY patria medzi metafaacutezne formy FISH diagnostiky ktoreacute umožňujuacute simultaacutennu vizualizaacuteciu všetkyacutech ľudskyacutech chromozoacutemov v rocircznych farbaacutech čo predstavuje uľahčenie analyacutezy karyotypu hlavne pri komplexnyacutech zmenaacutech a markeroch neznaacutemeho pocircvodu Obe techniky vychaacutedzajuacute z použitia

46

celochromozoacutemovyacutech sond značenyacutech kombinaacuteciou viaceryacutech fluorochroacutemov Rozdiel medzi M-FISH a SKY spočiacuteva v technike ziacuteskania konečneacuteho obrazu

Obr 46 Multicolor FISH - každyacute chromozoacutemovyacute paacuter je zafarbenyacute inou farbou pričom na ich zafarbenie postačuje kombinaacutecia 5 fluorochroacutemov Na vyhodnocovanie je potrebnaacute špeciaacutelna sada fluorescenčnyacutech filtrov pre jednotliveacute fluorochroacutemy a špeciaacutelnyacute softweacuter Vľavo-štandardnyacute karyotyp vpravo karyotyp s mutaacuteciami (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

V molekulovej cytogenetike suacute komerčne dostupneacute sety M-FISH proacuteb umožňujuacutece

viacfarebneacute pruacutežkovanie chromozoacutemov (banding) s vysokyacutem rozliacutešeniacutem (multicolor-banding mBAND FISH MCB) čo umožňuje identifikaacuteciu intrachromozoacutemovyacutech prestavieb (Obr 47) Nevyhnutnosťou mBAND-u je mať chromozoacutemy v metafaacuteze Taacuteto metoacuteda bola prvyacutekraacutet uskutočnenaacute na chromozoacuteme 5 v roku 1999 mBAND FISH umožňuje rozliacutešiť špecifickeacute oblasti chromozoacutemov na uacuterovni pruacutežku - bandu a sub-bandu s detekciou 550 bandov haploidneacuteho karyotypu

Obr 47 A - mBAND chromozoacutemu 11 - inverzia duplikovanej oblasti 11q223-q25 B - mBAND chromozoacutemu 3 - na kruhovom chromozoacuteme deleacutecia oblasti 3p263 C - mBAND chromozoacutemu 2 - potvrdenie inverzie duplikovanej časti chromozoacutemu (poskytnuteacute RNDr Dagmar Landlovou Medirex)

FISH metoacuteda a jej varianty (M-FISH mBAND SKY) majuacute v suacutečasnosti širokeacute využitie v

klinickej genetike v onkologickej genetike na detekciu aberaacuteciiacute v čase diagnoacutezy počas liečby po

47

liečbe monitorovanie po transplantaacutecii kostnej drene v prenataacutelnej a postnataacutelnej diagnostike pri detekcii submikroskopickyacutech deleacuteciiacute (napr DiGeorge syndroacutem - 22q112 delečnyacute syndroacutem PraderndashWilli syndroacutem- chromozoacutem 15q11-13) prostredniacutectvom FISH je možnaacute detekcia numerickyacutech zmien chromozoacutemov (trizoacutemia chromozoacutemu 21 pri Downovom syndroacuteme trizoacutemia chromozoacutemu 15 pri Patauovom syndroacuteme trizoacutemia chromozoacutemu 18 pri Edwardsovom syndroacuteme) rocirczne zmeny v počte pohlavnyacutech chromozoacutemov (monozoacutemia X pri Turnerovom syndroacuteme Klinefelterov syndroacutem s X chromozoacutemom naviac - XXY) podobne v predimplantačnej diagnostike

83 DNA Microarray (DNA mikro čip biočip) DNA mikročipovanie je technika využiacutevajuacuteca hybridizaacuteciu skuacutemanej nukleovej kyseliny

(cieľovaacute vzorka) s veľkyacutem množstvom oligonukleotidovyacutech proacuteb (desať tisiacutec až milioacuten) ktoreacute suacute prichyteneacute na pevnyacute podklad najčastejšie sklenyacute silikoacutenovyacute alebo nylonovyacute (doštička čip) Skuacutemanaacute nukleovaacute kyselina je pred hybridizaacuteciou fragmentovanaacute označenaacute fluorofoacuterom a denaturovanaacute Po kontakte čipu s cieľovou vzorkou ktoraacute je vlastne zmes označenyacutech oligonukleotidov značeneacute oligonukleotidy hybridizujuacute s oligonukleotidovyacutemi sekvenciami prichytenyacutemi na čipe Potom suacute na zaacuteklade fluorescencie detekovaneacute miesta kde došlo k hybridizaacutecii čiže vzorka obsahovala takuacuteto nukleotidovuacute sekvenciu Z jedneacuteho mikročipu sa ziacuteska obrovskeacute množstvo daacutet ktoreacute je vždy nutneacute softveacuterovo spracovať V dnešnej dobe existuje niekoľko firiem poskytujuacutecich komerčne mikročipy na objednaacutevku alebo si ich laboratoacuteria produkujuacute sami

Mikročipovanie prebieha nasledovne

1) Vytvorenie DNA čipu ndash tisiacutece rocircznych jednovlaacuteknovyacutech DNA oligonukleotidov znaacutemych sekvencii sa kovalentne naviažu na povrch doštičky vždy v určitej lokalite je niekoľko rovnakyacutech oligonukleotidov veľkosť takejto lokality je ˂ 200 microm Proacutebami mocircže byť DNA cDNA alebo syntetizovaneacute oligonukleotidy Už hotoveacute mikročipy ponuacutekajuacute viacereacute firmy (Affymetrix Agilent Technologies Eppendorf Illumina) alebo si ich jednotliveacute laboratoacuteria vyraacutebajuacute sami pomocou robotickyacutech zariadeniacute DNA čip sa vytvaacutera buď nanaacutešaniacutem kvapiek oligonukleotidov na podklad alebo synteacutezou oligonukleotidov in situ na čipe 2) Priacuteprava vzorky ndash nukleovaacute kyselina (mRNA DNA) sa purifikuje určiacute sa jej kvantita a kvalita (spektrofotometericky) fragmentuje resp v priacutepade mRNA sa syntetizuje cDNA v priacutepade potreby sa mocircže DNA amplifikovať PCR reakciou štiepiť restrikčnyacutemi endonukleaacutezami 3) Fluorescenčneacute označenie (zriedkavejšie raacutedioaktiacutevne) fragmentov DNA prebieha počas reverznej transkripcie alebo PCR amplifikaacutecie za uacutečasti fluorescenčne značenyacutech nukleotidov Keď sa analyzujuacute dve rocirczne vzorky napr zdraveacute tkanivo a naacutedoroveacute tkanivo označenie nukleovyacutech kyseliacuten v tyacutechto tkanivaacutech byacuteva rozdielne a to použitiacutem dvoch rocircznych fluorescenčnyacutech farbiacutev (napr zeleneacute a červeneacute) Pred hybridizaacuteciou je potrebneacute vzorku denaturovať čiacutem sa vytvoriacute zmes jednovlaacuteknovyacutech DNA označenyacutech značkou 4) Hybridizaacutecia s mikročipom ndash v špeciaacutelnom hybridizačnom roztoku hybridizujuacute komplementaacuterne sekvencie zo vzorky s priacuteslušnyacutemi oligonukleotidovyacutemi sondami naviazanyacutemi na čipe Potom sa čip obmyje aby došlo k odstraacuteneniu čiastočne hybridizovanyacutech nukleovyacutech kyseliacuten 5) Skenovanie mikročipu ndash skenerom čipov docircjde k ožiareniu čipu laserom pričom v mieste hybridizaacutecie fluorescenčne značenyacutech DNA fragmentov s proacutebou docircjde k emisii svetla určitej vlnovej dĺžky ktoruacute skener zaznamenaacute 6) Analyacuteza daacutet prebieha metoacutedami bioinformatiky spracovaniacutem softveacutermi sa zistiacute ktoreacute lokality čipu navzaacutejom hybridizovali v priacutepade použitia dvoch vzoriek kontrolnej a skuacutemanej je možneacute analyzovať ich relatiacutevnu intenzitu hybridizaacutecie (expresie určiteacuteho geacutenu)

Existujuacute štyri typy mikročipov 1) Čipy ur čeneacute na analyacutezu expresie (obsahujuacute cDNA proacuteby) pre tzv dvojkanaacutelovyacute experiment kedy je vzorka určenaacute k hybridizaacutecii na čipe ziacuteskanaacute zmiešaniacutem DNA fragmentov kontrolnej a skuacutemanej vzorky pričom fragmenty suacute rozdielne fluorescenčne označeneacute (napr zelenyacute fluorofoacuter pre kontrolnuacute vzorku a červenyacute pre skuacutemanuacute) Na zaacuteklade intenzity a typu fluorescencie sa deteguje expresia geacutenov typickaacute pre kontrolnuacute vzorku (napr zelenaacute fluorescencia) pre skuacutemanuacute vzorku (napr

48

červenaacute fluorescencia) a expresia podobnaacute u oboch vzoriek (žltaacute fluorescencia) neexprimovaneacute geacuteny (čierna fluorescencia) rocirczne odtiene (v zaacutevislosti od prevažujuacutecej hybridizaacutecie) (obr 48) 2) Čipy ur čeneacute na analyacutezu mutaacutecii použije sa genoacutemovaacute DNA označenaacute jednou fluorescenčnou farbičkou na určenie jednonukleotidovej zmeny (SNP ndash Single Nukleotide Polymorphism) 3) Čipy na komparatiacutevnu genoacutemovuacute hybridizaacuteciu (aCGH array Comparative Genomic Hybridization) ndash použiacutevaneacute na zistenie zvyacutešenia alebo zniacuteženia množstva chromozoacutemovyacutech fragmentov obsahujuacutecich geacuteny zodpovedneacute za určiteacute ochorenie Na analyacutezu sa použije skuacutemanaacute gDNA a referenčnaacute (kontrolnaacute) DNA každaacute sa značiacute inou fluorescenčnou farbičkou (princiacutep ako pri analyacuteze expresie) (obr 49 50) 4) Čipy CGH - SNP kombinovaneacute čipy ur čeneacute na analyacutezu aj mutaacuteciiacute SNP aj na komparatiacutevnu genoacutemovuacute hybridizaacuteciu CGH

Mikročipy majuacute rozsiahle využitie napriacuteklad v identifikaacuteciiacute novyacutech geacutenov vo vyacuteskume ich funkciiacute expresie v rocircznych podmienkach pri diagnostike mnohyacutech ochoreniacute vo farmakogenomike vo vyacuteskume vplyvu toxiacutenov

Obr 48 Heatmapa geacutenovej expresie vybranyacutech geacutenov (mRNA) mikročip obsahuje 46000 cDNA proacuteb (poskytnuteacute Ing Helenou Gbelcovou PhD Uacutestav lekaacuterskej bioloacutegie genetiky a klinickej genetiky LF UK a UNB)

49

Obr 49 Princiacutep komparatiacutevnej genoacutemovej hybridizaacutecie (aCGH - array comparative genomic hybridization) Obr 50 A) Vyacutesledok komparatiacutevnej genoacutemovej hybridizaacutecie (aCGH - array comparative genomic hybridization) vzorky DNA izolovanej plodovej vody U plodu s abnormaacutelnym ultrasonografickyacutem vyšetreniacutem bola identifikovanaacute duplikaacutecia oblasti 3q261q29 (modryacute paacutes) a deleacutecia oblasti 5p1533p151 (červenyacute paacutes) Pre porovnanie chromozoacutem 1 bez aberaacutecie b) Ten istyacute pacient ale ineacute softveacuteroveacute spracovanie (poskytnuteacute RNDr Miroslavom Tomkom PhD Medirex)

50

Odporuacutečanaacute a použitaacute literatuacutera

Odborneacute knihy Klug W S Cummings M R Spencer Ch A Palladino M A Concepts of Genetics jedenaacuteste vydanie (2015) Carson S Molecular Biology Techniques tretie vydanie (2012) Strachan T Read A Human Molecular Genetics štvrteacute vydanie (2011) Sudbery P Sudbery I Human Molecular Genetics tretie vydanie (2009)

Internetoveacute straacutenky

wwwncbinlmnihgov wwwmlpacom wwwthermofishercom wwwilluminacom wwwpromegask wwwqiagencom wwwambioncom

Odborneacute člaacutenky Chacon-Cortes D Griffiths L R Methods for extracting genomic DNA from whole blood samples current perspectives Journal of Biorepository Science for Applied Medicine Volume 2 strany 1- 9 Viltrop T Krjutskov K Palta P Metspalu A Comparison of DNA extraction methods for multiplex polymerase chain reaction Anal Biochem 2010 Volume 398(2) strany 260-262 Ing Martin Čermaacutek Molekulaacuterna cytogenetika v problematike familiaacuternych maligniacutet Onkoloacutegia Volume 2 strany 77 - 83 Livak KJ Schmittgen TD Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method Methods 2001 Volume 25(4) strany 402 - 408 Bustin S A Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays J Mol Endocrinol 2000 Volume 25(2) strany169 - 193

MOLEKULAacuteRNE METOacuteDY AKTUAacuteLNE POUŽIacuteVANEacute V KLINICKEJ GENETIKE RNDr Andrea Pastoraacutekovaacute PhD RNDr Robert Petrovič PhD Vydala Univerzita Komenskeacuteho v Bratislave Lekaacuterska fakulta Rozsah 50 straacuten 246 AH prveacute vydanie ISBN 978-80-223-4231-5

17

2) Faacuteza II nazyacutevanaacute aj exponenciaacutelna faacuteza v ktorej sa fluorescencia zvyacuteši na uacuteroveň optickej detekcie bod resp cyklus kedy začiacutena exponenciaacutelna faacuteza je kľuacutečovyacute na určenie kvantity vstupneacuteho množstva templaacutetovej DNA nazyacuteva sa prahovyacute cyklus označuje sa Ct (angl treshold cycle) alebo Cq (quantification) Čiacutem nižšie je Ct (Cq) tyacutem vaumlčšiacute počet koacutepiiacute templaacutetovej DNA bolo v reakcii Ct hodnota je teda hlavnyacute uacutedaj s ktoryacutem sa pracuje vo vyacutepočtoch fluorescencia v tomto mieste sa nazyacuteva prahovaacute resp treshold 3) Faacuteza III - lineaacuterna faacuteza ndash charakterizuje ju postupneacute spotrebovaacutevanie komponentov reakcie na narastajuacutece množstvo amplikoacutenu 4) Faacuteza IV - plateau (čiacutetaj platoacute) ndash množstvo amplikoacutenu sa v docircsledku vyčerpania zložiek qPCR už nezvyšuje

Obr 13 Princiacutep real-time PCR Obr 14 Faacutezy real-time PCR

Ako štandardnaacute PCR aj qPCR maacute tri zaacutekladneacute kroky 1) Denaturaacutecia dvojvlaacuteknovej DNA na jednovlaacuteknovuacute DNA pri vysokej teplote (obyčajne 95degC) 2) Hybridizaacutecia primerov (annealing) ndash komplementaacuterne sekvencie sa spolu hybridizujuacute 3) Polymerizaacutecia pri 70-72degC kedy v docircsledku optimaacutelnej aktivity DNA polymeraacutezy dochaacutedza k predĺženiu primeru až o 100 baacutez za sekundu

18

Real-time PCR (obr 15) sa využiacuteva na kvantifikaacuteciu expresie geacutenov určenie počtu koacutepiiacute geacutenov určenie genotypu (genotypovanie) alelovou diskriminaacuteciou alebo analyacutezou krivky topenia tzv high resolution melt a multiplexnuacute real time PCR s možnosťou detekcie viaceryacutech cieľovgeacutenov

Multiplexnaacute real-time PCR sa využiacuteva na detekciu viaceryacutech cieľovgeacutenov v jednej reakcii suacutečasne Vyacutehodou multiplexovania je jednak uacutespora vzorky ako aj ziacuteskanie vaumlčšieho množstva informaacuteciiacute z rovnakeacuteho množstva materiaacutelu Nevyhnutnosťou multiplexnej qPCR suacute proacuteby značeneacute rocircznymi fluorescenčnyacutemi farbivami

Najdocircležitejšie zložky qPCR (real-time PCR komponenty) suacute DNA polymeraacuteza (reverznaacute transkriptaacuteza v priacutepade jednokrokovej kvantitatiacutevnej RT-PCT) dNTPs primery resp primeryproacuteby dvojmocneacute Mg templaacutet Na uľahčenie qPCR suacute v suacutečasnosti už komerčne dostupneacute takeacute reakčneacute zmesi ku ktoryacutem stačiacute pridať už len templaacutet (napr kity využiacutevajuacutece TaqManProacuteby) alebo kity s fluorescenčnyacutemi farbami viažucimi sa na dvojvlaacuteknovuacute DNA ku ktoryacutem sa do reakčnej zmesi okrem templaacutetu pridajuacute primery

Obr 15 Real-time PCR cykleacuter

331 Kvantifikaacutecia pomocou qPCR

Na kvantifikaacuteciu DNA pomocou qPCR sa požiacutevajuacute dve zaacutekladneacute metoacutedy - absoluacutetna kvantifikaacutecia a relatiacutevna kvantifikaacutecia

Absoluacutetna kvantifikaacutecia vychaacutedza zo štandardnej krivky (obr 16) ktoraacute sa ziacuteska po qPCR seacuterie riedeniacute DNA znaacutemej koncentraacutecie Kvantifikaacutecia neznaacutemej vzorky sa zistiacute interpolaacuteciou (odčiacutetaniacutem) Ct neznaacutemej vzorky zo štandardnej krivky (obr 16 17) Využiacutevaneacute napr v kriminalistike na stanovenie koncentraacutecie DNA vo vzorke

Relatiacutevna kvantifikaacutecia (obr 18 19) porovnaacuteva uacuteroveň expresie určiteacuteho geacutenu vo vzorke k expresii toho isteacuteho geacutenu v referenčnej (kontrolnej) vzorke alebo množstvo určiteacuteho geacutenu (počet koacutepiiacute) vo vzorke porovnaniacutem s množstvom geacutenu v kontrolnyacutech vzorkaacutech V raacutemci každej vzorky musiacute pred relatiacutevnou kvantifikaacuteciou docircjsť k tzv normalizaacutecii t j porovnanie expresie sledovaneacuteho geacutenu k expresii referenčneacuteho geacutenu (najčastejšie niacutem byacuteva tzv bdquohousekeepingldquo geacuten napr GAPDH aktiacuten tubuliacuten)

V priacutepade kvantifikaacutecie expresie určiteacuteho geacutenu metoacutedou real-time PCR (RT-qPCR) pred samotnou kvantifikaacuteciou cDNA musiacute byť taacuteto cDNA nasyntetizovanaacute prostredniacutectvom reverznej

19

transkripcie za použitia enzyacutemu reverznej transkriptaacutezy Kvantitatiacutevna PCR s reverznou transkripciou RT-qPCR mocircže byť dvojkrokovaacute alebo jednokrokovaacute Pri dvojkrokovej RT-qPCR treba pred qPCR syntetizovať cDNA vlaacutekno z RNA pomocou reverznej transkriptaacutezy - 1 krok druhyacutem krokom je samotnaacute real-time PCR Jednokrokovaacute RT-qPCR umožňuje uskutočniť obidve reakcie reverznuacute transkripciu a kvantitatiacutevnu PCR v jednej skuacutemavke čo zjednodušuje qPCR a redukuje možnosť kontaminaacutecie Obr 16 5-bodovaacute štandardnaacute krivka (amplifikaacutecia piatich koncentraacuteciiacute jednej vzorky konkreacutetne ide o 10-tkoveacute riedenie)

Obr 17 Ukaacutežka amplifikačnyacutech kriviek riedenia a z nich ziacuteskanej štandardnej krivky poukazuje na vysokuacute presnosť metoacutedy RT-PCR

20

Obr 18 Relatiacutevna kvantifikaacutecia - určenie počtu koacutepiiacute geacutenu CYP21A2 vo vzorke DNA izolovanej z perifeacuternej krvi pacientov mutaacutecie v geacutene CYP21A2 spocircsobujuacute kongenitaacutelnu adrenaacutelnu hyperplaacuteziu (CAH) Vyacutesledok analyacutezy všetci pacienti majuacute dve koacutepie geacutenu

Obr 19 Relatiacutevna kvantifikaacutecia - určenie počtu koacutepiiacute geacutenu CYP21A2 vo vzorke DNA izolovanej z plodovej vody mutaacutecie v geacutene CYP21A2 spocircsobujuacute kongenitaacutelnu adrenaacutelnu hyperplaacuteziu (CAH) Prenaacutetalnou diagnostikou (qPCR) sa zistila priacutetomnost jednej koacutepie CYP21A2 geacutenu 332 Určenie genotypu metoacutedou alelovej diskriminaacutecie a analyacutezou krivky topenia (HRM)

Určenie genotypu metoacutedou alelovej diskriminaacutecie (obr 20) sa uskutočňuje použitiacutem hydrolyzujuacutecich proacuteb (sond) je veľmi ryacutechla a senzitiacutevna (presnaacute) metoacuteda frekventovane využiacutevanaacute v laboratoacuteriaacutech Dva variantyalely suacute vyšetreneacute suacutečasne v jednej vzorke a v jednej reakčnej

21

skuacutemavke V reakcii suacute použiteacute dve proacuteby označeneacute rozdielnymi fluorescenčnyacutemi farbičkami emitujuacutecimi svetlo o rocircznej vlnovej dĺžke (najčastejšie jedna označenaacute FAM farbičkou a druhaacute proacuteba označenaacute VIC farbičkou) Počas amplifikaacutecie amplikoacutenu dochaacutedza k odstraacuteneniu zhaacutešača z bliacutezkosti farbičky ktoraacute potom emituje svetlo priacuteslušnej vlnovej dĺžky Vzorky so signaacutelom len jednej fluorescenčnej farbičky (FAM) a bez signaacutelu druhej farbičky (VIC) suacute homozygoti pre alelu 1 vzorky so signaacutelom len druhej farbičky (VIC) a bez signaacutelu prvej (FAM) suacute homozygoti pre alelu 2 v priacutepade ak vyšetrovanaacute vzorka bdquosvietildquo obidvoma farbami jednaacute sa o heterozygota

Obr 20 Určenie genotypu metoacutedou alelovej diskriminaacutecie ndash amplifikačnaacute krivka vzoriek DNA majuacutecich tri rocirczne genotypy A ndash jednotliveacute vzorky (plnaacute čiara predstavuje štandardnuacute alelu guličkovanaacute mutovanuacute alelu) B ndash 72 vzoriek C ndash scatter plot 72 vzoriek

Určenie genotypu analyacutezou krivky topenia tzv high resolution melt (HRM) (obr 21) umožňuje detekciu takmer všetkyacutech genetickyacutech variaacuteciiacute (SNP mutaacuteciiacute) Keďže taacuteto metoacuteda okrem štandardnyacutech podmienok reakcie vyžaduje len primery a farbičku (nie proacuteby) je veľmi jednoduchaacute a lacnejšia Po amplifikaacuteciiacute treba amplikoacuten pomaly zohrievať až kyacutem nedocircjde k denaturaacuteciiacute Teplota topenia amplikoacutenu vo vzorke zaacutevisiacute od DNA sekvencie čo umožňuje detegovať priacutetomnosť mutaacutecie resp SNP Tvar vyacuteslednyacutech kriviek topenia určuje teda genotyp

22

Obr 21 Určenie genotypu analyacutezou krivky topenia tzv metoacutedou high resolution melting (HRM) A ndash krivka topenia vzoriek DNA majuacutecich tri rocirczne genotypy B ndash graf rozdielnosti krivky topenia vzoriek DNA majuacutecich tri rocirczne genotypy

23

4 Elektroforetickaacute separaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten

Separaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten predstavuje rozdelenie molekuacutel DNA alebo RNA na zaacuteklade veľkosti zloženia a poradia baacutez Podobnyacutemi metoacutedami je možneacute separovať aj proteiacuteny

Elektroforeacuteza (ELFO) je technika použiacutevanaacute na separaacuteciu niekedy aj purifikaacuteciu makromolekuacutel ako suacute nukleoveacute kyseliny a proteiacuteny na zaacuteklade ich rozdielnej veľkosti naacuteboja alebo konformaacutecie Je to metoacuteda veľmi často využiacutevanaacute nielen v molekulovej genetike ale aj biocheacutemii Elektroforeacuteza využiacuteva schopnosť nabityacutech molekuacutel migrovať v jednosmernom elektrickom poli k opačneacutemu poacutelu Nukleoveacute kyseliny majuacute vďaka svojej fosfaacutetovej zložke negatiacutevny naacuteboj preto v jednosmernom elektrickom poli migrujuacute ku kladneacutemu poacutelu čiže k anoacutede Elektroforeacuteza prebieha v elektroforetickej aparatuacutere v geacuteloch (v nosiči) so sieťovitou štruktuacuterou ktoraacute umožňuje separaacuteciu molekuacutel Vzorka nukleovej kyseliny zmiešanaacute s tzv nanaacutešaciacutem tlmivyacutem roztokom s farbičkou sa nanesie do jamky v geacuteli ktoryacute je umiestnenyacute v elektroforetickej aparatuacutere v priacutetomnosti elektroforetickeacuteho pufra (TAE alebo TBE) (obr 22) Nanaacutešaciacute tlmivyacute roztoknanaacutešacia farbička umožňuje na zaacuteklade migraacutecie farbičky vidieť migraacuteciu vzorky v geacuteli a suacutečasne zvyacutešeniacutem hustoty vo vzorke umožniacute klesnuacuteť vzorke do jamky a tak zabraacuteniť jej vyplaveniu z geacutelu Draacuteha je časť geacutelu ktoryacutem putuje jedna vzorka od katoacutedy k anoacutede V draacutehe sa nachaacutedzajuacute oddeleneacute jednotliveacute fragmenty nukleovyacutech kyseliacuten určityacutech veľkostiacute viditeľneacute vo forme pruacutežkov (angl bands) Intenzita pruacutežku zaacutevisiacute od množstva molekuacutel danej veľkosti je ekvivalentnaacute hmotnosti Na určenie veľkosti fragmentov NK sa do jednej jamky nanesie štandard molekulovyacutech hmotnostiacute (angl ladder) ktoryacute maacute presne definovaneacute veľkosti fragmentov čo umožňuje odhadnuacuteť veľkosť aj hmotnosť neznaacutemych separovanyacutech fragmentov

Obr 22 Elektroforetickaacute separaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten v agaroacutezovom geacuteli (A) a vizualizaacutecia UV svetlom a GelRedtrade (B C)

24

Nukleoveacute kyseliny je možneacute elektroforeticky separovať 1) v geacuteloch agaroacutezovom (horizontaacutelna elektroforeacuteza) (obr 22) a polyakrylamidovom (vertikaacutelna elektroforeacuteza) 2) v špeciaacutelnych lineaacuternych polymeacuteroch kapilaacuternou elektroforeacutezou použitiacutem genetickeacuteho analyzaacutetora (obr 23)

Agaroacuteza je polysacharid ziacuteskanyacute z morskej riasy použiacuteva sa najčastejšie v koncentraacuteciiacute 05-2 čiacutem vyššia koncentraacutecia tyacutem je geacutel pevnejšiacute a schopnejšiacute rozliacutešiť menšie fragmenty NK Priacuteprava je jednoduchaacute odvaacuteži sa potrebneacute množstvo agaroacutezy ktoraacute sa zmieša s tlmivyacutem roztokom (pufrom) rozvariacute sa v mikrovlnnej ruacutere a naleje sa do špeciaacutelnej naacutedoby na vytvaacuteranie geacutelov kyacutem je geacutel tekutyacute vložiacute sa do neho tzv hrebeň na vytvorenie jamiek Agaroacuteza je netoxickaacute V bežnom agaroacutezovom geacuteli v zaacutevislosti od jeho koncentraacutecie je možneacute separovať DNA fragmenty dĺžky 200-50 000 bp Dnes suacute dostupneacute aj špeciaacutelne agaroacutezy napr MetaPhorreg Agarose schopneacute oddeliť fragment DNA dĺžky 20-800bp Separaacutecia v agaroacutezovom geacuteli prebieha v horizontaacutelnej aparatuacutere preto sa nazyacuteva aj horizontaacutelna elektroforeacuteza

Polyakrylamidovyacute geacutel (PAGE) vznikaacute polymerizaacuteciou akrylamidu v priacutetomnosti špeciaacutelnych chemickyacutech laacutetok (peroxodisiacuteran amoacutenny TEMED bisakrylamid) Jeho priacuteprava je preto odlišnaacute a aj naacuteročnejšia Polyakrylamidoveacute geacutely majuacute vysokuacute rozlišovaciu schopnosť (1bp) preto suacute PAGE geacutely vhodneacute aj na sekvenovanie DNA klasickyacutemi metoacutedami PAGE geacutel nie je vhodnyacute na separaacuteciu fragmentov dlhšiacutech ako 2kb Použiacuteva sa v koncentraacutecii 35 -20 s rozliacutešeniacutem fragmentov od 10bp-2000bp Akrylamid je neurotoxiacuten musiacute sa s niacutem pracovať veľmi opatrne PAGE elektroforeacuteza bežiacute vo vertikaacutelnej aparatuacutere preto sa volaacute aj vertikaacutelna elektroforeacuteza použiacuteva sa často aj na separaacuteciu proteiacutenov

Ryacutechlosť pohybu nukleovyacutech kyseliacuten (mobilita) určuje viacero faktorov 1) veľkosť NK ndash počet baacutezovyacutech paacuterov resp baacutez pričom menšie molekuly prechaacutedzajuacute geacutelom ryacutechlejšie pretože sa ľahšie pohybujuacute v geacuteli 2) konformaacutecia nukleovej kyseliny napr u rovnako veľkyacutech plazmidov kondenzovaneacute superšpiralizovaneacute plazmidy migrujuacute najryacutechlejšie rovnako veľkeacute lineaacuterne molekuly (toho isteacuteho plazmidu) bežia pomalšie a najpomalšie putujuacute relaxovaneacute kruhoveacute molekuly plazmidu 3) koncentraacutecia geacutelu určuje jeho rozlišovaciu schopnosť koncentrovanejšiacute geacutel je schopnyacute separovať kratšie fragmenty NK redšie geacutely suacute vhodneacute pre rozliacutešenie vaumlčšiacutech fragmentov 4) zloženie geacutelu je docircležiteacute pri analyacuteze sekundaacuternych štruktuacuter NK a proteiacutenov v nedenaturovanom stave sekundaacuterna štruktuacutera spomaľuje migraacuteciu NK a proteiacutenov Tento fakt využiacutevajuacute niektoreacute diagnostickeacute techniky (napr SSCP - Single Strand Conformation Polymorphism - polymorfismus konformaacutecie jednovlaacuteknovej DNA) umožňujuacutece detekciu zaacutemeny jedinej baacutezy ktoraacute spocircsobiacute odlišneacute vnuacutetromolekuloveacute paacuterovanie a vyacuteslednuacute konformaacuteciu molekuly Geacutely mocircžu teda byť denaturačneacute a nedenaturačneacute (natiacutevne) 5) napaumltie zdroja - čiacutem vyššie je napaumltie ktoreacute vytvaacutera elektrickeacute pole v elektroforetickej aparatuacutere tyacutem ryacutechlejšie fragmenty NK migrujuacute 6) zloženie roztokov a teploty

Elektroforetickyacute tlmivyacute roztok (pufor - elektrolyt) zabezpečuje stabilneacute elektroforetickeacute podmienky počas separaacutecie geacutel je v ňom ponorenyacute Obsahuje ioacuteny čo umožňuje vedenie elektrickeacuteho pruacutedu

Štandard molekulovyacutech hmotnostiacute (v laboratoacuteriaacutech nazyacutevanyacute ladder alebo marker) je zmes fragmentov DNA alebo RNA s presne definovanou veľkosťou ktoryacute sluacuteži na odhad veľkosti vyšetrovanyacutech fragmentov NK (obr 22) Pomocou špeciaacutelnych štandardov molekulovyacutech hmotnostiacute ktoryacutech fragmenty NK majuacute definovanuacute aj hmotnosť je možneacute odhadnuacuteť množstvo (hmotnosť - koncentraacuteciu) neznaacutemeho fragmentu

B C

25

41 Vizualizaacutecia DNA

Samotnaacute nukleovaacute kyselina je počas elektroforetickej separaacutecie neviditeľnaacute Vizualizaacuteciu NK umožňujuacute interkalačneacute činidlaacute ktoreacute suacute schopneacute naviazať sa na molekuly NK tyacutem že sa včlenia medzi susediace baacutezy Po ožiareniacute UV svetlom interkalačneacute činidlaacute naviazaneacute na NK fluoreskujuacute tak sa vizualizuje NK čiacutem intenziacutevnejšie fluoreskuje tyacutem viac NK je v geacutelipruacutežku priacutetomneacute Interkalačneacute činidlo sa buď primieša do geacutelu pri jeho priacuteprave čo umožniacute sledovať migraacuteciu fragmentov NK počas elektroforeacutezy a to po vybratiacute z ELFO aparatuacutery a po ožiareniacute UV svetlom alebo sa geacutel farbiacute po elektroforetickej separaacutecii V minulosti bol na zviditeľnenie NK najčastejšie použiacutevanyacute etidiumbromid kvocircli jeho mutageacutennym vlastnostiam sa v suacutečasnosti nahraacutedza menej mutageacutennymi a netoxickyacutemi činidlami ako suacute napr komerčne dostupneacute SYBRregSafe GelRedtrade GelGreentrade

Kapilaacuterna elektroforeacuteza NK prebieha v špeciaacutelnom priacutestroji genetickom analyzaacutetore (obr 23) ktoryacute musiacute mať zaacutekladneacute komponenty ako suacute elektroacutedy kapilaacutera zdroj vysokeacuteho napaumltia detektor prepojenie s počiacutetačom a softveacuteroveacute vybavenie priestor na vloženie vzoriek atď Genetickyacute analyzaacutetor predstavuje automatizovanyacute systeacutem umožňujuacuteci sekvenovanie určovanie dĺžky DNA fragmentov ndash fragmentačnuacute analyacutezu a kvantifikaacuteciu nukleovyacutech kyseliacuten V novšiacutech typoch genetickeacuteho analyzaacutetora je proces analyacutezy od vloženia vzoriek do stojana automatizovanyacute

Vzorka určenaacute na analyacutezu je elektrokineticky injektovanaacute do tenkej kapilaacutery naplnenej lineaacuternym polymeacuterom Vplyvom vysokeacuteho napaumltia sa negatiacutevne nabiteacute fragmenty DNA pohybujuacute v polymeacuteri k pozitiacutevne nabitej elektroacutede Kapilaacuterna elektroforeacuteza je tak citlivaacute že je schopnaacute detegovať jednobaacutezovyacute rozdiel DNA fragmentov DNA fragmenty musia byť pred kapilaacuternou elektroforeacutezou fluorescenčne označeneacute v kapilaacutere suacute separovaneacute na zaacuteklade veľkosti Kraacutetko pred dosiahnutiacutem kladne nabitej elektroacutedy docircjde po excitaacutecii laserovyacutem žiareniacutem k emisii žiarenia fluoroformi (farbičkami) tak že optickyacute detekčnyacute systeacutem zaznamenaacute fluorescenciu ktoraacute je naacutesledne softveacuterovo spracovanaacute a vyhodnotenaacute

Obr 23 Genetickyacute analyzaacutetor

42 RFLP

Metoacuteda polymorfizmu dĺžky restrik čnyacutech fragmentov (angl Restriction Fragment Length Polymorfism) bola prvou metoacutedou využiacutevanou na detekciu DNA variaacuteciiacute rocircznych biologickyacutech vzoriek Princiacutep metoacutedy spočiacuteva v priacutetomnosti polymorfizmov v DNA sekvencii rocircznych ľudiacute ktoreacute zapriacutečinia rozdielny profil (obrazec) DNA fragmentov po štiepeniacute jednou alebo viaceryacutemi restrikčnyacutemi endonukleaacutezami Restrikčneacute endonukleaacutezy (RE) suacute enzyacutemy ktoreacute štiepia DNA molekulu v oblasti špecifickej nukleotidovej sekvencie nazyacutevanej restrik čneacute miesto RE najčastejšie rozpoznaacutevajuacute a štiepia miesto veľkeacute 4-6 baacutez RE suacute priacutetomneacute u prokaryotov (bakteacuterie a archebakteacuterie) kde suacute suacutečasťou restrik čno-modifikačneacuteho systeacutemu akoby prokaryotickeacutej vrodenej imunity sluacutežia

26

na ochranu pred cudzou DNA (napr viacuterusovou) ktoruacute po rozpoznaniacute špecifickej sekvencie štiepia

Restrikčno-modifikačnyacute systeacutem maacute dve zložky 1) modifikačneacute enzyacutemy - metylaacutezy ktoreacute procesom metylaacutecie modifikujuacute určiteacute baacutezy svojej DNA čiacutem ich označia za vlastnuacute DNA takže takaacuteto DNA je potom rezistentnaacute voči štiepeniu restrikčnyacutemi endonukleaacutezami Najčastejšiacutem spocircsobom metylaacutecie u bakteacuteriiacute je metylaacutecia adeniacutenu na N6 pričom vznikne metyladeniacuten alebo cytoziacutenu na C5 metylcytoziacuten 2) restrikčneacute endonukleaacutezy štiepia špecifickeacute miesto dvojvlaacuteknovej DNA ktoreacute je tvoreneacute symetrickou sekvenciou zrkadlovo sa opakujuacutecich nukleotidov ndash tzv palindroacutem Restrikčneacute enzyacutemy sa použiacutevajuacute na štiepenie DNA sekvencie na mieste špecifickom pre tuacute ktoruacute restrikčnuacute endonukleaacutezu napr pri analyacuteze polymorfizmov dĺžky restrikčnyacutech fragmentov (RFLP) analyacuteze jednonukleotidovyacutech polymorfizmov (SNP) mutaacuteciiacute ako aj pri klonovaniacute DNA do vhodnyacutech vektorovyacutech DNA molekuacutel

Po štiepeniacute dvojvlaacuteknovej DNA restrikčnou endonukleaacutezou mocircžu vzniknuacuteť tri typy koncov - 5´-prečnievajuacutece konce (lepiveacute) 3´-prečnievajuacutece konce (lepiveacute) a tupeacute konce (obr 24)

Obr 24 Restrikčneacute štiepenie zanechaacutevajuacutece rocirczne konce tupeacute a lepiveacute

Restrikčneacute štiepenie je často použiacutevanou metoacutedou geacutenovyacutech manipulaacuteciiacute na konštrukciu

hybridnyacutech molekuacutel DNA s naacuteslednyacutem klonovaniacutem Priebeh RFLP analyacutezy je nasledovnyacute restrikčnaacute endonukleaacuteza sa pridaacute k DNA a zmes sa vo

vhodnyacutech reakčnyacutech podmienkach (pufor teplota) inkubuje niekoľko hodiacuten Počas inkubaacutecie docircjde k štiepeniu DNA na špecifickyacutech miestach DNA je potom elektroforeticky separovanaacute v geacuteli a naacutesledne vizualizovanaacute V minulosti po geacutelovej elektroforeacuteze nasledoval Southern blot (čiže prenos separovanyacutech fragmentov DNA z geacutelu na špeciaacutelnu membraacutenu) (obr 35) po ktorom nastala vizualizaacutecia raacutedioaktiacutevne značenou proacutebou V suacutečasnosti sa kvocircli praacutecnosti a zdravotnyacutem rizikaacutem od Southern blotu upuacutešťa a prechaacutedza sa na ryacutechlejšie menej praacutecne a zdravotne šetrnejšie metoacutedy priateľskejšie aj k životneacutemu prostrediu

RFLP bola prvou metoacutedou použiacutevanou na zistenie DNA profilu (DNA fingerprinting) mapovanie geacutenov zapriacutečiňujuacutece genetickeacute ochorenia a testovanie otcovstva Vaumlčšina RFLP markerov je vysoko lokusovo špecifickyacutech a kodominantnyacutech (obidve alely suacute detekovaneacute u heterozygota)

PCR-RFLP je laboratoacuterne priacutestupnejšia metoacuteda molekulaacuterno-genetickej diagnostiky keďže PCR umožňuje amplifikaacuteciu veľmi malyacutech množstiev DNA Alternatiacutevny naacutezov použiacutevanyacute v literatuacutere je CAPS z angl Cleaved Amplified Polymorphic Sequence assay Použitiacutem špecifickyacutech primerov docircjde PCR metoacutedou k amplifikaacutecii požadovaneacuteho uacuteseku DNA ten sa potom štiepi restrikčnou endonukleaacutezou vo vhodnyacutech podmienkach naacutesledne sa štiepne produkty elektroforeticky separujuacute a vizualizujuacute použitiacutem interkalačnyacutech farbiacutev a UV svetla (obr 25)

27

Obr 25 Princiacutep metoacutedy PCR-RFLP

43 VNTR a STR V geacutenome suacute priacutetomneacute dva typy tandemovyacutech (za sebou nasledujuacutecich) opakovaniacute

1) minisatelity ndash nazyacutevaneacute variabilnyacute počet tandemovyacutech opakovaniacute VNTR (variable number of tandem repeats) 2) mikrosatelity tiež kraacutetke tandemoveacute repetiacutecie STR (short tandem repeats)

Obidva tieto typy satelitnej DNA suacute rozmiestneneacute po celom genoacuteme suacute využiacutevaneacute hlavne vo forenznej genetike na identifikaacuteciu osocircb a určenie otcovstva popriacutepade materstva ale aj v mediciacutene na detekciu chromozoacutemovyacutech aneuploidiiacute Štruktuacutera obidvoch je podobnaacute Rozdiel medzi jednotlivyacutemi alelami je spocircsobenyacute rozdielnym počtom opakovaniacute opakujuacutecej sa sekvencie (motiacutevu) čo spocircsobiacute rocircznu dĺžku alel s rocircznym počtom tandemovyacutech opakovaniacute nazyacutevanuacute polymorfizmus dĺžky fragmentov

VNTR ndash variabilnyacute počet tandemovyacutech opakovaniacute pričom opakujuacuteca sa sekvencia maacute dĺžku od 6 do 100 baacutez pričom sa mocircže opakovať aj tisiacutece kraacutet alely tak mocircžu mať od 500do 30 000 baacutez VNTR boli v kombinaacutecii s RFLP (DNA fingerprinting ) prvyacutem polymorfizmom použiacutevanyacutem na zistenie DNA profilov a identifikaacuteciu osocircb v kriminalistickej praxi V suacutečasnosti jeho využitie v kriminalistike je kvocircli potrebe relatiacutevne veľkeacuteho množstva DNA nahradeneacute využitiacutem STR

STR - kraacutetke tandemoveacute repetiacutecie suacute v kriminalistike najčastejšie použiacutevanyacutem polymorfizmom STR lokusy suacute rozmiestneneacute po celom genoacuteme repetiacutecia obsahuje jednu až šesť baacutez pričom jej opakovaniacutem vznikne STR v rozsahu od 50 do 300bp V našom genoacuteme suacute tisiacutece STR ktoreacute mocircžu byť použiteacute pre forenznuacute analyacutezu V kriminalistike sa v suacutečasnosti na identifikaacuteciu osocircb použiacuteva 13 STR locusov ktoreacute patria k medzinaacuterodne uznaacutevanyacutem štandardom Z iniciatiacutevy FBI bola vytvorenaacute databaacuteza CODIS (Combined DNA Index System) každaacute krajina maacute svoju databaacutezu CODIS kde je možneacute vložiť a archivovať DNA profily jednotlivcov ako aj profily DNA ziacuteskanyacutech z miest kriminaacutelneho činu v databaacuteze je ich možneacute navzaacutejom porovnať a tak zistiť pocircvodcu trestneacuteho činu Medzinaacuterodnaacute jednotnosť v použiacutevaniacute CODIS STR lokusov umožňuje v priacutepade potreby vzaacutejomneacute porovnanie DNA profilov zistenyacutech na uacutezemiacute rocircznych štaacutetov CODIS STR lokusov je 13 a suacute to CSF1PO FGA TH01 TPOX VWA D3S1358 D5S818 D7S820 D8S1179 D13S317 D16S539 D18S51 a D21S11 Zistenie DNA profilu sa uskutočniacute multiplexnou PCR reakciou s fluorescenčne značenyacutemi primermi špecifickyacutemi pre konkreacutetny STR Naacutesledne suacute PCR produkty analyzovaneacute kapilaacuternou elektroforeacutezou genetickyacutem analyzaacutetorom ktoryacute rozliacuteši amplifikovaneacute fragmenty na zaacuteklade fluorescencie a dĺžky (fragmentačnaacute analyacuteza) (obr 26 Tab 3) DNA profil každeacuteho človeka je jedinečnyacute rovnakyacute profil mocircžu mať len jednovaječneacute dvojčataacute

28

Obr 26 Ukaacutežka DNA profilu človeka 15 STR lokusov s určeniacutem pohlavia pomocou lokusu pre amelogeniacuten (ženskeacute pohlavie - XX) maleacute oranžoveacute piacuteky predstavujuacute fragmenty veľkostneacuteho štandardu Tabuľka č 3 Zaacutepis DNA profilu človeka z obraacutezka č 26 15 STR lokusov s určeniacutem pohlavia pomocou lokusu pre amelogeniacuten System Alela 1 Alela 2

D3S1358 16 17

TH01 9 93 D21S11 28 28

D18S51 15 18

Penta E 7 14 D5S818 9 12

D13S317 8 11

D7S820 8 11 D16S539 11 12

CSF1PO 10 11

Penta D 11 12 vWA 15 18

D8S1179 13 16

TPOX 8 9 FGA 20 21

amel X X

29

5 MLPA

Multiplexnaacute amplifikaacutecia proacuteb zaacutevislaacute od ligaacutecie (z angl multiplex ligation-dependent probe amplification) je metoacuteda schopnaacute v jednej reakcii (v jednej skuacutemavke a vzorke) detegovať zmeny v počte až 50 nukleotidovyacutech sekvenciiacute Metoacutedou MLPA je možneacute ryacutechlo identifikovať amplifikaacutecie (duplikaacutecie) a deleacutecie veľkeacuteho počtu geacutenov či už použitiacutem DNA alebo mRNA krvnyacutech vzoriek alebo vzoriek z naacutedorov

Princiacutep MLPA spočiacuteva v multiplexnej amplifikaacutecii 50 špecifickyacutech nukleotidovyacutech sekvenciiacute použitiacutem jedneacuteho paacuteru primerov pričom jeden primer je fluorescenčne označenyacute Vyacutesledneacute PCR produkty suacute analyzovaneacute kapilaacuternou elektroforeacutezou (fragmentačnaacute analyacuteza) Dĺžka každeacuteho namnoženeacuteho produktu je jedinečnaacute narastaacute postupne o 6 alebo 9 nukleotidov pričom produkty PCR suacute 120 ndash 500 nukleotidov dlheacute Tento veľkostnyacute rozsah PCR fragmentov (dĺžka 120-500 nukleotidov s naacuterastom postupne o 6 alebo 9 nukleotidov) je optimaacutelny pre kapilaacuternu elektroforeacutezu MLPA multiplexnaacute PCR prebieha za použitia iba jedineacuteho paacuteru primerov ktoreacute amplifikujuacute špecifickeacute sekvencie Trik spočiacuteva v tom že nedochaacutedza k amplifikaacutecii DNA sekvencie ale MLPA proacuteb ktoreacute suacute pridaneacute k vzorkaacutem Každaacute MLPA proacuteba pozostaacuteva z dvoch oligonukleotidov (dve hemiproacuteby) pričom každyacute oligonukleotid obsahuje jednu zo sekvencie rozpoznaacutevanuacute PCR primermi Proacuteba vznikne jedine za predpokladu hybridizaacutecie dvoch oligonukleotidov (hemiproacuteb) k cieľovej sekvencii (geacutenu) a po ligaacutecii enzyacutemom ligaacutezou Iba ligovaneacute proacuteby suacute exponenciaacutelne amplifikovaneacute pomocou jedneacuteho paacuteru primerov Množstvo zligovanyacutech proacuteb teda zaacutevisiacute od množstva cieľovyacutech sekvenciiacute (geacutenov) vo vzorke

Postup MLPA analyacutezy je nasledovnyacute (obr27) K vzorke nukleovej kyseliny (DNA resp mRNA) sa pridaacute zmes 50 jedinečnyacutech proacuteb každaacute

proacuteba je komplementaacuterna k určitej cieľovej sekvencii NK vzorky Každaacute proacuteba však pozostaacuteva z dvoch oligonukleotidov hybridizujuacutecich vedľa seba zaacuteroveň každyacute oligonukleotid (hemiproacuteba) obsahuje pridanuacute sekvenciu rozpoznaacutevanuacute paacuterom PCR primerov Po hybridizaacuteciiacute oligonukleotidov (hemiproacuteb) dochaacutedza k ich ligaacutecii ligaacutezou Ligačnaacute reakcia je tak špecifickaacute že je schopnaacute rozliacutešiť sekvenciu liacutešiacu sa v jednom nukleotide Vyacuteslednyacute ligačnyacute produkt (proacuteba) obsahuje obidve sekvencie pre PCR primery na jednom fragmente čiže mocircže docircjsť k namnoženiu takeacutehoto fragmentu PCR reakciou V priacutepade ak nedocircjde k ligaacutecii priacuteslušnyacutech hemiproacuteb pretože hemiproacuteby nenaacutejdu cieľovuacute sekvenciu na DNA každaacute takaacuteto nezligovanaacute hemiproacuteba maacute len jednu sekvenciu rozpoznaacutevanuacute len jednyacutem PCR primerom v docircsledku čoho nemocircže prebehnuacuteť jej PCR amplifikaacutecia a počas fragmentačnej analyacutezy nie je detegovanaacute pretože negeneruje fluorescenčnyacute signaacutel

Pri MLPA analyacuteze je docircležiteacute okrem MLPA amplifikaacutecie vzorky urobiť aj MLPA amplifikaacuteciu referenčnej vzorky ku ktorej sa bude porovnaacutevať počet geacutenov (cieľovyacutech sekvenciiacute) Po kapilaacuternej elektroforeacuteze MLPA referenčnej a skuacutemanej vzorky porovnaniacutem obsahu nameranyacutech hodnocirct tzv piacutekov priacuteslušnyacutech proacuteb sa určiacute relatiacutevny počet koacutepiiacute v skuacutemanej vzorke

MLPA

1 DNA denaturaacutecia a hybridizaacutecia s MLPA proacutebami (hemiproacuteby)

2 Ligaacutecia (vytvorenie kompletnyacutech proacuteb)

3 PCR amplifikaacutecia proacuteb paacuterom primerov

4 Kapilaacuterna elektroforetickaacute separaacutecia PCR produktov

5 Analyacuteza daacutet

30

Obr 27 Princiacutep MLPA

Firma MRC-Holland v suacutečasnosti ponuacuteka stovky MLPA setov proacuteb ktoreacute suacute vhodneacute na 1) diagnostiku kongenitaacutelnych a dedičnyacutech ochoreniacute 2) zisťovanie profilu naacutedorov 3) zisťovanie metylačneacuteho profilu

MLPA je metoacuteda vhodnaacute na detekciu malyacutech prestavieb (BRCA1 BRCA2 MSH2 atď)

veľkyacutech chromozoacutemovyacutech prestavieb (Williamsov syndroacutem Prader-WilliAngelman syndroacutem atzď)

31

detekciu zmien v počte koacutepii geacutenov (obr 28 29) ako aj zistenie počtu kompletnyacutech chromozoacutemov (chromozoacutem 13 18 21 XY tiež aj z amniovej tekutiny) diagnostiku naacutedorov (zmeny počtu pri ALL CLL atď) kvantifikaacuteciu metylaacutecie (Prader-WilliAngelmanov syndroacutem Fragilnyacute X inaktivaacutecia naacutedorovyacutech supresorovyacutech geacutenov atď) mRNA analyacutezu geacutenov zuacutečastňujuacutecich sa apoptoacutezy alebo zaacutepalov

MS-MLPA (Methylation-Specific MLPA) je varianta MLPA určenaacute špeciaacutelne na analyacutezu aberantnyacutech metylaacutecii imprintovanyacutech oblastiacute ako aj detekciu metylačnyacutech zmien CpG ostrovčekov lokalizovanyacutech bliacutezko promoacutetora Rozdiel oproti štandardnej MLPA spočiacuteva v použitiacute metylačne senzitiacutevneho restrikčneacuteho enzyacutemu HhaI ktoryacute štiepi MS-MLPA proacuteby hybridizovaneacute k nemetylovanej sekvencii Každaacute DNA vzorka určenaacute pre MS-MLPA analyacutezu prejde dvoma reakciami v jednej mikroskuacutemavke štandardnou MLPA analyacutezou (bez štiepenia metylačne senzitiacutevnym enzyacutemom) a v druhej mikroskuacutemavke docircjde okrem ligaacutecie proacuteb aj k metylačne senzitiacutevnemu štiepeniu hybridizovanyacutech proacuteb s nemetylovanou DNA Amplifikujuacute sa len ligovaneacute proacuteby po PCR amplifikaacutecii sa fragmentačnou analyacutezou porovnaniacutem oboch reakciiacute zistia rozdiely v metylačnom profile vzorky k referenčnej vzorke

RT-MLPA (Reverse Transkriptase MLPA) je variaacutecia MLPA určenaacute pre zistenie mRNA profilu vzorky je alternatiacutevou k real-time PCR a mikročipom RT-MLPA nedeteguje mRNA množstvo priamo pretože použiacutevanaacute ligaacuteza nie je schopnaacute ligovať DNA oligonukleotidy keď suacute hybridizovaneacute s RNA Preto RT-MLPA začiacutena reverznou transkripciou so špeciaacutelne navrhnutyacutemi RT primermi tak aby vytvorili kraacutetke oligonukleotidy (cDNA) Potom reakcia pokračuje ako štandardnaacute MLPA

Obr 28 MLPA analyacuteza geacutenu DMD (koacutedujuacuteceho dystrofiacuten) mutaacutecie ktoreacuteho spocircsobujuacute Duchennovu svalovuacute dystrofiu u pacienta je priacutetomnaacute deleacutecia exoacutenu 45 v porovnaniacute s referenčnou vzorkou ndash kontrolou

32

Obr 29 MLPA analyacuteza geacutenu DMD (koacutedujuacuteceho dystrofiacuten) mutaacutecie ktoreacuteho spocircsobujuacute Duchennovu svalovuacute dystrofiu u pacienta suacute priacutetomneacute duplikaacutecie exoacutenov 41 42 43 44 45 (piacuteky vo vzorke pacienta sa porovnajuacute s piacutekmi v kontrole ndash referenčnej vzorke)

33

6 Sekvenovanie

Sekvenovaniacutem rozumieme určenie primaacuternej štruktuacutery DNA teda určenie poradia nukleotidov v reťazci DNA Začiatky moderneacuteho sekvenovania siahajuacute do roku 1977 kedy boli objaveneacute dve metoacutedy sekvenovania 1) chemickaacute metoacuteda Maxama a Gilberta 2) enzymatickaacute metoacuteda Sangera Nicklena a Coulsona

Princiacutep obidvoch metoacuted sekvenovania spočiacuteva v tom že sa vytvoriacute suacutebor DNA molekuacutel s rocircznou veľkosťou ktoreacute suacute zakončeneacute konkreacutetnym nukleotidom tieto DNA molekuly sa elektroforeticky separujuacute v geacuteloch s rozlišovacou schopnosťou 1 nukleotid 61 Chemickaacute metoacuteda

DNA molekuly sa na 5-konci raacutedioaktiacutevne označia raacutedioaktiacutevnym fosforom a naacutesledne sa chemicky modifikujuacute špecificky pre každuacute baacutezu DNA sa potom v modifikovanyacutech miestach štiepi čiacutem vzniknuacute rocirczne dlheacute fragmenty pričom podmienky suacute nastaveneacute tak aby sa DNA na každom mieste štiepila len raz Modifikaacutecia DNA a štiepenie prebehne v štyroch separaacutetnych reakciaacutech (skuacutemavkaacutech) takže po elektroforetickej separaacuteciiacute takto opracovanej DNA v štyroch draacutehach polyakrylamidoveacuteho geacutelu a naacuteslednej autoraacutediografii (podobne ako pri Southernovej hybridizaacutecii) je možneacute odčiacutetať nukleotidovuacute sekvenciu približne 100 nukleotidov od raacutedioaktiacutevneho označenia (v čase objavu Maxama a Gilberta) 62 Sangerova metoacuteda

Zaacuteklady metoacutedy boli popiacutesaneacute už v roku 1975 (metoacuteda plus a miacutenus) ale až vylepšenie použitiacutem dideoxynukleotidov (ddNTP) v roku 1977 došlo k zjednodušeniu sekvenovania Princiacutepom enzyacutemoveacuteho sekvenovania je terminaacutecia (zastavenie) polymerizaacutecie inkorporaacuteciou 2´ 3 -dideoxynukleotidov do novosyntetizujuacuteceho sa vlaacutekna DNA Keďže ddNTP neobsahujuacute hydroxylovuacute skupinu na 3 uhliacuteku riboacutezy nemocircžu sa zuacutečastniť na tvorbe fosfodiesterovej vaumlzby nemocircže sa pripojiť k nim ďalšiacute nukleotid čiže musiacute docircjsť k terminaacuteciiacute polymeraacutecie Reakcia prebieha v štyroch skuacutemavkaacutech s raacutedioaktiacutevne značenyacutem primerom V každej skuacutemavke suacute priacutetomneacute všetky štyri deoxynukleotidtrifosfaacutety (dNTP) ale pre každuacute skuacutemavku je špecifickyacute priacutedavok maleacuteho množstva jedneacuteho z dideoxynukleotidtrifosfaacutetov (v prvej skuacutemavke je ddATP v druhej ddCTP v tretej ddTTP a vo štvrtej ddGTP) Maleacute množstvo ddNTP spocircsobiacute že pri polymerizaacutecii dochaacutedza k prednostneacutemu zaradeniu štandardnyacutech dNTP do narastajuacuteceho reťazca a len občas sa inkorporuje ddNTP čiacutem sa zastaviacute synteacuteza reťazca V každej skuacutemavke tak vznikne suacutebor DNA fragmentov rocircznych veľkostiacute zakončenyacutech priacuteslušnyacutem ddNTP (v prvej skuacutemavke ddATP v druhej ddCTP v tretej ddTTP a vo štvrtej ddGTP) Po elektroforetickej separaacutecii v 4 draacutehach polyakrylamidoveacuteho geacutelu a autoraacutediografii sa z autoraacutediogramu odčiacuteta sekvencia

V suacutečasnosti je sekvenovanie do značnej miery automatizovaneacute pričom využiacuteva princiacutep Sangerovej enzyacutemovej metoacutedy s určityacutemi obmenami Uacutesek DNA ktoryacute treba sekvenovať sa prostredniacutectvom termostabilnyacutech DNA polymeraacutez namnožiacute PCR metoacutedou po ktorej nasleduje sekvenačnaacute reakcia (asymetrickaacute PCR) s fluorescenčne značenyacutemi ddNTP (každyacute druh označenyacute inyacutem fluorescenčnyacutem farbivom) Sekvenačnaacute reakcia prebieha v jednej skuacutemavke s jednyacutem primerom vznikne tak suacutebor jednovlaacuteknovyacutech DNA rocircznej dĺžky ktoreacute suacute na 3konci označeneacute ddNTP so špecifickyacutem fluorescenčnyacutem farbivom Taacuteto metoacuteda sekvenovania sa tiež nazyacuteva rdquodye-terminator cycle sequencingrdquo(obr 30) Po kapilaacuternej elektroforeacuteze vzorky v genetickom analyzaacutetore zaznamenaacutevaniacute fluorescencie jednotlivyacutech fragmentov CCD kamerou a softveacuterovom spracovaniacute sa ziacuteska sekvencia DNA (obr 31)

34

Obr 30 Princiacutep sekvenovania Sangerova dideoxy metoacuteda alebo tzv chain termination method (reťazec zastavujuacuteca metoacuteda) Obr 31 Určenie genotypu plodu a rodičov sekvenčnou analyacutezou DNA ziacuteskanej z plodovej vody (prenataacutelna diagnostika) a perifeacuternej krvi sekvenčnaacute analyacuteza geacutenu ASPA vyacutesledok u plodu priacutetomnaacute mutaacutecia c 914CgtA v homozygotnom stave (AA) rodičia heterozygoti (AC) Uvedenaacute mutaacutecia je v homozygotnom stave kauzaacutelnou priacutečinou Canavanovej choroby

Automatizovaneacute sekvenovanie prinaacuteša viacereacute vyacutehody oproti klasickej Sangerovej metoacutede vyššiu presnosť a ryacutechlosť v jednej sekvenačnej reakcii možnosť osekvenovať až 1200 nukleotidovyacute fragment maleacute množstvo templaacutetu potrebneacute na analyacutezu

35

63 Next Generation Sequencing (NGS)

NGS (sekvenovanie novej generaacutecie) maacute obrovskyacute potenciaacutel v analyacuteze genoacutemov pričom toto označenie zahŕňa viacereacute technologickeacute metoacutedy reprezentovaneacute niekoľkyacutemi firmami Princiacutepom je masiacutevne paralelneacute sekvenovanie čiacutem sa ziacuteskajuacute raacutedovo tisiacutece až milioacuteny sekvenciiacute naraz 631 Sekvenovanie druhej generaacutecie

Na začiatku sa analyzovanaacute DNA vo vaumlčšine priacutepadov fragmentuje (vznikne tak DNA

knižnica) na fragmenty sa pripoja kraacutetke sekvencie ndash adapteacutery naacutesledne sa tieto fragmenty rocircznymi priacutestupmi amplifikujuacute a určiacute sa ich sekvencia Vďaka čiastočnyacutem prekryvom je zo ziacuteskanyacutech sekvencii možneacute poskladať plynuluacute sekvenciu zodpovedajuacutecu pocircvodnej nefragmentovanej DNA

Pyrosekvenovanie je podobne ako Sangerova metoacuteda založenaacute na princiacutepe synteacutezy komplementaacuterneho vlaacutekna DNA avšak rozdiel je v tom že sa na detekciu inkorporaacutecie nukleotidu využiacuteva inyacute systeacutem tvorby luminiscenčneacuteho signaacutelu v priebehu reakcie Pyrosekvenovanie je umožneneacute vďaka aktivite 4 enzyacutemov - DNA polymeraacutezy ATP sulfurylaacutezy luciferaacutezy a apyraacutezy Reakčnaacute zmes obsahuje aj ďalšie komponenty - enzymatickeacute substraacutety adenoziacutenfosfosulfaacutet (APS) d-luciferiacuten sekvenovanyacute templaacutet a cyklicky postupne po jednom type pridaacutevaneacute nukleotidtrifosfaacutety Po zabudovaniacute nukleotidu do novovznikajuacuteceho reťazca docircjde k uvoľneniu pyrofosfaacutetu naacutesledne je využityacute ATP sulfurylaacutezou na synteacutezu ATP z APS počas ďalšej reakcie docircjde k využitiu ATP luciferaacutezou na premenu luciferiacutenu na oxyluciferiacuten čo spocircsobiacute svetelnyacute signaacutel a ten zaznamenaacute detekčnyacute systeacutem Poslednou enzymatickou reakciou je reakcia apyraacutezy ktoraacute odstraacuteni nezainkorporovaneacute nukleotidy a nevyužiteacute ATP aby sa celyacute proces mohol zopakovať s reakčnou zmesou obsahujuacutecou ďalšiacute nukleotidtrifosfaacutet (inyacute ako v predchaacutedzajuacutecej reakcii) Po každej reakcii detektor zaznamenaacuteva emisiu svetla na zaacuteklade intenzity svetla je možneacute určiť či bol vradenyacute priacuteslušnyacute nukleotidtrifosfaacutet či bol inkorporovanyacute jeden priacutepadne viac rovnakyacutech nukleotidtrifosfaacutetov

Zvyacutešenie vyacutekonu pyrosekvenovania umožnila tzv emulznaacute PCR v mikročasticiach a použitie platničky PicoTiterPlatereg toto sekvenovanie zaviedla firma Roche pod pojmom 454 pyrosekvenovanie v roku 2005 Na začiatku sa DNA fragmentuje na uacuteseky dlheacute 400-600 baacutez dvojvlaacuteknovaacute fragmentovanaacute DNA sa liguje s adapteacutermi prostredniacutectvom nich sa naviaže na mikročastice dvojvlaacuteknoveacute fragmenty sa oddelia mikročastice s naviazanyacutemi jednovlaacuteknovyacutemi fragmentami sa premiešajuacute so zmesou oleja a roztoku ktoryacute obsahuje všetky komponenty na uacutespešnuacute PCR Tyacutemto spocircsobom sa okolo každej mikročastice vytvoriacute vlastnyacute mikroreaktor v ktorom prebehne amplifikaacutecia fragmentu Po PCR reakcii sa mikročastice prenesuacute do platničky PicoTiterPlate v ktorej sa do jamky zmestiacute akuraacutet jedna mikročastica a reakčneacute komponenty pyrosekvenačnej reakcie PicoTiterPlatereg maacute 1 600 000 jamiek každaacute jamka maacute maximaacutelny objem 75 picolitra Platnička s mikročasticami sa vložiacute do sekvenačneacuteho systeacutemu ndash priacutestroja v ktorom sa celeacute pyrosekvenovanie uskutočniacute Chemiluminiscenčneacute signaacutely ktoryacutech počas sekvenovania vznikajuacute milioacuteny v priebehu hodiny suacute zachyteneacute CCD kamerou a analyzovaneacute softveacuterom

Firma Illumina predstavila inuacute technoloacutegiu PCR amplifikaacutecia a sekvenovanie sa uskutočňuje na skliacutečku (flow cell) Fragmentaacutecia DNA a pripojenie adapteacuterov prebieha za uacutečasti transpozoacutemov v procese nazvanom tagmentaacutecia Po hybridizaacutecii fragmentov DNA na skliacutečko prebehne v klastroch PCR amplifikaacutecia (tzv mostiacutekovaacute amplifikaacutecia) sekvenaacutecia prebieha za uacutečasti rozdielne fluorescenčne značenyacutech a chemicky modifikovanyacutech nukleotidov pričom každyacute nukleotid emituje fluorescenciu s inou vlnovou dĺžkou Na skliacutečku prebieha paralelne až 6 miliaacuterd sekvenaacutecii (obr 32)

Ďalšiacutemi možnosťami sekvenovania druhej generaacutecie je systeacutem SOLid (vyvinutyacute firmou Applied Biosystem dnes pod Thermo Fisher Scientific) a Ion Semiconductor Sequencing ndash polovodičoveacute ioacutenoveacute sekvenovanie (od firmy Ion Semiconductor Sequencing v suacutečasnosti Thermo Fisher Scientific)

36

Obr 32 Princiacutep sekvenovania novej generaacutecie od firmy Illumina PCR amplifikaacutecia a sekvenovanie sa uskutočňuje na skliacutečku (flow cell) paralelne prebieha až 6 miliaacuterd sekvenaacutecii

632 Sekvenovanie tretej generaacutecie

Pred sekvenovaniacutem netreba amplifikovať DNA PCR metoacutedou ale sekvencia sa ziacuteskava zachyteniacutem signaacutelu v reaacutelnom čase Medzi sekvenovanie tretej generaacutecie patriacute SMRT (Single Molecule Real-Time Sequencing) a Nanopore Sequencing

37

7 Fragmentačnaacute analyacuteza DNA

Je metoacuteda použiacutevanaacute na určenie veľkosti fragmentov DNA ziacuteskanyacutech PCR reakciou Dĺžka amplifikovanyacutech DNA fragmentov sa zistiacute ich porovnaniacutem s veľkostnyacutem štandardom (obr 33) ktoryacute je tvorenyacute DNA fragmentami znaacutemej dĺžky Veľkostnyacute štandard je pred kapilaacuternou elektroforeacutezou zmiešanyacute so vzorkou DNA fragmenty veľkostneacuteho štandardu suacute fluorescenčne označeneacute pričom použiteacute fluorescenčneacute farbivo je ineacute ako fluorescenčneacute farbivo použiteacute na označenie DNA fragmentov vo vyšetrovanej vzorke

Obr 33 Elektroforetogram veľkostneacuteho štandardu použiacutevaneacuteho na určenie veľkostiacute fragmentov analyzovanyacutech kapilaacuternou elektroforeacutezou v genetickom analyzaacutetore (GeneScantrade 500 LIZtrade dye Size Standard) dĺžka fragmentov v nukleotidoch (napr 50 nukleotidov)

Fragmentačnaacute analyacuteza pozostaacuteva z viaceryacutech krokov Prvyacutem je izolaacutecia DNA nasleduje PCR amplifikaacutecia počas ktorej sa novosyntetizovaneacute DNA fragmenty označia fluorescenčnyacutemi farbivami Vzorka s PCR produktom sa pripraviacute na kapilaacuternu elektroforeacutezu tak že sa zmieša s veľkostnyacutem štandardom (sluacuteži na určenie veľkosti fragmentov) a denaturačnou laacutetkou (formamid) nasleduje denaturaacutecia Pripraveneacute vzorky suacute injektovaneacute do priacutestroja (genetickyacute analyzaacutetor) kde v kapilaacutere naplnenej polymeacuterom v elektrickom poli migrujuacute fluorescenčne značeneacute fragmenty DNA na zaacuteklade veľkosti (kapilaacuterna elektroforeacuteza) Počas elektroforeacutezy genetickyacute analyzaacutetor zaznamenaacuteva fluorescenciu fragmentov Analyacutezou daacutet prostredniacutectvom špeciaacutelnych softveacuterov sa ziacuteskajuacute elektroforetogramy z ktoryacutech je možneacute zistiť veľkosť fragmentov ako aj typ fluorescencie (docircležiteacute ak suacute genetickeacute varianty rozliacutešiteľneacute rocircznou fluorescenciou napr SNaPshot) Fragmentačnaacute analyacuteza je suacutečasťou množstva molekulaacuterno-genetickyacutech metoacuted (pozri obr 12 26 28 29 34) ako suacute napr STR analyacuteza (Short Tandem Repeat) AFLP analyacuteza (Amplified Fragment Lenght Polymorfism) RFLPT-RFLP analyacuteza (Restriction Fragment Lenght PolymorfismTerminal Restricted Fragment Lenght Polymorfism) SSCP (Single Strand Conformation Polymorfism) VNTR (Variable Number of Tandem Repeat) analyacuteza straty heterozygotnosti (LOH loss of heterozygozity) MLPA (Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification) MSMSA (Methylation-Sensitive Mobility Shift Assay) SNP genotypovanie (SNaPshotreg) HiCEP (High-Coverage Expression Profiling)

38

Obr 34 Kvantitatiacutevna fragmentačnaacute PCR analyacuteza (QF-PCR) DNA izolovanej z plodovej vody vyacutesledok prenataacutelnej analyacutezy = priacutetomnosť troch piacutekov pre chromozoacutem 18 (u všetkyacutech fragmentov detegujuacutecich chromozoacutem 18 je pomer vyšetrovanyacutech markerov aberantnyacute 21 resp 111) čo znamenaacute trizoacutemiu chromozoacutemu 18 Edwardsov syndroacutem

39

8 Metoacutedy založeneacute na princiacutepe hybridizaacutecie

Nukleoveacute kyseliny majuacute schopnosť vytvaacuterať dvojvlaacuteknoveacute reťazce z jednovlaacuteknovyacutech molekuacutel na zaacuteklade komplementarity baacutez Komplementarita baacutez umožňuje replikaacuteciu DNA transkripciu RNA komplementarita baacutez zabezpečuje teda reprodukovateľnosť živej hmoty

Hybridizaacutecia je proces v ktorom na zaacuteklade komplementarity baacutez dochaacutedza k vytvoreniu dvojvlaacuteknovej nukleovej kyseliny z dvoch jednovlaacuteknovyacutech molekuacutel DNA alebo RNA alebo ich kombinaacuteciou DNA RNA pričom kratšia jednovlaacuteknovaacute nukleovaacute kyselina vystupuje ako sonda (proacuteba) Hybridizaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten je jeden z najpoužiacutevanejšiacutech naacutestrojov v molekulaacuternej bioloacutegii a genetike (hybridizaacutecia primerov alebo proacuteb sa využiacuteva v takmer každej metoacutede - v PCR RT-PCR qPCR RT-qPCR MLPA sekvenovaniacute fragmentačnej analyacuteze FISH DNA mikročipoch atď)

Denaturaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten je proces pri ktorom dochaacutedza k porušeniu vodiacutekovyacutech vaumlzieb medzi vlaacuteknami nukleovyacutech kyseliacuten (strata sekundaacuternej a terciaacutelnej štruktuacutery) tak že docircjde k ich uacuteplneacutemu oddeleniu vzniknuacute jednovlaacuteknoveacute reťazce Denaturaacutecia NK mocircže byť spocircsobenaacute vplyvom vysokyacutech teplocirct pH alebo chemickyacutech laacutetok (denaturačneacute činidlaacute) Renaturaacutecia je opačnyacute proces v ktorom na zaacuteklade komplementarity dochaacutedza k tvorbe dvojvlaacuteknovyacutech NK

Hybridiza čnaacute sonda (proacuteba) je jednovlaacuteknovaacute nukleovaacute kyselina určitej znaacutemej dĺžky a sekvencie (najčastejšie DNA pretože je stabilnejšia ako RNA) ktoraacute je značenaacute a sluacuteži na detekciu komplementaacuternych molekuacutel DNA alebo RNA v procese hybridizaacutecie V zaacutevislosti od podmienok hybridizaacutecie (stringencia) mocircže byť detegovanaacute sekvencia uacuteplne komplementaacuterna alebo v menej priacutesnych podmienkach mocircže mať sekvenčneacute odchyacutelky Proacuteba sluacuteži na vyhľadanie a zviditeľnenie cieľovyacutech NK Zviditeľnenie sa deje prostredniacutectvom označenia proacuteby ešte pred hybridizaacuteciou Značenie proacuteby mocircže byť raacutedioaktiacutevne a neraacutedioaktiacutevne (najčastejšie fluorescenčneacute)

Raacutedioaktiacutevne značeneacute proacuteby pomocou izotopov (32P) sa využiacutevali viac v minulosti v suacutečasnosti suacute kvocircli zdravotnyacutem rizikaacutem ohľaduplnosti k životneacutemu prostrediu ako aj kvocircli jednoduchšej manipulaacutecii použiacutevaneacute fluorescenčne značeneacute proacuteby Raacutedioaktiacutevne značeneacute sondy boli použiacutevaneacute hlavne metoacutedou Southernovej hybridizaacutecie (Southern blotting Southern blot) Citlivosť raacutedioaktiacutevne značenyacutech proacuteb je vyššia dosahuje schopnosť zachytiť 10 fg (femtogram 10-15) cieľovej DNA sekvencie 81 Southern blot

Metoacutedu objavil v roku 1975 britskyacute bioloacuteg Edwin Southern (preto Southern) Pri Southernovej hybridizaacutecii sa restrikčne štiepeneacute fragmenty DNA elektroforeticky separujuacute v geacuteli potom sa metoacutedou blottingu prenesuacute na nylonovuacute alebo nitroceluloacutezovuacute membraacutenu kde suacute naacutesledne hybridizovaneacute v roztoku obsahujuacutecom raacutedioaktiacutevne značenuacute sondu Priloženiacutem fotografickeacuteho filmu k membraacutene a vyvolaniacutem filmu autoraacutediografiou docircjde k zviditeľneniu lokaliacutet kde došlo k hybridizaacuteciiacute raacutedioaktiacutevne značenej sondy s fragmentom DNA (autoraacutediogram) Southern blot bol kľuacutečovou a prvou metoacutedou na identifikaacuteciu osocircb (DNA fingerprinting DNA pofiling) (obr 35)

Okrem Southern blotu existuje Northern blot na analyacutezu RNA (geacutenovej expresie) a Western blot na analyacutezu proteiacutenov postup je obdobnyacute ako pri Southern blote s obmenami špecifickyacutemi pre konkreacutetny blot Pri Northern blote sa použiacutevajuacute hybridizačneacute proacuteby ale pre vizualizaacuteciu proteiacutenov western blotom je potrebneacute použiť protilaacutetky s naacuteslednou vizualizaacuteciou Pomenovanie techniacutek je hra so sloviacutečkami (keďže paacuten Northern ani Western neobjavili takto nazvaneacute techniky)

Neraacutedioaktiacutevne značenie proacuteb použiacutevanyacutech v molekulaacuternej genetike mocircže byť nepriame (použitie haptenu) alebo priame Konečnaacute vizualizaacutecia je najčastejšie zabezpečenaacute fluoreskujuacutecimi farebnyacutemi značkami farbivami fluorochroacutemami (fluorofoacuterami) Pri priamom značeniacute je farbička kovalentne naviazanaacute na nukleotid a na zachytenie fluorescencie suacute potrebneacute špeciaacutelne priacutestroje umožňujuacutece excitaacuteciu farbičky ktoraacute potom emituje žiarenie určitej vlnovej dĺžky (emisneacute žiarenie) a to zachytiacute detekčnyacute systeacutem priacutestroja Využitie fluorochroacutemov v molekulaacuternej genetike je masiacutevne napr na vizualizaacuteciu NK elektroforeticky separovanyacutech v geacuteli kvantifikaacuteciu produktov PCR reakcie v priacutestroji real-time PCR cykleacuter sekvenovaniacute fragmentačnej analyacuteze FISH DNA mikročipoch atď

40

Obr 35 Princiacutep Southern blotu

82 FISH (fluorescenčnaacute in situ hybridizaacutecia)

FISH (fluorescent in situ hybridization fluorescenčnaacute in situ hybridizaacutecia) metoacuteda patriacute medzi molekulovo-cytogenetickeacute techniky Princiacutep FISH metoacutedy je založenyacute na hybridizaacuteciiacute fluorescenčne značenyacutech proacuteb ku komplementaacuternym uacutesekom vyšetrovanej DNA na podložnom skle (priamo na mieste - in situ) K denaturaacutecii dsDNA dochaacutedza buď vplyvom denaturačnyacutech činidiel alebo zvyacutešenou teplotou a naacuteslednou renaturaacuteciou dochaacutedza k naviazaniu sondy na komplementaacuterny uacutesek DNA Vyacutesledok hybridizaacutecie sa vizualizuje fluorescenčnyacutem mikroskopom vybavenyacutem vhodnyacutemi fluorescenčnyacutemi filtrami a vizuaacutelne zhodnotiacute skuacutesenyacutem odborniacutekom Fluorescencia sa v niektoryacutech priacutepadoch mocircže zaznamenať a hodnotiť aj pomocou softveacuteru (obr 36)

Pomocou FISH detegujeme numerickeacute aberaacutecie - zmeny v počte chromozoacutemov (napr trizoacutemia monozoacutemia chromozoacutemov) alebo štruktuacuterne aberaacutecie a prestavby (napr translokaacutecie inverzie deleacutecie duplikaacutecie amplifikaacutecie) FISH metoacuteda umožňuje identifikaacuteciu a detekciu každeacuteho ľudskeacuteho chromozoacutemu jeho zaradenie do karyotypu odhalenie malyacutech submikroskopickyacutech chromozoacutemovyacutech zmien a tiež mapovať poziacutecie jednotlivyacutech geacutenov na chromozoacuteme

41

Obr 36 Princiacutep štandardnej FISH a FISH maľovania celeacuteho chromozoacutemu

Veľkou vyacutehodou FISH metoacutedy je možnosť analyacutezy buniek v metafaacuteze aj v interfaacuteze kedy nie je nutnaacute kultivaacutecia buniek a tiež ryacutechle analyzovanie veľkeacuteho počtu buniek (stovky až tisiacutece) K ďalšiacutem vyacutehodaacutem patriacute bezpečnosť vysokaacute citlivosť dostatočnaacute stabilita relatiacutevne kraacutetky čas hybridizaacutecie a možnosť ryacutechleho vyhodnotenia Hybridizaacutecia pri vaumlčšine suacutečasne dodaacutevanyacutech sond trvaacute 10-12 hodin (na trhu suacute už dostupneacute aj sondy so skraacutetenyacutem časom hybridizaacutecie na 2-3 hodiny) Po hybridizaacuteciiacute nasleduje odmyacutevanie kedy pri priacuteslušnej teplote dochaacutedza k odmytiu nenaviazanyacutech a nespraacutevne hybridizovanyacutech sond Preparaacutet sa naacutesledne podfarbiacute a vyacutesledok sa zhodnotiacute vo fluorescenčnom mikroskope Na podfarbenie chromozoacutemov alebo jadier sa použiacuteva modreacute kontrastneacute farbivo DAPI (46-diamidino-2-fenylindol) ktoreacute maacute silneacute fluorescenčneacute vlastnosti dokaacuteže prechaacutedzať jadrovou membraacutenou a viazať sa na DNA Vyacutesledkom je modreacute zafarbenie ktoreacute vyacuteborne kontrastuje so signaacutelmi jednotlivyacutech sond

Limitujuacutecim faktorom FISH je možnosť identifikaacutecie len tyacutech uacutesekov DNA ku ktoryacutem suacute použiteacute sondy V jednej analyacuteze je možneacute použiť najviac 3 odlišne značeneacute sondy a tak zistiť priacutepadneacute abnormality len na 1 alebo na paacuter lokusoch Na relevantnuacute detekciu je potrebneacute mať vo vzorke 1-5 aberantnyacutech interfaacutezovyacutech jadier

FISH je možneacute uskutočniť na širokej škaacutele biologickeacuteho materiaacutelu na vzorkaacutech perifeacuternej krvi kostnej drene naacuteteroch choriovyacutech klkoch plodovej vode rocircznych druhov tkaniacutev natiacutevnych alebo zaliatych v parafiacutene na 1 bunke (predimplantačnaacute genetickaacute diagnostika PGD) (obr 37)

Využiacuteva sa na detekciu aberaacuteciiacute pri mnohyacutech onkologickyacutech ochoreniach (napr pri diagnoacuteze mnohopočetnyacute myeloacutem sa v suacutečasnosti po separaacutecii CD138+ buniek robiacute FISH s 5 sondami pre geacuteny IGH TP53 RB1 oblasť 1p321q21 a stanovuje sa hyperploidia chromozoacutemov 5 9 a 15) a tiež k spresneniu doplneniu a k overeniu bežneacuteho cytogenetickeacuteho vyšetrenia

Podľa miesta na chromozoacuteme na ktorom dochaacutedza k hybridizaacutecii sondy rozlišujeme 4 typy

DNA sond bull centromeacuteroveacute sondy ndash sa viažu na strednuacute časť chromozoacutemu ndash centromeacuteru sluacutežia k diagnostike zmien v počte chromozoacutemov k detekcii chromozoacutemov neznaacutemeho pocircvodu umožňujuacute interfaacuteznu FISH na nedeliacich sa bunkaacutech (obr 38-41)

42

Obr 37 Interfaacutezna FISH preimplantačnyacute genetickyacute skriacutening aneuploidiiacute ndash blastomeacutera 3-denneacuteho ľudskeacuteho embrya s normaacutelnym počtom chromozoacutemov 13 18 21 pohlavie XY použityacutech 5 sond pre chromozoacutemy 13 ndash orange 18 ndash aqua 21 ndash green X ndash blue a Y ndash yellow (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

Obr 38 Interfaacutezne jadro po hybridizaacutecii s centromeacuterovou sondou pre chromozoacutem 8 (Vysis Abbott) V pravom jadre je priacutetomnaacute trizoacutemia chromozoacutemu 8 (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex) Obr 39 Metafaacutezna (A) a interfaacutezna FISH (B) použitaacute centromeacuterovaacute sonda CEPX spectrum orangeCEPY spectrum green (Vysis Abbott) Sonda hybridizuje k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (červenyacute signaacutel) a Y (zelenyacute signaacutel) (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

43

Obr 40 Interfaacutezna FISH vyšetrenie spermiiacute použiteacute sondy CEPX greenCEPY orange (Aneuscore Metasystems) Sondy hybridizujuacute k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (zelenyacute signaacutel) Y (červenyacute signaacutel) vľavo ndash dve haploidneacute spermie (majuacutece jedna spermia X druhaacute Y chromozoacutem) vpravo ndash dve patologickeacute spermie obsahujuacutece gonozoacutemovyacute komplement XY (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

Obr 41 Interfaacutezna FISH vyšetrenie spermiiacute použiteacute sondy CEPX greenCEPY orange a CEP18 aqua (Aneuscore Metasystems) Sondy hybridizujuacute k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (zelenyacute signaacutel) Y (červenyacute signaacutel) a 18 (modryacute signaacutel) vľavo ndash normaacutelne haploidneacute ľudskeacute spermie - 1x chromozoacutem X alebo Y a jedenkraacutet chromozoacutem 18 v strede ndash patologickaacute spermia obsahujuacuteca gonozoacutemovyacute komplement XY a jeden chromozoacutem 18 vpravo ndash patologickaacute diploidnaacute spermia s chromozoacutemami X Y a dvoma chromozoacutemami 18 (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

bull lokusovo špecifickeacute sondy ndash hybridizaacutecia prebehne na konkreacutetnom mieste geacutenu (lokuse) (obr 42-44) použiacutevajuacute sa k vyšetreniu mikrodeleacuteciiacute (straty malyacutech častiacute chromozoacutemu pri mikrodelečnyacutech syndroacutemoch) k zisteniu amplifikaacutecie onkogeacutenov a niektoryacutech špecifickyacutech translokaacuteciiacute prestavby geacutenov umožňujuacute interfaacuteznu FISH na nedeliacich sa bunkaacutech bull subtelomeroveacute ndash vaumlzba na koncoveacute časti chromozoacutemu ndash telomeacutery bull celochromozoacutemoveacute alebo celomaľovacie sondy ndash sondy hybridizujuacute s mnohopočetnyacutemi chromozoacutemovyacutemi sekvenciami pričom sa fluorescenčne tak bdquovymaľujeldquo celyacute chromozoacutem (Obr 45) Použiacutevajuacute sa na vyšetrenie chromozoacutemovyacutech prestavieb k analyacuteze translokaacuteciiacute a k detekcii pocircvodu tzv marker chromozoacutemov (malyacutech nadpočetnyacutech chromozoacutemov neznaacutemeho pocircvodu) K použitiu sondy suacute potrebneacute metafaacutezne chromozoacutemy nepoužiacutevaju sa pre interfaacuteznu FISH

Pri konvenčnej chromozoacutemovej FISH suacute homogeacutenne DNA proacuteby hybridizovaneacute s fixovanyacutem metafaacuteznym alebo prometafaacuteznym chromozoacutemomchromozoacutemami na skliacutečku (Obr 36a) Maximaacutelna rozlišovacia schopnosť metafaacuteznej FISH je niekoľko megabaacutez (Obr 39a 45) využitiacutem viac

44

natiahnutyacutech prometafaacuteznych chromozoacutemov sa dosiahne 1 Mb rozliacutešenie Prostredniacutectvom fiber FISH konkreacutetne artificiaacutelne deproteinizovanej natiahnutej DNA pripravenej in situ z celyacutech buniek na mikroskopickom skliacutečku je možneacute vizualizovať individuaacutelne geacuteny maleacute DNA elementy na chromozoacuteme s rozliacutešeniacutem okolo 1000 bp

Obr 42 Interfaacutezne jadro po hybridizaacutecii s lokusovo-špecifickou sondou LSI 5q31 Spectrum Orange5p12 Spectrum Green (Vysis Abbott) Na ľavom obraacutezku suacute priacutetomneacute dva červeneacute (5q31) a dva zeleneacute signaacutely (5p12) v pravom jadre je priacutetomnaacute deleacutecia 5q31 oblasti chyacuteba jeden červenyacute signal (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

Obr 43 Interfaacutezna FISH použitaacute lokusovo-špecifickaacute sonda ndash translokačnaacute - XL BCRABL1 plus (Metasystems) dvojfarebnaacute dvojfuacutezna kde červenaacute označuje lokus ABL1 na chromozoacuteme 9 a zelenaacute oblasť BCR na chromozoacuteme 22 Sonda deteguje fuacuteziu protoonkogeacutenu ABL1 (9q34) a geacutenu BCR (22q11) v priacutepade že červenyacute a zelenyacute signaacutel suacute pri sebe (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

45

Obr 44 Interfaacutezna FISH Použitaacute lokusovo-špecifickaacute sonda- typ break apart pre IGH geacuten V docircsledku translokaacutecie došlo k rozskočeniu geacutenu pričom translokačneacuteho partnera nepoznaacuteme vieme určiť len percento v koľkyacutech jadraacutech je geacuten prestavanyacute (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex) Obr 45 Použiteacute celochromozoacutemoveacute sondy WCP 15 (červenyacute chromozoacutem) a WCP 17 (zelenyacute chromozoacutem) Na metafaacuteze je potvrdenaacute reciprokaacute translokaacutecia t(1517)(q2221) (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

FISH vizualizaacutecia celeacuteho chromozoacutemu maľovanie chromozoacutemu anglicky chromosome

painting je špeciaacutelnou aplikaacuteciou chromozoacutemovej FISH proacuteba je koktail veľkeacuteho počtu rocircznych fluorescenčne značenyacutech DNA fragmentov hybridizujuacutecich pozdĺž celeacuteho konkreacutetneho chromozoacutemu (obr 36b 45) bdquoChromosomepaintingldquo analyzuje metafaacutezne chromozoacutemy V minulosti bola FISH vizualizaacutecia celyacutech chromozoacutemov limitovanaacute malyacutem množstvom rocirczne sfarbenyacutech fluorochroacutemov

V suacutečasnosti je možneacute detegovať množstvo cieľovyacutech sekvenciiacute naraz čo sa využiacuteva pri celogenoacutemovej chromozoacutemovej vizualizaacutecii (whole-chromosomepainting - WCP) metoacutedou multiplex FISH (M-FISH multicolor FISH o br 46) alebo spektraacutelnej karyotypizaacutecie (SKY) kedy možno rozliacutešiť všetky ľudskeacute chromozoacutemy ndash teda 24 rocircznych chromozoacutemov M-FISH a SKY patria medzi metafaacutezne formy FISH diagnostiky ktoreacute umožňujuacute simultaacutennu vizualizaacuteciu všetkyacutech ľudskyacutech chromozoacutemov v rocircznych farbaacutech čo predstavuje uľahčenie analyacutezy karyotypu hlavne pri komplexnyacutech zmenaacutech a markeroch neznaacutemeho pocircvodu Obe techniky vychaacutedzajuacute z použitia

46

celochromozoacutemovyacutech sond značenyacutech kombinaacuteciou viaceryacutech fluorochroacutemov Rozdiel medzi M-FISH a SKY spočiacuteva v technike ziacuteskania konečneacuteho obrazu

Obr 46 Multicolor FISH - každyacute chromozoacutemovyacute paacuter je zafarbenyacute inou farbou pričom na ich zafarbenie postačuje kombinaacutecia 5 fluorochroacutemov Na vyhodnocovanie je potrebnaacute špeciaacutelna sada fluorescenčnyacutech filtrov pre jednotliveacute fluorochroacutemy a špeciaacutelnyacute softweacuter Vľavo-štandardnyacute karyotyp vpravo karyotyp s mutaacuteciami (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

V molekulovej cytogenetike suacute komerčne dostupneacute sety M-FISH proacuteb umožňujuacutece

viacfarebneacute pruacutežkovanie chromozoacutemov (banding) s vysokyacutem rozliacutešeniacutem (multicolor-banding mBAND FISH MCB) čo umožňuje identifikaacuteciu intrachromozoacutemovyacutech prestavieb (Obr 47) Nevyhnutnosťou mBAND-u je mať chromozoacutemy v metafaacuteze Taacuteto metoacuteda bola prvyacutekraacutet uskutočnenaacute na chromozoacuteme 5 v roku 1999 mBAND FISH umožňuje rozliacutešiť špecifickeacute oblasti chromozoacutemov na uacuterovni pruacutežku - bandu a sub-bandu s detekciou 550 bandov haploidneacuteho karyotypu

Obr 47 A - mBAND chromozoacutemu 11 - inverzia duplikovanej oblasti 11q223-q25 B - mBAND chromozoacutemu 3 - na kruhovom chromozoacuteme deleacutecia oblasti 3p263 C - mBAND chromozoacutemu 2 - potvrdenie inverzie duplikovanej časti chromozoacutemu (poskytnuteacute RNDr Dagmar Landlovou Medirex)

FISH metoacuteda a jej varianty (M-FISH mBAND SKY) majuacute v suacutečasnosti širokeacute využitie v

klinickej genetike v onkologickej genetike na detekciu aberaacuteciiacute v čase diagnoacutezy počas liečby po

47

liečbe monitorovanie po transplantaacutecii kostnej drene v prenataacutelnej a postnataacutelnej diagnostike pri detekcii submikroskopickyacutech deleacuteciiacute (napr DiGeorge syndroacutem - 22q112 delečnyacute syndroacutem PraderndashWilli syndroacutem- chromozoacutem 15q11-13) prostredniacutectvom FISH je možnaacute detekcia numerickyacutech zmien chromozoacutemov (trizoacutemia chromozoacutemu 21 pri Downovom syndroacuteme trizoacutemia chromozoacutemu 15 pri Patauovom syndroacuteme trizoacutemia chromozoacutemu 18 pri Edwardsovom syndroacuteme) rocirczne zmeny v počte pohlavnyacutech chromozoacutemov (monozoacutemia X pri Turnerovom syndroacuteme Klinefelterov syndroacutem s X chromozoacutemom naviac - XXY) podobne v predimplantačnej diagnostike

83 DNA Microarray (DNA mikro čip biočip) DNA mikročipovanie je technika využiacutevajuacuteca hybridizaacuteciu skuacutemanej nukleovej kyseliny

(cieľovaacute vzorka) s veľkyacutem množstvom oligonukleotidovyacutech proacuteb (desať tisiacutec až milioacuten) ktoreacute suacute prichyteneacute na pevnyacute podklad najčastejšie sklenyacute silikoacutenovyacute alebo nylonovyacute (doštička čip) Skuacutemanaacute nukleovaacute kyselina je pred hybridizaacuteciou fragmentovanaacute označenaacute fluorofoacuterom a denaturovanaacute Po kontakte čipu s cieľovou vzorkou ktoraacute je vlastne zmes označenyacutech oligonukleotidov značeneacute oligonukleotidy hybridizujuacute s oligonukleotidovyacutemi sekvenciami prichytenyacutemi na čipe Potom suacute na zaacuteklade fluorescencie detekovaneacute miesta kde došlo k hybridizaacutecii čiže vzorka obsahovala takuacuteto nukleotidovuacute sekvenciu Z jedneacuteho mikročipu sa ziacuteska obrovskeacute množstvo daacutet ktoreacute je vždy nutneacute softveacuterovo spracovať V dnešnej dobe existuje niekoľko firiem poskytujuacutecich komerčne mikročipy na objednaacutevku alebo si ich laboratoacuteria produkujuacute sami

Mikročipovanie prebieha nasledovne

1) Vytvorenie DNA čipu ndash tisiacutece rocircznych jednovlaacuteknovyacutech DNA oligonukleotidov znaacutemych sekvencii sa kovalentne naviažu na povrch doštičky vždy v určitej lokalite je niekoľko rovnakyacutech oligonukleotidov veľkosť takejto lokality je ˂ 200 microm Proacutebami mocircže byť DNA cDNA alebo syntetizovaneacute oligonukleotidy Už hotoveacute mikročipy ponuacutekajuacute viacereacute firmy (Affymetrix Agilent Technologies Eppendorf Illumina) alebo si ich jednotliveacute laboratoacuteria vyraacutebajuacute sami pomocou robotickyacutech zariadeniacute DNA čip sa vytvaacutera buď nanaacutešaniacutem kvapiek oligonukleotidov na podklad alebo synteacutezou oligonukleotidov in situ na čipe 2) Priacuteprava vzorky ndash nukleovaacute kyselina (mRNA DNA) sa purifikuje určiacute sa jej kvantita a kvalita (spektrofotometericky) fragmentuje resp v priacutepade mRNA sa syntetizuje cDNA v priacutepade potreby sa mocircže DNA amplifikovať PCR reakciou štiepiť restrikčnyacutemi endonukleaacutezami 3) Fluorescenčneacute označenie (zriedkavejšie raacutedioaktiacutevne) fragmentov DNA prebieha počas reverznej transkripcie alebo PCR amplifikaacutecie za uacutečasti fluorescenčne značenyacutech nukleotidov Keď sa analyzujuacute dve rocirczne vzorky napr zdraveacute tkanivo a naacutedoroveacute tkanivo označenie nukleovyacutech kyseliacuten v tyacutechto tkanivaacutech byacuteva rozdielne a to použitiacutem dvoch rocircznych fluorescenčnyacutech farbiacutev (napr zeleneacute a červeneacute) Pred hybridizaacuteciou je potrebneacute vzorku denaturovať čiacutem sa vytvoriacute zmes jednovlaacuteknovyacutech DNA označenyacutech značkou 4) Hybridizaacutecia s mikročipom ndash v špeciaacutelnom hybridizačnom roztoku hybridizujuacute komplementaacuterne sekvencie zo vzorky s priacuteslušnyacutemi oligonukleotidovyacutemi sondami naviazanyacutemi na čipe Potom sa čip obmyje aby došlo k odstraacuteneniu čiastočne hybridizovanyacutech nukleovyacutech kyseliacuten 5) Skenovanie mikročipu ndash skenerom čipov docircjde k ožiareniu čipu laserom pričom v mieste hybridizaacutecie fluorescenčne značenyacutech DNA fragmentov s proacutebou docircjde k emisii svetla určitej vlnovej dĺžky ktoruacute skener zaznamenaacute 6) Analyacuteza daacutet prebieha metoacutedami bioinformatiky spracovaniacutem softveacutermi sa zistiacute ktoreacute lokality čipu navzaacutejom hybridizovali v priacutepade použitia dvoch vzoriek kontrolnej a skuacutemanej je možneacute analyzovať ich relatiacutevnu intenzitu hybridizaacutecie (expresie určiteacuteho geacutenu)

Existujuacute štyri typy mikročipov 1) Čipy ur čeneacute na analyacutezu expresie (obsahujuacute cDNA proacuteby) pre tzv dvojkanaacutelovyacute experiment kedy je vzorka určenaacute k hybridizaacutecii na čipe ziacuteskanaacute zmiešaniacutem DNA fragmentov kontrolnej a skuacutemanej vzorky pričom fragmenty suacute rozdielne fluorescenčne označeneacute (napr zelenyacute fluorofoacuter pre kontrolnuacute vzorku a červenyacute pre skuacutemanuacute) Na zaacuteklade intenzity a typu fluorescencie sa deteguje expresia geacutenov typickaacute pre kontrolnuacute vzorku (napr zelenaacute fluorescencia) pre skuacutemanuacute vzorku (napr

48

červenaacute fluorescencia) a expresia podobnaacute u oboch vzoriek (žltaacute fluorescencia) neexprimovaneacute geacuteny (čierna fluorescencia) rocirczne odtiene (v zaacutevislosti od prevažujuacutecej hybridizaacutecie) (obr 48) 2) Čipy ur čeneacute na analyacutezu mutaacutecii použije sa genoacutemovaacute DNA označenaacute jednou fluorescenčnou farbičkou na určenie jednonukleotidovej zmeny (SNP ndash Single Nukleotide Polymorphism) 3) Čipy na komparatiacutevnu genoacutemovuacute hybridizaacuteciu (aCGH array Comparative Genomic Hybridization) ndash použiacutevaneacute na zistenie zvyacutešenia alebo zniacuteženia množstva chromozoacutemovyacutech fragmentov obsahujuacutecich geacuteny zodpovedneacute za určiteacute ochorenie Na analyacutezu sa použije skuacutemanaacute gDNA a referenčnaacute (kontrolnaacute) DNA každaacute sa značiacute inou fluorescenčnou farbičkou (princiacutep ako pri analyacuteze expresie) (obr 49 50) 4) Čipy CGH - SNP kombinovaneacute čipy ur čeneacute na analyacutezu aj mutaacuteciiacute SNP aj na komparatiacutevnu genoacutemovuacute hybridizaacuteciu CGH

Mikročipy majuacute rozsiahle využitie napriacuteklad v identifikaacuteciiacute novyacutech geacutenov vo vyacuteskume ich funkciiacute expresie v rocircznych podmienkach pri diagnostike mnohyacutech ochoreniacute vo farmakogenomike vo vyacuteskume vplyvu toxiacutenov

Obr 48 Heatmapa geacutenovej expresie vybranyacutech geacutenov (mRNA) mikročip obsahuje 46000 cDNA proacuteb (poskytnuteacute Ing Helenou Gbelcovou PhD Uacutestav lekaacuterskej bioloacutegie genetiky a klinickej genetiky LF UK a UNB)

49

Obr 49 Princiacutep komparatiacutevnej genoacutemovej hybridizaacutecie (aCGH - array comparative genomic hybridization) Obr 50 A) Vyacutesledok komparatiacutevnej genoacutemovej hybridizaacutecie (aCGH - array comparative genomic hybridization) vzorky DNA izolovanej plodovej vody U plodu s abnormaacutelnym ultrasonografickyacutem vyšetreniacutem bola identifikovanaacute duplikaacutecia oblasti 3q261q29 (modryacute paacutes) a deleacutecia oblasti 5p1533p151 (červenyacute paacutes) Pre porovnanie chromozoacutem 1 bez aberaacutecie b) Ten istyacute pacient ale ineacute softveacuteroveacute spracovanie (poskytnuteacute RNDr Miroslavom Tomkom PhD Medirex)

50

Odporuacutečanaacute a použitaacute literatuacutera

Odborneacute knihy Klug W S Cummings M R Spencer Ch A Palladino M A Concepts of Genetics jedenaacuteste vydanie (2015) Carson S Molecular Biology Techniques tretie vydanie (2012) Strachan T Read A Human Molecular Genetics štvrteacute vydanie (2011) Sudbery P Sudbery I Human Molecular Genetics tretie vydanie (2009)

Internetoveacute straacutenky

wwwncbinlmnihgov wwwmlpacom wwwthermofishercom wwwilluminacom wwwpromegask wwwqiagencom wwwambioncom

Odborneacute člaacutenky Chacon-Cortes D Griffiths L R Methods for extracting genomic DNA from whole blood samples current perspectives Journal of Biorepository Science for Applied Medicine Volume 2 strany 1- 9 Viltrop T Krjutskov K Palta P Metspalu A Comparison of DNA extraction methods for multiplex polymerase chain reaction Anal Biochem 2010 Volume 398(2) strany 260-262 Ing Martin Čermaacutek Molekulaacuterna cytogenetika v problematike familiaacuternych maligniacutet Onkoloacutegia Volume 2 strany 77 - 83 Livak KJ Schmittgen TD Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method Methods 2001 Volume 25(4) strany 402 - 408 Bustin S A Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays J Mol Endocrinol 2000 Volume 25(2) strany169 - 193

MOLEKULAacuteRNE METOacuteDY AKTUAacuteLNE POUŽIacuteVANEacute V KLINICKEJ GENETIKE RNDr Andrea Pastoraacutekovaacute PhD RNDr Robert Petrovič PhD Vydala Univerzita Komenskeacuteho v Bratislave Lekaacuterska fakulta Rozsah 50 straacuten 246 AH prveacute vydanie ISBN 978-80-223-4231-5

18

Real-time PCR (obr 15) sa využiacuteva na kvantifikaacuteciu expresie geacutenov určenie počtu koacutepiiacute geacutenov určenie genotypu (genotypovanie) alelovou diskriminaacuteciou alebo analyacutezou krivky topenia tzv high resolution melt a multiplexnuacute real time PCR s možnosťou detekcie viaceryacutech cieľovgeacutenov

Multiplexnaacute real-time PCR sa využiacuteva na detekciu viaceryacutech cieľovgeacutenov v jednej reakcii suacutečasne Vyacutehodou multiplexovania je jednak uacutespora vzorky ako aj ziacuteskanie vaumlčšieho množstva informaacuteciiacute z rovnakeacuteho množstva materiaacutelu Nevyhnutnosťou multiplexnej qPCR suacute proacuteby značeneacute rocircznymi fluorescenčnyacutemi farbivami

Najdocircležitejšie zložky qPCR (real-time PCR komponenty) suacute DNA polymeraacuteza (reverznaacute transkriptaacuteza v priacutepade jednokrokovej kvantitatiacutevnej RT-PCT) dNTPs primery resp primeryproacuteby dvojmocneacute Mg templaacutet Na uľahčenie qPCR suacute v suacutečasnosti už komerčne dostupneacute takeacute reakčneacute zmesi ku ktoryacutem stačiacute pridať už len templaacutet (napr kity využiacutevajuacutece TaqManProacuteby) alebo kity s fluorescenčnyacutemi farbami viažucimi sa na dvojvlaacuteknovuacute DNA ku ktoryacutem sa do reakčnej zmesi okrem templaacutetu pridajuacute primery

Obr 15 Real-time PCR cykleacuter

331 Kvantifikaacutecia pomocou qPCR

Na kvantifikaacuteciu DNA pomocou qPCR sa požiacutevajuacute dve zaacutekladneacute metoacutedy - absoluacutetna kvantifikaacutecia a relatiacutevna kvantifikaacutecia

Absoluacutetna kvantifikaacutecia vychaacutedza zo štandardnej krivky (obr 16) ktoraacute sa ziacuteska po qPCR seacuterie riedeniacute DNA znaacutemej koncentraacutecie Kvantifikaacutecia neznaacutemej vzorky sa zistiacute interpolaacuteciou (odčiacutetaniacutem) Ct neznaacutemej vzorky zo štandardnej krivky (obr 16 17) Využiacutevaneacute napr v kriminalistike na stanovenie koncentraacutecie DNA vo vzorke

Relatiacutevna kvantifikaacutecia (obr 18 19) porovnaacuteva uacuteroveň expresie určiteacuteho geacutenu vo vzorke k expresii toho isteacuteho geacutenu v referenčnej (kontrolnej) vzorke alebo množstvo určiteacuteho geacutenu (počet koacutepiiacute) vo vzorke porovnaniacutem s množstvom geacutenu v kontrolnyacutech vzorkaacutech V raacutemci každej vzorky musiacute pred relatiacutevnou kvantifikaacuteciou docircjsť k tzv normalizaacutecii t j porovnanie expresie sledovaneacuteho geacutenu k expresii referenčneacuteho geacutenu (najčastejšie niacutem byacuteva tzv bdquohousekeepingldquo geacuten napr GAPDH aktiacuten tubuliacuten)

V priacutepade kvantifikaacutecie expresie určiteacuteho geacutenu metoacutedou real-time PCR (RT-qPCR) pred samotnou kvantifikaacuteciou cDNA musiacute byť taacuteto cDNA nasyntetizovanaacute prostredniacutectvom reverznej

19

transkripcie za použitia enzyacutemu reverznej transkriptaacutezy Kvantitatiacutevna PCR s reverznou transkripciou RT-qPCR mocircže byť dvojkrokovaacute alebo jednokrokovaacute Pri dvojkrokovej RT-qPCR treba pred qPCR syntetizovať cDNA vlaacutekno z RNA pomocou reverznej transkriptaacutezy - 1 krok druhyacutem krokom je samotnaacute real-time PCR Jednokrokovaacute RT-qPCR umožňuje uskutočniť obidve reakcie reverznuacute transkripciu a kvantitatiacutevnu PCR v jednej skuacutemavke čo zjednodušuje qPCR a redukuje možnosť kontaminaacutecie Obr 16 5-bodovaacute štandardnaacute krivka (amplifikaacutecia piatich koncentraacuteciiacute jednej vzorky konkreacutetne ide o 10-tkoveacute riedenie)

Obr 17 Ukaacutežka amplifikačnyacutech kriviek riedenia a z nich ziacuteskanej štandardnej krivky poukazuje na vysokuacute presnosť metoacutedy RT-PCR

20

Obr 18 Relatiacutevna kvantifikaacutecia - určenie počtu koacutepiiacute geacutenu CYP21A2 vo vzorke DNA izolovanej z perifeacuternej krvi pacientov mutaacutecie v geacutene CYP21A2 spocircsobujuacute kongenitaacutelnu adrenaacutelnu hyperplaacuteziu (CAH) Vyacutesledok analyacutezy všetci pacienti majuacute dve koacutepie geacutenu

Obr 19 Relatiacutevna kvantifikaacutecia - určenie počtu koacutepiiacute geacutenu CYP21A2 vo vzorke DNA izolovanej z plodovej vody mutaacutecie v geacutene CYP21A2 spocircsobujuacute kongenitaacutelnu adrenaacutelnu hyperplaacuteziu (CAH) Prenaacutetalnou diagnostikou (qPCR) sa zistila priacutetomnost jednej koacutepie CYP21A2 geacutenu 332 Určenie genotypu metoacutedou alelovej diskriminaacutecie a analyacutezou krivky topenia (HRM)

Určenie genotypu metoacutedou alelovej diskriminaacutecie (obr 20) sa uskutočňuje použitiacutem hydrolyzujuacutecich proacuteb (sond) je veľmi ryacutechla a senzitiacutevna (presnaacute) metoacuteda frekventovane využiacutevanaacute v laboratoacuteriaacutech Dva variantyalely suacute vyšetreneacute suacutečasne v jednej vzorke a v jednej reakčnej

21

skuacutemavke V reakcii suacute použiteacute dve proacuteby označeneacute rozdielnymi fluorescenčnyacutemi farbičkami emitujuacutecimi svetlo o rocircznej vlnovej dĺžke (najčastejšie jedna označenaacute FAM farbičkou a druhaacute proacuteba označenaacute VIC farbičkou) Počas amplifikaacutecie amplikoacutenu dochaacutedza k odstraacuteneniu zhaacutešača z bliacutezkosti farbičky ktoraacute potom emituje svetlo priacuteslušnej vlnovej dĺžky Vzorky so signaacutelom len jednej fluorescenčnej farbičky (FAM) a bez signaacutelu druhej farbičky (VIC) suacute homozygoti pre alelu 1 vzorky so signaacutelom len druhej farbičky (VIC) a bez signaacutelu prvej (FAM) suacute homozygoti pre alelu 2 v priacutepade ak vyšetrovanaacute vzorka bdquosvietildquo obidvoma farbami jednaacute sa o heterozygota

Obr 20 Určenie genotypu metoacutedou alelovej diskriminaacutecie ndash amplifikačnaacute krivka vzoriek DNA majuacutecich tri rocirczne genotypy A ndash jednotliveacute vzorky (plnaacute čiara predstavuje štandardnuacute alelu guličkovanaacute mutovanuacute alelu) B ndash 72 vzoriek C ndash scatter plot 72 vzoriek

Určenie genotypu analyacutezou krivky topenia tzv high resolution melt (HRM) (obr 21) umožňuje detekciu takmer všetkyacutech genetickyacutech variaacuteciiacute (SNP mutaacuteciiacute) Keďže taacuteto metoacuteda okrem štandardnyacutech podmienok reakcie vyžaduje len primery a farbičku (nie proacuteby) je veľmi jednoduchaacute a lacnejšia Po amplifikaacuteciiacute treba amplikoacuten pomaly zohrievať až kyacutem nedocircjde k denaturaacuteciiacute Teplota topenia amplikoacutenu vo vzorke zaacutevisiacute od DNA sekvencie čo umožňuje detegovať priacutetomnosť mutaacutecie resp SNP Tvar vyacuteslednyacutech kriviek topenia určuje teda genotyp

22

Obr 21 Určenie genotypu analyacutezou krivky topenia tzv metoacutedou high resolution melting (HRM) A ndash krivka topenia vzoriek DNA majuacutecich tri rocirczne genotypy B ndash graf rozdielnosti krivky topenia vzoriek DNA majuacutecich tri rocirczne genotypy

23

4 Elektroforetickaacute separaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten

Separaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten predstavuje rozdelenie molekuacutel DNA alebo RNA na zaacuteklade veľkosti zloženia a poradia baacutez Podobnyacutemi metoacutedami je možneacute separovať aj proteiacuteny

Elektroforeacuteza (ELFO) je technika použiacutevanaacute na separaacuteciu niekedy aj purifikaacuteciu makromolekuacutel ako suacute nukleoveacute kyseliny a proteiacuteny na zaacuteklade ich rozdielnej veľkosti naacuteboja alebo konformaacutecie Je to metoacuteda veľmi často využiacutevanaacute nielen v molekulovej genetike ale aj biocheacutemii Elektroforeacuteza využiacuteva schopnosť nabityacutech molekuacutel migrovať v jednosmernom elektrickom poli k opačneacutemu poacutelu Nukleoveacute kyseliny majuacute vďaka svojej fosfaacutetovej zložke negatiacutevny naacuteboj preto v jednosmernom elektrickom poli migrujuacute ku kladneacutemu poacutelu čiže k anoacutede Elektroforeacuteza prebieha v elektroforetickej aparatuacutere v geacuteloch (v nosiči) so sieťovitou štruktuacuterou ktoraacute umožňuje separaacuteciu molekuacutel Vzorka nukleovej kyseliny zmiešanaacute s tzv nanaacutešaciacutem tlmivyacutem roztokom s farbičkou sa nanesie do jamky v geacuteli ktoryacute je umiestnenyacute v elektroforetickej aparatuacutere v priacutetomnosti elektroforetickeacuteho pufra (TAE alebo TBE) (obr 22) Nanaacutešaciacute tlmivyacute roztoknanaacutešacia farbička umožňuje na zaacuteklade migraacutecie farbičky vidieť migraacuteciu vzorky v geacuteli a suacutečasne zvyacutešeniacutem hustoty vo vzorke umožniacute klesnuacuteť vzorke do jamky a tak zabraacuteniť jej vyplaveniu z geacutelu Draacuteha je časť geacutelu ktoryacutem putuje jedna vzorka od katoacutedy k anoacutede V draacutehe sa nachaacutedzajuacute oddeleneacute jednotliveacute fragmenty nukleovyacutech kyseliacuten určityacutech veľkostiacute viditeľneacute vo forme pruacutežkov (angl bands) Intenzita pruacutežku zaacutevisiacute od množstva molekuacutel danej veľkosti je ekvivalentnaacute hmotnosti Na určenie veľkosti fragmentov NK sa do jednej jamky nanesie štandard molekulovyacutech hmotnostiacute (angl ladder) ktoryacute maacute presne definovaneacute veľkosti fragmentov čo umožňuje odhadnuacuteť veľkosť aj hmotnosť neznaacutemych separovanyacutech fragmentov

Obr 22 Elektroforetickaacute separaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten v agaroacutezovom geacuteli (A) a vizualizaacutecia UV svetlom a GelRedtrade (B C)

24

Nukleoveacute kyseliny je možneacute elektroforeticky separovať 1) v geacuteloch agaroacutezovom (horizontaacutelna elektroforeacuteza) (obr 22) a polyakrylamidovom (vertikaacutelna elektroforeacuteza) 2) v špeciaacutelnych lineaacuternych polymeacuteroch kapilaacuternou elektroforeacutezou použitiacutem genetickeacuteho analyzaacutetora (obr 23)

Agaroacuteza je polysacharid ziacuteskanyacute z morskej riasy použiacuteva sa najčastejšie v koncentraacuteciiacute 05-2 čiacutem vyššia koncentraacutecia tyacutem je geacutel pevnejšiacute a schopnejšiacute rozliacutešiť menšie fragmenty NK Priacuteprava je jednoduchaacute odvaacuteži sa potrebneacute množstvo agaroacutezy ktoraacute sa zmieša s tlmivyacutem roztokom (pufrom) rozvariacute sa v mikrovlnnej ruacutere a naleje sa do špeciaacutelnej naacutedoby na vytvaacuteranie geacutelov kyacutem je geacutel tekutyacute vložiacute sa do neho tzv hrebeň na vytvorenie jamiek Agaroacuteza je netoxickaacute V bežnom agaroacutezovom geacuteli v zaacutevislosti od jeho koncentraacutecie je možneacute separovať DNA fragmenty dĺžky 200-50 000 bp Dnes suacute dostupneacute aj špeciaacutelne agaroacutezy napr MetaPhorreg Agarose schopneacute oddeliť fragment DNA dĺžky 20-800bp Separaacutecia v agaroacutezovom geacuteli prebieha v horizontaacutelnej aparatuacutere preto sa nazyacuteva aj horizontaacutelna elektroforeacuteza

Polyakrylamidovyacute geacutel (PAGE) vznikaacute polymerizaacuteciou akrylamidu v priacutetomnosti špeciaacutelnych chemickyacutech laacutetok (peroxodisiacuteran amoacutenny TEMED bisakrylamid) Jeho priacuteprava je preto odlišnaacute a aj naacuteročnejšia Polyakrylamidoveacute geacutely majuacute vysokuacute rozlišovaciu schopnosť (1bp) preto suacute PAGE geacutely vhodneacute aj na sekvenovanie DNA klasickyacutemi metoacutedami PAGE geacutel nie je vhodnyacute na separaacuteciu fragmentov dlhšiacutech ako 2kb Použiacuteva sa v koncentraacutecii 35 -20 s rozliacutešeniacutem fragmentov od 10bp-2000bp Akrylamid je neurotoxiacuten musiacute sa s niacutem pracovať veľmi opatrne PAGE elektroforeacuteza bežiacute vo vertikaacutelnej aparatuacutere preto sa volaacute aj vertikaacutelna elektroforeacuteza použiacuteva sa často aj na separaacuteciu proteiacutenov

Ryacutechlosť pohybu nukleovyacutech kyseliacuten (mobilita) určuje viacero faktorov 1) veľkosť NK ndash počet baacutezovyacutech paacuterov resp baacutez pričom menšie molekuly prechaacutedzajuacute geacutelom ryacutechlejšie pretože sa ľahšie pohybujuacute v geacuteli 2) konformaacutecia nukleovej kyseliny napr u rovnako veľkyacutech plazmidov kondenzovaneacute superšpiralizovaneacute plazmidy migrujuacute najryacutechlejšie rovnako veľkeacute lineaacuterne molekuly (toho isteacuteho plazmidu) bežia pomalšie a najpomalšie putujuacute relaxovaneacute kruhoveacute molekuly plazmidu 3) koncentraacutecia geacutelu určuje jeho rozlišovaciu schopnosť koncentrovanejšiacute geacutel je schopnyacute separovať kratšie fragmenty NK redšie geacutely suacute vhodneacute pre rozliacutešenie vaumlčšiacutech fragmentov 4) zloženie geacutelu je docircležiteacute pri analyacuteze sekundaacuternych štruktuacuter NK a proteiacutenov v nedenaturovanom stave sekundaacuterna štruktuacutera spomaľuje migraacuteciu NK a proteiacutenov Tento fakt využiacutevajuacute niektoreacute diagnostickeacute techniky (napr SSCP - Single Strand Conformation Polymorphism - polymorfismus konformaacutecie jednovlaacuteknovej DNA) umožňujuacutece detekciu zaacutemeny jedinej baacutezy ktoraacute spocircsobiacute odlišneacute vnuacutetromolekuloveacute paacuterovanie a vyacuteslednuacute konformaacuteciu molekuly Geacutely mocircžu teda byť denaturačneacute a nedenaturačneacute (natiacutevne) 5) napaumltie zdroja - čiacutem vyššie je napaumltie ktoreacute vytvaacutera elektrickeacute pole v elektroforetickej aparatuacutere tyacutem ryacutechlejšie fragmenty NK migrujuacute 6) zloženie roztokov a teploty

Elektroforetickyacute tlmivyacute roztok (pufor - elektrolyt) zabezpečuje stabilneacute elektroforetickeacute podmienky počas separaacutecie geacutel je v ňom ponorenyacute Obsahuje ioacuteny čo umožňuje vedenie elektrickeacuteho pruacutedu

Štandard molekulovyacutech hmotnostiacute (v laboratoacuteriaacutech nazyacutevanyacute ladder alebo marker) je zmes fragmentov DNA alebo RNA s presne definovanou veľkosťou ktoryacute sluacuteži na odhad veľkosti vyšetrovanyacutech fragmentov NK (obr 22) Pomocou špeciaacutelnych štandardov molekulovyacutech hmotnostiacute ktoryacutech fragmenty NK majuacute definovanuacute aj hmotnosť je možneacute odhadnuacuteť množstvo (hmotnosť - koncentraacuteciu) neznaacutemeho fragmentu

B C

25

41 Vizualizaacutecia DNA

Samotnaacute nukleovaacute kyselina je počas elektroforetickej separaacutecie neviditeľnaacute Vizualizaacuteciu NK umožňujuacute interkalačneacute činidlaacute ktoreacute suacute schopneacute naviazať sa na molekuly NK tyacutem že sa včlenia medzi susediace baacutezy Po ožiareniacute UV svetlom interkalačneacute činidlaacute naviazaneacute na NK fluoreskujuacute tak sa vizualizuje NK čiacutem intenziacutevnejšie fluoreskuje tyacutem viac NK je v geacutelipruacutežku priacutetomneacute Interkalačneacute činidlo sa buď primieša do geacutelu pri jeho priacuteprave čo umožniacute sledovať migraacuteciu fragmentov NK počas elektroforeacutezy a to po vybratiacute z ELFO aparatuacutery a po ožiareniacute UV svetlom alebo sa geacutel farbiacute po elektroforetickej separaacutecii V minulosti bol na zviditeľnenie NK najčastejšie použiacutevanyacute etidiumbromid kvocircli jeho mutageacutennym vlastnostiam sa v suacutečasnosti nahraacutedza menej mutageacutennymi a netoxickyacutemi činidlami ako suacute napr komerčne dostupneacute SYBRregSafe GelRedtrade GelGreentrade

Kapilaacuterna elektroforeacuteza NK prebieha v špeciaacutelnom priacutestroji genetickom analyzaacutetore (obr 23) ktoryacute musiacute mať zaacutekladneacute komponenty ako suacute elektroacutedy kapilaacutera zdroj vysokeacuteho napaumltia detektor prepojenie s počiacutetačom a softveacuteroveacute vybavenie priestor na vloženie vzoriek atď Genetickyacute analyzaacutetor predstavuje automatizovanyacute systeacutem umožňujuacuteci sekvenovanie určovanie dĺžky DNA fragmentov ndash fragmentačnuacute analyacutezu a kvantifikaacuteciu nukleovyacutech kyseliacuten V novšiacutech typoch genetickeacuteho analyzaacutetora je proces analyacutezy od vloženia vzoriek do stojana automatizovanyacute

Vzorka určenaacute na analyacutezu je elektrokineticky injektovanaacute do tenkej kapilaacutery naplnenej lineaacuternym polymeacuterom Vplyvom vysokeacuteho napaumltia sa negatiacutevne nabiteacute fragmenty DNA pohybujuacute v polymeacuteri k pozitiacutevne nabitej elektroacutede Kapilaacuterna elektroforeacuteza je tak citlivaacute že je schopnaacute detegovať jednobaacutezovyacute rozdiel DNA fragmentov DNA fragmenty musia byť pred kapilaacuternou elektroforeacutezou fluorescenčne označeneacute v kapilaacutere suacute separovaneacute na zaacuteklade veľkosti Kraacutetko pred dosiahnutiacutem kladne nabitej elektroacutedy docircjde po excitaacutecii laserovyacutem žiareniacutem k emisii žiarenia fluoroformi (farbičkami) tak že optickyacute detekčnyacute systeacutem zaznamenaacute fluorescenciu ktoraacute je naacutesledne softveacuterovo spracovanaacute a vyhodnotenaacute

Obr 23 Genetickyacute analyzaacutetor

42 RFLP

Metoacuteda polymorfizmu dĺžky restrik čnyacutech fragmentov (angl Restriction Fragment Length Polymorfism) bola prvou metoacutedou využiacutevanou na detekciu DNA variaacuteciiacute rocircznych biologickyacutech vzoriek Princiacutep metoacutedy spočiacuteva v priacutetomnosti polymorfizmov v DNA sekvencii rocircznych ľudiacute ktoreacute zapriacutečinia rozdielny profil (obrazec) DNA fragmentov po štiepeniacute jednou alebo viaceryacutemi restrikčnyacutemi endonukleaacutezami Restrikčneacute endonukleaacutezy (RE) suacute enzyacutemy ktoreacute štiepia DNA molekulu v oblasti špecifickej nukleotidovej sekvencie nazyacutevanej restrik čneacute miesto RE najčastejšie rozpoznaacutevajuacute a štiepia miesto veľkeacute 4-6 baacutez RE suacute priacutetomneacute u prokaryotov (bakteacuterie a archebakteacuterie) kde suacute suacutečasťou restrik čno-modifikačneacuteho systeacutemu akoby prokaryotickeacutej vrodenej imunity sluacutežia

26

na ochranu pred cudzou DNA (napr viacuterusovou) ktoruacute po rozpoznaniacute špecifickej sekvencie štiepia

Restrikčno-modifikačnyacute systeacutem maacute dve zložky 1) modifikačneacute enzyacutemy - metylaacutezy ktoreacute procesom metylaacutecie modifikujuacute určiteacute baacutezy svojej DNA čiacutem ich označia za vlastnuacute DNA takže takaacuteto DNA je potom rezistentnaacute voči štiepeniu restrikčnyacutemi endonukleaacutezami Najčastejšiacutem spocircsobom metylaacutecie u bakteacuteriiacute je metylaacutecia adeniacutenu na N6 pričom vznikne metyladeniacuten alebo cytoziacutenu na C5 metylcytoziacuten 2) restrikčneacute endonukleaacutezy štiepia špecifickeacute miesto dvojvlaacuteknovej DNA ktoreacute je tvoreneacute symetrickou sekvenciou zrkadlovo sa opakujuacutecich nukleotidov ndash tzv palindroacutem Restrikčneacute enzyacutemy sa použiacutevajuacute na štiepenie DNA sekvencie na mieste špecifickom pre tuacute ktoruacute restrikčnuacute endonukleaacutezu napr pri analyacuteze polymorfizmov dĺžky restrikčnyacutech fragmentov (RFLP) analyacuteze jednonukleotidovyacutech polymorfizmov (SNP) mutaacuteciiacute ako aj pri klonovaniacute DNA do vhodnyacutech vektorovyacutech DNA molekuacutel

Po štiepeniacute dvojvlaacuteknovej DNA restrikčnou endonukleaacutezou mocircžu vzniknuacuteť tri typy koncov - 5´-prečnievajuacutece konce (lepiveacute) 3´-prečnievajuacutece konce (lepiveacute) a tupeacute konce (obr 24)

Obr 24 Restrikčneacute štiepenie zanechaacutevajuacutece rocirczne konce tupeacute a lepiveacute

Restrikčneacute štiepenie je často použiacutevanou metoacutedou geacutenovyacutech manipulaacuteciiacute na konštrukciu

hybridnyacutech molekuacutel DNA s naacuteslednyacutem klonovaniacutem Priebeh RFLP analyacutezy je nasledovnyacute restrikčnaacute endonukleaacuteza sa pridaacute k DNA a zmes sa vo

vhodnyacutech reakčnyacutech podmienkach (pufor teplota) inkubuje niekoľko hodiacuten Počas inkubaacutecie docircjde k štiepeniu DNA na špecifickyacutech miestach DNA je potom elektroforeticky separovanaacute v geacuteli a naacutesledne vizualizovanaacute V minulosti po geacutelovej elektroforeacuteze nasledoval Southern blot (čiže prenos separovanyacutech fragmentov DNA z geacutelu na špeciaacutelnu membraacutenu) (obr 35) po ktorom nastala vizualizaacutecia raacutedioaktiacutevne značenou proacutebou V suacutečasnosti sa kvocircli praacutecnosti a zdravotnyacutem rizikaacutem od Southern blotu upuacutešťa a prechaacutedza sa na ryacutechlejšie menej praacutecne a zdravotne šetrnejšie metoacutedy priateľskejšie aj k životneacutemu prostrediu

RFLP bola prvou metoacutedou použiacutevanou na zistenie DNA profilu (DNA fingerprinting) mapovanie geacutenov zapriacutečiňujuacutece genetickeacute ochorenia a testovanie otcovstva Vaumlčšina RFLP markerov je vysoko lokusovo špecifickyacutech a kodominantnyacutech (obidve alely suacute detekovaneacute u heterozygota)

PCR-RFLP je laboratoacuterne priacutestupnejšia metoacuteda molekulaacuterno-genetickej diagnostiky keďže PCR umožňuje amplifikaacuteciu veľmi malyacutech množstiev DNA Alternatiacutevny naacutezov použiacutevanyacute v literatuacutere je CAPS z angl Cleaved Amplified Polymorphic Sequence assay Použitiacutem špecifickyacutech primerov docircjde PCR metoacutedou k amplifikaacutecii požadovaneacuteho uacuteseku DNA ten sa potom štiepi restrikčnou endonukleaacutezou vo vhodnyacutech podmienkach naacutesledne sa štiepne produkty elektroforeticky separujuacute a vizualizujuacute použitiacutem interkalačnyacutech farbiacutev a UV svetla (obr 25)

27

Obr 25 Princiacutep metoacutedy PCR-RFLP

43 VNTR a STR V geacutenome suacute priacutetomneacute dva typy tandemovyacutech (za sebou nasledujuacutecich) opakovaniacute

1) minisatelity ndash nazyacutevaneacute variabilnyacute počet tandemovyacutech opakovaniacute VNTR (variable number of tandem repeats) 2) mikrosatelity tiež kraacutetke tandemoveacute repetiacutecie STR (short tandem repeats)

Obidva tieto typy satelitnej DNA suacute rozmiestneneacute po celom genoacuteme suacute využiacutevaneacute hlavne vo forenznej genetike na identifikaacuteciu osocircb a určenie otcovstva popriacutepade materstva ale aj v mediciacutene na detekciu chromozoacutemovyacutech aneuploidiiacute Štruktuacutera obidvoch je podobnaacute Rozdiel medzi jednotlivyacutemi alelami je spocircsobenyacute rozdielnym počtom opakovaniacute opakujuacutecej sa sekvencie (motiacutevu) čo spocircsobiacute rocircznu dĺžku alel s rocircznym počtom tandemovyacutech opakovaniacute nazyacutevanuacute polymorfizmus dĺžky fragmentov

VNTR ndash variabilnyacute počet tandemovyacutech opakovaniacute pričom opakujuacuteca sa sekvencia maacute dĺžku od 6 do 100 baacutez pričom sa mocircže opakovať aj tisiacutece kraacutet alely tak mocircžu mať od 500do 30 000 baacutez VNTR boli v kombinaacutecii s RFLP (DNA fingerprinting ) prvyacutem polymorfizmom použiacutevanyacutem na zistenie DNA profilov a identifikaacuteciu osocircb v kriminalistickej praxi V suacutečasnosti jeho využitie v kriminalistike je kvocircli potrebe relatiacutevne veľkeacuteho množstva DNA nahradeneacute využitiacutem STR

STR - kraacutetke tandemoveacute repetiacutecie suacute v kriminalistike najčastejšie použiacutevanyacutem polymorfizmom STR lokusy suacute rozmiestneneacute po celom genoacuteme repetiacutecia obsahuje jednu až šesť baacutez pričom jej opakovaniacutem vznikne STR v rozsahu od 50 do 300bp V našom genoacuteme suacute tisiacutece STR ktoreacute mocircžu byť použiteacute pre forenznuacute analyacutezu V kriminalistike sa v suacutečasnosti na identifikaacuteciu osocircb použiacuteva 13 STR locusov ktoreacute patria k medzinaacuterodne uznaacutevanyacutem štandardom Z iniciatiacutevy FBI bola vytvorenaacute databaacuteza CODIS (Combined DNA Index System) každaacute krajina maacute svoju databaacutezu CODIS kde je možneacute vložiť a archivovať DNA profily jednotlivcov ako aj profily DNA ziacuteskanyacutech z miest kriminaacutelneho činu v databaacuteze je ich možneacute navzaacutejom porovnať a tak zistiť pocircvodcu trestneacuteho činu Medzinaacuterodnaacute jednotnosť v použiacutevaniacute CODIS STR lokusov umožňuje v priacutepade potreby vzaacutejomneacute porovnanie DNA profilov zistenyacutech na uacutezemiacute rocircznych štaacutetov CODIS STR lokusov je 13 a suacute to CSF1PO FGA TH01 TPOX VWA D3S1358 D5S818 D7S820 D8S1179 D13S317 D16S539 D18S51 a D21S11 Zistenie DNA profilu sa uskutočniacute multiplexnou PCR reakciou s fluorescenčne značenyacutemi primermi špecifickyacutemi pre konkreacutetny STR Naacutesledne suacute PCR produkty analyzovaneacute kapilaacuternou elektroforeacutezou genetickyacutem analyzaacutetorom ktoryacute rozliacuteši amplifikovaneacute fragmenty na zaacuteklade fluorescencie a dĺžky (fragmentačnaacute analyacuteza) (obr 26 Tab 3) DNA profil každeacuteho človeka je jedinečnyacute rovnakyacute profil mocircžu mať len jednovaječneacute dvojčataacute

28

Obr 26 Ukaacutežka DNA profilu človeka 15 STR lokusov s určeniacutem pohlavia pomocou lokusu pre amelogeniacuten (ženskeacute pohlavie - XX) maleacute oranžoveacute piacuteky predstavujuacute fragmenty veľkostneacuteho štandardu Tabuľka č 3 Zaacutepis DNA profilu človeka z obraacutezka č 26 15 STR lokusov s určeniacutem pohlavia pomocou lokusu pre amelogeniacuten System Alela 1 Alela 2

D3S1358 16 17

TH01 9 93 D21S11 28 28

D18S51 15 18

Penta E 7 14 D5S818 9 12

D13S317 8 11

D7S820 8 11 D16S539 11 12

CSF1PO 10 11

Penta D 11 12 vWA 15 18

D8S1179 13 16

TPOX 8 9 FGA 20 21

amel X X

29

5 MLPA

Multiplexnaacute amplifikaacutecia proacuteb zaacutevislaacute od ligaacutecie (z angl multiplex ligation-dependent probe amplification) je metoacuteda schopnaacute v jednej reakcii (v jednej skuacutemavke a vzorke) detegovať zmeny v počte až 50 nukleotidovyacutech sekvenciiacute Metoacutedou MLPA je možneacute ryacutechlo identifikovať amplifikaacutecie (duplikaacutecie) a deleacutecie veľkeacuteho počtu geacutenov či už použitiacutem DNA alebo mRNA krvnyacutech vzoriek alebo vzoriek z naacutedorov

Princiacutep MLPA spočiacuteva v multiplexnej amplifikaacutecii 50 špecifickyacutech nukleotidovyacutech sekvenciiacute použitiacutem jedneacuteho paacuteru primerov pričom jeden primer je fluorescenčne označenyacute Vyacutesledneacute PCR produkty suacute analyzovaneacute kapilaacuternou elektroforeacutezou (fragmentačnaacute analyacuteza) Dĺžka každeacuteho namnoženeacuteho produktu je jedinečnaacute narastaacute postupne o 6 alebo 9 nukleotidov pričom produkty PCR suacute 120 ndash 500 nukleotidov dlheacute Tento veľkostnyacute rozsah PCR fragmentov (dĺžka 120-500 nukleotidov s naacuterastom postupne o 6 alebo 9 nukleotidov) je optimaacutelny pre kapilaacuternu elektroforeacutezu MLPA multiplexnaacute PCR prebieha za použitia iba jedineacuteho paacuteru primerov ktoreacute amplifikujuacute špecifickeacute sekvencie Trik spočiacuteva v tom že nedochaacutedza k amplifikaacutecii DNA sekvencie ale MLPA proacuteb ktoreacute suacute pridaneacute k vzorkaacutem Každaacute MLPA proacuteba pozostaacuteva z dvoch oligonukleotidov (dve hemiproacuteby) pričom každyacute oligonukleotid obsahuje jednu zo sekvencie rozpoznaacutevanuacute PCR primermi Proacuteba vznikne jedine za predpokladu hybridizaacutecie dvoch oligonukleotidov (hemiproacuteb) k cieľovej sekvencii (geacutenu) a po ligaacutecii enzyacutemom ligaacutezou Iba ligovaneacute proacuteby suacute exponenciaacutelne amplifikovaneacute pomocou jedneacuteho paacuteru primerov Množstvo zligovanyacutech proacuteb teda zaacutevisiacute od množstva cieľovyacutech sekvenciiacute (geacutenov) vo vzorke

Postup MLPA analyacutezy je nasledovnyacute (obr27) K vzorke nukleovej kyseliny (DNA resp mRNA) sa pridaacute zmes 50 jedinečnyacutech proacuteb každaacute

proacuteba je komplementaacuterna k určitej cieľovej sekvencii NK vzorky Každaacute proacuteba však pozostaacuteva z dvoch oligonukleotidov hybridizujuacutecich vedľa seba zaacuteroveň každyacute oligonukleotid (hemiproacuteba) obsahuje pridanuacute sekvenciu rozpoznaacutevanuacute paacuterom PCR primerov Po hybridizaacuteciiacute oligonukleotidov (hemiproacuteb) dochaacutedza k ich ligaacutecii ligaacutezou Ligačnaacute reakcia je tak špecifickaacute že je schopnaacute rozliacutešiť sekvenciu liacutešiacu sa v jednom nukleotide Vyacuteslednyacute ligačnyacute produkt (proacuteba) obsahuje obidve sekvencie pre PCR primery na jednom fragmente čiže mocircže docircjsť k namnoženiu takeacutehoto fragmentu PCR reakciou V priacutepade ak nedocircjde k ligaacutecii priacuteslušnyacutech hemiproacuteb pretože hemiproacuteby nenaacutejdu cieľovuacute sekvenciu na DNA každaacute takaacuteto nezligovanaacute hemiproacuteba maacute len jednu sekvenciu rozpoznaacutevanuacute len jednyacutem PCR primerom v docircsledku čoho nemocircže prebehnuacuteť jej PCR amplifikaacutecia a počas fragmentačnej analyacutezy nie je detegovanaacute pretože negeneruje fluorescenčnyacute signaacutel

Pri MLPA analyacuteze je docircležiteacute okrem MLPA amplifikaacutecie vzorky urobiť aj MLPA amplifikaacuteciu referenčnej vzorky ku ktorej sa bude porovnaacutevať počet geacutenov (cieľovyacutech sekvenciiacute) Po kapilaacuternej elektroforeacuteze MLPA referenčnej a skuacutemanej vzorky porovnaniacutem obsahu nameranyacutech hodnocirct tzv piacutekov priacuteslušnyacutech proacuteb sa určiacute relatiacutevny počet koacutepiiacute v skuacutemanej vzorke

MLPA

1 DNA denaturaacutecia a hybridizaacutecia s MLPA proacutebami (hemiproacuteby)

2 Ligaacutecia (vytvorenie kompletnyacutech proacuteb)

3 PCR amplifikaacutecia proacuteb paacuterom primerov

4 Kapilaacuterna elektroforetickaacute separaacutecia PCR produktov

5 Analyacuteza daacutet

30

Obr 27 Princiacutep MLPA

Firma MRC-Holland v suacutečasnosti ponuacuteka stovky MLPA setov proacuteb ktoreacute suacute vhodneacute na 1) diagnostiku kongenitaacutelnych a dedičnyacutech ochoreniacute 2) zisťovanie profilu naacutedorov 3) zisťovanie metylačneacuteho profilu

MLPA je metoacuteda vhodnaacute na detekciu malyacutech prestavieb (BRCA1 BRCA2 MSH2 atď)

veľkyacutech chromozoacutemovyacutech prestavieb (Williamsov syndroacutem Prader-WilliAngelman syndroacutem atzď)

31

detekciu zmien v počte koacutepii geacutenov (obr 28 29) ako aj zistenie počtu kompletnyacutech chromozoacutemov (chromozoacutem 13 18 21 XY tiež aj z amniovej tekutiny) diagnostiku naacutedorov (zmeny počtu pri ALL CLL atď) kvantifikaacuteciu metylaacutecie (Prader-WilliAngelmanov syndroacutem Fragilnyacute X inaktivaacutecia naacutedorovyacutech supresorovyacutech geacutenov atď) mRNA analyacutezu geacutenov zuacutečastňujuacutecich sa apoptoacutezy alebo zaacutepalov

MS-MLPA (Methylation-Specific MLPA) je varianta MLPA určenaacute špeciaacutelne na analyacutezu aberantnyacutech metylaacutecii imprintovanyacutech oblastiacute ako aj detekciu metylačnyacutech zmien CpG ostrovčekov lokalizovanyacutech bliacutezko promoacutetora Rozdiel oproti štandardnej MLPA spočiacuteva v použitiacute metylačne senzitiacutevneho restrikčneacuteho enzyacutemu HhaI ktoryacute štiepi MS-MLPA proacuteby hybridizovaneacute k nemetylovanej sekvencii Každaacute DNA vzorka určenaacute pre MS-MLPA analyacutezu prejde dvoma reakciami v jednej mikroskuacutemavke štandardnou MLPA analyacutezou (bez štiepenia metylačne senzitiacutevnym enzyacutemom) a v druhej mikroskuacutemavke docircjde okrem ligaacutecie proacuteb aj k metylačne senzitiacutevnemu štiepeniu hybridizovanyacutech proacuteb s nemetylovanou DNA Amplifikujuacute sa len ligovaneacute proacuteby po PCR amplifikaacutecii sa fragmentačnou analyacutezou porovnaniacutem oboch reakciiacute zistia rozdiely v metylačnom profile vzorky k referenčnej vzorke

RT-MLPA (Reverse Transkriptase MLPA) je variaacutecia MLPA určenaacute pre zistenie mRNA profilu vzorky je alternatiacutevou k real-time PCR a mikročipom RT-MLPA nedeteguje mRNA množstvo priamo pretože použiacutevanaacute ligaacuteza nie je schopnaacute ligovať DNA oligonukleotidy keď suacute hybridizovaneacute s RNA Preto RT-MLPA začiacutena reverznou transkripciou so špeciaacutelne navrhnutyacutemi RT primermi tak aby vytvorili kraacutetke oligonukleotidy (cDNA) Potom reakcia pokračuje ako štandardnaacute MLPA

Obr 28 MLPA analyacuteza geacutenu DMD (koacutedujuacuteceho dystrofiacuten) mutaacutecie ktoreacuteho spocircsobujuacute Duchennovu svalovuacute dystrofiu u pacienta je priacutetomnaacute deleacutecia exoacutenu 45 v porovnaniacute s referenčnou vzorkou ndash kontrolou

32

Obr 29 MLPA analyacuteza geacutenu DMD (koacutedujuacuteceho dystrofiacuten) mutaacutecie ktoreacuteho spocircsobujuacute Duchennovu svalovuacute dystrofiu u pacienta suacute priacutetomneacute duplikaacutecie exoacutenov 41 42 43 44 45 (piacuteky vo vzorke pacienta sa porovnajuacute s piacutekmi v kontrole ndash referenčnej vzorke)

33

6 Sekvenovanie

Sekvenovaniacutem rozumieme určenie primaacuternej štruktuacutery DNA teda určenie poradia nukleotidov v reťazci DNA Začiatky moderneacuteho sekvenovania siahajuacute do roku 1977 kedy boli objaveneacute dve metoacutedy sekvenovania 1) chemickaacute metoacuteda Maxama a Gilberta 2) enzymatickaacute metoacuteda Sangera Nicklena a Coulsona

Princiacutep obidvoch metoacuted sekvenovania spočiacuteva v tom že sa vytvoriacute suacutebor DNA molekuacutel s rocircznou veľkosťou ktoreacute suacute zakončeneacute konkreacutetnym nukleotidom tieto DNA molekuly sa elektroforeticky separujuacute v geacuteloch s rozlišovacou schopnosťou 1 nukleotid 61 Chemickaacute metoacuteda

DNA molekuly sa na 5-konci raacutedioaktiacutevne označia raacutedioaktiacutevnym fosforom a naacutesledne sa chemicky modifikujuacute špecificky pre každuacute baacutezu DNA sa potom v modifikovanyacutech miestach štiepi čiacutem vzniknuacute rocirczne dlheacute fragmenty pričom podmienky suacute nastaveneacute tak aby sa DNA na každom mieste štiepila len raz Modifikaacutecia DNA a štiepenie prebehne v štyroch separaacutetnych reakciaacutech (skuacutemavkaacutech) takže po elektroforetickej separaacuteciiacute takto opracovanej DNA v štyroch draacutehach polyakrylamidoveacuteho geacutelu a naacuteslednej autoraacutediografii (podobne ako pri Southernovej hybridizaacutecii) je možneacute odčiacutetať nukleotidovuacute sekvenciu približne 100 nukleotidov od raacutedioaktiacutevneho označenia (v čase objavu Maxama a Gilberta) 62 Sangerova metoacuteda

Zaacuteklady metoacutedy boli popiacutesaneacute už v roku 1975 (metoacuteda plus a miacutenus) ale až vylepšenie použitiacutem dideoxynukleotidov (ddNTP) v roku 1977 došlo k zjednodušeniu sekvenovania Princiacutepom enzyacutemoveacuteho sekvenovania je terminaacutecia (zastavenie) polymerizaacutecie inkorporaacuteciou 2´ 3 -dideoxynukleotidov do novosyntetizujuacuteceho sa vlaacutekna DNA Keďže ddNTP neobsahujuacute hydroxylovuacute skupinu na 3 uhliacuteku riboacutezy nemocircžu sa zuacutečastniť na tvorbe fosfodiesterovej vaumlzby nemocircže sa pripojiť k nim ďalšiacute nukleotid čiže musiacute docircjsť k terminaacuteciiacute polymeraacutecie Reakcia prebieha v štyroch skuacutemavkaacutech s raacutedioaktiacutevne značenyacutem primerom V každej skuacutemavke suacute priacutetomneacute všetky štyri deoxynukleotidtrifosfaacutety (dNTP) ale pre každuacute skuacutemavku je špecifickyacute priacutedavok maleacuteho množstva jedneacuteho z dideoxynukleotidtrifosfaacutetov (v prvej skuacutemavke je ddATP v druhej ddCTP v tretej ddTTP a vo štvrtej ddGTP) Maleacute množstvo ddNTP spocircsobiacute že pri polymerizaacutecii dochaacutedza k prednostneacutemu zaradeniu štandardnyacutech dNTP do narastajuacuteceho reťazca a len občas sa inkorporuje ddNTP čiacutem sa zastaviacute synteacuteza reťazca V každej skuacutemavke tak vznikne suacutebor DNA fragmentov rocircznych veľkostiacute zakončenyacutech priacuteslušnyacutem ddNTP (v prvej skuacutemavke ddATP v druhej ddCTP v tretej ddTTP a vo štvrtej ddGTP) Po elektroforetickej separaacutecii v 4 draacutehach polyakrylamidoveacuteho geacutelu a autoraacutediografii sa z autoraacutediogramu odčiacuteta sekvencia

V suacutečasnosti je sekvenovanie do značnej miery automatizovaneacute pričom využiacuteva princiacutep Sangerovej enzyacutemovej metoacutedy s určityacutemi obmenami Uacutesek DNA ktoryacute treba sekvenovať sa prostredniacutectvom termostabilnyacutech DNA polymeraacutez namnožiacute PCR metoacutedou po ktorej nasleduje sekvenačnaacute reakcia (asymetrickaacute PCR) s fluorescenčne značenyacutemi ddNTP (každyacute druh označenyacute inyacutem fluorescenčnyacutem farbivom) Sekvenačnaacute reakcia prebieha v jednej skuacutemavke s jednyacutem primerom vznikne tak suacutebor jednovlaacuteknovyacutech DNA rocircznej dĺžky ktoreacute suacute na 3konci označeneacute ddNTP so špecifickyacutem fluorescenčnyacutem farbivom Taacuteto metoacuteda sekvenovania sa tiež nazyacuteva rdquodye-terminator cycle sequencingrdquo(obr 30) Po kapilaacuternej elektroforeacuteze vzorky v genetickom analyzaacutetore zaznamenaacutevaniacute fluorescencie jednotlivyacutech fragmentov CCD kamerou a softveacuterovom spracovaniacute sa ziacuteska sekvencia DNA (obr 31)

34

Obr 30 Princiacutep sekvenovania Sangerova dideoxy metoacuteda alebo tzv chain termination method (reťazec zastavujuacuteca metoacuteda) Obr 31 Určenie genotypu plodu a rodičov sekvenčnou analyacutezou DNA ziacuteskanej z plodovej vody (prenataacutelna diagnostika) a perifeacuternej krvi sekvenčnaacute analyacuteza geacutenu ASPA vyacutesledok u plodu priacutetomnaacute mutaacutecia c 914CgtA v homozygotnom stave (AA) rodičia heterozygoti (AC) Uvedenaacute mutaacutecia je v homozygotnom stave kauzaacutelnou priacutečinou Canavanovej choroby

Automatizovaneacute sekvenovanie prinaacuteša viacereacute vyacutehody oproti klasickej Sangerovej metoacutede vyššiu presnosť a ryacutechlosť v jednej sekvenačnej reakcii možnosť osekvenovať až 1200 nukleotidovyacute fragment maleacute množstvo templaacutetu potrebneacute na analyacutezu

35

63 Next Generation Sequencing (NGS)

NGS (sekvenovanie novej generaacutecie) maacute obrovskyacute potenciaacutel v analyacuteze genoacutemov pričom toto označenie zahŕňa viacereacute technologickeacute metoacutedy reprezentovaneacute niekoľkyacutemi firmami Princiacutepom je masiacutevne paralelneacute sekvenovanie čiacutem sa ziacuteskajuacute raacutedovo tisiacutece až milioacuteny sekvenciiacute naraz 631 Sekvenovanie druhej generaacutecie

Na začiatku sa analyzovanaacute DNA vo vaumlčšine priacutepadov fragmentuje (vznikne tak DNA

knižnica) na fragmenty sa pripoja kraacutetke sekvencie ndash adapteacutery naacutesledne sa tieto fragmenty rocircznymi priacutestupmi amplifikujuacute a určiacute sa ich sekvencia Vďaka čiastočnyacutem prekryvom je zo ziacuteskanyacutech sekvencii možneacute poskladať plynuluacute sekvenciu zodpovedajuacutecu pocircvodnej nefragmentovanej DNA

Pyrosekvenovanie je podobne ako Sangerova metoacuteda založenaacute na princiacutepe synteacutezy komplementaacuterneho vlaacutekna DNA avšak rozdiel je v tom že sa na detekciu inkorporaacutecie nukleotidu využiacuteva inyacute systeacutem tvorby luminiscenčneacuteho signaacutelu v priebehu reakcie Pyrosekvenovanie je umožneneacute vďaka aktivite 4 enzyacutemov - DNA polymeraacutezy ATP sulfurylaacutezy luciferaacutezy a apyraacutezy Reakčnaacute zmes obsahuje aj ďalšie komponenty - enzymatickeacute substraacutety adenoziacutenfosfosulfaacutet (APS) d-luciferiacuten sekvenovanyacute templaacutet a cyklicky postupne po jednom type pridaacutevaneacute nukleotidtrifosfaacutety Po zabudovaniacute nukleotidu do novovznikajuacuteceho reťazca docircjde k uvoľneniu pyrofosfaacutetu naacutesledne je využityacute ATP sulfurylaacutezou na synteacutezu ATP z APS počas ďalšej reakcie docircjde k využitiu ATP luciferaacutezou na premenu luciferiacutenu na oxyluciferiacuten čo spocircsobiacute svetelnyacute signaacutel a ten zaznamenaacute detekčnyacute systeacutem Poslednou enzymatickou reakciou je reakcia apyraacutezy ktoraacute odstraacuteni nezainkorporovaneacute nukleotidy a nevyužiteacute ATP aby sa celyacute proces mohol zopakovať s reakčnou zmesou obsahujuacutecou ďalšiacute nukleotidtrifosfaacutet (inyacute ako v predchaacutedzajuacutecej reakcii) Po každej reakcii detektor zaznamenaacuteva emisiu svetla na zaacuteklade intenzity svetla je možneacute určiť či bol vradenyacute priacuteslušnyacute nukleotidtrifosfaacutet či bol inkorporovanyacute jeden priacutepadne viac rovnakyacutech nukleotidtrifosfaacutetov

Zvyacutešenie vyacutekonu pyrosekvenovania umožnila tzv emulznaacute PCR v mikročasticiach a použitie platničky PicoTiterPlatereg toto sekvenovanie zaviedla firma Roche pod pojmom 454 pyrosekvenovanie v roku 2005 Na začiatku sa DNA fragmentuje na uacuteseky dlheacute 400-600 baacutez dvojvlaacuteknovaacute fragmentovanaacute DNA sa liguje s adapteacutermi prostredniacutectvom nich sa naviaže na mikročastice dvojvlaacuteknoveacute fragmenty sa oddelia mikročastice s naviazanyacutemi jednovlaacuteknovyacutemi fragmentami sa premiešajuacute so zmesou oleja a roztoku ktoryacute obsahuje všetky komponenty na uacutespešnuacute PCR Tyacutemto spocircsobom sa okolo každej mikročastice vytvoriacute vlastnyacute mikroreaktor v ktorom prebehne amplifikaacutecia fragmentu Po PCR reakcii sa mikročastice prenesuacute do platničky PicoTiterPlate v ktorej sa do jamky zmestiacute akuraacutet jedna mikročastica a reakčneacute komponenty pyrosekvenačnej reakcie PicoTiterPlatereg maacute 1 600 000 jamiek každaacute jamka maacute maximaacutelny objem 75 picolitra Platnička s mikročasticami sa vložiacute do sekvenačneacuteho systeacutemu ndash priacutestroja v ktorom sa celeacute pyrosekvenovanie uskutočniacute Chemiluminiscenčneacute signaacutely ktoryacutech počas sekvenovania vznikajuacute milioacuteny v priebehu hodiny suacute zachyteneacute CCD kamerou a analyzovaneacute softveacuterom

Firma Illumina predstavila inuacute technoloacutegiu PCR amplifikaacutecia a sekvenovanie sa uskutočňuje na skliacutečku (flow cell) Fragmentaacutecia DNA a pripojenie adapteacuterov prebieha za uacutečasti transpozoacutemov v procese nazvanom tagmentaacutecia Po hybridizaacutecii fragmentov DNA na skliacutečko prebehne v klastroch PCR amplifikaacutecia (tzv mostiacutekovaacute amplifikaacutecia) sekvenaacutecia prebieha za uacutečasti rozdielne fluorescenčne značenyacutech a chemicky modifikovanyacutech nukleotidov pričom každyacute nukleotid emituje fluorescenciu s inou vlnovou dĺžkou Na skliacutečku prebieha paralelne až 6 miliaacuterd sekvenaacutecii (obr 32)

Ďalšiacutemi možnosťami sekvenovania druhej generaacutecie je systeacutem SOLid (vyvinutyacute firmou Applied Biosystem dnes pod Thermo Fisher Scientific) a Ion Semiconductor Sequencing ndash polovodičoveacute ioacutenoveacute sekvenovanie (od firmy Ion Semiconductor Sequencing v suacutečasnosti Thermo Fisher Scientific)

36

Obr 32 Princiacutep sekvenovania novej generaacutecie od firmy Illumina PCR amplifikaacutecia a sekvenovanie sa uskutočňuje na skliacutečku (flow cell) paralelne prebieha až 6 miliaacuterd sekvenaacutecii

632 Sekvenovanie tretej generaacutecie

Pred sekvenovaniacutem netreba amplifikovať DNA PCR metoacutedou ale sekvencia sa ziacuteskava zachyteniacutem signaacutelu v reaacutelnom čase Medzi sekvenovanie tretej generaacutecie patriacute SMRT (Single Molecule Real-Time Sequencing) a Nanopore Sequencing

37

7 Fragmentačnaacute analyacuteza DNA

Je metoacuteda použiacutevanaacute na určenie veľkosti fragmentov DNA ziacuteskanyacutech PCR reakciou Dĺžka amplifikovanyacutech DNA fragmentov sa zistiacute ich porovnaniacutem s veľkostnyacutem štandardom (obr 33) ktoryacute je tvorenyacute DNA fragmentami znaacutemej dĺžky Veľkostnyacute štandard je pred kapilaacuternou elektroforeacutezou zmiešanyacute so vzorkou DNA fragmenty veľkostneacuteho štandardu suacute fluorescenčne označeneacute pričom použiteacute fluorescenčneacute farbivo je ineacute ako fluorescenčneacute farbivo použiteacute na označenie DNA fragmentov vo vyšetrovanej vzorke

Obr 33 Elektroforetogram veľkostneacuteho štandardu použiacutevaneacuteho na určenie veľkostiacute fragmentov analyzovanyacutech kapilaacuternou elektroforeacutezou v genetickom analyzaacutetore (GeneScantrade 500 LIZtrade dye Size Standard) dĺžka fragmentov v nukleotidoch (napr 50 nukleotidov)

Fragmentačnaacute analyacuteza pozostaacuteva z viaceryacutech krokov Prvyacutem je izolaacutecia DNA nasleduje PCR amplifikaacutecia počas ktorej sa novosyntetizovaneacute DNA fragmenty označia fluorescenčnyacutemi farbivami Vzorka s PCR produktom sa pripraviacute na kapilaacuternu elektroforeacutezu tak že sa zmieša s veľkostnyacutem štandardom (sluacuteži na určenie veľkosti fragmentov) a denaturačnou laacutetkou (formamid) nasleduje denaturaacutecia Pripraveneacute vzorky suacute injektovaneacute do priacutestroja (genetickyacute analyzaacutetor) kde v kapilaacutere naplnenej polymeacuterom v elektrickom poli migrujuacute fluorescenčne značeneacute fragmenty DNA na zaacuteklade veľkosti (kapilaacuterna elektroforeacuteza) Počas elektroforeacutezy genetickyacute analyzaacutetor zaznamenaacuteva fluorescenciu fragmentov Analyacutezou daacutet prostredniacutectvom špeciaacutelnych softveacuterov sa ziacuteskajuacute elektroforetogramy z ktoryacutech je možneacute zistiť veľkosť fragmentov ako aj typ fluorescencie (docircležiteacute ak suacute genetickeacute varianty rozliacutešiteľneacute rocircznou fluorescenciou napr SNaPshot) Fragmentačnaacute analyacuteza je suacutečasťou množstva molekulaacuterno-genetickyacutech metoacuted (pozri obr 12 26 28 29 34) ako suacute napr STR analyacuteza (Short Tandem Repeat) AFLP analyacuteza (Amplified Fragment Lenght Polymorfism) RFLPT-RFLP analyacuteza (Restriction Fragment Lenght PolymorfismTerminal Restricted Fragment Lenght Polymorfism) SSCP (Single Strand Conformation Polymorfism) VNTR (Variable Number of Tandem Repeat) analyacuteza straty heterozygotnosti (LOH loss of heterozygozity) MLPA (Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification) MSMSA (Methylation-Sensitive Mobility Shift Assay) SNP genotypovanie (SNaPshotreg) HiCEP (High-Coverage Expression Profiling)

38

Obr 34 Kvantitatiacutevna fragmentačnaacute PCR analyacuteza (QF-PCR) DNA izolovanej z plodovej vody vyacutesledok prenataacutelnej analyacutezy = priacutetomnosť troch piacutekov pre chromozoacutem 18 (u všetkyacutech fragmentov detegujuacutecich chromozoacutem 18 je pomer vyšetrovanyacutech markerov aberantnyacute 21 resp 111) čo znamenaacute trizoacutemiu chromozoacutemu 18 Edwardsov syndroacutem

39

8 Metoacutedy založeneacute na princiacutepe hybridizaacutecie

Nukleoveacute kyseliny majuacute schopnosť vytvaacuterať dvojvlaacuteknoveacute reťazce z jednovlaacuteknovyacutech molekuacutel na zaacuteklade komplementarity baacutez Komplementarita baacutez umožňuje replikaacuteciu DNA transkripciu RNA komplementarita baacutez zabezpečuje teda reprodukovateľnosť živej hmoty

Hybridizaacutecia je proces v ktorom na zaacuteklade komplementarity baacutez dochaacutedza k vytvoreniu dvojvlaacuteknovej nukleovej kyseliny z dvoch jednovlaacuteknovyacutech molekuacutel DNA alebo RNA alebo ich kombinaacuteciou DNA RNA pričom kratšia jednovlaacuteknovaacute nukleovaacute kyselina vystupuje ako sonda (proacuteba) Hybridizaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten je jeden z najpoužiacutevanejšiacutech naacutestrojov v molekulaacuternej bioloacutegii a genetike (hybridizaacutecia primerov alebo proacuteb sa využiacuteva v takmer každej metoacutede - v PCR RT-PCR qPCR RT-qPCR MLPA sekvenovaniacute fragmentačnej analyacuteze FISH DNA mikročipoch atď)

Denaturaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten je proces pri ktorom dochaacutedza k porušeniu vodiacutekovyacutech vaumlzieb medzi vlaacuteknami nukleovyacutech kyseliacuten (strata sekundaacuternej a terciaacutelnej štruktuacutery) tak že docircjde k ich uacuteplneacutemu oddeleniu vzniknuacute jednovlaacuteknoveacute reťazce Denaturaacutecia NK mocircže byť spocircsobenaacute vplyvom vysokyacutech teplocirct pH alebo chemickyacutech laacutetok (denaturačneacute činidlaacute) Renaturaacutecia je opačnyacute proces v ktorom na zaacuteklade komplementarity dochaacutedza k tvorbe dvojvlaacuteknovyacutech NK

Hybridiza čnaacute sonda (proacuteba) je jednovlaacuteknovaacute nukleovaacute kyselina určitej znaacutemej dĺžky a sekvencie (najčastejšie DNA pretože je stabilnejšia ako RNA) ktoraacute je značenaacute a sluacuteži na detekciu komplementaacuternych molekuacutel DNA alebo RNA v procese hybridizaacutecie V zaacutevislosti od podmienok hybridizaacutecie (stringencia) mocircže byť detegovanaacute sekvencia uacuteplne komplementaacuterna alebo v menej priacutesnych podmienkach mocircže mať sekvenčneacute odchyacutelky Proacuteba sluacuteži na vyhľadanie a zviditeľnenie cieľovyacutech NK Zviditeľnenie sa deje prostredniacutectvom označenia proacuteby ešte pred hybridizaacuteciou Značenie proacuteby mocircže byť raacutedioaktiacutevne a neraacutedioaktiacutevne (najčastejšie fluorescenčneacute)

Raacutedioaktiacutevne značeneacute proacuteby pomocou izotopov (32P) sa využiacutevali viac v minulosti v suacutečasnosti suacute kvocircli zdravotnyacutem rizikaacutem ohľaduplnosti k životneacutemu prostrediu ako aj kvocircli jednoduchšej manipulaacutecii použiacutevaneacute fluorescenčne značeneacute proacuteby Raacutedioaktiacutevne značeneacute sondy boli použiacutevaneacute hlavne metoacutedou Southernovej hybridizaacutecie (Southern blotting Southern blot) Citlivosť raacutedioaktiacutevne značenyacutech proacuteb je vyššia dosahuje schopnosť zachytiť 10 fg (femtogram 10-15) cieľovej DNA sekvencie 81 Southern blot

Metoacutedu objavil v roku 1975 britskyacute bioloacuteg Edwin Southern (preto Southern) Pri Southernovej hybridizaacutecii sa restrikčne štiepeneacute fragmenty DNA elektroforeticky separujuacute v geacuteli potom sa metoacutedou blottingu prenesuacute na nylonovuacute alebo nitroceluloacutezovuacute membraacutenu kde suacute naacutesledne hybridizovaneacute v roztoku obsahujuacutecom raacutedioaktiacutevne značenuacute sondu Priloženiacutem fotografickeacuteho filmu k membraacutene a vyvolaniacutem filmu autoraacutediografiou docircjde k zviditeľneniu lokaliacutet kde došlo k hybridizaacuteciiacute raacutedioaktiacutevne značenej sondy s fragmentom DNA (autoraacutediogram) Southern blot bol kľuacutečovou a prvou metoacutedou na identifikaacuteciu osocircb (DNA fingerprinting DNA pofiling) (obr 35)

Okrem Southern blotu existuje Northern blot na analyacutezu RNA (geacutenovej expresie) a Western blot na analyacutezu proteiacutenov postup je obdobnyacute ako pri Southern blote s obmenami špecifickyacutemi pre konkreacutetny blot Pri Northern blote sa použiacutevajuacute hybridizačneacute proacuteby ale pre vizualizaacuteciu proteiacutenov western blotom je potrebneacute použiť protilaacutetky s naacuteslednou vizualizaacuteciou Pomenovanie techniacutek je hra so sloviacutečkami (keďže paacuten Northern ani Western neobjavili takto nazvaneacute techniky)

Neraacutedioaktiacutevne značenie proacuteb použiacutevanyacutech v molekulaacuternej genetike mocircže byť nepriame (použitie haptenu) alebo priame Konečnaacute vizualizaacutecia je najčastejšie zabezpečenaacute fluoreskujuacutecimi farebnyacutemi značkami farbivami fluorochroacutemami (fluorofoacuterami) Pri priamom značeniacute je farbička kovalentne naviazanaacute na nukleotid a na zachytenie fluorescencie suacute potrebneacute špeciaacutelne priacutestroje umožňujuacutece excitaacuteciu farbičky ktoraacute potom emituje žiarenie určitej vlnovej dĺžky (emisneacute žiarenie) a to zachytiacute detekčnyacute systeacutem priacutestroja Využitie fluorochroacutemov v molekulaacuternej genetike je masiacutevne napr na vizualizaacuteciu NK elektroforeticky separovanyacutech v geacuteli kvantifikaacuteciu produktov PCR reakcie v priacutestroji real-time PCR cykleacuter sekvenovaniacute fragmentačnej analyacuteze FISH DNA mikročipoch atď

40

Obr 35 Princiacutep Southern blotu

82 FISH (fluorescenčnaacute in situ hybridizaacutecia)

FISH (fluorescent in situ hybridization fluorescenčnaacute in situ hybridizaacutecia) metoacuteda patriacute medzi molekulovo-cytogenetickeacute techniky Princiacutep FISH metoacutedy je založenyacute na hybridizaacuteciiacute fluorescenčne značenyacutech proacuteb ku komplementaacuternym uacutesekom vyšetrovanej DNA na podložnom skle (priamo na mieste - in situ) K denaturaacutecii dsDNA dochaacutedza buď vplyvom denaturačnyacutech činidiel alebo zvyacutešenou teplotou a naacuteslednou renaturaacuteciou dochaacutedza k naviazaniu sondy na komplementaacuterny uacutesek DNA Vyacutesledok hybridizaacutecie sa vizualizuje fluorescenčnyacutem mikroskopom vybavenyacutem vhodnyacutemi fluorescenčnyacutemi filtrami a vizuaacutelne zhodnotiacute skuacutesenyacutem odborniacutekom Fluorescencia sa v niektoryacutech priacutepadoch mocircže zaznamenať a hodnotiť aj pomocou softveacuteru (obr 36)

Pomocou FISH detegujeme numerickeacute aberaacutecie - zmeny v počte chromozoacutemov (napr trizoacutemia monozoacutemia chromozoacutemov) alebo štruktuacuterne aberaacutecie a prestavby (napr translokaacutecie inverzie deleacutecie duplikaacutecie amplifikaacutecie) FISH metoacuteda umožňuje identifikaacuteciu a detekciu každeacuteho ľudskeacuteho chromozoacutemu jeho zaradenie do karyotypu odhalenie malyacutech submikroskopickyacutech chromozoacutemovyacutech zmien a tiež mapovať poziacutecie jednotlivyacutech geacutenov na chromozoacuteme

41

Obr 36 Princiacutep štandardnej FISH a FISH maľovania celeacuteho chromozoacutemu

Veľkou vyacutehodou FISH metoacutedy je možnosť analyacutezy buniek v metafaacuteze aj v interfaacuteze kedy nie je nutnaacute kultivaacutecia buniek a tiež ryacutechle analyzovanie veľkeacuteho počtu buniek (stovky až tisiacutece) K ďalšiacutem vyacutehodaacutem patriacute bezpečnosť vysokaacute citlivosť dostatočnaacute stabilita relatiacutevne kraacutetky čas hybridizaacutecie a možnosť ryacutechleho vyhodnotenia Hybridizaacutecia pri vaumlčšine suacutečasne dodaacutevanyacutech sond trvaacute 10-12 hodin (na trhu suacute už dostupneacute aj sondy so skraacutetenyacutem časom hybridizaacutecie na 2-3 hodiny) Po hybridizaacuteciiacute nasleduje odmyacutevanie kedy pri priacuteslušnej teplote dochaacutedza k odmytiu nenaviazanyacutech a nespraacutevne hybridizovanyacutech sond Preparaacutet sa naacutesledne podfarbiacute a vyacutesledok sa zhodnotiacute vo fluorescenčnom mikroskope Na podfarbenie chromozoacutemov alebo jadier sa použiacuteva modreacute kontrastneacute farbivo DAPI (46-diamidino-2-fenylindol) ktoreacute maacute silneacute fluorescenčneacute vlastnosti dokaacuteže prechaacutedzať jadrovou membraacutenou a viazať sa na DNA Vyacutesledkom je modreacute zafarbenie ktoreacute vyacuteborne kontrastuje so signaacutelmi jednotlivyacutech sond

Limitujuacutecim faktorom FISH je možnosť identifikaacutecie len tyacutech uacutesekov DNA ku ktoryacutem suacute použiteacute sondy V jednej analyacuteze je možneacute použiť najviac 3 odlišne značeneacute sondy a tak zistiť priacutepadneacute abnormality len na 1 alebo na paacuter lokusoch Na relevantnuacute detekciu je potrebneacute mať vo vzorke 1-5 aberantnyacutech interfaacutezovyacutech jadier

FISH je možneacute uskutočniť na širokej škaacutele biologickeacuteho materiaacutelu na vzorkaacutech perifeacuternej krvi kostnej drene naacuteteroch choriovyacutech klkoch plodovej vode rocircznych druhov tkaniacutev natiacutevnych alebo zaliatych v parafiacutene na 1 bunke (predimplantačnaacute genetickaacute diagnostika PGD) (obr 37)

Využiacuteva sa na detekciu aberaacuteciiacute pri mnohyacutech onkologickyacutech ochoreniach (napr pri diagnoacuteze mnohopočetnyacute myeloacutem sa v suacutečasnosti po separaacutecii CD138+ buniek robiacute FISH s 5 sondami pre geacuteny IGH TP53 RB1 oblasť 1p321q21 a stanovuje sa hyperploidia chromozoacutemov 5 9 a 15) a tiež k spresneniu doplneniu a k overeniu bežneacuteho cytogenetickeacuteho vyšetrenia

Podľa miesta na chromozoacuteme na ktorom dochaacutedza k hybridizaacutecii sondy rozlišujeme 4 typy

DNA sond bull centromeacuteroveacute sondy ndash sa viažu na strednuacute časť chromozoacutemu ndash centromeacuteru sluacutežia k diagnostike zmien v počte chromozoacutemov k detekcii chromozoacutemov neznaacutemeho pocircvodu umožňujuacute interfaacuteznu FISH na nedeliacich sa bunkaacutech (obr 38-41)

42

Obr 37 Interfaacutezna FISH preimplantačnyacute genetickyacute skriacutening aneuploidiiacute ndash blastomeacutera 3-denneacuteho ľudskeacuteho embrya s normaacutelnym počtom chromozoacutemov 13 18 21 pohlavie XY použityacutech 5 sond pre chromozoacutemy 13 ndash orange 18 ndash aqua 21 ndash green X ndash blue a Y ndash yellow (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

Obr 38 Interfaacutezne jadro po hybridizaacutecii s centromeacuterovou sondou pre chromozoacutem 8 (Vysis Abbott) V pravom jadre je priacutetomnaacute trizoacutemia chromozoacutemu 8 (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex) Obr 39 Metafaacutezna (A) a interfaacutezna FISH (B) použitaacute centromeacuterovaacute sonda CEPX spectrum orangeCEPY spectrum green (Vysis Abbott) Sonda hybridizuje k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (červenyacute signaacutel) a Y (zelenyacute signaacutel) (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

43

Obr 40 Interfaacutezna FISH vyšetrenie spermiiacute použiteacute sondy CEPX greenCEPY orange (Aneuscore Metasystems) Sondy hybridizujuacute k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (zelenyacute signaacutel) Y (červenyacute signaacutel) vľavo ndash dve haploidneacute spermie (majuacutece jedna spermia X druhaacute Y chromozoacutem) vpravo ndash dve patologickeacute spermie obsahujuacutece gonozoacutemovyacute komplement XY (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

Obr 41 Interfaacutezna FISH vyšetrenie spermiiacute použiteacute sondy CEPX greenCEPY orange a CEP18 aqua (Aneuscore Metasystems) Sondy hybridizujuacute k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (zelenyacute signaacutel) Y (červenyacute signaacutel) a 18 (modryacute signaacutel) vľavo ndash normaacutelne haploidneacute ľudskeacute spermie - 1x chromozoacutem X alebo Y a jedenkraacutet chromozoacutem 18 v strede ndash patologickaacute spermia obsahujuacuteca gonozoacutemovyacute komplement XY a jeden chromozoacutem 18 vpravo ndash patologickaacute diploidnaacute spermia s chromozoacutemami X Y a dvoma chromozoacutemami 18 (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

bull lokusovo špecifickeacute sondy ndash hybridizaacutecia prebehne na konkreacutetnom mieste geacutenu (lokuse) (obr 42-44) použiacutevajuacute sa k vyšetreniu mikrodeleacuteciiacute (straty malyacutech častiacute chromozoacutemu pri mikrodelečnyacutech syndroacutemoch) k zisteniu amplifikaacutecie onkogeacutenov a niektoryacutech špecifickyacutech translokaacuteciiacute prestavby geacutenov umožňujuacute interfaacuteznu FISH na nedeliacich sa bunkaacutech bull subtelomeroveacute ndash vaumlzba na koncoveacute časti chromozoacutemu ndash telomeacutery bull celochromozoacutemoveacute alebo celomaľovacie sondy ndash sondy hybridizujuacute s mnohopočetnyacutemi chromozoacutemovyacutemi sekvenciami pričom sa fluorescenčne tak bdquovymaľujeldquo celyacute chromozoacutem (Obr 45) Použiacutevajuacute sa na vyšetrenie chromozoacutemovyacutech prestavieb k analyacuteze translokaacuteciiacute a k detekcii pocircvodu tzv marker chromozoacutemov (malyacutech nadpočetnyacutech chromozoacutemov neznaacutemeho pocircvodu) K použitiu sondy suacute potrebneacute metafaacutezne chromozoacutemy nepoužiacutevaju sa pre interfaacuteznu FISH

Pri konvenčnej chromozoacutemovej FISH suacute homogeacutenne DNA proacuteby hybridizovaneacute s fixovanyacutem metafaacuteznym alebo prometafaacuteznym chromozoacutemomchromozoacutemami na skliacutečku (Obr 36a) Maximaacutelna rozlišovacia schopnosť metafaacuteznej FISH je niekoľko megabaacutez (Obr 39a 45) využitiacutem viac

44

natiahnutyacutech prometafaacuteznych chromozoacutemov sa dosiahne 1 Mb rozliacutešenie Prostredniacutectvom fiber FISH konkreacutetne artificiaacutelne deproteinizovanej natiahnutej DNA pripravenej in situ z celyacutech buniek na mikroskopickom skliacutečku je možneacute vizualizovať individuaacutelne geacuteny maleacute DNA elementy na chromozoacuteme s rozliacutešeniacutem okolo 1000 bp

Obr 42 Interfaacutezne jadro po hybridizaacutecii s lokusovo-špecifickou sondou LSI 5q31 Spectrum Orange5p12 Spectrum Green (Vysis Abbott) Na ľavom obraacutezku suacute priacutetomneacute dva červeneacute (5q31) a dva zeleneacute signaacutely (5p12) v pravom jadre je priacutetomnaacute deleacutecia 5q31 oblasti chyacuteba jeden červenyacute signal (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

Obr 43 Interfaacutezna FISH použitaacute lokusovo-špecifickaacute sonda ndash translokačnaacute - XL BCRABL1 plus (Metasystems) dvojfarebnaacute dvojfuacutezna kde červenaacute označuje lokus ABL1 na chromozoacuteme 9 a zelenaacute oblasť BCR na chromozoacuteme 22 Sonda deteguje fuacuteziu protoonkogeacutenu ABL1 (9q34) a geacutenu BCR (22q11) v priacutepade že červenyacute a zelenyacute signaacutel suacute pri sebe (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

45

Obr 44 Interfaacutezna FISH Použitaacute lokusovo-špecifickaacute sonda- typ break apart pre IGH geacuten V docircsledku translokaacutecie došlo k rozskočeniu geacutenu pričom translokačneacuteho partnera nepoznaacuteme vieme určiť len percento v koľkyacutech jadraacutech je geacuten prestavanyacute (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex) Obr 45 Použiteacute celochromozoacutemoveacute sondy WCP 15 (červenyacute chromozoacutem) a WCP 17 (zelenyacute chromozoacutem) Na metafaacuteze je potvrdenaacute reciprokaacute translokaacutecia t(1517)(q2221) (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

FISH vizualizaacutecia celeacuteho chromozoacutemu maľovanie chromozoacutemu anglicky chromosome

painting je špeciaacutelnou aplikaacuteciou chromozoacutemovej FISH proacuteba je koktail veľkeacuteho počtu rocircznych fluorescenčne značenyacutech DNA fragmentov hybridizujuacutecich pozdĺž celeacuteho konkreacutetneho chromozoacutemu (obr 36b 45) bdquoChromosomepaintingldquo analyzuje metafaacutezne chromozoacutemy V minulosti bola FISH vizualizaacutecia celyacutech chromozoacutemov limitovanaacute malyacutem množstvom rocirczne sfarbenyacutech fluorochroacutemov

V suacutečasnosti je možneacute detegovať množstvo cieľovyacutech sekvenciiacute naraz čo sa využiacuteva pri celogenoacutemovej chromozoacutemovej vizualizaacutecii (whole-chromosomepainting - WCP) metoacutedou multiplex FISH (M-FISH multicolor FISH o br 46) alebo spektraacutelnej karyotypizaacutecie (SKY) kedy možno rozliacutešiť všetky ľudskeacute chromozoacutemy ndash teda 24 rocircznych chromozoacutemov M-FISH a SKY patria medzi metafaacutezne formy FISH diagnostiky ktoreacute umožňujuacute simultaacutennu vizualizaacuteciu všetkyacutech ľudskyacutech chromozoacutemov v rocircznych farbaacutech čo predstavuje uľahčenie analyacutezy karyotypu hlavne pri komplexnyacutech zmenaacutech a markeroch neznaacutemeho pocircvodu Obe techniky vychaacutedzajuacute z použitia

46

celochromozoacutemovyacutech sond značenyacutech kombinaacuteciou viaceryacutech fluorochroacutemov Rozdiel medzi M-FISH a SKY spočiacuteva v technike ziacuteskania konečneacuteho obrazu

Obr 46 Multicolor FISH - každyacute chromozoacutemovyacute paacuter je zafarbenyacute inou farbou pričom na ich zafarbenie postačuje kombinaacutecia 5 fluorochroacutemov Na vyhodnocovanie je potrebnaacute špeciaacutelna sada fluorescenčnyacutech filtrov pre jednotliveacute fluorochroacutemy a špeciaacutelnyacute softweacuter Vľavo-štandardnyacute karyotyp vpravo karyotyp s mutaacuteciami (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

V molekulovej cytogenetike suacute komerčne dostupneacute sety M-FISH proacuteb umožňujuacutece

viacfarebneacute pruacutežkovanie chromozoacutemov (banding) s vysokyacutem rozliacutešeniacutem (multicolor-banding mBAND FISH MCB) čo umožňuje identifikaacuteciu intrachromozoacutemovyacutech prestavieb (Obr 47) Nevyhnutnosťou mBAND-u je mať chromozoacutemy v metafaacuteze Taacuteto metoacuteda bola prvyacutekraacutet uskutočnenaacute na chromozoacuteme 5 v roku 1999 mBAND FISH umožňuje rozliacutešiť špecifickeacute oblasti chromozoacutemov na uacuterovni pruacutežku - bandu a sub-bandu s detekciou 550 bandov haploidneacuteho karyotypu

Obr 47 A - mBAND chromozoacutemu 11 - inverzia duplikovanej oblasti 11q223-q25 B - mBAND chromozoacutemu 3 - na kruhovom chromozoacuteme deleacutecia oblasti 3p263 C - mBAND chromozoacutemu 2 - potvrdenie inverzie duplikovanej časti chromozoacutemu (poskytnuteacute RNDr Dagmar Landlovou Medirex)

FISH metoacuteda a jej varianty (M-FISH mBAND SKY) majuacute v suacutečasnosti širokeacute využitie v

klinickej genetike v onkologickej genetike na detekciu aberaacuteciiacute v čase diagnoacutezy počas liečby po

47

liečbe monitorovanie po transplantaacutecii kostnej drene v prenataacutelnej a postnataacutelnej diagnostike pri detekcii submikroskopickyacutech deleacuteciiacute (napr DiGeorge syndroacutem - 22q112 delečnyacute syndroacutem PraderndashWilli syndroacutem- chromozoacutem 15q11-13) prostredniacutectvom FISH je možnaacute detekcia numerickyacutech zmien chromozoacutemov (trizoacutemia chromozoacutemu 21 pri Downovom syndroacuteme trizoacutemia chromozoacutemu 15 pri Patauovom syndroacuteme trizoacutemia chromozoacutemu 18 pri Edwardsovom syndroacuteme) rocirczne zmeny v počte pohlavnyacutech chromozoacutemov (monozoacutemia X pri Turnerovom syndroacuteme Klinefelterov syndroacutem s X chromozoacutemom naviac - XXY) podobne v predimplantačnej diagnostike

83 DNA Microarray (DNA mikro čip biočip) DNA mikročipovanie je technika využiacutevajuacuteca hybridizaacuteciu skuacutemanej nukleovej kyseliny

(cieľovaacute vzorka) s veľkyacutem množstvom oligonukleotidovyacutech proacuteb (desať tisiacutec až milioacuten) ktoreacute suacute prichyteneacute na pevnyacute podklad najčastejšie sklenyacute silikoacutenovyacute alebo nylonovyacute (doštička čip) Skuacutemanaacute nukleovaacute kyselina je pred hybridizaacuteciou fragmentovanaacute označenaacute fluorofoacuterom a denaturovanaacute Po kontakte čipu s cieľovou vzorkou ktoraacute je vlastne zmes označenyacutech oligonukleotidov značeneacute oligonukleotidy hybridizujuacute s oligonukleotidovyacutemi sekvenciami prichytenyacutemi na čipe Potom suacute na zaacuteklade fluorescencie detekovaneacute miesta kde došlo k hybridizaacutecii čiže vzorka obsahovala takuacuteto nukleotidovuacute sekvenciu Z jedneacuteho mikročipu sa ziacuteska obrovskeacute množstvo daacutet ktoreacute je vždy nutneacute softveacuterovo spracovať V dnešnej dobe existuje niekoľko firiem poskytujuacutecich komerčne mikročipy na objednaacutevku alebo si ich laboratoacuteria produkujuacute sami

Mikročipovanie prebieha nasledovne

1) Vytvorenie DNA čipu ndash tisiacutece rocircznych jednovlaacuteknovyacutech DNA oligonukleotidov znaacutemych sekvencii sa kovalentne naviažu na povrch doštičky vždy v určitej lokalite je niekoľko rovnakyacutech oligonukleotidov veľkosť takejto lokality je ˂ 200 microm Proacutebami mocircže byť DNA cDNA alebo syntetizovaneacute oligonukleotidy Už hotoveacute mikročipy ponuacutekajuacute viacereacute firmy (Affymetrix Agilent Technologies Eppendorf Illumina) alebo si ich jednotliveacute laboratoacuteria vyraacutebajuacute sami pomocou robotickyacutech zariadeniacute DNA čip sa vytvaacutera buď nanaacutešaniacutem kvapiek oligonukleotidov na podklad alebo synteacutezou oligonukleotidov in situ na čipe 2) Priacuteprava vzorky ndash nukleovaacute kyselina (mRNA DNA) sa purifikuje určiacute sa jej kvantita a kvalita (spektrofotometericky) fragmentuje resp v priacutepade mRNA sa syntetizuje cDNA v priacutepade potreby sa mocircže DNA amplifikovať PCR reakciou štiepiť restrikčnyacutemi endonukleaacutezami 3) Fluorescenčneacute označenie (zriedkavejšie raacutedioaktiacutevne) fragmentov DNA prebieha počas reverznej transkripcie alebo PCR amplifikaacutecie za uacutečasti fluorescenčne značenyacutech nukleotidov Keď sa analyzujuacute dve rocirczne vzorky napr zdraveacute tkanivo a naacutedoroveacute tkanivo označenie nukleovyacutech kyseliacuten v tyacutechto tkanivaacutech byacuteva rozdielne a to použitiacutem dvoch rocircznych fluorescenčnyacutech farbiacutev (napr zeleneacute a červeneacute) Pred hybridizaacuteciou je potrebneacute vzorku denaturovať čiacutem sa vytvoriacute zmes jednovlaacuteknovyacutech DNA označenyacutech značkou 4) Hybridizaacutecia s mikročipom ndash v špeciaacutelnom hybridizačnom roztoku hybridizujuacute komplementaacuterne sekvencie zo vzorky s priacuteslušnyacutemi oligonukleotidovyacutemi sondami naviazanyacutemi na čipe Potom sa čip obmyje aby došlo k odstraacuteneniu čiastočne hybridizovanyacutech nukleovyacutech kyseliacuten 5) Skenovanie mikročipu ndash skenerom čipov docircjde k ožiareniu čipu laserom pričom v mieste hybridizaacutecie fluorescenčne značenyacutech DNA fragmentov s proacutebou docircjde k emisii svetla určitej vlnovej dĺžky ktoruacute skener zaznamenaacute 6) Analyacuteza daacutet prebieha metoacutedami bioinformatiky spracovaniacutem softveacutermi sa zistiacute ktoreacute lokality čipu navzaacutejom hybridizovali v priacutepade použitia dvoch vzoriek kontrolnej a skuacutemanej je možneacute analyzovať ich relatiacutevnu intenzitu hybridizaacutecie (expresie určiteacuteho geacutenu)

Existujuacute štyri typy mikročipov 1) Čipy ur čeneacute na analyacutezu expresie (obsahujuacute cDNA proacuteby) pre tzv dvojkanaacutelovyacute experiment kedy je vzorka určenaacute k hybridizaacutecii na čipe ziacuteskanaacute zmiešaniacutem DNA fragmentov kontrolnej a skuacutemanej vzorky pričom fragmenty suacute rozdielne fluorescenčne označeneacute (napr zelenyacute fluorofoacuter pre kontrolnuacute vzorku a červenyacute pre skuacutemanuacute) Na zaacuteklade intenzity a typu fluorescencie sa deteguje expresia geacutenov typickaacute pre kontrolnuacute vzorku (napr zelenaacute fluorescencia) pre skuacutemanuacute vzorku (napr

48

červenaacute fluorescencia) a expresia podobnaacute u oboch vzoriek (žltaacute fluorescencia) neexprimovaneacute geacuteny (čierna fluorescencia) rocirczne odtiene (v zaacutevislosti od prevažujuacutecej hybridizaacutecie) (obr 48) 2) Čipy ur čeneacute na analyacutezu mutaacutecii použije sa genoacutemovaacute DNA označenaacute jednou fluorescenčnou farbičkou na určenie jednonukleotidovej zmeny (SNP ndash Single Nukleotide Polymorphism) 3) Čipy na komparatiacutevnu genoacutemovuacute hybridizaacuteciu (aCGH array Comparative Genomic Hybridization) ndash použiacutevaneacute na zistenie zvyacutešenia alebo zniacuteženia množstva chromozoacutemovyacutech fragmentov obsahujuacutecich geacuteny zodpovedneacute za určiteacute ochorenie Na analyacutezu sa použije skuacutemanaacute gDNA a referenčnaacute (kontrolnaacute) DNA každaacute sa značiacute inou fluorescenčnou farbičkou (princiacutep ako pri analyacuteze expresie) (obr 49 50) 4) Čipy CGH - SNP kombinovaneacute čipy ur čeneacute na analyacutezu aj mutaacuteciiacute SNP aj na komparatiacutevnu genoacutemovuacute hybridizaacuteciu CGH

Mikročipy majuacute rozsiahle využitie napriacuteklad v identifikaacuteciiacute novyacutech geacutenov vo vyacuteskume ich funkciiacute expresie v rocircznych podmienkach pri diagnostike mnohyacutech ochoreniacute vo farmakogenomike vo vyacuteskume vplyvu toxiacutenov

Obr 48 Heatmapa geacutenovej expresie vybranyacutech geacutenov (mRNA) mikročip obsahuje 46000 cDNA proacuteb (poskytnuteacute Ing Helenou Gbelcovou PhD Uacutestav lekaacuterskej bioloacutegie genetiky a klinickej genetiky LF UK a UNB)

49

Obr 49 Princiacutep komparatiacutevnej genoacutemovej hybridizaacutecie (aCGH - array comparative genomic hybridization) Obr 50 A) Vyacutesledok komparatiacutevnej genoacutemovej hybridizaacutecie (aCGH - array comparative genomic hybridization) vzorky DNA izolovanej plodovej vody U plodu s abnormaacutelnym ultrasonografickyacutem vyšetreniacutem bola identifikovanaacute duplikaacutecia oblasti 3q261q29 (modryacute paacutes) a deleacutecia oblasti 5p1533p151 (červenyacute paacutes) Pre porovnanie chromozoacutem 1 bez aberaacutecie b) Ten istyacute pacient ale ineacute softveacuteroveacute spracovanie (poskytnuteacute RNDr Miroslavom Tomkom PhD Medirex)

50

Odporuacutečanaacute a použitaacute literatuacutera

Odborneacute knihy Klug W S Cummings M R Spencer Ch A Palladino M A Concepts of Genetics jedenaacuteste vydanie (2015) Carson S Molecular Biology Techniques tretie vydanie (2012) Strachan T Read A Human Molecular Genetics štvrteacute vydanie (2011) Sudbery P Sudbery I Human Molecular Genetics tretie vydanie (2009)

Internetoveacute straacutenky

wwwncbinlmnihgov wwwmlpacom wwwthermofishercom wwwilluminacom wwwpromegask wwwqiagencom wwwambioncom

Odborneacute člaacutenky Chacon-Cortes D Griffiths L R Methods for extracting genomic DNA from whole blood samples current perspectives Journal of Biorepository Science for Applied Medicine Volume 2 strany 1- 9 Viltrop T Krjutskov K Palta P Metspalu A Comparison of DNA extraction methods for multiplex polymerase chain reaction Anal Biochem 2010 Volume 398(2) strany 260-262 Ing Martin Čermaacutek Molekulaacuterna cytogenetika v problematike familiaacuternych maligniacutet Onkoloacutegia Volume 2 strany 77 - 83 Livak KJ Schmittgen TD Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method Methods 2001 Volume 25(4) strany 402 - 408 Bustin S A Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays J Mol Endocrinol 2000 Volume 25(2) strany169 - 193

MOLEKULAacuteRNE METOacuteDY AKTUAacuteLNE POUŽIacuteVANEacute V KLINICKEJ GENETIKE RNDr Andrea Pastoraacutekovaacute PhD RNDr Robert Petrovič PhD Vydala Univerzita Komenskeacuteho v Bratislave Lekaacuterska fakulta Rozsah 50 straacuten 246 AH prveacute vydanie ISBN 978-80-223-4231-5

19

transkripcie za použitia enzyacutemu reverznej transkriptaacutezy Kvantitatiacutevna PCR s reverznou transkripciou RT-qPCR mocircže byť dvojkrokovaacute alebo jednokrokovaacute Pri dvojkrokovej RT-qPCR treba pred qPCR syntetizovať cDNA vlaacutekno z RNA pomocou reverznej transkriptaacutezy - 1 krok druhyacutem krokom je samotnaacute real-time PCR Jednokrokovaacute RT-qPCR umožňuje uskutočniť obidve reakcie reverznuacute transkripciu a kvantitatiacutevnu PCR v jednej skuacutemavke čo zjednodušuje qPCR a redukuje možnosť kontaminaacutecie Obr 16 5-bodovaacute štandardnaacute krivka (amplifikaacutecia piatich koncentraacuteciiacute jednej vzorky konkreacutetne ide o 10-tkoveacute riedenie)

Obr 17 Ukaacutežka amplifikačnyacutech kriviek riedenia a z nich ziacuteskanej štandardnej krivky poukazuje na vysokuacute presnosť metoacutedy RT-PCR

20

Obr 18 Relatiacutevna kvantifikaacutecia - určenie počtu koacutepiiacute geacutenu CYP21A2 vo vzorke DNA izolovanej z perifeacuternej krvi pacientov mutaacutecie v geacutene CYP21A2 spocircsobujuacute kongenitaacutelnu adrenaacutelnu hyperplaacuteziu (CAH) Vyacutesledok analyacutezy všetci pacienti majuacute dve koacutepie geacutenu

Obr 19 Relatiacutevna kvantifikaacutecia - určenie počtu koacutepiiacute geacutenu CYP21A2 vo vzorke DNA izolovanej z plodovej vody mutaacutecie v geacutene CYP21A2 spocircsobujuacute kongenitaacutelnu adrenaacutelnu hyperplaacuteziu (CAH) Prenaacutetalnou diagnostikou (qPCR) sa zistila priacutetomnost jednej koacutepie CYP21A2 geacutenu 332 Určenie genotypu metoacutedou alelovej diskriminaacutecie a analyacutezou krivky topenia (HRM)

Určenie genotypu metoacutedou alelovej diskriminaacutecie (obr 20) sa uskutočňuje použitiacutem hydrolyzujuacutecich proacuteb (sond) je veľmi ryacutechla a senzitiacutevna (presnaacute) metoacuteda frekventovane využiacutevanaacute v laboratoacuteriaacutech Dva variantyalely suacute vyšetreneacute suacutečasne v jednej vzorke a v jednej reakčnej

21

skuacutemavke V reakcii suacute použiteacute dve proacuteby označeneacute rozdielnymi fluorescenčnyacutemi farbičkami emitujuacutecimi svetlo o rocircznej vlnovej dĺžke (najčastejšie jedna označenaacute FAM farbičkou a druhaacute proacuteba označenaacute VIC farbičkou) Počas amplifikaacutecie amplikoacutenu dochaacutedza k odstraacuteneniu zhaacutešača z bliacutezkosti farbičky ktoraacute potom emituje svetlo priacuteslušnej vlnovej dĺžky Vzorky so signaacutelom len jednej fluorescenčnej farbičky (FAM) a bez signaacutelu druhej farbičky (VIC) suacute homozygoti pre alelu 1 vzorky so signaacutelom len druhej farbičky (VIC) a bez signaacutelu prvej (FAM) suacute homozygoti pre alelu 2 v priacutepade ak vyšetrovanaacute vzorka bdquosvietildquo obidvoma farbami jednaacute sa o heterozygota

Obr 20 Určenie genotypu metoacutedou alelovej diskriminaacutecie ndash amplifikačnaacute krivka vzoriek DNA majuacutecich tri rocirczne genotypy A ndash jednotliveacute vzorky (plnaacute čiara predstavuje štandardnuacute alelu guličkovanaacute mutovanuacute alelu) B ndash 72 vzoriek C ndash scatter plot 72 vzoriek

Určenie genotypu analyacutezou krivky topenia tzv high resolution melt (HRM) (obr 21) umožňuje detekciu takmer všetkyacutech genetickyacutech variaacuteciiacute (SNP mutaacuteciiacute) Keďže taacuteto metoacuteda okrem štandardnyacutech podmienok reakcie vyžaduje len primery a farbičku (nie proacuteby) je veľmi jednoduchaacute a lacnejšia Po amplifikaacuteciiacute treba amplikoacuten pomaly zohrievať až kyacutem nedocircjde k denaturaacuteciiacute Teplota topenia amplikoacutenu vo vzorke zaacutevisiacute od DNA sekvencie čo umožňuje detegovať priacutetomnosť mutaacutecie resp SNP Tvar vyacuteslednyacutech kriviek topenia určuje teda genotyp

22

Obr 21 Určenie genotypu analyacutezou krivky topenia tzv metoacutedou high resolution melting (HRM) A ndash krivka topenia vzoriek DNA majuacutecich tri rocirczne genotypy B ndash graf rozdielnosti krivky topenia vzoriek DNA majuacutecich tri rocirczne genotypy

23

4 Elektroforetickaacute separaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten

Separaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten predstavuje rozdelenie molekuacutel DNA alebo RNA na zaacuteklade veľkosti zloženia a poradia baacutez Podobnyacutemi metoacutedami je možneacute separovať aj proteiacuteny

Elektroforeacuteza (ELFO) je technika použiacutevanaacute na separaacuteciu niekedy aj purifikaacuteciu makromolekuacutel ako suacute nukleoveacute kyseliny a proteiacuteny na zaacuteklade ich rozdielnej veľkosti naacuteboja alebo konformaacutecie Je to metoacuteda veľmi často využiacutevanaacute nielen v molekulovej genetike ale aj biocheacutemii Elektroforeacuteza využiacuteva schopnosť nabityacutech molekuacutel migrovať v jednosmernom elektrickom poli k opačneacutemu poacutelu Nukleoveacute kyseliny majuacute vďaka svojej fosfaacutetovej zložke negatiacutevny naacuteboj preto v jednosmernom elektrickom poli migrujuacute ku kladneacutemu poacutelu čiže k anoacutede Elektroforeacuteza prebieha v elektroforetickej aparatuacutere v geacuteloch (v nosiči) so sieťovitou štruktuacuterou ktoraacute umožňuje separaacuteciu molekuacutel Vzorka nukleovej kyseliny zmiešanaacute s tzv nanaacutešaciacutem tlmivyacutem roztokom s farbičkou sa nanesie do jamky v geacuteli ktoryacute je umiestnenyacute v elektroforetickej aparatuacutere v priacutetomnosti elektroforetickeacuteho pufra (TAE alebo TBE) (obr 22) Nanaacutešaciacute tlmivyacute roztoknanaacutešacia farbička umožňuje na zaacuteklade migraacutecie farbičky vidieť migraacuteciu vzorky v geacuteli a suacutečasne zvyacutešeniacutem hustoty vo vzorke umožniacute klesnuacuteť vzorke do jamky a tak zabraacuteniť jej vyplaveniu z geacutelu Draacuteha je časť geacutelu ktoryacutem putuje jedna vzorka od katoacutedy k anoacutede V draacutehe sa nachaacutedzajuacute oddeleneacute jednotliveacute fragmenty nukleovyacutech kyseliacuten určityacutech veľkostiacute viditeľneacute vo forme pruacutežkov (angl bands) Intenzita pruacutežku zaacutevisiacute od množstva molekuacutel danej veľkosti je ekvivalentnaacute hmotnosti Na určenie veľkosti fragmentov NK sa do jednej jamky nanesie štandard molekulovyacutech hmotnostiacute (angl ladder) ktoryacute maacute presne definovaneacute veľkosti fragmentov čo umožňuje odhadnuacuteť veľkosť aj hmotnosť neznaacutemych separovanyacutech fragmentov

Obr 22 Elektroforetickaacute separaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten v agaroacutezovom geacuteli (A) a vizualizaacutecia UV svetlom a GelRedtrade (B C)

24

Nukleoveacute kyseliny je možneacute elektroforeticky separovať 1) v geacuteloch agaroacutezovom (horizontaacutelna elektroforeacuteza) (obr 22) a polyakrylamidovom (vertikaacutelna elektroforeacuteza) 2) v špeciaacutelnych lineaacuternych polymeacuteroch kapilaacuternou elektroforeacutezou použitiacutem genetickeacuteho analyzaacutetora (obr 23)

Agaroacuteza je polysacharid ziacuteskanyacute z morskej riasy použiacuteva sa najčastejšie v koncentraacuteciiacute 05-2 čiacutem vyššia koncentraacutecia tyacutem je geacutel pevnejšiacute a schopnejšiacute rozliacutešiť menšie fragmenty NK Priacuteprava je jednoduchaacute odvaacuteži sa potrebneacute množstvo agaroacutezy ktoraacute sa zmieša s tlmivyacutem roztokom (pufrom) rozvariacute sa v mikrovlnnej ruacutere a naleje sa do špeciaacutelnej naacutedoby na vytvaacuteranie geacutelov kyacutem je geacutel tekutyacute vložiacute sa do neho tzv hrebeň na vytvorenie jamiek Agaroacuteza je netoxickaacute V bežnom agaroacutezovom geacuteli v zaacutevislosti od jeho koncentraacutecie je možneacute separovať DNA fragmenty dĺžky 200-50 000 bp Dnes suacute dostupneacute aj špeciaacutelne agaroacutezy napr MetaPhorreg Agarose schopneacute oddeliť fragment DNA dĺžky 20-800bp Separaacutecia v agaroacutezovom geacuteli prebieha v horizontaacutelnej aparatuacutere preto sa nazyacuteva aj horizontaacutelna elektroforeacuteza

Polyakrylamidovyacute geacutel (PAGE) vznikaacute polymerizaacuteciou akrylamidu v priacutetomnosti špeciaacutelnych chemickyacutech laacutetok (peroxodisiacuteran amoacutenny TEMED bisakrylamid) Jeho priacuteprava je preto odlišnaacute a aj naacuteročnejšia Polyakrylamidoveacute geacutely majuacute vysokuacute rozlišovaciu schopnosť (1bp) preto suacute PAGE geacutely vhodneacute aj na sekvenovanie DNA klasickyacutemi metoacutedami PAGE geacutel nie je vhodnyacute na separaacuteciu fragmentov dlhšiacutech ako 2kb Použiacuteva sa v koncentraacutecii 35 -20 s rozliacutešeniacutem fragmentov od 10bp-2000bp Akrylamid je neurotoxiacuten musiacute sa s niacutem pracovať veľmi opatrne PAGE elektroforeacuteza bežiacute vo vertikaacutelnej aparatuacutere preto sa volaacute aj vertikaacutelna elektroforeacuteza použiacuteva sa často aj na separaacuteciu proteiacutenov

Ryacutechlosť pohybu nukleovyacutech kyseliacuten (mobilita) určuje viacero faktorov 1) veľkosť NK ndash počet baacutezovyacutech paacuterov resp baacutez pričom menšie molekuly prechaacutedzajuacute geacutelom ryacutechlejšie pretože sa ľahšie pohybujuacute v geacuteli 2) konformaacutecia nukleovej kyseliny napr u rovnako veľkyacutech plazmidov kondenzovaneacute superšpiralizovaneacute plazmidy migrujuacute najryacutechlejšie rovnako veľkeacute lineaacuterne molekuly (toho isteacuteho plazmidu) bežia pomalšie a najpomalšie putujuacute relaxovaneacute kruhoveacute molekuly plazmidu 3) koncentraacutecia geacutelu určuje jeho rozlišovaciu schopnosť koncentrovanejšiacute geacutel je schopnyacute separovať kratšie fragmenty NK redšie geacutely suacute vhodneacute pre rozliacutešenie vaumlčšiacutech fragmentov 4) zloženie geacutelu je docircležiteacute pri analyacuteze sekundaacuternych štruktuacuter NK a proteiacutenov v nedenaturovanom stave sekundaacuterna štruktuacutera spomaľuje migraacuteciu NK a proteiacutenov Tento fakt využiacutevajuacute niektoreacute diagnostickeacute techniky (napr SSCP - Single Strand Conformation Polymorphism - polymorfismus konformaacutecie jednovlaacuteknovej DNA) umožňujuacutece detekciu zaacutemeny jedinej baacutezy ktoraacute spocircsobiacute odlišneacute vnuacutetromolekuloveacute paacuterovanie a vyacuteslednuacute konformaacuteciu molekuly Geacutely mocircžu teda byť denaturačneacute a nedenaturačneacute (natiacutevne) 5) napaumltie zdroja - čiacutem vyššie je napaumltie ktoreacute vytvaacutera elektrickeacute pole v elektroforetickej aparatuacutere tyacutem ryacutechlejšie fragmenty NK migrujuacute 6) zloženie roztokov a teploty

Elektroforetickyacute tlmivyacute roztok (pufor - elektrolyt) zabezpečuje stabilneacute elektroforetickeacute podmienky počas separaacutecie geacutel je v ňom ponorenyacute Obsahuje ioacuteny čo umožňuje vedenie elektrickeacuteho pruacutedu

Štandard molekulovyacutech hmotnostiacute (v laboratoacuteriaacutech nazyacutevanyacute ladder alebo marker) je zmes fragmentov DNA alebo RNA s presne definovanou veľkosťou ktoryacute sluacuteži na odhad veľkosti vyšetrovanyacutech fragmentov NK (obr 22) Pomocou špeciaacutelnych štandardov molekulovyacutech hmotnostiacute ktoryacutech fragmenty NK majuacute definovanuacute aj hmotnosť je možneacute odhadnuacuteť množstvo (hmotnosť - koncentraacuteciu) neznaacutemeho fragmentu

B C

25

41 Vizualizaacutecia DNA

Samotnaacute nukleovaacute kyselina je počas elektroforetickej separaacutecie neviditeľnaacute Vizualizaacuteciu NK umožňujuacute interkalačneacute činidlaacute ktoreacute suacute schopneacute naviazať sa na molekuly NK tyacutem že sa včlenia medzi susediace baacutezy Po ožiareniacute UV svetlom interkalačneacute činidlaacute naviazaneacute na NK fluoreskujuacute tak sa vizualizuje NK čiacutem intenziacutevnejšie fluoreskuje tyacutem viac NK je v geacutelipruacutežku priacutetomneacute Interkalačneacute činidlo sa buď primieša do geacutelu pri jeho priacuteprave čo umožniacute sledovať migraacuteciu fragmentov NK počas elektroforeacutezy a to po vybratiacute z ELFO aparatuacutery a po ožiareniacute UV svetlom alebo sa geacutel farbiacute po elektroforetickej separaacutecii V minulosti bol na zviditeľnenie NK najčastejšie použiacutevanyacute etidiumbromid kvocircli jeho mutageacutennym vlastnostiam sa v suacutečasnosti nahraacutedza menej mutageacutennymi a netoxickyacutemi činidlami ako suacute napr komerčne dostupneacute SYBRregSafe GelRedtrade GelGreentrade

Kapilaacuterna elektroforeacuteza NK prebieha v špeciaacutelnom priacutestroji genetickom analyzaacutetore (obr 23) ktoryacute musiacute mať zaacutekladneacute komponenty ako suacute elektroacutedy kapilaacutera zdroj vysokeacuteho napaumltia detektor prepojenie s počiacutetačom a softveacuteroveacute vybavenie priestor na vloženie vzoriek atď Genetickyacute analyzaacutetor predstavuje automatizovanyacute systeacutem umožňujuacuteci sekvenovanie určovanie dĺžky DNA fragmentov ndash fragmentačnuacute analyacutezu a kvantifikaacuteciu nukleovyacutech kyseliacuten V novšiacutech typoch genetickeacuteho analyzaacutetora je proces analyacutezy od vloženia vzoriek do stojana automatizovanyacute

Vzorka určenaacute na analyacutezu je elektrokineticky injektovanaacute do tenkej kapilaacutery naplnenej lineaacuternym polymeacuterom Vplyvom vysokeacuteho napaumltia sa negatiacutevne nabiteacute fragmenty DNA pohybujuacute v polymeacuteri k pozitiacutevne nabitej elektroacutede Kapilaacuterna elektroforeacuteza je tak citlivaacute že je schopnaacute detegovať jednobaacutezovyacute rozdiel DNA fragmentov DNA fragmenty musia byť pred kapilaacuternou elektroforeacutezou fluorescenčne označeneacute v kapilaacutere suacute separovaneacute na zaacuteklade veľkosti Kraacutetko pred dosiahnutiacutem kladne nabitej elektroacutedy docircjde po excitaacutecii laserovyacutem žiareniacutem k emisii žiarenia fluoroformi (farbičkami) tak že optickyacute detekčnyacute systeacutem zaznamenaacute fluorescenciu ktoraacute je naacutesledne softveacuterovo spracovanaacute a vyhodnotenaacute

Obr 23 Genetickyacute analyzaacutetor

42 RFLP

Metoacuteda polymorfizmu dĺžky restrik čnyacutech fragmentov (angl Restriction Fragment Length Polymorfism) bola prvou metoacutedou využiacutevanou na detekciu DNA variaacuteciiacute rocircznych biologickyacutech vzoriek Princiacutep metoacutedy spočiacuteva v priacutetomnosti polymorfizmov v DNA sekvencii rocircznych ľudiacute ktoreacute zapriacutečinia rozdielny profil (obrazec) DNA fragmentov po štiepeniacute jednou alebo viaceryacutemi restrikčnyacutemi endonukleaacutezami Restrikčneacute endonukleaacutezy (RE) suacute enzyacutemy ktoreacute štiepia DNA molekulu v oblasti špecifickej nukleotidovej sekvencie nazyacutevanej restrik čneacute miesto RE najčastejšie rozpoznaacutevajuacute a štiepia miesto veľkeacute 4-6 baacutez RE suacute priacutetomneacute u prokaryotov (bakteacuterie a archebakteacuterie) kde suacute suacutečasťou restrik čno-modifikačneacuteho systeacutemu akoby prokaryotickeacutej vrodenej imunity sluacutežia

26

na ochranu pred cudzou DNA (napr viacuterusovou) ktoruacute po rozpoznaniacute špecifickej sekvencie štiepia

Restrikčno-modifikačnyacute systeacutem maacute dve zložky 1) modifikačneacute enzyacutemy - metylaacutezy ktoreacute procesom metylaacutecie modifikujuacute určiteacute baacutezy svojej DNA čiacutem ich označia za vlastnuacute DNA takže takaacuteto DNA je potom rezistentnaacute voči štiepeniu restrikčnyacutemi endonukleaacutezami Najčastejšiacutem spocircsobom metylaacutecie u bakteacuteriiacute je metylaacutecia adeniacutenu na N6 pričom vznikne metyladeniacuten alebo cytoziacutenu na C5 metylcytoziacuten 2) restrikčneacute endonukleaacutezy štiepia špecifickeacute miesto dvojvlaacuteknovej DNA ktoreacute je tvoreneacute symetrickou sekvenciou zrkadlovo sa opakujuacutecich nukleotidov ndash tzv palindroacutem Restrikčneacute enzyacutemy sa použiacutevajuacute na štiepenie DNA sekvencie na mieste špecifickom pre tuacute ktoruacute restrikčnuacute endonukleaacutezu napr pri analyacuteze polymorfizmov dĺžky restrikčnyacutech fragmentov (RFLP) analyacuteze jednonukleotidovyacutech polymorfizmov (SNP) mutaacuteciiacute ako aj pri klonovaniacute DNA do vhodnyacutech vektorovyacutech DNA molekuacutel

Po štiepeniacute dvojvlaacuteknovej DNA restrikčnou endonukleaacutezou mocircžu vzniknuacuteť tri typy koncov - 5´-prečnievajuacutece konce (lepiveacute) 3´-prečnievajuacutece konce (lepiveacute) a tupeacute konce (obr 24)

Obr 24 Restrikčneacute štiepenie zanechaacutevajuacutece rocirczne konce tupeacute a lepiveacute

Restrikčneacute štiepenie je často použiacutevanou metoacutedou geacutenovyacutech manipulaacuteciiacute na konštrukciu

hybridnyacutech molekuacutel DNA s naacuteslednyacutem klonovaniacutem Priebeh RFLP analyacutezy je nasledovnyacute restrikčnaacute endonukleaacuteza sa pridaacute k DNA a zmes sa vo

vhodnyacutech reakčnyacutech podmienkach (pufor teplota) inkubuje niekoľko hodiacuten Počas inkubaacutecie docircjde k štiepeniu DNA na špecifickyacutech miestach DNA je potom elektroforeticky separovanaacute v geacuteli a naacutesledne vizualizovanaacute V minulosti po geacutelovej elektroforeacuteze nasledoval Southern blot (čiže prenos separovanyacutech fragmentov DNA z geacutelu na špeciaacutelnu membraacutenu) (obr 35) po ktorom nastala vizualizaacutecia raacutedioaktiacutevne značenou proacutebou V suacutečasnosti sa kvocircli praacutecnosti a zdravotnyacutem rizikaacutem od Southern blotu upuacutešťa a prechaacutedza sa na ryacutechlejšie menej praacutecne a zdravotne šetrnejšie metoacutedy priateľskejšie aj k životneacutemu prostrediu

RFLP bola prvou metoacutedou použiacutevanou na zistenie DNA profilu (DNA fingerprinting) mapovanie geacutenov zapriacutečiňujuacutece genetickeacute ochorenia a testovanie otcovstva Vaumlčšina RFLP markerov je vysoko lokusovo špecifickyacutech a kodominantnyacutech (obidve alely suacute detekovaneacute u heterozygota)

PCR-RFLP je laboratoacuterne priacutestupnejšia metoacuteda molekulaacuterno-genetickej diagnostiky keďže PCR umožňuje amplifikaacuteciu veľmi malyacutech množstiev DNA Alternatiacutevny naacutezov použiacutevanyacute v literatuacutere je CAPS z angl Cleaved Amplified Polymorphic Sequence assay Použitiacutem špecifickyacutech primerov docircjde PCR metoacutedou k amplifikaacutecii požadovaneacuteho uacuteseku DNA ten sa potom štiepi restrikčnou endonukleaacutezou vo vhodnyacutech podmienkach naacutesledne sa štiepne produkty elektroforeticky separujuacute a vizualizujuacute použitiacutem interkalačnyacutech farbiacutev a UV svetla (obr 25)

27

Obr 25 Princiacutep metoacutedy PCR-RFLP

43 VNTR a STR V geacutenome suacute priacutetomneacute dva typy tandemovyacutech (za sebou nasledujuacutecich) opakovaniacute

1) minisatelity ndash nazyacutevaneacute variabilnyacute počet tandemovyacutech opakovaniacute VNTR (variable number of tandem repeats) 2) mikrosatelity tiež kraacutetke tandemoveacute repetiacutecie STR (short tandem repeats)

Obidva tieto typy satelitnej DNA suacute rozmiestneneacute po celom genoacuteme suacute využiacutevaneacute hlavne vo forenznej genetike na identifikaacuteciu osocircb a určenie otcovstva popriacutepade materstva ale aj v mediciacutene na detekciu chromozoacutemovyacutech aneuploidiiacute Štruktuacutera obidvoch je podobnaacute Rozdiel medzi jednotlivyacutemi alelami je spocircsobenyacute rozdielnym počtom opakovaniacute opakujuacutecej sa sekvencie (motiacutevu) čo spocircsobiacute rocircznu dĺžku alel s rocircznym počtom tandemovyacutech opakovaniacute nazyacutevanuacute polymorfizmus dĺžky fragmentov

VNTR ndash variabilnyacute počet tandemovyacutech opakovaniacute pričom opakujuacuteca sa sekvencia maacute dĺžku od 6 do 100 baacutez pričom sa mocircže opakovať aj tisiacutece kraacutet alely tak mocircžu mať od 500do 30 000 baacutez VNTR boli v kombinaacutecii s RFLP (DNA fingerprinting ) prvyacutem polymorfizmom použiacutevanyacutem na zistenie DNA profilov a identifikaacuteciu osocircb v kriminalistickej praxi V suacutečasnosti jeho využitie v kriminalistike je kvocircli potrebe relatiacutevne veľkeacuteho množstva DNA nahradeneacute využitiacutem STR

STR - kraacutetke tandemoveacute repetiacutecie suacute v kriminalistike najčastejšie použiacutevanyacutem polymorfizmom STR lokusy suacute rozmiestneneacute po celom genoacuteme repetiacutecia obsahuje jednu až šesť baacutez pričom jej opakovaniacutem vznikne STR v rozsahu od 50 do 300bp V našom genoacuteme suacute tisiacutece STR ktoreacute mocircžu byť použiteacute pre forenznuacute analyacutezu V kriminalistike sa v suacutečasnosti na identifikaacuteciu osocircb použiacuteva 13 STR locusov ktoreacute patria k medzinaacuterodne uznaacutevanyacutem štandardom Z iniciatiacutevy FBI bola vytvorenaacute databaacuteza CODIS (Combined DNA Index System) každaacute krajina maacute svoju databaacutezu CODIS kde je možneacute vložiť a archivovať DNA profily jednotlivcov ako aj profily DNA ziacuteskanyacutech z miest kriminaacutelneho činu v databaacuteze je ich možneacute navzaacutejom porovnať a tak zistiť pocircvodcu trestneacuteho činu Medzinaacuterodnaacute jednotnosť v použiacutevaniacute CODIS STR lokusov umožňuje v priacutepade potreby vzaacutejomneacute porovnanie DNA profilov zistenyacutech na uacutezemiacute rocircznych štaacutetov CODIS STR lokusov je 13 a suacute to CSF1PO FGA TH01 TPOX VWA D3S1358 D5S818 D7S820 D8S1179 D13S317 D16S539 D18S51 a D21S11 Zistenie DNA profilu sa uskutočniacute multiplexnou PCR reakciou s fluorescenčne značenyacutemi primermi špecifickyacutemi pre konkreacutetny STR Naacutesledne suacute PCR produkty analyzovaneacute kapilaacuternou elektroforeacutezou genetickyacutem analyzaacutetorom ktoryacute rozliacuteši amplifikovaneacute fragmenty na zaacuteklade fluorescencie a dĺžky (fragmentačnaacute analyacuteza) (obr 26 Tab 3) DNA profil každeacuteho človeka je jedinečnyacute rovnakyacute profil mocircžu mať len jednovaječneacute dvojčataacute

28

Obr 26 Ukaacutežka DNA profilu človeka 15 STR lokusov s určeniacutem pohlavia pomocou lokusu pre amelogeniacuten (ženskeacute pohlavie - XX) maleacute oranžoveacute piacuteky predstavujuacute fragmenty veľkostneacuteho štandardu Tabuľka č 3 Zaacutepis DNA profilu človeka z obraacutezka č 26 15 STR lokusov s určeniacutem pohlavia pomocou lokusu pre amelogeniacuten System Alela 1 Alela 2

D3S1358 16 17

TH01 9 93 D21S11 28 28

D18S51 15 18

Penta E 7 14 D5S818 9 12

D13S317 8 11

D7S820 8 11 D16S539 11 12

CSF1PO 10 11

Penta D 11 12 vWA 15 18

D8S1179 13 16

TPOX 8 9 FGA 20 21

amel X X

29

5 MLPA

Multiplexnaacute amplifikaacutecia proacuteb zaacutevislaacute od ligaacutecie (z angl multiplex ligation-dependent probe amplification) je metoacuteda schopnaacute v jednej reakcii (v jednej skuacutemavke a vzorke) detegovať zmeny v počte až 50 nukleotidovyacutech sekvenciiacute Metoacutedou MLPA je možneacute ryacutechlo identifikovať amplifikaacutecie (duplikaacutecie) a deleacutecie veľkeacuteho počtu geacutenov či už použitiacutem DNA alebo mRNA krvnyacutech vzoriek alebo vzoriek z naacutedorov

Princiacutep MLPA spočiacuteva v multiplexnej amplifikaacutecii 50 špecifickyacutech nukleotidovyacutech sekvenciiacute použitiacutem jedneacuteho paacuteru primerov pričom jeden primer je fluorescenčne označenyacute Vyacutesledneacute PCR produkty suacute analyzovaneacute kapilaacuternou elektroforeacutezou (fragmentačnaacute analyacuteza) Dĺžka každeacuteho namnoženeacuteho produktu je jedinečnaacute narastaacute postupne o 6 alebo 9 nukleotidov pričom produkty PCR suacute 120 ndash 500 nukleotidov dlheacute Tento veľkostnyacute rozsah PCR fragmentov (dĺžka 120-500 nukleotidov s naacuterastom postupne o 6 alebo 9 nukleotidov) je optimaacutelny pre kapilaacuternu elektroforeacutezu MLPA multiplexnaacute PCR prebieha za použitia iba jedineacuteho paacuteru primerov ktoreacute amplifikujuacute špecifickeacute sekvencie Trik spočiacuteva v tom že nedochaacutedza k amplifikaacutecii DNA sekvencie ale MLPA proacuteb ktoreacute suacute pridaneacute k vzorkaacutem Každaacute MLPA proacuteba pozostaacuteva z dvoch oligonukleotidov (dve hemiproacuteby) pričom každyacute oligonukleotid obsahuje jednu zo sekvencie rozpoznaacutevanuacute PCR primermi Proacuteba vznikne jedine za predpokladu hybridizaacutecie dvoch oligonukleotidov (hemiproacuteb) k cieľovej sekvencii (geacutenu) a po ligaacutecii enzyacutemom ligaacutezou Iba ligovaneacute proacuteby suacute exponenciaacutelne amplifikovaneacute pomocou jedneacuteho paacuteru primerov Množstvo zligovanyacutech proacuteb teda zaacutevisiacute od množstva cieľovyacutech sekvenciiacute (geacutenov) vo vzorke

Postup MLPA analyacutezy je nasledovnyacute (obr27) K vzorke nukleovej kyseliny (DNA resp mRNA) sa pridaacute zmes 50 jedinečnyacutech proacuteb každaacute

proacuteba je komplementaacuterna k určitej cieľovej sekvencii NK vzorky Každaacute proacuteba však pozostaacuteva z dvoch oligonukleotidov hybridizujuacutecich vedľa seba zaacuteroveň každyacute oligonukleotid (hemiproacuteba) obsahuje pridanuacute sekvenciu rozpoznaacutevanuacute paacuterom PCR primerov Po hybridizaacuteciiacute oligonukleotidov (hemiproacuteb) dochaacutedza k ich ligaacutecii ligaacutezou Ligačnaacute reakcia je tak špecifickaacute že je schopnaacute rozliacutešiť sekvenciu liacutešiacu sa v jednom nukleotide Vyacuteslednyacute ligačnyacute produkt (proacuteba) obsahuje obidve sekvencie pre PCR primery na jednom fragmente čiže mocircže docircjsť k namnoženiu takeacutehoto fragmentu PCR reakciou V priacutepade ak nedocircjde k ligaacutecii priacuteslušnyacutech hemiproacuteb pretože hemiproacuteby nenaacutejdu cieľovuacute sekvenciu na DNA každaacute takaacuteto nezligovanaacute hemiproacuteba maacute len jednu sekvenciu rozpoznaacutevanuacute len jednyacutem PCR primerom v docircsledku čoho nemocircže prebehnuacuteť jej PCR amplifikaacutecia a počas fragmentačnej analyacutezy nie je detegovanaacute pretože negeneruje fluorescenčnyacute signaacutel

Pri MLPA analyacuteze je docircležiteacute okrem MLPA amplifikaacutecie vzorky urobiť aj MLPA amplifikaacuteciu referenčnej vzorky ku ktorej sa bude porovnaacutevať počet geacutenov (cieľovyacutech sekvenciiacute) Po kapilaacuternej elektroforeacuteze MLPA referenčnej a skuacutemanej vzorky porovnaniacutem obsahu nameranyacutech hodnocirct tzv piacutekov priacuteslušnyacutech proacuteb sa určiacute relatiacutevny počet koacutepiiacute v skuacutemanej vzorke

MLPA

1 DNA denaturaacutecia a hybridizaacutecia s MLPA proacutebami (hemiproacuteby)

2 Ligaacutecia (vytvorenie kompletnyacutech proacuteb)

3 PCR amplifikaacutecia proacuteb paacuterom primerov

4 Kapilaacuterna elektroforetickaacute separaacutecia PCR produktov

5 Analyacuteza daacutet

30

Obr 27 Princiacutep MLPA

Firma MRC-Holland v suacutečasnosti ponuacuteka stovky MLPA setov proacuteb ktoreacute suacute vhodneacute na 1) diagnostiku kongenitaacutelnych a dedičnyacutech ochoreniacute 2) zisťovanie profilu naacutedorov 3) zisťovanie metylačneacuteho profilu

MLPA je metoacuteda vhodnaacute na detekciu malyacutech prestavieb (BRCA1 BRCA2 MSH2 atď)

veľkyacutech chromozoacutemovyacutech prestavieb (Williamsov syndroacutem Prader-WilliAngelman syndroacutem atzď)

31

detekciu zmien v počte koacutepii geacutenov (obr 28 29) ako aj zistenie počtu kompletnyacutech chromozoacutemov (chromozoacutem 13 18 21 XY tiež aj z amniovej tekutiny) diagnostiku naacutedorov (zmeny počtu pri ALL CLL atď) kvantifikaacuteciu metylaacutecie (Prader-WilliAngelmanov syndroacutem Fragilnyacute X inaktivaacutecia naacutedorovyacutech supresorovyacutech geacutenov atď) mRNA analyacutezu geacutenov zuacutečastňujuacutecich sa apoptoacutezy alebo zaacutepalov

MS-MLPA (Methylation-Specific MLPA) je varianta MLPA určenaacute špeciaacutelne na analyacutezu aberantnyacutech metylaacutecii imprintovanyacutech oblastiacute ako aj detekciu metylačnyacutech zmien CpG ostrovčekov lokalizovanyacutech bliacutezko promoacutetora Rozdiel oproti štandardnej MLPA spočiacuteva v použitiacute metylačne senzitiacutevneho restrikčneacuteho enzyacutemu HhaI ktoryacute štiepi MS-MLPA proacuteby hybridizovaneacute k nemetylovanej sekvencii Každaacute DNA vzorka určenaacute pre MS-MLPA analyacutezu prejde dvoma reakciami v jednej mikroskuacutemavke štandardnou MLPA analyacutezou (bez štiepenia metylačne senzitiacutevnym enzyacutemom) a v druhej mikroskuacutemavke docircjde okrem ligaacutecie proacuteb aj k metylačne senzitiacutevnemu štiepeniu hybridizovanyacutech proacuteb s nemetylovanou DNA Amplifikujuacute sa len ligovaneacute proacuteby po PCR amplifikaacutecii sa fragmentačnou analyacutezou porovnaniacutem oboch reakciiacute zistia rozdiely v metylačnom profile vzorky k referenčnej vzorke

RT-MLPA (Reverse Transkriptase MLPA) je variaacutecia MLPA určenaacute pre zistenie mRNA profilu vzorky je alternatiacutevou k real-time PCR a mikročipom RT-MLPA nedeteguje mRNA množstvo priamo pretože použiacutevanaacute ligaacuteza nie je schopnaacute ligovať DNA oligonukleotidy keď suacute hybridizovaneacute s RNA Preto RT-MLPA začiacutena reverznou transkripciou so špeciaacutelne navrhnutyacutemi RT primermi tak aby vytvorili kraacutetke oligonukleotidy (cDNA) Potom reakcia pokračuje ako štandardnaacute MLPA

Obr 28 MLPA analyacuteza geacutenu DMD (koacutedujuacuteceho dystrofiacuten) mutaacutecie ktoreacuteho spocircsobujuacute Duchennovu svalovuacute dystrofiu u pacienta je priacutetomnaacute deleacutecia exoacutenu 45 v porovnaniacute s referenčnou vzorkou ndash kontrolou

32

Obr 29 MLPA analyacuteza geacutenu DMD (koacutedujuacuteceho dystrofiacuten) mutaacutecie ktoreacuteho spocircsobujuacute Duchennovu svalovuacute dystrofiu u pacienta suacute priacutetomneacute duplikaacutecie exoacutenov 41 42 43 44 45 (piacuteky vo vzorke pacienta sa porovnajuacute s piacutekmi v kontrole ndash referenčnej vzorke)

33

6 Sekvenovanie

Sekvenovaniacutem rozumieme určenie primaacuternej štruktuacutery DNA teda určenie poradia nukleotidov v reťazci DNA Začiatky moderneacuteho sekvenovania siahajuacute do roku 1977 kedy boli objaveneacute dve metoacutedy sekvenovania 1) chemickaacute metoacuteda Maxama a Gilberta 2) enzymatickaacute metoacuteda Sangera Nicklena a Coulsona

Princiacutep obidvoch metoacuted sekvenovania spočiacuteva v tom že sa vytvoriacute suacutebor DNA molekuacutel s rocircznou veľkosťou ktoreacute suacute zakončeneacute konkreacutetnym nukleotidom tieto DNA molekuly sa elektroforeticky separujuacute v geacuteloch s rozlišovacou schopnosťou 1 nukleotid 61 Chemickaacute metoacuteda

DNA molekuly sa na 5-konci raacutedioaktiacutevne označia raacutedioaktiacutevnym fosforom a naacutesledne sa chemicky modifikujuacute špecificky pre každuacute baacutezu DNA sa potom v modifikovanyacutech miestach štiepi čiacutem vzniknuacute rocirczne dlheacute fragmenty pričom podmienky suacute nastaveneacute tak aby sa DNA na každom mieste štiepila len raz Modifikaacutecia DNA a štiepenie prebehne v štyroch separaacutetnych reakciaacutech (skuacutemavkaacutech) takže po elektroforetickej separaacuteciiacute takto opracovanej DNA v štyroch draacutehach polyakrylamidoveacuteho geacutelu a naacuteslednej autoraacutediografii (podobne ako pri Southernovej hybridizaacutecii) je možneacute odčiacutetať nukleotidovuacute sekvenciu približne 100 nukleotidov od raacutedioaktiacutevneho označenia (v čase objavu Maxama a Gilberta) 62 Sangerova metoacuteda

Zaacuteklady metoacutedy boli popiacutesaneacute už v roku 1975 (metoacuteda plus a miacutenus) ale až vylepšenie použitiacutem dideoxynukleotidov (ddNTP) v roku 1977 došlo k zjednodušeniu sekvenovania Princiacutepom enzyacutemoveacuteho sekvenovania je terminaacutecia (zastavenie) polymerizaacutecie inkorporaacuteciou 2´ 3 -dideoxynukleotidov do novosyntetizujuacuteceho sa vlaacutekna DNA Keďže ddNTP neobsahujuacute hydroxylovuacute skupinu na 3 uhliacuteku riboacutezy nemocircžu sa zuacutečastniť na tvorbe fosfodiesterovej vaumlzby nemocircže sa pripojiť k nim ďalšiacute nukleotid čiže musiacute docircjsť k terminaacuteciiacute polymeraacutecie Reakcia prebieha v štyroch skuacutemavkaacutech s raacutedioaktiacutevne značenyacutem primerom V každej skuacutemavke suacute priacutetomneacute všetky štyri deoxynukleotidtrifosfaacutety (dNTP) ale pre každuacute skuacutemavku je špecifickyacute priacutedavok maleacuteho množstva jedneacuteho z dideoxynukleotidtrifosfaacutetov (v prvej skuacutemavke je ddATP v druhej ddCTP v tretej ddTTP a vo štvrtej ddGTP) Maleacute množstvo ddNTP spocircsobiacute že pri polymerizaacutecii dochaacutedza k prednostneacutemu zaradeniu štandardnyacutech dNTP do narastajuacuteceho reťazca a len občas sa inkorporuje ddNTP čiacutem sa zastaviacute synteacuteza reťazca V každej skuacutemavke tak vznikne suacutebor DNA fragmentov rocircznych veľkostiacute zakončenyacutech priacuteslušnyacutem ddNTP (v prvej skuacutemavke ddATP v druhej ddCTP v tretej ddTTP a vo štvrtej ddGTP) Po elektroforetickej separaacutecii v 4 draacutehach polyakrylamidoveacuteho geacutelu a autoraacutediografii sa z autoraacutediogramu odčiacuteta sekvencia

V suacutečasnosti je sekvenovanie do značnej miery automatizovaneacute pričom využiacuteva princiacutep Sangerovej enzyacutemovej metoacutedy s určityacutemi obmenami Uacutesek DNA ktoryacute treba sekvenovať sa prostredniacutectvom termostabilnyacutech DNA polymeraacutez namnožiacute PCR metoacutedou po ktorej nasleduje sekvenačnaacute reakcia (asymetrickaacute PCR) s fluorescenčne značenyacutemi ddNTP (každyacute druh označenyacute inyacutem fluorescenčnyacutem farbivom) Sekvenačnaacute reakcia prebieha v jednej skuacutemavke s jednyacutem primerom vznikne tak suacutebor jednovlaacuteknovyacutech DNA rocircznej dĺžky ktoreacute suacute na 3konci označeneacute ddNTP so špecifickyacutem fluorescenčnyacutem farbivom Taacuteto metoacuteda sekvenovania sa tiež nazyacuteva rdquodye-terminator cycle sequencingrdquo(obr 30) Po kapilaacuternej elektroforeacuteze vzorky v genetickom analyzaacutetore zaznamenaacutevaniacute fluorescencie jednotlivyacutech fragmentov CCD kamerou a softveacuterovom spracovaniacute sa ziacuteska sekvencia DNA (obr 31)

34

Obr 30 Princiacutep sekvenovania Sangerova dideoxy metoacuteda alebo tzv chain termination method (reťazec zastavujuacuteca metoacuteda) Obr 31 Určenie genotypu plodu a rodičov sekvenčnou analyacutezou DNA ziacuteskanej z plodovej vody (prenataacutelna diagnostika) a perifeacuternej krvi sekvenčnaacute analyacuteza geacutenu ASPA vyacutesledok u plodu priacutetomnaacute mutaacutecia c 914CgtA v homozygotnom stave (AA) rodičia heterozygoti (AC) Uvedenaacute mutaacutecia je v homozygotnom stave kauzaacutelnou priacutečinou Canavanovej choroby

Automatizovaneacute sekvenovanie prinaacuteša viacereacute vyacutehody oproti klasickej Sangerovej metoacutede vyššiu presnosť a ryacutechlosť v jednej sekvenačnej reakcii možnosť osekvenovať až 1200 nukleotidovyacute fragment maleacute množstvo templaacutetu potrebneacute na analyacutezu

35

63 Next Generation Sequencing (NGS)

NGS (sekvenovanie novej generaacutecie) maacute obrovskyacute potenciaacutel v analyacuteze genoacutemov pričom toto označenie zahŕňa viacereacute technologickeacute metoacutedy reprezentovaneacute niekoľkyacutemi firmami Princiacutepom je masiacutevne paralelneacute sekvenovanie čiacutem sa ziacuteskajuacute raacutedovo tisiacutece až milioacuteny sekvenciiacute naraz 631 Sekvenovanie druhej generaacutecie

Na začiatku sa analyzovanaacute DNA vo vaumlčšine priacutepadov fragmentuje (vznikne tak DNA

knižnica) na fragmenty sa pripoja kraacutetke sekvencie ndash adapteacutery naacutesledne sa tieto fragmenty rocircznymi priacutestupmi amplifikujuacute a určiacute sa ich sekvencia Vďaka čiastočnyacutem prekryvom je zo ziacuteskanyacutech sekvencii možneacute poskladať plynuluacute sekvenciu zodpovedajuacutecu pocircvodnej nefragmentovanej DNA

Pyrosekvenovanie je podobne ako Sangerova metoacuteda založenaacute na princiacutepe synteacutezy komplementaacuterneho vlaacutekna DNA avšak rozdiel je v tom že sa na detekciu inkorporaacutecie nukleotidu využiacuteva inyacute systeacutem tvorby luminiscenčneacuteho signaacutelu v priebehu reakcie Pyrosekvenovanie je umožneneacute vďaka aktivite 4 enzyacutemov - DNA polymeraacutezy ATP sulfurylaacutezy luciferaacutezy a apyraacutezy Reakčnaacute zmes obsahuje aj ďalšie komponenty - enzymatickeacute substraacutety adenoziacutenfosfosulfaacutet (APS) d-luciferiacuten sekvenovanyacute templaacutet a cyklicky postupne po jednom type pridaacutevaneacute nukleotidtrifosfaacutety Po zabudovaniacute nukleotidu do novovznikajuacuteceho reťazca docircjde k uvoľneniu pyrofosfaacutetu naacutesledne je využityacute ATP sulfurylaacutezou na synteacutezu ATP z APS počas ďalšej reakcie docircjde k využitiu ATP luciferaacutezou na premenu luciferiacutenu na oxyluciferiacuten čo spocircsobiacute svetelnyacute signaacutel a ten zaznamenaacute detekčnyacute systeacutem Poslednou enzymatickou reakciou je reakcia apyraacutezy ktoraacute odstraacuteni nezainkorporovaneacute nukleotidy a nevyužiteacute ATP aby sa celyacute proces mohol zopakovať s reakčnou zmesou obsahujuacutecou ďalšiacute nukleotidtrifosfaacutet (inyacute ako v predchaacutedzajuacutecej reakcii) Po každej reakcii detektor zaznamenaacuteva emisiu svetla na zaacuteklade intenzity svetla je možneacute určiť či bol vradenyacute priacuteslušnyacute nukleotidtrifosfaacutet či bol inkorporovanyacute jeden priacutepadne viac rovnakyacutech nukleotidtrifosfaacutetov

Zvyacutešenie vyacutekonu pyrosekvenovania umožnila tzv emulznaacute PCR v mikročasticiach a použitie platničky PicoTiterPlatereg toto sekvenovanie zaviedla firma Roche pod pojmom 454 pyrosekvenovanie v roku 2005 Na začiatku sa DNA fragmentuje na uacuteseky dlheacute 400-600 baacutez dvojvlaacuteknovaacute fragmentovanaacute DNA sa liguje s adapteacutermi prostredniacutectvom nich sa naviaže na mikročastice dvojvlaacuteknoveacute fragmenty sa oddelia mikročastice s naviazanyacutemi jednovlaacuteknovyacutemi fragmentami sa premiešajuacute so zmesou oleja a roztoku ktoryacute obsahuje všetky komponenty na uacutespešnuacute PCR Tyacutemto spocircsobom sa okolo každej mikročastice vytvoriacute vlastnyacute mikroreaktor v ktorom prebehne amplifikaacutecia fragmentu Po PCR reakcii sa mikročastice prenesuacute do platničky PicoTiterPlate v ktorej sa do jamky zmestiacute akuraacutet jedna mikročastica a reakčneacute komponenty pyrosekvenačnej reakcie PicoTiterPlatereg maacute 1 600 000 jamiek každaacute jamka maacute maximaacutelny objem 75 picolitra Platnička s mikročasticami sa vložiacute do sekvenačneacuteho systeacutemu ndash priacutestroja v ktorom sa celeacute pyrosekvenovanie uskutočniacute Chemiluminiscenčneacute signaacutely ktoryacutech počas sekvenovania vznikajuacute milioacuteny v priebehu hodiny suacute zachyteneacute CCD kamerou a analyzovaneacute softveacuterom

Firma Illumina predstavila inuacute technoloacutegiu PCR amplifikaacutecia a sekvenovanie sa uskutočňuje na skliacutečku (flow cell) Fragmentaacutecia DNA a pripojenie adapteacuterov prebieha za uacutečasti transpozoacutemov v procese nazvanom tagmentaacutecia Po hybridizaacutecii fragmentov DNA na skliacutečko prebehne v klastroch PCR amplifikaacutecia (tzv mostiacutekovaacute amplifikaacutecia) sekvenaacutecia prebieha za uacutečasti rozdielne fluorescenčne značenyacutech a chemicky modifikovanyacutech nukleotidov pričom každyacute nukleotid emituje fluorescenciu s inou vlnovou dĺžkou Na skliacutečku prebieha paralelne až 6 miliaacuterd sekvenaacutecii (obr 32)

Ďalšiacutemi možnosťami sekvenovania druhej generaacutecie je systeacutem SOLid (vyvinutyacute firmou Applied Biosystem dnes pod Thermo Fisher Scientific) a Ion Semiconductor Sequencing ndash polovodičoveacute ioacutenoveacute sekvenovanie (od firmy Ion Semiconductor Sequencing v suacutečasnosti Thermo Fisher Scientific)

36

Obr 32 Princiacutep sekvenovania novej generaacutecie od firmy Illumina PCR amplifikaacutecia a sekvenovanie sa uskutočňuje na skliacutečku (flow cell) paralelne prebieha až 6 miliaacuterd sekvenaacutecii

632 Sekvenovanie tretej generaacutecie

Pred sekvenovaniacutem netreba amplifikovať DNA PCR metoacutedou ale sekvencia sa ziacuteskava zachyteniacutem signaacutelu v reaacutelnom čase Medzi sekvenovanie tretej generaacutecie patriacute SMRT (Single Molecule Real-Time Sequencing) a Nanopore Sequencing

37

7 Fragmentačnaacute analyacuteza DNA

Je metoacuteda použiacutevanaacute na určenie veľkosti fragmentov DNA ziacuteskanyacutech PCR reakciou Dĺžka amplifikovanyacutech DNA fragmentov sa zistiacute ich porovnaniacutem s veľkostnyacutem štandardom (obr 33) ktoryacute je tvorenyacute DNA fragmentami znaacutemej dĺžky Veľkostnyacute štandard je pred kapilaacuternou elektroforeacutezou zmiešanyacute so vzorkou DNA fragmenty veľkostneacuteho štandardu suacute fluorescenčne označeneacute pričom použiteacute fluorescenčneacute farbivo je ineacute ako fluorescenčneacute farbivo použiteacute na označenie DNA fragmentov vo vyšetrovanej vzorke

Obr 33 Elektroforetogram veľkostneacuteho štandardu použiacutevaneacuteho na určenie veľkostiacute fragmentov analyzovanyacutech kapilaacuternou elektroforeacutezou v genetickom analyzaacutetore (GeneScantrade 500 LIZtrade dye Size Standard) dĺžka fragmentov v nukleotidoch (napr 50 nukleotidov)

Fragmentačnaacute analyacuteza pozostaacuteva z viaceryacutech krokov Prvyacutem je izolaacutecia DNA nasleduje PCR amplifikaacutecia počas ktorej sa novosyntetizovaneacute DNA fragmenty označia fluorescenčnyacutemi farbivami Vzorka s PCR produktom sa pripraviacute na kapilaacuternu elektroforeacutezu tak že sa zmieša s veľkostnyacutem štandardom (sluacuteži na určenie veľkosti fragmentov) a denaturačnou laacutetkou (formamid) nasleduje denaturaacutecia Pripraveneacute vzorky suacute injektovaneacute do priacutestroja (genetickyacute analyzaacutetor) kde v kapilaacutere naplnenej polymeacuterom v elektrickom poli migrujuacute fluorescenčne značeneacute fragmenty DNA na zaacuteklade veľkosti (kapilaacuterna elektroforeacuteza) Počas elektroforeacutezy genetickyacute analyzaacutetor zaznamenaacuteva fluorescenciu fragmentov Analyacutezou daacutet prostredniacutectvom špeciaacutelnych softveacuterov sa ziacuteskajuacute elektroforetogramy z ktoryacutech je možneacute zistiť veľkosť fragmentov ako aj typ fluorescencie (docircležiteacute ak suacute genetickeacute varianty rozliacutešiteľneacute rocircznou fluorescenciou napr SNaPshot) Fragmentačnaacute analyacuteza je suacutečasťou množstva molekulaacuterno-genetickyacutech metoacuted (pozri obr 12 26 28 29 34) ako suacute napr STR analyacuteza (Short Tandem Repeat) AFLP analyacuteza (Amplified Fragment Lenght Polymorfism) RFLPT-RFLP analyacuteza (Restriction Fragment Lenght PolymorfismTerminal Restricted Fragment Lenght Polymorfism) SSCP (Single Strand Conformation Polymorfism) VNTR (Variable Number of Tandem Repeat) analyacuteza straty heterozygotnosti (LOH loss of heterozygozity) MLPA (Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification) MSMSA (Methylation-Sensitive Mobility Shift Assay) SNP genotypovanie (SNaPshotreg) HiCEP (High-Coverage Expression Profiling)

38

Obr 34 Kvantitatiacutevna fragmentačnaacute PCR analyacuteza (QF-PCR) DNA izolovanej z plodovej vody vyacutesledok prenataacutelnej analyacutezy = priacutetomnosť troch piacutekov pre chromozoacutem 18 (u všetkyacutech fragmentov detegujuacutecich chromozoacutem 18 je pomer vyšetrovanyacutech markerov aberantnyacute 21 resp 111) čo znamenaacute trizoacutemiu chromozoacutemu 18 Edwardsov syndroacutem

39

8 Metoacutedy založeneacute na princiacutepe hybridizaacutecie

Nukleoveacute kyseliny majuacute schopnosť vytvaacuterať dvojvlaacuteknoveacute reťazce z jednovlaacuteknovyacutech molekuacutel na zaacuteklade komplementarity baacutez Komplementarita baacutez umožňuje replikaacuteciu DNA transkripciu RNA komplementarita baacutez zabezpečuje teda reprodukovateľnosť živej hmoty

Hybridizaacutecia je proces v ktorom na zaacuteklade komplementarity baacutez dochaacutedza k vytvoreniu dvojvlaacuteknovej nukleovej kyseliny z dvoch jednovlaacuteknovyacutech molekuacutel DNA alebo RNA alebo ich kombinaacuteciou DNA RNA pričom kratšia jednovlaacuteknovaacute nukleovaacute kyselina vystupuje ako sonda (proacuteba) Hybridizaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten je jeden z najpoužiacutevanejšiacutech naacutestrojov v molekulaacuternej bioloacutegii a genetike (hybridizaacutecia primerov alebo proacuteb sa využiacuteva v takmer každej metoacutede - v PCR RT-PCR qPCR RT-qPCR MLPA sekvenovaniacute fragmentačnej analyacuteze FISH DNA mikročipoch atď)

Denaturaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten je proces pri ktorom dochaacutedza k porušeniu vodiacutekovyacutech vaumlzieb medzi vlaacuteknami nukleovyacutech kyseliacuten (strata sekundaacuternej a terciaacutelnej štruktuacutery) tak že docircjde k ich uacuteplneacutemu oddeleniu vzniknuacute jednovlaacuteknoveacute reťazce Denaturaacutecia NK mocircže byť spocircsobenaacute vplyvom vysokyacutech teplocirct pH alebo chemickyacutech laacutetok (denaturačneacute činidlaacute) Renaturaacutecia je opačnyacute proces v ktorom na zaacuteklade komplementarity dochaacutedza k tvorbe dvojvlaacuteknovyacutech NK

Hybridiza čnaacute sonda (proacuteba) je jednovlaacuteknovaacute nukleovaacute kyselina určitej znaacutemej dĺžky a sekvencie (najčastejšie DNA pretože je stabilnejšia ako RNA) ktoraacute je značenaacute a sluacuteži na detekciu komplementaacuternych molekuacutel DNA alebo RNA v procese hybridizaacutecie V zaacutevislosti od podmienok hybridizaacutecie (stringencia) mocircže byť detegovanaacute sekvencia uacuteplne komplementaacuterna alebo v menej priacutesnych podmienkach mocircže mať sekvenčneacute odchyacutelky Proacuteba sluacuteži na vyhľadanie a zviditeľnenie cieľovyacutech NK Zviditeľnenie sa deje prostredniacutectvom označenia proacuteby ešte pred hybridizaacuteciou Značenie proacuteby mocircže byť raacutedioaktiacutevne a neraacutedioaktiacutevne (najčastejšie fluorescenčneacute)

Raacutedioaktiacutevne značeneacute proacuteby pomocou izotopov (32P) sa využiacutevali viac v minulosti v suacutečasnosti suacute kvocircli zdravotnyacutem rizikaacutem ohľaduplnosti k životneacutemu prostrediu ako aj kvocircli jednoduchšej manipulaacutecii použiacutevaneacute fluorescenčne značeneacute proacuteby Raacutedioaktiacutevne značeneacute sondy boli použiacutevaneacute hlavne metoacutedou Southernovej hybridizaacutecie (Southern blotting Southern blot) Citlivosť raacutedioaktiacutevne značenyacutech proacuteb je vyššia dosahuje schopnosť zachytiť 10 fg (femtogram 10-15) cieľovej DNA sekvencie 81 Southern blot

Metoacutedu objavil v roku 1975 britskyacute bioloacuteg Edwin Southern (preto Southern) Pri Southernovej hybridizaacutecii sa restrikčne štiepeneacute fragmenty DNA elektroforeticky separujuacute v geacuteli potom sa metoacutedou blottingu prenesuacute na nylonovuacute alebo nitroceluloacutezovuacute membraacutenu kde suacute naacutesledne hybridizovaneacute v roztoku obsahujuacutecom raacutedioaktiacutevne značenuacute sondu Priloženiacutem fotografickeacuteho filmu k membraacutene a vyvolaniacutem filmu autoraacutediografiou docircjde k zviditeľneniu lokaliacutet kde došlo k hybridizaacuteciiacute raacutedioaktiacutevne značenej sondy s fragmentom DNA (autoraacutediogram) Southern blot bol kľuacutečovou a prvou metoacutedou na identifikaacuteciu osocircb (DNA fingerprinting DNA pofiling) (obr 35)

Okrem Southern blotu existuje Northern blot na analyacutezu RNA (geacutenovej expresie) a Western blot na analyacutezu proteiacutenov postup je obdobnyacute ako pri Southern blote s obmenami špecifickyacutemi pre konkreacutetny blot Pri Northern blote sa použiacutevajuacute hybridizačneacute proacuteby ale pre vizualizaacuteciu proteiacutenov western blotom je potrebneacute použiť protilaacutetky s naacuteslednou vizualizaacuteciou Pomenovanie techniacutek je hra so sloviacutečkami (keďže paacuten Northern ani Western neobjavili takto nazvaneacute techniky)

Neraacutedioaktiacutevne značenie proacuteb použiacutevanyacutech v molekulaacuternej genetike mocircže byť nepriame (použitie haptenu) alebo priame Konečnaacute vizualizaacutecia je najčastejšie zabezpečenaacute fluoreskujuacutecimi farebnyacutemi značkami farbivami fluorochroacutemami (fluorofoacuterami) Pri priamom značeniacute je farbička kovalentne naviazanaacute na nukleotid a na zachytenie fluorescencie suacute potrebneacute špeciaacutelne priacutestroje umožňujuacutece excitaacuteciu farbičky ktoraacute potom emituje žiarenie určitej vlnovej dĺžky (emisneacute žiarenie) a to zachytiacute detekčnyacute systeacutem priacutestroja Využitie fluorochroacutemov v molekulaacuternej genetike je masiacutevne napr na vizualizaacuteciu NK elektroforeticky separovanyacutech v geacuteli kvantifikaacuteciu produktov PCR reakcie v priacutestroji real-time PCR cykleacuter sekvenovaniacute fragmentačnej analyacuteze FISH DNA mikročipoch atď

40

Obr 35 Princiacutep Southern blotu

82 FISH (fluorescenčnaacute in situ hybridizaacutecia)

FISH (fluorescent in situ hybridization fluorescenčnaacute in situ hybridizaacutecia) metoacuteda patriacute medzi molekulovo-cytogenetickeacute techniky Princiacutep FISH metoacutedy je založenyacute na hybridizaacuteciiacute fluorescenčne značenyacutech proacuteb ku komplementaacuternym uacutesekom vyšetrovanej DNA na podložnom skle (priamo na mieste - in situ) K denaturaacutecii dsDNA dochaacutedza buď vplyvom denaturačnyacutech činidiel alebo zvyacutešenou teplotou a naacuteslednou renaturaacuteciou dochaacutedza k naviazaniu sondy na komplementaacuterny uacutesek DNA Vyacutesledok hybridizaacutecie sa vizualizuje fluorescenčnyacutem mikroskopom vybavenyacutem vhodnyacutemi fluorescenčnyacutemi filtrami a vizuaacutelne zhodnotiacute skuacutesenyacutem odborniacutekom Fluorescencia sa v niektoryacutech priacutepadoch mocircže zaznamenať a hodnotiť aj pomocou softveacuteru (obr 36)

Pomocou FISH detegujeme numerickeacute aberaacutecie - zmeny v počte chromozoacutemov (napr trizoacutemia monozoacutemia chromozoacutemov) alebo štruktuacuterne aberaacutecie a prestavby (napr translokaacutecie inverzie deleacutecie duplikaacutecie amplifikaacutecie) FISH metoacuteda umožňuje identifikaacuteciu a detekciu každeacuteho ľudskeacuteho chromozoacutemu jeho zaradenie do karyotypu odhalenie malyacutech submikroskopickyacutech chromozoacutemovyacutech zmien a tiež mapovať poziacutecie jednotlivyacutech geacutenov na chromozoacuteme

41

Obr 36 Princiacutep štandardnej FISH a FISH maľovania celeacuteho chromozoacutemu

Veľkou vyacutehodou FISH metoacutedy je možnosť analyacutezy buniek v metafaacuteze aj v interfaacuteze kedy nie je nutnaacute kultivaacutecia buniek a tiež ryacutechle analyzovanie veľkeacuteho počtu buniek (stovky až tisiacutece) K ďalšiacutem vyacutehodaacutem patriacute bezpečnosť vysokaacute citlivosť dostatočnaacute stabilita relatiacutevne kraacutetky čas hybridizaacutecie a možnosť ryacutechleho vyhodnotenia Hybridizaacutecia pri vaumlčšine suacutečasne dodaacutevanyacutech sond trvaacute 10-12 hodin (na trhu suacute už dostupneacute aj sondy so skraacutetenyacutem časom hybridizaacutecie na 2-3 hodiny) Po hybridizaacuteciiacute nasleduje odmyacutevanie kedy pri priacuteslušnej teplote dochaacutedza k odmytiu nenaviazanyacutech a nespraacutevne hybridizovanyacutech sond Preparaacutet sa naacutesledne podfarbiacute a vyacutesledok sa zhodnotiacute vo fluorescenčnom mikroskope Na podfarbenie chromozoacutemov alebo jadier sa použiacuteva modreacute kontrastneacute farbivo DAPI (46-diamidino-2-fenylindol) ktoreacute maacute silneacute fluorescenčneacute vlastnosti dokaacuteže prechaacutedzať jadrovou membraacutenou a viazať sa na DNA Vyacutesledkom je modreacute zafarbenie ktoreacute vyacuteborne kontrastuje so signaacutelmi jednotlivyacutech sond

Limitujuacutecim faktorom FISH je možnosť identifikaacutecie len tyacutech uacutesekov DNA ku ktoryacutem suacute použiteacute sondy V jednej analyacuteze je možneacute použiť najviac 3 odlišne značeneacute sondy a tak zistiť priacutepadneacute abnormality len na 1 alebo na paacuter lokusoch Na relevantnuacute detekciu je potrebneacute mať vo vzorke 1-5 aberantnyacutech interfaacutezovyacutech jadier

FISH je možneacute uskutočniť na širokej škaacutele biologickeacuteho materiaacutelu na vzorkaacutech perifeacuternej krvi kostnej drene naacuteteroch choriovyacutech klkoch plodovej vode rocircznych druhov tkaniacutev natiacutevnych alebo zaliatych v parafiacutene na 1 bunke (predimplantačnaacute genetickaacute diagnostika PGD) (obr 37)

Využiacuteva sa na detekciu aberaacuteciiacute pri mnohyacutech onkologickyacutech ochoreniach (napr pri diagnoacuteze mnohopočetnyacute myeloacutem sa v suacutečasnosti po separaacutecii CD138+ buniek robiacute FISH s 5 sondami pre geacuteny IGH TP53 RB1 oblasť 1p321q21 a stanovuje sa hyperploidia chromozoacutemov 5 9 a 15) a tiež k spresneniu doplneniu a k overeniu bežneacuteho cytogenetickeacuteho vyšetrenia

Podľa miesta na chromozoacuteme na ktorom dochaacutedza k hybridizaacutecii sondy rozlišujeme 4 typy

DNA sond bull centromeacuteroveacute sondy ndash sa viažu na strednuacute časť chromozoacutemu ndash centromeacuteru sluacutežia k diagnostike zmien v počte chromozoacutemov k detekcii chromozoacutemov neznaacutemeho pocircvodu umožňujuacute interfaacuteznu FISH na nedeliacich sa bunkaacutech (obr 38-41)

42

Obr 37 Interfaacutezna FISH preimplantačnyacute genetickyacute skriacutening aneuploidiiacute ndash blastomeacutera 3-denneacuteho ľudskeacuteho embrya s normaacutelnym počtom chromozoacutemov 13 18 21 pohlavie XY použityacutech 5 sond pre chromozoacutemy 13 ndash orange 18 ndash aqua 21 ndash green X ndash blue a Y ndash yellow (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

Obr 38 Interfaacutezne jadro po hybridizaacutecii s centromeacuterovou sondou pre chromozoacutem 8 (Vysis Abbott) V pravom jadre je priacutetomnaacute trizoacutemia chromozoacutemu 8 (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex) Obr 39 Metafaacutezna (A) a interfaacutezna FISH (B) použitaacute centromeacuterovaacute sonda CEPX spectrum orangeCEPY spectrum green (Vysis Abbott) Sonda hybridizuje k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (červenyacute signaacutel) a Y (zelenyacute signaacutel) (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

43

Obr 40 Interfaacutezna FISH vyšetrenie spermiiacute použiteacute sondy CEPX greenCEPY orange (Aneuscore Metasystems) Sondy hybridizujuacute k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (zelenyacute signaacutel) Y (červenyacute signaacutel) vľavo ndash dve haploidneacute spermie (majuacutece jedna spermia X druhaacute Y chromozoacutem) vpravo ndash dve patologickeacute spermie obsahujuacutece gonozoacutemovyacute komplement XY (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

Obr 41 Interfaacutezna FISH vyšetrenie spermiiacute použiteacute sondy CEPX greenCEPY orange a CEP18 aqua (Aneuscore Metasystems) Sondy hybridizujuacute k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (zelenyacute signaacutel) Y (červenyacute signaacutel) a 18 (modryacute signaacutel) vľavo ndash normaacutelne haploidneacute ľudskeacute spermie - 1x chromozoacutem X alebo Y a jedenkraacutet chromozoacutem 18 v strede ndash patologickaacute spermia obsahujuacuteca gonozoacutemovyacute komplement XY a jeden chromozoacutem 18 vpravo ndash patologickaacute diploidnaacute spermia s chromozoacutemami X Y a dvoma chromozoacutemami 18 (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

bull lokusovo špecifickeacute sondy ndash hybridizaacutecia prebehne na konkreacutetnom mieste geacutenu (lokuse) (obr 42-44) použiacutevajuacute sa k vyšetreniu mikrodeleacuteciiacute (straty malyacutech častiacute chromozoacutemu pri mikrodelečnyacutech syndroacutemoch) k zisteniu amplifikaacutecie onkogeacutenov a niektoryacutech špecifickyacutech translokaacuteciiacute prestavby geacutenov umožňujuacute interfaacuteznu FISH na nedeliacich sa bunkaacutech bull subtelomeroveacute ndash vaumlzba na koncoveacute časti chromozoacutemu ndash telomeacutery bull celochromozoacutemoveacute alebo celomaľovacie sondy ndash sondy hybridizujuacute s mnohopočetnyacutemi chromozoacutemovyacutemi sekvenciami pričom sa fluorescenčne tak bdquovymaľujeldquo celyacute chromozoacutem (Obr 45) Použiacutevajuacute sa na vyšetrenie chromozoacutemovyacutech prestavieb k analyacuteze translokaacuteciiacute a k detekcii pocircvodu tzv marker chromozoacutemov (malyacutech nadpočetnyacutech chromozoacutemov neznaacutemeho pocircvodu) K použitiu sondy suacute potrebneacute metafaacutezne chromozoacutemy nepoužiacutevaju sa pre interfaacuteznu FISH

Pri konvenčnej chromozoacutemovej FISH suacute homogeacutenne DNA proacuteby hybridizovaneacute s fixovanyacutem metafaacuteznym alebo prometafaacuteznym chromozoacutemomchromozoacutemami na skliacutečku (Obr 36a) Maximaacutelna rozlišovacia schopnosť metafaacuteznej FISH je niekoľko megabaacutez (Obr 39a 45) využitiacutem viac

44

natiahnutyacutech prometafaacuteznych chromozoacutemov sa dosiahne 1 Mb rozliacutešenie Prostredniacutectvom fiber FISH konkreacutetne artificiaacutelne deproteinizovanej natiahnutej DNA pripravenej in situ z celyacutech buniek na mikroskopickom skliacutečku je možneacute vizualizovať individuaacutelne geacuteny maleacute DNA elementy na chromozoacuteme s rozliacutešeniacutem okolo 1000 bp

Obr 42 Interfaacutezne jadro po hybridizaacutecii s lokusovo-špecifickou sondou LSI 5q31 Spectrum Orange5p12 Spectrum Green (Vysis Abbott) Na ľavom obraacutezku suacute priacutetomneacute dva červeneacute (5q31) a dva zeleneacute signaacutely (5p12) v pravom jadre je priacutetomnaacute deleacutecia 5q31 oblasti chyacuteba jeden červenyacute signal (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

Obr 43 Interfaacutezna FISH použitaacute lokusovo-špecifickaacute sonda ndash translokačnaacute - XL BCRABL1 plus (Metasystems) dvojfarebnaacute dvojfuacutezna kde červenaacute označuje lokus ABL1 na chromozoacuteme 9 a zelenaacute oblasť BCR na chromozoacuteme 22 Sonda deteguje fuacuteziu protoonkogeacutenu ABL1 (9q34) a geacutenu BCR (22q11) v priacutepade že červenyacute a zelenyacute signaacutel suacute pri sebe (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

45

Obr 44 Interfaacutezna FISH Použitaacute lokusovo-špecifickaacute sonda- typ break apart pre IGH geacuten V docircsledku translokaacutecie došlo k rozskočeniu geacutenu pričom translokačneacuteho partnera nepoznaacuteme vieme určiť len percento v koľkyacutech jadraacutech je geacuten prestavanyacute (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex) Obr 45 Použiteacute celochromozoacutemoveacute sondy WCP 15 (červenyacute chromozoacutem) a WCP 17 (zelenyacute chromozoacutem) Na metafaacuteze je potvrdenaacute reciprokaacute translokaacutecia t(1517)(q2221) (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

FISH vizualizaacutecia celeacuteho chromozoacutemu maľovanie chromozoacutemu anglicky chromosome

painting je špeciaacutelnou aplikaacuteciou chromozoacutemovej FISH proacuteba je koktail veľkeacuteho počtu rocircznych fluorescenčne značenyacutech DNA fragmentov hybridizujuacutecich pozdĺž celeacuteho konkreacutetneho chromozoacutemu (obr 36b 45) bdquoChromosomepaintingldquo analyzuje metafaacutezne chromozoacutemy V minulosti bola FISH vizualizaacutecia celyacutech chromozoacutemov limitovanaacute malyacutem množstvom rocirczne sfarbenyacutech fluorochroacutemov

V suacutečasnosti je možneacute detegovať množstvo cieľovyacutech sekvenciiacute naraz čo sa využiacuteva pri celogenoacutemovej chromozoacutemovej vizualizaacutecii (whole-chromosomepainting - WCP) metoacutedou multiplex FISH (M-FISH multicolor FISH o br 46) alebo spektraacutelnej karyotypizaacutecie (SKY) kedy možno rozliacutešiť všetky ľudskeacute chromozoacutemy ndash teda 24 rocircznych chromozoacutemov M-FISH a SKY patria medzi metafaacutezne formy FISH diagnostiky ktoreacute umožňujuacute simultaacutennu vizualizaacuteciu všetkyacutech ľudskyacutech chromozoacutemov v rocircznych farbaacutech čo predstavuje uľahčenie analyacutezy karyotypu hlavne pri komplexnyacutech zmenaacutech a markeroch neznaacutemeho pocircvodu Obe techniky vychaacutedzajuacute z použitia

46

celochromozoacutemovyacutech sond značenyacutech kombinaacuteciou viaceryacutech fluorochroacutemov Rozdiel medzi M-FISH a SKY spočiacuteva v technike ziacuteskania konečneacuteho obrazu

Obr 46 Multicolor FISH - každyacute chromozoacutemovyacute paacuter je zafarbenyacute inou farbou pričom na ich zafarbenie postačuje kombinaacutecia 5 fluorochroacutemov Na vyhodnocovanie je potrebnaacute špeciaacutelna sada fluorescenčnyacutech filtrov pre jednotliveacute fluorochroacutemy a špeciaacutelnyacute softweacuter Vľavo-štandardnyacute karyotyp vpravo karyotyp s mutaacuteciami (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

V molekulovej cytogenetike suacute komerčne dostupneacute sety M-FISH proacuteb umožňujuacutece

viacfarebneacute pruacutežkovanie chromozoacutemov (banding) s vysokyacutem rozliacutešeniacutem (multicolor-banding mBAND FISH MCB) čo umožňuje identifikaacuteciu intrachromozoacutemovyacutech prestavieb (Obr 47) Nevyhnutnosťou mBAND-u je mať chromozoacutemy v metafaacuteze Taacuteto metoacuteda bola prvyacutekraacutet uskutočnenaacute na chromozoacuteme 5 v roku 1999 mBAND FISH umožňuje rozliacutešiť špecifickeacute oblasti chromozoacutemov na uacuterovni pruacutežku - bandu a sub-bandu s detekciou 550 bandov haploidneacuteho karyotypu

Obr 47 A - mBAND chromozoacutemu 11 - inverzia duplikovanej oblasti 11q223-q25 B - mBAND chromozoacutemu 3 - na kruhovom chromozoacuteme deleacutecia oblasti 3p263 C - mBAND chromozoacutemu 2 - potvrdenie inverzie duplikovanej časti chromozoacutemu (poskytnuteacute RNDr Dagmar Landlovou Medirex)

FISH metoacuteda a jej varianty (M-FISH mBAND SKY) majuacute v suacutečasnosti širokeacute využitie v

klinickej genetike v onkologickej genetike na detekciu aberaacuteciiacute v čase diagnoacutezy počas liečby po

47

liečbe monitorovanie po transplantaacutecii kostnej drene v prenataacutelnej a postnataacutelnej diagnostike pri detekcii submikroskopickyacutech deleacuteciiacute (napr DiGeorge syndroacutem - 22q112 delečnyacute syndroacutem PraderndashWilli syndroacutem- chromozoacutem 15q11-13) prostredniacutectvom FISH je možnaacute detekcia numerickyacutech zmien chromozoacutemov (trizoacutemia chromozoacutemu 21 pri Downovom syndroacuteme trizoacutemia chromozoacutemu 15 pri Patauovom syndroacuteme trizoacutemia chromozoacutemu 18 pri Edwardsovom syndroacuteme) rocirczne zmeny v počte pohlavnyacutech chromozoacutemov (monozoacutemia X pri Turnerovom syndroacuteme Klinefelterov syndroacutem s X chromozoacutemom naviac - XXY) podobne v predimplantačnej diagnostike

83 DNA Microarray (DNA mikro čip biočip) DNA mikročipovanie je technika využiacutevajuacuteca hybridizaacuteciu skuacutemanej nukleovej kyseliny

(cieľovaacute vzorka) s veľkyacutem množstvom oligonukleotidovyacutech proacuteb (desať tisiacutec až milioacuten) ktoreacute suacute prichyteneacute na pevnyacute podklad najčastejšie sklenyacute silikoacutenovyacute alebo nylonovyacute (doštička čip) Skuacutemanaacute nukleovaacute kyselina je pred hybridizaacuteciou fragmentovanaacute označenaacute fluorofoacuterom a denaturovanaacute Po kontakte čipu s cieľovou vzorkou ktoraacute je vlastne zmes označenyacutech oligonukleotidov značeneacute oligonukleotidy hybridizujuacute s oligonukleotidovyacutemi sekvenciami prichytenyacutemi na čipe Potom suacute na zaacuteklade fluorescencie detekovaneacute miesta kde došlo k hybridizaacutecii čiže vzorka obsahovala takuacuteto nukleotidovuacute sekvenciu Z jedneacuteho mikročipu sa ziacuteska obrovskeacute množstvo daacutet ktoreacute je vždy nutneacute softveacuterovo spracovať V dnešnej dobe existuje niekoľko firiem poskytujuacutecich komerčne mikročipy na objednaacutevku alebo si ich laboratoacuteria produkujuacute sami

Mikročipovanie prebieha nasledovne

1) Vytvorenie DNA čipu ndash tisiacutece rocircznych jednovlaacuteknovyacutech DNA oligonukleotidov znaacutemych sekvencii sa kovalentne naviažu na povrch doštičky vždy v určitej lokalite je niekoľko rovnakyacutech oligonukleotidov veľkosť takejto lokality je ˂ 200 microm Proacutebami mocircže byť DNA cDNA alebo syntetizovaneacute oligonukleotidy Už hotoveacute mikročipy ponuacutekajuacute viacereacute firmy (Affymetrix Agilent Technologies Eppendorf Illumina) alebo si ich jednotliveacute laboratoacuteria vyraacutebajuacute sami pomocou robotickyacutech zariadeniacute DNA čip sa vytvaacutera buď nanaacutešaniacutem kvapiek oligonukleotidov na podklad alebo synteacutezou oligonukleotidov in situ na čipe 2) Priacuteprava vzorky ndash nukleovaacute kyselina (mRNA DNA) sa purifikuje určiacute sa jej kvantita a kvalita (spektrofotometericky) fragmentuje resp v priacutepade mRNA sa syntetizuje cDNA v priacutepade potreby sa mocircže DNA amplifikovať PCR reakciou štiepiť restrikčnyacutemi endonukleaacutezami 3) Fluorescenčneacute označenie (zriedkavejšie raacutedioaktiacutevne) fragmentov DNA prebieha počas reverznej transkripcie alebo PCR amplifikaacutecie za uacutečasti fluorescenčne značenyacutech nukleotidov Keď sa analyzujuacute dve rocirczne vzorky napr zdraveacute tkanivo a naacutedoroveacute tkanivo označenie nukleovyacutech kyseliacuten v tyacutechto tkanivaacutech byacuteva rozdielne a to použitiacutem dvoch rocircznych fluorescenčnyacutech farbiacutev (napr zeleneacute a červeneacute) Pred hybridizaacuteciou je potrebneacute vzorku denaturovať čiacutem sa vytvoriacute zmes jednovlaacuteknovyacutech DNA označenyacutech značkou 4) Hybridizaacutecia s mikročipom ndash v špeciaacutelnom hybridizačnom roztoku hybridizujuacute komplementaacuterne sekvencie zo vzorky s priacuteslušnyacutemi oligonukleotidovyacutemi sondami naviazanyacutemi na čipe Potom sa čip obmyje aby došlo k odstraacuteneniu čiastočne hybridizovanyacutech nukleovyacutech kyseliacuten 5) Skenovanie mikročipu ndash skenerom čipov docircjde k ožiareniu čipu laserom pričom v mieste hybridizaacutecie fluorescenčne značenyacutech DNA fragmentov s proacutebou docircjde k emisii svetla určitej vlnovej dĺžky ktoruacute skener zaznamenaacute 6) Analyacuteza daacutet prebieha metoacutedami bioinformatiky spracovaniacutem softveacutermi sa zistiacute ktoreacute lokality čipu navzaacutejom hybridizovali v priacutepade použitia dvoch vzoriek kontrolnej a skuacutemanej je možneacute analyzovať ich relatiacutevnu intenzitu hybridizaacutecie (expresie určiteacuteho geacutenu)

Existujuacute štyri typy mikročipov 1) Čipy ur čeneacute na analyacutezu expresie (obsahujuacute cDNA proacuteby) pre tzv dvojkanaacutelovyacute experiment kedy je vzorka určenaacute k hybridizaacutecii na čipe ziacuteskanaacute zmiešaniacutem DNA fragmentov kontrolnej a skuacutemanej vzorky pričom fragmenty suacute rozdielne fluorescenčne označeneacute (napr zelenyacute fluorofoacuter pre kontrolnuacute vzorku a červenyacute pre skuacutemanuacute) Na zaacuteklade intenzity a typu fluorescencie sa deteguje expresia geacutenov typickaacute pre kontrolnuacute vzorku (napr zelenaacute fluorescencia) pre skuacutemanuacute vzorku (napr

48

červenaacute fluorescencia) a expresia podobnaacute u oboch vzoriek (žltaacute fluorescencia) neexprimovaneacute geacuteny (čierna fluorescencia) rocirczne odtiene (v zaacutevislosti od prevažujuacutecej hybridizaacutecie) (obr 48) 2) Čipy ur čeneacute na analyacutezu mutaacutecii použije sa genoacutemovaacute DNA označenaacute jednou fluorescenčnou farbičkou na určenie jednonukleotidovej zmeny (SNP ndash Single Nukleotide Polymorphism) 3) Čipy na komparatiacutevnu genoacutemovuacute hybridizaacuteciu (aCGH array Comparative Genomic Hybridization) ndash použiacutevaneacute na zistenie zvyacutešenia alebo zniacuteženia množstva chromozoacutemovyacutech fragmentov obsahujuacutecich geacuteny zodpovedneacute za určiteacute ochorenie Na analyacutezu sa použije skuacutemanaacute gDNA a referenčnaacute (kontrolnaacute) DNA každaacute sa značiacute inou fluorescenčnou farbičkou (princiacutep ako pri analyacuteze expresie) (obr 49 50) 4) Čipy CGH - SNP kombinovaneacute čipy ur čeneacute na analyacutezu aj mutaacuteciiacute SNP aj na komparatiacutevnu genoacutemovuacute hybridizaacuteciu CGH

Mikročipy majuacute rozsiahle využitie napriacuteklad v identifikaacuteciiacute novyacutech geacutenov vo vyacuteskume ich funkciiacute expresie v rocircznych podmienkach pri diagnostike mnohyacutech ochoreniacute vo farmakogenomike vo vyacuteskume vplyvu toxiacutenov

Obr 48 Heatmapa geacutenovej expresie vybranyacutech geacutenov (mRNA) mikročip obsahuje 46000 cDNA proacuteb (poskytnuteacute Ing Helenou Gbelcovou PhD Uacutestav lekaacuterskej bioloacutegie genetiky a klinickej genetiky LF UK a UNB)

49

Obr 49 Princiacutep komparatiacutevnej genoacutemovej hybridizaacutecie (aCGH - array comparative genomic hybridization) Obr 50 A) Vyacutesledok komparatiacutevnej genoacutemovej hybridizaacutecie (aCGH - array comparative genomic hybridization) vzorky DNA izolovanej plodovej vody U plodu s abnormaacutelnym ultrasonografickyacutem vyšetreniacutem bola identifikovanaacute duplikaacutecia oblasti 3q261q29 (modryacute paacutes) a deleacutecia oblasti 5p1533p151 (červenyacute paacutes) Pre porovnanie chromozoacutem 1 bez aberaacutecie b) Ten istyacute pacient ale ineacute softveacuteroveacute spracovanie (poskytnuteacute RNDr Miroslavom Tomkom PhD Medirex)

50

Odporuacutečanaacute a použitaacute literatuacutera

Odborneacute knihy Klug W S Cummings M R Spencer Ch A Palladino M A Concepts of Genetics jedenaacuteste vydanie (2015) Carson S Molecular Biology Techniques tretie vydanie (2012) Strachan T Read A Human Molecular Genetics štvrteacute vydanie (2011) Sudbery P Sudbery I Human Molecular Genetics tretie vydanie (2009)

Internetoveacute straacutenky

wwwncbinlmnihgov wwwmlpacom wwwthermofishercom wwwilluminacom wwwpromegask wwwqiagencom wwwambioncom

Odborneacute člaacutenky Chacon-Cortes D Griffiths L R Methods for extracting genomic DNA from whole blood samples current perspectives Journal of Biorepository Science for Applied Medicine Volume 2 strany 1- 9 Viltrop T Krjutskov K Palta P Metspalu A Comparison of DNA extraction methods for multiplex polymerase chain reaction Anal Biochem 2010 Volume 398(2) strany 260-262 Ing Martin Čermaacutek Molekulaacuterna cytogenetika v problematike familiaacuternych maligniacutet Onkoloacutegia Volume 2 strany 77 - 83 Livak KJ Schmittgen TD Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method Methods 2001 Volume 25(4) strany 402 - 408 Bustin S A Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays J Mol Endocrinol 2000 Volume 25(2) strany169 - 193

MOLEKULAacuteRNE METOacuteDY AKTUAacuteLNE POUŽIacuteVANEacute V KLINICKEJ GENETIKE RNDr Andrea Pastoraacutekovaacute PhD RNDr Robert Petrovič PhD Vydala Univerzita Komenskeacuteho v Bratislave Lekaacuterska fakulta Rozsah 50 straacuten 246 AH prveacute vydanie ISBN 978-80-223-4231-5

20

Obr 18 Relatiacutevna kvantifikaacutecia - určenie počtu koacutepiiacute geacutenu CYP21A2 vo vzorke DNA izolovanej z perifeacuternej krvi pacientov mutaacutecie v geacutene CYP21A2 spocircsobujuacute kongenitaacutelnu adrenaacutelnu hyperplaacuteziu (CAH) Vyacutesledok analyacutezy všetci pacienti majuacute dve koacutepie geacutenu

Obr 19 Relatiacutevna kvantifikaacutecia - určenie počtu koacutepiiacute geacutenu CYP21A2 vo vzorke DNA izolovanej z plodovej vody mutaacutecie v geacutene CYP21A2 spocircsobujuacute kongenitaacutelnu adrenaacutelnu hyperplaacuteziu (CAH) Prenaacutetalnou diagnostikou (qPCR) sa zistila priacutetomnost jednej koacutepie CYP21A2 geacutenu 332 Určenie genotypu metoacutedou alelovej diskriminaacutecie a analyacutezou krivky topenia (HRM)

Určenie genotypu metoacutedou alelovej diskriminaacutecie (obr 20) sa uskutočňuje použitiacutem hydrolyzujuacutecich proacuteb (sond) je veľmi ryacutechla a senzitiacutevna (presnaacute) metoacuteda frekventovane využiacutevanaacute v laboratoacuteriaacutech Dva variantyalely suacute vyšetreneacute suacutečasne v jednej vzorke a v jednej reakčnej

21

skuacutemavke V reakcii suacute použiteacute dve proacuteby označeneacute rozdielnymi fluorescenčnyacutemi farbičkami emitujuacutecimi svetlo o rocircznej vlnovej dĺžke (najčastejšie jedna označenaacute FAM farbičkou a druhaacute proacuteba označenaacute VIC farbičkou) Počas amplifikaacutecie amplikoacutenu dochaacutedza k odstraacuteneniu zhaacutešača z bliacutezkosti farbičky ktoraacute potom emituje svetlo priacuteslušnej vlnovej dĺžky Vzorky so signaacutelom len jednej fluorescenčnej farbičky (FAM) a bez signaacutelu druhej farbičky (VIC) suacute homozygoti pre alelu 1 vzorky so signaacutelom len druhej farbičky (VIC) a bez signaacutelu prvej (FAM) suacute homozygoti pre alelu 2 v priacutepade ak vyšetrovanaacute vzorka bdquosvietildquo obidvoma farbami jednaacute sa o heterozygota

Obr 20 Určenie genotypu metoacutedou alelovej diskriminaacutecie ndash amplifikačnaacute krivka vzoriek DNA majuacutecich tri rocirczne genotypy A ndash jednotliveacute vzorky (plnaacute čiara predstavuje štandardnuacute alelu guličkovanaacute mutovanuacute alelu) B ndash 72 vzoriek C ndash scatter plot 72 vzoriek

Určenie genotypu analyacutezou krivky topenia tzv high resolution melt (HRM) (obr 21) umožňuje detekciu takmer všetkyacutech genetickyacutech variaacuteciiacute (SNP mutaacuteciiacute) Keďže taacuteto metoacuteda okrem štandardnyacutech podmienok reakcie vyžaduje len primery a farbičku (nie proacuteby) je veľmi jednoduchaacute a lacnejšia Po amplifikaacuteciiacute treba amplikoacuten pomaly zohrievať až kyacutem nedocircjde k denaturaacuteciiacute Teplota topenia amplikoacutenu vo vzorke zaacutevisiacute od DNA sekvencie čo umožňuje detegovať priacutetomnosť mutaacutecie resp SNP Tvar vyacuteslednyacutech kriviek topenia určuje teda genotyp

22

Obr 21 Určenie genotypu analyacutezou krivky topenia tzv metoacutedou high resolution melting (HRM) A ndash krivka topenia vzoriek DNA majuacutecich tri rocirczne genotypy B ndash graf rozdielnosti krivky topenia vzoriek DNA majuacutecich tri rocirczne genotypy

23

4 Elektroforetickaacute separaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten

Separaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten predstavuje rozdelenie molekuacutel DNA alebo RNA na zaacuteklade veľkosti zloženia a poradia baacutez Podobnyacutemi metoacutedami je možneacute separovať aj proteiacuteny

Elektroforeacuteza (ELFO) je technika použiacutevanaacute na separaacuteciu niekedy aj purifikaacuteciu makromolekuacutel ako suacute nukleoveacute kyseliny a proteiacuteny na zaacuteklade ich rozdielnej veľkosti naacuteboja alebo konformaacutecie Je to metoacuteda veľmi často využiacutevanaacute nielen v molekulovej genetike ale aj biocheacutemii Elektroforeacuteza využiacuteva schopnosť nabityacutech molekuacutel migrovať v jednosmernom elektrickom poli k opačneacutemu poacutelu Nukleoveacute kyseliny majuacute vďaka svojej fosfaacutetovej zložke negatiacutevny naacuteboj preto v jednosmernom elektrickom poli migrujuacute ku kladneacutemu poacutelu čiže k anoacutede Elektroforeacuteza prebieha v elektroforetickej aparatuacutere v geacuteloch (v nosiči) so sieťovitou štruktuacuterou ktoraacute umožňuje separaacuteciu molekuacutel Vzorka nukleovej kyseliny zmiešanaacute s tzv nanaacutešaciacutem tlmivyacutem roztokom s farbičkou sa nanesie do jamky v geacuteli ktoryacute je umiestnenyacute v elektroforetickej aparatuacutere v priacutetomnosti elektroforetickeacuteho pufra (TAE alebo TBE) (obr 22) Nanaacutešaciacute tlmivyacute roztoknanaacutešacia farbička umožňuje na zaacuteklade migraacutecie farbičky vidieť migraacuteciu vzorky v geacuteli a suacutečasne zvyacutešeniacutem hustoty vo vzorke umožniacute klesnuacuteť vzorke do jamky a tak zabraacuteniť jej vyplaveniu z geacutelu Draacuteha je časť geacutelu ktoryacutem putuje jedna vzorka od katoacutedy k anoacutede V draacutehe sa nachaacutedzajuacute oddeleneacute jednotliveacute fragmenty nukleovyacutech kyseliacuten určityacutech veľkostiacute viditeľneacute vo forme pruacutežkov (angl bands) Intenzita pruacutežku zaacutevisiacute od množstva molekuacutel danej veľkosti je ekvivalentnaacute hmotnosti Na určenie veľkosti fragmentov NK sa do jednej jamky nanesie štandard molekulovyacutech hmotnostiacute (angl ladder) ktoryacute maacute presne definovaneacute veľkosti fragmentov čo umožňuje odhadnuacuteť veľkosť aj hmotnosť neznaacutemych separovanyacutech fragmentov

Obr 22 Elektroforetickaacute separaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten v agaroacutezovom geacuteli (A) a vizualizaacutecia UV svetlom a GelRedtrade (B C)

24

Nukleoveacute kyseliny je možneacute elektroforeticky separovať 1) v geacuteloch agaroacutezovom (horizontaacutelna elektroforeacuteza) (obr 22) a polyakrylamidovom (vertikaacutelna elektroforeacuteza) 2) v špeciaacutelnych lineaacuternych polymeacuteroch kapilaacuternou elektroforeacutezou použitiacutem genetickeacuteho analyzaacutetora (obr 23)

Agaroacuteza je polysacharid ziacuteskanyacute z morskej riasy použiacuteva sa najčastejšie v koncentraacuteciiacute 05-2 čiacutem vyššia koncentraacutecia tyacutem je geacutel pevnejšiacute a schopnejšiacute rozliacutešiť menšie fragmenty NK Priacuteprava je jednoduchaacute odvaacuteži sa potrebneacute množstvo agaroacutezy ktoraacute sa zmieša s tlmivyacutem roztokom (pufrom) rozvariacute sa v mikrovlnnej ruacutere a naleje sa do špeciaacutelnej naacutedoby na vytvaacuteranie geacutelov kyacutem je geacutel tekutyacute vložiacute sa do neho tzv hrebeň na vytvorenie jamiek Agaroacuteza je netoxickaacute V bežnom agaroacutezovom geacuteli v zaacutevislosti od jeho koncentraacutecie je možneacute separovať DNA fragmenty dĺžky 200-50 000 bp Dnes suacute dostupneacute aj špeciaacutelne agaroacutezy napr MetaPhorreg Agarose schopneacute oddeliť fragment DNA dĺžky 20-800bp Separaacutecia v agaroacutezovom geacuteli prebieha v horizontaacutelnej aparatuacutere preto sa nazyacuteva aj horizontaacutelna elektroforeacuteza

Polyakrylamidovyacute geacutel (PAGE) vznikaacute polymerizaacuteciou akrylamidu v priacutetomnosti špeciaacutelnych chemickyacutech laacutetok (peroxodisiacuteran amoacutenny TEMED bisakrylamid) Jeho priacuteprava je preto odlišnaacute a aj naacuteročnejšia Polyakrylamidoveacute geacutely majuacute vysokuacute rozlišovaciu schopnosť (1bp) preto suacute PAGE geacutely vhodneacute aj na sekvenovanie DNA klasickyacutemi metoacutedami PAGE geacutel nie je vhodnyacute na separaacuteciu fragmentov dlhšiacutech ako 2kb Použiacuteva sa v koncentraacutecii 35 -20 s rozliacutešeniacutem fragmentov od 10bp-2000bp Akrylamid je neurotoxiacuten musiacute sa s niacutem pracovať veľmi opatrne PAGE elektroforeacuteza bežiacute vo vertikaacutelnej aparatuacutere preto sa volaacute aj vertikaacutelna elektroforeacuteza použiacuteva sa často aj na separaacuteciu proteiacutenov

Ryacutechlosť pohybu nukleovyacutech kyseliacuten (mobilita) určuje viacero faktorov 1) veľkosť NK ndash počet baacutezovyacutech paacuterov resp baacutez pričom menšie molekuly prechaacutedzajuacute geacutelom ryacutechlejšie pretože sa ľahšie pohybujuacute v geacuteli 2) konformaacutecia nukleovej kyseliny napr u rovnako veľkyacutech plazmidov kondenzovaneacute superšpiralizovaneacute plazmidy migrujuacute najryacutechlejšie rovnako veľkeacute lineaacuterne molekuly (toho isteacuteho plazmidu) bežia pomalšie a najpomalšie putujuacute relaxovaneacute kruhoveacute molekuly plazmidu 3) koncentraacutecia geacutelu určuje jeho rozlišovaciu schopnosť koncentrovanejšiacute geacutel je schopnyacute separovať kratšie fragmenty NK redšie geacutely suacute vhodneacute pre rozliacutešenie vaumlčšiacutech fragmentov 4) zloženie geacutelu je docircležiteacute pri analyacuteze sekundaacuternych štruktuacuter NK a proteiacutenov v nedenaturovanom stave sekundaacuterna štruktuacutera spomaľuje migraacuteciu NK a proteiacutenov Tento fakt využiacutevajuacute niektoreacute diagnostickeacute techniky (napr SSCP - Single Strand Conformation Polymorphism - polymorfismus konformaacutecie jednovlaacuteknovej DNA) umožňujuacutece detekciu zaacutemeny jedinej baacutezy ktoraacute spocircsobiacute odlišneacute vnuacutetromolekuloveacute paacuterovanie a vyacuteslednuacute konformaacuteciu molekuly Geacutely mocircžu teda byť denaturačneacute a nedenaturačneacute (natiacutevne) 5) napaumltie zdroja - čiacutem vyššie je napaumltie ktoreacute vytvaacutera elektrickeacute pole v elektroforetickej aparatuacutere tyacutem ryacutechlejšie fragmenty NK migrujuacute 6) zloženie roztokov a teploty

Elektroforetickyacute tlmivyacute roztok (pufor - elektrolyt) zabezpečuje stabilneacute elektroforetickeacute podmienky počas separaacutecie geacutel je v ňom ponorenyacute Obsahuje ioacuteny čo umožňuje vedenie elektrickeacuteho pruacutedu

Štandard molekulovyacutech hmotnostiacute (v laboratoacuteriaacutech nazyacutevanyacute ladder alebo marker) je zmes fragmentov DNA alebo RNA s presne definovanou veľkosťou ktoryacute sluacuteži na odhad veľkosti vyšetrovanyacutech fragmentov NK (obr 22) Pomocou špeciaacutelnych štandardov molekulovyacutech hmotnostiacute ktoryacutech fragmenty NK majuacute definovanuacute aj hmotnosť je možneacute odhadnuacuteť množstvo (hmotnosť - koncentraacuteciu) neznaacutemeho fragmentu

B C

25

41 Vizualizaacutecia DNA

Samotnaacute nukleovaacute kyselina je počas elektroforetickej separaacutecie neviditeľnaacute Vizualizaacuteciu NK umožňujuacute interkalačneacute činidlaacute ktoreacute suacute schopneacute naviazať sa na molekuly NK tyacutem že sa včlenia medzi susediace baacutezy Po ožiareniacute UV svetlom interkalačneacute činidlaacute naviazaneacute na NK fluoreskujuacute tak sa vizualizuje NK čiacutem intenziacutevnejšie fluoreskuje tyacutem viac NK je v geacutelipruacutežku priacutetomneacute Interkalačneacute činidlo sa buď primieša do geacutelu pri jeho priacuteprave čo umožniacute sledovať migraacuteciu fragmentov NK počas elektroforeacutezy a to po vybratiacute z ELFO aparatuacutery a po ožiareniacute UV svetlom alebo sa geacutel farbiacute po elektroforetickej separaacutecii V minulosti bol na zviditeľnenie NK najčastejšie použiacutevanyacute etidiumbromid kvocircli jeho mutageacutennym vlastnostiam sa v suacutečasnosti nahraacutedza menej mutageacutennymi a netoxickyacutemi činidlami ako suacute napr komerčne dostupneacute SYBRregSafe GelRedtrade GelGreentrade

Kapilaacuterna elektroforeacuteza NK prebieha v špeciaacutelnom priacutestroji genetickom analyzaacutetore (obr 23) ktoryacute musiacute mať zaacutekladneacute komponenty ako suacute elektroacutedy kapilaacutera zdroj vysokeacuteho napaumltia detektor prepojenie s počiacutetačom a softveacuteroveacute vybavenie priestor na vloženie vzoriek atď Genetickyacute analyzaacutetor predstavuje automatizovanyacute systeacutem umožňujuacuteci sekvenovanie určovanie dĺžky DNA fragmentov ndash fragmentačnuacute analyacutezu a kvantifikaacuteciu nukleovyacutech kyseliacuten V novšiacutech typoch genetickeacuteho analyzaacutetora je proces analyacutezy od vloženia vzoriek do stojana automatizovanyacute

Vzorka určenaacute na analyacutezu je elektrokineticky injektovanaacute do tenkej kapilaacutery naplnenej lineaacuternym polymeacuterom Vplyvom vysokeacuteho napaumltia sa negatiacutevne nabiteacute fragmenty DNA pohybujuacute v polymeacuteri k pozitiacutevne nabitej elektroacutede Kapilaacuterna elektroforeacuteza je tak citlivaacute že je schopnaacute detegovať jednobaacutezovyacute rozdiel DNA fragmentov DNA fragmenty musia byť pred kapilaacuternou elektroforeacutezou fluorescenčne označeneacute v kapilaacutere suacute separovaneacute na zaacuteklade veľkosti Kraacutetko pred dosiahnutiacutem kladne nabitej elektroacutedy docircjde po excitaacutecii laserovyacutem žiareniacutem k emisii žiarenia fluoroformi (farbičkami) tak že optickyacute detekčnyacute systeacutem zaznamenaacute fluorescenciu ktoraacute je naacutesledne softveacuterovo spracovanaacute a vyhodnotenaacute

Obr 23 Genetickyacute analyzaacutetor

42 RFLP

Metoacuteda polymorfizmu dĺžky restrik čnyacutech fragmentov (angl Restriction Fragment Length Polymorfism) bola prvou metoacutedou využiacutevanou na detekciu DNA variaacuteciiacute rocircznych biologickyacutech vzoriek Princiacutep metoacutedy spočiacuteva v priacutetomnosti polymorfizmov v DNA sekvencii rocircznych ľudiacute ktoreacute zapriacutečinia rozdielny profil (obrazec) DNA fragmentov po štiepeniacute jednou alebo viaceryacutemi restrikčnyacutemi endonukleaacutezami Restrikčneacute endonukleaacutezy (RE) suacute enzyacutemy ktoreacute štiepia DNA molekulu v oblasti špecifickej nukleotidovej sekvencie nazyacutevanej restrik čneacute miesto RE najčastejšie rozpoznaacutevajuacute a štiepia miesto veľkeacute 4-6 baacutez RE suacute priacutetomneacute u prokaryotov (bakteacuterie a archebakteacuterie) kde suacute suacutečasťou restrik čno-modifikačneacuteho systeacutemu akoby prokaryotickeacutej vrodenej imunity sluacutežia

26

na ochranu pred cudzou DNA (napr viacuterusovou) ktoruacute po rozpoznaniacute špecifickej sekvencie štiepia

Restrikčno-modifikačnyacute systeacutem maacute dve zložky 1) modifikačneacute enzyacutemy - metylaacutezy ktoreacute procesom metylaacutecie modifikujuacute určiteacute baacutezy svojej DNA čiacutem ich označia za vlastnuacute DNA takže takaacuteto DNA je potom rezistentnaacute voči štiepeniu restrikčnyacutemi endonukleaacutezami Najčastejšiacutem spocircsobom metylaacutecie u bakteacuteriiacute je metylaacutecia adeniacutenu na N6 pričom vznikne metyladeniacuten alebo cytoziacutenu na C5 metylcytoziacuten 2) restrikčneacute endonukleaacutezy štiepia špecifickeacute miesto dvojvlaacuteknovej DNA ktoreacute je tvoreneacute symetrickou sekvenciou zrkadlovo sa opakujuacutecich nukleotidov ndash tzv palindroacutem Restrikčneacute enzyacutemy sa použiacutevajuacute na štiepenie DNA sekvencie na mieste špecifickom pre tuacute ktoruacute restrikčnuacute endonukleaacutezu napr pri analyacuteze polymorfizmov dĺžky restrikčnyacutech fragmentov (RFLP) analyacuteze jednonukleotidovyacutech polymorfizmov (SNP) mutaacuteciiacute ako aj pri klonovaniacute DNA do vhodnyacutech vektorovyacutech DNA molekuacutel

Po štiepeniacute dvojvlaacuteknovej DNA restrikčnou endonukleaacutezou mocircžu vzniknuacuteť tri typy koncov - 5´-prečnievajuacutece konce (lepiveacute) 3´-prečnievajuacutece konce (lepiveacute) a tupeacute konce (obr 24)

Obr 24 Restrikčneacute štiepenie zanechaacutevajuacutece rocirczne konce tupeacute a lepiveacute

Restrikčneacute štiepenie je často použiacutevanou metoacutedou geacutenovyacutech manipulaacuteciiacute na konštrukciu

hybridnyacutech molekuacutel DNA s naacuteslednyacutem klonovaniacutem Priebeh RFLP analyacutezy je nasledovnyacute restrikčnaacute endonukleaacuteza sa pridaacute k DNA a zmes sa vo

vhodnyacutech reakčnyacutech podmienkach (pufor teplota) inkubuje niekoľko hodiacuten Počas inkubaacutecie docircjde k štiepeniu DNA na špecifickyacutech miestach DNA je potom elektroforeticky separovanaacute v geacuteli a naacutesledne vizualizovanaacute V minulosti po geacutelovej elektroforeacuteze nasledoval Southern blot (čiže prenos separovanyacutech fragmentov DNA z geacutelu na špeciaacutelnu membraacutenu) (obr 35) po ktorom nastala vizualizaacutecia raacutedioaktiacutevne značenou proacutebou V suacutečasnosti sa kvocircli praacutecnosti a zdravotnyacutem rizikaacutem od Southern blotu upuacutešťa a prechaacutedza sa na ryacutechlejšie menej praacutecne a zdravotne šetrnejšie metoacutedy priateľskejšie aj k životneacutemu prostrediu

RFLP bola prvou metoacutedou použiacutevanou na zistenie DNA profilu (DNA fingerprinting) mapovanie geacutenov zapriacutečiňujuacutece genetickeacute ochorenia a testovanie otcovstva Vaumlčšina RFLP markerov je vysoko lokusovo špecifickyacutech a kodominantnyacutech (obidve alely suacute detekovaneacute u heterozygota)

PCR-RFLP je laboratoacuterne priacutestupnejšia metoacuteda molekulaacuterno-genetickej diagnostiky keďže PCR umožňuje amplifikaacuteciu veľmi malyacutech množstiev DNA Alternatiacutevny naacutezov použiacutevanyacute v literatuacutere je CAPS z angl Cleaved Amplified Polymorphic Sequence assay Použitiacutem špecifickyacutech primerov docircjde PCR metoacutedou k amplifikaacutecii požadovaneacuteho uacuteseku DNA ten sa potom štiepi restrikčnou endonukleaacutezou vo vhodnyacutech podmienkach naacutesledne sa štiepne produkty elektroforeticky separujuacute a vizualizujuacute použitiacutem interkalačnyacutech farbiacutev a UV svetla (obr 25)

27

Obr 25 Princiacutep metoacutedy PCR-RFLP

43 VNTR a STR V geacutenome suacute priacutetomneacute dva typy tandemovyacutech (za sebou nasledujuacutecich) opakovaniacute

1) minisatelity ndash nazyacutevaneacute variabilnyacute počet tandemovyacutech opakovaniacute VNTR (variable number of tandem repeats) 2) mikrosatelity tiež kraacutetke tandemoveacute repetiacutecie STR (short tandem repeats)

Obidva tieto typy satelitnej DNA suacute rozmiestneneacute po celom genoacuteme suacute využiacutevaneacute hlavne vo forenznej genetike na identifikaacuteciu osocircb a určenie otcovstva popriacutepade materstva ale aj v mediciacutene na detekciu chromozoacutemovyacutech aneuploidiiacute Štruktuacutera obidvoch je podobnaacute Rozdiel medzi jednotlivyacutemi alelami je spocircsobenyacute rozdielnym počtom opakovaniacute opakujuacutecej sa sekvencie (motiacutevu) čo spocircsobiacute rocircznu dĺžku alel s rocircznym počtom tandemovyacutech opakovaniacute nazyacutevanuacute polymorfizmus dĺžky fragmentov

VNTR ndash variabilnyacute počet tandemovyacutech opakovaniacute pričom opakujuacuteca sa sekvencia maacute dĺžku od 6 do 100 baacutez pričom sa mocircže opakovať aj tisiacutece kraacutet alely tak mocircžu mať od 500do 30 000 baacutez VNTR boli v kombinaacutecii s RFLP (DNA fingerprinting ) prvyacutem polymorfizmom použiacutevanyacutem na zistenie DNA profilov a identifikaacuteciu osocircb v kriminalistickej praxi V suacutečasnosti jeho využitie v kriminalistike je kvocircli potrebe relatiacutevne veľkeacuteho množstva DNA nahradeneacute využitiacutem STR

STR - kraacutetke tandemoveacute repetiacutecie suacute v kriminalistike najčastejšie použiacutevanyacutem polymorfizmom STR lokusy suacute rozmiestneneacute po celom genoacuteme repetiacutecia obsahuje jednu až šesť baacutez pričom jej opakovaniacutem vznikne STR v rozsahu od 50 do 300bp V našom genoacuteme suacute tisiacutece STR ktoreacute mocircžu byť použiteacute pre forenznuacute analyacutezu V kriminalistike sa v suacutečasnosti na identifikaacuteciu osocircb použiacuteva 13 STR locusov ktoreacute patria k medzinaacuterodne uznaacutevanyacutem štandardom Z iniciatiacutevy FBI bola vytvorenaacute databaacuteza CODIS (Combined DNA Index System) každaacute krajina maacute svoju databaacutezu CODIS kde je možneacute vložiť a archivovať DNA profily jednotlivcov ako aj profily DNA ziacuteskanyacutech z miest kriminaacutelneho činu v databaacuteze je ich možneacute navzaacutejom porovnať a tak zistiť pocircvodcu trestneacuteho činu Medzinaacuterodnaacute jednotnosť v použiacutevaniacute CODIS STR lokusov umožňuje v priacutepade potreby vzaacutejomneacute porovnanie DNA profilov zistenyacutech na uacutezemiacute rocircznych štaacutetov CODIS STR lokusov je 13 a suacute to CSF1PO FGA TH01 TPOX VWA D3S1358 D5S818 D7S820 D8S1179 D13S317 D16S539 D18S51 a D21S11 Zistenie DNA profilu sa uskutočniacute multiplexnou PCR reakciou s fluorescenčne značenyacutemi primermi špecifickyacutemi pre konkreacutetny STR Naacutesledne suacute PCR produkty analyzovaneacute kapilaacuternou elektroforeacutezou genetickyacutem analyzaacutetorom ktoryacute rozliacuteši amplifikovaneacute fragmenty na zaacuteklade fluorescencie a dĺžky (fragmentačnaacute analyacuteza) (obr 26 Tab 3) DNA profil každeacuteho človeka je jedinečnyacute rovnakyacute profil mocircžu mať len jednovaječneacute dvojčataacute

28

Obr 26 Ukaacutežka DNA profilu človeka 15 STR lokusov s určeniacutem pohlavia pomocou lokusu pre amelogeniacuten (ženskeacute pohlavie - XX) maleacute oranžoveacute piacuteky predstavujuacute fragmenty veľkostneacuteho štandardu Tabuľka č 3 Zaacutepis DNA profilu človeka z obraacutezka č 26 15 STR lokusov s určeniacutem pohlavia pomocou lokusu pre amelogeniacuten System Alela 1 Alela 2

D3S1358 16 17

TH01 9 93 D21S11 28 28

D18S51 15 18

Penta E 7 14 D5S818 9 12

D13S317 8 11

D7S820 8 11 D16S539 11 12

CSF1PO 10 11

Penta D 11 12 vWA 15 18

D8S1179 13 16

TPOX 8 9 FGA 20 21

amel X X

29

5 MLPA

Multiplexnaacute amplifikaacutecia proacuteb zaacutevislaacute od ligaacutecie (z angl multiplex ligation-dependent probe amplification) je metoacuteda schopnaacute v jednej reakcii (v jednej skuacutemavke a vzorke) detegovať zmeny v počte až 50 nukleotidovyacutech sekvenciiacute Metoacutedou MLPA je možneacute ryacutechlo identifikovať amplifikaacutecie (duplikaacutecie) a deleacutecie veľkeacuteho počtu geacutenov či už použitiacutem DNA alebo mRNA krvnyacutech vzoriek alebo vzoriek z naacutedorov

Princiacutep MLPA spočiacuteva v multiplexnej amplifikaacutecii 50 špecifickyacutech nukleotidovyacutech sekvenciiacute použitiacutem jedneacuteho paacuteru primerov pričom jeden primer je fluorescenčne označenyacute Vyacutesledneacute PCR produkty suacute analyzovaneacute kapilaacuternou elektroforeacutezou (fragmentačnaacute analyacuteza) Dĺžka každeacuteho namnoženeacuteho produktu je jedinečnaacute narastaacute postupne o 6 alebo 9 nukleotidov pričom produkty PCR suacute 120 ndash 500 nukleotidov dlheacute Tento veľkostnyacute rozsah PCR fragmentov (dĺžka 120-500 nukleotidov s naacuterastom postupne o 6 alebo 9 nukleotidov) je optimaacutelny pre kapilaacuternu elektroforeacutezu MLPA multiplexnaacute PCR prebieha za použitia iba jedineacuteho paacuteru primerov ktoreacute amplifikujuacute špecifickeacute sekvencie Trik spočiacuteva v tom že nedochaacutedza k amplifikaacutecii DNA sekvencie ale MLPA proacuteb ktoreacute suacute pridaneacute k vzorkaacutem Každaacute MLPA proacuteba pozostaacuteva z dvoch oligonukleotidov (dve hemiproacuteby) pričom každyacute oligonukleotid obsahuje jednu zo sekvencie rozpoznaacutevanuacute PCR primermi Proacuteba vznikne jedine za predpokladu hybridizaacutecie dvoch oligonukleotidov (hemiproacuteb) k cieľovej sekvencii (geacutenu) a po ligaacutecii enzyacutemom ligaacutezou Iba ligovaneacute proacuteby suacute exponenciaacutelne amplifikovaneacute pomocou jedneacuteho paacuteru primerov Množstvo zligovanyacutech proacuteb teda zaacutevisiacute od množstva cieľovyacutech sekvenciiacute (geacutenov) vo vzorke

Postup MLPA analyacutezy je nasledovnyacute (obr27) K vzorke nukleovej kyseliny (DNA resp mRNA) sa pridaacute zmes 50 jedinečnyacutech proacuteb každaacute

proacuteba je komplementaacuterna k určitej cieľovej sekvencii NK vzorky Každaacute proacuteba však pozostaacuteva z dvoch oligonukleotidov hybridizujuacutecich vedľa seba zaacuteroveň každyacute oligonukleotid (hemiproacuteba) obsahuje pridanuacute sekvenciu rozpoznaacutevanuacute paacuterom PCR primerov Po hybridizaacuteciiacute oligonukleotidov (hemiproacuteb) dochaacutedza k ich ligaacutecii ligaacutezou Ligačnaacute reakcia je tak špecifickaacute že je schopnaacute rozliacutešiť sekvenciu liacutešiacu sa v jednom nukleotide Vyacuteslednyacute ligačnyacute produkt (proacuteba) obsahuje obidve sekvencie pre PCR primery na jednom fragmente čiže mocircže docircjsť k namnoženiu takeacutehoto fragmentu PCR reakciou V priacutepade ak nedocircjde k ligaacutecii priacuteslušnyacutech hemiproacuteb pretože hemiproacuteby nenaacutejdu cieľovuacute sekvenciu na DNA každaacute takaacuteto nezligovanaacute hemiproacuteba maacute len jednu sekvenciu rozpoznaacutevanuacute len jednyacutem PCR primerom v docircsledku čoho nemocircže prebehnuacuteť jej PCR amplifikaacutecia a počas fragmentačnej analyacutezy nie je detegovanaacute pretože negeneruje fluorescenčnyacute signaacutel

Pri MLPA analyacuteze je docircležiteacute okrem MLPA amplifikaacutecie vzorky urobiť aj MLPA amplifikaacuteciu referenčnej vzorky ku ktorej sa bude porovnaacutevať počet geacutenov (cieľovyacutech sekvenciiacute) Po kapilaacuternej elektroforeacuteze MLPA referenčnej a skuacutemanej vzorky porovnaniacutem obsahu nameranyacutech hodnocirct tzv piacutekov priacuteslušnyacutech proacuteb sa určiacute relatiacutevny počet koacutepiiacute v skuacutemanej vzorke

MLPA

1 DNA denaturaacutecia a hybridizaacutecia s MLPA proacutebami (hemiproacuteby)

2 Ligaacutecia (vytvorenie kompletnyacutech proacuteb)

3 PCR amplifikaacutecia proacuteb paacuterom primerov

4 Kapilaacuterna elektroforetickaacute separaacutecia PCR produktov

5 Analyacuteza daacutet

30

Obr 27 Princiacutep MLPA

Firma MRC-Holland v suacutečasnosti ponuacuteka stovky MLPA setov proacuteb ktoreacute suacute vhodneacute na 1) diagnostiku kongenitaacutelnych a dedičnyacutech ochoreniacute 2) zisťovanie profilu naacutedorov 3) zisťovanie metylačneacuteho profilu

MLPA je metoacuteda vhodnaacute na detekciu malyacutech prestavieb (BRCA1 BRCA2 MSH2 atď)

veľkyacutech chromozoacutemovyacutech prestavieb (Williamsov syndroacutem Prader-WilliAngelman syndroacutem atzď)

31

detekciu zmien v počte koacutepii geacutenov (obr 28 29) ako aj zistenie počtu kompletnyacutech chromozoacutemov (chromozoacutem 13 18 21 XY tiež aj z amniovej tekutiny) diagnostiku naacutedorov (zmeny počtu pri ALL CLL atď) kvantifikaacuteciu metylaacutecie (Prader-WilliAngelmanov syndroacutem Fragilnyacute X inaktivaacutecia naacutedorovyacutech supresorovyacutech geacutenov atď) mRNA analyacutezu geacutenov zuacutečastňujuacutecich sa apoptoacutezy alebo zaacutepalov

MS-MLPA (Methylation-Specific MLPA) je varianta MLPA určenaacute špeciaacutelne na analyacutezu aberantnyacutech metylaacutecii imprintovanyacutech oblastiacute ako aj detekciu metylačnyacutech zmien CpG ostrovčekov lokalizovanyacutech bliacutezko promoacutetora Rozdiel oproti štandardnej MLPA spočiacuteva v použitiacute metylačne senzitiacutevneho restrikčneacuteho enzyacutemu HhaI ktoryacute štiepi MS-MLPA proacuteby hybridizovaneacute k nemetylovanej sekvencii Každaacute DNA vzorka určenaacute pre MS-MLPA analyacutezu prejde dvoma reakciami v jednej mikroskuacutemavke štandardnou MLPA analyacutezou (bez štiepenia metylačne senzitiacutevnym enzyacutemom) a v druhej mikroskuacutemavke docircjde okrem ligaacutecie proacuteb aj k metylačne senzitiacutevnemu štiepeniu hybridizovanyacutech proacuteb s nemetylovanou DNA Amplifikujuacute sa len ligovaneacute proacuteby po PCR amplifikaacutecii sa fragmentačnou analyacutezou porovnaniacutem oboch reakciiacute zistia rozdiely v metylačnom profile vzorky k referenčnej vzorke

RT-MLPA (Reverse Transkriptase MLPA) je variaacutecia MLPA určenaacute pre zistenie mRNA profilu vzorky je alternatiacutevou k real-time PCR a mikročipom RT-MLPA nedeteguje mRNA množstvo priamo pretože použiacutevanaacute ligaacuteza nie je schopnaacute ligovať DNA oligonukleotidy keď suacute hybridizovaneacute s RNA Preto RT-MLPA začiacutena reverznou transkripciou so špeciaacutelne navrhnutyacutemi RT primermi tak aby vytvorili kraacutetke oligonukleotidy (cDNA) Potom reakcia pokračuje ako štandardnaacute MLPA

Obr 28 MLPA analyacuteza geacutenu DMD (koacutedujuacuteceho dystrofiacuten) mutaacutecie ktoreacuteho spocircsobujuacute Duchennovu svalovuacute dystrofiu u pacienta je priacutetomnaacute deleacutecia exoacutenu 45 v porovnaniacute s referenčnou vzorkou ndash kontrolou

32

Obr 29 MLPA analyacuteza geacutenu DMD (koacutedujuacuteceho dystrofiacuten) mutaacutecie ktoreacuteho spocircsobujuacute Duchennovu svalovuacute dystrofiu u pacienta suacute priacutetomneacute duplikaacutecie exoacutenov 41 42 43 44 45 (piacuteky vo vzorke pacienta sa porovnajuacute s piacutekmi v kontrole ndash referenčnej vzorke)

33

6 Sekvenovanie

Sekvenovaniacutem rozumieme určenie primaacuternej štruktuacutery DNA teda určenie poradia nukleotidov v reťazci DNA Začiatky moderneacuteho sekvenovania siahajuacute do roku 1977 kedy boli objaveneacute dve metoacutedy sekvenovania 1) chemickaacute metoacuteda Maxama a Gilberta 2) enzymatickaacute metoacuteda Sangera Nicklena a Coulsona

Princiacutep obidvoch metoacuted sekvenovania spočiacuteva v tom že sa vytvoriacute suacutebor DNA molekuacutel s rocircznou veľkosťou ktoreacute suacute zakončeneacute konkreacutetnym nukleotidom tieto DNA molekuly sa elektroforeticky separujuacute v geacuteloch s rozlišovacou schopnosťou 1 nukleotid 61 Chemickaacute metoacuteda

DNA molekuly sa na 5-konci raacutedioaktiacutevne označia raacutedioaktiacutevnym fosforom a naacutesledne sa chemicky modifikujuacute špecificky pre každuacute baacutezu DNA sa potom v modifikovanyacutech miestach štiepi čiacutem vzniknuacute rocirczne dlheacute fragmenty pričom podmienky suacute nastaveneacute tak aby sa DNA na každom mieste štiepila len raz Modifikaacutecia DNA a štiepenie prebehne v štyroch separaacutetnych reakciaacutech (skuacutemavkaacutech) takže po elektroforetickej separaacuteciiacute takto opracovanej DNA v štyroch draacutehach polyakrylamidoveacuteho geacutelu a naacuteslednej autoraacutediografii (podobne ako pri Southernovej hybridizaacutecii) je možneacute odčiacutetať nukleotidovuacute sekvenciu približne 100 nukleotidov od raacutedioaktiacutevneho označenia (v čase objavu Maxama a Gilberta) 62 Sangerova metoacuteda

Zaacuteklady metoacutedy boli popiacutesaneacute už v roku 1975 (metoacuteda plus a miacutenus) ale až vylepšenie použitiacutem dideoxynukleotidov (ddNTP) v roku 1977 došlo k zjednodušeniu sekvenovania Princiacutepom enzyacutemoveacuteho sekvenovania je terminaacutecia (zastavenie) polymerizaacutecie inkorporaacuteciou 2´ 3 -dideoxynukleotidov do novosyntetizujuacuteceho sa vlaacutekna DNA Keďže ddNTP neobsahujuacute hydroxylovuacute skupinu na 3 uhliacuteku riboacutezy nemocircžu sa zuacutečastniť na tvorbe fosfodiesterovej vaumlzby nemocircže sa pripojiť k nim ďalšiacute nukleotid čiže musiacute docircjsť k terminaacuteciiacute polymeraacutecie Reakcia prebieha v štyroch skuacutemavkaacutech s raacutedioaktiacutevne značenyacutem primerom V každej skuacutemavke suacute priacutetomneacute všetky štyri deoxynukleotidtrifosfaacutety (dNTP) ale pre každuacute skuacutemavku je špecifickyacute priacutedavok maleacuteho množstva jedneacuteho z dideoxynukleotidtrifosfaacutetov (v prvej skuacutemavke je ddATP v druhej ddCTP v tretej ddTTP a vo štvrtej ddGTP) Maleacute množstvo ddNTP spocircsobiacute že pri polymerizaacutecii dochaacutedza k prednostneacutemu zaradeniu štandardnyacutech dNTP do narastajuacuteceho reťazca a len občas sa inkorporuje ddNTP čiacutem sa zastaviacute synteacuteza reťazca V každej skuacutemavke tak vznikne suacutebor DNA fragmentov rocircznych veľkostiacute zakončenyacutech priacuteslušnyacutem ddNTP (v prvej skuacutemavke ddATP v druhej ddCTP v tretej ddTTP a vo štvrtej ddGTP) Po elektroforetickej separaacutecii v 4 draacutehach polyakrylamidoveacuteho geacutelu a autoraacutediografii sa z autoraacutediogramu odčiacuteta sekvencia

V suacutečasnosti je sekvenovanie do značnej miery automatizovaneacute pričom využiacuteva princiacutep Sangerovej enzyacutemovej metoacutedy s určityacutemi obmenami Uacutesek DNA ktoryacute treba sekvenovať sa prostredniacutectvom termostabilnyacutech DNA polymeraacutez namnožiacute PCR metoacutedou po ktorej nasleduje sekvenačnaacute reakcia (asymetrickaacute PCR) s fluorescenčne značenyacutemi ddNTP (každyacute druh označenyacute inyacutem fluorescenčnyacutem farbivom) Sekvenačnaacute reakcia prebieha v jednej skuacutemavke s jednyacutem primerom vznikne tak suacutebor jednovlaacuteknovyacutech DNA rocircznej dĺžky ktoreacute suacute na 3konci označeneacute ddNTP so špecifickyacutem fluorescenčnyacutem farbivom Taacuteto metoacuteda sekvenovania sa tiež nazyacuteva rdquodye-terminator cycle sequencingrdquo(obr 30) Po kapilaacuternej elektroforeacuteze vzorky v genetickom analyzaacutetore zaznamenaacutevaniacute fluorescencie jednotlivyacutech fragmentov CCD kamerou a softveacuterovom spracovaniacute sa ziacuteska sekvencia DNA (obr 31)

34

Obr 30 Princiacutep sekvenovania Sangerova dideoxy metoacuteda alebo tzv chain termination method (reťazec zastavujuacuteca metoacuteda) Obr 31 Určenie genotypu plodu a rodičov sekvenčnou analyacutezou DNA ziacuteskanej z plodovej vody (prenataacutelna diagnostika) a perifeacuternej krvi sekvenčnaacute analyacuteza geacutenu ASPA vyacutesledok u plodu priacutetomnaacute mutaacutecia c 914CgtA v homozygotnom stave (AA) rodičia heterozygoti (AC) Uvedenaacute mutaacutecia je v homozygotnom stave kauzaacutelnou priacutečinou Canavanovej choroby

Automatizovaneacute sekvenovanie prinaacuteša viacereacute vyacutehody oproti klasickej Sangerovej metoacutede vyššiu presnosť a ryacutechlosť v jednej sekvenačnej reakcii možnosť osekvenovať až 1200 nukleotidovyacute fragment maleacute množstvo templaacutetu potrebneacute na analyacutezu

35

63 Next Generation Sequencing (NGS)

NGS (sekvenovanie novej generaacutecie) maacute obrovskyacute potenciaacutel v analyacuteze genoacutemov pričom toto označenie zahŕňa viacereacute technologickeacute metoacutedy reprezentovaneacute niekoľkyacutemi firmami Princiacutepom je masiacutevne paralelneacute sekvenovanie čiacutem sa ziacuteskajuacute raacutedovo tisiacutece až milioacuteny sekvenciiacute naraz 631 Sekvenovanie druhej generaacutecie

Na začiatku sa analyzovanaacute DNA vo vaumlčšine priacutepadov fragmentuje (vznikne tak DNA

knižnica) na fragmenty sa pripoja kraacutetke sekvencie ndash adapteacutery naacutesledne sa tieto fragmenty rocircznymi priacutestupmi amplifikujuacute a určiacute sa ich sekvencia Vďaka čiastočnyacutem prekryvom je zo ziacuteskanyacutech sekvencii možneacute poskladať plynuluacute sekvenciu zodpovedajuacutecu pocircvodnej nefragmentovanej DNA

Pyrosekvenovanie je podobne ako Sangerova metoacuteda založenaacute na princiacutepe synteacutezy komplementaacuterneho vlaacutekna DNA avšak rozdiel je v tom že sa na detekciu inkorporaacutecie nukleotidu využiacuteva inyacute systeacutem tvorby luminiscenčneacuteho signaacutelu v priebehu reakcie Pyrosekvenovanie je umožneneacute vďaka aktivite 4 enzyacutemov - DNA polymeraacutezy ATP sulfurylaacutezy luciferaacutezy a apyraacutezy Reakčnaacute zmes obsahuje aj ďalšie komponenty - enzymatickeacute substraacutety adenoziacutenfosfosulfaacutet (APS) d-luciferiacuten sekvenovanyacute templaacutet a cyklicky postupne po jednom type pridaacutevaneacute nukleotidtrifosfaacutety Po zabudovaniacute nukleotidu do novovznikajuacuteceho reťazca docircjde k uvoľneniu pyrofosfaacutetu naacutesledne je využityacute ATP sulfurylaacutezou na synteacutezu ATP z APS počas ďalšej reakcie docircjde k využitiu ATP luciferaacutezou na premenu luciferiacutenu na oxyluciferiacuten čo spocircsobiacute svetelnyacute signaacutel a ten zaznamenaacute detekčnyacute systeacutem Poslednou enzymatickou reakciou je reakcia apyraacutezy ktoraacute odstraacuteni nezainkorporovaneacute nukleotidy a nevyužiteacute ATP aby sa celyacute proces mohol zopakovať s reakčnou zmesou obsahujuacutecou ďalšiacute nukleotidtrifosfaacutet (inyacute ako v predchaacutedzajuacutecej reakcii) Po každej reakcii detektor zaznamenaacuteva emisiu svetla na zaacuteklade intenzity svetla je možneacute určiť či bol vradenyacute priacuteslušnyacute nukleotidtrifosfaacutet či bol inkorporovanyacute jeden priacutepadne viac rovnakyacutech nukleotidtrifosfaacutetov

Zvyacutešenie vyacutekonu pyrosekvenovania umožnila tzv emulznaacute PCR v mikročasticiach a použitie platničky PicoTiterPlatereg toto sekvenovanie zaviedla firma Roche pod pojmom 454 pyrosekvenovanie v roku 2005 Na začiatku sa DNA fragmentuje na uacuteseky dlheacute 400-600 baacutez dvojvlaacuteknovaacute fragmentovanaacute DNA sa liguje s adapteacutermi prostredniacutectvom nich sa naviaže na mikročastice dvojvlaacuteknoveacute fragmenty sa oddelia mikročastice s naviazanyacutemi jednovlaacuteknovyacutemi fragmentami sa premiešajuacute so zmesou oleja a roztoku ktoryacute obsahuje všetky komponenty na uacutespešnuacute PCR Tyacutemto spocircsobom sa okolo každej mikročastice vytvoriacute vlastnyacute mikroreaktor v ktorom prebehne amplifikaacutecia fragmentu Po PCR reakcii sa mikročastice prenesuacute do platničky PicoTiterPlate v ktorej sa do jamky zmestiacute akuraacutet jedna mikročastica a reakčneacute komponenty pyrosekvenačnej reakcie PicoTiterPlatereg maacute 1 600 000 jamiek každaacute jamka maacute maximaacutelny objem 75 picolitra Platnička s mikročasticami sa vložiacute do sekvenačneacuteho systeacutemu ndash priacutestroja v ktorom sa celeacute pyrosekvenovanie uskutočniacute Chemiluminiscenčneacute signaacutely ktoryacutech počas sekvenovania vznikajuacute milioacuteny v priebehu hodiny suacute zachyteneacute CCD kamerou a analyzovaneacute softveacuterom

Firma Illumina predstavila inuacute technoloacutegiu PCR amplifikaacutecia a sekvenovanie sa uskutočňuje na skliacutečku (flow cell) Fragmentaacutecia DNA a pripojenie adapteacuterov prebieha za uacutečasti transpozoacutemov v procese nazvanom tagmentaacutecia Po hybridizaacutecii fragmentov DNA na skliacutečko prebehne v klastroch PCR amplifikaacutecia (tzv mostiacutekovaacute amplifikaacutecia) sekvenaacutecia prebieha za uacutečasti rozdielne fluorescenčne značenyacutech a chemicky modifikovanyacutech nukleotidov pričom každyacute nukleotid emituje fluorescenciu s inou vlnovou dĺžkou Na skliacutečku prebieha paralelne až 6 miliaacuterd sekvenaacutecii (obr 32)

Ďalšiacutemi možnosťami sekvenovania druhej generaacutecie je systeacutem SOLid (vyvinutyacute firmou Applied Biosystem dnes pod Thermo Fisher Scientific) a Ion Semiconductor Sequencing ndash polovodičoveacute ioacutenoveacute sekvenovanie (od firmy Ion Semiconductor Sequencing v suacutečasnosti Thermo Fisher Scientific)

36

Obr 32 Princiacutep sekvenovania novej generaacutecie od firmy Illumina PCR amplifikaacutecia a sekvenovanie sa uskutočňuje na skliacutečku (flow cell) paralelne prebieha až 6 miliaacuterd sekvenaacutecii

632 Sekvenovanie tretej generaacutecie

Pred sekvenovaniacutem netreba amplifikovať DNA PCR metoacutedou ale sekvencia sa ziacuteskava zachyteniacutem signaacutelu v reaacutelnom čase Medzi sekvenovanie tretej generaacutecie patriacute SMRT (Single Molecule Real-Time Sequencing) a Nanopore Sequencing

37

7 Fragmentačnaacute analyacuteza DNA

Je metoacuteda použiacutevanaacute na určenie veľkosti fragmentov DNA ziacuteskanyacutech PCR reakciou Dĺžka amplifikovanyacutech DNA fragmentov sa zistiacute ich porovnaniacutem s veľkostnyacutem štandardom (obr 33) ktoryacute je tvorenyacute DNA fragmentami znaacutemej dĺžky Veľkostnyacute štandard je pred kapilaacuternou elektroforeacutezou zmiešanyacute so vzorkou DNA fragmenty veľkostneacuteho štandardu suacute fluorescenčne označeneacute pričom použiteacute fluorescenčneacute farbivo je ineacute ako fluorescenčneacute farbivo použiteacute na označenie DNA fragmentov vo vyšetrovanej vzorke

Obr 33 Elektroforetogram veľkostneacuteho štandardu použiacutevaneacuteho na určenie veľkostiacute fragmentov analyzovanyacutech kapilaacuternou elektroforeacutezou v genetickom analyzaacutetore (GeneScantrade 500 LIZtrade dye Size Standard) dĺžka fragmentov v nukleotidoch (napr 50 nukleotidov)

Fragmentačnaacute analyacuteza pozostaacuteva z viaceryacutech krokov Prvyacutem je izolaacutecia DNA nasleduje PCR amplifikaacutecia počas ktorej sa novosyntetizovaneacute DNA fragmenty označia fluorescenčnyacutemi farbivami Vzorka s PCR produktom sa pripraviacute na kapilaacuternu elektroforeacutezu tak že sa zmieša s veľkostnyacutem štandardom (sluacuteži na určenie veľkosti fragmentov) a denaturačnou laacutetkou (formamid) nasleduje denaturaacutecia Pripraveneacute vzorky suacute injektovaneacute do priacutestroja (genetickyacute analyzaacutetor) kde v kapilaacutere naplnenej polymeacuterom v elektrickom poli migrujuacute fluorescenčne značeneacute fragmenty DNA na zaacuteklade veľkosti (kapilaacuterna elektroforeacuteza) Počas elektroforeacutezy genetickyacute analyzaacutetor zaznamenaacuteva fluorescenciu fragmentov Analyacutezou daacutet prostredniacutectvom špeciaacutelnych softveacuterov sa ziacuteskajuacute elektroforetogramy z ktoryacutech je možneacute zistiť veľkosť fragmentov ako aj typ fluorescencie (docircležiteacute ak suacute genetickeacute varianty rozliacutešiteľneacute rocircznou fluorescenciou napr SNaPshot) Fragmentačnaacute analyacuteza je suacutečasťou množstva molekulaacuterno-genetickyacutech metoacuted (pozri obr 12 26 28 29 34) ako suacute napr STR analyacuteza (Short Tandem Repeat) AFLP analyacuteza (Amplified Fragment Lenght Polymorfism) RFLPT-RFLP analyacuteza (Restriction Fragment Lenght PolymorfismTerminal Restricted Fragment Lenght Polymorfism) SSCP (Single Strand Conformation Polymorfism) VNTR (Variable Number of Tandem Repeat) analyacuteza straty heterozygotnosti (LOH loss of heterozygozity) MLPA (Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification) MSMSA (Methylation-Sensitive Mobility Shift Assay) SNP genotypovanie (SNaPshotreg) HiCEP (High-Coverage Expression Profiling)

38

Obr 34 Kvantitatiacutevna fragmentačnaacute PCR analyacuteza (QF-PCR) DNA izolovanej z plodovej vody vyacutesledok prenataacutelnej analyacutezy = priacutetomnosť troch piacutekov pre chromozoacutem 18 (u všetkyacutech fragmentov detegujuacutecich chromozoacutem 18 je pomer vyšetrovanyacutech markerov aberantnyacute 21 resp 111) čo znamenaacute trizoacutemiu chromozoacutemu 18 Edwardsov syndroacutem

39

8 Metoacutedy založeneacute na princiacutepe hybridizaacutecie

Nukleoveacute kyseliny majuacute schopnosť vytvaacuterať dvojvlaacuteknoveacute reťazce z jednovlaacuteknovyacutech molekuacutel na zaacuteklade komplementarity baacutez Komplementarita baacutez umožňuje replikaacuteciu DNA transkripciu RNA komplementarita baacutez zabezpečuje teda reprodukovateľnosť živej hmoty

Hybridizaacutecia je proces v ktorom na zaacuteklade komplementarity baacutez dochaacutedza k vytvoreniu dvojvlaacuteknovej nukleovej kyseliny z dvoch jednovlaacuteknovyacutech molekuacutel DNA alebo RNA alebo ich kombinaacuteciou DNA RNA pričom kratšia jednovlaacuteknovaacute nukleovaacute kyselina vystupuje ako sonda (proacuteba) Hybridizaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten je jeden z najpoužiacutevanejšiacutech naacutestrojov v molekulaacuternej bioloacutegii a genetike (hybridizaacutecia primerov alebo proacuteb sa využiacuteva v takmer každej metoacutede - v PCR RT-PCR qPCR RT-qPCR MLPA sekvenovaniacute fragmentačnej analyacuteze FISH DNA mikročipoch atď)

Denaturaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten je proces pri ktorom dochaacutedza k porušeniu vodiacutekovyacutech vaumlzieb medzi vlaacuteknami nukleovyacutech kyseliacuten (strata sekundaacuternej a terciaacutelnej štruktuacutery) tak že docircjde k ich uacuteplneacutemu oddeleniu vzniknuacute jednovlaacuteknoveacute reťazce Denaturaacutecia NK mocircže byť spocircsobenaacute vplyvom vysokyacutech teplocirct pH alebo chemickyacutech laacutetok (denaturačneacute činidlaacute) Renaturaacutecia je opačnyacute proces v ktorom na zaacuteklade komplementarity dochaacutedza k tvorbe dvojvlaacuteknovyacutech NK

Hybridiza čnaacute sonda (proacuteba) je jednovlaacuteknovaacute nukleovaacute kyselina určitej znaacutemej dĺžky a sekvencie (najčastejšie DNA pretože je stabilnejšia ako RNA) ktoraacute je značenaacute a sluacuteži na detekciu komplementaacuternych molekuacutel DNA alebo RNA v procese hybridizaacutecie V zaacutevislosti od podmienok hybridizaacutecie (stringencia) mocircže byť detegovanaacute sekvencia uacuteplne komplementaacuterna alebo v menej priacutesnych podmienkach mocircže mať sekvenčneacute odchyacutelky Proacuteba sluacuteži na vyhľadanie a zviditeľnenie cieľovyacutech NK Zviditeľnenie sa deje prostredniacutectvom označenia proacuteby ešte pred hybridizaacuteciou Značenie proacuteby mocircže byť raacutedioaktiacutevne a neraacutedioaktiacutevne (najčastejšie fluorescenčneacute)

Raacutedioaktiacutevne značeneacute proacuteby pomocou izotopov (32P) sa využiacutevali viac v minulosti v suacutečasnosti suacute kvocircli zdravotnyacutem rizikaacutem ohľaduplnosti k životneacutemu prostrediu ako aj kvocircli jednoduchšej manipulaacutecii použiacutevaneacute fluorescenčne značeneacute proacuteby Raacutedioaktiacutevne značeneacute sondy boli použiacutevaneacute hlavne metoacutedou Southernovej hybridizaacutecie (Southern blotting Southern blot) Citlivosť raacutedioaktiacutevne značenyacutech proacuteb je vyššia dosahuje schopnosť zachytiť 10 fg (femtogram 10-15) cieľovej DNA sekvencie 81 Southern blot

Metoacutedu objavil v roku 1975 britskyacute bioloacuteg Edwin Southern (preto Southern) Pri Southernovej hybridizaacutecii sa restrikčne štiepeneacute fragmenty DNA elektroforeticky separujuacute v geacuteli potom sa metoacutedou blottingu prenesuacute na nylonovuacute alebo nitroceluloacutezovuacute membraacutenu kde suacute naacutesledne hybridizovaneacute v roztoku obsahujuacutecom raacutedioaktiacutevne značenuacute sondu Priloženiacutem fotografickeacuteho filmu k membraacutene a vyvolaniacutem filmu autoraacutediografiou docircjde k zviditeľneniu lokaliacutet kde došlo k hybridizaacuteciiacute raacutedioaktiacutevne značenej sondy s fragmentom DNA (autoraacutediogram) Southern blot bol kľuacutečovou a prvou metoacutedou na identifikaacuteciu osocircb (DNA fingerprinting DNA pofiling) (obr 35)

Okrem Southern blotu existuje Northern blot na analyacutezu RNA (geacutenovej expresie) a Western blot na analyacutezu proteiacutenov postup je obdobnyacute ako pri Southern blote s obmenami špecifickyacutemi pre konkreacutetny blot Pri Northern blote sa použiacutevajuacute hybridizačneacute proacuteby ale pre vizualizaacuteciu proteiacutenov western blotom je potrebneacute použiť protilaacutetky s naacuteslednou vizualizaacuteciou Pomenovanie techniacutek je hra so sloviacutečkami (keďže paacuten Northern ani Western neobjavili takto nazvaneacute techniky)

Neraacutedioaktiacutevne značenie proacuteb použiacutevanyacutech v molekulaacuternej genetike mocircže byť nepriame (použitie haptenu) alebo priame Konečnaacute vizualizaacutecia je najčastejšie zabezpečenaacute fluoreskujuacutecimi farebnyacutemi značkami farbivami fluorochroacutemami (fluorofoacuterami) Pri priamom značeniacute je farbička kovalentne naviazanaacute na nukleotid a na zachytenie fluorescencie suacute potrebneacute špeciaacutelne priacutestroje umožňujuacutece excitaacuteciu farbičky ktoraacute potom emituje žiarenie určitej vlnovej dĺžky (emisneacute žiarenie) a to zachytiacute detekčnyacute systeacutem priacutestroja Využitie fluorochroacutemov v molekulaacuternej genetike je masiacutevne napr na vizualizaacuteciu NK elektroforeticky separovanyacutech v geacuteli kvantifikaacuteciu produktov PCR reakcie v priacutestroji real-time PCR cykleacuter sekvenovaniacute fragmentačnej analyacuteze FISH DNA mikročipoch atď

40

Obr 35 Princiacutep Southern blotu

82 FISH (fluorescenčnaacute in situ hybridizaacutecia)

FISH (fluorescent in situ hybridization fluorescenčnaacute in situ hybridizaacutecia) metoacuteda patriacute medzi molekulovo-cytogenetickeacute techniky Princiacutep FISH metoacutedy je založenyacute na hybridizaacuteciiacute fluorescenčne značenyacutech proacuteb ku komplementaacuternym uacutesekom vyšetrovanej DNA na podložnom skle (priamo na mieste - in situ) K denaturaacutecii dsDNA dochaacutedza buď vplyvom denaturačnyacutech činidiel alebo zvyacutešenou teplotou a naacuteslednou renaturaacuteciou dochaacutedza k naviazaniu sondy na komplementaacuterny uacutesek DNA Vyacutesledok hybridizaacutecie sa vizualizuje fluorescenčnyacutem mikroskopom vybavenyacutem vhodnyacutemi fluorescenčnyacutemi filtrami a vizuaacutelne zhodnotiacute skuacutesenyacutem odborniacutekom Fluorescencia sa v niektoryacutech priacutepadoch mocircže zaznamenať a hodnotiť aj pomocou softveacuteru (obr 36)

Pomocou FISH detegujeme numerickeacute aberaacutecie - zmeny v počte chromozoacutemov (napr trizoacutemia monozoacutemia chromozoacutemov) alebo štruktuacuterne aberaacutecie a prestavby (napr translokaacutecie inverzie deleacutecie duplikaacutecie amplifikaacutecie) FISH metoacuteda umožňuje identifikaacuteciu a detekciu každeacuteho ľudskeacuteho chromozoacutemu jeho zaradenie do karyotypu odhalenie malyacutech submikroskopickyacutech chromozoacutemovyacutech zmien a tiež mapovať poziacutecie jednotlivyacutech geacutenov na chromozoacuteme

41

Obr 36 Princiacutep štandardnej FISH a FISH maľovania celeacuteho chromozoacutemu

Veľkou vyacutehodou FISH metoacutedy je možnosť analyacutezy buniek v metafaacuteze aj v interfaacuteze kedy nie je nutnaacute kultivaacutecia buniek a tiež ryacutechle analyzovanie veľkeacuteho počtu buniek (stovky až tisiacutece) K ďalšiacutem vyacutehodaacutem patriacute bezpečnosť vysokaacute citlivosť dostatočnaacute stabilita relatiacutevne kraacutetky čas hybridizaacutecie a možnosť ryacutechleho vyhodnotenia Hybridizaacutecia pri vaumlčšine suacutečasne dodaacutevanyacutech sond trvaacute 10-12 hodin (na trhu suacute už dostupneacute aj sondy so skraacutetenyacutem časom hybridizaacutecie na 2-3 hodiny) Po hybridizaacuteciiacute nasleduje odmyacutevanie kedy pri priacuteslušnej teplote dochaacutedza k odmytiu nenaviazanyacutech a nespraacutevne hybridizovanyacutech sond Preparaacutet sa naacutesledne podfarbiacute a vyacutesledok sa zhodnotiacute vo fluorescenčnom mikroskope Na podfarbenie chromozoacutemov alebo jadier sa použiacuteva modreacute kontrastneacute farbivo DAPI (46-diamidino-2-fenylindol) ktoreacute maacute silneacute fluorescenčneacute vlastnosti dokaacuteže prechaacutedzať jadrovou membraacutenou a viazať sa na DNA Vyacutesledkom je modreacute zafarbenie ktoreacute vyacuteborne kontrastuje so signaacutelmi jednotlivyacutech sond

Limitujuacutecim faktorom FISH je možnosť identifikaacutecie len tyacutech uacutesekov DNA ku ktoryacutem suacute použiteacute sondy V jednej analyacuteze je možneacute použiť najviac 3 odlišne značeneacute sondy a tak zistiť priacutepadneacute abnormality len na 1 alebo na paacuter lokusoch Na relevantnuacute detekciu je potrebneacute mať vo vzorke 1-5 aberantnyacutech interfaacutezovyacutech jadier

FISH je možneacute uskutočniť na širokej škaacutele biologickeacuteho materiaacutelu na vzorkaacutech perifeacuternej krvi kostnej drene naacuteteroch choriovyacutech klkoch plodovej vode rocircznych druhov tkaniacutev natiacutevnych alebo zaliatych v parafiacutene na 1 bunke (predimplantačnaacute genetickaacute diagnostika PGD) (obr 37)

Využiacuteva sa na detekciu aberaacuteciiacute pri mnohyacutech onkologickyacutech ochoreniach (napr pri diagnoacuteze mnohopočetnyacute myeloacutem sa v suacutečasnosti po separaacutecii CD138+ buniek robiacute FISH s 5 sondami pre geacuteny IGH TP53 RB1 oblasť 1p321q21 a stanovuje sa hyperploidia chromozoacutemov 5 9 a 15) a tiež k spresneniu doplneniu a k overeniu bežneacuteho cytogenetickeacuteho vyšetrenia

Podľa miesta na chromozoacuteme na ktorom dochaacutedza k hybridizaacutecii sondy rozlišujeme 4 typy

DNA sond bull centromeacuteroveacute sondy ndash sa viažu na strednuacute časť chromozoacutemu ndash centromeacuteru sluacutežia k diagnostike zmien v počte chromozoacutemov k detekcii chromozoacutemov neznaacutemeho pocircvodu umožňujuacute interfaacuteznu FISH na nedeliacich sa bunkaacutech (obr 38-41)

42

Obr 37 Interfaacutezna FISH preimplantačnyacute genetickyacute skriacutening aneuploidiiacute ndash blastomeacutera 3-denneacuteho ľudskeacuteho embrya s normaacutelnym počtom chromozoacutemov 13 18 21 pohlavie XY použityacutech 5 sond pre chromozoacutemy 13 ndash orange 18 ndash aqua 21 ndash green X ndash blue a Y ndash yellow (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

Obr 38 Interfaacutezne jadro po hybridizaacutecii s centromeacuterovou sondou pre chromozoacutem 8 (Vysis Abbott) V pravom jadre je priacutetomnaacute trizoacutemia chromozoacutemu 8 (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex) Obr 39 Metafaacutezna (A) a interfaacutezna FISH (B) použitaacute centromeacuterovaacute sonda CEPX spectrum orangeCEPY spectrum green (Vysis Abbott) Sonda hybridizuje k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (červenyacute signaacutel) a Y (zelenyacute signaacutel) (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

43

Obr 40 Interfaacutezna FISH vyšetrenie spermiiacute použiteacute sondy CEPX greenCEPY orange (Aneuscore Metasystems) Sondy hybridizujuacute k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (zelenyacute signaacutel) Y (červenyacute signaacutel) vľavo ndash dve haploidneacute spermie (majuacutece jedna spermia X druhaacute Y chromozoacutem) vpravo ndash dve patologickeacute spermie obsahujuacutece gonozoacutemovyacute komplement XY (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

Obr 41 Interfaacutezna FISH vyšetrenie spermiiacute použiteacute sondy CEPX greenCEPY orange a CEP18 aqua (Aneuscore Metasystems) Sondy hybridizujuacute k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (zelenyacute signaacutel) Y (červenyacute signaacutel) a 18 (modryacute signaacutel) vľavo ndash normaacutelne haploidneacute ľudskeacute spermie - 1x chromozoacutem X alebo Y a jedenkraacutet chromozoacutem 18 v strede ndash patologickaacute spermia obsahujuacuteca gonozoacutemovyacute komplement XY a jeden chromozoacutem 18 vpravo ndash patologickaacute diploidnaacute spermia s chromozoacutemami X Y a dvoma chromozoacutemami 18 (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

bull lokusovo špecifickeacute sondy ndash hybridizaacutecia prebehne na konkreacutetnom mieste geacutenu (lokuse) (obr 42-44) použiacutevajuacute sa k vyšetreniu mikrodeleacuteciiacute (straty malyacutech častiacute chromozoacutemu pri mikrodelečnyacutech syndroacutemoch) k zisteniu amplifikaacutecie onkogeacutenov a niektoryacutech špecifickyacutech translokaacuteciiacute prestavby geacutenov umožňujuacute interfaacuteznu FISH na nedeliacich sa bunkaacutech bull subtelomeroveacute ndash vaumlzba na koncoveacute časti chromozoacutemu ndash telomeacutery bull celochromozoacutemoveacute alebo celomaľovacie sondy ndash sondy hybridizujuacute s mnohopočetnyacutemi chromozoacutemovyacutemi sekvenciami pričom sa fluorescenčne tak bdquovymaľujeldquo celyacute chromozoacutem (Obr 45) Použiacutevajuacute sa na vyšetrenie chromozoacutemovyacutech prestavieb k analyacuteze translokaacuteciiacute a k detekcii pocircvodu tzv marker chromozoacutemov (malyacutech nadpočetnyacutech chromozoacutemov neznaacutemeho pocircvodu) K použitiu sondy suacute potrebneacute metafaacutezne chromozoacutemy nepoužiacutevaju sa pre interfaacuteznu FISH

Pri konvenčnej chromozoacutemovej FISH suacute homogeacutenne DNA proacuteby hybridizovaneacute s fixovanyacutem metafaacuteznym alebo prometafaacuteznym chromozoacutemomchromozoacutemami na skliacutečku (Obr 36a) Maximaacutelna rozlišovacia schopnosť metafaacuteznej FISH je niekoľko megabaacutez (Obr 39a 45) využitiacutem viac

44

natiahnutyacutech prometafaacuteznych chromozoacutemov sa dosiahne 1 Mb rozliacutešenie Prostredniacutectvom fiber FISH konkreacutetne artificiaacutelne deproteinizovanej natiahnutej DNA pripravenej in situ z celyacutech buniek na mikroskopickom skliacutečku je možneacute vizualizovať individuaacutelne geacuteny maleacute DNA elementy na chromozoacuteme s rozliacutešeniacutem okolo 1000 bp

Obr 42 Interfaacutezne jadro po hybridizaacutecii s lokusovo-špecifickou sondou LSI 5q31 Spectrum Orange5p12 Spectrum Green (Vysis Abbott) Na ľavom obraacutezku suacute priacutetomneacute dva červeneacute (5q31) a dva zeleneacute signaacutely (5p12) v pravom jadre je priacutetomnaacute deleacutecia 5q31 oblasti chyacuteba jeden červenyacute signal (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

Obr 43 Interfaacutezna FISH použitaacute lokusovo-špecifickaacute sonda ndash translokačnaacute - XL BCRABL1 plus (Metasystems) dvojfarebnaacute dvojfuacutezna kde červenaacute označuje lokus ABL1 na chromozoacuteme 9 a zelenaacute oblasť BCR na chromozoacuteme 22 Sonda deteguje fuacuteziu protoonkogeacutenu ABL1 (9q34) a geacutenu BCR (22q11) v priacutepade že červenyacute a zelenyacute signaacutel suacute pri sebe (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

45

Obr 44 Interfaacutezna FISH Použitaacute lokusovo-špecifickaacute sonda- typ break apart pre IGH geacuten V docircsledku translokaacutecie došlo k rozskočeniu geacutenu pričom translokačneacuteho partnera nepoznaacuteme vieme určiť len percento v koľkyacutech jadraacutech je geacuten prestavanyacute (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex) Obr 45 Použiteacute celochromozoacutemoveacute sondy WCP 15 (červenyacute chromozoacutem) a WCP 17 (zelenyacute chromozoacutem) Na metafaacuteze je potvrdenaacute reciprokaacute translokaacutecia t(1517)(q2221) (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

FISH vizualizaacutecia celeacuteho chromozoacutemu maľovanie chromozoacutemu anglicky chromosome

painting je špeciaacutelnou aplikaacuteciou chromozoacutemovej FISH proacuteba je koktail veľkeacuteho počtu rocircznych fluorescenčne značenyacutech DNA fragmentov hybridizujuacutecich pozdĺž celeacuteho konkreacutetneho chromozoacutemu (obr 36b 45) bdquoChromosomepaintingldquo analyzuje metafaacutezne chromozoacutemy V minulosti bola FISH vizualizaacutecia celyacutech chromozoacutemov limitovanaacute malyacutem množstvom rocirczne sfarbenyacutech fluorochroacutemov

V suacutečasnosti je možneacute detegovať množstvo cieľovyacutech sekvenciiacute naraz čo sa využiacuteva pri celogenoacutemovej chromozoacutemovej vizualizaacutecii (whole-chromosomepainting - WCP) metoacutedou multiplex FISH (M-FISH multicolor FISH o br 46) alebo spektraacutelnej karyotypizaacutecie (SKY) kedy možno rozliacutešiť všetky ľudskeacute chromozoacutemy ndash teda 24 rocircznych chromozoacutemov M-FISH a SKY patria medzi metafaacutezne formy FISH diagnostiky ktoreacute umožňujuacute simultaacutennu vizualizaacuteciu všetkyacutech ľudskyacutech chromozoacutemov v rocircznych farbaacutech čo predstavuje uľahčenie analyacutezy karyotypu hlavne pri komplexnyacutech zmenaacutech a markeroch neznaacutemeho pocircvodu Obe techniky vychaacutedzajuacute z použitia

46

celochromozoacutemovyacutech sond značenyacutech kombinaacuteciou viaceryacutech fluorochroacutemov Rozdiel medzi M-FISH a SKY spočiacuteva v technike ziacuteskania konečneacuteho obrazu

Obr 46 Multicolor FISH - každyacute chromozoacutemovyacute paacuter je zafarbenyacute inou farbou pričom na ich zafarbenie postačuje kombinaacutecia 5 fluorochroacutemov Na vyhodnocovanie je potrebnaacute špeciaacutelna sada fluorescenčnyacutech filtrov pre jednotliveacute fluorochroacutemy a špeciaacutelnyacute softweacuter Vľavo-štandardnyacute karyotyp vpravo karyotyp s mutaacuteciami (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

V molekulovej cytogenetike suacute komerčne dostupneacute sety M-FISH proacuteb umožňujuacutece

viacfarebneacute pruacutežkovanie chromozoacutemov (banding) s vysokyacutem rozliacutešeniacutem (multicolor-banding mBAND FISH MCB) čo umožňuje identifikaacuteciu intrachromozoacutemovyacutech prestavieb (Obr 47) Nevyhnutnosťou mBAND-u je mať chromozoacutemy v metafaacuteze Taacuteto metoacuteda bola prvyacutekraacutet uskutočnenaacute na chromozoacuteme 5 v roku 1999 mBAND FISH umožňuje rozliacutešiť špecifickeacute oblasti chromozoacutemov na uacuterovni pruacutežku - bandu a sub-bandu s detekciou 550 bandov haploidneacuteho karyotypu

Obr 47 A - mBAND chromozoacutemu 11 - inverzia duplikovanej oblasti 11q223-q25 B - mBAND chromozoacutemu 3 - na kruhovom chromozoacuteme deleacutecia oblasti 3p263 C - mBAND chromozoacutemu 2 - potvrdenie inverzie duplikovanej časti chromozoacutemu (poskytnuteacute RNDr Dagmar Landlovou Medirex)

FISH metoacuteda a jej varianty (M-FISH mBAND SKY) majuacute v suacutečasnosti širokeacute využitie v

klinickej genetike v onkologickej genetike na detekciu aberaacuteciiacute v čase diagnoacutezy počas liečby po

47

liečbe monitorovanie po transplantaacutecii kostnej drene v prenataacutelnej a postnataacutelnej diagnostike pri detekcii submikroskopickyacutech deleacuteciiacute (napr DiGeorge syndroacutem - 22q112 delečnyacute syndroacutem PraderndashWilli syndroacutem- chromozoacutem 15q11-13) prostredniacutectvom FISH je možnaacute detekcia numerickyacutech zmien chromozoacutemov (trizoacutemia chromozoacutemu 21 pri Downovom syndroacuteme trizoacutemia chromozoacutemu 15 pri Patauovom syndroacuteme trizoacutemia chromozoacutemu 18 pri Edwardsovom syndroacuteme) rocirczne zmeny v počte pohlavnyacutech chromozoacutemov (monozoacutemia X pri Turnerovom syndroacuteme Klinefelterov syndroacutem s X chromozoacutemom naviac - XXY) podobne v predimplantačnej diagnostike

83 DNA Microarray (DNA mikro čip biočip) DNA mikročipovanie je technika využiacutevajuacuteca hybridizaacuteciu skuacutemanej nukleovej kyseliny

(cieľovaacute vzorka) s veľkyacutem množstvom oligonukleotidovyacutech proacuteb (desať tisiacutec až milioacuten) ktoreacute suacute prichyteneacute na pevnyacute podklad najčastejšie sklenyacute silikoacutenovyacute alebo nylonovyacute (doštička čip) Skuacutemanaacute nukleovaacute kyselina je pred hybridizaacuteciou fragmentovanaacute označenaacute fluorofoacuterom a denaturovanaacute Po kontakte čipu s cieľovou vzorkou ktoraacute je vlastne zmes označenyacutech oligonukleotidov značeneacute oligonukleotidy hybridizujuacute s oligonukleotidovyacutemi sekvenciami prichytenyacutemi na čipe Potom suacute na zaacuteklade fluorescencie detekovaneacute miesta kde došlo k hybridizaacutecii čiže vzorka obsahovala takuacuteto nukleotidovuacute sekvenciu Z jedneacuteho mikročipu sa ziacuteska obrovskeacute množstvo daacutet ktoreacute je vždy nutneacute softveacuterovo spracovať V dnešnej dobe existuje niekoľko firiem poskytujuacutecich komerčne mikročipy na objednaacutevku alebo si ich laboratoacuteria produkujuacute sami

Mikročipovanie prebieha nasledovne

1) Vytvorenie DNA čipu ndash tisiacutece rocircznych jednovlaacuteknovyacutech DNA oligonukleotidov znaacutemych sekvencii sa kovalentne naviažu na povrch doštičky vždy v určitej lokalite je niekoľko rovnakyacutech oligonukleotidov veľkosť takejto lokality je ˂ 200 microm Proacutebami mocircže byť DNA cDNA alebo syntetizovaneacute oligonukleotidy Už hotoveacute mikročipy ponuacutekajuacute viacereacute firmy (Affymetrix Agilent Technologies Eppendorf Illumina) alebo si ich jednotliveacute laboratoacuteria vyraacutebajuacute sami pomocou robotickyacutech zariadeniacute DNA čip sa vytvaacutera buď nanaacutešaniacutem kvapiek oligonukleotidov na podklad alebo synteacutezou oligonukleotidov in situ na čipe 2) Priacuteprava vzorky ndash nukleovaacute kyselina (mRNA DNA) sa purifikuje určiacute sa jej kvantita a kvalita (spektrofotometericky) fragmentuje resp v priacutepade mRNA sa syntetizuje cDNA v priacutepade potreby sa mocircže DNA amplifikovať PCR reakciou štiepiť restrikčnyacutemi endonukleaacutezami 3) Fluorescenčneacute označenie (zriedkavejšie raacutedioaktiacutevne) fragmentov DNA prebieha počas reverznej transkripcie alebo PCR amplifikaacutecie za uacutečasti fluorescenčne značenyacutech nukleotidov Keď sa analyzujuacute dve rocirczne vzorky napr zdraveacute tkanivo a naacutedoroveacute tkanivo označenie nukleovyacutech kyseliacuten v tyacutechto tkanivaacutech byacuteva rozdielne a to použitiacutem dvoch rocircznych fluorescenčnyacutech farbiacutev (napr zeleneacute a červeneacute) Pred hybridizaacuteciou je potrebneacute vzorku denaturovať čiacutem sa vytvoriacute zmes jednovlaacuteknovyacutech DNA označenyacutech značkou 4) Hybridizaacutecia s mikročipom ndash v špeciaacutelnom hybridizačnom roztoku hybridizujuacute komplementaacuterne sekvencie zo vzorky s priacuteslušnyacutemi oligonukleotidovyacutemi sondami naviazanyacutemi na čipe Potom sa čip obmyje aby došlo k odstraacuteneniu čiastočne hybridizovanyacutech nukleovyacutech kyseliacuten 5) Skenovanie mikročipu ndash skenerom čipov docircjde k ožiareniu čipu laserom pričom v mieste hybridizaacutecie fluorescenčne značenyacutech DNA fragmentov s proacutebou docircjde k emisii svetla určitej vlnovej dĺžky ktoruacute skener zaznamenaacute 6) Analyacuteza daacutet prebieha metoacutedami bioinformatiky spracovaniacutem softveacutermi sa zistiacute ktoreacute lokality čipu navzaacutejom hybridizovali v priacutepade použitia dvoch vzoriek kontrolnej a skuacutemanej je možneacute analyzovať ich relatiacutevnu intenzitu hybridizaacutecie (expresie určiteacuteho geacutenu)

Existujuacute štyri typy mikročipov 1) Čipy ur čeneacute na analyacutezu expresie (obsahujuacute cDNA proacuteby) pre tzv dvojkanaacutelovyacute experiment kedy je vzorka určenaacute k hybridizaacutecii na čipe ziacuteskanaacute zmiešaniacutem DNA fragmentov kontrolnej a skuacutemanej vzorky pričom fragmenty suacute rozdielne fluorescenčne označeneacute (napr zelenyacute fluorofoacuter pre kontrolnuacute vzorku a červenyacute pre skuacutemanuacute) Na zaacuteklade intenzity a typu fluorescencie sa deteguje expresia geacutenov typickaacute pre kontrolnuacute vzorku (napr zelenaacute fluorescencia) pre skuacutemanuacute vzorku (napr

48

červenaacute fluorescencia) a expresia podobnaacute u oboch vzoriek (žltaacute fluorescencia) neexprimovaneacute geacuteny (čierna fluorescencia) rocirczne odtiene (v zaacutevislosti od prevažujuacutecej hybridizaacutecie) (obr 48) 2) Čipy ur čeneacute na analyacutezu mutaacutecii použije sa genoacutemovaacute DNA označenaacute jednou fluorescenčnou farbičkou na určenie jednonukleotidovej zmeny (SNP ndash Single Nukleotide Polymorphism) 3) Čipy na komparatiacutevnu genoacutemovuacute hybridizaacuteciu (aCGH array Comparative Genomic Hybridization) ndash použiacutevaneacute na zistenie zvyacutešenia alebo zniacuteženia množstva chromozoacutemovyacutech fragmentov obsahujuacutecich geacuteny zodpovedneacute za určiteacute ochorenie Na analyacutezu sa použije skuacutemanaacute gDNA a referenčnaacute (kontrolnaacute) DNA každaacute sa značiacute inou fluorescenčnou farbičkou (princiacutep ako pri analyacuteze expresie) (obr 49 50) 4) Čipy CGH - SNP kombinovaneacute čipy ur čeneacute na analyacutezu aj mutaacuteciiacute SNP aj na komparatiacutevnu genoacutemovuacute hybridizaacuteciu CGH

Mikročipy majuacute rozsiahle využitie napriacuteklad v identifikaacuteciiacute novyacutech geacutenov vo vyacuteskume ich funkciiacute expresie v rocircznych podmienkach pri diagnostike mnohyacutech ochoreniacute vo farmakogenomike vo vyacuteskume vplyvu toxiacutenov

Obr 48 Heatmapa geacutenovej expresie vybranyacutech geacutenov (mRNA) mikročip obsahuje 46000 cDNA proacuteb (poskytnuteacute Ing Helenou Gbelcovou PhD Uacutestav lekaacuterskej bioloacutegie genetiky a klinickej genetiky LF UK a UNB)

49

Obr 49 Princiacutep komparatiacutevnej genoacutemovej hybridizaacutecie (aCGH - array comparative genomic hybridization) Obr 50 A) Vyacutesledok komparatiacutevnej genoacutemovej hybridizaacutecie (aCGH - array comparative genomic hybridization) vzorky DNA izolovanej plodovej vody U plodu s abnormaacutelnym ultrasonografickyacutem vyšetreniacutem bola identifikovanaacute duplikaacutecia oblasti 3q261q29 (modryacute paacutes) a deleacutecia oblasti 5p1533p151 (červenyacute paacutes) Pre porovnanie chromozoacutem 1 bez aberaacutecie b) Ten istyacute pacient ale ineacute softveacuteroveacute spracovanie (poskytnuteacute RNDr Miroslavom Tomkom PhD Medirex)

50

Odporuacutečanaacute a použitaacute literatuacutera

Odborneacute knihy Klug W S Cummings M R Spencer Ch A Palladino M A Concepts of Genetics jedenaacuteste vydanie (2015) Carson S Molecular Biology Techniques tretie vydanie (2012) Strachan T Read A Human Molecular Genetics štvrteacute vydanie (2011) Sudbery P Sudbery I Human Molecular Genetics tretie vydanie (2009)

Internetoveacute straacutenky

wwwncbinlmnihgov wwwmlpacom wwwthermofishercom wwwilluminacom wwwpromegask wwwqiagencom wwwambioncom

Odborneacute člaacutenky Chacon-Cortes D Griffiths L R Methods for extracting genomic DNA from whole blood samples current perspectives Journal of Biorepository Science for Applied Medicine Volume 2 strany 1- 9 Viltrop T Krjutskov K Palta P Metspalu A Comparison of DNA extraction methods for multiplex polymerase chain reaction Anal Biochem 2010 Volume 398(2) strany 260-262 Ing Martin Čermaacutek Molekulaacuterna cytogenetika v problematike familiaacuternych maligniacutet Onkoloacutegia Volume 2 strany 77 - 83 Livak KJ Schmittgen TD Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method Methods 2001 Volume 25(4) strany 402 - 408 Bustin S A Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays J Mol Endocrinol 2000 Volume 25(2) strany169 - 193

MOLEKULAacuteRNE METOacuteDY AKTUAacuteLNE POUŽIacuteVANEacute V KLINICKEJ GENETIKE RNDr Andrea Pastoraacutekovaacute PhD RNDr Robert Petrovič PhD Vydala Univerzita Komenskeacuteho v Bratislave Lekaacuterska fakulta Rozsah 50 straacuten 246 AH prveacute vydanie ISBN 978-80-223-4231-5

21

skuacutemavke V reakcii suacute použiteacute dve proacuteby označeneacute rozdielnymi fluorescenčnyacutemi farbičkami emitujuacutecimi svetlo o rocircznej vlnovej dĺžke (najčastejšie jedna označenaacute FAM farbičkou a druhaacute proacuteba označenaacute VIC farbičkou) Počas amplifikaacutecie amplikoacutenu dochaacutedza k odstraacuteneniu zhaacutešača z bliacutezkosti farbičky ktoraacute potom emituje svetlo priacuteslušnej vlnovej dĺžky Vzorky so signaacutelom len jednej fluorescenčnej farbičky (FAM) a bez signaacutelu druhej farbičky (VIC) suacute homozygoti pre alelu 1 vzorky so signaacutelom len druhej farbičky (VIC) a bez signaacutelu prvej (FAM) suacute homozygoti pre alelu 2 v priacutepade ak vyšetrovanaacute vzorka bdquosvietildquo obidvoma farbami jednaacute sa o heterozygota

Obr 20 Určenie genotypu metoacutedou alelovej diskriminaacutecie ndash amplifikačnaacute krivka vzoriek DNA majuacutecich tri rocirczne genotypy A ndash jednotliveacute vzorky (plnaacute čiara predstavuje štandardnuacute alelu guličkovanaacute mutovanuacute alelu) B ndash 72 vzoriek C ndash scatter plot 72 vzoriek

Určenie genotypu analyacutezou krivky topenia tzv high resolution melt (HRM) (obr 21) umožňuje detekciu takmer všetkyacutech genetickyacutech variaacuteciiacute (SNP mutaacuteciiacute) Keďže taacuteto metoacuteda okrem štandardnyacutech podmienok reakcie vyžaduje len primery a farbičku (nie proacuteby) je veľmi jednoduchaacute a lacnejšia Po amplifikaacuteciiacute treba amplikoacuten pomaly zohrievať až kyacutem nedocircjde k denaturaacuteciiacute Teplota topenia amplikoacutenu vo vzorke zaacutevisiacute od DNA sekvencie čo umožňuje detegovať priacutetomnosť mutaacutecie resp SNP Tvar vyacuteslednyacutech kriviek topenia určuje teda genotyp

22

Obr 21 Určenie genotypu analyacutezou krivky topenia tzv metoacutedou high resolution melting (HRM) A ndash krivka topenia vzoriek DNA majuacutecich tri rocirczne genotypy B ndash graf rozdielnosti krivky topenia vzoriek DNA majuacutecich tri rocirczne genotypy

23

4 Elektroforetickaacute separaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten

Separaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten predstavuje rozdelenie molekuacutel DNA alebo RNA na zaacuteklade veľkosti zloženia a poradia baacutez Podobnyacutemi metoacutedami je možneacute separovať aj proteiacuteny

Elektroforeacuteza (ELFO) je technika použiacutevanaacute na separaacuteciu niekedy aj purifikaacuteciu makromolekuacutel ako suacute nukleoveacute kyseliny a proteiacuteny na zaacuteklade ich rozdielnej veľkosti naacuteboja alebo konformaacutecie Je to metoacuteda veľmi často využiacutevanaacute nielen v molekulovej genetike ale aj biocheacutemii Elektroforeacuteza využiacuteva schopnosť nabityacutech molekuacutel migrovať v jednosmernom elektrickom poli k opačneacutemu poacutelu Nukleoveacute kyseliny majuacute vďaka svojej fosfaacutetovej zložke negatiacutevny naacuteboj preto v jednosmernom elektrickom poli migrujuacute ku kladneacutemu poacutelu čiže k anoacutede Elektroforeacuteza prebieha v elektroforetickej aparatuacutere v geacuteloch (v nosiči) so sieťovitou štruktuacuterou ktoraacute umožňuje separaacuteciu molekuacutel Vzorka nukleovej kyseliny zmiešanaacute s tzv nanaacutešaciacutem tlmivyacutem roztokom s farbičkou sa nanesie do jamky v geacuteli ktoryacute je umiestnenyacute v elektroforetickej aparatuacutere v priacutetomnosti elektroforetickeacuteho pufra (TAE alebo TBE) (obr 22) Nanaacutešaciacute tlmivyacute roztoknanaacutešacia farbička umožňuje na zaacuteklade migraacutecie farbičky vidieť migraacuteciu vzorky v geacuteli a suacutečasne zvyacutešeniacutem hustoty vo vzorke umožniacute klesnuacuteť vzorke do jamky a tak zabraacuteniť jej vyplaveniu z geacutelu Draacuteha je časť geacutelu ktoryacutem putuje jedna vzorka od katoacutedy k anoacutede V draacutehe sa nachaacutedzajuacute oddeleneacute jednotliveacute fragmenty nukleovyacutech kyseliacuten určityacutech veľkostiacute viditeľneacute vo forme pruacutežkov (angl bands) Intenzita pruacutežku zaacutevisiacute od množstva molekuacutel danej veľkosti je ekvivalentnaacute hmotnosti Na určenie veľkosti fragmentov NK sa do jednej jamky nanesie štandard molekulovyacutech hmotnostiacute (angl ladder) ktoryacute maacute presne definovaneacute veľkosti fragmentov čo umožňuje odhadnuacuteť veľkosť aj hmotnosť neznaacutemych separovanyacutech fragmentov

Obr 22 Elektroforetickaacute separaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten v agaroacutezovom geacuteli (A) a vizualizaacutecia UV svetlom a GelRedtrade (B C)

24

Nukleoveacute kyseliny je možneacute elektroforeticky separovať 1) v geacuteloch agaroacutezovom (horizontaacutelna elektroforeacuteza) (obr 22) a polyakrylamidovom (vertikaacutelna elektroforeacuteza) 2) v špeciaacutelnych lineaacuternych polymeacuteroch kapilaacuternou elektroforeacutezou použitiacutem genetickeacuteho analyzaacutetora (obr 23)

Agaroacuteza je polysacharid ziacuteskanyacute z morskej riasy použiacuteva sa najčastejšie v koncentraacuteciiacute 05-2 čiacutem vyššia koncentraacutecia tyacutem je geacutel pevnejšiacute a schopnejšiacute rozliacutešiť menšie fragmenty NK Priacuteprava je jednoduchaacute odvaacuteži sa potrebneacute množstvo agaroacutezy ktoraacute sa zmieša s tlmivyacutem roztokom (pufrom) rozvariacute sa v mikrovlnnej ruacutere a naleje sa do špeciaacutelnej naacutedoby na vytvaacuteranie geacutelov kyacutem je geacutel tekutyacute vložiacute sa do neho tzv hrebeň na vytvorenie jamiek Agaroacuteza je netoxickaacute V bežnom agaroacutezovom geacuteli v zaacutevislosti od jeho koncentraacutecie je možneacute separovať DNA fragmenty dĺžky 200-50 000 bp Dnes suacute dostupneacute aj špeciaacutelne agaroacutezy napr MetaPhorreg Agarose schopneacute oddeliť fragment DNA dĺžky 20-800bp Separaacutecia v agaroacutezovom geacuteli prebieha v horizontaacutelnej aparatuacutere preto sa nazyacuteva aj horizontaacutelna elektroforeacuteza

Polyakrylamidovyacute geacutel (PAGE) vznikaacute polymerizaacuteciou akrylamidu v priacutetomnosti špeciaacutelnych chemickyacutech laacutetok (peroxodisiacuteran amoacutenny TEMED bisakrylamid) Jeho priacuteprava je preto odlišnaacute a aj naacuteročnejšia Polyakrylamidoveacute geacutely majuacute vysokuacute rozlišovaciu schopnosť (1bp) preto suacute PAGE geacutely vhodneacute aj na sekvenovanie DNA klasickyacutemi metoacutedami PAGE geacutel nie je vhodnyacute na separaacuteciu fragmentov dlhšiacutech ako 2kb Použiacuteva sa v koncentraacutecii 35 -20 s rozliacutešeniacutem fragmentov od 10bp-2000bp Akrylamid je neurotoxiacuten musiacute sa s niacutem pracovať veľmi opatrne PAGE elektroforeacuteza bežiacute vo vertikaacutelnej aparatuacutere preto sa volaacute aj vertikaacutelna elektroforeacuteza použiacuteva sa často aj na separaacuteciu proteiacutenov

Ryacutechlosť pohybu nukleovyacutech kyseliacuten (mobilita) určuje viacero faktorov 1) veľkosť NK ndash počet baacutezovyacutech paacuterov resp baacutez pričom menšie molekuly prechaacutedzajuacute geacutelom ryacutechlejšie pretože sa ľahšie pohybujuacute v geacuteli 2) konformaacutecia nukleovej kyseliny napr u rovnako veľkyacutech plazmidov kondenzovaneacute superšpiralizovaneacute plazmidy migrujuacute najryacutechlejšie rovnako veľkeacute lineaacuterne molekuly (toho isteacuteho plazmidu) bežia pomalšie a najpomalšie putujuacute relaxovaneacute kruhoveacute molekuly plazmidu 3) koncentraacutecia geacutelu určuje jeho rozlišovaciu schopnosť koncentrovanejšiacute geacutel je schopnyacute separovať kratšie fragmenty NK redšie geacutely suacute vhodneacute pre rozliacutešenie vaumlčšiacutech fragmentov 4) zloženie geacutelu je docircležiteacute pri analyacuteze sekundaacuternych štruktuacuter NK a proteiacutenov v nedenaturovanom stave sekundaacuterna štruktuacutera spomaľuje migraacuteciu NK a proteiacutenov Tento fakt využiacutevajuacute niektoreacute diagnostickeacute techniky (napr SSCP - Single Strand Conformation Polymorphism - polymorfismus konformaacutecie jednovlaacuteknovej DNA) umožňujuacutece detekciu zaacutemeny jedinej baacutezy ktoraacute spocircsobiacute odlišneacute vnuacutetromolekuloveacute paacuterovanie a vyacuteslednuacute konformaacuteciu molekuly Geacutely mocircžu teda byť denaturačneacute a nedenaturačneacute (natiacutevne) 5) napaumltie zdroja - čiacutem vyššie je napaumltie ktoreacute vytvaacutera elektrickeacute pole v elektroforetickej aparatuacutere tyacutem ryacutechlejšie fragmenty NK migrujuacute 6) zloženie roztokov a teploty

Elektroforetickyacute tlmivyacute roztok (pufor - elektrolyt) zabezpečuje stabilneacute elektroforetickeacute podmienky počas separaacutecie geacutel je v ňom ponorenyacute Obsahuje ioacuteny čo umožňuje vedenie elektrickeacuteho pruacutedu

Štandard molekulovyacutech hmotnostiacute (v laboratoacuteriaacutech nazyacutevanyacute ladder alebo marker) je zmes fragmentov DNA alebo RNA s presne definovanou veľkosťou ktoryacute sluacuteži na odhad veľkosti vyšetrovanyacutech fragmentov NK (obr 22) Pomocou špeciaacutelnych štandardov molekulovyacutech hmotnostiacute ktoryacutech fragmenty NK majuacute definovanuacute aj hmotnosť je možneacute odhadnuacuteť množstvo (hmotnosť - koncentraacuteciu) neznaacutemeho fragmentu

B C

25

41 Vizualizaacutecia DNA

Samotnaacute nukleovaacute kyselina je počas elektroforetickej separaacutecie neviditeľnaacute Vizualizaacuteciu NK umožňujuacute interkalačneacute činidlaacute ktoreacute suacute schopneacute naviazať sa na molekuly NK tyacutem že sa včlenia medzi susediace baacutezy Po ožiareniacute UV svetlom interkalačneacute činidlaacute naviazaneacute na NK fluoreskujuacute tak sa vizualizuje NK čiacutem intenziacutevnejšie fluoreskuje tyacutem viac NK je v geacutelipruacutežku priacutetomneacute Interkalačneacute činidlo sa buď primieša do geacutelu pri jeho priacuteprave čo umožniacute sledovať migraacuteciu fragmentov NK počas elektroforeacutezy a to po vybratiacute z ELFO aparatuacutery a po ožiareniacute UV svetlom alebo sa geacutel farbiacute po elektroforetickej separaacutecii V minulosti bol na zviditeľnenie NK najčastejšie použiacutevanyacute etidiumbromid kvocircli jeho mutageacutennym vlastnostiam sa v suacutečasnosti nahraacutedza menej mutageacutennymi a netoxickyacutemi činidlami ako suacute napr komerčne dostupneacute SYBRregSafe GelRedtrade GelGreentrade

Kapilaacuterna elektroforeacuteza NK prebieha v špeciaacutelnom priacutestroji genetickom analyzaacutetore (obr 23) ktoryacute musiacute mať zaacutekladneacute komponenty ako suacute elektroacutedy kapilaacutera zdroj vysokeacuteho napaumltia detektor prepojenie s počiacutetačom a softveacuteroveacute vybavenie priestor na vloženie vzoriek atď Genetickyacute analyzaacutetor predstavuje automatizovanyacute systeacutem umožňujuacuteci sekvenovanie určovanie dĺžky DNA fragmentov ndash fragmentačnuacute analyacutezu a kvantifikaacuteciu nukleovyacutech kyseliacuten V novšiacutech typoch genetickeacuteho analyzaacutetora je proces analyacutezy od vloženia vzoriek do stojana automatizovanyacute

Vzorka určenaacute na analyacutezu je elektrokineticky injektovanaacute do tenkej kapilaacutery naplnenej lineaacuternym polymeacuterom Vplyvom vysokeacuteho napaumltia sa negatiacutevne nabiteacute fragmenty DNA pohybujuacute v polymeacuteri k pozitiacutevne nabitej elektroacutede Kapilaacuterna elektroforeacuteza je tak citlivaacute že je schopnaacute detegovať jednobaacutezovyacute rozdiel DNA fragmentov DNA fragmenty musia byť pred kapilaacuternou elektroforeacutezou fluorescenčne označeneacute v kapilaacutere suacute separovaneacute na zaacuteklade veľkosti Kraacutetko pred dosiahnutiacutem kladne nabitej elektroacutedy docircjde po excitaacutecii laserovyacutem žiareniacutem k emisii žiarenia fluoroformi (farbičkami) tak že optickyacute detekčnyacute systeacutem zaznamenaacute fluorescenciu ktoraacute je naacutesledne softveacuterovo spracovanaacute a vyhodnotenaacute

Obr 23 Genetickyacute analyzaacutetor

42 RFLP

Metoacuteda polymorfizmu dĺžky restrik čnyacutech fragmentov (angl Restriction Fragment Length Polymorfism) bola prvou metoacutedou využiacutevanou na detekciu DNA variaacuteciiacute rocircznych biologickyacutech vzoriek Princiacutep metoacutedy spočiacuteva v priacutetomnosti polymorfizmov v DNA sekvencii rocircznych ľudiacute ktoreacute zapriacutečinia rozdielny profil (obrazec) DNA fragmentov po štiepeniacute jednou alebo viaceryacutemi restrikčnyacutemi endonukleaacutezami Restrikčneacute endonukleaacutezy (RE) suacute enzyacutemy ktoreacute štiepia DNA molekulu v oblasti špecifickej nukleotidovej sekvencie nazyacutevanej restrik čneacute miesto RE najčastejšie rozpoznaacutevajuacute a štiepia miesto veľkeacute 4-6 baacutez RE suacute priacutetomneacute u prokaryotov (bakteacuterie a archebakteacuterie) kde suacute suacutečasťou restrik čno-modifikačneacuteho systeacutemu akoby prokaryotickeacutej vrodenej imunity sluacutežia

26

na ochranu pred cudzou DNA (napr viacuterusovou) ktoruacute po rozpoznaniacute špecifickej sekvencie štiepia

Restrikčno-modifikačnyacute systeacutem maacute dve zložky 1) modifikačneacute enzyacutemy - metylaacutezy ktoreacute procesom metylaacutecie modifikujuacute určiteacute baacutezy svojej DNA čiacutem ich označia za vlastnuacute DNA takže takaacuteto DNA je potom rezistentnaacute voči štiepeniu restrikčnyacutemi endonukleaacutezami Najčastejšiacutem spocircsobom metylaacutecie u bakteacuteriiacute je metylaacutecia adeniacutenu na N6 pričom vznikne metyladeniacuten alebo cytoziacutenu na C5 metylcytoziacuten 2) restrikčneacute endonukleaacutezy štiepia špecifickeacute miesto dvojvlaacuteknovej DNA ktoreacute je tvoreneacute symetrickou sekvenciou zrkadlovo sa opakujuacutecich nukleotidov ndash tzv palindroacutem Restrikčneacute enzyacutemy sa použiacutevajuacute na štiepenie DNA sekvencie na mieste špecifickom pre tuacute ktoruacute restrikčnuacute endonukleaacutezu napr pri analyacuteze polymorfizmov dĺžky restrikčnyacutech fragmentov (RFLP) analyacuteze jednonukleotidovyacutech polymorfizmov (SNP) mutaacuteciiacute ako aj pri klonovaniacute DNA do vhodnyacutech vektorovyacutech DNA molekuacutel

Po štiepeniacute dvojvlaacuteknovej DNA restrikčnou endonukleaacutezou mocircžu vzniknuacuteť tri typy koncov - 5´-prečnievajuacutece konce (lepiveacute) 3´-prečnievajuacutece konce (lepiveacute) a tupeacute konce (obr 24)

Obr 24 Restrikčneacute štiepenie zanechaacutevajuacutece rocirczne konce tupeacute a lepiveacute

Restrikčneacute štiepenie je často použiacutevanou metoacutedou geacutenovyacutech manipulaacuteciiacute na konštrukciu

hybridnyacutech molekuacutel DNA s naacuteslednyacutem klonovaniacutem Priebeh RFLP analyacutezy je nasledovnyacute restrikčnaacute endonukleaacuteza sa pridaacute k DNA a zmes sa vo

vhodnyacutech reakčnyacutech podmienkach (pufor teplota) inkubuje niekoľko hodiacuten Počas inkubaacutecie docircjde k štiepeniu DNA na špecifickyacutech miestach DNA je potom elektroforeticky separovanaacute v geacuteli a naacutesledne vizualizovanaacute V minulosti po geacutelovej elektroforeacuteze nasledoval Southern blot (čiže prenos separovanyacutech fragmentov DNA z geacutelu na špeciaacutelnu membraacutenu) (obr 35) po ktorom nastala vizualizaacutecia raacutedioaktiacutevne značenou proacutebou V suacutečasnosti sa kvocircli praacutecnosti a zdravotnyacutem rizikaacutem od Southern blotu upuacutešťa a prechaacutedza sa na ryacutechlejšie menej praacutecne a zdravotne šetrnejšie metoacutedy priateľskejšie aj k životneacutemu prostrediu

RFLP bola prvou metoacutedou použiacutevanou na zistenie DNA profilu (DNA fingerprinting) mapovanie geacutenov zapriacutečiňujuacutece genetickeacute ochorenia a testovanie otcovstva Vaumlčšina RFLP markerov je vysoko lokusovo špecifickyacutech a kodominantnyacutech (obidve alely suacute detekovaneacute u heterozygota)

PCR-RFLP je laboratoacuterne priacutestupnejšia metoacuteda molekulaacuterno-genetickej diagnostiky keďže PCR umožňuje amplifikaacuteciu veľmi malyacutech množstiev DNA Alternatiacutevny naacutezov použiacutevanyacute v literatuacutere je CAPS z angl Cleaved Amplified Polymorphic Sequence assay Použitiacutem špecifickyacutech primerov docircjde PCR metoacutedou k amplifikaacutecii požadovaneacuteho uacuteseku DNA ten sa potom štiepi restrikčnou endonukleaacutezou vo vhodnyacutech podmienkach naacutesledne sa štiepne produkty elektroforeticky separujuacute a vizualizujuacute použitiacutem interkalačnyacutech farbiacutev a UV svetla (obr 25)

27

Obr 25 Princiacutep metoacutedy PCR-RFLP

43 VNTR a STR V geacutenome suacute priacutetomneacute dva typy tandemovyacutech (za sebou nasledujuacutecich) opakovaniacute

1) minisatelity ndash nazyacutevaneacute variabilnyacute počet tandemovyacutech opakovaniacute VNTR (variable number of tandem repeats) 2) mikrosatelity tiež kraacutetke tandemoveacute repetiacutecie STR (short tandem repeats)

Obidva tieto typy satelitnej DNA suacute rozmiestneneacute po celom genoacuteme suacute využiacutevaneacute hlavne vo forenznej genetike na identifikaacuteciu osocircb a určenie otcovstva popriacutepade materstva ale aj v mediciacutene na detekciu chromozoacutemovyacutech aneuploidiiacute Štruktuacutera obidvoch je podobnaacute Rozdiel medzi jednotlivyacutemi alelami je spocircsobenyacute rozdielnym počtom opakovaniacute opakujuacutecej sa sekvencie (motiacutevu) čo spocircsobiacute rocircznu dĺžku alel s rocircznym počtom tandemovyacutech opakovaniacute nazyacutevanuacute polymorfizmus dĺžky fragmentov

VNTR ndash variabilnyacute počet tandemovyacutech opakovaniacute pričom opakujuacuteca sa sekvencia maacute dĺžku od 6 do 100 baacutez pričom sa mocircže opakovať aj tisiacutece kraacutet alely tak mocircžu mať od 500do 30 000 baacutez VNTR boli v kombinaacutecii s RFLP (DNA fingerprinting ) prvyacutem polymorfizmom použiacutevanyacutem na zistenie DNA profilov a identifikaacuteciu osocircb v kriminalistickej praxi V suacutečasnosti jeho využitie v kriminalistike je kvocircli potrebe relatiacutevne veľkeacuteho množstva DNA nahradeneacute využitiacutem STR

STR - kraacutetke tandemoveacute repetiacutecie suacute v kriminalistike najčastejšie použiacutevanyacutem polymorfizmom STR lokusy suacute rozmiestneneacute po celom genoacuteme repetiacutecia obsahuje jednu až šesť baacutez pričom jej opakovaniacutem vznikne STR v rozsahu od 50 do 300bp V našom genoacuteme suacute tisiacutece STR ktoreacute mocircžu byť použiteacute pre forenznuacute analyacutezu V kriminalistike sa v suacutečasnosti na identifikaacuteciu osocircb použiacuteva 13 STR locusov ktoreacute patria k medzinaacuterodne uznaacutevanyacutem štandardom Z iniciatiacutevy FBI bola vytvorenaacute databaacuteza CODIS (Combined DNA Index System) každaacute krajina maacute svoju databaacutezu CODIS kde je možneacute vložiť a archivovať DNA profily jednotlivcov ako aj profily DNA ziacuteskanyacutech z miest kriminaacutelneho činu v databaacuteze je ich možneacute navzaacutejom porovnať a tak zistiť pocircvodcu trestneacuteho činu Medzinaacuterodnaacute jednotnosť v použiacutevaniacute CODIS STR lokusov umožňuje v priacutepade potreby vzaacutejomneacute porovnanie DNA profilov zistenyacutech na uacutezemiacute rocircznych štaacutetov CODIS STR lokusov je 13 a suacute to CSF1PO FGA TH01 TPOX VWA D3S1358 D5S818 D7S820 D8S1179 D13S317 D16S539 D18S51 a D21S11 Zistenie DNA profilu sa uskutočniacute multiplexnou PCR reakciou s fluorescenčne značenyacutemi primermi špecifickyacutemi pre konkreacutetny STR Naacutesledne suacute PCR produkty analyzovaneacute kapilaacuternou elektroforeacutezou genetickyacutem analyzaacutetorom ktoryacute rozliacuteši amplifikovaneacute fragmenty na zaacuteklade fluorescencie a dĺžky (fragmentačnaacute analyacuteza) (obr 26 Tab 3) DNA profil každeacuteho človeka je jedinečnyacute rovnakyacute profil mocircžu mať len jednovaječneacute dvojčataacute

28

Obr 26 Ukaacutežka DNA profilu človeka 15 STR lokusov s určeniacutem pohlavia pomocou lokusu pre amelogeniacuten (ženskeacute pohlavie - XX) maleacute oranžoveacute piacuteky predstavujuacute fragmenty veľkostneacuteho štandardu Tabuľka č 3 Zaacutepis DNA profilu človeka z obraacutezka č 26 15 STR lokusov s určeniacutem pohlavia pomocou lokusu pre amelogeniacuten System Alela 1 Alela 2

D3S1358 16 17

TH01 9 93 D21S11 28 28

D18S51 15 18

Penta E 7 14 D5S818 9 12

D13S317 8 11

D7S820 8 11 D16S539 11 12

CSF1PO 10 11

Penta D 11 12 vWA 15 18

D8S1179 13 16

TPOX 8 9 FGA 20 21

amel X X

29

5 MLPA

Multiplexnaacute amplifikaacutecia proacuteb zaacutevislaacute od ligaacutecie (z angl multiplex ligation-dependent probe amplification) je metoacuteda schopnaacute v jednej reakcii (v jednej skuacutemavke a vzorke) detegovať zmeny v počte až 50 nukleotidovyacutech sekvenciiacute Metoacutedou MLPA je možneacute ryacutechlo identifikovať amplifikaacutecie (duplikaacutecie) a deleacutecie veľkeacuteho počtu geacutenov či už použitiacutem DNA alebo mRNA krvnyacutech vzoriek alebo vzoriek z naacutedorov

Princiacutep MLPA spočiacuteva v multiplexnej amplifikaacutecii 50 špecifickyacutech nukleotidovyacutech sekvenciiacute použitiacutem jedneacuteho paacuteru primerov pričom jeden primer je fluorescenčne označenyacute Vyacutesledneacute PCR produkty suacute analyzovaneacute kapilaacuternou elektroforeacutezou (fragmentačnaacute analyacuteza) Dĺžka každeacuteho namnoženeacuteho produktu je jedinečnaacute narastaacute postupne o 6 alebo 9 nukleotidov pričom produkty PCR suacute 120 ndash 500 nukleotidov dlheacute Tento veľkostnyacute rozsah PCR fragmentov (dĺžka 120-500 nukleotidov s naacuterastom postupne o 6 alebo 9 nukleotidov) je optimaacutelny pre kapilaacuternu elektroforeacutezu MLPA multiplexnaacute PCR prebieha za použitia iba jedineacuteho paacuteru primerov ktoreacute amplifikujuacute špecifickeacute sekvencie Trik spočiacuteva v tom že nedochaacutedza k amplifikaacutecii DNA sekvencie ale MLPA proacuteb ktoreacute suacute pridaneacute k vzorkaacutem Každaacute MLPA proacuteba pozostaacuteva z dvoch oligonukleotidov (dve hemiproacuteby) pričom každyacute oligonukleotid obsahuje jednu zo sekvencie rozpoznaacutevanuacute PCR primermi Proacuteba vznikne jedine za predpokladu hybridizaacutecie dvoch oligonukleotidov (hemiproacuteb) k cieľovej sekvencii (geacutenu) a po ligaacutecii enzyacutemom ligaacutezou Iba ligovaneacute proacuteby suacute exponenciaacutelne amplifikovaneacute pomocou jedneacuteho paacuteru primerov Množstvo zligovanyacutech proacuteb teda zaacutevisiacute od množstva cieľovyacutech sekvenciiacute (geacutenov) vo vzorke

Postup MLPA analyacutezy je nasledovnyacute (obr27) K vzorke nukleovej kyseliny (DNA resp mRNA) sa pridaacute zmes 50 jedinečnyacutech proacuteb každaacute

proacuteba je komplementaacuterna k určitej cieľovej sekvencii NK vzorky Každaacute proacuteba však pozostaacuteva z dvoch oligonukleotidov hybridizujuacutecich vedľa seba zaacuteroveň každyacute oligonukleotid (hemiproacuteba) obsahuje pridanuacute sekvenciu rozpoznaacutevanuacute paacuterom PCR primerov Po hybridizaacuteciiacute oligonukleotidov (hemiproacuteb) dochaacutedza k ich ligaacutecii ligaacutezou Ligačnaacute reakcia je tak špecifickaacute že je schopnaacute rozliacutešiť sekvenciu liacutešiacu sa v jednom nukleotide Vyacuteslednyacute ligačnyacute produkt (proacuteba) obsahuje obidve sekvencie pre PCR primery na jednom fragmente čiže mocircže docircjsť k namnoženiu takeacutehoto fragmentu PCR reakciou V priacutepade ak nedocircjde k ligaacutecii priacuteslušnyacutech hemiproacuteb pretože hemiproacuteby nenaacutejdu cieľovuacute sekvenciu na DNA každaacute takaacuteto nezligovanaacute hemiproacuteba maacute len jednu sekvenciu rozpoznaacutevanuacute len jednyacutem PCR primerom v docircsledku čoho nemocircže prebehnuacuteť jej PCR amplifikaacutecia a počas fragmentačnej analyacutezy nie je detegovanaacute pretože negeneruje fluorescenčnyacute signaacutel

Pri MLPA analyacuteze je docircležiteacute okrem MLPA amplifikaacutecie vzorky urobiť aj MLPA amplifikaacuteciu referenčnej vzorky ku ktorej sa bude porovnaacutevať počet geacutenov (cieľovyacutech sekvenciiacute) Po kapilaacuternej elektroforeacuteze MLPA referenčnej a skuacutemanej vzorky porovnaniacutem obsahu nameranyacutech hodnocirct tzv piacutekov priacuteslušnyacutech proacuteb sa určiacute relatiacutevny počet koacutepiiacute v skuacutemanej vzorke

MLPA

1 DNA denaturaacutecia a hybridizaacutecia s MLPA proacutebami (hemiproacuteby)

2 Ligaacutecia (vytvorenie kompletnyacutech proacuteb)

3 PCR amplifikaacutecia proacuteb paacuterom primerov

4 Kapilaacuterna elektroforetickaacute separaacutecia PCR produktov

5 Analyacuteza daacutet

30

Obr 27 Princiacutep MLPA

Firma MRC-Holland v suacutečasnosti ponuacuteka stovky MLPA setov proacuteb ktoreacute suacute vhodneacute na 1) diagnostiku kongenitaacutelnych a dedičnyacutech ochoreniacute 2) zisťovanie profilu naacutedorov 3) zisťovanie metylačneacuteho profilu

MLPA je metoacuteda vhodnaacute na detekciu malyacutech prestavieb (BRCA1 BRCA2 MSH2 atď)

veľkyacutech chromozoacutemovyacutech prestavieb (Williamsov syndroacutem Prader-WilliAngelman syndroacutem atzď)

31

detekciu zmien v počte koacutepii geacutenov (obr 28 29) ako aj zistenie počtu kompletnyacutech chromozoacutemov (chromozoacutem 13 18 21 XY tiež aj z amniovej tekutiny) diagnostiku naacutedorov (zmeny počtu pri ALL CLL atď) kvantifikaacuteciu metylaacutecie (Prader-WilliAngelmanov syndroacutem Fragilnyacute X inaktivaacutecia naacutedorovyacutech supresorovyacutech geacutenov atď) mRNA analyacutezu geacutenov zuacutečastňujuacutecich sa apoptoacutezy alebo zaacutepalov

MS-MLPA (Methylation-Specific MLPA) je varianta MLPA určenaacute špeciaacutelne na analyacutezu aberantnyacutech metylaacutecii imprintovanyacutech oblastiacute ako aj detekciu metylačnyacutech zmien CpG ostrovčekov lokalizovanyacutech bliacutezko promoacutetora Rozdiel oproti štandardnej MLPA spočiacuteva v použitiacute metylačne senzitiacutevneho restrikčneacuteho enzyacutemu HhaI ktoryacute štiepi MS-MLPA proacuteby hybridizovaneacute k nemetylovanej sekvencii Každaacute DNA vzorka určenaacute pre MS-MLPA analyacutezu prejde dvoma reakciami v jednej mikroskuacutemavke štandardnou MLPA analyacutezou (bez štiepenia metylačne senzitiacutevnym enzyacutemom) a v druhej mikroskuacutemavke docircjde okrem ligaacutecie proacuteb aj k metylačne senzitiacutevnemu štiepeniu hybridizovanyacutech proacuteb s nemetylovanou DNA Amplifikujuacute sa len ligovaneacute proacuteby po PCR amplifikaacutecii sa fragmentačnou analyacutezou porovnaniacutem oboch reakciiacute zistia rozdiely v metylačnom profile vzorky k referenčnej vzorke

RT-MLPA (Reverse Transkriptase MLPA) je variaacutecia MLPA určenaacute pre zistenie mRNA profilu vzorky je alternatiacutevou k real-time PCR a mikročipom RT-MLPA nedeteguje mRNA množstvo priamo pretože použiacutevanaacute ligaacuteza nie je schopnaacute ligovať DNA oligonukleotidy keď suacute hybridizovaneacute s RNA Preto RT-MLPA začiacutena reverznou transkripciou so špeciaacutelne navrhnutyacutemi RT primermi tak aby vytvorili kraacutetke oligonukleotidy (cDNA) Potom reakcia pokračuje ako štandardnaacute MLPA

Obr 28 MLPA analyacuteza geacutenu DMD (koacutedujuacuteceho dystrofiacuten) mutaacutecie ktoreacuteho spocircsobujuacute Duchennovu svalovuacute dystrofiu u pacienta je priacutetomnaacute deleacutecia exoacutenu 45 v porovnaniacute s referenčnou vzorkou ndash kontrolou

32

Obr 29 MLPA analyacuteza geacutenu DMD (koacutedujuacuteceho dystrofiacuten) mutaacutecie ktoreacuteho spocircsobujuacute Duchennovu svalovuacute dystrofiu u pacienta suacute priacutetomneacute duplikaacutecie exoacutenov 41 42 43 44 45 (piacuteky vo vzorke pacienta sa porovnajuacute s piacutekmi v kontrole ndash referenčnej vzorke)

33

6 Sekvenovanie

Sekvenovaniacutem rozumieme určenie primaacuternej štruktuacutery DNA teda určenie poradia nukleotidov v reťazci DNA Začiatky moderneacuteho sekvenovania siahajuacute do roku 1977 kedy boli objaveneacute dve metoacutedy sekvenovania 1) chemickaacute metoacuteda Maxama a Gilberta 2) enzymatickaacute metoacuteda Sangera Nicklena a Coulsona

Princiacutep obidvoch metoacuted sekvenovania spočiacuteva v tom že sa vytvoriacute suacutebor DNA molekuacutel s rocircznou veľkosťou ktoreacute suacute zakončeneacute konkreacutetnym nukleotidom tieto DNA molekuly sa elektroforeticky separujuacute v geacuteloch s rozlišovacou schopnosťou 1 nukleotid 61 Chemickaacute metoacuteda

DNA molekuly sa na 5-konci raacutedioaktiacutevne označia raacutedioaktiacutevnym fosforom a naacutesledne sa chemicky modifikujuacute špecificky pre každuacute baacutezu DNA sa potom v modifikovanyacutech miestach štiepi čiacutem vzniknuacute rocirczne dlheacute fragmenty pričom podmienky suacute nastaveneacute tak aby sa DNA na každom mieste štiepila len raz Modifikaacutecia DNA a štiepenie prebehne v štyroch separaacutetnych reakciaacutech (skuacutemavkaacutech) takže po elektroforetickej separaacuteciiacute takto opracovanej DNA v štyroch draacutehach polyakrylamidoveacuteho geacutelu a naacuteslednej autoraacutediografii (podobne ako pri Southernovej hybridizaacutecii) je možneacute odčiacutetať nukleotidovuacute sekvenciu približne 100 nukleotidov od raacutedioaktiacutevneho označenia (v čase objavu Maxama a Gilberta) 62 Sangerova metoacuteda

Zaacuteklady metoacutedy boli popiacutesaneacute už v roku 1975 (metoacuteda plus a miacutenus) ale až vylepšenie použitiacutem dideoxynukleotidov (ddNTP) v roku 1977 došlo k zjednodušeniu sekvenovania Princiacutepom enzyacutemoveacuteho sekvenovania je terminaacutecia (zastavenie) polymerizaacutecie inkorporaacuteciou 2´ 3 -dideoxynukleotidov do novosyntetizujuacuteceho sa vlaacutekna DNA Keďže ddNTP neobsahujuacute hydroxylovuacute skupinu na 3 uhliacuteku riboacutezy nemocircžu sa zuacutečastniť na tvorbe fosfodiesterovej vaumlzby nemocircže sa pripojiť k nim ďalšiacute nukleotid čiže musiacute docircjsť k terminaacuteciiacute polymeraacutecie Reakcia prebieha v štyroch skuacutemavkaacutech s raacutedioaktiacutevne značenyacutem primerom V každej skuacutemavke suacute priacutetomneacute všetky štyri deoxynukleotidtrifosfaacutety (dNTP) ale pre každuacute skuacutemavku je špecifickyacute priacutedavok maleacuteho množstva jedneacuteho z dideoxynukleotidtrifosfaacutetov (v prvej skuacutemavke je ddATP v druhej ddCTP v tretej ddTTP a vo štvrtej ddGTP) Maleacute množstvo ddNTP spocircsobiacute že pri polymerizaacutecii dochaacutedza k prednostneacutemu zaradeniu štandardnyacutech dNTP do narastajuacuteceho reťazca a len občas sa inkorporuje ddNTP čiacutem sa zastaviacute synteacuteza reťazca V každej skuacutemavke tak vznikne suacutebor DNA fragmentov rocircznych veľkostiacute zakončenyacutech priacuteslušnyacutem ddNTP (v prvej skuacutemavke ddATP v druhej ddCTP v tretej ddTTP a vo štvrtej ddGTP) Po elektroforetickej separaacutecii v 4 draacutehach polyakrylamidoveacuteho geacutelu a autoraacutediografii sa z autoraacutediogramu odčiacuteta sekvencia

V suacutečasnosti je sekvenovanie do značnej miery automatizovaneacute pričom využiacuteva princiacutep Sangerovej enzyacutemovej metoacutedy s určityacutemi obmenami Uacutesek DNA ktoryacute treba sekvenovať sa prostredniacutectvom termostabilnyacutech DNA polymeraacutez namnožiacute PCR metoacutedou po ktorej nasleduje sekvenačnaacute reakcia (asymetrickaacute PCR) s fluorescenčne značenyacutemi ddNTP (každyacute druh označenyacute inyacutem fluorescenčnyacutem farbivom) Sekvenačnaacute reakcia prebieha v jednej skuacutemavke s jednyacutem primerom vznikne tak suacutebor jednovlaacuteknovyacutech DNA rocircznej dĺžky ktoreacute suacute na 3konci označeneacute ddNTP so špecifickyacutem fluorescenčnyacutem farbivom Taacuteto metoacuteda sekvenovania sa tiež nazyacuteva rdquodye-terminator cycle sequencingrdquo(obr 30) Po kapilaacuternej elektroforeacuteze vzorky v genetickom analyzaacutetore zaznamenaacutevaniacute fluorescencie jednotlivyacutech fragmentov CCD kamerou a softveacuterovom spracovaniacute sa ziacuteska sekvencia DNA (obr 31)

34

Obr 30 Princiacutep sekvenovania Sangerova dideoxy metoacuteda alebo tzv chain termination method (reťazec zastavujuacuteca metoacuteda) Obr 31 Určenie genotypu plodu a rodičov sekvenčnou analyacutezou DNA ziacuteskanej z plodovej vody (prenataacutelna diagnostika) a perifeacuternej krvi sekvenčnaacute analyacuteza geacutenu ASPA vyacutesledok u plodu priacutetomnaacute mutaacutecia c 914CgtA v homozygotnom stave (AA) rodičia heterozygoti (AC) Uvedenaacute mutaacutecia je v homozygotnom stave kauzaacutelnou priacutečinou Canavanovej choroby

Automatizovaneacute sekvenovanie prinaacuteša viacereacute vyacutehody oproti klasickej Sangerovej metoacutede vyššiu presnosť a ryacutechlosť v jednej sekvenačnej reakcii možnosť osekvenovať až 1200 nukleotidovyacute fragment maleacute množstvo templaacutetu potrebneacute na analyacutezu

35

63 Next Generation Sequencing (NGS)

NGS (sekvenovanie novej generaacutecie) maacute obrovskyacute potenciaacutel v analyacuteze genoacutemov pričom toto označenie zahŕňa viacereacute technologickeacute metoacutedy reprezentovaneacute niekoľkyacutemi firmami Princiacutepom je masiacutevne paralelneacute sekvenovanie čiacutem sa ziacuteskajuacute raacutedovo tisiacutece až milioacuteny sekvenciiacute naraz 631 Sekvenovanie druhej generaacutecie

Na začiatku sa analyzovanaacute DNA vo vaumlčšine priacutepadov fragmentuje (vznikne tak DNA

knižnica) na fragmenty sa pripoja kraacutetke sekvencie ndash adapteacutery naacutesledne sa tieto fragmenty rocircznymi priacutestupmi amplifikujuacute a určiacute sa ich sekvencia Vďaka čiastočnyacutem prekryvom je zo ziacuteskanyacutech sekvencii možneacute poskladať plynuluacute sekvenciu zodpovedajuacutecu pocircvodnej nefragmentovanej DNA

Pyrosekvenovanie je podobne ako Sangerova metoacuteda založenaacute na princiacutepe synteacutezy komplementaacuterneho vlaacutekna DNA avšak rozdiel je v tom že sa na detekciu inkorporaacutecie nukleotidu využiacuteva inyacute systeacutem tvorby luminiscenčneacuteho signaacutelu v priebehu reakcie Pyrosekvenovanie je umožneneacute vďaka aktivite 4 enzyacutemov - DNA polymeraacutezy ATP sulfurylaacutezy luciferaacutezy a apyraacutezy Reakčnaacute zmes obsahuje aj ďalšie komponenty - enzymatickeacute substraacutety adenoziacutenfosfosulfaacutet (APS) d-luciferiacuten sekvenovanyacute templaacutet a cyklicky postupne po jednom type pridaacutevaneacute nukleotidtrifosfaacutety Po zabudovaniacute nukleotidu do novovznikajuacuteceho reťazca docircjde k uvoľneniu pyrofosfaacutetu naacutesledne je využityacute ATP sulfurylaacutezou na synteacutezu ATP z APS počas ďalšej reakcie docircjde k využitiu ATP luciferaacutezou na premenu luciferiacutenu na oxyluciferiacuten čo spocircsobiacute svetelnyacute signaacutel a ten zaznamenaacute detekčnyacute systeacutem Poslednou enzymatickou reakciou je reakcia apyraacutezy ktoraacute odstraacuteni nezainkorporovaneacute nukleotidy a nevyužiteacute ATP aby sa celyacute proces mohol zopakovať s reakčnou zmesou obsahujuacutecou ďalšiacute nukleotidtrifosfaacutet (inyacute ako v predchaacutedzajuacutecej reakcii) Po každej reakcii detektor zaznamenaacuteva emisiu svetla na zaacuteklade intenzity svetla je možneacute určiť či bol vradenyacute priacuteslušnyacute nukleotidtrifosfaacutet či bol inkorporovanyacute jeden priacutepadne viac rovnakyacutech nukleotidtrifosfaacutetov

Zvyacutešenie vyacutekonu pyrosekvenovania umožnila tzv emulznaacute PCR v mikročasticiach a použitie platničky PicoTiterPlatereg toto sekvenovanie zaviedla firma Roche pod pojmom 454 pyrosekvenovanie v roku 2005 Na začiatku sa DNA fragmentuje na uacuteseky dlheacute 400-600 baacutez dvojvlaacuteknovaacute fragmentovanaacute DNA sa liguje s adapteacutermi prostredniacutectvom nich sa naviaže na mikročastice dvojvlaacuteknoveacute fragmenty sa oddelia mikročastice s naviazanyacutemi jednovlaacuteknovyacutemi fragmentami sa premiešajuacute so zmesou oleja a roztoku ktoryacute obsahuje všetky komponenty na uacutespešnuacute PCR Tyacutemto spocircsobom sa okolo každej mikročastice vytvoriacute vlastnyacute mikroreaktor v ktorom prebehne amplifikaacutecia fragmentu Po PCR reakcii sa mikročastice prenesuacute do platničky PicoTiterPlate v ktorej sa do jamky zmestiacute akuraacutet jedna mikročastica a reakčneacute komponenty pyrosekvenačnej reakcie PicoTiterPlatereg maacute 1 600 000 jamiek každaacute jamka maacute maximaacutelny objem 75 picolitra Platnička s mikročasticami sa vložiacute do sekvenačneacuteho systeacutemu ndash priacutestroja v ktorom sa celeacute pyrosekvenovanie uskutočniacute Chemiluminiscenčneacute signaacutely ktoryacutech počas sekvenovania vznikajuacute milioacuteny v priebehu hodiny suacute zachyteneacute CCD kamerou a analyzovaneacute softveacuterom

Firma Illumina predstavila inuacute technoloacutegiu PCR amplifikaacutecia a sekvenovanie sa uskutočňuje na skliacutečku (flow cell) Fragmentaacutecia DNA a pripojenie adapteacuterov prebieha za uacutečasti transpozoacutemov v procese nazvanom tagmentaacutecia Po hybridizaacutecii fragmentov DNA na skliacutečko prebehne v klastroch PCR amplifikaacutecia (tzv mostiacutekovaacute amplifikaacutecia) sekvenaacutecia prebieha za uacutečasti rozdielne fluorescenčne značenyacutech a chemicky modifikovanyacutech nukleotidov pričom každyacute nukleotid emituje fluorescenciu s inou vlnovou dĺžkou Na skliacutečku prebieha paralelne až 6 miliaacuterd sekvenaacutecii (obr 32)

Ďalšiacutemi možnosťami sekvenovania druhej generaacutecie je systeacutem SOLid (vyvinutyacute firmou Applied Biosystem dnes pod Thermo Fisher Scientific) a Ion Semiconductor Sequencing ndash polovodičoveacute ioacutenoveacute sekvenovanie (od firmy Ion Semiconductor Sequencing v suacutečasnosti Thermo Fisher Scientific)

36

Obr 32 Princiacutep sekvenovania novej generaacutecie od firmy Illumina PCR amplifikaacutecia a sekvenovanie sa uskutočňuje na skliacutečku (flow cell) paralelne prebieha až 6 miliaacuterd sekvenaacutecii

632 Sekvenovanie tretej generaacutecie

Pred sekvenovaniacutem netreba amplifikovať DNA PCR metoacutedou ale sekvencia sa ziacuteskava zachyteniacutem signaacutelu v reaacutelnom čase Medzi sekvenovanie tretej generaacutecie patriacute SMRT (Single Molecule Real-Time Sequencing) a Nanopore Sequencing

37

7 Fragmentačnaacute analyacuteza DNA

Je metoacuteda použiacutevanaacute na určenie veľkosti fragmentov DNA ziacuteskanyacutech PCR reakciou Dĺžka amplifikovanyacutech DNA fragmentov sa zistiacute ich porovnaniacutem s veľkostnyacutem štandardom (obr 33) ktoryacute je tvorenyacute DNA fragmentami znaacutemej dĺžky Veľkostnyacute štandard je pred kapilaacuternou elektroforeacutezou zmiešanyacute so vzorkou DNA fragmenty veľkostneacuteho štandardu suacute fluorescenčne označeneacute pričom použiteacute fluorescenčneacute farbivo je ineacute ako fluorescenčneacute farbivo použiteacute na označenie DNA fragmentov vo vyšetrovanej vzorke

Obr 33 Elektroforetogram veľkostneacuteho štandardu použiacutevaneacuteho na určenie veľkostiacute fragmentov analyzovanyacutech kapilaacuternou elektroforeacutezou v genetickom analyzaacutetore (GeneScantrade 500 LIZtrade dye Size Standard) dĺžka fragmentov v nukleotidoch (napr 50 nukleotidov)

Fragmentačnaacute analyacuteza pozostaacuteva z viaceryacutech krokov Prvyacutem je izolaacutecia DNA nasleduje PCR amplifikaacutecia počas ktorej sa novosyntetizovaneacute DNA fragmenty označia fluorescenčnyacutemi farbivami Vzorka s PCR produktom sa pripraviacute na kapilaacuternu elektroforeacutezu tak že sa zmieša s veľkostnyacutem štandardom (sluacuteži na určenie veľkosti fragmentov) a denaturačnou laacutetkou (formamid) nasleduje denaturaacutecia Pripraveneacute vzorky suacute injektovaneacute do priacutestroja (genetickyacute analyzaacutetor) kde v kapilaacutere naplnenej polymeacuterom v elektrickom poli migrujuacute fluorescenčne značeneacute fragmenty DNA na zaacuteklade veľkosti (kapilaacuterna elektroforeacuteza) Počas elektroforeacutezy genetickyacute analyzaacutetor zaznamenaacuteva fluorescenciu fragmentov Analyacutezou daacutet prostredniacutectvom špeciaacutelnych softveacuterov sa ziacuteskajuacute elektroforetogramy z ktoryacutech je možneacute zistiť veľkosť fragmentov ako aj typ fluorescencie (docircležiteacute ak suacute genetickeacute varianty rozliacutešiteľneacute rocircznou fluorescenciou napr SNaPshot) Fragmentačnaacute analyacuteza je suacutečasťou množstva molekulaacuterno-genetickyacutech metoacuted (pozri obr 12 26 28 29 34) ako suacute napr STR analyacuteza (Short Tandem Repeat) AFLP analyacuteza (Amplified Fragment Lenght Polymorfism) RFLPT-RFLP analyacuteza (Restriction Fragment Lenght PolymorfismTerminal Restricted Fragment Lenght Polymorfism) SSCP (Single Strand Conformation Polymorfism) VNTR (Variable Number of Tandem Repeat) analyacuteza straty heterozygotnosti (LOH loss of heterozygozity) MLPA (Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification) MSMSA (Methylation-Sensitive Mobility Shift Assay) SNP genotypovanie (SNaPshotreg) HiCEP (High-Coverage Expression Profiling)

38

Obr 34 Kvantitatiacutevna fragmentačnaacute PCR analyacuteza (QF-PCR) DNA izolovanej z plodovej vody vyacutesledok prenataacutelnej analyacutezy = priacutetomnosť troch piacutekov pre chromozoacutem 18 (u všetkyacutech fragmentov detegujuacutecich chromozoacutem 18 je pomer vyšetrovanyacutech markerov aberantnyacute 21 resp 111) čo znamenaacute trizoacutemiu chromozoacutemu 18 Edwardsov syndroacutem

39

8 Metoacutedy založeneacute na princiacutepe hybridizaacutecie

Nukleoveacute kyseliny majuacute schopnosť vytvaacuterať dvojvlaacuteknoveacute reťazce z jednovlaacuteknovyacutech molekuacutel na zaacuteklade komplementarity baacutez Komplementarita baacutez umožňuje replikaacuteciu DNA transkripciu RNA komplementarita baacutez zabezpečuje teda reprodukovateľnosť živej hmoty

Hybridizaacutecia je proces v ktorom na zaacuteklade komplementarity baacutez dochaacutedza k vytvoreniu dvojvlaacuteknovej nukleovej kyseliny z dvoch jednovlaacuteknovyacutech molekuacutel DNA alebo RNA alebo ich kombinaacuteciou DNA RNA pričom kratšia jednovlaacuteknovaacute nukleovaacute kyselina vystupuje ako sonda (proacuteba) Hybridizaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten je jeden z najpoužiacutevanejšiacutech naacutestrojov v molekulaacuternej bioloacutegii a genetike (hybridizaacutecia primerov alebo proacuteb sa využiacuteva v takmer každej metoacutede - v PCR RT-PCR qPCR RT-qPCR MLPA sekvenovaniacute fragmentačnej analyacuteze FISH DNA mikročipoch atď)

Denaturaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten je proces pri ktorom dochaacutedza k porušeniu vodiacutekovyacutech vaumlzieb medzi vlaacuteknami nukleovyacutech kyseliacuten (strata sekundaacuternej a terciaacutelnej štruktuacutery) tak že docircjde k ich uacuteplneacutemu oddeleniu vzniknuacute jednovlaacuteknoveacute reťazce Denaturaacutecia NK mocircže byť spocircsobenaacute vplyvom vysokyacutech teplocirct pH alebo chemickyacutech laacutetok (denaturačneacute činidlaacute) Renaturaacutecia je opačnyacute proces v ktorom na zaacuteklade komplementarity dochaacutedza k tvorbe dvojvlaacuteknovyacutech NK

Hybridiza čnaacute sonda (proacuteba) je jednovlaacuteknovaacute nukleovaacute kyselina určitej znaacutemej dĺžky a sekvencie (najčastejšie DNA pretože je stabilnejšia ako RNA) ktoraacute je značenaacute a sluacuteži na detekciu komplementaacuternych molekuacutel DNA alebo RNA v procese hybridizaacutecie V zaacutevislosti od podmienok hybridizaacutecie (stringencia) mocircže byť detegovanaacute sekvencia uacuteplne komplementaacuterna alebo v menej priacutesnych podmienkach mocircže mať sekvenčneacute odchyacutelky Proacuteba sluacuteži na vyhľadanie a zviditeľnenie cieľovyacutech NK Zviditeľnenie sa deje prostredniacutectvom označenia proacuteby ešte pred hybridizaacuteciou Značenie proacuteby mocircže byť raacutedioaktiacutevne a neraacutedioaktiacutevne (najčastejšie fluorescenčneacute)

Raacutedioaktiacutevne značeneacute proacuteby pomocou izotopov (32P) sa využiacutevali viac v minulosti v suacutečasnosti suacute kvocircli zdravotnyacutem rizikaacutem ohľaduplnosti k životneacutemu prostrediu ako aj kvocircli jednoduchšej manipulaacutecii použiacutevaneacute fluorescenčne značeneacute proacuteby Raacutedioaktiacutevne značeneacute sondy boli použiacutevaneacute hlavne metoacutedou Southernovej hybridizaacutecie (Southern blotting Southern blot) Citlivosť raacutedioaktiacutevne značenyacutech proacuteb je vyššia dosahuje schopnosť zachytiť 10 fg (femtogram 10-15) cieľovej DNA sekvencie 81 Southern blot

Metoacutedu objavil v roku 1975 britskyacute bioloacuteg Edwin Southern (preto Southern) Pri Southernovej hybridizaacutecii sa restrikčne štiepeneacute fragmenty DNA elektroforeticky separujuacute v geacuteli potom sa metoacutedou blottingu prenesuacute na nylonovuacute alebo nitroceluloacutezovuacute membraacutenu kde suacute naacutesledne hybridizovaneacute v roztoku obsahujuacutecom raacutedioaktiacutevne značenuacute sondu Priloženiacutem fotografickeacuteho filmu k membraacutene a vyvolaniacutem filmu autoraacutediografiou docircjde k zviditeľneniu lokaliacutet kde došlo k hybridizaacuteciiacute raacutedioaktiacutevne značenej sondy s fragmentom DNA (autoraacutediogram) Southern blot bol kľuacutečovou a prvou metoacutedou na identifikaacuteciu osocircb (DNA fingerprinting DNA pofiling) (obr 35)

Okrem Southern blotu existuje Northern blot na analyacutezu RNA (geacutenovej expresie) a Western blot na analyacutezu proteiacutenov postup je obdobnyacute ako pri Southern blote s obmenami špecifickyacutemi pre konkreacutetny blot Pri Northern blote sa použiacutevajuacute hybridizačneacute proacuteby ale pre vizualizaacuteciu proteiacutenov western blotom je potrebneacute použiť protilaacutetky s naacuteslednou vizualizaacuteciou Pomenovanie techniacutek je hra so sloviacutečkami (keďže paacuten Northern ani Western neobjavili takto nazvaneacute techniky)

Neraacutedioaktiacutevne značenie proacuteb použiacutevanyacutech v molekulaacuternej genetike mocircže byť nepriame (použitie haptenu) alebo priame Konečnaacute vizualizaacutecia je najčastejšie zabezpečenaacute fluoreskujuacutecimi farebnyacutemi značkami farbivami fluorochroacutemami (fluorofoacuterami) Pri priamom značeniacute je farbička kovalentne naviazanaacute na nukleotid a na zachytenie fluorescencie suacute potrebneacute špeciaacutelne priacutestroje umožňujuacutece excitaacuteciu farbičky ktoraacute potom emituje žiarenie určitej vlnovej dĺžky (emisneacute žiarenie) a to zachytiacute detekčnyacute systeacutem priacutestroja Využitie fluorochroacutemov v molekulaacuternej genetike je masiacutevne napr na vizualizaacuteciu NK elektroforeticky separovanyacutech v geacuteli kvantifikaacuteciu produktov PCR reakcie v priacutestroji real-time PCR cykleacuter sekvenovaniacute fragmentačnej analyacuteze FISH DNA mikročipoch atď

40

Obr 35 Princiacutep Southern blotu

82 FISH (fluorescenčnaacute in situ hybridizaacutecia)

FISH (fluorescent in situ hybridization fluorescenčnaacute in situ hybridizaacutecia) metoacuteda patriacute medzi molekulovo-cytogenetickeacute techniky Princiacutep FISH metoacutedy je založenyacute na hybridizaacuteciiacute fluorescenčne značenyacutech proacuteb ku komplementaacuternym uacutesekom vyšetrovanej DNA na podložnom skle (priamo na mieste - in situ) K denaturaacutecii dsDNA dochaacutedza buď vplyvom denaturačnyacutech činidiel alebo zvyacutešenou teplotou a naacuteslednou renaturaacuteciou dochaacutedza k naviazaniu sondy na komplementaacuterny uacutesek DNA Vyacutesledok hybridizaacutecie sa vizualizuje fluorescenčnyacutem mikroskopom vybavenyacutem vhodnyacutemi fluorescenčnyacutemi filtrami a vizuaacutelne zhodnotiacute skuacutesenyacutem odborniacutekom Fluorescencia sa v niektoryacutech priacutepadoch mocircže zaznamenať a hodnotiť aj pomocou softveacuteru (obr 36)

Pomocou FISH detegujeme numerickeacute aberaacutecie - zmeny v počte chromozoacutemov (napr trizoacutemia monozoacutemia chromozoacutemov) alebo štruktuacuterne aberaacutecie a prestavby (napr translokaacutecie inverzie deleacutecie duplikaacutecie amplifikaacutecie) FISH metoacuteda umožňuje identifikaacuteciu a detekciu každeacuteho ľudskeacuteho chromozoacutemu jeho zaradenie do karyotypu odhalenie malyacutech submikroskopickyacutech chromozoacutemovyacutech zmien a tiež mapovať poziacutecie jednotlivyacutech geacutenov na chromozoacuteme

41

Obr 36 Princiacutep štandardnej FISH a FISH maľovania celeacuteho chromozoacutemu

Veľkou vyacutehodou FISH metoacutedy je možnosť analyacutezy buniek v metafaacuteze aj v interfaacuteze kedy nie je nutnaacute kultivaacutecia buniek a tiež ryacutechle analyzovanie veľkeacuteho počtu buniek (stovky až tisiacutece) K ďalšiacutem vyacutehodaacutem patriacute bezpečnosť vysokaacute citlivosť dostatočnaacute stabilita relatiacutevne kraacutetky čas hybridizaacutecie a možnosť ryacutechleho vyhodnotenia Hybridizaacutecia pri vaumlčšine suacutečasne dodaacutevanyacutech sond trvaacute 10-12 hodin (na trhu suacute už dostupneacute aj sondy so skraacutetenyacutem časom hybridizaacutecie na 2-3 hodiny) Po hybridizaacuteciiacute nasleduje odmyacutevanie kedy pri priacuteslušnej teplote dochaacutedza k odmytiu nenaviazanyacutech a nespraacutevne hybridizovanyacutech sond Preparaacutet sa naacutesledne podfarbiacute a vyacutesledok sa zhodnotiacute vo fluorescenčnom mikroskope Na podfarbenie chromozoacutemov alebo jadier sa použiacuteva modreacute kontrastneacute farbivo DAPI (46-diamidino-2-fenylindol) ktoreacute maacute silneacute fluorescenčneacute vlastnosti dokaacuteže prechaacutedzať jadrovou membraacutenou a viazať sa na DNA Vyacutesledkom je modreacute zafarbenie ktoreacute vyacuteborne kontrastuje so signaacutelmi jednotlivyacutech sond

Limitujuacutecim faktorom FISH je možnosť identifikaacutecie len tyacutech uacutesekov DNA ku ktoryacutem suacute použiteacute sondy V jednej analyacuteze je možneacute použiť najviac 3 odlišne značeneacute sondy a tak zistiť priacutepadneacute abnormality len na 1 alebo na paacuter lokusoch Na relevantnuacute detekciu je potrebneacute mať vo vzorke 1-5 aberantnyacutech interfaacutezovyacutech jadier

FISH je možneacute uskutočniť na širokej škaacutele biologickeacuteho materiaacutelu na vzorkaacutech perifeacuternej krvi kostnej drene naacuteteroch choriovyacutech klkoch plodovej vode rocircznych druhov tkaniacutev natiacutevnych alebo zaliatych v parafiacutene na 1 bunke (predimplantačnaacute genetickaacute diagnostika PGD) (obr 37)

Využiacuteva sa na detekciu aberaacuteciiacute pri mnohyacutech onkologickyacutech ochoreniach (napr pri diagnoacuteze mnohopočetnyacute myeloacutem sa v suacutečasnosti po separaacutecii CD138+ buniek robiacute FISH s 5 sondami pre geacuteny IGH TP53 RB1 oblasť 1p321q21 a stanovuje sa hyperploidia chromozoacutemov 5 9 a 15) a tiež k spresneniu doplneniu a k overeniu bežneacuteho cytogenetickeacuteho vyšetrenia

Podľa miesta na chromozoacuteme na ktorom dochaacutedza k hybridizaacutecii sondy rozlišujeme 4 typy

DNA sond bull centromeacuteroveacute sondy ndash sa viažu na strednuacute časť chromozoacutemu ndash centromeacuteru sluacutežia k diagnostike zmien v počte chromozoacutemov k detekcii chromozoacutemov neznaacutemeho pocircvodu umožňujuacute interfaacuteznu FISH na nedeliacich sa bunkaacutech (obr 38-41)

42

Obr 37 Interfaacutezna FISH preimplantačnyacute genetickyacute skriacutening aneuploidiiacute ndash blastomeacutera 3-denneacuteho ľudskeacuteho embrya s normaacutelnym počtom chromozoacutemov 13 18 21 pohlavie XY použityacutech 5 sond pre chromozoacutemy 13 ndash orange 18 ndash aqua 21 ndash green X ndash blue a Y ndash yellow (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

Obr 38 Interfaacutezne jadro po hybridizaacutecii s centromeacuterovou sondou pre chromozoacutem 8 (Vysis Abbott) V pravom jadre je priacutetomnaacute trizoacutemia chromozoacutemu 8 (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex) Obr 39 Metafaacutezna (A) a interfaacutezna FISH (B) použitaacute centromeacuterovaacute sonda CEPX spectrum orangeCEPY spectrum green (Vysis Abbott) Sonda hybridizuje k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (červenyacute signaacutel) a Y (zelenyacute signaacutel) (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

43

Obr 40 Interfaacutezna FISH vyšetrenie spermiiacute použiteacute sondy CEPX greenCEPY orange (Aneuscore Metasystems) Sondy hybridizujuacute k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (zelenyacute signaacutel) Y (červenyacute signaacutel) vľavo ndash dve haploidneacute spermie (majuacutece jedna spermia X druhaacute Y chromozoacutem) vpravo ndash dve patologickeacute spermie obsahujuacutece gonozoacutemovyacute komplement XY (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

Obr 41 Interfaacutezna FISH vyšetrenie spermiiacute použiteacute sondy CEPX greenCEPY orange a CEP18 aqua (Aneuscore Metasystems) Sondy hybridizujuacute k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (zelenyacute signaacutel) Y (červenyacute signaacutel) a 18 (modryacute signaacutel) vľavo ndash normaacutelne haploidneacute ľudskeacute spermie - 1x chromozoacutem X alebo Y a jedenkraacutet chromozoacutem 18 v strede ndash patologickaacute spermia obsahujuacuteca gonozoacutemovyacute komplement XY a jeden chromozoacutem 18 vpravo ndash patologickaacute diploidnaacute spermia s chromozoacutemami X Y a dvoma chromozoacutemami 18 (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

bull lokusovo špecifickeacute sondy ndash hybridizaacutecia prebehne na konkreacutetnom mieste geacutenu (lokuse) (obr 42-44) použiacutevajuacute sa k vyšetreniu mikrodeleacuteciiacute (straty malyacutech častiacute chromozoacutemu pri mikrodelečnyacutech syndroacutemoch) k zisteniu amplifikaacutecie onkogeacutenov a niektoryacutech špecifickyacutech translokaacuteciiacute prestavby geacutenov umožňujuacute interfaacuteznu FISH na nedeliacich sa bunkaacutech bull subtelomeroveacute ndash vaumlzba na koncoveacute časti chromozoacutemu ndash telomeacutery bull celochromozoacutemoveacute alebo celomaľovacie sondy ndash sondy hybridizujuacute s mnohopočetnyacutemi chromozoacutemovyacutemi sekvenciami pričom sa fluorescenčne tak bdquovymaľujeldquo celyacute chromozoacutem (Obr 45) Použiacutevajuacute sa na vyšetrenie chromozoacutemovyacutech prestavieb k analyacuteze translokaacuteciiacute a k detekcii pocircvodu tzv marker chromozoacutemov (malyacutech nadpočetnyacutech chromozoacutemov neznaacutemeho pocircvodu) K použitiu sondy suacute potrebneacute metafaacutezne chromozoacutemy nepoužiacutevaju sa pre interfaacuteznu FISH

Pri konvenčnej chromozoacutemovej FISH suacute homogeacutenne DNA proacuteby hybridizovaneacute s fixovanyacutem metafaacuteznym alebo prometafaacuteznym chromozoacutemomchromozoacutemami na skliacutečku (Obr 36a) Maximaacutelna rozlišovacia schopnosť metafaacuteznej FISH je niekoľko megabaacutez (Obr 39a 45) využitiacutem viac

44

natiahnutyacutech prometafaacuteznych chromozoacutemov sa dosiahne 1 Mb rozliacutešenie Prostredniacutectvom fiber FISH konkreacutetne artificiaacutelne deproteinizovanej natiahnutej DNA pripravenej in situ z celyacutech buniek na mikroskopickom skliacutečku je možneacute vizualizovať individuaacutelne geacuteny maleacute DNA elementy na chromozoacuteme s rozliacutešeniacutem okolo 1000 bp

Obr 42 Interfaacutezne jadro po hybridizaacutecii s lokusovo-špecifickou sondou LSI 5q31 Spectrum Orange5p12 Spectrum Green (Vysis Abbott) Na ľavom obraacutezku suacute priacutetomneacute dva červeneacute (5q31) a dva zeleneacute signaacutely (5p12) v pravom jadre je priacutetomnaacute deleacutecia 5q31 oblasti chyacuteba jeden červenyacute signal (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

Obr 43 Interfaacutezna FISH použitaacute lokusovo-špecifickaacute sonda ndash translokačnaacute - XL BCRABL1 plus (Metasystems) dvojfarebnaacute dvojfuacutezna kde červenaacute označuje lokus ABL1 na chromozoacuteme 9 a zelenaacute oblasť BCR na chromozoacuteme 22 Sonda deteguje fuacuteziu protoonkogeacutenu ABL1 (9q34) a geacutenu BCR (22q11) v priacutepade že červenyacute a zelenyacute signaacutel suacute pri sebe (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

45

Obr 44 Interfaacutezna FISH Použitaacute lokusovo-špecifickaacute sonda- typ break apart pre IGH geacuten V docircsledku translokaacutecie došlo k rozskočeniu geacutenu pričom translokačneacuteho partnera nepoznaacuteme vieme určiť len percento v koľkyacutech jadraacutech je geacuten prestavanyacute (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex) Obr 45 Použiteacute celochromozoacutemoveacute sondy WCP 15 (červenyacute chromozoacutem) a WCP 17 (zelenyacute chromozoacutem) Na metafaacuteze je potvrdenaacute reciprokaacute translokaacutecia t(1517)(q2221) (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

FISH vizualizaacutecia celeacuteho chromozoacutemu maľovanie chromozoacutemu anglicky chromosome

painting je špeciaacutelnou aplikaacuteciou chromozoacutemovej FISH proacuteba je koktail veľkeacuteho počtu rocircznych fluorescenčne značenyacutech DNA fragmentov hybridizujuacutecich pozdĺž celeacuteho konkreacutetneho chromozoacutemu (obr 36b 45) bdquoChromosomepaintingldquo analyzuje metafaacutezne chromozoacutemy V minulosti bola FISH vizualizaacutecia celyacutech chromozoacutemov limitovanaacute malyacutem množstvom rocirczne sfarbenyacutech fluorochroacutemov

V suacutečasnosti je možneacute detegovať množstvo cieľovyacutech sekvenciiacute naraz čo sa využiacuteva pri celogenoacutemovej chromozoacutemovej vizualizaacutecii (whole-chromosomepainting - WCP) metoacutedou multiplex FISH (M-FISH multicolor FISH o br 46) alebo spektraacutelnej karyotypizaacutecie (SKY) kedy možno rozliacutešiť všetky ľudskeacute chromozoacutemy ndash teda 24 rocircznych chromozoacutemov M-FISH a SKY patria medzi metafaacutezne formy FISH diagnostiky ktoreacute umožňujuacute simultaacutennu vizualizaacuteciu všetkyacutech ľudskyacutech chromozoacutemov v rocircznych farbaacutech čo predstavuje uľahčenie analyacutezy karyotypu hlavne pri komplexnyacutech zmenaacutech a markeroch neznaacutemeho pocircvodu Obe techniky vychaacutedzajuacute z použitia

46

celochromozoacutemovyacutech sond značenyacutech kombinaacuteciou viaceryacutech fluorochroacutemov Rozdiel medzi M-FISH a SKY spočiacuteva v technike ziacuteskania konečneacuteho obrazu

Obr 46 Multicolor FISH - každyacute chromozoacutemovyacute paacuter je zafarbenyacute inou farbou pričom na ich zafarbenie postačuje kombinaacutecia 5 fluorochroacutemov Na vyhodnocovanie je potrebnaacute špeciaacutelna sada fluorescenčnyacutech filtrov pre jednotliveacute fluorochroacutemy a špeciaacutelnyacute softweacuter Vľavo-štandardnyacute karyotyp vpravo karyotyp s mutaacuteciami (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

V molekulovej cytogenetike suacute komerčne dostupneacute sety M-FISH proacuteb umožňujuacutece

viacfarebneacute pruacutežkovanie chromozoacutemov (banding) s vysokyacutem rozliacutešeniacutem (multicolor-banding mBAND FISH MCB) čo umožňuje identifikaacuteciu intrachromozoacutemovyacutech prestavieb (Obr 47) Nevyhnutnosťou mBAND-u je mať chromozoacutemy v metafaacuteze Taacuteto metoacuteda bola prvyacutekraacutet uskutočnenaacute na chromozoacuteme 5 v roku 1999 mBAND FISH umožňuje rozliacutešiť špecifickeacute oblasti chromozoacutemov na uacuterovni pruacutežku - bandu a sub-bandu s detekciou 550 bandov haploidneacuteho karyotypu

Obr 47 A - mBAND chromozoacutemu 11 - inverzia duplikovanej oblasti 11q223-q25 B - mBAND chromozoacutemu 3 - na kruhovom chromozoacuteme deleacutecia oblasti 3p263 C - mBAND chromozoacutemu 2 - potvrdenie inverzie duplikovanej časti chromozoacutemu (poskytnuteacute RNDr Dagmar Landlovou Medirex)

FISH metoacuteda a jej varianty (M-FISH mBAND SKY) majuacute v suacutečasnosti širokeacute využitie v

klinickej genetike v onkologickej genetike na detekciu aberaacuteciiacute v čase diagnoacutezy počas liečby po

47

liečbe monitorovanie po transplantaacutecii kostnej drene v prenataacutelnej a postnataacutelnej diagnostike pri detekcii submikroskopickyacutech deleacuteciiacute (napr DiGeorge syndroacutem - 22q112 delečnyacute syndroacutem PraderndashWilli syndroacutem- chromozoacutem 15q11-13) prostredniacutectvom FISH je možnaacute detekcia numerickyacutech zmien chromozoacutemov (trizoacutemia chromozoacutemu 21 pri Downovom syndroacuteme trizoacutemia chromozoacutemu 15 pri Patauovom syndroacuteme trizoacutemia chromozoacutemu 18 pri Edwardsovom syndroacuteme) rocirczne zmeny v počte pohlavnyacutech chromozoacutemov (monozoacutemia X pri Turnerovom syndroacuteme Klinefelterov syndroacutem s X chromozoacutemom naviac - XXY) podobne v predimplantačnej diagnostike

83 DNA Microarray (DNA mikro čip biočip) DNA mikročipovanie je technika využiacutevajuacuteca hybridizaacuteciu skuacutemanej nukleovej kyseliny

(cieľovaacute vzorka) s veľkyacutem množstvom oligonukleotidovyacutech proacuteb (desať tisiacutec až milioacuten) ktoreacute suacute prichyteneacute na pevnyacute podklad najčastejšie sklenyacute silikoacutenovyacute alebo nylonovyacute (doštička čip) Skuacutemanaacute nukleovaacute kyselina je pred hybridizaacuteciou fragmentovanaacute označenaacute fluorofoacuterom a denaturovanaacute Po kontakte čipu s cieľovou vzorkou ktoraacute je vlastne zmes označenyacutech oligonukleotidov značeneacute oligonukleotidy hybridizujuacute s oligonukleotidovyacutemi sekvenciami prichytenyacutemi na čipe Potom suacute na zaacuteklade fluorescencie detekovaneacute miesta kde došlo k hybridizaacutecii čiže vzorka obsahovala takuacuteto nukleotidovuacute sekvenciu Z jedneacuteho mikročipu sa ziacuteska obrovskeacute množstvo daacutet ktoreacute je vždy nutneacute softveacuterovo spracovať V dnešnej dobe existuje niekoľko firiem poskytujuacutecich komerčne mikročipy na objednaacutevku alebo si ich laboratoacuteria produkujuacute sami

Mikročipovanie prebieha nasledovne

1) Vytvorenie DNA čipu ndash tisiacutece rocircznych jednovlaacuteknovyacutech DNA oligonukleotidov znaacutemych sekvencii sa kovalentne naviažu na povrch doštičky vždy v určitej lokalite je niekoľko rovnakyacutech oligonukleotidov veľkosť takejto lokality je ˂ 200 microm Proacutebami mocircže byť DNA cDNA alebo syntetizovaneacute oligonukleotidy Už hotoveacute mikročipy ponuacutekajuacute viacereacute firmy (Affymetrix Agilent Technologies Eppendorf Illumina) alebo si ich jednotliveacute laboratoacuteria vyraacutebajuacute sami pomocou robotickyacutech zariadeniacute DNA čip sa vytvaacutera buď nanaacutešaniacutem kvapiek oligonukleotidov na podklad alebo synteacutezou oligonukleotidov in situ na čipe 2) Priacuteprava vzorky ndash nukleovaacute kyselina (mRNA DNA) sa purifikuje určiacute sa jej kvantita a kvalita (spektrofotometericky) fragmentuje resp v priacutepade mRNA sa syntetizuje cDNA v priacutepade potreby sa mocircže DNA amplifikovať PCR reakciou štiepiť restrikčnyacutemi endonukleaacutezami 3) Fluorescenčneacute označenie (zriedkavejšie raacutedioaktiacutevne) fragmentov DNA prebieha počas reverznej transkripcie alebo PCR amplifikaacutecie za uacutečasti fluorescenčne značenyacutech nukleotidov Keď sa analyzujuacute dve rocirczne vzorky napr zdraveacute tkanivo a naacutedoroveacute tkanivo označenie nukleovyacutech kyseliacuten v tyacutechto tkanivaacutech byacuteva rozdielne a to použitiacutem dvoch rocircznych fluorescenčnyacutech farbiacutev (napr zeleneacute a červeneacute) Pred hybridizaacuteciou je potrebneacute vzorku denaturovať čiacutem sa vytvoriacute zmes jednovlaacuteknovyacutech DNA označenyacutech značkou 4) Hybridizaacutecia s mikročipom ndash v špeciaacutelnom hybridizačnom roztoku hybridizujuacute komplementaacuterne sekvencie zo vzorky s priacuteslušnyacutemi oligonukleotidovyacutemi sondami naviazanyacutemi na čipe Potom sa čip obmyje aby došlo k odstraacuteneniu čiastočne hybridizovanyacutech nukleovyacutech kyseliacuten 5) Skenovanie mikročipu ndash skenerom čipov docircjde k ožiareniu čipu laserom pričom v mieste hybridizaacutecie fluorescenčne značenyacutech DNA fragmentov s proacutebou docircjde k emisii svetla určitej vlnovej dĺžky ktoruacute skener zaznamenaacute 6) Analyacuteza daacutet prebieha metoacutedami bioinformatiky spracovaniacutem softveacutermi sa zistiacute ktoreacute lokality čipu navzaacutejom hybridizovali v priacutepade použitia dvoch vzoriek kontrolnej a skuacutemanej je možneacute analyzovať ich relatiacutevnu intenzitu hybridizaacutecie (expresie určiteacuteho geacutenu)

Existujuacute štyri typy mikročipov 1) Čipy ur čeneacute na analyacutezu expresie (obsahujuacute cDNA proacuteby) pre tzv dvojkanaacutelovyacute experiment kedy je vzorka určenaacute k hybridizaacutecii na čipe ziacuteskanaacute zmiešaniacutem DNA fragmentov kontrolnej a skuacutemanej vzorky pričom fragmenty suacute rozdielne fluorescenčne označeneacute (napr zelenyacute fluorofoacuter pre kontrolnuacute vzorku a červenyacute pre skuacutemanuacute) Na zaacuteklade intenzity a typu fluorescencie sa deteguje expresia geacutenov typickaacute pre kontrolnuacute vzorku (napr zelenaacute fluorescencia) pre skuacutemanuacute vzorku (napr

48

červenaacute fluorescencia) a expresia podobnaacute u oboch vzoriek (žltaacute fluorescencia) neexprimovaneacute geacuteny (čierna fluorescencia) rocirczne odtiene (v zaacutevislosti od prevažujuacutecej hybridizaacutecie) (obr 48) 2) Čipy ur čeneacute na analyacutezu mutaacutecii použije sa genoacutemovaacute DNA označenaacute jednou fluorescenčnou farbičkou na určenie jednonukleotidovej zmeny (SNP ndash Single Nukleotide Polymorphism) 3) Čipy na komparatiacutevnu genoacutemovuacute hybridizaacuteciu (aCGH array Comparative Genomic Hybridization) ndash použiacutevaneacute na zistenie zvyacutešenia alebo zniacuteženia množstva chromozoacutemovyacutech fragmentov obsahujuacutecich geacuteny zodpovedneacute za určiteacute ochorenie Na analyacutezu sa použije skuacutemanaacute gDNA a referenčnaacute (kontrolnaacute) DNA každaacute sa značiacute inou fluorescenčnou farbičkou (princiacutep ako pri analyacuteze expresie) (obr 49 50) 4) Čipy CGH - SNP kombinovaneacute čipy ur čeneacute na analyacutezu aj mutaacuteciiacute SNP aj na komparatiacutevnu genoacutemovuacute hybridizaacuteciu CGH

Mikročipy majuacute rozsiahle využitie napriacuteklad v identifikaacuteciiacute novyacutech geacutenov vo vyacuteskume ich funkciiacute expresie v rocircznych podmienkach pri diagnostike mnohyacutech ochoreniacute vo farmakogenomike vo vyacuteskume vplyvu toxiacutenov

Obr 48 Heatmapa geacutenovej expresie vybranyacutech geacutenov (mRNA) mikročip obsahuje 46000 cDNA proacuteb (poskytnuteacute Ing Helenou Gbelcovou PhD Uacutestav lekaacuterskej bioloacutegie genetiky a klinickej genetiky LF UK a UNB)

49

Obr 49 Princiacutep komparatiacutevnej genoacutemovej hybridizaacutecie (aCGH - array comparative genomic hybridization) Obr 50 A) Vyacutesledok komparatiacutevnej genoacutemovej hybridizaacutecie (aCGH - array comparative genomic hybridization) vzorky DNA izolovanej plodovej vody U plodu s abnormaacutelnym ultrasonografickyacutem vyšetreniacutem bola identifikovanaacute duplikaacutecia oblasti 3q261q29 (modryacute paacutes) a deleacutecia oblasti 5p1533p151 (červenyacute paacutes) Pre porovnanie chromozoacutem 1 bez aberaacutecie b) Ten istyacute pacient ale ineacute softveacuteroveacute spracovanie (poskytnuteacute RNDr Miroslavom Tomkom PhD Medirex)

50

Odporuacutečanaacute a použitaacute literatuacutera

Odborneacute knihy Klug W S Cummings M R Spencer Ch A Palladino M A Concepts of Genetics jedenaacuteste vydanie (2015) Carson S Molecular Biology Techniques tretie vydanie (2012) Strachan T Read A Human Molecular Genetics štvrteacute vydanie (2011) Sudbery P Sudbery I Human Molecular Genetics tretie vydanie (2009)

Internetoveacute straacutenky

wwwncbinlmnihgov wwwmlpacom wwwthermofishercom wwwilluminacom wwwpromegask wwwqiagencom wwwambioncom

Odborneacute člaacutenky Chacon-Cortes D Griffiths L R Methods for extracting genomic DNA from whole blood samples current perspectives Journal of Biorepository Science for Applied Medicine Volume 2 strany 1- 9 Viltrop T Krjutskov K Palta P Metspalu A Comparison of DNA extraction methods for multiplex polymerase chain reaction Anal Biochem 2010 Volume 398(2) strany 260-262 Ing Martin Čermaacutek Molekulaacuterna cytogenetika v problematike familiaacuternych maligniacutet Onkoloacutegia Volume 2 strany 77 - 83 Livak KJ Schmittgen TD Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method Methods 2001 Volume 25(4) strany 402 - 408 Bustin S A Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays J Mol Endocrinol 2000 Volume 25(2) strany169 - 193

MOLEKULAacuteRNE METOacuteDY AKTUAacuteLNE POUŽIacuteVANEacute V KLINICKEJ GENETIKE RNDr Andrea Pastoraacutekovaacute PhD RNDr Robert Petrovič PhD Vydala Univerzita Komenskeacuteho v Bratislave Lekaacuterska fakulta Rozsah 50 straacuten 246 AH prveacute vydanie ISBN 978-80-223-4231-5

22

Obr 21 Určenie genotypu analyacutezou krivky topenia tzv metoacutedou high resolution melting (HRM) A ndash krivka topenia vzoriek DNA majuacutecich tri rocirczne genotypy B ndash graf rozdielnosti krivky topenia vzoriek DNA majuacutecich tri rocirczne genotypy

23

4 Elektroforetickaacute separaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten

Separaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten predstavuje rozdelenie molekuacutel DNA alebo RNA na zaacuteklade veľkosti zloženia a poradia baacutez Podobnyacutemi metoacutedami je možneacute separovať aj proteiacuteny

Elektroforeacuteza (ELFO) je technika použiacutevanaacute na separaacuteciu niekedy aj purifikaacuteciu makromolekuacutel ako suacute nukleoveacute kyseliny a proteiacuteny na zaacuteklade ich rozdielnej veľkosti naacuteboja alebo konformaacutecie Je to metoacuteda veľmi často využiacutevanaacute nielen v molekulovej genetike ale aj biocheacutemii Elektroforeacuteza využiacuteva schopnosť nabityacutech molekuacutel migrovať v jednosmernom elektrickom poli k opačneacutemu poacutelu Nukleoveacute kyseliny majuacute vďaka svojej fosfaacutetovej zložke negatiacutevny naacuteboj preto v jednosmernom elektrickom poli migrujuacute ku kladneacutemu poacutelu čiže k anoacutede Elektroforeacuteza prebieha v elektroforetickej aparatuacutere v geacuteloch (v nosiči) so sieťovitou štruktuacuterou ktoraacute umožňuje separaacuteciu molekuacutel Vzorka nukleovej kyseliny zmiešanaacute s tzv nanaacutešaciacutem tlmivyacutem roztokom s farbičkou sa nanesie do jamky v geacuteli ktoryacute je umiestnenyacute v elektroforetickej aparatuacutere v priacutetomnosti elektroforetickeacuteho pufra (TAE alebo TBE) (obr 22) Nanaacutešaciacute tlmivyacute roztoknanaacutešacia farbička umožňuje na zaacuteklade migraacutecie farbičky vidieť migraacuteciu vzorky v geacuteli a suacutečasne zvyacutešeniacutem hustoty vo vzorke umožniacute klesnuacuteť vzorke do jamky a tak zabraacuteniť jej vyplaveniu z geacutelu Draacuteha je časť geacutelu ktoryacutem putuje jedna vzorka od katoacutedy k anoacutede V draacutehe sa nachaacutedzajuacute oddeleneacute jednotliveacute fragmenty nukleovyacutech kyseliacuten určityacutech veľkostiacute viditeľneacute vo forme pruacutežkov (angl bands) Intenzita pruacutežku zaacutevisiacute od množstva molekuacutel danej veľkosti je ekvivalentnaacute hmotnosti Na určenie veľkosti fragmentov NK sa do jednej jamky nanesie štandard molekulovyacutech hmotnostiacute (angl ladder) ktoryacute maacute presne definovaneacute veľkosti fragmentov čo umožňuje odhadnuacuteť veľkosť aj hmotnosť neznaacutemych separovanyacutech fragmentov

Obr 22 Elektroforetickaacute separaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten v agaroacutezovom geacuteli (A) a vizualizaacutecia UV svetlom a GelRedtrade (B C)

24

Nukleoveacute kyseliny je možneacute elektroforeticky separovať 1) v geacuteloch agaroacutezovom (horizontaacutelna elektroforeacuteza) (obr 22) a polyakrylamidovom (vertikaacutelna elektroforeacuteza) 2) v špeciaacutelnych lineaacuternych polymeacuteroch kapilaacuternou elektroforeacutezou použitiacutem genetickeacuteho analyzaacutetora (obr 23)

Agaroacuteza je polysacharid ziacuteskanyacute z morskej riasy použiacuteva sa najčastejšie v koncentraacuteciiacute 05-2 čiacutem vyššia koncentraacutecia tyacutem je geacutel pevnejšiacute a schopnejšiacute rozliacutešiť menšie fragmenty NK Priacuteprava je jednoduchaacute odvaacuteži sa potrebneacute množstvo agaroacutezy ktoraacute sa zmieša s tlmivyacutem roztokom (pufrom) rozvariacute sa v mikrovlnnej ruacutere a naleje sa do špeciaacutelnej naacutedoby na vytvaacuteranie geacutelov kyacutem je geacutel tekutyacute vložiacute sa do neho tzv hrebeň na vytvorenie jamiek Agaroacuteza je netoxickaacute V bežnom agaroacutezovom geacuteli v zaacutevislosti od jeho koncentraacutecie je možneacute separovať DNA fragmenty dĺžky 200-50 000 bp Dnes suacute dostupneacute aj špeciaacutelne agaroacutezy napr MetaPhorreg Agarose schopneacute oddeliť fragment DNA dĺžky 20-800bp Separaacutecia v agaroacutezovom geacuteli prebieha v horizontaacutelnej aparatuacutere preto sa nazyacuteva aj horizontaacutelna elektroforeacuteza

Polyakrylamidovyacute geacutel (PAGE) vznikaacute polymerizaacuteciou akrylamidu v priacutetomnosti špeciaacutelnych chemickyacutech laacutetok (peroxodisiacuteran amoacutenny TEMED bisakrylamid) Jeho priacuteprava je preto odlišnaacute a aj naacuteročnejšia Polyakrylamidoveacute geacutely majuacute vysokuacute rozlišovaciu schopnosť (1bp) preto suacute PAGE geacutely vhodneacute aj na sekvenovanie DNA klasickyacutemi metoacutedami PAGE geacutel nie je vhodnyacute na separaacuteciu fragmentov dlhšiacutech ako 2kb Použiacuteva sa v koncentraacutecii 35 -20 s rozliacutešeniacutem fragmentov od 10bp-2000bp Akrylamid je neurotoxiacuten musiacute sa s niacutem pracovať veľmi opatrne PAGE elektroforeacuteza bežiacute vo vertikaacutelnej aparatuacutere preto sa volaacute aj vertikaacutelna elektroforeacuteza použiacuteva sa často aj na separaacuteciu proteiacutenov

Ryacutechlosť pohybu nukleovyacutech kyseliacuten (mobilita) určuje viacero faktorov 1) veľkosť NK ndash počet baacutezovyacutech paacuterov resp baacutez pričom menšie molekuly prechaacutedzajuacute geacutelom ryacutechlejšie pretože sa ľahšie pohybujuacute v geacuteli 2) konformaacutecia nukleovej kyseliny napr u rovnako veľkyacutech plazmidov kondenzovaneacute superšpiralizovaneacute plazmidy migrujuacute najryacutechlejšie rovnako veľkeacute lineaacuterne molekuly (toho isteacuteho plazmidu) bežia pomalšie a najpomalšie putujuacute relaxovaneacute kruhoveacute molekuly plazmidu 3) koncentraacutecia geacutelu určuje jeho rozlišovaciu schopnosť koncentrovanejšiacute geacutel je schopnyacute separovať kratšie fragmenty NK redšie geacutely suacute vhodneacute pre rozliacutešenie vaumlčšiacutech fragmentov 4) zloženie geacutelu je docircležiteacute pri analyacuteze sekundaacuternych štruktuacuter NK a proteiacutenov v nedenaturovanom stave sekundaacuterna štruktuacutera spomaľuje migraacuteciu NK a proteiacutenov Tento fakt využiacutevajuacute niektoreacute diagnostickeacute techniky (napr SSCP - Single Strand Conformation Polymorphism - polymorfismus konformaacutecie jednovlaacuteknovej DNA) umožňujuacutece detekciu zaacutemeny jedinej baacutezy ktoraacute spocircsobiacute odlišneacute vnuacutetromolekuloveacute paacuterovanie a vyacuteslednuacute konformaacuteciu molekuly Geacutely mocircžu teda byť denaturačneacute a nedenaturačneacute (natiacutevne) 5) napaumltie zdroja - čiacutem vyššie je napaumltie ktoreacute vytvaacutera elektrickeacute pole v elektroforetickej aparatuacutere tyacutem ryacutechlejšie fragmenty NK migrujuacute 6) zloženie roztokov a teploty

Elektroforetickyacute tlmivyacute roztok (pufor - elektrolyt) zabezpečuje stabilneacute elektroforetickeacute podmienky počas separaacutecie geacutel je v ňom ponorenyacute Obsahuje ioacuteny čo umožňuje vedenie elektrickeacuteho pruacutedu

Štandard molekulovyacutech hmotnostiacute (v laboratoacuteriaacutech nazyacutevanyacute ladder alebo marker) je zmes fragmentov DNA alebo RNA s presne definovanou veľkosťou ktoryacute sluacuteži na odhad veľkosti vyšetrovanyacutech fragmentov NK (obr 22) Pomocou špeciaacutelnych štandardov molekulovyacutech hmotnostiacute ktoryacutech fragmenty NK majuacute definovanuacute aj hmotnosť je možneacute odhadnuacuteť množstvo (hmotnosť - koncentraacuteciu) neznaacutemeho fragmentu

B C

25

41 Vizualizaacutecia DNA

Samotnaacute nukleovaacute kyselina je počas elektroforetickej separaacutecie neviditeľnaacute Vizualizaacuteciu NK umožňujuacute interkalačneacute činidlaacute ktoreacute suacute schopneacute naviazať sa na molekuly NK tyacutem že sa včlenia medzi susediace baacutezy Po ožiareniacute UV svetlom interkalačneacute činidlaacute naviazaneacute na NK fluoreskujuacute tak sa vizualizuje NK čiacutem intenziacutevnejšie fluoreskuje tyacutem viac NK je v geacutelipruacutežku priacutetomneacute Interkalačneacute činidlo sa buď primieša do geacutelu pri jeho priacuteprave čo umožniacute sledovať migraacuteciu fragmentov NK počas elektroforeacutezy a to po vybratiacute z ELFO aparatuacutery a po ožiareniacute UV svetlom alebo sa geacutel farbiacute po elektroforetickej separaacutecii V minulosti bol na zviditeľnenie NK najčastejšie použiacutevanyacute etidiumbromid kvocircli jeho mutageacutennym vlastnostiam sa v suacutečasnosti nahraacutedza menej mutageacutennymi a netoxickyacutemi činidlami ako suacute napr komerčne dostupneacute SYBRregSafe GelRedtrade GelGreentrade

Kapilaacuterna elektroforeacuteza NK prebieha v špeciaacutelnom priacutestroji genetickom analyzaacutetore (obr 23) ktoryacute musiacute mať zaacutekladneacute komponenty ako suacute elektroacutedy kapilaacutera zdroj vysokeacuteho napaumltia detektor prepojenie s počiacutetačom a softveacuteroveacute vybavenie priestor na vloženie vzoriek atď Genetickyacute analyzaacutetor predstavuje automatizovanyacute systeacutem umožňujuacuteci sekvenovanie určovanie dĺžky DNA fragmentov ndash fragmentačnuacute analyacutezu a kvantifikaacuteciu nukleovyacutech kyseliacuten V novšiacutech typoch genetickeacuteho analyzaacutetora je proces analyacutezy od vloženia vzoriek do stojana automatizovanyacute

Vzorka určenaacute na analyacutezu je elektrokineticky injektovanaacute do tenkej kapilaacutery naplnenej lineaacuternym polymeacuterom Vplyvom vysokeacuteho napaumltia sa negatiacutevne nabiteacute fragmenty DNA pohybujuacute v polymeacuteri k pozitiacutevne nabitej elektroacutede Kapilaacuterna elektroforeacuteza je tak citlivaacute že je schopnaacute detegovať jednobaacutezovyacute rozdiel DNA fragmentov DNA fragmenty musia byť pred kapilaacuternou elektroforeacutezou fluorescenčne označeneacute v kapilaacutere suacute separovaneacute na zaacuteklade veľkosti Kraacutetko pred dosiahnutiacutem kladne nabitej elektroacutedy docircjde po excitaacutecii laserovyacutem žiareniacutem k emisii žiarenia fluoroformi (farbičkami) tak že optickyacute detekčnyacute systeacutem zaznamenaacute fluorescenciu ktoraacute je naacutesledne softveacuterovo spracovanaacute a vyhodnotenaacute

Obr 23 Genetickyacute analyzaacutetor

42 RFLP

Metoacuteda polymorfizmu dĺžky restrik čnyacutech fragmentov (angl Restriction Fragment Length Polymorfism) bola prvou metoacutedou využiacutevanou na detekciu DNA variaacuteciiacute rocircznych biologickyacutech vzoriek Princiacutep metoacutedy spočiacuteva v priacutetomnosti polymorfizmov v DNA sekvencii rocircznych ľudiacute ktoreacute zapriacutečinia rozdielny profil (obrazec) DNA fragmentov po štiepeniacute jednou alebo viaceryacutemi restrikčnyacutemi endonukleaacutezami Restrikčneacute endonukleaacutezy (RE) suacute enzyacutemy ktoreacute štiepia DNA molekulu v oblasti špecifickej nukleotidovej sekvencie nazyacutevanej restrik čneacute miesto RE najčastejšie rozpoznaacutevajuacute a štiepia miesto veľkeacute 4-6 baacutez RE suacute priacutetomneacute u prokaryotov (bakteacuterie a archebakteacuterie) kde suacute suacutečasťou restrik čno-modifikačneacuteho systeacutemu akoby prokaryotickeacutej vrodenej imunity sluacutežia

26

na ochranu pred cudzou DNA (napr viacuterusovou) ktoruacute po rozpoznaniacute špecifickej sekvencie štiepia

Restrikčno-modifikačnyacute systeacutem maacute dve zložky 1) modifikačneacute enzyacutemy - metylaacutezy ktoreacute procesom metylaacutecie modifikujuacute určiteacute baacutezy svojej DNA čiacutem ich označia za vlastnuacute DNA takže takaacuteto DNA je potom rezistentnaacute voči štiepeniu restrikčnyacutemi endonukleaacutezami Najčastejšiacutem spocircsobom metylaacutecie u bakteacuteriiacute je metylaacutecia adeniacutenu na N6 pričom vznikne metyladeniacuten alebo cytoziacutenu na C5 metylcytoziacuten 2) restrikčneacute endonukleaacutezy štiepia špecifickeacute miesto dvojvlaacuteknovej DNA ktoreacute je tvoreneacute symetrickou sekvenciou zrkadlovo sa opakujuacutecich nukleotidov ndash tzv palindroacutem Restrikčneacute enzyacutemy sa použiacutevajuacute na štiepenie DNA sekvencie na mieste špecifickom pre tuacute ktoruacute restrikčnuacute endonukleaacutezu napr pri analyacuteze polymorfizmov dĺžky restrikčnyacutech fragmentov (RFLP) analyacuteze jednonukleotidovyacutech polymorfizmov (SNP) mutaacuteciiacute ako aj pri klonovaniacute DNA do vhodnyacutech vektorovyacutech DNA molekuacutel

Po štiepeniacute dvojvlaacuteknovej DNA restrikčnou endonukleaacutezou mocircžu vzniknuacuteť tri typy koncov - 5´-prečnievajuacutece konce (lepiveacute) 3´-prečnievajuacutece konce (lepiveacute) a tupeacute konce (obr 24)

Obr 24 Restrikčneacute štiepenie zanechaacutevajuacutece rocirczne konce tupeacute a lepiveacute

Restrikčneacute štiepenie je často použiacutevanou metoacutedou geacutenovyacutech manipulaacuteciiacute na konštrukciu

hybridnyacutech molekuacutel DNA s naacuteslednyacutem klonovaniacutem Priebeh RFLP analyacutezy je nasledovnyacute restrikčnaacute endonukleaacuteza sa pridaacute k DNA a zmes sa vo

vhodnyacutech reakčnyacutech podmienkach (pufor teplota) inkubuje niekoľko hodiacuten Počas inkubaacutecie docircjde k štiepeniu DNA na špecifickyacutech miestach DNA je potom elektroforeticky separovanaacute v geacuteli a naacutesledne vizualizovanaacute V minulosti po geacutelovej elektroforeacuteze nasledoval Southern blot (čiže prenos separovanyacutech fragmentov DNA z geacutelu na špeciaacutelnu membraacutenu) (obr 35) po ktorom nastala vizualizaacutecia raacutedioaktiacutevne značenou proacutebou V suacutečasnosti sa kvocircli praacutecnosti a zdravotnyacutem rizikaacutem od Southern blotu upuacutešťa a prechaacutedza sa na ryacutechlejšie menej praacutecne a zdravotne šetrnejšie metoacutedy priateľskejšie aj k životneacutemu prostrediu

RFLP bola prvou metoacutedou použiacutevanou na zistenie DNA profilu (DNA fingerprinting) mapovanie geacutenov zapriacutečiňujuacutece genetickeacute ochorenia a testovanie otcovstva Vaumlčšina RFLP markerov je vysoko lokusovo špecifickyacutech a kodominantnyacutech (obidve alely suacute detekovaneacute u heterozygota)

PCR-RFLP je laboratoacuterne priacutestupnejšia metoacuteda molekulaacuterno-genetickej diagnostiky keďže PCR umožňuje amplifikaacuteciu veľmi malyacutech množstiev DNA Alternatiacutevny naacutezov použiacutevanyacute v literatuacutere je CAPS z angl Cleaved Amplified Polymorphic Sequence assay Použitiacutem špecifickyacutech primerov docircjde PCR metoacutedou k amplifikaacutecii požadovaneacuteho uacuteseku DNA ten sa potom štiepi restrikčnou endonukleaacutezou vo vhodnyacutech podmienkach naacutesledne sa štiepne produkty elektroforeticky separujuacute a vizualizujuacute použitiacutem interkalačnyacutech farbiacutev a UV svetla (obr 25)

27

Obr 25 Princiacutep metoacutedy PCR-RFLP

43 VNTR a STR V geacutenome suacute priacutetomneacute dva typy tandemovyacutech (za sebou nasledujuacutecich) opakovaniacute

1) minisatelity ndash nazyacutevaneacute variabilnyacute počet tandemovyacutech opakovaniacute VNTR (variable number of tandem repeats) 2) mikrosatelity tiež kraacutetke tandemoveacute repetiacutecie STR (short tandem repeats)

Obidva tieto typy satelitnej DNA suacute rozmiestneneacute po celom genoacuteme suacute využiacutevaneacute hlavne vo forenznej genetike na identifikaacuteciu osocircb a určenie otcovstva popriacutepade materstva ale aj v mediciacutene na detekciu chromozoacutemovyacutech aneuploidiiacute Štruktuacutera obidvoch je podobnaacute Rozdiel medzi jednotlivyacutemi alelami je spocircsobenyacute rozdielnym počtom opakovaniacute opakujuacutecej sa sekvencie (motiacutevu) čo spocircsobiacute rocircznu dĺžku alel s rocircznym počtom tandemovyacutech opakovaniacute nazyacutevanuacute polymorfizmus dĺžky fragmentov

VNTR ndash variabilnyacute počet tandemovyacutech opakovaniacute pričom opakujuacuteca sa sekvencia maacute dĺžku od 6 do 100 baacutez pričom sa mocircže opakovať aj tisiacutece kraacutet alely tak mocircžu mať od 500do 30 000 baacutez VNTR boli v kombinaacutecii s RFLP (DNA fingerprinting ) prvyacutem polymorfizmom použiacutevanyacutem na zistenie DNA profilov a identifikaacuteciu osocircb v kriminalistickej praxi V suacutečasnosti jeho využitie v kriminalistike je kvocircli potrebe relatiacutevne veľkeacuteho množstva DNA nahradeneacute využitiacutem STR

STR - kraacutetke tandemoveacute repetiacutecie suacute v kriminalistike najčastejšie použiacutevanyacutem polymorfizmom STR lokusy suacute rozmiestneneacute po celom genoacuteme repetiacutecia obsahuje jednu až šesť baacutez pričom jej opakovaniacutem vznikne STR v rozsahu od 50 do 300bp V našom genoacuteme suacute tisiacutece STR ktoreacute mocircžu byť použiteacute pre forenznuacute analyacutezu V kriminalistike sa v suacutečasnosti na identifikaacuteciu osocircb použiacuteva 13 STR locusov ktoreacute patria k medzinaacuterodne uznaacutevanyacutem štandardom Z iniciatiacutevy FBI bola vytvorenaacute databaacuteza CODIS (Combined DNA Index System) každaacute krajina maacute svoju databaacutezu CODIS kde je možneacute vložiť a archivovať DNA profily jednotlivcov ako aj profily DNA ziacuteskanyacutech z miest kriminaacutelneho činu v databaacuteze je ich možneacute navzaacutejom porovnať a tak zistiť pocircvodcu trestneacuteho činu Medzinaacuterodnaacute jednotnosť v použiacutevaniacute CODIS STR lokusov umožňuje v priacutepade potreby vzaacutejomneacute porovnanie DNA profilov zistenyacutech na uacutezemiacute rocircznych štaacutetov CODIS STR lokusov je 13 a suacute to CSF1PO FGA TH01 TPOX VWA D3S1358 D5S818 D7S820 D8S1179 D13S317 D16S539 D18S51 a D21S11 Zistenie DNA profilu sa uskutočniacute multiplexnou PCR reakciou s fluorescenčne značenyacutemi primermi špecifickyacutemi pre konkreacutetny STR Naacutesledne suacute PCR produkty analyzovaneacute kapilaacuternou elektroforeacutezou genetickyacutem analyzaacutetorom ktoryacute rozliacuteši amplifikovaneacute fragmenty na zaacuteklade fluorescencie a dĺžky (fragmentačnaacute analyacuteza) (obr 26 Tab 3) DNA profil každeacuteho človeka je jedinečnyacute rovnakyacute profil mocircžu mať len jednovaječneacute dvojčataacute

28

Obr 26 Ukaacutežka DNA profilu človeka 15 STR lokusov s určeniacutem pohlavia pomocou lokusu pre amelogeniacuten (ženskeacute pohlavie - XX) maleacute oranžoveacute piacuteky predstavujuacute fragmenty veľkostneacuteho štandardu Tabuľka č 3 Zaacutepis DNA profilu človeka z obraacutezka č 26 15 STR lokusov s určeniacutem pohlavia pomocou lokusu pre amelogeniacuten System Alela 1 Alela 2

D3S1358 16 17

TH01 9 93 D21S11 28 28

D18S51 15 18

Penta E 7 14 D5S818 9 12

D13S317 8 11

D7S820 8 11 D16S539 11 12

CSF1PO 10 11

Penta D 11 12 vWA 15 18

D8S1179 13 16

TPOX 8 9 FGA 20 21

amel X X

29

5 MLPA

Multiplexnaacute amplifikaacutecia proacuteb zaacutevislaacute od ligaacutecie (z angl multiplex ligation-dependent probe amplification) je metoacuteda schopnaacute v jednej reakcii (v jednej skuacutemavke a vzorke) detegovať zmeny v počte až 50 nukleotidovyacutech sekvenciiacute Metoacutedou MLPA je možneacute ryacutechlo identifikovať amplifikaacutecie (duplikaacutecie) a deleacutecie veľkeacuteho počtu geacutenov či už použitiacutem DNA alebo mRNA krvnyacutech vzoriek alebo vzoriek z naacutedorov

Princiacutep MLPA spočiacuteva v multiplexnej amplifikaacutecii 50 špecifickyacutech nukleotidovyacutech sekvenciiacute použitiacutem jedneacuteho paacuteru primerov pričom jeden primer je fluorescenčne označenyacute Vyacutesledneacute PCR produkty suacute analyzovaneacute kapilaacuternou elektroforeacutezou (fragmentačnaacute analyacuteza) Dĺžka každeacuteho namnoženeacuteho produktu je jedinečnaacute narastaacute postupne o 6 alebo 9 nukleotidov pričom produkty PCR suacute 120 ndash 500 nukleotidov dlheacute Tento veľkostnyacute rozsah PCR fragmentov (dĺžka 120-500 nukleotidov s naacuterastom postupne o 6 alebo 9 nukleotidov) je optimaacutelny pre kapilaacuternu elektroforeacutezu MLPA multiplexnaacute PCR prebieha za použitia iba jedineacuteho paacuteru primerov ktoreacute amplifikujuacute špecifickeacute sekvencie Trik spočiacuteva v tom že nedochaacutedza k amplifikaacutecii DNA sekvencie ale MLPA proacuteb ktoreacute suacute pridaneacute k vzorkaacutem Každaacute MLPA proacuteba pozostaacuteva z dvoch oligonukleotidov (dve hemiproacuteby) pričom každyacute oligonukleotid obsahuje jednu zo sekvencie rozpoznaacutevanuacute PCR primermi Proacuteba vznikne jedine za predpokladu hybridizaacutecie dvoch oligonukleotidov (hemiproacuteb) k cieľovej sekvencii (geacutenu) a po ligaacutecii enzyacutemom ligaacutezou Iba ligovaneacute proacuteby suacute exponenciaacutelne amplifikovaneacute pomocou jedneacuteho paacuteru primerov Množstvo zligovanyacutech proacuteb teda zaacutevisiacute od množstva cieľovyacutech sekvenciiacute (geacutenov) vo vzorke

Postup MLPA analyacutezy je nasledovnyacute (obr27) K vzorke nukleovej kyseliny (DNA resp mRNA) sa pridaacute zmes 50 jedinečnyacutech proacuteb každaacute

proacuteba je komplementaacuterna k určitej cieľovej sekvencii NK vzorky Každaacute proacuteba však pozostaacuteva z dvoch oligonukleotidov hybridizujuacutecich vedľa seba zaacuteroveň každyacute oligonukleotid (hemiproacuteba) obsahuje pridanuacute sekvenciu rozpoznaacutevanuacute paacuterom PCR primerov Po hybridizaacuteciiacute oligonukleotidov (hemiproacuteb) dochaacutedza k ich ligaacutecii ligaacutezou Ligačnaacute reakcia je tak špecifickaacute že je schopnaacute rozliacutešiť sekvenciu liacutešiacu sa v jednom nukleotide Vyacuteslednyacute ligačnyacute produkt (proacuteba) obsahuje obidve sekvencie pre PCR primery na jednom fragmente čiže mocircže docircjsť k namnoženiu takeacutehoto fragmentu PCR reakciou V priacutepade ak nedocircjde k ligaacutecii priacuteslušnyacutech hemiproacuteb pretože hemiproacuteby nenaacutejdu cieľovuacute sekvenciu na DNA každaacute takaacuteto nezligovanaacute hemiproacuteba maacute len jednu sekvenciu rozpoznaacutevanuacute len jednyacutem PCR primerom v docircsledku čoho nemocircže prebehnuacuteť jej PCR amplifikaacutecia a počas fragmentačnej analyacutezy nie je detegovanaacute pretože negeneruje fluorescenčnyacute signaacutel

Pri MLPA analyacuteze je docircležiteacute okrem MLPA amplifikaacutecie vzorky urobiť aj MLPA amplifikaacuteciu referenčnej vzorky ku ktorej sa bude porovnaacutevať počet geacutenov (cieľovyacutech sekvenciiacute) Po kapilaacuternej elektroforeacuteze MLPA referenčnej a skuacutemanej vzorky porovnaniacutem obsahu nameranyacutech hodnocirct tzv piacutekov priacuteslušnyacutech proacuteb sa určiacute relatiacutevny počet koacutepiiacute v skuacutemanej vzorke

MLPA

1 DNA denaturaacutecia a hybridizaacutecia s MLPA proacutebami (hemiproacuteby)

2 Ligaacutecia (vytvorenie kompletnyacutech proacuteb)

3 PCR amplifikaacutecia proacuteb paacuterom primerov

4 Kapilaacuterna elektroforetickaacute separaacutecia PCR produktov

5 Analyacuteza daacutet

30

Obr 27 Princiacutep MLPA

Firma MRC-Holland v suacutečasnosti ponuacuteka stovky MLPA setov proacuteb ktoreacute suacute vhodneacute na 1) diagnostiku kongenitaacutelnych a dedičnyacutech ochoreniacute 2) zisťovanie profilu naacutedorov 3) zisťovanie metylačneacuteho profilu

MLPA je metoacuteda vhodnaacute na detekciu malyacutech prestavieb (BRCA1 BRCA2 MSH2 atď)

veľkyacutech chromozoacutemovyacutech prestavieb (Williamsov syndroacutem Prader-WilliAngelman syndroacutem atzď)

31

detekciu zmien v počte koacutepii geacutenov (obr 28 29) ako aj zistenie počtu kompletnyacutech chromozoacutemov (chromozoacutem 13 18 21 XY tiež aj z amniovej tekutiny) diagnostiku naacutedorov (zmeny počtu pri ALL CLL atď) kvantifikaacuteciu metylaacutecie (Prader-WilliAngelmanov syndroacutem Fragilnyacute X inaktivaacutecia naacutedorovyacutech supresorovyacutech geacutenov atď) mRNA analyacutezu geacutenov zuacutečastňujuacutecich sa apoptoacutezy alebo zaacutepalov

MS-MLPA (Methylation-Specific MLPA) je varianta MLPA určenaacute špeciaacutelne na analyacutezu aberantnyacutech metylaacutecii imprintovanyacutech oblastiacute ako aj detekciu metylačnyacutech zmien CpG ostrovčekov lokalizovanyacutech bliacutezko promoacutetora Rozdiel oproti štandardnej MLPA spočiacuteva v použitiacute metylačne senzitiacutevneho restrikčneacuteho enzyacutemu HhaI ktoryacute štiepi MS-MLPA proacuteby hybridizovaneacute k nemetylovanej sekvencii Každaacute DNA vzorka určenaacute pre MS-MLPA analyacutezu prejde dvoma reakciami v jednej mikroskuacutemavke štandardnou MLPA analyacutezou (bez štiepenia metylačne senzitiacutevnym enzyacutemom) a v druhej mikroskuacutemavke docircjde okrem ligaacutecie proacuteb aj k metylačne senzitiacutevnemu štiepeniu hybridizovanyacutech proacuteb s nemetylovanou DNA Amplifikujuacute sa len ligovaneacute proacuteby po PCR amplifikaacutecii sa fragmentačnou analyacutezou porovnaniacutem oboch reakciiacute zistia rozdiely v metylačnom profile vzorky k referenčnej vzorke

RT-MLPA (Reverse Transkriptase MLPA) je variaacutecia MLPA určenaacute pre zistenie mRNA profilu vzorky je alternatiacutevou k real-time PCR a mikročipom RT-MLPA nedeteguje mRNA množstvo priamo pretože použiacutevanaacute ligaacuteza nie je schopnaacute ligovať DNA oligonukleotidy keď suacute hybridizovaneacute s RNA Preto RT-MLPA začiacutena reverznou transkripciou so špeciaacutelne navrhnutyacutemi RT primermi tak aby vytvorili kraacutetke oligonukleotidy (cDNA) Potom reakcia pokračuje ako štandardnaacute MLPA

Obr 28 MLPA analyacuteza geacutenu DMD (koacutedujuacuteceho dystrofiacuten) mutaacutecie ktoreacuteho spocircsobujuacute Duchennovu svalovuacute dystrofiu u pacienta je priacutetomnaacute deleacutecia exoacutenu 45 v porovnaniacute s referenčnou vzorkou ndash kontrolou

32

Obr 29 MLPA analyacuteza geacutenu DMD (koacutedujuacuteceho dystrofiacuten) mutaacutecie ktoreacuteho spocircsobujuacute Duchennovu svalovuacute dystrofiu u pacienta suacute priacutetomneacute duplikaacutecie exoacutenov 41 42 43 44 45 (piacuteky vo vzorke pacienta sa porovnajuacute s piacutekmi v kontrole ndash referenčnej vzorke)

33

6 Sekvenovanie

Sekvenovaniacutem rozumieme určenie primaacuternej štruktuacutery DNA teda určenie poradia nukleotidov v reťazci DNA Začiatky moderneacuteho sekvenovania siahajuacute do roku 1977 kedy boli objaveneacute dve metoacutedy sekvenovania 1) chemickaacute metoacuteda Maxama a Gilberta 2) enzymatickaacute metoacuteda Sangera Nicklena a Coulsona

Princiacutep obidvoch metoacuted sekvenovania spočiacuteva v tom že sa vytvoriacute suacutebor DNA molekuacutel s rocircznou veľkosťou ktoreacute suacute zakončeneacute konkreacutetnym nukleotidom tieto DNA molekuly sa elektroforeticky separujuacute v geacuteloch s rozlišovacou schopnosťou 1 nukleotid 61 Chemickaacute metoacuteda

DNA molekuly sa na 5-konci raacutedioaktiacutevne označia raacutedioaktiacutevnym fosforom a naacutesledne sa chemicky modifikujuacute špecificky pre každuacute baacutezu DNA sa potom v modifikovanyacutech miestach štiepi čiacutem vzniknuacute rocirczne dlheacute fragmenty pričom podmienky suacute nastaveneacute tak aby sa DNA na každom mieste štiepila len raz Modifikaacutecia DNA a štiepenie prebehne v štyroch separaacutetnych reakciaacutech (skuacutemavkaacutech) takže po elektroforetickej separaacuteciiacute takto opracovanej DNA v štyroch draacutehach polyakrylamidoveacuteho geacutelu a naacuteslednej autoraacutediografii (podobne ako pri Southernovej hybridizaacutecii) je možneacute odčiacutetať nukleotidovuacute sekvenciu približne 100 nukleotidov od raacutedioaktiacutevneho označenia (v čase objavu Maxama a Gilberta) 62 Sangerova metoacuteda

Zaacuteklady metoacutedy boli popiacutesaneacute už v roku 1975 (metoacuteda plus a miacutenus) ale až vylepšenie použitiacutem dideoxynukleotidov (ddNTP) v roku 1977 došlo k zjednodušeniu sekvenovania Princiacutepom enzyacutemoveacuteho sekvenovania je terminaacutecia (zastavenie) polymerizaacutecie inkorporaacuteciou 2´ 3 -dideoxynukleotidov do novosyntetizujuacuteceho sa vlaacutekna DNA Keďže ddNTP neobsahujuacute hydroxylovuacute skupinu na 3 uhliacuteku riboacutezy nemocircžu sa zuacutečastniť na tvorbe fosfodiesterovej vaumlzby nemocircže sa pripojiť k nim ďalšiacute nukleotid čiže musiacute docircjsť k terminaacuteciiacute polymeraacutecie Reakcia prebieha v štyroch skuacutemavkaacutech s raacutedioaktiacutevne značenyacutem primerom V každej skuacutemavke suacute priacutetomneacute všetky štyri deoxynukleotidtrifosfaacutety (dNTP) ale pre každuacute skuacutemavku je špecifickyacute priacutedavok maleacuteho množstva jedneacuteho z dideoxynukleotidtrifosfaacutetov (v prvej skuacutemavke je ddATP v druhej ddCTP v tretej ddTTP a vo štvrtej ddGTP) Maleacute množstvo ddNTP spocircsobiacute že pri polymerizaacutecii dochaacutedza k prednostneacutemu zaradeniu štandardnyacutech dNTP do narastajuacuteceho reťazca a len občas sa inkorporuje ddNTP čiacutem sa zastaviacute synteacuteza reťazca V každej skuacutemavke tak vznikne suacutebor DNA fragmentov rocircznych veľkostiacute zakončenyacutech priacuteslušnyacutem ddNTP (v prvej skuacutemavke ddATP v druhej ddCTP v tretej ddTTP a vo štvrtej ddGTP) Po elektroforetickej separaacutecii v 4 draacutehach polyakrylamidoveacuteho geacutelu a autoraacutediografii sa z autoraacutediogramu odčiacuteta sekvencia

V suacutečasnosti je sekvenovanie do značnej miery automatizovaneacute pričom využiacuteva princiacutep Sangerovej enzyacutemovej metoacutedy s určityacutemi obmenami Uacutesek DNA ktoryacute treba sekvenovať sa prostredniacutectvom termostabilnyacutech DNA polymeraacutez namnožiacute PCR metoacutedou po ktorej nasleduje sekvenačnaacute reakcia (asymetrickaacute PCR) s fluorescenčne značenyacutemi ddNTP (každyacute druh označenyacute inyacutem fluorescenčnyacutem farbivom) Sekvenačnaacute reakcia prebieha v jednej skuacutemavke s jednyacutem primerom vznikne tak suacutebor jednovlaacuteknovyacutech DNA rocircznej dĺžky ktoreacute suacute na 3konci označeneacute ddNTP so špecifickyacutem fluorescenčnyacutem farbivom Taacuteto metoacuteda sekvenovania sa tiež nazyacuteva rdquodye-terminator cycle sequencingrdquo(obr 30) Po kapilaacuternej elektroforeacuteze vzorky v genetickom analyzaacutetore zaznamenaacutevaniacute fluorescencie jednotlivyacutech fragmentov CCD kamerou a softveacuterovom spracovaniacute sa ziacuteska sekvencia DNA (obr 31)

34

Obr 30 Princiacutep sekvenovania Sangerova dideoxy metoacuteda alebo tzv chain termination method (reťazec zastavujuacuteca metoacuteda) Obr 31 Určenie genotypu plodu a rodičov sekvenčnou analyacutezou DNA ziacuteskanej z plodovej vody (prenataacutelna diagnostika) a perifeacuternej krvi sekvenčnaacute analyacuteza geacutenu ASPA vyacutesledok u plodu priacutetomnaacute mutaacutecia c 914CgtA v homozygotnom stave (AA) rodičia heterozygoti (AC) Uvedenaacute mutaacutecia je v homozygotnom stave kauzaacutelnou priacutečinou Canavanovej choroby

Automatizovaneacute sekvenovanie prinaacuteša viacereacute vyacutehody oproti klasickej Sangerovej metoacutede vyššiu presnosť a ryacutechlosť v jednej sekvenačnej reakcii možnosť osekvenovať až 1200 nukleotidovyacute fragment maleacute množstvo templaacutetu potrebneacute na analyacutezu

35

63 Next Generation Sequencing (NGS)

NGS (sekvenovanie novej generaacutecie) maacute obrovskyacute potenciaacutel v analyacuteze genoacutemov pričom toto označenie zahŕňa viacereacute technologickeacute metoacutedy reprezentovaneacute niekoľkyacutemi firmami Princiacutepom je masiacutevne paralelneacute sekvenovanie čiacutem sa ziacuteskajuacute raacutedovo tisiacutece až milioacuteny sekvenciiacute naraz 631 Sekvenovanie druhej generaacutecie

Na začiatku sa analyzovanaacute DNA vo vaumlčšine priacutepadov fragmentuje (vznikne tak DNA

knižnica) na fragmenty sa pripoja kraacutetke sekvencie ndash adapteacutery naacutesledne sa tieto fragmenty rocircznymi priacutestupmi amplifikujuacute a určiacute sa ich sekvencia Vďaka čiastočnyacutem prekryvom je zo ziacuteskanyacutech sekvencii možneacute poskladať plynuluacute sekvenciu zodpovedajuacutecu pocircvodnej nefragmentovanej DNA

Pyrosekvenovanie je podobne ako Sangerova metoacuteda založenaacute na princiacutepe synteacutezy komplementaacuterneho vlaacutekna DNA avšak rozdiel je v tom že sa na detekciu inkorporaacutecie nukleotidu využiacuteva inyacute systeacutem tvorby luminiscenčneacuteho signaacutelu v priebehu reakcie Pyrosekvenovanie je umožneneacute vďaka aktivite 4 enzyacutemov - DNA polymeraacutezy ATP sulfurylaacutezy luciferaacutezy a apyraacutezy Reakčnaacute zmes obsahuje aj ďalšie komponenty - enzymatickeacute substraacutety adenoziacutenfosfosulfaacutet (APS) d-luciferiacuten sekvenovanyacute templaacutet a cyklicky postupne po jednom type pridaacutevaneacute nukleotidtrifosfaacutety Po zabudovaniacute nukleotidu do novovznikajuacuteceho reťazca docircjde k uvoľneniu pyrofosfaacutetu naacutesledne je využityacute ATP sulfurylaacutezou na synteacutezu ATP z APS počas ďalšej reakcie docircjde k využitiu ATP luciferaacutezou na premenu luciferiacutenu na oxyluciferiacuten čo spocircsobiacute svetelnyacute signaacutel a ten zaznamenaacute detekčnyacute systeacutem Poslednou enzymatickou reakciou je reakcia apyraacutezy ktoraacute odstraacuteni nezainkorporovaneacute nukleotidy a nevyužiteacute ATP aby sa celyacute proces mohol zopakovať s reakčnou zmesou obsahujuacutecou ďalšiacute nukleotidtrifosfaacutet (inyacute ako v predchaacutedzajuacutecej reakcii) Po každej reakcii detektor zaznamenaacuteva emisiu svetla na zaacuteklade intenzity svetla je možneacute určiť či bol vradenyacute priacuteslušnyacute nukleotidtrifosfaacutet či bol inkorporovanyacute jeden priacutepadne viac rovnakyacutech nukleotidtrifosfaacutetov

Zvyacutešenie vyacutekonu pyrosekvenovania umožnila tzv emulznaacute PCR v mikročasticiach a použitie platničky PicoTiterPlatereg toto sekvenovanie zaviedla firma Roche pod pojmom 454 pyrosekvenovanie v roku 2005 Na začiatku sa DNA fragmentuje na uacuteseky dlheacute 400-600 baacutez dvojvlaacuteknovaacute fragmentovanaacute DNA sa liguje s adapteacutermi prostredniacutectvom nich sa naviaže na mikročastice dvojvlaacuteknoveacute fragmenty sa oddelia mikročastice s naviazanyacutemi jednovlaacuteknovyacutemi fragmentami sa premiešajuacute so zmesou oleja a roztoku ktoryacute obsahuje všetky komponenty na uacutespešnuacute PCR Tyacutemto spocircsobom sa okolo každej mikročastice vytvoriacute vlastnyacute mikroreaktor v ktorom prebehne amplifikaacutecia fragmentu Po PCR reakcii sa mikročastice prenesuacute do platničky PicoTiterPlate v ktorej sa do jamky zmestiacute akuraacutet jedna mikročastica a reakčneacute komponenty pyrosekvenačnej reakcie PicoTiterPlatereg maacute 1 600 000 jamiek každaacute jamka maacute maximaacutelny objem 75 picolitra Platnička s mikročasticami sa vložiacute do sekvenačneacuteho systeacutemu ndash priacutestroja v ktorom sa celeacute pyrosekvenovanie uskutočniacute Chemiluminiscenčneacute signaacutely ktoryacutech počas sekvenovania vznikajuacute milioacuteny v priebehu hodiny suacute zachyteneacute CCD kamerou a analyzovaneacute softveacuterom

Firma Illumina predstavila inuacute technoloacutegiu PCR amplifikaacutecia a sekvenovanie sa uskutočňuje na skliacutečku (flow cell) Fragmentaacutecia DNA a pripojenie adapteacuterov prebieha za uacutečasti transpozoacutemov v procese nazvanom tagmentaacutecia Po hybridizaacutecii fragmentov DNA na skliacutečko prebehne v klastroch PCR amplifikaacutecia (tzv mostiacutekovaacute amplifikaacutecia) sekvenaacutecia prebieha za uacutečasti rozdielne fluorescenčne značenyacutech a chemicky modifikovanyacutech nukleotidov pričom každyacute nukleotid emituje fluorescenciu s inou vlnovou dĺžkou Na skliacutečku prebieha paralelne až 6 miliaacuterd sekvenaacutecii (obr 32)

Ďalšiacutemi možnosťami sekvenovania druhej generaacutecie je systeacutem SOLid (vyvinutyacute firmou Applied Biosystem dnes pod Thermo Fisher Scientific) a Ion Semiconductor Sequencing ndash polovodičoveacute ioacutenoveacute sekvenovanie (od firmy Ion Semiconductor Sequencing v suacutečasnosti Thermo Fisher Scientific)

36

Obr 32 Princiacutep sekvenovania novej generaacutecie od firmy Illumina PCR amplifikaacutecia a sekvenovanie sa uskutočňuje na skliacutečku (flow cell) paralelne prebieha až 6 miliaacuterd sekvenaacutecii

632 Sekvenovanie tretej generaacutecie

Pred sekvenovaniacutem netreba amplifikovať DNA PCR metoacutedou ale sekvencia sa ziacuteskava zachyteniacutem signaacutelu v reaacutelnom čase Medzi sekvenovanie tretej generaacutecie patriacute SMRT (Single Molecule Real-Time Sequencing) a Nanopore Sequencing

37

7 Fragmentačnaacute analyacuteza DNA

Je metoacuteda použiacutevanaacute na určenie veľkosti fragmentov DNA ziacuteskanyacutech PCR reakciou Dĺžka amplifikovanyacutech DNA fragmentov sa zistiacute ich porovnaniacutem s veľkostnyacutem štandardom (obr 33) ktoryacute je tvorenyacute DNA fragmentami znaacutemej dĺžky Veľkostnyacute štandard je pred kapilaacuternou elektroforeacutezou zmiešanyacute so vzorkou DNA fragmenty veľkostneacuteho štandardu suacute fluorescenčne označeneacute pričom použiteacute fluorescenčneacute farbivo je ineacute ako fluorescenčneacute farbivo použiteacute na označenie DNA fragmentov vo vyšetrovanej vzorke

Obr 33 Elektroforetogram veľkostneacuteho štandardu použiacutevaneacuteho na určenie veľkostiacute fragmentov analyzovanyacutech kapilaacuternou elektroforeacutezou v genetickom analyzaacutetore (GeneScantrade 500 LIZtrade dye Size Standard) dĺžka fragmentov v nukleotidoch (napr 50 nukleotidov)

Fragmentačnaacute analyacuteza pozostaacuteva z viaceryacutech krokov Prvyacutem je izolaacutecia DNA nasleduje PCR amplifikaacutecia počas ktorej sa novosyntetizovaneacute DNA fragmenty označia fluorescenčnyacutemi farbivami Vzorka s PCR produktom sa pripraviacute na kapilaacuternu elektroforeacutezu tak že sa zmieša s veľkostnyacutem štandardom (sluacuteži na určenie veľkosti fragmentov) a denaturačnou laacutetkou (formamid) nasleduje denaturaacutecia Pripraveneacute vzorky suacute injektovaneacute do priacutestroja (genetickyacute analyzaacutetor) kde v kapilaacutere naplnenej polymeacuterom v elektrickom poli migrujuacute fluorescenčne značeneacute fragmenty DNA na zaacuteklade veľkosti (kapilaacuterna elektroforeacuteza) Počas elektroforeacutezy genetickyacute analyzaacutetor zaznamenaacuteva fluorescenciu fragmentov Analyacutezou daacutet prostredniacutectvom špeciaacutelnych softveacuterov sa ziacuteskajuacute elektroforetogramy z ktoryacutech je možneacute zistiť veľkosť fragmentov ako aj typ fluorescencie (docircležiteacute ak suacute genetickeacute varianty rozliacutešiteľneacute rocircznou fluorescenciou napr SNaPshot) Fragmentačnaacute analyacuteza je suacutečasťou množstva molekulaacuterno-genetickyacutech metoacuted (pozri obr 12 26 28 29 34) ako suacute napr STR analyacuteza (Short Tandem Repeat) AFLP analyacuteza (Amplified Fragment Lenght Polymorfism) RFLPT-RFLP analyacuteza (Restriction Fragment Lenght PolymorfismTerminal Restricted Fragment Lenght Polymorfism) SSCP (Single Strand Conformation Polymorfism) VNTR (Variable Number of Tandem Repeat) analyacuteza straty heterozygotnosti (LOH loss of heterozygozity) MLPA (Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification) MSMSA (Methylation-Sensitive Mobility Shift Assay) SNP genotypovanie (SNaPshotreg) HiCEP (High-Coverage Expression Profiling)

38

Obr 34 Kvantitatiacutevna fragmentačnaacute PCR analyacuteza (QF-PCR) DNA izolovanej z plodovej vody vyacutesledok prenataacutelnej analyacutezy = priacutetomnosť troch piacutekov pre chromozoacutem 18 (u všetkyacutech fragmentov detegujuacutecich chromozoacutem 18 je pomer vyšetrovanyacutech markerov aberantnyacute 21 resp 111) čo znamenaacute trizoacutemiu chromozoacutemu 18 Edwardsov syndroacutem

39

8 Metoacutedy založeneacute na princiacutepe hybridizaacutecie

Nukleoveacute kyseliny majuacute schopnosť vytvaacuterať dvojvlaacuteknoveacute reťazce z jednovlaacuteknovyacutech molekuacutel na zaacuteklade komplementarity baacutez Komplementarita baacutez umožňuje replikaacuteciu DNA transkripciu RNA komplementarita baacutez zabezpečuje teda reprodukovateľnosť živej hmoty

Hybridizaacutecia je proces v ktorom na zaacuteklade komplementarity baacutez dochaacutedza k vytvoreniu dvojvlaacuteknovej nukleovej kyseliny z dvoch jednovlaacuteknovyacutech molekuacutel DNA alebo RNA alebo ich kombinaacuteciou DNA RNA pričom kratšia jednovlaacuteknovaacute nukleovaacute kyselina vystupuje ako sonda (proacuteba) Hybridizaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten je jeden z najpoužiacutevanejšiacutech naacutestrojov v molekulaacuternej bioloacutegii a genetike (hybridizaacutecia primerov alebo proacuteb sa využiacuteva v takmer každej metoacutede - v PCR RT-PCR qPCR RT-qPCR MLPA sekvenovaniacute fragmentačnej analyacuteze FISH DNA mikročipoch atď)

Denaturaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten je proces pri ktorom dochaacutedza k porušeniu vodiacutekovyacutech vaumlzieb medzi vlaacuteknami nukleovyacutech kyseliacuten (strata sekundaacuternej a terciaacutelnej štruktuacutery) tak že docircjde k ich uacuteplneacutemu oddeleniu vzniknuacute jednovlaacuteknoveacute reťazce Denaturaacutecia NK mocircže byť spocircsobenaacute vplyvom vysokyacutech teplocirct pH alebo chemickyacutech laacutetok (denaturačneacute činidlaacute) Renaturaacutecia je opačnyacute proces v ktorom na zaacuteklade komplementarity dochaacutedza k tvorbe dvojvlaacuteknovyacutech NK

Hybridiza čnaacute sonda (proacuteba) je jednovlaacuteknovaacute nukleovaacute kyselina určitej znaacutemej dĺžky a sekvencie (najčastejšie DNA pretože je stabilnejšia ako RNA) ktoraacute je značenaacute a sluacuteži na detekciu komplementaacuternych molekuacutel DNA alebo RNA v procese hybridizaacutecie V zaacutevislosti od podmienok hybridizaacutecie (stringencia) mocircže byť detegovanaacute sekvencia uacuteplne komplementaacuterna alebo v menej priacutesnych podmienkach mocircže mať sekvenčneacute odchyacutelky Proacuteba sluacuteži na vyhľadanie a zviditeľnenie cieľovyacutech NK Zviditeľnenie sa deje prostredniacutectvom označenia proacuteby ešte pred hybridizaacuteciou Značenie proacuteby mocircže byť raacutedioaktiacutevne a neraacutedioaktiacutevne (najčastejšie fluorescenčneacute)

Raacutedioaktiacutevne značeneacute proacuteby pomocou izotopov (32P) sa využiacutevali viac v minulosti v suacutečasnosti suacute kvocircli zdravotnyacutem rizikaacutem ohľaduplnosti k životneacutemu prostrediu ako aj kvocircli jednoduchšej manipulaacutecii použiacutevaneacute fluorescenčne značeneacute proacuteby Raacutedioaktiacutevne značeneacute sondy boli použiacutevaneacute hlavne metoacutedou Southernovej hybridizaacutecie (Southern blotting Southern blot) Citlivosť raacutedioaktiacutevne značenyacutech proacuteb je vyššia dosahuje schopnosť zachytiť 10 fg (femtogram 10-15) cieľovej DNA sekvencie 81 Southern blot

Metoacutedu objavil v roku 1975 britskyacute bioloacuteg Edwin Southern (preto Southern) Pri Southernovej hybridizaacutecii sa restrikčne štiepeneacute fragmenty DNA elektroforeticky separujuacute v geacuteli potom sa metoacutedou blottingu prenesuacute na nylonovuacute alebo nitroceluloacutezovuacute membraacutenu kde suacute naacutesledne hybridizovaneacute v roztoku obsahujuacutecom raacutedioaktiacutevne značenuacute sondu Priloženiacutem fotografickeacuteho filmu k membraacutene a vyvolaniacutem filmu autoraacutediografiou docircjde k zviditeľneniu lokaliacutet kde došlo k hybridizaacuteciiacute raacutedioaktiacutevne značenej sondy s fragmentom DNA (autoraacutediogram) Southern blot bol kľuacutečovou a prvou metoacutedou na identifikaacuteciu osocircb (DNA fingerprinting DNA pofiling) (obr 35)

Okrem Southern blotu existuje Northern blot na analyacutezu RNA (geacutenovej expresie) a Western blot na analyacutezu proteiacutenov postup je obdobnyacute ako pri Southern blote s obmenami špecifickyacutemi pre konkreacutetny blot Pri Northern blote sa použiacutevajuacute hybridizačneacute proacuteby ale pre vizualizaacuteciu proteiacutenov western blotom je potrebneacute použiť protilaacutetky s naacuteslednou vizualizaacuteciou Pomenovanie techniacutek je hra so sloviacutečkami (keďže paacuten Northern ani Western neobjavili takto nazvaneacute techniky)

Neraacutedioaktiacutevne značenie proacuteb použiacutevanyacutech v molekulaacuternej genetike mocircže byť nepriame (použitie haptenu) alebo priame Konečnaacute vizualizaacutecia je najčastejšie zabezpečenaacute fluoreskujuacutecimi farebnyacutemi značkami farbivami fluorochroacutemami (fluorofoacuterami) Pri priamom značeniacute je farbička kovalentne naviazanaacute na nukleotid a na zachytenie fluorescencie suacute potrebneacute špeciaacutelne priacutestroje umožňujuacutece excitaacuteciu farbičky ktoraacute potom emituje žiarenie určitej vlnovej dĺžky (emisneacute žiarenie) a to zachytiacute detekčnyacute systeacutem priacutestroja Využitie fluorochroacutemov v molekulaacuternej genetike je masiacutevne napr na vizualizaacuteciu NK elektroforeticky separovanyacutech v geacuteli kvantifikaacuteciu produktov PCR reakcie v priacutestroji real-time PCR cykleacuter sekvenovaniacute fragmentačnej analyacuteze FISH DNA mikročipoch atď

40

Obr 35 Princiacutep Southern blotu

82 FISH (fluorescenčnaacute in situ hybridizaacutecia)

FISH (fluorescent in situ hybridization fluorescenčnaacute in situ hybridizaacutecia) metoacuteda patriacute medzi molekulovo-cytogenetickeacute techniky Princiacutep FISH metoacutedy je založenyacute na hybridizaacuteciiacute fluorescenčne značenyacutech proacuteb ku komplementaacuternym uacutesekom vyšetrovanej DNA na podložnom skle (priamo na mieste - in situ) K denaturaacutecii dsDNA dochaacutedza buď vplyvom denaturačnyacutech činidiel alebo zvyacutešenou teplotou a naacuteslednou renaturaacuteciou dochaacutedza k naviazaniu sondy na komplementaacuterny uacutesek DNA Vyacutesledok hybridizaacutecie sa vizualizuje fluorescenčnyacutem mikroskopom vybavenyacutem vhodnyacutemi fluorescenčnyacutemi filtrami a vizuaacutelne zhodnotiacute skuacutesenyacutem odborniacutekom Fluorescencia sa v niektoryacutech priacutepadoch mocircže zaznamenať a hodnotiť aj pomocou softveacuteru (obr 36)

Pomocou FISH detegujeme numerickeacute aberaacutecie - zmeny v počte chromozoacutemov (napr trizoacutemia monozoacutemia chromozoacutemov) alebo štruktuacuterne aberaacutecie a prestavby (napr translokaacutecie inverzie deleacutecie duplikaacutecie amplifikaacutecie) FISH metoacuteda umožňuje identifikaacuteciu a detekciu každeacuteho ľudskeacuteho chromozoacutemu jeho zaradenie do karyotypu odhalenie malyacutech submikroskopickyacutech chromozoacutemovyacutech zmien a tiež mapovať poziacutecie jednotlivyacutech geacutenov na chromozoacuteme

41

Obr 36 Princiacutep štandardnej FISH a FISH maľovania celeacuteho chromozoacutemu

Veľkou vyacutehodou FISH metoacutedy je možnosť analyacutezy buniek v metafaacuteze aj v interfaacuteze kedy nie je nutnaacute kultivaacutecia buniek a tiež ryacutechle analyzovanie veľkeacuteho počtu buniek (stovky až tisiacutece) K ďalšiacutem vyacutehodaacutem patriacute bezpečnosť vysokaacute citlivosť dostatočnaacute stabilita relatiacutevne kraacutetky čas hybridizaacutecie a možnosť ryacutechleho vyhodnotenia Hybridizaacutecia pri vaumlčšine suacutečasne dodaacutevanyacutech sond trvaacute 10-12 hodin (na trhu suacute už dostupneacute aj sondy so skraacutetenyacutem časom hybridizaacutecie na 2-3 hodiny) Po hybridizaacuteciiacute nasleduje odmyacutevanie kedy pri priacuteslušnej teplote dochaacutedza k odmytiu nenaviazanyacutech a nespraacutevne hybridizovanyacutech sond Preparaacutet sa naacutesledne podfarbiacute a vyacutesledok sa zhodnotiacute vo fluorescenčnom mikroskope Na podfarbenie chromozoacutemov alebo jadier sa použiacuteva modreacute kontrastneacute farbivo DAPI (46-diamidino-2-fenylindol) ktoreacute maacute silneacute fluorescenčneacute vlastnosti dokaacuteže prechaacutedzať jadrovou membraacutenou a viazať sa na DNA Vyacutesledkom je modreacute zafarbenie ktoreacute vyacuteborne kontrastuje so signaacutelmi jednotlivyacutech sond

Limitujuacutecim faktorom FISH je možnosť identifikaacutecie len tyacutech uacutesekov DNA ku ktoryacutem suacute použiteacute sondy V jednej analyacuteze je možneacute použiť najviac 3 odlišne značeneacute sondy a tak zistiť priacutepadneacute abnormality len na 1 alebo na paacuter lokusoch Na relevantnuacute detekciu je potrebneacute mať vo vzorke 1-5 aberantnyacutech interfaacutezovyacutech jadier

FISH je možneacute uskutočniť na širokej škaacutele biologickeacuteho materiaacutelu na vzorkaacutech perifeacuternej krvi kostnej drene naacuteteroch choriovyacutech klkoch plodovej vode rocircznych druhov tkaniacutev natiacutevnych alebo zaliatych v parafiacutene na 1 bunke (predimplantačnaacute genetickaacute diagnostika PGD) (obr 37)

Využiacuteva sa na detekciu aberaacuteciiacute pri mnohyacutech onkologickyacutech ochoreniach (napr pri diagnoacuteze mnohopočetnyacute myeloacutem sa v suacutečasnosti po separaacutecii CD138+ buniek robiacute FISH s 5 sondami pre geacuteny IGH TP53 RB1 oblasť 1p321q21 a stanovuje sa hyperploidia chromozoacutemov 5 9 a 15) a tiež k spresneniu doplneniu a k overeniu bežneacuteho cytogenetickeacuteho vyšetrenia

Podľa miesta na chromozoacuteme na ktorom dochaacutedza k hybridizaacutecii sondy rozlišujeme 4 typy

DNA sond bull centromeacuteroveacute sondy ndash sa viažu na strednuacute časť chromozoacutemu ndash centromeacuteru sluacutežia k diagnostike zmien v počte chromozoacutemov k detekcii chromozoacutemov neznaacutemeho pocircvodu umožňujuacute interfaacuteznu FISH na nedeliacich sa bunkaacutech (obr 38-41)

42

Obr 37 Interfaacutezna FISH preimplantačnyacute genetickyacute skriacutening aneuploidiiacute ndash blastomeacutera 3-denneacuteho ľudskeacuteho embrya s normaacutelnym počtom chromozoacutemov 13 18 21 pohlavie XY použityacutech 5 sond pre chromozoacutemy 13 ndash orange 18 ndash aqua 21 ndash green X ndash blue a Y ndash yellow (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

Obr 38 Interfaacutezne jadro po hybridizaacutecii s centromeacuterovou sondou pre chromozoacutem 8 (Vysis Abbott) V pravom jadre je priacutetomnaacute trizoacutemia chromozoacutemu 8 (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex) Obr 39 Metafaacutezna (A) a interfaacutezna FISH (B) použitaacute centromeacuterovaacute sonda CEPX spectrum orangeCEPY spectrum green (Vysis Abbott) Sonda hybridizuje k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (červenyacute signaacutel) a Y (zelenyacute signaacutel) (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

43

Obr 40 Interfaacutezna FISH vyšetrenie spermiiacute použiteacute sondy CEPX greenCEPY orange (Aneuscore Metasystems) Sondy hybridizujuacute k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (zelenyacute signaacutel) Y (červenyacute signaacutel) vľavo ndash dve haploidneacute spermie (majuacutece jedna spermia X druhaacute Y chromozoacutem) vpravo ndash dve patologickeacute spermie obsahujuacutece gonozoacutemovyacute komplement XY (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

Obr 41 Interfaacutezna FISH vyšetrenie spermiiacute použiteacute sondy CEPX greenCEPY orange a CEP18 aqua (Aneuscore Metasystems) Sondy hybridizujuacute k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (zelenyacute signaacutel) Y (červenyacute signaacutel) a 18 (modryacute signaacutel) vľavo ndash normaacutelne haploidneacute ľudskeacute spermie - 1x chromozoacutem X alebo Y a jedenkraacutet chromozoacutem 18 v strede ndash patologickaacute spermia obsahujuacuteca gonozoacutemovyacute komplement XY a jeden chromozoacutem 18 vpravo ndash patologickaacute diploidnaacute spermia s chromozoacutemami X Y a dvoma chromozoacutemami 18 (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

bull lokusovo špecifickeacute sondy ndash hybridizaacutecia prebehne na konkreacutetnom mieste geacutenu (lokuse) (obr 42-44) použiacutevajuacute sa k vyšetreniu mikrodeleacuteciiacute (straty malyacutech častiacute chromozoacutemu pri mikrodelečnyacutech syndroacutemoch) k zisteniu amplifikaacutecie onkogeacutenov a niektoryacutech špecifickyacutech translokaacuteciiacute prestavby geacutenov umožňujuacute interfaacuteznu FISH na nedeliacich sa bunkaacutech bull subtelomeroveacute ndash vaumlzba na koncoveacute časti chromozoacutemu ndash telomeacutery bull celochromozoacutemoveacute alebo celomaľovacie sondy ndash sondy hybridizujuacute s mnohopočetnyacutemi chromozoacutemovyacutemi sekvenciami pričom sa fluorescenčne tak bdquovymaľujeldquo celyacute chromozoacutem (Obr 45) Použiacutevajuacute sa na vyšetrenie chromozoacutemovyacutech prestavieb k analyacuteze translokaacuteciiacute a k detekcii pocircvodu tzv marker chromozoacutemov (malyacutech nadpočetnyacutech chromozoacutemov neznaacutemeho pocircvodu) K použitiu sondy suacute potrebneacute metafaacutezne chromozoacutemy nepoužiacutevaju sa pre interfaacuteznu FISH

Pri konvenčnej chromozoacutemovej FISH suacute homogeacutenne DNA proacuteby hybridizovaneacute s fixovanyacutem metafaacuteznym alebo prometafaacuteznym chromozoacutemomchromozoacutemami na skliacutečku (Obr 36a) Maximaacutelna rozlišovacia schopnosť metafaacuteznej FISH je niekoľko megabaacutez (Obr 39a 45) využitiacutem viac

44

natiahnutyacutech prometafaacuteznych chromozoacutemov sa dosiahne 1 Mb rozliacutešenie Prostredniacutectvom fiber FISH konkreacutetne artificiaacutelne deproteinizovanej natiahnutej DNA pripravenej in situ z celyacutech buniek na mikroskopickom skliacutečku je možneacute vizualizovať individuaacutelne geacuteny maleacute DNA elementy na chromozoacuteme s rozliacutešeniacutem okolo 1000 bp

Obr 42 Interfaacutezne jadro po hybridizaacutecii s lokusovo-špecifickou sondou LSI 5q31 Spectrum Orange5p12 Spectrum Green (Vysis Abbott) Na ľavom obraacutezku suacute priacutetomneacute dva červeneacute (5q31) a dva zeleneacute signaacutely (5p12) v pravom jadre je priacutetomnaacute deleacutecia 5q31 oblasti chyacuteba jeden červenyacute signal (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

Obr 43 Interfaacutezna FISH použitaacute lokusovo-špecifickaacute sonda ndash translokačnaacute - XL BCRABL1 plus (Metasystems) dvojfarebnaacute dvojfuacutezna kde červenaacute označuje lokus ABL1 na chromozoacuteme 9 a zelenaacute oblasť BCR na chromozoacuteme 22 Sonda deteguje fuacuteziu protoonkogeacutenu ABL1 (9q34) a geacutenu BCR (22q11) v priacutepade že červenyacute a zelenyacute signaacutel suacute pri sebe (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

45

Obr 44 Interfaacutezna FISH Použitaacute lokusovo-špecifickaacute sonda- typ break apart pre IGH geacuten V docircsledku translokaacutecie došlo k rozskočeniu geacutenu pričom translokačneacuteho partnera nepoznaacuteme vieme určiť len percento v koľkyacutech jadraacutech je geacuten prestavanyacute (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex) Obr 45 Použiteacute celochromozoacutemoveacute sondy WCP 15 (červenyacute chromozoacutem) a WCP 17 (zelenyacute chromozoacutem) Na metafaacuteze je potvrdenaacute reciprokaacute translokaacutecia t(1517)(q2221) (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

FISH vizualizaacutecia celeacuteho chromozoacutemu maľovanie chromozoacutemu anglicky chromosome

painting je špeciaacutelnou aplikaacuteciou chromozoacutemovej FISH proacuteba je koktail veľkeacuteho počtu rocircznych fluorescenčne značenyacutech DNA fragmentov hybridizujuacutecich pozdĺž celeacuteho konkreacutetneho chromozoacutemu (obr 36b 45) bdquoChromosomepaintingldquo analyzuje metafaacutezne chromozoacutemy V minulosti bola FISH vizualizaacutecia celyacutech chromozoacutemov limitovanaacute malyacutem množstvom rocirczne sfarbenyacutech fluorochroacutemov

V suacutečasnosti je možneacute detegovať množstvo cieľovyacutech sekvenciiacute naraz čo sa využiacuteva pri celogenoacutemovej chromozoacutemovej vizualizaacutecii (whole-chromosomepainting - WCP) metoacutedou multiplex FISH (M-FISH multicolor FISH o br 46) alebo spektraacutelnej karyotypizaacutecie (SKY) kedy možno rozliacutešiť všetky ľudskeacute chromozoacutemy ndash teda 24 rocircznych chromozoacutemov M-FISH a SKY patria medzi metafaacutezne formy FISH diagnostiky ktoreacute umožňujuacute simultaacutennu vizualizaacuteciu všetkyacutech ľudskyacutech chromozoacutemov v rocircznych farbaacutech čo predstavuje uľahčenie analyacutezy karyotypu hlavne pri komplexnyacutech zmenaacutech a markeroch neznaacutemeho pocircvodu Obe techniky vychaacutedzajuacute z použitia

46

celochromozoacutemovyacutech sond značenyacutech kombinaacuteciou viaceryacutech fluorochroacutemov Rozdiel medzi M-FISH a SKY spočiacuteva v technike ziacuteskania konečneacuteho obrazu

Obr 46 Multicolor FISH - každyacute chromozoacutemovyacute paacuter je zafarbenyacute inou farbou pričom na ich zafarbenie postačuje kombinaacutecia 5 fluorochroacutemov Na vyhodnocovanie je potrebnaacute špeciaacutelna sada fluorescenčnyacutech filtrov pre jednotliveacute fluorochroacutemy a špeciaacutelnyacute softweacuter Vľavo-štandardnyacute karyotyp vpravo karyotyp s mutaacuteciami (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

V molekulovej cytogenetike suacute komerčne dostupneacute sety M-FISH proacuteb umožňujuacutece

viacfarebneacute pruacutežkovanie chromozoacutemov (banding) s vysokyacutem rozliacutešeniacutem (multicolor-banding mBAND FISH MCB) čo umožňuje identifikaacuteciu intrachromozoacutemovyacutech prestavieb (Obr 47) Nevyhnutnosťou mBAND-u je mať chromozoacutemy v metafaacuteze Taacuteto metoacuteda bola prvyacutekraacutet uskutočnenaacute na chromozoacuteme 5 v roku 1999 mBAND FISH umožňuje rozliacutešiť špecifickeacute oblasti chromozoacutemov na uacuterovni pruacutežku - bandu a sub-bandu s detekciou 550 bandov haploidneacuteho karyotypu

Obr 47 A - mBAND chromozoacutemu 11 - inverzia duplikovanej oblasti 11q223-q25 B - mBAND chromozoacutemu 3 - na kruhovom chromozoacuteme deleacutecia oblasti 3p263 C - mBAND chromozoacutemu 2 - potvrdenie inverzie duplikovanej časti chromozoacutemu (poskytnuteacute RNDr Dagmar Landlovou Medirex)

FISH metoacuteda a jej varianty (M-FISH mBAND SKY) majuacute v suacutečasnosti širokeacute využitie v

klinickej genetike v onkologickej genetike na detekciu aberaacuteciiacute v čase diagnoacutezy počas liečby po

47

liečbe monitorovanie po transplantaacutecii kostnej drene v prenataacutelnej a postnataacutelnej diagnostike pri detekcii submikroskopickyacutech deleacuteciiacute (napr DiGeorge syndroacutem - 22q112 delečnyacute syndroacutem PraderndashWilli syndroacutem- chromozoacutem 15q11-13) prostredniacutectvom FISH je možnaacute detekcia numerickyacutech zmien chromozoacutemov (trizoacutemia chromozoacutemu 21 pri Downovom syndroacuteme trizoacutemia chromozoacutemu 15 pri Patauovom syndroacuteme trizoacutemia chromozoacutemu 18 pri Edwardsovom syndroacuteme) rocirczne zmeny v počte pohlavnyacutech chromozoacutemov (monozoacutemia X pri Turnerovom syndroacuteme Klinefelterov syndroacutem s X chromozoacutemom naviac - XXY) podobne v predimplantačnej diagnostike

83 DNA Microarray (DNA mikro čip biočip) DNA mikročipovanie je technika využiacutevajuacuteca hybridizaacuteciu skuacutemanej nukleovej kyseliny

(cieľovaacute vzorka) s veľkyacutem množstvom oligonukleotidovyacutech proacuteb (desať tisiacutec až milioacuten) ktoreacute suacute prichyteneacute na pevnyacute podklad najčastejšie sklenyacute silikoacutenovyacute alebo nylonovyacute (doštička čip) Skuacutemanaacute nukleovaacute kyselina je pred hybridizaacuteciou fragmentovanaacute označenaacute fluorofoacuterom a denaturovanaacute Po kontakte čipu s cieľovou vzorkou ktoraacute je vlastne zmes označenyacutech oligonukleotidov značeneacute oligonukleotidy hybridizujuacute s oligonukleotidovyacutemi sekvenciami prichytenyacutemi na čipe Potom suacute na zaacuteklade fluorescencie detekovaneacute miesta kde došlo k hybridizaacutecii čiže vzorka obsahovala takuacuteto nukleotidovuacute sekvenciu Z jedneacuteho mikročipu sa ziacuteska obrovskeacute množstvo daacutet ktoreacute je vždy nutneacute softveacuterovo spracovať V dnešnej dobe existuje niekoľko firiem poskytujuacutecich komerčne mikročipy na objednaacutevku alebo si ich laboratoacuteria produkujuacute sami

Mikročipovanie prebieha nasledovne

1) Vytvorenie DNA čipu ndash tisiacutece rocircznych jednovlaacuteknovyacutech DNA oligonukleotidov znaacutemych sekvencii sa kovalentne naviažu na povrch doštičky vždy v určitej lokalite je niekoľko rovnakyacutech oligonukleotidov veľkosť takejto lokality je ˂ 200 microm Proacutebami mocircže byť DNA cDNA alebo syntetizovaneacute oligonukleotidy Už hotoveacute mikročipy ponuacutekajuacute viacereacute firmy (Affymetrix Agilent Technologies Eppendorf Illumina) alebo si ich jednotliveacute laboratoacuteria vyraacutebajuacute sami pomocou robotickyacutech zariadeniacute DNA čip sa vytvaacutera buď nanaacutešaniacutem kvapiek oligonukleotidov na podklad alebo synteacutezou oligonukleotidov in situ na čipe 2) Priacuteprava vzorky ndash nukleovaacute kyselina (mRNA DNA) sa purifikuje určiacute sa jej kvantita a kvalita (spektrofotometericky) fragmentuje resp v priacutepade mRNA sa syntetizuje cDNA v priacutepade potreby sa mocircže DNA amplifikovať PCR reakciou štiepiť restrikčnyacutemi endonukleaacutezami 3) Fluorescenčneacute označenie (zriedkavejšie raacutedioaktiacutevne) fragmentov DNA prebieha počas reverznej transkripcie alebo PCR amplifikaacutecie za uacutečasti fluorescenčne značenyacutech nukleotidov Keď sa analyzujuacute dve rocirczne vzorky napr zdraveacute tkanivo a naacutedoroveacute tkanivo označenie nukleovyacutech kyseliacuten v tyacutechto tkanivaacutech byacuteva rozdielne a to použitiacutem dvoch rocircznych fluorescenčnyacutech farbiacutev (napr zeleneacute a červeneacute) Pred hybridizaacuteciou je potrebneacute vzorku denaturovať čiacutem sa vytvoriacute zmes jednovlaacuteknovyacutech DNA označenyacutech značkou 4) Hybridizaacutecia s mikročipom ndash v špeciaacutelnom hybridizačnom roztoku hybridizujuacute komplementaacuterne sekvencie zo vzorky s priacuteslušnyacutemi oligonukleotidovyacutemi sondami naviazanyacutemi na čipe Potom sa čip obmyje aby došlo k odstraacuteneniu čiastočne hybridizovanyacutech nukleovyacutech kyseliacuten 5) Skenovanie mikročipu ndash skenerom čipov docircjde k ožiareniu čipu laserom pričom v mieste hybridizaacutecie fluorescenčne značenyacutech DNA fragmentov s proacutebou docircjde k emisii svetla určitej vlnovej dĺžky ktoruacute skener zaznamenaacute 6) Analyacuteza daacutet prebieha metoacutedami bioinformatiky spracovaniacutem softveacutermi sa zistiacute ktoreacute lokality čipu navzaacutejom hybridizovali v priacutepade použitia dvoch vzoriek kontrolnej a skuacutemanej je možneacute analyzovať ich relatiacutevnu intenzitu hybridizaacutecie (expresie určiteacuteho geacutenu)

Existujuacute štyri typy mikročipov 1) Čipy ur čeneacute na analyacutezu expresie (obsahujuacute cDNA proacuteby) pre tzv dvojkanaacutelovyacute experiment kedy je vzorka určenaacute k hybridizaacutecii na čipe ziacuteskanaacute zmiešaniacutem DNA fragmentov kontrolnej a skuacutemanej vzorky pričom fragmenty suacute rozdielne fluorescenčne označeneacute (napr zelenyacute fluorofoacuter pre kontrolnuacute vzorku a červenyacute pre skuacutemanuacute) Na zaacuteklade intenzity a typu fluorescencie sa deteguje expresia geacutenov typickaacute pre kontrolnuacute vzorku (napr zelenaacute fluorescencia) pre skuacutemanuacute vzorku (napr

48

červenaacute fluorescencia) a expresia podobnaacute u oboch vzoriek (žltaacute fluorescencia) neexprimovaneacute geacuteny (čierna fluorescencia) rocirczne odtiene (v zaacutevislosti od prevažujuacutecej hybridizaacutecie) (obr 48) 2) Čipy ur čeneacute na analyacutezu mutaacutecii použije sa genoacutemovaacute DNA označenaacute jednou fluorescenčnou farbičkou na určenie jednonukleotidovej zmeny (SNP ndash Single Nukleotide Polymorphism) 3) Čipy na komparatiacutevnu genoacutemovuacute hybridizaacuteciu (aCGH array Comparative Genomic Hybridization) ndash použiacutevaneacute na zistenie zvyacutešenia alebo zniacuteženia množstva chromozoacutemovyacutech fragmentov obsahujuacutecich geacuteny zodpovedneacute za určiteacute ochorenie Na analyacutezu sa použije skuacutemanaacute gDNA a referenčnaacute (kontrolnaacute) DNA každaacute sa značiacute inou fluorescenčnou farbičkou (princiacutep ako pri analyacuteze expresie) (obr 49 50) 4) Čipy CGH - SNP kombinovaneacute čipy ur čeneacute na analyacutezu aj mutaacuteciiacute SNP aj na komparatiacutevnu genoacutemovuacute hybridizaacuteciu CGH

Mikročipy majuacute rozsiahle využitie napriacuteklad v identifikaacuteciiacute novyacutech geacutenov vo vyacuteskume ich funkciiacute expresie v rocircznych podmienkach pri diagnostike mnohyacutech ochoreniacute vo farmakogenomike vo vyacuteskume vplyvu toxiacutenov

Obr 48 Heatmapa geacutenovej expresie vybranyacutech geacutenov (mRNA) mikročip obsahuje 46000 cDNA proacuteb (poskytnuteacute Ing Helenou Gbelcovou PhD Uacutestav lekaacuterskej bioloacutegie genetiky a klinickej genetiky LF UK a UNB)

49

Obr 49 Princiacutep komparatiacutevnej genoacutemovej hybridizaacutecie (aCGH - array comparative genomic hybridization) Obr 50 A) Vyacutesledok komparatiacutevnej genoacutemovej hybridizaacutecie (aCGH - array comparative genomic hybridization) vzorky DNA izolovanej plodovej vody U plodu s abnormaacutelnym ultrasonografickyacutem vyšetreniacutem bola identifikovanaacute duplikaacutecia oblasti 3q261q29 (modryacute paacutes) a deleacutecia oblasti 5p1533p151 (červenyacute paacutes) Pre porovnanie chromozoacutem 1 bez aberaacutecie b) Ten istyacute pacient ale ineacute softveacuteroveacute spracovanie (poskytnuteacute RNDr Miroslavom Tomkom PhD Medirex)

50

Odporuacutečanaacute a použitaacute literatuacutera

Odborneacute knihy Klug W S Cummings M R Spencer Ch A Palladino M A Concepts of Genetics jedenaacuteste vydanie (2015) Carson S Molecular Biology Techniques tretie vydanie (2012) Strachan T Read A Human Molecular Genetics štvrteacute vydanie (2011) Sudbery P Sudbery I Human Molecular Genetics tretie vydanie (2009)

Internetoveacute straacutenky

wwwncbinlmnihgov wwwmlpacom wwwthermofishercom wwwilluminacom wwwpromegask wwwqiagencom wwwambioncom

Odborneacute člaacutenky Chacon-Cortes D Griffiths L R Methods for extracting genomic DNA from whole blood samples current perspectives Journal of Biorepository Science for Applied Medicine Volume 2 strany 1- 9 Viltrop T Krjutskov K Palta P Metspalu A Comparison of DNA extraction methods for multiplex polymerase chain reaction Anal Biochem 2010 Volume 398(2) strany 260-262 Ing Martin Čermaacutek Molekulaacuterna cytogenetika v problematike familiaacuternych maligniacutet Onkoloacutegia Volume 2 strany 77 - 83 Livak KJ Schmittgen TD Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method Methods 2001 Volume 25(4) strany 402 - 408 Bustin S A Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays J Mol Endocrinol 2000 Volume 25(2) strany169 - 193

MOLEKULAacuteRNE METOacuteDY AKTUAacuteLNE POUŽIacuteVANEacute V KLINICKEJ GENETIKE RNDr Andrea Pastoraacutekovaacute PhD RNDr Robert Petrovič PhD Vydala Univerzita Komenskeacuteho v Bratislave Lekaacuterska fakulta Rozsah 50 straacuten 246 AH prveacute vydanie ISBN 978-80-223-4231-5

23

4 Elektroforetickaacute separaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten

Separaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten predstavuje rozdelenie molekuacutel DNA alebo RNA na zaacuteklade veľkosti zloženia a poradia baacutez Podobnyacutemi metoacutedami je možneacute separovať aj proteiacuteny

Elektroforeacuteza (ELFO) je technika použiacutevanaacute na separaacuteciu niekedy aj purifikaacuteciu makromolekuacutel ako suacute nukleoveacute kyseliny a proteiacuteny na zaacuteklade ich rozdielnej veľkosti naacuteboja alebo konformaacutecie Je to metoacuteda veľmi často využiacutevanaacute nielen v molekulovej genetike ale aj biocheacutemii Elektroforeacuteza využiacuteva schopnosť nabityacutech molekuacutel migrovať v jednosmernom elektrickom poli k opačneacutemu poacutelu Nukleoveacute kyseliny majuacute vďaka svojej fosfaacutetovej zložke negatiacutevny naacuteboj preto v jednosmernom elektrickom poli migrujuacute ku kladneacutemu poacutelu čiže k anoacutede Elektroforeacuteza prebieha v elektroforetickej aparatuacutere v geacuteloch (v nosiči) so sieťovitou štruktuacuterou ktoraacute umožňuje separaacuteciu molekuacutel Vzorka nukleovej kyseliny zmiešanaacute s tzv nanaacutešaciacutem tlmivyacutem roztokom s farbičkou sa nanesie do jamky v geacuteli ktoryacute je umiestnenyacute v elektroforetickej aparatuacutere v priacutetomnosti elektroforetickeacuteho pufra (TAE alebo TBE) (obr 22) Nanaacutešaciacute tlmivyacute roztoknanaacutešacia farbička umožňuje na zaacuteklade migraacutecie farbičky vidieť migraacuteciu vzorky v geacuteli a suacutečasne zvyacutešeniacutem hustoty vo vzorke umožniacute klesnuacuteť vzorke do jamky a tak zabraacuteniť jej vyplaveniu z geacutelu Draacuteha je časť geacutelu ktoryacutem putuje jedna vzorka od katoacutedy k anoacutede V draacutehe sa nachaacutedzajuacute oddeleneacute jednotliveacute fragmenty nukleovyacutech kyseliacuten určityacutech veľkostiacute viditeľneacute vo forme pruacutežkov (angl bands) Intenzita pruacutežku zaacutevisiacute od množstva molekuacutel danej veľkosti je ekvivalentnaacute hmotnosti Na určenie veľkosti fragmentov NK sa do jednej jamky nanesie štandard molekulovyacutech hmotnostiacute (angl ladder) ktoryacute maacute presne definovaneacute veľkosti fragmentov čo umožňuje odhadnuacuteť veľkosť aj hmotnosť neznaacutemych separovanyacutech fragmentov

Obr 22 Elektroforetickaacute separaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten v agaroacutezovom geacuteli (A) a vizualizaacutecia UV svetlom a GelRedtrade (B C)

24

Nukleoveacute kyseliny je možneacute elektroforeticky separovať 1) v geacuteloch agaroacutezovom (horizontaacutelna elektroforeacuteza) (obr 22) a polyakrylamidovom (vertikaacutelna elektroforeacuteza) 2) v špeciaacutelnych lineaacuternych polymeacuteroch kapilaacuternou elektroforeacutezou použitiacutem genetickeacuteho analyzaacutetora (obr 23)

Agaroacuteza je polysacharid ziacuteskanyacute z morskej riasy použiacuteva sa najčastejšie v koncentraacuteciiacute 05-2 čiacutem vyššia koncentraacutecia tyacutem je geacutel pevnejšiacute a schopnejšiacute rozliacutešiť menšie fragmenty NK Priacuteprava je jednoduchaacute odvaacuteži sa potrebneacute množstvo agaroacutezy ktoraacute sa zmieša s tlmivyacutem roztokom (pufrom) rozvariacute sa v mikrovlnnej ruacutere a naleje sa do špeciaacutelnej naacutedoby na vytvaacuteranie geacutelov kyacutem je geacutel tekutyacute vložiacute sa do neho tzv hrebeň na vytvorenie jamiek Agaroacuteza je netoxickaacute V bežnom agaroacutezovom geacuteli v zaacutevislosti od jeho koncentraacutecie je možneacute separovať DNA fragmenty dĺžky 200-50 000 bp Dnes suacute dostupneacute aj špeciaacutelne agaroacutezy napr MetaPhorreg Agarose schopneacute oddeliť fragment DNA dĺžky 20-800bp Separaacutecia v agaroacutezovom geacuteli prebieha v horizontaacutelnej aparatuacutere preto sa nazyacuteva aj horizontaacutelna elektroforeacuteza

Polyakrylamidovyacute geacutel (PAGE) vznikaacute polymerizaacuteciou akrylamidu v priacutetomnosti špeciaacutelnych chemickyacutech laacutetok (peroxodisiacuteran amoacutenny TEMED bisakrylamid) Jeho priacuteprava je preto odlišnaacute a aj naacuteročnejšia Polyakrylamidoveacute geacutely majuacute vysokuacute rozlišovaciu schopnosť (1bp) preto suacute PAGE geacutely vhodneacute aj na sekvenovanie DNA klasickyacutemi metoacutedami PAGE geacutel nie je vhodnyacute na separaacuteciu fragmentov dlhšiacutech ako 2kb Použiacuteva sa v koncentraacutecii 35 -20 s rozliacutešeniacutem fragmentov od 10bp-2000bp Akrylamid je neurotoxiacuten musiacute sa s niacutem pracovať veľmi opatrne PAGE elektroforeacuteza bežiacute vo vertikaacutelnej aparatuacutere preto sa volaacute aj vertikaacutelna elektroforeacuteza použiacuteva sa často aj na separaacuteciu proteiacutenov

Ryacutechlosť pohybu nukleovyacutech kyseliacuten (mobilita) určuje viacero faktorov 1) veľkosť NK ndash počet baacutezovyacutech paacuterov resp baacutez pričom menšie molekuly prechaacutedzajuacute geacutelom ryacutechlejšie pretože sa ľahšie pohybujuacute v geacuteli 2) konformaacutecia nukleovej kyseliny napr u rovnako veľkyacutech plazmidov kondenzovaneacute superšpiralizovaneacute plazmidy migrujuacute najryacutechlejšie rovnako veľkeacute lineaacuterne molekuly (toho isteacuteho plazmidu) bežia pomalšie a najpomalšie putujuacute relaxovaneacute kruhoveacute molekuly plazmidu 3) koncentraacutecia geacutelu určuje jeho rozlišovaciu schopnosť koncentrovanejšiacute geacutel je schopnyacute separovať kratšie fragmenty NK redšie geacutely suacute vhodneacute pre rozliacutešenie vaumlčšiacutech fragmentov 4) zloženie geacutelu je docircležiteacute pri analyacuteze sekundaacuternych štruktuacuter NK a proteiacutenov v nedenaturovanom stave sekundaacuterna štruktuacutera spomaľuje migraacuteciu NK a proteiacutenov Tento fakt využiacutevajuacute niektoreacute diagnostickeacute techniky (napr SSCP - Single Strand Conformation Polymorphism - polymorfismus konformaacutecie jednovlaacuteknovej DNA) umožňujuacutece detekciu zaacutemeny jedinej baacutezy ktoraacute spocircsobiacute odlišneacute vnuacutetromolekuloveacute paacuterovanie a vyacuteslednuacute konformaacuteciu molekuly Geacutely mocircžu teda byť denaturačneacute a nedenaturačneacute (natiacutevne) 5) napaumltie zdroja - čiacutem vyššie je napaumltie ktoreacute vytvaacutera elektrickeacute pole v elektroforetickej aparatuacutere tyacutem ryacutechlejšie fragmenty NK migrujuacute 6) zloženie roztokov a teploty

Elektroforetickyacute tlmivyacute roztok (pufor - elektrolyt) zabezpečuje stabilneacute elektroforetickeacute podmienky počas separaacutecie geacutel je v ňom ponorenyacute Obsahuje ioacuteny čo umožňuje vedenie elektrickeacuteho pruacutedu

Štandard molekulovyacutech hmotnostiacute (v laboratoacuteriaacutech nazyacutevanyacute ladder alebo marker) je zmes fragmentov DNA alebo RNA s presne definovanou veľkosťou ktoryacute sluacuteži na odhad veľkosti vyšetrovanyacutech fragmentov NK (obr 22) Pomocou špeciaacutelnych štandardov molekulovyacutech hmotnostiacute ktoryacutech fragmenty NK majuacute definovanuacute aj hmotnosť je možneacute odhadnuacuteť množstvo (hmotnosť - koncentraacuteciu) neznaacutemeho fragmentu

B C

25

41 Vizualizaacutecia DNA

Samotnaacute nukleovaacute kyselina je počas elektroforetickej separaacutecie neviditeľnaacute Vizualizaacuteciu NK umožňujuacute interkalačneacute činidlaacute ktoreacute suacute schopneacute naviazať sa na molekuly NK tyacutem že sa včlenia medzi susediace baacutezy Po ožiareniacute UV svetlom interkalačneacute činidlaacute naviazaneacute na NK fluoreskujuacute tak sa vizualizuje NK čiacutem intenziacutevnejšie fluoreskuje tyacutem viac NK je v geacutelipruacutežku priacutetomneacute Interkalačneacute činidlo sa buď primieša do geacutelu pri jeho priacuteprave čo umožniacute sledovať migraacuteciu fragmentov NK počas elektroforeacutezy a to po vybratiacute z ELFO aparatuacutery a po ožiareniacute UV svetlom alebo sa geacutel farbiacute po elektroforetickej separaacutecii V minulosti bol na zviditeľnenie NK najčastejšie použiacutevanyacute etidiumbromid kvocircli jeho mutageacutennym vlastnostiam sa v suacutečasnosti nahraacutedza menej mutageacutennymi a netoxickyacutemi činidlami ako suacute napr komerčne dostupneacute SYBRregSafe GelRedtrade GelGreentrade

Kapilaacuterna elektroforeacuteza NK prebieha v špeciaacutelnom priacutestroji genetickom analyzaacutetore (obr 23) ktoryacute musiacute mať zaacutekladneacute komponenty ako suacute elektroacutedy kapilaacutera zdroj vysokeacuteho napaumltia detektor prepojenie s počiacutetačom a softveacuteroveacute vybavenie priestor na vloženie vzoriek atď Genetickyacute analyzaacutetor predstavuje automatizovanyacute systeacutem umožňujuacuteci sekvenovanie určovanie dĺžky DNA fragmentov ndash fragmentačnuacute analyacutezu a kvantifikaacuteciu nukleovyacutech kyseliacuten V novšiacutech typoch genetickeacuteho analyzaacutetora je proces analyacutezy od vloženia vzoriek do stojana automatizovanyacute

Vzorka určenaacute na analyacutezu je elektrokineticky injektovanaacute do tenkej kapilaacutery naplnenej lineaacuternym polymeacuterom Vplyvom vysokeacuteho napaumltia sa negatiacutevne nabiteacute fragmenty DNA pohybujuacute v polymeacuteri k pozitiacutevne nabitej elektroacutede Kapilaacuterna elektroforeacuteza je tak citlivaacute že je schopnaacute detegovať jednobaacutezovyacute rozdiel DNA fragmentov DNA fragmenty musia byť pred kapilaacuternou elektroforeacutezou fluorescenčne označeneacute v kapilaacutere suacute separovaneacute na zaacuteklade veľkosti Kraacutetko pred dosiahnutiacutem kladne nabitej elektroacutedy docircjde po excitaacutecii laserovyacutem žiareniacutem k emisii žiarenia fluoroformi (farbičkami) tak že optickyacute detekčnyacute systeacutem zaznamenaacute fluorescenciu ktoraacute je naacutesledne softveacuterovo spracovanaacute a vyhodnotenaacute

Obr 23 Genetickyacute analyzaacutetor

42 RFLP

Metoacuteda polymorfizmu dĺžky restrik čnyacutech fragmentov (angl Restriction Fragment Length Polymorfism) bola prvou metoacutedou využiacutevanou na detekciu DNA variaacuteciiacute rocircznych biologickyacutech vzoriek Princiacutep metoacutedy spočiacuteva v priacutetomnosti polymorfizmov v DNA sekvencii rocircznych ľudiacute ktoreacute zapriacutečinia rozdielny profil (obrazec) DNA fragmentov po štiepeniacute jednou alebo viaceryacutemi restrikčnyacutemi endonukleaacutezami Restrikčneacute endonukleaacutezy (RE) suacute enzyacutemy ktoreacute štiepia DNA molekulu v oblasti špecifickej nukleotidovej sekvencie nazyacutevanej restrik čneacute miesto RE najčastejšie rozpoznaacutevajuacute a štiepia miesto veľkeacute 4-6 baacutez RE suacute priacutetomneacute u prokaryotov (bakteacuterie a archebakteacuterie) kde suacute suacutečasťou restrik čno-modifikačneacuteho systeacutemu akoby prokaryotickeacutej vrodenej imunity sluacutežia

26

na ochranu pred cudzou DNA (napr viacuterusovou) ktoruacute po rozpoznaniacute špecifickej sekvencie štiepia

Restrikčno-modifikačnyacute systeacutem maacute dve zložky 1) modifikačneacute enzyacutemy - metylaacutezy ktoreacute procesom metylaacutecie modifikujuacute určiteacute baacutezy svojej DNA čiacutem ich označia za vlastnuacute DNA takže takaacuteto DNA je potom rezistentnaacute voči štiepeniu restrikčnyacutemi endonukleaacutezami Najčastejšiacutem spocircsobom metylaacutecie u bakteacuteriiacute je metylaacutecia adeniacutenu na N6 pričom vznikne metyladeniacuten alebo cytoziacutenu na C5 metylcytoziacuten 2) restrikčneacute endonukleaacutezy štiepia špecifickeacute miesto dvojvlaacuteknovej DNA ktoreacute je tvoreneacute symetrickou sekvenciou zrkadlovo sa opakujuacutecich nukleotidov ndash tzv palindroacutem Restrikčneacute enzyacutemy sa použiacutevajuacute na štiepenie DNA sekvencie na mieste špecifickom pre tuacute ktoruacute restrikčnuacute endonukleaacutezu napr pri analyacuteze polymorfizmov dĺžky restrikčnyacutech fragmentov (RFLP) analyacuteze jednonukleotidovyacutech polymorfizmov (SNP) mutaacuteciiacute ako aj pri klonovaniacute DNA do vhodnyacutech vektorovyacutech DNA molekuacutel

Po štiepeniacute dvojvlaacuteknovej DNA restrikčnou endonukleaacutezou mocircžu vzniknuacuteť tri typy koncov - 5´-prečnievajuacutece konce (lepiveacute) 3´-prečnievajuacutece konce (lepiveacute) a tupeacute konce (obr 24)

Obr 24 Restrikčneacute štiepenie zanechaacutevajuacutece rocirczne konce tupeacute a lepiveacute

Restrikčneacute štiepenie je často použiacutevanou metoacutedou geacutenovyacutech manipulaacuteciiacute na konštrukciu

hybridnyacutech molekuacutel DNA s naacuteslednyacutem klonovaniacutem Priebeh RFLP analyacutezy je nasledovnyacute restrikčnaacute endonukleaacuteza sa pridaacute k DNA a zmes sa vo

vhodnyacutech reakčnyacutech podmienkach (pufor teplota) inkubuje niekoľko hodiacuten Počas inkubaacutecie docircjde k štiepeniu DNA na špecifickyacutech miestach DNA je potom elektroforeticky separovanaacute v geacuteli a naacutesledne vizualizovanaacute V minulosti po geacutelovej elektroforeacuteze nasledoval Southern blot (čiže prenos separovanyacutech fragmentov DNA z geacutelu na špeciaacutelnu membraacutenu) (obr 35) po ktorom nastala vizualizaacutecia raacutedioaktiacutevne značenou proacutebou V suacutečasnosti sa kvocircli praacutecnosti a zdravotnyacutem rizikaacutem od Southern blotu upuacutešťa a prechaacutedza sa na ryacutechlejšie menej praacutecne a zdravotne šetrnejšie metoacutedy priateľskejšie aj k životneacutemu prostrediu

RFLP bola prvou metoacutedou použiacutevanou na zistenie DNA profilu (DNA fingerprinting) mapovanie geacutenov zapriacutečiňujuacutece genetickeacute ochorenia a testovanie otcovstva Vaumlčšina RFLP markerov je vysoko lokusovo špecifickyacutech a kodominantnyacutech (obidve alely suacute detekovaneacute u heterozygota)

PCR-RFLP je laboratoacuterne priacutestupnejšia metoacuteda molekulaacuterno-genetickej diagnostiky keďže PCR umožňuje amplifikaacuteciu veľmi malyacutech množstiev DNA Alternatiacutevny naacutezov použiacutevanyacute v literatuacutere je CAPS z angl Cleaved Amplified Polymorphic Sequence assay Použitiacutem špecifickyacutech primerov docircjde PCR metoacutedou k amplifikaacutecii požadovaneacuteho uacuteseku DNA ten sa potom štiepi restrikčnou endonukleaacutezou vo vhodnyacutech podmienkach naacutesledne sa štiepne produkty elektroforeticky separujuacute a vizualizujuacute použitiacutem interkalačnyacutech farbiacutev a UV svetla (obr 25)

27

Obr 25 Princiacutep metoacutedy PCR-RFLP

43 VNTR a STR V geacutenome suacute priacutetomneacute dva typy tandemovyacutech (za sebou nasledujuacutecich) opakovaniacute

1) minisatelity ndash nazyacutevaneacute variabilnyacute počet tandemovyacutech opakovaniacute VNTR (variable number of tandem repeats) 2) mikrosatelity tiež kraacutetke tandemoveacute repetiacutecie STR (short tandem repeats)

Obidva tieto typy satelitnej DNA suacute rozmiestneneacute po celom genoacuteme suacute využiacutevaneacute hlavne vo forenznej genetike na identifikaacuteciu osocircb a určenie otcovstva popriacutepade materstva ale aj v mediciacutene na detekciu chromozoacutemovyacutech aneuploidiiacute Štruktuacutera obidvoch je podobnaacute Rozdiel medzi jednotlivyacutemi alelami je spocircsobenyacute rozdielnym počtom opakovaniacute opakujuacutecej sa sekvencie (motiacutevu) čo spocircsobiacute rocircznu dĺžku alel s rocircznym počtom tandemovyacutech opakovaniacute nazyacutevanuacute polymorfizmus dĺžky fragmentov

VNTR ndash variabilnyacute počet tandemovyacutech opakovaniacute pričom opakujuacuteca sa sekvencia maacute dĺžku od 6 do 100 baacutez pričom sa mocircže opakovať aj tisiacutece kraacutet alely tak mocircžu mať od 500do 30 000 baacutez VNTR boli v kombinaacutecii s RFLP (DNA fingerprinting ) prvyacutem polymorfizmom použiacutevanyacutem na zistenie DNA profilov a identifikaacuteciu osocircb v kriminalistickej praxi V suacutečasnosti jeho využitie v kriminalistike je kvocircli potrebe relatiacutevne veľkeacuteho množstva DNA nahradeneacute využitiacutem STR

STR - kraacutetke tandemoveacute repetiacutecie suacute v kriminalistike najčastejšie použiacutevanyacutem polymorfizmom STR lokusy suacute rozmiestneneacute po celom genoacuteme repetiacutecia obsahuje jednu až šesť baacutez pričom jej opakovaniacutem vznikne STR v rozsahu od 50 do 300bp V našom genoacuteme suacute tisiacutece STR ktoreacute mocircžu byť použiteacute pre forenznuacute analyacutezu V kriminalistike sa v suacutečasnosti na identifikaacuteciu osocircb použiacuteva 13 STR locusov ktoreacute patria k medzinaacuterodne uznaacutevanyacutem štandardom Z iniciatiacutevy FBI bola vytvorenaacute databaacuteza CODIS (Combined DNA Index System) každaacute krajina maacute svoju databaacutezu CODIS kde je možneacute vložiť a archivovať DNA profily jednotlivcov ako aj profily DNA ziacuteskanyacutech z miest kriminaacutelneho činu v databaacuteze je ich možneacute navzaacutejom porovnať a tak zistiť pocircvodcu trestneacuteho činu Medzinaacuterodnaacute jednotnosť v použiacutevaniacute CODIS STR lokusov umožňuje v priacutepade potreby vzaacutejomneacute porovnanie DNA profilov zistenyacutech na uacutezemiacute rocircznych štaacutetov CODIS STR lokusov je 13 a suacute to CSF1PO FGA TH01 TPOX VWA D3S1358 D5S818 D7S820 D8S1179 D13S317 D16S539 D18S51 a D21S11 Zistenie DNA profilu sa uskutočniacute multiplexnou PCR reakciou s fluorescenčne značenyacutemi primermi špecifickyacutemi pre konkreacutetny STR Naacutesledne suacute PCR produkty analyzovaneacute kapilaacuternou elektroforeacutezou genetickyacutem analyzaacutetorom ktoryacute rozliacuteši amplifikovaneacute fragmenty na zaacuteklade fluorescencie a dĺžky (fragmentačnaacute analyacuteza) (obr 26 Tab 3) DNA profil každeacuteho človeka je jedinečnyacute rovnakyacute profil mocircžu mať len jednovaječneacute dvojčataacute

28

Obr 26 Ukaacutežka DNA profilu človeka 15 STR lokusov s určeniacutem pohlavia pomocou lokusu pre amelogeniacuten (ženskeacute pohlavie - XX) maleacute oranžoveacute piacuteky predstavujuacute fragmenty veľkostneacuteho štandardu Tabuľka č 3 Zaacutepis DNA profilu človeka z obraacutezka č 26 15 STR lokusov s určeniacutem pohlavia pomocou lokusu pre amelogeniacuten System Alela 1 Alela 2

D3S1358 16 17

TH01 9 93 D21S11 28 28

D18S51 15 18

Penta E 7 14 D5S818 9 12

D13S317 8 11

D7S820 8 11 D16S539 11 12

CSF1PO 10 11

Penta D 11 12 vWA 15 18

D8S1179 13 16

TPOX 8 9 FGA 20 21

amel X X

29

5 MLPA

Multiplexnaacute amplifikaacutecia proacuteb zaacutevislaacute od ligaacutecie (z angl multiplex ligation-dependent probe amplification) je metoacuteda schopnaacute v jednej reakcii (v jednej skuacutemavke a vzorke) detegovať zmeny v počte až 50 nukleotidovyacutech sekvenciiacute Metoacutedou MLPA je možneacute ryacutechlo identifikovať amplifikaacutecie (duplikaacutecie) a deleacutecie veľkeacuteho počtu geacutenov či už použitiacutem DNA alebo mRNA krvnyacutech vzoriek alebo vzoriek z naacutedorov

Princiacutep MLPA spočiacuteva v multiplexnej amplifikaacutecii 50 špecifickyacutech nukleotidovyacutech sekvenciiacute použitiacutem jedneacuteho paacuteru primerov pričom jeden primer je fluorescenčne označenyacute Vyacutesledneacute PCR produkty suacute analyzovaneacute kapilaacuternou elektroforeacutezou (fragmentačnaacute analyacuteza) Dĺžka každeacuteho namnoženeacuteho produktu je jedinečnaacute narastaacute postupne o 6 alebo 9 nukleotidov pričom produkty PCR suacute 120 ndash 500 nukleotidov dlheacute Tento veľkostnyacute rozsah PCR fragmentov (dĺžka 120-500 nukleotidov s naacuterastom postupne o 6 alebo 9 nukleotidov) je optimaacutelny pre kapilaacuternu elektroforeacutezu MLPA multiplexnaacute PCR prebieha za použitia iba jedineacuteho paacuteru primerov ktoreacute amplifikujuacute špecifickeacute sekvencie Trik spočiacuteva v tom že nedochaacutedza k amplifikaacutecii DNA sekvencie ale MLPA proacuteb ktoreacute suacute pridaneacute k vzorkaacutem Každaacute MLPA proacuteba pozostaacuteva z dvoch oligonukleotidov (dve hemiproacuteby) pričom každyacute oligonukleotid obsahuje jednu zo sekvencie rozpoznaacutevanuacute PCR primermi Proacuteba vznikne jedine za predpokladu hybridizaacutecie dvoch oligonukleotidov (hemiproacuteb) k cieľovej sekvencii (geacutenu) a po ligaacutecii enzyacutemom ligaacutezou Iba ligovaneacute proacuteby suacute exponenciaacutelne amplifikovaneacute pomocou jedneacuteho paacuteru primerov Množstvo zligovanyacutech proacuteb teda zaacutevisiacute od množstva cieľovyacutech sekvenciiacute (geacutenov) vo vzorke

Postup MLPA analyacutezy je nasledovnyacute (obr27) K vzorke nukleovej kyseliny (DNA resp mRNA) sa pridaacute zmes 50 jedinečnyacutech proacuteb každaacute

proacuteba je komplementaacuterna k určitej cieľovej sekvencii NK vzorky Každaacute proacuteba však pozostaacuteva z dvoch oligonukleotidov hybridizujuacutecich vedľa seba zaacuteroveň každyacute oligonukleotid (hemiproacuteba) obsahuje pridanuacute sekvenciu rozpoznaacutevanuacute paacuterom PCR primerov Po hybridizaacuteciiacute oligonukleotidov (hemiproacuteb) dochaacutedza k ich ligaacutecii ligaacutezou Ligačnaacute reakcia je tak špecifickaacute že je schopnaacute rozliacutešiť sekvenciu liacutešiacu sa v jednom nukleotide Vyacuteslednyacute ligačnyacute produkt (proacuteba) obsahuje obidve sekvencie pre PCR primery na jednom fragmente čiže mocircže docircjsť k namnoženiu takeacutehoto fragmentu PCR reakciou V priacutepade ak nedocircjde k ligaacutecii priacuteslušnyacutech hemiproacuteb pretože hemiproacuteby nenaacutejdu cieľovuacute sekvenciu na DNA každaacute takaacuteto nezligovanaacute hemiproacuteba maacute len jednu sekvenciu rozpoznaacutevanuacute len jednyacutem PCR primerom v docircsledku čoho nemocircže prebehnuacuteť jej PCR amplifikaacutecia a počas fragmentačnej analyacutezy nie je detegovanaacute pretože negeneruje fluorescenčnyacute signaacutel

Pri MLPA analyacuteze je docircležiteacute okrem MLPA amplifikaacutecie vzorky urobiť aj MLPA amplifikaacuteciu referenčnej vzorky ku ktorej sa bude porovnaacutevať počet geacutenov (cieľovyacutech sekvenciiacute) Po kapilaacuternej elektroforeacuteze MLPA referenčnej a skuacutemanej vzorky porovnaniacutem obsahu nameranyacutech hodnocirct tzv piacutekov priacuteslušnyacutech proacuteb sa určiacute relatiacutevny počet koacutepiiacute v skuacutemanej vzorke

MLPA

1 DNA denaturaacutecia a hybridizaacutecia s MLPA proacutebami (hemiproacuteby)

2 Ligaacutecia (vytvorenie kompletnyacutech proacuteb)

3 PCR amplifikaacutecia proacuteb paacuterom primerov

4 Kapilaacuterna elektroforetickaacute separaacutecia PCR produktov

5 Analyacuteza daacutet

30

Obr 27 Princiacutep MLPA

Firma MRC-Holland v suacutečasnosti ponuacuteka stovky MLPA setov proacuteb ktoreacute suacute vhodneacute na 1) diagnostiku kongenitaacutelnych a dedičnyacutech ochoreniacute 2) zisťovanie profilu naacutedorov 3) zisťovanie metylačneacuteho profilu

MLPA je metoacuteda vhodnaacute na detekciu malyacutech prestavieb (BRCA1 BRCA2 MSH2 atď)

veľkyacutech chromozoacutemovyacutech prestavieb (Williamsov syndroacutem Prader-WilliAngelman syndroacutem atzď)

31

detekciu zmien v počte koacutepii geacutenov (obr 28 29) ako aj zistenie počtu kompletnyacutech chromozoacutemov (chromozoacutem 13 18 21 XY tiež aj z amniovej tekutiny) diagnostiku naacutedorov (zmeny počtu pri ALL CLL atď) kvantifikaacuteciu metylaacutecie (Prader-WilliAngelmanov syndroacutem Fragilnyacute X inaktivaacutecia naacutedorovyacutech supresorovyacutech geacutenov atď) mRNA analyacutezu geacutenov zuacutečastňujuacutecich sa apoptoacutezy alebo zaacutepalov

MS-MLPA (Methylation-Specific MLPA) je varianta MLPA určenaacute špeciaacutelne na analyacutezu aberantnyacutech metylaacutecii imprintovanyacutech oblastiacute ako aj detekciu metylačnyacutech zmien CpG ostrovčekov lokalizovanyacutech bliacutezko promoacutetora Rozdiel oproti štandardnej MLPA spočiacuteva v použitiacute metylačne senzitiacutevneho restrikčneacuteho enzyacutemu HhaI ktoryacute štiepi MS-MLPA proacuteby hybridizovaneacute k nemetylovanej sekvencii Každaacute DNA vzorka určenaacute pre MS-MLPA analyacutezu prejde dvoma reakciami v jednej mikroskuacutemavke štandardnou MLPA analyacutezou (bez štiepenia metylačne senzitiacutevnym enzyacutemom) a v druhej mikroskuacutemavke docircjde okrem ligaacutecie proacuteb aj k metylačne senzitiacutevnemu štiepeniu hybridizovanyacutech proacuteb s nemetylovanou DNA Amplifikujuacute sa len ligovaneacute proacuteby po PCR amplifikaacutecii sa fragmentačnou analyacutezou porovnaniacutem oboch reakciiacute zistia rozdiely v metylačnom profile vzorky k referenčnej vzorke

RT-MLPA (Reverse Transkriptase MLPA) je variaacutecia MLPA určenaacute pre zistenie mRNA profilu vzorky je alternatiacutevou k real-time PCR a mikročipom RT-MLPA nedeteguje mRNA množstvo priamo pretože použiacutevanaacute ligaacuteza nie je schopnaacute ligovať DNA oligonukleotidy keď suacute hybridizovaneacute s RNA Preto RT-MLPA začiacutena reverznou transkripciou so špeciaacutelne navrhnutyacutemi RT primermi tak aby vytvorili kraacutetke oligonukleotidy (cDNA) Potom reakcia pokračuje ako štandardnaacute MLPA

Obr 28 MLPA analyacuteza geacutenu DMD (koacutedujuacuteceho dystrofiacuten) mutaacutecie ktoreacuteho spocircsobujuacute Duchennovu svalovuacute dystrofiu u pacienta je priacutetomnaacute deleacutecia exoacutenu 45 v porovnaniacute s referenčnou vzorkou ndash kontrolou

32

Obr 29 MLPA analyacuteza geacutenu DMD (koacutedujuacuteceho dystrofiacuten) mutaacutecie ktoreacuteho spocircsobujuacute Duchennovu svalovuacute dystrofiu u pacienta suacute priacutetomneacute duplikaacutecie exoacutenov 41 42 43 44 45 (piacuteky vo vzorke pacienta sa porovnajuacute s piacutekmi v kontrole ndash referenčnej vzorke)

33

6 Sekvenovanie

Sekvenovaniacutem rozumieme určenie primaacuternej štruktuacutery DNA teda určenie poradia nukleotidov v reťazci DNA Začiatky moderneacuteho sekvenovania siahajuacute do roku 1977 kedy boli objaveneacute dve metoacutedy sekvenovania 1) chemickaacute metoacuteda Maxama a Gilberta 2) enzymatickaacute metoacuteda Sangera Nicklena a Coulsona

Princiacutep obidvoch metoacuted sekvenovania spočiacuteva v tom že sa vytvoriacute suacutebor DNA molekuacutel s rocircznou veľkosťou ktoreacute suacute zakončeneacute konkreacutetnym nukleotidom tieto DNA molekuly sa elektroforeticky separujuacute v geacuteloch s rozlišovacou schopnosťou 1 nukleotid 61 Chemickaacute metoacuteda

DNA molekuly sa na 5-konci raacutedioaktiacutevne označia raacutedioaktiacutevnym fosforom a naacutesledne sa chemicky modifikujuacute špecificky pre každuacute baacutezu DNA sa potom v modifikovanyacutech miestach štiepi čiacutem vzniknuacute rocirczne dlheacute fragmenty pričom podmienky suacute nastaveneacute tak aby sa DNA na každom mieste štiepila len raz Modifikaacutecia DNA a štiepenie prebehne v štyroch separaacutetnych reakciaacutech (skuacutemavkaacutech) takže po elektroforetickej separaacuteciiacute takto opracovanej DNA v štyroch draacutehach polyakrylamidoveacuteho geacutelu a naacuteslednej autoraacutediografii (podobne ako pri Southernovej hybridizaacutecii) je možneacute odčiacutetať nukleotidovuacute sekvenciu približne 100 nukleotidov od raacutedioaktiacutevneho označenia (v čase objavu Maxama a Gilberta) 62 Sangerova metoacuteda

Zaacuteklady metoacutedy boli popiacutesaneacute už v roku 1975 (metoacuteda plus a miacutenus) ale až vylepšenie použitiacutem dideoxynukleotidov (ddNTP) v roku 1977 došlo k zjednodušeniu sekvenovania Princiacutepom enzyacutemoveacuteho sekvenovania je terminaacutecia (zastavenie) polymerizaacutecie inkorporaacuteciou 2´ 3 -dideoxynukleotidov do novosyntetizujuacuteceho sa vlaacutekna DNA Keďže ddNTP neobsahujuacute hydroxylovuacute skupinu na 3 uhliacuteku riboacutezy nemocircžu sa zuacutečastniť na tvorbe fosfodiesterovej vaumlzby nemocircže sa pripojiť k nim ďalšiacute nukleotid čiže musiacute docircjsť k terminaacuteciiacute polymeraacutecie Reakcia prebieha v štyroch skuacutemavkaacutech s raacutedioaktiacutevne značenyacutem primerom V každej skuacutemavke suacute priacutetomneacute všetky štyri deoxynukleotidtrifosfaacutety (dNTP) ale pre každuacute skuacutemavku je špecifickyacute priacutedavok maleacuteho množstva jedneacuteho z dideoxynukleotidtrifosfaacutetov (v prvej skuacutemavke je ddATP v druhej ddCTP v tretej ddTTP a vo štvrtej ddGTP) Maleacute množstvo ddNTP spocircsobiacute že pri polymerizaacutecii dochaacutedza k prednostneacutemu zaradeniu štandardnyacutech dNTP do narastajuacuteceho reťazca a len občas sa inkorporuje ddNTP čiacutem sa zastaviacute synteacuteza reťazca V každej skuacutemavke tak vznikne suacutebor DNA fragmentov rocircznych veľkostiacute zakončenyacutech priacuteslušnyacutem ddNTP (v prvej skuacutemavke ddATP v druhej ddCTP v tretej ddTTP a vo štvrtej ddGTP) Po elektroforetickej separaacutecii v 4 draacutehach polyakrylamidoveacuteho geacutelu a autoraacutediografii sa z autoraacutediogramu odčiacuteta sekvencia

V suacutečasnosti je sekvenovanie do značnej miery automatizovaneacute pričom využiacuteva princiacutep Sangerovej enzyacutemovej metoacutedy s určityacutemi obmenami Uacutesek DNA ktoryacute treba sekvenovať sa prostredniacutectvom termostabilnyacutech DNA polymeraacutez namnožiacute PCR metoacutedou po ktorej nasleduje sekvenačnaacute reakcia (asymetrickaacute PCR) s fluorescenčne značenyacutemi ddNTP (každyacute druh označenyacute inyacutem fluorescenčnyacutem farbivom) Sekvenačnaacute reakcia prebieha v jednej skuacutemavke s jednyacutem primerom vznikne tak suacutebor jednovlaacuteknovyacutech DNA rocircznej dĺžky ktoreacute suacute na 3konci označeneacute ddNTP so špecifickyacutem fluorescenčnyacutem farbivom Taacuteto metoacuteda sekvenovania sa tiež nazyacuteva rdquodye-terminator cycle sequencingrdquo(obr 30) Po kapilaacuternej elektroforeacuteze vzorky v genetickom analyzaacutetore zaznamenaacutevaniacute fluorescencie jednotlivyacutech fragmentov CCD kamerou a softveacuterovom spracovaniacute sa ziacuteska sekvencia DNA (obr 31)

34

Obr 30 Princiacutep sekvenovania Sangerova dideoxy metoacuteda alebo tzv chain termination method (reťazec zastavujuacuteca metoacuteda) Obr 31 Určenie genotypu plodu a rodičov sekvenčnou analyacutezou DNA ziacuteskanej z plodovej vody (prenataacutelna diagnostika) a perifeacuternej krvi sekvenčnaacute analyacuteza geacutenu ASPA vyacutesledok u plodu priacutetomnaacute mutaacutecia c 914CgtA v homozygotnom stave (AA) rodičia heterozygoti (AC) Uvedenaacute mutaacutecia je v homozygotnom stave kauzaacutelnou priacutečinou Canavanovej choroby

Automatizovaneacute sekvenovanie prinaacuteša viacereacute vyacutehody oproti klasickej Sangerovej metoacutede vyššiu presnosť a ryacutechlosť v jednej sekvenačnej reakcii možnosť osekvenovať až 1200 nukleotidovyacute fragment maleacute množstvo templaacutetu potrebneacute na analyacutezu

35

63 Next Generation Sequencing (NGS)

NGS (sekvenovanie novej generaacutecie) maacute obrovskyacute potenciaacutel v analyacuteze genoacutemov pričom toto označenie zahŕňa viacereacute technologickeacute metoacutedy reprezentovaneacute niekoľkyacutemi firmami Princiacutepom je masiacutevne paralelneacute sekvenovanie čiacutem sa ziacuteskajuacute raacutedovo tisiacutece až milioacuteny sekvenciiacute naraz 631 Sekvenovanie druhej generaacutecie

Na začiatku sa analyzovanaacute DNA vo vaumlčšine priacutepadov fragmentuje (vznikne tak DNA

knižnica) na fragmenty sa pripoja kraacutetke sekvencie ndash adapteacutery naacutesledne sa tieto fragmenty rocircznymi priacutestupmi amplifikujuacute a určiacute sa ich sekvencia Vďaka čiastočnyacutem prekryvom je zo ziacuteskanyacutech sekvencii možneacute poskladať plynuluacute sekvenciu zodpovedajuacutecu pocircvodnej nefragmentovanej DNA

Pyrosekvenovanie je podobne ako Sangerova metoacuteda založenaacute na princiacutepe synteacutezy komplementaacuterneho vlaacutekna DNA avšak rozdiel je v tom že sa na detekciu inkorporaacutecie nukleotidu využiacuteva inyacute systeacutem tvorby luminiscenčneacuteho signaacutelu v priebehu reakcie Pyrosekvenovanie je umožneneacute vďaka aktivite 4 enzyacutemov - DNA polymeraacutezy ATP sulfurylaacutezy luciferaacutezy a apyraacutezy Reakčnaacute zmes obsahuje aj ďalšie komponenty - enzymatickeacute substraacutety adenoziacutenfosfosulfaacutet (APS) d-luciferiacuten sekvenovanyacute templaacutet a cyklicky postupne po jednom type pridaacutevaneacute nukleotidtrifosfaacutety Po zabudovaniacute nukleotidu do novovznikajuacuteceho reťazca docircjde k uvoľneniu pyrofosfaacutetu naacutesledne je využityacute ATP sulfurylaacutezou na synteacutezu ATP z APS počas ďalšej reakcie docircjde k využitiu ATP luciferaacutezou na premenu luciferiacutenu na oxyluciferiacuten čo spocircsobiacute svetelnyacute signaacutel a ten zaznamenaacute detekčnyacute systeacutem Poslednou enzymatickou reakciou je reakcia apyraacutezy ktoraacute odstraacuteni nezainkorporovaneacute nukleotidy a nevyužiteacute ATP aby sa celyacute proces mohol zopakovať s reakčnou zmesou obsahujuacutecou ďalšiacute nukleotidtrifosfaacutet (inyacute ako v predchaacutedzajuacutecej reakcii) Po každej reakcii detektor zaznamenaacuteva emisiu svetla na zaacuteklade intenzity svetla je možneacute určiť či bol vradenyacute priacuteslušnyacute nukleotidtrifosfaacutet či bol inkorporovanyacute jeden priacutepadne viac rovnakyacutech nukleotidtrifosfaacutetov

Zvyacutešenie vyacutekonu pyrosekvenovania umožnila tzv emulznaacute PCR v mikročasticiach a použitie platničky PicoTiterPlatereg toto sekvenovanie zaviedla firma Roche pod pojmom 454 pyrosekvenovanie v roku 2005 Na začiatku sa DNA fragmentuje na uacuteseky dlheacute 400-600 baacutez dvojvlaacuteknovaacute fragmentovanaacute DNA sa liguje s adapteacutermi prostredniacutectvom nich sa naviaže na mikročastice dvojvlaacuteknoveacute fragmenty sa oddelia mikročastice s naviazanyacutemi jednovlaacuteknovyacutemi fragmentami sa premiešajuacute so zmesou oleja a roztoku ktoryacute obsahuje všetky komponenty na uacutespešnuacute PCR Tyacutemto spocircsobom sa okolo každej mikročastice vytvoriacute vlastnyacute mikroreaktor v ktorom prebehne amplifikaacutecia fragmentu Po PCR reakcii sa mikročastice prenesuacute do platničky PicoTiterPlate v ktorej sa do jamky zmestiacute akuraacutet jedna mikročastica a reakčneacute komponenty pyrosekvenačnej reakcie PicoTiterPlatereg maacute 1 600 000 jamiek každaacute jamka maacute maximaacutelny objem 75 picolitra Platnička s mikročasticami sa vložiacute do sekvenačneacuteho systeacutemu ndash priacutestroja v ktorom sa celeacute pyrosekvenovanie uskutočniacute Chemiluminiscenčneacute signaacutely ktoryacutech počas sekvenovania vznikajuacute milioacuteny v priebehu hodiny suacute zachyteneacute CCD kamerou a analyzovaneacute softveacuterom

Firma Illumina predstavila inuacute technoloacutegiu PCR amplifikaacutecia a sekvenovanie sa uskutočňuje na skliacutečku (flow cell) Fragmentaacutecia DNA a pripojenie adapteacuterov prebieha za uacutečasti transpozoacutemov v procese nazvanom tagmentaacutecia Po hybridizaacutecii fragmentov DNA na skliacutečko prebehne v klastroch PCR amplifikaacutecia (tzv mostiacutekovaacute amplifikaacutecia) sekvenaacutecia prebieha za uacutečasti rozdielne fluorescenčne značenyacutech a chemicky modifikovanyacutech nukleotidov pričom každyacute nukleotid emituje fluorescenciu s inou vlnovou dĺžkou Na skliacutečku prebieha paralelne až 6 miliaacuterd sekvenaacutecii (obr 32)

Ďalšiacutemi možnosťami sekvenovania druhej generaacutecie je systeacutem SOLid (vyvinutyacute firmou Applied Biosystem dnes pod Thermo Fisher Scientific) a Ion Semiconductor Sequencing ndash polovodičoveacute ioacutenoveacute sekvenovanie (od firmy Ion Semiconductor Sequencing v suacutečasnosti Thermo Fisher Scientific)

36

Obr 32 Princiacutep sekvenovania novej generaacutecie od firmy Illumina PCR amplifikaacutecia a sekvenovanie sa uskutočňuje na skliacutečku (flow cell) paralelne prebieha až 6 miliaacuterd sekvenaacutecii

632 Sekvenovanie tretej generaacutecie

Pred sekvenovaniacutem netreba amplifikovať DNA PCR metoacutedou ale sekvencia sa ziacuteskava zachyteniacutem signaacutelu v reaacutelnom čase Medzi sekvenovanie tretej generaacutecie patriacute SMRT (Single Molecule Real-Time Sequencing) a Nanopore Sequencing

37

7 Fragmentačnaacute analyacuteza DNA

Je metoacuteda použiacutevanaacute na určenie veľkosti fragmentov DNA ziacuteskanyacutech PCR reakciou Dĺžka amplifikovanyacutech DNA fragmentov sa zistiacute ich porovnaniacutem s veľkostnyacutem štandardom (obr 33) ktoryacute je tvorenyacute DNA fragmentami znaacutemej dĺžky Veľkostnyacute štandard je pred kapilaacuternou elektroforeacutezou zmiešanyacute so vzorkou DNA fragmenty veľkostneacuteho štandardu suacute fluorescenčne označeneacute pričom použiteacute fluorescenčneacute farbivo je ineacute ako fluorescenčneacute farbivo použiteacute na označenie DNA fragmentov vo vyšetrovanej vzorke

Obr 33 Elektroforetogram veľkostneacuteho štandardu použiacutevaneacuteho na určenie veľkostiacute fragmentov analyzovanyacutech kapilaacuternou elektroforeacutezou v genetickom analyzaacutetore (GeneScantrade 500 LIZtrade dye Size Standard) dĺžka fragmentov v nukleotidoch (napr 50 nukleotidov)

Fragmentačnaacute analyacuteza pozostaacuteva z viaceryacutech krokov Prvyacutem je izolaacutecia DNA nasleduje PCR amplifikaacutecia počas ktorej sa novosyntetizovaneacute DNA fragmenty označia fluorescenčnyacutemi farbivami Vzorka s PCR produktom sa pripraviacute na kapilaacuternu elektroforeacutezu tak že sa zmieša s veľkostnyacutem štandardom (sluacuteži na určenie veľkosti fragmentov) a denaturačnou laacutetkou (formamid) nasleduje denaturaacutecia Pripraveneacute vzorky suacute injektovaneacute do priacutestroja (genetickyacute analyzaacutetor) kde v kapilaacutere naplnenej polymeacuterom v elektrickom poli migrujuacute fluorescenčne značeneacute fragmenty DNA na zaacuteklade veľkosti (kapilaacuterna elektroforeacuteza) Počas elektroforeacutezy genetickyacute analyzaacutetor zaznamenaacuteva fluorescenciu fragmentov Analyacutezou daacutet prostredniacutectvom špeciaacutelnych softveacuterov sa ziacuteskajuacute elektroforetogramy z ktoryacutech je možneacute zistiť veľkosť fragmentov ako aj typ fluorescencie (docircležiteacute ak suacute genetickeacute varianty rozliacutešiteľneacute rocircznou fluorescenciou napr SNaPshot) Fragmentačnaacute analyacuteza je suacutečasťou množstva molekulaacuterno-genetickyacutech metoacuted (pozri obr 12 26 28 29 34) ako suacute napr STR analyacuteza (Short Tandem Repeat) AFLP analyacuteza (Amplified Fragment Lenght Polymorfism) RFLPT-RFLP analyacuteza (Restriction Fragment Lenght PolymorfismTerminal Restricted Fragment Lenght Polymorfism) SSCP (Single Strand Conformation Polymorfism) VNTR (Variable Number of Tandem Repeat) analyacuteza straty heterozygotnosti (LOH loss of heterozygozity) MLPA (Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification) MSMSA (Methylation-Sensitive Mobility Shift Assay) SNP genotypovanie (SNaPshotreg) HiCEP (High-Coverage Expression Profiling)

38

Obr 34 Kvantitatiacutevna fragmentačnaacute PCR analyacuteza (QF-PCR) DNA izolovanej z plodovej vody vyacutesledok prenataacutelnej analyacutezy = priacutetomnosť troch piacutekov pre chromozoacutem 18 (u všetkyacutech fragmentov detegujuacutecich chromozoacutem 18 je pomer vyšetrovanyacutech markerov aberantnyacute 21 resp 111) čo znamenaacute trizoacutemiu chromozoacutemu 18 Edwardsov syndroacutem

39

8 Metoacutedy založeneacute na princiacutepe hybridizaacutecie

Nukleoveacute kyseliny majuacute schopnosť vytvaacuterať dvojvlaacuteknoveacute reťazce z jednovlaacuteknovyacutech molekuacutel na zaacuteklade komplementarity baacutez Komplementarita baacutez umožňuje replikaacuteciu DNA transkripciu RNA komplementarita baacutez zabezpečuje teda reprodukovateľnosť živej hmoty

Hybridizaacutecia je proces v ktorom na zaacuteklade komplementarity baacutez dochaacutedza k vytvoreniu dvojvlaacuteknovej nukleovej kyseliny z dvoch jednovlaacuteknovyacutech molekuacutel DNA alebo RNA alebo ich kombinaacuteciou DNA RNA pričom kratšia jednovlaacuteknovaacute nukleovaacute kyselina vystupuje ako sonda (proacuteba) Hybridizaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten je jeden z najpoužiacutevanejšiacutech naacutestrojov v molekulaacuternej bioloacutegii a genetike (hybridizaacutecia primerov alebo proacuteb sa využiacuteva v takmer každej metoacutede - v PCR RT-PCR qPCR RT-qPCR MLPA sekvenovaniacute fragmentačnej analyacuteze FISH DNA mikročipoch atď)

Denaturaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten je proces pri ktorom dochaacutedza k porušeniu vodiacutekovyacutech vaumlzieb medzi vlaacuteknami nukleovyacutech kyseliacuten (strata sekundaacuternej a terciaacutelnej štruktuacutery) tak že docircjde k ich uacuteplneacutemu oddeleniu vzniknuacute jednovlaacuteknoveacute reťazce Denaturaacutecia NK mocircže byť spocircsobenaacute vplyvom vysokyacutech teplocirct pH alebo chemickyacutech laacutetok (denaturačneacute činidlaacute) Renaturaacutecia je opačnyacute proces v ktorom na zaacuteklade komplementarity dochaacutedza k tvorbe dvojvlaacuteknovyacutech NK

Hybridiza čnaacute sonda (proacuteba) je jednovlaacuteknovaacute nukleovaacute kyselina určitej znaacutemej dĺžky a sekvencie (najčastejšie DNA pretože je stabilnejšia ako RNA) ktoraacute je značenaacute a sluacuteži na detekciu komplementaacuternych molekuacutel DNA alebo RNA v procese hybridizaacutecie V zaacutevislosti od podmienok hybridizaacutecie (stringencia) mocircže byť detegovanaacute sekvencia uacuteplne komplementaacuterna alebo v menej priacutesnych podmienkach mocircže mať sekvenčneacute odchyacutelky Proacuteba sluacuteži na vyhľadanie a zviditeľnenie cieľovyacutech NK Zviditeľnenie sa deje prostredniacutectvom označenia proacuteby ešte pred hybridizaacuteciou Značenie proacuteby mocircže byť raacutedioaktiacutevne a neraacutedioaktiacutevne (najčastejšie fluorescenčneacute)

Raacutedioaktiacutevne značeneacute proacuteby pomocou izotopov (32P) sa využiacutevali viac v minulosti v suacutečasnosti suacute kvocircli zdravotnyacutem rizikaacutem ohľaduplnosti k životneacutemu prostrediu ako aj kvocircli jednoduchšej manipulaacutecii použiacutevaneacute fluorescenčne značeneacute proacuteby Raacutedioaktiacutevne značeneacute sondy boli použiacutevaneacute hlavne metoacutedou Southernovej hybridizaacutecie (Southern blotting Southern blot) Citlivosť raacutedioaktiacutevne značenyacutech proacuteb je vyššia dosahuje schopnosť zachytiť 10 fg (femtogram 10-15) cieľovej DNA sekvencie 81 Southern blot

Metoacutedu objavil v roku 1975 britskyacute bioloacuteg Edwin Southern (preto Southern) Pri Southernovej hybridizaacutecii sa restrikčne štiepeneacute fragmenty DNA elektroforeticky separujuacute v geacuteli potom sa metoacutedou blottingu prenesuacute na nylonovuacute alebo nitroceluloacutezovuacute membraacutenu kde suacute naacutesledne hybridizovaneacute v roztoku obsahujuacutecom raacutedioaktiacutevne značenuacute sondu Priloženiacutem fotografickeacuteho filmu k membraacutene a vyvolaniacutem filmu autoraacutediografiou docircjde k zviditeľneniu lokaliacutet kde došlo k hybridizaacuteciiacute raacutedioaktiacutevne značenej sondy s fragmentom DNA (autoraacutediogram) Southern blot bol kľuacutečovou a prvou metoacutedou na identifikaacuteciu osocircb (DNA fingerprinting DNA pofiling) (obr 35)

Okrem Southern blotu existuje Northern blot na analyacutezu RNA (geacutenovej expresie) a Western blot na analyacutezu proteiacutenov postup je obdobnyacute ako pri Southern blote s obmenami špecifickyacutemi pre konkreacutetny blot Pri Northern blote sa použiacutevajuacute hybridizačneacute proacuteby ale pre vizualizaacuteciu proteiacutenov western blotom je potrebneacute použiť protilaacutetky s naacuteslednou vizualizaacuteciou Pomenovanie techniacutek je hra so sloviacutečkami (keďže paacuten Northern ani Western neobjavili takto nazvaneacute techniky)

Neraacutedioaktiacutevne značenie proacuteb použiacutevanyacutech v molekulaacuternej genetike mocircže byť nepriame (použitie haptenu) alebo priame Konečnaacute vizualizaacutecia je najčastejšie zabezpečenaacute fluoreskujuacutecimi farebnyacutemi značkami farbivami fluorochroacutemami (fluorofoacuterami) Pri priamom značeniacute je farbička kovalentne naviazanaacute na nukleotid a na zachytenie fluorescencie suacute potrebneacute špeciaacutelne priacutestroje umožňujuacutece excitaacuteciu farbičky ktoraacute potom emituje žiarenie určitej vlnovej dĺžky (emisneacute žiarenie) a to zachytiacute detekčnyacute systeacutem priacutestroja Využitie fluorochroacutemov v molekulaacuternej genetike je masiacutevne napr na vizualizaacuteciu NK elektroforeticky separovanyacutech v geacuteli kvantifikaacuteciu produktov PCR reakcie v priacutestroji real-time PCR cykleacuter sekvenovaniacute fragmentačnej analyacuteze FISH DNA mikročipoch atď

40

Obr 35 Princiacutep Southern blotu

82 FISH (fluorescenčnaacute in situ hybridizaacutecia)

FISH (fluorescent in situ hybridization fluorescenčnaacute in situ hybridizaacutecia) metoacuteda patriacute medzi molekulovo-cytogenetickeacute techniky Princiacutep FISH metoacutedy je založenyacute na hybridizaacuteciiacute fluorescenčne značenyacutech proacuteb ku komplementaacuternym uacutesekom vyšetrovanej DNA na podložnom skle (priamo na mieste - in situ) K denaturaacutecii dsDNA dochaacutedza buď vplyvom denaturačnyacutech činidiel alebo zvyacutešenou teplotou a naacuteslednou renaturaacuteciou dochaacutedza k naviazaniu sondy na komplementaacuterny uacutesek DNA Vyacutesledok hybridizaacutecie sa vizualizuje fluorescenčnyacutem mikroskopom vybavenyacutem vhodnyacutemi fluorescenčnyacutemi filtrami a vizuaacutelne zhodnotiacute skuacutesenyacutem odborniacutekom Fluorescencia sa v niektoryacutech priacutepadoch mocircže zaznamenať a hodnotiť aj pomocou softveacuteru (obr 36)

Pomocou FISH detegujeme numerickeacute aberaacutecie - zmeny v počte chromozoacutemov (napr trizoacutemia monozoacutemia chromozoacutemov) alebo štruktuacuterne aberaacutecie a prestavby (napr translokaacutecie inverzie deleacutecie duplikaacutecie amplifikaacutecie) FISH metoacuteda umožňuje identifikaacuteciu a detekciu každeacuteho ľudskeacuteho chromozoacutemu jeho zaradenie do karyotypu odhalenie malyacutech submikroskopickyacutech chromozoacutemovyacutech zmien a tiež mapovať poziacutecie jednotlivyacutech geacutenov na chromozoacuteme

41

Obr 36 Princiacutep štandardnej FISH a FISH maľovania celeacuteho chromozoacutemu

Veľkou vyacutehodou FISH metoacutedy je možnosť analyacutezy buniek v metafaacuteze aj v interfaacuteze kedy nie je nutnaacute kultivaacutecia buniek a tiež ryacutechle analyzovanie veľkeacuteho počtu buniek (stovky až tisiacutece) K ďalšiacutem vyacutehodaacutem patriacute bezpečnosť vysokaacute citlivosť dostatočnaacute stabilita relatiacutevne kraacutetky čas hybridizaacutecie a možnosť ryacutechleho vyhodnotenia Hybridizaacutecia pri vaumlčšine suacutečasne dodaacutevanyacutech sond trvaacute 10-12 hodin (na trhu suacute už dostupneacute aj sondy so skraacutetenyacutem časom hybridizaacutecie na 2-3 hodiny) Po hybridizaacuteciiacute nasleduje odmyacutevanie kedy pri priacuteslušnej teplote dochaacutedza k odmytiu nenaviazanyacutech a nespraacutevne hybridizovanyacutech sond Preparaacutet sa naacutesledne podfarbiacute a vyacutesledok sa zhodnotiacute vo fluorescenčnom mikroskope Na podfarbenie chromozoacutemov alebo jadier sa použiacuteva modreacute kontrastneacute farbivo DAPI (46-diamidino-2-fenylindol) ktoreacute maacute silneacute fluorescenčneacute vlastnosti dokaacuteže prechaacutedzať jadrovou membraacutenou a viazať sa na DNA Vyacutesledkom je modreacute zafarbenie ktoreacute vyacuteborne kontrastuje so signaacutelmi jednotlivyacutech sond

Limitujuacutecim faktorom FISH je možnosť identifikaacutecie len tyacutech uacutesekov DNA ku ktoryacutem suacute použiteacute sondy V jednej analyacuteze je možneacute použiť najviac 3 odlišne značeneacute sondy a tak zistiť priacutepadneacute abnormality len na 1 alebo na paacuter lokusoch Na relevantnuacute detekciu je potrebneacute mať vo vzorke 1-5 aberantnyacutech interfaacutezovyacutech jadier

FISH je možneacute uskutočniť na širokej škaacutele biologickeacuteho materiaacutelu na vzorkaacutech perifeacuternej krvi kostnej drene naacuteteroch choriovyacutech klkoch plodovej vode rocircznych druhov tkaniacutev natiacutevnych alebo zaliatych v parafiacutene na 1 bunke (predimplantačnaacute genetickaacute diagnostika PGD) (obr 37)

Využiacuteva sa na detekciu aberaacuteciiacute pri mnohyacutech onkologickyacutech ochoreniach (napr pri diagnoacuteze mnohopočetnyacute myeloacutem sa v suacutečasnosti po separaacutecii CD138+ buniek robiacute FISH s 5 sondami pre geacuteny IGH TP53 RB1 oblasť 1p321q21 a stanovuje sa hyperploidia chromozoacutemov 5 9 a 15) a tiež k spresneniu doplneniu a k overeniu bežneacuteho cytogenetickeacuteho vyšetrenia

Podľa miesta na chromozoacuteme na ktorom dochaacutedza k hybridizaacutecii sondy rozlišujeme 4 typy

DNA sond bull centromeacuteroveacute sondy ndash sa viažu na strednuacute časť chromozoacutemu ndash centromeacuteru sluacutežia k diagnostike zmien v počte chromozoacutemov k detekcii chromozoacutemov neznaacutemeho pocircvodu umožňujuacute interfaacuteznu FISH na nedeliacich sa bunkaacutech (obr 38-41)

42

Obr 37 Interfaacutezna FISH preimplantačnyacute genetickyacute skriacutening aneuploidiiacute ndash blastomeacutera 3-denneacuteho ľudskeacuteho embrya s normaacutelnym počtom chromozoacutemov 13 18 21 pohlavie XY použityacutech 5 sond pre chromozoacutemy 13 ndash orange 18 ndash aqua 21 ndash green X ndash blue a Y ndash yellow (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

Obr 38 Interfaacutezne jadro po hybridizaacutecii s centromeacuterovou sondou pre chromozoacutem 8 (Vysis Abbott) V pravom jadre je priacutetomnaacute trizoacutemia chromozoacutemu 8 (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex) Obr 39 Metafaacutezna (A) a interfaacutezna FISH (B) použitaacute centromeacuterovaacute sonda CEPX spectrum orangeCEPY spectrum green (Vysis Abbott) Sonda hybridizuje k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (červenyacute signaacutel) a Y (zelenyacute signaacutel) (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

43

Obr 40 Interfaacutezna FISH vyšetrenie spermiiacute použiteacute sondy CEPX greenCEPY orange (Aneuscore Metasystems) Sondy hybridizujuacute k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (zelenyacute signaacutel) Y (červenyacute signaacutel) vľavo ndash dve haploidneacute spermie (majuacutece jedna spermia X druhaacute Y chromozoacutem) vpravo ndash dve patologickeacute spermie obsahujuacutece gonozoacutemovyacute komplement XY (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

Obr 41 Interfaacutezna FISH vyšetrenie spermiiacute použiteacute sondy CEPX greenCEPY orange a CEP18 aqua (Aneuscore Metasystems) Sondy hybridizujuacute k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (zelenyacute signaacutel) Y (červenyacute signaacutel) a 18 (modryacute signaacutel) vľavo ndash normaacutelne haploidneacute ľudskeacute spermie - 1x chromozoacutem X alebo Y a jedenkraacutet chromozoacutem 18 v strede ndash patologickaacute spermia obsahujuacuteca gonozoacutemovyacute komplement XY a jeden chromozoacutem 18 vpravo ndash patologickaacute diploidnaacute spermia s chromozoacutemami X Y a dvoma chromozoacutemami 18 (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

bull lokusovo špecifickeacute sondy ndash hybridizaacutecia prebehne na konkreacutetnom mieste geacutenu (lokuse) (obr 42-44) použiacutevajuacute sa k vyšetreniu mikrodeleacuteciiacute (straty malyacutech častiacute chromozoacutemu pri mikrodelečnyacutech syndroacutemoch) k zisteniu amplifikaacutecie onkogeacutenov a niektoryacutech špecifickyacutech translokaacuteciiacute prestavby geacutenov umožňujuacute interfaacuteznu FISH na nedeliacich sa bunkaacutech bull subtelomeroveacute ndash vaumlzba na koncoveacute časti chromozoacutemu ndash telomeacutery bull celochromozoacutemoveacute alebo celomaľovacie sondy ndash sondy hybridizujuacute s mnohopočetnyacutemi chromozoacutemovyacutemi sekvenciami pričom sa fluorescenčne tak bdquovymaľujeldquo celyacute chromozoacutem (Obr 45) Použiacutevajuacute sa na vyšetrenie chromozoacutemovyacutech prestavieb k analyacuteze translokaacuteciiacute a k detekcii pocircvodu tzv marker chromozoacutemov (malyacutech nadpočetnyacutech chromozoacutemov neznaacutemeho pocircvodu) K použitiu sondy suacute potrebneacute metafaacutezne chromozoacutemy nepoužiacutevaju sa pre interfaacuteznu FISH

Pri konvenčnej chromozoacutemovej FISH suacute homogeacutenne DNA proacuteby hybridizovaneacute s fixovanyacutem metafaacuteznym alebo prometafaacuteznym chromozoacutemomchromozoacutemami na skliacutečku (Obr 36a) Maximaacutelna rozlišovacia schopnosť metafaacuteznej FISH je niekoľko megabaacutez (Obr 39a 45) využitiacutem viac

44

natiahnutyacutech prometafaacuteznych chromozoacutemov sa dosiahne 1 Mb rozliacutešenie Prostredniacutectvom fiber FISH konkreacutetne artificiaacutelne deproteinizovanej natiahnutej DNA pripravenej in situ z celyacutech buniek na mikroskopickom skliacutečku je možneacute vizualizovať individuaacutelne geacuteny maleacute DNA elementy na chromozoacuteme s rozliacutešeniacutem okolo 1000 bp

Obr 42 Interfaacutezne jadro po hybridizaacutecii s lokusovo-špecifickou sondou LSI 5q31 Spectrum Orange5p12 Spectrum Green (Vysis Abbott) Na ľavom obraacutezku suacute priacutetomneacute dva červeneacute (5q31) a dva zeleneacute signaacutely (5p12) v pravom jadre je priacutetomnaacute deleacutecia 5q31 oblasti chyacuteba jeden červenyacute signal (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

Obr 43 Interfaacutezna FISH použitaacute lokusovo-špecifickaacute sonda ndash translokačnaacute - XL BCRABL1 plus (Metasystems) dvojfarebnaacute dvojfuacutezna kde červenaacute označuje lokus ABL1 na chromozoacuteme 9 a zelenaacute oblasť BCR na chromozoacuteme 22 Sonda deteguje fuacuteziu protoonkogeacutenu ABL1 (9q34) a geacutenu BCR (22q11) v priacutepade že červenyacute a zelenyacute signaacutel suacute pri sebe (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

45

Obr 44 Interfaacutezna FISH Použitaacute lokusovo-špecifickaacute sonda- typ break apart pre IGH geacuten V docircsledku translokaacutecie došlo k rozskočeniu geacutenu pričom translokačneacuteho partnera nepoznaacuteme vieme určiť len percento v koľkyacutech jadraacutech je geacuten prestavanyacute (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex) Obr 45 Použiteacute celochromozoacutemoveacute sondy WCP 15 (červenyacute chromozoacutem) a WCP 17 (zelenyacute chromozoacutem) Na metafaacuteze je potvrdenaacute reciprokaacute translokaacutecia t(1517)(q2221) (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

FISH vizualizaacutecia celeacuteho chromozoacutemu maľovanie chromozoacutemu anglicky chromosome

painting je špeciaacutelnou aplikaacuteciou chromozoacutemovej FISH proacuteba je koktail veľkeacuteho počtu rocircznych fluorescenčne značenyacutech DNA fragmentov hybridizujuacutecich pozdĺž celeacuteho konkreacutetneho chromozoacutemu (obr 36b 45) bdquoChromosomepaintingldquo analyzuje metafaacutezne chromozoacutemy V minulosti bola FISH vizualizaacutecia celyacutech chromozoacutemov limitovanaacute malyacutem množstvom rocirczne sfarbenyacutech fluorochroacutemov

V suacutečasnosti je možneacute detegovať množstvo cieľovyacutech sekvenciiacute naraz čo sa využiacuteva pri celogenoacutemovej chromozoacutemovej vizualizaacutecii (whole-chromosomepainting - WCP) metoacutedou multiplex FISH (M-FISH multicolor FISH o br 46) alebo spektraacutelnej karyotypizaacutecie (SKY) kedy možno rozliacutešiť všetky ľudskeacute chromozoacutemy ndash teda 24 rocircznych chromozoacutemov M-FISH a SKY patria medzi metafaacutezne formy FISH diagnostiky ktoreacute umožňujuacute simultaacutennu vizualizaacuteciu všetkyacutech ľudskyacutech chromozoacutemov v rocircznych farbaacutech čo predstavuje uľahčenie analyacutezy karyotypu hlavne pri komplexnyacutech zmenaacutech a markeroch neznaacutemeho pocircvodu Obe techniky vychaacutedzajuacute z použitia

46

celochromozoacutemovyacutech sond značenyacutech kombinaacuteciou viaceryacutech fluorochroacutemov Rozdiel medzi M-FISH a SKY spočiacuteva v technike ziacuteskania konečneacuteho obrazu

Obr 46 Multicolor FISH - každyacute chromozoacutemovyacute paacuter je zafarbenyacute inou farbou pričom na ich zafarbenie postačuje kombinaacutecia 5 fluorochroacutemov Na vyhodnocovanie je potrebnaacute špeciaacutelna sada fluorescenčnyacutech filtrov pre jednotliveacute fluorochroacutemy a špeciaacutelnyacute softweacuter Vľavo-štandardnyacute karyotyp vpravo karyotyp s mutaacuteciami (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

V molekulovej cytogenetike suacute komerčne dostupneacute sety M-FISH proacuteb umožňujuacutece

viacfarebneacute pruacutežkovanie chromozoacutemov (banding) s vysokyacutem rozliacutešeniacutem (multicolor-banding mBAND FISH MCB) čo umožňuje identifikaacuteciu intrachromozoacutemovyacutech prestavieb (Obr 47) Nevyhnutnosťou mBAND-u je mať chromozoacutemy v metafaacuteze Taacuteto metoacuteda bola prvyacutekraacutet uskutočnenaacute na chromozoacuteme 5 v roku 1999 mBAND FISH umožňuje rozliacutešiť špecifickeacute oblasti chromozoacutemov na uacuterovni pruacutežku - bandu a sub-bandu s detekciou 550 bandov haploidneacuteho karyotypu

Obr 47 A - mBAND chromozoacutemu 11 - inverzia duplikovanej oblasti 11q223-q25 B - mBAND chromozoacutemu 3 - na kruhovom chromozoacuteme deleacutecia oblasti 3p263 C - mBAND chromozoacutemu 2 - potvrdenie inverzie duplikovanej časti chromozoacutemu (poskytnuteacute RNDr Dagmar Landlovou Medirex)

FISH metoacuteda a jej varianty (M-FISH mBAND SKY) majuacute v suacutečasnosti širokeacute využitie v

klinickej genetike v onkologickej genetike na detekciu aberaacuteciiacute v čase diagnoacutezy počas liečby po

47

liečbe monitorovanie po transplantaacutecii kostnej drene v prenataacutelnej a postnataacutelnej diagnostike pri detekcii submikroskopickyacutech deleacuteciiacute (napr DiGeorge syndroacutem - 22q112 delečnyacute syndroacutem PraderndashWilli syndroacutem- chromozoacutem 15q11-13) prostredniacutectvom FISH je možnaacute detekcia numerickyacutech zmien chromozoacutemov (trizoacutemia chromozoacutemu 21 pri Downovom syndroacuteme trizoacutemia chromozoacutemu 15 pri Patauovom syndroacuteme trizoacutemia chromozoacutemu 18 pri Edwardsovom syndroacuteme) rocirczne zmeny v počte pohlavnyacutech chromozoacutemov (monozoacutemia X pri Turnerovom syndroacuteme Klinefelterov syndroacutem s X chromozoacutemom naviac - XXY) podobne v predimplantačnej diagnostike

83 DNA Microarray (DNA mikro čip biočip) DNA mikročipovanie je technika využiacutevajuacuteca hybridizaacuteciu skuacutemanej nukleovej kyseliny

(cieľovaacute vzorka) s veľkyacutem množstvom oligonukleotidovyacutech proacuteb (desať tisiacutec až milioacuten) ktoreacute suacute prichyteneacute na pevnyacute podklad najčastejšie sklenyacute silikoacutenovyacute alebo nylonovyacute (doštička čip) Skuacutemanaacute nukleovaacute kyselina je pred hybridizaacuteciou fragmentovanaacute označenaacute fluorofoacuterom a denaturovanaacute Po kontakte čipu s cieľovou vzorkou ktoraacute je vlastne zmes označenyacutech oligonukleotidov značeneacute oligonukleotidy hybridizujuacute s oligonukleotidovyacutemi sekvenciami prichytenyacutemi na čipe Potom suacute na zaacuteklade fluorescencie detekovaneacute miesta kde došlo k hybridizaacutecii čiže vzorka obsahovala takuacuteto nukleotidovuacute sekvenciu Z jedneacuteho mikročipu sa ziacuteska obrovskeacute množstvo daacutet ktoreacute je vždy nutneacute softveacuterovo spracovať V dnešnej dobe existuje niekoľko firiem poskytujuacutecich komerčne mikročipy na objednaacutevku alebo si ich laboratoacuteria produkujuacute sami

Mikročipovanie prebieha nasledovne

1) Vytvorenie DNA čipu ndash tisiacutece rocircznych jednovlaacuteknovyacutech DNA oligonukleotidov znaacutemych sekvencii sa kovalentne naviažu na povrch doštičky vždy v určitej lokalite je niekoľko rovnakyacutech oligonukleotidov veľkosť takejto lokality je ˂ 200 microm Proacutebami mocircže byť DNA cDNA alebo syntetizovaneacute oligonukleotidy Už hotoveacute mikročipy ponuacutekajuacute viacereacute firmy (Affymetrix Agilent Technologies Eppendorf Illumina) alebo si ich jednotliveacute laboratoacuteria vyraacutebajuacute sami pomocou robotickyacutech zariadeniacute DNA čip sa vytvaacutera buď nanaacutešaniacutem kvapiek oligonukleotidov na podklad alebo synteacutezou oligonukleotidov in situ na čipe 2) Priacuteprava vzorky ndash nukleovaacute kyselina (mRNA DNA) sa purifikuje určiacute sa jej kvantita a kvalita (spektrofotometericky) fragmentuje resp v priacutepade mRNA sa syntetizuje cDNA v priacutepade potreby sa mocircže DNA amplifikovať PCR reakciou štiepiť restrikčnyacutemi endonukleaacutezami 3) Fluorescenčneacute označenie (zriedkavejšie raacutedioaktiacutevne) fragmentov DNA prebieha počas reverznej transkripcie alebo PCR amplifikaacutecie za uacutečasti fluorescenčne značenyacutech nukleotidov Keď sa analyzujuacute dve rocirczne vzorky napr zdraveacute tkanivo a naacutedoroveacute tkanivo označenie nukleovyacutech kyseliacuten v tyacutechto tkanivaacutech byacuteva rozdielne a to použitiacutem dvoch rocircznych fluorescenčnyacutech farbiacutev (napr zeleneacute a červeneacute) Pred hybridizaacuteciou je potrebneacute vzorku denaturovať čiacutem sa vytvoriacute zmes jednovlaacuteknovyacutech DNA označenyacutech značkou 4) Hybridizaacutecia s mikročipom ndash v špeciaacutelnom hybridizačnom roztoku hybridizujuacute komplementaacuterne sekvencie zo vzorky s priacuteslušnyacutemi oligonukleotidovyacutemi sondami naviazanyacutemi na čipe Potom sa čip obmyje aby došlo k odstraacuteneniu čiastočne hybridizovanyacutech nukleovyacutech kyseliacuten 5) Skenovanie mikročipu ndash skenerom čipov docircjde k ožiareniu čipu laserom pričom v mieste hybridizaacutecie fluorescenčne značenyacutech DNA fragmentov s proacutebou docircjde k emisii svetla určitej vlnovej dĺžky ktoruacute skener zaznamenaacute 6) Analyacuteza daacutet prebieha metoacutedami bioinformatiky spracovaniacutem softveacutermi sa zistiacute ktoreacute lokality čipu navzaacutejom hybridizovali v priacutepade použitia dvoch vzoriek kontrolnej a skuacutemanej je možneacute analyzovať ich relatiacutevnu intenzitu hybridizaacutecie (expresie určiteacuteho geacutenu)

Existujuacute štyri typy mikročipov 1) Čipy ur čeneacute na analyacutezu expresie (obsahujuacute cDNA proacuteby) pre tzv dvojkanaacutelovyacute experiment kedy je vzorka určenaacute k hybridizaacutecii na čipe ziacuteskanaacute zmiešaniacutem DNA fragmentov kontrolnej a skuacutemanej vzorky pričom fragmenty suacute rozdielne fluorescenčne označeneacute (napr zelenyacute fluorofoacuter pre kontrolnuacute vzorku a červenyacute pre skuacutemanuacute) Na zaacuteklade intenzity a typu fluorescencie sa deteguje expresia geacutenov typickaacute pre kontrolnuacute vzorku (napr zelenaacute fluorescencia) pre skuacutemanuacute vzorku (napr

48

červenaacute fluorescencia) a expresia podobnaacute u oboch vzoriek (žltaacute fluorescencia) neexprimovaneacute geacuteny (čierna fluorescencia) rocirczne odtiene (v zaacutevislosti od prevažujuacutecej hybridizaacutecie) (obr 48) 2) Čipy ur čeneacute na analyacutezu mutaacutecii použije sa genoacutemovaacute DNA označenaacute jednou fluorescenčnou farbičkou na určenie jednonukleotidovej zmeny (SNP ndash Single Nukleotide Polymorphism) 3) Čipy na komparatiacutevnu genoacutemovuacute hybridizaacuteciu (aCGH array Comparative Genomic Hybridization) ndash použiacutevaneacute na zistenie zvyacutešenia alebo zniacuteženia množstva chromozoacutemovyacutech fragmentov obsahujuacutecich geacuteny zodpovedneacute za určiteacute ochorenie Na analyacutezu sa použije skuacutemanaacute gDNA a referenčnaacute (kontrolnaacute) DNA každaacute sa značiacute inou fluorescenčnou farbičkou (princiacutep ako pri analyacuteze expresie) (obr 49 50) 4) Čipy CGH - SNP kombinovaneacute čipy ur čeneacute na analyacutezu aj mutaacuteciiacute SNP aj na komparatiacutevnu genoacutemovuacute hybridizaacuteciu CGH

Mikročipy majuacute rozsiahle využitie napriacuteklad v identifikaacuteciiacute novyacutech geacutenov vo vyacuteskume ich funkciiacute expresie v rocircznych podmienkach pri diagnostike mnohyacutech ochoreniacute vo farmakogenomike vo vyacuteskume vplyvu toxiacutenov

Obr 48 Heatmapa geacutenovej expresie vybranyacutech geacutenov (mRNA) mikročip obsahuje 46000 cDNA proacuteb (poskytnuteacute Ing Helenou Gbelcovou PhD Uacutestav lekaacuterskej bioloacutegie genetiky a klinickej genetiky LF UK a UNB)

49

Obr 49 Princiacutep komparatiacutevnej genoacutemovej hybridizaacutecie (aCGH - array comparative genomic hybridization) Obr 50 A) Vyacutesledok komparatiacutevnej genoacutemovej hybridizaacutecie (aCGH - array comparative genomic hybridization) vzorky DNA izolovanej plodovej vody U plodu s abnormaacutelnym ultrasonografickyacutem vyšetreniacutem bola identifikovanaacute duplikaacutecia oblasti 3q261q29 (modryacute paacutes) a deleacutecia oblasti 5p1533p151 (červenyacute paacutes) Pre porovnanie chromozoacutem 1 bez aberaacutecie b) Ten istyacute pacient ale ineacute softveacuteroveacute spracovanie (poskytnuteacute RNDr Miroslavom Tomkom PhD Medirex)

50

Odporuacutečanaacute a použitaacute literatuacutera

Odborneacute knihy Klug W S Cummings M R Spencer Ch A Palladino M A Concepts of Genetics jedenaacuteste vydanie (2015) Carson S Molecular Biology Techniques tretie vydanie (2012) Strachan T Read A Human Molecular Genetics štvrteacute vydanie (2011) Sudbery P Sudbery I Human Molecular Genetics tretie vydanie (2009)

Internetoveacute straacutenky

wwwncbinlmnihgov wwwmlpacom wwwthermofishercom wwwilluminacom wwwpromegask wwwqiagencom wwwambioncom

Odborneacute člaacutenky Chacon-Cortes D Griffiths L R Methods for extracting genomic DNA from whole blood samples current perspectives Journal of Biorepository Science for Applied Medicine Volume 2 strany 1- 9 Viltrop T Krjutskov K Palta P Metspalu A Comparison of DNA extraction methods for multiplex polymerase chain reaction Anal Biochem 2010 Volume 398(2) strany 260-262 Ing Martin Čermaacutek Molekulaacuterna cytogenetika v problematike familiaacuternych maligniacutet Onkoloacutegia Volume 2 strany 77 - 83 Livak KJ Schmittgen TD Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method Methods 2001 Volume 25(4) strany 402 - 408 Bustin S A Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays J Mol Endocrinol 2000 Volume 25(2) strany169 - 193

MOLEKULAacuteRNE METOacuteDY AKTUAacuteLNE POUŽIacuteVANEacute V KLINICKEJ GENETIKE RNDr Andrea Pastoraacutekovaacute PhD RNDr Robert Petrovič PhD Vydala Univerzita Komenskeacuteho v Bratislave Lekaacuterska fakulta Rozsah 50 straacuten 246 AH prveacute vydanie ISBN 978-80-223-4231-5

24

Nukleoveacute kyseliny je možneacute elektroforeticky separovať 1) v geacuteloch agaroacutezovom (horizontaacutelna elektroforeacuteza) (obr 22) a polyakrylamidovom (vertikaacutelna elektroforeacuteza) 2) v špeciaacutelnych lineaacuternych polymeacuteroch kapilaacuternou elektroforeacutezou použitiacutem genetickeacuteho analyzaacutetora (obr 23)

Agaroacuteza je polysacharid ziacuteskanyacute z morskej riasy použiacuteva sa najčastejšie v koncentraacuteciiacute 05-2 čiacutem vyššia koncentraacutecia tyacutem je geacutel pevnejšiacute a schopnejšiacute rozliacutešiť menšie fragmenty NK Priacuteprava je jednoduchaacute odvaacuteži sa potrebneacute množstvo agaroacutezy ktoraacute sa zmieša s tlmivyacutem roztokom (pufrom) rozvariacute sa v mikrovlnnej ruacutere a naleje sa do špeciaacutelnej naacutedoby na vytvaacuteranie geacutelov kyacutem je geacutel tekutyacute vložiacute sa do neho tzv hrebeň na vytvorenie jamiek Agaroacuteza je netoxickaacute V bežnom agaroacutezovom geacuteli v zaacutevislosti od jeho koncentraacutecie je možneacute separovať DNA fragmenty dĺžky 200-50 000 bp Dnes suacute dostupneacute aj špeciaacutelne agaroacutezy napr MetaPhorreg Agarose schopneacute oddeliť fragment DNA dĺžky 20-800bp Separaacutecia v agaroacutezovom geacuteli prebieha v horizontaacutelnej aparatuacutere preto sa nazyacuteva aj horizontaacutelna elektroforeacuteza

Polyakrylamidovyacute geacutel (PAGE) vznikaacute polymerizaacuteciou akrylamidu v priacutetomnosti špeciaacutelnych chemickyacutech laacutetok (peroxodisiacuteran amoacutenny TEMED bisakrylamid) Jeho priacuteprava je preto odlišnaacute a aj naacuteročnejšia Polyakrylamidoveacute geacutely majuacute vysokuacute rozlišovaciu schopnosť (1bp) preto suacute PAGE geacutely vhodneacute aj na sekvenovanie DNA klasickyacutemi metoacutedami PAGE geacutel nie je vhodnyacute na separaacuteciu fragmentov dlhšiacutech ako 2kb Použiacuteva sa v koncentraacutecii 35 -20 s rozliacutešeniacutem fragmentov od 10bp-2000bp Akrylamid je neurotoxiacuten musiacute sa s niacutem pracovať veľmi opatrne PAGE elektroforeacuteza bežiacute vo vertikaacutelnej aparatuacutere preto sa volaacute aj vertikaacutelna elektroforeacuteza použiacuteva sa často aj na separaacuteciu proteiacutenov

Ryacutechlosť pohybu nukleovyacutech kyseliacuten (mobilita) určuje viacero faktorov 1) veľkosť NK ndash počet baacutezovyacutech paacuterov resp baacutez pričom menšie molekuly prechaacutedzajuacute geacutelom ryacutechlejšie pretože sa ľahšie pohybujuacute v geacuteli 2) konformaacutecia nukleovej kyseliny napr u rovnako veľkyacutech plazmidov kondenzovaneacute superšpiralizovaneacute plazmidy migrujuacute najryacutechlejšie rovnako veľkeacute lineaacuterne molekuly (toho isteacuteho plazmidu) bežia pomalšie a najpomalšie putujuacute relaxovaneacute kruhoveacute molekuly plazmidu 3) koncentraacutecia geacutelu určuje jeho rozlišovaciu schopnosť koncentrovanejšiacute geacutel je schopnyacute separovať kratšie fragmenty NK redšie geacutely suacute vhodneacute pre rozliacutešenie vaumlčšiacutech fragmentov 4) zloženie geacutelu je docircležiteacute pri analyacuteze sekundaacuternych štruktuacuter NK a proteiacutenov v nedenaturovanom stave sekundaacuterna štruktuacutera spomaľuje migraacuteciu NK a proteiacutenov Tento fakt využiacutevajuacute niektoreacute diagnostickeacute techniky (napr SSCP - Single Strand Conformation Polymorphism - polymorfismus konformaacutecie jednovlaacuteknovej DNA) umožňujuacutece detekciu zaacutemeny jedinej baacutezy ktoraacute spocircsobiacute odlišneacute vnuacutetromolekuloveacute paacuterovanie a vyacuteslednuacute konformaacuteciu molekuly Geacutely mocircžu teda byť denaturačneacute a nedenaturačneacute (natiacutevne) 5) napaumltie zdroja - čiacutem vyššie je napaumltie ktoreacute vytvaacutera elektrickeacute pole v elektroforetickej aparatuacutere tyacutem ryacutechlejšie fragmenty NK migrujuacute 6) zloženie roztokov a teploty

Elektroforetickyacute tlmivyacute roztok (pufor - elektrolyt) zabezpečuje stabilneacute elektroforetickeacute podmienky počas separaacutecie geacutel je v ňom ponorenyacute Obsahuje ioacuteny čo umožňuje vedenie elektrickeacuteho pruacutedu

Štandard molekulovyacutech hmotnostiacute (v laboratoacuteriaacutech nazyacutevanyacute ladder alebo marker) je zmes fragmentov DNA alebo RNA s presne definovanou veľkosťou ktoryacute sluacuteži na odhad veľkosti vyšetrovanyacutech fragmentov NK (obr 22) Pomocou špeciaacutelnych štandardov molekulovyacutech hmotnostiacute ktoryacutech fragmenty NK majuacute definovanuacute aj hmotnosť je možneacute odhadnuacuteť množstvo (hmotnosť - koncentraacuteciu) neznaacutemeho fragmentu

B C

25

41 Vizualizaacutecia DNA

Samotnaacute nukleovaacute kyselina je počas elektroforetickej separaacutecie neviditeľnaacute Vizualizaacuteciu NK umožňujuacute interkalačneacute činidlaacute ktoreacute suacute schopneacute naviazať sa na molekuly NK tyacutem že sa včlenia medzi susediace baacutezy Po ožiareniacute UV svetlom interkalačneacute činidlaacute naviazaneacute na NK fluoreskujuacute tak sa vizualizuje NK čiacutem intenziacutevnejšie fluoreskuje tyacutem viac NK je v geacutelipruacutežku priacutetomneacute Interkalačneacute činidlo sa buď primieša do geacutelu pri jeho priacuteprave čo umožniacute sledovať migraacuteciu fragmentov NK počas elektroforeacutezy a to po vybratiacute z ELFO aparatuacutery a po ožiareniacute UV svetlom alebo sa geacutel farbiacute po elektroforetickej separaacutecii V minulosti bol na zviditeľnenie NK najčastejšie použiacutevanyacute etidiumbromid kvocircli jeho mutageacutennym vlastnostiam sa v suacutečasnosti nahraacutedza menej mutageacutennymi a netoxickyacutemi činidlami ako suacute napr komerčne dostupneacute SYBRregSafe GelRedtrade GelGreentrade

Kapilaacuterna elektroforeacuteza NK prebieha v špeciaacutelnom priacutestroji genetickom analyzaacutetore (obr 23) ktoryacute musiacute mať zaacutekladneacute komponenty ako suacute elektroacutedy kapilaacutera zdroj vysokeacuteho napaumltia detektor prepojenie s počiacutetačom a softveacuteroveacute vybavenie priestor na vloženie vzoriek atď Genetickyacute analyzaacutetor predstavuje automatizovanyacute systeacutem umožňujuacuteci sekvenovanie určovanie dĺžky DNA fragmentov ndash fragmentačnuacute analyacutezu a kvantifikaacuteciu nukleovyacutech kyseliacuten V novšiacutech typoch genetickeacuteho analyzaacutetora je proces analyacutezy od vloženia vzoriek do stojana automatizovanyacute

Vzorka určenaacute na analyacutezu je elektrokineticky injektovanaacute do tenkej kapilaacutery naplnenej lineaacuternym polymeacuterom Vplyvom vysokeacuteho napaumltia sa negatiacutevne nabiteacute fragmenty DNA pohybujuacute v polymeacuteri k pozitiacutevne nabitej elektroacutede Kapilaacuterna elektroforeacuteza je tak citlivaacute že je schopnaacute detegovať jednobaacutezovyacute rozdiel DNA fragmentov DNA fragmenty musia byť pred kapilaacuternou elektroforeacutezou fluorescenčne označeneacute v kapilaacutere suacute separovaneacute na zaacuteklade veľkosti Kraacutetko pred dosiahnutiacutem kladne nabitej elektroacutedy docircjde po excitaacutecii laserovyacutem žiareniacutem k emisii žiarenia fluoroformi (farbičkami) tak že optickyacute detekčnyacute systeacutem zaznamenaacute fluorescenciu ktoraacute je naacutesledne softveacuterovo spracovanaacute a vyhodnotenaacute

Obr 23 Genetickyacute analyzaacutetor

42 RFLP

Metoacuteda polymorfizmu dĺžky restrik čnyacutech fragmentov (angl Restriction Fragment Length Polymorfism) bola prvou metoacutedou využiacutevanou na detekciu DNA variaacuteciiacute rocircznych biologickyacutech vzoriek Princiacutep metoacutedy spočiacuteva v priacutetomnosti polymorfizmov v DNA sekvencii rocircznych ľudiacute ktoreacute zapriacutečinia rozdielny profil (obrazec) DNA fragmentov po štiepeniacute jednou alebo viaceryacutemi restrikčnyacutemi endonukleaacutezami Restrikčneacute endonukleaacutezy (RE) suacute enzyacutemy ktoreacute štiepia DNA molekulu v oblasti špecifickej nukleotidovej sekvencie nazyacutevanej restrik čneacute miesto RE najčastejšie rozpoznaacutevajuacute a štiepia miesto veľkeacute 4-6 baacutez RE suacute priacutetomneacute u prokaryotov (bakteacuterie a archebakteacuterie) kde suacute suacutečasťou restrik čno-modifikačneacuteho systeacutemu akoby prokaryotickeacutej vrodenej imunity sluacutežia

26

na ochranu pred cudzou DNA (napr viacuterusovou) ktoruacute po rozpoznaniacute špecifickej sekvencie štiepia

Restrikčno-modifikačnyacute systeacutem maacute dve zložky 1) modifikačneacute enzyacutemy - metylaacutezy ktoreacute procesom metylaacutecie modifikujuacute určiteacute baacutezy svojej DNA čiacutem ich označia za vlastnuacute DNA takže takaacuteto DNA je potom rezistentnaacute voči štiepeniu restrikčnyacutemi endonukleaacutezami Najčastejšiacutem spocircsobom metylaacutecie u bakteacuteriiacute je metylaacutecia adeniacutenu na N6 pričom vznikne metyladeniacuten alebo cytoziacutenu na C5 metylcytoziacuten 2) restrikčneacute endonukleaacutezy štiepia špecifickeacute miesto dvojvlaacuteknovej DNA ktoreacute je tvoreneacute symetrickou sekvenciou zrkadlovo sa opakujuacutecich nukleotidov ndash tzv palindroacutem Restrikčneacute enzyacutemy sa použiacutevajuacute na štiepenie DNA sekvencie na mieste špecifickom pre tuacute ktoruacute restrikčnuacute endonukleaacutezu napr pri analyacuteze polymorfizmov dĺžky restrikčnyacutech fragmentov (RFLP) analyacuteze jednonukleotidovyacutech polymorfizmov (SNP) mutaacuteciiacute ako aj pri klonovaniacute DNA do vhodnyacutech vektorovyacutech DNA molekuacutel

Po štiepeniacute dvojvlaacuteknovej DNA restrikčnou endonukleaacutezou mocircžu vzniknuacuteť tri typy koncov - 5´-prečnievajuacutece konce (lepiveacute) 3´-prečnievajuacutece konce (lepiveacute) a tupeacute konce (obr 24)

Obr 24 Restrikčneacute štiepenie zanechaacutevajuacutece rocirczne konce tupeacute a lepiveacute

Restrikčneacute štiepenie je často použiacutevanou metoacutedou geacutenovyacutech manipulaacuteciiacute na konštrukciu

hybridnyacutech molekuacutel DNA s naacuteslednyacutem klonovaniacutem Priebeh RFLP analyacutezy je nasledovnyacute restrikčnaacute endonukleaacuteza sa pridaacute k DNA a zmes sa vo

vhodnyacutech reakčnyacutech podmienkach (pufor teplota) inkubuje niekoľko hodiacuten Počas inkubaacutecie docircjde k štiepeniu DNA na špecifickyacutech miestach DNA je potom elektroforeticky separovanaacute v geacuteli a naacutesledne vizualizovanaacute V minulosti po geacutelovej elektroforeacuteze nasledoval Southern blot (čiže prenos separovanyacutech fragmentov DNA z geacutelu na špeciaacutelnu membraacutenu) (obr 35) po ktorom nastala vizualizaacutecia raacutedioaktiacutevne značenou proacutebou V suacutečasnosti sa kvocircli praacutecnosti a zdravotnyacutem rizikaacutem od Southern blotu upuacutešťa a prechaacutedza sa na ryacutechlejšie menej praacutecne a zdravotne šetrnejšie metoacutedy priateľskejšie aj k životneacutemu prostrediu

RFLP bola prvou metoacutedou použiacutevanou na zistenie DNA profilu (DNA fingerprinting) mapovanie geacutenov zapriacutečiňujuacutece genetickeacute ochorenia a testovanie otcovstva Vaumlčšina RFLP markerov je vysoko lokusovo špecifickyacutech a kodominantnyacutech (obidve alely suacute detekovaneacute u heterozygota)

PCR-RFLP je laboratoacuterne priacutestupnejšia metoacuteda molekulaacuterno-genetickej diagnostiky keďže PCR umožňuje amplifikaacuteciu veľmi malyacutech množstiev DNA Alternatiacutevny naacutezov použiacutevanyacute v literatuacutere je CAPS z angl Cleaved Amplified Polymorphic Sequence assay Použitiacutem špecifickyacutech primerov docircjde PCR metoacutedou k amplifikaacutecii požadovaneacuteho uacuteseku DNA ten sa potom štiepi restrikčnou endonukleaacutezou vo vhodnyacutech podmienkach naacutesledne sa štiepne produkty elektroforeticky separujuacute a vizualizujuacute použitiacutem interkalačnyacutech farbiacutev a UV svetla (obr 25)

27

Obr 25 Princiacutep metoacutedy PCR-RFLP

43 VNTR a STR V geacutenome suacute priacutetomneacute dva typy tandemovyacutech (za sebou nasledujuacutecich) opakovaniacute

1) minisatelity ndash nazyacutevaneacute variabilnyacute počet tandemovyacutech opakovaniacute VNTR (variable number of tandem repeats) 2) mikrosatelity tiež kraacutetke tandemoveacute repetiacutecie STR (short tandem repeats)

Obidva tieto typy satelitnej DNA suacute rozmiestneneacute po celom genoacuteme suacute využiacutevaneacute hlavne vo forenznej genetike na identifikaacuteciu osocircb a určenie otcovstva popriacutepade materstva ale aj v mediciacutene na detekciu chromozoacutemovyacutech aneuploidiiacute Štruktuacutera obidvoch je podobnaacute Rozdiel medzi jednotlivyacutemi alelami je spocircsobenyacute rozdielnym počtom opakovaniacute opakujuacutecej sa sekvencie (motiacutevu) čo spocircsobiacute rocircznu dĺžku alel s rocircznym počtom tandemovyacutech opakovaniacute nazyacutevanuacute polymorfizmus dĺžky fragmentov

VNTR ndash variabilnyacute počet tandemovyacutech opakovaniacute pričom opakujuacuteca sa sekvencia maacute dĺžku od 6 do 100 baacutez pričom sa mocircže opakovať aj tisiacutece kraacutet alely tak mocircžu mať od 500do 30 000 baacutez VNTR boli v kombinaacutecii s RFLP (DNA fingerprinting ) prvyacutem polymorfizmom použiacutevanyacutem na zistenie DNA profilov a identifikaacuteciu osocircb v kriminalistickej praxi V suacutečasnosti jeho využitie v kriminalistike je kvocircli potrebe relatiacutevne veľkeacuteho množstva DNA nahradeneacute využitiacutem STR

STR - kraacutetke tandemoveacute repetiacutecie suacute v kriminalistike najčastejšie použiacutevanyacutem polymorfizmom STR lokusy suacute rozmiestneneacute po celom genoacuteme repetiacutecia obsahuje jednu až šesť baacutez pričom jej opakovaniacutem vznikne STR v rozsahu od 50 do 300bp V našom genoacuteme suacute tisiacutece STR ktoreacute mocircžu byť použiteacute pre forenznuacute analyacutezu V kriminalistike sa v suacutečasnosti na identifikaacuteciu osocircb použiacuteva 13 STR locusov ktoreacute patria k medzinaacuterodne uznaacutevanyacutem štandardom Z iniciatiacutevy FBI bola vytvorenaacute databaacuteza CODIS (Combined DNA Index System) každaacute krajina maacute svoju databaacutezu CODIS kde je možneacute vložiť a archivovať DNA profily jednotlivcov ako aj profily DNA ziacuteskanyacutech z miest kriminaacutelneho činu v databaacuteze je ich možneacute navzaacutejom porovnať a tak zistiť pocircvodcu trestneacuteho činu Medzinaacuterodnaacute jednotnosť v použiacutevaniacute CODIS STR lokusov umožňuje v priacutepade potreby vzaacutejomneacute porovnanie DNA profilov zistenyacutech na uacutezemiacute rocircznych štaacutetov CODIS STR lokusov je 13 a suacute to CSF1PO FGA TH01 TPOX VWA D3S1358 D5S818 D7S820 D8S1179 D13S317 D16S539 D18S51 a D21S11 Zistenie DNA profilu sa uskutočniacute multiplexnou PCR reakciou s fluorescenčne značenyacutemi primermi špecifickyacutemi pre konkreacutetny STR Naacutesledne suacute PCR produkty analyzovaneacute kapilaacuternou elektroforeacutezou genetickyacutem analyzaacutetorom ktoryacute rozliacuteši amplifikovaneacute fragmenty na zaacuteklade fluorescencie a dĺžky (fragmentačnaacute analyacuteza) (obr 26 Tab 3) DNA profil každeacuteho človeka je jedinečnyacute rovnakyacute profil mocircžu mať len jednovaječneacute dvojčataacute

28

Obr 26 Ukaacutežka DNA profilu človeka 15 STR lokusov s určeniacutem pohlavia pomocou lokusu pre amelogeniacuten (ženskeacute pohlavie - XX) maleacute oranžoveacute piacuteky predstavujuacute fragmenty veľkostneacuteho štandardu Tabuľka č 3 Zaacutepis DNA profilu človeka z obraacutezka č 26 15 STR lokusov s určeniacutem pohlavia pomocou lokusu pre amelogeniacuten System Alela 1 Alela 2

D3S1358 16 17

TH01 9 93 D21S11 28 28

D18S51 15 18

Penta E 7 14 D5S818 9 12

D13S317 8 11

D7S820 8 11 D16S539 11 12

CSF1PO 10 11

Penta D 11 12 vWA 15 18

D8S1179 13 16

TPOX 8 9 FGA 20 21

amel X X

29

5 MLPA

Multiplexnaacute amplifikaacutecia proacuteb zaacutevislaacute od ligaacutecie (z angl multiplex ligation-dependent probe amplification) je metoacuteda schopnaacute v jednej reakcii (v jednej skuacutemavke a vzorke) detegovať zmeny v počte až 50 nukleotidovyacutech sekvenciiacute Metoacutedou MLPA je možneacute ryacutechlo identifikovať amplifikaacutecie (duplikaacutecie) a deleacutecie veľkeacuteho počtu geacutenov či už použitiacutem DNA alebo mRNA krvnyacutech vzoriek alebo vzoriek z naacutedorov

Princiacutep MLPA spočiacuteva v multiplexnej amplifikaacutecii 50 špecifickyacutech nukleotidovyacutech sekvenciiacute použitiacutem jedneacuteho paacuteru primerov pričom jeden primer je fluorescenčne označenyacute Vyacutesledneacute PCR produkty suacute analyzovaneacute kapilaacuternou elektroforeacutezou (fragmentačnaacute analyacuteza) Dĺžka každeacuteho namnoženeacuteho produktu je jedinečnaacute narastaacute postupne o 6 alebo 9 nukleotidov pričom produkty PCR suacute 120 ndash 500 nukleotidov dlheacute Tento veľkostnyacute rozsah PCR fragmentov (dĺžka 120-500 nukleotidov s naacuterastom postupne o 6 alebo 9 nukleotidov) je optimaacutelny pre kapilaacuternu elektroforeacutezu MLPA multiplexnaacute PCR prebieha za použitia iba jedineacuteho paacuteru primerov ktoreacute amplifikujuacute špecifickeacute sekvencie Trik spočiacuteva v tom že nedochaacutedza k amplifikaacutecii DNA sekvencie ale MLPA proacuteb ktoreacute suacute pridaneacute k vzorkaacutem Každaacute MLPA proacuteba pozostaacuteva z dvoch oligonukleotidov (dve hemiproacuteby) pričom každyacute oligonukleotid obsahuje jednu zo sekvencie rozpoznaacutevanuacute PCR primermi Proacuteba vznikne jedine za predpokladu hybridizaacutecie dvoch oligonukleotidov (hemiproacuteb) k cieľovej sekvencii (geacutenu) a po ligaacutecii enzyacutemom ligaacutezou Iba ligovaneacute proacuteby suacute exponenciaacutelne amplifikovaneacute pomocou jedneacuteho paacuteru primerov Množstvo zligovanyacutech proacuteb teda zaacutevisiacute od množstva cieľovyacutech sekvenciiacute (geacutenov) vo vzorke

Postup MLPA analyacutezy je nasledovnyacute (obr27) K vzorke nukleovej kyseliny (DNA resp mRNA) sa pridaacute zmes 50 jedinečnyacutech proacuteb každaacute

proacuteba je komplementaacuterna k určitej cieľovej sekvencii NK vzorky Každaacute proacuteba však pozostaacuteva z dvoch oligonukleotidov hybridizujuacutecich vedľa seba zaacuteroveň každyacute oligonukleotid (hemiproacuteba) obsahuje pridanuacute sekvenciu rozpoznaacutevanuacute paacuterom PCR primerov Po hybridizaacuteciiacute oligonukleotidov (hemiproacuteb) dochaacutedza k ich ligaacutecii ligaacutezou Ligačnaacute reakcia je tak špecifickaacute že je schopnaacute rozliacutešiť sekvenciu liacutešiacu sa v jednom nukleotide Vyacuteslednyacute ligačnyacute produkt (proacuteba) obsahuje obidve sekvencie pre PCR primery na jednom fragmente čiže mocircže docircjsť k namnoženiu takeacutehoto fragmentu PCR reakciou V priacutepade ak nedocircjde k ligaacutecii priacuteslušnyacutech hemiproacuteb pretože hemiproacuteby nenaacutejdu cieľovuacute sekvenciu na DNA každaacute takaacuteto nezligovanaacute hemiproacuteba maacute len jednu sekvenciu rozpoznaacutevanuacute len jednyacutem PCR primerom v docircsledku čoho nemocircže prebehnuacuteť jej PCR amplifikaacutecia a počas fragmentačnej analyacutezy nie je detegovanaacute pretože negeneruje fluorescenčnyacute signaacutel

Pri MLPA analyacuteze je docircležiteacute okrem MLPA amplifikaacutecie vzorky urobiť aj MLPA amplifikaacuteciu referenčnej vzorky ku ktorej sa bude porovnaacutevať počet geacutenov (cieľovyacutech sekvenciiacute) Po kapilaacuternej elektroforeacuteze MLPA referenčnej a skuacutemanej vzorky porovnaniacutem obsahu nameranyacutech hodnocirct tzv piacutekov priacuteslušnyacutech proacuteb sa určiacute relatiacutevny počet koacutepiiacute v skuacutemanej vzorke

MLPA

1 DNA denaturaacutecia a hybridizaacutecia s MLPA proacutebami (hemiproacuteby)

2 Ligaacutecia (vytvorenie kompletnyacutech proacuteb)

3 PCR amplifikaacutecia proacuteb paacuterom primerov

4 Kapilaacuterna elektroforetickaacute separaacutecia PCR produktov

5 Analyacuteza daacutet

30

Obr 27 Princiacutep MLPA

Firma MRC-Holland v suacutečasnosti ponuacuteka stovky MLPA setov proacuteb ktoreacute suacute vhodneacute na 1) diagnostiku kongenitaacutelnych a dedičnyacutech ochoreniacute 2) zisťovanie profilu naacutedorov 3) zisťovanie metylačneacuteho profilu

MLPA je metoacuteda vhodnaacute na detekciu malyacutech prestavieb (BRCA1 BRCA2 MSH2 atď)

veľkyacutech chromozoacutemovyacutech prestavieb (Williamsov syndroacutem Prader-WilliAngelman syndroacutem atzď)

31

detekciu zmien v počte koacutepii geacutenov (obr 28 29) ako aj zistenie počtu kompletnyacutech chromozoacutemov (chromozoacutem 13 18 21 XY tiež aj z amniovej tekutiny) diagnostiku naacutedorov (zmeny počtu pri ALL CLL atď) kvantifikaacuteciu metylaacutecie (Prader-WilliAngelmanov syndroacutem Fragilnyacute X inaktivaacutecia naacutedorovyacutech supresorovyacutech geacutenov atď) mRNA analyacutezu geacutenov zuacutečastňujuacutecich sa apoptoacutezy alebo zaacutepalov

MS-MLPA (Methylation-Specific MLPA) je varianta MLPA určenaacute špeciaacutelne na analyacutezu aberantnyacutech metylaacutecii imprintovanyacutech oblastiacute ako aj detekciu metylačnyacutech zmien CpG ostrovčekov lokalizovanyacutech bliacutezko promoacutetora Rozdiel oproti štandardnej MLPA spočiacuteva v použitiacute metylačne senzitiacutevneho restrikčneacuteho enzyacutemu HhaI ktoryacute štiepi MS-MLPA proacuteby hybridizovaneacute k nemetylovanej sekvencii Každaacute DNA vzorka určenaacute pre MS-MLPA analyacutezu prejde dvoma reakciami v jednej mikroskuacutemavke štandardnou MLPA analyacutezou (bez štiepenia metylačne senzitiacutevnym enzyacutemom) a v druhej mikroskuacutemavke docircjde okrem ligaacutecie proacuteb aj k metylačne senzitiacutevnemu štiepeniu hybridizovanyacutech proacuteb s nemetylovanou DNA Amplifikujuacute sa len ligovaneacute proacuteby po PCR amplifikaacutecii sa fragmentačnou analyacutezou porovnaniacutem oboch reakciiacute zistia rozdiely v metylačnom profile vzorky k referenčnej vzorke

RT-MLPA (Reverse Transkriptase MLPA) je variaacutecia MLPA určenaacute pre zistenie mRNA profilu vzorky je alternatiacutevou k real-time PCR a mikročipom RT-MLPA nedeteguje mRNA množstvo priamo pretože použiacutevanaacute ligaacuteza nie je schopnaacute ligovať DNA oligonukleotidy keď suacute hybridizovaneacute s RNA Preto RT-MLPA začiacutena reverznou transkripciou so špeciaacutelne navrhnutyacutemi RT primermi tak aby vytvorili kraacutetke oligonukleotidy (cDNA) Potom reakcia pokračuje ako štandardnaacute MLPA

Obr 28 MLPA analyacuteza geacutenu DMD (koacutedujuacuteceho dystrofiacuten) mutaacutecie ktoreacuteho spocircsobujuacute Duchennovu svalovuacute dystrofiu u pacienta je priacutetomnaacute deleacutecia exoacutenu 45 v porovnaniacute s referenčnou vzorkou ndash kontrolou

32

Obr 29 MLPA analyacuteza geacutenu DMD (koacutedujuacuteceho dystrofiacuten) mutaacutecie ktoreacuteho spocircsobujuacute Duchennovu svalovuacute dystrofiu u pacienta suacute priacutetomneacute duplikaacutecie exoacutenov 41 42 43 44 45 (piacuteky vo vzorke pacienta sa porovnajuacute s piacutekmi v kontrole ndash referenčnej vzorke)

33

6 Sekvenovanie

Sekvenovaniacutem rozumieme určenie primaacuternej štruktuacutery DNA teda určenie poradia nukleotidov v reťazci DNA Začiatky moderneacuteho sekvenovania siahajuacute do roku 1977 kedy boli objaveneacute dve metoacutedy sekvenovania 1) chemickaacute metoacuteda Maxama a Gilberta 2) enzymatickaacute metoacuteda Sangera Nicklena a Coulsona

Princiacutep obidvoch metoacuted sekvenovania spočiacuteva v tom že sa vytvoriacute suacutebor DNA molekuacutel s rocircznou veľkosťou ktoreacute suacute zakončeneacute konkreacutetnym nukleotidom tieto DNA molekuly sa elektroforeticky separujuacute v geacuteloch s rozlišovacou schopnosťou 1 nukleotid 61 Chemickaacute metoacuteda

DNA molekuly sa na 5-konci raacutedioaktiacutevne označia raacutedioaktiacutevnym fosforom a naacutesledne sa chemicky modifikujuacute špecificky pre každuacute baacutezu DNA sa potom v modifikovanyacutech miestach štiepi čiacutem vzniknuacute rocirczne dlheacute fragmenty pričom podmienky suacute nastaveneacute tak aby sa DNA na každom mieste štiepila len raz Modifikaacutecia DNA a štiepenie prebehne v štyroch separaacutetnych reakciaacutech (skuacutemavkaacutech) takže po elektroforetickej separaacuteciiacute takto opracovanej DNA v štyroch draacutehach polyakrylamidoveacuteho geacutelu a naacuteslednej autoraacutediografii (podobne ako pri Southernovej hybridizaacutecii) je možneacute odčiacutetať nukleotidovuacute sekvenciu približne 100 nukleotidov od raacutedioaktiacutevneho označenia (v čase objavu Maxama a Gilberta) 62 Sangerova metoacuteda

Zaacuteklady metoacutedy boli popiacutesaneacute už v roku 1975 (metoacuteda plus a miacutenus) ale až vylepšenie použitiacutem dideoxynukleotidov (ddNTP) v roku 1977 došlo k zjednodušeniu sekvenovania Princiacutepom enzyacutemoveacuteho sekvenovania je terminaacutecia (zastavenie) polymerizaacutecie inkorporaacuteciou 2´ 3 -dideoxynukleotidov do novosyntetizujuacuteceho sa vlaacutekna DNA Keďže ddNTP neobsahujuacute hydroxylovuacute skupinu na 3 uhliacuteku riboacutezy nemocircžu sa zuacutečastniť na tvorbe fosfodiesterovej vaumlzby nemocircže sa pripojiť k nim ďalšiacute nukleotid čiže musiacute docircjsť k terminaacuteciiacute polymeraacutecie Reakcia prebieha v štyroch skuacutemavkaacutech s raacutedioaktiacutevne značenyacutem primerom V každej skuacutemavke suacute priacutetomneacute všetky štyri deoxynukleotidtrifosfaacutety (dNTP) ale pre každuacute skuacutemavku je špecifickyacute priacutedavok maleacuteho množstva jedneacuteho z dideoxynukleotidtrifosfaacutetov (v prvej skuacutemavke je ddATP v druhej ddCTP v tretej ddTTP a vo štvrtej ddGTP) Maleacute množstvo ddNTP spocircsobiacute že pri polymerizaacutecii dochaacutedza k prednostneacutemu zaradeniu štandardnyacutech dNTP do narastajuacuteceho reťazca a len občas sa inkorporuje ddNTP čiacutem sa zastaviacute synteacuteza reťazca V každej skuacutemavke tak vznikne suacutebor DNA fragmentov rocircznych veľkostiacute zakončenyacutech priacuteslušnyacutem ddNTP (v prvej skuacutemavke ddATP v druhej ddCTP v tretej ddTTP a vo štvrtej ddGTP) Po elektroforetickej separaacutecii v 4 draacutehach polyakrylamidoveacuteho geacutelu a autoraacutediografii sa z autoraacutediogramu odčiacuteta sekvencia

V suacutečasnosti je sekvenovanie do značnej miery automatizovaneacute pričom využiacuteva princiacutep Sangerovej enzyacutemovej metoacutedy s určityacutemi obmenami Uacutesek DNA ktoryacute treba sekvenovať sa prostredniacutectvom termostabilnyacutech DNA polymeraacutez namnožiacute PCR metoacutedou po ktorej nasleduje sekvenačnaacute reakcia (asymetrickaacute PCR) s fluorescenčne značenyacutemi ddNTP (každyacute druh označenyacute inyacutem fluorescenčnyacutem farbivom) Sekvenačnaacute reakcia prebieha v jednej skuacutemavke s jednyacutem primerom vznikne tak suacutebor jednovlaacuteknovyacutech DNA rocircznej dĺžky ktoreacute suacute na 3konci označeneacute ddNTP so špecifickyacutem fluorescenčnyacutem farbivom Taacuteto metoacuteda sekvenovania sa tiež nazyacuteva rdquodye-terminator cycle sequencingrdquo(obr 30) Po kapilaacuternej elektroforeacuteze vzorky v genetickom analyzaacutetore zaznamenaacutevaniacute fluorescencie jednotlivyacutech fragmentov CCD kamerou a softveacuterovom spracovaniacute sa ziacuteska sekvencia DNA (obr 31)

34

Obr 30 Princiacutep sekvenovania Sangerova dideoxy metoacuteda alebo tzv chain termination method (reťazec zastavujuacuteca metoacuteda) Obr 31 Určenie genotypu plodu a rodičov sekvenčnou analyacutezou DNA ziacuteskanej z plodovej vody (prenataacutelna diagnostika) a perifeacuternej krvi sekvenčnaacute analyacuteza geacutenu ASPA vyacutesledok u plodu priacutetomnaacute mutaacutecia c 914CgtA v homozygotnom stave (AA) rodičia heterozygoti (AC) Uvedenaacute mutaacutecia je v homozygotnom stave kauzaacutelnou priacutečinou Canavanovej choroby

Automatizovaneacute sekvenovanie prinaacuteša viacereacute vyacutehody oproti klasickej Sangerovej metoacutede vyššiu presnosť a ryacutechlosť v jednej sekvenačnej reakcii možnosť osekvenovať až 1200 nukleotidovyacute fragment maleacute množstvo templaacutetu potrebneacute na analyacutezu

35

63 Next Generation Sequencing (NGS)

NGS (sekvenovanie novej generaacutecie) maacute obrovskyacute potenciaacutel v analyacuteze genoacutemov pričom toto označenie zahŕňa viacereacute technologickeacute metoacutedy reprezentovaneacute niekoľkyacutemi firmami Princiacutepom je masiacutevne paralelneacute sekvenovanie čiacutem sa ziacuteskajuacute raacutedovo tisiacutece až milioacuteny sekvenciiacute naraz 631 Sekvenovanie druhej generaacutecie

Na začiatku sa analyzovanaacute DNA vo vaumlčšine priacutepadov fragmentuje (vznikne tak DNA

knižnica) na fragmenty sa pripoja kraacutetke sekvencie ndash adapteacutery naacutesledne sa tieto fragmenty rocircznymi priacutestupmi amplifikujuacute a určiacute sa ich sekvencia Vďaka čiastočnyacutem prekryvom je zo ziacuteskanyacutech sekvencii možneacute poskladať plynuluacute sekvenciu zodpovedajuacutecu pocircvodnej nefragmentovanej DNA

Pyrosekvenovanie je podobne ako Sangerova metoacuteda založenaacute na princiacutepe synteacutezy komplementaacuterneho vlaacutekna DNA avšak rozdiel je v tom že sa na detekciu inkorporaacutecie nukleotidu využiacuteva inyacute systeacutem tvorby luminiscenčneacuteho signaacutelu v priebehu reakcie Pyrosekvenovanie je umožneneacute vďaka aktivite 4 enzyacutemov - DNA polymeraacutezy ATP sulfurylaacutezy luciferaacutezy a apyraacutezy Reakčnaacute zmes obsahuje aj ďalšie komponenty - enzymatickeacute substraacutety adenoziacutenfosfosulfaacutet (APS) d-luciferiacuten sekvenovanyacute templaacutet a cyklicky postupne po jednom type pridaacutevaneacute nukleotidtrifosfaacutety Po zabudovaniacute nukleotidu do novovznikajuacuteceho reťazca docircjde k uvoľneniu pyrofosfaacutetu naacutesledne je využityacute ATP sulfurylaacutezou na synteacutezu ATP z APS počas ďalšej reakcie docircjde k využitiu ATP luciferaacutezou na premenu luciferiacutenu na oxyluciferiacuten čo spocircsobiacute svetelnyacute signaacutel a ten zaznamenaacute detekčnyacute systeacutem Poslednou enzymatickou reakciou je reakcia apyraacutezy ktoraacute odstraacuteni nezainkorporovaneacute nukleotidy a nevyužiteacute ATP aby sa celyacute proces mohol zopakovať s reakčnou zmesou obsahujuacutecou ďalšiacute nukleotidtrifosfaacutet (inyacute ako v predchaacutedzajuacutecej reakcii) Po každej reakcii detektor zaznamenaacuteva emisiu svetla na zaacuteklade intenzity svetla je možneacute určiť či bol vradenyacute priacuteslušnyacute nukleotidtrifosfaacutet či bol inkorporovanyacute jeden priacutepadne viac rovnakyacutech nukleotidtrifosfaacutetov

Zvyacutešenie vyacutekonu pyrosekvenovania umožnila tzv emulznaacute PCR v mikročasticiach a použitie platničky PicoTiterPlatereg toto sekvenovanie zaviedla firma Roche pod pojmom 454 pyrosekvenovanie v roku 2005 Na začiatku sa DNA fragmentuje na uacuteseky dlheacute 400-600 baacutez dvojvlaacuteknovaacute fragmentovanaacute DNA sa liguje s adapteacutermi prostredniacutectvom nich sa naviaže na mikročastice dvojvlaacuteknoveacute fragmenty sa oddelia mikročastice s naviazanyacutemi jednovlaacuteknovyacutemi fragmentami sa premiešajuacute so zmesou oleja a roztoku ktoryacute obsahuje všetky komponenty na uacutespešnuacute PCR Tyacutemto spocircsobom sa okolo každej mikročastice vytvoriacute vlastnyacute mikroreaktor v ktorom prebehne amplifikaacutecia fragmentu Po PCR reakcii sa mikročastice prenesuacute do platničky PicoTiterPlate v ktorej sa do jamky zmestiacute akuraacutet jedna mikročastica a reakčneacute komponenty pyrosekvenačnej reakcie PicoTiterPlatereg maacute 1 600 000 jamiek každaacute jamka maacute maximaacutelny objem 75 picolitra Platnička s mikročasticami sa vložiacute do sekvenačneacuteho systeacutemu ndash priacutestroja v ktorom sa celeacute pyrosekvenovanie uskutočniacute Chemiluminiscenčneacute signaacutely ktoryacutech počas sekvenovania vznikajuacute milioacuteny v priebehu hodiny suacute zachyteneacute CCD kamerou a analyzovaneacute softveacuterom

Firma Illumina predstavila inuacute technoloacutegiu PCR amplifikaacutecia a sekvenovanie sa uskutočňuje na skliacutečku (flow cell) Fragmentaacutecia DNA a pripojenie adapteacuterov prebieha za uacutečasti transpozoacutemov v procese nazvanom tagmentaacutecia Po hybridizaacutecii fragmentov DNA na skliacutečko prebehne v klastroch PCR amplifikaacutecia (tzv mostiacutekovaacute amplifikaacutecia) sekvenaacutecia prebieha za uacutečasti rozdielne fluorescenčne značenyacutech a chemicky modifikovanyacutech nukleotidov pričom každyacute nukleotid emituje fluorescenciu s inou vlnovou dĺžkou Na skliacutečku prebieha paralelne až 6 miliaacuterd sekvenaacutecii (obr 32)

Ďalšiacutemi možnosťami sekvenovania druhej generaacutecie je systeacutem SOLid (vyvinutyacute firmou Applied Biosystem dnes pod Thermo Fisher Scientific) a Ion Semiconductor Sequencing ndash polovodičoveacute ioacutenoveacute sekvenovanie (od firmy Ion Semiconductor Sequencing v suacutečasnosti Thermo Fisher Scientific)

36

Obr 32 Princiacutep sekvenovania novej generaacutecie od firmy Illumina PCR amplifikaacutecia a sekvenovanie sa uskutočňuje na skliacutečku (flow cell) paralelne prebieha až 6 miliaacuterd sekvenaacutecii

632 Sekvenovanie tretej generaacutecie

Pred sekvenovaniacutem netreba amplifikovať DNA PCR metoacutedou ale sekvencia sa ziacuteskava zachyteniacutem signaacutelu v reaacutelnom čase Medzi sekvenovanie tretej generaacutecie patriacute SMRT (Single Molecule Real-Time Sequencing) a Nanopore Sequencing

37

7 Fragmentačnaacute analyacuteza DNA

Je metoacuteda použiacutevanaacute na určenie veľkosti fragmentov DNA ziacuteskanyacutech PCR reakciou Dĺžka amplifikovanyacutech DNA fragmentov sa zistiacute ich porovnaniacutem s veľkostnyacutem štandardom (obr 33) ktoryacute je tvorenyacute DNA fragmentami znaacutemej dĺžky Veľkostnyacute štandard je pred kapilaacuternou elektroforeacutezou zmiešanyacute so vzorkou DNA fragmenty veľkostneacuteho štandardu suacute fluorescenčne označeneacute pričom použiteacute fluorescenčneacute farbivo je ineacute ako fluorescenčneacute farbivo použiteacute na označenie DNA fragmentov vo vyšetrovanej vzorke

Obr 33 Elektroforetogram veľkostneacuteho štandardu použiacutevaneacuteho na určenie veľkostiacute fragmentov analyzovanyacutech kapilaacuternou elektroforeacutezou v genetickom analyzaacutetore (GeneScantrade 500 LIZtrade dye Size Standard) dĺžka fragmentov v nukleotidoch (napr 50 nukleotidov)

Fragmentačnaacute analyacuteza pozostaacuteva z viaceryacutech krokov Prvyacutem je izolaacutecia DNA nasleduje PCR amplifikaacutecia počas ktorej sa novosyntetizovaneacute DNA fragmenty označia fluorescenčnyacutemi farbivami Vzorka s PCR produktom sa pripraviacute na kapilaacuternu elektroforeacutezu tak že sa zmieša s veľkostnyacutem štandardom (sluacuteži na určenie veľkosti fragmentov) a denaturačnou laacutetkou (formamid) nasleduje denaturaacutecia Pripraveneacute vzorky suacute injektovaneacute do priacutestroja (genetickyacute analyzaacutetor) kde v kapilaacutere naplnenej polymeacuterom v elektrickom poli migrujuacute fluorescenčne značeneacute fragmenty DNA na zaacuteklade veľkosti (kapilaacuterna elektroforeacuteza) Počas elektroforeacutezy genetickyacute analyzaacutetor zaznamenaacuteva fluorescenciu fragmentov Analyacutezou daacutet prostredniacutectvom špeciaacutelnych softveacuterov sa ziacuteskajuacute elektroforetogramy z ktoryacutech je možneacute zistiť veľkosť fragmentov ako aj typ fluorescencie (docircležiteacute ak suacute genetickeacute varianty rozliacutešiteľneacute rocircznou fluorescenciou napr SNaPshot) Fragmentačnaacute analyacuteza je suacutečasťou množstva molekulaacuterno-genetickyacutech metoacuted (pozri obr 12 26 28 29 34) ako suacute napr STR analyacuteza (Short Tandem Repeat) AFLP analyacuteza (Amplified Fragment Lenght Polymorfism) RFLPT-RFLP analyacuteza (Restriction Fragment Lenght PolymorfismTerminal Restricted Fragment Lenght Polymorfism) SSCP (Single Strand Conformation Polymorfism) VNTR (Variable Number of Tandem Repeat) analyacuteza straty heterozygotnosti (LOH loss of heterozygozity) MLPA (Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification) MSMSA (Methylation-Sensitive Mobility Shift Assay) SNP genotypovanie (SNaPshotreg) HiCEP (High-Coverage Expression Profiling)

38

Obr 34 Kvantitatiacutevna fragmentačnaacute PCR analyacuteza (QF-PCR) DNA izolovanej z plodovej vody vyacutesledok prenataacutelnej analyacutezy = priacutetomnosť troch piacutekov pre chromozoacutem 18 (u všetkyacutech fragmentov detegujuacutecich chromozoacutem 18 je pomer vyšetrovanyacutech markerov aberantnyacute 21 resp 111) čo znamenaacute trizoacutemiu chromozoacutemu 18 Edwardsov syndroacutem

39

8 Metoacutedy založeneacute na princiacutepe hybridizaacutecie

Nukleoveacute kyseliny majuacute schopnosť vytvaacuterať dvojvlaacuteknoveacute reťazce z jednovlaacuteknovyacutech molekuacutel na zaacuteklade komplementarity baacutez Komplementarita baacutez umožňuje replikaacuteciu DNA transkripciu RNA komplementarita baacutez zabezpečuje teda reprodukovateľnosť živej hmoty

Hybridizaacutecia je proces v ktorom na zaacuteklade komplementarity baacutez dochaacutedza k vytvoreniu dvojvlaacuteknovej nukleovej kyseliny z dvoch jednovlaacuteknovyacutech molekuacutel DNA alebo RNA alebo ich kombinaacuteciou DNA RNA pričom kratšia jednovlaacuteknovaacute nukleovaacute kyselina vystupuje ako sonda (proacuteba) Hybridizaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten je jeden z najpoužiacutevanejšiacutech naacutestrojov v molekulaacuternej bioloacutegii a genetike (hybridizaacutecia primerov alebo proacuteb sa využiacuteva v takmer každej metoacutede - v PCR RT-PCR qPCR RT-qPCR MLPA sekvenovaniacute fragmentačnej analyacuteze FISH DNA mikročipoch atď)

Denaturaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten je proces pri ktorom dochaacutedza k porušeniu vodiacutekovyacutech vaumlzieb medzi vlaacuteknami nukleovyacutech kyseliacuten (strata sekundaacuternej a terciaacutelnej štruktuacutery) tak že docircjde k ich uacuteplneacutemu oddeleniu vzniknuacute jednovlaacuteknoveacute reťazce Denaturaacutecia NK mocircže byť spocircsobenaacute vplyvom vysokyacutech teplocirct pH alebo chemickyacutech laacutetok (denaturačneacute činidlaacute) Renaturaacutecia je opačnyacute proces v ktorom na zaacuteklade komplementarity dochaacutedza k tvorbe dvojvlaacuteknovyacutech NK

Hybridiza čnaacute sonda (proacuteba) je jednovlaacuteknovaacute nukleovaacute kyselina určitej znaacutemej dĺžky a sekvencie (najčastejšie DNA pretože je stabilnejšia ako RNA) ktoraacute je značenaacute a sluacuteži na detekciu komplementaacuternych molekuacutel DNA alebo RNA v procese hybridizaacutecie V zaacutevislosti od podmienok hybridizaacutecie (stringencia) mocircže byť detegovanaacute sekvencia uacuteplne komplementaacuterna alebo v menej priacutesnych podmienkach mocircže mať sekvenčneacute odchyacutelky Proacuteba sluacuteži na vyhľadanie a zviditeľnenie cieľovyacutech NK Zviditeľnenie sa deje prostredniacutectvom označenia proacuteby ešte pred hybridizaacuteciou Značenie proacuteby mocircže byť raacutedioaktiacutevne a neraacutedioaktiacutevne (najčastejšie fluorescenčneacute)

Raacutedioaktiacutevne značeneacute proacuteby pomocou izotopov (32P) sa využiacutevali viac v minulosti v suacutečasnosti suacute kvocircli zdravotnyacutem rizikaacutem ohľaduplnosti k životneacutemu prostrediu ako aj kvocircli jednoduchšej manipulaacutecii použiacutevaneacute fluorescenčne značeneacute proacuteby Raacutedioaktiacutevne značeneacute sondy boli použiacutevaneacute hlavne metoacutedou Southernovej hybridizaacutecie (Southern blotting Southern blot) Citlivosť raacutedioaktiacutevne značenyacutech proacuteb je vyššia dosahuje schopnosť zachytiť 10 fg (femtogram 10-15) cieľovej DNA sekvencie 81 Southern blot

Metoacutedu objavil v roku 1975 britskyacute bioloacuteg Edwin Southern (preto Southern) Pri Southernovej hybridizaacutecii sa restrikčne štiepeneacute fragmenty DNA elektroforeticky separujuacute v geacuteli potom sa metoacutedou blottingu prenesuacute na nylonovuacute alebo nitroceluloacutezovuacute membraacutenu kde suacute naacutesledne hybridizovaneacute v roztoku obsahujuacutecom raacutedioaktiacutevne značenuacute sondu Priloženiacutem fotografickeacuteho filmu k membraacutene a vyvolaniacutem filmu autoraacutediografiou docircjde k zviditeľneniu lokaliacutet kde došlo k hybridizaacuteciiacute raacutedioaktiacutevne značenej sondy s fragmentom DNA (autoraacutediogram) Southern blot bol kľuacutečovou a prvou metoacutedou na identifikaacuteciu osocircb (DNA fingerprinting DNA pofiling) (obr 35)

Okrem Southern blotu existuje Northern blot na analyacutezu RNA (geacutenovej expresie) a Western blot na analyacutezu proteiacutenov postup je obdobnyacute ako pri Southern blote s obmenami špecifickyacutemi pre konkreacutetny blot Pri Northern blote sa použiacutevajuacute hybridizačneacute proacuteby ale pre vizualizaacuteciu proteiacutenov western blotom je potrebneacute použiť protilaacutetky s naacuteslednou vizualizaacuteciou Pomenovanie techniacutek je hra so sloviacutečkami (keďže paacuten Northern ani Western neobjavili takto nazvaneacute techniky)

Neraacutedioaktiacutevne značenie proacuteb použiacutevanyacutech v molekulaacuternej genetike mocircže byť nepriame (použitie haptenu) alebo priame Konečnaacute vizualizaacutecia je najčastejšie zabezpečenaacute fluoreskujuacutecimi farebnyacutemi značkami farbivami fluorochroacutemami (fluorofoacuterami) Pri priamom značeniacute je farbička kovalentne naviazanaacute na nukleotid a na zachytenie fluorescencie suacute potrebneacute špeciaacutelne priacutestroje umožňujuacutece excitaacuteciu farbičky ktoraacute potom emituje žiarenie určitej vlnovej dĺžky (emisneacute žiarenie) a to zachytiacute detekčnyacute systeacutem priacutestroja Využitie fluorochroacutemov v molekulaacuternej genetike je masiacutevne napr na vizualizaacuteciu NK elektroforeticky separovanyacutech v geacuteli kvantifikaacuteciu produktov PCR reakcie v priacutestroji real-time PCR cykleacuter sekvenovaniacute fragmentačnej analyacuteze FISH DNA mikročipoch atď

40

Obr 35 Princiacutep Southern blotu

82 FISH (fluorescenčnaacute in situ hybridizaacutecia)

FISH (fluorescent in situ hybridization fluorescenčnaacute in situ hybridizaacutecia) metoacuteda patriacute medzi molekulovo-cytogenetickeacute techniky Princiacutep FISH metoacutedy je založenyacute na hybridizaacuteciiacute fluorescenčne značenyacutech proacuteb ku komplementaacuternym uacutesekom vyšetrovanej DNA na podložnom skle (priamo na mieste - in situ) K denaturaacutecii dsDNA dochaacutedza buď vplyvom denaturačnyacutech činidiel alebo zvyacutešenou teplotou a naacuteslednou renaturaacuteciou dochaacutedza k naviazaniu sondy na komplementaacuterny uacutesek DNA Vyacutesledok hybridizaacutecie sa vizualizuje fluorescenčnyacutem mikroskopom vybavenyacutem vhodnyacutemi fluorescenčnyacutemi filtrami a vizuaacutelne zhodnotiacute skuacutesenyacutem odborniacutekom Fluorescencia sa v niektoryacutech priacutepadoch mocircže zaznamenať a hodnotiť aj pomocou softveacuteru (obr 36)

Pomocou FISH detegujeme numerickeacute aberaacutecie - zmeny v počte chromozoacutemov (napr trizoacutemia monozoacutemia chromozoacutemov) alebo štruktuacuterne aberaacutecie a prestavby (napr translokaacutecie inverzie deleacutecie duplikaacutecie amplifikaacutecie) FISH metoacuteda umožňuje identifikaacuteciu a detekciu každeacuteho ľudskeacuteho chromozoacutemu jeho zaradenie do karyotypu odhalenie malyacutech submikroskopickyacutech chromozoacutemovyacutech zmien a tiež mapovať poziacutecie jednotlivyacutech geacutenov na chromozoacuteme

41

Obr 36 Princiacutep štandardnej FISH a FISH maľovania celeacuteho chromozoacutemu

Veľkou vyacutehodou FISH metoacutedy je možnosť analyacutezy buniek v metafaacuteze aj v interfaacuteze kedy nie je nutnaacute kultivaacutecia buniek a tiež ryacutechle analyzovanie veľkeacuteho počtu buniek (stovky až tisiacutece) K ďalšiacutem vyacutehodaacutem patriacute bezpečnosť vysokaacute citlivosť dostatočnaacute stabilita relatiacutevne kraacutetky čas hybridizaacutecie a možnosť ryacutechleho vyhodnotenia Hybridizaacutecia pri vaumlčšine suacutečasne dodaacutevanyacutech sond trvaacute 10-12 hodin (na trhu suacute už dostupneacute aj sondy so skraacutetenyacutem časom hybridizaacutecie na 2-3 hodiny) Po hybridizaacuteciiacute nasleduje odmyacutevanie kedy pri priacuteslušnej teplote dochaacutedza k odmytiu nenaviazanyacutech a nespraacutevne hybridizovanyacutech sond Preparaacutet sa naacutesledne podfarbiacute a vyacutesledok sa zhodnotiacute vo fluorescenčnom mikroskope Na podfarbenie chromozoacutemov alebo jadier sa použiacuteva modreacute kontrastneacute farbivo DAPI (46-diamidino-2-fenylindol) ktoreacute maacute silneacute fluorescenčneacute vlastnosti dokaacuteže prechaacutedzať jadrovou membraacutenou a viazať sa na DNA Vyacutesledkom je modreacute zafarbenie ktoreacute vyacuteborne kontrastuje so signaacutelmi jednotlivyacutech sond

Limitujuacutecim faktorom FISH je možnosť identifikaacutecie len tyacutech uacutesekov DNA ku ktoryacutem suacute použiteacute sondy V jednej analyacuteze je možneacute použiť najviac 3 odlišne značeneacute sondy a tak zistiť priacutepadneacute abnormality len na 1 alebo na paacuter lokusoch Na relevantnuacute detekciu je potrebneacute mať vo vzorke 1-5 aberantnyacutech interfaacutezovyacutech jadier

FISH je možneacute uskutočniť na širokej škaacutele biologickeacuteho materiaacutelu na vzorkaacutech perifeacuternej krvi kostnej drene naacuteteroch choriovyacutech klkoch plodovej vode rocircznych druhov tkaniacutev natiacutevnych alebo zaliatych v parafiacutene na 1 bunke (predimplantačnaacute genetickaacute diagnostika PGD) (obr 37)

Využiacuteva sa na detekciu aberaacuteciiacute pri mnohyacutech onkologickyacutech ochoreniach (napr pri diagnoacuteze mnohopočetnyacute myeloacutem sa v suacutečasnosti po separaacutecii CD138+ buniek robiacute FISH s 5 sondami pre geacuteny IGH TP53 RB1 oblasť 1p321q21 a stanovuje sa hyperploidia chromozoacutemov 5 9 a 15) a tiež k spresneniu doplneniu a k overeniu bežneacuteho cytogenetickeacuteho vyšetrenia

Podľa miesta na chromozoacuteme na ktorom dochaacutedza k hybridizaacutecii sondy rozlišujeme 4 typy

DNA sond bull centromeacuteroveacute sondy ndash sa viažu na strednuacute časť chromozoacutemu ndash centromeacuteru sluacutežia k diagnostike zmien v počte chromozoacutemov k detekcii chromozoacutemov neznaacutemeho pocircvodu umožňujuacute interfaacuteznu FISH na nedeliacich sa bunkaacutech (obr 38-41)

42

Obr 37 Interfaacutezna FISH preimplantačnyacute genetickyacute skriacutening aneuploidiiacute ndash blastomeacutera 3-denneacuteho ľudskeacuteho embrya s normaacutelnym počtom chromozoacutemov 13 18 21 pohlavie XY použityacutech 5 sond pre chromozoacutemy 13 ndash orange 18 ndash aqua 21 ndash green X ndash blue a Y ndash yellow (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

Obr 38 Interfaacutezne jadro po hybridizaacutecii s centromeacuterovou sondou pre chromozoacutem 8 (Vysis Abbott) V pravom jadre je priacutetomnaacute trizoacutemia chromozoacutemu 8 (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex) Obr 39 Metafaacutezna (A) a interfaacutezna FISH (B) použitaacute centromeacuterovaacute sonda CEPX spectrum orangeCEPY spectrum green (Vysis Abbott) Sonda hybridizuje k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (červenyacute signaacutel) a Y (zelenyacute signaacutel) (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

43

Obr 40 Interfaacutezna FISH vyšetrenie spermiiacute použiteacute sondy CEPX greenCEPY orange (Aneuscore Metasystems) Sondy hybridizujuacute k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (zelenyacute signaacutel) Y (červenyacute signaacutel) vľavo ndash dve haploidneacute spermie (majuacutece jedna spermia X druhaacute Y chromozoacutem) vpravo ndash dve patologickeacute spermie obsahujuacutece gonozoacutemovyacute komplement XY (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

Obr 41 Interfaacutezna FISH vyšetrenie spermiiacute použiteacute sondy CEPX greenCEPY orange a CEP18 aqua (Aneuscore Metasystems) Sondy hybridizujuacute k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (zelenyacute signaacutel) Y (červenyacute signaacutel) a 18 (modryacute signaacutel) vľavo ndash normaacutelne haploidneacute ľudskeacute spermie - 1x chromozoacutem X alebo Y a jedenkraacutet chromozoacutem 18 v strede ndash patologickaacute spermia obsahujuacuteca gonozoacutemovyacute komplement XY a jeden chromozoacutem 18 vpravo ndash patologickaacute diploidnaacute spermia s chromozoacutemami X Y a dvoma chromozoacutemami 18 (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

bull lokusovo špecifickeacute sondy ndash hybridizaacutecia prebehne na konkreacutetnom mieste geacutenu (lokuse) (obr 42-44) použiacutevajuacute sa k vyšetreniu mikrodeleacuteciiacute (straty malyacutech častiacute chromozoacutemu pri mikrodelečnyacutech syndroacutemoch) k zisteniu amplifikaacutecie onkogeacutenov a niektoryacutech špecifickyacutech translokaacuteciiacute prestavby geacutenov umožňujuacute interfaacuteznu FISH na nedeliacich sa bunkaacutech bull subtelomeroveacute ndash vaumlzba na koncoveacute časti chromozoacutemu ndash telomeacutery bull celochromozoacutemoveacute alebo celomaľovacie sondy ndash sondy hybridizujuacute s mnohopočetnyacutemi chromozoacutemovyacutemi sekvenciami pričom sa fluorescenčne tak bdquovymaľujeldquo celyacute chromozoacutem (Obr 45) Použiacutevajuacute sa na vyšetrenie chromozoacutemovyacutech prestavieb k analyacuteze translokaacuteciiacute a k detekcii pocircvodu tzv marker chromozoacutemov (malyacutech nadpočetnyacutech chromozoacutemov neznaacutemeho pocircvodu) K použitiu sondy suacute potrebneacute metafaacutezne chromozoacutemy nepoužiacutevaju sa pre interfaacuteznu FISH

Pri konvenčnej chromozoacutemovej FISH suacute homogeacutenne DNA proacuteby hybridizovaneacute s fixovanyacutem metafaacuteznym alebo prometafaacuteznym chromozoacutemomchromozoacutemami na skliacutečku (Obr 36a) Maximaacutelna rozlišovacia schopnosť metafaacuteznej FISH je niekoľko megabaacutez (Obr 39a 45) využitiacutem viac

44

natiahnutyacutech prometafaacuteznych chromozoacutemov sa dosiahne 1 Mb rozliacutešenie Prostredniacutectvom fiber FISH konkreacutetne artificiaacutelne deproteinizovanej natiahnutej DNA pripravenej in situ z celyacutech buniek na mikroskopickom skliacutečku je možneacute vizualizovať individuaacutelne geacuteny maleacute DNA elementy na chromozoacuteme s rozliacutešeniacutem okolo 1000 bp

Obr 42 Interfaacutezne jadro po hybridizaacutecii s lokusovo-špecifickou sondou LSI 5q31 Spectrum Orange5p12 Spectrum Green (Vysis Abbott) Na ľavom obraacutezku suacute priacutetomneacute dva červeneacute (5q31) a dva zeleneacute signaacutely (5p12) v pravom jadre je priacutetomnaacute deleacutecia 5q31 oblasti chyacuteba jeden červenyacute signal (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

Obr 43 Interfaacutezna FISH použitaacute lokusovo-špecifickaacute sonda ndash translokačnaacute - XL BCRABL1 plus (Metasystems) dvojfarebnaacute dvojfuacutezna kde červenaacute označuje lokus ABL1 na chromozoacuteme 9 a zelenaacute oblasť BCR na chromozoacuteme 22 Sonda deteguje fuacuteziu protoonkogeacutenu ABL1 (9q34) a geacutenu BCR (22q11) v priacutepade že červenyacute a zelenyacute signaacutel suacute pri sebe (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

45

Obr 44 Interfaacutezna FISH Použitaacute lokusovo-špecifickaacute sonda- typ break apart pre IGH geacuten V docircsledku translokaacutecie došlo k rozskočeniu geacutenu pričom translokačneacuteho partnera nepoznaacuteme vieme určiť len percento v koľkyacutech jadraacutech je geacuten prestavanyacute (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex) Obr 45 Použiteacute celochromozoacutemoveacute sondy WCP 15 (červenyacute chromozoacutem) a WCP 17 (zelenyacute chromozoacutem) Na metafaacuteze je potvrdenaacute reciprokaacute translokaacutecia t(1517)(q2221) (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

FISH vizualizaacutecia celeacuteho chromozoacutemu maľovanie chromozoacutemu anglicky chromosome

painting je špeciaacutelnou aplikaacuteciou chromozoacutemovej FISH proacuteba je koktail veľkeacuteho počtu rocircznych fluorescenčne značenyacutech DNA fragmentov hybridizujuacutecich pozdĺž celeacuteho konkreacutetneho chromozoacutemu (obr 36b 45) bdquoChromosomepaintingldquo analyzuje metafaacutezne chromozoacutemy V minulosti bola FISH vizualizaacutecia celyacutech chromozoacutemov limitovanaacute malyacutem množstvom rocirczne sfarbenyacutech fluorochroacutemov

V suacutečasnosti je možneacute detegovať množstvo cieľovyacutech sekvenciiacute naraz čo sa využiacuteva pri celogenoacutemovej chromozoacutemovej vizualizaacutecii (whole-chromosomepainting - WCP) metoacutedou multiplex FISH (M-FISH multicolor FISH o br 46) alebo spektraacutelnej karyotypizaacutecie (SKY) kedy možno rozliacutešiť všetky ľudskeacute chromozoacutemy ndash teda 24 rocircznych chromozoacutemov M-FISH a SKY patria medzi metafaacutezne formy FISH diagnostiky ktoreacute umožňujuacute simultaacutennu vizualizaacuteciu všetkyacutech ľudskyacutech chromozoacutemov v rocircznych farbaacutech čo predstavuje uľahčenie analyacutezy karyotypu hlavne pri komplexnyacutech zmenaacutech a markeroch neznaacutemeho pocircvodu Obe techniky vychaacutedzajuacute z použitia

46

celochromozoacutemovyacutech sond značenyacutech kombinaacuteciou viaceryacutech fluorochroacutemov Rozdiel medzi M-FISH a SKY spočiacuteva v technike ziacuteskania konečneacuteho obrazu

Obr 46 Multicolor FISH - každyacute chromozoacutemovyacute paacuter je zafarbenyacute inou farbou pričom na ich zafarbenie postačuje kombinaacutecia 5 fluorochroacutemov Na vyhodnocovanie je potrebnaacute špeciaacutelna sada fluorescenčnyacutech filtrov pre jednotliveacute fluorochroacutemy a špeciaacutelnyacute softweacuter Vľavo-štandardnyacute karyotyp vpravo karyotyp s mutaacuteciami (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

V molekulovej cytogenetike suacute komerčne dostupneacute sety M-FISH proacuteb umožňujuacutece

viacfarebneacute pruacutežkovanie chromozoacutemov (banding) s vysokyacutem rozliacutešeniacutem (multicolor-banding mBAND FISH MCB) čo umožňuje identifikaacuteciu intrachromozoacutemovyacutech prestavieb (Obr 47) Nevyhnutnosťou mBAND-u je mať chromozoacutemy v metafaacuteze Taacuteto metoacuteda bola prvyacutekraacutet uskutočnenaacute na chromozoacuteme 5 v roku 1999 mBAND FISH umožňuje rozliacutešiť špecifickeacute oblasti chromozoacutemov na uacuterovni pruacutežku - bandu a sub-bandu s detekciou 550 bandov haploidneacuteho karyotypu

Obr 47 A - mBAND chromozoacutemu 11 - inverzia duplikovanej oblasti 11q223-q25 B - mBAND chromozoacutemu 3 - na kruhovom chromozoacuteme deleacutecia oblasti 3p263 C - mBAND chromozoacutemu 2 - potvrdenie inverzie duplikovanej časti chromozoacutemu (poskytnuteacute RNDr Dagmar Landlovou Medirex)

FISH metoacuteda a jej varianty (M-FISH mBAND SKY) majuacute v suacutečasnosti širokeacute využitie v

klinickej genetike v onkologickej genetike na detekciu aberaacuteciiacute v čase diagnoacutezy počas liečby po

47

liečbe monitorovanie po transplantaacutecii kostnej drene v prenataacutelnej a postnataacutelnej diagnostike pri detekcii submikroskopickyacutech deleacuteciiacute (napr DiGeorge syndroacutem - 22q112 delečnyacute syndroacutem PraderndashWilli syndroacutem- chromozoacutem 15q11-13) prostredniacutectvom FISH je možnaacute detekcia numerickyacutech zmien chromozoacutemov (trizoacutemia chromozoacutemu 21 pri Downovom syndroacuteme trizoacutemia chromozoacutemu 15 pri Patauovom syndroacuteme trizoacutemia chromozoacutemu 18 pri Edwardsovom syndroacuteme) rocirczne zmeny v počte pohlavnyacutech chromozoacutemov (monozoacutemia X pri Turnerovom syndroacuteme Klinefelterov syndroacutem s X chromozoacutemom naviac - XXY) podobne v predimplantačnej diagnostike

83 DNA Microarray (DNA mikro čip biočip) DNA mikročipovanie je technika využiacutevajuacuteca hybridizaacuteciu skuacutemanej nukleovej kyseliny

(cieľovaacute vzorka) s veľkyacutem množstvom oligonukleotidovyacutech proacuteb (desať tisiacutec až milioacuten) ktoreacute suacute prichyteneacute na pevnyacute podklad najčastejšie sklenyacute silikoacutenovyacute alebo nylonovyacute (doštička čip) Skuacutemanaacute nukleovaacute kyselina je pred hybridizaacuteciou fragmentovanaacute označenaacute fluorofoacuterom a denaturovanaacute Po kontakte čipu s cieľovou vzorkou ktoraacute je vlastne zmes označenyacutech oligonukleotidov značeneacute oligonukleotidy hybridizujuacute s oligonukleotidovyacutemi sekvenciami prichytenyacutemi na čipe Potom suacute na zaacuteklade fluorescencie detekovaneacute miesta kde došlo k hybridizaacutecii čiže vzorka obsahovala takuacuteto nukleotidovuacute sekvenciu Z jedneacuteho mikročipu sa ziacuteska obrovskeacute množstvo daacutet ktoreacute je vždy nutneacute softveacuterovo spracovať V dnešnej dobe existuje niekoľko firiem poskytujuacutecich komerčne mikročipy na objednaacutevku alebo si ich laboratoacuteria produkujuacute sami

Mikročipovanie prebieha nasledovne

1) Vytvorenie DNA čipu ndash tisiacutece rocircznych jednovlaacuteknovyacutech DNA oligonukleotidov znaacutemych sekvencii sa kovalentne naviažu na povrch doštičky vždy v určitej lokalite je niekoľko rovnakyacutech oligonukleotidov veľkosť takejto lokality je ˂ 200 microm Proacutebami mocircže byť DNA cDNA alebo syntetizovaneacute oligonukleotidy Už hotoveacute mikročipy ponuacutekajuacute viacereacute firmy (Affymetrix Agilent Technologies Eppendorf Illumina) alebo si ich jednotliveacute laboratoacuteria vyraacutebajuacute sami pomocou robotickyacutech zariadeniacute DNA čip sa vytvaacutera buď nanaacutešaniacutem kvapiek oligonukleotidov na podklad alebo synteacutezou oligonukleotidov in situ na čipe 2) Priacuteprava vzorky ndash nukleovaacute kyselina (mRNA DNA) sa purifikuje určiacute sa jej kvantita a kvalita (spektrofotometericky) fragmentuje resp v priacutepade mRNA sa syntetizuje cDNA v priacutepade potreby sa mocircže DNA amplifikovať PCR reakciou štiepiť restrikčnyacutemi endonukleaacutezami 3) Fluorescenčneacute označenie (zriedkavejšie raacutedioaktiacutevne) fragmentov DNA prebieha počas reverznej transkripcie alebo PCR amplifikaacutecie za uacutečasti fluorescenčne značenyacutech nukleotidov Keď sa analyzujuacute dve rocirczne vzorky napr zdraveacute tkanivo a naacutedoroveacute tkanivo označenie nukleovyacutech kyseliacuten v tyacutechto tkanivaacutech byacuteva rozdielne a to použitiacutem dvoch rocircznych fluorescenčnyacutech farbiacutev (napr zeleneacute a červeneacute) Pred hybridizaacuteciou je potrebneacute vzorku denaturovať čiacutem sa vytvoriacute zmes jednovlaacuteknovyacutech DNA označenyacutech značkou 4) Hybridizaacutecia s mikročipom ndash v špeciaacutelnom hybridizačnom roztoku hybridizujuacute komplementaacuterne sekvencie zo vzorky s priacuteslušnyacutemi oligonukleotidovyacutemi sondami naviazanyacutemi na čipe Potom sa čip obmyje aby došlo k odstraacuteneniu čiastočne hybridizovanyacutech nukleovyacutech kyseliacuten 5) Skenovanie mikročipu ndash skenerom čipov docircjde k ožiareniu čipu laserom pričom v mieste hybridizaacutecie fluorescenčne značenyacutech DNA fragmentov s proacutebou docircjde k emisii svetla určitej vlnovej dĺžky ktoruacute skener zaznamenaacute 6) Analyacuteza daacutet prebieha metoacutedami bioinformatiky spracovaniacutem softveacutermi sa zistiacute ktoreacute lokality čipu navzaacutejom hybridizovali v priacutepade použitia dvoch vzoriek kontrolnej a skuacutemanej je možneacute analyzovať ich relatiacutevnu intenzitu hybridizaacutecie (expresie určiteacuteho geacutenu)

Existujuacute štyri typy mikročipov 1) Čipy ur čeneacute na analyacutezu expresie (obsahujuacute cDNA proacuteby) pre tzv dvojkanaacutelovyacute experiment kedy je vzorka určenaacute k hybridizaacutecii na čipe ziacuteskanaacute zmiešaniacutem DNA fragmentov kontrolnej a skuacutemanej vzorky pričom fragmenty suacute rozdielne fluorescenčne označeneacute (napr zelenyacute fluorofoacuter pre kontrolnuacute vzorku a červenyacute pre skuacutemanuacute) Na zaacuteklade intenzity a typu fluorescencie sa deteguje expresia geacutenov typickaacute pre kontrolnuacute vzorku (napr zelenaacute fluorescencia) pre skuacutemanuacute vzorku (napr

48

červenaacute fluorescencia) a expresia podobnaacute u oboch vzoriek (žltaacute fluorescencia) neexprimovaneacute geacuteny (čierna fluorescencia) rocirczne odtiene (v zaacutevislosti od prevažujuacutecej hybridizaacutecie) (obr 48) 2) Čipy ur čeneacute na analyacutezu mutaacutecii použije sa genoacutemovaacute DNA označenaacute jednou fluorescenčnou farbičkou na určenie jednonukleotidovej zmeny (SNP ndash Single Nukleotide Polymorphism) 3) Čipy na komparatiacutevnu genoacutemovuacute hybridizaacuteciu (aCGH array Comparative Genomic Hybridization) ndash použiacutevaneacute na zistenie zvyacutešenia alebo zniacuteženia množstva chromozoacutemovyacutech fragmentov obsahujuacutecich geacuteny zodpovedneacute za určiteacute ochorenie Na analyacutezu sa použije skuacutemanaacute gDNA a referenčnaacute (kontrolnaacute) DNA každaacute sa značiacute inou fluorescenčnou farbičkou (princiacutep ako pri analyacuteze expresie) (obr 49 50) 4) Čipy CGH - SNP kombinovaneacute čipy ur čeneacute na analyacutezu aj mutaacuteciiacute SNP aj na komparatiacutevnu genoacutemovuacute hybridizaacuteciu CGH

Mikročipy majuacute rozsiahle využitie napriacuteklad v identifikaacuteciiacute novyacutech geacutenov vo vyacuteskume ich funkciiacute expresie v rocircznych podmienkach pri diagnostike mnohyacutech ochoreniacute vo farmakogenomike vo vyacuteskume vplyvu toxiacutenov

Obr 48 Heatmapa geacutenovej expresie vybranyacutech geacutenov (mRNA) mikročip obsahuje 46000 cDNA proacuteb (poskytnuteacute Ing Helenou Gbelcovou PhD Uacutestav lekaacuterskej bioloacutegie genetiky a klinickej genetiky LF UK a UNB)

49

Obr 49 Princiacutep komparatiacutevnej genoacutemovej hybridizaacutecie (aCGH - array comparative genomic hybridization) Obr 50 A) Vyacutesledok komparatiacutevnej genoacutemovej hybridizaacutecie (aCGH - array comparative genomic hybridization) vzorky DNA izolovanej plodovej vody U plodu s abnormaacutelnym ultrasonografickyacutem vyšetreniacutem bola identifikovanaacute duplikaacutecia oblasti 3q261q29 (modryacute paacutes) a deleacutecia oblasti 5p1533p151 (červenyacute paacutes) Pre porovnanie chromozoacutem 1 bez aberaacutecie b) Ten istyacute pacient ale ineacute softveacuteroveacute spracovanie (poskytnuteacute RNDr Miroslavom Tomkom PhD Medirex)

50

Odporuacutečanaacute a použitaacute literatuacutera

Odborneacute knihy Klug W S Cummings M R Spencer Ch A Palladino M A Concepts of Genetics jedenaacuteste vydanie (2015) Carson S Molecular Biology Techniques tretie vydanie (2012) Strachan T Read A Human Molecular Genetics štvrteacute vydanie (2011) Sudbery P Sudbery I Human Molecular Genetics tretie vydanie (2009)

Internetoveacute straacutenky

wwwncbinlmnihgov wwwmlpacom wwwthermofishercom wwwilluminacom wwwpromegask wwwqiagencom wwwambioncom

Odborneacute člaacutenky Chacon-Cortes D Griffiths L R Methods for extracting genomic DNA from whole blood samples current perspectives Journal of Biorepository Science for Applied Medicine Volume 2 strany 1- 9 Viltrop T Krjutskov K Palta P Metspalu A Comparison of DNA extraction methods for multiplex polymerase chain reaction Anal Biochem 2010 Volume 398(2) strany 260-262 Ing Martin Čermaacutek Molekulaacuterna cytogenetika v problematike familiaacuternych maligniacutet Onkoloacutegia Volume 2 strany 77 - 83 Livak KJ Schmittgen TD Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method Methods 2001 Volume 25(4) strany 402 - 408 Bustin S A Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays J Mol Endocrinol 2000 Volume 25(2) strany169 - 193

MOLEKULAacuteRNE METOacuteDY AKTUAacuteLNE POUŽIacuteVANEacute V KLINICKEJ GENETIKE RNDr Andrea Pastoraacutekovaacute PhD RNDr Robert Petrovič PhD Vydala Univerzita Komenskeacuteho v Bratislave Lekaacuterska fakulta Rozsah 50 straacuten 246 AH prveacute vydanie ISBN 978-80-223-4231-5

25

41 Vizualizaacutecia DNA

Samotnaacute nukleovaacute kyselina je počas elektroforetickej separaacutecie neviditeľnaacute Vizualizaacuteciu NK umožňujuacute interkalačneacute činidlaacute ktoreacute suacute schopneacute naviazať sa na molekuly NK tyacutem že sa včlenia medzi susediace baacutezy Po ožiareniacute UV svetlom interkalačneacute činidlaacute naviazaneacute na NK fluoreskujuacute tak sa vizualizuje NK čiacutem intenziacutevnejšie fluoreskuje tyacutem viac NK je v geacutelipruacutežku priacutetomneacute Interkalačneacute činidlo sa buď primieša do geacutelu pri jeho priacuteprave čo umožniacute sledovať migraacuteciu fragmentov NK počas elektroforeacutezy a to po vybratiacute z ELFO aparatuacutery a po ožiareniacute UV svetlom alebo sa geacutel farbiacute po elektroforetickej separaacutecii V minulosti bol na zviditeľnenie NK najčastejšie použiacutevanyacute etidiumbromid kvocircli jeho mutageacutennym vlastnostiam sa v suacutečasnosti nahraacutedza menej mutageacutennymi a netoxickyacutemi činidlami ako suacute napr komerčne dostupneacute SYBRregSafe GelRedtrade GelGreentrade

Kapilaacuterna elektroforeacuteza NK prebieha v špeciaacutelnom priacutestroji genetickom analyzaacutetore (obr 23) ktoryacute musiacute mať zaacutekladneacute komponenty ako suacute elektroacutedy kapilaacutera zdroj vysokeacuteho napaumltia detektor prepojenie s počiacutetačom a softveacuteroveacute vybavenie priestor na vloženie vzoriek atď Genetickyacute analyzaacutetor predstavuje automatizovanyacute systeacutem umožňujuacuteci sekvenovanie určovanie dĺžky DNA fragmentov ndash fragmentačnuacute analyacutezu a kvantifikaacuteciu nukleovyacutech kyseliacuten V novšiacutech typoch genetickeacuteho analyzaacutetora je proces analyacutezy od vloženia vzoriek do stojana automatizovanyacute

Vzorka určenaacute na analyacutezu je elektrokineticky injektovanaacute do tenkej kapilaacutery naplnenej lineaacuternym polymeacuterom Vplyvom vysokeacuteho napaumltia sa negatiacutevne nabiteacute fragmenty DNA pohybujuacute v polymeacuteri k pozitiacutevne nabitej elektroacutede Kapilaacuterna elektroforeacuteza je tak citlivaacute že je schopnaacute detegovať jednobaacutezovyacute rozdiel DNA fragmentov DNA fragmenty musia byť pred kapilaacuternou elektroforeacutezou fluorescenčne označeneacute v kapilaacutere suacute separovaneacute na zaacuteklade veľkosti Kraacutetko pred dosiahnutiacutem kladne nabitej elektroacutedy docircjde po excitaacutecii laserovyacutem žiareniacutem k emisii žiarenia fluoroformi (farbičkami) tak že optickyacute detekčnyacute systeacutem zaznamenaacute fluorescenciu ktoraacute je naacutesledne softveacuterovo spracovanaacute a vyhodnotenaacute

Obr 23 Genetickyacute analyzaacutetor

42 RFLP

Metoacuteda polymorfizmu dĺžky restrik čnyacutech fragmentov (angl Restriction Fragment Length Polymorfism) bola prvou metoacutedou využiacutevanou na detekciu DNA variaacuteciiacute rocircznych biologickyacutech vzoriek Princiacutep metoacutedy spočiacuteva v priacutetomnosti polymorfizmov v DNA sekvencii rocircznych ľudiacute ktoreacute zapriacutečinia rozdielny profil (obrazec) DNA fragmentov po štiepeniacute jednou alebo viaceryacutemi restrikčnyacutemi endonukleaacutezami Restrikčneacute endonukleaacutezy (RE) suacute enzyacutemy ktoreacute štiepia DNA molekulu v oblasti špecifickej nukleotidovej sekvencie nazyacutevanej restrik čneacute miesto RE najčastejšie rozpoznaacutevajuacute a štiepia miesto veľkeacute 4-6 baacutez RE suacute priacutetomneacute u prokaryotov (bakteacuterie a archebakteacuterie) kde suacute suacutečasťou restrik čno-modifikačneacuteho systeacutemu akoby prokaryotickeacutej vrodenej imunity sluacutežia

26

na ochranu pred cudzou DNA (napr viacuterusovou) ktoruacute po rozpoznaniacute špecifickej sekvencie štiepia

Restrikčno-modifikačnyacute systeacutem maacute dve zložky 1) modifikačneacute enzyacutemy - metylaacutezy ktoreacute procesom metylaacutecie modifikujuacute určiteacute baacutezy svojej DNA čiacutem ich označia za vlastnuacute DNA takže takaacuteto DNA je potom rezistentnaacute voči štiepeniu restrikčnyacutemi endonukleaacutezami Najčastejšiacutem spocircsobom metylaacutecie u bakteacuteriiacute je metylaacutecia adeniacutenu na N6 pričom vznikne metyladeniacuten alebo cytoziacutenu na C5 metylcytoziacuten 2) restrikčneacute endonukleaacutezy štiepia špecifickeacute miesto dvojvlaacuteknovej DNA ktoreacute je tvoreneacute symetrickou sekvenciou zrkadlovo sa opakujuacutecich nukleotidov ndash tzv palindroacutem Restrikčneacute enzyacutemy sa použiacutevajuacute na štiepenie DNA sekvencie na mieste špecifickom pre tuacute ktoruacute restrikčnuacute endonukleaacutezu napr pri analyacuteze polymorfizmov dĺžky restrikčnyacutech fragmentov (RFLP) analyacuteze jednonukleotidovyacutech polymorfizmov (SNP) mutaacuteciiacute ako aj pri klonovaniacute DNA do vhodnyacutech vektorovyacutech DNA molekuacutel

Po štiepeniacute dvojvlaacuteknovej DNA restrikčnou endonukleaacutezou mocircžu vzniknuacuteť tri typy koncov - 5´-prečnievajuacutece konce (lepiveacute) 3´-prečnievajuacutece konce (lepiveacute) a tupeacute konce (obr 24)

Obr 24 Restrikčneacute štiepenie zanechaacutevajuacutece rocirczne konce tupeacute a lepiveacute

Restrikčneacute štiepenie je často použiacutevanou metoacutedou geacutenovyacutech manipulaacuteciiacute na konštrukciu

hybridnyacutech molekuacutel DNA s naacuteslednyacutem klonovaniacutem Priebeh RFLP analyacutezy je nasledovnyacute restrikčnaacute endonukleaacuteza sa pridaacute k DNA a zmes sa vo

vhodnyacutech reakčnyacutech podmienkach (pufor teplota) inkubuje niekoľko hodiacuten Počas inkubaacutecie docircjde k štiepeniu DNA na špecifickyacutech miestach DNA je potom elektroforeticky separovanaacute v geacuteli a naacutesledne vizualizovanaacute V minulosti po geacutelovej elektroforeacuteze nasledoval Southern blot (čiže prenos separovanyacutech fragmentov DNA z geacutelu na špeciaacutelnu membraacutenu) (obr 35) po ktorom nastala vizualizaacutecia raacutedioaktiacutevne značenou proacutebou V suacutečasnosti sa kvocircli praacutecnosti a zdravotnyacutem rizikaacutem od Southern blotu upuacutešťa a prechaacutedza sa na ryacutechlejšie menej praacutecne a zdravotne šetrnejšie metoacutedy priateľskejšie aj k životneacutemu prostrediu

RFLP bola prvou metoacutedou použiacutevanou na zistenie DNA profilu (DNA fingerprinting) mapovanie geacutenov zapriacutečiňujuacutece genetickeacute ochorenia a testovanie otcovstva Vaumlčšina RFLP markerov je vysoko lokusovo špecifickyacutech a kodominantnyacutech (obidve alely suacute detekovaneacute u heterozygota)

PCR-RFLP je laboratoacuterne priacutestupnejšia metoacuteda molekulaacuterno-genetickej diagnostiky keďže PCR umožňuje amplifikaacuteciu veľmi malyacutech množstiev DNA Alternatiacutevny naacutezov použiacutevanyacute v literatuacutere je CAPS z angl Cleaved Amplified Polymorphic Sequence assay Použitiacutem špecifickyacutech primerov docircjde PCR metoacutedou k amplifikaacutecii požadovaneacuteho uacuteseku DNA ten sa potom štiepi restrikčnou endonukleaacutezou vo vhodnyacutech podmienkach naacutesledne sa štiepne produkty elektroforeticky separujuacute a vizualizujuacute použitiacutem interkalačnyacutech farbiacutev a UV svetla (obr 25)

27

Obr 25 Princiacutep metoacutedy PCR-RFLP

43 VNTR a STR V geacutenome suacute priacutetomneacute dva typy tandemovyacutech (za sebou nasledujuacutecich) opakovaniacute

1) minisatelity ndash nazyacutevaneacute variabilnyacute počet tandemovyacutech opakovaniacute VNTR (variable number of tandem repeats) 2) mikrosatelity tiež kraacutetke tandemoveacute repetiacutecie STR (short tandem repeats)

Obidva tieto typy satelitnej DNA suacute rozmiestneneacute po celom genoacuteme suacute využiacutevaneacute hlavne vo forenznej genetike na identifikaacuteciu osocircb a určenie otcovstva popriacutepade materstva ale aj v mediciacutene na detekciu chromozoacutemovyacutech aneuploidiiacute Štruktuacutera obidvoch je podobnaacute Rozdiel medzi jednotlivyacutemi alelami je spocircsobenyacute rozdielnym počtom opakovaniacute opakujuacutecej sa sekvencie (motiacutevu) čo spocircsobiacute rocircznu dĺžku alel s rocircznym počtom tandemovyacutech opakovaniacute nazyacutevanuacute polymorfizmus dĺžky fragmentov

VNTR ndash variabilnyacute počet tandemovyacutech opakovaniacute pričom opakujuacuteca sa sekvencia maacute dĺžku od 6 do 100 baacutez pričom sa mocircže opakovať aj tisiacutece kraacutet alely tak mocircžu mať od 500do 30 000 baacutez VNTR boli v kombinaacutecii s RFLP (DNA fingerprinting ) prvyacutem polymorfizmom použiacutevanyacutem na zistenie DNA profilov a identifikaacuteciu osocircb v kriminalistickej praxi V suacutečasnosti jeho využitie v kriminalistike je kvocircli potrebe relatiacutevne veľkeacuteho množstva DNA nahradeneacute využitiacutem STR

STR - kraacutetke tandemoveacute repetiacutecie suacute v kriminalistike najčastejšie použiacutevanyacutem polymorfizmom STR lokusy suacute rozmiestneneacute po celom genoacuteme repetiacutecia obsahuje jednu až šesť baacutez pričom jej opakovaniacutem vznikne STR v rozsahu od 50 do 300bp V našom genoacuteme suacute tisiacutece STR ktoreacute mocircžu byť použiteacute pre forenznuacute analyacutezu V kriminalistike sa v suacutečasnosti na identifikaacuteciu osocircb použiacuteva 13 STR locusov ktoreacute patria k medzinaacuterodne uznaacutevanyacutem štandardom Z iniciatiacutevy FBI bola vytvorenaacute databaacuteza CODIS (Combined DNA Index System) každaacute krajina maacute svoju databaacutezu CODIS kde je možneacute vložiť a archivovať DNA profily jednotlivcov ako aj profily DNA ziacuteskanyacutech z miest kriminaacutelneho činu v databaacuteze je ich možneacute navzaacutejom porovnať a tak zistiť pocircvodcu trestneacuteho činu Medzinaacuterodnaacute jednotnosť v použiacutevaniacute CODIS STR lokusov umožňuje v priacutepade potreby vzaacutejomneacute porovnanie DNA profilov zistenyacutech na uacutezemiacute rocircznych štaacutetov CODIS STR lokusov je 13 a suacute to CSF1PO FGA TH01 TPOX VWA D3S1358 D5S818 D7S820 D8S1179 D13S317 D16S539 D18S51 a D21S11 Zistenie DNA profilu sa uskutočniacute multiplexnou PCR reakciou s fluorescenčne značenyacutemi primermi špecifickyacutemi pre konkreacutetny STR Naacutesledne suacute PCR produkty analyzovaneacute kapilaacuternou elektroforeacutezou genetickyacutem analyzaacutetorom ktoryacute rozliacuteši amplifikovaneacute fragmenty na zaacuteklade fluorescencie a dĺžky (fragmentačnaacute analyacuteza) (obr 26 Tab 3) DNA profil každeacuteho človeka je jedinečnyacute rovnakyacute profil mocircžu mať len jednovaječneacute dvojčataacute

28

Obr 26 Ukaacutežka DNA profilu človeka 15 STR lokusov s určeniacutem pohlavia pomocou lokusu pre amelogeniacuten (ženskeacute pohlavie - XX) maleacute oranžoveacute piacuteky predstavujuacute fragmenty veľkostneacuteho štandardu Tabuľka č 3 Zaacutepis DNA profilu človeka z obraacutezka č 26 15 STR lokusov s určeniacutem pohlavia pomocou lokusu pre amelogeniacuten System Alela 1 Alela 2

D3S1358 16 17

TH01 9 93 D21S11 28 28

D18S51 15 18

Penta E 7 14 D5S818 9 12

D13S317 8 11

D7S820 8 11 D16S539 11 12

CSF1PO 10 11

Penta D 11 12 vWA 15 18

D8S1179 13 16

TPOX 8 9 FGA 20 21

amel X X

29

5 MLPA

Multiplexnaacute amplifikaacutecia proacuteb zaacutevislaacute od ligaacutecie (z angl multiplex ligation-dependent probe amplification) je metoacuteda schopnaacute v jednej reakcii (v jednej skuacutemavke a vzorke) detegovať zmeny v počte až 50 nukleotidovyacutech sekvenciiacute Metoacutedou MLPA je možneacute ryacutechlo identifikovať amplifikaacutecie (duplikaacutecie) a deleacutecie veľkeacuteho počtu geacutenov či už použitiacutem DNA alebo mRNA krvnyacutech vzoriek alebo vzoriek z naacutedorov

Princiacutep MLPA spočiacuteva v multiplexnej amplifikaacutecii 50 špecifickyacutech nukleotidovyacutech sekvenciiacute použitiacutem jedneacuteho paacuteru primerov pričom jeden primer je fluorescenčne označenyacute Vyacutesledneacute PCR produkty suacute analyzovaneacute kapilaacuternou elektroforeacutezou (fragmentačnaacute analyacuteza) Dĺžka každeacuteho namnoženeacuteho produktu je jedinečnaacute narastaacute postupne o 6 alebo 9 nukleotidov pričom produkty PCR suacute 120 ndash 500 nukleotidov dlheacute Tento veľkostnyacute rozsah PCR fragmentov (dĺžka 120-500 nukleotidov s naacuterastom postupne o 6 alebo 9 nukleotidov) je optimaacutelny pre kapilaacuternu elektroforeacutezu MLPA multiplexnaacute PCR prebieha za použitia iba jedineacuteho paacuteru primerov ktoreacute amplifikujuacute špecifickeacute sekvencie Trik spočiacuteva v tom že nedochaacutedza k amplifikaacutecii DNA sekvencie ale MLPA proacuteb ktoreacute suacute pridaneacute k vzorkaacutem Každaacute MLPA proacuteba pozostaacuteva z dvoch oligonukleotidov (dve hemiproacuteby) pričom každyacute oligonukleotid obsahuje jednu zo sekvencie rozpoznaacutevanuacute PCR primermi Proacuteba vznikne jedine za predpokladu hybridizaacutecie dvoch oligonukleotidov (hemiproacuteb) k cieľovej sekvencii (geacutenu) a po ligaacutecii enzyacutemom ligaacutezou Iba ligovaneacute proacuteby suacute exponenciaacutelne amplifikovaneacute pomocou jedneacuteho paacuteru primerov Množstvo zligovanyacutech proacuteb teda zaacutevisiacute od množstva cieľovyacutech sekvenciiacute (geacutenov) vo vzorke

Postup MLPA analyacutezy je nasledovnyacute (obr27) K vzorke nukleovej kyseliny (DNA resp mRNA) sa pridaacute zmes 50 jedinečnyacutech proacuteb každaacute

proacuteba je komplementaacuterna k určitej cieľovej sekvencii NK vzorky Každaacute proacuteba však pozostaacuteva z dvoch oligonukleotidov hybridizujuacutecich vedľa seba zaacuteroveň každyacute oligonukleotid (hemiproacuteba) obsahuje pridanuacute sekvenciu rozpoznaacutevanuacute paacuterom PCR primerov Po hybridizaacuteciiacute oligonukleotidov (hemiproacuteb) dochaacutedza k ich ligaacutecii ligaacutezou Ligačnaacute reakcia je tak špecifickaacute že je schopnaacute rozliacutešiť sekvenciu liacutešiacu sa v jednom nukleotide Vyacuteslednyacute ligačnyacute produkt (proacuteba) obsahuje obidve sekvencie pre PCR primery na jednom fragmente čiže mocircže docircjsť k namnoženiu takeacutehoto fragmentu PCR reakciou V priacutepade ak nedocircjde k ligaacutecii priacuteslušnyacutech hemiproacuteb pretože hemiproacuteby nenaacutejdu cieľovuacute sekvenciu na DNA každaacute takaacuteto nezligovanaacute hemiproacuteba maacute len jednu sekvenciu rozpoznaacutevanuacute len jednyacutem PCR primerom v docircsledku čoho nemocircže prebehnuacuteť jej PCR amplifikaacutecia a počas fragmentačnej analyacutezy nie je detegovanaacute pretože negeneruje fluorescenčnyacute signaacutel

Pri MLPA analyacuteze je docircležiteacute okrem MLPA amplifikaacutecie vzorky urobiť aj MLPA amplifikaacuteciu referenčnej vzorky ku ktorej sa bude porovnaacutevať počet geacutenov (cieľovyacutech sekvenciiacute) Po kapilaacuternej elektroforeacuteze MLPA referenčnej a skuacutemanej vzorky porovnaniacutem obsahu nameranyacutech hodnocirct tzv piacutekov priacuteslušnyacutech proacuteb sa určiacute relatiacutevny počet koacutepiiacute v skuacutemanej vzorke

MLPA

1 DNA denaturaacutecia a hybridizaacutecia s MLPA proacutebami (hemiproacuteby)

2 Ligaacutecia (vytvorenie kompletnyacutech proacuteb)

3 PCR amplifikaacutecia proacuteb paacuterom primerov

4 Kapilaacuterna elektroforetickaacute separaacutecia PCR produktov

5 Analyacuteza daacutet

30

Obr 27 Princiacutep MLPA

Firma MRC-Holland v suacutečasnosti ponuacuteka stovky MLPA setov proacuteb ktoreacute suacute vhodneacute na 1) diagnostiku kongenitaacutelnych a dedičnyacutech ochoreniacute 2) zisťovanie profilu naacutedorov 3) zisťovanie metylačneacuteho profilu

MLPA je metoacuteda vhodnaacute na detekciu malyacutech prestavieb (BRCA1 BRCA2 MSH2 atď)

veľkyacutech chromozoacutemovyacutech prestavieb (Williamsov syndroacutem Prader-WilliAngelman syndroacutem atzď)

31

detekciu zmien v počte koacutepii geacutenov (obr 28 29) ako aj zistenie počtu kompletnyacutech chromozoacutemov (chromozoacutem 13 18 21 XY tiež aj z amniovej tekutiny) diagnostiku naacutedorov (zmeny počtu pri ALL CLL atď) kvantifikaacuteciu metylaacutecie (Prader-WilliAngelmanov syndroacutem Fragilnyacute X inaktivaacutecia naacutedorovyacutech supresorovyacutech geacutenov atď) mRNA analyacutezu geacutenov zuacutečastňujuacutecich sa apoptoacutezy alebo zaacutepalov

MS-MLPA (Methylation-Specific MLPA) je varianta MLPA určenaacute špeciaacutelne na analyacutezu aberantnyacutech metylaacutecii imprintovanyacutech oblastiacute ako aj detekciu metylačnyacutech zmien CpG ostrovčekov lokalizovanyacutech bliacutezko promoacutetora Rozdiel oproti štandardnej MLPA spočiacuteva v použitiacute metylačne senzitiacutevneho restrikčneacuteho enzyacutemu HhaI ktoryacute štiepi MS-MLPA proacuteby hybridizovaneacute k nemetylovanej sekvencii Každaacute DNA vzorka určenaacute pre MS-MLPA analyacutezu prejde dvoma reakciami v jednej mikroskuacutemavke štandardnou MLPA analyacutezou (bez štiepenia metylačne senzitiacutevnym enzyacutemom) a v druhej mikroskuacutemavke docircjde okrem ligaacutecie proacuteb aj k metylačne senzitiacutevnemu štiepeniu hybridizovanyacutech proacuteb s nemetylovanou DNA Amplifikujuacute sa len ligovaneacute proacuteby po PCR amplifikaacutecii sa fragmentačnou analyacutezou porovnaniacutem oboch reakciiacute zistia rozdiely v metylačnom profile vzorky k referenčnej vzorke

RT-MLPA (Reverse Transkriptase MLPA) je variaacutecia MLPA určenaacute pre zistenie mRNA profilu vzorky je alternatiacutevou k real-time PCR a mikročipom RT-MLPA nedeteguje mRNA množstvo priamo pretože použiacutevanaacute ligaacuteza nie je schopnaacute ligovať DNA oligonukleotidy keď suacute hybridizovaneacute s RNA Preto RT-MLPA začiacutena reverznou transkripciou so špeciaacutelne navrhnutyacutemi RT primermi tak aby vytvorili kraacutetke oligonukleotidy (cDNA) Potom reakcia pokračuje ako štandardnaacute MLPA

Obr 28 MLPA analyacuteza geacutenu DMD (koacutedujuacuteceho dystrofiacuten) mutaacutecie ktoreacuteho spocircsobujuacute Duchennovu svalovuacute dystrofiu u pacienta je priacutetomnaacute deleacutecia exoacutenu 45 v porovnaniacute s referenčnou vzorkou ndash kontrolou

32

Obr 29 MLPA analyacuteza geacutenu DMD (koacutedujuacuteceho dystrofiacuten) mutaacutecie ktoreacuteho spocircsobujuacute Duchennovu svalovuacute dystrofiu u pacienta suacute priacutetomneacute duplikaacutecie exoacutenov 41 42 43 44 45 (piacuteky vo vzorke pacienta sa porovnajuacute s piacutekmi v kontrole ndash referenčnej vzorke)

33

6 Sekvenovanie

Sekvenovaniacutem rozumieme určenie primaacuternej štruktuacutery DNA teda určenie poradia nukleotidov v reťazci DNA Začiatky moderneacuteho sekvenovania siahajuacute do roku 1977 kedy boli objaveneacute dve metoacutedy sekvenovania 1) chemickaacute metoacuteda Maxama a Gilberta 2) enzymatickaacute metoacuteda Sangera Nicklena a Coulsona

Princiacutep obidvoch metoacuted sekvenovania spočiacuteva v tom že sa vytvoriacute suacutebor DNA molekuacutel s rocircznou veľkosťou ktoreacute suacute zakončeneacute konkreacutetnym nukleotidom tieto DNA molekuly sa elektroforeticky separujuacute v geacuteloch s rozlišovacou schopnosťou 1 nukleotid 61 Chemickaacute metoacuteda

DNA molekuly sa na 5-konci raacutedioaktiacutevne označia raacutedioaktiacutevnym fosforom a naacutesledne sa chemicky modifikujuacute špecificky pre každuacute baacutezu DNA sa potom v modifikovanyacutech miestach štiepi čiacutem vzniknuacute rocirczne dlheacute fragmenty pričom podmienky suacute nastaveneacute tak aby sa DNA na každom mieste štiepila len raz Modifikaacutecia DNA a štiepenie prebehne v štyroch separaacutetnych reakciaacutech (skuacutemavkaacutech) takže po elektroforetickej separaacuteciiacute takto opracovanej DNA v štyroch draacutehach polyakrylamidoveacuteho geacutelu a naacuteslednej autoraacutediografii (podobne ako pri Southernovej hybridizaacutecii) je možneacute odčiacutetať nukleotidovuacute sekvenciu približne 100 nukleotidov od raacutedioaktiacutevneho označenia (v čase objavu Maxama a Gilberta) 62 Sangerova metoacuteda

Zaacuteklady metoacutedy boli popiacutesaneacute už v roku 1975 (metoacuteda plus a miacutenus) ale až vylepšenie použitiacutem dideoxynukleotidov (ddNTP) v roku 1977 došlo k zjednodušeniu sekvenovania Princiacutepom enzyacutemoveacuteho sekvenovania je terminaacutecia (zastavenie) polymerizaacutecie inkorporaacuteciou 2´ 3 -dideoxynukleotidov do novosyntetizujuacuteceho sa vlaacutekna DNA Keďže ddNTP neobsahujuacute hydroxylovuacute skupinu na 3 uhliacuteku riboacutezy nemocircžu sa zuacutečastniť na tvorbe fosfodiesterovej vaumlzby nemocircže sa pripojiť k nim ďalšiacute nukleotid čiže musiacute docircjsť k terminaacuteciiacute polymeraacutecie Reakcia prebieha v štyroch skuacutemavkaacutech s raacutedioaktiacutevne značenyacutem primerom V každej skuacutemavke suacute priacutetomneacute všetky štyri deoxynukleotidtrifosfaacutety (dNTP) ale pre každuacute skuacutemavku je špecifickyacute priacutedavok maleacuteho množstva jedneacuteho z dideoxynukleotidtrifosfaacutetov (v prvej skuacutemavke je ddATP v druhej ddCTP v tretej ddTTP a vo štvrtej ddGTP) Maleacute množstvo ddNTP spocircsobiacute že pri polymerizaacutecii dochaacutedza k prednostneacutemu zaradeniu štandardnyacutech dNTP do narastajuacuteceho reťazca a len občas sa inkorporuje ddNTP čiacutem sa zastaviacute synteacuteza reťazca V každej skuacutemavke tak vznikne suacutebor DNA fragmentov rocircznych veľkostiacute zakončenyacutech priacuteslušnyacutem ddNTP (v prvej skuacutemavke ddATP v druhej ddCTP v tretej ddTTP a vo štvrtej ddGTP) Po elektroforetickej separaacutecii v 4 draacutehach polyakrylamidoveacuteho geacutelu a autoraacutediografii sa z autoraacutediogramu odčiacuteta sekvencia

V suacutečasnosti je sekvenovanie do značnej miery automatizovaneacute pričom využiacuteva princiacutep Sangerovej enzyacutemovej metoacutedy s určityacutemi obmenami Uacutesek DNA ktoryacute treba sekvenovať sa prostredniacutectvom termostabilnyacutech DNA polymeraacutez namnožiacute PCR metoacutedou po ktorej nasleduje sekvenačnaacute reakcia (asymetrickaacute PCR) s fluorescenčne značenyacutemi ddNTP (každyacute druh označenyacute inyacutem fluorescenčnyacutem farbivom) Sekvenačnaacute reakcia prebieha v jednej skuacutemavke s jednyacutem primerom vznikne tak suacutebor jednovlaacuteknovyacutech DNA rocircznej dĺžky ktoreacute suacute na 3konci označeneacute ddNTP so špecifickyacutem fluorescenčnyacutem farbivom Taacuteto metoacuteda sekvenovania sa tiež nazyacuteva rdquodye-terminator cycle sequencingrdquo(obr 30) Po kapilaacuternej elektroforeacuteze vzorky v genetickom analyzaacutetore zaznamenaacutevaniacute fluorescencie jednotlivyacutech fragmentov CCD kamerou a softveacuterovom spracovaniacute sa ziacuteska sekvencia DNA (obr 31)

34

Obr 30 Princiacutep sekvenovania Sangerova dideoxy metoacuteda alebo tzv chain termination method (reťazec zastavujuacuteca metoacuteda) Obr 31 Určenie genotypu plodu a rodičov sekvenčnou analyacutezou DNA ziacuteskanej z plodovej vody (prenataacutelna diagnostika) a perifeacuternej krvi sekvenčnaacute analyacuteza geacutenu ASPA vyacutesledok u plodu priacutetomnaacute mutaacutecia c 914CgtA v homozygotnom stave (AA) rodičia heterozygoti (AC) Uvedenaacute mutaacutecia je v homozygotnom stave kauzaacutelnou priacutečinou Canavanovej choroby

Automatizovaneacute sekvenovanie prinaacuteša viacereacute vyacutehody oproti klasickej Sangerovej metoacutede vyššiu presnosť a ryacutechlosť v jednej sekvenačnej reakcii možnosť osekvenovať až 1200 nukleotidovyacute fragment maleacute množstvo templaacutetu potrebneacute na analyacutezu

35

63 Next Generation Sequencing (NGS)

NGS (sekvenovanie novej generaacutecie) maacute obrovskyacute potenciaacutel v analyacuteze genoacutemov pričom toto označenie zahŕňa viacereacute technologickeacute metoacutedy reprezentovaneacute niekoľkyacutemi firmami Princiacutepom je masiacutevne paralelneacute sekvenovanie čiacutem sa ziacuteskajuacute raacutedovo tisiacutece až milioacuteny sekvenciiacute naraz 631 Sekvenovanie druhej generaacutecie

Na začiatku sa analyzovanaacute DNA vo vaumlčšine priacutepadov fragmentuje (vznikne tak DNA

knižnica) na fragmenty sa pripoja kraacutetke sekvencie ndash adapteacutery naacutesledne sa tieto fragmenty rocircznymi priacutestupmi amplifikujuacute a určiacute sa ich sekvencia Vďaka čiastočnyacutem prekryvom je zo ziacuteskanyacutech sekvencii možneacute poskladať plynuluacute sekvenciu zodpovedajuacutecu pocircvodnej nefragmentovanej DNA

Pyrosekvenovanie je podobne ako Sangerova metoacuteda založenaacute na princiacutepe synteacutezy komplementaacuterneho vlaacutekna DNA avšak rozdiel je v tom že sa na detekciu inkorporaacutecie nukleotidu využiacuteva inyacute systeacutem tvorby luminiscenčneacuteho signaacutelu v priebehu reakcie Pyrosekvenovanie je umožneneacute vďaka aktivite 4 enzyacutemov - DNA polymeraacutezy ATP sulfurylaacutezy luciferaacutezy a apyraacutezy Reakčnaacute zmes obsahuje aj ďalšie komponenty - enzymatickeacute substraacutety adenoziacutenfosfosulfaacutet (APS) d-luciferiacuten sekvenovanyacute templaacutet a cyklicky postupne po jednom type pridaacutevaneacute nukleotidtrifosfaacutety Po zabudovaniacute nukleotidu do novovznikajuacuteceho reťazca docircjde k uvoľneniu pyrofosfaacutetu naacutesledne je využityacute ATP sulfurylaacutezou na synteacutezu ATP z APS počas ďalšej reakcie docircjde k využitiu ATP luciferaacutezou na premenu luciferiacutenu na oxyluciferiacuten čo spocircsobiacute svetelnyacute signaacutel a ten zaznamenaacute detekčnyacute systeacutem Poslednou enzymatickou reakciou je reakcia apyraacutezy ktoraacute odstraacuteni nezainkorporovaneacute nukleotidy a nevyužiteacute ATP aby sa celyacute proces mohol zopakovať s reakčnou zmesou obsahujuacutecou ďalšiacute nukleotidtrifosfaacutet (inyacute ako v predchaacutedzajuacutecej reakcii) Po každej reakcii detektor zaznamenaacuteva emisiu svetla na zaacuteklade intenzity svetla je možneacute určiť či bol vradenyacute priacuteslušnyacute nukleotidtrifosfaacutet či bol inkorporovanyacute jeden priacutepadne viac rovnakyacutech nukleotidtrifosfaacutetov

Zvyacutešenie vyacutekonu pyrosekvenovania umožnila tzv emulznaacute PCR v mikročasticiach a použitie platničky PicoTiterPlatereg toto sekvenovanie zaviedla firma Roche pod pojmom 454 pyrosekvenovanie v roku 2005 Na začiatku sa DNA fragmentuje na uacuteseky dlheacute 400-600 baacutez dvojvlaacuteknovaacute fragmentovanaacute DNA sa liguje s adapteacutermi prostredniacutectvom nich sa naviaže na mikročastice dvojvlaacuteknoveacute fragmenty sa oddelia mikročastice s naviazanyacutemi jednovlaacuteknovyacutemi fragmentami sa premiešajuacute so zmesou oleja a roztoku ktoryacute obsahuje všetky komponenty na uacutespešnuacute PCR Tyacutemto spocircsobom sa okolo každej mikročastice vytvoriacute vlastnyacute mikroreaktor v ktorom prebehne amplifikaacutecia fragmentu Po PCR reakcii sa mikročastice prenesuacute do platničky PicoTiterPlate v ktorej sa do jamky zmestiacute akuraacutet jedna mikročastica a reakčneacute komponenty pyrosekvenačnej reakcie PicoTiterPlatereg maacute 1 600 000 jamiek každaacute jamka maacute maximaacutelny objem 75 picolitra Platnička s mikročasticami sa vložiacute do sekvenačneacuteho systeacutemu ndash priacutestroja v ktorom sa celeacute pyrosekvenovanie uskutočniacute Chemiluminiscenčneacute signaacutely ktoryacutech počas sekvenovania vznikajuacute milioacuteny v priebehu hodiny suacute zachyteneacute CCD kamerou a analyzovaneacute softveacuterom

Firma Illumina predstavila inuacute technoloacutegiu PCR amplifikaacutecia a sekvenovanie sa uskutočňuje na skliacutečku (flow cell) Fragmentaacutecia DNA a pripojenie adapteacuterov prebieha za uacutečasti transpozoacutemov v procese nazvanom tagmentaacutecia Po hybridizaacutecii fragmentov DNA na skliacutečko prebehne v klastroch PCR amplifikaacutecia (tzv mostiacutekovaacute amplifikaacutecia) sekvenaacutecia prebieha za uacutečasti rozdielne fluorescenčne značenyacutech a chemicky modifikovanyacutech nukleotidov pričom každyacute nukleotid emituje fluorescenciu s inou vlnovou dĺžkou Na skliacutečku prebieha paralelne až 6 miliaacuterd sekvenaacutecii (obr 32)

Ďalšiacutemi možnosťami sekvenovania druhej generaacutecie je systeacutem SOLid (vyvinutyacute firmou Applied Biosystem dnes pod Thermo Fisher Scientific) a Ion Semiconductor Sequencing ndash polovodičoveacute ioacutenoveacute sekvenovanie (od firmy Ion Semiconductor Sequencing v suacutečasnosti Thermo Fisher Scientific)

36

Obr 32 Princiacutep sekvenovania novej generaacutecie od firmy Illumina PCR amplifikaacutecia a sekvenovanie sa uskutočňuje na skliacutečku (flow cell) paralelne prebieha až 6 miliaacuterd sekvenaacutecii

632 Sekvenovanie tretej generaacutecie

Pred sekvenovaniacutem netreba amplifikovať DNA PCR metoacutedou ale sekvencia sa ziacuteskava zachyteniacutem signaacutelu v reaacutelnom čase Medzi sekvenovanie tretej generaacutecie patriacute SMRT (Single Molecule Real-Time Sequencing) a Nanopore Sequencing

37

7 Fragmentačnaacute analyacuteza DNA

Je metoacuteda použiacutevanaacute na určenie veľkosti fragmentov DNA ziacuteskanyacutech PCR reakciou Dĺžka amplifikovanyacutech DNA fragmentov sa zistiacute ich porovnaniacutem s veľkostnyacutem štandardom (obr 33) ktoryacute je tvorenyacute DNA fragmentami znaacutemej dĺžky Veľkostnyacute štandard je pred kapilaacuternou elektroforeacutezou zmiešanyacute so vzorkou DNA fragmenty veľkostneacuteho štandardu suacute fluorescenčne označeneacute pričom použiteacute fluorescenčneacute farbivo je ineacute ako fluorescenčneacute farbivo použiteacute na označenie DNA fragmentov vo vyšetrovanej vzorke

Obr 33 Elektroforetogram veľkostneacuteho štandardu použiacutevaneacuteho na určenie veľkostiacute fragmentov analyzovanyacutech kapilaacuternou elektroforeacutezou v genetickom analyzaacutetore (GeneScantrade 500 LIZtrade dye Size Standard) dĺžka fragmentov v nukleotidoch (napr 50 nukleotidov)

Fragmentačnaacute analyacuteza pozostaacuteva z viaceryacutech krokov Prvyacutem je izolaacutecia DNA nasleduje PCR amplifikaacutecia počas ktorej sa novosyntetizovaneacute DNA fragmenty označia fluorescenčnyacutemi farbivami Vzorka s PCR produktom sa pripraviacute na kapilaacuternu elektroforeacutezu tak že sa zmieša s veľkostnyacutem štandardom (sluacuteži na určenie veľkosti fragmentov) a denaturačnou laacutetkou (formamid) nasleduje denaturaacutecia Pripraveneacute vzorky suacute injektovaneacute do priacutestroja (genetickyacute analyzaacutetor) kde v kapilaacutere naplnenej polymeacuterom v elektrickom poli migrujuacute fluorescenčne značeneacute fragmenty DNA na zaacuteklade veľkosti (kapilaacuterna elektroforeacuteza) Počas elektroforeacutezy genetickyacute analyzaacutetor zaznamenaacuteva fluorescenciu fragmentov Analyacutezou daacutet prostredniacutectvom špeciaacutelnych softveacuterov sa ziacuteskajuacute elektroforetogramy z ktoryacutech je možneacute zistiť veľkosť fragmentov ako aj typ fluorescencie (docircležiteacute ak suacute genetickeacute varianty rozliacutešiteľneacute rocircznou fluorescenciou napr SNaPshot) Fragmentačnaacute analyacuteza je suacutečasťou množstva molekulaacuterno-genetickyacutech metoacuted (pozri obr 12 26 28 29 34) ako suacute napr STR analyacuteza (Short Tandem Repeat) AFLP analyacuteza (Amplified Fragment Lenght Polymorfism) RFLPT-RFLP analyacuteza (Restriction Fragment Lenght PolymorfismTerminal Restricted Fragment Lenght Polymorfism) SSCP (Single Strand Conformation Polymorfism) VNTR (Variable Number of Tandem Repeat) analyacuteza straty heterozygotnosti (LOH loss of heterozygozity) MLPA (Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification) MSMSA (Methylation-Sensitive Mobility Shift Assay) SNP genotypovanie (SNaPshotreg) HiCEP (High-Coverage Expression Profiling)

38

Obr 34 Kvantitatiacutevna fragmentačnaacute PCR analyacuteza (QF-PCR) DNA izolovanej z plodovej vody vyacutesledok prenataacutelnej analyacutezy = priacutetomnosť troch piacutekov pre chromozoacutem 18 (u všetkyacutech fragmentov detegujuacutecich chromozoacutem 18 je pomer vyšetrovanyacutech markerov aberantnyacute 21 resp 111) čo znamenaacute trizoacutemiu chromozoacutemu 18 Edwardsov syndroacutem

39

8 Metoacutedy založeneacute na princiacutepe hybridizaacutecie

Nukleoveacute kyseliny majuacute schopnosť vytvaacuterať dvojvlaacuteknoveacute reťazce z jednovlaacuteknovyacutech molekuacutel na zaacuteklade komplementarity baacutez Komplementarita baacutez umožňuje replikaacuteciu DNA transkripciu RNA komplementarita baacutez zabezpečuje teda reprodukovateľnosť živej hmoty

Hybridizaacutecia je proces v ktorom na zaacuteklade komplementarity baacutez dochaacutedza k vytvoreniu dvojvlaacuteknovej nukleovej kyseliny z dvoch jednovlaacuteknovyacutech molekuacutel DNA alebo RNA alebo ich kombinaacuteciou DNA RNA pričom kratšia jednovlaacuteknovaacute nukleovaacute kyselina vystupuje ako sonda (proacuteba) Hybridizaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten je jeden z najpoužiacutevanejšiacutech naacutestrojov v molekulaacuternej bioloacutegii a genetike (hybridizaacutecia primerov alebo proacuteb sa využiacuteva v takmer každej metoacutede - v PCR RT-PCR qPCR RT-qPCR MLPA sekvenovaniacute fragmentačnej analyacuteze FISH DNA mikročipoch atď)

Denaturaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten je proces pri ktorom dochaacutedza k porušeniu vodiacutekovyacutech vaumlzieb medzi vlaacuteknami nukleovyacutech kyseliacuten (strata sekundaacuternej a terciaacutelnej štruktuacutery) tak že docircjde k ich uacuteplneacutemu oddeleniu vzniknuacute jednovlaacuteknoveacute reťazce Denaturaacutecia NK mocircže byť spocircsobenaacute vplyvom vysokyacutech teplocirct pH alebo chemickyacutech laacutetok (denaturačneacute činidlaacute) Renaturaacutecia je opačnyacute proces v ktorom na zaacuteklade komplementarity dochaacutedza k tvorbe dvojvlaacuteknovyacutech NK

Hybridiza čnaacute sonda (proacuteba) je jednovlaacuteknovaacute nukleovaacute kyselina určitej znaacutemej dĺžky a sekvencie (najčastejšie DNA pretože je stabilnejšia ako RNA) ktoraacute je značenaacute a sluacuteži na detekciu komplementaacuternych molekuacutel DNA alebo RNA v procese hybridizaacutecie V zaacutevislosti od podmienok hybridizaacutecie (stringencia) mocircže byť detegovanaacute sekvencia uacuteplne komplementaacuterna alebo v menej priacutesnych podmienkach mocircže mať sekvenčneacute odchyacutelky Proacuteba sluacuteži na vyhľadanie a zviditeľnenie cieľovyacutech NK Zviditeľnenie sa deje prostredniacutectvom označenia proacuteby ešte pred hybridizaacuteciou Značenie proacuteby mocircže byť raacutedioaktiacutevne a neraacutedioaktiacutevne (najčastejšie fluorescenčneacute)

Raacutedioaktiacutevne značeneacute proacuteby pomocou izotopov (32P) sa využiacutevali viac v minulosti v suacutečasnosti suacute kvocircli zdravotnyacutem rizikaacutem ohľaduplnosti k životneacutemu prostrediu ako aj kvocircli jednoduchšej manipulaacutecii použiacutevaneacute fluorescenčne značeneacute proacuteby Raacutedioaktiacutevne značeneacute sondy boli použiacutevaneacute hlavne metoacutedou Southernovej hybridizaacutecie (Southern blotting Southern blot) Citlivosť raacutedioaktiacutevne značenyacutech proacuteb je vyššia dosahuje schopnosť zachytiť 10 fg (femtogram 10-15) cieľovej DNA sekvencie 81 Southern blot

Metoacutedu objavil v roku 1975 britskyacute bioloacuteg Edwin Southern (preto Southern) Pri Southernovej hybridizaacutecii sa restrikčne štiepeneacute fragmenty DNA elektroforeticky separujuacute v geacuteli potom sa metoacutedou blottingu prenesuacute na nylonovuacute alebo nitroceluloacutezovuacute membraacutenu kde suacute naacutesledne hybridizovaneacute v roztoku obsahujuacutecom raacutedioaktiacutevne značenuacute sondu Priloženiacutem fotografickeacuteho filmu k membraacutene a vyvolaniacutem filmu autoraacutediografiou docircjde k zviditeľneniu lokaliacutet kde došlo k hybridizaacuteciiacute raacutedioaktiacutevne značenej sondy s fragmentom DNA (autoraacutediogram) Southern blot bol kľuacutečovou a prvou metoacutedou na identifikaacuteciu osocircb (DNA fingerprinting DNA pofiling) (obr 35)

Okrem Southern blotu existuje Northern blot na analyacutezu RNA (geacutenovej expresie) a Western blot na analyacutezu proteiacutenov postup je obdobnyacute ako pri Southern blote s obmenami špecifickyacutemi pre konkreacutetny blot Pri Northern blote sa použiacutevajuacute hybridizačneacute proacuteby ale pre vizualizaacuteciu proteiacutenov western blotom je potrebneacute použiť protilaacutetky s naacuteslednou vizualizaacuteciou Pomenovanie techniacutek je hra so sloviacutečkami (keďže paacuten Northern ani Western neobjavili takto nazvaneacute techniky)

Neraacutedioaktiacutevne značenie proacuteb použiacutevanyacutech v molekulaacuternej genetike mocircže byť nepriame (použitie haptenu) alebo priame Konečnaacute vizualizaacutecia je najčastejšie zabezpečenaacute fluoreskujuacutecimi farebnyacutemi značkami farbivami fluorochroacutemami (fluorofoacuterami) Pri priamom značeniacute je farbička kovalentne naviazanaacute na nukleotid a na zachytenie fluorescencie suacute potrebneacute špeciaacutelne priacutestroje umožňujuacutece excitaacuteciu farbičky ktoraacute potom emituje žiarenie určitej vlnovej dĺžky (emisneacute žiarenie) a to zachytiacute detekčnyacute systeacutem priacutestroja Využitie fluorochroacutemov v molekulaacuternej genetike je masiacutevne napr na vizualizaacuteciu NK elektroforeticky separovanyacutech v geacuteli kvantifikaacuteciu produktov PCR reakcie v priacutestroji real-time PCR cykleacuter sekvenovaniacute fragmentačnej analyacuteze FISH DNA mikročipoch atď

40

Obr 35 Princiacutep Southern blotu

82 FISH (fluorescenčnaacute in situ hybridizaacutecia)

FISH (fluorescent in situ hybridization fluorescenčnaacute in situ hybridizaacutecia) metoacuteda patriacute medzi molekulovo-cytogenetickeacute techniky Princiacutep FISH metoacutedy je založenyacute na hybridizaacuteciiacute fluorescenčne značenyacutech proacuteb ku komplementaacuternym uacutesekom vyšetrovanej DNA na podložnom skle (priamo na mieste - in situ) K denaturaacutecii dsDNA dochaacutedza buď vplyvom denaturačnyacutech činidiel alebo zvyacutešenou teplotou a naacuteslednou renaturaacuteciou dochaacutedza k naviazaniu sondy na komplementaacuterny uacutesek DNA Vyacutesledok hybridizaacutecie sa vizualizuje fluorescenčnyacutem mikroskopom vybavenyacutem vhodnyacutemi fluorescenčnyacutemi filtrami a vizuaacutelne zhodnotiacute skuacutesenyacutem odborniacutekom Fluorescencia sa v niektoryacutech priacutepadoch mocircže zaznamenať a hodnotiť aj pomocou softveacuteru (obr 36)

Pomocou FISH detegujeme numerickeacute aberaacutecie - zmeny v počte chromozoacutemov (napr trizoacutemia monozoacutemia chromozoacutemov) alebo štruktuacuterne aberaacutecie a prestavby (napr translokaacutecie inverzie deleacutecie duplikaacutecie amplifikaacutecie) FISH metoacuteda umožňuje identifikaacuteciu a detekciu každeacuteho ľudskeacuteho chromozoacutemu jeho zaradenie do karyotypu odhalenie malyacutech submikroskopickyacutech chromozoacutemovyacutech zmien a tiež mapovať poziacutecie jednotlivyacutech geacutenov na chromozoacuteme

41

Obr 36 Princiacutep štandardnej FISH a FISH maľovania celeacuteho chromozoacutemu

Veľkou vyacutehodou FISH metoacutedy je možnosť analyacutezy buniek v metafaacuteze aj v interfaacuteze kedy nie je nutnaacute kultivaacutecia buniek a tiež ryacutechle analyzovanie veľkeacuteho počtu buniek (stovky až tisiacutece) K ďalšiacutem vyacutehodaacutem patriacute bezpečnosť vysokaacute citlivosť dostatočnaacute stabilita relatiacutevne kraacutetky čas hybridizaacutecie a možnosť ryacutechleho vyhodnotenia Hybridizaacutecia pri vaumlčšine suacutečasne dodaacutevanyacutech sond trvaacute 10-12 hodin (na trhu suacute už dostupneacute aj sondy so skraacutetenyacutem časom hybridizaacutecie na 2-3 hodiny) Po hybridizaacuteciiacute nasleduje odmyacutevanie kedy pri priacuteslušnej teplote dochaacutedza k odmytiu nenaviazanyacutech a nespraacutevne hybridizovanyacutech sond Preparaacutet sa naacutesledne podfarbiacute a vyacutesledok sa zhodnotiacute vo fluorescenčnom mikroskope Na podfarbenie chromozoacutemov alebo jadier sa použiacuteva modreacute kontrastneacute farbivo DAPI (46-diamidino-2-fenylindol) ktoreacute maacute silneacute fluorescenčneacute vlastnosti dokaacuteže prechaacutedzať jadrovou membraacutenou a viazať sa na DNA Vyacutesledkom je modreacute zafarbenie ktoreacute vyacuteborne kontrastuje so signaacutelmi jednotlivyacutech sond

Limitujuacutecim faktorom FISH je možnosť identifikaacutecie len tyacutech uacutesekov DNA ku ktoryacutem suacute použiteacute sondy V jednej analyacuteze je možneacute použiť najviac 3 odlišne značeneacute sondy a tak zistiť priacutepadneacute abnormality len na 1 alebo na paacuter lokusoch Na relevantnuacute detekciu je potrebneacute mať vo vzorke 1-5 aberantnyacutech interfaacutezovyacutech jadier

FISH je možneacute uskutočniť na širokej škaacutele biologickeacuteho materiaacutelu na vzorkaacutech perifeacuternej krvi kostnej drene naacuteteroch choriovyacutech klkoch plodovej vode rocircznych druhov tkaniacutev natiacutevnych alebo zaliatych v parafiacutene na 1 bunke (predimplantačnaacute genetickaacute diagnostika PGD) (obr 37)

Využiacuteva sa na detekciu aberaacuteciiacute pri mnohyacutech onkologickyacutech ochoreniach (napr pri diagnoacuteze mnohopočetnyacute myeloacutem sa v suacutečasnosti po separaacutecii CD138+ buniek robiacute FISH s 5 sondami pre geacuteny IGH TP53 RB1 oblasť 1p321q21 a stanovuje sa hyperploidia chromozoacutemov 5 9 a 15) a tiež k spresneniu doplneniu a k overeniu bežneacuteho cytogenetickeacuteho vyšetrenia

Podľa miesta na chromozoacuteme na ktorom dochaacutedza k hybridizaacutecii sondy rozlišujeme 4 typy

DNA sond bull centromeacuteroveacute sondy ndash sa viažu na strednuacute časť chromozoacutemu ndash centromeacuteru sluacutežia k diagnostike zmien v počte chromozoacutemov k detekcii chromozoacutemov neznaacutemeho pocircvodu umožňujuacute interfaacuteznu FISH na nedeliacich sa bunkaacutech (obr 38-41)

42

Obr 37 Interfaacutezna FISH preimplantačnyacute genetickyacute skriacutening aneuploidiiacute ndash blastomeacutera 3-denneacuteho ľudskeacuteho embrya s normaacutelnym počtom chromozoacutemov 13 18 21 pohlavie XY použityacutech 5 sond pre chromozoacutemy 13 ndash orange 18 ndash aqua 21 ndash green X ndash blue a Y ndash yellow (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

Obr 38 Interfaacutezne jadro po hybridizaacutecii s centromeacuterovou sondou pre chromozoacutem 8 (Vysis Abbott) V pravom jadre je priacutetomnaacute trizoacutemia chromozoacutemu 8 (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex) Obr 39 Metafaacutezna (A) a interfaacutezna FISH (B) použitaacute centromeacuterovaacute sonda CEPX spectrum orangeCEPY spectrum green (Vysis Abbott) Sonda hybridizuje k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (červenyacute signaacutel) a Y (zelenyacute signaacutel) (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

43

Obr 40 Interfaacutezna FISH vyšetrenie spermiiacute použiteacute sondy CEPX greenCEPY orange (Aneuscore Metasystems) Sondy hybridizujuacute k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (zelenyacute signaacutel) Y (červenyacute signaacutel) vľavo ndash dve haploidneacute spermie (majuacutece jedna spermia X druhaacute Y chromozoacutem) vpravo ndash dve patologickeacute spermie obsahujuacutece gonozoacutemovyacute komplement XY (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

Obr 41 Interfaacutezna FISH vyšetrenie spermiiacute použiteacute sondy CEPX greenCEPY orange a CEP18 aqua (Aneuscore Metasystems) Sondy hybridizujuacute k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (zelenyacute signaacutel) Y (červenyacute signaacutel) a 18 (modryacute signaacutel) vľavo ndash normaacutelne haploidneacute ľudskeacute spermie - 1x chromozoacutem X alebo Y a jedenkraacutet chromozoacutem 18 v strede ndash patologickaacute spermia obsahujuacuteca gonozoacutemovyacute komplement XY a jeden chromozoacutem 18 vpravo ndash patologickaacute diploidnaacute spermia s chromozoacutemami X Y a dvoma chromozoacutemami 18 (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

bull lokusovo špecifickeacute sondy ndash hybridizaacutecia prebehne na konkreacutetnom mieste geacutenu (lokuse) (obr 42-44) použiacutevajuacute sa k vyšetreniu mikrodeleacuteciiacute (straty malyacutech častiacute chromozoacutemu pri mikrodelečnyacutech syndroacutemoch) k zisteniu amplifikaacutecie onkogeacutenov a niektoryacutech špecifickyacutech translokaacuteciiacute prestavby geacutenov umožňujuacute interfaacuteznu FISH na nedeliacich sa bunkaacutech bull subtelomeroveacute ndash vaumlzba na koncoveacute časti chromozoacutemu ndash telomeacutery bull celochromozoacutemoveacute alebo celomaľovacie sondy ndash sondy hybridizujuacute s mnohopočetnyacutemi chromozoacutemovyacutemi sekvenciami pričom sa fluorescenčne tak bdquovymaľujeldquo celyacute chromozoacutem (Obr 45) Použiacutevajuacute sa na vyšetrenie chromozoacutemovyacutech prestavieb k analyacuteze translokaacuteciiacute a k detekcii pocircvodu tzv marker chromozoacutemov (malyacutech nadpočetnyacutech chromozoacutemov neznaacutemeho pocircvodu) K použitiu sondy suacute potrebneacute metafaacutezne chromozoacutemy nepoužiacutevaju sa pre interfaacuteznu FISH

Pri konvenčnej chromozoacutemovej FISH suacute homogeacutenne DNA proacuteby hybridizovaneacute s fixovanyacutem metafaacuteznym alebo prometafaacuteznym chromozoacutemomchromozoacutemami na skliacutečku (Obr 36a) Maximaacutelna rozlišovacia schopnosť metafaacuteznej FISH je niekoľko megabaacutez (Obr 39a 45) využitiacutem viac

44

natiahnutyacutech prometafaacuteznych chromozoacutemov sa dosiahne 1 Mb rozliacutešenie Prostredniacutectvom fiber FISH konkreacutetne artificiaacutelne deproteinizovanej natiahnutej DNA pripravenej in situ z celyacutech buniek na mikroskopickom skliacutečku je možneacute vizualizovať individuaacutelne geacuteny maleacute DNA elementy na chromozoacuteme s rozliacutešeniacutem okolo 1000 bp

Obr 42 Interfaacutezne jadro po hybridizaacutecii s lokusovo-špecifickou sondou LSI 5q31 Spectrum Orange5p12 Spectrum Green (Vysis Abbott) Na ľavom obraacutezku suacute priacutetomneacute dva červeneacute (5q31) a dva zeleneacute signaacutely (5p12) v pravom jadre je priacutetomnaacute deleacutecia 5q31 oblasti chyacuteba jeden červenyacute signal (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

Obr 43 Interfaacutezna FISH použitaacute lokusovo-špecifickaacute sonda ndash translokačnaacute - XL BCRABL1 plus (Metasystems) dvojfarebnaacute dvojfuacutezna kde červenaacute označuje lokus ABL1 na chromozoacuteme 9 a zelenaacute oblasť BCR na chromozoacuteme 22 Sonda deteguje fuacuteziu protoonkogeacutenu ABL1 (9q34) a geacutenu BCR (22q11) v priacutepade že červenyacute a zelenyacute signaacutel suacute pri sebe (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

45

Obr 44 Interfaacutezna FISH Použitaacute lokusovo-špecifickaacute sonda- typ break apart pre IGH geacuten V docircsledku translokaacutecie došlo k rozskočeniu geacutenu pričom translokačneacuteho partnera nepoznaacuteme vieme určiť len percento v koľkyacutech jadraacutech je geacuten prestavanyacute (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex) Obr 45 Použiteacute celochromozoacutemoveacute sondy WCP 15 (červenyacute chromozoacutem) a WCP 17 (zelenyacute chromozoacutem) Na metafaacuteze je potvrdenaacute reciprokaacute translokaacutecia t(1517)(q2221) (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

FISH vizualizaacutecia celeacuteho chromozoacutemu maľovanie chromozoacutemu anglicky chromosome

painting je špeciaacutelnou aplikaacuteciou chromozoacutemovej FISH proacuteba je koktail veľkeacuteho počtu rocircznych fluorescenčne značenyacutech DNA fragmentov hybridizujuacutecich pozdĺž celeacuteho konkreacutetneho chromozoacutemu (obr 36b 45) bdquoChromosomepaintingldquo analyzuje metafaacutezne chromozoacutemy V minulosti bola FISH vizualizaacutecia celyacutech chromozoacutemov limitovanaacute malyacutem množstvom rocirczne sfarbenyacutech fluorochroacutemov

V suacutečasnosti je možneacute detegovať množstvo cieľovyacutech sekvenciiacute naraz čo sa využiacuteva pri celogenoacutemovej chromozoacutemovej vizualizaacutecii (whole-chromosomepainting - WCP) metoacutedou multiplex FISH (M-FISH multicolor FISH o br 46) alebo spektraacutelnej karyotypizaacutecie (SKY) kedy možno rozliacutešiť všetky ľudskeacute chromozoacutemy ndash teda 24 rocircznych chromozoacutemov M-FISH a SKY patria medzi metafaacutezne formy FISH diagnostiky ktoreacute umožňujuacute simultaacutennu vizualizaacuteciu všetkyacutech ľudskyacutech chromozoacutemov v rocircznych farbaacutech čo predstavuje uľahčenie analyacutezy karyotypu hlavne pri komplexnyacutech zmenaacutech a markeroch neznaacutemeho pocircvodu Obe techniky vychaacutedzajuacute z použitia

46

celochromozoacutemovyacutech sond značenyacutech kombinaacuteciou viaceryacutech fluorochroacutemov Rozdiel medzi M-FISH a SKY spočiacuteva v technike ziacuteskania konečneacuteho obrazu

Obr 46 Multicolor FISH - každyacute chromozoacutemovyacute paacuter je zafarbenyacute inou farbou pričom na ich zafarbenie postačuje kombinaacutecia 5 fluorochroacutemov Na vyhodnocovanie je potrebnaacute špeciaacutelna sada fluorescenčnyacutech filtrov pre jednotliveacute fluorochroacutemy a špeciaacutelnyacute softweacuter Vľavo-štandardnyacute karyotyp vpravo karyotyp s mutaacuteciami (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

V molekulovej cytogenetike suacute komerčne dostupneacute sety M-FISH proacuteb umožňujuacutece

viacfarebneacute pruacutežkovanie chromozoacutemov (banding) s vysokyacutem rozliacutešeniacutem (multicolor-banding mBAND FISH MCB) čo umožňuje identifikaacuteciu intrachromozoacutemovyacutech prestavieb (Obr 47) Nevyhnutnosťou mBAND-u je mať chromozoacutemy v metafaacuteze Taacuteto metoacuteda bola prvyacutekraacutet uskutočnenaacute na chromozoacuteme 5 v roku 1999 mBAND FISH umožňuje rozliacutešiť špecifickeacute oblasti chromozoacutemov na uacuterovni pruacutežku - bandu a sub-bandu s detekciou 550 bandov haploidneacuteho karyotypu

Obr 47 A - mBAND chromozoacutemu 11 - inverzia duplikovanej oblasti 11q223-q25 B - mBAND chromozoacutemu 3 - na kruhovom chromozoacuteme deleacutecia oblasti 3p263 C - mBAND chromozoacutemu 2 - potvrdenie inverzie duplikovanej časti chromozoacutemu (poskytnuteacute RNDr Dagmar Landlovou Medirex)

FISH metoacuteda a jej varianty (M-FISH mBAND SKY) majuacute v suacutečasnosti širokeacute využitie v

klinickej genetike v onkologickej genetike na detekciu aberaacuteciiacute v čase diagnoacutezy počas liečby po

47

liečbe monitorovanie po transplantaacutecii kostnej drene v prenataacutelnej a postnataacutelnej diagnostike pri detekcii submikroskopickyacutech deleacuteciiacute (napr DiGeorge syndroacutem - 22q112 delečnyacute syndroacutem PraderndashWilli syndroacutem- chromozoacutem 15q11-13) prostredniacutectvom FISH je možnaacute detekcia numerickyacutech zmien chromozoacutemov (trizoacutemia chromozoacutemu 21 pri Downovom syndroacuteme trizoacutemia chromozoacutemu 15 pri Patauovom syndroacuteme trizoacutemia chromozoacutemu 18 pri Edwardsovom syndroacuteme) rocirczne zmeny v počte pohlavnyacutech chromozoacutemov (monozoacutemia X pri Turnerovom syndroacuteme Klinefelterov syndroacutem s X chromozoacutemom naviac - XXY) podobne v predimplantačnej diagnostike

83 DNA Microarray (DNA mikro čip biočip) DNA mikročipovanie je technika využiacutevajuacuteca hybridizaacuteciu skuacutemanej nukleovej kyseliny

(cieľovaacute vzorka) s veľkyacutem množstvom oligonukleotidovyacutech proacuteb (desať tisiacutec až milioacuten) ktoreacute suacute prichyteneacute na pevnyacute podklad najčastejšie sklenyacute silikoacutenovyacute alebo nylonovyacute (doštička čip) Skuacutemanaacute nukleovaacute kyselina je pred hybridizaacuteciou fragmentovanaacute označenaacute fluorofoacuterom a denaturovanaacute Po kontakte čipu s cieľovou vzorkou ktoraacute je vlastne zmes označenyacutech oligonukleotidov značeneacute oligonukleotidy hybridizujuacute s oligonukleotidovyacutemi sekvenciami prichytenyacutemi na čipe Potom suacute na zaacuteklade fluorescencie detekovaneacute miesta kde došlo k hybridizaacutecii čiže vzorka obsahovala takuacuteto nukleotidovuacute sekvenciu Z jedneacuteho mikročipu sa ziacuteska obrovskeacute množstvo daacutet ktoreacute je vždy nutneacute softveacuterovo spracovať V dnešnej dobe existuje niekoľko firiem poskytujuacutecich komerčne mikročipy na objednaacutevku alebo si ich laboratoacuteria produkujuacute sami

Mikročipovanie prebieha nasledovne

1) Vytvorenie DNA čipu ndash tisiacutece rocircznych jednovlaacuteknovyacutech DNA oligonukleotidov znaacutemych sekvencii sa kovalentne naviažu na povrch doštičky vždy v určitej lokalite je niekoľko rovnakyacutech oligonukleotidov veľkosť takejto lokality je ˂ 200 microm Proacutebami mocircže byť DNA cDNA alebo syntetizovaneacute oligonukleotidy Už hotoveacute mikročipy ponuacutekajuacute viacereacute firmy (Affymetrix Agilent Technologies Eppendorf Illumina) alebo si ich jednotliveacute laboratoacuteria vyraacutebajuacute sami pomocou robotickyacutech zariadeniacute DNA čip sa vytvaacutera buď nanaacutešaniacutem kvapiek oligonukleotidov na podklad alebo synteacutezou oligonukleotidov in situ na čipe 2) Priacuteprava vzorky ndash nukleovaacute kyselina (mRNA DNA) sa purifikuje určiacute sa jej kvantita a kvalita (spektrofotometericky) fragmentuje resp v priacutepade mRNA sa syntetizuje cDNA v priacutepade potreby sa mocircže DNA amplifikovať PCR reakciou štiepiť restrikčnyacutemi endonukleaacutezami 3) Fluorescenčneacute označenie (zriedkavejšie raacutedioaktiacutevne) fragmentov DNA prebieha počas reverznej transkripcie alebo PCR amplifikaacutecie za uacutečasti fluorescenčne značenyacutech nukleotidov Keď sa analyzujuacute dve rocirczne vzorky napr zdraveacute tkanivo a naacutedoroveacute tkanivo označenie nukleovyacutech kyseliacuten v tyacutechto tkanivaacutech byacuteva rozdielne a to použitiacutem dvoch rocircznych fluorescenčnyacutech farbiacutev (napr zeleneacute a červeneacute) Pred hybridizaacuteciou je potrebneacute vzorku denaturovať čiacutem sa vytvoriacute zmes jednovlaacuteknovyacutech DNA označenyacutech značkou 4) Hybridizaacutecia s mikročipom ndash v špeciaacutelnom hybridizačnom roztoku hybridizujuacute komplementaacuterne sekvencie zo vzorky s priacuteslušnyacutemi oligonukleotidovyacutemi sondami naviazanyacutemi na čipe Potom sa čip obmyje aby došlo k odstraacuteneniu čiastočne hybridizovanyacutech nukleovyacutech kyseliacuten 5) Skenovanie mikročipu ndash skenerom čipov docircjde k ožiareniu čipu laserom pričom v mieste hybridizaacutecie fluorescenčne značenyacutech DNA fragmentov s proacutebou docircjde k emisii svetla určitej vlnovej dĺžky ktoruacute skener zaznamenaacute 6) Analyacuteza daacutet prebieha metoacutedami bioinformatiky spracovaniacutem softveacutermi sa zistiacute ktoreacute lokality čipu navzaacutejom hybridizovali v priacutepade použitia dvoch vzoriek kontrolnej a skuacutemanej je možneacute analyzovať ich relatiacutevnu intenzitu hybridizaacutecie (expresie určiteacuteho geacutenu)

Existujuacute štyri typy mikročipov 1) Čipy ur čeneacute na analyacutezu expresie (obsahujuacute cDNA proacuteby) pre tzv dvojkanaacutelovyacute experiment kedy je vzorka určenaacute k hybridizaacutecii na čipe ziacuteskanaacute zmiešaniacutem DNA fragmentov kontrolnej a skuacutemanej vzorky pričom fragmenty suacute rozdielne fluorescenčne označeneacute (napr zelenyacute fluorofoacuter pre kontrolnuacute vzorku a červenyacute pre skuacutemanuacute) Na zaacuteklade intenzity a typu fluorescencie sa deteguje expresia geacutenov typickaacute pre kontrolnuacute vzorku (napr zelenaacute fluorescencia) pre skuacutemanuacute vzorku (napr

48

červenaacute fluorescencia) a expresia podobnaacute u oboch vzoriek (žltaacute fluorescencia) neexprimovaneacute geacuteny (čierna fluorescencia) rocirczne odtiene (v zaacutevislosti od prevažujuacutecej hybridizaacutecie) (obr 48) 2) Čipy ur čeneacute na analyacutezu mutaacutecii použije sa genoacutemovaacute DNA označenaacute jednou fluorescenčnou farbičkou na určenie jednonukleotidovej zmeny (SNP ndash Single Nukleotide Polymorphism) 3) Čipy na komparatiacutevnu genoacutemovuacute hybridizaacuteciu (aCGH array Comparative Genomic Hybridization) ndash použiacutevaneacute na zistenie zvyacutešenia alebo zniacuteženia množstva chromozoacutemovyacutech fragmentov obsahujuacutecich geacuteny zodpovedneacute za určiteacute ochorenie Na analyacutezu sa použije skuacutemanaacute gDNA a referenčnaacute (kontrolnaacute) DNA každaacute sa značiacute inou fluorescenčnou farbičkou (princiacutep ako pri analyacuteze expresie) (obr 49 50) 4) Čipy CGH - SNP kombinovaneacute čipy ur čeneacute na analyacutezu aj mutaacuteciiacute SNP aj na komparatiacutevnu genoacutemovuacute hybridizaacuteciu CGH

Mikročipy majuacute rozsiahle využitie napriacuteklad v identifikaacuteciiacute novyacutech geacutenov vo vyacuteskume ich funkciiacute expresie v rocircznych podmienkach pri diagnostike mnohyacutech ochoreniacute vo farmakogenomike vo vyacuteskume vplyvu toxiacutenov

Obr 48 Heatmapa geacutenovej expresie vybranyacutech geacutenov (mRNA) mikročip obsahuje 46000 cDNA proacuteb (poskytnuteacute Ing Helenou Gbelcovou PhD Uacutestav lekaacuterskej bioloacutegie genetiky a klinickej genetiky LF UK a UNB)

49

Obr 49 Princiacutep komparatiacutevnej genoacutemovej hybridizaacutecie (aCGH - array comparative genomic hybridization) Obr 50 A) Vyacutesledok komparatiacutevnej genoacutemovej hybridizaacutecie (aCGH - array comparative genomic hybridization) vzorky DNA izolovanej plodovej vody U plodu s abnormaacutelnym ultrasonografickyacutem vyšetreniacutem bola identifikovanaacute duplikaacutecia oblasti 3q261q29 (modryacute paacutes) a deleacutecia oblasti 5p1533p151 (červenyacute paacutes) Pre porovnanie chromozoacutem 1 bez aberaacutecie b) Ten istyacute pacient ale ineacute softveacuteroveacute spracovanie (poskytnuteacute RNDr Miroslavom Tomkom PhD Medirex)

50

Odporuacutečanaacute a použitaacute literatuacutera

Odborneacute knihy Klug W S Cummings M R Spencer Ch A Palladino M A Concepts of Genetics jedenaacuteste vydanie (2015) Carson S Molecular Biology Techniques tretie vydanie (2012) Strachan T Read A Human Molecular Genetics štvrteacute vydanie (2011) Sudbery P Sudbery I Human Molecular Genetics tretie vydanie (2009)

Internetoveacute straacutenky

wwwncbinlmnihgov wwwmlpacom wwwthermofishercom wwwilluminacom wwwpromegask wwwqiagencom wwwambioncom

Odborneacute člaacutenky Chacon-Cortes D Griffiths L R Methods for extracting genomic DNA from whole blood samples current perspectives Journal of Biorepository Science for Applied Medicine Volume 2 strany 1- 9 Viltrop T Krjutskov K Palta P Metspalu A Comparison of DNA extraction methods for multiplex polymerase chain reaction Anal Biochem 2010 Volume 398(2) strany 260-262 Ing Martin Čermaacutek Molekulaacuterna cytogenetika v problematike familiaacuternych maligniacutet Onkoloacutegia Volume 2 strany 77 - 83 Livak KJ Schmittgen TD Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method Methods 2001 Volume 25(4) strany 402 - 408 Bustin S A Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays J Mol Endocrinol 2000 Volume 25(2) strany169 - 193

MOLEKULAacuteRNE METOacuteDY AKTUAacuteLNE POUŽIacuteVANEacute V KLINICKEJ GENETIKE RNDr Andrea Pastoraacutekovaacute PhD RNDr Robert Petrovič PhD Vydala Univerzita Komenskeacuteho v Bratislave Lekaacuterska fakulta Rozsah 50 straacuten 246 AH prveacute vydanie ISBN 978-80-223-4231-5

26

na ochranu pred cudzou DNA (napr viacuterusovou) ktoruacute po rozpoznaniacute špecifickej sekvencie štiepia

Restrikčno-modifikačnyacute systeacutem maacute dve zložky 1) modifikačneacute enzyacutemy - metylaacutezy ktoreacute procesom metylaacutecie modifikujuacute určiteacute baacutezy svojej DNA čiacutem ich označia za vlastnuacute DNA takže takaacuteto DNA je potom rezistentnaacute voči štiepeniu restrikčnyacutemi endonukleaacutezami Najčastejšiacutem spocircsobom metylaacutecie u bakteacuteriiacute je metylaacutecia adeniacutenu na N6 pričom vznikne metyladeniacuten alebo cytoziacutenu na C5 metylcytoziacuten 2) restrikčneacute endonukleaacutezy štiepia špecifickeacute miesto dvojvlaacuteknovej DNA ktoreacute je tvoreneacute symetrickou sekvenciou zrkadlovo sa opakujuacutecich nukleotidov ndash tzv palindroacutem Restrikčneacute enzyacutemy sa použiacutevajuacute na štiepenie DNA sekvencie na mieste špecifickom pre tuacute ktoruacute restrikčnuacute endonukleaacutezu napr pri analyacuteze polymorfizmov dĺžky restrikčnyacutech fragmentov (RFLP) analyacuteze jednonukleotidovyacutech polymorfizmov (SNP) mutaacuteciiacute ako aj pri klonovaniacute DNA do vhodnyacutech vektorovyacutech DNA molekuacutel

Po štiepeniacute dvojvlaacuteknovej DNA restrikčnou endonukleaacutezou mocircžu vzniknuacuteť tri typy koncov - 5´-prečnievajuacutece konce (lepiveacute) 3´-prečnievajuacutece konce (lepiveacute) a tupeacute konce (obr 24)

Obr 24 Restrikčneacute štiepenie zanechaacutevajuacutece rocirczne konce tupeacute a lepiveacute

Restrikčneacute štiepenie je často použiacutevanou metoacutedou geacutenovyacutech manipulaacuteciiacute na konštrukciu

hybridnyacutech molekuacutel DNA s naacuteslednyacutem klonovaniacutem Priebeh RFLP analyacutezy je nasledovnyacute restrikčnaacute endonukleaacuteza sa pridaacute k DNA a zmes sa vo

vhodnyacutech reakčnyacutech podmienkach (pufor teplota) inkubuje niekoľko hodiacuten Počas inkubaacutecie docircjde k štiepeniu DNA na špecifickyacutech miestach DNA je potom elektroforeticky separovanaacute v geacuteli a naacutesledne vizualizovanaacute V minulosti po geacutelovej elektroforeacuteze nasledoval Southern blot (čiže prenos separovanyacutech fragmentov DNA z geacutelu na špeciaacutelnu membraacutenu) (obr 35) po ktorom nastala vizualizaacutecia raacutedioaktiacutevne značenou proacutebou V suacutečasnosti sa kvocircli praacutecnosti a zdravotnyacutem rizikaacutem od Southern blotu upuacutešťa a prechaacutedza sa na ryacutechlejšie menej praacutecne a zdravotne šetrnejšie metoacutedy priateľskejšie aj k životneacutemu prostrediu

RFLP bola prvou metoacutedou použiacutevanou na zistenie DNA profilu (DNA fingerprinting) mapovanie geacutenov zapriacutečiňujuacutece genetickeacute ochorenia a testovanie otcovstva Vaumlčšina RFLP markerov je vysoko lokusovo špecifickyacutech a kodominantnyacutech (obidve alely suacute detekovaneacute u heterozygota)

PCR-RFLP je laboratoacuterne priacutestupnejšia metoacuteda molekulaacuterno-genetickej diagnostiky keďže PCR umožňuje amplifikaacuteciu veľmi malyacutech množstiev DNA Alternatiacutevny naacutezov použiacutevanyacute v literatuacutere je CAPS z angl Cleaved Amplified Polymorphic Sequence assay Použitiacutem špecifickyacutech primerov docircjde PCR metoacutedou k amplifikaacutecii požadovaneacuteho uacuteseku DNA ten sa potom štiepi restrikčnou endonukleaacutezou vo vhodnyacutech podmienkach naacutesledne sa štiepne produkty elektroforeticky separujuacute a vizualizujuacute použitiacutem interkalačnyacutech farbiacutev a UV svetla (obr 25)

27

Obr 25 Princiacutep metoacutedy PCR-RFLP

43 VNTR a STR V geacutenome suacute priacutetomneacute dva typy tandemovyacutech (za sebou nasledujuacutecich) opakovaniacute

1) minisatelity ndash nazyacutevaneacute variabilnyacute počet tandemovyacutech opakovaniacute VNTR (variable number of tandem repeats) 2) mikrosatelity tiež kraacutetke tandemoveacute repetiacutecie STR (short tandem repeats)

Obidva tieto typy satelitnej DNA suacute rozmiestneneacute po celom genoacuteme suacute využiacutevaneacute hlavne vo forenznej genetike na identifikaacuteciu osocircb a určenie otcovstva popriacutepade materstva ale aj v mediciacutene na detekciu chromozoacutemovyacutech aneuploidiiacute Štruktuacutera obidvoch je podobnaacute Rozdiel medzi jednotlivyacutemi alelami je spocircsobenyacute rozdielnym počtom opakovaniacute opakujuacutecej sa sekvencie (motiacutevu) čo spocircsobiacute rocircznu dĺžku alel s rocircznym počtom tandemovyacutech opakovaniacute nazyacutevanuacute polymorfizmus dĺžky fragmentov

VNTR ndash variabilnyacute počet tandemovyacutech opakovaniacute pričom opakujuacuteca sa sekvencia maacute dĺžku od 6 do 100 baacutez pričom sa mocircže opakovať aj tisiacutece kraacutet alely tak mocircžu mať od 500do 30 000 baacutez VNTR boli v kombinaacutecii s RFLP (DNA fingerprinting ) prvyacutem polymorfizmom použiacutevanyacutem na zistenie DNA profilov a identifikaacuteciu osocircb v kriminalistickej praxi V suacutečasnosti jeho využitie v kriminalistike je kvocircli potrebe relatiacutevne veľkeacuteho množstva DNA nahradeneacute využitiacutem STR

STR - kraacutetke tandemoveacute repetiacutecie suacute v kriminalistike najčastejšie použiacutevanyacutem polymorfizmom STR lokusy suacute rozmiestneneacute po celom genoacuteme repetiacutecia obsahuje jednu až šesť baacutez pričom jej opakovaniacutem vznikne STR v rozsahu od 50 do 300bp V našom genoacuteme suacute tisiacutece STR ktoreacute mocircžu byť použiteacute pre forenznuacute analyacutezu V kriminalistike sa v suacutečasnosti na identifikaacuteciu osocircb použiacuteva 13 STR locusov ktoreacute patria k medzinaacuterodne uznaacutevanyacutem štandardom Z iniciatiacutevy FBI bola vytvorenaacute databaacuteza CODIS (Combined DNA Index System) každaacute krajina maacute svoju databaacutezu CODIS kde je možneacute vložiť a archivovať DNA profily jednotlivcov ako aj profily DNA ziacuteskanyacutech z miest kriminaacutelneho činu v databaacuteze je ich možneacute navzaacutejom porovnať a tak zistiť pocircvodcu trestneacuteho činu Medzinaacuterodnaacute jednotnosť v použiacutevaniacute CODIS STR lokusov umožňuje v priacutepade potreby vzaacutejomneacute porovnanie DNA profilov zistenyacutech na uacutezemiacute rocircznych štaacutetov CODIS STR lokusov je 13 a suacute to CSF1PO FGA TH01 TPOX VWA D3S1358 D5S818 D7S820 D8S1179 D13S317 D16S539 D18S51 a D21S11 Zistenie DNA profilu sa uskutočniacute multiplexnou PCR reakciou s fluorescenčne značenyacutemi primermi špecifickyacutemi pre konkreacutetny STR Naacutesledne suacute PCR produkty analyzovaneacute kapilaacuternou elektroforeacutezou genetickyacutem analyzaacutetorom ktoryacute rozliacuteši amplifikovaneacute fragmenty na zaacuteklade fluorescencie a dĺžky (fragmentačnaacute analyacuteza) (obr 26 Tab 3) DNA profil každeacuteho človeka je jedinečnyacute rovnakyacute profil mocircžu mať len jednovaječneacute dvojčataacute

28

Obr 26 Ukaacutežka DNA profilu človeka 15 STR lokusov s určeniacutem pohlavia pomocou lokusu pre amelogeniacuten (ženskeacute pohlavie - XX) maleacute oranžoveacute piacuteky predstavujuacute fragmenty veľkostneacuteho štandardu Tabuľka č 3 Zaacutepis DNA profilu človeka z obraacutezka č 26 15 STR lokusov s určeniacutem pohlavia pomocou lokusu pre amelogeniacuten System Alela 1 Alela 2

D3S1358 16 17

TH01 9 93 D21S11 28 28

D18S51 15 18

Penta E 7 14 D5S818 9 12

D13S317 8 11

D7S820 8 11 D16S539 11 12

CSF1PO 10 11

Penta D 11 12 vWA 15 18

D8S1179 13 16

TPOX 8 9 FGA 20 21

amel X X

29

5 MLPA

Multiplexnaacute amplifikaacutecia proacuteb zaacutevislaacute od ligaacutecie (z angl multiplex ligation-dependent probe amplification) je metoacuteda schopnaacute v jednej reakcii (v jednej skuacutemavke a vzorke) detegovať zmeny v počte až 50 nukleotidovyacutech sekvenciiacute Metoacutedou MLPA je možneacute ryacutechlo identifikovať amplifikaacutecie (duplikaacutecie) a deleacutecie veľkeacuteho počtu geacutenov či už použitiacutem DNA alebo mRNA krvnyacutech vzoriek alebo vzoriek z naacutedorov

Princiacutep MLPA spočiacuteva v multiplexnej amplifikaacutecii 50 špecifickyacutech nukleotidovyacutech sekvenciiacute použitiacutem jedneacuteho paacuteru primerov pričom jeden primer je fluorescenčne označenyacute Vyacutesledneacute PCR produkty suacute analyzovaneacute kapilaacuternou elektroforeacutezou (fragmentačnaacute analyacuteza) Dĺžka každeacuteho namnoženeacuteho produktu je jedinečnaacute narastaacute postupne o 6 alebo 9 nukleotidov pričom produkty PCR suacute 120 ndash 500 nukleotidov dlheacute Tento veľkostnyacute rozsah PCR fragmentov (dĺžka 120-500 nukleotidov s naacuterastom postupne o 6 alebo 9 nukleotidov) je optimaacutelny pre kapilaacuternu elektroforeacutezu MLPA multiplexnaacute PCR prebieha za použitia iba jedineacuteho paacuteru primerov ktoreacute amplifikujuacute špecifickeacute sekvencie Trik spočiacuteva v tom že nedochaacutedza k amplifikaacutecii DNA sekvencie ale MLPA proacuteb ktoreacute suacute pridaneacute k vzorkaacutem Každaacute MLPA proacuteba pozostaacuteva z dvoch oligonukleotidov (dve hemiproacuteby) pričom každyacute oligonukleotid obsahuje jednu zo sekvencie rozpoznaacutevanuacute PCR primermi Proacuteba vznikne jedine za predpokladu hybridizaacutecie dvoch oligonukleotidov (hemiproacuteb) k cieľovej sekvencii (geacutenu) a po ligaacutecii enzyacutemom ligaacutezou Iba ligovaneacute proacuteby suacute exponenciaacutelne amplifikovaneacute pomocou jedneacuteho paacuteru primerov Množstvo zligovanyacutech proacuteb teda zaacutevisiacute od množstva cieľovyacutech sekvenciiacute (geacutenov) vo vzorke

Postup MLPA analyacutezy je nasledovnyacute (obr27) K vzorke nukleovej kyseliny (DNA resp mRNA) sa pridaacute zmes 50 jedinečnyacutech proacuteb každaacute

proacuteba je komplementaacuterna k určitej cieľovej sekvencii NK vzorky Každaacute proacuteba však pozostaacuteva z dvoch oligonukleotidov hybridizujuacutecich vedľa seba zaacuteroveň každyacute oligonukleotid (hemiproacuteba) obsahuje pridanuacute sekvenciu rozpoznaacutevanuacute paacuterom PCR primerov Po hybridizaacuteciiacute oligonukleotidov (hemiproacuteb) dochaacutedza k ich ligaacutecii ligaacutezou Ligačnaacute reakcia je tak špecifickaacute že je schopnaacute rozliacutešiť sekvenciu liacutešiacu sa v jednom nukleotide Vyacuteslednyacute ligačnyacute produkt (proacuteba) obsahuje obidve sekvencie pre PCR primery na jednom fragmente čiže mocircže docircjsť k namnoženiu takeacutehoto fragmentu PCR reakciou V priacutepade ak nedocircjde k ligaacutecii priacuteslušnyacutech hemiproacuteb pretože hemiproacuteby nenaacutejdu cieľovuacute sekvenciu na DNA každaacute takaacuteto nezligovanaacute hemiproacuteba maacute len jednu sekvenciu rozpoznaacutevanuacute len jednyacutem PCR primerom v docircsledku čoho nemocircže prebehnuacuteť jej PCR amplifikaacutecia a počas fragmentačnej analyacutezy nie je detegovanaacute pretože negeneruje fluorescenčnyacute signaacutel

Pri MLPA analyacuteze je docircležiteacute okrem MLPA amplifikaacutecie vzorky urobiť aj MLPA amplifikaacuteciu referenčnej vzorky ku ktorej sa bude porovnaacutevať počet geacutenov (cieľovyacutech sekvenciiacute) Po kapilaacuternej elektroforeacuteze MLPA referenčnej a skuacutemanej vzorky porovnaniacutem obsahu nameranyacutech hodnocirct tzv piacutekov priacuteslušnyacutech proacuteb sa určiacute relatiacutevny počet koacutepiiacute v skuacutemanej vzorke

MLPA

1 DNA denaturaacutecia a hybridizaacutecia s MLPA proacutebami (hemiproacuteby)

2 Ligaacutecia (vytvorenie kompletnyacutech proacuteb)

3 PCR amplifikaacutecia proacuteb paacuterom primerov

4 Kapilaacuterna elektroforetickaacute separaacutecia PCR produktov

5 Analyacuteza daacutet

30

Obr 27 Princiacutep MLPA

Firma MRC-Holland v suacutečasnosti ponuacuteka stovky MLPA setov proacuteb ktoreacute suacute vhodneacute na 1) diagnostiku kongenitaacutelnych a dedičnyacutech ochoreniacute 2) zisťovanie profilu naacutedorov 3) zisťovanie metylačneacuteho profilu

MLPA je metoacuteda vhodnaacute na detekciu malyacutech prestavieb (BRCA1 BRCA2 MSH2 atď)

veľkyacutech chromozoacutemovyacutech prestavieb (Williamsov syndroacutem Prader-WilliAngelman syndroacutem atzď)

31

detekciu zmien v počte koacutepii geacutenov (obr 28 29) ako aj zistenie počtu kompletnyacutech chromozoacutemov (chromozoacutem 13 18 21 XY tiež aj z amniovej tekutiny) diagnostiku naacutedorov (zmeny počtu pri ALL CLL atď) kvantifikaacuteciu metylaacutecie (Prader-WilliAngelmanov syndroacutem Fragilnyacute X inaktivaacutecia naacutedorovyacutech supresorovyacutech geacutenov atď) mRNA analyacutezu geacutenov zuacutečastňujuacutecich sa apoptoacutezy alebo zaacutepalov

MS-MLPA (Methylation-Specific MLPA) je varianta MLPA určenaacute špeciaacutelne na analyacutezu aberantnyacutech metylaacutecii imprintovanyacutech oblastiacute ako aj detekciu metylačnyacutech zmien CpG ostrovčekov lokalizovanyacutech bliacutezko promoacutetora Rozdiel oproti štandardnej MLPA spočiacuteva v použitiacute metylačne senzitiacutevneho restrikčneacuteho enzyacutemu HhaI ktoryacute štiepi MS-MLPA proacuteby hybridizovaneacute k nemetylovanej sekvencii Každaacute DNA vzorka určenaacute pre MS-MLPA analyacutezu prejde dvoma reakciami v jednej mikroskuacutemavke štandardnou MLPA analyacutezou (bez štiepenia metylačne senzitiacutevnym enzyacutemom) a v druhej mikroskuacutemavke docircjde okrem ligaacutecie proacuteb aj k metylačne senzitiacutevnemu štiepeniu hybridizovanyacutech proacuteb s nemetylovanou DNA Amplifikujuacute sa len ligovaneacute proacuteby po PCR amplifikaacutecii sa fragmentačnou analyacutezou porovnaniacutem oboch reakciiacute zistia rozdiely v metylačnom profile vzorky k referenčnej vzorke

RT-MLPA (Reverse Transkriptase MLPA) je variaacutecia MLPA určenaacute pre zistenie mRNA profilu vzorky je alternatiacutevou k real-time PCR a mikročipom RT-MLPA nedeteguje mRNA množstvo priamo pretože použiacutevanaacute ligaacuteza nie je schopnaacute ligovať DNA oligonukleotidy keď suacute hybridizovaneacute s RNA Preto RT-MLPA začiacutena reverznou transkripciou so špeciaacutelne navrhnutyacutemi RT primermi tak aby vytvorili kraacutetke oligonukleotidy (cDNA) Potom reakcia pokračuje ako štandardnaacute MLPA

Obr 28 MLPA analyacuteza geacutenu DMD (koacutedujuacuteceho dystrofiacuten) mutaacutecie ktoreacuteho spocircsobujuacute Duchennovu svalovuacute dystrofiu u pacienta je priacutetomnaacute deleacutecia exoacutenu 45 v porovnaniacute s referenčnou vzorkou ndash kontrolou

32

Obr 29 MLPA analyacuteza geacutenu DMD (koacutedujuacuteceho dystrofiacuten) mutaacutecie ktoreacuteho spocircsobujuacute Duchennovu svalovuacute dystrofiu u pacienta suacute priacutetomneacute duplikaacutecie exoacutenov 41 42 43 44 45 (piacuteky vo vzorke pacienta sa porovnajuacute s piacutekmi v kontrole ndash referenčnej vzorke)

33

6 Sekvenovanie

Sekvenovaniacutem rozumieme určenie primaacuternej štruktuacutery DNA teda určenie poradia nukleotidov v reťazci DNA Začiatky moderneacuteho sekvenovania siahajuacute do roku 1977 kedy boli objaveneacute dve metoacutedy sekvenovania 1) chemickaacute metoacuteda Maxama a Gilberta 2) enzymatickaacute metoacuteda Sangera Nicklena a Coulsona

Princiacutep obidvoch metoacuted sekvenovania spočiacuteva v tom že sa vytvoriacute suacutebor DNA molekuacutel s rocircznou veľkosťou ktoreacute suacute zakončeneacute konkreacutetnym nukleotidom tieto DNA molekuly sa elektroforeticky separujuacute v geacuteloch s rozlišovacou schopnosťou 1 nukleotid 61 Chemickaacute metoacuteda

DNA molekuly sa na 5-konci raacutedioaktiacutevne označia raacutedioaktiacutevnym fosforom a naacutesledne sa chemicky modifikujuacute špecificky pre každuacute baacutezu DNA sa potom v modifikovanyacutech miestach štiepi čiacutem vzniknuacute rocirczne dlheacute fragmenty pričom podmienky suacute nastaveneacute tak aby sa DNA na každom mieste štiepila len raz Modifikaacutecia DNA a štiepenie prebehne v štyroch separaacutetnych reakciaacutech (skuacutemavkaacutech) takže po elektroforetickej separaacuteciiacute takto opracovanej DNA v štyroch draacutehach polyakrylamidoveacuteho geacutelu a naacuteslednej autoraacutediografii (podobne ako pri Southernovej hybridizaacutecii) je možneacute odčiacutetať nukleotidovuacute sekvenciu približne 100 nukleotidov od raacutedioaktiacutevneho označenia (v čase objavu Maxama a Gilberta) 62 Sangerova metoacuteda

Zaacuteklady metoacutedy boli popiacutesaneacute už v roku 1975 (metoacuteda plus a miacutenus) ale až vylepšenie použitiacutem dideoxynukleotidov (ddNTP) v roku 1977 došlo k zjednodušeniu sekvenovania Princiacutepom enzyacutemoveacuteho sekvenovania je terminaacutecia (zastavenie) polymerizaacutecie inkorporaacuteciou 2´ 3 -dideoxynukleotidov do novosyntetizujuacuteceho sa vlaacutekna DNA Keďže ddNTP neobsahujuacute hydroxylovuacute skupinu na 3 uhliacuteku riboacutezy nemocircžu sa zuacutečastniť na tvorbe fosfodiesterovej vaumlzby nemocircže sa pripojiť k nim ďalšiacute nukleotid čiže musiacute docircjsť k terminaacuteciiacute polymeraacutecie Reakcia prebieha v štyroch skuacutemavkaacutech s raacutedioaktiacutevne značenyacutem primerom V každej skuacutemavke suacute priacutetomneacute všetky štyri deoxynukleotidtrifosfaacutety (dNTP) ale pre každuacute skuacutemavku je špecifickyacute priacutedavok maleacuteho množstva jedneacuteho z dideoxynukleotidtrifosfaacutetov (v prvej skuacutemavke je ddATP v druhej ddCTP v tretej ddTTP a vo štvrtej ddGTP) Maleacute množstvo ddNTP spocircsobiacute že pri polymerizaacutecii dochaacutedza k prednostneacutemu zaradeniu štandardnyacutech dNTP do narastajuacuteceho reťazca a len občas sa inkorporuje ddNTP čiacutem sa zastaviacute synteacuteza reťazca V každej skuacutemavke tak vznikne suacutebor DNA fragmentov rocircznych veľkostiacute zakončenyacutech priacuteslušnyacutem ddNTP (v prvej skuacutemavke ddATP v druhej ddCTP v tretej ddTTP a vo štvrtej ddGTP) Po elektroforetickej separaacutecii v 4 draacutehach polyakrylamidoveacuteho geacutelu a autoraacutediografii sa z autoraacutediogramu odčiacuteta sekvencia

V suacutečasnosti je sekvenovanie do značnej miery automatizovaneacute pričom využiacuteva princiacutep Sangerovej enzyacutemovej metoacutedy s určityacutemi obmenami Uacutesek DNA ktoryacute treba sekvenovať sa prostredniacutectvom termostabilnyacutech DNA polymeraacutez namnožiacute PCR metoacutedou po ktorej nasleduje sekvenačnaacute reakcia (asymetrickaacute PCR) s fluorescenčne značenyacutemi ddNTP (každyacute druh označenyacute inyacutem fluorescenčnyacutem farbivom) Sekvenačnaacute reakcia prebieha v jednej skuacutemavke s jednyacutem primerom vznikne tak suacutebor jednovlaacuteknovyacutech DNA rocircznej dĺžky ktoreacute suacute na 3konci označeneacute ddNTP so špecifickyacutem fluorescenčnyacutem farbivom Taacuteto metoacuteda sekvenovania sa tiež nazyacuteva rdquodye-terminator cycle sequencingrdquo(obr 30) Po kapilaacuternej elektroforeacuteze vzorky v genetickom analyzaacutetore zaznamenaacutevaniacute fluorescencie jednotlivyacutech fragmentov CCD kamerou a softveacuterovom spracovaniacute sa ziacuteska sekvencia DNA (obr 31)

34

Obr 30 Princiacutep sekvenovania Sangerova dideoxy metoacuteda alebo tzv chain termination method (reťazec zastavujuacuteca metoacuteda) Obr 31 Určenie genotypu plodu a rodičov sekvenčnou analyacutezou DNA ziacuteskanej z plodovej vody (prenataacutelna diagnostika) a perifeacuternej krvi sekvenčnaacute analyacuteza geacutenu ASPA vyacutesledok u plodu priacutetomnaacute mutaacutecia c 914CgtA v homozygotnom stave (AA) rodičia heterozygoti (AC) Uvedenaacute mutaacutecia je v homozygotnom stave kauzaacutelnou priacutečinou Canavanovej choroby

Automatizovaneacute sekvenovanie prinaacuteša viacereacute vyacutehody oproti klasickej Sangerovej metoacutede vyššiu presnosť a ryacutechlosť v jednej sekvenačnej reakcii možnosť osekvenovať až 1200 nukleotidovyacute fragment maleacute množstvo templaacutetu potrebneacute na analyacutezu

35

63 Next Generation Sequencing (NGS)

NGS (sekvenovanie novej generaacutecie) maacute obrovskyacute potenciaacutel v analyacuteze genoacutemov pričom toto označenie zahŕňa viacereacute technologickeacute metoacutedy reprezentovaneacute niekoľkyacutemi firmami Princiacutepom je masiacutevne paralelneacute sekvenovanie čiacutem sa ziacuteskajuacute raacutedovo tisiacutece až milioacuteny sekvenciiacute naraz 631 Sekvenovanie druhej generaacutecie

Na začiatku sa analyzovanaacute DNA vo vaumlčšine priacutepadov fragmentuje (vznikne tak DNA

knižnica) na fragmenty sa pripoja kraacutetke sekvencie ndash adapteacutery naacutesledne sa tieto fragmenty rocircznymi priacutestupmi amplifikujuacute a určiacute sa ich sekvencia Vďaka čiastočnyacutem prekryvom je zo ziacuteskanyacutech sekvencii možneacute poskladať plynuluacute sekvenciu zodpovedajuacutecu pocircvodnej nefragmentovanej DNA

Pyrosekvenovanie je podobne ako Sangerova metoacuteda založenaacute na princiacutepe synteacutezy komplementaacuterneho vlaacutekna DNA avšak rozdiel je v tom že sa na detekciu inkorporaacutecie nukleotidu využiacuteva inyacute systeacutem tvorby luminiscenčneacuteho signaacutelu v priebehu reakcie Pyrosekvenovanie je umožneneacute vďaka aktivite 4 enzyacutemov - DNA polymeraacutezy ATP sulfurylaacutezy luciferaacutezy a apyraacutezy Reakčnaacute zmes obsahuje aj ďalšie komponenty - enzymatickeacute substraacutety adenoziacutenfosfosulfaacutet (APS) d-luciferiacuten sekvenovanyacute templaacutet a cyklicky postupne po jednom type pridaacutevaneacute nukleotidtrifosfaacutety Po zabudovaniacute nukleotidu do novovznikajuacuteceho reťazca docircjde k uvoľneniu pyrofosfaacutetu naacutesledne je využityacute ATP sulfurylaacutezou na synteacutezu ATP z APS počas ďalšej reakcie docircjde k využitiu ATP luciferaacutezou na premenu luciferiacutenu na oxyluciferiacuten čo spocircsobiacute svetelnyacute signaacutel a ten zaznamenaacute detekčnyacute systeacutem Poslednou enzymatickou reakciou je reakcia apyraacutezy ktoraacute odstraacuteni nezainkorporovaneacute nukleotidy a nevyužiteacute ATP aby sa celyacute proces mohol zopakovať s reakčnou zmesou obsahujuacutecou ďalšiacute nukleotidtrifosfaacutet (inyacute ako v predchaacutedzajuacutecej reakcii) Po každej reakcii detektor zaznamenaacuteva emisiu svetla na zaacuteklade intenzity svetla je možneacute určiť či bol vradenyacute priacuteslušnyacute nukleotidtrifosfaacutet či bol inkorporovanyacute jeden priacutepadne viac rovnakyacutech nukleotidtrifosfaacutetov

Zvyacutešenie vyacutekonu pyrosekvenovania umožnila tzv emulznaacute PCR v mikročasticiach a použitie platničky PicoTiterPlatereg toto sekvenovanie zaviedla firma Roche pod pojmom 454 pyrosekvenovanie v roku 2005 Na začiatku sa DNA fragmentuje na uacuteseky dlheacute 400-600 baacutez dvojvlaacuteknovaacute fragmentovanaacute DNA sa liguje s adapteacutermi prostredniacutectvom nich sa naviaže na mikročastice dvojvlaacuteknoveacute fragmenty sa oddelia mikročastice s naviazanyacutemi jednovlaacuteknovyacutemi fragmentami sa premiešajuacute so zmesou oleja a roztoku ktoryacute obsahuje všetky komponenty na uacutespešnuacute PCR Tyacutemto spocircsobom sa okolo každej mikročastice vytvoriacute vlastnyacute mikroreaktor v ktorom prebehne amplifikaacutecia fragmentu Po PCR reakcii sa mikročastice prenesuacute do platničky PicoTiterPlate v ktorej sa do jamky zmestiacute akuraacutet jedna mikročastica a reakčneacute komponenty pyrosekvenačnej reakcie PicoTiterPlatereg maacute 1 600 000 jamiek každaacute jamka maacute maximaacutelny objem 75 picolitra Platnička s mikročasticami sa vložiacute do sekvenačneacuteho systeacutemu ndash priacutestroja v ktorom sa celeacute pyrosekvenovanie uskutočniacute Chemiluminiscenčneacute signaacutely ktoryacutech počas sekvenovania vznikajuacute milioacuteny v priebehu hodiny suacute zachyteneacute CCD kamerou a analyzovaneacute softveacuterom

Firma Illumina predstavila inuacute technoloacutegiu PCR amplifikaacutecia a sekvenovanie sa uskutočňuje na skliacutečku (flow cell) Fragmentaacutecia DNA a pripojenie adapteacuterov prebieha za uacutečasti transpozoacutemov v procese nazvanom tagmentaacutecia Po hybridizaacutecii fragmentov DNA na skliacutečko prebehne v klastroch PCR amplifikaacutecia (tzv mostiacutekovaacute amplifikaacutecia) sekvenaacutecia prebieha za uacutečasti rozdielne fluorescenčne značenyacutech a chemicky modifikovanyacutech nukleotidov pričom každyacute nukleotid emituje fluorescenciu s inou vlnovou dĺžkou Na skliacutečku prebieha paralelne až 6 miliaacuterd sekvenaacutecii (obr 32)

Ďalšiacutemi možnosťami sekvenovania druhej generaacutecie je systeacutem SOLid (vyvinutyacute firmou Applied Biosystem dnes pod Thermo Fisher Scientific) a Ion Semiconductor Sequencing ndash polovodičoveacute ioacutenoveacute sekvenovanie (od firmy Ion Semiconductor Sequencing v suacutečasnosti Thermo Fisher Scientific)

36

Obr 32 Princiacutep sekvenovania novej generaacutecie od firmy Illumina PCR amplifikaacutecia a sekvenovanie sa uskutočňuje na skliacutečku (flow cell) paralelne prebieha až 6 miliaacuterd sekvenaacutecii

632 Sekvenovanie tretej generaacutecie

Pred sekvenovaniacutem netreba amplifikovať DNA PCR metoacutedou ale sekvencia sa ziacuteskava zachyteniacutem signaacutelu v reaacutelnom čase Medzi sekvenovanie tretej generaacutecie patriacute SMRT (Single Molecule Real-Time Sequencing) a Nanopore Sequencing

37

7 Fragmentačnaacute analyacuteza DNA

Je metoacuteda použiacutevanaacute na určenie veľkosti fragmentov DNA ziacuteskanyacutech PCR reakciou Dĺžka amplifikovanyacutech DNA fragmentov sa zistiacute ich porovnaniacutem s veľkostnyacutem štandardom (obr 33) ktoryacute je tvorenyacute DNA fragmentami znaacutemej dĺžky Veľkostnyacute štandard je pred kapilaacuternou elektroforeacutezou zmiešanyacute so vzorkou DNA fragmenty veľkostneacuteho štandardu suacute fluorescenčne označeneacute pričom použiteacute fluorescenčneacute farbivo je ineacute ako fluorescenčneacute farbivo použiteacute na označenie DNA fragmentov vo vyšetrovanej vzorke

Obr 33 Elektroforetogram veľkostneacuteho štandardu použiacutevaneacuteho na určenie veľkostiacute fragmentov analyzovanyacutech kapilaacuternou elektroforeacutezou v genetickom analyzaacutetore (GeneScantrade 500 LIZtrade dye Size Standard) dĺžka fragmentov v nukleotidoch (napr 50 nukleotidov)

Fragmentačnaacute analyacuteza pozostaacuteva z viaceryacutech krokov Prvyacutem je izolaacutecia DNA nasleduje PCR amplifikaacutecia počas ktorej sa novosyntetizovaneacute DNA fragmenty označia fluorescenčnyacutemi farbivami Vzorka s PCR produktom sa pripraviacute na kapilaacuternu elektroforeacutezu tak že sa zmieša s veľkostnyacutem štandardom (sluacuteži na určenie veľkosti fragmentov) a denaturačnou laacutetkou (formamid) nasleduje denaturaacutecia Pripraveneacute vzorky suacute injektovaneacute do priacutestroja (genetickyacute analyzaacutetor) kde v kapilaacutere naplnenej polymeacuterom v elektrickom poli migrujuacute fluorescenčne značeneacute fragmenty DNA na zaacuteklade veľkosti (kapilaacuterna elektroforeacuteza) Počas elektroforeacutezy genetickyacute analyzaacutetor zaznamenaacuteva fluorescenciu fragmentov Analyacutezou daacutet prostredniacutectvom špeciaacutelnych softveacuterov sa ziacuteskajuacute elektroforetogramy z ktoryacutech je možneacute zistiť veľkosť fragmentov ako aj typ fluorescencie (docircležiteacute ak suacute genetickeacute varianty rozliacutešiteľneacute rocircznou fluorescenciou napr SNaPshot) Fragmentačnaacute analyacuteza je suacutečasťou množstva molekulaacuterno-genetickyacutech metoacuted (pozri obr 12 26 28 29 34) ako suacute napr STR analyacuteza (Short Tandem Repeat) AFLP analyacuteza (Amplified Fragment Lenght Polymorfism) RFLPT-RFLP analyacuteza (Restriction Fragment Lenght PolymorfismTerminal Restricted Fragment Lenght Polymorfism) SSCP (Single Strand Conformation Polymorfism) VNTR (Variable Number of Tandem Repeat) analyacuteza straty heterozygotnosti (LOH loss of heterozygozity) MLPA (Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification) MSMSA (Methylation-Sensitive Mobility Shift Assay) SNP genotypovanie (SNaPshotreg) HiCEP (High-Coverage Expression Profiling)

38

Obr 34 Kvantitatiacutevna fragmentačnaacute PCR analyacuteza (QF-PCR) DNA izolovanej z plodovej vody vyacutesledok prenataacutelnej analyacutezy = priacutetomnosť troch piacutekov pre chromozoacutem 18 (u všetkyacutech fragmentov detegujuacutecich chromozoacutem 18 je pomer vyšetrovanyacutech markerov aberantnyacute 21 resp 111) čo znamenaacute trizoacutemiu chromozoacutemu 18 Edwardsov syndroacutem

39

8 Metoacutedy založeneacute na princiacutepe hybridizaacutecie

Nukleoveacute kyseliny majuacute schopnosť vytvaacuterať dvojvlaacuteknoveacute reťazce z jednovlaacuteknovyacutech molekuacutel na zaacuteklade komplementarity baacutez Komplementarita baacutez umožňuje replikaacuteciu DNA transkripciu RNA komplementarita baacutez zabezpečuje teda reprodukovateľnosť živej hmoty

Hybridizaacutecia je proces v ktorom na zaacuteklade komplementarity baacutez dochaacutedza k vytvoreniu dvojvlaacuteknovej nukleovej kyseliny z dvoch jednovlaacuteknovyacutech molekuacutel DNA alebo RNA alebo ich kombinaacuteciou DNA RNA pričom kratšia jednovlaacuteknovaacute nukleovaacute kyselina vystupuje ako sonda (proacuteba) Hybridizaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten je jeden z najpoužiacutevanejšiacutech naacutestrojov v molekulaacuternej bioloacutegii a genetike (hybridizaacutecia primerov alebo proacuteb sa využiacuteva v takmer každej metoacutede - v PCR RT-PCR qPCR RT-qPCR MLPA sekvenovaniacute fragmentačnej analyacuteze FISH DNA mikročipoch atď)

Denaturaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten je proces pri ktorom dochaacutedza k porušeniu vodiacutekovyacutech vaumlzieb medzi vlaacuteknami nukleovyacutech kyseliacuten (strata sekundaacuternej a terciaacutelnej štruktuacutery) tak že docircjde k ich uacuteplneacutemu oddeleniu vzniknuacute jednovlaacuteknoveacute reťazce Denaturaacutecia NK mocircže byť spocircsobenaacute vplyvom vysokyacutech teplocirct pH alebo chemickyacutech laacutetok (denaturačneacute činidlaacute) Renaturaacutecia je opačnyacute proces v ktorom na zaacuteklade komplementarity dochaacutedza k tvorbe dvojvlaacuteknovyacutech NK

Hybridiza čnaacute sonda (proacuteba) je jednovlaacuteknovaacute nukleovaacute kyselina určitej znaacutemej dĺžky a sekvencie (najčastejšie DNA pretože je stabilnejšia ako RNA) ktoraacute je značenaacute a sluacuteži na detekciu komplementaacuternych molekuacutel DNA alebo RNA v procese hybridizaacutecie V zaacutevislosti od podmienok hybridizaacutecie (stringencia) mocircže byť detegovanaacute sekvencia uacuteplne komplementaacuterna alebo v menej priacutesnych podmienkach mocircže mať sekvenčneacute odchyacutelky Proacuteba sluacuteži na vyhľadanie a zviditeľnenie cieľovyacutech NK Zviditeľnenie sa deje prostredniacutectvom označenia proacuteby ešte pred hybridizaacuteciou Značenie proacuteby mocircže byť raacutedioaktiacutevne a neraacutedioaktiacutevne (najčastejšie fluorescenčneacute)

Raacutedioaktiacutevne značeneacute proacuteby pomocou izotopov (32P) sa využiacutevali viac v minulosti v suacutečasnosti suacute kvocircli zdravotnyacutem rizikaacutem ohľaduplnosti k životneacutemu prostrediu ako aj kvocircli jednoduchšej manipulaacutecii použiacutevaneacute fluorescenčne značeneacute proacuteby Raacutedioaktiacutevne značeneacute sondy boli použiacutevaneacute hlavne metoacutedou Southernovej hybridizaacutecie (Southern blotting Southern blot) Citlivosť raacutedioaktiacutevne značenyacutech proacuteb je vyššia dosahuje schopnosť zachytiť 10 fg (femtogram 10-15) cieľovej DNA sekvencie 81 Southern blot

Metoacutedu objavil v roku 1975 britskyacute bioloacuteg Edwin Southern (preto Southern) Pri Southernovej hybridizaacutecii sa restrikčne štiepeneacute fragmenty DNA elektroforeticky separujuacute v geacuteli potom sa metoacutedou blottingu prenesuacute na nylonovuacute alebo nitroceluloacutezovuacute membraacutenu kde suacute naacutesledne hybridizovaneacute v roztoku obsahujuacutecom raacutedioaktiacutevne značenuacute sondu Priloženiacutem fotografickeacuteho filmu k membraacutene a vyvolaniacutem filmu autoraacutediografiou docircjde k zviditeľneniu lokaliacutet kde došlo k hybridizaacuteciiacute raacutedioaktiacutevne značenej sondy s fragmentom DNA (autoraacutediogram) Southern blot bol kľuacutečovou a prvou metoacutedou na identifikaacuteciu osocircb (DNA fingerprinting DNA pofiling) (obr 35)

Okrem Southern blotu existuje Northern blot na analyacutezu RNA (geacutenovej expresie) a Western blot na analyacutezu proteiacutenov postup je obdobnyacute ako pri Southern blote s obmenami špecifickyacutemi pre konkreacutetny blot Pri Northern blote sa použiacutevajuacute hybridizačneacute proacuteby ale pre vizualizaacuteciu proteiacutenov western blotom je potrebneacute použiť protilaacutetky s naacuteslednou vizualizaacuteciou Pomenovanie techniacutek je hra so sloviacutečkami (keďže paacuten Northern ani Western neobjavili takto nazvaneacute techniky)

Neraacutedioaktiacutevne značenie proacuteb použiacutevanyacutech v molekulaacuternej genetike mocircže byť nepriame (použitie haptenu) alebo priame Konečnaacute vizualizaacutecia je najčastejšie zabezpečenaacute fluoreskujuacutecimi farebnyacutemi značkami farbivami fluorochroacutemami (fluorofoacuterami) Pri priamom značeniacute je farbička kovalentne naviazanaacute na nukleotid a na zachytenie fluorescencie suacute potrebneacute špeciaacutelne priacutestroje umožňujuacutece excitaacuteciu farbičky ktoraacute potom emituje žiarenie určitej vlnovej dĺžky (emisneacute žiarenie) a to zachytiacute detekčnyacute systeacutem priacutestroja Využitie fluorochroacutemov v molekulaacuternej genetike je masiacutevne napr na vizualizaacuteciu NK elektroforeticky separovanyacutech v geacuteli kvantifikaacuteciu produktov PCR reakcie v priacutestroji real-time PCR cykleacuter sekvenovaniacute fragmentačnej analyacuteze FISH DNA mikročipoch atď

40

Obr 35 Princiacutep Southern blotu

82 FISH (fluorescenčnaacute in situ hybridizaacutecia)

FISH (fluorescent in situ hybridization fluorescenčnaacute in situ hybridizaacutecia) metoacuteda patriacute medzi molekulovo-cytogenetickeacute techniky Princiacutep FISH metoacutedy je založenyacute na hybridizaacuteciiacute fluorescenčne značenyacutech proacuteb ku komplementaacuternym uacutesekom vyšetrovanej DNA na podložnom skle (priamo na mieste - in situ) K denaturaacutecii dsDNA dochaacutedza buď vplyvom denaturačnyacutech činidiel alebo zvyacutešenou teplotou a naacuteslednou renaturaacuteciou dochaacutedza k naviazaniu sondy na komplementaacuterny uacutesek DNA Vyacutesledok hybridizaacutecie sa vizualizuje fluorescenčnyacutem mikroskopom vybavenyacutem vhodnyacutemi fluorescenčnyacutemi filtrami a vizuaacutelne zhodnotiacute skuacutesenyacutem odborniacutekom Fluorescencia sa v niektoryacutech priacutepadoch mocircže zaznamenať a hodnotiť aj pomocou softveacuteru (obr 36)

Pomocou FISH detegujeme numerickeacute aberaacutecie - zmeny v počte chromozoacutemov (napr trizoacutemia monozoacutemia chromozoacutemov) alebo štruktuacuterne aberaacutecie a prestavby (napr translokaacutecie inverzie deleacutecie duplikaacutecie amplifikaacutecie) FISH metoacuteda umožňuje identifikaacuteciu a detekciu každeacuteho ľudskeacuteho chromozoacutemu jeho zaradenie do karyotypu odhalenie malyacutech submikroskopickyacutech chromozoacutemovyacutech zmien a tiež mapovať poziacutecie jednotlivyacutech geacutenov na chromozoacuteme

41

Obr 36 Princiacutep štandardnej FISH a FISH maľovania celeacuteho chromozoacutemu

Veľkou vyacutehodou FISH metoacutedy je možnosť analyacutezy buniek v metafaacuteze aj v interfaacuteze kedy nie je nutnaacute kultivaacutecia buniek a tiež ryacutechle analyzovanie veľkeacuteho počtu buniek (stovky až tisiacutece) K ďalšiacutem vyacutehodaacutem patriacute bezpečnosť vysokaacute citlivosť dostatočnaacute stabilita relatiacutevne kraacutetky čas hybridizaacutecie a možnosť ryacutechleho vyhodnotenia Hybridizaacutecia pri vaumlčšine suacutečasne dodaacutevanyacutech sond trvaacute 10-12 hodin (na trhu suacute už dostupneacute aj sondy so skraacutetenyacutem časom hybridizaacutecie na 2-3 hodiny) Po hybridizaacuteciiacute nasleduje odmyacutevanie kedy pri priacuteslušnej teplote dochaacutedza k odmytiu nenaviazanyacutech a nespraacutevne hybridizovanyacutech sond Preparaacutet sa naacutesledne podfarbiacute a vyacutesledok sa zhodnotiacute vo fluorescenčnom mikroskope Na podfarbenie chromozoacutemov alebo jadier sa použiacuteva modreacute kontrastneacute farbivo DAPI (46-diamidino-2-fenylindol) ktoreacute maacute silneacute fluorescenčneacute vlastnosti dokaacuteže prechaacutedzať jadrovou membraacutenou a viazať sa na DNA Vyacutesledkom je modreacute zafarbenie ktoreacute vyacuteborne kontrastuje so signaacutelmi jednotlivyacutech sond

Limitujuacutecim faktorom FISH je možnosť identifikaacutecie len tyacutech uacutesekov DNA ku ktoryacutem suacute použiteacute sondy V jednej analyacuteze je možneacute použiť najviac 3 odlišne značeneacute sondy a tak zistiť priacutepadneacute abnormality len na 1 alebo na paacuter lokusoch Na relevantnuacute detekciu je potrebneacute mať vo vzorke 1-5 aberantnyacutech interfaacutezovyacutech jadier

FISH je možneacute uskutočniť na širokej škaacutele biologickeacuteho materiaacutelu na vzorkaacutech perifeacuternej krvi kostnej drene naacuteteroch choriovyacutech klkoch plodovej vode rocircznych druhov tkaniacutev natiacutevnych alebo zaliatych v parafiacutene na 1 bunke (predimplantačnaacute genetickaacute diagnostika PGD) (obr 37)

Využiacuteva sa na detekciu aberaacuteciiacute pri mnohyacutech onkologickyacutech ochoreniach (napr pri diagnoacuteze mnohopočetnyacute myeloacutem sa v suacutečasnosti po separaacutecii CD138+ buniek robiacute FISH s 5 sondami pre geacuteny IGH TP53 RB1 oblasť 1p321q21 a stanovuje sa hyperploidia chromozoacutemov 5 9 a 15) a tiež k spresneniu doplneniu a k overeniu bežneacuteho cytogenetickeacuteho vyšetrenia

Podľa miesta na chromozoacuteme na ktorom dochaacutedza k hybridizaacutecii sondy rozlišujeme 4 typy

DNA sond bull centromeacuteroveacute sondy ndash sa viažu na strednuacute časť chromozoacutemu ndash centromeacuteru sluacutežia k diagnostike zmien v počte chromozoacutemov k detekcii chromozoacutemov neznaacutemeho pocircvodu umožňujuacute interfaacuteznu FISH na nedeliacich sa bunkaacutech (obr 38-41)

42

Obr 37 Interfaacutezna FISH preimplantačnyacute genetickyacute skriacutening aneuploidiiacute ndash blastomeacutera 3-denneacuteho ľudskeacuteho embrya s normaacutelnym počtom chromozoacutemov 13 18 21 pohlavie XY použityacutech 5 sond pre chromozoacutemy 13 ndash orange 18 ndash aqua 21 ndash green X ndash blue a Y ndash yellow (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

Obr 38 Interfaacutezne jadro po hybridizaacutecii s centromeacuterovou sondou pre chromozoacutem 8 (Vysis Abbott) V pravom jadre je priacutetomnaacute trizoacutemia chromozoacutemu 8 (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex) Obr 39 Metafaacutezna (A) a interfaacutezna FISH (B) použitaacute centromeacuterovaacute sonda CEPX spectrum orangeCEPY spectrum green (Vysis Abbott) Sonda hybridizuje k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (červenyacute signaacutel) a Y (zelenyacute signaacutel) (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

43

Obr 40 Interfaacutezna FISH vyšetrenie spermiiacute použiteacute sondy CEPX greenCEPY orange (Aneuscore Metasystems) Sondy hybridizujuacute k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (zelenyacute signaacutel) Y (červenyacute signaacutel) vľavo ndash dve haploidneacute spermie (majuacutece jedna spermia X druhaacute Y chromozoacutem) vpravo ndash dve patologickeacute spermie obsahujuacutece gonozoacutemovyacute komplement XY (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

Obr 41 Interfaacutezna FISH vyšetrenie spermiiacute použiteacute sondy CEPX greenCEPY orange a CEP18 aqua (Aneuscore Metasystems) Sondy hybridizujuacute k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (zelenyacute signaacutel) Y (červenyacute signaacutel) a 18 (modryacute signaacutel) vľavo ndash normaacutelne haploidneacute ľudskeacute spermie - 1x chromozoacutem X alebo Y a jedenkraacutet chromozoacutem 18 v strede ndash patologickaacute spermia obsahujuacuteca gonozoacutemovyacute komplement XY a jeden chromozoacutem 18 vpravo ndash patologickaacute diploidnaacute spermia s chromozoacutemami X Y a dvoma chromozoacutemami 18 (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

bull lokusovo špecifickeacute sondy ndash hybridizaacutecia prebehne na konkreacutetnom mieste geacutenu (lokuse) (obr 42-44) použiacutevajuacute sa k vyšetreniu mikrodeleacuteciiacute (straty malyacutech častiacute chromozoacutemu pri mikrodelečnyacutech syndroacutemoch) k zisteniu amplifikaacutecie onkogeacutenov a niektoryacutech špecifickyacutech translokaacuteciiacute prestavby geacutenov umožňujuacute interfaacuteznu FISH na nedeliacich sa bunkaacutech bull subtelomeroveacute ndash vaumlzba na koncoveacute časti chromozoacutemu ndash telomeacutery bull celochromozoacutemoveacute alebo celomaľovacie sondy ndash sondy hybridizujuacute s mnohopočetnyacutemi chromozoacutemovyacutemi sekvenciami pričom sa fluorescenčne tak bdquovymaľujeldquo celyacute chromozoacutem (Obr 45) Použiacutevajuacute sa na vyšetrenie chromozoacutemovyacutech prestavieb k analyacuteze translokaacuteciiacute a k detekcii pocircvodu tzv marker chromozoacutemov (malyacutech nadpočetnyacutech chromozoacutemov neznaacutemeho pocircvodu) K použitiu sondy suacute potrebneacute metafaacutezne chromozoacutemy nepoužiacutevaju sa pre interfaacuteznu FISH

Pri konvenčnej chromozoacutemovej FISH suacute homogeacutenne DNA proacuteby hybridizovaneacute s fixovanyacutem metafaacuteznym alebo prometafaacuteznym chromozoacutemomchromozoacutemami na skliacutečku (Obr 36a) Maximaacutelna rozlišovacia schopnosť metafaacuteznej FISH je niekoľko megabaacutez (Obr 39a 45) využitiacutem viac

44

natiahnutyacutech prometafaacuteznych chromozoacutemov sa dosiahne 1 Mb rozliacutešenie Prostredniacutectvom fiber FISH konkreacutetne artificiaacutelne deproteinizovanej natiahnutej DNA pripravenej in situ z celyacutech buniek na mikroskopickom skliacutečku je možneacute vizualizovať individuaacutelne geacuteny maleacute DNA elementy na chromozoacuteme s rozliacutešeniacutem okolo 1000 bp

Obr 42 Interfaacutezne jadro po hybridizaacutecii s lokusovo-špecifickou sondou LSI 5q31 Spectrum Orange5p12 Spectrum Green (Vysis Abbott) Na ľavom obraacutezku suacute priacutetomneacute dva červeneacute (5q31) a dva zeleneacute signaacutely (5p12) v pravom jadre je priacutetomnaacute deleacutecia 5q31 oblasti chyacuteba jeden červenyacute signal (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

Obr 43 Interfaacutezna FISH použitaacute lokusovo-špecifickaacute sonda ndash translokačnaacute - XL BCRABL1 plus (Metasystems) dvojfarebnaacute dvojfuacutezna kde červenaacute označuje lokus ABL1 na chromozoacuteme 9 a zelenaacute oblasť BCR na chromozoacuteme 22 Sonda deteguje fuacuteziu protoonkogeacutenu ABL1 (9q34) a geacutenu BCR (22q11) v priacutepade že červenyacute a zelenyacute signaacutel suacute pri sebe (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

45

Obr 44 Interfaacutezna FISH Použitaacute lokusovo-špecifickaacute sonda- typ break apart pre IGH geacuten V docircsledku translokaacutecie došlo k rozskočeniu geacutenu pričom translokačneacuteho partnera nepoznaacuteme vieme určiť len percento v koľkyacutech jadraacutech je geacuten prestavanyacute (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex) Obr 45 Použiteacute celochromozoacutemoveacute sondy WCP 15 (červenyacute chromozoacutem) a WCP 17 (zelenyacute chromozoacutem) Na metafaacuteze je potvrdenaacute reciprokaacute translokaacutecia t(1517)(q2221) (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

FISH vizualizaacutecia celeacuteho chromozoacutemu maľovanie chromozoacutemu anglicky chromosome

painting je špeciaacutelnou aplikaacuteciou chromozoacutemovej FISH proacuteba je koktail veľkeacuteho počtu rocircznych fluorescenčne značenyacutech DNA fragmentov hybridizujuacutecich pozdĺž celeacuteho konkreacutetneho chromozoacutemu (obr 36b 45) bdquoChromosomepaintingldquo analyzuje metafaacutezne chromozoacutemy V minulosti bola FISH vizualizaacutecia celyacutech chromozoacutemov limitovanaacute malyacutem množstvom rocirczne sfarbenyacutech fluorochroacutemov

V suacutečasnosti je možneacute detegovať množstvo cieľovyacutech sekvenciiacute naraz čo sa využiacuteva pri celogenoacutemovej chromozoacutemovej vizualizaacutecii (whole-chromosomepainting - WCP) metoacutedou multiplex FISH (M-FISH multicolor FISH o br 46) alebo spektraacutelnej karyotypizaacutecie (SKY) kedy možno rozliacutešiť všetky ľudskeacute chromozoacutemy ndash teda 24 rocircznych chromozoacutemov M-FISH a SKY patria medzi metafaacutezne formy FISH diagnostiky ktoreacute umožňujuacute simultaacutennu vizualizaacuteciu všetkyacutech ľudskyacutech chromozoacutemov v rocircznych farbaacutech čo predstavuje uľahčenie analyacutezy karyotypu hlavne pri komplexnyacutech zmenaacutech a markeroch neznaacutemeho pocircvodu Obe techniky vychaacutedzajuacute z použitia

46

celochromozoacutemovyacutech sond značenyacutech kombinaacuteciou viaceryacutech fluorochroacutemov Rozdiel medzi M-FISH a SKY spočiacuteva v technike ziacuteskania konečneacuteho obrazu

Obr 46 Multicolor FISH - každyacute chromozoacutemovyacute paacuter je zafarbenyacute inou farbou pričom na ich zafarbenie postačuje kombinaacutecia 5 fluorochroacutemov Na vyhodnocovanie je potrebnaacute špeciaacutelna sada fluorescenčnyacutech filtrov pre jednotliveacute fluorochroacutemy a špeciaacutelnyacute softweacuter Vľavo-štandardnyacute karyotyp vpravo karyotyp s mutaacuteciami (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

V molekulovej cytogenetike suacute komerčne dostupneacute sety M-FISH proacuteb umožňujuacutece

viacfarebneacute pruacutežkovanie chromozoacutemov (banding) s vysokyacutem rozliacutešeniacutem (multicolor-banding mBAND FISH MCB) čo umožňuje identifikaacuteciu intrachromozoacutemovyacutech prestavieb (Obr 47) Nevyhnutnosťou mBAND-u je mať chromozoacutemy v metafaacuteze Taacuteto metoacuteda bola prvyacutekraacutet uskutočnenaacute na chromozoacuteme 5 v roku 1999 mBAND FISH umožňuje rozliacutešiť špecifickeacute oblasti chromozoacutemov na uacuterovni pruacutežku - bandu a sub-bandu s detekciou 550 bandov haploidneacuteho karyotypu

Obr 47 A - mBAND chromozoacutemu 11 - inverzia duplikovanej oblasti 11q223-q25 B - mBAND chromozoacutemu 3 - na kruhovom chromozoacuteme deleacutecia oblasti 3p263 C - mBAND chromozoacutemu 2 - potvrdenie inverzie duplikovanej časti chromozoacutemu (poskytnuteacute RNDr Dagmar Landlovou Medirex)

FISH metoacuteda a jej varianty (M-FISH mBAND SKY) majuacute v suacutečasnosti širokeacute využitie v

klinickej genetike v onkologickej genetike na detekciu aberaacuteciiacute v čase diagnoacutezy počas liečby po

47

liečbe monitorovanie po transplantaacutecii kostnej drene v prenataacutelnej a postnataacutelnej diagnostike pri detekcii submikroskopickyacutech deleacuteciiacute (napr DiGeorge syndroacutem - 22q112 delečnyacute syndroacutem PraderndashWilli syndroacutem- chromozoacutem 15q11-13) prostredniacutectvom FISH je možnaacute detekcia numerickyacutech zmien chromozoacutemov (trizoacutemia chromozoacutemu 21 pri Downovom syndroacuteme trizoacutemia chromozoacutemu 15 pri Patauovom syndroacuteme trizoacutemia chromozoacutemu 18 pri Edwardsovom syndroacuteme) rocirczne zmeny v počte pohlavnyacutech chromozoacutemov (monozoacutemia X pri Turnerovom syndroacuteme Klinefelterov syndroacutem s X chromozoacutemom naviac - XXY) podobne v predimplantačnej diagnostike

83 DNA Microarray (DNA mikro čip biočip) DNA mikročipovanie je technika využiacutevajuacuteca hybridizaacuteciu skuacutemanej nukleovej kyseliny

(cieľovaacute vzorka) s veľkyacutem množstvom oligonukleotidovyacutech proacuteb (desať tisiacutec až milioacuten) ktoreacute suacute prichyteneacute na pevnyacute podklad najčastejšie sklenyacute silikoacutenovyacute alebo nylonovyacute (doštička čip) Skuacutemanaacute nukleovaacute kyselina je pred hybridizaacuteciou fragmentovanaacute označenaacute fluorofoacuterom a denaturovanaacute Po kontakte čipu s cieľovou vzorkou ktoraacute je vlastne zmes označenyacutech oligonukleotidov značeneacute oligonukleotidy hybridizujuacute s oligonukleotidovyacutemi sekvenciami prichytenyacutemi na čipe Potom suacute na zaacuteklade fluorescencie detekovaneacute miesta kde došlo k hybridizaacutecii čiže vzorka obsahovala takuacuteto nukleotidovuacute sekvenciu Z jedneacuteho mikročipu sa ziacuteska obrovskeacute množstvo daacutet ktoreacute je vždy nutneacute softveacuterovo spracovať V dnešnej dobe existuje niekoľko firiem poskytujuacutecich komerčne mikročipy na objednaacutevku alebo si ich laboratoacuteria produkujuacute sami

Mikročipovanie prebieha nasledovne

1) Vytvorenie DNA čipu ndash tisiacutece rocircznych jednovlaacuteknovyacutech DNA oligonukleotidov znaacutemych sekvencii sa kovalentne naviažu na povrch doštičky vždy v určitej lokalite je niekoľko rovnakyacutech oligonukleotidov veľkosť takejto lokality je ˂ 200 microm Proacutebami mocircže byť DNA cDNA alebo syntetizovaneacute oligonukleotidy Už hotoveacute mikročipy ponuacutekajuacute viacereacute firmy (Affymetrix Agilent Technologies Eppendorf Illumina) alebo si ich jednotliveacute laboratoacuteria vyraacutebajuacute sami pomocou robotickyacutech zariadeniacute DNA čip sa vytvaacutera buď nanaacutešaniacutem kvapiek oligonukleotidov na podklad alebo synteacutezou oligonukleotidov in situ na čipe 2) Priacuteprava vzorky ndash nukleovaacute kyselina (mRNA DNA) sa purifikuje určiacute sa jej kvantita a kvalita (spektrofotometericky) fragmentuje resp v priacutepade mRNA sa syntetizuje cDNA v priacutepade potreby sa mocircže DNA amplifikovať PCR reakciou štiepiť restrikčnyacutemi endonukleaacutezami 3) Fluorescenčneacute označenie (zriedkavejšie raacutedioaktiacutevne) fragmentov DNA prebieha počas reverznej transkripcie alebo PCR amplifikaacutecie za uacutečasti fluorescenčne značenyacutech nukleotidov Keď sa analyzujuacute dve rocirczne vzorky napr zdraveacute tkanivo a naacutedoroveacute tkanivo označenie nukleovyacutech kyseliacuten v tyacutechto tkanivaacutech byacuteva rozdielne a to použitiacutem dvoch rocircznych fluorescenčnyacutech farbiacutev (napr zeleneacute a červeneacute) Pred hybridizaacuteciou je potrebneacute vzorku denaturovať čiacutem sa vytvoriacute zmes jednovlaacuteknovyacutech DNA označenyacutech značkou 4) Hybridizaacutecia s mikročipom ndash v špeciaacutelnom hybridizačnom roztoku hybridizujuacute komplementaacuterne sekvencie zo vzorky s priacuteslušnyacutemi oligonukleotidovyacutemi sondami naviazanyacutemi na čipe Potom sa čip obmyje aby došlo k odstraacuteneniu čiastočne hybridizovanyacutech nukleovyacutech kyseliacuten 5) Skenovanie mikročipu ndash skenerom čipov docircjde k ožiareniu čipu laserom pričom v mieste hybridizaacutecie fluorescenčne značenyacutech DNA fragmentov s proacutebou docircjde k emisii svetla určitej vlnovej dĺžky ktoruacute skener zaznamenaacute 6) Analyacuteza daacutet prebieha metoacutedami bioinformatiky spracovaniacutem softveacutermi sa zistiacute ktoreacute lokality čipu navzaacutejom hybridizovali v priacutepade použitia dvoch vzoriek kontrolnej a skuacutemanej je možneacute analyzovať ich relatiacutevnu intenzitu hybridizaacutecie (expresie určiteacuteho geacutenu)

Existujuacute štyri typy mikročipov 1) Čipy ur čeneacute na analyacutezu expresie (obsahujuacute cDNA proacuteby) pre tzv dvojkanaacutelovyacute experiment kedy je vzorka určenaacute k hybridizaacutecii na čipe ziacuteskanaacute zmiešaniacutem DNA fragmentov kontrolnej a skuacutemanej vzorky pričom fragmenty suacute rozdielne fluorescenčne označeneacute (napr zelenyacute fluorofoacuter pre kontrolnuacute vzorku a červenyacute pre skuacutemanuacute) Na zaacuteklade intenzity a typu fluorescencie sa deteguje expresia geacutenov typickaacute pre kontrolnuacute vzorku (napr zelenaacute fluorescencia) pre skuacutemanuacute vzorku (napr

48

červenaacute fluorescencia) a expresia podobnaacute u oboch vzoriek (žltaacute fluorescencia) neexprimovaneacute geacuteny (čierna fluorescencia) rocirczne odtiene (v zaacutevislosti od prevažujuacutecej hybridizaacutecie) (obr 48) 2) Čipy ur čeneacute na analyacutezu mutaacutecii použije sa genoacutemovaacute DNA označenaacute jednou fluorescenčnou farbičkou na určenie jednonukleotidovej zmeny (SNP ndash Single Nukleotide Polymorphism) 3) Čipy na komparatiacutevnu genoacutemovuacute hybridizaacuteciu (aCGH array Comparative Genomic Hybridization) ndash použiacutevaneacute na zistenie zvyacutešenia alebo zniacuteženia množstva chromozoacutemovyacutech fragmentov obsahujuacutecich geacuteny zodpovedneacute za určiteacute ochorenie Na analyacutezu sa použije skuacutemanaacute gDNA a referenčnaacute (kontrolnaacute) DNA každaacute sa značiacute inou fluorescenčnou farbičkou (princiacutep ako pri analyacuteze expresie) (obr 49 50) 4) Čipy CGH - SNP kombinovaneacute čipy ur čeneacute na analyacutezu aj mutaacuteciiacute SNP aj na komparatiacutevnu genoacutemovuacute hybridizaacuteciu CGH

Mikročipy majuacute rozsiahle využitie napriacuteklad v identifikaacuteciiacute novyacutech geacutenov vo vyacuteskume ich funkciiacute expresie v rocircznych podmienkach pri diagnostike mnohyacutech ochoreniacute vo farmakogenomike vo vyacuteskume vplyvu toxiacutenov

Obr 48 Heatmapa geacutenovej expresie vybranyacutech geacutenov (mRNA) mikročip obsahuje 46000 cDNA proacuteb (poskytnuteacute Ing Helenou Gbelcovou PhD Uacutestav lekaacuterskej bioloacutegie genetiky a klinickej genetiky LF UK a UNB)

49

Obr 49 Princiacutep komparatiacutevnej genoacutemovej hybridizaacutecie (aCGH - array comparative genomic hybridization) Obr 50 A) Vyacutesledok komparatiacutevnej genoacutemovej hybridizaacutecie (aCGH - array comparative genomic hybridization) vzorky DNA izolovanej plodovej vody U plodu s abnormaacutelnym ultrasonografickyacutem vyšetreniacutem bola identifikovanaacute duplikaacutecia oblasti 3q261q29 (modryacute paacutes) a deleacutecia oblasti 5p1533p151 (červenyacute paacutes) Pre porovnanie chromozoacutem 1 bez aberaacutecie b) Ten istyacute pacient ale ineacute softveacuteroveacute spracovanie (poskytnuteacute RNDr Miroslavom Tomkom PhD Medirex)

50

Odporuacutečanaacute a použitaacute literatuacutera

Odborneacute knihy Klug W S Cummings M R Spencer Ch A Palladino M A Concepts of Genetics jedenaacuteste vydanie (2015) Carson S Molecular Biology Techniques tretie vydanie (2012) Strachan T Read A Human Molecular Genetics štvrteacute vydanie (2011) Sudbery P Sudbery I Human Molecular Genetics tretie vydanie (2009)

Internetoveacute straacutenky

wwwncbinlmnihgov wwwmlpacom wwwthermofishercom wwwilluminacom wwwpromegask wwwqiagencom wwwambioncom

Odborneacute člaacutenky Chacon-Cortes D Griffiths L R Methods for extracting genomic DNA from whole blood samples current perspectives Journal of Biorepository Science for Applied Medicine Volume 2 strany 1- 9 Viltrop T Krjutskov K Palta P Metspalu A Comparison of DNA extraction methods for multiplex polymerase chain reaction Anal Biochem 2010 Volume 398(2) strany 260-262 Ing Martin Čermaacutek Molekulaacuterna cytogenetika v problematike familiaacuternych maligniacutet Onkoloacutegia Volume 2 strany 77 - 83 Livak KJ Schmittgen TD Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method Methods 2001 Volume 25(4) strany 402 - 408 Bustin S A Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays J Mol Endocrinol 2000 Volume 25(2) strany169 - 193

MOLEKULAacuteRNE METOacuteDY AKTUAacuteLNE POUŽIacuteVANEacute V KLINICKEJ GENETIKE RNDr Andrea Pastoraacutekovaacute PhD RNDr Robert Petrovič PhD Vydala Univerzita Komenskeacuteho v Bratislave Lekaacuterska fakulta Rozsah 50 straacuten 246 AH prveacute vydanie ISBN 978-80-223-4231-5

27

Obr 25 Princiacutep metoacutedy PCR-RFLP

43 VNTR a STR V geacutenome suacute priacutetomneacute dva typy tandemovyacutech (za sebou nasledujuacutecich) opakovaniacute

1) minisatelity ndash nazyacutevaneacute variabilnyacute počet tandemovyacutech opakovaniacute VNTR (variable number of tandem repeats) 2) mikrosatelity tiež kraacutetke tandemoveacute repetiacutecie STR (short tandem repeats)

Obidva tieto typy satelitnej DNA suacute rozmiestneneacute po celom genoacuteme suacute využiacutevaneacute hlavne vo forenznej genetike na identifikaacuteciu osocircb a určenie otcovstva popriacutepade materstva ale aj v mediciacutene na detekciu chromozoacutemovyacutech aneuploidiiacute Štruktuacutera obidvoch je podobnaacute Rozdiel medzi jednotlivyacutemi alelami je spocircsobenyacute rozdielnym počtom opakovaniacute opakujuacutecej sa sekvencie (motiacutevu) čo spocircsobiacute rocircznu dĺžku alel s rocircznym počtom tandemovyacutech opakovaniacute nazyacutevanuacute polymorfizmus dĺžky fragmentov

VNTR ndash variabilnyacute počet tandemovyacutech opakovaniacute pričom opakujuacuteca sa sekvencia maacute dĺžku od 6 do 100 baacutez pričom sa mocircže opakovať aj tisiacutece kraacutet alely tak mocircžu mať od 500do 30 000 baacutez VNTR boli v kombinaacutecii s RFLP (DNA fingerprinting ) prvyacutem polymorfizmom použiacutevanyacutem na zistenie DNA profilov a identifikaacuteciu osocircb v kriminalistickej praxi V suacutečasnosti jeho využitie v kriminalistike je kvocircli potrebe relatiacutevne veľkeacuteho množstva DNA nahradeneacute využitiacutem STR

STR - kraacutetke tandemoveacute repetiacutecie suacute v kriminalistike najčastejšie použiacutevanyacutem polymorfizmom STR lokusy suacute rozmiestneneacute po celom genoacuteme repetiacutecia obsahuje jednu až šesť baacutez pričom jej opakovaniacutem vznikne STR v rozsahu od 50 do 300bp V našom genoacuteme suacute tisiacutece STR ktoreacute mocircžu byť použiteacute pre forenznuacute analyacutezu V kriminalistike sa v suacutečasnosti na identifikaacuteciu osocircb použiacuteva 13 STR locusov ktoreacute patria k medzinaacuterodne uznaacutevanyacutem štandardom Z iniciatiacutevy FBI bola vytvorenaacute databaacuteza CODIS (Combined DNA Index System) každaacute krajina maacute svoju databaacutezu CODIS kde je možneacute vložiť a archivovať DNA profily jednotlivcov ako aj profily DNA ziacuteskanyacutech z miest kriminaacutelneho činu v databaacuteze je ich možneacute navzaacutejom porovnať a tak zistiť pocircvodcu trestneacuteho činu Medzinaacuterodnaacute jednotnosť v použiacutevaniacute CODIS STR lokusov umožňuje v priacutepade potreby vzaacutejomneacute porovnanie DNA profilov zistenyacutech na uacutezemiacute rocircznych štaacutetov CODIS STR lokusov je 13 a suacute to CSF1PO FGA TH01 TPOX VWA D3S1358 D5S818 D7S820 D8S1179 D13S317 D16S539 D18S51 a D21S11 Zistenie DNA profilu sa uskutočniacute multiplexnou PCR reakciou s fluorescenčne značenyacutemi primermi špecifickyacutemi pre konkreacutetny STR Naacutesledne suacute PCR produkty analyzovaneacute kapilaacuternou elektroforeacutezou genetickyacutem analyzaacutetorom ktoryacute rozliacuteši amplifikovaneacute fragmenty na zaacuteklade fluorescencie a dĺžky (fragmentačnaacute analyacuteza) (obr 26 Tab 3) DNA profil každeacuteho človeka je jedinečnyacute rovnakyacute profil mocircžu mať len jednovaječneacute dvojčataacute

28

Obr 26 Ukaacutežka DNA profilu človeka 15 STR lokusov s určeniacutem pohlavia pomocou lokusu pre amelogeniacuten (ženskeacute pohlavie - XX) maleacute oranžoveacute piacuteky predstavujuacute fragmenty veľkostneacuteho štandardu Tabuľka č 3 Zaacutepis DNA profilu človeka z obraacutezka č 26 15 STR lokusov s určeniacutem pohlavia pomocou lokusu pre amelogeniacuten System Alela 1 Alela 2

D3S1358 16 17

TH01 9 93 D21S11 28 28

D18S51 15 18

Penta E 7 14 D5S818 9 12

D13S317 8 11

D7S820 8 11 D16S539 11 12

CSF1PO 10 11

Penta D 11 12 vWA 15 18

D8S1179 13 16

TPOX 8 9 FGA 20 21

amel X X

29

5 MLPA

Multiplexnaacute amplifikaacutecia proacuteb zaacutevislaacute od ligaacutecie (z angl multiplex ligation-dependent probe amplification) je metoacuteda schopnaacute v jednej reakcii (v jednej skuacutemavke a vzorke) detegovať zmeny v počte až 50 nukleotidovyacutech sekvenciiacute Metoacutedou MLPA je možneacute ryacutechlo identifikovať amplifikaacutecie (duplikaacutecie) a deleacutecie veľkeacuteho počtu geacutenov či už použitiacutem DNA alebo mRNA krvnyacutech vzoriek alebo vzoriek z naacutedorov

Princiacutep MLPA spočiacuteva v multiplexnej amplifikaacutecii 50 špecifickyacutech nukleotidovyacutech sekvenciiacute použitiacutem jedneacuteho paacuteru primerov pričom jeden primer je fluorescenčne označenyacute Vyacutesledneacute PCR produkty suacute analyzovaneacute kapilaacuternou elektroforeacutezou (fragmentačnaacute analyacuteza) Dĺžka každeacuteho namnoženeacuteho produktu je jedinečnaacute narastaacute postupne o 6 alebo 9 nukleotidov pričom produkty PCR suacute 120 ndash 500 nukleotidov dlheacute Tento veľkostnyacute rozsah PCR fragmentov (dĺžka 120-500 nukleotidov s naacuterastom postupne o 6 alebo 9 nukleotidov) je optimaacutelny pre kapilaacuternu elektroforeacutezu MLPA multiplexnaacute PCR prebieha za použitia iba jedineacuteho paacuteru primerov ktoreacute amplifikujuacute špecifickeacute sekvencie Trik spočiacuteva v tom že nedochaacutedza k amplifikaacutecii DNA sekvencie ale MLPA proacuteb ktoreacute suacute pridaneacute k vzorkaacutem Každaacute MLPA proacuteba pozostaacuteva z dvoch oligonukleotidov (dve hemiproacuteby) pričom každyacute oligonukleotid obsahuje jednu zo sekvencie rozpoznaacutevanuacute PCR primermi Proacuteba vznikne jedine za predpokladu hybridizaacutecie dvoch oligonukleotidov (hemiproacuteb) k cieľovej sekvencii (geacutenu) a po ligaacutecii enzyacutemom ligaacutezou Iba ligovaneacute proacuteby suacute exponenciaacutelne amplifikovaneacute pomocou jedneacuteho paacuteru primerov Množstvo zligovanyacutech proacuteb teda zaacutevisiacute od množstva cieľovyacutech sekvenciiacute (geacutenov) vo vzorke

Postup MLPA analyacutezy je nasledovnyacute (obr27) K vzorke nukleovej kyseliny (DNA resp mRNA) sa pridaacute zmes 50 jedinečnyacutech proacuteb každaacute

proacuteba je komplementaacuterna k určitej cieľovej sekvencii NK vzorky Každaacute proacuteba však pozostaacuteva z dvoch oligonukleotidov hybridizujuacutecich vedľa seba zaacuteroveň každyacute oligonukleotid (hemiproacuteba) obsahuje pridanuacute sekvenciu rozpoznaacutevanuacute paacuterom PCR primerov Po hybridizaacuteciiacute oligonukleotidov (hemiproacuteb) dochaacutedza k ich ligaacutecii ligaacutezou Ligačnaacute reakcia je tak špecifickaacute že je schopnaacute rozliacutešiť sekvenciu liacutešiacu sa v jednom nukleotide Vyacuteslednyacute ligačnyacute produkt (proacuteba) obsahuje obidve sekvencie pre PCR primery na jednom fragmente čiže mocircže docircjsť k namnoženiu takeacutehoto fragmentu PCR reakciou V priacutepade ak nedocircjde k ligaacutecii priacuteslušnyacutech hemiproacuteb pretože hemiproacuteby nenaacutejdu cieľovuacute sekvenciu na DNA každaacute takaacuteto nezligovanaacute hemiproacuteba maacute len jednu sekvenciu rozpoznaacutevanuacute len jednyacutem PCR primerom v docircsledku čoho nemocircže prebehnuacuteť jej PCR amplifikaacutecia a počas fragmentačnej analyacutezy nie je detegovanaacute pretože negeneruje fluorescenčnyacute signaacutel

Pri MLPA analyacuteze je docircležiteacute okrem MLPA amplifikaacutecie vzorky urobiť aj MLPA amplifikaacuteciu referenčnej vzorky ku ktorej sa bude porovnaacutevať počet geacutenov (cieľovyacutech sekvenciiacute) Po kapilaacuternej elektroforeacuteze MLPA referenčnej a skuacutemanej vzorky porovnaniacutem obsahu nameranyacutech hodnocirct tzv piacutekov priacuteslušnyacutech proacuteb sa určiacute relatiacutevny počet koacutepiiacute v skuacutemanej vzorke

MLPA

1 DNA denaturaacutecia a hybridizaacutecia s MLPA proacutebami (hemiproacuteby)

2 Ligaacutecia (vytvorenie kompletnyacutech proacuteb)

3 PCR amplifikaacutecia proacuteb paacuterom primerov

4 Kapilaacuterna elektroforetickaacute separaacutecia PCR produktov

5 Analyacuteza daacutet

30

Obr 27 Princiacutep MLPA

Firma MRC-Holland v suacutečasnosti ponuacuteka stovky MLPA setov proacuteb ktoreacute suacute vhodneacute na 1) diagnostiku kongenitaacutelnych a dedičnyacutech ochoreniacute 2) zisťovanie profilu naacutedorov 3) zisťovanie metylačneacuteho profilu

MLPA je metoacuteda vhodnaacute na detekciu malyacutech prestavieb (BRCA1 BRCA2 MSH2 atď)

veľkyacutech chromozoacutemovyacutech prestavieb (Williamsov syndroacutem Prader-WilliAngelman syndroacutem atzď)

31

detekciu zmien v počte koacutepii geacutenov (obr 28 29) ako aj zistenie počtu kompletnyacutech chromozoacutemov (chromozoacutem 13 18 21 XY tiež aj z amniovej tekutiny) diagnostiku naacutedorov (zmeny počtu pri ALL CLL atď) kvantifikaacuteciu metylaacutecie (Prader-WilliAngelmanov syndroacutem Fragilnyacute X inaktivaacutecia naacutedorovyacutech supresorovyacutech geacutenov atď) mRNA analyacutezu geacutenov zuacutečastňujuacutecich sa apoptoacutezy alebo zaacutepalov

MS-MLPA (Methylation-Specific MLPA) je varianta MLPA určenaacute špeciaacutelne na analyacutezu aberantnyacutech metylaacutecii imprintovanyacutech oblastiacute ako aj detekciu metylačnyacutech zmien CpG ostrovčekov lokalizovanyacutech bliacutezko promoacutetora Rozdiel oproti štandardnej MLPA spočiacuteva v použitiacute metylačne senzitiacutevneho restrikčneacuteho enzyacutemu HhaI ktoryacute štiepi MS-MLPA proacuteby hybridizovaneacute k nemetylovanej sekvencii Každaacute DNA vzorka určenaacute pre MS-MLPA analyacutezu prejde dvoma reakciami v jednej mikroskuacutemavke štandardnou MLPA analyacutezou (bez štiepenia metylačne senzitiacutevnym enzyacutemom) a v druhej mikroskuacutemavke docircjde okrem ligaacutecie proacuteb aj k metylačne senzitiacutevnemu štiepeniu hybridizovanyacutech proacuteb s nemetylovanou DNA Amplifikujuacute sa len ligovaneacute proacuteby po PCR amplifikaacutecii sa fragmentačnou analyacutezou porovnaniacutem oboch reakciiacute zistia rozdiely v metylačnom profile vzorky k referenčnej vzorke

RT-MLPA (Reverse Transkriptase MLPA) je variaacutecia MLPA určenaacute pre zistenie mRNA profilu vzorky je alternatiacutevou k real-time PCR a mikročipom RT-MLPA nedeteguje mRNA množstvo priamo pretože použiacutevanaacute ligaacuteza nie je schopnaacute ligovať DNA oligonukleotidy keď suacute hybridizovaneacute s RNA Preto RT-MLPA začiacutena reverznou transkripciou so špeciaacutelne navrhnutyacutemi RT primermi tak aby vytvorili kraacutetke oligonukleotidy (cDNA) Potom reakcia pokračuje ako štandardnaacute MLPA

Obr 28 MLPA analyacuteza geacutenu DMD (koacutedujuacuteceho dystrofiacuten) mutaacutecie ktoreacuteho spocircsobujuacute Duchennovu svalovuacute dystrofiu u pacienta je priacutetomnaacute deleacutecia exoacutenu 45 v porovnaniacute s referenčnou vzorkou ndash kontrolou

32

Obr 29 MLPA analyacuteza geacutenu DMD (koacutedujuacuteceho dystrofiacuten) mutaacutecie ktoreacuteho spocircsobujuacute Duchennovu svalovuacute dystrofiu u pacienta suacute priacutetomneacute duplikaacutecie exoacutenov 41 42 43 44 45 (piacuteky vo vzorke pacienta sa porovnajuacute s piacutekmi v kontrole ndash referenčnej vzorke)

33

6 Sekvenovanie

Sekvenovaniacutem rozumieme určenie primaacuternej štruktuacutery DNA teda určenie poradia nukleotidov v reťazci DNA Začiatky moderneacuteho sekvenovania siahajuacute do roku 1977 kedy boli objaveneacute dve metoacutedy sekvenovania 1) chemickaacute metoacuteda Maxama a Gilberta 2) enzymatickaacute metoacuteda Sangera Nicklena a Coulsona

Princiacutep obidvoch metoacuted sekvenovania spočiacuteva v tom že sa vytvoriacute suacutebor DNA molekuacutel s rocircznou veľkosťou ktoreacute suacute zakončeneacute konkreacutetnym nukleotidom tieto DNA molekuly sa elektroforeticky separujuacute v geacuteloch s rozlišovacou schopnosťou 1 nukleotid 61 Chemickaacute metoacuteda

DNA molekuly sa na 5-konci raacutedioaktiacutevne označia raacutedioaktiacutevnym fosforom a naacutesledne sa chemicky modifikujuacute špecificky pre každuacute baacutezu DNA sa potom v modifikovanyacutech miestach štiepi čiacutem vzniknuacute rocirczne dlheacute fragmenty pričom podmienky suacute nastaveneacute tak aby sa DNA na každom mieste štiepila len raz Modifikaacutecia DNA a štiepenie prebehne v štyroch separaacutetnych reakciaacutech (skuacutemavkaacutech) takže po elektroforetickej separaacuteciiacute takto opracovanej DNA v štyroch draacutehach polyakrylamidoveacuteho geacutelu a naacuteslednej autoraacutediografii (podobne ako pri Southernovej hybridizaacutecii) je možneacute odčiacutetať nukleotidovuacute sekvenciu približne 100 nukleotidov od raacutedioaktiacutevneho označenia (v čase objavu Maxama a Gilberta) 62 Sangerova metoacuteda

Zaacuteklady metoacutedy boli popiacutesaneacute už v roku 1975 (metoacuteda plus a miacutenus) ale až vylepšenie použitiacutem dideoxynukleotidov (ddNTP) v roku 1977 došlo k zjednodušeniu sekvenovania Princiacutepom enzyacutemoveacuteho sekvenovania je terminaacutecia (zastavenie) polymerizaacutecie inkorporaacuteciou 2´ 3 -dideoxynukleotidov do novosyntetizujuacuteceho sa vlaacutekna DNA Keďže ddNTP neobsahujuacute hydroxylovuacute skupinu na 3 uhliacuteku riboacutezy nemocircžu sa zuacutečastniť na tvorbe fosfodiesterovej vaumlzby nemocircže sa pripojiť k nim ďalšiacute nukleotid čiže musiacute docircjsť k terminaacuteciiacute polymeraacutecie Reakcia prebieha v štyroch skuacutemavkaacutech s raacutedioaktiacutevne značenyacutem primerom V každej skuacutemavke suacute priacutetomneacute všetky štyri deoxynukleotidtrifosfaacutety (dNTP) ale pre každuacute skuacutemavku je špecifickyacute priacutedavok maleacuteho množstva jedneacuteho z dideoxynukleotidtrifosfaacutetov (v prvej skuacutemavke je ddATP v druhej ddCTP v tretej ddTTP a vo štvrtej ddGTP) Maleacute množstvo ddNTP spocircsobiacute že pri polymerizaacutecii dochaacutedza k prednostneacutemu zaradeniu štandardnyacutech dNTP do narastajuacuteceho reťazca a len občas sa inkorporuje ddNTP čiacutem sa zastaviacute synteacuteza reťazca V každej skuacutemavke tak vznikne suacutebor DNA fragmentov rocircznych veľkostiacute zakončenyacutech priacuteslušnyacutem ddNTP (v prvej skuacutemavke ddATP v druhej ddCTP v tretej ddTTP a vo štvrtej ddGTP) Po elektroforetickej separaacutecii v 4 draacutehach polyakrylamidoveacuteho geacutelu a autoraacutediografii sa z autoraacutediogramu odčiacuteta sekvencia

V suacutečasnosti je sekvenovanie do značnej miery automatizovaneacute pričom využiacuteva princiacutep Sangerovej enzyacutemovej metoacutedy s určityacutemi obmenami Uacutesek DNA ktoryacute treba sekvenovať sa prostredniacutectvom termostabilnyacutech DNA polymeraacutez namnožiacute PCR metoacutedou po ktorej nasleduje sekvenačnaacute reakcia (asymetrickaacute PCR) s fluorescenčne značenyacutemi ddNTP (každyacute druh označenyacute inyacutem fluorescenčnyacutem farbivom) Sekvenačnaacute reakcia prebieha v jednej skuacutemavke s jednyacutem primerom vznikne tak suacutebor jednovlaacuteknovyacutech DNA rocircznej dĺžky ktoreacute suacute na 3konci označeneacute ddNTP so špecifickyacutem fluorescenčnyacutem farbivom Taacuteto metoacuteda sekvenovania sa tiež nazyacuteva rdquodye-terminator cycle sequencingrdquo(obr 30) Po kapilaacuternej elektroforeacuteze vzorky v genetickom analyzaacutetore zaznamenaacutevaniacute fluorescencie jednotlivyacutech fragmentov CCD kamerou a softveacuterovom spracovaniacute sa ziacuteska sekvencia DNA (obr 31)

34

Obr 30 Princiacutep sekvenovania Sangerova dideoxy metoacuteda alebo tzv chain termination method (reťazec zastavujuacuteca metoacuteda) Obr 31 Určenie genotypu plodu a rodičov sekvenčnou analyacutezou DNA ziacuteskanej z plodovej vody (prenataacutelna diagnostika) a perifeacuternej krvi sekvenčnaacute analyacuteza geacutenu ASPA vyacutesledok u plodu priacutetomnaacute mutaacutecia c 914CgtA v homozygotnom stave (AA) rodičia heterozygoti (AC) Uvedenaacute mutaacutecia je v homozygotnom stave kauzaacutelnou priacutečinou Canavanovej choroby

Automatizovaneacute sekvenovanie prinaacuteša viacereacute vyacutehody oproti klasickej Sangerovej metoacutede vyššiu presnosť a ryacutechlosť v jednej sekvenačnej reakcii možnosť osekvenovať až 1200 nukleotidovyacute fragment maleacute množstvo templaacutetu potrebneacute na analyacutezu

35

63 Next Generation Sequencing (NGS)

NGS (sekvenovanie novej generaacutecie) maacute obrovskyacute potenciaacutel v analyacuteze genoacutemov pričom toto označenie zahŕňa viacereacute technologickeacute metoacutedy reprezentovaneacute niekoľkyacutemi firmami Princiacutepom je masiacutevne paralelneacute sekvenovanie čiacutem sa ziacuteskajuacute raacutedovo tisiacutece až milioacuteny sekvenciiacute naraz 631 Sekvenovanie druhej generaacutecie

Na začiatku sa analyzovanaacute DNA vo vaumlčšine priacutepadov fragmentuje (vznikne tak DNA

knižnica) na fragmenty sa pripoja kraacutetke sekvencie ndash adapteacutery naacutesledne sa tieto fragmenty rocircznymi priacutestupmi amplifikujuacute a určiacute sa ich sekvencia Vďaka čiastočnyacutem prekryvom je zo ziacuteskanyacutech sekvencii možneacute poskladať plynuluacute sekvenciu zodpovedajuacutecu pocircvodnej nefragmentovanej DNA

Pyrosekvenovanie je podobne ako Sangerova metoacuteda založenaacute na princiacutepe synteacutezy komplementaacuterneho vlaacutekna DNA avšak rozdiel je v tom že sa na detekciu inkorporaacutecie nukleotidu využiacuteva inyacute systeacutem tvorby luminiscenčneacuteho signaacutelu v priebehu reakcie Pyrosekvenovanie je umožneneacute vďaka aktivite 4 enzyacutemov - DNA polymeraacutezy ATP sulfurylaacutezy luciferaacutezy a apyraacutezy Reakčnaacute zmes obsahuje aj ďalšie komponenty - enzymatickeacute substraacutety adenoziacutenfosfosulfaacutet (APS) d-luciferiacuten sekvenovanyacute templaacutet a cyklicky postupne po jednom type pridaacutevaneacute nukleotidtrifosfaacutety Po zabudovaniacute nukleotidu do novovznikajuacuteceho reťazca docircjde k uvoľneniu pyrofosfaacutetu naacutesledne je využityacute ATP sulfurylaacutezou na synteacutezu ATP z APS počas ďalšej reakcie docircjde k využitiu ATP luciferaacutezou na premenu luciferiacutenu na oxyluciferiacuten čo spocircsobiacute svetelnyacute signaacutel a ten zaznamenaacute detekčnyacute systeacutem Poslednou enzymatickou reakciou je reakcia apyraacutezy ktoraacute odstraacuteni nezainkorporovaneacute nukleotidy a nevyužiteacute ATP aby sa celyacute proces mohol zopakovať s reakčnou zmesou obsahujuacutecou ďalšiacute nukleotidtrifosfaacutet (inyacute ako v predchaacutedzajuacutecej reakcii) Po každej reakcii detektor zaznamenaacuteva emisiu svetla na zaacuteklade intenzity svetla je možneacute určiť či bol vradenyacute priacuteslušnyacute nukleotidtrifosfaacutet či bol inkorporovanyacute jeden priacutepadne viac rovnakyacutech nukleotidtrifosfaacutetov

Zvyacutešenie vyacutekonu pyrosekvenovania umožnila tzv emulznaacute PCR v mikročasticiach a použitie platničky PicoTiterPlatereg toto sekvenovanie zaviedla firma Roche pod pojmom 454 pyrosekvenovanie v roku 2005 Na začiatku sa DNA fragmentuje na uacuteseky dlheacute 400-600 baacutez dvojvlaacuteknovaacute fragmentovanaacute DNA sa liguje s adapteacutermi prostredniacutectvom nich sa naviaže na mikročastice dvojvlaacuteknoveacute fragmenty sa oddelia mikročastice s naviazanyacutemi jednovlaacuteknovyacutemi fragmentami sa premiešajuacute so zmesou oleja a roztoku ktoryacute obsahuje všetky komponenty na uacutespešnuacute PCR Tyacutemto spocircsobom sa okolo každej mikročastice vytvoriacute vlastnyacute mikroreaktor v ktorom prebehne amplifikaacutecia fragmentu Po PCR reakcii sa mikročastice prenesuacute do platničky PicoTiterPlate v ktorej sa do jamky zmestiacute akuraacutet jedna mikročastica a reakčneacute komponenty pyrosekvenačnej reakcie PicoTiterPlatereg maacute 1 600 000 jamiek každaacute jamka maacute maximaacutelny objem 75 picolitra Platnička s mikročasticami sa vložiacute do sekvenačneacuteho systeacutemu ndash priacutestroja v ktorom sa celeacute pyrosekvenovanie uskutočniacute Chemiluminiscenčneacute signaacutely ktoryacutech počas sekvenovania vznikajuacute milioacuteny v priebehu hodiny suacute zachyteneacute CCD kamerou a analyzovaneacute softveacuterom

Firma Illumina predstavila inuacute technoloacutegiu PCR amplifikaacutecia a sekvenovanie sa uskutočňuje na skliacutečku (flow cell) Fragmentaacutecia DNA a pripojenie adapteacuterov prebieha za uacutečasti transpozoacutemov v procese nazvanom tagmentaacutecia Po hybridizaacutecii fragmentov DNA na skliacutečko prebehne v klastroch PCR amplifikaacutecia (tzv mostiacutekovaacute amplifikaacutecia) sekvenaacutecia prebieha za uacutečasti rozdielne fluorescenčne značenyacutech a chemicky modifikovanyacutech nukleotidov pričom každyacute nukleotid emituje fluorescenciu s inou vlnovou dĺžkou Na skliacutečku prebieha paralelne až 6 miliaacuterd sekvenaacutecii (obr 32)

Ďalšiacutemi možnosťami sekvenovania druhej generaacutecie je systeacutem SOLid (vyvinutyacute firmou Applied Biosystem dnes pod Thermo Fisher Scientific) a Ion Semiconductor Sequencing ndash polovodičoveacute ioacutenoveacute sekvenovanie (od firmy Ion Semiconductor Sequencing v suacutečasnosti Thermo Fisher Scientific)

36

Obr 32 Princiacutep sekvenovania novej generaacutecie od firmy Illumina PCR amplifikaacutecia a sekvenovanie sa uskutočňuje na skliacutečku (flow cell) paralelne prebieha až 6 miliaacuterd sekvenaacutecii

632 Sekvenovanie tretej generaacutecie

Pred sekvenovaniacutem netreba amplifikovať DNA PCR metoacutedou ale sekvencia sa ziacuteskava zachyteniacutem signaacutelu v reaacutelnom čase Medzi sekvenovanie tretej generaacutecie patriacute SMRT (Single Molecule Real-Time Sequencing) a Nanopore Sequencing

37

7 Fragmentačnaacute analyacuteza DNA

Je metoacuteda použiacutevanaacute na určenie veľkosti fragmentov DNA ziacuteskanyacutech PCR reakciou Dĺžka amplifikovanyacutech DNA fragmentov sa zistiacute ich porovnaniacutem s veľkostnyacutem štandardom (obr 33) ktoryacute je tvorenyacute DNA fragmentami znaacutemej dĺžky Veľkostnyacute štandard je pred kapilaacuternou elektroforeacutezou zmiešanyacute so vzorkou DNA fragmenty veľkostneacuteho štandardu suacute fluorescenčne označeneacute pričom použiteacute fluorescenčneacute farbivo je ineacute ako fluorescenčneacute farbivo použiteacute na označenie DNA fragmentov vo vyšetrovanej vzorke

Obr 33 Elektroforetogram veľkostneacuteho štandardu použiacutevaneacuteho na určenie veľkostiacute fragmentov analyzovanyacutech kapilaacuternou elektroforeacutezou v genetickom analyzaacutetore (GeneScantrade 500 LIZtrade dye Size Standard) dĺžka fragmentov v nukleotidoch (napr 50 nukleotidov)

Fragmentačnaacute analyacuteza pozostaacuteva z viaceryacutech krokov Prvyacutem je izolaacutecia DNA nasleduje PCR amplifikaacutecia počas ktorej sa novosyntetizovaneacute DNA fragmenty označia fluorescenčnyacutemi farbivami Vzorka s PCR produktom sa pripraviacute na kapilaacuternu elektroforeacutezu tak že sa zmieša s veľkostnyacutem štandardom (sluacuteži na určenie veľkosti fragmentov) a denaturačnou laacutetkou (formamid) nasleduje denaturaacutecia Pripraveneacute vzorky suacute injektovaneacute do priacutestroja (genetickyacute analyzaacutetor) kde v kapilaacutere naplnenej polymeacuterom v elektrickom poli migrujuacute fluorescenčne značeneacute fragmenty DNA na zaacuteklade veľkosti (kapilaacuterna elektroforeacuteza) Počas elektroforeacutezy genetickyacute analyzaacutetor zaznamenaacuteva fluorescenciu fragmentov Analyacutezou daacutet prostredniacutectvom špeciaacutelnych softveacuterov sa ziacuteskajuacute elektroforetogramy z ktoryacutech je možneacute zistiť veľkosť fragmentov ako aj typ fluorescencie (docircležiteacute ak suacute genetickeacute varianty rozliacutešiteľneacute rocircznou fluorescenciou napr SNaPshot) Fragmentačnaacute analyacuteza je suacutečasťou množstva molekulaacuterno-genetickyacutech metoacuted (pozri obr 12 26 28 29 34) ako suacute napr STR analyacuteza (Short Tandem Repeat) AFLP analyacuteza (Amplified Fragment Lenght Polymorfism) RFLPT-RFLP analyacuteza (Restriction Fragment Lenght PolymorfismTerminal Restricted Fragment Lenght Polymorfism) SSCP (Single Strand Conformation Polymorfism) VNTR (Variable Number of Tandem Repeat) analyacuteza straty heterozygotnosti (LOH loss of heterozygozity) MLPA (Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification) MSMSA (Methylation-Sensitive Mobility Shift Assay) SNP genotypovanie (SNaPshotreg) HiCEP (High-Coverage Expression Profiling)

38

Obr 34 Kvantitatiacutevna fragmentačnaacute PCR analyacuteza (QF-PCR) DNA izolovanej z plodovej vody vyacutesledok prenataacutelnej analyacutezy = priacutetomnosť troch piacutekov pre chromozoacutem 18 (u všetkyacutech fragmentov detegujuacutecich chromozoacutem 18 je pomer vyšetrovanyacutech markerov aberantnyacute 21 resp 111) čo znamenaacute trizoacutemiu chromozoacutemu 18 Edwardsov syndroacutem

39

8 Metoacutedy založeneacute na princiacutepe hybridizaacutecie

Nukleoveacute kyseliny majuacute schopnosť vytvaacuterať dvojvlaacuteknoveacute reťazce z jednovlaacuteknovyacutech molekuacutel na zaacuteklade komplementarity baacutez Komplementarita baacutez umožňuje replikaacuteciu DNA transkripciu RNA komplementarita baacutez zabezpečuje teda reprodukovateľnosť živej hmoty

Hybridizaacutecia je proces v ktorom na zaacuteklade komplementarity baacutez dochaacutedza k vytvoreniu dvojvlaacuteknovej nukleovej kyseliny z dvoch jednovlaacuteknovyacutech molekuacutel DNA alebo RNA alebo ich kombinaacuteciou DNA RNA pričom kratšia jednovlaacuteknovaacute nukleovaacute kyselina vystupuje ako sonda (proacuteba) Hybridizaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten je jeden z najpoužiacutevanejšiacutech naacutestrojov v molekulaacuternej bioloacutegii a genetike (hybridizaacutecia primerov alebo proacuteb sa využiacuteva v takmer každej metoacutede - v PCR RT-PCR qPCR RT-qPCR MLPA sekvenovaniacute fragmentačnej analyacuteze FISH DNA mikročipoch atď)

Denaturaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten je proces pri ktorom dochaacutedza k porušeniu vodiacutekovyacutech vaumlzieb medzi vlaacuteknami nukleovyacutech kyseliacuten (strata sekundaacuternej a terciaacutelnej štruktuacutery) tak že docircjde k ich uacuteplneacutemu oddeleniu vzniknuacute jednovlaacuteknoveacute reťazce Denaturaacutecia NK mocircže byť spocircsobenaacute vplyvom vysokyacutech teplocirct pH alebo chemickyacutech laacutetok (denaturačneacute činidlaacute) Renaturaacutecia je opačnyacute proces v ktorom na zaacuteklade komplementarity dochaacutedza k tvorbe dvojvlaacuteknovyacutech NK

Hybridiza čnaacute sonda (proacuteba) je jednovlaacuteknovaacute nukleovaacute kyselina určitej znaacutemej dĺžky a sekvencie (najčastejšie DNA pretože je stabilnejšia ako RNA) ktoraacute je značenaacute a sluacuteži na detekciu komplementaacuternych molekuacutel DNA alebo RNA v procese hybridizaacutecie V zaacutevislosti od podmienok hybridizaacutecie (stringencia) mocircže byť detegovanaacute sekvencia uacuteplne komplementaacuterna alebo v menej priacutesnych podmienkach mocircže mať sekvenčneacute odchyacutelky Proacuteba sluacuteži na vyhľadanie a zviditeľnenie cieľovyacutech NK Zviditeľnenie sa deje prostredniacutectvom označenia proacuteby ešte pred hybridizaacuteciou Značenie proacuteby mocircže byť raacutedioaktiacutevne a neraacutedioaktiacutevne (najčastejšie fluorescenčneacute)

Raacutedioaktiacutevne značeneacute proacuteby pomocou izotopov (32P) sa využiacutevali viac v minulosti v suacutečasnosti suacute kvocircli zdravotnyacutem rizikaacutem ohľaduplnosti k životneacutemu prostrediu ako aj kvocircli jednoduchšej manipulaacutecii použiacutevaneacute fluorescenčne značeneacute proacuteby Raacutedioaktiacutevne značeneacute sondy boli použiacutevaneacute hlavne metoacutedou Southernovej hybridizaacutecie (Southern blotting Southern blot) Citlivosť raacutedioaktiacutevne značenyacutech proacuteb je vyššia dosahuje schopnosť zachytiť 10 fg (femtogram 10-15) cieľovej DNA sekvencie 81 Southern blot

Metoacutedu objavil v roku 1975 britskyacute bioloacuteg Edwin Southern (preto Southern) Pri Southernovej hybridizaacutecii sa restrikčne štiepeneacute fragmenty DNA elektroforeticky separujuacute v geacuteli potom sa metoacutedou blottingu prenesuacute na nylonovuacute alebo nitroceluloacutezovuacute membraacutenu kde suacute naacutesledne hybridizovaneacute v roztoku obsahujuacutecom raacutedioaktiacutevne značenuacute sondu Priloženiacutem fotografickeacuteho filmu k membraacutene a vyvolaniacutem filmu autoraacutediografiou docircjde k zviditeľneniu lokaliacutet kde došlo k hybridizaacuteciiacute raacutedioaktiacutevne značenej sondy s fragmentom DNA (autoraacutediogram) Southern blot bol kľuacutečovou a prvou metoacutedou na identifikaacuteciu osocircb (DNA fingerprinting DNA pofiling) (obr 35)

Okrem Southern blotu existuje Northern blot na analyacutezu RNA (geacutenovej expresie) a Western blot na analyacutezu proteiacutenov postup je obdobnyacute ako pri Southern blote s obmenami špecifickyacutemi pre konkreacutetny blot Pri Northern blote sa použiacutevajuacute hybridizačneacute proacuteby ale pre vizualizaacuteciu proteiacutenov western blotom je potrebneacute použiť protilaacutetky s naacuteslednou vizualizaacuteciou Pomenovanie techniacutek je hra so sloviacutečkami (keďže paacuten Northern ani Western neobjavili takto nazvaneacute techniky)

Neraacutedioaktiacutevne značenie proacuteb použiacutevanyacutech v molekulaacuternej genetike mocircže byť nepriame (použitie haptenu) alebo priame Konečnaacute vizualizaacutecia je najčastejšie zabezpečenaacute fluoreskujuacutecimi farebnyacutemi značkami farbivami fluorochroacutemami (fluorofoacuterami) Pri priamom značeniacute je farbička kovalentne naviazanaacute na nukleotid a na zachytenie fluorescencie suacute potrebneacute špeciaacutelne priacutestroje umožňujuacutece excitaacuteciu farbičky ktoraacute potom emituje žiarenie určitej vlnovej dĺžky (emisneacute žiarenie) a to zachytiacute detekčnyacute systeacutem priacutestroja Využitie fluorochroacutemov v molekulaacuternej genetike je masiacutevne napr na vizualizaacuteciu NK elektroforeticky separovanyacutech v geacuteli kvantifikaacuteciu produktov PCR reakcie v priacutestroji real-time PCR cykleacuter sekvenovaniacute fragmentačnej analyacuteze FISH DNA mikročipoch atď

40

Obr 35 Princiacutep Southern blotu

82 FISH (fluorescenčnaacute in situ hybridizaacutecia)

FISH (fluorescent in situ hybridization fluorescenčnaacute in situ hybridizaacutecia) metoacuteda patriacute medzi molekulovo-cytogenetickeacute techniky Princiacutep FISH metoacutedy je založenyacute na hybridizaacuteciiacute fluorescenčne značenyacutech proacuteb ku komplementaacuternym uacutesekom vyšetrovanej DNA na podložnom skle (priamo na mieste - in situ) K denaturaacutecii dsDNA dochaacutedza buď vplyvom denaturačnyacutech činidiel alebo zvyacutešenou teplotou a naacuteslednou renaturaacuteciou dochaacutedza k naviazaniu sondy na komplementaacuterny uacutesek DNA Vyacutesledok hybridizaacutecie sa vizualizuje fluorescenčnyacutem mikroskopom vybavenyacutem vhodnyacutemi fluorescenčnyacutemi filtrami a vizuaacutelne zhodnotiacute skuacutesenyacutem odborniacutekom Fluorescencia sa v niektoryacutech priacutepadoch mocircže zaznamenať a hodnotiť aj pomocou softveacuteru (obr 36)

Pomocou FISH detegujeme numerickeacute aberaacutecie - zmeny v počte chromozoacutemov (napr trizoacutemia monozoacutemia chromozoacutemov) alebo štruktuacuterne aberaacutecie a prestavby (napr translokaacutecie inverzie deleacutecie duplikaacutecie amplifikaacutecie) FISH metoacuteda umožňuje identifikaacuteciu a detekciu každeacuteho ľudskeacuteho chromozoacutemu jeho zaradenie do karyotypu odhalenie malyacutech submikroskopickyacutech chromozoacutemovyacutech zmien a tiež mapovať poziacutecie jednotlivyacutech geacutenov na chromozoacuteme

41

Obr 36 Princiacutep štandardnej FISH a FISH maľovania celeacuteho chromozoacutemu

Veľkou vyacutehodou FISH metoacutedy je možnosť analyacutezy buniek v metafaacuteze aj v interfaacuteze kedy nie je nutnaacute kultivaacutecia buniek a tiež ryacutechle analyzovanie veľkeacuteho počtu buniek (stovky až tisiacutece) K ďalšiacutem vyacutehodaacutem patriacute bezpečnosť vysokaacute citlivosť dostatočnaacute stabilita relatiacutevne kraacutetky čas hybridizaacutecie a možnosť ryacutechleho vyhodnotenia Hybridizaacutecia pri vaumlčšine suacutečasne dodaacutevanyacutech sond trvaacute 10-12 hodin (na trhu suacute už dostupneacute aj sondy so skraacutetenyacutem časom hybridizaacutecie na 2-3 hodiny) Po hybridizaacuteciiacute nasleduje odmyacutevanie kedy pri priacuteslušnej teplote dochaacutedza k odmytiu nenaviazanyacutech a nespraacutevne hybridizovanyacutech sond Preparaacutet sa naacutesledne podfarbiacute a vyacutesledok sa zhodnotiacute vo fluorescenčnom mikroskope Na podfarbenie chromozoacutemov alebo jadier sa použiacuteva modreacute kontrastneacute farbivo DAPI (46-diamidino-2-fenylindol) ktoreacute maacute silneacute fluorescenčneacute vlastnosti dokaacuteže prechaacutedzať jadrovou membraacutenou a viazať sa na DNA Vyacutesledkom je modreacute zafarbenie ktoreacute vyacuteborne kontrastuje so signaacutelmi jednotlivyacutech sond

Limitujuacutecim faktorom FISH je možnosť identifikaacutecie len tyacutech uacutesekov DNA ku ktoryacutem suacute použiteacute sondy V jednej analyacuteze je možneacute použiť najviac 3 odlišne značeneacute sondy a tak zistiť priacutepadneacute abnormality len na 1 alebo na paacuter lokusoch Na relevantnuacute detekciu je potrebneacute mať vo vzorke 1-5 aberantnyacutech interfaacutezovyacutech jadier

FISH je možneacute uskutočniť na širokej škaacutele biologickeacuteho materiaacutelu na vzorkaacutech perifeacuternej krvi kostnej drene naacuteteroch choriovyacutech klkoch plodovej vode rocircznych druhov tkaniacutev natiacutevnych alebo zaliatych v parafiacutene na 1 bunke (predimplantačnaacute genetickaacute diagnostika PGD) (obr 37)

Využiacuteva sa na detekciu aberaacuteciiacute pri mnohyacutech onkologickyacutech ochoreniach (napr pri diagnoacuteze mnohopočetnyacute myeloacutem sa v suacutečasnosti po separaacutecii CD138+ buniek robiacute FISH s 5 sondami pre geacuteny IGH TP53 RB1 oblasť 1p321q21 a stanovuje sa hyperploidia chromozoacutemov 5 9 a 15) a tiež k spresneniu doplneniu a k overeniu bežneacuteho cytogenetickeacuteho vyšetrenia

Podľa miesta na chromozoacuteme na ktorom dochaacutedza k hybridizaacutecii sondy rozlišujeme 4 typy

DNA sond bull centromeacuteroveacute sondy ndash sa viažu na strednuacute časť chromozoacutemu ndash centromeacuteru sluacutežia k diagnostike zmien v počte chromozoacutemov k detekcii chromozoacutemov neznaacutemeho pocircvodu umožňujuacute interfaacuteznu FISH na nedeliacich sa bunkaacutech (obr 38-41)

42

Obr 37 Interfaacutezna FISH preimplantačnyacute genetickyacute skriacutening aneuploidiiacute ndash blastomeacutera 3-denneacuteho ľudskeacuteho embrya s normaacutelnym počtom chromozoacutemov 13 18 21 pohlavie XY použityacutech 5 sond pre chromozoacutemy 13 ndash orange 18 ndash aqua 21 ndash green X ndash blue a Y ndash yellow (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

Obr 38 Interfaacutezne jadro po hybridizaacutecii s centromeacuterovou sondou pre chromozoacutem 8 (Vysis Abbott) V pravom jadre je priacutetomnaacute trizoacutemia chromozoacutemu 8 (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex) Obr 39 Metafaacutezna (A) a interfaacutezna FISH (B) použitaacute centromeacuterovaacute sonda CEPX spectrum orangeCEPY spectrum green (Vysis Abbott) Sonda hybridizuje k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (červenyacute signaacutel) a Y (zelenyacute signaacutel) (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

43

Obr 40 Interfaacutezna FISH vyšetrenie spermiiacute použiteacute sondy CEPX greenCEPY orange (Aneuscore Metasystems) Sondy hybridizujuacute k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (zelenyacute signaacutel) Y (červenyacute signaacutel) vľavo ndash dve haploidneacute spermie (majuacutece jedna spermia X druhaacute Y chromozoacutem) vpravo ndash dve patologickeacute spermie obsahujuacutece gonozoacutemovyacute komplement XY (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

Obr 41 Interfaacutezna FISH vyšetrenie spermiiacute použiteacute sondy CEPX greenCEPY orange a CEP18 aqua (Aneuscore Metasystems) Sondy hybridizujuacute k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (zelenyacute signaacutel) Y (červenyacute signaacutel) a 18 (modryacute signaacutel) vľavo ndash normaacutelne haploidneacute ľudskeacute spermie - 1x chromozoacutem X alebo Y a jedenkraacutet chromozoacutem 18 v strede ndash patologickaacute spermia obsahujuacuteca gonozoacutemovyacute komplement XY a jeden chromozoacutem 18 vpravo ndash patologickaacute diploidnaacute spermia s chromozoacutemami X Y a dvoma chromozoacutemami 18 (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

bull lokusovo špecifickeacute sondy ndash hybridizaacutecia prebehne na konkreacutetnom mieste geacutenu (lokuse) (obr 42-44) použiacutevajuacute sa k vyšetreniu mikrodeleacuteciiacute (straty malyacutech častiacute chromozoacutemu pri mikrodelečnyacutech syndroacutemoch) k zisteniu amplifikaacutecie onkogeacutenov a niektoryacutech špecifickyacutech translokaacuteciiacute prestavby geacutenov umožňujuacute interfaacuteznu FISH na nedeliacich sa bunkaacutech bull subtelomeroveacute ndash vaumlzba na koncoveacute časti chromozoacutemu ndash telomeacutery bull celochromozoacutemoveacute alebo celomaľovacie sondy ndash sondy hybridizujuacute s mnohopočetnyacutemi chromozoacutemovyacutemi sekvenciami pričom sa fluorescenčne tak bdquovymaľujeldquo celyacute chromozoacutem (Obr 45) Použiacutevajuacute sa na vyšetrenie chromozoacutemovyacutech prestavieb k analyacuteze translokaacuteciiacute a k detekcii pocircvodu tzv marker chromozoacutemov (malyacutech nadpočetnyacutech chromozoacutemov neznaacutemeho pocircvodu) K použitiu sondy suacute potrebneacute metafaacutezne chromozoacutemy nepoužiacutevaju sa pre interfaacuteznu FISH

Pri konvenčnej chromozoacutemovej FISH suacute homogeacutenne DNA proacuteby hybridizovaneacute s fixovanyacutem metafaacuteznym alebo prometafaacuteznym chromozoacutemomchromozoacutemami na skliacutečku (Obr 36a) Maximaacutelna rozlišovacia schopnosť metafaacuteznej FISH je niekoľko megabaacutez (Obr 39a 45) využitiacutem viac

44

natiahnutyacutech prometafaacuteznych chromozoacutemov sa dosiahne 1 Mb rozliacutešenie Prostredniacutectvom fiber FISH konkreacutetne artificiaacutelne deproteinizovanej natiahnutej DNA pripravenej in situ z celyacutech buniek na mikroskopickom skliacutečku je možneacute vizualizovať individuaacutelne geacuteny maleacute DNA elementy na chromozoacuteme s rozliacutešeniacutem okolo 1000 bp

Obr 42 Interfaacutezne jadro po hybridizaacutecii s lokusovo-špecifickou sondou LSI 5q31 Spectrum Orange5p12 Spectrum Green (Vysis Abbott) Na ľavom obraacutezku suacute priacutetomneacute dva červeneacute (5q31) a dva zeleneacute signaacutely (5p12) v pravom jadre je priacutetomnaacute deleacutecia 5q31 oblasti chyacuteba jeden červenyacute signal (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

Obr 43 Interfaacutezna FISH použitaacute lokusovo-špecifickaacute sonda ndash translokačnaacute - XL BCRABL1 plus (Metasystems) dvojfarebnaacute dvojfuacutezna kde červenaacute označuje lokus ABL1 na chromozoacuteme 9 a zelenaacute oblasť BCR na chromozoacuteme 22 Sonda deteguje fuacuteziu protoonkogeacutenu ABL1 (9q34) a geacutenu BCR (22q11) v priacutepade že červenyacute a zelenyacute signaacutel suacute pri sebe (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

45

Obr 44 Interfaacutezna FISH Použitaacute lokusovo-špecifickaacute sonda- typ break apart pre IGH geacuten V docircsledku translokaacutecie došlo k rozskočeniu geacutenu pričom translokačneacuteho partnera nepoznaacuteme vieme určiť len percento v koľkyacutech jadraacutech je geacuten prestavanyacute (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex) Obr 45 Použiteacute celochromozoacutemoveacute sondy WCP 15 (červenyacute chromozoacutem) a WCP 17 (zelenyacute chromozoacutem) Na metafaacuteze je potvrdenaacute reciprokaacute translokaacutecia t(1517)(q2221) (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

FISH vizualizaacutecia celeacuteho chromozoacutemu maľovanie chromozoacutemu anglicky chromosome

painting je špeciaacutelnou aplikaacuteciou chromozoacutemovej FISH proacuteba je koktail veľkeacuteho počtu rocircznych fluorescenčne značenyacutech DNA fragmentov hybridizujuacutecich pozdĺž celeacuteho konkreacutetneho chromozoacutemu (obr 36b 45) bdquoChromosomepaintingldquo analyzuje metafaacutezne chromozoacutemy V minulosti bola FISH vizualizaacutecia celyacutech chromozoacutemov limitovanaacute malyacutem množstvom rocirczne sfarbenyacutech fluorochroacutemov

V suacutečasnosti je možneacute detegovať množstvo cieľovyacutech sekvenciiacute naraz čo sa využiacuteva pri celogenoacutemovej chromozoacutemovej vizualizaacutecii (whole-chromosomepainting - WCP) metoacutedou multiplex FISH (M-FISH multicolor FISH o br 46) alebo spektraacutelnej karyotypizaacutecie (SKY) kedy možno rozliacutešiť všetky ľudskeacute chromozoacutemy ndash teda 24 rocircznych chromozoacutemov M-FISH a SKY patria medzi metafaacutezne formy FISH diagnostiky ktoreacute umožňujuacute simultaacutennu vizualizaacuteciu všetkyacutech ľudskyacutech chromozoacutemov v rocircznych farbaacutech čo predstavuje uľahčenie analyacutezy karyotypu hlavne pri komplexnyacutech zmenaacutech a markeroch neznaacutemeho pocircvodu Obe techniky vychaacutedzajuacute z použitia

46

celochromozoacutemovyacutech sond značenyacutech kombinaacuteciou viaceryacutech fluorochroacutemov Rozdiel medzi M-FISH a SKY spočiacuteva v technike ziacuteskania konečneacuteho obrazu

Obr 46 Multicolor FISH - každyacute chromozoacutemovyacute paacuter je zafarbenyacute inou farbou pričom na ich zafarbenie postačuje kombinaacutecia 5 fluorochroacutemov Na vyhodnocovanie je potrebnaacute špeciaacutelna sada fluorescenčnyacutech filtrov pre jednotliveacute fluorochroacutemy a špeciaacutelnyacute softweacuter Vľavo-štandardnyacute karyotyp vpravo karyotyp s mutaacuteciami (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

V molekulovej cytogenetike suacute komerčne dostupneacute sety M-FISH proacuteb umožňujuacutece

viacfarebneacute pruacutežkovanie chromozoacutemov (banding) s vysokyacutem rozliacutešeniacutem (multicolor-banding mBAND FISH MCB) čo umožňuje identifikaacuteciu intrachromozoacutemovyacutech prestavieb (Obr 47) Nevyhnutnosťou mBAND-u je mať chromozoacutemy v metafaacuteze Taacuteto metoacuteda bola prvyacutekraacutet uskutočnenaacute na chromozoacuteme 5 v roku 1999 mBAND FISH umožňuje rozliacutešiť špecifickeacute oblasti chromozoacutemov na uacuterovni pruacutežku - bandu a sub-bandu s detekciou 550 bandov haploidneacuteho karyotypu

Obr 47 A - mBAND chromozoacutemu 11 - inverzia duplikovanej oblasti 11q223-q25 B - mBAND chromozoacutemu 3 - na kruhovom chromozoacuteme deleacutecia oblasti 3p263 C - mBAND chromozoacutemu 2 - potvrdenie inverzie duplikovanej časti chromozoacutemu (poskytnuteacute RNDr Dagmar Landlovou Medirex)

FISH metoacuteda a jej varianty (M-FISH mBAND SKY) majuacute v suacutečasnosti širokeacute využitie v

klinickej genetike v onkologickej genetike na detekciu aberaacuteciiacute v čase diagnoacutezy počas liečby po

47

liečbe monitorovanie po transplantaacutecii kostnej drene v prenataacutelnej a postnataacutelnej diagnostike pri detekcii submikroskopickyacutech deleacuteciiacute (napr DiGeorge syndroacutem - 22q112 delečnyacute syndroacutem PraderndashWilli syndroacutem- chromozoacutem 15q11-13) prostredniacutectvom FISH je možnaacute detekcia numerickyacutech zmien chromozoacutemov (trizoacutemia chromozoacutemu 21 pri Downovom syndroacuteme trizoacutemia chromozoacutemu 15 pri Patauovom syndroacuteme trizoacutemia chromozoacutemu 18 pri Edwardsovom syndroacuteme) rocirczne zmeny v počte pohlavnyacutech chromozoacutemov (monozoacutemia X pri Turnerovom syndroacuteme Klinefelterov syndroacutem s X chromozoacutemom naviac - XXY) podobne v predimplantačnej diagnostike

83 DNA Microarray (DNA mikro čip biočip) DNA mikročipovanie je technika využiacutevajuacuteca hybridizaacuteciu skuacutemanej nukleovej kyseliny

(cieľovaacute vzorka) s veľkyacutem množstvom oligonukleotidovyacutech proacuteb (desať tisiacutec až milioacuten) ktoreacute suacute prichyteneacute na pevnyacute podklad najčastejšie sklenyacute silikoacutenovyacute alebo nylonovyacute (doštička čip) Skuacutemanaacute nukleovaacute kyselina je pred hybridizaacuteciou fragmentovanaacute označenaacute fluorofoacuterom a denaturovanaacute Po kontakte čipu s cieľovou vzorkou ktoraacute je vlastne zmes označenyacutech oligonukleotidov značeneacute oligonukleotidy hybridizujuacute s oligonukleotidovyacutemi sekvenciami prichytenyacutemi na čipe Potom suacute na zaacuteklade fluorescencie detekovaneacute miesta kde došlo k hybridizaacutecii čiže vzorka obsahovala takuacuteto nukleotidovuacute sekvenciu Z jedneacuteho mikročipu sa ziacuteska obrovskeacute množstvo daacutet ktoreacute je vždy nutneacute softveacuterovo spracovať V dnešnej dobe existuje niekoľko firiem poskytujuacutecich komerčne mikročipy na objednaacutevku alebo si ich laboratoacuteria produkujuacute sami

Mikročipovanie prebieha nasledovne

1) Vytvorenie DNA čipu ndash tisiacutece rocircznych jednovlaacuteknovyacutech DNA oligonukleotidov znaacutemych sekvencii sa kovalentne naviažu na povrch doštičky vždy v určitej lokalite je niekoľko rovnakyacutech oligonukleotidov veľkosť takejto lokality je ˂ 200 microm Proacutebami mocircže byť DNA cDNA alebo syntetizovaneacute oligonukleotidy Už hotoveacute mikročipy ponuacutekajuacute viacereacute firmy (Affymetrix Agilent Technologies Eppendorf Illumina) alebo si ich jednotliveacute laboratoacuteria vyraacutebajuacute sami pomocou robotickyacutech zariadeniacute DNA čip sa vytvaacutera buď nanaacutešaniacutem kvapiek oligonukleotidov na podklad alebo synteacutezou oligonukleotidov in situ na čipe 2) Priacuteprava vzorky ndash nukleovaacute kyselina (mRNA DNA) sa purifikuje určiacute sa jej kvantita a kvalita (spektrofotometericky) fragmentuje resp v priacutepade mRNA sa syntetizuje cDNA v priacutepade potreby sa mocircže DNA amplifikovať PCR reakciou štiepiť restrikčnyacutemi endonukleaacutezami 3) Fluorescenčneacute označenie (zriedkavejšie raacutedioaktiacutevne) fragmentov DNA prebieha počas reverznej transkripcie alebo PCR amplifikaacutecie za uacutečasti fluorescenčne značenyacutech nukleotidov Keď sa analyzujuacute dve rocirczne vzorky napr zdraveacute tkanivo a naacutedoroveacute tkanivo označenie nukleovyacutech kyseliacuten v tyacutechto tkanivaacutech byacuteva rozdielne a to použitiacutem dvoch rocircznych fluorescenčnyacutech farbiacutev (napr zeleneacute a červeneacute) Pred hybridizaacuteciou je potrebneacute vzorku denaturovať čiacutem sa vytvoriacute zmes jednovlaacuteknovyacutech DNA označenyacutech značkou 4) Hybridizaacutecia s mikročipom ndash v špeciaacutelnom hybridizačnom roztoku hybridizujuacute komplementaacuterne sekvencie zo vzorky s priacuteslušnyacutemi oligonukleotidovyacutemi sondami naviazanyacutemi na čipe Potom sa čip obmyje aby došlo k odstraacuteneniu čiastočne hybridizovanyacutech nukleovyacutech kyseliacuten 5) Skenovanie mikročipu ndash skenerom čipov docircjde k ožiareniu čipu laserom pričom v mieste hybridizaacutecie fluorescenčne značenyacutech DNA fragmentov s proacutebou docircjde k emisii svetla určitej vlnovej dĺžky ktoruacute skener zaznamenaacute 6) Analyacuteza daacutet prebieha metoacutedami bioinformatiky spracovaniacutem softveacutermi sa zistiacute ktoreacute lokality čipu navzaacutejom hybridizovali v priacutepade použitia dvoch vzoriek kontrolnej a skuacutemanej je možneacute analyzovať ich relatiacutevnu intenzitu hybridizaacutecie (expresie určiteacuteho geacutenu)

Existujuacute štyri typy mikročipov 1) Čipy ur čeneacute na analyacutezu expresie (obsahujuacute cDNA proacuteby) pre tzv dvojkanaacutelovyacute experiment kedy je vzorka určenaacute k hybridizaacutecii na čipe ziacuteskanaacute zmiešaniacutem DNA fragmentov kontrolnej a skuacutemanej vzorky pričom fragmenty suacute rozdielne fluorescenčne označeneacute (napr zelenyacute fluorofoacuter pre kontrolnuacute vzorku a červenyacute pre skuacutemanuacute) Na zaacuteklade intenzity a typu fluorescencie sa deteguje expresia geacutenov typickaacute pre kontrolnuacute vzorku (napr zelenaacute fluorescencia) pre skuacutemanuacute vzorku (napr

48

červenaacute fluorescencia) a expresia podobnaacute u oboch vzoriek (žltaacute fluorescencia) neexprimovaneacute geacuteny (čierna fluorescencia) rocirczne odtiene (v zaacutevislosti od prevažujuacutecej hybridizaacutecie) (obr 48) 2) Čipy ur čeneacute na analyacutezu mutaacutecii použije sa genoacutemovaacute DNA označenaacute jednou fluorescenčnou farbičkou na určenie jednonukleotidovej zmeny (SNP ndash Single Nukleotide Polymorphism) 3) Čipy na komparatiacutevnu genoacutemovuacute hybridizaacuteciu (aCGH array Comparative Genomic Hybridization) ndash použiacutevaneacute na zistenie zvyacutešenia alebo zniacuteženia množstva chromozoacutemovyacutech fragmentov obsahujuacutecich geacuteny zodpovedneacute za určiteacute ochorenie Na analyacutezu sa použije skuacutemanaacute gDNA a referenčnaacute (kontrolnaacute) DNA každaacute sa značiacute inou fluorescenčnou farbičkou (princiacutep ako pri analyacuteze expresie) (obr 49 50) 4) Čipy CGH - SNP kombinovaneacute čipy ur čeneacute na analyacutezu aj mutaacuteciiacute SNP aj na komparatiacutevnu genoacutemovuacute hybridizaacuteciu CGH

Mikročipy majuacute rozsiahle využitie napriacuteklad v identifikaacuteciiacute novyacutech geacutenov vo vyacuteskume ich funkciiacute expresie v rocircznych podmienkach pri diagnostike mnohyacutech ochoreniacute vo farmakogenomike vo vyacuteskume vplyvu toxiacutenov

Obr 48 Heatmapa geacutenovej expresie vybranyacutech geacutenov (mRNA) mikročip obsahuje 46000 cDNA proacuteb (poskytnuteacute Ing Helenou Gbelcovou PhD Uacutestav lekaacuterskej bioloacutegie genetiky a klinickej genetiky LF UK a UNB)

49

Obr 49 Princiacutep komparatiacutevnej genoacutemovej hybridizaacutecie (aCGH - array comparative genomic hybridization) Obr 50 A) Vyacutesledok komparatiacutevnej genoacutemovej hybridizaacutecie (aCGH - array comparative genomic hybridization) vzorky DNA izolovanej plodovej vody U plodu s abnormaacutelnym ultrasonografickyacutem vyšetreniacutem bola identifikovanaacute duplikaacutecia oblasti 3q261q29 (modryacute paacutes) a deleacutecia oblasti 5p1533p151 (červenyacute paacutes) Pre porovnanie chromozoacutem 1 bez aberaacutecie b) Ten istyacute pacient ale ineacute softveacuteroveacute spracovanie (poskytnuteacute RNDr Miroslavom Tomkom PhD Medirex)

50

Odporuacutečanaacute a použitaacute literatuacutera

Odborneacute knihy Klug W S Cummings M R Spencer Ch A Palladino M A Concepts of Genetics jedenaacuteste vydanie (2015) Carson S Molecular Biology Techniques tretie vydanie (2012) Strachan T Read A Human Molecular Genetics štvrteacute vydanie (2011) Sudbery P Sudbery I Human Molecular Genetics tretie vydanie (2009)

Internetoveacute straacutenky

wwwncbinlmnihgov wwwmlpacom wwwthermofishercom wwwilluminacom wwwpromegask wwwqiagencom wwwambioncom

Odborneacute člaacutenky Chacon-Cortes D Griffiths L R Methods for extracting genomic DNA from whole blood samples current perspectives Journal of Biorepository Science for Applied Medicine Volume 2 strany 1- 9 Viltrop T Krjutskov K Palta P Metspalu A Comparison of DNA extraction methods for multiplex polymerase chain reaction Anal Biochem 2010 Volume 398(2) strany 260-262 Ing Martin Čermaacutek Molekulaacuterna cytogenetika v problematike familiaacuternych maligniacutet Onkoloacutegia Volume 2 strany 77 - 83 Livak KJ Schmittgen TD Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method Methods 2001 Volume 25(4) strany 402 - 408 Bustin S A Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays J Mol Endocrinol 2000 Volume 25(2) strany169 - 193

MOLEKULAacuteRNE METOacuteDY AKTUAacuteLNE POUŽIacuteVANEacute V KLINICKEJ GENETIKE RNDr Andrea Pastoraacutekovaacute PhD RNDr Robert Petrovič PhD Vydala Univerzita Komenskeacuteho v Bratislave Lekaacuterska fakulta Rozsah 50 straacuten 246 AH prveacute vydanie ISBN 978-80-223-4231-5

28

Obr 26 Ukaacutežka DNA profilu človeka 15 STR lokusov s určeniacutem pohlavia pomocou lokusu pre amelogeniacuten (ženskeacute pohlavie - XX) maleacute oranžoveacute piacuteky predstavujuacute fragmenty veľkostneacuteho štandardu Tabuľka č 3 Zaacutepis DNA profilu človeka z obraacutezka č 26 15 STR lokusov s určeniacutem pohlavia pomocou lokusu pre amelogeniacuten System Alela 1 Alela 2

D3S1358 16 17

TH01 9 93 D21S11 28 28

D18S51 15 18

Penta E 7 14 D5S818 9 12

D13S317 8 11

D7S820 8 11 D16S539 11 12

CSF1PO 10 11

Penta D 11 12 vWA 15 18

D8S1179 13 16

TPOX 8 9 FGA 20 21

amel X X

29

5 MLPA

Multiplexnaacute amplifikaacutecia proacuteb zaacutevislaacute od ligaacutecie (z angl multiplex ligation-dependent probe amplification) je metoacuteda schopnaacute v jednej reakcii (v jednej skuacutemavke a vzorke) detegovať zmeny v počte až 50 nukleotidovyacutech sekvenciiacute Metoacutedou MLPA je možneacute ryacutechlo identifikovať amplifikaacutecie (duplikaacutecie) a deleacutecie veľkeacuteho počtu geacutenov či už použitiacutem DNA alebo mRNA krvnyacutech vzoriek alebo vzoriek z naacutedorov

Princiacutep MLPA spočiacuteva v multiplexnej amplifikaacutecii 50 špecifickyacutech nukleotidovyacutech sekvenciiacute použitiacutem jedneacuteho paacuteru primerov pričom jeden primer je fluorescenčne označenyacute Vyacutesledneacute PCR produkty suacute analyzovaneacute kapilaacuternou elektroforeacutezou (fragmentačnaacute analyacuteza) Dĺžka každeacuteho namnoženeacuteho produktu je jedinečnaacute narastaacute postupne o 6 alebo 9 nukleotidov pričom produkty PCR suacute 120 ndash 500 nukleotidov dlheacute Tento veľkostnyacute rozsah PCR fragmentov (dĺžka 120-500 nukleotidov s naacuterastom postupne o 6 alebo 9 nukleotidov) je optimaacutelny pre kapilaacuternu elektroforeacutezu MLPA multiplexnaacute PCR prebieha za použitia iba jedineacuteho paacuteru primerov ktoreacute amplifikujuacute špecifickeacute sekvencie Trik spočiacuteva v tom že nedochaacutedza k amplifikaacutecii DNA sekvencie ale MLPA proacuteb ktoreacute suacute pridaneacute k vzorkaacutem Každaacute MLPA proacuteba pozostaacuteva z dvoch oligonukleotidov (dve hemiproacuteby) pričom každyacute oligonukleotid obsahuje jednu zo sekvencie rozpoznaacutevanuacute PCR primermi Proacuteba vznikne jedine za predpokladu hybridizaacutecie dvoch oligonukleotidov (hemiproacuteb) k cieľovej sekvencii (geacutenu) a po ligaacutecii enzyacutemom ligaacutezou Iba ligovaneacute proacuteby suacute exponenciaacutelne amplifikovaneacute pomocou jedneacuteho paacuteru primerov Množstvo zligovanyacutech proacuteb teda zaacutevisiacute od množstva cieľovyacutech sekvenciiacute (geacutenov) vo vzorke

Postup MLPA analyacutezy je nasledovnyacute (obr27) K vzorke nukleovej kyseliny (DNA resp mRNA) sa pridaacute zmes 50 jedinečnyacutech proacuteb každaacute

proacuteba je komplementaacuterna k určitej cieľovej sekvencii NK vzorky Každaacute proacuteba však pozostaacuteva z dvoch oligonukleotidov hybridizujuacutecich vedľa seba zaacuteroveň každyacute oligonukleotid (hemiproacuteba) obsahuje pridanuacute sekvenciu rozpoznaacutevanuacute paacuterom PCR primerov Po hybridizaacuteciiacute oligonukleotidov (hemiproacuteb) dochaacutedza k ich ligaacutecii ligaacutezou Ligačnaacute reakcia je tak špecifickaacute že je schopnaacute rozliacutešiť sekvenciu liacutešiacu sa v jednom nukleotide Vyacuteslednyacute ligačnyacute produkt (proacuteba) obsahuje obidve sekvencie pre PCR primery na jednom fragmente čiže mocircže docircjsť k namnoženiu takeacutehoto fragmentu PCR reakciou V priacutepade ak nedocircjde k ligaacutecii priacuteslušnyacutech hemiproacuteb pretože hemiproacuteby nenaacutejdu cieľovuacute sekvenciu na DNA každaacute takaacuteto nezligovanaacute hemiproacuteba maacute len jednu sekvenciu rozpoznaacutevanuacute len jednyacutem PCR primerom v docircsledku čoho nemocircže prebehnuacuteť jej PCR amplifikaacutecia a počas fragmentačnej analyacutezy nie je detegovanaacute pretože negeneruje fluorescenčnyacute signaacutel

Pri MLPA analyacuteze je docircležiteacute okrem MLPA amplifikaacutecie vzorky urobiť aj MLPA amplifikaacuteciu referenčnej vzorky ku ktorej sa bude porovnaacutevať počet geacutenov (cieľovyacutech sekvenciiacute) Po kapilaacuternej elektroforeacuteze MLPA referenčnej a skuacutemanej vzorky porovnaniacutem obsahu nameranyacutech hodnocirct tzv piacutekov priacuteslušnyacutech proacuteb sa určiacute relatiacutevny počet koacutepiiacute v skuacutemanej vzorke

MLPA

1 DNA denaturaacutecia a hybridizaacutecia s MLPA proacutebami (hemiproacuteby)

2 Ligaacutecia (vytvorenie kompletnyacutech proacuteb)

3 PCR amplifikaacutecia proacuteb paacuterom primerov

4 Kapilaacuterna elektroforetickaacute separaacutecia PCR produktov

5 Analyacuteza daacutet

30

Obr 27 Princiacutep MLPA

Firma MRC-Holland v suacutečasnosti ponuacuteka stovky MLPA setov proacuteb ktoreacute suacute vhodneacute na 1) diagnostiku kongenitaacutelnych a dedičnyacutech ochoreniacute 2) zisťovanie profilu naacutedorov 3) zisťovanie metylačneacuteho profilu

MLPA je metoacuteda vhodnaacute na detekciu malyacutech prestavieb (BRCA1 BRCA2 MSH2 atď)

veľkyacutech chromozoacutemovyacutech prestavieb (Williamsov syndroacutem Prader-WilliAngelman syndroacutem atzď)

31

detekciu zmien v počte koacutepii geacutenov (obr 28 29) ako aj zistenie počtu kompletnyacutech chromozoacutemov (chromozoacutem 13 18 21 XY tiež aj z amniovej tekutiny) diagnostiku naacutedorov (zmeny počtu pri ALL CLL atď) kvantifikaacuteciu metylaacutecie (Prader-WilliAngelmanov syndroacutem Fragilnyacute X inaktivaacutecia naacutedorovyacutech supresorovyacutech geacutenov atď) mRNA analyacutezu geacutenov zuacutečastňujuacutecich sa apoptoacutezy alebo zaacutepalov

MS-MLPA (Methylation-Specific MLPA) je varianta MLPA určenaacute špeciaacutelne na analyacutezu aberantnyacutech metylaacutecii imprintovanyacutech oblastiacute ako aj detekciu metylačnyacutech zmien CpG ostrovčekov lokalizovanyacutech bliacutezko promoacutetora Rozdiel oproti štandardnej MLPA spočiacuteva v použitiacute metylačne senzitiacutevneho restrikčneacuteho enzyacutemu HhaI ktoryacute štiepi MS-MLPA proacuteby hybridizovaneacute k nemetylovanej sekvencii Každaacute DNA vzorka určenaacute pre MS-MLPA analyacutezu prejde dvoma reakciami v jednej mikroskuacutemavke štandardnou MLPA analyacutezou (bez štiepenia metylačne senzitiacutevnym enzyacutemom) a v druhej mikroskuacutemavke docircjde okrem ligaacutecie proacuteb aj k metylačne senzitiacutevnemu štiepeniu hybridizovanyacutech proacuteb s nemetylovanou DNA Amplifikujuacute sa len ligovaneacute proacuteby po PCR amplifikaacutecii sa fragmentačnou analyacutezou porovnaniacutem oboch reakciiacute zistia rozdiely v metylačnom profile vzorky k referenčnej vzorke

RT-MLPA (Reverse Transkriptase MLPA) je variaacutecia MLPA určenaacute pre zistenie mRNA profilu vzorky je alternatiacutevou k real-time PCR a mikročipom RT-MLPA nedeteguje mRNA množstvo priamo pretože použiacutevanaacute ligaacuteza nie je schopnaacute ligovať DNA oligonukleotidy keď suacute hybridizovaneacute s RNA Preto RT-MLPA začiacutena reverznou transkripciou so špeciaacutelne navrhnutyacutemi RT primermi tak aby vytvorili kraacutetke oligonukleotidy (cDNA) Potom reakcia pokračuje ako štandardnaacute MLPA

Obr 28 MLPA analyacuteza geacutenu DMD (koacutedujuacuteceho dystrofiacuten) mutaacutecie ktoreacuteho spocircsobujuacute Duchennovu svalovuacute dystrofiu u pacienta je priacutetomnaacute deleacutecia exoacutenu 45 v porovnaniacute s referenčnou vzorkou ndash kontrolou

32

Obr 29 MLPA analyacuteza geacutenu DMD (koacutedujuacuteceho dystrofiacuten) mutaacutecie ktoreacuteho spocircsobujuacute Duchennovu svalovuacute dystrofiu u pacienta suacute priacutetomneacute duplikaacutecie exoacutenov 41 42 43 44 45 (piacuteky vo vzorke pacienta sa porovnajuacute s piacutekmi v kontrole ndash referenčnej vzorke)

33

6 Sekvenovanie

Sekvenovaniacutem rozumieme určenie primaacuternej štruktuacutery DNA teda určenie poradia nukleotidov v reťazci DNA Začiatky moderneacuteho sekvenovania siahajuacute do roku 1977 kedy boli objaveneacute dve metoacutedy sekvenovania 1) chemickaacute metoacuteda Maxama a Gilberta 2) enzymatickaacute metoacuteda Sangera Nicklena a Coulsona

Princiacutep obidvoch metoacuted sekvenovania spočiacuteva v tom že sa vytvoriacute suacutebor DNA molekuacutel s rocircznou veľkosťou ktoreacute suacute zakončeneacute konkreacutetnym nukleotidom tieto DNA molekuly sa elektroforeticky separujuacute v geacuteloch s rozlišovacou schopnosťou 1 nukleotid 61 Chemickaacute metoacuteda

DNA molekuly sa na 5-konci raacutedioaktiacutevne označia raacutedioaktiacutevnym fosforom a naacutesledne sa chemicky modifikujuacute špecificky pre každuacute baacutezu DNA sa potom v modifikovanyacutech miestach štiepi čiacutem vzniknuacute rocirczne dlheacute fragmenty pričom podmienky suacute nastaveneacute tak aby sa DNA na každom mieste štiepila len raz Modifikaacutecia DNA a štiepenie prebehne v štyroch separaacutetnych reakciaacutech (skuacutemavkaacutech) takže po elektroforetickej separaacuteciiacute takto opracovanej DNA v štyroch draacutehach polyakrylamidoveacuteho geacutelu a naacuteslednej autoraacutediografii (podobne ako pri Southernovej hybridizaacutecii) je možneacute odčiacutetať nukleotidovuacute sekvenciu približne 100 nukleotidov od raacutedioaktiacutevneho označenia (v čase objavu Maxama a Gilberta) 62 Sangerova metoacuteda

Zaacuteklady metoacutedy boli popiacutesaneacute už v roku 1975 (metoacuteda plus a miacutenus) ale až vylepšenie použitiacutem dideoxynukleotidov (ddNTP) v roku 1977 došlo k zjednodušeniu sekvenovania Princiacutepom enzyacutemoveacuteho sekvenovania je terminaacutecia (zastavenie) polymerizaacutecie inkorporaacuteciou 2´ 3 -dideoxynukleotidov do novosyntetizujuacuteceho sa vlaacutekna DNA Keďže ddNTP neobsahujuacute hydroxylovuacute skupinu na 3 uhliacuteku riboacutezy nemocircžu sa zuacutečastniť na tvorbe fosfodiesterovej vaumlzby nemocircže sa pripojiť k nim ďalšiacute nukleotid čiže musiacute docircjsť k terminaacuteciiacute polymeraacutecie Reakcia prebieha v štyroch skuacutemavkaacutech s raacutedioaktiacutevne značenyacutem primerom V každej skuacutemavke suacute priacutetomneacute všetky štyri deoxynukleotidtrifosfaacutety (dNTP) ale pre každuacute skuacutemavku je špecifickyacute priacutedavok maleacuteho množstva jedneacuteho z dideoxynukleotidtrifosfaacutetov (v prvej skuacutemavke je ddATP v druhej ddCTP v tretej ddTTP a vo štvrtej ddGTP) Maleacute množstvo ddNTP spocircsobiacute že pri polymerizaacutecii dochaacutedza k prednostneacutemu zaradeniu štandardnyacutech dNTP do narastajuacuteceho reťazca a len občas sa inkorporuje ddNTP čiacutem sa zastaviacute synteacuteza reťazca V každej skuacutemavke tak vznikne suacutebor DNA fragmentov rocircznych veľkostiacute zakončenyacutech priacuteslušnyacutem ddNTP (v prvej skuacutemavke ddATP v druhej ddCTP v tretej ddTTP a vo štvrtej ddGTP) Po elektroforetickej separaacutecii v 4 draacutehach polyakrylamidoveacuteho geacutelu a autoraacutediografii sa z autoraacutediogramu odčiacuteta sekvencia

V suacutečasnosti je sekvenovanie do značnej miery automatizovaneacute pričom využiacuteva princiacutep Sangerovej enzyacutemovej metoacutedy s určityacutemi obmenami Uacutesek DNA ktoryacute treba sekvenovať sa prostredniacutectvom termostabilnyacutech DNA polymeraacutez namnožiacute PCR metoacutedou po ktorej nasleduje sekvenačnaacute reakcia (asymetrickaacute PCR) s fluorescenčne značenyacutemi ddNTP (každyacute druh označenyacute inyacutem fluorescenčnyacutem farbivom) Sekvenačnaacute reakcia prebieha v jednej skuacutemavke s jednyacutem primerom vznikne tak suacutebor jednovlaacuteknovyacutech DNA rocircznej dĺžky ktoreacute suacute na 3konci označeneacute ddNTP so špecifickyacutem fluorescenčnyacutem farbivom Taacuteto metoacuteda sekvenovania sa tiež nazyacuteva rdquodye-terminator cycle sequencingrdquo(obr 30) Po kapilaacuternej elektroforeacuteze vzorky v genetickom analyzaacutetore zaznamenaacutevaniacute fluorescencie jednotlivyacutech fragmentov CCD kamerou a softveacuterovom spracovaniacute sa ziacuteska sekvencia DNA (obr 31)

34

Obr 30 Princiacutep sekvenovania Sangerova dideoxy metoacuteda alebo tzv chain termination method (reťazec zastavujuacuteca metoacuteda) Obr 31 Určenie genotypu plodu a rodičov sekvenčnou analyacutezou DNA ziacuteskanej z plodovej vody (prenataacutelna diagnostika) a perifeacuternej krvi sekvenčnaacute analyacuteza geacutenu ASPA vyacutesledok u plodu priacutetomnaacute mutaacutecia c 914CgtA v homozygotnom stave (AA) rodičia heterozygoti (AC) Uvedenaacute mutaacutecia je v homozygotnom stave kauzaacutelnou priacutečinou Canavanovej choroby

Automatizovaneacute sekvenovanie prinaacuteša viacereacute vyacutehody oproti klasickej Sangerovej metoacutede vyššiu presnosť a ryacutechlosť v jednej sekvenačnej reakcii možnosť osekvenovať až 1200 nukleotidovyacute fragment maleacute množstvo templaacutetu potrebneacute na analyacutezu

35

63 Next Generation Sequencing (NGS)

NGS (sekvenovanie novej generaacutecie) maacute obrovskyacute potenciaacutel v analyacuteze genoacutemov pričom toto označenie zahŕňa viacereacute technologickeacute metoacutedy reprezentovaneacute niekoľkyacutemi firmami Princiacutepom je masiacutevne paralelneacute sekvenovanie čiacutem sa ziacuteskajuacute raacutedovo tisiacutece až milioacuteny sekvenciiacute naraz 631 Sekvenovanie druhej generaacutecie

Na začiatku sa analyzovanaacute DNA vo vaumlčšine priacutepadov fragmentuje (vznikne tak DNA

knižnica) na fragmenty sa pripoja kraacutetke sekvencie ndash adapteacutery naacutesledne sa tieto fragmenty rocircznymi priacutestupmi amplifikujuacute a určiacute sa ich sekvencia Vďaka čiastočnyacutem prekryvom je zo ziacuteskanyacutech sekvencii možneacute poskladať plynuluacute sekvenciu zodpovedajuacutecu pocircvodnej nefragmentovanej DNA

Pyrosekvenovanie je podobne ako Sangerova metoacuteda založenaacute na princiacutepe synteacutezy komplementaacuterneho vlaacutekna DNA avšak rozdiel je v tom že sa na detekciu inkorporaacutecie nukleotidu využiacuteva inyacute systeacutem tvorby luminiscenčneacuteho signaacutelu v priebehu reakcie Pyrosekvenovanie je umožneneacute vďaka aktivite 4 enzyacutemov - DNA polymeraacutezy ATP sulfurylaacutezy luciferaacutezy a apyraacutezy Reakčnaacute zmes obsahuje aj ďalšie komponenty - enzymatickeacute substraacutety adenoziacutenfosfosulfaacutet (APS) d-luciferiacuten sekvenovanyacute templaacutet a cyklicky postupne po jednom type pridaacutevaneacute nukleotidtrifosfaacutety Po zabudovaniacute nukleotidu do novovznikajuacuteceho reťazca docircjde k uvoľneniu pyrofosfaacutetu naacutesledne je využityacute ATP sulfurylaacutezou na synteacutezu ATP z APS počas ďalšej reakcie docircjde k využitiu ATP luciferaacutezou na premenu luciferiacutenu na oxyluciferiacuten čo spocircsobiacute svetelnyacute signaacutel a ten zaznamenaacute detekčnyacute systeacutem Poslednou enzymatickou reakciou je reakcia apyraacutezy ktoraacute odstraacuteni nezainkorporovaneacute nukleotidy a nevyužiteacute ATP aby sa celyacute proces mohol zopakovať s reakčnou zmesou obsahujuacutecou ďalšiacute nukleotidtrifosfaacutet (inyacute ako v predchaacutedzajuacutecej reakcii) Po každej reakcii detektor zaznamenaacuteva emisiu svetla na zaacuteklade intenzity svetla je možneacute určiť či bol vradenyacute priacuteslušnyacute nukleotidtrifosfaacutet či bol inkorporovanyacute jeden priacutepadne viac rovnakyacutech nukleotidtrifosfaacutetov

Zvyacutešenie vyacutekonu pyrosekvenovania umožnila tzv emulznaacute PCR v mikročasticiach a použitie platničky PicoTiterPlatereg toto sekvenovanie zaviedla firma Roche pod pojmom 454 pyrosekvenovanie v roku 2005 Na začiatku sa DNA fragmentuje na uacuteseky dlheacute 400-600 baacutez dvojvlaacuteknovaacute fragmentovanaacute DNA sa liguje s adapteacutermi prostredniacutectvom nich sa naviaže na mikročastice dvojvlaacuteknoveacute fragmenty sa oddelia mikročastice s naviazanyacutemi jednovlaacuteknovyacutemi fragmentami sa premiešajuacute so zmesou oleja a roztoku ktoryacute obsahuje všetky komponenty na uacutespešnuacute PCR Tyacutemto spocircsobom sa okolo každej mikročastice vytvoriacute vlastnyacute mikroreaktor v ktorom prebehne amplifikaacutecia fragmentu Po PCR reakcii sa mikročastice prenesuacute do platničky PicoTiterPlate v ktorej sa do jamky zmestiacute akuraacutet jedna mikročastica a reakčneacute komponenty pyrosekvenačnej reakcie PicoTiterPlatereg maacute 1 600 000 jamiek každaacute jamka maacute maximaacutelny objem 75 picolitra Platnička s mikročasticami sa vložiacute do sekvenačneacuteho systeacutemu ndash priacutestroja v ktorom sa celeacute pyrosekvenovanie uskutočniacute Chemiluminiscenčneacute signaacutely ktoryacutech počas sekvenovania vznikajuacute milioacuteny v priebehu hodiny suacute zachyteneacute CCD kamerou a analyzovaneacute softveacuterom

Firma Illumina predstavila inuacute technoloacutegiu PCR amplifikaacutecia a sekvenovanie sa uskutočňuje na skliacutečku (flow cell) Fragmentaacutecia DNA a pripojenie adapteacuterov prebieha za uacutečasti transpozoacutemov v procese nazvanom tagmentaacutecia Po hybridizaacutecii fragmentov DNA na skliacutečko prebehne v klastroch PCR amplifikaacutecia (tzv mostiacutekovaacute amplifikaacutecia) sekvenaacutecia prebieha za uacutečasti rozdielne fluorescenčne značenyacutech a chemicky modifikovanyacutech nukleotidov pričom každyacute nukleotid emituje fluorescenciu s inou vlnovou dĺžkou Na skliacutečku prebieha paralelne až 6 miliaacuterd sekvenaacutecii (obr 32)

Ďalšiacutemi možnosťami sekvenovania druhej generaacutecie je systeacutem SOLid (vyvinutyacute firmou Applied Biosystem dnes pod Thermo Fisher Scientific) a Ion Semiconductor Sequencing ndash polovodičoveacute ioacutenoveacute sekvenovanie (od firmy Ion Semiconductor Sequencing v suacutečasnosti Thermo Fisher Scientific)

36

Obr 32 Princiacutep sekvenovania novej generaacutecie od firmy Illumina PCR amplifikaacutecia a sekvenovanie sa uskutočňuje na skliacutečku (flow cell) paralelne prebieha až 6 miliaacuterd sekvenaacutecii

632 Sekvenovanie tretej generaacutecie

Pred sekvenovaniacutem netreba amplifikovať DNA PCR metoacutedou ale sekvencia sa ziacuteskava zachyteniacutem signaacutelu v reaacutelnom čase Medzi sekvenovanie tretej generaacutecie patriacute SMRT (Single Molecule Real-Time Sequencing) a Nanopore Sequencing

37

7 Fragmentačnaacute analyacuteza DNA

Je metoacuteda použiacutevanaacute na určenie veľkosti fragmentov DNA ziacuteskanyacutech PCR reakciou Dĺžka amplifikovanyacutech DNA fragmentov sa zistiacute ich porovnaniacutem s veľkostnyacutem štandardom (obr 33) ktoryacute je tvorenyacute DNA fragmentami znaacutemej dĺžky Veľkostnyacute štandard je pred kapilaacuternou elektroforeacutezou zmiešanyacute so vzorkou DNA fragmenty veľkostneacuteho štandardu suacute fluorescenčne označeneacute pričom použiteacute fluorescenčneacute farbivo je ineacute ako fluorescenčneacute farbivo použiteacute na označenie DNA fragmentov vo vyšetrovanej vzorke

Obr 33 Elektroforetogram veľkostneacuteho štandardu použiacutevaneacuteho na určenie veľkostiacute fragmentov analyzovanyacutech kapilaacuternou elektroforeacutezou v genetickom analyzaacutetore (GeneScantrade 500 LIZtrade dye Size Standard) dĺžka fragmentov v nukleotidoch (napr 50 nukleotidov)

Fragmentačnaacute analyacuteza pozostaacuteva z viaceryacutech krokov Prvyacutem je izolaacutecia DNA nasleduje PCR amplifikaacutecia počas ktorej sa novosyntetizovaneacute DNA fragmenty označia fluorescenčnyacutemi farbivami Vzorka s PCR produktom sa pripraviacute na kapilaacuternu elektroforeacutezu tak že sa zmieša s veľkostnyacutem štandardom (sluacuteži na určenie veľkosti fragmentov) a denaturačnou laacutetkou (formamid) nasleduje denaturaacutecia Pripraveneacute vzorky suacute injektovaneacute do priacutestroja (genetickyacute analyzaacutetor) kde v kapilaacutere naplnenej polymeacuterom v elektrickom poli migrujuacute fluorescenčne značeneacute fragmenty DNA na zaacuteklade veľkosti (kapilaacuterna elektroforeacuteza) Počas elektroforeacutezy genetickyacute analyzaacutetor zaznamenaacuteva fluorescenciu fragmentov Analyacutezou daacutet prostredniacutectvom špeciaacutelnych softveacuterov sa ziacuteskajuacute elektroforetogramy z ktoryacutech je možneacute zistiť veľkosť fragmentov ako aj typ fluorescencie (docircležiteacute ak suacute genetickeacute varianty rozliacutešiteľneacute rocircznou fluorescenciou napr SNaPshot) Fragmentačnaacute analyacuteza je suacutečasťou množstva molekulaacuterno-genetickyacutech metoacuted (pozri obr 12 26 28 29 34) ako suacute napr STR analyacuteza (Short Tandem Repeat) AFLP analyacuteza (Amplified Fragment Lenght Polymorfism) RFLPT-RFLP analyacuteza (Restriction Fragment Lenght PolymorfismTerminal Restricted Fragment Lenght Polymorfism) SSCP (Single Strand Conformation Polymorfism) VNTR (Variable Number of Tandem Repeat) analyacuteza straty heterozygotnosti (LOH loss of heterozygozity) MLPA (Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification) MSMSA (Methylation-Sensitive Mobility Shift Assay) SNP genotypovanie (SNaPshotreg) HiCEP (High-Coverage Expression Profiling)

38

Obr 34 Kvantitatiacutevna fragmentačnaacute PCR analyacuteza (QF-PCR) DNA izolovanej z plodovej vody vyacutesledok prenataacutelnej analyacutezy = priacutetomnosť troch piacutekov pre chromozoacutem 18 (u všetkyacutech fragmentov detegujuacutecich chromozoacutem 18 je pomer vyšetrovanyacutech markerov aberantnyacute 21 resp 111) čo znamenaacute trizoacutemiu chromozoacutemu 18 Edwardsov syndroacutem

39

8 Metoacutedy založeneacute na princiacutepe hybridizaacutecie

Nukleoveacute kyseliny majuacute schopnosť vytvaacuterať dvojvlaacuteknoveacute reťazce z jednovlaacuteknovyacutech molekuacutel na zaacuteklade komplementarity baacutez Komplementarita baacutez umožňuje replikaacuteciu DNA transkripciu RNA komplementarita baacutez zabezpečuje teda reprodukovateľnosť živej hmoty

Hybridizaacutecia je proces v ktorom na zaacuteklade komplementarity baacutez dochaacutedza k vytvoreniu dvojvlaacuteknovej nukleovej kyseliny z dvoch jednovlaacuteknovyacutech molekuacutel DNA alebo RNA alebo ich kombinaacuteciou DNA RNA pričom kratšia jednovlaacuteknovaacute nukleovaacute kyselina vystupuje ako sonda (proacuteba) Hybridizaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten je jeden z najpoužiacutevanejšiacutech naacutestrojov v molekulaacuternej bioloacutegii a genetike (hybridizaacutecia primerov alebo proacuteb sa využiacuteva v takmer každej metoacutede - v PCR RT-PCR qPCR RT-qPCR MLPA sekvenovaniacute fragmentačnej analyacuteze FISH DNA mikročipoch atď)

Denaturaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten je proces pri ktorom dochaacutedza k porušeniu vodiacutekovyacutech vaumlzieb medzi vlaacuteknami nukleovyacutech kyseliacuten (strata sekundaacuternej a terciaacutelnej štruktuacutery) tak že docircjde k ich uacuteplneacutemu oddeleniu vzniknuacute jednovlaacuteknoveacute reťazce Denaturaacutecia NK mocircže byť spocircsobenaacute vplyvom vysokyacutech teplocirct pH alebo chemickyacutech laacutetok (denaturačneacute činidlaacute) Renaturaacutecia je opačnyacute proces v ktorom na zaacuteklade komplementarity dochaacutedza k tvorbe dvojvlaacuteknovyacutech NK

Hybridiza čnaacute sonda (proacuteba) je jednovlaacuteknovaacute nukleovaacute kyselina určitej znaacutemej dĺžky a sekvencie (najčastejšie DNA pretože je stabilnejšia ako RNA) ktoraacute je značenaacute a sluacuteži na detekciu komplementaacuternych molekuacutel DNA alebo RNA v procese hybridizaacutecie V zaacutevislosti od podmienok hybridizaacutecie (stringencia) mocircže byť detegovanaacute sekvencia uacuteplne komplementaacuterna alebo v menej priacutesnych podmienkach mocircže mať sekvenčneacute odchyacutelky Proacuteba sluacuteži na vyhľadanie a zviditeľnenie cieľovyacutech NK Zviditeľnenie sa deje prostredniacutectvom označenia proacuteby ešte pred hybridizaacuteciou Značenie proacuteby mocircže byť raacutedioaktiacutevne a neraacutedioaktiacutevne (najčastejšie fluorescenčneacute)

Raacutedioaktiacutevne značeneacute proacuteby pomocou izotopov (32P) sa využiacutevali viac v minulosti v suacutečasnosti suacute kvocircli zdravotnyacutem rizikaacutem ohľaduplnosti k životneacutemu prostrediu ako aj kvocircli jednoduchšej manipulaacutecii použiacutevaneacute fluorescenčne značeneacute proacuteby Raacutedioaktiacutevne značeneacute sondy boli použiacutevaneacute hlavne metoacutedou Southernovej hybridizaacutecie (Southern blotting Southern blot) Citlivosť raacutedioaktiacutevne značenyacutech proacuteb je vyššia dosahuje schopnosť zachytiť 10 fg (femtogram 10-15) cieľovej DNA sekvencie 81 Southern blot

Metoacutedu objavil v roku 1975 britskyacute bioloacuteg Edwin Southern (preto Southern) Pri Southernovej hybridizaacutecii sa restrikčne štiepeneacute fragmenty DNA elektroforeticky separujuacute v geacuteli potom sa metoacutedou blottingu prenesuacute na nylonovuacute alebo nitroceluloacutezovuacute membraacutenu kde suacute naacutesledne hybridizovaneacute v roztoku obsahujuacutecom raacutedioaktiacutevne značenuacute sondu Priloženiacutem fotografickeacuteho filmu k membraacutene a vyvolaniacutem filmu autoraacutediografiou docircjde k zviditeľneniu lokaliacutet kde došlo k hybridizaacuteciiacute raacutedioaktiacutevne značenej sondy s fragmentom DNA (autoraacutediogram) Southern blot bol kľuacutečovou a prvou metoacutedou na identifikaacuteciu osocircb (DNA fingerprinting DNA pofiling) (obr 35)

Okrem Southern blotu existuje Northern blot na analyacutezu RNA (geacutenovej expresie) a Western blot na analyacutezu proteiacutenov postup je obdobnyacute ako pri Southern blote s obmenami špecifickyacutemi pre konkreacutetny blot Pri Northern blote sa použiacutevajuacute hybridizačneacute proacuteby ale pre vizualizaacuteciu proteiacutenov western blotom je potrebneacute použiť protilaacutetky s naacuteslednou vizualizaacuteciou Pomenovanie techniacutek je hra so sloviacutečkami (keďže paacuten Northern ani Western neobjavili takto nazvaneacute techniky)

Neraacutedioaktiacutevne značenie proacuteb použiacutevanyacutech v molekulaacuternej genetike mocircže byť nepriame (použitie haptenu) alebo priame Konečnaacute vizualizaacutecia je najčastejšie zabezpečenaacute fluoreskujuacutecimi farebnyacutemi značkami farbivami fluorochroacutemami (fluorofoacuterami) Pri priamom značeniacute je farbička kovalentne naviazanaacute na nukleotid a na zachytenie fluorescencie suacute potrebneacute špeciaacutelne priacutestroje umožňujuacutece excitaacuteciu farbičky ktoraacute potom emituje žiarenie určitej vlnovej dĺžky (emisneacute žiarenie) a to zachytiacute detekčnyacute systeacutem priacutestroja Využitie fluorochroacutemov v molekulaacuternej genetike je masiacutevne napr na vizualizaacuteciu NK elektroforeticky separovanyacutech v geacuteli kvantifikaacuteciu produktov PCR reakcie v priacutestroji real-time PCR cykleacuter sekvenovaniacute fragmentačnej analyacuteze FISH DNA mikročipoch atď

40

Obr 35 Princiacutep Southern blotu

82 FISH (fluorescenčnaacute in situ hybridizaacutecia)

FISH (fluorescent in situ hybridization fluorescenčnaacute in situ hybridizaacutecia) metoacuteda patriacute medzi molekulovo-cytogenetickeacute techniky Princiacutep FISH metoacutedy je založenyacute na hybridizaacuteciiacute fluorescenčne značenyacutech proacuteb ku komplementaacuternym uacutesekom vyšetrovanej DNA na podložnom skle (priamo na mieste - in situ) K denaturaacutecii dsDNA dochaacutedza buď vplyvom denaturačnyacutech činidiel alebo zvyacutešenou teplotou a naacuteslednou renaturaacuteciou dochaacutedza k naviazaniu sondy na komplementaacuterny uacutesek DNA Vyacutesledok hybridizaacutecie sa vizualizuje fluorescenčnyacutem mikroskopom vybavenyacutem vhodnyacutemi fluorescenčnyacutemi filtrami a vizuaacutelne zhodnotiacute skuacutesenyacutem odborniacutekom Fluorescencia sa v niektoryacutech priacutepadoch mocircže zaznamenať a hodnotiť aj pomocou softveacuteru (obr 36)

Pomocou FISH detegujeme numerickeacute aberaacutecie - zmeny v počte chromozoacutemov (napr trizoacutemia monozoacutemia chromozoacutemov) alebo štruktuacuterne aberaacutecie a prestavby (napr translokaacutecie inverzie deleacutecie duplikaacutecie amplifikaacutecie) FISH metoacuteda umožňuje identifikaacuteciu a detekciu každeacuteho ľudskeacuteho chromozoacutemu jeho zaradenie do karyotypu odhalenie malyacutech submikroskopickyacutech chromozoacutemovyacutech zmien a tiež mapovať poziacutecie jednotlivyacutech geacutenov na chromozoacuteme

41

Obr 36 Princiacutep štandardnej FISH a FISH maľovania celeacuteho chromozoacutemu

Veľkou vyacutehodou FISH metoacutedy je možnosť analyacutezy buniek v metafaacuteze aj v interfaacuteze kedy nie je nutnaacute kultivaacutecia buniek a tiež ryacutechle analyzovanie veľkeacuteho počtu buniek (stovky až tisiacutece) K ďalšiacutem vyacutehodaacutem patriacute bezpečnosť vysokaacute citlivosť dostatočnaacute stabilita relatiacutevne kraacutetky čas hybridizaacutecie a možnosť ryacutechleho vyhodnotenia Hybridizaacutecia pri vaumlčšine suacutečasne dodaacutevanyacutech sond trvaacute 10-12 hodin (na trhu suacute už dostupneacute aj sondy so skraacutetenyacutem časom hybridizaacutecie na 2-3 hodiny) Po hybridizaacuteciiacute nasleduje odmyacutevanie kedy pri priacuteslušnej teplote dochaacutedza k odmytiu nenaviazanyacutech a nespraacutevne hybridizovanyacutech sond Preparaacutet sa naacutesledne podfarbiacute a vyacutesledok sa zhodnotiacute vo fluorescenčnom mikroskope Na podfarbenie chromozoacutemov alebo jadier sa použiacuteva modreacute kontrastneacute farbivo DAPI (46-diamidino-2-fenylindol) ktoreacute maacute silneacute fluorescenčneacute vlastnosti dokaacuteže prechaacutedzať jadrovou membraacutenou a viazať sa na DNA Vyacutesledkom je modreacute zafarbenie ktoreacute vyacuteborne kontrastuje so signaacutelmi jednotlivyacutech sond

Limitujuacutecim faktorom FISH je možnosť identifikaacutecie len tyacutech uacutesekov DNA ku ktoryacutem suacute použiteacute sondy V jednej analyacuteze je možneacute použiť najviac 3 odlišne značeneacute sondy a tak zistiť priacutepadneacute abnormality len na 1 alebo na paacuter lokusoch Na relevantnuacute detekciu je potrebneacute mať vo vzorke 1-5 aberantnyacutech interfaacutezovyacutech jadier

FISH je možneacute uskutočniť na širokej škaacutele biologickeacuteho materiaacutelu na vzorkaacutech perifeacuternej krvi kostnej drene naacuteteroch choriovyacutech klkoch plodovej vode rocircznych druhov tkaniacutev natiacutevnych alebo zaliatych v parafiacutene na 1 bunke (predimplantačnaacute genetickaacute diagnostika PGD) (obr 37)

Využiacuteva sa na detekciu aberaacuteciiacute pri mnohyacutech onkologickyacutech ochoreniach (napr pri diagnoacuteze mnohopočetnyacute myeloacutem sa v suacutečasnosti po separaacutecii CD138+ buniek robiacute FISH s 5 sondami pre geacuteny IGH TP53 RB1 oblasť 1p321q21 a stanovuje sa hyperploidia chromozoacutemov 5 9 a 15) a tiež k spresneniu doplneniu a k overeniu bežneacuteho cytogenetickeacuteho vyšetrenia

Podľa miesta na chromozoacuteme na ktorom dochaacutedza k hybridizaacutecii sondy rozlišujeme 4 typy

DNA sond bull centromeacuteroveacute sondy ndash sa viažu na strednuacute časť chromozoacutemu ndash centromeacuteru sluacutežia k diagnostike zmien v počte chromozoacutemov k detekcii chromozoacutemov neznaacutemeho pocircvodu umožňujuacute interfaacuteznu FISH na nedeliacich sa bunkaacutech (obr 38-41)

42

Obr 37 Interfaacutezna FISH preimplantačnyacute genetickyacute skriacutening aneuploidiiacute ndash blastomeacutera 3-denneacuteho ľudskeacuteho embrya s normaacutelnym počtom chromozoacutemov 13 18 21 pohlavie XY použityacutech 5 sond pre chromozoacutemy 13 ndash orange 18 ndash aqua 21 ndash green X ndash blue a Y ndash yellow (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

Obr 38 Interfaacutezne jadro po hybridizaacutecii s centromeacuterovou sondou pre chromozoacutem 8 (Vysis Abbott) V pravom jadre je priacutetomnaacute trizoacutemia chromozoacutemu 8 (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex) Obr 39 Metafaacutezna (A) a interfaacutezna FISH (B) použitaacute centromeacuterovaacute sonda CEPX spectrum orangeCEPY spectrum green (Vysis Abbott) Sonda hybridizuje k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (červenyacute signaacutel) a Y (zelenyacute signaacutel) (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

43

Obr 40 Interfaacutezna FISH vyšetrenie spermiiacute použiteacute sondy CEPX greenCEPY orange (Aneuscore Metasystems) Sondy hybridizujuacute k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (zelenyacute signaacutel) Y (červenyacute signaacutel) vľavo ndash dve haploidneacute spermie (majuacutece jedna spermia X druhaacute Y chromozoacutem) vpravo ndash dve patologickeacute spermie obsahujuacutece gonozoacutemovyacute komplement XY (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

Obr 41 Interfaacutezna FISH vyšetrenie spermiiacute použiteacute sondy CEPX greenCEPY orange a CEP18 aqua (Aneuscore Metasystems) Sondy hybridizujuacute k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (zelenyacute signaacutel) Y (červenyacute signaacutel) a 18 (modryacute signaacutel) vľavo ndash normaacutelne haploidneacute ľudskeacute spermie - 1x chromozoacutem X alebo Y a jedenkraacutet chromozoacutem 18 v strede ndash patologickaacute spermia obsahujuacuteca gonozoacutemovyacute komplement XY a jeden chromozoacutem 18 vpravo ndash patologickaacute diploidnaacute spermia s chromozoacutemami X Y a dvoma chromozoacutemami 18 (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

bull lokusovo špecifickeacute sondy ndash hybridizaacutecia prebehne na konkreacutetnom mieste geacutenu (lokuse) (obr 42-44) použiacutevajuacute sa k vyšetreniu mikrodeleacuteciiacute (straty malyacutech častiacute chromozoacutemu pri mikrodelečnyacutech syndroacutemoch) k zisteniu amplifikaacutecie onkogeacutenov a niektoryacutech špecifickyacutech translokaacuteciiacute prestavby geacutenov umožňujuacute interfaacuteznu FISH na nedeliacich sa bunkaacutech bull subtelomeroveacute ndash vaumlzba na koncoveacute časti chromozoacutemu ndash telomeacutery bull celochromozoacutemoveacute alebo celomaľovacie sondy ndash sondy hybridizujuacute s mnohopočetnyacutemi chromozoacutemovyacutemi sekvenciami pričom sa fluorescenčne tak bdquovymaľujeldquo celyacute chromozoacutem (Obr 45) Použiacutevajuacute sa na vyšetrenie chromozoacutemovyacutech prestavieb k analyacuteze translokaacuteciiacute a k detekcii pocircvodu tzv marker chromozoacutemov (malyacutech nadpočetnyacutech chromozoacutemov neznaacutemeho pocircvodu) K použitiu sondy suacute potrebneacute metafaacutezne chromozoacutemy nepoužiacutevaju sa pre interfaacuteznu FISH

Pri konvenčnej chromozoacutemovej FISH suacute homogeacutenne DNA proacuteby hybridizovaneacute s fixovanyacutem metafaacuteznym alebo prometafaacuteznym chromozoacutemomchromozoacutemami na skliacutečku (Obr 36a) Maximaacutelna rozlišovacia schopnosť metafaacuteznej FISH je niekoľko megabaacutez (Obr 39a 45) využitiacutem viac

44

natiahnutyacutech prometafaacuteznych chromozoacutemov sa dosiahne 1 Mb rozliacutešenie Prostredniacutectvom fiber FISH konkreacutetne artificiaacutelne deproteinizovanej natiahnutej DNA pripravenej in situ z celyacutech buniek na mikroskopickom skliacutečku je možneacute vizualizovať individuaacutelne geacuteny maleacute DNA elementy na chromozoacuteme s rozliacutešeniacutem okolo 1000 bp

Obr 42 Interfaacutezne jadro po hybridizaacutecii s lokusovo-špecifickou sondou LSI 5q31 Spectrum Orange5p12 Spectrum Green (Vysis Abbott) Na ľavom obraacutezku suacute priacutetomneacute dva červeneacute (5q31) a dva zeleneacute signaacutely (5p12) v pravom jadre je priacutetomnaacute deleacutecia 5q31 oblasti chyacuteba jeden červenyacute signal (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

Obr 43 Interfaacutezna FISH použitaacute lokusovo-špecifickaacute sonda ndash translokačnaacute - XL BCRABL1 plus (Metasystems) dvojfarebnaacute dvojfuacutezna kde červenaacute označuje lokus ABL1 na chromozoacuteme 9 a zelenaacute oblasť BCR na chromozoacuteme 22 Sonda deteguje fuacuteziu protoonkogeacutenu ABL1 (9q34) a geacutenu BCR (22q11) v priacutepade že červenyacute a zelenyacute signaacutel suacute pri sebe (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

45

Obr 44 Interfaacutezna FISH Použitaacute lokusovo-špecifickaacute sonda- typ break apart pre IGH geacuten V docircsledku translokaacutecie došlo k rozskočeniu geacutenu pričom translokačneacuteho partnera nepoznaacuteme vieme určiť len percento v koľkyacutech jadraacutech je geacuten prestavanyacute (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex) Obr 45 Použiteacute celochromozoacutemoveacute sondy WCP 15 (červenyacute chromozoacutem) a WCP 17 (zelenyacute chromozoacutem) Na metafaacuteze je potvrdenaacute reciprokaacute translokaacutecia t(1517)(q2221) (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

FISH vizualizaacutecia celeacuteho chromozoacutemu maľovanie chromozoacutemu anglicky chromosome

painting je špeciaacutelnou aplikaacuteciou chromozoacutemovej FISH proacuteba je koktail veľkeacuteho počtu rocircznych fluorescenčne značenyacutech DNA fragmentov hybridizujuacutecich pozdĺž celeacuteho konkreacutetneho chromozoacutemu (obr 36b 45) bdquoChromosomepaintingldquo analyzuje metafaacutezne chromozoacutemy V minulosti bola FISH vizualizaacutecia celyacutech chromozoacutemov limitovanaacute malyacutem množstvom rocirczne sfarbenyacutech fluorochroacutemov

V suacutečasnosti je možneacute detegovať množstvo cieľovyacutech sekvenciiacute naraz čo sa využiacuteva pri celogenoacutemovej chromozoacutemovej vizualizaacutecii (whole-chromosomepainting - WCP) metoacutedou multiplex FISH (M-FISH multicolor FISH o br 46) alebo spektraacutelnej karyotypizaacutecie (SKY) kedy možno rozliacutešiť všetky ľudskeacute chromozoacutemy ndash teda 24 rocircznych chromozoacutemov M-FISH a SKY patria medzi metafaacutezne formy FISH diagnostiky ktoreacute umožňujuacute simultaacutennu vizualizaacuteciu všetkyacutech ľudskyacutech chromozoacutemov v rocircznych farbaacutech čo predstavuje uľahčenie analyacutezy karyotypu hlavne pri komplexnyacutech zmenaacutech a markeroch neznaacutemeho pocircvodu Obe techniky vychaacutedzajuacute z použitia

46

celochromozoacutemovyacutech sond značenyacutech kombinaacuteciou viaceryacutech fluorochroacutemov Rozdiel medzi M-FISH a SKY spočiacuteva v technike ziacuteskania konečneacuteho obrazu

Obr 46 Multicolor FISH - každyacute chromozoacutemovyacute paacuter je zafarbenyacute inou farbou pričom na ich zafarbenie postačuje kombinaacutecia 5 fluorochroacutemov Na vyhodnocovanie je potrebnaacute špeciaacutelna sada fluorescenčnyacutech filtrov pre jednotliveacute fluorochroacutemy a špeciaacutelnyacute softweacuter Vľavo-štandardnyacute karyotyp vpravo karyotyp s mutaacuteciami (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

V molekulovej cytogenetike suacute komerčne dostupneacute sety M-FISH proacuteb umožňujuacutece

viacfarebneacute pruacutežkovanie chromozoacutemov (banding) s vysokyacutem rozliacutešeniacutem (multicolor-banding mBAND FISH MCB) čo umožňuje identifikaacuteciu intrachromozoacutemovyacutech prestavieb (Obr 47) Nevyhnutnosťou mBAND-u je mať chromozoacutemy v metafaacuteze Taacuteto metoacuteda bola prvyacutekraacutet uskutočnenaacute na chromozoacuteme 5 v roku 1999 mBAND FISH umožňuje rozliacutešiť špecifickeacute oblasti chromozoacutemov na uacuterovni pruacutežku - bandu a sub-bandu s detekciou 550 bandov haploidneacuteho karyotypu

Obr 47 A - mBAND chromozoacutemu 11 - inverzia duplikovanej oblasti 11q223-q25 B - mBAND chromozoacutemu 3 - na kruhovom chromozoacuteme deleacutecia oblasti 3p263 C - mBAND chromozoacutemu 2 - potvrdenie inverzie duplikovanej časti chromozoacutemu (poskytnuteacute RNDr Dagmar Landlovou Medirex)

FISH metoacuteda a jej varianty (M-FISH mBAND SKY) majuacute v suacutečasnosti širokeacute využitie v

klinickej genetike v onkologickej genetike na detekciu aberaacuteciiacute v čase diagnoacutezy počas liečby po

47

liečbe monitorovanie po transplantaacutecii kostnej drene v prenataacutelnej a postnataacutelnej diagnostike pri detekcii submikroskopickyacutech deleacuteciiacute (napr DiGeorge syndroacutem - 22q112 delečnyacute syndroacutem PraderndashWilli syndroacutem- chromozoacutem 15q11-13) prostredniacutectvom FISH je možnaacute detekcia numerickyacutech zmien chromozoacutemov (trizoacutemia chromozoacutemu 21 pri Downovom syndroacuteme trizoacutemia chromozoacutemu 15 pri Patauovom syndroacuteme trizoacutemia chromozoacutemu 18 pri Edwardsovom syndroacuteme) rocirczne zmeny v počte pohlavnyacutech chromozoacutemov (monozoacutemia X pri Turnerovom syndroacuteme Klinefelterov syndroacutem s X chromozoacutemom naviac - XXY) podobne v predimplantačnej diagnostike

83 DNA Microarray (DNA mikro čip biočip) DNA mikročipovanie je technika využiacutevajuacuteca hybridizaacuteciu skuacutemanej nukleovej kyseliny

(cieľovaacute vzorka) s veľkyacutem množstvom oligonukleotidovyacutech proacuteb (desať tisiacutec až milioacuten) ktoreacute suacute prichyteneacute na pevnyacute podklad najčastejšie sklenyacute silikoacutenovyacute alebo nylonovyacute (doštička čip) Skuacutemanaacute nukleovaacute kyselina je pred hybridizaacuteciou fragmentovanaacute označenaacute fluorofoacuterom a denaturovanaacute Po kontakte čipu s cieľovou vzorkou ktoraacute je vlastne zmes označenyacutech oligonukleotidov značeneacute oligonukleotidy hybridizujuacute s oligonukleotidovyacutemi sekvenciami prichytenyacutemi na čipe Potom suacute na zaacuteklade fluorescencie detekovaneacute miesta kde došlo k hybridizaacutecii čiže vzorka obsahovala takuacuteto nukleotidovuacute sekvenciu Z jedneacuteho mikročipu sa ziacuteska obrovskeacute množstvo daacutet ktoreacute je vždy nutneacute softveacuterovo spracovať V dnešnej dobe existuje niekoľko firiem poskytujuacutecich komerčne mikročipy na objednaacutevku alebo si ich laboratoacuteria produkujuacute sami

Mikročipovanie prebieha nasledovne

1) Vytvorenie DNA čipu ndash tisiacutece rocircznych jednovlaacuteknovyacutech DNA oligonukleotidov znaacutemych sekvencii sa kovalentne naviažu na povrch doštičky vždy v určitej lokalite je niekoľko rovnakyacutech oligonukleotidov veľkosť takejto lokality je ˂ 200 microm Proacutebami mocircže byť DNA cDNA alebo syntetizovaneacute oligonukleotidy Už hotoveacute mikročipy ponuacutekajuacute viacereacute firmy (Affymetrix Agilent Technologies Eppendorf Illumina) alebo si ich jednotliveacute laboratoacuteria vyraacutebajuacute sami pomocou robotickyacutech zariadeniacute DNA čip sa vytvaacutera buď nanaacutešaniacutem kvapiek oligonukleotidov na podklad alebo synteacutezou oligonukleotidov in situ na čipe 2) Priacuteprava vzorky ndash nukleovaacute kyselina (mRNA DNA) sa purifikuje určiacute sa jej kvantita a kvalita (spektrofotometericky) fragmentuje resp v priacutepade mRNA sa syntetizuje cDNA v priacutepade potreby sa mocircže DNA amplifikovať PCR reakciou štiepiť restrikčnyacutemi endonukleaacutezami 3) Fluorescenčneacute označenie (zriedkavejšie raacutedioaktiacutevne) fragmentov DNA prebieha počas reverznej transkripcie alebo PCR amplifikaacutecie za uacutečasti fluorescenčne značenyacutech nukleotidov Keď sa analyzujuacute dve rocirczne vzorky napr zdraveacute tkanivo a naacutedoroveacute tkanivo označenie nukleovyacutech kyseliacuten v tyacutechto tkanivaacutech byacuteva rozdielne a to použitiacutem dvoch rocircznych fluorescenčnyacutech farbiacutev (napr zeleneacute a červeneacute) Pred hybridizaacuteciou je potrebneacute vzorku denaturovať čiacutem sa vytvoriacute zmes jednovlaacuteknovyacutech DNA označenyacutech značkou 4) Hybridizaacutecia s mikročipom ndash v špeciaacutelnom hybridizačnom roztoku hybridizujuacute komplementaacuterne sekvencie zo vzorky s priacuteslušnyacutemi oligonukleotidovyacutemi sondami naviazanyacutemi na čipe Potom sa čip obmyje aby došlo k odstraacuteneniu čiastočne hybridizovanyacutech nukleovyacutech kyseliacuten 5) Skenovanie mikročipu ndash skenerom čipov docircjde k ožiareniu čipu laserom pričom v mieste hybridizaacutecie fluorescenčne značenyacutech DNA fragmentov s proacutebou docircjde k emisii svetla určitej vlnovej dĺžky ktoruacute skener zaznamenaacute 6) Analyacuteza daacutet prebieha metoacutedami bioinformatiky spracovaniacutem softveacutermi sa zistiacute ktoreacute lokality čipu navzaacutejom hybridizovali v priacutepade použitia dvoch vzoriek kontrolnej a skuacutemanej je možneacute analyzovať ich relatiacutevnu intenzitu hybridizaacutecie (expresie určiteacuteho geacutenu)

Existujuacute štyri typy mikročipov 1) Čipy ur čeneacute na analyacutezu expresie (obsahujuacute cDNA proacuteby) pre tzv dvojkanaacutelovyacute experiment kedy je vzorka určenaacute k hybridizaacutecii na čipe ziacuteskanaacute zmiešaniacutem DNA fragmentov kontrolnej a skuacutemanej vzorky pričom fragmenty suacute rozdielne fluorescenčne označeneacute (napr zelenyacute fluorofoacuter pre kontrolnuacute vzorku a červenyacute pre skuacutemanuacute) Na zaacuteklade intenzity a typu fluorescencie sa deteguje expresia geacutenov typickaacute pre kontrolnuacute vzorku (napr zelenaacute fluorescencia) pre skuacutemanuacute vzorku (napr

48

červenaacute fluorescencia) a expresia podobnaacute u oboch vzoriek (žltaacute fluorescencia) neexprimovaneacute geacuteny (čierna fluorescencia) rocirczne odtiene (v zaacutevislosti od prevažujuacutecej hybridizaacutecie) (obr 48) 2) Čipy ur čeneacute na analyacutezu mutaacutecii použije sa genoacutemovaacute DNA označenaacute jednou fluorescenčnou farbičkou na určenie jednonukleotidovej zmeny (SNP ndash Single Nukleotide Polymorphism) 3) Čipy na komparatiacutevnu genoacutemovuacute hybridizaacuteciu (aCGH array Comparative Genomic Hybridization) ndash použiacutevaneacute na zistenie zvyacutešenia alebo zniacuteženia množstva chromozoacutemovyacutech fragmentov obsahujuacutecich geacuteny zodpovedneacute za určiteacute ochorenie Na analyacutezu sa použije skuacutemanaacute gDNA a referenčnaacute (kontrolnaacute) DNA každaacute sa značiacute inou fluorescenčnou farbičkou (princiacutep ako pri analyacuteze expresie) (obr 49 50) 4) Čipy CGH - SNP kombinovaneacute čipy ur čeneacute na analyacutezu aj mutaacuteciiacute SNP aj na komparatiacutevnu genoacutemovuacute hybridizaacuteciu CGH

Mikročipy majuacute rozsiahle využitie napriacuteklad v identifikaacuteciiacute novyacutech geacutenov vo vyacuteskume ich funkciiacute expresie v rocircznych podmienkach pri diagnostike mnohyacutech ochoreniacute vo farmakogenomike vo vyacuteskume vplyvu toxiacutenov

Obr 48 Heatmapa geacutenovej expresie vybranyacutech geacutenov (mRNA) mikročip obsahuje 46000 cDNA proacuteb (poskytnuteacute Ing Helenou Gbelcovou PhD Uacutestav lekaacuterskej bioloacutegie genetiky a klinickej genetiky LF UK a UNB)

49

Obr 49 Princiacutep komparatiacutevnej genoacutemovej hybridizaacutecie (aCGH - array comparative genomic hybridization) Obr 50 A) Vyacutesledok komparatiacutevnej genoacutemovej hybridizaacutecie (aCGH - array comparative genomic hybridization) vzorky DNA izolovanej plodovej vody U plodu s abnormaacutelnym ultrasonografickyacutem vyšetreniacutem bola identifikovanaacute duplikaacutecia oblasti 3q261q29 (modryacute paacutes) a deleacutecia oblasti 5p1533p151 (červenyacute paacutes) Pre porovnanie chromozoacutem 1 bez aberaacutecie b) Ten istyacute pacient ale ineacute softveacuteroveacute spracovanie (poskytnuteacute RNDr Miroslavom Tomkom PhD Medirex)

50

Odporuacutečanaacute a použitaacute literatuacutera

Odborneacute knihy Klug W S Cummings M R Spencer Ch A Palladino M A Concepts of Genetics jedenaacuteste vydanie (2015) Carson S Molecular Biology Techniques tretie vydanie (2012) Strachan T Read A Human Molecular Genetics štvrteacute vydanie (2011) Sudbery P Sudbery I Human Molecular Genetics tretie vydanie (2009)

Internetoveacute straacutenky

wwwncbinlmnihgov wwwmlpacom wwwthermofishercom wwwilluminacom wwwpromegask wwwqiagencom wwwambioncom

Odborneacute člaacutenky Chacon-Cortes D Griffiths L R Methods for extracting genomic DNA from whole blood samples current perspectives Journal of Biorepository Science for Applied Medicine Volume 2 strany 1- 9 Viltrop T Krjutskov K Palta P Metspalu A Comparison of DNA extraction methods for multiplex polymerase chain reaction Anal Biochem 2010 Volume 398(2) strany 260-262 Ing Martin Čermaacutek Molekulaacuterna cytogenetika v problematike familiaacuternych maligniacutet Onkoloacutegia Volume 2 strany 77 - 83 Livak KJ Schmittgen TD Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method Methods 2001 Volume 25(4) strany 402 - 408 Bustin S A Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays J Mol Endocrinol 2000 Volume 25(2) strany169 - 193

MOLEKULAacuteRNE METOacuteDY AKTUAacuteLNE POUŽIacuteVANEacute V KLINICKEJ GENETIKE RNDr Andrea Pastoraacutekovaacute PhD RNDr Robert Petrovič PhD Vydala Univerzita Komenskeacuteho v Bratislave Lekaacuterska fakulta Rozsah 50 straacuten 246 AH prveacute vydanie ISBN 978-80-223-4231-5

29

5 MLPA

Multiplexnaacute amplifikaacutecia proacuteb zaacutevislaacute od ligaacutecie (z angl multiplex ligation-dependent probe amplification) je metoacuteda schopnaacute v jednej reakcii (v jednej skuacutemavke a vzorke) detegovať zmeny v počte až 50 nukleotidovyacutech sekvenciiacute Metoacutedou MLPA je možneacute ryacutechlo identifikovať amplifikaacutecie (duplikaacutecie) a deleacutecie veľkeacuteho počtu geacutenov či už použitiacutem DNA alebo mRNA krvnyacutech vzoriek alebo vzoriek z naacutedorov

Princiacutep MLPA spočiacuteva v multiplexnej amplifikaacutecii 50 špecifickyacutech nukleotidovyacutech sekvenciiacute použitiacutem jedneacuteho paacuteru primerov pričom jeden primer je fluorescenčne označenyacute Vyacutesledneacute PCR produkty suacute analyzovaneacute kapilaacuternou elektroforeacutezou (fragmentačnaacute analyacuteza) Dĺžka každeacuteho namnoženeacuteho produktu je jedinečnaacute narastaacute postupne o 6 alebo 9 nukleotidov pričom produkty PCR suacute 120 ndash 500 nukleotidov dlheacute Tento veľkostnyacute rozsah PCR fragmentov (dĺžka 120-500 nukleotidov s naacuterastom postupne o 6 alebo 9 nukleotidov) je optimaacutelny pre kapilaacuternu elektroforeacutezu MLPA multiplexnaacute PCR prebieha za použitia iba jedineacuteho paacuteru primerov ktoreacute amplifikujuacute špecifickeacute sekvencie Trik spočiacuteva v tom že nedochaacutedza k amplifikaacutecii DNA sekvencie ale MLPA proacuteb ktoreacute suacute pridaneacute k vzorkaacutem Každaacute MLPA proacuteba pozostaacuteva z dvoch oligonukleotidov (dve hemiproacuteby) pričom každyacute oligonukleotid obsahuje jednu zo sekvencie rozpoznaacutevanuacute PCR primermi Proacuteba vznikne jedine za predpokladu hybridizaacutecie dvoch oligonukleotidov (hemiproacuteb) k cieľovej sekvencii (geacutenu) a po ligaacutecii enzyacutemom ligaacutezou Iba ligovaneacute proacuteby suacute exponenciaacutelne amplifikovaneacute pomocou jedneacuteho paacuteru primerov Množstvo zligovanyacutech proacuteb teda zaacutevisiacute od množstva cieľovyacutech sekvenciiacute (geacutenov) vo vzorke

Postup MLPA analyacutezy je nasledovnyacute (obr27) K vzorke nukleovej kyseliny (DNA resp mRNA) sa pridaacute zmes 50 jedinečnyacutech proacuteb každaacute

proacuteba je komplementaacuterna k určitej cieľovej sekvencii NK vzorky Každaacute proacuteba však pozostaacuteva z dvoch oligonukleotidov hybridizujuacutecich vedľa seba zaacuteroveň každyacute oligonukleotid (hemiproacuteba) obsahuje pridanuacute sekvenciu rozpoznaacutevanuacute paacuterom PCR primerov Po hybridizaacuteciiacute oligonukleotidov (hemiproacuteb) dochaacutedza k ich ligaacutecii ligaacutezou Ligačnaacute reakcia je tak špecifickaacute že je schopnaacute rozliacutešiť sekvenciu liacutešiacu sa v jednom nukleotide Vyacuteslednyacute ligačnyacute produkt (proacuteba) obsahuje obidve sekvencie pre PCR primery na jednom fragmente čiže mocircže docircjsť k namnoženiu takeacutehoto fragmentu PCR reakciou V priacutepade ak nedocircjde k ligaacutecii priacuteslušnyacutech hemiproacuteb pretože hemiproacuteby nenaacutejdu cieľovuacute sekvenciu na DNA každaacute takaacuteto nezligovanaacute hemiproacuteba maacute len jednu sekvenciu rozpoznaacutevanuacute len jednyacutem PCR primerom v docircsledku čoho nemocircže prebehnuacuteť jej PCR amplifikaacutecia a počas fragmentačnej analyacutezy nie je detegovanaacute pretože negeneruje fluorescenčnyacute signaacutel

Pri MLPA analyacuteze je docircležiteacute okrem MLPA amplifikaacutecie vzorky urobiť aj MLPA amplifikaacuteciu referenčnej vzorky ku ktorej sa bude porovnaacutevať počet geacutenov (cieľovyacutech sekvenciiacute) Po kapilaacuternej elektroforeacuteze MLPA referenčnej a skuacutemanej vzorky porovnaniacutem obsahu nameranyacutech hodnocirct tzv piacutekov priacuteslušnyacutech proacuteb sa určiacute relatiacutevny počet koacutepiiacute v skuacutemanej vzorke

MLPA

1 DNA denaturaacutecia a hybridizaacutecia s MLPA proacutebami (hemiproacuteby)

2 Ligaacutecia (vytvorenie kompletnyacutech proacuteb)

3 PCR amplifikaacutecia proacuteb paacuterom primerov

4 Kapilaacuterna elektroforetickaacute separaacutecia PCR produktov

5 Analyacuteza daacutet

30

Obr 27 Princiacutep MLPA

Firma MRC-Holland v suacutečasnosti ponuacuteka stovky MLPA setov proacuteb ktoreacute suacute vhodneacute na 1) diagnostiku kongenitaacutelnych a dedičnyacutech ochoreniacute 2) zisťovanie profilu naacutedorov 3) zisťovanie metylačneacuteho profilu

MLPA je metoacuteda vhodnaacute na detekciu malyacutech prestavieb (BRCA1 BRCA2 MSH2 atď)

veľkyacutech chromozoacutemovyacutech prestavieb (Williamsov syndroacutem Prader-WilliAngelman syndroacutem atzď)

31

detekciu zmien v počte koacutepii geacutenov (obr 28 29) ako aj zistenie počtu kompletnyacutech chromozoacutemov (chromozoacutem 13 18 21 XY tiež aj z amniovej tekutiny) diagnostiku naacutedorov (zmeny počtu pri ALL CLL atď) kvantifikaacuteciu metylaacutecie (Prader-WilliAngelmanov syndroacutem Fragilnyacute X inaktivaacutecia naacutedorovyacutech supresorovyacutech geacutenov atď) mRNA analyacutezu geacutenov zuacutečastňujuacutecich sa apoptoacutezy alebo zaacutepalov

MS-MLPA (Methylation-Specific MLPA) je varianta MLPA určenaacute špeciaacutelne na analyacutezu aberantnyacutech metylaacutecii imprintovanyacutech oblastiacute ako aj detekciu metylačnyacutech zmien CpG ostrovčekov lokalizovanyacutech bliacutezko promoacutetora Rozdiel oproti štandardnej MLPA spočiacuteva v použitiacute metylačne senzitiacutevneho restrikčneacuteho enzyacutemu HhaI ktoryacute štiepi MS-MLPA proacuteby hybridizovaneacute k nemetylovanej sekvencii Každaacute DNA vzorka určenaacute pre MS-MLPA analyacutezu prejde dvoma reakciami v jednej mikroskuacutemavke štandardnou MLPA analyacutezou (bez štiepenia metylačne senzitiacutevnym enzyacutemom) a v druhej mikroskuacutemavke docircjde okrem ligaacutecie proacuteb aj k metylačne senzitiacutevnemu štiepeniu hybridizovanyacutech proacuteb s nemetylovanou DNA Amplifikujuacute sa len ligovaneacute proacuteby po PCR amplifikaacutecii sa fragmentačnou analyacutezou porovnaniacutem oboch reakciiacute zistia rozdiely v metylačnom profile vzorky k referenčnej vzorke

RT-MLPA (Reverse Transkriptase MLPA) je variaacutecia MLPA určenaacute pre zistenie mRNA profilu vzorky je alternatiacutevou k real-time PCR a mikročipom RT-MLPA nedeteguje mRNA množstvo priamo pretože použiacutevanaacute ligaacuteza nie je schopnaacute ligovať DNA oligonukleotidy keď suacute hybridizovaneacute s RNA Preto RT-MLPA začiacutena reverznou transkripciou so špeciaacutelne navrhnutyacutemi RT primermi tak aby vytvorili kraacutetke oligonukleotidy (cDNA) Potom reakcia pokračuje ako štandardnaacute MLPA

Obr 28 MLPA analyacuteza geacutenu DMD (koacutedujuacuteceho dystrofiacuten) mutaacutecie ktoreacuteho spocircsobujuacute Duchennovu svalovuacute dystrofiu u pacienta je priacutetomnaacute deleacutecia exoacutenu 45 v porovnaniacute s referenčnou vzorkou ndash kontrolou

32

Obr 29 MLPA analyacuteza geacutenu DMD (koacutedujuacuteceho dystrofiacuten) mutaacutecie ktoreacuteho spocircsobujuacute Duchennovu svalovuacute dystrofiu u pacienta suacute priacutetomneacute duplikaacutecie exoacutenov 41 42 43 44 45 (piacuteky vo vzorke pacienta sa porovnajuacute s piacutekmi v kontrole ndash referenčnej vzorke)

33

6 Sekvenovanie

Sekvenovaniacutem rozumieme určenie primaacuternej štruktuacutery DNA teda určenie poradia nukleotidov v reťazci DNA Začiatky moderneacuteho sekvenovania siahajuacute do roku 1977 kedy boli objaveneacute dve metoacutedy sekvenovania 1) chemickaacute metoacuteda Maxama a Gilberta 2) enzymatickaacute metoacuteda Sangera Nicklena a Coulsona

Princiacutep obidvoch metoacuted sekvenovania spočiacuteva v tom že sa vytvoriacute suacutebor DNA molekuacutel s rocircznou veľkosťou ktoreacute suacute zakončeneacute konkreacutetnym nukleotidom tieto DNA molekuly sa elektroforeticky separujuacute v geacuteloch s rozlišovacou schopnosťou 1 nukleotid 61 Chemickaacute metoacuteda

DNA molekuly sa na 5-konci raacutedioaktiacutevne označia raacutedioaktiacutevnym fosforom a naacutesledne sa chemicky modifikujuacute špecificky pre každuacute baacutezu DNA sa potom v modifikovanyacutech miestach štiepi čiacutem vzniknuacute rocirczne dlheacute fragmenty pričom podmienky suacute nastaveneacute tak aby sa DNA na každom mieste štiepila len raz Modifikaacutecia DNA a štiepenie prebehne v štyroch separaacutetnych reakciaacutech (skuacutemavkaacutech) takže po elektroforetickej separaacuteciiacute takto opracovanej DNA v štyroch draacutehach polyakrylamidoveacuteho geacutelu a naacuteslednej autoraacutediografii (podobne ako pri Southernovej hybridizaacutecii) je možneacute odčiacutetať nukleotidovuacute sekvenciu približne 100 nukleotidov od raacutedioaktiacutevneho označenia (v čase objavu Maxama a Gilberta) 62 Sangerova metoacuteda

Zaacuteklady metoacutedy boli popiacutesaneacute už v roku 1975 (metoacuteda plus a miacutenus) ale až vylepšenie použitiacutem dideoxynukleotidov (ddNTP) v roku 1977 došlo k zjednodušeniu sekvenovania Princiacutepom enzyacutemoveacuteho sekvenovania je terminaacutecia (zastavenie) polymerizaacutecie inkorporaacuteciou 2´ 3 -dideoxynukleotidov do novosyntetizujuacuteceho sa vlaacutekna DNA Keďže ddNTP neobsahujuacute hydroxylovuacute skupinu na 3 uhliacuteku riboacutezy nemocircžu sa zuacutečastniť na tvorbe fosfodiesterovej vaumlzby nemocircže sa pripojiť k nim ďalšiacute nukleotid čiže musiacute docircjsť k terminaacuteciiacute polymeraacutecie Reakcia prebieha v štyroch skuacutemavkaacutech s raacutedioaktiacutevne značenyacutem primerom V každej skuacutemavke suacute priacutetomneacute všetky štyri deoxynukleotidtrifosfaacutety (dNTP) ale pre každuacute skuacutemavku je špecifickyacute priacutedavok maleacuteho množstva jedneacuteho z dideoxynukleotidtrifosfaacutetov (v prvej skuacutemavke je ddATP v druhej ddCTP v tretej ddTTP a vo štvrtej ddGTP) Maleacute množstvo ddNTP spocircsobiacute že pri polymerizaacutecii dochaacutedza k prednostneacutemu zaradeniu štandardnyacutech dNTP do narastajuacuteceho reťazca a len občas sa inkorporuje ddNTP čiacutem sa zastaviacute synteacuteza reťazca V každej skuacutemavke tak vznikne suacutebor DNA fragmentov rocircznych veľkostiacute zakončenyacutech priacuteslušnyacutem ddNTP (v prvej skuacutemavke ddATP v druhej ddCTP v tretej ddTTP a vo štvrtej ddGTP) Po elektroforetickej separaacutecii v 4 draacutehach polyakrylamidoveacuteho geacutelu a autoraacutediografii sa z autoraacutediogramu odčiacuteta sekvencia

V suacutečasnosti je sekvenovanie do značnej miery automatizovaneacute pričom využiacuteva princiacutep Sangerovej enzyacutemovej metoacutedy s určityacutemi obmenami Uacutesek DNA ktoryacute treba sekvenovať sa prostredniacutectvom termostabilnyacutech DNA polymeraacutez namnožiacute PCR metoacutedou po ktorej nasleduje sekvenačnaacute reakcia (asymetrickaacute PCR) s fluorescenčne značenyacutemi ddNTP (každyacute druh označenyacute inyacutem fluorescenčnyacutem farbivom) Sekvenačnaacute reakcia prebieha v jednej skuacutemavke s jednyacutem primerom vznikne tak suacutebor jednovlaacuteknovyacutech DNA rocircznej dĺžky ktoreacute suacute na 3konci označeneacute ddNTP so špecifickyacutem fluorescenčnyacutem farbivom Taacuteto metoacuteda sekvenovania sa tiež nazyacuteva rdquodye-terminator cycle sequencingrdquo(obr 30) Po kapilaacuternej elektroforeacuteze vzorky v genetickom analyzaacutetore zaznamenaacutevaniacute fluorescencie jednotlivyacutech fragmentov CCD kamerou a softveacuterovom spracovaniacute sa ziacuteska sekvencia DNA (obr 31)

34

Obr 30 Princiacutep sekvenovania Sangerova dideoxy metoacuteda alebo tzv chain termination method (reťazec zastavujuacuteca metoacuteda) Obr 31 Určenie genotypu plodu a rodičov sekvenčnou analyacutezou DNA ziacuteskanej z plodovej vody (prenataacutelna diagnostika) a perifeacuternej krvi sekvenčnaacute analyacuteza geacutenu ASPA vyacutesledok u plodu priacutetomnaacute mutaacutecia c 914CgtA v homozygotnom stave (AA) rodičia heterozygoti (AC) Uvedenaacute mutaacutecia je v homozygotnom stave kauzaacutelnou priacutečinou Canavanovej choroby

Automatizovaneacute sekvenovanie prinaacuteša viacereacute vyacutehody oproti klasickej Sangerovej metoacutede vyššiu presnosť a ryacutechlosť v jednej sekvenačnej reakcii možnosť osekvenovať až 1200 nukleotidovyacute fragment maleacute množstvo templaacutetu potrebneacute na analyacutezu

35

63 Next Generation Sequencing (NGS)

NGS (sekvenovanie novej generaacutecie) maacute obrovskyacute potenciaacutel v analyacuteze genoacutemov pričom toto označenie zahŕňa viacereacute technologickeacute metoacutedy reprezentovaneacute niekoľkyacutemi firmami Princiacutepom je masiacutevne paralelneacute sekvenovanie čiacutem sa ziacuteskajuacute raacutedovo tisiacutece až milioacuteny sekvenciiacute naraz 631 Sekvenovanie druhej generaacutecie

Na začiatku sa analyzovanaacute DNA vo vaumlčšine priacutepadov fragmentuje (vznikne tak DNA

knižnica) na fragmenty sa pripoja kraacutetke sekvencie ndash adapteacutery naacutesledne sa tieto fragmenty rocircznymi priacutestupmi amplifikujuacute a určiacute sa ich sekvencia Vďaka čiastočnyacutem prekryvom je zo ziacuteskanyacutech sekvencii možneacute poskladať plynuluacute sekvenciu zodpovedajuacutecu pocircvodnej nefragmentovanej DNA

Pyrosekvenovanie je podobne ako Sangerova metoacuteda založenaacute na princiacutepe synteacutezy komplementaacuterneho vlaacutekna DNA avšak rozdiel je v tom že sa na detekciu inkorporaacutecie nukleotidu využiacuteva inyacute systeacutem tvorby luminiscenčneacuteho signaacutelu v priebehu reakcie Pyrosekvenovanie je umožneneacute vďaka aktivite 4 enzyacutemov - DNA polymeraacutezy ATP sulfurylaacutezy luciferaacutezy a apyraacutezy Reakčnaacute zmes obsahuje aj ďalšie komponenty - enzymatickeacute substraacutety adenoziacutenfosfosulfaacutet (APS) d-luciferiacuten sekvenovanyacute templaacutet a cyklicky postupne po jednom type pridaacutevaneacute nukleotidtrifosfaacutety Po zabudovaniacute nukleotidu do novovznikajuacuteceho reťazca docircjde k uvoľneniu pyrofosfaacutetu naacutesledne je využityacute ATP sulfurylaacutezou na synteacutezu ATP z APS počas ďalšej reakcie docircjde k využitiu ATP luciferaacutezou na premenu luciferiacutenu na oxyluciferiacuten čo spocircsobiacute svetelnyacute signaacutel a ten zaznamenaacute detekčnyacute systeacutem Poslednou enzymatickou reakciou je reakcia apyraacutezy ktoraacute odstraacuteni nezainkorporovaneacute nukleotidy a nevyužiteacute ATP aby sa celyacute proces mohol zopakovať s reakčnou zmesou obsahujuacutecou ďalšiacute nukleotidtrifosfaacutet (inyacute ako v predchaacutedzajuacutecej reakcii) Po každej reakcii detektor zaznamenaacuteva emisiu svetla na zaacuteklade intenzity svetla je možneacute určiť či bol vradenyacute priacuteslušnyacute nukleotidtrifosfaacutet či bol inkorporovanyacute jeden priacutepadne viac rovnakyacutech nukleotidtrifosfaacutetov

Zvyacutešenie vyacutekonu pyrosekvenovania umožnila tzv emulznaacute PCR v mikročasticiach a použitie platničky PicoTiterPlatereg toto sekvenovanie zaviedla firma Roche pod pojmom 454 pyrosekvenovanie v roku 2005 Na začiatku sa DNA fragmentuje na uacuteseky dlheacute 400-600 baacutez dvojvlaacuteknovaacute fragmentovanaacute DNA sa liguje s adapteacutermi prostredniacutectvom nich sa naviaže na mikročastice dvojvlaacuteknoveacute fragmenty sa oddelia mikročastice s naviazanyacutemi jednovlaacuteknovyacutemi fragmentami sa premiešajuacute so zmesou oleja a roztoku ktoryacute obsahuje všetky komponenty na uacutespešnuacute PCR Tyacutemto spocircsobom sa okolo každej mikročastice vytvoriacute vlastnyacute mikroreaktor v ktorom prebehne amplifikaacutecia fragmentu Po PCR reakcii sa mikročastice prenesuacute do platničky PicoTiterPlate v ktorej sa do jamky zmestiacute akuraacutet jedna mikročastica a reakčneacute komponenty pyrosekvenačnej reakcie PicoTiterPlatereg maacute 1 600 000 jamiek každaacute jamka maacute maximaacutelny objem 75 picolitra Platnička s mikročasticami sa vložiacute do sekvenačneacuteho systeacutemu ndash priacutestroja v ktorom sa celeacute pyrosekvenovanie uskutočniacute Chemiluminiscenčneacute signaacutely ktoryacutech počas sekvenovania vznikajuacute milioacuteny v priebehu hodiny suacute zachyteneacute CCD kamerou a analyzovaneacute softveacuterom

Firma Illumina predstavila inuacute technoloacutegiu PCR amplifikaacutecia a sekvenovanie sa uskutočňuje na skliacutečku (flow cell) Fragmentaacutecia DNA a pripojenie adapteacuterov prebieha za uacutečasti transpozoacutemov v procese nazvanom tagmentaacutecia Po hybridizaacutecii fragmentov DNA na skliacutečko prebehne v klastroch PCR amplifikaacutecia (tzv mostiacutekovaacute amplifikaacutecia) sekvenaacutecia prebieha za uacutečasti rozdielne fluorescenčne značenyacutech a chemicky modifikovanyacutech nukleotidov pričom každyacute nukleotid emituje fluorescenciu s inou vlnovou dĺžkou Na skliacutečku prebieha paralelne až 6 miliaacuterd sekvenaacutecii (obr 32)

Ďalšiacutemi možnosťami sekvenovania druhej generaacutecie je systeacutem SOLid (vyvinutyacute firmou Applied Biosystem dnes pod Thermo Fisher Scientific) a Ion Semiconductor Sequencing ndash polovodičoveacute ioacutenoveacute sekvenovanie (od firmy Ion Semiconductor Sequencing v suacutečasnosti Thermo Fisher Scientific)

36

Obr 32 Princiacutep sekvenovania novej generaacutecie od firmy Illumina PCR amplifikaacutecia a sekvenovanie sa uskutočňuje na skliacutečku (flow cell) paralelne prebieha až 6 miliaacuterd sekvenaacutecii

632 Sekvenovanie tretej generaacutecie

Pred sekvenovaniacutem netreba amplifikovať DNA PCR metoacutedou ale sekvencia sa ziacuteskava zachyteniacutem signaacutelu v reaacutelnom čase Medzi sekvenovanie tretej generaacutecie patriacute SMRT (Single Molecule Real-Time Sequencing) a Nanopore Sequencing

37

7 Fragmentačnaacute analyacuteza DNA

Je metoacuteda použiacutevanaacute na určenie veľkosti fragmentov DNA ziacuteskanyacutech PCR reakciou Dĺžka amplifikovanyacutech DNA fragmentov sa zistiacute ich porovnaniacutem s veľkostnyacutem štandardom (obr 33) ktoryacute je tvorenyacute DNA fragmentami znaacutemej dĺžky Veľkostnyacute štandard je pred kapilaacuternou elektroforeacutezou zmiešanyacute so vzorkou DNA fragmenty veľkostneacuteho štandardu suacute fluorescenčne označeneacute pričom použiteacute fluorescenčneacute farbivo je ineacute ako fluorescenčneacute farbivo použiteacute na označenie DNA fragmentov vo vyšetrovanej vzorke

Obr 33 Elektroforetogram veľkostneacuteho štandardu použiacutevaneacuteho na určenie veľkostiacute fragmentov analyzovanyacutech kapilaacuternou elektroforeacutezou v genetickom analyzaacutetore (GeneScantrade 500 LIZtrade dye Size Standard) dĺžka fragmentov v nukleotidoch (napr 50 nukleotidov)

Fragmentačnaacute analyacuteza pozostaacuteva z viaceryacutech krokov Prvyacutem je izolaacutecia DNA nasleduje PCR amplifikaacutecia počas ktorej sa novosyntetizovaneacute DNA fragmenty označia fluorescenčnyacutemi farbivami Vzorka s PCR produktom sa pripraviacute na kapilaacuternu elektroforeacutezu tak že sa zmieša s veľkostnyacutem štandardom (sluacuteži na určenie veľkosti fragmentov) a denaturačnou laacutetkou (formamid) nasleduje denaturaacutecia Pripraveneacute vzorky suacute injektovaneacute do priacutestroja (genetickyacute analyzaacutetor) kde v kapilaacutere naplnenej polymeacuterom v elektrickom poli migrujuacute fluorescenčne značeneacute fragmenty DNA na zaacuteklade veľkosti (kapilaacuterna elektroforeacuteza) Počas elektroforeacutezy genetickyacute analyzaacutetor zaznamenaacuteva fluorescenciu fragmentov Analyacutezou daacutet prostredniacutectvom špeciaacutelnych softveacuterov sa ziacuteskajuacute elektroforetogramy z ktoryacutech je možneacute zistiť veľkosť fragmentov ako aj typ fluorescencie (docircležiteacute ak suacute genetickeacute varianty rozliacutešiteľneacute rocircznou fluorescenciou napr SNaPshot) Fragmentačnaacute analyacuteza je suacutečasťou množstva molekulaacuterno-genetickyacutech metoacuted (pozri obr 12 26 28 29 34) ako suacute napr STR analyacuteza (Short Tandem Repeat) AFLP analyacuteza (Amplified Fragment Lenght Polymorfism) RFLPT-RFLP analyacuteza (Restriction Fragment Lenght PolymorfismTerminal Restricted Fragment Lenght Polymorfism) SSCP (Single Strand Conformation Polymorfism) VNTR (Variable Number of Tandem Repeat) analyacuteza straty heterozygotnosti (LOH loss of heterozygozity) MLPA (Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification) MSMSA (Methylation-Sensitive Mobility Shift Assay) SNP genotypovanie (SNaPshotreg) HiCEP (High-Coverage Expression Profiling)

38

Obr 34 Kvantitatiacutevna fragmentačnaacute PCR analyacuteza (QF-PCR) DNA izolovanej z plodovej vody vyacutesledok prenataacutelnej analyacutezy = priacutetomnosť troch piacutekov pre chromozoacutem 18 (u všetkyacutech fragmentov detegujuacutecich chromozoacutem 18 je pomer vyšetrovanyacutech markerov aberantnyacute 21 resp 111) čo znamenaacute trizoacutemiu chromozoacutemu 18 Edwardsov syndroacutem

39

8 Metoacutedy založeneacute na princiacutepe hybridizaacutecie

Nukleoveacute kyseliny majuacute schopnosť vytvaacuterať dvojvlaacuteknoveacute reťazce z jednovlaacuteknovyacutech molekuacutel na zaacuteklade komplementarity baacutez Komplementarita baacutez umožňuje replikaacuteciu DNA transkripciu RNA komplementarita baacutez zabezpečuje teda reprodukovateľnosť živej hmoty

Hybridizaacutecia je proces v ktorom na zaacuteklade komplementarity baacutez dochaacutedza k vytvoreniu dvojvlaacuteknovej nukleovej kyseliny z dvoch jednovlaacuteknovyacutech molekuacutel DNA alebo RNA alebo ich kombinaacuteciou DNA RNA pričom kratšia jednovlaacuteknovaacute nukleovaacute kyselina vystupuje ako sonda (proacuteba) Hybridizaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten je jeden z najpoužiacutevanejšiacutech naacutestrojov v molekulaacuternej bioloacutegii a genetike (hybridizaacutecia primerov alebo proacuteb sa využiacuteva v takmer každej metoacutede - v PCR RT-PCR qPCR RT-qPCR MLPA sekvenovaniacute fragmentačnej analyacuteze FISH DNA mikročipoch atď)

Denaturaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten je proces pri ktorom dochaacutedza k porušeniu vodiacutekovyacutech vaumlzieb medzi vlaacuteknami nukleovyacutech kyseliacuten (strata sekundaacuternej a terciaacutelnej štruktuacutery) tak že docircjde k ich uacuteplneacutemu oddeleniu vzniknuacute jednovlaacuteknoveacute reťazce Denaturaacutecia NK mocircže byť spocircsobenaacute vplyvom vysokyacutech teplocirct pH alebo chemickyacutech laacutetok (denaturačneacute činidlaacute) Renaturaacutecia je opačnyacute proces v ktorom na zaacuteklade komplementarity dochaacutedza k tvorbe dvojvlaacuteknovyacutech NK

Hybridiza čnaacute sonda (proacuteba) je jednovlaacuteknovaacute nukleovaacute kyselina určitej znaacutemej dĺžky a sekvencie (najčastejšie DNA pretože je stabilnejšia ako RNA) ktoraacute je značenaacute a sluacuteži na detekciu komplementaacuternych molekuacutel DNA alebo RNA v procese hybridizaacutecie V zaacutevislosti od podmienok hybridizaacutecie (stringencia) mocircže byť detegovanaacute sekvencia uacuteplne komplementaacuterna alebo v menej priacutesnych podmienkach mocircže mať sekvenčneacute odchyacutelky Proacuteba sluacuteži na vyhľadanie a zviditeľnenie cieľovyacutech NK Zviditeľnenie sa deje prostredniacutectvom označenia proacuteby ešte pred hybridizaacuteciou Značenie proacuteby mocircže byť raacutedioaktiacutevne a neraacutedioaktiacutevne (najčastejšie fluorescenčneacute)

Raacutedioaktiacutevne značeneacute proacuteby pomocou izotopov (32P) sa využiacutevali viac v minulosti v suacutečasnosti suacute kvocircli zdravotnyacutem rizikaacutem ohľaduplnosti k životneacutemu prostrediu ako aj kvocircli jednoduchšej manipulaacutecii použiacutevaneacute fluorescenčne značeneacute proacuteby Raacutedioaktiacutevne značeneacute sondy boli použiacutevaneacute hlavne metoacutedou Southernovej hybridizaacutecie (Southern blotting Southern blot) Citlivosť raacutedioaktiacutevne značenyacutech proacuteb je vyššia dosahuje schopnosť zachytiť 10 fg (femtogram 10-15) cieľovej DNA sekvencie 81 Southern blot

Metoacutedu objavil v roku 1975 britskyacute bioloacuteg Edwin Southern (preto Southern) Pri Southernovej hybridizaacutecii sa restrikčne štiepeneacute fragmenty DNA elektroforeticky separujuacute v geacuteli potom sa metoacutedou blottingu prenesuacute na nylonovuacute alebo nitroceluloacutezovuacute membraacutenu kde suacute naacutesledne hybridizovaneacute v roztoku obsahujuacutecom raacutedioaktiacutevne značenuacute sondu Priloženiacutem fotografickeacuteho filmu k membraacutene a vyvolaniacutem filmu autoraacutediografiou docircjde k zviditeľneniu lokaliacutet kde došlo k hybridizaacuteciiacute raacutedioaktiacutevne značenej sondy s fragmentom DNA (autoraacutediogram) Southern blot bol kľuacutečovou a prvou metoacutedou na identifikaacuteciu osocircb (DNA fingerprinting DNA pofiling) (obr 35)

Okrem Southern blotu existuje Northern blot na analyacutezu RNA (geacutenovej expresie) a Western blot na analyacutezu proteiacutenov postup je obdobnyacute ako pri Southern blote s obmenami špecifickyacutemi pre konkreacutetny blot Pri Northern blote sa použiacutevajuacute hybridizačneacute proacuteby ale pre vizualizaacuteciu proteiacutenov western blotom je potrebneacute použiť protilaacutetky s naacuteslednou vizualizaacuteciou Pomenovanie techniacutek je hra so sloviacutečkami (keďže paacuten Northern ani Western neobjavili takto nazvaneacute techniky)

Neraacutedioaktiacutevne značenie proacuteb použiacutevanyacutech v molekulaacuternej genetike mocircže byť nepriame (použitie haptenu) alebo priame Konečnaacute vizualizaacutecia je najčastejšie zabezpečenaacute fluoreskujuacutecimi farebnyacutemi značkami farbivami fluorochroacutemami (fluorofoacuterami) Pri priamom značeniacute je farbička kovalentne naviazanaacute na nukleotid a na zachytenie fluorescencie suacute potrebneacute špeciaacutelne priacutestroje umožňujuacutece excitaacuteciu farbičky ktoraacute potom emituje žiarenie určitej vlnovej dĺžky (emisneacute žiarenie) a to zachytiacute detekčnyacute systeacutem priacutestroja Využitie fluorochroacutemov v molekulaacuternej genetike je masiacutevne napr na vizualizaacuteciu NK elektroforeticky separovanyacutech v geacuteli kvantifikaacuteciu produktov PCR reakcie v priacutestroji real-time PCR cykleacuter sekvenovaniacute fragmentačnej analyacuteze FISH DNA mikročipoch atď

40

Obr 35 Princiacutep Southern blotu

82 FISH (fluorescenčnaacute in situ hybridizaacutecia)

FISH (fluorescent in situ hybridization fluorescenčnaacute in situ hybridizaacutecia) metoacuteda patriacute medzi molekulovo-cytogenetickeacute techniky Princiacutep FISH metoacutedy je založenyacute na hybridizaacuteciiacute fluorescenčne značenyacutech proacuteb ku komplementaacuternym uacutesekom vyšetrovanej DNA na podložnom skle (priamo na mieste - in situ) K denaturaacutecii dsDNA dochaacutedza buď vplyvom denaturačnyacutech činidiel alebo zvyacutešenou teplotou a naacuteslednou renaturaacuteciou dochaacutedza k naviazaniu sondy na komplementaacuterny uacutesek DNA Vyacutesledok hybridizaacutecie sa vizualizuje fluorescenčnyacutem mikroskopom vybavenyacutem vhodnyacutemi fluorescenčnyacutemi filtrami a vizuaacutelne zhodnotiacute skuacutesenyacutem odborniacutekom Fluorescencia sa v niektoryacutech priacutepadoch mocircže zaznamenať a hodnotiť aj pomocou softveacuteru (obr 36)

Pomocou FISH detegujeme numerickeacute aberaacutecie - zmeny v počte chromozoacutemov (napr trizoacutemia monozoacutemia chromozoacutemov) alebo štruktuacuterne aberaacutecie a prestavby (napr translokaacutecie inverzie deleacutecie duplikaacutecie amplifikaacutecie) FISH metoacuteda umožňuje identifikaacuteciu a detekciu každeacuteho ľudskeacuteho chromozoacutemu jeho zaradenie do karyotypu odhalenie malyacutech submikroskopickyacutech chromozoacutemovyacutech zmien a tiež mapovať poziacutecie jednotlivyacutech geacutenov na chromozoacuteme

41

Obr 36 Princiacutep štandardnej FISH a FISH maľovania celeacuteho chromozoacutemu

Veľkou vyacutehodou FISH metoacutedy je možnosť analyacutezy buniek v metafaacuteze aj v interfaacuteze kedy nie je nutnaacute kultivaacutecia buniek a tiež ryacutechle analyzovanie veľkeacuteho počtu buniek (stovky až tisiacutece) K ďalšiacutem vyacutehodaacutem patriacute bezpečnosť vysokaacute citlivosť dostatočnaacute stabilita relatiacutevne kraacutetky čas hybridizaacutecie a možnosť ryacutechleho vyhodnotenia Hybridizaacutecia pri vaumlčšine suacutečasne dodaacutevanyacutech sond trvaacute 10-12 hodin (na trhu suacute už dostupneacute aj sondy so skraacutetenyacutem časom hybridizaacutecie na 2-3 hodiny) Po hybridizaacuteciiacute nasleduje odmyacutevanie kedy pri priacuteslušnej teplote dochaacutedza k odmytiu nenaviazanyacutech a nespraacutevne hybridizovanyacutech sond Preparaacutet sa naacutesledne podfarbiacute a vyacutesledok sa zhodnotiacute vo fluorescenčnom mikroskope Na podfarbenie chromozoacutemov alebo jadier sa použiacuteva modreacute kontrastneacute farbivo DAPI (46-diamidino-2-fenylindol) ktoreacute maacute silneacute fluorescenčneacute vlastnosti dokaacuteže prechaacutedzať jadrovou membraacutenou a viazať sa na DNA Vyacutesledkom je modreacute zafarbenie ktoreacute vyacuteborne kontrastuje so signaacutelmi jednotlivyacutech sond

Limitujuacutecim faktorom FISH je možnosť identifikaacutecie len tyacutech uacutesekov DNA ku ktoryacutem suacute použiteacute sondy V jednej analyacuteze je možneacute použiť najviac 3 odlišne značeneacute sondy a tak zistiť priacutepadneacute abnormality len na 1 alebo na paacuter lokusoch Na relevantnuacute detekciu je potrebneacute mať vo vzorke 1-5 aberantnyacutech interfaacutezovyacutech jadier

FISH je možneacute uskutočniť na širokej škaacutele biologickeacuteho materiaacutelu na vzorkaacutech perifeacuternej krvi kostnej drene naacuteteroch choriovyacutech klkoch plodovej vode rocircznych druhov tkaniacutev natiacutevnych alebo zaliatych v parafiacutene na 1 bunke (predimplantačnaacute genetickaacute diagnostika PGD) (obr 37)

Využiacuteva sa na detekciu aberaacuteciiacute pri mnohyacutech onkologickyacutech ochoreniach (napr pri diagnoacuteze mnohopočetnyacute myeloacutem sa v suacutečasnosti po separaacutecii CD138+ buniek robiacute FISH s 5 sondami pre geacuteny IGH TP53 RB1 oblasť 1p321q21 a stanovuje sa hyperploidia chromozoacutemov 5 9 a 15) a tiež k spresneniu doplneniu a k overeniu bežneacuteho cytogenetickeacuteho vyšetrenia

Podľa miesta na chromozoacuteme na ktorom dochaacutedza k hybridizaacutecii sondy rozlišujeme 4 typy

DNA sond bull centromeacuteroveacute sondy ndash sa viažu na strednuacute časť chromozoacutemu ndash centromeacuteru sluacutežia k diagnostike zmien v počte chromozoacutemov k detekcii chromozoacutemov neznaacutemeho pocircvodu umožňujuacute interfaacuteznu FISH na nedeliacich sa bunkaacutech (obr 38-41)

42

Obr 37 Interfaacutezna FISH preimplantačnyacute genetickyacute skriacutening aneuploidiiacute ndash blastomeacutera 3-denneacuteho ľudskeacuteho embrya s normaacutelnym počtom chromozoacutemov 13 18 21 pohlavie XY použityacutech 5 sond pre chromozoacutemy 13 ndash orange 18 ndash aqua 21 ndash green X ndash blue a Y ndash yellow (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

Obr 38 Interfaacutezne jadro po hybridizaacutecii s centromeacuterovou sondou pre chromozoacutem 8 (Vysis Abbott) V pravom jadre je priacutetomnaacute trizoacutemia chromozoacutemu 8 (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex) Obr 39 Metafaacutezna (A) a interfaacutezna FISH (B) použitaacute centromeacuterovaacute sonda CEPX spectrum orangeCEPY spectrum green (Vysis Abbott) Sonda hybridizuje k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (červenyacute signaacutel) a Y (zelenyacute signaacutel) (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

43

Obr 40 Interfaacutezna FISH vyšetrenie spermiiacute použiteacute sondy CEPX greenCEPY orange (Aneuscore Metasystems) Sondy hybridizujuacute k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (zelenyacute signaacutel) Y (červenyacute signaacutel) vľavo ndash dve haploidneacute spermie (majuacutece jedna spermia X druhaacute Y chromozoacutem) vpravo ndash dve patologickeacute spermie obsahujuacutece gonozoacutemovyacute komplement XY (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

Obr 41 Interfaacutezna FISH vyšetrenie spermiiacute použiteacute sondy CEPX greenCEPY orange a CEP18 aqua (Aneuscore Metasystems) Sondy hybridizujuacute k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (zelenyacute signaacutel) Y (červenyacute signaacutel) a 18 (modryacute signaacutel) vľavo ndash normaacutelne haploidneacute ľudskeacute spermie - 1x chromozoacutem X alebo Y a jedenkraacutet chromozoacutem 18 v strede ndash patologickaacute spermia obsahujuacuteca gonozoacutemovyacute komplement XY a jeden chromozoacutem 18 vpravo ndash patologickaacute diploidnaacute spermia s chromozoacutemami X Y a dvoma chromozoacutemami 18 (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

bull lokusovo špecifickeacute sondy ndash hybridizaacutecia prebehne na konkreacutetnom mieste geacutenu (lokuse) (obr 42-44) použiacutevajuacute sa k vyšetreniu mikrodeleacuteciiacute (straty malyacutech častiacute chromozoacutemu pri mikrodelečnyacutech syndroacutemoch) k zisteniu amplifikaacutecie onkogeacutenov a niektoryacutech špecifickyacutech translokaacuteciiacute prestavby geacutenov umožňujuacute interfaacuteznu FISH na nedeliacich sa bunkaacutech bull subtelomeroveacute ndash vaumlzba na koncoveacute časti chromozoacutemu ndash telomeacutery bull celochromozoacutemoveacute alebo celomaľovacie sondy ndash sondy hybridizujuacute s mnohopočetnyacutemi chromozoacutemovyacutemi sekvenciami pričom sa fluorescenčne tak bdquovymaľujeldquo celyacute chromozoacutem (Obr 45) Použiacutevajuacute sa na vyšetrenie chromozoacutemovyacutech prestavieb k analyacuteze translokaacuteciiacute a k detekcii pocircvodu tzv marker chromozoacutemov (malyacutech nadpočetnyacutech chromozoacutemov neznaacutemeho pocircvodu) K použitiu sondy suacute potrebneacute metafaacutezne chromozoacutemy nepoužiacutevaju sa pre interfaacuteznu FISH

Pri konvenčnej chromozoacutemovej FISH suacute homogeacutenne DNA proacuteby hybridizovaneacute s fixovanyacutem metafaacuteznym alebo prometafaacuteznym chromozoacutemomchromozoacutemami na skliacutečku (Obr 36a) Maximaacutelna rozlišovacia schopnosť metafaacuteznej FISH je niekoľko megabaacutez (Obr 39a 45) využitiacutem viac

44

natiahnutyacutech prometafaacuteznych chromozoacutemov sa dosiahne 1 Mb rozliacutešenie Prostredniacutectvom fiber FISH konkreacutetne artificiaacutelne deproteinizovanej natiahnutej DNA pripravenej in situ z celyacutech buniek na mikroskopickom skliacutečku je možneacute vizualizovať individuaacutelne geacuteny maleacute DNA elementy na chromozoacuteme s rozliacutešeniacutem okolo 1000 bp

Obr 42 Interfaacutezne jadro po hybridizaacutecii s lokusovo-špecifickou sondou LSI 5q31 Spectrum Orange5p12 Spectrum Green (Vysis Abbott) Na ľavom obraacutezku suacute priacutetomneacute dva červeneacute (5q31) a dva zeleneacute signaacutely (5p12) v pravom jadre je priacutetomnaacute deleacutecia 5q31 oblasti chyacuteba jeden červenyacute signal (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

Obr 43 Interfaacutezna FISH použitaacute lokusovo-špecifickaacute sonda ndash translokačnaacute - XL BCRABL1 plus (Metasystems) dvojfarebnaacute dvojfuacutezna kde červenaacute označuje lokus ABL1 na chromozoacuteme 9 a zelenaacute oblasť BCR na chromozoacuteme 22 Sonda deteguje fuacuteziu protoonkogeacutenu ABL1 (9q34) a geacutenu BCR (22q11) v priacutepade že červenyacute a zelenyacute signaacutel suacute pri sebe (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

45

Obr 44 Interfaacutezna FISH Použitaacute lokusovo-špecifickaacute sonda- typ break apart pre IGH geacuten V docircsledku translokaacutecie došlo k rozskočeniu geacutenu pričom translokačneacuteho partnera nepoznaacuteme vieme určiť len percento v koľkyacutech jadraacutech je geacuten prestavanyacute (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex) Obr 45 Použiteacute celochromozoacutemoveacute sondy WCP 15 (červenyacute chromozoacutem) a WCP 17 (zelenyacute chromozoacutem) Na metafaacuteze je potvrdenaacute reciprokaacute translokaacutecia t(1517)(q2221) (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

FISH vizualizaacutecia celeacuteho chromozoacutemu maľovanie chromozoacutemu anglicky chromosome

painting je špeciaacutelnou aplikaacuteciou chromozoacutemovej FISH proacuteba je koktail veľkeacuteho počtu rocircznych fluorescenčne značenyacutech DNA fragmentov hybridizujuacutecich pozdĺž celeacuteho konkreacutetneho chromozoacutemu (obr 36b 45) bdquoChromosomepaintingldquo analyzuje metafaacutezne chromozoacutemy V minulosti bola FISH vizualizaacutecia celyacutech chromozoacutemov limitovanaacute malyacutem množstvom rocirczne sfarbenyacutech fluorochroacutemov

V suacutečasnosti je možneacute detegovať množstvo cieľovyacutech sekvenciiacute naraz čo sa využiacuteva pri celogenoacutemovej chromozoacutemovej vizualizaacutecii (whole-chromosomepainting - WCP) metoacutedou multiplex FISH (M-FISH multicolor FISH o br 46) alebo spektraacutelnej karyotypizaacutecie (SKY) kedy možno rozliacutešiť všetky ľudskeacute chromozoacutemy ndash teda 24 rocircznych chromozoacutemov M-FISH a SKY patria medzi metafaacutezne formy FISH diagnostiky ktoreacute umožňujuacute simultaacutennu vizualizaacuteciu všetkyacutech ľudskyacutech chromozoacutemov v rocircznych farbaacutech čo predstavuje uľahčenie analyacutezy karyotypu hlavne pri komplexnyacutech zmenaacutech a markeroch neznaacutemeho pocircvodu Obe techniky vychaacutedzajuacute z použitia

46

celochromozoacutemovyacutech sond značenyacutech kombinaacuteciou viaceryacutech fluorochroacutemov Rozdiel medzi M-FISH a SKY spočiacuteva v technike ziacuteskania konečneacuteho obrazu

Obr 46 Multicolor FISH - každyacute chromozoacutemovyacute paacuter je zafarbenyacute inou farbou pričom na ich zafarbenie postačuje kombinaacutecia 5 fluorochroacutemov Na vyhodnocovanie je potrebnaacute špeciaacutelna sada fluorescenčnyacutech filtrov pre jednotliveacute fluorochroacutemy a špeciaacutelnyacute softweacuter Vľavo-štandardnyacute karyotyp vpravo karyotyp s mutaacuteciami (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

V molekulovej cytogenetike suacute komerčne dostupneacute sety M-FISH proacuteb umožňujuacutece

viacfarebneacute pruacutežkovanie chromozoacutemov (banding) s vysokyacutem rozliacutešeniacutem (multicolor-banding mBAND FISH MCB) čo umožňuje identifikaacuteciu intrachromozoacutemovyacutech prestavieb (Obr 47) Nevyhnutnosťou mBAND-u je mať chromozoacutemy v metafaacuteze Taacuteto metoacuteda bola prvyacutekraacutet uskutočnenaacute na chromozoacuteme 5 v roku 1999 mBAND FISH umožňuje rozliacutešiť špecifickeacute oblasti chromozoacutemov na uacuterovni pruacutežku - bandu a sub-bandu s detekciou 550 bandov haploidneacuteho karyotypu

Obr 47 A - mBAND chromozoacutemu 11 - inverzia duplikovanej oblasti 11q223-q25 B - mBAND chromozoacutemu 3 - na kruhovom chromozoacuteme deleacutecia oblasti 3p263 C - mBAND chromozoacutemu 2 - potvrdenie inverzie duplikovanej časti chromozoacutemu (poskytnuteacute RNDr Dagmar Landlovou Medirex)

FISH metoacuteda a jej varianty (M-FISH mBAND SKY) majuacute v suacutečasnosti širokeacute využitie v

klinickej genetike v onkologickej genetike na detekciu aberaacuteciiacute v čase diagnoacutezy počas liečby po

47

liečbe monitorovanie po transplantaacutecii kostnej drene v prenataacutelnej a postnataacutelnej diagnostike pri detekcii submikroskopickyacutech deleacuteciiacute (napr DiGeorge syndroacutem - 22q112 delečnyacute syndroacutem PraderndashWilli syndroacutem- chromozoacutem 15q11-13) prostredniacutectvom FISH je možnaacute detekcia numerickyacutech zmien chromozoacutemov (trizoacutemia chromozoacutemu 21 pri Downovom syndroacuteme trizoacutemia chromozoacutemu 15 pri Patauovom syndroacuteme trizoacutemia chromozoacutemu 18 pri Edwardsovom syndroacuteme) rocirczne zmeny v počte pohlavnyacutech chromozoacutemov (monozoacutemia X pri Turnerovom syndroacuteme Klinefelterov syndroacutem s X chromozoacutemom naviac - XXY) podobne v predimplantačnej diagnostike

83 DNA Microarray (DNA mikro čip biočip) DNA mikročipovanie je technika využiacutevajuacuteca hybridizaacuteciu skuacutemanej nukleovej kyseliny

(cieľovaacute vzorka) s veľkyacutem množstvom oligonukleotidovyacutech proacuteb (desať tisiacutec až milioacuten) ktoreacute suacute prichyteneacute na pevnyacute podklad najčastejšie sklenyacute silikoacutenovyacute alebo nylonovyacute (doštička čip) Skuacutemanaacute nukleovaacute kyselina je pred hybridizaacuteciou fragmentovanaacute označenaacute fluorofoacuterom a denaturovanaacute Po kontakte čipu s cieľovou vzorkou ktoraacute je vlastne zmes označenyacutech oligonukleotidov značeneacute oligonukleotidy hybridizujuacute s oligonukleotidovyacutemi sekvenciami prichytenyacutemi na čipe Potom suacute na zaacuteklade fluorescencie detekovaneacute miesta kde došlo k hybridizaacutecii čiže vzorka obsahovala takuacuteto nukleotidovuacute sekvenciu Z jedneacuteho mikročipu sa ziacuteska obrovskeacute množstvo daacutet ktoreacute je vždy nutneacute softveacuterovo spracovať V dnešnej dobe existuje niekoľko firiem poskytujuacutecich komerčne mikročipy na objednaacutevku alebo si ich laboratoacuteria produkujuacute sami

Mikročipovanie prebieha nasledovne

1) Vytvorenie DNA čipu ndash tisiacutece rocircznych jednovlaacuteknovyacutech DNA oligonukleotidov znaacutemych sekvencii sa kovalentne naviažu na povrch doštičky vždy v určitej lokalite je niekoľko rovnakyacutech oligonukleotidov veľkosť takejto lokality je ˂ 200 microm Proacutebami mocircže byť DNA cDNA alebo syntetizovaneacute oligonukleotidy Už hotoveacute mikročipy ponuacutekajuacute viacereacute firmy (Affymetrix Agilent Technologies Eppendorf Illumina) alebo si ich jednotliveacute laboratoacuteria vyraacutebajuacute sami pomocou robotickyacutech zariadeniacute DNA čip sa vytvaacutera buď nanaacutešaniacutem kvapiek oligonukleotidov na podklad alebo synteacutezou oligonukleotidov in situ na čipe 2) Priacuteprava vzorky ndash nukleovaacute kyselina (mRNA DNA) sa purifikuje určiacute sa jej kvantita a kvalita (spektrofotometericky) fragmentuje resp v priacutepade mRNA sa syntetizuje cDNA v priacutepade potreby sa mocircže DNA amplifikovať PCR reakciou štiepiť restrikčnyacutemi endonukleaacutezami 3) Fluorescenčneacute označenie (zriedkavejšie raacutedioaktiacutevne) fragmentov DNA prebieha počas reverznej transkripcie alebo PCR amplifikaacutecie za uacutečasti fluorescenčne značenyacutech nukleotidov Keď sa analyzujuacute dve rocirczne vzorky napr zdraveacute tkanivo a naacutedoroveacute tkanivo označenie nukleovyacutech kyseliacuten v tyacutechto tkanivaacutech byacuteva rozdielne a to použitiacutem dvoch rocircznych fluorescenčnyacutech farbiacutev (napr zeleneacute a červeneacute) Pred hybridizaacuteciou je potrebneacute vzorku denaturovať čiacutem sa vytvoriacute zmes jednovlaacuteknovyacutech DNA označenyacutech značkou 4) Hybridizaacutecia s mikročipom ndash v špeciaacutelnom hybridizačnom roztoku hybridizujuacute komplementaacuterne sekvencie zo vzorky s priacuteslušnyacutemi oligonukleotidovyacutemi sondami naviazanyacutemi na čipe Potom sa čip obmyje aby došlo k odstraacuteneniu čiastočne hybridizovanyacutech nukleovyacutech kyseliacuten 5) Skenovanie mikročipu ndash skenerom čipov docircjde k ožiareniu čipu laserom pričom v mieste hybridizaacutecie fluorescenčne značenyacutech DNA fragmentov s proacutebou docircjde k emisii svetla určitej vlnovej dĺžky ktoruacute skener zaznamenaacute 6) Analyacuteza daacutet prebieha metoacutedami bioinformatiky spracovaniacutem softveacutermi sa zistiacute ktoreacute lokality čipu navzaacutejom hybridizovali v priacutepade použitia dvoch vzoriek kontrolnej a skuacutemanej je možneacute analyzovať ich relatiacutevnu intenzitu hybridizaacutecie (expresie určiteacuteho geacutenu)

Existujuacute štyri typy mikročipov 1) Čipy ur čeneacute na analyacutezu expresie (obsahujuacute cDNA proacuteby) pre tzv dvojkanaacutelovyacute experiment kedy je vzorka určenaacute k hybridizaacutecii na čipe ziacuteskanaacute zmiešaniacutem DNA fragmentov kontrolnej a skuacutemanej vzorky pričom fragmenty suacute rozdielne fluorescenčne označeneacute (napr zelenyacute fluorofoacuter pre kontrolnuacute vzorku a červenyacute pre skuacutemanuacute) Na zaacuteklade intenzity a typu fluorescencie sa deteguje expresia geacutenov typickaacute pre kontrolnuacute vzorku (napr zelenaacute fluorescencia) pre skuacutemanuacute vzorku (napr

48

červenaacute fluorescencia) a expresia podobnaacute u oboch vzoriek (žltaacute fluorescencia) neexprimovaneacute geacuteny (čierna fluorescencia) rocirczne odtiene (v zaacutevislosti od prevažujuacutecej hybridizaacutecie) (obr 48) 2) Čipy ur čeneacute na analyacutezu mutaacutecii použije sa genoacutemovaacute DNA označenaacute jednou fluorescenčnou farbičkou na určenie jednonukleotidovej zmeny (SNP ndash Single Nukleotide Polymorphism) 3) Čipy na komparatiacutevnu genoacutemovuacute hybridizaacuteciu (aCGH array Comparative Genomic Hybridization) ndash použiacutevaneacute na zistenie zvyacutešenia alebo zniacuteženia množstva chromozoacutemovyacutech fragmentov obsahujuacutecich geacuteny zodpovedneacute za určiteacute ochorenie Na analyacutezu sa použije skuacutemanaacute gDNA a referenčnaacute (kontrolnaacute) DNA každaacute sa značiacute inou fluorescenčnou farbičkou (princiacutep ako pri analyacuteze expresie) (obr 49 50) 4) Čipy CGH - SNP kombinovaneacute čipy ur čeneacute na analyacutezu aj mutaacuteciiacute SNP aj na komparatiacutevnu genoacutemovuacute hybridizaacuteciu CGH

Mikročipy majuacute rozsiahle využitie napriacuteklad v identifikaacuteciiacute novyacutech geacutenov vo vyacuteskume ich funkciiacute expresie v rocircznych podmienkach pri diagnostike mnohyacutech ochoreniacute vo farmakogenomike vo vyacuteskume vplyvu toxiacutenov

Obr 48 Heatmapa geacutenovej expresie vybranyacutech geacutenov (mRNA) mikročip obsahuje 46000 cDNA proacuteb (poskytnuteacute Ing Helenou Gbelcovou PhD Uacutestav lekaacuterskej bioloacutegie genetiky a klinickej genetiky LF UK a UNB)

49

Obr 49 Princiacutep komparatiacutevnej genoacutemovej hybridizaacutecie (aCGH - array comparative genomic hybridization) Obr 50 A) Vyacutesledok komparatiacutevnej genoacutemovej hybridizaacutecie (aCGH - array comparative genomic hybridization) vzorky DNA izolovanej plodovej vody U plodu s abnormaacutelnym ultrasonografickyacutem vyšetreniacutem bola identifikovanaacute duplikaacutecia oblasti 3q261q29 (modryacute paacutes) a deleacutecia oblasti 5p1533p151 (červenyacute paacutes) Pre porovnanie chromozoacutem 1 bez aberaacutecie b) Ten istyacute pacient ale ineacute softveacuteroveacute spracovanie (poskytnuteacute RNDr Miroslavom Tomkom PhD Medirex)

50

Odporuacutečanaacute a použitaacute literatuacutera

Odborneacute knihy Klug W S Cummings M R Spencer Ch A Palladino M A Concepts of Genetics jedenaacuteste vydanie (2015) Carson S Molecular Biology Techniques tretie vydanie (2012) Strachan T Read A Human Molecular Genetics štvrteacute vydanie (2011) Sudbery P Sudbery I Human Molecular Genetics tretie vydanie (2009)

Internetoveacute straacutenky

wwwncbinlmnihgov wwwmlpacom wwwthermofishercom wwwilluminacom wwwpromegask wwwqiagencom wwwambioncom

Odborneacute člaacutenky Chacon-Cortes D Griffiths L R Methods for extracting genomic DNA from whole blood samples current perspectives Journal of Biorepository Science for Applied Medicine Volume 2 strany 1- 9 Viltrop T Krjutskov K Palta P Metspalu A Comparison of DNA extraction methods for multiplex polymerase chain reaction Anal Biochem 2010 Volume 398(2) strany 260-262 Ing Martin Čermaacutek Molekulaacuterna cytogenetika v problematike familiaacuternych maligniacutet Onkoloacutegia Volume 2 strany 77 - 83 Livak KJ Schmittgen TD Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method Methods 2001 Volume 25(4) strany 402 - 408 Bustin S A Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays J Mol Endocrinol 2000 Volume 25(2) strany169 - 193

MOLEKULAacuteRNE METOacuteDY AKTUAacuteLNE POUŽIacuteVANEacute V KLINICKEJ GENETIKE RNDr Andrea Pastoraacutekovaacute PhD RNDr Robert Petrovič PhD Vydala Univerzita Komenskeacuteho v Bratislave Lekaacuterska fakulta Rozsah 50 straacuten 246 AH prveacute vydanie ISBN 978-80-223-4231-5

30

Obr 27 Princiacutep MLPA

Firma MRC-Holland v suacutečasnosti ponuacuteka stovky MLPA setov proacuteb ktoreacute suacute vhodneacute na 1) diagnostiku kongenitaacutelnych a dedičnyacutech ochoreniacute 2) zisťovanie profilu naacutedorov 3) zisťovanie metylačneacuteho profilu

MLPA je metoacuteda vhodnaacute na detekciu malyacutech prestavieb (BRCA1 BRCA2 MSH2 atď)

veľkyacutech chromozoacutemovyacutech prestavieb (Williamsov syndroacutem Prader-WilliAngelman syndroacutem atzď)

31

detekciu zmien v počte koacutepii geacutenov (obr 28 29) ako aj zistenie počtu kompletnyacutech chromozoacutemov (chromozoacutem 13 18 21 XY tiež aj z amniovej tekutiny) diagnostiku naacutedorov (zmeny počtu pri ALL CLL atď) kvantifikaacuteciu metylaacutecie (Prader-WilliAngelmanov syndroacutem Fragilnyacute X inaktivaacutecia naacutedorovyacutech supresorovyacutech geacutenov atď) mRNA analyacutezu geacutenov zuacutečastňujuacutecich sa apoptoacutezy alebo zaacutepalov

MS-MLPA (Methylation-Specific MLPA) je varianta MLPA určenaacute špeciaacutelne na analyacutezu aberantnyacutech metylaacutecii imprintovanyacutech oblastiacute ako aj detekciu metylačnyacutech zmien CpG ostrovčekov lokalizovanyacutech bliacutezko promoacutetora Rozdiel oproti štandardnej MLPA spočiacuteva v použitiacute metylačne senzitiacutevneho restrikčneacuteho enzyacutemu HhaI ktoryacute štiepi MS-MLPA proacuteby hybridizovaneacute k nemetylovanej sekvencii Každaacute DNA vzorka určenaacute pre MS-MLPA analyacutezu prejde dvoma reakciami v jednej mikroskuacutemavke štandardnou MLPA analyacutezou (bez štiepenia metylačne senzitiacutevnym enzyacutemom) a v druhej mikroskuacutemavke docircjde okrem ligaacutecie proacuteb aj k metylačne senzitiacutevnemu štiepeniu hybridizovanyacutech proacuteb s nemetylovanou DNA Amplifikujuacute sa len ligovaneacute proacuteby po PCR amplifikaacutecii sa fragmentačnou analyacutezou porovnaniacutem oboch reakciiacute zistia rozdiely v metylačnom profile vzorky k referenčnej vzorke

RT-MLPA (Reverse Transkriptase MLPA) je variaacutecia MLPA určenaacute pre zistenie mRNA profilu vzorky je alternatiacutevou k real-time PCR a mikročipom RT-MLPA nedeteguje mRNA množstvo priamo pretože použiacutevanaacute ligaacuteza nie je schopnaacute ligovať DNA oligonukleotidy keď suacute hybridizovaneacute s RNA Preto RT-MLPA začiacutena reverznou transkripciou so špeciaacutelne navrhnutyacutemi RT primermi tak aby vytvorili kraacutetke oligonukleotidy (cDNA) Potom reakcia pokračuje ako štandardnaacute MLPA

Obr 28 MLPA analyacuteza geacutenu DMD (koacutedujuacuteceho dystrofiacuten) mutaacutecie ktoreacuteho spocircsobujuacute Duchennovu svalovuacute dystrofiu u pacienta je priacutetomnaacute deleacutecia exoacutenu 45 v porovnaniacute s referenčnou vzorkou ndash kontrolou

32

Obr 29 MLPA analyacuteza geacutenu DMD (koacutedujuacuteceho dystrofiacuten) mutaacutecie ktoreacuteho spocircsobujuacute Duchennovu svalovuacute dystrofiu u pacienta suacute priacutetomneacute duplikaacutecie exoacutenov 41 42 43 44 45 (piacuteky vo vzorke pacienta sa porovnajuacute s piacutekmi v kontrole ndash referenčnej vzorke)

33

6 Sekvenovanie

Sekvenovaniacutem rozumieme určenie primaacuternej štruktuacutery DNA teda určenie poradia nukleotidov v reťazci DNA Začiatky moderneacuteho sekvenovania siahajuacute do roku 1977 kedy boli objaveneacute dve metoacutedy sekvenovania 1) chemickaacute metoacuteda Maxama a Gilberta 2) enzymatickaacute metoacuteda Sangera Nicklena a Coulsona

Princiacutep obidvoch metoacuted sekvenovania spočiacuteva v tom že sa vytvoriacute suacutebor DNA molekuacutel s rocircznou veľkosťou ktoreacute suacute zakončeneacute konkreacutetnym nukleotidom tieto DNA molekuly sa elektroforeticky separujuacute v geacuteloch s rozlišovacou schopnosťou 1 nukleotid 61 Chemickaacute metoacuteda

DNA molekuly sa na 5-konci raacutedioaktiacutevne označia raacutedioaktiacutevnym fosforom a naacutesledne sa chemicky modifikujuacute špecificky pre každuacute baacutezu DNA sa potom v modifikovanyacutech miestach štiepi čiacutem vzniknuacute rocirczne dlheacute fragmenty pričom podmienky suacute nastaveneacute tak aby sa DNA na každom mieste štiepila len raz Modifikaacutecia DNA a štiepenie prebehne v štyroch separaacutetnych reakciaacutech (skuacutemavkaacutech) takže po elektroforetickej separaacuteciiacute takto opracovanej DNA v štyroch draacutehach polyakrylamidoveacuteho geacutelu a naacuteslednej autoraacutediografii (podobne ako pri Southernovej hybridizaacutecii) je možneacute odčiacutetať nukleotidovuacute sekvenciu približne 100 nukleotidov od raacutedioaktiacutevneho označenia (v čase objavu Maxama a Gilberta) 62 Sangerova metoacuteda

Zaacuteklady metoacutedy boli popiacutesaneacute už v roku 1975 (metoacuteda plus a miacutenus) ale až vylepšenie použitiacutem dideoxynukleotidov (ddNTP) v roku 1977 došlo k zjednodušeniu sekvenovania Princiacutepom enzyacutemoveacuteho sekvenovania je terminaacutecia (zastavenie) polymerizaacutecie inkorporaacuteciou 2´ 3 -dideoxynukleotidov do novosyntetizujuacuteceho sa vlaacutekna DNA Keďže ddNTP neobsahujuacute hydroxylovuacute skupinu na 3 uhliacuteku riboacutezy nemocircžu sa zuacutečastniť na tvorbe fosfodiesterovej vaumlzby nemocircže sa pripojiť k nim ďalšiacute nukleotid čiže musiacute docircjsť k terminaacuteciiacute polymeraacutecie Reakcia prebieha v štyroch skuacutemavkaacutech s raacutedioaktiacutevne značenyacutem primerom V každej skuacutemavke suacute priacutetomneacute všetky štyri deoxynukleotidtrifosfaacutety (dNTP) ale pre každuacute skuacutemavku je špecifickyacute priacutedavok maleacuteho množstva jedneacuteho z dideoxynukleotidtrifosfaacutetov (v prvej skuacutemavke je ddATP v druhej ddCTP v tretej ddTTP a vo štvrtej ddGTP) Maleacute množstvo ddNTP spocircsobiacute že pri polymerizaacutecii dochaacutedza k prednostneacutemu zaradeniu štandardnyacutech dNTP do narastajuacuteceho reťazca a len občas sa inkorporuje ddNTP čiacutem sa zastaviacute synteacuteza reťazca V každej skuacutemavke tak vznikne suacutebor DNA fragmentov rocircznych veľkostiacute zakončenyacutech priacuteslušnyacutem ddNTP (v prvej skuacutemavke ddATP v druhej ddCTP v tretej ddTTP a vo štvrtej ddGTP) Po elektroforetickej separaacutecii v 4 draacutehach polyakrylamidoveacuteho geacutelu a autoraacutediografii sa z autoraacutediogramu odčiacuteta sekvencia

V suacutečasnosti je sekvenovanie do značnej miery automatizovaneacute pričom využiacuteva princiacutep Sangerovej enzyacutemovej metoacutedy s určityacutemi obmenami Uacutesek DNA ktoryacute treba sekvenovať sa prostredniacutectvom termostabilnyacutech DNA polymeraacutez namnožiacute PCR metoacutedou po ktorej nasleduje sekvenačnaacute reakcia (asymetrickaacute PCR) s fluorescenčne značenyacutemi ddNTP (každyacute druh označenyacute inyacutem fluorescenčnyacutem farbivom) Sekvenačnaacute reakcia prebieha v jednej skuacutemavke s jednyacutem primerom vznikne tak suacutebor jednovlaacuteknovyacutech DNA rocircznej dĺžky ktoreacute suacute na 3konci označeneacute ddNTP so špecifickyacutem fluorescenčnyacutem farbivom Taacuteto metoacuteda sekvenovania sa tiež nazyacuteva rdquodye-terminator cycle sequencingrdquo(obr 30) Po kapilaacuternej elektroforeacuteze vzorky v genetickom analyzaacutetore zaznamenaacutevaniacute fluorescencie jednotlivyacutech fragmentov CCD kamerou a softveacuterovom spracovaniacute sa ziacuteska sekvencia DNA (obr 31)

34

Obr 30 Princiacutep sekvenovania Sangerova dideoxy metoacuteda alebo tzv chain termination method (reťazec zastavujuacuteca metoacuteda) Obr 31 Určenie genotypu plodu a rodičov sekvenčnou analyacutezou DNA ziacuteskanej z plodovej vody (prenataacutelna diagnostika) a perifeacuternej krvi sekvenčnaacute analyacuteza geacutenu ASPA vyacutesledok u plodu priacutetomnaacute mutaacutecia c 914CgtA v homozygotnom stave (AA) rodičia heterozygoti (AC) Uvedenaacute mutaacutecia je v homozygotnom stave kauzaacutelnou priacutečinou Canavanovej choroby

Automatizovaneacute sekvenovanie prinaacuteša viacereacute vyacutehody oproti klasickej Sangerovej metoacutede vyššiu presnosť a ryacutechlosť v jednej sekvenačnej reakcii možnosť osekvenovať až 1200 nukleotidovyacute fragment maleacute množstvo templaacutetu potrebneacute na analyacutezu

35

63 Next Generation Sequencing (NGS)

NGS (sekvenovanie novej generaacutecie) maacute obrovskyacute potenciaacutel v analyacuteze genoacutemov pričom toto označenie zahŕňa viacereacute technologickeacute metoacutedy reprezentovaneacute niekoľkyacutemi firmami Princiacutepom je masiacutevne paralelneacute sekvenovanie čiacutem sa ziacuteskajuacute raacutedovo tisiacutece až milioacuteny sekvenciiacute naraz 631 Sekvenovanie druhej generaacutecie

Na začiatku sa analyzovanaacute DNA vo vaumlčšine priacutepadov fragmentuje (vznikne tak DNA

knižnica) na fragmenty sa pripoja kraacutetke sekvencie ndash adapteacutery naacutesledne sa tieto fragmenty rocircznymi priacutestupmi amplifikujuacute a určiacute sa ich sekvencia Vďaka čiastočnyacutem prekryvom je zo ziacuteskanyacutech sekvencii možneacute poskladať plynuluacute sekvenciu zodpovedajuacutecu pocircvodnej nefragmentovanej DNA

Pyrosekvenovanie je podobne ako Sangerova metoacuteda založenaacute na princiacutepe synteacutezy komplementaacuterneho vlaacutekna DNA avšak rozdiel je v tom že sa na detekciu inkorporaacutecie nukleotidu využiacuteva inyacute systeacutem tvorby luminiscenčneacuteho signaacutelu v priebehu reakcie Pyrosekvenovanie je umožneneacute vďaka aktivite 4 enzyacutemov - DNA polymeraacutezy ATP sulfurylaacutezy luciferaacutezy a apyraacutezy Reakčnaacute zmes obsahuje aj ďalšie komponenty - enzymatickeacute substraacutety adenoziacutenfosfosulfaacutet (APS) d-luciferiacuten sekvenovanyacute templaacutet a cyklicky postupne po jednom type pridaacutevaneacute nukleotidtrifosfaacutety Po zabudovaniacute nukleotidu do novovznikajuacuteceho reťazca docircjde k uvoľneniu pyrofosfaacutetu naacutesledne je využityacute ATP sulfurylaacutezou na synteacutezu ATP z APS počas ďalšej reakcie docircjde k využitiu ATP luciferaacutezou na premenu luciferiacutenu na oxyluciferiacuten čo spocircsobiacute svetelnyacute signaacutel a ten zaznamenaacute detekčnyacute systeacutem Poslednou enzymatickou reakciou je reakcia apyraacutezy ktoraacute odstraacuteni nezainkorporovaneacute nukleotidy a nevyužiteacute ATP aby sa celyacute proces mohol zopakovať s reakčnou zmesou obsahujuacutecou ďalšiacute nukleotidtrifosfaacutet (inyacute ako v predchaacutedzajuacutecej reakcii) Po každej reakcii detektor zaznamenaacuteva emisiu svetla na zaacuteklade intenzity svetla je možneacute určiť či bol vradenyacute priacuteslušnyacute nukleotidtrifosfaacutet či bol inkorporovanyacute jeden priacutepadne viac rovnakyacutech nukleotidtrifosfaacutetov

Zvyacutešenie vyacutekonu pyrosekvenovania umožnila tzv emulznaacute PCR v mikročasticiach a použitie platničky PicoTiterPlatereg toto sekvenovanie zaviedla firma Roche pod pojmom 454 pyrosekvenovanie v roku 2005 Na začiatku sa DNA fragmentuje na uacuteseky dlheacute 400-600 baacutez dvojvlaacuteknovaacute fragmentovanaacute DNA sa liguje s adapteacutermi prostredniacutectvom nich sa naviaže na mikročastice dvojvlaacuteknoveacute fragmenty sa oddelia mikročastice s naviazanyacutemi jednovlaacuteknovyacutemi fragmentami sa premiešajuacute so zmesou oleja a roztoku ktoryacute obsahuje všetky komponenty na uacutespešnuacute PCR Tyacutemto spocircsobom sa okolo každej mikročastice vytvoriacute vlastnyacute mikroreaktor v ktorom prebehne amplifikaacutecia fragmentu Po PCR reakcii sa mikročastice prenesuacute do platničky PicoTiterPlate v ktorej sa do jamky zmestiacute akuraacutet jedna mikročastica a reakčneacute komponenty pyrosekvenačnej reakcie PicoTiterPlatereg maacute 1 600 000 jamiek každaacute jamka maacute maximaacutelny objem 75 picolitra Platnička s mikročasticami sa vložiacute do sekvenačneacuteho systeacutemu ndash priacutestroja v ktorom sa celeacute pyrosekvenovanie uskutočniacute Chemiluminiscenčneacute signaacutely ktoryacutech počas sekvenovania vznikajuacute milioacuteny v priebehu hodiny suacute zachyteneacute CCD kamerou a analyzovaneacute softveacuterom

Firma Illumina predstavila inuacute technoloacutegiu PCR amplifikaacutecia a sekvenovanie sa uskutočňuje na skliacutečku (flow cell) Fragmentaacutecia DNA a pripojenie adapteacuterov prebieha za uacutečasti transpozoacutemov v procese nazvanom tagmentaacutecia Po hybridizaacutecii fragmentov DNA na skliacutečko prebehne v klastroch PCR amplifikaacutecia (tzv mostiacutekovaacute amplifikaacutecia) sekvenaacutecia prebieha za uacutečasti rozdielne fluorescenčne značenyacutech a chemicky modifikovanyacutech nukleotidov pričom každyacute nukleotid emituje fluorescenciu s inou vlnovou dĺžkou Na skliacutečku prebieha paralelne až 6 miliaacuterd sekvenaacutecii (obr 32)

Ďalšiacutemi možnosťami sekvenovania druhej generaacutecie je systeacutem SOLid (vyvinutyacute firmou Applied Biosystem dnes pod Thermo Fisher Scientific) a Ion Semiconductor Sequencing ndash polovodičoveacute ioacutenoveacute sekvenovanie (od firmy Ion Semiconductor Sequencing v suacutečasnosti Thermo Fisher Scientific)

36

Obr 32 Princiacutep sekvenovania novej generaacutecie od firmy Illumina PCR amplifikaacutecia a sekvenovanie sa uskutočňuje na skliacutečku (flow cell) paralelne prebieha až 6 miliaacuterd sekvenaacutecii

632 Sekvenovanie tretej generaacutecie

Pred sekvenovaniacutem netreba amplifikovať DNA PCR metoacutedou ale sekvencia sa ziacuteskava zachyteniacutem signaacutelu v reaacutelnom čase Medzi sekvenovanie tretej generaacutecie patriacute SMRT (Single Molecule Real-Time Sequencing) a Nanopore Sequencing

37

7 Fragmentačnaacute analyacuteza DNA

Je metoacuteda použiacutevanaacute na určenie veľkosti fragmentov DNA ziacuteskanyacutech PCR reakciou Dĺžka amplifikovanyacutech DNA fragmentov sa zistiacute ich porovnaniacutem s veľkostnyacutem štandardom (obr 33) ktoryacute je tvorenyacute DNA fragmentami znaacutemej dĺžky Veľkostnyacute štandard je pred kapilaacuternou elektroforeacutezou zmiešanyacute so vzorkou DNA fragmenty veľkostneacuteho štandardu suacute fluorescenčne označeneacute pričom použiteacute fluorescenčneacute farbivo je ineacute ako fluorescenčneacute farbivo použiteacute na označenie DNA fragmentov vo vyšetrovanej vzorke

Obr 33 Elektroforetogram veľkostneacuteho štandardu použiacutevaneacuteho na určenie veľkostiacute fragmentov analyzovanyacutech kapilaacuternou elektroforeacutezou v genetickom analyzaacutetore (GeneScantrade 500 LIZtrade dye Size Standard) dĺžka fragmentov v nukleotidoch (napr 50 nukleotidov)

Fragmentačnaacute analyacuteza pozostaacuteva z viaceryacutech krokov Prvyacutem je izolaacutecia DNA nasleduje PCR amplifikaacutecia počas ktorej sa novosyntetizovaneacute DNA fragmenty označia fluorescenčnyacutemi farbivami Vzorka s PCR produktom sa pripraviacute na kapilaacuternu elektroforeacutezu tak že sa zmieša s veľkostnyacutem štandardom (sluacuteži na určenie veľkosti fragmentov) a denaturačnou laacutetkou (formamid) nasleduje denaturaacutecia Pripraveneacute vzorky suacute injektovaneacute do priacutestroja (genetickyacute analyzaacutetor) kde v kapilaacutere naplnenej polymeacuterom v elektrickom poli migrujuacute fluorescenčne značeneacute fragmenty DNA na zaacuteklade veľkosti (kapilaacuterna elektroforeacuteza) Počas elektroforeacutezy genetickyacute analyzaacutetor zaznamenaacuteva fluorescenciu fragmentov Analyacutezou daacutet prostredniacutectvom špeciaacutelnych softveacuterov sa ziacuteskajuacute elektroforetogramy z ktoryacutech je možneacute zistiť veľkosť fragmentov ako aj typ fluorescencie (docircležiteacute ak suacute genetickeacute varianty rozliacutešiteľneacute rocircznou fluorescenciou napr SNaPshot) Fragmentačnaacute analyacuteza je suacutečasťou množstva molekulaacuterno-genetickyacutech metoacuted (pozri obr 12 26 28 29 34) ako suacute napr STR analyacuteza (Short Tandem Repeat) AFLP analyacuteza (Amplified Fragment Lenght Polymorfism) RFLPT-RFLP analyacuteza (Restriction Fragment Lenght PolymorfismTerminal Restricted Fragment Lenght Polymorfism) SSCP (Single Strand Conformation Polymorfism) VNTR (Variable Number of Tandem Repeat) analyacuteza straty heterozygotnosti (LOH loss of heterozygozity) MLPA (Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification) MSMSA (Methylation-Sensitive Mobility Shift Assay) SNP genotypovanie (SNaPshotreg) HiCEP (High-Coverage Expression Profiling)

38

Obr 34 Kvantitatiacutevna fragmentačnaacute PCR analyacuteza (QF-PCR) DNA izolovanej z plodovej vody vyacutesledok prenataacutelnej analyacutezy = priacutetomnosť troch piacutekov pre chromozoacutem 18 (u všetkyacutech fragmentov detegujuacutecich chromozoacutem 18 je pomer vyšetrovanyacutech markerov aberantnyacute 21 resp 111) čo znamenaacute trizoacutemiu chromozoacutemu 18 Edwardsov syndroacutem

39

8 Metoacutedy založeneacute na princiacutepe hybridizaacutecie

Nukleoveacute kyseliny majuacute schopnosť vytvaacuterať dvojvlaacuteknoveacute reťazce z jednovlaacuteknovyacutech molekuacutel na zaacuteklade komplementarity baacutez Komplementarita baacutez umožňuje replikaacuteciu DNA transkripciu RNA komplementarita baacutez zabezpečuje teda reprodukovateľnosť živej hmoty

Hybridizaacutecia je proces v ktorom na zaacuteklade komplementarity baacutez dochaacutedza k vytvoreniu dvojvlaacuteknovej nukleovej kyseliny z dvoch jednovlaacuteknovyacutech molekuacutel DNA alebo RNA alebo ich kombinaacuteciou DNA RNA pričom kratšia jednovlaacuteknovaacute nukleovaacute kyselina vystupuje ako sonda (proacuteba) Hybridizaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten je jeden z najpoužiacutevanejšiacutech naacutestrojov v molekulaacuternej bioloacutegii a genetike (hybridizaacutecia primerov alebo proacuteb sa využiacuteva v takmer každej metoacutede - v PCR RT-PCR qPCR RT-qPCR MLPA sekvenovaniacute fragmentačnej analyacuteze FISH DNA mikročipoch atď)

Denaturaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten je proces pri ktorom dochaacutedza k porušeniu vodiacutekovyacutech vaumlzieb medzi vlaacuteknami nukleovyacutech kyseliacuten (strata sekundaacuternej a terciaacutelnej štruktuacutery) tak že docircjde k ich uacuteplneacutemu oddeleniu vzniknuacute jednovlaacuteknoveacute reťazce Denaturaacutecia NK mocircže byť spocircsobenaacute vplyvom vysokyacutech teplocirct pH alebo chemickyacutech laacutetok (denaturačneacute činidlaacute) Renaturaacutecia je opačnyacute proces v ktorom na zaacuteklade komplementarity dochaacutedza k tvorbe dvojvlaacuteknovyacutech NK

Hybridiza čnaacute sonda (proacuteba) je jednovlaacuteknovaacute nukleovaacute kyselina určitej znaacutemej dĺžky a sekvencie (najčastejšie DNA pretože je stabilnejšia ako RNA) ktoraacute je značenaacute a sluacuteži na detekciu komplementaacuternych molekuacutel DNA alebo RNA v procese hybridizaacutecie V zaacutevislosti od podmienok hybridizaacutecie (stringencia) mocircže byť detegovanaacute sekvencia uacuteplne komplementaacuterna alebo v menej priacutesnych podmienkach mocircže mať sekvenčneacute odchyacutelky Proacuteba sluacuteži na vyhľadanie a zviditeľnenie cieľovyacutech NK Zviditeľnenie sa deje prostredniacutectvom označenia proacuteby ešte pred hybridizaacuteciou Značenie proacuteby mocircže byť raacutedioaktiacutevne a neraacutedioaktiacutevne (najčastejšie fluorescenčneacute)

Raacutedioaktiacutevne značeneacute proacuteby pomocou izotopov (32P) sa využiacutevali viac v minulosti v suacutečasnosti suacute kvocircli zdravotnyacutem rizikaacutem ohľaduplnosti k životneacutemu prostrediu ako aj kvocircli jednoduchšej manipulaacutecii použiacutevaneacute fluorescenčne značeneacute proacuteby Raacutedioaktiacutevne značeneacute sondy boli použiacutevaneacute hlavne metoacutedou Southernovej hybridizaacutecie (Southern blotting Southern blot) Citlivosť raacutedioaktiacutevne značenyacutech proacuteb je vyššia dosahuje schopnosť zachytiť 10 fg (femtogram 10-15) cieľovej DNA sekvencie 81 Southern blot

Metoacutedu objavil v roku 1975 britskyacute bioloacuteg Edwin Southern (preto Southern) Pri Southernovej hybridizaacutecii sa restrikčne štiepeneacute fragmenty DNA elektroforeticky separujuacute v geacuteli potom sa metoacutedou blottingu prenesuacute na nylonovuacute alebo nitroceluloacutezovuacute membraacutenu kde suacute naacutesledne hybridizovaneacute v roztoku obsahujuacutecom raacutedioaktiacutevne značenuacute sondu Priloženiacutem fotografickeacuteho filmu k membraacutene a vyvolaniacutem filmu autoraacutediografiou docircjde k zviditeľneniu lokaliacutet kde došlo k hybridizaacuteciiacute raacutedioaktiacutevne značenej sondy s fragmentom DNA (autoraacutediogram) Southern blot bol kľuacutečovou a prvou metoacutedou na identifikaacuteciu osocircb (DNA fingerprinting DNA pofiling) (obr 35)

Okrem Southern blotu existuje Northern blot na analyacutezu RNA (geacutenovej expresie) a Western blot na analyacutezu proteiacutenov postup je obdobnyacute ako pri Southern blote s obmenami špecifickyacutemi pre konkreacutetny blot Pri Northern blote sa použiacutevajuacute hybridizačneacute proacuteby ale pre vizualizaacuteciu proteiacutenov western blotom je potrebneacute použiť protilaacutetky s naacuteslednou vizualizaacuteciou Pomenovanie techniacutek je hra so sloviacutečkami (keďže paacuten Northern ani Western neobjavili takto nazvaneacute techniky)

Neraacutedioaktiacutevne značenie proacuteb použiacutevanyacutech v molekulaacuternej genetike mocircže byť nepriame (použitie haptenu) alebo priame Konečnaacute vizualizaacutecia je najčastejšie zabezpečenaacute fluoreskujuacutecimi farebnyacutemi značkami farbivami fluorochroacutemami (fluorofoacuterami) Pri priamom značeniacute je farbička kovalentne naviazanaacute na nukleotid a na zachytenie fluorescencie suacute potrebneacute špeciaacutelne priacutestroje umožňujuacutece excitaacuteciu farbičky ktoraacute potom emituje žiarenie určitej vlnovej dĺžky (emisneacute žiarenie) a to zachytiacute detekčnyacute systeacutem priacutestroja Využitie fluorochroacutemov v molekulaacuternej genetike je masiacutevne napr na vizualizaacuteciu NK elektroforeticky separovanyacutech v geacuteli kvantifikaacuteciu produktov PCR reakcie v priacutestroji real-time PCR cykleacuter sekvenovaniacute fragmentačnej analyacuteze FISH DNA mikročipoch atď

40

Obr 35 Princiacutep Southern blotu

82 FISH (fluorescenčnaacute in situ hybridizaacutecia)

FISH (fluorescent in situ hybridization fluorescenčnaacute in situ hybridizaacutecia) metoacuteda patriacute medzi molekulovo-cytogenetickeacute techniky Princiacutep FISH metoacutedy je založenyacute na hybridizaacuteciiacute fluorescenčne značenyacutech proacuteb ku komplementaacuternym uacutesekom vyšetrovanej DNA na podložnom skle (priamo na mieste - in situ) K denaturaacutecii dsDNA dochaacutedza buď vplyvom denaturačnyacutech činidiel alebo zvyacutešenou teplotou a naacuteslednou renaturaacuteciou dochaacutedza k naviazaniu sondy na komplementaacuterny uacutesek DNA Vyacutesledok hybridizaacutecie sa vizualizuje fluorescenčnyacutem mikroskopom vybavenyacutem vhodnyacutemi fluorescenčnyacutemi filtrami a vizuaacutelne zhodnotiacute skuacutesenyacutem odborniacutekom Fluorescencia sa v niektoryacutech priacutepadoch mocircže zaznamenať a hodnotiť aj pomocou softveacuteru (obr 36)

Pomocou FISH detegujeme numerickeacute aberaacutecie - zmeny v počte chromozoacutemov (napr trizoacutemia monozoacutemia chromozoacutemov) alebo štruktuacuterne aberaacutecie a prestavby (napr translokaacutecie inverzie deleacutecie duplikaacutecie amplifikaacutecie) FISH metoacuteda umožňuje identifikaacuteciu a detekciu každeacuteho ľudskeacuteho chromozoacutemu jeho zaradenie do karyotypu odhalenie malyacutech submikroskopickyacutech chromozoacutemovyacutech zmien a tiež mapovať poziacutecie jednotlivyacutech geacutenov na chromozoacuteme

41

Obr 36 Princiacutep štandardnej FISH a FISH maľovania celeacuteho chromozoacutemu

Veľkou vyacutehodou FISH metoacutedy je možnosť analyacutezy buniek v metafaacuteze aj v interfaacuteze kedy nie je nutnaacute kultivaacutecia buniek a tiež ryacutechle analyzovanie veľkeacuteho počtu buniek (stovky až tisiacutece) K ďalšiacutem vyacutehodaacutem patriacute bezpečnosť vysokaacute citlivosť dostatočnaacute stabilita relatiacutevne kraacutetky čas hybridizaacutecie a možnosť ryacutechleho vyhodnotenia Hybridizaacutecia pri vaumlčšine suacutečasne dodaacutevanyacutech sond trvaacute 10-12 hodin (na trhu suacute už dostupneacute aj sondy so skraacutetenyacutem časom hybridizaacutecie na 2-3 hodiny) Po hybridizaacuteciiacute nasleduje odmyacutevanie kedy pri priacuteslušnej teplote dochaacutedza k odmytiu nenaviazanyacutech a nespraacutevne hybridizovanyacutech sond Preparaacutet sa naacutesledne podfarbiacute a vyacutesledok sa zhodnotiacute vo fluorescenčnom mikroskope Na podfarbenie chromozoacutemov alebo jadier sa použiacuteva modreacute kontrastneacute farbivo DAPI (46-diamidino-2-fenylindol) ktoreacute maacute silneacute fluorescenčneacute vlastnosti dokaacuteže prechaacutedzať jadrovou membraacutenou a viazať sa na DNA Vyacutesledkom je modreacute zafarbenie ktoreacute vyacuteborne kontrastuje so signaacutelmi jednotlivyacutech sond

Limitujuacutecim faktorom FISH je možnosť identifikaacutecie len tyacutech uacutesekov DNA ku ktoryacutem suacute použiteacute sondy V jednej analyacuteze je možneacute použiť najviac 3 odlišne značeneacute sondy a tak zistiť priacutepadneacute abnormality len na 1 alebo na paacuter lokusoch Na relevantnuacute detekciu je potrebneacute mať vo vzorke 1-5 aberantnyacutech interfaacutezovyacutech jadier

FISH je možneacute uskutočniť na širokej škaacutele biologickeacuteho materiaacutelu na vzorkaacutech perifeacuternej krvi kostnej drene naacuteteroch choriovyacutech klkoch plodovej vode rocircznych druhov tkaniacutev natiacutevnych alebo zaliatych v parafiacutene na 1 bunke (predimplantačnaacute genetickaacute diagnostika PGD) (obr 37)

Využiacuteva sa na detekciu aberaacuteciiacute pri mnohyacutech onkologickyacutech ochoreniach (napr pri diagnoacuteze mnohopočetnyacute myeloacutem sa v suacutečasnosti po separaacutecii CD138+ buniek robiacute FISH s 5 sondami pre geacuteny IGH TP53 RB1 oblasť 1p321q21 a stanovuje sa hyperploidia chromozoacutemov 5 9 a 15) a tiež k spresneniu doplneniu a k overeniu bežneacuteho cytogenetickeacuteho vyšetrenia

Podľa miesta na chromozoacuteme na ktorom dochaacutedza k hybridizaacutecii sondy rozlišujeme 4 typy

DNA sond bull centromeacuteroveacute sondy ndash sa viažu na strednuacute časť chromozoacutemu ndash centromeacuteru sluacutežia k diagnostike zmien v počte chromozoacutemov k detekcii chromozoacutemov neznaacutemeho pocircvodu umožňujuacute interfaacuteznu FISH na nedeliacich sa bunkaacutech (obr 38-41)

42

Obr 37 Interfaacutezna FISH preimplantačnyacute genetickyacute skriacutening aneuploidiiacute ndash blastomeacutera 3-denneacuteho ľudskeacuteho embrya s normaacutelnym počtom chromozoacutemov 13 18 21 pohlavie XY použityacutech 5 sond pre chromozoacutemy 13 ndash orange 18 ndash aqua 21 ndash green X ndash blue a Y ndash yellow (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

Obr 38 Interfaacutezne jadro po hybridizaacutecii s centromeacuterovou sondou pre chromozoacutem 8 (Vysis Abbott) V pravom jadre je priacutetomnaacute trizoacutemia chromozoacutemu 8 (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex) Obr 39 Metafaacutezna (A) a interfaacutezna FISH (B) použitaacute centromeacuterovaacute sonda CEPX spectrum orangeCEPY spectrum green (Vysis Abbott) Sonda hybridizuje k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (červenyacute signaacutel) a Y (zelenyacute signaacutel) (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

43

Obr 40 Interfaacutezna FISH vyšetrenie spermiiacute použiteacute sondy CEPX greenCEPY orange (Aneuscore Metasystems) Sondy hybridizujuacute k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (zelenyacute signaacutel) Y (červenyacute signaacutel) vľavo ndash dve haploidneacute spermie (majuacutece jedna spermia X druhaacute Y chromozoacutem) vpravo ndash dve patologickeacute spermie obsahujuacutece gonozoacutemovyacute komplement XY (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

Obr 41 Interfaacutezna FISH vyšetrenie spermiiacute použiteacute sondy CEPX greenCEPY orange a CEP18 aqua (Aneuscore Metasystems) Sondy hybridizujuacute k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (zelenyacute signaacutel) Y (červenyacute signaacutel) a 18 (modryacute signaacutel) vľavo ndash normaacutelne haploidneacute ľudskeacute spermie - 1x chromozoacutem X alebo Y a jedenkraacutet chromozoacutem 18 v strede ndash patologickaacute spermia obsahujuacuteca gonozoacutemovyacute komplement XY a jeden chromozoacutem 18 vpravo ndash patologickaacute diploidnaacute spermia s chromozoacutemami X Y a dvoma chromozoacutemami 18 (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

bull lokusovo špecifickeacute sondy ndash hybridizaacutecia prebehne na konkreacutetnom mieste geacutenu (lokuse) (obr 42-44) použiacutevajuacute sa k vyšetreniu mikrodeleacuteciiacute (straty malyacutech častiacute chromozoacutemu pri mikrodelečnyacutech syndroacutemoch) k zisteniu amplifikaacutecie onkogeacutenov a niektoryacutech špecifickyacutech translokaacuteciiacute prestavby geacutenov umožňujuacute interfaacuteznu FISH na nedeliacich sa bunkaacutech bull subtelomeroveacute ndash vaumlzba na koncoveacute časti chromozoacutemu ndash telomeacutery bull celochromozoacutemoveacute alebo celomaľovacie sondy ndash sondy hybridizujuacute s mnohopočetnyacutemi chromozoacutemovyacutemi sekvenciami pričom sa fluorescenčne tak bdquovymaľujeldquo celyacute chromozoacutem (Obr 45) Použiacutevajuacute sa na vyšetrenie chromozoacutemovyacutech prestavieb k analyacuteze translokaacuteciiacute a k detekcii pocircvodu tzv marker chromozoacutemov (malyacutech nadpočetnyacutech chromozoacutemov neznaacutemeho pocircvodu) K použitiu sondy suacute potrebneacute metafaacutezne chromozoacutemy nepoužiacutevaju sa pre interfaacuteznu FISH

Pri konvenčnej chromozoacutemovej FISH suacute homogeacutenne DNA proacuteby hybridizovaneacute s fixovanyacutem metafaacuteznym alebo prometafaacuteznym chromozoacutemomchromozoacutemami na skliacutečku (Obr 36a) Maximaacutelna rozlišovacia schopnosť metafaacuteznej FISH je niekoľko megabaacutez (Obr 39a 45) využitiacutem viac

44

natiahnutyacutech prometafaacuteznych chromozoacutemov sa dosiahne 1 Mb rozliacutešenie Prostredniacutectvom fiber FISH konkreacutetne artificiaacutelne deproteinizovanej natiahnutej DNA pripravenej in situ z celyacutech buniek na mikroskopickom skliacutečku je možneacute vizualizovať individuaacutelne geacuteny maleacute DNA elementy na chromozoacuteme s rozliacutešeniacutem okolo 1000 bp

Obr 42 Interfaacutezne jadro po hybridizaacutecii s lokusovo-špecifickou sondou LSI 5q31 Spectrum Orange5p12 Spectrum Green (Vysis Abbott) Na ľavom obraacutezku suacute priacutetomneacute dva červeneacute (5q31) a dva zeleneacute signaacutely (5p12) v pravom jadre je priacutetomnaacute deleacutecia 5q31 oblasti chyacuteba jeden červenyacute signal (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

Obr 43 Interfaacutezna FISH použitaacute lokusovo-špecifickaacute sonda ndash translokačnaacute - XL BCRABL1 plus (Metasystems) dvojfarebnaacute dvojfuacutezna kde červenaacute označuje lokus ABL1 na chromozoacuteme 9 a zelenaacute oblasť BCR na chromozoacuteme 22 Sonda deteguje fuacuteziu protoonkogeacutenu ABL1 (9q34) a geacutenu BCR (22q11) v priacutepade že červenyacute a zelenyacute signaacutel suacute pri sebe (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

45

Obr 44 Interfaacutezna FISH Použitaacute lokusovo-špecifickaacute sonda- typ break apart pre IGH geacuten V docircsledku translokaacutecie došlo k rozskočeniu geacutenu pričom translokačneacuteho partnera nepoznaacuteme vieme určiť len percento v koľkyacutech jadraacutech je geacuten prestavanyacute (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex) Obr 45 Použiteacute celochromozoacutemoveacute sondy WCP 15 (červenyacute chromozoacutem) a WCP 17 (zelenyacute chromozoacutem) Na metafaacuteze je potvrdenaacute reciprokaacute translokaacutecia t(1517)(q2221) (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

FISH vizualizaacutecia celeacuteho chromozoacutemu maľovanie chromozoacutemu anglicky chromosome

painting je špeciaacutelnou aplikaacuteciou chromozoacutemovej FISH proacuteba je koktail veľkeacuteho počtu rocircznych fluorescenčne značenyacutech DNA fragmentov hybridizujuacutecich pozdĺž celeacuteho konkreacutetneho chromozoacutemu (obr 36b 45) bdquoChromosomepaintingldquo analyzuje metafaacutezne chromozoacutemy V minulosti bola FISH vizualizaacutecia celyacutech chromozoacutemov limitovanaacute malyacutem množstvom rocirczne sfarbenyacutech fluorochroacutemov

V suacutečasnosti je možneacute detegovať množstvo cieľovyacutech sekvenciiacute naraz čo sa využiacuteva pri celogenoacutemovej chromozoacutemovej vizualizaacutecii (whole-chromosomepainting - WCP) metoacutedou multiplex FISH (M-FISH multicolor FISH o br 46) alebo spektraacutelnej karyotypizaacutecie (SKY) kedy možno rozliacutešiť všetky ľudskeacute chromozoacutemy ndash teda 24 rocircznych chromozoacutemov M-FISH a SKY patria medzi metafaacutezne formy FISH diagnostiky ktoreacute umožňujuacute simultaacutennu vizualizaacuteciu všetkyacutech ľudskyacutech chromozoacutemov v rocircznych farbaacutech čo predstavuje uľahčenie analyacutezy karyotypu hlavne pri komplexnyacutech zmenaacutech a markeroch neznaacutemeho pocircvodu Obe techniky vychaacutedzajuacute z použitia

46

celochromozoacutemovyacutech sond značenyacutech kombinaacuteciou viaceryacutech fluorochroacutemov Rozdiel medzi M-FISH a SKY spočiacuteva v technike ziacuteskania konečneacuteho obrazu

Obr 46 Multicolor FISH - každyacute chromozoacutemovyacute paacuter je zafarbenyacute inou farbou pričom na ich zafarbenie postačuje kombinaacutecia 5 fluorochroacutemov Na vyhodnocovanie je potrebnaacute špeciaacutelna sada fluorescenčnyacutech filtrov pre jednotliveacute fluorochroacutemy a špeciaacutelnyacute softweacuter Vľavo-štandardnyacute karyotyp vpravo karyotyp s mutaacuteciami (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

V molekulovej cytogenetike suacute komerčne dostupneacute sety M-FISH proacuteb umožňujuacutece

viacfarebneacute pruacutežkovanie chromozoacutemov (banding) s vysokyacutem rozliacutešeniacutem (multicolor-banding mBAND FISH MCB) čo umožňuje identifikaacuteciu intrachromozoacutemovyacutech prestavieb (Obr 47) Nevyhnutnosťou mBAND-u je mať chromozoacutemy v metafaacuteze Taacuteto metoacuteda bola prvyacutekraacutet uskutočnenaacute na chromozoacuteme 5 v roku 1999 mBAND FISH umožňuje rozliacutešiť špecifickeacute oblasti chromozoacutemov na uacuterovni pruacutežku - bandu a sub-bandu s detekciou 550 bandov haploidneacuteho karyotypu

Obr 47 A - mBAND chromozoacutemu 11 - inverzia duplikovanej oblasti 11q223-q25 B - mBAND chromozoacutemu 3 - na kruhovom chromozoacuteme deleacutecia oblasti 3p263 C - mBAND chromozoacutemu 2 - potvrdenie inverzie duplikovanej časti chromozoacutemu (poskytnuteacute RNDr Dagmar Landlovou Medirex)

FISH metoacuteda a jej varianty (M-FISH mBAND SKY) majuacute v suacutečasnosti širokeacute využitie v

klinickej genetike v onkologickej genetike na detekciu aberaacuteciiacute v čase diagnoacutezy počas liečby po

47

liečbe monitorovanie po transplantaacutecii kostnej drene v prenataacutelnej a postnataacutelnej diagnostike pri detekcii submikroskopickyacutech deleacuteciiacute (napr DiGeorge syndroacutem - 22q112 delečnyacute syndroacutem PraderndashWilli syndroacutem- chromozoacutem 15q11-13) prostredniacutectvom FISH je možnaacute detekcia numerickyacutech zmien chromozoacutemov (trizoacutemia chromozoacutemu 21 pri Downovom syndroacuteme trizoacutemia chromozoacutemu 15 pri Patauovom syndroacuteme trizoacutemia chromozoacutemu 18 pri Edwardsovom syndroacuteme) rocirczne zmeny v počte pohlavnyacutech chromozoacutemov (monozoacutemia X pri Turnerovom syndroacuteme Klinefelterov syndroacutem s X chromozoacutemom naviac - XXY) podobne v predimplantačnej diagnostike

83 DNA Microarray (DNA mikro čip biočip) DNA mikročipovanie je technika využiacutevajuacuteca hybridizaacuteciu skuacutemanej nukleovej kyseliny

(cieľovaacute vzorka) s veľkyacutem množstvom oligonukleotidovyacutech proacuteb (desať tisiacutec až milioacuten) ktoreacute suacute prichyteneacute na pevnyacute podklad najčastejšie sklenyacute silikoacutenovyacute alebo nylonovyacute (doštička čip) Skuacutemanaacute nukleovaacute kyselina je pred hybridizaacuteciou fragmentovanaacute označenaacute fluorofoacuterom a denaturovanaacute Po kontakte čipu s cieľovou vzorkou ktoraacute je vlastne zmes označenyacutech oligonukleotidov značeneacute oligonukleotidy hybridizujuacute s oligonukleotidovyacutemi sekvenciami prichytenyacutemi na čipe Potom suacute na zaacuteklade fluorescencie detekovaneacute miesta kde došlo k hybridizaacutecii čiže vzorka obsahovala takuacuteto nukleotidovuacute sekvenciu Z jedneacuteho mikročipu sa ziacuteska obrovskeacute množstvo daacutet ktoreacute je vždy nutneacute softveacuterovo spracovať V dnešnej dobe existuje niekoľko firiem poskytujuacutecich komerčne mikročipy na objednaacutevku alebo si ich laboratoacuteria produkujuacute sami

Mikročipovanie prebieha nasledovne

1) Vytvorenie DNA čipu ndash tisiacutece rocircznych jednovlaacuteknovyacutech DNA oligonukleotidov znaacutemych sekvencii sa kovalentne naviažu na povrch doštičky vždy v určitej lokalite je niekoľko rovnakyacutech oligonukleotidov veľkosť takejto lokality je ˂ 200 microm Proacutebami mocircže byť DNA cDNA alebo syntetizovaneacute oligonukleotidy Už hotoveacute mikročipy ponuacutekajuacute viacereacute firmy (Affymetrix Agilent Technologies Eppendorf Illumina) alebo si ich jednotliveacute laboratoacuteria vyraacutebajuacute sami pomocou robotickyacutech zariadeniacute DNA čip sa vytvaacutera buď nanaacutešaniacutem kvapiek oligonukleotidov na podklad alebo synteacutezou oligonukleotidov in situ na čipe 2) Priacuteprava vzorky ndash nukleovaacute kyselina (mRNA DNA) sa purifikuje určiacute sa jej kvantita a kvalita (spektrofotometericky) fragmentuje resp v priacutepade mRNA sa syntetizuje cDNA v priacutepade potreby sa mocircže DNA amplifikovať PCR reakciou štiepiť restrikčnyacutemi endonukleaacutezami 3) Fluorescenčneacute označenie (zriedkavejšie raacutedioaktiacutevne) fragmentov DNA prebieha počas reverznej transkripcie alebo PCR amplifikaacutecie za uacutečasti fluorescenčne značenyacutech nukleotidov Keď sa analyzujuacute dve rocirczne vzorky napr zdraveacute tkanivo a naacutedoroveacute tkanivo označenie nukleovyacutech kyseliacuten v tyacutechto tkanivaacutech byacuteva rozdielne a to použitiacutem dvoch rocircznych fluorescenčnyacutech farbiacutev (napr zeleneacute a červeneacute) Pred hybridizaacuteciou je potrebneacute vzorku denaturovať čiacutem sa vytvoriacute zmes jednovlaacuteknovyacutech DNA označenyacutech značkou 4) Hybridizaacutecia s mikročipom ndash v špeciaacutelnom hybridizačnom roztoku hybridizujuacute komplementaacuterne sekvencie zo vzorky s priacuteslušnyacutemi oligonukleotidovyacutemi sondami naviazanyacutemi na čipe Potom sa čip obmyje aby došlo k odstraacuteneniu čiastočne hybridizovanyacutech nukleovyacutech kyseliacuten 5) Skenovanie mikročipu ndash skenerom čipov docircjde k ožiareniu čipu laserom pričom v mieste hybridizaacutecie fluorescenčne značenyacutech DNA fragmentov s proacutebou docircjde k emisii svetla určitej vlnovej dĺžky ktoruacute skener zaznamenaacute 6) Analyacuteza daacutet prebieha metoacutedami bioinformatiky spracovaniacutem softveacutermi sa zistiacute ktoreacute lokality čipu navzaacutejom hybridizovali v priacutepade použitia dvoch vzoriek kontrolnej a skuacutemanej je možneacute analyzovať ich relatiacutevnu intenzitu hybridizaacutecie (expresie určiteacuteho geacutenu)

Existujuacute štyri typy mikročipov 1) Čipy ur čeneacute na analyacutezu expresie (obsahujuacute cDNA proacuteby) pre tzv dvojkanaacutelovyacute experiment kedy je vzorka určenaacute k hybridizaacutecii na čipe ziacuteskanaacute zmiešaniacutem DNA fragmentov kontrolnej a skuacutemanej vzorky pričom fragmenty suacute rozdielne fluorescenčne označeneacute (napr zelenyacute fluorofoacuter pre kontrolnuacute vzorku a červenyacute pre skuacutemanuacute) Na zaacuteklade intenzity a typu fluorescencie sa deteguje expresia geacutenov typickaacute pre kontrolnuacute vzorku (napr zelenaacute fluorescencia) pre skuacutemanuacute vzorku (napr

48

červenaacute fluorescencia) a expresia podobnaacute u oboch vzoriek (žltaacute fluorescencia) neexprimovaneacute geacuteny (čierna fluorescencia) rocirczne odtiene (v zaacutevislosti od prevažujuacutecej hybridizaacutecie) (obr 48) 2) Čipy ur čeneacute na analyacutezu mutaacutecii použije sa genoacutemovaacute DNA označenaacute jednou fluorescenčnou farbičkou na určenie jednonukleotidovej zmeny (SNP ndash Single Nukleotide Polymorphism) 3) Čipy na komparatiacutevnu genoacutemovuacute hybridizaacuteciu (aCGH array Comparative Genomic Hybridization) ndash použiacutevaneacute na zistenie zvyacutešenia alebo zniacuteženia množstva chromozoacutemovyacutech fragmentov obsahujuacutecich geacuteny zodpovedneacute za určiteacute ochorenie Na analyacutezu sa použije skuacutemanaacute gDNA a referenčnaacute (kontrolnaacute) DNA každaacute sa značiacute inou fluorescenčnou farbičkou (princiacutep ako pri analyacuteze expresie) (obr 49 50) 4) Čipy CGH - SNP kombinovaneacute čipy ur čeneacute na analyacutezu aj mutaacuteciiacute SNP aj na komparatiacutevnu genoacutemovuacute hybridizaacuteciu CGH

Mikročipy majuacute rozsiahle využitie napriacuteklad v identifikaacuteciiacute novyacutech geacutenov vo vyacuteskume ich funkciiacute expresie v rocircznych podmienkach pri diagnostike mnohyacutech ochoreniacute vo farmakogenomike vo vyacuteskume vplyvu toxiacutenov

Obr 48 Heatmapa geacutenovej expresie vybranyacutech geacutenov (mRNA) mikročip obsahuje 46000 cDNA proacuteb (poskytnuteacute Ing Helenou Gbelcovou PhD Uacutestav lekaacuterskej bioloacutegie genetiky a klinickej genetiky LF UK a UNB)

49

Obr 49 Princiacutep komparatiacutevnej genoacutemovej hybridizaacutecie (aCGH - array comparative genomic hybridization) Obr 50 A) Vyacutesledok komparatiacutevnej genoacutemovej hybridizaacutecie (aCGH - array comparative genomic hybridization) vzorky DNA izolovanej plodovej vody U plodu s abnormaacutelnym ultrasonografickyacutem vyšetreniacutem bola identifikovanaacute duplikaacutecia oblasti 3q261q29 (modryacute paacutes) a deleacutecia oblasti 5p1533p151 (červenyacute paacutes) Pre porovnanie chromozoacutem 1 bez aberaacutecie b) Ten istyacute pacient ale ineacute softveacuteroveacute spracovanie (poskytnuteacute RNDr Miroslavom Tomkom PhD Medirex)

50

Odporuacutečanaacute a použitaacute literatuacutera

Odborneacute knihy Klug W S Cummings M R Spencer Ch A Palladino M A Concepts of Genetics jedenaacuteste vydanie (2015) Carson S Molecular Biology Techniques tretie vydanie (2012) Strachan T Read A Human Molecular Genetics štvrteacute vydanie (2011) Sudbery P Sudbery I Human Molecular Genetics tretie vydanie (2009)

Internetoveacute straacutenky

wwwncbinlmnihgov wwwmlpacom wwwthermofishercom wwwilluminacom wwwpromegask wwwqiagencom wwwambioncom

Odborneacute člaacutenky Chacon-Cortes D Griffiths L R Methods for extracting genomic DNA from whole blood samples current perspectives Journal of Biorepository Science for Applied Medicine Volume 2 strany 1- 9 Viltrop T Krjutskov K Palta P Metspalu A Comparison of DNA extraction methods for multiplex polymerase chain reaction Anal Biochem 2010 Volume 398(2) strany 260-262 Ing Martin Čermaacutek Molekulaacuterna cytogenetika v problematike familiaacuternych maligniacutet Onkoloacutegia Volume 2 strany 77 - 83 Livak KJ Schmittgen TD Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method Methods 2001 Volume 25(4) strany 402 - 408 Bustin S A Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays J Mol Endocrinol 2000 Volume 25(2) strany169 - 193

MOLEKULAacuteRNE METOacuteDY AKTUAacuteLNE POUŽIacuteVANEacute V KLINICKEJ GENETIKE RNDr Andrea Pastoraacutekovaacute PhD RNDr Robert Petrovič PhD Vydala Univerzita Komenskeacuteho v Bratislave Lekaacuterska fakulta Rozsah 50 straacuten 246 AH prveacute vydanie ISBN 978-80-223-4231-5

31

detekciu zmien v počte koacutepii geacutenov (obr 28 29) ako aj zistenie počtu kompletnyacutech chromozoacutemov (chromozoacutem 13 18 21 XY tiež aj z amniovej tekutiny) diagnostiku naacutedorov (zmeny počtu pri ALL CLL atď) kvantifikaacuteciu metylaacutecie (Prader-WilliAngelmanov syndroacutem Fragilnyacute X inaktivaacutecia naacutedorovyacutech supresorovyacutech geacutenov atď) mRNA analyacutezu geacutenov zuacutečastňujuacutecich sa apoptoacutezy alebo zaacutepalov

MS-MLPA (Methylation-Specific MLPA) je varianta MLPA určenaacute špeciaacutelne na analyacutezu aberantnyacutech metylaacutecii imprintovanyacutech oblastiacute ako aj detekciu metylačnyacutech zmien CpG ostrovčekov lokalizovanyacutech bliacutezko promoacutetora Rozdiel oproti štandardnej MLPA spočiacuteva v použitiacute metylačne senzitiacutevneho restrikčneacuteho enzyacutemu HhaI ktoryacute štiepi MS-MLPA proacuteby hybridizovaneacute k nemetylovanej sekvencii Každaacute DNA vzorka určenaacute pre MS-MLPA analyacutezu prejde dvoma reakciami v jednej mikroskuacutemavke štandardnou MLPA analyacutezou (bez štiepenia metylačne senzitiacutevnym enzyacutemom) a v druhej mikroskuacutemavke docircjde okrem ligaacutecie proacuteb aj k metylačne senzitiacutevnemu štiepeniu hybridizovanyacutech proacuteb s nemetylovanou DNA Amplifikujuacute sa len ligovaneacute proacuteby po PCR amplifikaacutecii sa fragmentačnou analyacutezou porovnaniacutem oboch reakciiacute zistia rozdiely v metylačnom profile vzorky k referenčnej vzorke

RT-MLPA (Reverse Transkriptase MLPA) je variaacutecia MLPA určenaacute pre zistenie mRNA profilu vzorky je alternatiacutevou k real-time PCR a mikročipom RT-MLPA nedeteguje mRNA množstvo priamo pretože použiacutevanaacute ligaacuteza nie je schopnaacute ligovať DNA oligonukleotidy keď suacute hybridizovaneacute s RNA Preto RT-MLPA začiacutena reverznou transkripciou so špeciaacutelne navrhnutyacutemi RT primermi tak aby vytvorili kraacutetke oligonukleotidy (cDNA) Potom reakcia pokračuje ako štandardnaacute MLPA

Obr 28 MLPA analyacuteza geacutenu DMD (koacutedujuacuteceho dystrofiacuten) mutaacutecie ktoreacuteho spocircsobujuacute Duchennovu svalovuacute dystrofiu u pacienta je priacutetomnaacute deleacutecia exoacutenu 45 v porovnaniacute s referenčnou vzorkou ndash kontrolou

32

Obr 29 MLPA analyacuteza geacutenu DMD (koacutedujuacuteceho dystrofiacuten) mutaacutecie ktoreacuteho spocircsobujuacute Duchennovu svalovuacute dystrofiu u pacienta suacute priacutetomneacute duplikaacutecie exoacutenov 41 42 43 44 45 (piacuteky vo vzorke pacienta sa porovnajuacute s piacutekmi v kontrole ndash referenčnej vzorke)

33

6 Sekvenovanie

Sekvenovaniacutem rozumieme určenie primaacuternej štruktuacutery DNA teda určenie poradia nukleotidov v reťazci DNA Začiatky moderneacuteho sekvenovania siahajuacute do roku 1977 kedy boli objaveneacute dve metoacutedy sekvenovania 1) chemickaacute metoacuteda Maxama a Gilberta 2) enzymatickaacute metoacuteda Sangera Nicklena a Coulsona

Princiacutep obidvoch metoacuted sekvenovania spočiacuteva v tom že sa vytvoriacute suacutebor DNA molekuacutel s rocircznou veľkosťou ktoreacute suacute zakončeneacute konkreacutetnym nukleotidom tieto DNA molekuly sa elektroforeticky separujuacute v geacuteloch s rozlišovacou schopnosťou 1 nukleotid 61 Chemickaacute metoacuteda

DNA molekuly sa na 5-konci raacutedioaktiacutevne označia raacutedioaktiacutevnym fosforom a naacutesledne sa chemicky modifikujuacute špecificky pre každuacute baacutezu DNA sa potom v modifikovanyacutech miestach štiepi čiacutem vzniknuacute rocirczne dlheacute fragmenty pričom podmienky suacute nastaveneacute tak aby sa DNA na každom mieste štiepila len raz Modifikaacutecia DNA a štiepenie prebehne v štyroch separaacutetnych reakciaacutech (skuacutemavkaacutech) takže po elektroforetickej separaacuteciiacute takto opracovanej DNA v štyroch draacutehach polyakrylamidoveacuteho geacutelu a naacuteslednej autoraacutediografii (podobne ako pri Southernovej hybridizaacutecii) je možneacute odčiacutetať nukleotidovuacute sekvenciu približne 100 nukleotidov od raacutedioaktiacutevneho označenia (v čase objavu Maxama a Gilberta) 62 Sangerova metoacuteda

Zaacuteklady metoacutedy boli popiacutesaneacute už v roku 1975 (metoacuteda plus a miacutenus) ale až vylepšenie použitiacutem dideoxynukleotidov (ddNTP) v roku 1977 došlo k zjednodušeniu sekvenovania Princiacutepom enzyacutemoveacuteho sekvenovania je terminaacutecia (zastavenie) polymerizaacutecie inkorporaacuteciou 2´ 3 -dideoxynukleotidov do novosyntetizujuacuteceho sa vlaacutekna DNA Keďže ddNTP neobsahujuacute hydroxylovuacute skupinu na 3 uhliacuteku riboacutezy nemocircžu sa zuacutečastniť na tvorbe fosfodiesterovej vaumlzby nemocircže sa pripojiť k nim ďalšiacute nukleotid čiže musiacute docircjsť k terminaacuteciiacute polymeraacutecie Reakcia prebieha v štyroch skuacutemavkaacutech s raacutedioaktiacutevne značenyacutem primerom V každej skuacutemavke suacute priacutetomneacute všetky štyri deoxynukleotidtrifosfaacutety (dNTP) ale pre každuacute skuacutemavku je špecifickyacute priacutedavok maleacuteho množstva jedneacuteho z dideoxynukleotidtrifosfaacutetov (v prvej skuacutemavke je ddATP v druhej ddCTP v tretej ddTTP a vo štvrtej ddGTP) Maleacute množstvo ddNTP spocircsobiacute že pri polymerizaacutecii dochaacutedza k prednostneacutemu zaradeniu štandardnyacutech dNTP do narastajuacuteceho reťazca a len občas sa inkorporuje ddNTP čiacutem sa zastaviacute synteacuteza reťazca V každej skuacutemavke tak vznikne suacutebor DNA fragmentov rocircznych veľkostiacute zakončenyacutech priacuteslušnyacutem ddNTP (v prvej skuacutemavke ddATP v druhej ddCTP v tretej ddTTP a vo štvrtej ddGTP) Po elektroforetickej separaacutecii v 4 draacutehach polyakrylamidoveacuteho geacutelu a autoraacutediografii sa z autoraacutediogramu odčiacuteta sekvencia

V suacutečasnosti je sekvenovanie do značnej miery automatizovaneacute pričom využiacuteva princiacutep Sangerovej enzyacutemovej metoacutedy s určityacutemi obmenami Uacutesek DNA ktoryacute treba sekvenovať sa prostredniacutectvom termostabilnyacutech DNA polymeraacutez namnožiacute PCR metoacutedou po ktorej nasleduje sekvenačnaacute reakcia (asymetrickaacute PCR) s fluorescenčne značenyacutemi ddNTP (každyacute druh označenyacute inyacutem fluorescenčnyacutem farbivom) Sekvenačnaacute reakcia prebieha v jednej skuacutemavke s jednyacutem primerom vznikne tak suacutebor jednovlaacuteknovyacutech DNA rocircznej dĺžky ktoreacute suacute na 3konci označeneacute ddNTP so špecifickyacutem fluorescenčnyacutem farbivom Taacuteto metoacuteda sekvenovania sa tiež nazyacuteva rdquodye-terminator cycle sequencingrdquo(obr 30) Po kapilaacuternej elektroforeacuteze vzorky v genetickom analyzaacutetore zaznamenaacutevaniacute fluorescencie jednotlivyacutech fragmentov CCD kamerou a softveacuterovom spracovaniacute sa ziacuteska sekvencia DNA (obr 31)

34

Obr 30 Princiacutep sekvenovania Sangerova dideoxy metoacuteda alebo tzv chain termination method (reťazec zastavujuacuteca metoacuteda) Obr 31 Určenie genotypu plodu a rodičov sekvenčnou analyacutezou DNA ziacuteskanej z plodovej vody (prenataacutelna diagnostika) a perifeacuternej krvi sekvenčnaacute analyacuteza geacutenu ASPA vyacutesledok u plodu priacutetomnaacute mutaacutecia c 914CgtA v homozygotnom stave (AA) rodičia heterozygoti (AC) Uvedenaacute mutaacutecia je v homozygotnom stave kauzaacutelnou priacutečinou Canavanovej choroby

Automatizovaneacute sekvenovanie prinaacuteša viacereacute vyacutehody oproti klasickej Sangerovej metoacutede vyššiu presnosť a ryacutechlosť v jednej sekvenačnej reakcii možnosť osekvenovať až 1200 nukleotidovyacute fragment maleacute množstvo templaacutetu potrebneacute na analyacutezu

35

63 Next Generation Sequencing (NGS)

NGS (sekvenovanie novej generaacutecie) maacute obrovskyacute potenciaacutel v analyacuteze genoacutemov pričom toto označenie zahŕňa viacereacute technologickeacute metoacutedy reprezentovaneacute niekoľkyacutemi firmami Princiacutepom je masiacutevne paralelneacute sekvenovanie čiacutem sa ziacuteskajuacute raacutedovo tisiacutece až milioacuteny sekvenciiacute naraz 631 Sekvenovanie druhej generaacutecie

Na začiatku sa analyzovanaacute DNA vo vaumlčšine priacutepadov fragmentuje (vznikne tak DNA

knižnica) na fragmenty sa pripoja kraacutetke sekvencie ndash adapteacutery naacutesledne sa tieto fragmenty rocircznymi priacutestupmi amplifikujuacute a určiacute sa ich sekvencia Vďaka čiastočnyacutem prekryvom je zo ziacuteskanyacutech sekvencii možneacute poskladať plynuluacute sekvenciu zodpovedajuacutecu pocircvodnej nefragmentovanej DNA

Pyrosekvenovanie je podobne ako Sangerova metoacuteda založenaacute na princiacutepe synteacutezy komplementaacuterneho vlaacutekna DNA avšak rozdiel je v tom že sa na detekciu inkorporaacutecie nukleotidu využiacuteva inyacute systeacutem tvorby luminiscenčneacuteho signaacutelu v priebehu reakcie Pyrosekvenovanie je umožneneacute vďaka aktivite 4 enzyacutemov - DNA polymeraacutezy ATP sulfurylaacutezy luciferaacutezy a apyraacutezy Reakčnaacute zmes obsahuje aj ďalšie komponenty - enzymatickeacute substraacutety adenoziacutenfosfosulfaacutet (APS) d-luciferiacuten sekvenovanyacute templaacutet a cyklicky postupne po jednom type pridaacutevaneacute nukleotidtrifosfaacutety Po zabudovaniacute nukleotidu do novovznikajuacuteceho reťazca docircjde k uvoľneniu pyrofosfaacutetu naacutesledne je využityacute ATP sulfurylaacutezou na synteacutezu ATP z APS počas ďalšej reakcie docircjde k využitiu ATP luciferaacutezou na premenu luciferiacutenu na oxyluciferiacuten čo spocircsobiacute svetelnyacute signaacutel a ten zaznamenaacute detekčnyacute systeacutem Poslednou enzymatickou reakciou je reakcia apyraacutezy ktoraacute odstraacuteni nezainkorporovaneacute nukleotidy a nevyužiteacute ATP aby sa celyacute proces mohol zopakovať s reakčnou zmesou obsahujuacutecou ďalšiacute nukleotidtrifosfaacutet (inyacute ako v predchaacutedzajuacutecej reakcii) Po každej reakcii detektor zaznamenaacuteva emisiu svetla na zaacuteklade intenzity svetla je možneacute určiť či bol vradenyacute priacuteslušnyacute nukleotidtrifosfaacutet či bol inkorporovanyacute jeden priacutepadne viac rovnakyacutech nukleotidtrifosfaacutetov

Zvyacutešenie vyacutekonu pyrosekvenovania umožnila tzv emulznaacute PCR v mikročasticiach a použitie platničky PicoTiterPlatereg toto sekvenovanie zaviedla firma Roche pod pojmom 454 pyrosekvenovanie v roku 2005 Na začiatku sa DNA fragmentuje na uacuteseky dlheacute 400-600 baacutez dvojvlaacuteknovaacute fragmentovanaacute DNA sa liguje s adapteacutermi prostredniacutectvom nich sa naviaže na mikročastice dvojvlaacuteknoveacute fragmenty sa oddelia mikročastice s naviazanyacutemi jednovlaacuteknovyacutemi fragmentami sa premiešajuacute so zmesou oleja a roztoku ktoryacute obsahuje všetky komponenty na uacutespešnuacute PCR Tyacutemto spocircsobom sa okolo každej mikročastice vytvoriacute vlastnyacute mikroreaktor v ktorom prebehne amplifikaacutecia fragmentu Po PCR reakcii sa mikročastice prenesuacute do platničky PicoTiterPlate v ktorej sa do jamky zmestiacute akuraacutet jedna mikročastica a reakčneacute komponenty pyrosekvenačnej reakcie PicoTiterPlatereg maacute 1 600 000 jamiek každaacute jamka maacute maximaacutelny objem 75 picolitra Platnička s mikročasticami sa vložiacute do sekvenačneacuteho systeacutemu ndash priacutestroja v ktorom sa celeacute pyrosekvenovanie uskutočniacute Chemiluminiscenčneacute signaacutely ktoryacutech počas sekvenovania vznikajuacute milioacuteny v priebehu hodiny suacute zachyteneacute CCD kamerou a analyzovaneacute softveacuterom

Firma Illumina predstavila inuacute technoloacutegiu PCR amplifikaacutecia a sekvenovanie sa uskutočňuje na skliacutečku (flow cell) Fragmentaacutecia DNA a pripojenie adapteacuterov prebieha za uacutečasti transpozoacutemov v procese nazvanom tagmentaacutecia Po hybridizaacutecii fragmentov DNA na skliacutečko prebehne v klastroch PCR amplifikaacutecia (tzv mostiacutekovaacute amplifikaacutecia) sekvenaacutecia prebieha za uacutečasti rozdielne fluorescenčne značenyacutech a chemicky modifikovanyacutech nukleotidov pričom každyacute nukleotid emituje fluorescenciu s inou vlnovou dĺžkou Na skliacutečku prebieha paralelne až 6 miliaacuterd sekvenaacutecii (obr 32)

Ďalšiacutemi možnosťami sekvenovania druhej generaacutecie je systeacutem SOLid (vyvinutyacute firmou Applied Biosystem dnes pod Thermo Fisher Scientific) a Ion Semiconductor Sequencing ndash polovodičoveacute ioacutenoveacute sekvenovanie (od firmy Ion Semiconductor Sequencing v suacutečasnosti Thermo Fisher Scientific)

36

Obr 32 Princiacutep sekvenovania novej generaacutecie od firmy Illumina PCR amplifikaacutecia a sekvenovanie sa uskutočňuje na skliacutečku (flow cell) paralelne prebieha až 6 miliaacuterd sekvenaacutecii

632 Sekvenovanie tretej generaacutecie

Pred sekvenovaniacutem netreba amplifikovať DNA PCR metoacutedou ale sekvencia sa ziacuteskava zachyteniacutem signaacutelu v reaacutelnom čase Medzi sekvenovanie tretej generaacutecie patriacute SMRT (Single Molecule Real-Time Sequencing) a Nanopore Sequencing

37

7 Fragmentačnaacute analyacuteza DNA

Je metoacuteda použiacutevanaacute na určenie veľkosti fragmentov DNA ziacuteskanyacutech PCR reakciou Dĺžka amplifikovanyacutech DNA fragmentov sa zistiacute ich porovnaniacutem s veľkostnyacutem štandardom (obr 33) ktoryacute je tvorenyacute DNA fragmentami znaacutemej dĺžky Veľkostnyacute štandard je pred kapilaacuternou elektroforeacutezou zmiešanyacute so vzorkou DNA fragmenty veľkostneacuteho štandardu suacute fluorescenčne označeneacute pričom použiteacute fluorescenčneacute farbivo je ineacute ako fluorescenčneacute farbivo použiteacute na označenie DNA fragmentov vo vyšetrovanej vzorke

Obr 33 Elektroforetogram veľkostneacuteho štandardu použiacutevaneacuteho na určenie veľkostiacute fragmentov analyzovanyacutech kapilaacuternou elektroforeacutezou v genetickom analyzaacutetore (GeneScantrade 500 LIZtrade dye Size Standard) dĺžka fragmentov v nukleotidoch (napr 50 nukleotidov)

Fragmentačnaacute analyacuteza pozostaacuteva z viaceryacutech krokov Prvyacutem je izolaacutecia DNA nasleduje PCR amplifikaacutecia počas ktorej sa novosyntetizovaneacute DNA fragmenty označia fluorescenčnyacutemi farbivami Vzorka s PCR produktom sa pripraviacute na kapilaacuternu elektroforeacutezu tak že sa zmieša s veľkostnyacutem štandardom (sluacuteži na určenie veľkosti fragmentov) a denaturačnou laacutetkou (formamid) nasleduje denaturaacutecia Pripraveneacute vzorky suacute injektovaneacute do priacutestroja (genetickyacute analyzaacutetor) kde v kapilaacutere naplnenej polymeacuterom v elektrickom poli migrujuacute fluorescenčne značeneacute fragmenty DNA na zaacuteklade veľkosti (kapilaacuterna elektroforeacuteza) Počas elektroforeacutezy genetickyacute analyzaacutetor zaznamenaacuteva fluorescenciu fragmentov Analyacutezou daacutet prostredniacutectvom špeciaacutelnych softveacuterov sa ziacuteskajuacute elektroforetogramy z ktoryacutech je možneacute zistiť veľkosť fragmentov ako aj typ fluorescencie (docircležiteacute ak suacute genetickeacute varianty rozliacutešiteľneacute rocircznou fluorescenciou napr SNaPshot) Fragmentačnaacute analyacuteza je suacutečasťou množstva molekulaacuterno-genetickyacutech metoacuted (pozri obr 12 26 28 29 34) ako suacute napr STR analyacuteza (Short Tandem Repeat) AFLP analyacuteza (Amplified Fragment Lenght Polymorfism) RFLPT-RFLP analyacuteza (Restriction Fragment Lenght PolymorfismTerminal Restricted Fragment Lenght Polymorfism) SSCP (Single Strand Conformation Polymorfism) VNTR (Variable Number of Tandem Repeat) analyacuteza straty heterozygotnosti (LOH loss of heterozygozity) MLPA (Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification) MSMSA (Methylation-Sensitive Mobility Shift Assay) SNP genotypovanie (SNaPshotreg) HiCEP (High-Coverage Expression Profiling)

38

Obr 34 Kvantitatiacutevna fragmentačnaacute PCR analyacuteza (QF-PCR) DNA izolovanej z plodovej vody vyacutesledok prenataacutelnej analyacutezy = priacutetomnosť troch piacutekov pre chromozoacutem 18 (u všetkyacutech fragmentov detegujuacutecich chromozoacutem 18 je pomer vyšetrovanyacutech markerov aberantnyacute 21 resp 111) čo znamenaacute trizoacutemiu chromozoacutemu 18 Edwardsov syndroacutem

39

8 Metoacutedy založeneacute na princiacutepe hybridizaacutecie

Nukleoveacute kyseliny majuacute schopnosť vytvaacuterať dvojvlaacuteknoveacute reťazce z jednovlaacuteknovyacutech molekuacutel na zaacuteklade komplementarity baacutez Komplementarita baacutez umožňuje replikaacuteciu DNA transkripciu RNA komplementarita baacutez zabezpečuje teda reprodukovateľnosť živej hmoty

Hybridizaacutecia je proces v ktorom na zaacuteklade komplementarity baacutez dochaacutedza k vytvoreniu dvojvlaacuteknovej nukleovej kyseliny z dvoch jednovlaacuteknovyacutech molekuacutel DNA alebo RNA alebo ich kombinaacuteciou DNA RNA pričom kratšia jednovlaacuteknovaacute nukleovaacute kyselina vystupuje ako sonda (proacuteba) Hybridizaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten je jeden z najpoužiacutevanejšiacutech naacutestrojov v molekulaacuternej bioloacutegii a genetike (hybridizaacutecia primerov alebo proacuteb sa využiacuteva v takmer každej metoacutede - v PCR RT-PCR qPCR RT-qPCR MLPA sekvenovaniacute fragmentačnej analyacuteze FISH DNA mikročipoch atď)

Denaturaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten je proces pri ktorom dochaacutedza k porušeniu vodiacutekovyacutech vaumlzieb medzi vlaacuteknami nukleovyacutech kyseliacuten (strata sekundaacuternej a terciaacutelnej štruktuacutery) tak že docircjde k ich uacuteplneacutemu oddeleniu vzniknuacute jednovlaacuteknoveacute reťazce Denaturaacutecia NK mocircže byť spocircsobenaacute vplyvom vysokyacutech teplocirct pH alebo chemickyacutech laacutetok (denaturačneacute činidlaacute) Renaturaacutecia je opačnyacute proces v ktorom na zaacuteklade komplementarity dochaacutedza k tvorbe dvojvlaacuteknovyacutech NK

Hybridiza čnaacute sonda (proacuteba) je jednovlaacuteknovaacute nukleovaacute kyselina určitej znaacutemej dĺžky a sekvencie (najčastejšie DNA pretože je stabilnejšia ako RNA) ktoraacute je značenaacute a sluacuteži na detekciu komplementaacuternych molekuacutel DNA alebo RNA v procese hybridizaacutecie V zaacutevislosti od podmienok hybridizaacutecie (stringencia) mocircže byť detegovanaacute sekvencia uacuteplne komplementaacuterna alebo v menej priacutesnych podmienkach mocircže mať sekvenčneacute odchyacutelky Proacuteba sluacuteži na vyhľadanie a zviditeľnenie cieľovyacutech NK Zviditeľnenie sa deje prostredniacutectvom označenia proacuteby ešte pred hybridizaacuteciou Značenie proacuteby mocircže byť raacutedioaktiacutevne a neraacutedioaktiacutevne (najčastejšie fluorescenčneacute)

Raacutedioaktiacutevne značeneacute proacuteby pomocou izotopov (32P) sa využiacutevali viac v minulosti v suacutečasnosti suacute kvocircli zdravotnyacutem rizikaacutem ohľaduplnosti k životneacutemu prostrediu ako aj kvocircli jednoduchšej manipulaacutecii použiacutevaneacute fluorescenčne značeneacute proacuteby Raacutedioaktiacutevne značeneacute sondy boli použiacutevaneacute hlavne metoacutedou Southernovej hybridizaacutecie (Southern blotting Southern blot) Citlivosť raacutedioaktiacutevne značenyacutech proacuteb je vyššia dosahuje schopnosť zachytiť 10 fg (femtogram 10-15) cieľovej DNA sekvencie 81 Southern blot

Metoacutedu objavil v roku 1975 britskyacute bioloacuteg Edwin Southern (preto Southern) Pri Southernovej hybridizaacutecii sa restrikčne štiepeneacute fragmenty DNA elektroforeticky separujuacute v geacuteli potom sa metoacutedou blottingu prenesuacute na nylonovuacute alebo nitroceluloacutezovuacute membraacutenu kde suacute naacutesledne hybridizovaneacute v roztoku obsahujuacutecom raacutedioaktiacutevne značenuacute sondu Priloženiacutem fotografickeacuteho filmu k membraacutene a vyvolaniacutem filmu autoraacutediografiou docircjde k zviditeľneniu lokaliacutet kde došlo k hybridizaacuteciiacute raacutedioaktiacutevne značenej sondy s fragmentom DNA (autoraacutediogram) Southern blot bol kľuacutečovou a prvou metoacutedou na identifikaacuteciu osocircb (DNA fingerprinting DNA pofiling) (obr 35)

Okrem Southern blotu existuje Northern blot na analyacutezu RNA (geacutenovej expresie) a Western blot na analyacutezu proteiacutenov postup je obdobnyacute ako pri Southern blote s obmenami špecifickyacutemi pre konkreacutetny blot Pri Northern blote sa použiacutevajuacute hybridizačneacute proacuteby ale pre vizualizaacuteciu proteiacutenov western blotom je potrebneacute použiť protilaacutetky s naacuteslednou vizualizaacuteciou Pomenovanie techniacutek je hra so sloviacutečkami (keďže paacuten Northern ani Western neobjavili takto nazvaneacute techniky)

Neraacutedioaktiacutevne značenie proacuteb použiacutevanyacutech v molekulaacuternej genetike mocircže byť nepriame (použitie haptenu) alebo priame Konečnaacute vizualizaacutecia je najčastejšie zabezpečenaacute fluoreskujuacutecimi farebnyacutemi značkami farbivami fluorochroacutemami (fluorofoacuterami) Pri priamom značeniacute je farbička kovalentne naviazanaacute na nukleotid a na zachytenie fluorescencie suacute potrebneacute špeciaacutelne priacutestroje umožňujuacutece excitaacuteciu farbičky ktoraacute potom emituje žiarenie určitej vlnovej dĺžky (emisneacute žiarenie) a to zachytiacute detekčnyacute systeacutem priacutestroja Využitie fluorochroacutemov v molekulaacuternej genetike je masiacutevne napr na vizualizaacuteciu NK elektroforeticky separovanyacutech v geacuteli kvantifikaacuteciu produktov PCR reakcie v priacutestroji real-time PCR cykleacuter sekvenovaniacute fragmentačnej analyacuteze FISH DNA mikročipoch atď

40

Obr 35 Princiacutep Southern blotu

82 FISH (fluorescenčnaacute in situ hybridizaacutecia)

FISH (fluorescent in situ hybridization fluorescenčnaacute in situ hybridizaacutecia) metoacuteda patriacute medzi molekulovo-cytogenetickeacute techniky Princiacutep FISH metoacutedy je založenyacute na hybridizaacuteciiacute fluorescenčne značenyacutech proacuteb ku komplementaacuternym uacutesekom vyšetrovanej DNA na podložnom skle (priamo na mieste - in situ) K denaturaacutecii dsDNA dochaacutedza buď vplyvom denaturačnyacutech činidiel alebo zvyacutešenou teplotou a naacuteslednou renaturaacuteciou dochaacutedza k naviazaniu sondy na komplementaacuterny uacutesek DNA Vyacutesledok hybridizaacutecie sa vizualizuje fluorescenčnyacutem mikroskopom vybavenyacutem vhodnyacutemi fluorescenčnyacutemi filtrami a vizuaacutelne zhodnotiacute skuacutesenyacutem odborniacutekom Fluorescencia sa v niektoryacutech priacutepadoch mocircže zaznamenať a hodnotiť aj pomocou softveacuteru (obr 36)

Pomocou FISH detegujeme numerickeacute aberaacutecie - zmeny v počte chromozoacutemov (napr trizoacutemia monozoacutemia chromozoacutemov) alebo štruktuacuterne aberaacutecie a prestavby (napr translokaacutecie inverzie deleacutecie duplikaacutecie amplifikaacutecie) FISH metoacuteda umožňuje identifikaacuteciu a detekciu každeacuteho ľudskeacuteho chromozoacutemu jeho zaradenie do karyotypu odhalenie malyacutech submikroskopickyacutech chromozoacutemovyacutech zmien a tiež mapovať poziacutecie jednotlivyacutech geacutenov na chromozoacuteme

41

Obr 36 Princiacutep štandardnej FISH a FISH maľovania celeacuteho chromozoacutemu

Veľkou vyacutehodou FISH metoacutedy je možnosť analyacutezy buniek v metafaacuteze aj v interfaacuteze kedy nie je nutnaacute kultivaacutecia buniek a tiež ryacutechle analyzovanie veľkeacuteho počtu buniek (stovky až tisiacutece) K ďalšiacutem vyacutehodaacutem patriacute bezpečnosť vysokaacute citlivosť dostatočnaacute stabilita relatiacutevne kraacutetky čas hybridizaacutecie a možnosť ryacutechleho vyhodnotenia Hybridizaacutecia pri vaumlčšine suacutečasne dodaacutevanyacutech sond trvaacute 10-12 hodin (na trhu suacute už dostupneacute aj sondy so skraacutetenyacutem časom hybridizaacutecie na 2-3 hodiny) Po hybridizaacuteciiacute nasleduje odmyacutevanie kedy pri priacuteslušnej teplote dochaacutedza k odmytiu nenaviazanyacutech a nespraacutevne hybridizovanyacutech sond Preparaacutet sa naacutesledne podfarbiacute a vyacutesledok sa zhodnotiacute vo fluorescenčnom mikroskope Na podfarbenie chromozoacutemov alebo jadier sa použiacuteva modreacute kontrastneacute farbivo DAPI (46-diamidino-2-fenylindol) ktoreacute maacute silneacute fluorescenčneacute vlastnosti dokaacuteže prechaacutedzať jadrovou membraacutenou a viazať sa na DNA Vyacutesledkom je modreacute zafarbenie ktoreacute vyacuteborne kontrastuje so signaacutelmi jednotlivyacutech sond

Limitujuacutecim faktorom FISH je možnosť identifikaacutecie len tyacutech uacutesekov DNA ku ktoryacutem suacute použiteacute sondy V jednej analyacuteze je možneacute použiť najviac 3 odlišne značeneacute sondy a tak zistiť priacutepadneacute abnormality len na 1 alebo na paacuter lokusoch Na relevantnuacute detekciu je potrebneacute mať vo vzorke 1-5 aberantnyacutech interfaacutezovyacutech jadier

FISH je možneacute uskutočniť na širokej škaacutele biologickeacuteho materiaacutelu na vzorkaacutech perifeacuternej krvi kostnej drene naacuteteroch choriovyacutech klkoch plodovej vode rocircznych druhov tkaniacutev natiacutevnych alebo zaliatych v parafiacutene na 1 bunke (predimplantačnaacute genetickaacute diagnostika PGD) (obr 37)

Využiacuteva sa na detekciu aberaacuteciiacute pri mnohyacutech onkologickyacutech ochoreniach (napr pri diagnoacuteze mnohopočetnyacute myeloacutem sa v suacutečasnosti po separaacutecii CD138+ buniek robiacute FISH s 5 sondami pre geacuteny IGH TP53 RB1 oblasť 1p321q21 a stanovuje sa hyperploidia chromozoacutemov 5 9 a 15) a tiež k spresneniu doplneniu a k overeniu bežneacuteho cytogenetickeacuteho vyšetrenia

Podľa miesta na chromozoacuteme na ktorom dochaacutedza k hybridizaacutecii sondy rozlišujeme 4 typy

DNA sond bull centromeacuteroveacute sondy ndash sa viažu na strednuacute časť chromozoacutemu ndash centromeacuteru sluacutežia k diagnostike zmien v počte chromozoacutemov k detekcii chromozoacutemov neznaacutemeho pocircvodu umožňujuacute interfaacuteznu FISH na nedeliacich sa bunkaacutech (obr 38-41)

42

Obr 37 Interfaacutezna FISH preimplantačnyacute genetickyacute skriacutening aneuploidiiacute ndash blastomeacutera 3-denneacuteho ľudskeacuteho embrya s normaacutelnym počtom chromozoacutemov 13 18 21 pohlavie XY použityacutech 5 sond pre chromozoacutemy 13 ndash orange 18 ndash aqua 21 ndash green X ndash blue a Y ndash yellow (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

Obr 38 Interfaacutezne jadro po hybridizaacutecii s centromeacuterovou sondou pre chromozoacutem 8 (Vysis Abbott) V pravom jadre je priacutetomnaacute trizoacutemia chromozoacutemu 8 (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex) Obr 39 Metafaacutezna (A) a interfaacutezna FISH (B) použitaacute centromeacuterovaacute sonda CEPX spectrum orangeCEPY spectrum green (Vysis Abbott) Sonda hybridizuje k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (červenyacute signaacutel) a Y (zelenyacute signaacutel) (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

43

Obr 40 Interfaacutezna FISH vyšetrenie spermiiacute použiteacute sondy CEPX greenCEPY orange (Aneuscore Metasystems) Sondy hybridizujuacute k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (zelenyacute signaacutel) Y (červenyacute signaacutel) vľavo ndash dve haploidneacute spermie (majuacutece jedna spermia X druhaacute Y chromozoacutem) vpravo ndash dve patologickeacute spermie obsahujuacutece gonozoacutemovyacute komplement XY (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

Obr 41 Interfaacutezna FISH vyšetrenie spermiiacute použiteacute sondy CEPX greenCEPY orange a CEP18 aqua (Aneuscore Metasystems) Sondy hybridizujuacute k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (zelenyacute signaacutel) Y (červenyacute signaacutel) a 18 (modryacute signaacutel) vľavo ndash normaacutelne haploidneacute ľudskeacute spermie - 1x chromozoacutem X alebo Y a jedenkraacutet chromozoacutem 18 v strede ndash patologickaacute spermia obsahujuacuteca gonozoacutemovyacute komplement XY a jeden chromozoacutem 18 vpravo ndash patologickaacute diploidnaacute spermia s chromozoacutemami X Y a dvoma chromozoacutemami 18 (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

bull lokusovo špecifickeacute sondy ndash hybridizaacutecia prebehne na konkreacutetnom mieste geacutenu (lokuse) (obr 42-44) použiacutevajuacute sa k vyšetreniu mikrodeleacuteciiacute (straty malyacutech častiacute chromozoacutemu pri mikrodelečnyacutech syndroacutemoch) k zisteniu amplifikaacutecie onkogeacutenov a niektoryacutech špecifickyacutech translokaacuteciiacute prestavby geacutenov umožňujuacute interfaacuteznu FISH na nedeliacich sa bunkaacutech bull subtelomeroveacute ndash vaumlzba na koncoveacute časti chromozoacutemu ndash telomeacutery bull celochromozoacutemoveacute alebo celomaľovacie sondy ndash sondy hybridizujuacute s mnohopočetnyacutemi chromozoacutemovyacutemi sekvenciami pričom sa fluorescenčne tak bdquovymaľujeldquo celyacute chromozoacutem (Obr 45) Použiacutevajuacute sa na vyšetrenie chromozoacutemovyacutech prestavieb k analyacuteze translokaacuteciiacute a k detekcii pocircvodu tzv marker chromozoacutemov (malyacutech nadpočetnyacutech chromozoacutemov neznaacutemeho pocircvodu) K použitiu sondy suacute potrebneacute metafaacutezne chromozoacutemy nepoužiacutevaju sa pre interfaacuteznu FISH

Pri konvenčnej chromozoacutemovej FISH suacute homogeacutenne DNA proacuteby hybridizovaneacute s fixovanyacutem metafaacuteznym alebo prometafaacuteznym chromozoacutemomchromozoacutemami na skliacutečku (Obr 36a) Maximaacutelna rozlišovacia schopnosť metafaacuteznej FISH je niekoľko megabaacutez (Obr 39a 45) využitiacutem viac

44

natiahnutyacutech prometafaacuteznych chromozoacutemov sa dosiahne 1 Mb rozliacutešenie Prostredniacutectvom fiber FISH konkreacutetne artificiaacutelne deproteinizovanej natiahnutej DNA pripravenej in situ z celyacutech buniek na mikroskopickom skliacutečku je možneacute vizualizovať individuaacutelne geacuteny maleacute DNA elementy na chromozoacuteme s rozliacutešeniacutem okolo 1000 bp

Obr 42 Interfaacutezne jadro po hybridizaacutecii s lokusovo-špecifickou sondou LSI 5q31 Spectrum Orange5p12 Spectrum Green (Vysis Abbott) Na ľavom obraacutezku suacute priacutetomneacute dva červeneacute (5q31) a dva zeleneacute signaacutely (5p12) v pravom jadre je priacutetomnaacute deleacutecia 5q31 oblasti chyacuteba jeden červenyacute signal (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

Obr 43 Interfaacutezna FISH použitaacute lokusovo-špecifickaacute sonda ndash translokačnaacute - XL BCRABL1 plus (Metasystems) dvojfarebnaacute dvojfuacutezna kde červenaacute označuje lokus ABL1 na chromozoacuteme 9 a zelenaacute oblasť BCR na chromozoacuteme 22 Sonda deteguje fuacuteziu protoonkogeacutenu ABL1 (9q34) a geacutenu BCR (22q11) v priacutepade že červenyacute a zelenyacute signaacutel suacute pri sebe (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

45

Obr 44 Interfaacutezna FISH Použitaacute lokusovo-špecifickaacute sonda- typ break apart pre IGH geacuten V docircsledku translokaacutecie došlo k rozskočeniu geacutenu pričom translokačneacuteho partnera nepoznaacuteme vieme určiť len percento v koľkyacutech jadraacutech je geacuten prestavanyacute (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex) Obr 45 Použiteacute celochromozoacutemoveacute sondy WCP 15 (červenyacute chromozoacutem) a WCP 17 (zelenyacute chromozoacutem) Na metafaacuteze je potvrdenaacute reciprokaacute translokaacutecia t(1517)(q2221) (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

FISH vizualizaacutecia celeacuteho chromozoacutemu maľovanie chromozoacutemu anglicky chromosome

painting je špeciaacutelnou aplikaacuteciou chromozoacutemovej FISH proacuteba je koktail veľkeacuteho počtu rocircznych fluorescenčne značenyacutech DNA fragmentov hybridizujuacutecich pozdĺž celeacuteho konkreacutetneho chromozoacutemu (obr 36b 45) bdquoChromosomepaintingldquo analyzuje metafaacutezne chromozoacutemy V minulosti bola FISH vizualizaacutecia celyacutech chromozoacutemov limitovanaacute malyacutem množstvom rocirczne sfarbenyacutech fluorochroacutemov

V suacutečasnosti je možneacute detegovať množstvo cieľovyacutech sekvenciiacute naraz čo sa využiacuteva pri celogenoacutemovej chromozoacutemovej vizualizaacutecii (whole-chromosomepainting - WCP) metoacutedou multiplex FISH (M-FISH multicolor FISH o br 46) alebo spektraacutelnej karyotypizaacutecie (SKY) kedy možno rozliacutešiť všetky ľudskeacute chromozoacutemy ndash teda 24 rocircznych chromozoacutemov M-FISH a SKY patria medzi metafaacutezne formy FISH diagnostiky ktoreacute umožňujuacute simultaacutennu vizualizaacuteciu všetkyacutech ľudskyacutech chromozoacutemov v rocircznych farbaacutech čo predstavuje uľahčenie analyacutezy karyotypu hlavne pri komplexnyacutech zmenaacutech a markeroch neznaacutemeho pocircvodu Obe techniky vychaacutedzajuacute z použitia

46

celochromozoacutemovyacutech sond značenyacutech kombinaacuteciou viaceryacutech fluorochroacutemov Rozdiel medzi M-FISH a SKY spočiacuteva v technike ziacuteskania konečneacuteho obrazu

Obr 46 Multicolor FISH - každyacute chromozoacutemovyacute paacuter je zafarbenyacute inou farbou pričom na ich zafarbenie postačuje kombinaacutecia 5 fluorochroacutemov Na vyhodnocovanie je potrebnaacute špeciaacutelna sada fluorescenčnyacutech filtrov pre jednotliveacute fluorochroacutemy a špeciaacutelnyacute softweacuter Vľavo-štandardnyacute karyotyp vpravo karyotyp s mutaacuteciami (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

V molekulovej cytogenetike suacute komerčne dostupneacute sety M-FISH proacuteb umožňujuacutece

viacfarebneacute pruacutežkovanie chromozoacutemov (banding) s vysokyacutem rozliacutešeniacutem (multicolor-banding mBAND FISH MCB) čo umožňuje identifikaacuteciu intrachromozoacutemovyacutech prestavieb (Obr 47) Nevyhnutnosťou mBAND-u je mať chromozoacutemy v metafaacuteze Taacuteto metoacuteda bola prvyacutekraacutet uskutočnenaacute na chromozoacuteme 5 v roku 1999 mBAND FISH umožňuje rozliacutešiť špecifickeacute oblasti chromozoacutemov na uacuterovni pruacutežku - bandu a sub-bandu s detekciou 550 bandov haploidneacuteho karyotypu

Obr 47 A - mBAND chromozoacutemu 11 - inverzia duplikovanej oblasti 11q223-q25 B - mBAND chromozoacutemu 3 - na kruhovom chromozoacuteme deleacutecia oblasti 3p263 C - mBAND chromozoacutemu 2 - potvrdenie inverzie duplikovanej časti chromozoacutemu (poskytnuteacute RNDr Dagmar Landlovou Medirex)

FISH metoacuteda a jej varianty (M-FISH mBAND SKY) majuacute v suacutečasnosti širokeacute využitie v

klinickej genetike v onkologickej genetike na detekciu aberaacuteciiacute v čase diagnoacutezy počas liečby po

47

liečbe monitorovanie po transplantaacutecii kostnej drene v prenataacutelnej a postnataacutelnej diagnostike pri detekcii submikroskopickyacutech deleacuteciiacute (napr DiGeorge syndroacutem - 22q112 delečnyacute syndroacutem PraderndashWilli syndroacutem- chromozoacutem 15q11-13) prostredniacutectvom FISH je možnaacute detekcia numerickyacutech zmien chromozoacutemov (trizoacutemia chromozoacutemu 21 pri Downovom syndroacuteme trizoacutemia chromozoacutemu 15 pri Patauovom syndroacuteme trizoacutemia chromozoacutemu 18 pri Edwardsovom syndroacuteme) rocirczne zmeny v počte pohlavnyacutech chromozoacutemov (monozoacutemia X pri Turnerovom syndroacuteme Klinefelterov syndroacutem s X chromozoacutemom naviac - XXY) podobne v predimplantačnej diagnostike

83 DNA Microarray (DNA mikro čip biočip) DNA mikročipovanie je technika využiacutevajuacuteca hybridizaacuteciu skuacutemanej nukleovej kyseliny

(cieľovaacute vzorka) s veľkyacutem množstvom oligonukleotidovyacutech proacuteb (desať tisiacutec až milioacuten) ktoreacute suacute prichyteneacute na pevnyacute podklad najčastejšie sklenyacute silikoacutenovyacute alebo nylonovyacute (doštička čip) Skuacutemanaacute nukleovaacute kyselina je pred hybridizaacuteciou fragmentovanaacute označenaacute fluorofoacuterom a denaturovanaacute Po kontakte čipu s cieľovou vzorkou ktoraacute je vlastne zmes označenyacutech oligonukleotidov značeneacute oligonukleotidy hybridizujuacute s oligonukleotidovyacutemi sekvenciami prichytenyacutemi na čipe Potom suacute na zaacuteklade fluorescencie detekovaneacute miesta kde došlo k hybridizaacutecii čiže vzorka obsahovala takuacuteto nukleotidovuacute sekvenciu Z jedneacuteho mikročipu sa ziacuteska obrovskeacute množstvo daacutet ktoreacute je vždy nutneacute softveacuterovo spracovať V dnešnej dobe existuje niekoľko firiem poskytujuacutecich komerčne mikročipy na objednaacutevku alebo si ich laboratoacuteria produkujuacute sami

Mikročipovanie prebieha nasledovne

1) Vytvorenie DNA čipu ndash tisiacutece rocircznych jednovlaacuteknovyacutech DNA oligonukleotidov znaacutemych sekvencii sa kovalentne naviažu na povrch doštičky vždy v určitej lokalite je niekoľko rovnakyacutech oligonukleotidov veľkosť takejto lokality je ˂ 200 microm Proacutebami mocircže byť DNA cDNA alebo syntetizovaneacute oligonukleotidy Už hotoveacute mikročipy ponuacutekajuacute viacereacute firmy (Affymetrix Agilent Technologies Eppendorf Illumina) alebo si ich jednotliveacute laboratoacuteria vyraacutebajuacute sami pomocou robotickyacutech zariadeniacute DNA čip sa vytvaacutera buď nanaacutešaniacutem kvapiek oligonukleotidov na podklad alebo synteacutezou oligonukleotidov in situ na čipe 2) Priacuteprava vzorky ndash nukleovaacute kyselina (mRNA DNA) sa purifikuje určiacute sa jej kvantita a kvalita (spektrofotometericky) fragmentuje resp v priacutepade mRNA sa syntetizuje cDNA v priacutepade potreby sa mocircže DNA amplifikovať PCR reakciou štiepiť restrikčnyacutemi endonukleaacutezami 3) Fluorescenčneacute označenie (zriedkavejšie raacutedioaktiacutevne) fragmentov DNA prebieha počas reverznej transkripcie alebo PCR amplifikaacutecie za uacutečasti fluorescenčne značenyacutech nukleotidov Keď sa analyzujuacute dve rocirczne vzorky napr zdraveacute tkanivo a naacutedoroveacute tkanivo označenie nukleovyacutech kyseliacuten v tyacutechto tkanivaacutech byacuteva rozdielne a to použitiacutem dvoch rocircznych fluorescenčnyacutech farbiacutev (napr zeleneacute a červeneacute) Pred hybridizaacuteciou je potrebneacute vzorku denaturovať čiacutem sa vytvoriacute zmes jednovlaacuteknovyacutech DNA označenyacutech značkou 4) Hybridizaacutecia s mikročipom ndash v špeciaacutelnom hybridizačnom roztoku hybridizujuacute komplementaacuterne sekvencie zo vzorky s priacuteslušnyacutemi oligonukleotidovyacutemi sondami naviazanyacutemi na čipe Potom sa čip obmyje aby došlo k odstraacuteneniu čiastočne hybridizovanyacutech nukleovyacutech kyseliacuten 5) Skenovanie mikročipu ndash skenerom čipov docircjde k ožiareniu čipu laserom pričom v mieste hybridizaacutecie fluorescenčne značenyacutech DNA fragmentov s proacutebou docircjde k emisii svetla určitej vlnovej dĺžky ktoruacute skener zaznamenaacute 6) Analyacuteza daacutet prebieha metoacutedami bioinformatiky spracovaniacutem softveacutermi sa zistiacute ktoreacute lokality čipu navzaacutejom hybridizovali v priacutepade použitia dvoch vzoriek kontrolnej a skuacutemanej je možneacute analyzovať ich relatiacutevnu intenzitu hybridizaacutecie (expresie určiteacuteho geacutenu)

Existujuacute štyri typy mikročipov 1) Čipy ur čeneacute na analyacutezu expresie (obsahujuacute cDNA proacuteby) pre tzv dvojkanaacutelovyacute experiment kedy je vzorka určenaacute k hybridizaacutecii na čipe ziacuteskanaacute zmiešaniacutem DNA fragmentov kontrolnej a skuacutemanej vzorky pričom fragmenty suacute rozdielne fluorescenčne označeneacute (napr zelenyacute fluorofoacuter pre kontrolnuacute vzorku a červenyacute pre skuacutemanuacute) Na zaacuteklade intenzity a typu fluorescencie sa deteguje expresia geacutenov typickaacute pre kontrolnuacute vzorku (napr zelenaacute fluorescencia) pre skuacutemanuacute vzorku (napr

48

červenaacute fluorescencia) a expresia podobnaacute u oboch vzoriek (žltaacute fluorescencia) neexprimovaneacute geacuteny (čierna fluorescencia) rocirczne odtiene (v zaacutevislosti od prevažujuacutecej hybridizaacutecie) (obr 48) 2) Čipy ur čeneacute na analyacutezu mutaacutecii použije sa genoacutemovaacute DNA označenaacute jednou fluorescenčnou farbičkou na určenie jednonukleotidovej zmeny (SNP ndash Single Nukleotide Polymorphism) 3) Čipy na komparatiacutevnu genoacutemovuacute hybridizaacuteciu (aCGH array Comparative Genomic Hybridization) ndash použiacutevaneacute na zistenie zvyacutešenia alebo zniacuteženia množstva chromozoacutemovyacutech fragmentov obsahujuacutecich geacuteny zodpovedneacute za určiteacute ochorenie Na analyacutezu sa použije skuacutemanaacute gDNA a referenčnaacute (kontrolnaacute) DNA každaacute sa značiacute inou fluorescenčnou farbičkou (princiacutep ako pri analyacuteze expresie) (obr 49 50) 4) Čipy CGH - SNP kombinovaneacute čipy ur čeneacute na analyacutezu aj mutaacuteciiacute SNP aj na komparatiacutevnu genoacutemovuacute hybridizaacuteciu CGH

Mikročipy majuacute rozsiahle využitie napriacuteklad v identifikaacuteciiacute novyacutech geacutenov vo vyacuteskume ich funkciiacute expresie v rocircznych podmienkach pri diagnostike mnohyacutech ochoreniacute vo farmakogenomike vo vyacuteskume vplyvu toxiacutenov

Obr 48 Heatmapa geacutenovej expresie vybranyacutech geacutenov (mRNA) mikročip obsahuje 46000 cDNA proacuteb (poskytnuteacute Ing Helenou Gbelcovou PhD Uacutestav lekaacuterskej bioloacutegie genetiky a klinickej genetiky LF UK a UNB)

49

Obr 49 Princiacutep komparatiacutevnej genoacutemovej hybridizaacutecie (aCGH - array comparative genomic hybridization) Obr 50 A) Vyacutesledok komparatiacutevnej genoacutemovej hybridizaacutecie (aCGH - array comparative genomic hybridization) vzorky DNA izolovanej plodovej vody U plodu s abnormaacutelnym ultrasonografickyacutem vyšetreniacutem bola identifikovanaacute duplikaacutecia oblasti 3q261q29 (modryacute paacutes) a deleacutecia oblasti 5p1533p151 (červenyacute paacutes) Pre porovnanie chromozoacutem 1 bez aberaacutecie b) Ten istyacute pacient ale ineacute softveacuteroveacute spracovanie (poskytnuteacute RNDr Miroslavom Tomkom PhD Medirex)

50

Odporuacutečanaacute a použitaacute literatuacutera

Odborneacute knihy Klug W S Cummings M R Spencer Ch A Palladino M A Concepts of Genetics jedenaacuteste vydanie (2015) Carson S Molecular Biology Techniques tretie vydanie (2012) Strachan T Read A Human Molecular Genetics štvrteacute vydanie (2011) Sudbery P Sudbery I Human Molecular Genetics tretie vydanie (2009)

Internetoveacute straacutenky

wwwncbinlmnihgov wwwmlpacom wwwthermofishercom wwwilluminacom wwwpromegask wwwqiagencom wwwambioncom

Odborneacute člaacutenky Chacon-Cortes D Griffiths L R Methods for extracting genomic DNA from whole blood samples current perspectives Journal of Biorepository Science for Applied Medicine Volume 2 strany 1- 9 Viltrop T Krjutskov K Palta P Metspalu A Comparison of DNA extraction methods for multiplex polymerase chain reaction Anal Biochem 2010 Volume 398(2) strany 260-262 Ing Martin Čermaacutek Molekulaacuterna cytogenetika v problematike familiaacuternych maligniacutet Onkoloacutegia Volume 2 strany 77 - 83 Livak KJ Schmittgen TD Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method Methods 2001 Volume 25(4) strany 402 - 408 Bustin S A Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays J Mol Endocrinol 2000 Volume 25(2) strany169 - 193

MOLEKULAacuteRNE METOacuteDY AKTUAacuteLNE POUŽIacuteVANEacute V KLINICKEJ GENETIKE RNDr Andrea Pastoraacutekovaacute PhD RNDr Robert Petrovič PhD Vydala Univerzita Komenskeacuteho v Bratislave Lekaacuterska fakulta Rozsah 50 straacuten 246 AH prveacute vydanie ISBN 978-80-223-4231-5

32

Obr 29 MLPA analyacuteza geacutenu DMD (koacutedujuacuteceho dystrofiacuten) mutaacutecie ktoreacuteho spocircsobujuacute Duchennovu svalovuacute dystrofiu u pacienta suacute priacutetomneacute duplikaacutecie exoacutenov 41 42 43 44 45 (piacuteky vo vzorke pacienta sa porovnajuacute s piacutekmi v kontrole ndash referenčnej vzorke)

33

6 Sekvenovanie

Sekvenovaniacutem rozumieme určenie primaacuternej štruktuacutery DNA teda určenie poradia nukleotidov v reťazci DNA Začiatky moderneacuteho sekvenovania siahajuacute do roku 1977 kedy boli objaveneacute dve metoacutedy sekvenovania 1) chemickaacute metoacuteda Maxama a Gilberta 2) enzymatickaacute metoacuteda Sangera Nicklena a Coulsona

Princiacutep obidvoch metoacuted sekvenovania spočiacuteva v tom že sa vytvoriacute suacutebor DNA molekuacutel s rocircznou veľkosťou ktoreacute suacute zakončeneacute konkreacutetnym nukleotidom tieto DNA molekuly sa elektroforeticky separujuacute v geacuteloch s rozlišovacou schopnosťou 1 nukleotid 61 Chemickaacute metoacuteda

DNA molekuly sa na 5-konci raacutedioaktiacutevne označia raacutedioaktiacutevnym fosforom a naacutesledne sa chemicky modifikujuacute špecificky pre každuacute baacutezu DNA sa potom v modifikovanyacutech miestach štiepi čiacutem vzniknuacute rocirczne dlheacute fragmenty pričom podmienky suacute nastaveneacute tak aby sa DNA na každom mieste štiepila len raz Modifikaacutecia DNA a štiepenie prebehne v štyroch separaacutetnych reakciaacutech (skuacutemavkaacutech) takže po elektroforetickej separaacuteciiacute takto opracovanej DNA v štyroch draacutehach polyakrylamidoveacuteho geacutelu a naacuteslednej autoraacutediografii (podobne ako pri Southernovej hybridizaacutecii) je možneacute odčiacutetať nukleotidovuacute sekvenciu približne 100 nukleotidov od raacutedioaktiacutevneho označenia (v čase objavu Maxama a Gilberta) 62 Sangerova metoacuteda

Zaacuteklady metoacutedy boli popiacutesaneacute už v roku 1975 (metoacuteda plus a miacutenus) ale až vylepšenie použitiacutem dideoxynukleotidov (ddNTP) v roku 1977 došlo k zjednodušeniu sekvenovania Princiacutepom enzyacutemoveacuteho sekvenovania je terminaacutecia (zastavenie) polymerizaacutecie inkorporaacuteciou 2´ 3 -dideoxynukleotidov do novosyntetizujuacuteceho sa vlaacutekna DNA Keďže ddNTP neobsahujuacute hydroxylovuacute skupinu na 3 uhliacuteku riboacutezy nemocircžu sa zuacutečastniť na tvorbe fosfodiesterovej vaumlzby nemocircže sa pripojiť k nim ďalšiacute nukleotid čiže musiacute docircjsť k terminaacuteciiacute polymeraacutecie Reakcia prebieha v štyroch skuacutemavkaacutech s raacutedioaktiacutevne značenyacutem primerom V každej skuacutemavke suacute priacutetomneacute všetky štyri deoxynukleotidtrifosfaacutety (dNTP) ale pre každuacute skuacutemavku je špecifickyacute priacutedavok maleacuteho množstva jedneacuteho z dideoxynukleotidtrifosfaacutetov (v prvej skuacutemavke je ddATP v druhej ddCTP v tretej ddTTP a vo štvrtej ddGTP) Maleacute množstvo ddNTP spocircsobiacute že pri polymerizaacutecii dochaacutedza k prednostneacutemu zaradeniu štandardnyacutech dNTP do narastajuacuteceho reťazca a len občas sa inkorporuje ddNTP čiacutem sa zastaviacute synteacuteza reťazca V každej skuacutemavke tak vznikne suacutebor DNA fragmentov rocircznych veľkostiacute zakončenyacutech priacuteslušnyacutem ddNTP (v prvej skuacutemavke ddATP v druhej ddCTP v tretej ddTTP a vo štvrtej ddGTP) Po elektroforetickej separaacutecii v 4 draacutehach polyakrylamidoveacuteho geacutelu a autoraacutediografii sa z autoraacutediogramu odčiacuteta sekvencia

V suacutečasnosti je sekvenovanie do značnej miery automatizovaneacute pričom využiacuteva princiacutep Sangerovej enzyacutemovej metoacutedy s určityacutemi obmenami Uacutesek DNA ktoryacute treba sekvenovať sa prostredniacutectvom termostabilnyacutech DNA polymeraacutez namnožiacute PCR metoacutedou po ktorej nasleduje sekvenačnaacute reakcia (asymetrickaacute PCR) s fluorescenčne značenyacutemi ddNTP (každyacute druh označenyacute inyacutem fluorescenčnyacutem farbivom) Sekvenačnaacute reakcia prebieha v jednej skuacutemavke s jednyacutem primerom vznikne tak suacutebor jednovlaacuteknovyacutech DNA rocircznej dĺžky ktoreacute suacute na 3konci označeneacute ddNTP so špecifickyacutem fluorescenčnyacutem farbivom Taacuteto metoacuteda sekvenovania sa tiež nazyacuteva rdquodye-terminator cycle sequencingrdquo(obr 30) Po kapilaacuternej elektroforeacuteze vzorky v genetickom analyzaacutetore zaznamenaacutevaniacute fluorescencie jednotlivyacutech fragmentov CCD kamerou a softveacuterovom spracovaniacute sa ziacuteska sekvencia DNA (obr 31)

34

Obr 30 Princiacutep sekvenovania Sangerova dideoxy metoacuteda alebo tzv chain termination method (reťazec zastavujuacuteca metoacuteda) Obr 31 Určenie genotypu plodu a rodičov sekvenčnou analyacutezou DNA ziacuteskanej z plodovej vody (prenataacutelna diagnostika) a perifeacuternej krvi sekvenčnaacute analyacuteza geacutenu ASPA vyacutesledok u plodu priacutetomnaacute mutaacutecia c 914CgtA v homozygotnom stave (AA) rodičia heterozygoti (AC) Uvedenaacute mutaacutecia je v homozygotnom stave kauzaacutelnou priacutečinou Canavanovej choroby

Automatizovaneacute sekvenovanie prinaacuteša viacereacute vyacutehody oproti klasickej Sangerovej metoacutede vyššiu presnosť a ryacutechlosť v jednej sekvenačnej reakcii možnosť osekvenovať až 1200 nukleotidovyacute fragment maleacute množstvo templaacutetu potrebneacute na analyacutezu

35

63 Next Generation Sequencing (NGS)

NGS (sekvenovanie novej generaacutecie) maacute obrovskyacute potenciaacutel v analyacuteze genoacutemov pričom toto označenie zahŕňa viacereacute technologickeacute metoacutedy reprezentovaneacute niekoľkyacutemi firmami Princiacutepom je masiacutevne paralelneacute sekvenovanie čiacutem sa ziacuteskajuacute raacutedovo tisiacutece až milioacuteny sekvenciiacute naraz 631 Sekvenovanie druhej generaacutecie

Na začiatku sa analyzovanaacute DNA vo vaumlčšine priacutepadov fragmentuje (vznikne tak DNA

knižnica) na fragmenty sa pripoja kraacutetke sekvencie ndash adapteacutery naacutesledne sa tieto fragmenty rocircznymi priacutestupmi amplifikujuacute a určiacute sa ich sekvencia Vďaka čiastočnyacutem prekryvom je zo ziacuteskanyacutech sekvencii možneacute poskladať plynuluacute sekvenciu zodpovedajuacutecu pocircvodnej nefragmentovanej DNA

Pyrosekvenovanie je podobne ako Sangerova metoacuteda založenaacute na princiacutepe synteacutezy komplementaacuterneho vlaacutekna DNA avšak rozdiel je v tom že sa na detekciu inkorporaacutecie nukleotidu využiacuteva inyacute systeacutem tvorby luminiscenčneacuteho signaacutelu v priebehu reakcie Pyrosekvenovanie je umožneneacute vďaka aktivite 4 enzyacutemov - DNA polymeraacutezy ATP sulfurylaacutezy luciferaacutezy a apyraacutezy Reakčnaacute zmes obsahuje aj ďalšie komponenty - enzymatickeacute substraacutety adenoziacutenfosfosulfaacutet (APS) d-luciferiacuten sekvenovanyacute templaacutet a cyklicky postupne po jednom type pridaacutevaneacute nukleotidtrifosfaacutety Po zabudovaniacute nukleotidu do novovznikajuacuteceho reťazca docircjde k uvoľneniu pyrofosfaacutetu naacutesledne je využityacute ATP sulfurylaacutezou na synteacutezu ATP z APS počas ďalšej reakcie docircjde k využitiu ATP luciferaacutezou na premenu luciferiacutenu na oxyluciferiacuten čo spocircsobiacute svetelnyacute signaacutel a ten zaznamenaacute detekčnyacute systeacutem Poslednou enzymatickou reakciou je reakcia apyraacutezy ktoraacute odstraacuteni nezainkorporovaneacute nukleotidy a nevyužiteacute ATP aby sa celyacute proces mohol zopakovať s reakčnou zmesou obsahujuacutecou ďalšiacute nukleotidtrifosfaacutet (inyacute ako v predchaacutedzajuacutecej reakcii) Po každej reakcii detektor zaznamenaacuteva emisiu svetla na zaacuteklade intenzity svetla je možneacute určiť či bol vradenyacute priacuteslušnyacute nukleotidtrifosfaacutet či bol inkorporovanyacute jeden priacutepadne viac rovnakyacutech nukleotidtrifosfaacutetov

Zvyacutešenie vyacutekonu pyrosekvenovania umožnila tzv emulznaacute PCR v mikročasticiach a použitie platničky PicoTiterPlatereg toto sekvenovanie zaviedla firma Roche pod pojmom 454 pyrosekvenovanie v roku 2005 Na začiatku sa DNA fragmentuje na uacuteseky dlheacute 400-600 baacutez dvojvlaacuteknovaacute fragmentovanaacute DNA sa liguje s adapteacutermi prostredniacutectvom nich sa naviaže na mikročastice dvojvlaacuteknoveacute fragmenty sa oddelia mikročastice s naviazanyacutemi jednovlaacuteknovyacutemi fragmentami sa premiešajuacute so zmesou oleja a roztoku ktoryacute obsahuje všetky komponenty na uacutespešnuacute PCR Tyacutemto spocircsobom sa okolo každej mikročastice vytvoriacute vlastnyacute mikroreaktor v ktorom prebehne amplifikaacutecia fragmentu Po PCR reakcii sa mikročastice prenesuacute do platničky PicoTiterPlate v ktorej sa do jamky zmestiacute akuraacutet jedna mikročastica a reakčneacute komponenty pyrosekvenačnej reakcie PicoTiterPlatereg maacute 1 600 000 jamiek každaacute jamka maacute maximaacutelny objem 75 picolitra Platnička s mikročasticami sa vložiacute do sekvenačneacuteho systeacutemu ndash priacutestroja v ktorom sa celeacute pyrosekvenovanie uskutočniacute Chemiluminiscenčneacute signaacutely ktoryacutech počas sekvenovania vznikajuacute milioacuteny v priebehu hodiny suacute zachyteneacute CCD kamerou a analyzovaneacute softveacuterom

Firma Illumina predstavila inuacute technoloacutegiu PCR amplifikaacutecia a sekvenovanie sa uskutočňuje na skliacutečku (flow cell) Fragmentaacutecia DNA a pripojenie adapteacuterov prebieha za uacutečasti transpozoacutemov v procese nazvanom tagmentaacutecia Po hybridizaacutecii fragmentov DNA na skliacutečko prebehne v klastroch PCR amplifikaacutecia (tzv mostiacutekovaacute amplifikaacutecia) sekvenaacutecia prebieha za uacutečasti rozdielne fluorescenčne značenyacutech a chemicky modifikovanyacutech nukleotidov pričom každyacute nukleotid emituje fluorescenciu s inou vlnovou dĺžkou Na skliacutečku prebieha paralelne až 6 miliaacuterd sekvenaacutecii (obr 32)

Ďalšiacutemi možnosťami sekvenovania druhej generaacutecie je systeacutem SOLid (vyvinutyacute firmou Applied Biosystem dnes pod Thermo Fisher Scientific) a Ion Semiconductor Sequencing ndash polovodičoveacute ioacutenoveacute sekvenovanie (od firmy Ion Semiconductor Sequencing v suacutečasnosti Thermo Fisher Scientific)

36

Obr 32 Princiacutep sekvenovania novej generaacutecie od firmy Illumina PCR amplifikaacutecia a sekvenovanie sa uskutočňuje na skliacutečku (flow cell) paralelne prebieha až 6 miliaacuterd sekvenaacutecii

632 Sekvenovanie tretej generaacutecie

Pred sekvenovaniacutem netreba amplifikovať DNA PCR metoacutedou ale sekvencia sa ziacuteskava zachyteniacutem signaacutelu v reaacutelnom čase Medzi sekvenovanie tretej generaacutecie patriacute SMRT (Single Molecule Real-Time Sequencing) a Nanopore Sequencing

37

7 Fragmentačnaacute analyacuteza DNA

Je metoacuteda použiacutevanaacute na určenie veľkosti fragmentov DNA ziacuteskanyacutech PCR reakciou Dĺžka amplifikovanyacutech DNA fragmentov sa zistiacute ich porovnaniacutem s veľkostnyacutem štandardom (obr 33) ktoryacute je tvorenyacute DNA fragmentami znaacutemej dĺžky Veľkostnyacute štandard je pred kapilaacuternou elektroforeacutezou zmiešanyacute so vzorkou DNA fragmenty veľkostneacuteho štandardu suacute fluorescenčne označeneacute pričom použiteacute fluorescenčneacute farbivo je ineacute ako fluorescenčneacute farbivo použiteacute na označenie DNA fragmentov vo vyšetrovanej vzorke

Obr 33 Elektroforetogram veľkostneacuteho štandardu použiacutevaneacuteho na určenie veľkostiacute fragmentov analyzovanyacutech kapilaacuternou elektroforeacutezou v genetickom analyzaacutetore (GeneScantrade 500 LIZtrade dye Size Standard) dĺžka fragmentov v nukleotidoch (napr 50 nukleotidov)

Fragmentačnaacute analyacuteza pozostaacuteva z viaceryacutech krokov Prvyacutem je izolaacutecia DNA nasleduje PCR amplifikaacutecia počas ktorej sa novosyntetizovaneacute DNA fragmenty označia fluorescenčnyacutemi farbivami Vzorka s PCR produktom sa pripraviacute na kapilaacuternu elektroforeacutezu tak že sa zmieša s veľkostnyacutem štandardom (sluacuteži na určenie veľkosti fragmentov) a denaturačnou laacutetkou (formamid) nasleduje denaturaacutecia Pripraveneacute vzorky suacute injektovaneacute do priacutestroja (genetickyacute analyzaacutetor) kde v kapilaacutere naplnenej polymeacuterom v elektrickom poli migrujuacute fluorescenčne značeneacute fragmenty DNA na zaacuteklade veľkosti (kapilaacuterna elektroforeacuteza) Počas elektroforeacutezy genetickyacute analyzaacutetor zaznamenaacuteva fluorescenciu fragmentov Analyacutezou daacutet prostredniacutectvom špeciaacutelnych softveacuterov sa ziacuteskajuacute elektroforetogramy z ktoryacutech je možneacute zistiť veľkosť fragmentov ako aj typ fluorescencie (docircležiteacute ak suacute genetickeacute varianty rozliacutešiteľneacute rocircznou fluorescenciou napr SNaPshot) Fragmentačnaacute analyacuteza je suacutečasťou množstva molekulaacuterno-genetickyacutech metoacuted (pozri obr 12 26 28 29 34) ako suacute napr STR analyacuteza (Short Tandem Repeat) AFLP analyacuteza (Amplified Fragment Lenght Polymorfism) RFLPT-RFLP analyacuteza (Restriction Fragment Lenght PolymorfismTerminal Restricted Fragment Lenght Polymorfism) SSCP (Single Strand Conformation Polymorfism) VNTR (Variable Number of Tandem Repeat) analyacuteza straty heterozygotnosti (LOH loss of heterozygozity) MLPA (Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification) MSMSA (Methylation-Sensitive Mobility Shift Assay) SNP genotypovanie (SNaPshotreg) HiCEP (High-Coverage Expression Profiling)

38

Obr 34 Kvantitatiacutevna fragmentačnaacute PCR analyacuteza (QF-PCR) DNA izolovanej z plodovej vody vyacutesledok prenataacutelnej analyacutezy = priacutetomnosť troch piacutekov pre chromozoacutem 18 (u všetkyacutech fragmentov detegujuacutecich chromozoacutem 18 je pomer vyšetrovanyacutech markerov aberantnyacute 21 resp 111) čo znamenaacute trizoacutemiu chromozoacutemu 18 Edwardsov syndroacutem

39

8 Metoacutedy založeneacute na princiacutepe hybridizaacutecie

Nukleoveacute kyseliny majuacute schopnosť vytvaacuterať dvojvlaacuteknoveacute reťazce z jednovlaacuteknovyacutech molekuacutel na zaacuteklade komplementarity baacutez Komplementarita baacutez umožňuje replikaacuteciu DNA transkripciu RNA komplementarita baacutez zabezpečuje teda reprodukovateľnosť živej hmoty

Hybridizaacutecia je proces v ktorom na zaacuteklade komplementarity baacutez dochaacutedza k vytvoreniu dvojvlaacuteknovej nukleovej kyseliny z dvoch jednovlaacuteknovyacutech molekuacutel DNA alebo RNA alebo ich kombinaacuteciou DNA RNA pričom kratšia jednovlaacuteknovaacute nukleovaacute kyselina vystupuje ako sonda (proacuteba) Hybridizaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten je jeden z najpoužiacutevanejšiacutech naacutestrojov v molekulaacuternej bioloacutegii a genetike (hybridizaacutecia primerov alebo proacuteb sa využiacuteva v takmer každej metoacutede - v PCR RT-PCR qPCR RT-qPCR MLPA sekvenovaniacute fragmentačnej analyacuteze FISH DNA mikročipoch atď)

Denaturaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten je proces pri ktorom dochaacutedza k porušeniu vodiacutekovyacutech vaumlzieb medzi vlaacuteknami nukleovyacutech kyseliacuten (strata sekundaacuternej a terciaacutelnej štruktuacutery) tak že docircjde k ich uacuteplneacutemu oddeleniu vzniknuacute jednovlaacuteknoveacute reťazce Denaturaacutecia NK mocircže byť spocircsobenaacute vplyvom vysokyacutech teplocirct pH alebo chemickyacutech laacutetok (denaturačneacute činidlaacute) Renaturaacutecia je opačnyacute proces v ktorom na zaacuteklade komplementarity dochaacutedza k tvorbe dvojvlaacuteknovyacutech NK

Hybridiza čnaacute sonda (proacuteba) je jednovlaacuteknovaacute nukleovaacute kyselina určitej znaacutemej dĺžky a sekvencie (najčastejšie DNA pretože je stabilnejšia ako RNA) ktoraacute je značenaacute a sluacuteži na detekciu komplementaacuternych molekuacutel DNA alebo RNA v procese hybridizaacutecie V zaacutevislosti od podmienok hybridizaacutecie (stringencia) mocircže byť detegovanaacute sekvencia uacuteplne komplementaacuterna alebo v menej priacutesnych podmienkach mocircže mať sekvenčneacute odchyacutelky Proacuteba sluacuteži na vyhľadanie a zviditeľnenie cieľovyacutech NK Zviditeľnenie sa deje prostredniacutectvom označenia proacuteby ešte pred hybridizaacuteciou Značenie proacuteby mocircže byť raacutedioaktiacutevne a neraacutedioaktiacutevne (najčastejšie fluorescenčneacute)

Raacutedioaktiacutevne značeneacute proacuteby pomocou izotopov (32P) sa využiacutevali viac v minulosti v suacutečasnosti suacute kvocircli zdravotnyacutem rizikaacutem ohľaduplnosti k životneacutemu prostrediu ako aj kvocircli jednoduchšej manipulaacutecii použiacutevaneacute fluorescenčne značeneacute proacuteby Raacutedioaktiacutevne značeneacute sondy boli použiacutevaneacute hlavne metoacutedou Southernovej hybridizaacutecie (Southern blotting Southern blot) Citlivosť raacutedioaktiacutevne značenyacutech proacuteb je vyššia dosahuje schopnosť zachytiť 10 fg (femtogram 10-15) cieľovej DNA sekvencie 81 Southern blot

Metoacutedu objavil v roku 1975 britskyacute bioloacuteg Edwin Southern (preto Southern) Pri Southernovej hybridizaacutecii sa restrikčne štiepeneacute fragmenty DNA elektroforeticky separujuacute v geacuteli potom sa metoacutedou blottingu prenesuacute na nylonovuacute alebo nitroceluloacutezovuacute membraacutenu kde suacute naacutesledne hybridizovaneacute v roztoku obsahujuacutecom raacutedioaktiacutevne značenuacute sondu Priloženiacutem fotografickeacuteho filmu k membraacutene a vyvolaniacutem filmu autoraacutediografiou docircjde k zviditeľneniu lokaliacutet kde došlo k hybridizaacuteciiacute raacutedioaktiacutevne značenej sondy s fragmentom DNA (autoraacutediogram) Southern blot bol kľuacutečovou a prvou metoacutedou na identifikaacuteciu osocircb (DNA fingerprinting DNA pofiling) (obr 35)

Okrem Southern blotu existuje Northern blot na analyacutezu RNA (geacutenovej expresie) a Western blot na analyacutezu proteiacutenov postup je obdobnyacute ako pri Southern blote s obmenami špecifickyacutemi pre konkreacutetny blot Pri Northern blote sa použiacutevajuacute hybridizačneacute proacuteby ale pre vizualizaacuteciu proteiacutenov western blotom je potrebneacute použiť protilaacutetky s naacuteslednou vizualizaacuteciou Pomenovanie techniacutek je hra so sloviacutečkami (keďže paacuten Northern ani Western neobjavili takto nazvaneacute techniky)

Neraacutedioaktiacutevne značenie proacuteb použiacutevanyacutech v molekulaacuternej genetike mocircže byť nepriame (použitie haptenu) alebo priame Konečnaacute vizualizaacutecia je najčastejšie zabezpečenaacute fluoreskujuacutecimi farebnyacutemi značkami farbivami fluorochroacutemami (fluorofoacuterami) Pri priamom značeniacute je farbička kovalentne naviazanaacute na nukleotid a na zachytenie fluorescencie suacute potrebneacute špeciaacutelne priacutestroje umožňujuacutece excitaacuteciu farbičky ktoraacute potom emituje žiarenie určitej vlnovej dĺžky (emisneacute žiarenie) a to zachytiacute detekčnyacute systeacutem priacutestroja Využitie fluorochroacutemov v molekulaacuternej genetike je masiacutevne napr na vizualizaacuteciu NK elektroforeticky separovanyacutech v geacuteli kvantifikaacuteciu produktov PCR reakcie v priacutestroji real-time PCR cykleacuter sekvenovaniacute fragmentačnej analyacuteze FISH DNA mikročipoch atď

40

Obr 35 Princiacutep Southern blotu

82 FISH (fluorescenčnaacute in situ hybridizaacutecia)

FISH (fluorescent in situ hybridization fluorescenčnaacute in situ hybridizaacutecia) metoacuteda patriacute medzi molekulovo-cytogenetickeacute techniky Princiacutep FISH metoacutedy je založenyacute na hybridizaacuteciiacute fluorescenčne značenyacutech proacuteb ku komplementaacuternym uacutesekom vyšetrovanej DNA na podložnom skle (priamo na mieste - in situ) K denaturaacutecii dsDNA dochaacutedza buď vplyvom denaturačnyacutech činidiel alebo zvyacutešenou teplotou a naacuteslednou renaturaacuteciou dochaacutedza k naviazaniu sondy na komplementaacuterny uacutesek DNA Vyacutesledok hybridizaacutecie sa vizualizuje fluorescenčnyacutem mikroskopom vybavenyacutem vhodnyacutemi fluorescenčnyacutemi filtrami a vizuaacutelne zhodnotiacute skuacutesenyacutem odborniacutekom Fluorescencia sa v niektoryacutech priacutepadoch mocircže zaznamenať a hodnotiť aj pomocou softveacuteru (obr 36)

Pomocou FISH detegujeme numerickeacute aberaacutecie - zmeny v počte chromozoacutemov (napr trizoacutemia monozoacutemia chromozoacutemov) alebo štruktuacuterne aberaacutecie a prestavby (napr translokaacutecie inverzie deleacutecie duplikaacutecie amplifikaacutecie) FISH metoacuteda umožňuje identifikaacuteciu a detekciu každeacuteho ľudskeacuteho chromozoacutemu jeho zaradenie do karyotypu odhalenie malyacutech submikroskopickyacutech chromozoacutemovyacutech zmien a tiež mapovať poziacutecie jednotlivyacutech geacutenov na chromozoacuteme

41

Obr 36 Princiacutep štandardnej FISH a FISH maľovania celeacuteho chromozoacutemu

Veľkou vyacutehodou FISH metoacutedy je možnosť analyacutezy buniek v metafaacuteze aj v interfaacuteze kedy nie je nutnaacute kultivaacutecia buniek a tiež ryacutechle analyzovanie veľkeacuteho počtu buniek (stovky až tisiacutece) K ďalšiacutem vyacutehodaacutem patriacute bezpečnosť vysokaacute citlivosť dostatočnaacute stabilita relatiacutevne kraacutetky čas hybridizaacutecie a možnosť ryacutechleho vyhodnotenia Hybridizaacutecia pri vaumlčšine suacutečasne dodaacutevanyacutech sond trvaacute 10-12 hodin (na trhu suacute už dostupneacute aj sondy so skraacutetenyacutem časom hybridizaacutecie na 2-3 hodiny) Po hybridizaacuteciiacute nasleduje odmyacutevanie kedy pri priacuteslušnej teplote dochaacutedza k odmytiu nenaviazanyacutech a nespraacutevne hybridizovanyacutech sond Preparaacutet sa naacutesledne podfarbiacute a vyacutesledok sa zhodnotiacute vo fluorescenčnom mikroskope Na podfarbenie chromozoacutemov alebo jadier sa použiacuteva modreacute kontrastneacute farbivo DAPI (46-diamidino-2-fenylindol) ktoreacute maacute silneacute fluorescenčneacute vlastnosti dokaacuteže prechaacutedzať jadrovou membraacutenou a viazať sa na DNA Vyacutesledkom je modreacute zafarbenie ktoreacute vyacuteborne kontrastuje so signaacutelmi jednotlivyacutech sond

Limitujuacutecim faktorom FISH je možnosť identifikaacutecie len tyacutech uacutesekov DNA ku ktoryacutem suacute použiteacute sondy V jednej analyacuteze je možneacute použiť najviac 3 odlišne značeneacute sondy a tak zistiť priacutepadneacute abnormality len na 1 alebo na paacuter lokusoch Na relevantnuacute detekciu je potrebneacute mať vo vzorke 1-5 aberantnyacutech interfaacutezovyacutech jadier

FISH je možneacute uskutočniť na širokej škaacutele biologickeacuteho materiaacutelu na vzorkaacutech perifeacuternej krvi kostnej drene naacuteteroch choriovyacutech klkoch plodovej vode rocircznych druhov tkaniacutev natiacutevnych alebo zaliatych v parafiacutene na 1 bunke (predimplantačnaacute genetickaacute diagnostika PGD) (obr 37)

Využiacuteva sa na detekciu aberaacuteciiacute pri mnohyacutech onkologickyacutech ochoreniach (napr pri diagnoacuteze mnohopočetnyacute myeloacutem sa v suacutečasnosti po separaacutecii CD138+ buniek robiacute FISH s 5 sondami pre geacuteny IGH TP53 RB1 oblasť 1p321q21 a stanovuje sa hyperploidia chromozoacutemov 5 9 a 15) a tiež k spresneniu doplneniu a k overeniu bežneacuteho cytogenetickeacuteho vyšetrenia

Podľa miesta na chromozoacuteme na ktorom dochaacutedza k hybridizaacutecii sondy rozlišujeme 4 typy

DNA sond bull centromeacuteroveacute sondy ndash sa viažu na strednuacute časť chromozoacutemu ndash centromeacuteru sluacutežia k diagnostike zmien v počte chromozoacutemov k detekcii chromozoacutemov neznaacutemeho pocircvodu umožňujuacute interfaacuteznu FISH na nedeliacich sa bunkaacutech (obr 38-41)

42

Obr 37 Interfaacutezna FISH preimplantačnyacute genetickyacute skriacutening aneuploidiiacute ndash blastomeacutera 3-denneacuteho ľudskeacuteho embrya s normaacutelnym počtom chromozoacutemov 13 18 21 pohlavie XY použityacutech 5 sond pre chromozoacutemy 13 ndash orange 18 ndash aqua 21 ndash green X ndash blue a Y ndash yellow (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

Obr 38 Interfaacutezne jadro po hybridizaacutecii s centromeacuterovou sondou pre chromozoacutem 8 (Vysis Abbott) V pravom jadre je priacutetomnaacute trizoacutemia chromozoacutemu 8 (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex) Obr 39 Metafaacutezna (A) a interfaacutezna FISH (B) použitaacute centromeacuterovaacute sonda CEPX spectrum orangeCEPY spectrum green (Vysis Abbott) Sonda hybridizuje k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (červenyacute signaacutel) a Y (zelenyacute signaacutel) (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

43

Obr 40 Interfaacutezna FISH vyšetrenie spermiiacute použiteacute sondy CEPX greenCEPY orange (Aneuscore Metasystems) Sondy hybridizujuacute k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (zelenyacute signaacutel) Y (červenyacute signaacutel) vľavo ndash dve haploidneacute spermie (majuacutece jedna spermia X druhaacute Y chromozoacutem) vpravo ndash dve patologickeacute spermie obsahujuacutece gonozoacutemovyacute komplement XY (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

Obr 41 Interfaacutezna FISH vyšetrenie spermiiacute použiteacute sondy CEPX greenCEPY orange a CEP18 aqua (Aneuscore Metasystems) Sondy hybridizujuacute k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (zelenyacute signaacutel) Y (červenyacute signaacutel) a 18 (modryacute signaacutel) vľavo ndash normaacutelne haploidneacute ľudskeacute spermie - 1x chromozoacutem X alebo Y a jedenkraacutet chromozoacutem 18 v strede ndash patologickaacute spermia obsahujuacuteca gonozoacutemovyacute komplement XY a jeden chromozoacutem 18 vpravo ndash patologickaacute diploidnaacute spermia s chromozoacutemami X Y a dvoma chromozoacutemami 18 (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

bull lokusovo špecifickeacute sondy ndash hybridizaacutecia prebehne na konkreacutetnom mieste geacutenu (lokuse) (obr 42-44) použiacutevajuacute sa k vyšetreniu mikrodeleacuteciiacute (straty malyacutech častiacute chromozoacutemu pri mikrodelečnyacutech syndroacutemoch) k zisteniu amplifikaacutecie onkogeacutenov a niektoryacutech špecifickyacutech translokaacuteciiacute prestavby geacutenov umožňujuacute interfaacuteznu FISH na nedeliacich sa bunkaacutech bull subtelomeroveacute ndash vaumlzba na koncoveacute časti chromozoacutemu ndash telomeacutery bull celochromozoacutemoveacute alebo celomaľovacie sondy ndash sondy hybridizujuacute s mnohopočetnyacutemi chromozoacutemovyacutemi sekvenciami pričom sa fluorescenčne tak bdquovymaľujeldquo celyacute chromozoacutem (Obr 45) Použiacutevajuacute sa na vyšetrenie chromozoacutemovyacutech prestavieb k analyacuteze translokaacuteciiacute a k detekcii pocircvodu tzv marker chromozoacutemov (malyacutech nadpočetnyacutech chromozoacutemov neznaacutemeho pocircvodu) K použitiu sondy suacute potrebneacute metafaacutezne chromozoacutemy nepoužiacutevaju sa pre interfaacuteznu FISH

Pri konvenčnej chromozoacutemovej FISH suacute homogeacutenne DNA proacuteby hybridizovaneacute s fixovanyacutem metafaacuteznym alebo prometafaacuteznym chromozoacutemomchromozoacutemami na skliacutečku (Obr 36a) Maximaacutelna rozlišovacia schopnosť metafaacuteznej FISH je niekoľko megabaacutez (Obr 39a 45) využitiacutem viac

44

natiahnutyacutech prometafaacuteznych chromozoacutemov sa dosiahne 1 Mb rozliacutešenie Prostredniacutectvom fiber FISH konkreacutetne artificiaacutelne deproteinizovanej natiahnutej DNA pripravenej in situ z celyacutech buniek na mikroskopickom skliacutečku je možneacute vizualizovať individuaacutelne geacuteny maleacute DNA elementy na chromozoacuteme s rozliacutešeniacutem okolo 1000 bp

Obr 42 Interfaacutezne jadro po hybridizaacutecii s lokusovo-špecifickou sondou LSI 5q31 Spectrum Orange5p12 Spectrum Green (Vysis Abbott) Na ľavom obraacutezku suacute priacutetomneacute dva červeneacute (5q31) a dva zeleneacute signaacutely (5p12) v pravom jadre je priacutetomnaacute deleacutecia 5q31 oblasti chyacuteba jeden červenyacute signal (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

Obr 43 Interfaacutezna FISH použitaacute lokusovo-špecifickaacute sonda ndash translokačnaacute - XL BCRABL1 plus (Metasystems) dvojfarebnaacute dvojfuacutezna kde červenaacute označuje lokus ABL1 na chromozoacuteme 9 a zelenaacute oblasť BCR na chromozoacuteme 22 Sonda deteguje fuacuteziu protoonkogeacutenu ABL1 (9q34) a geacutenu BCR (22q11) v priacutepade že červenyacute a zelenyacute signaacutel suacute pri sebe (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

45

Obr 44 Interfaacutezna FISH Použitaacute lokusovo-špecifickaacute sonda- typ break apart pre IGH geacuten V docircsledku translokaacutecie došlo k rozskočeniu geacutenu pričom translokačneacuteho partnera nepoznaacuteme vieme určiť len percento v koľkyacutech jadraacutech je geacuten prestavanyacute (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex) Obr 45 Použiteacute celochromozoacutemoveacute sondy WCP 15 (červenyacute chromozoacutem) a WCP 17 (zelenyacute chromozoacutem) Na metafaacuteze je potvrdenaacute reciprokaacute translokaacutecia t(1517)(q2221) (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

FISH vizualizaacutecia celeacuteho chromozoacutemu maľovanie chromozoacutemu anglicky chromosome

painting je špeciaacutelnou aplikaacuteciou chromozoacutemovej FISH proacuteba je koktail veľkeacuteho počtu rocircznych fluorescenčne značenyacutech DNA fragmentov hybridizujuacutecich pozdĺž celeacuteho konkreacutetneho chromozoacutemu (obr 36b 45) bdquoChromosomepaintingldquo analyzuje metafaacutezne chromozoacutemy V minulosti bola FISH vizualizaacutecia celyacutech chromozoacutemov limitovanaacute malyacutem množstvom rocirczne sfarbenyacutech fluorochroacutemov

V suacutečasnosti je možneacute detegovať množstvo cieľovyacutech sekvenciiacute naraz čo sa využiacuteva pri celogenoacutemovej chromozoacutemovej vizualizaacutecii (whole-chromosomepainting - WCP) metoacutedou multiplex FISH (M-FISH multicolor FISH o br 46) alebo spektraacutelnej karyotypizaacutecie (SKY) kedy možno rozliacutešiť všetky ľudskeacute chromozoacutemy ndash teda 24 rocircznych chromozoacutemov M-FISH a SKY patria medzi metafaacutezne formy FISH diagnostiky ktoreacute umožňujuacute simultaacutennu vizualizaacuteciu všetkyacutech ľudskyacutech chromozoacutemov v rocircznych farbaacutech čo predstavuje uľahčenie analyacutezy karyotypu hlavne pri komplexnyacutech zmenaacutech a markeroch neznaacutemeho pocircvodu Obe techniky vychaacutedzajuacute z použitia

46

celochromozoacutemovyacutech sond značenyacutech kombinaacuteciou viaceryacutech fluorochroacutemov Rozdiel medzi M-FISH a SKY spočiacuteva v technike ziacuteskania konečneacuteho obrazu

Obr 46 Multicolor FISH - každyacute chromozoacutemovyacute paacuter je zafarbenyacute inou farbou pričom na ich zafarbenie postačuje kombinaacutecia 5 fluorochroacutemov Na vyhodnocovanie je potrebnaacute špeciaacutelna sada fluorescenčnyacutech filtrov pre jednotliveacute fluorochroacutemy a špeciaacutelnyacute softweacuter Vľavo-štandardnyacute karyotyp vpravo karyotyp s mutaacuteciami (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

V molekulovej cytogenetike suacute komerčne dostupneacute sety M-FISH proacuteb umožňujuacutece

viacfarebneacute pruacutežkovanie chromozoacutemov (banding) s vysokyacutem rozliacutešeniacutem (multicolor-banding mBAND FISH MCB) čo umožňuje identifikaacuteciu intrachromozoacutemovyacutech prestavieb (Obr 47) Nevyhnutnosťou mBAND-u je mať chromozoacutemy v metafaacuteze Taacuteto metoacuteda bola prvyacutekraacutet uskutočnenaacute na chromozoacuteme 5 v roku 1999 mBAND FISH umožňuje rozliacutešiť špecifickeacute oblasti chromozoacutemov na uacuterovni pruacutežku - bandu a sub-bandu s detekciou 550 bandov haploidneacuteho karyotypu

Obr 47 A - mBAND chromozoacutemu 11 - inverzia duplikovanej oblasti 11q223-q25 B - mBAND chromozoacutemu 3 - na kruhovom chromozoacuteme deleacutecia oblasti 3p263 C - mBAND chromozoacutemu 2 - potvrdenie inverzie duplikovanej časti chromozoacutemu (poskytnuteacute RNDr Dagmar Landlovou Medirex)

FISH metoacuteda a jej varianty (M-FISH mBAND SKY) majuacute v suacutečasnosti širokeacute využitie v

klinickej genetike v onkologickej genetike na detekciu aberaacuteciiacute v čase diagnoacutezy počas liečby po

47

liečbe monitorovanie po transplantaacutecii kostnej drene v prenataacutelnej a postnataacutelnej diagnostike pri detekcii submikroskopickyacutech deleacuteciiacute (napr DiGeorge syndroacutem - 22q112 delečnyacute syndroacutem PraderndashWilli syndroacutem- chromozoacutem 15q11-13) prostredniacutectvom FISH je možnaacute detekcia numerickyacutech zmien chromozoacutemov (trizoacutemia chromozoacutemu 21 pri Downovom syndroacuteme trizoacutemia chromozoacutemu 15 pri Patauovom syndroacuteme trizoacutemia chromozoacutemu 18 pri Edwardsovom syndroacuteme) rocirczne zmeny v počte pohlavnyacutech chromozoacutemov (monozoacutemia X pri Turnerovom syndroacuteme Klinefelterov syndroacutem s X chromozoacutemom naviac - XXY) podobne v predimplantačnej diagnostike

83 DNA Microarray (DNA mikro čip biočip) DNA mikročipovanie je technika využiacutevajuacuteca hybridizaacuteciu skuacutemanej nukleovej kyseliny

(cieľovaacute vzorka) s veľkyacutem množstvom oligonukleotidovyacutech proacuteb (desať tisiacutec až milioacuten) ktoreacute suacute prichyteneacute na pevnyacute podklad najčastejšie sklenyacute silikoacutenovyacute alebo nylonovyacute (doštička čip) Skuacutemanaacute nukleovaacute kyselina je pred hybridizaacuteciou fragmentovanaacute označenaacute fluorofoacuterom a denaturovanaacute Po kontakte čipu s cieľovou vzorkou ktoraacute je vlastne zmes označenyacutech oligonukleotidov značeneacute oligonukleotidy hybridizujuacute s oligonukleotidovyacutemi sekvenciami prichytenyacutemi na čipe Potom suacute na zaacuteklade fluorescencie detekovaneacute miesta kde došlo k hybridizaacutecii čiže vzorka obsahovala takuacuteto nukleotidovuacute sekvenciu Z jedneacuteho mikročipu sa ziacuteska obrovskeacute množstvo daacutet ktoreacute je vždy nutneacute softveacuterovo spracovať V dnešnej dobe existuje niekoľko firiem poskytujuacutecich komerčne mikročipy na objednaacutevku alebo si ich laboratoacuteria produkujuacute sami

Mikročipovanie prebieha nasledovne

1) Vytvorenie DNA čipu ndash tisiacutece rocircznych jednovlaacuteknovyacutech DNA oligonukleotidov znaacutemych sekvencii sa kovalentne naviažu na povrch doštičky vždy v určitej lokalite je niekoľko rovnakyacutech oligonukleotidov veľkosť takejto lokality je ˂ 200 microm Proacutebami mocircže byť DNA cDNA alebo syntetizovaneacute oligonukleotidy Už hotoveacute mikročipy ponuacutekajuacute viacereacute firmy (Affymetrix Agilent Technologies Eppendorf Illumina) alebo si ich jednotliveacute laboratoacuteria vyraacutebajuacute sami pomocou robotickyacutech zariadeniacute DNA čip sa vytvaacutera buď nanaacutešaniacutem kvapiek oligonukleotidov na podklad alebo synteacutezou oligonukleotidov in situ na čipe 2) Priacuteprava vzorky ndash nukleovaacute kyselina (mRNA DNA) sa purifikuje určiacute sa jej kvantita a kvalita (spektrofotometericky) fragmentuje resp v priacutepade mRNA sa syntetizuje cDNA v priacutepade potreby sa mocircže DNA amplifikovať PCR reakciou štiepiť restrikčnyacutemi endonukleaacutezami 3) Fluorescenčneacute označenie (zriedkavejšie raacutedioaktiacutevne) fragmentov DNA prebieha počas reverznej transkripcie alebo PCR amplifikaacutecie za uacutečasti fluorescenčne značenyacutech nukleotidov Keď sa analyzujuacute dve rocirczne vzorky napr zdraveacute tkanivo a naacutedoroveacute tkanivo označenie nukleovyacutech kyseliacuten v tyacutechto tkanivaacutech byacuteva rozdielne a to použitiacutem dvoch rocircznych fluorescenčnyacutech farbiacutev (napr zeleneacute a červeneacute) Pred hybridizaacuteciou je potrebneacute vzorku denaturovať čiacutem sa vytvoriacute zmes jednovlaacuteknovyacutech DNA označenyacutech značkou 4) Hybridizaacutecia s mikročipom ndash v špeciaacutelnom hybridizačnom roztoku hybridizujuacute komplementaacuterne sekvencie zo vzorky s priacuteslušnyacutemi oligonukleotidovyacutemi sondami naviazanyacutemi na čipe Potom sa čip obmyje aby došlo k odstraacuteneniu čiastočne hybridizovanyacutech nukleovyacutech kyseliacuten 5) Skenovanie mikročipu ndash skenerom čipov docircjde k ožiareniu čipu laserom pričom v mieste hybridizaacutecie fluorescenčne značenyacutech DNA fragmentov s proacutebou docircjde k emisii svetla určitej vlnovej dĺžky ktoruacute skener zaznamenaacute 6) Analyacuteza daacutet prebieha metoacutedami bioinformatiky spracovaniacutem softveacutermi sa zistiacute ktoreacute lokality čipu navzaacutejom hybridizovali v priacutepade použitia dvoch vzoriek kontrolnej a skuacutemanej je možneacute analyzovať ich relatiacutevnu intenzitu hybridizaacutecie (expresie určiteacuteho geacutenu)

Existujuacute štyri typy mikročipov 1) Čipy ur čeneacute na analyacutezu expresie (obsahujuacute cDNA proacuteby) pre tzv dvojkanaacutelovyacute experiment kedy je vzorka určenaacute k hybridizaacutecii na čipe ziacuteskanaacute zmiešaniacutem DNA fragmentov kontrolnej a skuacutemanej vzorky pričom fragmenty suacute rozdielne fluorescenčne označeneacute (napr zelenyacute fluorofoacuter pre kontrolnuacute vzorku a červenyacute pre skuacutemanuacute) Na zaacuteklade intenzity a typu fluorescencie sa deteguje expresia geacutenov typickaacute pre kontrolnuacute vzorku (napr zelenaacute fluorescencia) pre skuacutemanuacute vzorku (napr

48

červenaacute fluorescencia) a expresia podobnaacute u oboch vzoriek (žltaacute fluorescencia) neexprimovaneacute geacuteny (čierna fluorescencia) rocirczne odtiene (v zaacutevislosti od prevažujuacutecej hybridizaacutecie) (obr 48) 2) Čipy ur čeneacute na analyacutezu mutaacutecii použije sa genoacutemovaacute DNA označenaacute jednou fluorescenčnou farbičkou na určenie jednonukleotidovej zmeny (SNP ndash Single Nukleotide Polymorphism) 3) Čipy na komparatiacutevnu genoacutemovuacute hybridizaacuteciu (aCGH array Comparative Genomic Hybridization) ndash použiacutevaneacute na zistenie zvyacutešenia alebo zniacuteženia množstva chromozoacutemovyacutech fragmentov obsahujuacutecich geacuteny zodpovedneacute za určiteacute ochorenie Na analyacutezu sa použije skuacutemanaacute gDNA a referenčnaacute (kontrolnaacute) DNA každaacute sa značiacute inou fluorescenčnou farbičkou (princiacutep ako pri analyacuteze expresie) (obr 49 50) 4) Čipy CGH - SNP kombinovaneacute čipy ur čeneacute na analyacutezu aj mutaacuteciiacute SNP aj na komparatiacutevnu genoacutemovuacute hybridizaacuteciu CGH

Mikročipy majuacute rozsiahle využitie napriacuteklad v identifikaacuteciiacute novyacutech geacutenov vo vyacuteskume ich funkciiacute expresie v rocircznych podmienkach pri diagnostike mnohyacutech ochoreniacute vo farmakogenomike vo vyacuteskume vplyvu toxiacutenov

Obr 48 Heatmapa geacutenovej expresie vybranyacutech geacutenov (mRNA) mikročip obsahuje 46000 cDNA proacuteb (poskytnuteacute Ing Helenou Gbelcovou PhD Uacutestav lekaacuterskej bioloacutegie genetiky a klinickej genetiky LF UK a UNB)

49

Obr 49 Princiacutep komparatiacutevnej genoacutemovej hybridizaacutecie (aCGH - array comparative genomic hybridization) Obr 50 A) Vyacutesledok komparatiacutevnej genoacutemovej hybridizaacutecie (aCGH - array comparative genomic hybridization) vzorky DNA izolovanej plodovej vody U plodu s abnormaacutelnym ultrasonografickyacutem vyšetreniacutem bola identifikovanaacute duplikaacutecia oblasti 3q261q29 (modryacute paacutes) a deleacutecia oblasti 5p1533p151 (červenyacute paacutes) Pre porovnanie chromozoacutem 1 bez aberaacutecie b) Ten istyacute pacient ale ineacute softveacuteroveacute spracovanie (poskytnuteacute RNDr Miroslavom Tomkom PhD Medirex)

50

Odporuacutečanaacute a použitaacute literatuacutera

Odborneacute knihy Klug W S Cummings M R Spencer Ch A Palladino M A Concepts of Genetics jedenaacuteste vydanie (2015) Carson S Molecular Biology Techniques tretie vydanie (2012) Strachan T Read A Human Molecular Genetics štvrteacute vydanie (2011) Sudbery P Sudbery I Human Molecular Genetics tretie vydanie (2009)

Internetoveacute straacutenky

wwwncbinlmnihgov wwwmlpacom wwwthermofishercom wwwilluminacom wwwpromegask wwwqiagencom wwwambioncom

Odborneacute člaacutenky Chacon-Cortes D Griffiths L R Methods for extracting genomic DNA from whole blood samples current perspectives Journal of Biorepository Science for Applied Medicine Volume 2 strany 1- 9 Viltrop T Krjutskov K Palta P Metspalu A Comparison of DNA extraction methods for multiplex polymerase chain reaction Anal Biochem 2010 Volume 398(2) strany 260-262 Ing Martin Čermaacutek Molekulaacuterna cytogenetika v problematike familiaacuternych maligniacutet Onkoloacutegia Volume 2 strany 77 - 83 Livak KJ Schmittgen TD Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method Methods 2001 Volume 25(4) strany 402 - 408 Bustin S A Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays J Mol Endocrinol 2000 Volume 25(2) strany169 - 193

MOLEKULAacuteRNE METOacuteDY AKTUAacuteLNE POUŽIacuteVANEacute V KLINICKEJ GENETIKE RNDr Andrea Pastoraacutekovaacute PhD RNDr Robert Petrovič PhD Vydala Univerzita Komenskeacuteho v Bratislave Lekaacuterska fakulta Rozsah 50 straacuten 246 AH prveacute vydanie ISBN 978-80-223-4231-5

33

6 Sekvenovanie

Sekvenovaniacutem rozumieme určenie primaacuternej štruktuacutery DNA teda určenie poradia nukleotidov v reťazci DNA Začiatky moderneacuteho sekvenovania siahajuacute do roku 1977 kedy boli objaveneacute dve metoacutedy sekvenovania 1) chemickaacute metoacuteda Maxama a Gilberta 2) enzymatickaacute metoacuteda Sangera Nicklena a Coulsona

Princiacutep obidvoch metoacuted sekvenovania spočiacuteva v tom že sa vytvoriacute suacutebor DNA molekuacutel s rocircznou veľkosťou ktoreacute suacute zakončeneacute konkreacutetnym nukleotidom tieto DNA molekuly sa elektroforeticky separujuacute v geacuteloch s rozlišovacou schopnosťou 1 nukleotid 61 Chemickaacute metoacuteda

DNA molekuly sa na 5-konci raacutedioaktiacutevne označia raacutedioaktiacutevnym fosforom a naacutesledne sa chemicky modifikujuacute špecificky pre každuacute baacutezu DNA sa potom v modifikovanyacutech miestach štiepi čiacutem vzniknuacute rocirczne dlheacute fragmenty pričom podmienky suacute nastaveneacute tak aby sa DNA na každom mieste štiepila len raz Modifikaacutecia DNA a štiepenie prebehne v štyroch separaacutetnych reakciaacutech (skuacutemavkaacutech) takže po elektroforetickej separaacuteciiacute takto opracovanej DNA v štyroch draacutehach polyakrylamidoveacuteho geacutelu a naacuteslednej autoraacutediografii (podobne ako pri Southernovej hybridizaacutecii) je možneacute odčiacutetať nukleotidovuacute sekvenciu približne 100 nukleotidov od raacutedioaktiacutevneho označenia (v čase objavu Maxama a Gilberta) 62 Sangerova metoacuteda

Zaacuteklady metoacutedy boli popiacutesaneacute už v roku 1975 (metoacuteda plus a miacutenus) ale až vylepšenie použitiacutem dideoxynukleotidov (ddNTP) v roku 1977 došlo k zjednodušeniu sekvenovania Princiacutepom enzyacutemoveacuteho sekvenovania je terminaacutecia (zastavenie) polymerizaacutecie inkorporaacuteciou 2´ 3 -dideoxynukleotidov do novosyntetizujuacuteceho sa vlaacutekna DNA Keďže ddNTP neobsahujuacute hydroxylovuacute skupinu na 3 uhliacuteku riboacutezy nemocircžu sa zuacutečastniť na tvorbe fosfodiesterovej vaumlzby nemocircže sa pripojiť k nim ďalšiacute nukleotid čiže musiacute docircjsť k terminaacuteciiacute polymeraacutecie Reakcia prebieha v štyroch skuacutemavkaacutech s raacutedioaktiacutevne značenyacutem primerom V každej skuacutemavke suacute priacutetomneacute všetky štyri deoxynukleotidtrifosfaacutety (dNTP) ale pre každuacute skuacutemavku je špecifickyacute priacutedavok maleacuteho množstva jedneacuteho z dideoxynukleotidtrifosfaacutetov (v prvej skuacutemavke je ddATP v druhej ddCTP v tretej ddTTP a vo štvrtej ddGTP) Maleacute množstvo ddNTP spocircsobiacute že pri polymerizaacutecii dochaacutedza k prednostneacutemu zaradeniu štandardnyacutech dNTP do narastajuacuteceho reťazca a len občas sa inkorporuje ddNTP čiacutem sa zastaviacute synteacuteza reťazca V každej skuacutemavke tak vznikne suacutebor DNA fragmentov rocircznych veľkostiacute zakončenyacutech priacuteslušnyacutem ddNTP (v prvej skuacutemavke ddATP v druhej ddCTP v tretej ddTTP a vo štvrtej ddGTP) Po elektroforetickej separaacutecii v 4 draacutehach polyakrylamidoveacuteho geacutelu a autoraacutediografii sa z autoraacutediogramu odčiacuteta sekvencia

V suacutečasnosti je sekvenovanie do značnej miery automatizovaneacute pričom využiacuteva princiacutep Sangerovej enzyacutemovej metoacutedy s určityacutemi obmenami Uacutesek DNA ktoryacute treba sekvenovať sa prostredniacutectvom termostabilnyacutech DNA polymeraacutez namnožiacute PCR metoacutedou po ktorej nasleduje sekvenačnaacute reakcia (asymetrickaacute PCR) s fluorescenčne značenyacutemi ddNTP (každyacute druh označenyacute inyacutem fluorescenčnyacutem farbivom) Sekvenačnaacute reakcia prebieha v jednej skuacutemavke s jednyacutem primerom vznikne tak suacutebor jednovlaacuteknovyacutech DNA rocircznej dĺžky ktoreacute suacute na 3konci označeneacute ddNTP so špecifickyacutem fluorescenčnyacutem farbivom Taacuteto metoacuteda sekvenovania sa tiež nazyacuteva rdquodye-terminator cycle sequencingrdquo(obr 30) Po kapilaacuternej elektroforeacuteze vzorky v genetickom analyzaacutetore zaznamenaacutevaniacute fluorescencie jednotlivyacutech fragmentov CCD kamerou a softveacuterovom spracovaniacute sa ziacuteska sekvencia DNA (obr 31)

34

Obr 30 Princiacutep sekvenovania Sangerova dideoxy metoacuteda alebo tzv chain termination method (reťazec zastavujuacuteca metoacuteda) Obr 31 Určenie genotypu plodu a rodičov sekvenčnou analyacutezou DNA ziacuteskanej z plodovej vody (prenataacutelna diagnostika) a perifeacuternej krvi sekvenčnaacute analyacuteza geacutenu ASPA vyacutesledok u plodu priacutetomnaacute mutaacutecia c 914CgtA v homozygotnom stave (AA) rodičia heterozygoti (AC) Uvedenaacute mutaacutecia je v homozygotnom stave kauzaacutelnou priacutečinou Canavanovej choroby

Automatizovaneacute sekvenovanie prinaacuteša viacereacute vyacutehody oproti klasickej Sangerovej metoacutede vyššiu presnosť a ryacutechlosť v jednej sekvenačnej reakcii možnosť osekvenovať až 1200 nukleotidovyacute fragment maleacute množstvo templaacutetu potrebneacute na analyacutezu

35

63 Next Generation Sequencing (NGS)

NGS (sekvenovanie novej generaacutecie) maacute obrovskyacute potenciaacutel v analyacuteze genoacutemov pričom toto označenie zahŕňa viacereacute technologickeacute metoacutedy reprezentovaneacute niekoľkyacutemi firmami Princiacutepom je masiacutevne paralelneacute sekvenovanie čiacutem sa ziacuteskajuacute raacutedovo tisiacutece až milioacuteny sekvenciiacute naraz 631 Sekvenovanie druhej generaacutecie

Na začiatku sa analyzovanaacute DNA vo vaumlčšine priacutepadov fragmentuje (vznikne tak DNA

knižnica) na fragmenty sa pripoja kraacutetke sekvencie ndash adapteacutery naacutesledne sa tieto fragmenty rocircznymi priacutestupmi amplifikujuacute a určiacute sa ich sekvencia Vďaka čiastočnyacutem prekryvom je zo ziacuteskanyacutech sekvencii možneacute poskladať plynuluacute sekvenciu zodpovedajuacutecu pocircvodnej nefragmentovanej DNA

Pyrosekvenovanie je podobne ako Sangerova metoacuteda založenaacute na princiacutepe synteacutezy komplementaacuterneho vlaacutekna DNA avšak rozdiel je v tom že sa na detekciu inkorporaacutecie nukleotidu využiacuteva inyacute systeacutem tvorby luminiscenčneacuteho signaacutelu v priebehu reakcie Pyrosekvenovanie je umožneneacute vďaka aktivite 4 enzyacutemov - DNA polymeraacutezy ATP sulfurylaacutezy luciferaacutezy a apyraacutezy Reakčnaacute zmes obsahuje aj ďalšie komponenty - enzymatickeacute substraacutety adenoziacutenfosfosulfaacutet (APS) d-luciferiacuten sekvenovanyacute templaacutet a cyklicky postupne po jednom type pridaacutevaneacute nukleotidtrifosfaacutety Po zabudovaniacute nukleotidu do novovznikajuacuteceho reťazca docircjde k uvoľneniu pyrofosfaacutetu naacutesledne je využityacute ATP sulfurylaacutezou na synteacutezu ATP z APS počas ďalšej reakcie docircjde k využitiu ATP luciferaacutezou na premenu luciferiacutenu na oxyluciferiacuten čo spocircsobiacute svetelnyacute signaacutel a ten zaznamenaacute detekčnyacute systeacutem Poslednou enzymatickou reakciou je reakcia apyraacutezy ktoraacute odstraacuteni nezainkorporovaneacute nukleotidy a nevyužiteacute ATP aby sa celyacute proces mohol zopakovať s reakčnou zmesou obsahujuacutecou ďalšiacute nukleotidtrifosfaacutet (inyacute ako v predchaacutedzajuacutecej reakcii) Po každej reakcii detektor zaznamenaacuteva emisiu svetla na zaacuteklade intenzity svetla je možneacute určiť či bol vradenyacute priacuteslušnyacute nukleotidtrifosfaacutet či bol inkorporovanyacute jeden priacutepadne viac rovnakyacutech nukleotidtrifosfaacutetov

Zvyacutešenie vyacutekonu pyrosekvenovania umožnila tzv emulznaacute PCR v mikročasticiach a použitie platničky PicoTiterPlatereg toto sekvenovanie zaviedla firma Roche pod pojmom 454 pyrosekvenovanie v roku 2005 Na začiatku sa DNA fragmentuje na uacuteseky dlheacute 400-600 baacutez dvojvlaacuteknovaacute fragmentovanaacute DNA sa liguje s adapteacutermi prostredniacutectvom nich sa naviaže na mikročastice dvojvlaacuteknoveacute fragmenty sa oddelia mikročastice s naviazanyacutemi jednovlaacuteknovyacutemi fragmentami sa premiešajuacute so zmesou oleja a roztoku ktoryacute obsahuje všetky komponenty na uacutespešnuacute PCR Tyacutemto spocircsobom sa okolo každej mikročastice vytvoriacute vlastnyacute mikroreaktor v ktorom prebehne amplifikaacutecia fragmentu Po PCR reakcii sa mikročastice prenesuacute do platničky PicoTiterPlate v ktorej sa do jamky zmestiacute akuraacutet jedna mikročastica a reakčneacute komponenty pyrosekvenačnej reakcie PicoTiterPlatereg maacute 1 600 000 jamiek každaacute jamka maacute maximaacutelny objem 75 picolitra Platnička s mikročasticami sa vložiacute do sekvenačneacuteho systeacutemu ndash priacutestroja v ktorom sa celeacute pyrosekvenovanie uskutočniacute Chemiluminiscenčneacute signaacutely ktoryacutech počas sekvenovania vznikajuacute milioacuteny v priebehu hodiny suacute zachyteneacute CCD kamerou a analyzovaneacute softveacuterom

Firma Illumina predstavila inuacute technoloacutegiu PCR amplifikaacutecia a sekvenovanie sa uskutočňuje na skliacutečku (flow cell) Fragmentaacutecia DNA a pripojenie adapteacuterov prebieha za uacutečasti transpozoacutemov v procese nazvanom tagmentaacutecia Po hybridizaacutecii fragmentov DNA na skliacutečko prebehne v klastroch PCR amplifikaacutecia (tzv mostiacutekovaacute amplifikaacutecia) sekvenaacutecia prebieha za uacutečasti rozdielne fluorescenčne značenyacutech a chemicky modifikovanyacutech nukleotidov pričom každyacute nukleotid emituje fluorescenciu s inou vlnovou dĺžkou Na skliacutečku prebieha paralelne až 6 miliaacuterd sekvenaacutecii (obr 32)

Ďalšiacutemi možnosťami sekvenovania druhej generaacutecie je systeacutem SOLid (vyvinutyacute firmou Applied Biosystem dnes pod Thermo Fisher Scientific) a Ion Semiconductor Sequencing ndash polovodičoveacute ioacutenoveacute sekvenovanie (od firmy Ion Semiconductor Sequencing v suacutečasnosti Thermo Fisher Scientific)

36

Obr 32 Princiacutep sekvenovania novej generaacutecie od firmy Illumina PCR amplifikaacutecia a sekvenovanie sa uskutočňuje na skliacutečku (flow cell) paralelne prebieha až 6 miliaacuterd sekvenaacutecii

632 Sekvenovanie tretej generaacutecie

Pred sekvenovaniacutem netreba amplifikovať DNA PCR metoacutedou ale sekvencia sa ziacuteskava zachyteniacutem signaacutelu v reaacutelnom čase Medzi sekvenovanie tretej generaacutecie patriacute SMRT (Single Molecule Real-Time Sequencing) a Nanopore Sequencing

37

7 Fragmentačnaacute analyacuteza DNA

Je metoacuteda použiacutevanaacute na určenie veľkosti fragmentov DNA ziacuteskanyacutech PCR reakciou Dĺžka amplifikovanyacutech DNA fragmentov sa zistiacute ich porovnaniacutem s veľkostnyacutem štandardom (obr 33) ktoryacute je tvorenyacute DNA fragmentami znaacutemej dĺžky Veľkostnyacute štandard je pred kapilaacuternou elektroforeacutezou zmiešanyacute so vzorkou DNA fragmenty veľkostneacuteho štandardu suacute fluorescenčne označeneacute pričom použiteacute fluorescenčneacute farbivo je ineacute ako fluorescenčneacute farbivo použiteacute na označenie DNA fragmentov vo vyšetrovanej vzorke

Obr 33 Elektroforetogram veľkostneacuteho štandardu použiacutevaneacuteho na určenie veľkostiacute fragmentov analyzovanyacutech kapilaacuternou elektroforeacutezou v genetickom analyzaacutetore (GeneScantrade 500 LIZtrade dye Size Standard) dĺžka fragmentov v nukleotidoch (napr 50 nukleotidov)

Fragmentačnaacute analyacuteza pozostaacuteva z viaceryacutech krokov Prvyacutem je izolaacutecia DNA nasleduje PCR amplifikaacutecia počas ktorej sa novosyntetizovaneacute DNA fragmenty označia fluorescenčnyacutemi farbivami Vzorka s PCR produktom sa pripraviacute na kapilaacuternu elektroforeacutezu tak že sa zmieša s veľkostnyacutem štandardom (sluacuteži na určenie veľkosti fragmentov) a denaturačnou laacutetkou (formamid) nasleduje denaturaacutecia Pripraveneacute vzorky suacute injektovaneacute do priacutestroja (genetickyacute analyzaacutetor) kde v kapilaacutere naplnenej polymeacuterom v elektrickom poli migrujuacute fluorescenčne značeneacute fragmenty DNA na zaacuteklade veľkosti (kapilaacuterna elektroforeacuteza) Počas elektroforeacutezy genetickyacute analyzaacutetor zaznamenaacuteva fluorescenciu fragmentov Analyacutezou daacutet prostredniacutectvom špeciaacutelnych softveacuterov sa ziacuteskajuacute elektroforetogramy z ktoryacutech je možneacute zistiť veľkosť fragmentov ako aj typ fluorescencie (docircležiteacute ak suacute genetickeacute varianty rozliacutešiteľneacute rocircznou fluorescenciou napr SNaPshot) Fragmentačnaacute analyacuteza je suacutečasťou množstva molekulaacuterno-genetickyacutech metoacuted (pozri obr 12 26 28 29 34) ako suacute napr STR analyacuteza (Short Tandem Repeat) AFLP analyacuteza (Amplified Fragment Lenght Polymorfism) RFLPT-RFLP analyacuteza (Restriction Fragment Lenght PolymorfismTerminal Restricted Fragment Lenght Polymorfism) SSCP (Single Strand Conformation Polymorfism) VNTR (Variable Number of Tandem Repeat) analyacuteza straty heterozygotnosti (LOH loss of heterozygozity) MLPA (Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification) MSMSA (Methylation-Sensitive Mobility Shift Assay) SNP genotypovanie (SNaPshotreg) HiCEP (High-Coverage Expression Profiling)

38

Obr 34 Kvantitatiacutevna fragmentačnaacute PCR analyacuteza (QF-PCR) DNA izolovanej z plodovej vody vyacutesledok prenataacutelnej analyacutezy = priacutetomnosť troch piacutekov pre chromozoacutem 18 (u všetkyacutech fragmentov detegujuacutecich chromozoacutem 18 je pomer vyšetrovanyacutech markerov aberantnyacute 21 resp 111) čo znamenaacute trizoacutemiu chromozoacutemu 18 Edwardsov syndroacutem

39

8 Metoacutedy založeneacute na princiacutepe hybridizaacutecie

Nukleoveacute kyseliny majuacute schopnosť vytvaacuterať dvojvlaacuteknoveacute reťazce z jednovlaacuteknovyacutech molekuacutel na zaacuteklade komplementarity baacutez Komplementarita baacutez umožňuje replikaacuteciu DNA transkripciu RNA komplementarita baacutez zabezpečuje teda reprodukovateľnosť živej hmoty

Hybridizaacutecia je proces v ktorom na zaacuteklade komplementarity baacutez dochaacutedza k vytvoreniu dvojvlaacuteknovej nukleovej kyseliny z dvoch jednovlaacuteknovyacutech molekuacutel DNA alebo RNA alebo ich kombinaacuteciou DNA RNA pričom kratšia jednovlaacuteknovaacute nukleovaacute kyselina vystupuje ako sonda (proacuteba) Hybridizaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten je jeden z najpoužiacutevanejšiacutech naacutestrojov v molekulaacuternej bioloacutegii a genetike (hybridizaacutecia primerov alebo proacuteb sa využiacuteva v takmer každej metoacutede - v PCR RT-PCR qPCR RT-qPCR MLPA sekvenovaniacute fragmentačnej analyacuteze FISH DNA mikročipoch atď)

Denaturaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten je proces pri ktorom dochaacutedza k porušeniu vodiacutekovyacutech vaumlzieb medzi vlaacuteknami nukleovyacutech kyseliacuten (strata sekundaacuternej a terciaacutelnej štruktuacutery) tak že docircjde k ich uacuteplneacutemu oddeleniu vzniknuacute jednovlaacuteknoveacute reťazce Denaturaacutecia NK mocircže byť spocircsobenaacute vplyvom vysokyacutech teplocirct pH alebo chemickyacutech laacutetok (denaturačneacute činidlaacute) Renaturaacutecia je opačnyacute proces v ktorom na zaacuteklade komplementarity dochaacutedza k tvorbe dvojvlaacuteknovyacutech NK

Hybridiza čnaacute sonda (proacuteba) je jednovlaacuteknovaacute nukleovaacute kyselina určitej znaacutemej dĺžky a sekvencie (najčastejšie DNA pretože je stabilnejšia ako RNA) ktoraacute je značenaacute a sluacuteži na detekciu komplementaacuternych molekuacutel DNA alebo RNA v procese hybridizaacutecie V zaacutevislosti od podmienok hybridizaacutecie (stringencia) mocircže byť detegovanaacute sekvencia uacuteplne komplementaacuterna alebo v menej priacutesnych podmienkach mocircže mať sekvenčneacute odchyacutelky Proacuteba sluacuteži na vyhľadanie a zviditeľnenie cieľovyacutech NK Zviditeľnenie sa deje prostredniacutectvom označenia proacuteby ešte pred hybridizaacuteciou Značenie proacuteby mocircže byť raacutedioaktiacutevne a neraacutedioaktiacutevne (najčastejšie fluorescenčneacute)

Raacutedioaktiacutevne značeneacute proacuteby pomocou izotopov (32P) sa využiacutevali viac v minulosti v suacutečasnosti suacute kvocircli zdravotnyacutem rizikaacutem ohľaduplnosti k životneacutemu prostrediu ako aj kvocircli jednoduchšej manipulaacutecii použiacutevaneacute fluorescenčne značeneacute proacuteby Raacutedioaktiacutevne značeneacute sondy boli použiacutevaneacute hlavne metoacutedou Southernovej hybridizaacutecie (Southern blotting Southern blot) Citlivosť raacutedioaktiacutevne značenyacutech proacuteb je vyššia dosahuje schopnosť zachytiť 10 fg (femtogram 10-15) cieľovej DNA sekvencie 81 Southern blot

Metoacutedu objavil v roku 1975 britskyacute bioloacuteg Edwin Southern (preto Southern) Pri Southernovej hybridizaacutecii sa restrikčne štiepeneacute fragmenty DNA elektroforeticky separujuacute v geacuteli potom sa metoacutedou blottingu prenesuacute na nylonovuacute alebo nitroceluloacutezovuacute membraacutenu kde suacute naacutesledne hybridizovaneacute v roztoku obsahujuacutecom raacutedioaktiacutevne značenuacute sondu Priloženiacutem fotografickeacuteho filmu k membraacutene a vyvolaniacutem filmu autoraacutediografiou docircjde k zviditeľneniu lokaliacutet kde došlo k hybridizaacuteciiacute raacutedioaktiacutevne značenej sondy s fragmentom DNA (autoraacutediogram) Southern blot bol kľuacutečovou a prvou metoacutedou na identifikaacuteciu osocircb (DNA fingerprinting DNA pofiling) (obr 35)

Okrem Southern blotu existuje Northern blot na analyacutezu RNA (geacutenovej expresie) a Western blot na analyacutezu proteiacutenov postup je obdobnyacute ako pri Southern blote s obmenami špecifickyacutemi pre konkreacutetny blot Pri Northern blote sa použiacutevajuacute hybridizačneacute proacuteby ale pre vizualizaacuteciu proteiacutenov western blotom je potrebneacute použiť protilaacutetky s naacuteslednou vizualizaacuteciou Pomenovanie techniacutek je hra so sloviacutečkami (keďže paacuten Northern ani Western neobjavili takto nazvaneacute techniky)

Neraacutedioaktiacutevne značenie proacuteb použiacutevanyacutech v molekulaacuternej genetike mocircže byť nepriame (použitie haptenu) alebo priame Konečnaacute vizualizaacutecia je najčastejšie zabezpečenaacute fluoreskujuacutecimi farebnyacutemi značkami farbivami fluorochroacutemami (fluorofoacuterami) Pri priamom značeniacute je farbička kovalentne naviazanaacute na nukleotid a na zachytenie fluorescencie suacute potrebneacute špeciaacutelne priacutestroje umožňujuacutece excitaacuteciu farbičky ktoraacute potom emituje žiarenie určitej vlnovej dĺžky (emisneacute žiarenie) a to zachytiacute detekčnyacute systeacutem priacutestroja Využitie fluorochroacutemov v molekulaacuternej genetike je masiacutevne napr na vizualizaacuteciu NK elektroforeticky separovanyacutech v geacuteli kvantifikaacuteciu produktov PCR reakcie v priacutestroji real-time PCR cykleacuter sekvenovaniacute fragmentačnej analyacuteze FISH DNA mikročipoch atď

40

Obr 35 Princiacutep Southern blotu

82 FISH (fluorescenčnaacute in situ hybridizaacutecia)

FISH (fluorescent in situ hybridization fluorescenčnaacute in situ hybridizaacutecia) metoacuteda patriacute medzi molekulovo-cytogenetickeacute techniky Princiacutep FISH metoacutedy je založenyacute na hybridizaacuteciiacute fluorescenčne značenyacutech proacuteb ku komplementaacuternym uacutesekom vyšetrovanej DNA na podložnom skle (priamo na mieste - in situ) K denaturaacutecii dsDNA dochaacutedza buď vplyvom denaturačnyacutech činidiel alebo zvyacutešenou teplotou a naacuteslednou renaturaacuteciou dochaacutedza k naviazaniu sondy na komplementaacuterny uacutesek DNA Vyacutesledok hybridizaacutecie sa vizualizuje fluorescenčnyacutem mikroskopom vybavenyacutem vhodnyacutemi fluorescenčnyacutemi filtrami a vizuaacutelne zhodnotiacute skuacutesenyacutem odborniacutekom Fluorescencia sa v niektoryacutech priacutepadoch mocircže zaznamenať a hodnotiť aj pomocou softveacuteru (obr 36)

Pomocou FISH detegujeme numerickeacute aberaacutecie - zmeny v počte chromozoacutemov (napr trizoacutemia monozoacutemia chromozoacutemov) alebo štruktuacuterne aberaacutecie a prestavby (napr translokaacutecie inverzie deleacutecie duplikaacutecie amplifikaacutecie) FISH metoacuteda umožňuje identifikaacuteciu a detekciu každeacuteho ľudskeacuteho chromozoacutemu jeho zaradenie do karyotypu odhalenie malyacutech submikroskopickyacutech chromozoacutemovyacutech zmien a tiež mapovať poziacutecie jednotlivyacutech geacutenov na chromozoacuteme

41

Obr 36 Princiacutep štandardnej FISH a FISH maľovania celeacuteho chromozoacutemu

Veľkou vyacutehodou FISH metoacutedy je možnosť analyacutezy buniek v metafaacuteze aj v interfaacuteze kedy nie je nutnaacute kultivaacutecia buniek a tiež ryacutechle analyzovanie veľkeacuteho počtu buniek (stovky až tisiacutece) K ďalšiacutem vyacutehodaacutem patriacute bezpečnosť vysokaacute citlivosť dostatočnaacute stabilita relatiacutevne kraacutetky čas hybridizaacutecie a možnosť ryacutechleho vyhodnotenia Hybridizaacutecia pri vaumlčšine suacutečasne dodaacutevanyacutech sond trvaacute 10-12 hodin (na trhu suacute už dostupneacute aj sondy so skraacutetenyacutem časom hybridizaacutecie na 2-3 hodiny) Po hybridizaacuteciiacute nasleduje odmyacutevanie kedy pri priacuteslušnej teplote dochaacutedza k odmytiu nenaviazanyacutech a nespraacutevne hybridizovanyacutech sond Preparaacutet sa naacutesledne podfarbiacute a vyacutesledok sa zhodnotiacute vo fluorescenčnom mikroskope Na podfarbenie chromozoacutemov alebo jadier sa použiacuteva modreacute kontrastneacute farbivo DAPI (46-diamidino-2-fenylindol) ktoreacute maacute silneacute fluorescenčneacute vlastnosti dokaacuteže prechaacutedzať jadrovou membraacutenou a viazať sa na DNA Vyacutesledkom je modreacute zafarbenie ktoreacute vyacuteborne kontrastuje so signaacutelmi jednotlivyacutech sond

Limitujuacutecim faktorom FISH je možnosť identifikaacutecie len tyacutech uacutesekov DNA ku ktoryacutem suacute použiteacute sondy V jednej analyacuteze je možneacute použiť najviac 3 odlišne značeneacute sondy a tak zistiť priacutepadneacute abnormality len na 1 alebo na paacuter lokusoch Na relevantnuacute detekciu je potrebneacute mať vo vzorke 1-5 aberantnyacutech interfaacutezovyacutech jadier

FISH je možneacute uskutočniť na širokej škaacutele biologickeacuteho materiaacutelu na vzorkaacutech perifeacuternej krvi kostnej drene naacuteteroch choriovyacutech klkoch plodovej vode rocircznych druhov tkaniacutev natiacutevnych alebo zaliatych v parafiacutene na 1 bunke (predimplantačnaacute genetickaacute diagnostika PGD) (obr 37)

Využiacuteva sa na detekciu aberaacuteciiacute pri mnohyacutech onkologickyacutech ochoreniach (napr pri diagnoacuteze mnohopočetnyacute myeloacutem sa v suacutečasnosti po separaacutecii CD138+ buniek robiacute FISH s 5 sondami pre geacuteny IGH TP53 RB1 oblasť 1p321q21 a stanovuje sa hyperploidia chromozoacutemov 5 9 a 15) a tiež k spresneniu doplneniu a k overeniu bežneacuteho cytogenetickeacuteho vyšetrenia

Podľa miesta na chromozoacuteme na ktorom dochaacutedza k hybridizaacutecii sondy rozlišujeme 4 typy

DNA sond bull centromeacuteroveacute sondy ndash sa viažu na strednuacute časť chromozoacutemu ndash centromeacuteru sluacutežia k diagnostike zmien v počte chromozoacutemov k detekcii chromozoacutemov neznaacutemeho pocircvodu umožňujuacute interfaacuteznu FISH na nedeliacich sa bunkaacutech (obr 38-41)

42

Obr 37 Interfaacutezna FISH preimplantačnyacute genetickyacute skriacutening aneuploidiiacute ndash blastomeacutera 3-denneacuteho ľudskeacuteho embrya s normaacutelnym počtom chromozoacutemov 13 18 21 pohlavie XY použityacutech 5 sond pre chromozoacutemy 13 ndash orange 18 ndash aqua 21 ndash green X ndash blue a Y ndash yellow (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

Obr 38 Interfaacutezne jadro po hybridizaacutecii s centromeacuterovou sondou pre chromozoacutem 8 (Vysis Abbott) V pravom jadre je priacutetomnaacute trizoacutemia chromozoacutemu 8 (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex) Obr 39 Metafaacutezna (A) a interfaacutezna FISH (B) použitaacute centromeacuterovaacute sonda CEPX spectrum orangeCEPY spectrum green (Vysis Abbott) Sonda hybridizuje k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (červenyacute signaacutel) a Y (zelenyacute signaacutel) (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

43

Obr 40 Interfaacutezna FISH vyšetrenie spermiiacute použiteacute sondy CEPX greenCEPY orange (Aneuscore Metasystems) Sondy hybridizujuacute k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (zelenyacute signaacutel) Y (červenyacute signaacutel) vľavo ndash dve haploidneacute spermie (majuacutece jedna spermia X druhaacute Y chromozoacutem) vpravo ndash dve patologickeacute spermie obsahujuacutece gonozoacutemovyacute komplement XY (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

Obr 41 Interfaacutezna FISH vyšetrenie spermiiacute použiteacute sondy CEPX greenCEPY orange a CEP18 aqua (Aneuscore Metasystems) Sondy hybridizujuacute k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (zelenyacute signaacutel) Y (červenyacute signaacutel) a 18 (modryacute signaacutel) vľavo ndash normaacutelne haploidneacute ľudskeacute spermie - 1x chromozoacutem X alebo Y a jedenkraacutet chromozoacutem 18 v strede ndash patologickaacute spermia obsahujuacuteca gonozoacutemovyacute komplement XY a jeden chromozoacutem 18 vpravo ndash patologickaacute diploidnaacute spermia s chromozoacutemami X Y a dvoma chromozoacutemami 18 (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

bull lokusovo špecifickeacute sondy ndash hybridizaacutecia prebehne na konkreacutetnom mieste geacutenu (lokuse) (obr 42-44) použiacutevajuacute sa k vyšetreniu mikrodeleacuteciiacute (straty malyacutech častiacute chromozoacutemu pri mikrodelečnyacutech syndroacutemoch) k zisteniu amplifikaacutecie onkogeacutenov a niektoryacutech špecifickyacutech translokaacuteciiacute prestavby geacutenov umožňujuacute interfaacuteznu FISH na nedeliacich sa bunkaacutech bull subtelomeroveacute ndash vaumlzba na koncoveacute časti chromozoacutemu ndash telomeacutery bull celochromozoacutemoveacute alebo celomaľovacie sondy ndash sondy hybridizujuacute s mnohopočetnyacutemi chromozoacutemovyacutemi sekvenciami pričom sa fluorescenčne tak bdquovymaľujeldquo celyacute chromozoacutem (Obr 45) Použiacutevajuacute sa na vyšetrenie chromozoacutemovyacutech prestavieb k analyacuteze translokaacuteciiacute a k detekcii pocircvodu tzv marker chromozoacutemov (malyacutech nadpočetnyacutech chromozoacutemov neznaacutemeho pocircvodu) K použitiu sondy suacute potrebneacute metafaacutezne chromozoacutemy nepoužiacutevaju sa pre interfaacuteznu FISH

Pri konvenčnej chromozoacutemovej FISH suacute homogeacutenne DNA proacuteby hybridizovaneacute s fixovanyacutem metafaacuteznym alebo prometafaacuteznym chromozoacutemomchromozoacutemami na skliacutečku (Obr 36a) Maximaacutelna rozlišovacia schopnosť metafaacuteznej FISH je niekoľko megabaacutez (Obr 39a 45) využitiacutem viac

44

natiahnutyacutech prometafaacuteznych chromozoacutemov sa dosiahne 1 Mb rozliacutešenie Prostredniacutectvom fiber FISH konkreacutetne artificiaacutelne deproteinizovanej natiahnutej DNA pripravenej in situ z celyacutech buniek na mikroskopickom skliacutečku je možneacute vizualizovať individuaacutelne geacuteny maleacute DNA elementy na chromozoacuteme s rozliacutešeniacutem okolo 1000 bp

Obr 42 Interfaacutezne jadro po hybridizaacutecii s lokusovo-špecifickou sondou LSI 5q31 Spectrum Orange5p12 Spectrum Green (Vysis Abbott) Na ľavom obraacutezku suacute priacutetomneacute dva červeneacute (5q31) a dva zeleneacute signaacutely (5p12) v pravom jadre je priacutetomnaacute deleacutecia 5q31 oblasti chyacuteba jeden červenyacute signal (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

Obr 43 Interfaacutezna FISH použitaacute lokusovo-špecifickaacute sonda ndash translokačnaacute - XL BCRABL1 plus (Metasystems) dvojfarebnaacute dvojfuacutezna kde červenaacute označuje lokus ABL1 na chromozoacuteme 9 a zelenaacute oblasť BCR na chromozoacuteme 22 Sonda deteguje fuacuteziu protoonkogeacutenu ABL1 (9q34) a geacutenu BCR (22q11) v priacutepade že červenyacute a zelenyacute signaacutel suacute pri sebe (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

45

Obr 44 Interfaacutezna FISH Použitaacute lokusovo-špecifickaacute sonda- typ break apart pre IGH geacuten V docircsledku translokaacutecie došlo k rozskočeniu geacutenu pričom translokačneacuteho partnera nepoznaacuteme vieme určiť len percento v koľkyacutech jadraacutech je geacuten prestavanyacute (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex) Obr 45 Použiteacute celochromozoacutemoveacute sondy WCP 15 (červenyacute chromozoacutem) a WCP 17 (zelenyacute chromozoacutem) Na metafaacuteze je potvrdenaacute reciprokaacute translokaacutecia t(1517)(q2221) (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

FISH vizualizaacutecia celeacuteho chromozoacutemu maľovanie chromozoacutemu anglicky chromosome

painting je špeciaacutelnou aplikaacuteciou chromozoacutemovej FISH proacuteba je koktail veľkeacuteho počtu rocircznych fluorescenčne značenyacutech DNA fragmentov hybridizujuacutecich pozdĺž celeacuteho konkreacutetneho chromozoacutemu (obr 36b 45) bdquoChromosomepaintingldquo analyzuje metafaacutezne chromozoacutemy V minulosti bola FISH vizualizaacutecia celyacutech chromozoacutemov limitovanaacute malyacutem množstvom rocirczne sfarbenyacutech fluorochroacutemov

V suacutečasnosti je možneacute detegovať množstvo cieľovyacutech sekvenciiacute naraz čo sa využiacuteva pri celogenoacutemovej chromozoacutemovej vizualizaacutecii (whole-chromosomepainting - WCP) metoacutedou multiplex FISH (M-FISH multicolor FISH o br 46) alebo spektraacutelnej karyotypizaacutecie (SKY) kedy možno rozliacutešiť všetky ľudskeacute chromozoacutemy ndash teda 24 rocircznych chromozoacutemov M-FISH a SKY patria medzi metafaacutezne formy FISH diagnostiky ktoreacute umožňujuacute simultaacutennu vizualizaacuteciu všetkyacutech ľudskyacutech chromozoacutemov v rocircznych farbaacutech čo predstavuje uľahčenie analyacutezy karyotypu hlavne pri komplexnyacutech zmenaacutech a markeroch neznaacutemeho pocircvodu Obe techniky vychaacutedzajuacute z použitia

46

celochromozoacutemovyacutech sond značenyacutech kombinaacuteciou viaceryacutech fluorochroacutemov Rozdiel medzi M-FISH a SKY spočiacuteva v technike ziacuteskania konečneacuteho obrazu

Obr 46 Multicolor FISH - každyacute chromozoacutemovyacute paacuter je zafarbenyacute inou farbou pričom na ich zafarbenie postačuje kombinaacutecia 5 fluorochroacutemov Na vyhodnocovanie je potrebnaacute špeciaacutelna sada fluorescenčnyacutech filtrov pre jednotliveacute fluorochroacutemy a špeciaacutelnyacute softweacuter Vľavo-štandardnyacute karyotyp vpravo karyotyp s mutaacuteciami (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

V molekulovej cytogenetike suacute komerčne dostupneacute sety M-FISH proacuteb umožňujuacutece

viacfarebneacute pruacutežkovanie chromozoacutemov (banding) s vysokyacutem rozliacutešeniacutem (multicolor-banding mBAND FISH MCB) čo umožňuje identifikaacuteciu intrachromozoacutemovyacutech prestavieb (Obr 47) Nevyhnutnosťou mBAND-u je mať chromozoacutemy v metafaacuteze Taacuteto metoacuteda bola prvyacutekraacutet uskutočnenaacute na chromozoacuteme 5 v roku 1999 mBAND FISH umožňuje rozliacutešiť špecifickeacute oblasti chromozoacutemov na uacuterovni pruacutežku - bandu a sub-bandu s detekciou 550 bandov haploidneacuteho karyotypu

Obr 47 A - mBAND chromozoacutemu 11 - inverzia duplikovanej oblasti 11q223-q25 B - mBAND chromozoacutemu 3 - na kruhovom chromozoacuteme deleacutecia oblasti 3p263 C - mBAND chromozoacutemu 2 - potvrdenie inverzie duplikovanej časti chromozoacutemu (poskytnuteacute RNDr Dagmar Landlovou Medirex)

FISH metoacuteda a jej varianty (M-FISH mBAND SKY) majuacute v suacutečasnosti širokeacute využitie v

klinickej genetike v onkologickej genetike na detekciu aberaacuteciiacute v čase diagnoacutezy počas liečby po

47

liečbe monitorovanie po transplantaacutecii kostnej drene v prenataacutelnej a postnataacutelnej diagnostike pri detekcii submikroskopickyacutech deleacuteciiacute (napr DiGeorge syndroacutem - 22q112 delečnyacute syndroacutem PraderndashWilli syndroacutem- chromozoacutem 15q11-13) prostredniacutectvom FISH je možnaacute detekcia numerickyacutech zmien chromozoacutemov (trizoacutemia chromozoacutemu 21 pri Downovom syndroacuteme trizoacutemia chromozoacutemu 15 pri Patauovom syndroacuteme trizoacutemia chromozoacutemu 18 pri Edwardsovom syndroacuteme) rocirczne zmeny v počte pohlavnyacutech chromozoacutemov (monozoacutemia X pri Turnerovom syndroacuteme Klinefelterov syndroacutem s X chromozoacutemom naviac - XXY) podobne v predimplantačnej diagnostike

83 DNA Microarray (DNA mikro čip biočip) DNA mikročipovanie je technika využiacutevajuacuteca hybridizaacuteciu skuacutemanej nukleovej kyseliny

(cieľovaacute vzorka) s veľkyacutem množstvom oligonukleotidovyacutech proacuteb (desať tisiacutec až milioacuten) ktoreacute suacute prichyteneacute na pevnyacute podklad najčastejšie sklenyacute silikoacutenovyacute alebo nylonovyacute (doštička čip) Skuacutemanaacute nukleovaacute kyselina je pred hybridizaacuteciou fragmentovanaacute označenaacute fluorofoacuterom a denaturovanaacute Po kontakte čipu s cieľovou vzorkou ktoraacute je vlastne zmes označenyacutech oligonukleotidov značeneacute oligonukleotidy hybridizujuacute s oligonukleotidovyacutemi sekvenciami prichytenyacutemi na čipe Potom suacute na zaacuteklade fluorescencie detekovaneacute miesta kde došlo k hybridizaacutecii čiže vzorka obsahovala takuacuteto nukleotidovuacute sekvenciu Z jedneacuteho mikročipu sa ziacuteska obrovskeacute množstvo daacutet ktoreacute je vždy nutneacute softveacuterovo spracovať V dnešnej dobe existuje niekoľko firiem poskytujuacutecich komerčne mikročipy na objednaacutevku alebo si ich laboratoacuteria produkujuacute sami

Mikročipovanie prebieha nasledovne

1) Vytvorenie DNA čipu ndash tisiacutece rocircznych jednovlaacuteknovyacutech DNA oligonukleotidov znaacutemych sekvencii sa kovalentne naviažu na povrch doštičky vždy v určitej lokalite je niekoľko rovnakyacutech oligonukleotidov veľkosť takejto lokality je ˂ 200 microm Proacutebami mocircže byť DNA cDNA alebo syntetizovaneacute oligonukleotidy Už hotoveacute mikročipy ponuacutekajuacute viacereacute firmy (Affymetrix Agilent Technologies Eppendorf Illumina) alebo si ich jednotliveacute laboratoacuteria vyraacutebajuacute sami pomocou robotickyacutech zariadeniacute DNA čip sa vytvaacutera buď nanaacutešaniacutem kvapiek oligonukleotidov na podklad alebo synteacutezou oligonukleotidov in situ na čipe 2) Priacuteprava vzorky ndash nukleovaacute kyselina (mRNA DNA) sa purifikuje určiacute sa jej kvantita a kvalita (spektrofotometericky) fragmentuje resp v priacutepade mRNA sa syntetizuje cDNA v priacutepade potreby sa mocircže DNA amplifikovať PCR reakciou štiepiť restrikčnyacutemi endonukleaacutezami 3) Fluorescenčneacute označenie (zriedkavejšie raacutedioaktiacutevne) fragmentov DNA prebieha počas reverznej transkripcie alebo PCR amplifikaacutecie za uacutečasti fluorescenčne značenyacutech nukleotidov Keď sa analyzujuacute dve rocirczne vzorky napr zdraveacute tkanivo a naacutedoroveacute tkanivo označenie nukleovyacutech kyseliacuten v tyacutechto tkanivaacutech byacuteva rozdielne a to použitiacutem dvoch rocircznych fluorescenčnyacutech farbiacutev (napr zeleneacute a červeneacute) Pred hybridizaacuteciou je potrebneacute vzorku denaturovať čiacutem sa vytvoriacute zmes jednovlaacuteknovyacutech DNA označenyacutech značkou 4) Hybridizaacutecia s mikročipom ndash v špeciaacutelnom hybridizačnom roztoku hybridizujuacute komplementaacuterne sekvencie zo vzorky s priacuteslušnyacutemi oligonukleotidovyacutemi sondami naviazanyacutemi na čipe Potom sa čip obmyje aby došlo k odstraacuteneniu čiastočne hybridizovanyacutech nukleovyacutech kyseliacuten 5) Skenovanie mikročipu ndash skenerom čipov docircjde k ožiareniu čipu laserom pričom v mieste hybridizaacutecie fluorescenčne značenyacutech DNA fragmentov s proacutebou docircjde k emisii svetla určitej vlnovej dĺžky ktoruacute skener zaznamenaacute 6) Analyacuteza daacutet prebieha metoacutedami bioinformatiky spracovaniacutem softveacutermi sa zistiacute ktoreacute lokality čipu navzaacutejom hybridizovali v priacutepade použitia dvoch vzoriek kontrolnej a skuacutemanej je možneacute analyzovať ich relatiacutevnu intenzitu hybridizaacutecie (expresie určiteacuteho geacutenu)

Existujuacute štyri typy mikročipov 1) Čipy ur čeneacute na analyacutezu expresie (obsahujuacute cDNA proacuteby) pre tzv dvojkanaacutelovyacute experiment kedy je vzorka určenaacute k hybridizaacutecii na čipe ziacuteskanaacute zmiešaniacutem DNA fragmentov kontrolnej a skuacutemanej vzorky pričom fragmenty suacute rozdielne fluorescenčne označeneacute (napr zelenyacute fluorofoacuter pre kontrolnuacute vzorku a červenyacute pre skuacutemanuacute) Na zaacuteklade intenzity a typu fluorescencie sa deteguje expresia geacutenov typickaacute pre kontrolnuacute vzorku (napr zelenaacute fluorescencia) pre skuacutemanuacute vzorku (napr

48

červenaacute fluorescencia) a expresia podobnaacute u oboch vzoriek (žltaacute fluorescencia) neexprimovaneacute geacuteny (čierna fluorescencia) rocirczne odtiene (v zaacutevislosti od prevažujuacutecej hybridizaacutecie) (obr 48) 2) Čipy ur čeneacute na analyacutezu mutaacutecii použije sa genoacutemovaacute DNA označenaacute jednou fluorescenčnou farbičkou na určenie jednonukleotidovej zmeny (SNP ndash Single Nukleotide Polymorphism) 3) Čipy na komparatiacutevnu genoacutemovuacute hybridizaacuteciu (aCGH array Comparative Genomic Hybridization) ndash použiacutevaneacute na zistenie zvyacutešenia alebo zniacuteženia množstva chromozoacutemovyacutech fragmentov obsahujuacutecich geacuteny zodpovedneacute za určiteacute ochorenie Na analyacutezu sa použije skuacutemanaacute gDNA a referenčnaacute (kontrolnaacute) DNA každaacute sa značiacute inou fluorescenčnou farbičkou (princiacutep ako pri analyacuteze expresie) (obr 49 50) 4) Čipy CGH - SNP kombinovaneacute čipy ur čeneacute na analyacutezu aj mutaacuteciiacute SNP aj na komparatiacutevnu genoacutemovuacute hybridizaacuteciu CGH

Mikročipy majuacute rozsiahle využitie napriacuteklad v identifikaacuteciiacute novyacutech geacutenov vo vyacuteskume ich funkciiacute expresie v rocircznych podmienkach pri diagnostike mnohyacutech ochoreniacute vo farmakogenomike vo vyacuteskume vplyvu toxiacutenov

Obr 48 Heatmapa geacutenovej expresie vybranyacutech geacutenov (mRNA) mikročip obsahuje 46000 cDNA proacuteb (poskytnuteacute Ing Helenou Gbelcovou PhD Uacutestav lekaacuterskej bioloacutegie genetiky a klinickej genetiky LF UK a UNB)

49

Obr 49 Princiacutep komparatiacutevnej genoacutemovej hybridizaacutecie (aCGH - array comparative genomic hybridization) Obr 50 A) Vyacutesledok komparatiacutevnej genoacutemovej hybridizaacutecie (aCGH - array comparative genomic hybridization) vzorky DNA izolovanej plodovej vody U plodu s abnormaacutelnym ultrasonografickyacutem vyšetreniacutem bola identifikovanaacute duplikaacutecia oblasti 3q261q29 (modryacute paacutes) a deleacutecia oblasti 5p1533p151 (červenyacute paacutes) Pre porovnanie chromozoacutem 1 bez aberaacutecie b) Ten istyacute pacient ale ineacute softveacuteroveacute spracovanie (poskytnuteacute RNDr Miroslavom Tomkom PhD Medirex)

50

Odporuacutečanaacute a použitaacute literatuacutera

Odborneacute knihy Klug W S Cummings M R Spencer Ch A Palladino M A Concepts of Genetics jedenaacuteste vydanie (2015) Carson S Molecular Biology Techniques tretie vydanie (2012) Strachan T Read A Human Molecular Genetics štvrteacute vydanie (2011) Sudbery P Sudbery I Human Molecular Genetics tretie vydanie (2009)

Internetoveacute straacutenky

wwwncbinlmnihgov wwwmlpacom wwwthermofishercom wwwilluminacom wwwpromegask wwwqiagencom wwwambioncom

Odborneacute člaacutenky Chacon-Cortes D Griffiths L R Methods for extracting genomic DNA from whole blood samples current perspectives Journal of Biorepository Science for Applied Medicine Volume 2 strany 1- 9 Viltrop T Krjutskov K Palta P Metspalu A Comparison of DNA extraction methods for multiplex polymerase chain reaction Anal Biochem 2010 Volume 398(2) strany 260-262 Ing Martin Čermaacutek Molekulaacuterna cytogenetika v problematike familiaacuternych maligniacutet Onkoloacutegia Volume 2 strany 77 - 83 Livak KJ Schmittgen TD Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method Methods 2001 Volume 25(4) strany 402 - 408 Bustin S A Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays J Mol Endocrinol 2000 Volume 25(2) strany169 - 193

MOLEKULAacuteRNE METOacuteDY AKTUAacuteLNE POUŽIacuteVANEacute V KLINICKEJ GENETIKE RNDr Andrea Pastoraacutekovaacute PhD RNDr Robert Petrovič PhD Vydala Univerzita Komenskeacuteho v Bratislave Lekaacuterska fakulta Rozsah 50 straacuten 246 AH prveacute vydanie ISBN 978-80-223-4231-5

34

Obr 30 Princiacutep sekvenovania Sangerova dideoxy metoacuteda alebo tzv chain termination method (reťazec zastavujuacuteca metoacuteda) Obr 31 Určenie genotypu plodu a rodičov sekvenčnou analyacutezou DNA ziacuteskanej z plodovej vody (prenataacutelna diagnostika) a perifeacuternej krvi sekvenčnaacute analyacuteza geacutenu ASPA vyacutesledok u plodu priacutetomnaacute mutaacutecia c 914CgtA v homozygotnom stave (AA) rodičia heterozygoti (AC) Uvedenaacute mutaacutecia je v homozygotnom stave kauzaacutelnou priacutečinou Canavanovej choroby

Automatizovaneacute sekvenovanie prinaacuteša viacereacute vyacutehody oproti klasickej Sangerovej metoacutede vyššiu presnosť a ryacutechlosť v jednej sekvenačnej reakcii možnosť osekvenovať až 1200 nukleotidovyacute fragment maleacute množstvo templaacutetu potrebneacute na analyacutezu

35

63 Next Generation Sequencing (NGS)

NGS (sekvenovanie novej generaacutecie) maacute obrovskyacute potenciaacutel v analyacuteze genoacutemov pričom toto označenie zahŕňa viacereacute technologickeacute metoacutedy reprezentovaneacute niekoľkyacutemi firmami Princiacutepom je masiacutevne paralelneacute sekvenovanie čiacutem sa ziacuteskajuacute raacutedovo tisiacutece až milioacuteny sekvenciiacute naraz 631 Sekvenovanie druhej generaacutecie

Na začiatku sa analyzovanaacute DNA vo vaumlčšine priacutepadov fragmentuje (vznikne tak DNA

knižnica) na fragmenty sa pripoja kraacutetke sekvencie ndash adapteacutery naacutesledne sa tieto fragmenty rocircznymi priacutestupmi amplifikujuacute a určiacute sa ich sekvencia Vďaka čiastočnyacutem prekryvom je zo ziacuteskanyacutech sekvencii možneacute poskladať plynuluacute sekvenciu zodpovedajuacutecu pocircvodnej nefragmentovanej DNA

Pyrosekvenovanie je podobne ako Sangerova metoacuteda založenaacute na princiacutepe synteacutezy komplementaacuterneho vlaacutekna DNA avšak rozdiel je v tom že sa na detekciu inkorporaacutecie nukleotidu využiacuteva inyacute systeacutem tvorby luminiscenčneacuteho signaacutelu v priebehu reakcie Pyrosekvenovanie je umožneneacute vďaka aktivite 4 enzyacutemov - DNA polymeraacutezy ATP sulfurylaacutezy luciferaacutezy a apyraacutezy Reakčnaacute zmes obsahuje aj ďalšie komponenty - enzymatickeacute substraacutety adenoziacutenfosfosulfaacutet (APS) d-luciferiacuten sekvenovanyacute templaacutet a cyklicky postupne po jednom type pridaacutevaneacute nukleotidtrifosfaacutety Po zabudovaniacute nukleotidu do novovznikajuacuteceho reťazca docircjde k uvoľneniu pyrofosfaacutetu naacutesledne je využityacute ATP sulfurylaacutezou na synteacutezu ATP z APS počas ďalšej reakcie docircjde k využitiu ATP luciferaacutezou na premenu luciferiacutenu na oxyluciferiacuten čo spocircsobiacute svetelnyacute signaacutel a ten zaznamenaacute detekčnyacute systeacutem Poslednou enzymatickou reakciou je reakcia apyraacutezy ktoraacute odstraacuteni nezainkorporovaneacute nukleotidy a nevyužiteacute ATP aby sa celyacute proces mohol zopakovať s reakčnou zmesou obsahujuacutecou ďalšiacute nukleotidtrifosfaacutet (inyacute ako v predchaacutedzajuacutecej reakcii) Po každej reakcii detektor zaznamenaacuteva emisiu svetla na zaacuteklade intenzity svetla je možneacute určiť či bol vradenyacute priacuteslušnyacute nukleotidtrifosfaacutet či bol inkorporovanyacute jeden priacutepadne viac rovnakyacutech nukleotidtrifosfaacutetov

Zvyacutešenie vyacutekonu pyrosekvenovania umožnila tzv emulznaacute PCR v mikročasticiach a použitie platničky PicoTiterPlatereg toto sekvenovanie zaviedla firma Roche pod pojmom 454 pyrosekvenovanie v roku 2005 Na začiatku sa DNA fragmentuje na uacuteseky dlheacute 400-600 baacutez dvojvlaacuteknovaacute fragmentovanaacute DNA sa liguje s adapteacutermi prostredniacutectvom nich sa naviaže na mikročastice dvojvlaacuteknoveacute fragmenty sa oddelia mikročastice s naviazanyacutemi jednovlaacuteknovyacutemi fragmentami sa premiešajuacute so zmesou oleja a roztoku ktoryacute obsahuje všetky komponenty na uacutespešnuacute PCR Tyacutemto spocircsobom sa okolo každej mikročastice vytvoriacute vlastnyacute mikroreaktor v ktorom prebehne amplifikaacutecia fragmentu Po PCR reakcii sa mikročastice prenesuacute do platničky PicoTiterPlate v ktorej sa do jamky zmestiacute akuraacutet jedna mikročastica a reakčneacute komponenty pyrosekvenačnej reakcie PicoTiterPlatereg maacute 1 600 000 jamiek každaacute jamka maacute maximaacutelny objem 75 picolitra Platnička s mikročasticami sa vložiacute do sekvenačneacuteho systeacutemu ndash priacutestroja v ktorom sa celeacute pyrosekvenovanie uskutočniacute Chemiluminiscenčneacute signaacutely ktoryacutech počas sekvenovania vznikajuacute milioacuteny v priebehu hodiny suacute zachyteneacute CCD kamerou a analyzovaneacute softveacuterom

Firma Illumina predstavila inuacute technoloacutegiu PCR amplifikaacutecia a sekvenovanie sa uskutočňuje na skliacutečku (flow cell) Fragmentaacutecia DNA a pripojenie adapteacuterov prebieha za uacutečasti transpozoacutemov v procese nazvanom tagmentaacutecia Po hybridizaacutecii fragmentov DNA na skliacutečko prebehne v klastroch PCR amplifikaacutecia (tzv mostiacutekovaacute amplifikaacutecia) sekvenaacutecia prebieha za uacutečasti rozdielne fluorescenčne značenyacutech a chemicky modifikovanyacutech nukleotidov pričom každyacute nukleotid emituje fluorescenciu s inou vlnovou dĺžkou Na skliacutečku prebieha paralelne až 6 miliaacuterd sekvenaacutecii (obr 32)

Ďalšiacutemi možnosťami sekvenovania druhej generaacutecie je systeacutem SOLid (vyvinutyacute firmou Applied Biosystem dnes pod Thermo Fisher Scientific) a Ion Semiconductor Sequencing ndash polovodičoveacute ioacutenoveacute sekvenovanie (od firmy Ion Semiconductor Sequencing v suacutečasnosti Thermo Fisher Scientific)

36

Obr 32 Princiacutep sekvenovania novej generaacutecie od firmy Illumina PCR amplifikaacutecia a sekvenovanie sa uskutočňuje na skliacutečku (flow cell) paralelne prebieha až 6 miliaacuterd sekvenaacutecii

632 Sekvenovanie tretej generaacutecie

Pred sekvenovaniacutem netreba amplifikovať DNA PCR metoacutedou ale sekvencia sa ziacuteskava zachyteniacutem signaacutelu v reaacutelnom čase Medzi sekvenovanie tretej generaacutecie patriacute SMRT (Single Molecule Real-Time Sequencing) a Nanopore Sequencing

37

7 Fragmentačnaacute analyacuteza DNA

Je metoacuteda použiacutevanaacute na určenie veľkosti fragmentov DNA ziacuteskanyacutech PCR reakciou Dĺžka amplifikovanyacutech DNA fragmentov sa zistiacute ich porovnaniacutem s veľkostnyacutem štandardom (obr 33) ktoryacute je tvorenyacute DNA fragmentami znaacutemej dĺžky Veľkostnyacute štandard je pred kapilaacuternou elektroforeacutezou zmiešanyacute so vzorkou DNA fragmenty veľkostneacuteho štandardu suacute fluorescenčne označeneacute pričom použiteacute fluorescenčneacute farbivo je ineacute ako fluorescenčneacute farbivo použiteacute na označenie DNA fragmentov vo vyšetrovanej vzorke

Obr 33 Elektroforetogram veľkostneacuteho štandardu použiacutevaneacuteho na určenie veľkostiacute fragmentov analyzovanyacutech kapilaacuternou elektroforeacutezou v genetickom analyzaacutetore (GeneScantrade 500 LIZtrade dye Size Standard) dĺžka fragmentov v nukleotidoch (napr 50 nukleotidov)

Fragmentačnaacute analyacuteza pozostaacuteva z viaceryacutech krokov Prvyacutem je izolaacutecia DNA nasleduje PCR amplifikaacutecia počas ktorej sa novosyntetizovaneacute DNA fragmenty označia fluorescenčnyacutemi farbivami Vzorka s PCR produktom sa pripraviacute na kapilaacuternu elektroforeacutezu tak že sa zmieša s veľkostnyacutem štandardom (sluacuteži na určenie veľkosti fragmentov) a denaturačnou laacutetkou (formamid) nasleduje denaturaacutecia Pripraveneacute vzorky suacute injektovaneacute do priacutestroja (genetickyacute analyzaacutetor) kde v kapilaacutere naplnenej polymeacuterom v elektrickom poli migrujuacute fluorescenčne značeneacute fragmenty DNA na zaacuteklade veľkosti (kapilaacuterna elektroforeacuteza) Počas elektroforeacutezy genetickyacute analyzaacutetor zaznamenaacuteva fluorescenciu fragmentov Analyacutezou daacutet prostredniacutectvom špeciaacutelnych softveacuterov sa ziacuteskajuacute elektroforetogramy z ktoryacutech je možneacute zistiť veľkosť fragmentov ako aj typ fluorescencie (docircležiteacute ak suacute genetickeacute varianty rozliacutešiteľneacute rocircznou fluorescenciou napr SNaPshot) Fragmentačnaacute analyacuteza je suacutečasťou množstva molekulaacuterno-genetickyacutech metoacuted (pozri obr 12 26 28 29 34) ako suacute napr STR analyacuteza (Short Tandem Repeat) AFLP analyacuteza (Amplified Fragment Lenght Polymorfism) RFLPT-RFLP analyacuteza (Restriction Fragment Lenght PolymorfismTerminal Restricted Fragment Lenght Polymorfism) SSCP (Single Strand Conformation Polymorfism) VNTR (Variable Number of Tandem Repeat) analyacuteza straty heterozygotnosti (LOH loss of heterozygozity) MLPA (Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification) MSMSA (Methylation-Sensitive Mobility Shift Assay) SNP genotypovanie (SNaPshotreg) HiCEP (High-Coverage Expression Profiling)

38

Obr 34 Kvantitatiacutevna fragmentačnaacute PCR analyacuteza (QF-PCR) DNA izolovanej z plodovej vody vyacutesledok prenataacutelnej analyacutezy = priacutetomnosť troch piacutekov pre chromozoacutem 18 (u všetkyacutech fragmentov detegujuacutecich chromozoacutem 18 je pomer vyšetrovanyacutech markerov aberantnyacute 21 resp 111) čo znamenaacute trizoacutemiu chromozoacutemu 18 Edwardsov syndroacutem

39

8 Metoacutedy založeneacute na princiacutepe hybridizaacutecie

Nukleoveacute kyseliny majuacute schopnosť vytvaacuterať dvojvlaacuteknoveacute reťazce z jednovlaacuteknovyacutech molekuacutel na zaacuteklade komplementarity baacutez Komplementarita baacutez umožňuje replikaacuteciu DNA transkripciu RNA komplementarita baacutez zabezpečuje teda reprodukovateľnosť živej hmoty

Hybridizaacutecia je proces v ktorom na zaacuteklade komplementarity baacutez dochaacutedza k vytvoreniu dvojvlaacuteknovej nukleovej kyseliny z dvoch jednovlaacuteknovyacutech molekuacutel DNA alebo RNA alebo ich kombinaacuteciou DNA RNA pričom kratšia jednovlaacuteknovaacute nukleovaacute kyselina vystupuje ako sonda (proacuteba) Hybridizaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten je jeden z najpoužiacutevanejšiacutech naacutestrojov v molekulaacuternej bioloacutegii a genetike (hybridizaacutecia primerov alebo proacuteb sa využiacuteva v takmer každej metoacutede - v PCR RT-PCR qPCR RT-qPCR MLPA sekvenovaniacute fragmentačnej analyacuteze FISH DNA mikročipoch atď)

Denaturaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten je proces pri ktorom dochaacutedza k porušeniu vodiacutekovyacutech vaumlzieb medzi vlaacuteknami nukleovyacutech kyseliacuten (strata sekundaacuternej a terciaacutelnej štruktuacutery) tak že docircjde k ich uacuteplneacutemu oddeleniu vzniknuacute jednovlaacuteknoveacute reťazce Denaturaacutecia NK mocircže byť spocircsobenaacute vplyvom vysokyacutech teplocirct pH alebo chemickyacutech laacutetok (denaturačneacute činidlaacute) Renaturaacutecia je opačnyacute proces v ktorom na zaacuteklade komplementarity dochaacutedza k tvorbe dvojvlaacuteknovyacutech NK

Hybridiza čnaacute sonda (proacuteba) je jednovlaacuteknovaacute nukleovaacute kyselina určitej znaacutemej dĺžky a sekvencie (najčastejšie DNA pretože je stabilnejšia ako RNA) ktoraacute je značenaacute a sluacuteži na detekciu komplementaacuternych molekuacutel DNA alebo RNA v procese hybridizaacutecie V zaacutevislosti od podmienok hybridizaacutecie (stringencia) mocircže byť detegovanaacute sekvencia uacuteplne komplementaacuterna alebo v menej priacutesnych podmienkach mocircže mať sekvenčneacute odchyacutelky Proacuteba sluacuteži na vyhľadanie a zviditeľnenie cieľovyacutech NK Zviditeľnenie sa deje prostredniacutectvom označenia proacuteby ešte pred hybridizaacuteciou Značenie proacuteby mocircže byť raacutedioaktiacutevne a neraacutedioaktiacutevne (najčastejšie fluorescenčneacute)

Raacutedioaktiacutevne značeneacute proacuteby pomocou izotopov (32P) sa využiacutevali viac v minulosti v suacutečasnosti suacute kvocircli zdravotnyacutem rizikaacutem ohľaduplnosti k životneacutemu prostrediu ako aj kvocircli jednoduchšej manipulaacutecii použiacutevaneacute fluorescenčne značeneacute proacuteby Raacutedioaktiacutevne značeneacute sondy boli použiacutevaneacute hlavne metoacutedou Southernovej hybridizaacutecie (Southern blotting Southern blot) Citlivosť raacutedioaktiacutevne značenyacutech proacuteb je vyššia dosahuje schopnosť zachytiť 10 fg (femtogram 10-15) cieľovej DNA sekvencie 81 Southern blot

Metoacutedu objavil v roku 1975 britskyacute bioloacuteg Edwin Southern (preto Southern) Pri Southernovej hybridizaacutecii sa restrikčne štiepeneacute fragmenty DNA elektroforeticky separujuacute v geacuteli potom sa metoacutedou blottingu prenesuacute na nylonovuacute alebo nitroceluloacutezovuacute membraacutenu kde suacute naacutesledne hybridizovaneacute v roztoku obsahujuacutecom raacutedioaktiacutevne značenuacute sondu Priloženiacutem fotografickeacuteho filmu k membraacutene a vyvolaniacutem filmu autoraacutediografiou docircjde k zviditeľneniu lokaliacutet kde došlo k hybridizaacuteciiacute raacutedioaktiacutevne značenej sondy s fragmentom DNA (autoraacutediogram) Southern blot bol kľuacutečovou a prvou metoacutedou na identifikaacuteciu osocircb (DNA fingerprinting DNA pofiling) (obr 35)

Okrem Southern blotu existuje Northern blot na analyacutezu RNA (geacutenovej expresie) a Western blot na analyacutezu proteiacutenov postup je obdobnyacute ako pri Southern blote s obmenami špecifickyacutemi pre konkreacutetny blot Pri Northern blote sa použiacutevajuacute hybridizačneacute proacuteby ale pre vizualizaacuteciu proteiacutenov western blotom je potrebneacute použiť protilaacutetky s naacuteslednou vizualizaacuteciou Pomenovanie techniacutek je hra so sloviacutečkami (keďže paacuten Northern ani Western neobjavili takto nazvaneacute techniky)

Neraacutedioaktiacutevne značenie proacuteb použiacutevanyacutech v molekulaacuternej genetike mocircže byť nepriame (použitie haptenu) alebo priame Konečnaacute vizualizaacutecia je najčastejšie zabezpečenaacute fluoreskujuacutecimi farebnyacutemi značkami farbivami fluorochroacutemami (fluorofoacuterami) Pri priamom značeniacute je farbička kovalentne naviazanaacute na nukleotid a na zachytenie fluorescencie suacute potrebneacute špeciaacutelne priacutestroje umožňujuacutece excitaacuteciu farbičky ktoraacute potom emituje žiarenie určitej vlnovej dĺžky (emisneacute žiarenie) a to zachytiacute detekčnyacute systeacutem priacutestroja Využitie fluorochroacutemov v molekulaacuternej genetike je masiacutevne napr na vizualizaacuteciu NK elektroforeticky separovanyacutech v geacuteli kvantifikaacuteciu produktov PCR reakcie v priacutestroji real-time PCR cykleacuter sekvenovaniacute fragmentačnej analyacuteze FISH DNA mikročipoch atď

40

Obr 35 Princiacutep Southern blotu

82 FISH (fluorescenčnaacute in situ hybridizaacutecia)

FISH (fluorescent in situ hybridization fluorescenčnaacute in situ hybridizaacutecia) metoacuteda patriacute medzi molekulovo-cytogenetickeacute techniky Princiacutep FISH metoacutedy je založenyacute na hybridizaacuteciiacute fluorescenčne značenyacutech proacuteb ku komplementaacuternym uacutesekom vyšetrovanej DNA na podložnom skle (priamo na mieste - in situ) K denaturaacutecii dsDNA dochaacutedza buď vplyvom denaturačnyacutech činidiel alebo zvyacutešenou teplotou a naacuteslednou renaturaacuteciou dochaacutedza k naviazaniu sondy na komplementaacuterny uacutesek DNA Vyacutesledok hybridizaacutecie sa vizualizuje fluorescenčnyacutem mikroskopom vybavenyacutem vhodnyacutemi fluorescenčnyacutemi filtrami a vizuaacutelne zhodnotiacute skuacutesenyacutem odborniacutekom Fluorescencia sa v niektoryacutech priacutepadoch mocircže zaznamenať a hodnotiť aj pomocou softveacuteru (obr 36)

Pomocou FISH detegujeme numerickeacute aberaacutecie - zmeny v počte chromozoacutemov (napr trizoacutemia monozoacutemia chromozoacutemov) alebo štruktuacuterne aberaacutecie a prestavby (napr translokaacutecie inverzie deleacutecie duplikaacutecie amplifikaacutecie) FISH metoacuteda umožňuje identifikaacuteciu a detekciu každeacuteho ľudskeacuteho chromozoacutemu jeho zaradenie do karyotypu odhalenie malyacutech submikroskopickyacutech chromozoacutemovyacutech zmien a tiež mapovať poziacutecie jednotlivyacutech geacutenov na chromozoacuteme

41

Obr 36 Princiacutep štandardnej FISH a FISH maľovania celeacuteho chromozoacutemu

Veľkou vyacutehodou FISH metoacutedy je možnosť analyacutezy buniek v metafaacuteze aj v interfaacuteze kedy nie je nutnaacute kultivaacutecia buniek a tiež ryacutechle analyzovanie veľkeacuteho počtu buniek (stovky až tisiacutece) K ďalšiacutem vyacutehodaacutem patriacute bezpečnosť vysokaacute citlivosť dostatočnaacute stabilita relatiacutevne kraacutetky čas hybridizaacutecie a možnosť ryacutechleho vyhodnotenia Hybridizaacutecia pri vaumlčšine suacutečasne dodaacutevanyacutech sond trvaacute 10-12 hodin (na trhu suacute už dostupneacute aj sondy so skraacutetenyacutem časom hybridizaacutecie na 2-3 hodiny) Po hybridizaacuteciiacute nasleduje odmyacutevanie kedy pri priacuteslušnej teplote dochaacutedza k odmytiu nenaviazanyacutech a nespraacutevne hybridizovanyacutech sond Preparaacutet sa naacutesledne podfarbiacute a vyacutesledok sa zhodnotiacute vo fluorescenčnom mikroskope Na podfarbenie chromozoacutemov alebo jadier sa použiacuteva modreacute kontrastneacute farbivo DAPI (46-diamidino-2-fenylindol) ktoreacute maacute silneacute fluorescenčneacute vlastnosti dokaacuteže prechaacutedzať jadrovou membraacutenou a viazať sa na DNA Vyacutesledkom je modreacute zafarbenie ktoreacute vyacuteborne kontrastuje so signaacutelmi jednotlivyacutech sond

Limitujuacutecim faktorom FISH je možnosť identifikaacutecie len tyacutech uacutesekov DNA ku ktoryacutem suacute použiteacute sondy V jednej analyacuteze je možneacute použiť najviac 3 odlišne značeneacute sondy a tak zistiť priacutepadneacute abnormality len na 1 alebo na paacuter lokusoch Na relevantnuacute detekciu je potrebneacute mať vo vzorke 1-5 aberantnyacutech interfaacutezovyacutech jadier

FISH je možneacute uskutočniť na širokej škaacutele biologickeacuteho materiaacutelu na vzorkaacutech perifeacuternej krvi kostnej drene naacuteteroch choriovyacutech klkoch plodovej vode rocircznych druhov tkaniacutev natiacutevnych alebo zaliatych v parafiacutene na 1 bunke (predimplantačnaacute genetickaacute diagnostika PGD) (obr 37)

Využiacuteva sa na detekciu aberaacuteciiacute pri mnohyacutech onkologickyacutech ochoreniach (napr pri diagnoacuteze mnohopočetnyacute myeloacutem sa v suacutečasnosti po separaacutecii CD138+ buniek robiacute FISH s 5 sondami pre geacuteny IGH TP53 RB1 oblasť 1p321q21 a stanovuje sa hyperploidia chromozoacutemov 5 9 a 15) a tiež k spresneniu doplneniu a k overeniu bežneacuteho cytogenetickeacuteho vyšetrenia

Podľa miesta na chromozoacuteme na ktorom dochaacutedza k hybridizaacutecii sondy rozlišujeme 4 typy

DNA sond bull centromeacuteroveacute sondy ndash sa viažu na strednuacute časť chromozoacutemu ndash centromeacuteru sluacutežia k diagnostike zmien v počte chromozoacutemov k detekcii chromozoacutemov neznaacutemeho pocircvodu umožňujuacute interfaacuteznu FISH na nedeliacich sa bunkaacutech (obr 38-41)

42

Obr 37 Interfaacutezna FISH preimplantačnyacute genetickyacute skriacutening aneuploidiiacute ndash blastomeacutera 3-denneacuteho ľudskeacuteho embrya s normaacutelnym počtom chromozoacutemov 13 18 21 pohlavie XY použityacutech 5 sond pre chromozoacutemy 13 ndash orange 18 ndash aqua 21 ndash green X ndash blue a Y ndash yellow (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

Obr 38 Interfaacutezne jadro po hybridizaacutecii s centromeacuterovou sondou pre chromozoacutem 8 (Vysis Abbott) V pravom jadre je priacutetomnaacute trizoacutemia chromozoacutemu 8 (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex) Obr 39 Metafaacutezna (A) a interfaacutezna FISH (B) použitaacute centromeacuterovaacute sonda CEPX spectrum orangeCEPY spectrum green (Vysis Abbott) Sonda hybridizuje k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (červenyacute signaacutel) a Y (zelenyacute signaacutel) (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

43

Obr 40 Interfaacutezna FISH vyšetrenie spermiiacute použiteacute sondy CEPX greenCEPY orange (Aneuscore Metasystems) Sondy hybridizujuacute k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (zelenyacute signaacutel) Y (červenyacute signaacutel) vľavo ndash dve haploidneacute spermie (majuacutece jedna spermia X druhaacute Y chromozoacutem) vpravo ndash dve patologickeacute spermie obsahujuacutece gonozoacutemovyacute komplement XY (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

Obr 41 Interfaacutezna FISH vyšetrenie spermiiacute použiteacute sondy CEPX greenCEPY orange a CEP18 aqua (Aneuscore Metasystems) Sondy hybridizujuacute k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (zelenyacute signaacutel) Y (červenyacute signaacutel) a 18 (modryacute signaacutel) vľavo ndash normaacutelne haploidneacute ľudskeacute spermie - 1x chromozoacutem X alebo Y a jedenkraacutet chromozoacutem 18 v strede ndash patologickaacute spermia obsahujuacuteca gonozoacutemovyacute komplement XY a jeden chromozoacutem 18 vpravo ndash patologickaacute diploidnaacute spermia s chromozoacutemami X Y a dvoma chromozoacutemami 18 (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

bull lokusovo špecifickeacute sondy ndash hybridizaacutecia prebehne na konkreacutetnom mieste geacutenu (lokuse) (obr 42-44) použiacutevajuacute sa k vyšetreniu mikrodeleacuteciiacute (straty malyacutech častiacute chromozoacutemu pri mikrodelečnyacutech syndroacutemoch) k zisteniu amplifikaacutecie onkogeacutenov a niektoryacutech špecifickyacutech translokaacuteciiacute prestavby geacutenov umožňujuacute interfaacuteznu FISH na nedeliacich sa bunkaacutech bull subtelomeroveacute ndash vaumlzba na koncoveacute časti chromozoacutemu ndash telomeacutery bull celochromozoacutemoveacute alebo celomaľovacie sondy ndash sondy hybridizujuacute s mnohopočetnyacutemi chromozoacutemovyacutemi sekvenciami pričom sa fluorescenčne tak bdquovymaľujeldquo celyacute chromozoacutem (Obr 45) Použiacutevajuacute sa na vyšetrenie chromozoacutemovyacutech prestavieb k analyacuteze translokaacuteciiacute a k detekcii pocircvodu tzv marker chromozoacutemov (malyacutech nadpočetnyacutech chromozoacutemov neznaacutemeho pocircvodu) K použitiu sondy suacute potrebneacute metafaacutezne chromozoacutemy nepoužiacutevaju sa pre interfaacuteznu FISH

Pri konvenčnej chromozoacutemovej FISH suacute homogeacutenne DNA proacuteby hybridizovaneacute s fixovanyacutem metafaacuteznym alebo prometafaacuteznym chromozoacutemomchromozoacutemami na skliacutečku (Obr 36a) Maximaacutelna rozlišovacia schopnosť metafaacuteznej FISH je niekoľko megabaacutez (Obr 39a 45) využitiacutem viac

44

natiahnutyacutech prometafaacuteznych chromozoacutemov sa dosiahne 1 Mb rozliacutešenie Prostredniacutectvom fiber FISH konkreacutetne artificiaacutelne deproteinizovanej natiahnutej DNA pripravenej in situ z celyacutech buniek na mikroskopickom skliacutečku je možneacute vizualizovať individuaacutelne geacuteny maleacute DNA elementy na chromozoacuteme s rozliacutešeniacutem okolo 1000 bp

Obr 42 Interfaacutezne jadro po hybridizaacutecii s lokusovo-špecifickou sondou LSI 5q31 Spectrum Orange5p12 Spectrum Green (Vysis Abbott) Na ľavom obraacutezku suacute priacutetomneacute dva červeneacute (5q31) a dva zeleneacute signaacutely (5p12) v pravom jadre je priacutetomnaacute deleacutecia 5q31 oblasti chyacuteba jeden červenyacute signal (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

Obr 43 Interfaacutezna FISH použitaacute lokusovo-špecifickaacute sonda ndash translokačnaacute - XL BCRABL1 plus (Metasystems) dvojfarebnaacute dvojfuacutezna kde červenaacute označuje lokus ABL1 na chromozoacuteme 9 a zelenaacute oblasť BCR na chromozoacuteme 22 Sonda deteguje fuacuteziu protoonkogeacutenu ABL1 (9q34) a geacutenu BCR (22q11) v priacutepade že červenyacute a zelenyacute signaacutel suacute pri sebe (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

45

Obr 44 Interfaacutezna FISH Použitaacute lokusovo-špecifickaacute sonda- typ break apart pre IGH geacuten V docircsledku translokaacutecie došlo k rozskočeniu geacutenu pričom translokačneacuteho partnera nepoznaacuteme vieme určiť len percento v koľkyacutech jadraacutech je geacuten prestavanyacute (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex) Obr 45 Použiteacute celochromozoacutemoveacute sondy WCP 15 (červenyacute chromozoacutem) a WCP 17 (zelenyacute chromozoacutem) Na metafaacuteze je potvrdenaacute reciprokaacute translokaacutecia t(1517)(q2221) (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

FISH vizualizaacutecia celeacuteho chromozoacutemu maľovanie chromozoacutemu anglicky chromosome

painting je špeciaacutelnou aplikaacuteciou chromozoacutemovej FISH proacuteba je koktail veľkeacuteho počtu rocircznych fluorescenčne značenyacutech DNA fragmentov hybridizujuacutecich pozdĺž celeacuteho konkreacutetneho chromozoacutemu (obr 36b 45) bdquoChromosomepaintingldquo analyzuje metafaacutezne chromozoacutemy V minulosti bola FISH vizualizaacutecia celyacutech chromozoacutemov limitovanaacute malyacutem množstvom rocirczne sfarbenyacutech fluorochroacutemov

V suacutečasnosti je možneacute detegovať množstvo cieľovyacutech sekvenciiacute naraz čo sa využiacuteva pri celogenoacutemovej chromozoacutemovej vizualizaacutecii (whole-chromosomepainting - WCP) metoacutedou multiplex FISH (M-FISH multicolor FISH o br 46) alebo spektraacutelnej karyotypizaacutecie (SKY) kedy možno rozliacutešiť všetky ľudskeacute chromozoacutemy ndash teda 24 rocircznych chromozoacutemov M-FISH a SKY patria medzi metafaacutezne formy FISH diagnostiky ktoreacute umožňujuacute simultaacutennu vizualizaacuteciu všetkyacutech ľudskyacutech chromozoacutemov v rocircznych farbaacutech čo predstavuje uľahčenie analyacutezy karyotypu hlavne pri komplexnyacutech zmenaacutech a markeroch neznaacutemeho pocircvodu Obe techniky vychaacutedzajuacute z použitia

46

celochromozoacutemovyacutech sond značenyacutech kombinaacuteciou viaceryacutech fluorochroacutemov Rozdiel medzi M-FISH a SKY spočiacuteva v technike ziacuteskania konečneacuteho obrazu

Obr 46 Multicolor FISH - každyacute chromozoacutemovyacute paacuter je zafarbenyacute inou farbou pričom na ich zafarbenie postačuje kombinaacutecia 5 fluorochroacutemov Na vyhodnocovanie je potrebnaacute špeciaacutelna sada fluorescenčnyacutech filtrov pre jednotliveacute fluorochroacutemy a špeciaacutelnyacute softweacuter Vľavo-štandardnyacute karyotyp vpravo karyotyp s mutaacuteciami (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

V molekulovej cytogenetike suacute komerčne dostupneacute sety M-FISH proacuteb umožňujuacutece

viacfarebneacute pruacutežkovanie chromozoacutemov (banding) s vysokyacutem rozliacutešeniacutem (multicolor-banding mBAND FISH MCB) čo umožňuje identifikaacuteciu intrachromozoacutemovyacutech prestavieb (Obr 47) Nevyhnutnosťou mBAND-u je mať chromozoacutemy v metafaacuteze Taacuteto metoacuteda bola prvyacutekraacutet uskutočnenaacute na chromozoacuteme 5 v roku 1999 mBAND FISH umožňuje rozliacutešiť špecifickeacute oblasti chromozoacutemov na uacuterovni pruacutežku - bandu a sub-bandu s detekciou 550 bandov haploidneacuteho karyotypu

Obr 47 A - mBAND chromozoacutemu 11 - inverzia duplikovanej oblasti 11q223-q25 B - mBAND chromozoacutemu 3 - na kruhovom chromozoacuteme deleacutecia oblasti 3p263 C - mBAND chromozoacutemu 2 - potvrdenie inverzie duplikovanej časti chromozoacutemu (poskytnuteacute RNDr Dagmar Landlovou Medirex)

FISH metoacuteda a jej varianty (M-FISH mBAND SKY) majuacute v suacutečasnosti širokeacute využitie v

klinickej genetike v onkologickej genetike na detekciu aberaacuteciiacute v čase diagnoacutezy počas liečby po

47

liečbe monitorovanie po transplantaacutecii kostnej drene v prenataacutelnej a postnataacutelnej diagnostike pri detekcii submikroskopickyacutech deleacuteciiacute (napr DiGeorge syndroacutem - 22q112 delečnyacute syndroacutem PraderndashWilli syndroacutem- chromozoacutem 15q11-13) prostredniacutectvom FISH je možnaacute detekcia numerickyacutech zmien chromozoacutemov (trizoacutemia chromozoacutemu 21 pri Downovom syndroacuteme trizoacutemia chromozoacutemu 15 pri Patauovom syndroacuteme trizoacutemia chromozoacutemu 18 pri Edwardsovom syndroacuteme) rocirczne zmeny v počte pohlavnyacutech chromozoacutemov (monozoacutemia X pri Turnerovom syndroacuteme Klinefelterov syndroacutem s X chromozoacutemom naviac - XXY) podobne v predimplantačnej diagnostike

83 DNA Microarray (DNA mikro čip biočip) DNA mikročipovanie je technika využiacutevajuacuteca hybridizaacuteciu skuacutemanej nukleovej kyseliny

(cieľovaacute vzorka) s veľkyacutem množstvom oligonukleotidovyacutech proacuteb (desať tisiacutec až milioacuten) ktoreacute suacute prichyteneacute na pevnyacute podklad najčastejšie sklenyacute silikoacutenovyacute alebo nylonovyacute (doštička čip) Skuacutemanaacute nukleovaacute kyselina je pred hybridizaacuteciou fragmentovanaacute označenaacute fluorofoacuterom a denaturovanaacute Po kontakte čipu s cieľovou vzorkou ktoraacute je vlastne zmes označenyacutech oligonukleotidov značeneacute oligonukleotidy hybridizujuacute s oligonukleotidovyacutemi sekvenciami prichytenyacutemi na čipe Potom suacute na zaacuteklade fluorescencie detekovaneacute miesta kde došlo k hybridizaacutecii čiže vzorka obsahovala takuacuteto nukleotidovuacute sekvenciu Z jedneacuteho mikročipu sa ziacuteska obrovskeacute množstvo daacutet ktoreacute je vždy nutneacute softveacuterovo spracovať V dnešnej dobe existuje niekoľko firiem poskytujuacutecich komerčne mikročipy na objednaacutevku alebo si ich laboratoacuteria produkujuacute sami

Mikročipovanie prebieha nasledovne

1) Vytvorenie DNA čipu ndash tisiacutece rocircznych jednovlaacuteknovyacutech DNA oligonukleotidov znaacutemych sekvencii sa kovalentne naviažu na povrch doštičky vždy v určitej lokalite je niekoľko rovnakyacutech oligonukleotidov veľkosť takejto lokality je ˂ 200 microm Proacutebami mocircže byť DNA cDNA alebo syntetizovaneacute oligonukleotidy Už hotoveacute mikročipy ponuacutekajuacute viacereacute firmy (Affymetrix Agilent Technologies Eppendorf Illumina) alebo si ich jednotliveacute laboratoacuteria vyraacutebajuacute sami pomocou robotickyacutech zariadeniacute DNA čip sa vytvaacutera buď nanaacutešaniacutem kvapiek oligonukleotidov na podklad alebo synteacutezou oligonukleotidov in situ na čipe 2) Priacuteprava vzorky ndash nukleovaacute kyselina (mRNA DNA) sa purifikuje určiacute sa jej kvantita a kvalita (spektrofotometericky) fragmentuje resp v priacutepade mRNA sa syntetizuje cDNA v priacutepade potreby sa mocircže DNA amplifikovať PCR reakciou štiepiť restrikčnyacutemi endonukleaacutezami 3) Fluorescenčneacute označenie (zriedkavejšie raacutedioaktiacutevne) fragmentov DNA prebieha počas reverznej transkripcie alebo PCR amplifikaacutecie za uacutečasti fluorescenčne značenyacutech nukleotidov Keď sa analyzujuacute dve rocirczne vzorky napr zdraveacute tkanivo a naacutedoroveacute tkanivo označenie nukleovyacutech kyseliacuten v tyacutechto tkanivaacutech byacuteva rozdielne a to použitiacutem dvoch rocircznych fluorescenčnyacutech farbiacutev (napr zeleneacute a červeneacute) Pred hybridizaacuteciou je potrebneacute vzorku denaturovať čiacutem sa vytvoriacute zmes jednovlaacuteknovyacutech DNA označenyacutech značkou 4) Hybridizaacutecia s mikročipom ndash v špeciaacutelnom hybridizačnom roztoku hybridizujuacute komplementaacuterne sekvencie zo vzorky s priacuteslušnyacutemi oligonukleotidovyacutemi sondami naviazanyacutemi na čipe Potom sa čip obmyje aby došlo k odstraacuteneniu čiastočne hybridizovanyacutech nukleovyacutech kyseliacuten 5) Skenovanie mikročipu ndash skenerom čipov docircjde k ožiareniu čipu laserom pričom v mieste hybridizaacutecie fluorescenčne značenyacutech DNA fragmentov s proacutebou docircjde k emisii svetla určitej vlnovej dĺžky ktoruacute skener zaznamenaacute 6) Analyacuteza daacutet prebieha metoacutedami bioinformatiky spracovaniacutem softveacutermi sa zistiacute ktoreacute lokality čipu navzaacutejom hybridizovali v priacutepade použitia dvoch vzoriek kontrolnej a skuacutemanej je možneacute analyzovať ich relatiacutevnu intenzitu hybridizaacutecie (expresie určiteacuteho geacutenu)

Existujuacute štyri typy mikročipov 1) Čipy ur čeneacute na analyacutezu expresie (obsahujuacute cDNA proacuteby) pre tzv dvojkanaacutelovyacute experiment kedy je vzorka určenaacute k hybridizaacutecii na čipe ziacuteskanaacute zmiešaniacutem DNA fragmentov kontrolnej a skuacutemanej vzorky pričom fragmenty suacute rozdielne fluorescenčne označeneacute (napr zelenyacute fluorofoacuter pre kontrolnuacute vzorku a červenyacute pre skuacutemanuacute) Na zaacuteklade intenzity a typu fluorescencie sa deteguje expresia geacutenov typickaacute pre kontrolnuacute vzorku (napr zelenaacute fluorescencia) pre skuacutemanuacute vzorku (napr

48

červenaacute fluorescencia) a expresia podobnaacute u oboch vzoriek (žltaacute fluorescencia) neexprimovaneacute geacuteny (čierna fluorescencia) rocirczne odtiene (v zaacutevislosti od prevažujuacutecej hybridizaacutecie) (obr 48) 2) Čipy ur čeneacute na analyacutezu mutaacutecii použije sa genoacutemovaacute DNA označenaacute jednou fluorescenčnou farbičkou na určenie jednonukleotidovej zmeny (SNP ndash Single Nukleotide Polymorphism) 3) Čipy na komparatiacutevnu genoacutemovuacute hybridizaacuteciu (aCGH array Comparative Genomic Hybridization) ndash použiacutevaneacute na zistenie zvyacutešenia alebo zniacuteženia množstva chromozoacutemovyacutech fragmentov obsahujuacutecich geacuteny zodpovedneacute za určiteacute ochorenie Na analyacutezu sa použije skuacutemanaacute gDNA a referenčnaacute (kontrolnaacute) DNA každaacute sa značiacute inou fluorescenčnou farbičkou (princiacutep ako pri analyacuteze expresie) (obr 49 50) 4) Čipy CGH - SNP kombinovaneacute čipy ur čeneacute na analyacutezu aj mutaacuteciiacute SNP aj na komparatiacutevnu genoacutemovuacute hybridizaacuteciu CGH

Mikročipy majuacute rozsiahle využitie napriacuteklad v identifikaacuteciiacute novyacutech geacutenov vo vyacuteskume ich funkciiacute expresie v rocircznych podmienkach pri diagnostike mnohyacutech ochoreniacute vo farmakogenomike vo vyacuteskume vplyvu toxiacutenov

Obr 48 Heatmapa geacutenovej expresie vybranyacutech geacutenov (mRNA) mikročip obsahuje 46000 cDNA proacuteb (poskytnuteacute Ing Helenou Gbelcovou PhD Uacutestav lekaacuterskej bioloacutegie genetiky a klinickej genetiky LF UK a UNB)

49

Obr 49 Princiacutep komparatiacutevnej genoacutemovej hybridizaacutecie (aCGH - array comparative genomic hybridization) Obr 50 A) Vyacutesledok komparatiacutevnej genoacutemovej hybridizaacutecie (aCGH - array comparative genomic hybridization) vzorky DNA izolovanej plodovej vody U plodu s abnormaacutelnym ultrasonografickyacutem vyšetreniacutem bola identifikovanaacute duplikaacutecia oblasti 3q261q29 (modryacute paacutes) a deleacutecia oblasti 5p1533p151 (červenyacute paacutes) Pre porovnanie chromozoacutem 1 bez aberaacutecie b) Ten istyacute pacient ale ineacute softveacuteroveacute spracovanie (poskytnuteacute RNDr Miroslavom Tomkom PhD Medirex)

50

Odporuacutečanaacute a použitaacute literatuacutera

Odborneacute knihy Klug W S Cummings M R Spencer Ch A Palladino M A Concepts of Genetics jedenaacuteste vydanie (2015) Carson S Molecular Biology Techniques tretie vydanie (2012) Strachan T Read A Human Molecular Genetics štvrteacute vydanie (2011) Sudbery P Sudbery I Human Molecular Genetics tretie vydanie (2009)

Internetoveacute straacutenky

wwwncbinlmnihgov wwwmlpacom wwwthermofishercom wwwilluminacom wwwpromegask wwwqiagencom wwwambioncom

Odborneacute člaacutenky Chacon-Cortes D Griffiths L R Methods for extracting genomic DNA from whole blood samples current perspectives Journal of Biorepository Science for Applied Medicine Volume 2 strany 1- 9 Viltrop T Krjutskov K Palta P Metspalu A Comparison of DNA extraction methods for multiplex polymerase chain reaction Anal Biochem 2010 Volume 398(2) strany 260-262 Ing Martin Čermaacutek Molekulaacuterna cytogenetika v problematike familiaacuternych maligniacutet Onkoloacutegia Volume 2 strany 77 - 83 Livak KJ Schmittgen TD Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method Methods 2001 Volume 25(4) strany 402 - 408 Bustin S A Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays J Mol Endocrinol 2000 Volume 25(2) strany169 - 193

MOLEKULAacuteRNE METOacuteDY AKTUAacuteLNE POUŽIacuteVANEacute V KLINICKEJ GENETIKE RNDr Andrea Pastoraacutekovaacute PhD RNDr Robert Petrovič PhD Vydala Univerzita Komenskeacuteho v Bratislave Lekaacuterska fakulta Rozsah 50 straacuten 246 AH prveacute vydanie ISBN 978-80-223-4231-5

35

63 Next Generation Sequencing (NGS)

NGS (sekvenovanie novej generaacutecie) maacute obrovskyacute potenciaacutel v analyacuteze genoacutemov pričom toto označenie zahŕňa viacereacute technologickeacute metoacutedy reprezentovaneacute niekoľkyacutemi firmami Princiacutepom je masiacutevne paralelneacute sekvenovanie čiacutem sa ziacuteskajuacute raacutedovo tisiacutece až milioacuteny sekvenciiacute naraz 631 Sekvenovanie druhej generaacutecie

Na začiatku sa analyzovanaacute DNA vo vaumlčšine priacutepadov fragmentuje (vznikne tak DNA

knižnica) na fragmenty sa pripoja kraacutetke sekvencie ndash adapteacutery naacutesledne sa tieto fragmenty rocircznymi priacutestupmi amplifikujuacute a určiacute sa ich sekvencia Vďaka čiastočnyacutem prekryvom je zo ziacuteskanyacutech sekvencii možneacute poskladať plynuluacute sekvenciu zodpovedajuacutecu pocircvodnej nefragmentovanej DNA

Pyrosekvenovanie je podobne ako Sangerova metoacuteda založenaacute na princiacutepe synteacutezy komplementaacuterneho vlaacutekna DNA avšak rozdiel je v tom že sa na detekciu inkorporaacutecie nukleotidu využiacuteva inyacute systeacutem tvorby luminiscenčneacuteho signaacutelu v priebehu reakcie Pyrosekvenovanie je umožneneacute vďaka aktivite 4 enzyacutemov - DNA polymeraacutezy ATP sulfurylaacutezy luciferaacutezy a apyraacutezy Reakčnaacute zmes obsahuje aj ďalšie komponenty - enzymatickeacute substraacutety adenoziacutenfosfosulfaacutet (APS) d-luciferiacuten sekvenovanyacute templaacutet a cyklicky postupne po jednom type pridaacutevaneacute nukleotidtrifosfaacutety Po zabudovaniacute nukleotidu do novovznikajuacuteceho reťazca docircjde k uvoľneniu pyrofosfaacutetu naacutesledne je využityacute ATP sulfurylaacutezou na synteacutezu ATP z APS počas ďalšej reakcie docircjde k využitiu ATP luciferaacutezou na premenu luciferiacutenu na oxyluciferiacuten čo spocircsobiacute svetelnyacute signaacutel a ten zaznamenaacute detekčnyacute systeacutem Poslednou enzymatickou reakciou je reakcia apyraacutezy ktoraacute odstraacuteni nezainkorporovaneacute nukleotidy a nevyužiteacute ATP aby sa celyacute proces mohol zopakovať s reakčnou zmesou obsahujuacutecou ďalšiacute nukleotidtrifosfaacutet (inyacute ako v predchaacutedzajuacutecej reakcii) Po každej reakcii detektor zaznamenaacuteva emisiu svetla na zaacuteklade intenzity svetla je možneacute určiť či bol vradenyacute priacuteslušnyacute nukleotidtrifosfaacutet či bol inkorporovanyacute jeden priacutepadne viac rovnakyacutech nukleotidtrifosfaacutetov

Zvyacutešenie vyacutekonu pyrosekvenovania umožnila tzv emulznaacute PCR v mikročasticiach a použitie platničky PicoTiterPlatereg toto sekvenovanie zaviedla firma Roche pod pojmom 454 pyrosekvenovanie v roku 2005 Na začiatku sa DNA fragmentuje na uacuteseky dlheacute 400-600 baacutez dvojvlaacuteknovaacute fragmentovanaacute DNA sa liguje s adapteacutermi prostredniacutectvom nich sa naviaže na mikročastice dvojvlaacuteknoveacute fragmenty sa oddelia mikročastice s naviazanyacutemi jednovlaacuteknovyacutemi fragmentami sa premiešajuacute so zmesou oleja a roztoku ktoryacute obsahuje všetky komponenty na uacutespešnuacute PCR Tyacutemto spocircsobom sa okolo každej mikročastice vytvoriacute vlastnyacute mikroreaktor v ktorom prebehne amplifikaacutecia fragmentu Po PCR reakcii sa mikročastice prenesuacute do platničky PicoTiterPlate v ktorej sa do jamky zmestiacute akuraacutet jedna mikročastica a reakčneacute komponenty pyrosekvenačnej reakcie PicoTiterPlatereg maacute 1 600 000 jamiek každaacute jamka maacute maximaacutelny objem 75 picolitra Platnička s mikročasticami sa vložiacute do sekvenačneacuteho systeacutemu ndash priacutestroja v ktorom sa celeacute pyrosekvenovanie uskutočniacute Chemiluminiscenčneacute signaacutely ktoryacutech počas sekvenovania vznikajuacute milioacuteny v priebehu hodiny suacute zachyteneacute CCD kamerou a analyzovaneacute softveacuterom

Firma Illumina predstavila inuacute technoloacutegiu PCR amplifikaacutecia a sekvenovanie sa uskutočňuje na skliacutečku (flow cell) Fragmentaacutecia DNA a pripojenie adapteacuterov prebieha za uacutečasti transpozoacutemov v procese nazvanom tagmentaacutecia Po hybridizaacutecii fragmentov DNA na skliacutečko prebehne v klastroch PCR amplifikaacutecia (tzv mostiacutekovaacute amplifikaacutecia) sekvenaacutecia prebieha za uacutečasti rozdielne fluorescenčne značenyacutech a chemicky modifikovanyacutech nukleotidov pričom každyacute nukleotid emituje fluorescenciu s inou vlnovou dĺžkou Na skliacutečku prebieha paralelne až 6 miliaacuterd sekvenaacutecii (obr 32)

Ďalšiacutemi možnosťami sekvenovania druhej generaacutecie je systeacutem SOLid (vyvinutyacute firmou Applied Biosystem dnes pod Thermo Fisher Scientific) a Ion Semiconductor Sequencing ndash polovodičoveacute ioacutenoveacute sekvenovanie (od firmy Ion Semiconductor Sequencing v suacutečasnosti Thermo Fisher Scientific)

36

Obr 32 Princiacutep sekvenovania novej generaacutecie od firmy Illumina PCR amplifikaacutecia a sekvenovanie sa uskutočňuje na skliacutečku (flow cell) paralelne prebieha až 6 miliaacuterd sekvenaacutecii

632 Sekvenovanie tretej generaacutecie

Pred sekvenovaniacutem netreba amplifikovať DNA PCR metoacutedou ale sekvencia sa ziacuteskava zachyteniacutem signaacutelu v reaacutelnom čase Medzi sekvenovanie tretej generaacutecie patriacute SMRT (Single Molecule Real-Time Sequencing) a Nanopore Sequencing

37

7 Fragmentačnaacute analyacuteza DNA

Je metoacuteda použiacutevanaacute na určenie veľkosti fragmentov DNA ziacuteskanyacutech PCR reakciou Dĺžka amplifikovanyacutech DNA fragmentov sa zistiacute ich porovnaniacutem s veľkostnyacutem štandardom (obr 33) ktoryacute je tvorenyacute DNA fragmentami znaacutemej dĺžky Veľkostnyacute štandard je pred kapilaacuternou elektroforeacutezou zmiešanyacute so vzorkou DNA fragmenty veľkostneacuteho štandardu suacute fluorescenčne označeneacute pričom použiteacute fluorescenčneacute farbivo je ineacute ako fluorescenčneacute farbivo použiteacute na označenie DNA fragmentov vo vyšetrovanej vzorke

Obr 33 Elektroforetogram veľkostneacuteho štandardu použiacutevaneacuteho na určenie veľkostiacute fragmentov analyzovanyacutech kapilaacuternou elektroforeacutezou v genetickom analyzaacutetore (GeneScantrade 500 LIZtrade dye Size Standard) dĺžka fragmentov v nukleotidoch (napr 50 nukleotidov)

Fragmentačnaacute analyacuteza pozostaacuteva z viaceryacutech krokov Prvyacutem je izolaacutecia DNA nasleduje PCR amplifikaacutecia počas ktorej sa novosyntetizovaneacute DNA fragmenty označia fluorescenčnyacutemi farbivami Vzorka s PCR produktom sa pripraviacute na kapilaacuternu elektroforeacutezu tak že sa zmieša s veľkostnyacutem štandardom (sluacuteži na určenie veľkosti fragmentov) a denaturačnou laacutetkou (formamid) nasleduje denaturaacutecia Pripraveneacute vzorky suacute injektovaneacute do priacutestroja (genetickyacute analyzaacutetor) kde v kapilaacutere naplnenej polymeacuterom v elektrickom poli migrujuacute fluorescenčne značeneacute fragmenty DNA na zaacuteklade veľkosti (kapilaacuterna elektroforeacuteza) Počas elektroforeacutezy genetickyacute analyzaacutetor zaznamenaacuteva fluorescenciu fragmentov Analyacutezou daacutet prostredniacutectvom špeciaacutelnych softveacuterov sa ziacuteskajuacute elektroforetogramy z ktoryacutech je možneacute zistiť veľkosť fragmentov ako aj typ fluorescencie (docircležiteacute ak suacute genetickeacute varianty rozliacutešiteľneacute rocircznou fluorescenciou napr SNaPshot) Fragmentačnaacute analyacuteza je suacutečasťou množstva molekulaacuterno-genetickyacutech metoacuted (pozri obr 12 26 28 29 34) ako suacute napr STR analyacuteza (Short Tandem Repeat) AFLP analyacuteza (Amplified Fragment Lenght Polymorfism) RFLPT-RFLP analyacuteza (Restriction Fragment Lenght PolymorfismTerminal Restricted Fragment Lenght Polymorfism) SSCP (Single Strand Conformation Polymorfism) VNTR (Variable Number of Tandem Repeat) analyacuteza straty heterozygotnosti (LOH loss of heterozygozity) MLPA (Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification) MSMSA (Methylation-Sensitive Mobility Shift Assay) SNP genotypovanie (SNaPshotreg) HiCEP (High-Coverage Expression Profiling)

38

Obr 34 Kvantitatiacutevna fragmentačnaacute PCR analyacuteza (QF-PCR) DNA izolovanej z plodovej vody vyacutesledok prenataacutelnej analyacutezy = priacutetomnosť troch piacutekov pre chromozoacutem 18 (u všetkyacutech fragmentov detegujuacutecich chromozoacutem 18 je pomer vyšetrovanyacutech markerov aberantnyacute 21 resp 111) čo znamenaacute trizoacutemiu chromozoacutemu 18 Edwardsov syndroacutem

39

8 Metoacutedy založeneacute na princiacutepe hybridizaacutecie

Nukleoveacute kyseliny majuacute schopnosť vytvaacuterať dvojvlaacuteknoveacute reťazce z jednovlaacuteknovyacutech molekuacutel na zaacuteklade komplementarity baacutez Komplementarita baacutez umožňuje replikaacuteciu DNA transkripciu RNA komplementarita baacutez zabezpečuje teda reprodukovateľnosť živej hmoty

Hybridizaacutecia je proces v ktorom na zaacuteklade komplementarity baacutez dochaacutedza k vytvoreniu dvojvlaacuteknovej nukleovej kyseliny z dvoch jednovlaacuteknovyacutech molekuacutel DNA alebo RNA alebo ich kombinaacuteciou DNA RNA pričom kratšia jednovlaacuteknovaacute nukleovaacute kyselina vystupuje ako sonda (proacuteba) Hybridizaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten je jeden z najpoužiacutevanejšiacutech naacutestrojov v molekulaacuternej bioloacutegii a genetike (hybridizaacutecia primerov alebo proacuteb sa využiacuteva v takmer každej metoacutede - v PCR RT-PCR qPCR RT-qPCR MLPA sekvenovaniacute fragmentačnej analyacuteze FISH DNA mikročipoch atď)

Denaturaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten je proces pri ktorom dochaacutedza k porušeniu vodiacutekovyacutech vaumlzieb medzi vlaacuteknami nukleovyacutech kyseliacuten (strata sekundaacuternej a terciaacutelnej štruktuacutery) tak že docircjde k ich uacuteplneacutemu oddeleniu vzniknuacute jednovlaacuteknoveacute reťazce Denaturaacutecia NK mocircže byť spocircsobenaacute vplyvom vysokyacutech teplocirct pH alebo chemickyacutech laacutetok (denaturačneacute činidlaacute) Renaturaacutecia je opačnyacute proces v ktorom na zaacuteklade komplementarity dochaacutedza k tvorbe dvojvlaacuteknovyacutech NK

Hybridiza čnaacute sonda (proacuteba) je jednovlaacuteknovaacute nukleovaacute kyselina určitej znaacutemej dĺžky a sekvencie (najčastejšie DNA pretože je stabilnejšia ako RNA) ktoraacute je značenaacute a sluacuteži na detekciu komplementaacuternych molekuacutel DNA alebo RNA v procese hybridizaacutecie V zaacutevislosti od podmienok hybridizaacutecie (stringencia) mocircže byť detegovanaacute sekvencia uacuteplne komplementaacuterna alebo v menej priacutesnych podmienkach mocircže mať sekvenčneacute odchyacutelky Proacuteba sluacuteži na vyhľadanie a zviditeľnenie cieľovyacutech NK Zviditeľnenie sa deje prostredniacutectvom označenia proacuteby ešte pred hybridizaacuteciou Značenie proacuteby mocircže byť raacutedioaktiacutevne a neraacutedioaktiacutevne (najčastejšie fluorescenčneacute)

Raacutedioaktiacutevne značeneacute proacuteby pomocou izotopov (32P) sa využiacutevali viac v minulosti v suacutečasnosti suacute kvocircli zdravotnyacutem rizikaacutem ohľaduplnosti k životneacutemu prostrediu ako aj kvocircli jednoduchšej manipulaacutecii použiacutevaneacute fluorescenčne značeneacute proacuteby Raacutedioaktiacutevne značeneacute sondy boli použiacutevaneacute hlavne metoacutedou Southernovej hybridizaacutecie (Southern blotting Southern blot) Citlivosť raacutedioaktiacutevne značenyacutech proacuteb je vyššia dosahuje schopnosť zachytiť 10 fg (femtogram 10-15) cieľovej DNA sekvencie 81 Southern blot

Metoacutedu objavil v roku 1975 britskyacute bioloacuteg Edwin Southern (preto Southern) Pri Southernovej hybridizaacutecii sa restrikčne štiepeneacute fragmenty DNA elektroforeticky separujuacute v geacuteli potom sa metoacutedou blottingu prenesuacute na nylonovuacute alebo nitroceluloacutezovuacute membraacutenu kde suacute naacutesledne hybridizovaneacute v roztoku obsahujuacutecom raacutedioaktiacutevne značenuacute sondu Priloženiacutem fotografickeacuteho filmu k membraacutene a vyvolaniacutem filmu autoraacutediografiou docircjde k zviditeľneniu lokaliacutet kde došlo k hybridizaacuteciiacute raacutedioaktiacutevne značenej sondy s fragmentom DNA (autoraacutediogram) Southern blot bol kľuacutečovou a prvou metoacutedou na identifikaacuteciu osocircb (DNA fingerprinting DNA pofiling) (obr 35)

Okrem Southern blotu existuje Northern blot na analyacutezu RNA (geacutenovej expresie) a Western blot na analyacutezu proteiacutenov postup je obdobnyacute ako pri Southern blote s obmenami špecifickyacutemi pre konkreacutetny blot Pri Northern blote sa použiacutevajuacute hybridizačneacute proacuteby ale pre vizualizaacuteciu proteiacutenov western blotom je potrebneacute použiť protilaacutetky s naacuteslednou vizualizaacuteciou Pomenovanie techniacutek je hra so sloviacutečkami (keďže paacuten Northern ani Western neobjavili takto nazvaneacute techniky)

Neraacutedioaktiacutevne značenie proacuteb použiacutevanyacutech v molekulaacuternej genetike mocircže byť nepriame (použitie haptenu) alebo priame Konečnaacute vizualizaacutecia je najčastejšie zabezpečenaacute fluoreskujuacutecimi farebnyacutemi značkami farbivami fluorochroacutemami (fluorofoacuterami) Pri priamom značeniacute je farbička kovalentne naviazanaacute na nukleotid a na zachytenie fluorescencie suacute potrebneacute špeciaacutelne priacutestroje umožňujuacutece excitaacuteciu farbičky ktoraacute potom emituje žiarenie určitej vlnovej dĺžky (emisneacute žiarenie) a to zachytiacute detekčnyacute systeacutem priacutestroja Využitie fluorochroacutemov v molekulaacuternej genetike je masiacutevne napr na vizualizaacuteciu NK elektroforeticky separovanyacutech v geacuteli kvantifikaacuteciu produktov PCR reakcie v priacutestroji real-time PCR cykleacuter sekvenovaniacute fragmentačnej analyacuteze FISH DNA mikročipoch atď

40

Obr 35 Princiacutep Southern blotu

82 FISH (fluorescenčnaacute in situ hybridizaacutecia)

FISH (fluorescent in situ hybridization fluorescenčnaacute in situ hybridizaacutecia) metoacuteda patriacute medzi molekulovo-cytogenetickeacute techniky Princiacutep FISH metoacutedy je založenyacute na hybridizaacuteciiacute fluorescenčne značenyacutech proacuteb ku komplementaacuternym uacutesekom vyšetrovanej DNA na podložnom skle (priamo na mieste - in situ) K denaturaacutecii dsDNA dochaacutedza buď vplyvom denaturačnyacutech činidiel alebo zvyacutešenou teplotou a naacuteslednou renaturaacuteciou dochaacutedza k naviazaniu sondy na komplementaacuterny uacutesek DNA Vyacutesledok hybridizaacutecie sa vizualizuje fluorescenčnyacutem mikroskopom vybavenyacutem vhodnyacutemi fluorescenčnyacutemi filtrami a vizuaacutelne zhodnotiacute skuacutesenyacutem odborniacutekom Fluorescencia sa v niektoryacutech priacutepadoch mocircže zaznamenať a hodnotiť aj pomocou softveacuteru (obr 36)

Pomocou FISH detegujeme numerickeacute aberaacutecie - zmeny v počte chromozoacutemov (napr trizoacutemia monozoacutemia chromozoacutemov) alebo štruktuacuterne aberaacutecie a prestavby (napr translokaacutecie inverzie deleacutecie duplikaacutecie amplifikaacutecie) FISH metoacuteda umožňuje identifikaacuteciu a detekciu každeacuteho ľudskeacuteho chromozoacutemu jeho zaradenie do karyotypu odhalenie malyacutech submikroskopickyacutech chromozoacutemovyacutech zmien a tiež mapovať poziacutecie jednotlivyacutech geacutenov na chromozoacuteme

41

Obr 36 Princiacutep štandardnej FISH a FISH maľovania celeacuteho chromozoacutemu

Veľkou vyacutehodou FISH metoacutedy je možnosť analyacutezy buniek v metafaacuteze aj v interfaacuteze kedy nie je nutnaacute kultivaacutecia buniek a tiež ryacutechle analyzovanie veľkeacuteho počtu buniek (stovky až tisiacutece) K ďalšiacutem vyacutehodaacutem patriacute bezpečnosť vysokaacute citlivosť dostatočnaacute stabilita relatiacutevne kraacutetky čas hybridizaacutecie a možnosť ryacutechleho vyhodnotenia Hybridizaacutecia pri vaumlčšine suacutečasne dodaacutevanyacutech sond trvaacute 10-12 hodin (na trhu suacute už dostupneacute aj sondy so skraacutetenyacutem časom hybridizaacutecie na 2-3 hodiny) Po hybridizaacuteciiacute nasleduje odmyacutevanie kedy pri priacuteslušnej teplote dochaacutedza k odmytiu nenaviazanyacutech a nespraacutevne hybridizovanyacutech sond Preparaacutet sa naacutesledne podfarbiacute a vyacutesledok sa zhodnotiacute vo fluorescenčnom mikroskope Na podfarbenie chromozoacutemov alebo jadier sa použiacuteva modreacute kontrastneacute farbivo DAPI (46-diamidino-2-fenylindol) ktoreacute maacute silneacute fluorescenčneacute vlastnosti dokaacuteže prechaacutedzať jadrovou membraacutenou a viazať sa na DNA Vyacutesledkom je modreacute zafarbenie ktoreacute vyacuteborne kontrastuje so signaacutelmi jednotlivyacutech sond

Limitujuacutecim faktorom FISH je možnosť identifikaacutecie len tyacutech uacutesekov DNA ku ktoryacutem suacute použiteacute sondy V jednej analyacuteze je možneacute použiť najviac 3 odlišne značeneacute sondy a tak zistiť priacutepadneacute abnormality len na 1 alebo na paacuter lokusoch Na relevantnuacute detekciu je potrebneacute mať vo vzorke 1-5 aberantnyacutech interfaacutezovyacutech jadier

FISH je možneacute uskutočniť na širokej škaacutele biologickeacuteho materiaacutelu na vzorkaacutech perifeacuternej krvi kostnej drene naacuteteroch choriovyacutech klkoch plodovej vode rocircznych druhov tkaniacutev natiacutevnych alebo zaliatych v parafiacutene na 1 bunke (predimplantačnaacute genetickaacute diagnostika PGD) (obr 37)

Využiacuteva sa na detekciu aberaacuteciiacute pri mnohyacutech onkologickyacutech ochoreniach (napr pri diagnoacuteze mnohopočetnyacute myeloacutem sa v suacutečasnosti po separaacutecii CD138+ buniek robiacute FISH s 5 sondami pre geacuteny IGH TP53 RB1 oblasť 1p321q21 a stanovuje sa hyperploidia chromozoacutemov 5 9 a 15) a tiež k spresneniu doplneniu a k overeniu bežneacuteho cytogenetickeacuteho vyšetrenia

Podľa miesta na chromozoacuteme na ktorom dochaacutedza k hybridizaacutecii sondy rozlišujeme 4 typy

DNA sond bull centromeacuteroveacute sondy ndash sa viažu na strednuacute časť chromozoacutemu ndash centromeacuteru sluacutežia k diagnostike zmien v počte chromozoacutemov k detekcii chromozoacutemov neznaacutemeho pocircvodu umožňujuacute interfaacuteznu FISH na nedeliacich sa bunkaacutech (obr 38-41)

42

Obr 37 Interfaacutezna FISH preimplantačnyacute genetickyacute skriacutening aneuploidiiacute ndash blastomeacutera 3-denneacuteho ľudskeacuteho embrya s normaacutelnym počtom chromozoacutemov 13 18 21 pohlavie XY použityacutech 5 sond pre chromozoacutemy 13 ndash orange 18 ndash aqua 21 ndash green X ndash blue a Y ndash yellow (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

Obr 38 Interfaacutezne jadro po hybridizaacutecii s centromeacuterovou sondou pre chromozoacutem 8 (Vysis Abbott) V pravom jadre je priacutetomnaacute trizoacutemia chromozoacutemu 8 (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex) Obr 39 Metafaacutezna (A) a interfaacutezna FISH (B) použitaacute centromeacuterovaacute sonda CEPX spectrum orangeCEPY spectrum green (Vysis Abbott) Sonda hybridizuje k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (červenyacute signaacutel) a Y (zelenyacute signaacutel) (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

43

Obr 40 Interfaacutezna FISH vyšetrenie spermiiacute použiteacute sondy CEPX greenCEPY orange (Aneuscore Metasystems) Sondy hybridizujuacute k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (zelenyacute signaacutel) Y (červenyacute signaacutel) vľavo ndash dve haploidneacute spermie (majuacutece jedna spermia X druhaacute Y chromozoacutem) vpravo ndash dve patologickeacute spermie obsahujuacutece gonozoacutemovyacute komplement XY (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

Obr 41 Interfaacutezna FISH vyšetrenie spermiiacute použiteacute sondy CEPX greenCEPY orange a CEP18 aqua (Aneuscore Metasystems) Sondy hybridizujuacute k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (zelenyacute signaacutel) Y (červenyacute signaacutel) a 18 (modryacute signaacutel) vľavo ndash normaacutelne haploidneacute ľudskeacute spermie - 1x chromozoacutem X alebo Y a jedenkraacutet chromozoacutem 18 v strede ndash patologickaacute spermia obsahujuacuteca gonozoacutemovyacute komplement XY a jeden chromozoacutem 18 vpravo ndash patologickaacute diploidnaacute spermia s chromozoacutemami X Y a dvoma chromozoacutemami 18 (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

bull lokusovo špecifickeacute sondy ndash hybridizaacutecia prebehne na konkreacutetnom mieste geacutenu (lokuse) (obr 42-44) použiacutevajuacute sa k vyšetreniu mikrodeleacuteciiacute (straty malyacutech častiacute chromozoacutemu pri mikrodelečnyacutech syndroacutemoch) k zisteniu amplifikaacutecie onkogeacutenov a niektoryacutech špecifickyacutech translokaacuteciiacute prestavby geacutenov umožňujuacute interfaacuteznu FISH na nedeliacich sa bunkaacutech bull subtelomeroveacute ndash vaumlzba na koncoveacute časti chromozoacutemu ndash telomeacutery bull celochromozoacutemoveacute alebo celomaľovacie sondy ndash sondy hybridizujuacute s mnohopočetnyacutemi chromozoacutemovyacutemi sekvenciami pričom sa fluorescenčne tak bdquovymaľujeldquo celyacute chromozoacutem (Obr 45) Použiacutevajuacute sa na vyšetrenie chromozoacutemovyacutech prestavieb k analyacuteze translokaacuteciiacute a k detekcii pocircvodu tzv marker chromozoacutemov (malyacutech nadpočetnyacutech chromozoacutemov neznaacutemeho pocircvodu) K použitiu sondy suacute potrebneacute metafaacutezne chromozoacutemy nepoužiacutevaju sa pre interfaacuteznu FISH

Pri konvenčnej chromozoacutemovej FISH suacute homogeacutenne DNA proacuteby hybridizovaneacute s fixovanyacutem metafaacuteznym alebo prometafaacuteznym chromozoacutemomchromozoacutemami na skliacutečku (Obr 36a) Maximaacutelna rozlišovacia schopnosť metafaacuteznej FISH je niekoľko megabaacutez (Obr 39a 45) využitiacutem viac

44

natiahnutyacutech prometafaacuteznych chromozoacutemov sa dosiahne 1 Mb rozliacutešenie Prostredniacutectvom fiber FISH konkreacutetne artificiaacutelne deproteinizovanej natiahnutej DNA pripravenej in situ z celyacutech buniek na mikroskopickom skliacutečku je možneacute vizualizovať individuaacutelne geacuteny maleacute DNA elementy na chromozoacuteme s rozliacutešeniacutem okolo 1000 bp

Obr 42 Interfaacutezne jadro po hybridizaacutecii s lokusovo-špecifickou sondou LSI 5q31 Spectrum Orange5p12 Spectrum Green (Vysis Abbott) Na ľavom obraacutezku suacute priacutetomneacute dva červeneacute (5q31) a dva zeleneacute signaacutely (5p12) v pravom jadre je priacutetomnaacute deleacutecia 5q31 oblasti chyacuteba jeden červenyacute signal (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

Obr 43 Interfaacutezna FISH použitaacute lokusovo-špecifickaacute sonda ndash translokačnaacute - XL BCRABL1 plus (Metasystems) dvojfarebnaacute dvojfuacutezna kde červenaacute označuje lokus ABL1 na chromozoacuteme 9 a zelenaacute oblasť BCR na chromozoacuteme 22 Sonda deteguje fuacuteziu protoonkogeacutenu ABL1 (9q34) a geacutenu BCR (22q11) v priacutepade že červenyacute a zelenyacute signaacutel suacute pri sebe (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

45

Obr 44 Interfaacutezna FISH Použitaacute lokusovo-špecifickaacute sonda- typ break apart pre IGH geacuten V docircsledku translokaacutecie došlo k rozskočeniu geacutenu pričom translokačneacuteho partnera nepoznaacuteme vieme určiť len percento v koľkyacutech jadraacutech je geacuten prestavanyacute (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex) Obr 45 Použiteacute celochromozoacutemoveacute sondy WCP 15 (červenyacute chromozoacutem) a WCP 17 (zelenyacute chromozoacutem) Na metafaacuteze je potvrdenaacute reciprokaacute translokaacutecia t(1517)(q2221) (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

FISH vizualizaacutecia celeacuteho chromozoacutemu maľovanie chromozoacutemu anglicky chromosome

painting je špeciaacutelnou aplikaacuteciou chromozoacutemovej FISH proacuteba je koktail veľkeacuteho počtu rocircznych fluorescenčne značenyacutech DNA fragmentov hybridizujuacutecich pozdĺž celeacuteho konkreacutetneho chromozoacutemu (obr 36b 45) bdquoChromosomepaintingldquo analyzuje metafaacutezne chromozoacutemy V minulosti bola FISH vizualizaacutecia celyacutech chromozoacutemov limitovanaacute malyacutem množstvom rocirczne sfarbenyacutech fluorochroacutemov

V suacutečasnosti je možneacute detegovať množstvo cieľovyacutech sekvenciiacute naraz čo sa využiacuteva pri celogenoacutemovej chromozoacutemovej vizualizaacutecii (whole-chromosomepainting - WCP) metoacutedou multiplex FISH (M-FISH multicolor FISH o br 46) alebo spektraacutelnej karyotypizaacutecie (SKY) kedy možno rozliacutešiť všetky ľudskeacute chromozoacutemy ndash teda 24 rocircznych chromozoacutemov M-FISH a SKY patria medzi metafaacutezne formy FISH diagnostiky ktoreacute umožňujuacute simultaacutennu vizualizaacuteciu všetkyacutech ľudskyacutech chromozoacutemov v rocircznych farbaacutech čo predstavuje uľahčenie analyacutezy karyotypu hlavne pri komplexnyacutech zmenaacutech a markeroch neznaacutemeho pocircvodu Obe techniky vychaacutedzajuacute z použitia

46

celochromozoacutemovyacutech sond značenyacutech kombinaacuteciou viaceryacutech fluorochroacutemov Rozdiel medzi M-FISH a SKY spočiacuteva v technike ziacuteskania konečneacuteho obrazu

Obr 46 Multicolor FISH - každyacute chromozoacutemovyacute paacuter je zafarbenyacute inou farbou pričom na ich zafarbenie postačuje kombinaacutecia 5 fluorochroacutemov Na vyhodnocovanie je potrebnaacute špeciaacutelna sada fluorescenčnyacutech filtrov pre jednotliveacute fluorochroacutemy a špeciaacutelnyacute softweacuter Vľavo-štandardnyacute karyotyp vpravo karyotyp s mutaacuteciami (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

V molekulovej cytogenetike suacute komerčne dostupneacute sety M-FISH proacuteb umožňujuacutece

viacfarebneacute pruacutežkovanie chromozoacutemov (banding) s vysokyacutem rozliacutešeniacutem (multicolor-banding mBAND FISH MCB) čo umožňuje identifikaacuteciu intrachromozoacutemovyacutech prestavieb (Obr 47) Nevyhnutnosťou mBAND-u je mať chromozoacutemy v metafaacuteze Taacuteto metoacuteda bola prvyacutekraacutet uskutočnenaacute na chromozoacuteme 5 v roku 1999 mBAND FISH umožňuje rozliacutešiť špecifickeacute oblasti chromozoacutemov na uacuterovni pruacutežku - bandu a sub-bandu s detekciou 550 bandov haploidneacuteho karyotypu

Obr 47 A - mBAND chromozoacutemu 11 - inverzia duplikovanej oblasti 11q223-q25 B - mBAND chromozoacutemu 3 - na kruhovom chromozoacuteme deleacutecia oblasti 3p263 C - mBAND chromozoacutemu 2 - potvrdenie inverzie duplikovanej časti chromozoacutemu (poskytnuteacute RNDr Dagmar Landlovou Medirex)

FISH metoacuteda a jej varianty (M-FISH mBAND SKY) majuacute v suacutečasnosti širokeacute využitie v

klinickej genetike v onkologickej genetike na detekciu aberaacuteciiacute v čase diagnoacutezy počas liečby po

47

liečbe monitorovanie po transplantaacutecii kostnej drene v prenataacutelnej a postnataacutelnej diagnostike pri detekcii submikroskopickyacutech deleacuteciiacute (napr DiGeorge syndroacutem - 22q112 delečnyacute syndroacutem PraderndashWilli syndroacutem- chromozoacutem 15q11-13) prostredniacutectvom FISH je možnaacute detekcia numerickyacutech zmien chromozoacutemov (trizoacutemia chromozoacutemu 21 pri Downovom syndroacuteme trizoacutemia chromozoacutemu 15 pri Patauovom syndroacuteme trizoacutemia chromozoacutemu 18 pri Edwardsovom syndroacuteme) rocirczne zmeny v počte pohlavnyacutech chromozoacutemov (monozoacutemia X pri Turnerovom syndroacuteme Klinefelterov syndroacutem s X chromozoacutemom naviac - XXY) podobne v predimplantačnej diagnostike

83 DNA Microarray (DNA mikro čip biočip) DNA mikročipovanie je technika využiacutevajuacuteca hybridizaacuteciu skuacutemanej nukleovej kyseliny

(cieľovaacute vzorka) s veľkyacutem množstvom oligonukleotidovyacutech proacuteb (desať tisiacutec až milioacuten) ktoreacute suacute prichyteneacute na pevnyacute podklad najčastejšie sklenyacute silikoacutenovyacute alebo nylonovyacute (doštička čip) Skuacutemanaacute nukleovaacute kyselina je pred hybridizaacuteciou fragmentovanaacute označenaacute fluorofoacuterom a denaturovanaacute Po kontakte čipu s cieľovou vzorkou ktoraacute je vlastne zmes označenyacutech oligonukleotidov značeneacute oligonukleotidy hybridizujuacute s oligonukleotidovyacutemi sekvenciami prichytenyacutemi na čipe Potom suacute na zaacuteklade fluorescencie detekovaneacute miesta kde došlo k hybridizaacutecii čiže vzorka obsahovala takuacuteto nukleotidovuacute sekvenciu Z jedneacuteho mikročipu sa ziacuteska obrovskeacute množstvo daacutet ktoreacute je vždy nutneacute softveacuterovo spracovať V dnešnej dobe existuje niekoľko firiem poskytujuacutecich komerčne mikročipy na objednaacutevku alebo si ich laboratoacuteria produkujuacute sami

Mikročipovanie prebieha nasledovne

1) Vytvorenie DNA čipu ndash tisiacutece rocircznych jednovlaacuteknovyacutech DNA oligonukleotidov znaacutemych sekvencii sa kovalentne naviažu na povrch doštičky vždy v určitej lokalite je niekoľko rovnakyacutech oligonukleotidov veľkosť takejto lokality je ˂ 200 microm Proacutebami mocircže byť DNA cDNA alebo syntetizovaneacute oligonukleotidy Už hotoveacute mikročipy ponuacutekajuacute viacereacute firmy (Affymetrix Agilent Technologies Eppendorf Illumina) alebo si ich jednotliveacute laboratoacuteria vyraacutebajuacute sami pomocou robotickyacutech zariadeniacute DNA čip sa vytvaacutera buď nanaacutešaniacutem kvapiek oligonukleotidov na podklad alebo synteacutezou oligonukleotidov in situ na čipe 2) Priacuteprava vzorky ndash nukleovaacute kyselina (mRNA DNA) sa purifikuje určiacute sa jej kvantita a kvalita (spektrofotometericky) fragmentuje resp v priacutepade mRNA sa syntetizuje cDNA v priacutepade potreby sa mocircže DNA amplifikovať PCR reakciou štiepiť restrikčnyacutemi endonukleaacutezami 3) Fluorescenčneacute označenie (zriedkavejšie raacutedioaktiacutevne) fragmentov DNA prebieha počas reverznej transkripcie alebo PCR amplifikaacutecie za uacutečasti fluorescenčne značenyacutech nukleotidov Keď sa analyzujuacute dve rocirczne vzorky napr zdraveacute tkanivo a naacutedoroveacute tkanivo označenie nukleovyacutech kyseliacuten v tyacutechto tkanivaacutech byacuteva rozdielne a to použitiacutem dvoch rocircznych fluorescenčnyacutech farbiacutev (napr zeleneacute a červeneacute) Pred hybridizaacuteciou je potrebneacute vzorku denaturovať čiacutem sa vytvoriacute zmes jednovlaacuteknovyacutech DNA označenyacutech značkou 4) Hybridizaacutecia s mikročipom ndash v špeciaacutelnom hybridizačnom roztoku hybridizujuacute komplementaacuterne sekvencie zo vzorky s priacuteslušnyacutemi oligonukleotidovyacutemi sondami naviazanyacutemi na čipe Potom sa čip obmyje aby došlo k odstraacuteneniu čiastočne hybridizovanyacutech nukleovyacutech kyseliacuten 5) Skenovanie mikročipu ndash skenerom čipov docircjde k ožiareniu čipu laserom pričom v mieste hybridizaacutecie fluorescenčne značenyacutech DNA fragmentov s proacutebou docircjde k emisii svetla určitej vlnovej dĺžky ktoruacute skener zaznamenaacute 6) Analyacuteza daacutet prebieha metoacutedami bioinformatiky spracovaniacutem softveacutermi sa zistiacute ktoreacute lokality čipu navzaacutejom hybridizovali v priacutepade použitia dvoch vzoriek kontrolnej a skuacutemanej je možneacute analyzovať ich relatiacutevnu intenzitu hybridizaacutecie (expresie určiteacuteho geacutenu)

Existujuacute štyri typy mikročipov 1) Čipy ur čeneacute na analyacutezu expresie (obsahujuacute cDNA proacuteby) pre tzv dvojkanaacutelovyacute experiment kedy je vzorka určenaacute k hybridizaacutecii na čipe ziacuteskanaacute zmiešaniacutem DNA fragmentov kontrolnej a skuacutemanej vzorky pričom fragmenty suacute rozdielne fluorescenčne označeneacute (napr zelenyacute fluorofoacuter pre kontrolnuacute vzorku a červenyacute pre skuacutemanuacute) Na zaacuteklade intenzity a typu fluorescencie sa deteguje expresia geacutenov typickaacute pre kontrolnuacute vzorku (napr zelenaacute fluorescencia) pre skuacutemanuacute vzorku (napr

48

červenaacute fluorescencia) a expresia podobnaacute u oboch vzoriek (žltaacute fluorescencia) neexprimovaneacute geacuteny (čierna fluorescencia) rocirczne odtiene (v zaacutevislosti od prevažujuacutecej hybridizaacutecie) (obr 48) 2) Čipy ur čeneacute na analyacutezu mutaacutecii použije sa genoacutemovaacute DNA označenaacute jednou fluorescenčnou farbičkou na určenie jednonukleotidovej zmeny (SNP ndash Single Nukleotide Polymorphism) 3) Čipy na komparatiacutevnu genoacutemovuacute hybridizaacuteciu (aCGH array Comparative Genomic Hybridization) ndash použiacutevaneacute na zistenie zvyacutešenia alebo zniacuteženia množstva chromozoacutemovyacutech fragmentov obsahujuacutecich geacuteny zodpovedneacute za určiteacute ochorenie Na analyacutezu sa použije skuacutemanaacute gDNA a referenčnaacute (kontrolnaacute) DNA každaacute sa značiacute inou fluorescenčnou farbičkou (princiacutep ako pri analyacuteze expresie) (obr 49 50) 4) Čipy CGH - SNP kombinovaneacute čipy ur čeneacute na analyacutezu aj mutaacuteciiacute SNP aj na komparatiacutevnu genoacutemovuacute hybridizaacuteciu CGH

Mikročipy majuacute rozsiahle využitie napriacuteklad v identifikaacuteciiacute novyacutech geacutenov vo vyacuteskume ich funkciiacute expresie v rocircznych podmienkach pri diagnostike mnohyacutech ochoreniacute vo farmakogenomike vo vyacuteskume vplyvu toxiacutenov

Obr 48 Heatmapa geacutenovej expresie vybranyacutech geacutenov (mRNA) mikročip obsahuje 46000 cDNA proacuteb (poskytnuteacute Ing Helenou Gbelcovou PhD Uacutestav lekaacuterskej bioloacutegie genetiky a klinickej genetiky LF UK a UNB)

49

Obr 49 Princiacutep komparatiacutevnej genoacutemovej hybridizaacutecie (aCGH - array comparative genomic hybridization) Obr 50 A) Vyacutesledok komparatiacutevnej genoacutemovej hybridizaacutecie (aCGH - array comparative genomic hybridization) vzorky DNA izolovanej plodovej vody U plodu s abnormaacutelnym ultrasonografickyacutem vyšetreniacutem bola identifikovanaacute duplikaacutecia oblasti 3q261q29 (modryacute paacutes) a deleacutecia oblasti 5p1533p151 (červenyacute paacutes) Pre porovnanie chromozoacutem 1 bez aberaacutecie b) Ten istyacute pacient ale ineacute softveacuteroveacute spracovanie (poskytnuteacute RNDr Miroslavom Tomkom PhD Medirex)

50

Odporuacutečanaacute a použitaacute literatuacutera

Odborneacute knihy Klug W S Cummings M R Spencer Ch A Palladino M A Concepts of Genetics jedenaacuteste vydanie (2015) Carson S Molecular Biology Techniques tretie vydanie (2012) Strachan T Read A Human Molecular Genetics štvrteacute vydanie (2011) Sudbery P Sudbery I Human Molecular Genetics tretie vydanie (2009)

Internetoveacute straacutenky

wwwncbinlmnihgov wwwmlpacom wwwthermofishercom wwwilluminacom wwwpromegask wwwqiagencom wwwambioncom

Odborneacute člaacutenky Chacon-Cortes D Griffiths L R Methods for extracting genomic DNA from whole blood samples current perspectives Journal of Biorepository Science for Applied Medicine Volume 2 strany 1- 9 Viltrop T Krjutskov K Palta P Metspalu A Comparison of DNA extraction methods for multiplex polymerase chain reaction Anal Biochem 2010 Volume 398(2) strany 260-262 Ing Martin Čermaacutek Molekulaacuterna cytogenetika v problematike familiaacuternych maligniacutet Onkoloacutegia Volume 2 strany 77 - 83 Livak KJ Schmittgen TD Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method Methods 2001 Volume 25(4) strany 402 - 408 Bustin S A Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays J Mol Endocrinol 2000 Volume 25(2) strany169 - 193

MOLEKULAacuteRNE METOacuteDY AKTUAacuteLNE POUŽIacuteVANEacute V KLINICKEJ GENETIKE RNDr Andrea Pastoraacutekovaacute PhD RNDr Robert Petrovič PhD Vydala Univerzita Komenskeacuteho v Bratislave Lekaacuterska fakulta Rozsah 50 straacuten 246 AH prveacute vydanie ISBN 978-80-223-4231-5

36

Obr 32 Princiacutep sekvenovania novej generaacutecie od firmy Illumina PCR amplifikaacutecia a sekvenovanie sa uskutočňuje na skliacutečku (flow cell) paralelne prebieha až 6 miliaacuterd sekvenaacutecii

632 Sekvenovanie tretej generaacutecie

Pred sekvenovaniacutem netreba amplifikovať DNA PCR metoacutedou ale sekvencia sa ziacuteskava zachyteniacutem signaacutelu v reaacutelnom čase Medzi sekvenovanie tretej generaacutecie patriacute SMRT (Single Molecule Real-Time Sequencing) a Nanopore Sequencing

37

7 Fragmentačnaacute analyacuteza DNA

Je metoacuteda použiacutevanaacute na určenie veľkosti fragmentov DNA ziacuteskanyacutech PCR reakciou Dĺžka amplifikovanyacutech DNA fragmentov sa zistiacute ich porovnaniacutem s veľkostnyacutem štandardom (obr 33) ktoryacute je tvorenyacute DNA fragmentami znaacutemej dĺžky Veľkostnyacute štandard je pred kapilaacuternou elektroforeacutezou zmiešanyacute so vzorkou DNA fragmenty veľkostneacuteho štandardu suacute fluorescenčne označeneacute pričom použiteacute fluorescenčneacute farbivo je ineacute ako fluorescenčneacute farbivo použiteacute na označenie DNA fragmentov vo vyšetrovanej vzorke

Obr 33 Elektroforetogram veľkostneacuteho štandardu použiacutevaneacuteho na určenie veľkostiacute fragmentov analyzovanyacutech kapilaacuternou elektroforeacutezou v genetickom analyzaacutetore (GeneScantrade 500 LIZtrade dye Size Standard) dĺžka fragmentov v nukleotidoch (napr 50 nukleotidov)

Fragmentačnaacute analyacuteza pozostaacuteva z viaceryacutech krokov Prvyacutem je izolaacutecia DNA nasleduje PCR amplifikaacutecia počas ktorej sa novosyntetizovaneacute DNA fragmenty označia fluorescenčnyacutemi farbivami Vzorka s PCR produktom sa pripraviacute na kapilaacuternu elektroforeacutezu tak že sa zmieša s veľkostnyacutem štandardom (sluacuteži na určenie veľkosti fragmentov) a denaturačnou laacutetkou (formamid) nasleduje denaturaacutecia Pripraveneacute vzorky suacute injektovaneacute do priacutestroja (genetickyacute analyzaacutetor) kde v kapilaacutere naplnenej polymeacuterom v elektrickom poli migrujuacute fluorescenčne značeneacute fragmenty DNA na zaacuteklade veľkosti (kapilaacuterna elektroforeacuteza) Počas elektroforeacutezy genetickyacute analyzaacutetor zaznamenaacuteva fluorescenciu fragmentov Analyacutezou daacutet prostredniacutectvom špeciaacutelnych softveacuterov sa ziacuteskajuacute elektroforetogramy z ktoryacutech je možneacute zistiť veľkosť fragmentov ako aj typ fluorescencie (docircležiteacute ak suacute genetickeacute varianty rozliacutešiteľneacute rocircznou fluorescenciou napr SNaPshot) Fragmentačnaacute analyacuteza je suacutečasťou množstva molekulaacuterno-genetickyacutech metoacuted (pozri obr 12 26 28 29 34) ako suacute napr STR analyacuteza (Short Tandem Repeat) AFLP analyacuteza (Amplified Fragment Lenght Polymorfism) RFLPT-RFLP analyacuteza (Restriction Fragment Lenght PolymorfismTerminal Restricted Fragment Lenght Polymorfism) SSCP (Single Strand Conformation Polymorfism) VNTR (Variable Number of Tandem Repeat) analyacuteza straty heterozygotnosti (LOH loss of heterozygozity) MLPA (Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification) MSMSA (Methylation-Sensitive Mobility Shift Assay) SNP genotypovanie (SNaPshotreg) HiCEP (High-Coverage Expression Profiling)

38

Obr 34 Kvantitatiacutevna fragmentačnaacute PCR analyacuteza (QF-PCR) DNA izolovanej z plodovej vody vyacutesledok prenataacutelnej analyacutezy = priacutetomnosť troch piacutekov pre chromozoacutem 18 (u všetkyacutech fragmentov detegujuacutecich chromozoacutem 18 je pomer vyšetrovanyacutech markerov aberantnyacute 21 resp 111) čo znamenaacute trizoacutemiu chromozoacutemu 18 Edwardsov syndroacutem

39

8 Metoacutedy založeneacute na princiacutepe hybridizaacutecie

Nukleoveacute kyseliny majuacute schopnosť vytvaacuterať dvojvlaacuteknoveacute reťazce z jednovlaacuteknovyacutech molekuacutel na zaacuteklade komplementarity baacutez Komplementarita baacutez umožňuje replikaacuteciu DNA transkripciu RNA komplementarita baacutez zabezpečuje teda reprodukovateľnosť živej hmoty

Hybridizaacutecia je proces v ktorom na zaacuteklade komplementarity baacutez dochaacutedza k vytvoreniu dvojvlaacuteknovej nukleovej kyseliny z dvoch jednovlaacuteknovyacutech molekuacutel DNA alebo RNA alebo ich kombinaacuteciou DNA RNA pričom kratšia jednovlaacuteknovaacute nukleovaacute kyselina vystupuje ako sonda (proacuteba) Hybridizaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten je jeden z najpoužiacutevanejšiacutech naacutestrojov v molekulaacuternej bioloacutegii a genetike (hybridizaacutecia primerov alebo proacuteb sa využiacuteva v takmer každej metoacutede - v PCR RT-PCR qPCR RT-qPCR MLPA sekvenovaniacute fragmentačnej analyacuteze FISH DNA mikročipoch atď)

Denaturaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten je proces pri ktorom dochaacutedza k porušeniu vodiacutekovyacutech vaumlzieb medzi vlaacuteknami nukleovyacutech kyseliacuten (strata sekundaacuternej a terciaacutelnej štruktuacutery) tak že docircjde k ich uacuteplneacutemu oddeleniu vzniknuacute jednovlaacuteknoveacute reťazce Denaturaacutecia NK mocircže byť spocircsobenaacute vplyvom vysokyacutech teplocirct pH alebo chemickyacutech laacutetok (denaturačneacute činidlaacute) Renaturaacutecia je opačnyacute proces v ktorom na zaacuteklade komplementarity dochaacutedza k tvorbe dvojvlaacuteknovyacutech NK

Hybridiza čnaacute sonda (proacuteba) je jednovlaacuteknovaacute nukleovaacute kyselina určitej znaacutemej dĺžky a sekvencie (najčastejšie DNA pretože je stabilnejšia ako RNA) ktoraacute je značenaacute a sluacuteži na detekciu komplementaacuternych molekuacutel DNA alebo RNA v procese hybridizaacutecie V zaacutevislosti od podmienok hybridizaacutecie (stringencia) mocircže byť detegovanaacute sekvencia uacuteplne komplementaacuterna alebo v menej priacutesnych podmienkach mocircže mať sekvenčneacute odchyacutelky Proacuteba sluacuteži na vyhľadanie a zviditeľnenie cieľovyacutech NK Zviditeľnenie sa deje prostredniacutectvom označenia proacuteby ešte pred hybridizaacuteciou Značenie proacuteby mocircže byť raacutedioaktiacutevne a neraacutedioaktiacutevne (najčastejšie fluorescenčneacute)

Raacutedioaktiacutevne značeneacute proacuteby pomocou izotopov (32P) sa využiacutevali viac v minulosti v suacutečasnosti suacute kvocircli zdravotnyacutem rizikaacutem ohľaduplnosti k životneacutemu prostrediu ako aj kvocircli jednoduchšej manipulaacutecii použiacutevaneacute fluorescenčne značeneacute proacuteby Raacutedioaktiacutevne značeneacute sondy boli použiacutevaneacute hlavne metoacutedou Southernovej hybridizaacutecie (Southern blotting Southern blot) Citlivosť raacutedioaktiacutevne značenyacutech proacuteb je vyššia dosahuje schopnosť zachytiť 10 fg (femtogram 10-15) cieľovej DNA sekvencie 81 Southern blot

Metoacutedu objavil v roku 1975 britskyacute bioloacuteg Edwin Southern (preto Southern) Pri Southernovej hybridizaacutecii sa restrikčne štiepeneacute fragmenty DNA elektroforeticky separujuacute v geacuteli potom sa metoacutedou blottingu prenesuacute na nylonovuacute alebo nitroceluloacutezovuacute membraacutenu kde suacute naacutesledne hybridizovaneacute v roztoku obsahujuacutecom raacutedioaktiacutevne značenuacute sondu Priloženiacutem fotografickeacuteho filmu k membraacutene a vyvolaniacutem filmu autoraacutediografiou docircjde k zviditeľneniu lokaliacutet kde došlo k hybridizaacuteciiacute raacutedioaktiacutevne značenej sondy s fragmentom DNA (autoraacutediogram) Southern blot bol kľuacutečovou a prvou metoacutedou na identifikaacuteciu osocircb (DNA fingerprinting DNA pofiling) (obr 35)

Okrem Southern blotu existuje Northern blot na analyacutezu RNA (geacutenovej expresie) a Western blot na analyacutezu proteiacutenov postup je obdobnyacute ako pri Southern blote s obmenami špecifickyacutemi pre konkreacutetny blot Pri Northern blote sa použiacutevajuacute hybridizačneacute proacuteby ale pre vizualizaacuteciu proteiacutenov western blotom je potrebneacute použiť protilaacutetky s naacuteslednou vizualizaacuteciou Pomenovanie techniacutek je hra so sloviacutečkami (keďže paacuten Northern ani Western neobjavili takto nazvaneacute techniky)

Neraacutedioaktiacutevne značenie proacuteb použiacutevanyacutech v molekulaacuternej genetike mocircže byť nepriame (použitie haptenu) alebo priame Konečnaacute vizualizaacutecia je najčastejšie zabezpečenaacute fluoreskujuacutecimi farebnyacutemi značkami farbivami fluorochroacutemami (fluorofoacuterami) Pri priamom značeniacute je farbička kovalentne naviazanaacute na nukleotid a na zachytenie fluorescencie suacute potrebneacute špeciaacutelne priacutestroje umožňujuacutece excitaacuteciu farbičky ktoraacute potom emituje žiarenie určitej vlnovej dĺžky (emisneacute žiarenie) a to zachytiacute detekčnyacute systeacutem priacutestroja Využitie fluorochroacutemov v molekulaacuternej genetike je masiacutevne napr na vizualizaacuteciu NK elektroforeticky separovanyacutech v geacuteli kvantifikaacuteciu produktov PCR reakcie v priacutestroji real-time PCR cykleacuter sekvenovaniacute fragmentačnej analyacuteze FISH DNA mikročipoch atď

40

Obr 35 Princiacutep Southern blotu

82 FISH (fluorescenčnaacute in situ hybridizaacutecia)

FISH (fluorescent in situ hybridization fluorescenčnaacute in situ hybridizaacutecia) metoacuteda patriacute medzi molekulovo-cytogenetickeacute techniky Princiacutep FISH metoacutedy je založenyacute na hybridizaacuteciiacute fluorescenčne značenyacutech proacuteb ku komplementaacuternym uacutesekom vyšetrovanej DNA na podložnom skle (priamo na mieste - in situ) K denaturaacutecii dsDNA dochaacutedza buď vplyvom denaturačnyacutech činidiel alebo zvyacutešenou teplotou a naacuteslednou renaturaacuteciou dochaacutedza k naviazaniu sondy na komplementaacuterny uacutesek DNA Vyacutesledok hybridizaacutecie sa vizualizuje fluorescenčnyacutem mikroskopom vybavenyacutem vhodnyacutemi fluorescenčnyacutemi filtrami a vizuaacutelne zhodnotiacute skuacutesenyacutem odborniacutekom Fluorescencia sa v niektoryacutech priacutepadoch mocircže zaznamenať a hodnotiť aj pomocou softveacuteru (obr 36)

Pomocou FISH detegujeme numerickeacute aberaacutecie - zmeny v počte chromozoacutemov (napr trizoacutemia monozoacutemia chromozoacutemov) alebo štruktuacuterne aberaacutecie a prestavby (napr translokaacutecie inverzie deleacutecie duplikaacutecie amplifikaacutecie) FISH metoacuteda umožňuje identifikaacuteciu a detekciu každeacuteho ľudskeacuteho chromozoacutemu jeho zaradenie do karyotypu odhalenie malyacutech submikroskopickyacutech chromozoacutemovyacutech zmien a tiež mapovať poziacutecie jednotlivyacutech geacutenov na chromozoacuteme

41

Obr 36 Princiacutep štandardnej FISH a FISH maľovania celeacuteho chromozoacutemu

Veľkou vyacutehodou FISH metoacutedy je možnosť analyacutezy buniek v metafaacuteze aj v interfaacuteze kedy nie je nutnaacute kultivaacutecia buniek a tiež ryacutechle analyzovanie veľkeacuteho počtu buniek (stovky až tisiacutece) K ďalšiacutem vyacutehodaacutem patriacute bezpečnosť vysokaacute citlivosť dostatočnaacute stabilita relatiacutevne kraacutetky čas hybridizaacutecie a možnosť ryacutechleho vyhodnotenia Hybridizaacutecia pri vaumlčšine suacutečasne dodaacutevanyacutech sond trvaacute 10-12 hodin (na trhu suacute už dostupneacute aj sondy so skraacutetenyacutem časom hybridizaacutecie na 2-3 hodiny) Po hybridizaacuteciiacute nasleduje odmyacutevanie kedy pri priacuteslušnej teplote dochaacutedza k odmytiu nenaviazanyacutech a nespraacutevne hybridizovanyacutech sond Preparaacutet sa naacutesledne podfarbiacute a vyacutesledok sa zhodnotiacute vo fluorescenčnom mikroskope Na podfarbenie chromozoacutemov alebo jadier sa použiacuteva modreacute kontrastneacute farbivo DAPI (46-diamidino-2-fenylindol) ktoreacute maacute silneacute fluorescenčneacute vlastnosti dokaacuteže prechaacutedzať jadrovou membraacutenou a viazať sa na DNA Vyacutesledkom je modreacute zafarbenie ktoreacute vyacuteborne kontrastuje so signaacutelmi jednotlivyacutech sond

Limitujuacutecim faktorom FISH je možnosť identifikaacutecie len tyacutech uacutesekov DNA ku ktoryacutem suacute použiteacute sondy V jednej analyacuteze je možneacute použiť najviac 3 odlišne značeneacute sondy a tak zistiť priacutepadneacute abnormality len na 1 alebo na paacuter lokusoch Na relevantnuacute detekciu je potrebneacute mať vo vzorke 1-5 aberantnyacutech interfaacutezovyacutech jadier

FISH je možneacute uskutočniť na širokej škaacutele biologickeacuteho materiaacutelu na vzorkaacutech perifeacuternej krvi kostnej drene naacuteteroch choriovyacutech klkoch plodovej vode rocircznych druhov tkaniacutev natiacutevnych alebo zaliatych v parafiacutene na 1 bunke (predimplantačnaacute genetickaacute diagnostika PGD) (obr 37)

Využiacuteva sa na detekciu aberaacuteciiacute pri mnohyacutech onkologickyacutech ochoreniach (napr pri diagnoacuteze mnohopočetnyacute myeloacutem sa v suacutečasnosti po separaacutecii CD138+ buniek robiacute FISH s 5 sondami pre geacuteny IGH TP53 RB1 oblasť 1p321q21 a stanovuje sa hyperploidia chromozoacutemov 5 9 a 15) a tiež k spresneniu doplneniu a k overeniu bežneacuteho cytogenetickeacuteho vyšetrenia

Podľa miesta na chromozoacuteme na ktorom dochaacutedza k hybridizaacutecii sondy rozlišujeme 4 typy

DNA sond bull centromeacuteroveacute sondy ndash sa viažu na strednuacute časť chromozoacutemu ndash centromeacuteru sluacutežia k diagnostike zmien v počte chromozoacutemov k detekcii chromozoacutemov neznaacutemeho pocircvodu umožňujuacute interfaacuteznu FISH na nedeliacich sa bunkaacutech (obr 38-41)

42

Obr 37 Interfaacutezna FISH preimplantačnyacute genetickyacute skriacutening aneuploidiiacute ndash blastomeacutera 3-denneacuteho ľudskeacuteho embrya s normaacutelnym počtom chromozoacutemov 13 18 21 pohlavie XY použityacutech 5 sond pre chromozoacutemy 13 ndash orange 18 ndash aqua 21 ndash green X ndash blue a Y ndash yellow (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

Obr 38 Interfaacutezne jadro po hybridizaacutecii s centromeacuterovou sondou pre chromozoacutem 8 (Vysis Abbott) V pravom jadre je priacutetomnaacute trizoacutemia chromozoacutemu 8 (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex) Obr 39 Metafaacutezna (A) a interfaacutezna FISH (B) použitaacute centromeacuterovaacute sonda CEPX spectrum orangeCEPY spectrum green (Vysis Abbott) Sonda hybridizuje k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (červenyacute signaacutel) a Y (zelenyacute signaacutel) (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

43

Obr 40 Interfaacutezna FISH vyšetrenie spermiiacute použiteacute sondy CEPX greenCEPY orange (Aneuscore Metasystems) Sondy hybridizujuacute k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (zelenyacute signaacutel) Y (červenyacute signaacutel) vľavo ndash dve haploidneacute spermie (majuacutece jedna spermia X druhaacute Y chromozoacutem) vpravo ndash dve patologickeacute spermie obsahujuacutece gonozoacutemovyacute komplement XY (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

Obr 41 Interfaacutezna FISH vyšetrenie spermiiacute použiteacute sondy CEPX greenCEPY orange a CEP18 aqua (Aneuscore Metasystems) Sondy hybridizujuacute k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (zelenyacute signaacutel) Y (červenyacute signaacutel) a 18 (modryacute signaacutel) vľavo ndash normaacutelne haploidneacute ľudskeacute spermie - 1x chromozoacutem X alebo Y a jedenkraacutet chromozoacutem 18 v strede ndash patologickaacute spermia obsahujuacuteca gonozoacutemovyacute komplement XY a jeden chromozoacutem 18 vpravo ndash patologickaacute diploidnaacute spermia s chromozoacutemami X Y a dvoma chromozoacutemami 18 (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

bull lokusovo špecifickeacute sondy ndash hybridizaacutecia prebehne na konkreacutetnom mieste geacutenu (lokuse) (obr 42-44) použiacutevajuacute sa k vyšetreniu mikrodeleacuteciiacute (straty malyacutech častiacute chromozoacutemu pri mikrodelečnyacutech syndroacutemoch) k zisteniu amplifikaacutecie onkogeacutenov a niektoryacutech špecifickyacutech translokaacuteciiacute prestavby geacutenov umožňujuacute interfaacuteznu FISH na nedeliacich sa bunkaacutech bull subtelomeroveacute ndash vaumlzba na koncoveacute časti chromozoacutemu ndash telomeacutery bull celochromozoacutemoveacute alebo celomaľovacie sondy ndash sondy hybridizujuacute s mnohopočetnyacutemi chromozoacutemovyacutemi sekvenciami pričom sa fluorescenčne tak bdquovymaľujeldquo celyacute chromozoacutem (Obr 45) Použiacutevajuacute sa na vyšetrenie chromozoacutemovyacutech prestavieb k analyacuteze translokaacuteciiacute a k detekcii pocircvodu tzv marker chromozoacutemov (malyacutech nadpočetnyacutech chromozoacutemov neznaacutemeho pocircvodu) K použitiu sondy suacute potrebneacute metafaacutezne chromozoacutemy nepoužiacutevaju sa pre interfaacuteznu FISH

Pri konvenčnej chromozoacutemovej FISH suacute homogeacutenne DNA proacuteby hybridizovaneacute s fixovanyacutem metafaacuteznym alebo prometafaacuteznym chromozoacutemomchromozoacutemami na skliacutečku (Obr 36a) Maximaacutelna rozlišovacia schopnosť metafaacuteznej FISH je niekoľko megabaacutez (Obr 39a 45) využitiacutem viac

44

natiahnutyacutech prometafaacuteznych chromozoacutemov sa dosiahne 1 Mb rozliacutešenie Prostredniacutectvom fiber FISH konkreacutetne artificiaacutelne deproteinizovanej natiahnutej DNA pripravenej in situ z celyacutech buniek na mikroskopickom skliacutečku je možneacute vizualizovať individuaacutelne geacuteny maleacute DNA elementy na chromozoacuteme s rozliacutešeniacutem okolo 1000 bp

Obr 42 Interfaacutezne jadro po hybridizaacutecii s lokusovo-špecifickou sondou LSI 5q31 Spectrum Orange5p12 Spectrum Green (Vysis Abbott) Na ľavom obraacutezku suacute priacutetomneacute dva červeneacute (5q31) a dva zeleneacute signaacutely (5p12) v pravom jadre je priacutetomnaacute deleacutecia 5q31 oblasti chyacuteba jeden červenyacute signal (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

Obr 43 Interfaacutezna FISH použitaacute lokusovo-špecifickaacute sonda ndash translokačnaacute - XL BCRABL1 plus (Metasystems) dvojfarebnaacute dvojfuacutezna kde červenaacute označuje lokus ABL1 na chromozoacuteme 9 a zelenaacute oblasť BCR na chromozoacuteme 22 Sonda deteguje fuacuteziu protoonkogeacutenu ABL1 (9q34) a geacutenu BCR (22q11) v priacutepade že červenyacute a zelenyacute signaacutel suacute pri sebe (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

45

Obr 44 Interfaacutezna FISH Použitaacute lokusovo-špecifickaacute sonda- typ break apart pre IGH geacuten V docircsledku translokaacutecie došlo k rozskočeniu geacutenu pričom translokačneacuteho partnera nepoznaacuteme vieme určiť len percento v koľkyacutech jadraacutech je geacuten prestavanyacute (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex) Obr 45 Použiteacute celochromozoacutemoveacute sondy WCP 15 (červenyacute chromozoacutem) a WCP 17 (zelenyacute chromozoacutem) Na metafaacuteze je potvrdenaacute reciprokaacute translokaacutecia t(1517)(q2221) (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

FISH vizualizaacutecia celeacuteho chromozoacutemu maľovanie chromozoacutemu anglicky chromosome

painting je špeciaacutelnou aplikaacuteciou chromozoacutemovej FISH proacuteba je koktail veľkeacuteho počtu rocircznych fluorescenčne značenyacutech DNA fragmentov hybridizujuacutecich pozdĺž celeacuteho konkreacutetneho chromozoacutemu (obr 36b 45) bdquoChromosomepaintingldquo analyzuje metafaacutezne chromozoacutemy V minulosti bola FISH vizualizaacutecia celyacutech chromozoacutemov limitovanaacute malyacutem množstvom rocirczne sfarbenyacutech fluorochroacutemov

V suacutečasnosti je možneacute detegovať množstvo cieľovyacutech sekvenciiacute naraz čo sa využiacuteva pri celogenoacutemovej chromozoacutemovej vizualizaacutecii (whole-chromosomepainting - WCP) metoacutedou multiplex FISH (M-FISH multicolor FISH o br 46) alebo spektraacutelnej karyotypizaacutecie (SKY) kedy možno rozliacutešiť všetky ľudskeacute chromozoacutemy ndash teda 24 rocircznych chromozoacutemov M-FISH a SKY patria medzi metafaacutezne formy FISH diagnostiky ktoreacute umožňujuacute simultaacutennu vizualizaacuteciu všetkyacutech ľudskyacutech chromozoacutemov v rocircznych farbaacutech čo predstavuje uľahčenie analyacutezy karyotypu hlavne pri komplexnyacutech zmenaacutech a markeroch neznaacutemeho pocircvodu Obe techniky vychaacutedzajuacute z použitia

46

celochromozoacutemovyacutech sond značenyacutech kombinaacuteciou viaceryacutech fluorochroacutemov Rozdiel medzi M-FISH a SKY spočiacuteva v technike ziacuteskania konečneacuteho obrazu

Obr 46 Multicolor FISH - každyacute chromozoacutemovyacute paacuter je zafarbenyacute inou farbou pričom na ich zafarbenie postačuje kombinaacutecia 5 fluorochroacutemov Na vyhodnocovanie je potrebnaacute špeciaacutelna sada fluorescenčnyacutech filtrov pre jednotliveacute fluorochroacutemy a špeciaacutelnyacute softweacuter Vľavo-štandardnyacute karyotyp vpravo karyotyp s mutaacuteciami (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

V molekulovej cytogenetike suacute komerčne dostupneacute sety M-FISH proacuteb umožňujuacutece

viacfarebneacute pruacutežkovanie chromozoacutemov (banding) s vysokyacutem rozliacutešeniacutem (multicolor-banding mBAND FISH MCB) čo umožňuje identifikaacuteciu intrachromozoacutemovyacutech prestavieb (Obr 47) Nevyhnutnosťou mBAND-u je mať chromozoacutemy v metafaacuteze Taacuteto metoacuteda bola prvyacutekraacutet uskutočnenaacute na chromozoacuteme 5 v roku 1999 mBAND FISH umožňuje rozliacutešiť špecifickeacute oblasti chromozoacutemov na uacuterovni pruacutežku - bandu a sub-bandu s detekciou 550 bandov haploidneacuteho karyotypu

Obr 47 A - mBAND chromozoacutemu 11 - inverzia duplikovanej oblasti 11q223-q25 B - mBAND chromozoacutemu 3 - na kruhovom chromozoacuteme deleacutecia oblasti 3p263 C - mBAND chromozoacutemu 2 - potvrdenie inverzie duplikovanej časti chromozoacutemu (poskytnuteacute RNDr Dagmar Landlovou Medirex)

FISH metoacuteda a jej varianty (M-FISH mBAND SKY) majuacute v suacutečasnosti širokeacute využitie v

klinickej genetike v onkologickej genetike na detekciu aberaacuteciiacute v čase diagnoacutezy počas liečby po

47

liečbe monitorovanie po transplantaacutecii kostnej drene v prenataacutelnej a postnataacutelnej diagnostike pri detekcii submikroskopickyacutech deleacuteciiacute (napr DiGeorge syndroacutem - 22q112 delečnyacute syndroacutem PraderndashWilli syndroacutem- chromozoacutem 15q11-13) prostredniacutectvom FISH je možnaacute detekcia numerickyacutech zmien chromozoacutemov (trizoacutemia chromozoacutemu 21 pri Downovom syndroacuteme trizoacutemia chromozoacutemu 15 pri Patauovom syndroacuteme trizoacutemia chromozoacutemu 18 pri Edwardsovom syndroacuteme) rocirczne zmeny v počte pohlavnyacutech chromozoacutemov (monozoacutemia X pri Turnerovom syndroacuteme Klinefelterov syndroacutem s X chromozoacutemom naviac - XXY) podobne v predimplantačnej diagnostike

83 DNA Microarray (DNA mikro čip biočip) DNA mikročipovanie je technika využiacutevajuacuteca hybridizaacuteciu skuacutemanej nukleovej kyseliny

(cieľovaacute vzorka) s veľkyacutem množstvom oligonukleotidovyacutech proacuteb (desať tisiacutec až milioacuten) ktoreacute suacute prichyteneacute na pevnyacute podklad najčastejšie sklenyacute silikoacutenovyacute alebo nylonovyacute (doštička čip) Skuacutemanaacute nukleovaacute kyselina je pred hybridizaacuteciou fragmentovanaacute označenaacute fluorofoacuterom a denaturovanaacute Po kontakte čipu s cieľovou vzorkou ktoraacute je vlastne zmes označenyacutech oligonukleotidov značeneacute oligonukleotidy hybridizujuacute s oligonukleotidovyacutemi sekvenciami prichytenyacutemi na čipe Potom suacute na zaacuteklade fluorescencie detekovaneacute miesta kde došlo k hybridizaacutecii čiže vzorka obsahovala takuacuteto nukleotidovuacute sekvenciu Z jedneacuteho mikročipu sa ziacuteska obrovskeacute množstvo daacutet ktoreacute je vždy nutneacute softveacuterovo spracovať V dnešnej dobe existuje niekoľko firiem poskytujuacutecich komerčne mikročipy na objednaacutevku alebo si ich laboratoacuteria produkujuacute sami

Mikročipovanie prebieha nasledovne

1) Vytvorenie DNA čipu ndash tisiacutece rocircznych jednovlaacuteknovyacutech DNA oligonukleotidov znaacutemych sekvencii sa kovalentne naviažu na povrch doštičky vždy v určitej lokalite je niekoľko rovnakyacutech oligonukleotidov veľkosť takejto lokality je ˂ 200 microm Proacutebami mocircže byť DNA cDNA alebo syntetizovaneacute oligonukleotidy Už hotoveacute mikročipy ponuacutekajuacute viacereacute firmy (Affymetrix Agilent Technologies Eppendorf Illumina) alebo si ich jednotliveacute laboratoacuteria vyraacutebajuacute sami pomocou robotickyacutech zariadeniacute DNA čip sa vytvaacutera buď nanaacutešaniacutem kvapiek oligonukleotidov na podklad alebo synteacutezou oligonukleotidov in situ na čipe 2) Priacuteprava vzorky ndash nukleovaacute kyselina (mRNA DNA) sa purifikuje určiacute sa jej kvantita a kvalita (spektrofotometericky) fragmentuje resp v priacutepade mRNA sa syntetizuje cDNA v priacutepade potreby sa mocircže DNA amplifikovať PCR reakciou štiepiť restrikčnyacutemi endonukleaacutezami 3) Fluorescenčneacute označenie (zriedkavejšie raacutedioaktiacutevne) fragmentov DNA prebieha počas reverznej transkripcie alebo PCR amplifikaacutecie za uacutečasti fluorescenčne značenyacutech nukleotidov Keď sa analyzujuacute dve rocirczne vzorky napr zdraveacute tkanivo a naacutedoroveacute tkanivo označenie nukleovyacutech kyseliacuten v tyacutechto tkanivaacutech byacuteva rozdielne a to použitiacutem dvoch rocircznych fluorescenčnyacutech farbiacutev (napr zeleneacute a červeneacute) Pred hybridizaacuteciou je potrebneacute vzorku denaturovať čiacutem sa vytvoriacute zmes jednovlaacuteknovyacutech DNA označenyacutech značkou 4) Hybridizaacutecia s mikročipom ndash v špeciaacutelnom hybridizačnom roztoku hybridizujuacute komplementaacuterne sekvencie zo vzorky s priacuteslušnyacutemi oligonukleotidovyacutemi sondami naviazanyacutemi na čipe Potom sa čip obmyje aby došlo k odstraacuteneniu čiastočne hybridizovanyacutech nukleovyacutech kyseliacuten 5) Skenovanie mikročipu ndash skenerom čipov docircjde k ožiareniu čipu laserom pričom v mieste hybridizaacutecie fluorescenčne značenyacutech DNA fragmentov s proacutebou docircjde k emisii svetla určitej vlnovej dĺžky ktoruacute skener zaznamenaacute 6) Analyacuteza daacutet prebieha metoacutedami bioinformatiky spracovaniacutem softveacutermi sa zistiacute ktoreacute lokality čipu navzaacutejom hybridizovali v priacutepade použitia dvoch vzoriek kontrolnej a skuacutemanej je možneacute analyzovať ich relatiacutevnu intenzitu hybridizaacutecie (expresie určiteacuteho geacutenu)

Existujuacute štyri typy mikročipov 1) Čipy ur čeneacute na analyacutezu expresie (obsahujuacute cDNA proacuteby) pre tzv dvojkanaacutelovyacute experiment kedy je vzorka určenaacute k hybridizaacutecii na čipe ziacuteskanaacute zmiešaniacutem DNA fragmentov kontrolnej a skuacutemanej vzorky pričom fragmenty suacute rozdielne fluorescenčne označeneacute (napr zelenyacute fluorofoacuter pre kontrolnuacute vzorku a červenyacute pre skuacutemanuacute) Na zaacuteklade intenzity a typu fluorescencie sa deteguje expresia geacutenov typickaacute pre kontrolnuacute vzorku (napr zelenaacute fluorescencia) pre skuacutemanuacute vzorku (napr

48

červenaacute fluorescencia) a expresia podobnaacute u oboch vzoriek (žltaacute fluorescencia) neexprimovaneacute geacuteny (čierna fluorescencia) rocirczne odtiene (v zaacutevislosti od prevažujuacutecej hybridizaacutecie) (obr 48) 2) Čipy ur čeneacute na analyacutezu mutaacutecii použije sa genoacutemovaacute DNA označenaacute jednou fluorescenčnou farbičkou na určenie jednonukleotidovej zmeny (SNP ndash Single Nukleotide Polymorphism) 3) Čipy na komparatiacutevnu genoacutemovuacute hybridizaacuteciu (aCGH array Comparative Genomic Hybridization) ndash použiacutevaneacute na zistenie zvyacutešenia alebo zniacuteženia množstva chromozoacutemovyacutech fragmentov obsahujuacutecich geacuteny zodpovedneacute za určiteacute ochorenie Na analyacutezu sa použije skuacutemanaacute gDNA a referenčnaacute (kontrolnaacute) DNA každaacute sa značiacute inou fluorescenčnou farbičkou (princiacutep ako pri analyacuteze expresie) (obr 49 50) 4) Čipy CGH - SNP kombinovaneacute čipy ur čeneacute na analyacutezu aj mutaacuteciiacute SNP aj na komparatiacutevnu genoacutemovuacute hybridizaacuteciu CGH

Mikročipy majuacute rozsiahle využitie napriacuteklad v identifikaacuteciiacute novyacutech geacutenov vo vyacuteskume ich funkciiacute expresie v rocircznych podmienkach pri diagnostike mnohyacutech ochoreniacute vo farmakogenomike vo vyacuteskume vplyvu toxiacutenov

Obr 48 Heatmapa geacutenovej expresie vybranyacutech geacutenov (mRNA) mikročip obsahuje 46000 cDNA proacuteb (poskytnuteacute Ing Helenou Gbelcovou PhD Uacutestav lekaacuterskej bioloacutegie genetiky a klinickej genetiky LF UK a UNB)

49

Obr 49 Princiacutep komparatiacutevnej genoacutemovej hybridizaacutecie (aCGH - array comparative genomic hybridization) Obr 50 A) Vyacutesledok komparatiacutevnej genoacutemovej hybridizaacutecie (aCGH - array comparative genomic hybridization) vzorky DNA izolovanej plodovej vody U plodu s abnormaacutelnym ultrasonografickyacutem vyšetreniacutem bola identifikovanaacute duplikaacutecia oblasti 3q261q29 (modryacute paacutes) a deleacutecia oblasti 5p1533p151 (červenyacute paacutes) Pre porovnanie chromozoacutem 1 bez aberaacutecie b) Ten istyacute pacient ale ineacute softveacuteroveacute spracovanie (poskytnuteacute RNDr Miroslavom Tomkom PhD Medirex)

50

Odporuacutečanaacute a použitaacute literatuacutera

Odborneacute knihy Klug W S Cummings M R Spencer Ch A Palladino M A Concepts of Genetics jedenaacuteste vydanie (2015) Carson S Molecular Biology Techniques tretie vydanie (2012) Strachan T Read A Human Molecular Genetics štvrteacute vydanie (2011) Sudbery P Sudbery I Human Molecular Genetics tretie vydanie (2009)

Internetoveacute straacutenky

wwwncbinlmnihgov wwwmlpacom wwwthermofishercom wwwilluminacom wwwpromegask wwwqiagencom wwwambioncom

Odborneacute člaacutenky Chacon-Cortes D Griffiths L R Methods for extracting genomic DNA from whole blood samples current perspectives Journal of Biorepository Science for Applied Medicine Volume 2 strany 1- 9 Viltrop T Krjutskov K Palta P Metspalu A Comparison of DNA extraction methods for multiplex polymerase chain reaction Anal Biochem 2010 Volume 398(2) strany 260-262 Ing Martin Čermaacutek Molekulaacuterna cytogenetika v problematike familiaacuternych maligniacutet Onkoloacutegia Volume 2 strany 77 - 83 Livak KJ Schmittgen TD Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method Methods 2001 Volume 25(4) strany 402 - 408 Bustin S A Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays J Mol Endocrinol 2000 Volume 25(2) strany169 - 193

MOLEKULAacuteRNE METOacuteDY AKTUAacuteLNE POUŽIacuteVANEacute V KLINICKEJ GENETIKE RNDr Andrea Pastoraacutekovaacute PhD RNDr Robert Petrovič PhD Vydala Univerzita Komenskeacuteho v Bratislave Lekaacuterska fakulta Rozsah 50 straacuten 246 AH prveacute vydanie ISBN 978-80-223-4231-5

37

7 Fragmentačnaacute analyacuteza DNA

Je metoacuteda použiacutevanaacute na určenie veľkosti fragmentov DNA ziacuteskanyacutech PCR reakciou Dĺžka amplifikovanyacutech DNA fragmentov sa zistiacute ich porovnaniacutem s veľkostnyacutem štandardom (obr 33) ktoryacute je tvorenyacute DNA fragmentami znaacutemej dĺžky Veľkostnyacute štandard je pred kapilaacuternou elektroforeacutezou zmiešanyacute so vzorkou DNA fragmenty veľkostneacuteho štandardu suacute fluorescenčne označeneacute pričom použiteacute fluorescenčneacute farbivo je ineacute ako fluorescenčneacute farbivo použiteacute na označenie DNA fragmentov vo vyšetrovanej vzorke

Obr 33 Elektroforetogram veľkostneacuteho štandardu použiacutevaneacuteho na určenie veľkostiacute fragmentov analyzovanyacutech kapilaacuternou elektroforeacutezou v genetickom analyzaacutetore (GeneScantrade 500 LIZtrade dye Size Standard) dĺžka fragmentov v nukleotidoch (napr 50 nukleotidov)

Fragmentačnaacute analyacuteza pozostaacuteva z viaceryacutech krokov Prvyacutem je izolaacutecia DNA nasleduje PCR amplifikaacutecia počas ktorej sa novosyntetizovaneacute DNA fragmenty označia fluorescenčnyacutemi farbivami Vzorka s PCR produktom sa pripraviacute na kapilaacuternu elektroforeacutezu tak že sa zmieša s veľkostnyacutem štandardom (sluacuteži na určenie veľkosti fragmentov) a denaturačnou laacutetkou (formamid) nasleduje denaturaacutecia Pripraveneacute vzorky suacute injektovaneacute do priacutestroja (genetickyacute analyzaacutetor) kde v kapilaacutere naplnenej polymeacuterom v elektrickom poli migrujuacute fluorescenčne značeneacute fragmenty DNA na zaacuteklade veľkosti (kapilaacuterna elektroforeacuteza) Počas elektroforeacutezy genetickyacute analyzaacutetor zaznamenaacuteva fluorescenciu fragmentov Analyacutezou daacutet prostredniacutectvom špeciaacutelnych softveacuterov sa ziacuteskajuacute elektroforetogramy z ktoryacutech je možneacute zistiť veľkosť fragmentov ako aj typ fluorescencie (docircležiteacute ak suacute genetickeacute varianty rozliacutešiteľneacute rocircznou fluorescenciou napr SNaPshot) Fragmentačnaacute analyacuteza je suacutečasťou množstva molekulaacuterno-genetickyacutech metoacuted (pozri obr 12 26 28 29 34) ako suacute napr STR analyacuteza (Short Tandem Repeat) AFLP analyacuteza (Amplified Fragment Lenght Polymorfism) RFLPT-RFLP analyacuteza (Restriction Fragment Lenght PolymorfismTerminal Restricted Fragment Lenght Polymorfism) SSCP (Single Strand Conformation Polymorfism) VNTR (Variable Number of Tandem Repeat) analyacuteza straty heterozygotnosti (LOH loss of heterozygozity) MLPA (Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification) MSMSA (Methylation-Sensitive Mobility Shift Assay) SNP genotypovanie (SNaPshotreg) HiCEP (High-Coverage Expression Profiling)

38

Obr 34 Kvantitatiacutevna fragmentačnaacute PCR analyacuteza (QF-PCR) DNA izolovanej z plodovej vody vyacutesledok prenataacutelnej analyacutezy = priacutetomnosť troch piacutekov pre chromozoacutem 18 (u všetkyacutech fragmentov detegujuacutecich chromozoacutem 18 je pomer vyšetrovanyacutech markerov aberantnyacute 21 resp 111) čo znamenaacute trizoacutemiu chromozoacutemu 18 Edwardsov syndroacutem

39

8 Metoacutedy založeneacute na princiacutepe hybridizaacutecie

Nukleoveacute kyseliny majuacute schopnosť vytvaacuterať dvojvlaacuteknoveacute reťazce z jednovlaacuteknovyacutech molekuacutel na zaacuteklade komplementarity baacutez Komplementarita baacutez umožňuje replikaacuteciu DNA transkripciu RNA komplementarita baacutez zabezpečuje teda reprodukovateľnosť živej hmoty

Hybridizaacutecia je proces v ktorom na zaacuteklade komplementarity baacutez dochaacutedza k vytvoreniu dvojvlaacuteknovej nukleovej kyseliny z dvoch jednovlaacuteknovyacutech molekuacutel DNA alebo RNA alebo ich kombinaacuteciou DNA RNA pričom kratšia jednovlaacuteknovaacute nukleovaacute kyselina vystupuje ako sonda (proacuteba) Hybridizaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten je jeden z najpoužiacutevanejšiacutech naacutestrojov v molekulaacuternej bioloacutegii a genetike (hybridizaacutecia primerov alebo proacuteb sa využiacuteva v takmer každej metoacutede - v PCR RT-PCR qPCR RT-qPCR MLPA sekvenovaniacute fragmentačnej analyacuteze FISH DNA mikročipoch atď)

Denaturaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten je proces pri ktorom dochaacutedza k porušeniu vodiacutekovyacutech vaumlzieb medzi vlaacuteknami nukleovyacutech kyseliacuten (strata sekundaacuternej a terciaacutelnej štruktuacutery) tak že docircjde k ich uacuteplneacutemu oddeleniu vzniknuacute jednovlaacuteknoveacute reťazce Denaturaacutecia NK mocircže byť spocircsobenaacute vplyvom vysokyacutech teplocirct pH alebo chemickyacutech laacutetok (denaturačneacute činidlaacute) Renaturaacutecia je opačnyacute proces v ktorom na zaacuteklade komplementarity dochaacutedza k tvorbe dvojvlaacuteknovyacutech NK

Hybridiza čnaacute sonda (proacuteba) je jednovlaacuteknovaacute nukleovaacute kyselina určitej znaacutemej dĺžky a sekvencie (najčastejšie DNA pretože je stabilnejšia ako RNA) ktoraacute je značenaacute a sluacuteži na detekciu komplementaacuternych molekuacutel DNA alebo RNA v procese hybridizaacutecie V zaacutevislosti od podmienok hybridizaacutecie (stringencia) mocircže byť detegovanaacute sekvencia uacuteplne komplementaacuterna alebo v menej priacutesnych podmienkach mocircže mať sekvenčneacute odchyacutelky Proacuteba sluacuteži na vyhľadanie a zviditeľnenie cieľovyacutech NK Zviditeľnenie sa deje prostredniacutectvom označenia proacuteby ešte pred hybridizaacuteciou Značenie proacuteby mocircže byť raacutedioaktiacutevne a neraacutedioaktiacutevne (najčastejšie fluorescenčneacute)

Raacutedioaktiacutevne značeneacute proacuteby pomocou izotopov (32P) sa využiacutevali viac v minulosti v suacutečasnosti suacute kvocircli zdravotnyacutem rizikaacutem ohľaduplnosti k životneacutemu prostrediu ako aj kvocircli jednoduchšej manipulaacutecii použiacutevaneacute fluorescenčne značeneacute proacuteby Raacutedioaktiacutevne značeneacute sondy boli použiacutevaneacute hlavne metoacutedou Southernovej hybridizaacutecie (Southern blotting Southern blot) Citlivosť raacutedioaktiacutevne značenyacutech proacuteb je vyššia dosahuje schopnosť zachytiť 10 fg (femtogram 10-15) cieľovej DNA sekvencie 81 Southern blot

Metoacutedu objavil v roku 1975 britskyacute bioloacuteg Edwin Southern (preto Southern) Pri Southernovej hybridizaacutecii sa restrikčne štiepeneacute fragmenty DNA elektroforeticky separujuacute v geacuteli potom sa metoacutedou blottingu prenesuacute na nylonovuacute alebo nitroceluloacutezovuacute membraacutenu kde suacute naacutesledne hybridizovaneacute v roztoku obsahujuacutecom raacutedioaktiacutevne značenuacute sondu Priloženiacutem fotografickeacuteho filmu k membraacutene a vyvolaniacutem filmu autoraacutediografiou docircjde k zviditeľneniu lokaliacutet kde došlo k hybridizaacuteciiacute raacutedioaktiacutevne značenej sondy s fragmentom DNA (autoraacutediogram) Southern blot bol kľuacutečovou a prvou metoacutedou na identifikaacuteciu osocircb (DNA fingerprinting DNA pofiling) (obr 35)

Okrem Southern blotu existuje Northern blot na analyacutezu RNA (geacutenovej expresie) a Western blot na analyacutezu proteiacutenov postup je obdobnyacute ako pri Southern blote s obmenami špecifickyacutemi pre konkreacutetny blot Pri Northern blote sa použiacutevajuacute hybridizačneacute proacuteby ale pre vizualizaacuteciu proteiacutenov western blotom je potrebneacute použiť protilaacutetky s naacuteslednou vizualizaacuteciou Pomenovanie techniacutek je hra so sloviacutečkami (keďže paacuten Northern ani Western neobjavili takto nazvaneacute techniky)

Neraacutedioaktiacutevne značenie proacuteb použiacutevanyacutech v molekulaacuternej genetike mocircže byť nepriame (použitie haptenu) alebo priame Konečnaacute vizualizaacutecia je najčastejšie zabezpečenaacute fluoreskujuacutecimi farebnyacutemi značkami farbivami fluorochroacutemami (fluorofoacuterami) Pri priamom značeniacute je farbička kovalentne naviazanaacute na nukleotid a na zachytenie fluorescencie suacute potrebneacute špeciaacutelne priacutestroje umožňujuacutece excitaacuteciu farbičky ktoraacute potom emituje žiarenie určitej vlnovej dĺžky (emisneacute žiarenie) a to zachytiacute detekčnyacute systeacutem priacutestroja Využitie fluorochroacutemov v molekulaacuternej genetike je masiacutevne napr na vizualizaacuteciu NK elektroforeticky separovanyacutech v geacuteli kvantifikaacuteciu produktov PCR reakcie v priacutestroji real-time PCR cykleacuter sekvenovaniacute fragmentačnej analyacuteze FISH DNA mikročipoch atď

40

Obr 35 Princiacutep Southern blotu

82 FISH (fluorescenčnaacute in situ hybridizaacutecia)

FISH (fluorescent in situ hybridization fluorescenčnaacute in situ hybridizaacutecia) metoacuteda patriacute medzi molekulovo-cytogenetickeacute techniky Princiacutep FISH metoacutedy je založenyacute na hybridizaacuteciiacute fluorescenčne značenyacutech proacuteb ku komplementaacuternym uacutesekom vyšetrovanej DNA na podložnom skle (priamo na mieste - in situ) K denaturaacutecii dsDNA dochaacutedza buď vplyvom denaturačnyacutech činidiel alebo zvyacutešenou teplotou a naacuteslednou renaturaacuteciou dochaacutedza k naviazaniu sondy na komplementaacuterny uacutesek DNA Vyacutesledok hybridizaacutecie sa vizualizuje fluorescenčnyacutem mikroskopom vybavenyacutem vhodnyacutemi fluorescenčnyacutemi filtrami a vizuaacutelne zhodnotiacute skuacutesenyacutem odborniacutekom Fluorescencia sa v niektoryacutech priacutepadoch mocircže zaznamenať a hodnotiť aj pomocou softveacuteru (obr 36)

Pomocou FISH detegujeme numerickeacute aberaacutecie - zmeny v počte chromozoacutemov (napr trizoacutemia monozoacutemia chromozoacutemov) alebo štruktuacuterne aberaacutecie a prestavby (napr translokaacutecie inverzie deleacutecie duplikaacutecie amplifikaacutecie) FISH metoacuteda umožňuje identifikaacuteciu a detekciu každeacuteho ľudskeacuteho chromozoacutemu jeho zaradenie do karyotypu odhalenie malyacutech submikroskopickyacutech chromozoacutemovyacutech zmien a tiež mapovať poziacutecie jednotlivyacutech geacutenov na chromozoacuteme

41

Obr 36 Princiacutep štandardnej FISH a FISH maľovania celeacuteho chromozoacutemu

Veľkou vyacutehodou FISH metoacutedy je možnosť analyacutezy buniek v metafaacuteze aj v interfaacuteze kedy nie je nutnaacute kultivaacutecia buniek a tiež ryacutechle analyzovanie veľkeacuteho počtu buniek (stovky až tisiacutece) K ďalšiacutem vyacutehodaacutem patriacute bezpečnosť vysokaacute citlivosť dostatočnaacute stabilita relatiacutevne kraacutetky čas hybridizaacutecie a možnosť ryacutechleho vyhodnotenia Hybridizaacutecia pri vaumlčšine suacutečasne dodaacutevanyacutech sond trvaacute 10-12 hodin (na trhu suacute už dostupneacute aj sondy so skraacutetenyacutem časom hybridizaacutecie na 2-3 hodiny) Po hybridizaacuteciiacute nasleduje odmyacutevanie kedy pri priacuteslušnej teplote dochaacutedza k odmytiu nenaviazanyacutech a nespraacutevne hybridizovanyacutech sond Preparaacutet sa naacutesledne podfarbiacute a vyacutesledok sa zhodnotiacute vo fluorescenčnom mikroskope Na podfarbenie chromozoacutemov alebo jadier sa použiacuteva modreacute kontrastneacute farbivo DAPI (46-diamidino-2-fenylindol) ktoreacute maacute silneacute fluorescenčneacute vlastnosti dokaacuteže prechaacutedzať jadrovou membraacutenou a viazať sa na DNA Vyacutesledkom je modreacute zafarbenie ktoreacute vyacuteborne kontrastuje so signaacutelmi jednotlivyacutech sond

Limitujuacutecim faktorom FISH je možnosť identifikaacutecie len tyacutech uacutesekov DNA ku ktoryacutem suacute použiteacute sondy V jednej analyacuteze je možneacute použiť najviac 3 odlišne značeneacute sondy a tak zistiť priacutepadneacute abnormality len na 1 alebo na paacuter lokusoch Na relevantnuacute detekciu je potrebneacute mať vo vzorke 1-5 aberantnyacutech interfaacutezovyacutech jadier

FISH je možneacute uskutočniť na širokej škaacutele biologickeacuteho materiaacutelu na vzorkaacutech perifeacuternej krvi kostnej drene naacuteteroch choriovyacutech klkoch plodovej vode rocircznych druhov tkaniacutev natiacutevnych alebo zaliatych v parafiacutene na 1 bunke (predimplantačnaacute genetickaacute diagnostika PGD) (obr 37)

Využiacuteva sa na detekciu aberaacuteciiacute pri mnohyacutech onkologickyacutech ochoreniach (napr pri diagnoacuteze mnohopočetnyacute myeloacutem sa v suacutečasnosti po separaacutecii CD138+ buniek robiacute FISH s 5 sondami pre geacuteny IGH TP53 RB1 oblasť 1p321q21 a stanovuje sa hyperploidia chromozoacutemov 5 9 a 15) a tiež k spresneniu doplneniu a k overeniu bežneacuteho cytogenetickeacuteho vyšetrenia

Podľa miesta na chromozoacuteme na ktorom dochaacutedza k hybridizaacutecii sondy rozlišujeme 4 typy

DNA sond bull centromeacuteroveacute sondy ndash sa viažu na strednuacute časť chromozoacutemu ndash centromeacuteru sluacutežia k diagnostike zmien v počte chromozoacutemov k detekcii chromozoacutemov neznaacutemeho pocircvodu umožňujuacute interfaacuteznu FISH na nedeliacich sa bunkaacutech (obr 38-41)

42

Obr 37 Interfaacutezna FISH preimplantačnyacute genetickyacute skriacutening aneuploidiiacute ndash blastomeacutera 3-denneacuteho ľudskeacuteho embrya s normaacutelnym počtom chromozoacutemov 13 18 21 pohlavie XY použityacutech 5 sond pre chromozoacutemy 13 ndash orange 18 ndash aqua 21 ndash green X ndash blue a Y ndash yellow (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

Obr 38 Interfaacutezne jadro po hybridizaacutecii s centromeacuterovou sondou pre chromozoacutem 8 (Vysis Abbott) V pravom jadre je priacutetomnaacute trizoacutemia chromozoacutemu 8 (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex) Obr 39 Metafaacutezna (A) a interfaacutezna FISH (B) použitaacute centromeacuterovaacute sonda CEPX spectrum orangeCEPY spectrum green (Vysis Abbott) Sonda hybridizuje k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (červenyacute signaacutel) a Y (zelenyacute signaacutel) (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

43

Obr 40 Interfaacutezna FISH vyšetrenie spermiiacute použiteacute sondy CEPX greenCEPY orange (Aneuscore Metasystems) Sondy hybridizujuacute k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (zelenyacute signaacutel) Y (červenyacute signaacutel) vľavo ndash dve haploidneacute spermie (majuacutece jedna spermia X druhaacute Y chromozoacutem) vpravo ndash dve patologickeacute spermie obsahujuacutece gonozoacutemovyacute komplement XY (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

Obr 41 Interfaacutezna FISH vyšetrenie spermiiacute použiteacute sondy CEPX greenCEPY orange a CEP18 aqua (Aneuscore Metasystems) Sondy hybridizujuacute k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (zelenyacute signaacutel) Y (červenyacute signaacutel) a 18 (modryacute signaacutel) vľavo ndash normaacutelne haploidneacute ľudskeacute spermie - 1x chromozoacutem X alebo Y a jedenkraacutet chromozoacutem 18 v strede ndash patologickaacute spermia obsahujuacuteca gonozoacutemovyacute komplement XY a jeden chromozoacutem 18 vpravo ndash patologickaacute diploidnaacute spermia s chromozoacutemami X Y a dvoma chromozoacutemami 18 (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

bull lokusovo špecifickeacute sondy ndash hybridizaacutecia prebehne na konkreacutetnom mieste geacutenu (lokuse) (obr 42-44) použiacutevajuacute sa k vyšetreniu mikrodeleacuteciiacute (straty malyacutech častiacute chromozoacutemu pri mikrodelečnyacutech syndroacutemoch) k zisteniu amplifikaacutecie onkogeacutenov a niektoryacutech špecifickyacutech translokaacuteciiacute prestavby geacutenov umožňujuacute interfaacuteznu FISH na nedeliacich sa bunkaacutech bull subtelomeroveacute ndash vaumlzba na koncoveacute časti chromozoacutemu ndash telomeacutery bull celochromozoacutemoveacute alebo celomaľovacie sondy ndash sondy hybridizujuacute s mnohopočetnyacutemi chromozoacutemovyacutemi sekvenciami pričom sa fluorescenčne tak bdquovymaľujeldquo celyacute chromozoacutem (Obr 45) Použiacutevajuacute sa na vyšetrenie chromozoacutemovyacutech prestavieb k analyacuteze translokaacuteciiacute a k detekcii pocircvodu tzv marker chromozoacutemov (malyacutech nadpočetnyacutech chromozoacutemov neznaacutemeho pocircvodu) K použitiu sondy suacute potrebneacute metafaacutezne chromozoacutemy nepoužiacutevaju sa pre interfaacuteznu FISH

Pri konvenčnej chromozoacutemovej FISH suacute homogeacutenne DNA proacuteby hybridizovaneacute s fixovanyacutem metafaacuteznym alebo prometafaacuteznym chromozoacutemomchromozoacutemami na skliacutečku (Obr 36a) Maximaacutelna rozlišovacia schopnosť metafaacuteznej FISH je niekoľko megabaacutez (Obr 39a 45) využitiacutem viac

44

natiahnutyacutech prometafaacuteznych chromozoacutemov sa dosiahne 1 Mb rozliacutešenie Prostredniacutectvom fiber FISH konkreacutetne artificiaacutelne deproteinizovanej natiahnutej DNA pripravenej in situ z celyacutech buniek na mikroskopickom skliacutečku je možneacute vizualizovať individuaacutelne geacuteny maleacute DNA elementy na chromozoacuteme s rozliacutešeniacutem okolo 1000 bp

Obr 42 Interfaacutezne jadro po hybridizaacutecii s lokusovo-špecifickou sondou LSI 5q31 Spectrum Orange5p12 Spectrum Green (Vysis Abbott) Na ľavom obraacutezku suacute priacutetomneacute dva červeneacute (5q31) a dva zeleneacute signaacutely (5p12) v pravom jadre je priacutetomnaacute deleacutecia 5q31 oblasti chyacuteba jeden červenyacute signal (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

Obr 43 Interfaacutezna FISH použitaacute lokusovo-špecifickaacute sonda ndash translokačnaacute - XL BCRABL1 plus (Metasystems) dvojfarebnaacute dvojfuacutezna kde červenaacute označuje lokus ABL1 na chromozoacuteme 9 a zelenaacute oblasť BCR na chromozoacuteme 22 Sonda deteguje fuacuteziu protoonkogeacutenu ABL1 (9q34) a geacutenu BCR (22q11) v priacutepade že červenyacute a zelenyacute signaacutel suacute pri sebe (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

45

Obr 44 Interfaacutezna FISH Použitaacute lokusovo-špecifickaacute sonda- typ break apart pre IGH geacuten V docircsledku translokaacutecie došlo k rozskočeniu geacutenu pričom translokačneacuteho partnera nepoznaacuteme vieme určiť len percento v koľkyacutech jadraacutech je geacuten prestavanyacute (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex) Obr 45 Použiteacute celochromozoacutemoveacute sondy WCP 15 (červenyacute chromozoacutem) a WCP 17 (zelenyacute chromozoacutem) Na metafaacuteze je potvrdenaacute reciprokaacute translokaacutecia t(1517)(q2221) (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

FISH vizualizaacutecia celeacuteho chromozoacutemu maľovanie chromozoacutemu anglicky chromosome

painting je špeciaacutelnou aplikaacuteciou chromozoacutemovej FISH proacuteba je koktail veľkeacuteho počtu rocircznych fluorescenčne značenyacutech DNA fragmentov hybridizujuacutecich pozdĺž celeacuteho konkreacutetneho chromozoacutemu (obr 36b 45) bdquoChromosomepaintingldquo analyzuje metafaacutezne chromozoacutemy V minulosti bola FISH vizualizaacutecia celyacutech chromozoacutemov limitovanaacute malyacutem množstvom rocirczne sfarbenyacutech fluorochroacutemov

V suacutečasnosti je možneacute detegovať množstvo cieľovyacutech sekvenciiacute naraz čo sa využiacuteva pri celogenoacutemovej chromozoacutemovej vizualizaacutecii (whole-chromosomepainting - WCP) metoacutedou multiplex FISH (M-FISH multicolor FISH o br 46) alebo spektraacutelnej karyotypizaacutecie (SKY) kedy možno rozliacutešiť všetky ľudskeacute chromozoacutemy ndash teda 24 rocircznych chromozoacutemov M-FISH a SKY patria medzi metafaacutezne formy FISH diagnostiky ktoreacute umožňujuacute simultaacutennu vizualizaacuteciu všetkyacutech ľudskyacutech chromozoacutemov v rocircznych farbaacutech čo predstavuje uľahčenie analyacutezy karyotypu hlavne pri komplexnyacutech zmenaacutech a markeroch neznaacutemeho pocircvodu Obe techniky vychaacutedzajuacute z použitia

46

celochromozoacutemovyacutech sond značenyacutech kombinaacuteciou viaceryacutech fluorochroacutemov Rozdiel medzi M-FISH a SKY spočiacuteva v technike ziacuteskania konečneacuteho obrazu

Obr 46 Multicolor FISH - každyacute chromozoacutemovyacute paacuter je zafarbenyacute inou farbou pričom na ich zafarbenie postačuje kombinaacutecia 5 fluorochroacutemov Na vyhodnocovanie je potrebnaacute špeciaacutelna sada fluorescenčnyacutech filtrov pre jednotliveacute fluorochroacutemy a špeciaacutelnyacute softweacuter Vľavo-štandardnyacute karyotyp vpravo karyotyp s mutaacuteciami (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

V molekulovej cytogenetike suacute komerčne dostupneacute sety M-FISH proacuteb umožňujuacutece

viacfarebneacute pruacutežkovanie chromozoacutemov (banding) s vysokyacutem rozliacutešeniacutem (multicolor-banding mBAND FISH MCB) čo umožňuje identifikaacuteciu intrachromozoacutemovyacutech prestavieb (Obr 47) Nevyhnutnosťou mBAND-u je mať chromozoacutemy v metafaacuteze Taacuteto metoacuteda bola prvyacutekraacutet uskutočnenaacute na chromozoacuteme 5 v roku 1999 mBAND FISH umožňuje rozliacutešiť špecifickeacute oblasti chromozoacutemov na uacuterovni pruacutežku - bandu a sub-bandu s detekciou 550 bandov haploidneacuteho karyotypu

Obr 47 A - mBAND chromozoacutemu 11 - inverzia duplikovanej oblasti 11q223-q25 B - mBAND chromozoacutemu 3 - na kruhovom chromozoacuteme deleacutecia oblasti 3p263 C - mBAND chromozoacutemu 2 - potvrdenie inverzie duplikovanej časti chromozoacutemu (poskytnuteacute RNDr Dagmar Landlovou Medirex)

FISH metoacuteda a jej varianty (M-FISH mBAND SKY) majuacute v suacutečasnosti širokeacute využitie v

klinickej genetike v onkologickej genetike na detekciu aberaacuteciiacute v čase diagnoacutezy počas liečby po

47

liečbe monitorovanie po transplantaacutecii kostnej drene v prenataacutelnej a postnataacutelnej diagnostike pri detekcii submikroskopickyacutech deleacuteciiacute (napr DiGeorge syndroacutem - 22q112 delečnyacute syndroacutem PraderndashWilli syndroacutem- chromozoacutem 15q11-13) prostredniacutectvom FISH je možnaacute detekcia numerickyacutech zmien chromozoacutemov (trizoacutemia chromozoacutemu 21 pri Downovom syndroacuteme trizoacutemia chromozoacutemu 15 pri Patauovom syndroacuteme trizoacutemia chromozoacutemu 18 pri Edwardsovom syndroacuteme) rocirczne zmeny v počte pohlavnyacutech chromozoacutemov (monozoacutemia X pri Turnerovom syndroacuteme Klinefelterov syndroacutem s X chromozoacutemom naviac - XXY) podobne v predimplantačnej diagnostike

83 DNA Microarray (DNA mikro čip biočip) DNA mikročipovanie je technika využiacutevajuacuteca hybridizaacuteciu skuacutemanej nukleovej kyseliny

(cieľovaacute vzorka) s veľkyacutem množstvom oligonukleotidovyacutech proacuteb (desať tisiacutec až milioacuten) ktoreacute suacute prichyteneacute na pevnyacute podklad najčastejšie sklenyacute silikoacutenovyacute alebo nylonovyacute (doštička čip) Skuacutemanaacute nukleovaacute kyselina je pred hybridizaacuteciou fragmentovanaacute označenaacute fluorofoacuterom a denaturovanaacute Po kontakte čipu s cieľovou vzorkou ktoraacute je vlastne zmes označenyacutech oligonukleotidov značeneacute oligonukleotidy hybridizujuacute s oligonukleotidovyacutemi sekvenciami prichytenyacutemi na čipe Potom suacute na zaacuteklade fluorescencie detekovaneacute miesta kde došlo k hybridizaacutecii čiže vzorka obsahovala takuacuteto nukleotidovuacute sekvenciu Z jedneacuteho mikročipu sa ziacuteska obrovskeacute množstvo daacutet ktoreacute je vždy nutneacute softveacuterovo spracovať V dnešnej dobe existuje niekoľko firiem poskytujuacutecich komerčne mikročipy na objednaacutevku alebo si ich laboratoacuteria produkujuacute sami

Mikročipovanie prebieha nasledovne

1) Vytvorenie DNA čipu ndash tisiacutece rocircznych jednovlaacuteknovyacutech DNA oligonukleotidov znaacutemych sekvencii sa kovalentne naviažu na povrch doštičky vždy v určitej lokalite je niekoľko rovnakyacutech oligonukleotidov veľkosť takejto lokality je ˂ 200 microm Proacutebami mocircže byť DNA cDNA alebo syntetizovaneacute oligonukleotidy Už hotoveacute mikročipy ponuacutekajuacute viacereacute firmy (Affymetrix Agilent Technologies Eppendorf Illumina) alebo si ich jednotliveacute laboratoacuteria vyraacutebajuacute sami pomocou robotickyacutech zariadeniacute DNA čip sa vytvaacutera buď nanaacutešaniacutem kvapiek oligonukleotidov na podklad alebo synteacutezou oligonukleotidov in situ na čipe 2) Priacuteprava vzorky ndash nukleovaacute kyselina (mRNA DNA) sa purifikuje určiacute sa jej kvantita a kvalita (spektrofotometericky) fragmentuje resp v priacutepade mRNA sa syntetizuje cDNA v priacutepade potreby sa mocircže DNA amplifikovať PCR reakciou štiepiť restrikčnyacutemi endonukleaacutezami 3) Fluorescenčneacute označenie (zriedkavejšie raacutedioaktiacutevne) fragmentov DNA prebieha počas reverznej transkripcie alebo PCR amplifikaacutecie za uacutečasti fluorescenčne značenyacutech nukleotidov Keď sa analyzujuacute dve rocirczne vzorky napr zdraveacute tkanivo a naacutedoroveacute tkanivo označenie nukleovyacutech kyseliacuten v tyacutechto tkanivaacutech byacuteva rozdielne a to použitiacutem dvoch rocircznych fluorescenčnyacutech farbiacutev (napr zeleneacute a červeneacute) Pred hybridizaacuteciou je potrebneacute vzorku denaturovať čiacutem sa vytvoriacute zmes jednovlaacuteknovyacutech DNA označenyacutech značkou 4) Hybridizaacutecia s mikročipom ndash v špeciaacutelnom hybridizačnom roztoku hybridizujuacute komplementaacuterne sekvencie zo vzorky s priacuteslušnyacutemi oligonukleotidovyacutemi sondami naviazanyacutemi na čipe Potom sa čip obmyje aby došlo k odstraacuteneniu čiastočne hybridizovanyacutech nukleovyacutech kyseliacuten 5) Skenovanie mikročipu ndash skenerom čipov docircjde k ožiareniu čipu laserom pričom v mieste hybridizaacutecie fluorescenčne značenyacutech DNA fragmentov s proacutebou docircjde k emisii svetla určitej vlnovej dĺžky ktoruacute skener zaznamenaacute 6) Analyacuteza daacutet prebieha metoacutedami bioinformatiky spracovaniacutem softveacutermi sa zistiacute ktoreacute lokality čipu navzaacutejom hybridizovali v priacutepade použitia dvoch vzoriek kontrolnej a skuacutemanej je možneacute analyzovať ich relatiacutevnu intenzitu hybridizaacutecie (expresie určiteacuteho geacutenu)

Existujuacute štyri typy mikročipov 1) Čipy ur čeneacute na analyacutezu expresie (obsahujuacute cDNA proacuteby) pre tzv dvojkanaacutelovyacute experiment kedy je vzorka určenaacute k hybridizaacutecii na čipe ziacuteskanaacute zmiešaniacutem DNA fragmentov kontrolnej a skuacutemanej vzorky pričom fragmenty suacute rozdielne fluorescenčne označeneacute (napr zelenyacute fluorofoacuter pre kontrolnuacute vzorku a červenyacute pre skuacutemanuacute) Na zaacuteklade intenzity a typu fluorescencie sa deteguje expresia geacutenov typickaacute pre kontrolnuacute vzorku (napr zelenaacute fluorescencia) pre skuacutemanuacute vzorku (napr

48

červenaacute fluorescencia) a expresia podobnaacute u oboch vzoriek (žltaacute fluorescencia) neexprimovaneacute geacuteny (čierna fluorescencia) rocirczne odtiene (v zaacutevislosti od prevažujuacutecej hybridizaacutecie) (obr 48) 2) Čipy ur čeneacute na analyacutezu mutaacutecii použije sa genoacutemovaacute DNA označenaacute jednou fluorescenčnou farbičkou na určenie jednonukleotidovej zmeny (SNP ndash Single Nukleotide Polymorphism) 3) Čipy na komparatiacutevnu genoacutemovuacute hybridizaacuteciu (aCGH array Comparative Genomic Hybridization) ndash použiacutevaneacute na zistenie zvyacutešenia alebo zniacuteženia množstva chromozoacutemovyacutech fragmentov obsahujuacutecich geacuteny zodpovedneacute za určiteacute ochorenie Na analyacutezu sa použije skuacutemanaacute gDNA a referenčnaacute (kontrolnaacute) DNA každaacute sa značiacute inou fluorescenčnou farbičkou (princiacutep ako pri analyacuteze expresie) (obr 49 50) 4) Čipy CGH - SNP kombinovaneacute čipy ur čeneacute na analyacutezu aj mutaacuteciiacute SNP aj na komparatiacutevnu genoacutemovuacute hybridizaacuteciu CGH

Mikročipy majuacute rozsiahle využitie napriacuteklad v identifikaacuteciiacute novyacutech geacutenov vo vyacuteskume ich funkciiacute expresie v rocircznych podmienkach pri diagnostike mnohyacutech ochoreniacute vo farmakogenomike vo vyacuteskume vplyvu toxiacutenov

Obr 48 Heatmapa geacutenovej expresie vybranyacutech geacutenov (mRNA) mikročip obsahuje 46000 cDNA proacuteb (poskytnuteacute Ing Helenou Gbelcovou PhD Uacutestav lekaacuterskej bioloacutegie genetiky a klinickej genetiky LF UK a UNB)

49

Obr 49 Princiacutep komparatiacutevnej genoacutemovej hybridizaacutecie (aCGH - array comparative genomic hybridization) Obr 50 A) Vyacutesledok komparatiacutevnej genoacutemovej hybridizaacutecie (aCGH - array comparative genomic hybridization) vzorky DNA izolovanej plodovej vody U plodu s abnormaacutelnym ultrasonografickyacutem vyšetreniacutem bola identifikovanaacute duplikaacutecia oblasti 3q261q29 (modryacute paacutes) a deleacutecia oblasti 5p1533p151 (červenyacute paacutes) Pre porovnanie chromozoacutem 1 bez aberaacutecie b) Ten istyacute pacient ale ineacute softveacuteroveacute spracovanie (poskytnuteacute RNDr Miroslavom Tomkom PhD Medirex)

50

Odporuacutečanaacute a použitaacute literatuacutera

Odborneacute knihy Klug W S Cummings M R Spencer Ch A Palladino M A Concepts of Genetics jedenaacuteste vydanie (2015) Carson S Molecular Biology Techniques tretie vydanie (2012) Strachan T Read A Human Molecular Genetics štvrteacute vydanie (2011) Sudbery P Sudbery I Human Molecular Genetics tretie vydanie (2009)

Internetoveacute straacutenky

wwwncbinlmnihgov wwwmlpacom wwwthermofishercom wwwilluminacom wwwpromegask wwwqiagencom wwwambioncom

Odborneacute člaacutenky Chacon-Cortes D Griffiths L R Methods for extracting genomic DNA from whole blood samples current perspectives Journal of Biorepository Science for Applied Medicine Volume 2 strany 1- 9 Viltrop T Krjutskov K Palta P Metspalu A Comparison of DNA extraction methods for multiplex polymerase chain reaction Anal Biochem 2010 Volume 398(2) strany 260-262 Ing Martin Čermaacutek Molekulaacuterna cytogenetika v problematike familiaacuternych maligniacutet Onkoloacutegia Volume 2 strany 77 - 83 Livak KJ Schmittgen TD Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method Methods 2001 Volume 25(4) strany 402 - 408 Bustin S A Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays J Mol Endocrinol 2000 Volume 25(2) strany169 - 193

MOLEKULAacuteRNE METOacuteDY AKTUAacuteLNE POUŽIacuteVANEacute V KLINICKEJ GENETIKE RNDr Andrea Pastoraacutekovaacute PhD RNDr Robert Petrovič PhD Vydala Univerzita Komenskeacuteho v Bratislave Lekaacuterska fakulta Rozsah 50 straacuten 246 AH prveacute vydanie ISBN 978-80-223-4231-5

38

Obr 34 Kvantitatiacutevna fragmentačnaacute PCR analyacuteza (QF-PCR) DNA izolovanej z plodovej vody vyacutesledok prenataacutelnej analyacutezy = priacutetomnosť troch piacutekov pre chromozoacutem 18 (u všetkyacutech fragmentov detegujuacutecich chromozoacutem 18 je pomer vyšetrovanyacutech markerov aberantnyacute 21 resp 111) čo znamenaacute trizoacutemiu chromozoacutemu 18 Edwardsov syndroacutem

39

8 Metoacutedy založeneacute na princiacutepe hybridizaacutecie

Nukleoveacute kyseliny majuacute schopnosť vytvaacuterať dvojvlaacuteknoveacute reťazce z jednovlaacuteknovyacutech molekuacutel na zaacuteklade komplementarity baacutez Komplementarita baacutez umožňuje replikaacuteciu DNA transkripciu RNA komplementarita baacutez zabezpečuje teda reprodukovateľnosť živej hmoty

Hybridizaacutecia je proces v ktorom na zaacuteklade komplementarity baacutez dochaacutedza k vytvoreniu dvojvlaacuteknovej nukleovej kyseliny z dvoch jednovlaacuteknovyacutech molekuacutel DNA alebo RNA alebo ich kombinaacuteciou DNA RNA pričom kratšia jednovlaacuteknovaacute nukleovaacute kyselina vystupuje ako sonda (proacuteba) Hybridizaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten je jeden z najpoužiacutevanejšiacutech naacutestrojov v molekulaacuternej bioloacutegii a genetike (hybridizaacutecia primerov alebo proacuteb sa využiacuteva v takmer každej metoacutede - v PCR RT-PCR qPCR RT-qPCR MLPA sekvenovaniacute fragmentačnej analyacuteze FISH DNA mikročipoch atď)

Denaturaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten je proces pri ktorom dochaacutedza k porušeniu vodiacutekovyacutech vaumlzieb medzi vlaacuteknami nukleovyacutech kyseliacuten (strata sekundaacuternej a terciaacutelnej štruktuacutery) tak že docircjde k ich uacuteplneacutemu oddeleniu vzniknuacute jednovlaacuteknoveacute reťazce Denaturaacutecia NK mocircže byť spocircsobenaacute vplyvom vysokyacutech teplocirct pH alebo chemickyacutech laacutetok (denaturačneacute činidlaacute) Renaturaacutecia je opačnyacute proces v ktorom na zaacuteklade komplementarity dochaacutedza k tvorbe dvojvlaacuteknovyacutech NK

Hybridiza čnaacute sonda (proacuteba) je jednovlaacuteknovaacute nukleovaacute kyselina určitej znaacutemej dĺžky a sekvencie (najčastejšie DNA pretože je stabilnejšia ako RNA) ktoraacute je značenaacute a sluacuteži na detekciu komplementaacuternych molekuacutel DNA alebo RNA v procese hybridizaacutecie V zaacutevislosti od podmienok hybridizaacutecie (stringencia) mocircže byť detegovanaacute sekvencia uacuteplne komplementaacuterna alebo v menej priacutesnych podmienkach mocircže mať sekvenčneacute odchyacutelky Proacuteba sluacuteži na vyhľadanie a zviditeľnenie cieľovyacutech NK Zviditeľnenie sa deje prostredniacutectvom označenia proacuteby ešte pred hybridizaacuteciou Značenie proacuteby mocircže byť raacutedioaktiacutevne a neraacutedioaktiacutevne (najčastejšie fluorescenčneacute)

Raacutedioaktiacutevne značeneacute proacuteby pomocou izotopov (32P) sa využiacutevali viac v minulosti v suacutečasnosti suacute kvocircli zdravotnyacutem rizikaacutem ohľaduplnosti k životneacutemu prostrediu ako aj kvocircli jednoduchšej manipulaacutecii použiacutevaneacute fluorescenčne značeneacute proacuteby Raacutedioaktiacutevne značeneacute sondy boli použiacutevaneacute hlavne metoacutedou Southernovej hybridizaacutecie (Southern blotting Southern blot) Citlivosť raacutedioaktiacutevne značenyacutech proacuteb je vyššia dosahuje schopnosť zachytiť 10 fg (femtogram 10-15) cieľovej DNA sekvencie 81 Southern blot

Metoacutedu objavil v roku 1975 britskyacute bioloacuteg Edwin Southern (preto Southern) Pri Southernovej hybridizaacutecii sa restrikčne štiepeneacute fragmenty DNA elektroforeticky separujuacute v geacuteli potom sa metoacutedou blottingu prenesuacute na nylonovuacute alebo nitroceluloacutezovuacute membraacutenu kde suacute naacutesledne hybridizovaneacute v roztoku obsahujuacutecom raacutedioaktiacutevne značenuacute sondu Priloženiacutem fotografickeacuteho filmu k membraacutene a vyvolaniacutem filmu autoraacutediografiou docircjde k zviditeľneniu lokaliacutet kde došlo k hybridizaacuteciiacute raacutedioaktiacutevne značenej sondy s fragmentom DNA (autoraacutediogram) Southern blot bol kľuacutečovou a prvou metoacutedou na identifikaacuteciu osocircb (DNA fingerprinting DNA pofiling) (obr 35)

Okrem Southern blotu existuje Northern blot na analyacutezu RNA (geacutenovej expresie) a Western blot na analyacutezu proteiacutenov postup je obdobnyacute ako pri Southern blote s obmenami špecifickyacutemi pre konkreacutetny blot Pri Northern blote sa použiacutevajuacute hybridizačneacute proacuteby ale pre vizualizaacuteciu proteiacutenov western blotom je potrebneacute použiť protilaacutetky s naacuteslednou vizualizaacuteciou Pomenovanie techniacutek je hra so sloviacutečkami (keďže paacuten Northern ani Western neobjavili takto nazvaneacute techniky)

Neraacutedioaktiacutevne značenie proacuteb použiacutevanyacutech v molekulaacuternej genetike mocircže byť nepriame (použitie haptenu) alebo priame Konečnaacute vizualizaacutecia je najčastejšie zabezpečenaacute fluoreskujuacutecimi farebnyacutemi značkami farbivami fluorochroacutemami (fluorofoacuterami) Pri priamom značeniacute je farbička kovalentne naviazanaacute na nukleotid a na zachytenie fluorescencie suacute potrebneacute špeciaacutelne priacutestroje umožňujuacutece excitaacuteciu farbičky ktoraacute potom emituje žiarenie určitej vlnovej dĺžky (emisneacute žiarenie) a to zachytiacute detekčnyacute systeacutem priacutestroja Využitie fluorochroacutemov v molekulaacuternej genetike je masiacutevne napr na vizualizaacuteciu NK elektroforeticky separovanyacutech v geacuteli kvantifikaacuteciu produktov PCR reakcie v priacutestroji real-time PCR cykleacuter sekvenovaniacute fragmentačnej analyacuteze FISH DNA mikročipoch atď

40

Obr 35 Princiacutep Southern blotu

82 FISH (fluorescenčnaacute in situ hybridizaacutecia)

FISH (fluorescent in situ hybridization fluorescenčnaacute in situ hybridizaacutecia) metoacuteda patriacute medzi molekulovo-cytogenetickeacute techniky Princiacutep FISH metoacutedy je založenyacute na hybridizaacuteciiacute fluorescenčne značenyacutech proacuteb ku komplementaacuternym uacutesekom vyšetrovanej DNA na podložnom skle (priamo na mieste - in situ) K denaturaacutecii dsDNA dochaacutedza buď vplyvom denaturačnyacutech činidiel alebo zvyacutešenou teplotou a naacuteslednou renaturaacuteciou dochaacutedza k naviazaniu sondy na komplementaacuterny uacutesek DNA Vyacutesledok hybridizaacutecie sa vizualizuje fluorescenčnyacutem mikroskopom vybavenyacutem vhodnyacutemi fluorescenčnyacutemi filtrami a vizuaacutelne zhodnotiacute skuacutesenyacutem odborniacutekom Fluorescencia sa v niektoryacutech priacutepadoch mocircže zaznamenať a hodnotiť aj pomocou softveacuteru (obr 36)

Pomocou FISH detegujeme numerickeacute aberaacutecie - zmeny v počte chromozoacutemov (napr trizoacutemia monozoacutemia chromozoacutemov) alebo štruktuacuterne aberaacutecie a prestavby (napr translokaacutecie inverzie deleacutecie duplikaacutecie amplifikaacutecie) FISH metoacuteda umožňuje identifikaacuteciu a detekciu každeacuteho ľudskeacuteho chromozoacutemu jeho zaradenie do karyotypu odhalenie malyacutech submikroskopickyacutech chromozoacutemovyacutech zmien a tiež mapovať poziacutecie jednotlivyacutech geacutenov na chromozoacuteme

41

Obr 36 Princiacutep štandardnej FISH a FISH maľovania celeacuteho chromozoacutemu

Veľkou vyacutehodou FISH metoacutedy je možnosť analyacutezy buniek v metafaacuteze aj v interfaacuteze kedy nie je nutnaacute kultivaacutecia buniek a tiež ryacutechle analyzovanie veľkeacuteho počtu buniek (stovky až tisiacutece) K ďalšiacutem vyacutehodaacutem patriacute bezpečnosť vysokaacute citlivosť dostatočnaacute stabilita relatiacutevne kraacutetky čas hybridizaacutecie a možnosť ryacutechleho vyhodnotenia Hybridizaacutecia pri vaumlčšine suacutečasne dodaacutevanyacutech sond trvaacute 10-12 hodin (na trhu suacute už dostupneacute aj sondy so skraacutetenyacutem časom hybridizaacutecie na 2-3 hodiny) Po hybridizaacuteciiacute nasleduje odmyacutevanie kedy pri priacuteslušnej teplote dochaacutedza k odmytiu nenaviazanyacutech a nespraacutevne hybridizovanyacutech sond Preparaacutet sa naacutesledne podfarbiacute a vyacutesledok sa zhodnotiacute vo fluorescenčnom mikroskope Na podfarbenie chromozoacutemov alebo jadier sa použiacuteva modreacute kontrastneacute farbivo DAPI (46-diamidino-2-fenylindol) ktoreacute maacute silneacute fluorescenčneacute vlastnosti dokaacuteže prechaacutedzať jadrovou membraacutenou a viazať sa na DNA Vyacutesledkom je modreacute zafarbenie ktoreacute vyacuteborne kontrastuje so signaacutelmi jednotlivyacutech sond

Limitujuacutecim faktorom FISH je možnosť identifikaacutecie len tyacutech uacutesekov DNA ku ktoryacutem suacute použiteacute sondy V jednej analyacuteze je možneacute použiť najviac 3 odlišne značeneacute sondy a tak zistiť priacutepadneacute abnormality len na 1 alebo na paacuter lokusoch Na relevantnuacute detekciu je potrebneacute mať vo vzorke 1-5 aberantnyacutech interfaacutezovyacutech jadier

FISH je možneacute uskutočniť na širokej škaacutele biologickeacuteho materiaacutelu na vzorkaacutech perifeacuternej krvi kostnej drene naacuteteroch choriovyacutech klkoch plodovej vode rocircznych druhov tkaniacutev natiacutevnych alebo zaliatych v parafiacutene na 1 bunke (predimplantačnaacute genetickaacute diagnostika PGD) (obr 37)

Využiacuteva sa na detekciu aberaacuteciiacute pri mnohyacutech onkologickyacutech ochoreniach (napr pri diagnoacuteze mnohopočetnyacute myeloacutem sa v suacutečasnosti po separaacutecii CD138+ buniek robiacute FISH s 5 sondami pre geacuteny IGH TP53 RB1 oblasť 1p321q21 a stanovuje sa hyperploidia chromozoacutemov 5 9 a 15) a tiež k spresneniu doplneniu a k overeniu bežneacuteho cytogenetickeacuteho vyšetrenia

Podľa miesta na chromozoacuteme na ktorom dochaacutedza k hybridizaacutecii sondy rozlišujeme 4 typy

DNA sond bull centromeacuteroveacute sondy ndash sa viažu na strednuacute časť chromozoacutemu ndash centromeacuteru sluacutežia k diagnostike zmien v počte chromozoacutemov k detekcii chromozoacutemov neznaacutemeho pocircvodu umožňujuacute interfaacuteznu FISH na nedeliacich sa bunkaacutech (obr 38-41)

42

Obr 37 Interfaacutezna FISH preimplantačnyacute genetickyacute skriacutening aneuploidiiacute ndash blastomeacutera 3-denneacuteho ľudskeacuteho embrya s normaacutelnym počtom chromozoacutemov 13 18 21 pohlavie XY použityacutech 5 sond pre chromozoacutemy 13 ndash orange 18 ndash aqua 21 ndash green X ndash blue a Y ndash yellow (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

Obr 38 Interfaacutezne jadro po hybridizaacutecii s centromeacuterovou sondou pre chromozoacutem 8 (Vysis Abbott) V pravom jadre je priacutetomnaacute trizoacutemia chromozoacutemu 8 (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex) Obr 39 Metafaacutezna (A) a interfaacutezna FISH (B) použitaacute centromeacuterovaacute sonda CEPX spectrum orangeCEPY spectrum green (Vysis Abbott) Sonda hybridizuje k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (červenyacute signaacutel) a Y (zelenyacute signaacutel) (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

43

Obr 40 Interfaacutezna FISH vyšetrenie spermiiacute použiteacute sondy CEPX greenCEPY orange (Aneuscore Metasystems) Sondy hybridizujuacute k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (zelenyacute signaacutel) Y (červenyacute signaacutel) vľavo ndash dve haploidneacute spermie (majuacutece jedna spermia X druhaacute Y chromozoacutem) vpravo ndash dve patologickeacute spermie obsahujuacutece gonozoacutemovyacute komplement XY (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

Obr 41 Interfaacutezna FISH vyšetrenie spermiiacute použiteacute sondy CEPX greenCEPY orange a CEP18 aqua (Aneuscore Metasystems) Sondy hybridizujuacute k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (zelenyacute signaacutel) Y (červenyacute signaacutel) a 18 (modryacute signaacutel) vľavo ndash normaacutelne haploidneacute ľudskeacute spermie - 1x chromozoacutem X alebo Y a jedenkraacutet chromozoacutem 18 v strede ndash patologickaacute spermia obsahujuacuteca gonozoacutemovyacute komplement XY a jeden chromozoacutem 18 vpravo ndash patologickaacute diploidnaacute spermia s chromozoacutemami X Y a dvoma chromozoacutemami 18 (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

bull lokusovo špecifickeacute sondy ndash hybridizaacutecia prebehne na konkreacutetnom mieste geacutenu (lokuse) (obr 42-44) použiacutevajuacute sa k vyšetreniu mikrodeleacuteciiacute (straty malyacutech častiacute chromozoacutemu pri mikrodelečnyacutech syndroacutemoch) k zisteniu amplifikaacutecie onkogeacutenov a niektoryacutech špecifickyacutech translokaacuteciiacute prestavby geacutenov umožňujuacute interfaacuteznu FISH na nedeliacich sa bunkaacutech bull subtelomeroveacute ndash vaumlzba na koncoveacute časti chromozoacutemu ndash telomeacutery bull celochromozoacutemoveacute alebo celomaľovacie sondy ndash sondy hybridizujuacute s mnohopočetnyacutemi chromozoacutemovyacutemi sekvenciami pričom sa fluorescenčne tak bdquovymaľujeldquo celyacute chromozoacutem (Obr 45) Použiacutevajuacute sa na vyšetrenie chromozoacutemovyacutech prestavieb k analyacuteze translokaacuteciiacute a k detekcii pocircvodu tzv marker chromozoacutemov (malyacutech nadpočetnyacutech chromozoacutemov neznaacutemeho pocircvodu) K použitiu sondy suacute potrebneacute metafaacutezne chromozoacutemy nepoužiacutevaju sa pre interfaacuteznu FISH

Pri konvenčnej chromozoacutemovej FISH suacute homogeacutenne DNA proacuteby hybridizovaneacute s fixovanyacutem metafaacuteznym alebo prometafaacuteznym chromozoacutemomchromozoacutemami na skliacutečku (Obr 36a) Maximaacutelna rozlišovacia schopnosť metafaacuteznej FISH je niekoľko megabaacutez (Obr 39a 45) využitiacutem viac

44

natiahnutyacutech prometafaacuteznych chromozoacutemov sa dosiahne 1 Mb rozliacutešenie Prostredniacutectvom fiber FISH konkreacutetne artificiaacutelne deproteinizovanej natiahnutej DNA pripravenej in situ z celyacutech buniek na mikroskopickom skliacutečku je možneacute vizualizovať individuaacutelne geacuteny maleacute DNA elementy na chromozoacuteme s rozliacutešeniacutem okolo 1000 bp

Obr 42 Interfaacutezne jadro po hybridizaacutecii s lokusovo-špecifickou sondou LSI 5q31 Spectrum Orange5p12 Spectrum Green (Vysis Abbott) Na ľavom obraacutezku suacute priacutetomneacute dva červeneacute (5q31) a dva zeleneacute signaacutely (5p12) v pravom jadre je priacutetomnaacute deleacutecia 5q31 oblasti chyacuteba jeden červenyacute signal (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

Obr 43 Interfaacutezna FISH použitaacute lokusovo-špecifickaacute sonda ndash translokačnaacute - XL BCRABL1 plus (Metasystems) dvojfarebnaacute dvojfuacutezna kde červenaacute označuje lokus ABL1 na chromozoacuteme 9 a zelenaacute oblasť BCR na chromozoacuteme 22 Sonda deteguje fuacuteziu protoonkogeacutenu ABL1 (9q34) a geacutenu BCR (22q11) v priacutepade že červenyacute a zelenyacute signaacutel suacute pri sebe (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

45

Obr 44 Interfaacutezna FISH Použitaacute lokusovo-špecifickaacute sonda- typ break apart pre IGH geacuten V docircsledku translokaacutecie došlo k rozskočeniu geacutenu pričom translokačneacuteho partnera nepoznaacuteme vieme určiť len percento v koľkyacutech jadraacutech je geacuten prestavanyacute (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex) Obr 45 Použiteacute celochromozoacutemoveacute sondy WCP 15 (červenyacute chromozoacutem) a WCP 17 (zelenyacute chromozoacutem) Na metafaacuteze je potvrdenaacute reciprokaacute translokaacutecia t(1517)(q2221) (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

FISH vizualizaacutecia celeacuteho chromozoacutemu maľovanie chromozoacutemu anglicky chromosome

painting je špeciaacutelnou aplikaacuteciou chromozoacutemovej FISH proacuteba je koktail veľkeacuteho počtu rocircznych fluorescenčne značenyacutech DNA fragmentov hybridizujuacutecich pozdĺž celeacuteho konkreacutetneho chromozoacutemu (obr 36b 45) bdquoChromosomepaintingldquo analyzuje metafaacutezne chromozoacutemy V minulosti bola FISH vizualizaacutecia celyacutech chromozoacutemov limitovanaacute malyacutem množstvom rocirczne sfarbenyacutech fluorochroacutemov

V suacutečasnosti je možneacute detegovať množstvo cieľovyacutech sekvenciiacute naraz čo sa využiacuteva pri celogenoacutemovej chromozoacutemovej vizualizaacutecii (whole-chromosomepainting - WCP) metoacutedou multiplex FISH (M-FISH multicolor FISH o br 46) alebo spektraacutelnej karyotypizaacutecie (SKY) kedy možno rozliacutešiť všetky ľudskeacute chromozoacutemy ndash teda 24 rocircznych chromozoacutemov M-FISH a SKY patria medzi metafaacutezne formy FISH diagnostiky ktoreacute umožňujuacute simultaacutennu vizualizaacuteciu všetkyacutech ľudskyacutech chromozoacutemov v rocircznych farbaacutech čo predstavuje uľahčenie analyacutezy karyotypu hlavne pri komplexnyacutech zmenaacutech a markeroch neznaacutemeho pocircvodu Obe techniky vychaacutedzajuacute z použitia

46

celochromozoacutemovyacutech sond značenyacutech kombinaacuteciou viaceryacutech fluorochroacutemov Rozdiel medzi M-FISH a SKY spočiacuteva v technike ziacuteskania konečneacuteho obrazu

Obr 46 Multicolor FISH - každyacute chromozoacutemovyacute paacuter je zafarbenyacute inou farbou pričom na ich zafarbenie postačuje kombinaacutecia 5 fluorochroacutemov Na vyhodnocovanie je potrebnaacute špeciaacutelna sada fluorescenčnyacutech filtrov pre jednotliveacute fluorochroacutemy a špeciaacutelnyacute softweacuter Vľavo-štandardnyacute karyotyp vpravo karyotyp s mutaacuteciami (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

V molekulovej cytogenetike suacute komerčne dostupneacute sety M-FISH proacuteb umožňujuacutece

viacfarebneacute pruacutežkovanie chromozoacutemov (banding) s vysokyacutem rozliacutešeniacutem (multicolor-banding mBAND FISH MCB) čo umožňuje identifikaacuteciu intrachromozoacutemovyacutech prestavieb (Obr 47) Nevyhnutnosťou mBAND-u je mať chromozoacutemy v metafaacuteze Taacuteto metoacuteda bola prvyacutekraacutet uskutočnenaacute na chromozoacuteme 5 v roku 1999 mBAND FISH umožňuje rozliacutešiť špecifickeacute oblasti chromozoacutemov na uacuterovni pruacutežku - bandu a sub-bandu s detekciou 550 bandov haploidneacuteho karyotypu

Obr 47 A - mBAND chromozoacutemu 11 - inverzia duplikovanej oblasti 11q223-q25 B - mBAND chromozoacutemu 3 - na kruhovom chromozoacuteme deleacutecia oblasti 3p263 C - mBAND chromozoacutemu 2 - potvrdenie inverzie duplikovanej časti chromozoacutemu (poskytnuteacute RNDr Dagmar Landlovou Medirex)

FISH metoacuteda a jej varianty (M-FISH mBAND SKY) majuacute v suacutečasnosti širokeacute využitie v

klinickej genetike v onkologickej genetike na detekciu aberaacuteciiacute v čase diagnoacutezy počas liečby po

47

liečbe monitorovanie po transplantaacutecii kostnej drene v prenataacutelnej a postnataacutelnej diagnostike pri detekcii submikroskopickyacutech deleacuteciiacute (napr DiGeorge syndroacutem - 22q112 delečnyacute syndroacutem PraderndashWilli syndroacutem- chromozoacutem 15q11-13) prostredniacutectvom FISH je možnaacute detekcia numerickyacutech zmien chromozoacutemov (trizoacutemia chromozoacutemu 21 pri Downovom syndroacuteme trizoacutemia chromozoacutemu 15 pri Patauovom syndroacuteme trizoacutemia chromozoacutemu 18 pri Edwardsovom syndroacuteme) rocirczne zmeny v počte pohlavnyacutech chromozoacutemov (monozoacutemia X pri Turnerovom syndroacuteme Klinefelterov syndroacutem s X chromozoacutemom naviac - XXY) podobne v predimplantačnej diagnostike

83 DNA Microarray (DNA mikro čip biočip) DNA mikročipovanie je technika využiacutevajuacuteca hybridizaacuteciu skuacutemanej nukleovej kyseliny

(cieľovaacute vzorka) s veľkyacutem množstvom oligonukleotidovyacutech proacuteb (desať tisiacutec až milioacuten) ktoreacute suacute prichyteneacute na pevnyacute podklad najčastejšie sklenyacute silikoacutenovyacute alebo nylonovyacute (doštička čip) Skuacutemanaacute nukleovaacute kyselina je pred hybridizaacuteciou fragmentovanaacute označenaacute fluorofoacuterom a denaturovanaacute Po kontakte čipu s cieľovou vzorkou ktoraacute je vlastne zmes označenyacutech oligonukleotidov značeneacute oligonukleotidy hybridizujuacute s oligonukleotidovyacutemi sekvenciami prichytenyacutemi na čipe Potom suacute na zaacuteklade fluorescencie detekovaneacute miesta kde došlo k hybridizaacutecii čiže vzorka obsahovala takuacuteto nukleotidovuacute sekvenciu Z jedneacuteho mikročipu sa ziacuteska obrovskeacute množstvo daacutet ktoreacute je vždy nutneacute softveacuterovo spracovať V dnešnej dobe existuje niekoľko firiem poskytujuacutecich komerčne mikročipy na objednaacutevku alebo si ich laboratoacuteria produkujuacute sami

Mikročipovanie prebieha nasledovne

1) Vytvorenie DNA čipu ndash tisiacutece rocircznych jednovlaacuteknovyacutech DNA oligonukleotidov znaacutemych sekvencii sa kovalentne naviažu na povrch doštičky vždy v určitej lokalite je niekoľko rovnakyacutech oligonukleotidov veľkosť takejto lokality je ˂ 200 microm Proacutebami mocircže byť DNA cDNA alebo syntetizovaneacute oligonukleotidy Už hotoveacute mikročipy ponuacutekajuacute viacereacute firmy (Affymetrix Agilent Technologies Eppendorf Illumina) alebo si ich jednotliveacute laboratoacuteria vyraacutebajuacute sami pomocou robotickyacutech zariadeniacute DNA čip sa vytvaacutera buď nanaacutešaniacutem kvapiek oligonukleotidov na podklad alebo synteacutezou oligonukleotidov in situ na čipe 2) Priacuteprava vzorky ndash nukleovaacute kyselina (mRNA DNA) sa purifikuje určiacute sa jej kvantita a kvalita (spektrofotometericky) fragmentuje resp v priacutepade mRNA sa syntetizuje cDNA v priacutepade potreby sa mocircže DNA amplifikovať PCR reakciou štiepiť restrikčnyacutemi endonukleaacutezami 3) Fluorescenčneacute označenie (zriedkavejšie raacutedioaktiacutevne) fragmentov DNA prebieha počas reverznej transkripcie alebo PCR amplifikaacutecie za uacutečasti fluorescenčne značenyacutech nukleotidov Keď sa analyzujuacute dve rocirczne vzorky napr zdraveacute tkanivo a naacutedoroveacute tkanivo označenie nukleovyacutech kyseliacuten v tyacutechto tkanivaacutech byacuteva rozdielne a to použitiacutem dvoch rocircznych fluorescenčnyacutech farbiacutev (napr zeleneacute a červeneacute) Pred hybridizaacuteciou je potrebneacute vzorku denaturovať čiacutem sa vytvoriacute zmes jednovlaacuteknovyacutech DNA označenyacutech značkou 4) Hybridizaacutecia s mikročipom ndash v špeciaacutelnom hybridizačnom roztoku hybridizujuacute komplementaacuterne sekvencie zo vzorky s priacuteslušnyacutemi oligonukleotidovyacutemi sondami naviazanyacutemi na čipe Potom sa čip obmyje aby došlo k odstraacuteneniu čiastočne hybridizovanyacutech nukleovyacutech kyseliacuten 5) Skenovanie mikročipu ndash skenerom čipov docircjde k ožiareniu čipu laserom pričom v mieste hybridizaacutecie fluorescenčne značenyacutech DNA fragmentov s proacutebou docircjde k emisii svetla určitej vlnovej dĺžky ktoruacute skener zaznamenaacute 6) Analyacuteza daacutet prebieha metoacutedami bioinformatiky spracovaniacutem softveacutermi sa zistiacute ktoreacute lokality čipu navzaacutejom hybridizovali v priacutepade použitia dvoch vzoriek kontrolnej a skuacutemanej je možneacute analyzovať ich relatiacutevnu intenzitu hybridizaacutecie (expresie určiteacuteho geacutenu)

Existujuacute štyri typy mikročipov 1) Čipy ur čeneacute na analyacutezu expresie (obsahujuacute cDNA proacuteby) pre tzv dvojkanaacutelovyacute experiment kedy je vzorka určenaacute k hybridizaacutecii na čipe ziacuteskanaacute zmiešaniacutem DNA fragmentov kontrolnej a skuacutemanej vzorky pričom fragmenty suacute rozdielne fluorescenčne označeneacute (napr zelenyacute fluorofoacuter pre kontrolnuacute vzorku a červenyacute pre skuacutemanuacute) Na zaacuteklade intenzity a typu fluorescencie sa deteguje expresia geacutenov typickaacute pre kontrolnuacute vzorku (napr zelenaacute fluorescencia) pre skuacutemanuacute vzorku (napr

48

červenaacute fluorescencia) a expresia podobnaacute u oboch vzoriek (žltaacute fluorescencia) neexprimovaneacute geacuteny (čierna fluorescencia) rocirczne odtiene (v zaacutevislosti od prevažujuacutecej hybridizaacutecie) (obr 48) 2) Čipy ur čeneacute na analyacutezu mutaacutecii použije sa genoacutemovaacute DNA označenaacute jednou fluorescenčnou farbičkou na určenie jednonukleotidovej zmeny (SNP ndash Single Nukleotide Polymorphism) 3) Čipy na komparatiacutevnu genoacutemovuacute hybridizaacuteciu (aCGH array Comparative Genomic Hybridization) ndash použiacutevaneacute na zistenie zvyacutešenia alebo zniacuteženia množstva chromozoacutemovyacutech fragmentov obsahujuacutecich geacuteny zodpovedneacute za určiteacute ochorenie Na analyacutezu sa použije skuacutemanaacute gDNA a referenčnaacute (kontrolnaacute) DNA každaacute sa značiacute inou fluorescenčnou farbičkou (princiacutep ako pri analyacuteze expresie) (obr 49 50) 4) Čipy CGH - SNP kombinovaneacute čipy ur čeneacute na analyacutezu aj mutaacuteciiacute SNP aj na komparatiacutevnu genoacutemovuacute hybridizaacuteciu CGH

Mikročipy majuacute rozsiahle využitie napriacuteklad v identifikaacuteciiacute novyacutech geacutenov vo vyacuteskume ich funkciiacute expresie v rocircznych podmienkach pri diagnostike mnohyacutech ochoreniacute vo farmakogenomike vo vyacuteskume vplyvu toxiacutenov

Obr 48 Heatmapa geacutenovej expresie vybranyacutech geacutenov (mRNA) mikročip obsahuje 46000 cDNA proacuteb (poskytnuteacute Ing Helenou Gbelcovou PhD Uacutestav lekaacuterskej bioloacutegie genetiky a klinickej genetiky LF UK a UNB)

49

Obr 49 Princiacutep komparatiacutevnej genoacutemovej hybridizaacutecie (aCGH - array comparative genomic hybridization) Obr 50 A) Vyacutesledok komparatiacutevnej genoacutemovej hybridizaacutecie (aCGH - array comparative genomic hybridization) vzorky DNA izolovanej plodovej vody U plodu s abnormaacutelnym ultrasonografickyacutem vyšetreniacutem bola identifikovanaacute duplikaacutecia oblasti 3q261q29 (modryacute paacutes) a deleacutecia oblasti 5p1533p151 (červenyacute paacutes) Pre porovnanie chromozoacutem 1 bez aberaacutecie b) Ten istyacute pacient ale ineacute softveacuteroveacute spracovanie (poskytnuteacute RNDr Miroslavom Tomkom PhD Medirex)

50

Odporuacutečanaacute a použitaacute literatuacutera

Odborneacute knihy Klug W S Cummings M R Spencer Ch A Palladino M A Concepts of Genetics jedenaacuteste vydanie (2015) Carson S Molecular Biology Techniques tretie vydanie (2012) Strachan T Read A Human Molecular Genetics štvrteacute vydanie (2011) Sudbery P Sudbery I Human Molecular Genetics tretie vydanie (2009)

Internetoveacute straacutenky

wwwncbinlmnihgov wwwmlpacom wwwthermofishercom wwwilluminacom wwwpromegask wwwqiagencom wwwambioncom

Odborneacute člaacutenky Chacon-Cortes D Griffiths L R Methods for extracting genomic DNA from whole blood samples current perspectives Journal of Biorepository Science for Applied Medicine Volume 2 strany 1- 9 Viltrop T Krjutskov K Palta P Metspalu A Comparison of DNA extraction methods for multiplex polymerase chain reaction Anal Biochem 2010 Volume 398(2) strany 260-262 Ing Martin Čermaacutek Molekulaacuterna cytogenetika v problematike familiaacuternych maligniacutet Onkoloacutegia Volume 2 strany 77 - 83 Livak KJ Schmittgen TD Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method Methods 2001 Volume 25(4) strany 402 - 408 Bustin S A Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays J Mol Endocrinol 2000 Volume 25(2) strany169 - 193

MOLEKULAacuteRNE METOacuteDY AKTUAacuteLNE POUŽIacuteVANEacute V KLINICKEJ GENETIKE RNDr Andrea Pastoraacutekovaacute PhD RNDr Robert Petrovič PhD Vydala Univerzita Komenskeacuteho v Bratislave Lekaacuterska fakulta Rozsah 50 straacuten 246 AH prveacute vydanie ISBN 978-80-223-4231-5

39

8 Metoacutedy založeneacute na princiacutepe hybridizaacutecie

Nukleoveacute kyseliny majuacute schopnosť vytvaacuterať dvojvlaacuteknoveacute reťazce z jednovlaacuteknovyacutech molekuacutel na zaacuteklade komplementarity baacutez Komplementarita baacutez umožňuje replikaacuteciu DNA transkripciu RNA komplementarita baacutez zabezpečuje teda reprodukovateľnosť živej hmoty

Hybridizaacutecia je proces v ktorom na zaacuteklade komplementarity baacutez dochaacutedza k vytvoreniu dvojvlaacuteknovej nukleovej kyseliny z dvoch jednovlaacuteknovyacutech molekuacutel DNA alebo RNA alebo ich kombinaacuteciou DNA RNA pričom kratšia jednovlaacuteknovaacute nukleovaacute kyselina vystupuje ako sonda (proacuteba) Hybridizaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten je jeden z najpoužiacutevanejšiacutech naacutestrojov v molekulaacuternej bioloacutegii a genetike (hybridizaacutecia primerov alebo proacuteb sa využiacuteva v takmer každej metoacutede - v PCR RT-PCR qPCR RT-qPCR MLPA sekvenovaniacute fragmentačnej analyacuteze FISH DNA mikročipoch atď)

Denaturaacutecia nukleovyacutech kyseliacuten je proces pri ktorom dochaacutedza k porušeniu vodiacutekovyacutech vaumlzieb medzi vlaacuteknami nukleovyacutech kyseliacuten (strata sekundaacuternej a terciaacutelnej štruktuacutery) tak že docircjde k ich uacuteplneacutemu oddeleniu vzniknuacute jednovlaacuteknoveacute reťazce Denaturaacutecia NK mocircže byť spocircsobenaacute vplyvom vysokyacutech teplocirct pH alebo chemickyacutech laacutetok (denaturačneacute činidlaacute) Renaturaacutecia je opačnyacute proces v ktorom na zaacuteklade komplementarity dochaacutedza k tvorbe dvojvlaacuteknovyacutech NK

Hybridiza čnaacute sonda (proacuteba) je jednovlaacuteknovaacute nukleovaacute kyselina určitej znaacutemej dĺžky a sekvencie (najčastejšie DNA pretože je stabilnejšia ako RNA) ktoraacute je značenaacute a sluacuteži na detekciu komplementaacuternych molekuacutel DNA alebo RNA v procese hybridizaacutecie V zaacutevislosti od podmienok hybridizaacutecie (stringencia) mocircže byť detegovanaacute sekvencia uacuteplne komplementaacuterna alebo v menej priacutesnych podmienkach mocircže mať sekvenčneacute odchyacutelky Proacuteba sluacuteži na vyhľadanie a zviditeľnenie cieľovyacutech NK Zviditeľnenie sa deje prostredniacutectvom označenia proacuteby ešte pred hybridizaacuteciou Značenie proacuteby mocircže byť raacutedioaktiacutevne a neraacutedioaktiacutevne (najčastejšie fluorescenčneacute)

Raacutedioaktiacutevne značeneacute proacuteby pomocou izotopov (32P) sa využiacutevali viac v minulosti v suacutečasnosti suacute kvocircli zdravotnyacutem rizikaacutem ohľaduplnosti k životneacutemu prostrediu ako aj kvocircli jednoduchšej manipulaacutecii použiacutevaneacute fluorescenčne značeneacute proacuteby Raacutedioaktiacutevne značeneacute sondy boli použiacutevaneacute hlavne metoacutedou Southernovej hybridizaacutecie (Southern blotting Southern blot) Citlivosť raacutedioaktiacutevne značenyacutech proacuteb je vyššia dosahuje schopnosť zachytiť 10 fg (femtogram 10-15) cieľovej DNA sekvencie 81 Southern blot

Metoacutedu objavil v roku 1975 britskyacute bioloacuteg Edwin Southern (preto Southern) Pri Southernovej hybridizaacutecii sa restrikčne štiepeneacute fragmenty DNA elektroforeticky separujuacute v geacuteli potom sa metoacutedou blottingu prenesuacute na nylonovuacute alebo nitroceluloacutezovuacute membraacutenu kde suacute naacutesledne hybridizovaneacute v roztoku obsahujuacutecom raacutedioaktiacutevne značenuacute sondu Priloženiacutem fotografickeacuteho filmu k membraacutene a vyvolaniacutem filmu autoraacutediografiou docircjde k zviditeľneniu lokaliacutet kde došlo k hybridizaacuteciiacute raacutedioaktiacutevne značenej sondy s fragmentom DNA (autoraacutediogram) Southern blot bol kľuacutečovou a prvou metoacutedou na identifikaacuteciu osocircb (DNA fingerprinting DNA pofiling) (obr 35)

Okrem Southern blotu existuje Northern blot na analyacutezu RNA (geacutenovej expresie) a Western blot na analyacutezu proteiacutenov postup je obdobnyacute ako pri Southern blote s obmenami špecifickyacutemi pre konkreacutetny blot Pri Northern blote sa použiacutevajuacute hybridizačneacute proacuteby ale pre vizualizaacuteciu proteiacutenov western blotom je potrebneacute použiť protilaacutetky s naacuteslednou vizualizaacuteciou Pomenovanie techniacutek je hra so sloviacutečkami (keďže paacuten Northern ani Western neobjavili takto nazvaneacute techniky)

Neraacutedioaktiacutevne značenie proacuteb použiacutevanyacutech v molekulaacuternej genetike mocircže byť nepriame (použitie haptenu) alebo priame Konečnaacute vizualizaacutecia je najčastejšie zabezpečenaacute fluoreskujuacutecimi farebnyacutemi značkami farbivami fluorochroacutemami (fluorofoacuterami) Pri priamom značeniacute je farbička kovalentne naviazanaacute na nukleotid a na zachytenie fluorescencie suacute potrebneacute špeciaacutelne priacutestroje umožňujuacutece excitaacuteciu farbičky ktoraacute potom emituje žiarenie určitej vlnovej dĺžky (emisneacute žiarenie) a to zachytiacute detekčnyacute systeacutem priacutestroja Využitie fluorochroacutemov v molekulaacuternej genetike je masiacutevne napr na vizualizaacuteciu NK elektroforeticky separovanyacutech v geacuteli kvantifikaacuteciu produktov PCR reakcie v priacutestroji real-time PCR cykleacuter sekvenovaniacute fragmentačnej analyacuteze FISH DNA mikročipoch atď

40

Obr 35 Princiacutep Southern blotu

82 FISH (fluorescenčnaacute in situ hybridizaacutecia)

FISH (fluorescent in situ hybridization fluorescenčnaacute in situ hybridizaacutecia) metoacuteda patriacute medzi molekulovo-cytogenetickeacute techniky Princiacutep FISH metoacutedy je založenyacute na hybridizaacuteciiacute fluorescenčne značenyacutech proacuteb ku komplementaacuternym uacutesekom vyšetrovanej DNA na podložnom skle (priamo na mieste - in situ) K denaturaacutecii dsDNA dochaacutedza buď vplyvom denaturačnyacutech činidiel alebo zvyacutešenou teplotou a naacuteslednou renaturaacuteciou dochaacutedza k naviazaniu sondy na komplementaacuterny uacutesek DNA Vyacutesledok hybridizaacutecie sa vizualizuje fluorescenčnyacutem mikroskopom vybavenyacutem vhodnyacutemi fluorescenčnyacutemi filtrami a vizuaacutelne zhodnotiacute skuacutesenyacutem odborniacutekom Fluorescencia sa v niektoryacutech priacutepadoch mocircže zaznamenať a hodnotiť aj pomocou softveacuteru (obr 36)

Pomocou FISH detegujeme numerickeacute aberaacutecie - zmeny v počte chromozoacutemov (napr trizoacutemia monozoacutemia chromozoacutemov) alebo štruktuacuterne aberaacutecie a prestavby (napr translokaacutecie inverzie deleacutecie duplikaacutecie amplifikaacutecie) FISH metoacuteda umožňuje identifikaacuteciu a detekciu každeacuteho ľudskeacuteho chromozoacutemu jeho zaradenie do karyotypu odhalenie malyacutech submikroskopickyacutech chromozoacutemovyacutech zmien a tiež mapovať poziacutecie jednotlivyacutech geacutenov na chromozoacuteme

41

Obr 36 Princiacutep štandardnej FISH a FISH maľovania celeacuteho chromozoacutemu

Veľkou vyacutehodou FISH metoacutedy je možnosť analyacutezy buniek v metafaacuteze aj v interfaacuteze kedy nie je nutnaacute kultivaacutecia buniek a tiež ryacutechle analyzovanie veľkeacuteho počtu buniek (stovky až tisiacutece) K ďalšiacutem vyacutehodaacutem patriacute bezpečnosť vysokaacute citlivosť dostatočnaacute stabilita relatiacutevne kraacutetky čas hybridizaacutecie a možnosť ryacutechleho vyhodnotenia Hybridizaacutecia pri vaumlčšine suacutečasne dodaacutevanyacutech sond trvaacute 10-12 hodin (na trhu suacute už dostupneacute aj sondy so skraacutetenyacutem časom hybridizaacutecie na 2-3 hodiny) Po hybridizaacuteciiacute nasleduje odmyacutevanie kedy pri priacuteslušnej teplote dochaacutedza k odmytiu nenaviazanyacutech a nespraacutevne hybridizovanyacutech sond Preparaacutet sa naacutesledne podfarbiacute a vyacutesledok sa zhodnotiacute vo fluorescenčnom mikroskope Na podfarbenie chromozoacutemov alebo jadier sa použiacuteva modreacute kontrastneacute farbivo DAPI (46-diamidino-2-fenylindol) ktoreacute maacute silneacute fluorescenčneacute vlastnosti dokaacuteže prechaacutedzať jadrovou membraacutenou a viazať sa na DNA Vyacutesledkom je modreacute zafarbenie ktoreacute vyacuteborne kontrastuje so signaacutelmi jednotlivyacutech sond

Limitujuacutecim faktorom FISH je možnosť identifikaacutecie len tyacutech uacutesekov DNA ku ktoryacutem suacute použiteacute sondy V jednej analyacuteze je možneacute použiť najviac 3 odlišne značeneacute sondy a tak zistiť priacutepadneacute abnormality len na 1 alebo na paacuter lokusoch Na relevantnuacute detekciu je potrebneacute mať vo vzorke 1-5 aberantnyacutech interfaacutezovyacutech jadier

FISH je možneacute uskutočniť na širokej škaacutele biologickeacuteho materiaacutelu na vzorkaacutech perifeacuternej krvi kostnej drene naacuteteroch choriovyacutech klkoch plodovej vode rocircznych druhov tkaniacutev natiacutevnych alebo zaliatych v parafiacutene na 1 bunke (predimplantačnaacute genetickaacute diagnostika PGD) (obr 37)

Využiacuteva sa na detekciu aberaacuteciiacute pri mnohyacutech onkologickyacutech ochoreniach (napr pri diagnoacuteze mnohopočetnyacute myeloacutem sa v suacutečasnosti po separaacutecii CD138+ buniek robiacute FISH s 5 sondami pre geacuteny IGH TP53 RB1 oblasť 1p321q21 a stanovuje sa hyperploidia chromozoacutemov 5 9 a 15) a tiež k spresneniu doplneniu a k overeniu bežneacuteho cytogenetickeacuteho vyšetrenia

Podľa miesta na chromozoacuteme na ktorom dochaacutedza k hybridizaacutecii sondy rozlišujeme 4 typy

DNA sond bull centromeacuteroveacute sondy ndash sa viažu na strednuacute časť chromozoacutemu ndash centromeacuteru sluacutežia k diagnostike zmien v počte chromozoacutemov k detekcii chromozoacutemov neznaacutemeho pocircvodu umožňujuacute interfaacuteznu FISH na nedeliacich sa bunkaacutech (obr 38-41)

42

Obr 37 Interfaacutezna FISH preimplantačnyacute genetickyacute skriacutening aneuploidiiacute ndash blastomeacutera 3-denneacuteho ľudskeacuteho embrya s normaacutelnym počtom chromozoacutemov 13 18 21 pohlavie XY použityacutech 5 sond pre chromozoacutemy 13 ndash orange 18 ndash aqua 21 ndash green X ndash blue a Y ndash yellow (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

Obr 38 Interfaacutezne jadro po hybridizaacutecii s centromeacuterovou sondou pre chromozoacutem 8 (Vysis Abbott) V pravom jadre je priacutetomnaacute trizoacutemia chromozoacutemu 8 (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex) Obr 39 Metafaacutezna (A) a interfaacutezna FISH (B) použitaacute centromeacuterovaacute sonda CEPX spectrum orangeCEPY spectrum green (Vysis Abbott) Sonda hybridizuje k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (červenyacute signaacutel) a Y (zelenyacute signaacutel) (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

43

Obr 40 Interfaacutezna FISH vyšetrenie spermiiacute použiteacute sondy CEPX greenCEPY orange (Aneuscore Metasystems) Sondy hybridizujuacute k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (zelenyacute signaacutel) Y (červenyacute signaacutel) vľavo ndash dve haploidneacute spermie (majuacutece jedna spermia X druhaacute Y chromozoacutem) vpravo ndash dve patologickeacute spermie obsahujuacutece gonozoacutemovyacute komplement XY (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

Obr 41 Interfaacutezna FISH vyšetrenie spermiiacute použiteacute sondy CEPX greenCEPY orange a CEP18 aqua (Aneuscore Metasystems) Sondy hybridizujuacute k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (zelenyacute signaacutel) Y (červenyacute signaacutel) a 18 (modryacute signaacutel) vľavo ndash normaacutelne haploidneacute ľudskeacute spermie - 1x chromozoacutem X alebo Y a jedenkraacutet chromozoacutem 18 v strede ndash patologickaacute spermia obsahujuacuteca gonozoacutemovyacute komplement XY a jeden chromozoacutem 18 vpravo ndash patologickaacute diploidnaacute spermia s chromozoacutemami X Y a dvoma chromozoacutemami 18 (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

bull lokusovo špecifickeacute sondy ndash hybridizaacutecia prebehne na konkreacutetnom mieste geacutenu (lokuse) (obr 42-44) použiacutevajuacute sa k vyšetreniu mikrodeleacuteciiacute (straty malyacutech častiacute chromozoacutemu pri mikrodelečnyacutech syndroacutemoch) k zisteniu amplifikaacutecie onkogeacutenov a niektoryacutech špecifickyacutech translokaacuteciiacute prestavby geacutenov umožňujuacute interfaacuteznu FISH na nedeliacich sa bunkaacutech bull subtelomeroveacute ndash vaumlzba na koncoveacute časti chromozoacutemu ndash telomeacutery bull celochromozoacutemoveacute alebo celomaľovacie sondy ndash sondy hybridizujuacute s mnohopočetnyacutemi chromozoacutemovyacutemi sekvenciami pričom sa fluorescenčne tak bdquovymaľujeldquo celyacute chromozoacutem (Obr 45) Použiacutevajuacute sa na vyšetrenie chromozoacutemovyacutech prestavieb k analyacuteze translokaacuteciiacute a k detekcii pocircvodu tzv marker chromozoacutemov (malyacutech nadpočetnyacutech chromozoacutemov neznaacutemeho pocircvodu) K použitiu sondy suacute potrebneacute metafaacutezne chromozoacutemy nepoužiacutevaju sa pre interfaacuteznu FISH

Pri konvenčnej chromozoacutemovej FISH suacute homogeacutenne DNA proacuteby hybridizovaneacute s fixovanyacutem metafaacuteznym alebo prometafaacuteznym chromozoacutemomchromozoacutemami na skliacutečku (Obr 36a) Maximaacutelna rozlišovacia schopnosť metafaacuteznej FISH je niekoľko megabaacutez (Obr 39a 45) využitiacutem viac

44

natiahnutyacutech prometafaacuteznych chromozoacutemov sa dosiahne 1 Mb rozliacutešenie Prostredniacutectvom fiber FISH konkreacutetne artificiaacutelne deproteinizovanej natiahnutej DNA pripravenej in situ z celyacutech buniek na mikroskopickom skliacutečku je možneacute vizualizovať individuaacutelne geacuteny maleacute DNA elementy na chromozoacuteme s rozliacutešeniacutem okolo 1000 bp

Obr 42 Interfaacutezne jadro po hybridizaacutecii s lokusovo-špecifickou sondou LSI 5q31 Spectrum Orange5p12 Spectrum Green (Vysis Abbott) Na ľavom obraacutezku suacute priacutetomneacute dva červeneacute (5q31) a dva zeleneacute signaacutely (5p12) v pravom jadre je priacutetomnaacute deleacutecia 5q31 oblasti chyacuteba jeden červenyacute signal (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

Obr 43 Interfaacutezna FISH použitaacute lokusovo-špecifickaacute sonda ndash translokačnaacute - XL BCRABL1 plus (Metasystems) dvojfarebnaacute dvojfuacutezna kde červenaacute označuje lokus ABL1 na chromozoacuteme 9 a zelenaacute oblasť BCR na chromozoacuteme 22 Sonda deteguje fuacuteziu protoonkogeacutenu ABL1 (9q34) a geacutenu BCR (22q11) v priacutepade že červenyacute a zelenyacute signaacutel suacute pri sebe (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

45

Obr 44 Interfaacutezna FISH Použitaacute lokusovo-špecifickaacute sonda- typ break apart pre IGH geacuten V docircsledku translokaacutecie došlo k rozskočeniu geacutenu pričom translokačneacuteho partnera nepoznaacuteme vieme určiť len percento v koľkyacutech jadraacutech je geacuten prestavanyacute (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex) Obr 45 Použiteacute celochromozoacutemoveacute sondy WCP 15 (červenyacute chromozoacutem) a WCP 17 (zelenyacute chromozoacutem) Na metafaacuteze je potvrdenaacute reciprokaacute translokaacutecia t(1517)(q2221) (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

FISH vizualizaacutecia celeacuteho chromozoacutemu maľovanie chromozoacutemu anglicky chromosome

painting je špeciaacutelnou aplikaacuteciou chromozoacutemovej FISH proacuteba je koktail veľkeacuteho počtu rocircznych fluorescenčne značenyacutech DNA fragmentov hybridizujuacutecich pozdĺž celeacuteho konkreacutetneho chromozoacutemu (obr 36b 45) bdquoChromosomepaintingldquo analyzuje metafaacutezne chromozoacutemy V minulosti bola FISH vizualizaacutecia celyacutech chromozoacutemov limitovanaacute malyacutem množstvom rocirczne sfarbenyacutech fluorochroacutemov

V suacutečasnosti je možneacute detegovať množstvo cieľovyacutech sekvenciiacute naraz čo sa využiacuteva pri celogenoacutemovej chromozoacutemovej vizualizaacutecii (whole-chromosomepainting - WCP) metoacutedou multiplex FISH (M-FISH multicolor FISH o br 46) alebo spektraacutelnej karyotypizaacutecie (SKY) kedy možno rozliacutešiť všetky ľudskeacute chromozoacutemy ndash teda 24 rocircznych chromozoacutemov M-FISH a SKY patria medzi metafaacutezne formy FISH diagnostiky ktoreacute umožňujuacute simultaacutennu vizualizaacuteciu všetkyacutech ľudskyacutech chromozoacutemov v rocircznych farbaacutech čo predstavuje uľahčenie analyacutezy karyotypu hlavne pri komplexnyacutech zmenaacutech a markeroch neznaacutemeho pocircvodu Obe techniky vychaacutedzajuacute z použitia

46

celochromozoacutemovyacutech sond značenyacutech kombinaacuteciou viaceryacutech fluorochroacutemov Rozdiel medzi M-FISH a SKY spočiacuteva v technike ziacuteskania konečneacuteho obrazu

Obr 46 Multicolor FISH - každyacute chromozoacutemovyacute paacuter je zafarbenyacute inou farbou pričom na ich zafarbenie postačuje kombinaacutecia 5 fluorochroacutemov Na vyhodnocovanie je potrebnaacute špeciaacutelna sada fluorescenčnyacutech filtrov pre jednotliveacute fluorochroacutemy a špeciaacutelnyacute softweacuter Vľavo-štandardnyacute karyotyp vpravo karyotyp s mutaacuteciami (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

V molekulovej cytogenetike suacute komerčne dostupneacute sety M-FISH proacuteb umožňujuacutece

viacfarebneacute pruacutežkovanie chromozoacutemov (banding) s vysokyacutem rozliacutešeniacutem (multicolor-banding mBAND FISH MCB) čo umožňuje identifikaacuteciu intrachromozoacutemovyacutech prestavieb (Obr 47) Nevyhnutnosťou mBAND-u je mať chromozoacutemy v metafaacuteze Taacuteto metoacuteda bola prvyacutekraacutet uskutočnenaacute na chromozoacuteme 5 v roku 1999 mBAND FISH umožňuje rozliacutešiť špecifickeacute oblasti chromozoacutemov na uacuterovni pruacutežku - bandu a sub-bandu s detekciou 550 bandov haploidneacuteho karyotypu

Obr 47 A - mBAND chromozoacutemu 11 - inverzia duplikovanej oblasti 11q223-q25 B - mBAND chromozoacutemu 3 - na kruhovom chromozoacuteme deleacutecia oblasti 3p263 C - mBAND chromozoacutemu 2 - potvrdenie inverzie duplikovanej časti chromozoacutemu (poskytnuteacute RNDr Dagmar Landlovou Medirex)

FISH metoacuteda a jej varianty (M-FISH mBAND SKY) majuacute v suacutečasnosti širokeacute využitie v

klinickej genetike v onkologickej genetike na detekciu aberaacuteciiacute v čase diagnoacutezy počas liečby po

47

liečbe monitorovanie po transplantaacutecii kostnej drene v prenataacutelnej a postnataacutelnej diagnostike pri detekcii submikroskopickyacutech deleacuteciiacute (napr DiGeorge syndroacutem - 22q112 delečnyacute syndroacutem PraderndashWilli syndroacutem- chromozoacutem 15q11-13) prostredniacutectvom FISH je možnaacute detekcia numerickyacutech zmien chromozoacutemov (trizoacutemia chromozoacutemu 21 pri Downovom syndroacuteme trizoacutemia chromozoacutemu 15 pri Patauovom syndroacuteme trizoacutemia chromozoacutemu 18 pri Edwardsovom syndroacuteme) rocirczne zmeny v počte pohlavnyacutech chromozoacutemov (monozoacutemia X pri Turnerovom syndroacuteme Klinefelterov syndroacutem s X chromozoacutemom naviac - XXY) podobne v predimplantačnej diagnostike

83 DNA Microarray (DNA mikro čip biočip) DNA mikročipovanie je technika využiacutevajuacuteca hybridizaacuteciu skuacutemanej nukleovej kyseliny

(cieľovaacute vzorka) s veľkyacutem množstvom oligonukleotidovyacutech proacuteb (desať tisiacutec až milioacuten) ktoreacute suacute prichyteneacute na pevnyacute podklad najčastejšie sklenyacute silikoacutenovyacute alebo nylonovyacute (doštička čip) Skuacutemanaacute nukleovaacute kyselina je pred hybridizaacuteciou fragmentovanaacute označenaacute fluorofoacuterom a denaturovanaacute Po kontakte čipu s cieľovou vzorkou ktoraacute je vlastne zmes označenyacutech oligonukleotidov značeneacute oligonukleotidy hybridizujuacute s oligonukleotidovyacutemi sekvenciami prichytenyacutemi na čipe Potom suacute na zaacuteklade fluorescencie detekovaneacute miesta kde došlo k hybridizaacutecii čiže vzorka obsahovala takuacuteto nukleotidovuacute sekvenciu Z jedneacuteho mikročipu sa ziacuteska obrovskeacute množstvo daacutet ktoreacute je vždy nutneacute softveacuterovo spracovať V dnešnej dobe existuje niekoľko firiem poskytujuacutecich komerčne mikročipy na objednaacutevku alebo si ich laboratoacuteria produkujuacute sami

Mikročipovanie prebieha nasledovne

1) Vytvorenie DNA čipu ndash tisiacutece rocircznych jednovlaacuteknovyacutech DNA oligonukleotidov znaacutemych sekvencii sa kovalentne naviažu na povrch doštičky vždy v určitej lokalite je niekoľko rovnakyacutech oligonukleotidov veľkosť takejto lokality je ˂ 200 microm Proacutebami mocircže byť DNA cDNA alebo syntetizovaneacute oligonukleotidy Už hotoveacute mikročipy ponuacutekajuacute viacereacute firmy (Affymetrix Agilent Technologies Eppendorf Illumina) alebo si ich jednotliveacute laboratoacuteria vyraacutebajuacute sami pomocou robotickyacutech zariadeniacute DNA čip sa vytvaacutera buď nanaacutešaniacutem kvapiek oligonukleotidov na podklad alebo synteacutezou oligonukleotidov in situ na čipe 2) Priacuteprava vzorky ndash nukleovaacute kyselina (mRNA DNA) sa purifikuje určiacute sa jej kvantita a kvalita (spektrofotometericky) fragmentuje resp v priacutepade mRNA sa syntetizuje cDNA v priacutepade potreby sa mocircže DNA amplifikovať PCR reakciou štiepiť restrikčnyacutemi endonukleaacutezami 3) Fluorescenčneacute označenie (zriedkavejšie raacutedioaktiacutevne) fragmentov DNA prebieha počas reverznej transkripcie alebo PCR amplifikaacutecie za uacutečasti fluorescenčne značenyacutech nukleotidov Keď sa analyzujuacute dve rocirczne vzorky napr zdraveacute tkanivo a naacutedoroveacute tkanivo označenie nukleovyacutech kyseliacuten v tyacutechto tkanivaacutech byacuteva rozdielne a to použitiacutem dvoch rocircznych fluorescenčnyacutech farbiacutev (napr zeleneacute a červeneacute) Pred hybridizaacuteciou je potrebneacute vzorku denaturovať čiacutem sa vytvoriacute zmes jednovlaacuteknovyacutech DNA označenyacutech značkou 4) Hybridizaacutecia s mikročipom ndash v špeciaacutelnom hybridizačnom roztoku hybridizujuacute komplementaacuterne sekvencie zo vzorky s priacuteslušnyacutemi oligonukleotidovyacutemi sondami naviazanyacutemi na čipe Potom sa čip obmyje aby došlo k odstraacuteneniu čiastočne hybridizovanyacutech nukleovyacutech kyseliacuten 5) Skenovanie mikročipu ndash skenerom čipov docircjde k ožiareniu čipu laserom pričom v mieste hybridizaacutecie fluorescenčne značenyacutech DNA fragmentov s proacutebou docircjde k emisii svetla určitej vlnovej dĺžky ktoruacute skener zaznamenaacute 6) Analyacuteza daacutet prebieha metoacutedami bioinformatiky spracovaniacutem softveacutermi sa zistiacute ktoreacute lokality čipu navzaacutejom hybridizovali v priacutepade použitia dvoch vzoriek kontrolnej a skuacutemanej je možneacute analyzovať ich relatiacutevnu intenzitu hybridizaacutecie (expresie určiteacuteho geacutenu)

Existujuacute štyri typy mikročipov 1) Čipy ur čeneacute na analyacutezu expresie (obsahujuacute cDNA proacuteby) pre tzv dvojkanaacutelovyacute experiment kedy je vzorka určenaacute k hybridizaacutecii na čipe ziacuteskanaacute zmiešaniacutem DNA fragmentov kontrolnej a skuacutemanej vzorky pričom fragmenty suacute rozdielne fluorescenčne označeneacute (napr zelenyacute fluorofoacuter pre kontrolnuacute vzorku a červenyacute pre skuacutemanuacute) Na zaacuteklade intenzity a typu fluorescencie sa deteguje expresia geacutenov typickaacute pre kontrolnuacute vzorku (napr zelenaacute fluorescencia) pre skuacutemanuacute vzorku (napr

48

červenaacute fluorescencia) a expresia podobnaacute u oboch vzoriek (žltaacute fluorescencia) neexprimovaneacute geacuteny (čierna fluorescencia) rocirczne odtiene (v zaacutevislosti od prevažujuacutecej hybridizaacutecie) (obr 48) 2) Čipy ur čeneacute na analyacutezu mutaacutecii použije sa genoacutemovaacute DNA označenaacute jednou fluorescenčnou farbičkou na určenie jednonukleotidovej zmeny (SNP ndash Single Nukleotide Polymorphism) 3) Čipy na komparatiacutevnu genoacutemovuacute hybridizaacuteciu (aCGH array Comparative Genomic Hybridization) ndash použiacutevaneacute na zistenie zvyacutešenia alebo zniacuteženia množstva chromozoacutemovyacutech fragmentov obsahujuacutecich geacuteny zodpovedneacute za určiteacute ochorenie Na analyacutezu sa použije skuacutemanaacute gDNA a referenčnaacute (kontrolnaacute) DNA každaacute sa značiacute inou fluorescenčnou farbičkou (princiacutep ako pri analyacuteze expresie) (obr 49 50) 4) Čipy CGH - SNP kombinovaneacute čipy ur čeneacute na analyacutezu aj mutaacuteciiacute SNP aj na komparatiacutevnu genoacutemovuacute hybridizaacuteciu CGH

Mikročipy majuacute rozsiahle využitie napriacuteklad v identifikaacuteciiacute novyacutech geacutenov vo vyacuteskume ich funkciiacute expresie v rocircznych podmienkach pri diagnostike mnohyacutech ochoreniacute vo farmakogenomike vo vyacuteskume vplyvu toxiacutenov

Obr 48 Heatmapa geacutenovej expresie vybranyacutech geacutenov (mRNA) mikročip obsahuje 46000 cDNA proacuteb (poskytnuteacute Ing Helenou Gbelcovou PhD Uacutestav lekaacuterskej bioloacutegie genetiky a klinickej genetiky LF UK a UNB)

49

Obr 49 Princiacutep komparatiacutevnej genoacutemovej hybridizaacutecie (aCGH - array comparative genomic hybridization) Obr 50 A) Vyacutesledok komparatiacutevnej genoacutemovej hybridizaacutecie (aCGH - array comparative genomic hybridization) vzorky DNA izolovanej plodovej vody U plodu s abnormaacutelnym ultrasonografickyacutem vyšetreniacutem bola identifikovanaacute duplikaacutecia oblasti 3q261q29 (modryacute paacutes) a deleacutecia oblasti 5p1533p151 (červenyacute paacutes) Pre porovnanie chromozoacutem 1 bez aberaacutecie b) Ten istyacute pacient ale ineacute softveacuteroveacute spracovanie (poskytnuteacute RNDr Miroslavom Tomkom PhD Medirex)

50

Odporuacutečanaacute a použitaacute literatuacutera

Odborneacute knihy Klug W S Cummings M R Spencer Ch A Palladino M A Concepts of Genetics jedenaacuteste vydanie (2015) Carson S Molecular Biology Techniques tretie vydanie (2012) Strachan T Read A Human Molecular Genetics štvrteacute vydanie (2011) Sudbery P Sudbery I Human Molecular Genetics tretie vydanie (2009)

Internetoveacute straacutenky

wwwncbinlmnihgov wwwmlpacom wwwthermofishercom wwwilluminacom wwwpromegask wwwqiagencom wwwambioncom

Odborneacute člaacutenky Chacon-Cortes D Griffiths L R Methods for extracting genomic DNA from whole blood samples current perspectives Journal of Biorepository Science for Applied Medicine Volume 2 strany 1- 9 Viltrop T Krjutskov K Palta P Metspalu A Comparison of DNA extraction methods for multiplex polymerase chain reaction Anal Biochem 2010 Volume 398(2) strany 260-262 Ing Martin Čermaacutek Molekulaacuterna cytogenetika v problematike familiaacuternych maligniacutet Onkoloacutegia Volume 2 strany 77 - 83 Livak KJ Schmittgen TD Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method Methods 2001 Volume 25(4) strany 402 - 408 Bustin S A Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays J Mol Endocrinol 2000 Volume 25(2) strany169 - 193

MOLEKULAacuteRNE METOacuteDY AKTUAacuteLNE POUŽIacuteVANEacute V KLINICKEJ GENETIKE RNDr Andrea Pastoraacutekovaacute PhD RNDr Robert Petrovič PhD Vydala Univerzita Komenskeacuteho v Bratislave Lekaacuterska fakulta Rozsah 50 straacuten 246 AH prveacute vydanie ISBN 978-80-223-4231-5

40

Obr 35 Princiacutep Southern blotu

82 FISH (fluorescenčnaacute in situ hybridizaacutecia)

FISH (fluorescent in situ hybridization fluorescenčnaacute in situ hybridizaacutecia) metoacuteda patriacute medzi molekulovo-cytogenetickeacute techniky Princiacutep FISH metoacutedy je založenyacute na hybridizaacuteciiacute fluorescenčne značenyacutech proacuteb ku komplementaacuternym uacutesekom vyšetrovanej DNA na podložnom skle (priamo na mieste - in situ) K denaturaacutecii dsDNA dochaacutedza buď vplyvom denaturačnyacutech činidiel alebo zvyacutešenou teplotou a naacuteslednou renaturaacuteciou dochaacutedza k naviazaniu sondy na komplementaacuterny uacutesek DNA Vyacutesledok hybridizaacutecie sa vizualizuje fluorescenčnyacutem mikroskopom vybavenyacutem vhodnyacutemi fluorescenčnyacutemi filtrami a vizuaacutelne zhodnotiacute skuacutesenyacutem odborniacutekom Fluorescencia sa v niektoryacutech priacutepadoch mocircže zaznamenať a hodnotiť aj pomocou softveacuteru (obr 36)

Pomocou FISH detegujeme numerickeacute aberaacutecie - zmeny v počte chromozoacutemov (napr trizoacutemia monozoacutemia chromozoacutemov) alebo štruktuacuterne aberaacutecie a prestavby (napr translokaacutecie inverzie deleacutecie duplikaacutecie amplifikaacutecie) FISH metoacuteda umožňuje identifikaacuteciu a detekciu každeacuteho ľudskeacuteho chromozoacutemu jeho zaradenie do karyotypu odhalenie malyacutech submikroskopickyacutech chromozoacutemovyacutech zmien a tiež mapovať poziacutecie jednotlivyacutech geacutenov na chromozoacuteme

41

Obr 36 Princiacutep štandardnej FISH a FISH maľovania celeacuteho chromozoacutemu

Veľkou vyacutehodou FISH metoacutedy je možnosť analyacutezy buniek v metafaacuteze aj v interfaacuteze kedy nie je nutnaacute kultivaacutecia buniek a tiež ryacutechle analyzovanie veľkeacuteho počtu buniek (stovky až tisiacutece) K ďalšiacutem vyacutehodaacutem patriacute bezpečnosť vysokaacute citlivosť dostatočnaacute stabilita relatiacutevne kraacutetky čas hybridizaacutecie a možnosť ryacutechleho vyhodnotenia Hybridizaacutecia pri vaumlčšine suacutečasne dodaacutevanyacutech sond trvaacute 10-12 hodin (na trhu suacute už dostupneacute aj sondy so skraacutetenyacutem časom hybridizaacutecie na 2-3 hodiny) Po hybridizaacuteciiacute nasleduje odmyacutevanie kedy pri priacuteslušnej teplote dochaacutedza k odmytiu nenaviazanyacutech a nespraacutevne hybridizovanyacutech sond Preparaacutet sa naacutesledne podfarbiacute a vyacutesledok sa zhodnotiacute vo fluorescenčnom mikroskope Na podfarbenie chromozoacutemov alebo jadier sa použiacuteva modreacute kontrastneacute farbivo DAPI (46-diamidino-2-fenylindol) ktoreacute maacute silneacute fluorescenčneacute vlastnosti dokaacuteže prechaacutedzať jadrovou membraacutenou a viazať sa na DNA Vyacutesledkom je modreacute zafarbenie ktoreacute vyacuteborne kontrastuje so signaacutelmi jednotlivyacutech sond

Limitujuacutecim faktorom FISH je možnosť identifikaacutecie len tyacutech uacutesekov DNA ku ktoryacutem suacute použiteacute sondy V jednej analyacuteze je možneacute použiť najviac 3 odlišne značeneacute sondy a tak zistiť priacutepadneacute abnormality len na 1 alebo na paacuter lokusoch Na relevantnuacute detekciu je potrebneacute mať vo vzorke 1-5 aberantnyacutech interfaacutezovyacutech jadier

FISH je možneacute uskutočniť na širokej škaacutele biologickeacuteho materiaacutelu na vzorkaacutech perifeacuternej krvi kostnej drene naacuteteroch choriovyacutech klkoch plodovej vode rocircznych druhov tkaniacutev natiacutevnych alebo zaliatych v parafiacutene na 1 bunke (predimplantačnaacute genetickaacute diagnostika PGD) (obr 37)

Využiacuteva sa na detekciu aberaacuteciiacute pri mnohyacutech onkologickyacutech ochoreniach (napr pri diagnoacuteze mnohopočetnyacute myeloacutem sa v suacutečasnosti po separaacutecii CD138+ buniek robiacute FISH s 5 sondami pre geacuteny IGH TP53 RB1 oblasť 1p321q21 a stanovuje sa hyperploidia chromozoacutemov 5 9 a 15) a tiež k spresneniu doplneniu a k overeniu bežneacuteho cytogenetickeacuteho vyšetrenia

Podľa miesta na chromozoacuteme na ktorom dochaacutedza k hybridizaacutecii sondy rozlišujeme 4 typy

DNA sond bull centromeacuteroveacute sondy ndash sa viažu na strednuacute časť chromozoacutemu ndash centromeacuteru sluacutežia k diagnostike zmien v počte chromozoacutemov k detekcii chromozoacutemov neznaacutemeho pocircvodu umožňujuacute interfaacuteznu FISH na nedeliacich sa bunkaacutech (obr 38-41)

42

Obr 37 Interfaacutezna FISH preimplantačnyacute genetickyacute skriacutening aneuploidiiacute ndash blastomeacutera 3-denneacuteho ľudskeacuteho embrya s normaacutelnym počtom chromozoacutemov 13 18 21 pohlavie XY použityacutech 5 sond pre chromozoacutemy 13 ndash orange 18 ndash aqua 21 ndash green X ndash blue a Y ndash yellow (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

Obr 38 Interfaacutezne jadro po hybridizaacutecii s centromeacuterovou sondou pre chromozoacutem 8 (Vysis Abbott) V pravom jadre je priacutetomnaacute trizoacutemia chromozoacutemu 8 (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex) Obr 39 Metafaacutezna (A) a interfaacutezna FISH (B) použitaacute centromeacuterovaacute sonda CEPX spectrum orangeCEPY spectrum green (Vysis Abbott) Sonda hybridizuje k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (červenyacute signaacutel) a Y (zelenyacute signaacutel) (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

43

Obr 40 Interfaacutezna FISH vyšetrenie spermiiacute použiteacute sondy CEPX greenCEPY orange (Aneuscore Metasystems) Sondy hybridizujuacute k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (zelenyacute signaacutel) Y (červenyacute signaacutel) vľavo ndash dve haploidneacute spermie (majuacutece jedna spermia X druhaacute Y chromozoacutem) vpravo ndash dve patologickeacute spermie obsahujuacutece gonozoacutemovyacute komplement XY (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

Obr 41 Interfaacutezna FISH vyšetrenie spermiiacute použiteacute sondy CEPX greenCEPY orange a CEP18 aqua (Aneuscore Metasystems) Sondy hybridizujuacute k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (zelenyacute signaacutel) Y (červenyacute signaacutel) a 18 (modryacute signaacutel) vľavo ndash normaacutelne haploidneacute ľudskeacute spermie - 1x chromozoacutem X alebo Y a jedenkraacutet chromozoacutem 18 v strede ndash patologickaacute spermia obsahujuacuteca gonozoacutemovyacute komplement XY a jeden chromozoacutem 18 vpravo ndash patologickaacute diploidnaacute spermia s chromozoacutemami X Y a dvoma chromozoacutemami 18 (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

bull lokusovo špecifickeacute sondy ndash hybridizaacutecia prebehne na konkreacutetnom mieste geacutenu (lokuse) (obr 42-44) použiacutevajuacute sa k vyšetreniu mikrodeleacuteciiacute (straty malyacutech častiacute chromozoacutemu pri mikrodelečnyacutech syndroacutemoch) k zisteniu amplifikaacutecie onkogeacutenov a niektoryacutech špecifickyacutech translokaacuteciiacute prestavby geacutenov umožňujuacute interfaacuteznu FISH na nedeliacich sa bunkaacutech bull subtelomeroveacute ndash vaumlzba na koncoveacute časti chromozoacutemu ndash telomeacutery bull celochromozoacutemoveacute alebo celomaľovacie sondy ndash sondy hybridizujuacute s mnohopočetnyacutemi chromozoacutemovyacutemi sekvenciami pričom sa fluorescenčne tak bdquovymaľujeldquo celyacute chromozoacutem (Obr 45) Použiacutevajuacute sa na vyšetrenie chromozoacutemovyacutech prestavieb k analyacuteze translokaacuteciiacute a k detekcii pocircvodu tzv marker chromozoacutemov (malyacutech nadpočetnyacutech chromozoacutemov neznaacutemeho pocircvodu) K použitiu sondy suacute potrebneacute metafaacutezne chromozoacutemy nepoužiacutevaju sa pre interfaacuteznu FISH

Pri konvenčnej chromozoacutemovej FISH suacute homogeacutenne DNA proacuteby hybridizovaneacute s fixovanyacutem metafaacuteznym alebo prometafaacuteznym chromozoacutemomchromozoacutemami na skliacutečku (Obr 36a) Maximaacutelna rozlišovacia schopnosť metafaacuteznej FISH je niekoľko megabaacutez (Obr 39a 45) využitiacutem viac

44

natiahnutyacutech prometafaacuteznych chromozoacutemov sa dosiahne 1 Mb rozliacutešenie Prostredniacutectvom fiber FISH konkreacutetne artificiaacutelne deproteinizovanej natiahnutej DNA pripravenej in situ z celyacutech buniek na mikroskopickom skliacutečku je možneacute vizualizovať individuaacutelne geacuteny maleacute DNA elementy na chromozoacuteme s rozliacutešeniacutem okolo 1000 bp

Obr 42 Interfaacutezne jadro po hybridizaacutecii s lokusovo-špecifickou sondou LSI 5q31 Spectrum Orange5p12 Spectrum Green (Vysis Abbott) Na ľavom obraacutezku suacute priacutetomneacute dva červeneacute (5q31) a dva zeleneacute signaacutely (5p12) v pravom jadre je priacutetomnaacute deleacutecia 5q31 oblasti chyacuteba jeden červenyacute signal (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

Obr 43 Interfaacutezna FISH použitaacute lokusovo-špecifickaacute sonda ndash translokačnaacute - XL BCRABL1 plus (Metasystems) dvojfarebnaacute dvojfuacutezna kde červenaacute označuje lokus ABL1 na chromozoacuteme 9 a zelenaacute oblasť BCR na chromozoacuteme 22 Sonda deteguje fuacuteziu protoonkogeacutenu ABL1 (9q34) a geacutenu BCR (22q11) v priacutepade že červenyacute a zelenyacute signaacutel suacute pri sebe (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

45

Obr 44 Interfaacutezna FISH Použitaacute lokusovo-špecifickaacute sonda- typ break apart pre IGH geacuten V docircsledku translokaacutecie došlo k rozskočeniu geacutenu pričom translokačneacuteho partnera nepoznaacuteme vieme určiť len percento v koľkyacutech jadraacutech je geacuten prestavanyacute (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex) Obr 45 Použiteacute celochromozoacutemoveacute sondy WCP 15 (červenyacute chromozoacutem) a WCP 17 (zelenyacute chromozoacutem) Na metafaacuteze je potvrdenaacute reciprokaacute translokaacutecia t(1517)(q2221) (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

FISH vizualizaacutecia celeacuteho chromozoacutemu maľovanie chromozoacutemu anglicky chromosome

painting je špeciaacutelnou aplikaacuteciou chromozoacutemovej FISH proacuteba je koktail veľkeacuteho počtu rocircznych fluorescenčne značenyacutech DNA fragmentov hybridizujuacutecich pozdĺž celeacuteho konkreacutetneho chromozoacutemu (obr 36b 45) bdquoChromosomepaintingldquo analyzuje metafaacutezne chromozoacutemy V minulosti bola FISH vizualizaacutecia celyacutech chromozoacutemov limitovanaacute malyacutem množstvom rocirczne sfarbenyacutech fluorochroacutemov

V suacutečasnosti je možneacute detegovať množstvo cieľovyacutech sekvenciiacute naraz čo sa využiacuteva pri celogenoacutemovej chromozoacutemovej vizualizaacutecii (whole-chromosomepainting - WCP) metoacutedou multiplex FISH (M-FISH multicolor FISH o br 46) alebo spektraacutelnej karyotypizaacutecie (SKY) kedy možno rozliacutešiť všetky ľudskeacute chromozoacutemy ndash teda 24 rocircznych chromozoacutemov M-FISH a SKY patria medzi metafaacutezne formy FISH diagnostiky ktoreacute umožňujuacute simultaacutennu vizualizaacuteciu všetkyacutech ľudskyacutech chromozoacutemov v rocircznych farbaacutech čo predstavuje uľahčenie analyacutezy karyotypu hlavne pri komplexnyacutech zmenaacutech a markeroch neznaacutemeho pocircvodu Obe techniky vychaacutedzajuacute z použitia

46

celochromozoacutemovyacutech sond značenyacutech kombinaacuteciou viaceryacutech fluorochroacutemov Rozdiel medzi M-FISH a SKY spočiacuteva v technike ziacuteskania konečneacuteho obrazu

Obr 46 Multicolor FISH - každyacute chromozoacutemovyacute paacuter je zafarbenyacute inou farbou pričom na ich zafarbenie postačuje kombinaacutecia 5 fluorochroacutemov Na vyhodnocovanie je potrebnaacute špeciaacutelna sada fluorescenčnyacutech filtrov pre jednotliveacute fluorochroacutemy a špeciaacutelnyacute softweacuter Vľavo-štandardnyacute karyotyp vpravo karyotyp s mutaacuteciami (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

V molekulovej cytogenetike suacute komerčne dostupneacute sety M-FISH proacuteb umožňujuacutece

viacfarebneacute pruacutežkovanie chromozoacutemov (banding) s vysokyacutem rozliacutešeniacutem (multicolor-banding mBAND FISH MCB) čo umožňuje identifikaacuteciu intrachromozoacutemovyacutech prestavieb (Obr 47) Nevyhnutnosťou mBAND-u je mať chromozoacutemy v metafaacuteze Taacuteto metoacuteda bola prvyacutekraacutet uskutočnenaacute na chromozoacuteme 5 v roku 1999 mBAND FISH umožňuje rozliacutešiť špecifickeacute oblasti chromozoacutemov na uacuterovni pruacutežku - bandu a sub-bandu s detekciou 550 bandov haploidneacuteho karyotypu

Obr 47 A - mBAND chromozoacutemu 11 - inverzia duplikovanej oblasti 11q223-q25 B - mBAND chromozoacutemu 3 - na kruhovom chromozoacuteme deleacutecia oblasti 3p263 C - mBAND chromozoacutemu 2 - potvrdenie inverzie duplikovanej časti chromozoacutemu (poskytnuteacute RNDr Dagmar Landlovou Medirex)

FISH metoacuteda a jej varianty (M-FISH mBAND SKY) majuacute v suacutečasnosti širokeacute využitie v

klinickej genetike v onkologickej genetike na detekciu aberaacuteciiacute v čase diagnoacutezy počas liečby po

47

liečbe monitorovanie po transplantaacutecii kostnej drene v prenataacutelnej a postnataacutelnej diagnostike pri detekcii submikroskopickyacutech deleacuteciiacute (napr DiGeorge syndroacutem - 22q112 delečnyacute syndroacutem PraderndashWilli syndroacutem- chromozoacutem 15q11-13) prostredniacutectvom FISH je možnaacute detekcia numerickyacutech zmien chromozoacutemov (trizoacutemia chromozoacutemu 21 pri Downovom syndroacuteme trizoacutemia chromozoacutemu 15 pri Patauovom syndroacuteme trizoacutemia chromozoacutemu 18 pri Edwardsovom syndroacuteme) rocirczne zmeny v počte pohlavnyacutech chromozoacutemov (monozoacutemia X pri Turnerovom syndroacuteme Klinefelterov syndroacutem s X chromozoacutemom naviac - XXY) podobne v predimplantačnej diagnostike

83 DNA Microarray (DNA mikro čip biočip) DNA mikročipovanie je technika využiacutevajuacuteca hybridizaacuteciu skuacutemanej nukleovej kyseliny

(cieľovaacute vzorka) s veľkyacutem množstvom oligonukleotidovyacutech proacuteb (desať tisiacutec až milioacuten) ktoreacute suacute prichyteneacute na pevnyacute podklad najčastejšie sklenyacute silikoacutenovyacute alebo nylonovyacute (doštička čip) Skuacutemanaacute nukleovaacute kyselina je pred hybridizaacuteciou fragmentovanaacute označenaacute fluorofoacuterom a denaturovanaacute Po kontakte čipu s cieľovou vzorkou ktoraacute je vlastne zmes označenyacutech oligonukleotidov značeneacute oligonukleotidy hybridizujuacute s oligonukleotidovyacutemi sekvenciami prichytenyacutemi na čipe Potom suacute na zaacuteklade fluorescencie detekovaneacute miesta kde došlo k hybridizaacutecii čiže vzorka obsahovala takuacuteto nukleotidovuacute sekvenciu Z jedneacuteho mikročipu sa ziacuteska obrovskeacute množstvo daacutet ktoreacute je vždy nutneacute softveacuterovo spracovať V dnešnej dobe existuje niekoľko firiem poskytujuacutecich komerčne mikročipy na objednaacutevku alebo si ich laboratoacuteria produkujuacute sami

Mikročipovanie prebieha nasledovne

1) Vytvorenie DNA čipu ndash tisiacutece rocircznych jednovlaacuteknovyacutech DNA oligonukleotidov znaacutemych sekvencii sa kovalentne naviažu na povrch doštičky vždy v určitej lokalite je niekoľko rovnakyacutech oligonukleotidov veľkosť takejto lokality je ˂ 200 microm Proacutebami mocircže byť DNA cDNA alebo syntetizovaneacute oligonukleotidy Už hotoveacute mikročipy ponuacutekajuacute viacereacute firmy (Affymetrix Agilent Technologies Eppendorf Illumina) alebo si ich jednotliveacute laboratoacuteria vyraacutebajuacute sami pomocou robotickyacutech zariadeniacute DNA čip sa vytvaacutera buď nanaacutešaniacutem kvapiek oligonukleotidov na podklad alebo synteacutezou oligonukleotidov in situ na čipe 2) Priacuteprava vzorky ndash nukleovaacute kyselina (mRNA DNA) sa purifikuje určiacute sa jej kvantita a kvalita (spektrofotometericky) fragmentuje resp v priacutepade mRNA sa syntetizuje cDNA v priacutepade potreby sa mocircže DNA amplifikovať PCR reakciou štiepiť restrikčnyacutemi endonukleaacutezami 3) Fluorescenčneacute označenie (zriedkavejšie raacutedioaktiacutevne) fragmentov DNA prebieha počas reverznej transkripcie alebo PCR amplifikaacutecie za uacutečasti fluorescenčne značenyacutech nukleotidov Keď sa analyzujuacute dve rocirczne vzorky napr zdraveacute tkanivo a naacutedoroveacute tkanivo označenie nukleovyacutech kyseliacuten v tyacutechto tkanivaacutech byacuteva rozdielne a to použitiacutem dvoch rocircznych fluorescenčnyacutech farbiacutev (napr zeleneacute a červeneacute) Pred hybridizaacuteciou je potrebneacute vzorku denaturovať čiacutem sa vytvoriacute zmes jednovlaacuteknovyacutech DNA označenyacutech značkou 4) Hybridizaacutecia s mikročipom ndash v špeciaacutelnom hybridizačnom roztoku hybridizujuacute komplementaacuterne sekvencie zo vzorky s priacuteslušnyacutemi oligonukleotidovyacutemi sondami naviazanyacutemi na čipe Potom sa čip obmyje aby došlo k odstraacuteneniu čiastočne hybridizovanyacutech nukleovyacutech kyseliacuten 5) Skenovanie mikročipu ndash skenerom čipov docircjde k ožiareniu čipu laserom pričom v mieste hybridizaacutecie fluorescenčne značenyacutech DNA fragmentov s proacutebou docircjde k emisii svetla určitej vlnovej dĺžky ktoruacute skener zaznamenaacute 6) Analyacuteza daacutet prebieha metoacutedami bioinformatiky spracovaniacutem softveacutermi sa zistiacute ktoreacute lokality čipu navzaacutejom hybridizovali v priacutepade použitia dvoch vzoriek kontrolnej a skuacutemanej je možneacute analyzovať ich relatiacutevnu intenzitu hybridizaacutecie (expresie určiteacuteho geacutenu)

Existujuacute štyri typy mikročipov 1) Čipy ur čeneacute na analyacutezu expresie (obsahujuacute cDNA proacuteby) pre tzv dvojkanaacutelovyacute experiment kedy je vzorka určenaacute k hybridizaacutecii na čipe ziacuteskanaacute zmiešaniacutem DNA fragmentov kontrolnej a skuacutemanej vzorky pričom fragmenty suacute rozdielne fluorescenčne označeneacute (napr zelenyacute fluorofoacuter pre kontrolnuacute vzorku a červenyacute pre skuacutemanuacute) Na zaacuteklade intenzity a typu fluorescencie sa deteguje expresia geacutenov typickaacute pre kontrolnuacute vzorku (napr zelenaacute fluorescencia) pre skuacutemanuacute vzorku (napr

48

červenaacute fluorescencia) a expresia podobnaacute u oboch vzoriek (žltaacute fluorescencia) neexprimovaneacute geacuteny (čierna fluorescencia) rocirczne odtiene (v zaacutevislosti od prevažujuacutecej hybridizaacutecie) (obr 48) 2) Čipy ur čeneacute na analyacutezu mutaacutecii použije sa genoacutemovaacute DNA označenaacute jednou fluorescenčnou farbičkou na určenie jednonukleotidovej zmeny (SNP ndash Single Nukleotide Polymorphism) 3) Čipy na komparatiacutevnu genoacutemovuacute hybridizaacuteciu (aCGH array Comparative Genomic Hybridization) ndash použiacutevaneacute na zistenie zvyacutešenia alebo zniacuteženia množstva chromozoacutemovyacutech fragmentov obsahujuacutecich geacuteny zodpovedneacute za určiteacute ochorenie Na analyacutezu sa použije skuacutemanaacute gDNA a referenčnaacute (kontrolnaacute) DNA každaacute sa značiacute inou fluorescenčnou farbičkou (princiacutep ako pri analyacuteze expresie) (obr 49 50) 4) Čipy CGH - SNP kombinovaneacute čipy ur čeneacute na analyacutezu aj mutaacuteciiacute SNP aj na komparatiacutevnu genoacutemovuacute hybridizaacuteciu CGH

Mikročipy majuacute rozsiahle využitie napriacuteklad v identifikaacuteciiacute novyacutech geacutenov vo vyacuteskume ich funkciiacute expresie v rocircznych podmienkach pri diagnostike mnohyacutech ochoreniacute vo farmakogenomike vo vyacuteskume vplyvu toxiacutenov

Obr 48 Heatmapa geacutenovej expresie vybranyacutech geacutenov (mRNA) mikročip obsahuje 46000 cDNA proacuteb (poskytnuteacute Ing Helenou Gbelcovou PhD Uacutestav lekaacuterskej bioloacutegie genetiky a klinickej genetiky LF UK a UNB)

49

Obr 49 Princiacutep komparatiacutevnej genoacutemovej hybridizaacutecie (aCGH - array comparative genomic hybridization) Obr 50 A) Vyacutesledok komparatiacutevnej genoacutemovej hybridizaacutecie (aCGH - array comparative genomic hybridization) vzorky DNA izolovanej plodovej vody U plodu s abnormaacutelnym ultrasonografickyacutem vyšetreniacutem bola identifikovanaacute duplikaacutecia oblasti 3q261q29 (modryacute paacutes) a deleacutecia oblasti 5p1533p151 (červenyacute paacutes) Pre porovnanie chromozoacutem 1 bez aberaacutecie b) Ten istyacute pacient ale ineacute softveacuteroveacute spracovanie (poskytnuteacute RNDr Miroslavom Tomkom PhD Medirex)

50

Odporuacutečanaacute a použitaacute literatuacutera

Odborneacute knihy Klug W S Cummings M R Spencer Ch A Palladino M A Concepts of Genetics jedenaacuteste vydanie (2015) Carson S Molecular Biology Techniques tretie vydanie (2012) Strachan T Read A Human Molecular Genetics štvrteacute vydanie (2011) Sudbery P Sudbery I Human Molecular Genetics tretie vydanie (2009)

Internetoveacute straacutenky

wwwncbinlmnihgov wwwmlpacom wwwthermofishercom wwwilluminacom wwwpromegask wwwqiagencom wwwambioncom

Odborneacute člaacutenky Chacon-Cortes D Griffiths L R Methods for extracting genomic DNA from whole blood samples current perspectives Journal of Biorepository Science for Applied Medicine Volume 2 strany 1- 9 Viltrop T Krjutskov K Palta P Metspalu A Comparison of DNA extraction methods for multiplex polymerase chain reaction Anal Biochem 2010 Volume 398(2) strany 260-262 Ing Martin Čermaacutek Molekulaacuterna cytogenetika v problematike familiaacuternych maligniacutet Onkoloacutegia Volume 2 strany 77 - 83 Livak KJ Schmittgen TD Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method Methods 2001 Volume 25(4) strany 402 - 408 Bustin S A Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays J Mol Endocrinol 2000 Volume 25(2) strany169 - 193

MOLEKULAacuteRNE METOacuteDY AKTUAacuteLNE POUŽIacuteVANEacute V KLINICKEJ GENETIKE RNDr Andrea Pastoraacutekovaacute PhD RNDr Robert Petrovič PhD Vydala Univerzita Komenskeacuteho v Bratislave Lekaacuterska fakulta Rozsah 50 straacuten 246 AH prveacute vydanie ISBN 978-80-223-4231-5

41

Obr 36 Princiacutep štandardnej FISH a FISH maľovania celeacuteho chromozoacutemu

Veľkou vyacutehodou FISH metoacutedy je možnosť analyacutezy buniek v metafaacuteze aj v interfaacuteze kedy nie je nutnaacute kultivaacutecia buniek a tiež ryacutechle analyzovanie veľkeacuteho počtu buniek (stovky až tisiacutece) K ďalšiacutem vyacutehodaacutem patriacute bezpečnosť vysokaacute citlivosť dostatočnaacute stabilita relatiacutevne kraacutetky čas hybridizaacutecie a možnosť ryacutechleho vyhodnotenia Hybridizaacutecia pri vaumlčšine suacutečasne dodaacutevanyacutech sond trvaacute 10-12 hodin (na trhu suacute už dostupneacute aj sondy so skraacutetenyacutem časom hybridizaacutecie na 2-3 hodiny) Po hybridizaacuteciiacute nasleduje odmyacutevanie kedy pri priacuteslušnej teplote dochaacutedza k odmytiu nenaviazanyacutech a nespraacutevne hybridizovanyacutech sond Preparaacutet sa naacutesledne podfarbiacute a vyacutesledok sa zhodnotiacute vo fluorescenčnom mikroskope Na podfarbenie chromozoacutemov alebo jadier sa použiacuteva modreacute kontrastneacute farbivo DAPI (46-diamidino-2-fenylindol) ktoreacute maacute silneacute fluorescenčneacute vlastnosti dokaacuteže prechaacutedzať jadrovou membraacutenou a viazať sa na DNA Vyacutesledkom je modreacute zafarbenie ktoreacute vyacuteborne kontrastuje so signaacutelmi jednotlivyacutech sond

Limitujuacutecim faktorom FISH je možnosť identifikaacutecie len tyacutech uacutesekov DNA ku ktoryacutem suacute použiteacute sondy V jednej analyacuteze je možneacute použiť najviac 3 odlišne značeneacute sondy a tak zistiť priacutepadneacute abnormality len na 1 alebo na paacuter lokusoch Na relevantnuacute detekciu je potrebneacute mať vo vzorke 1-5 aberantnyacutech interfaacutezovyacutech jadier

FISH je možneacute uskutočniť na širokej škaacutele biologickeacuteho materiaacutelu na vzorkaacutech perifeacuternej krvi kostnej drene naacuteteroch choriovyacutech klkoch plodovej vode rocircznych druhov tkaniacutev natiacutevnych alebo zaliatych v parafiacutene na 1 bunke (predimplantačnaacute genetickaacute diagnostika PGD) (obr 37)

Využiacuteva sa na detekciu aberaacuteciiacute pri mnohyacutech onkologickyacutech ochoreniach (napr pri diagnoacuteze mnohopočetnyacute myeloacutem sa v suacutečasnosti po separaacutecii CD138+ buniek robiacute FISH s 5 sondami pre geacuteny IGH TP53 RB1 oblasť 1p321q21 a stanovuje sa hyperploidia chromozoacutemov 5 9 a 15) a tiež k spresneniu doplneniu a k overeniu bežneacuteho cytogenetickeacuteho vyšetrenia

Podľa miesta na chromozoacuteme na ktorom dochaacutedza k hybridizaacutecii sondy rozlišujeme 4 typy

DNA sond bull centromeacuteroveacute sondy ndash sa viažu na strednuacute časť chromozoacutemu ndash centromeacuteru sluacutežia k diagnostike zmien v počte chromozoacutemov k detekcii chromozoacutemov neznaacutemeho pocircvodu umožňujuacute interfaacuteznu FISH na nedeliacich sa bunkaacutech (obr 38-41)

42

Obr 37 Interfaacutezna FISH preimplantačnyacute genetickyacute skriacutening aneuploidiiacute ndash blastomeacutera 3-denneacuteho ľudskeacuteho embrya s normaacutelnym počtom chromozoacutemov 13 18 21 pohlavie XY použityacutech 5 sond pre chromozoacutemy 13 ndash orange 18 ndash aqua 21 ndash green X ndash blue a Y ndash yellow (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

Obr 38 Interfaacutezne jadro po hybridizaacutecii s centromeacuterovou sondou pre chromozoacutem 8 (Vysis Abbott) V pravom jadre je priacutetomnaacute trizoacutemia chromozoacutemu 8 (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex) Obr 39 Metafaacutezna (A) a interfaacutezna FISH (B) použitaacute centromeacuterovaacute sonda CEPX spectrum orangeCEPY spectrum green (Vysis Abbott) Sonda hybridizuje k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (červenyacute signaacutel) a Y (zelenyacute signaacutel) (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

43

Obr 40 Interfaacutezna FISH vyšetrenie spermiiacute použiteacute sondy CEPX greenCEPY orange (Aneuscore Metasystems) Sondy hybridizujuacute k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (zelenyacute signaacutel) Y (červenyacute signaacutel) vľavo ndash dve haploidneacute spermie (majuacutece jedna spermia X druhaacute Y chromozoacutem) vpravo ndash dve patologickeacute spermie obsahujuacutece gonozoacutemovyacute komplement XY (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

Obr 41 Interfaacutezna FISH vyšetrenie spermiiacute použiteacute sondy CEPX greenCEPY orange a CEP18 aqua (Aneuscore Metasystems) Sondy hybridizujuacute k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (zelenyacute signaacutel) Y (červenyacute signaacutel) a 18 (modryacute signaacutel) vľavo ndash normaacutelne haploidneacute ľudskeacute spermie - 1x chromozoacutem X alebo Y a jedenkraacutet chromozoacutem 18 v strede ndash patologickaacute spermia obsahujuacuteca gonozoacutemovyacute komplement XY a jeden chromozoacutem 18 vpravo ndash patologickaacute diploidnaacute spermia s chromozoacutemami X Y a dvoma chromozoacutemami 18 (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

bull lokusovo špecifickeacute sondy ndash hybridizaacutecia prebehne na konkreacutetnom mieste geacutenu (lokuse) (obr 42-44) použiacutevajuacute sa k vyšetreniu mikrodeleacuteciiacute (straty malyacutech častiacute chromozoacutemu pri mikrodelečnyacutech syndroacutemoch) k zisteniu amplifikaacutecie onkogeacutenov a niektoryacutech špecifickyacutech translokaacuteciiacute prestavby geacutenov umožňujuacute interfaacuteznu FISH na nedeliacich sa bunkaacutech bull subtelomeroveacute ndash vaumlzba na koncoveacute časti chromozoacutemu ndash telomeacutery bull celochromozoacutemoveacute alebo celomaľovacie sondy ndash sondy hybridizujuacute s mnohopočetnyacutemi chromozoacutemovyacutemi sekvenciami pričom sa fluorescenčne tak bdquovymaľujeldquo celyacute chromozoacutem (Obr 45) Použiacutevajuacute sa na vyšetrenie chromozoacutemovyacutech prestavieb k analyacuteze translokaacuteciiacute a k detekcii pocircvodu tzv marker chromozoacutemov (malyacutech nadpočetnyacutech chromozoacutemov neznaacutemeho pocircvodu) K použitiu sondy suacute potrebneacute metafaacutezne chromozoacutemy nepoužiacutevaju sa pre interfaacuteznu FISH

Pri konvenčnej chromozoacutemovej FISH suacute homogeacutenne DNA proacuteby hybridizovaneacute s fixovanyacutem metafaacuteznym alebo prometafaacuteznym chromozoacutemomchromozoacutemami na skliacutečku (Obr 36a) Maximaacutelna rozlišovacia schopnosť metafaacuteznej FISH je niekoľko megabaacutez (Obr 39a 45) využitiacutem viac

44

natiahnutyacutech prometafaacuteznych chromozoacutemov sa dosiahne 1 Mb rozliacutešenie Prostredniacutectvom fiber FISH konkreacutetne artificiaacutelne deproteinizovanej natiahnutej DNA pripravenej in situ z celyacutech buniek na mikroskopickom skliacutečku je možneacute vizualizovať individuaacutelne geacuteny maleacute DNA elementy na chromozoacuteme s rozliacutešeniacutem okolo 1000 bp

Obr 42 Interfaacutezne jadro po hybridizaacutecii s lokusovo-špecifickou sondou LSI 5q31 Spectrum Orange5p12 Spectrum Green (Vysis Abbott) Na ľavom obraacutezku suacute priacutetomneacute dva červeneacute (5q31) a dva zeleneacute signaacutely (5p12) v pravom jadre je priacutetomnaacute deleacutecia 5q31 oblasti chyacuteba jeden červenyacute signal (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

Obr 43 Interfaacutezna FISH použitaacute lokusovo-špecifickaacute sonda ndash translokačnaacute - XL BCRABL1 plus (Metasystems) dvojfarebnaacute dvojfuacutezna kde červenaacute označuje lokus ABL1 na chromozoacuteme 9 a zelenaacute oblasť BCR na chromozoacuteme 22 Sonda deteguje fuacuteziu protoonkogeacutenu ABL1 (9q34) a geacutenu BCR (22q11) v priacutepade že červenyacute a zelenyacute signaacutel suacute pri sebe (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

45

Obr 44 Interfaacutezna FISH Použitaacute lokusovo-špecifickaacute sonda- typ break apart pre IGH geacuten V docircsledku translokaacutecie došlo k rozskočeniu geacutenu pričom translokačneacuteho partnera nepoznaacuteme vieme určiť len percento v koľkyacutech jadraacutech je geacuten prestavanyacute (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex) Obr 45 Použiteacute celochromozoacutemoveacute sondy WCP 15 (červenyacute chromozoacutem) a WCP 17 (zelenyacute chromozoacutem) Na metafaacuteze je potvrdenaacute reciprokaacute translokaacutecia t(1517)(q2221) (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

FISH vizualizaacutecia celeacuteho chromozoacutemu maľovanie chromozoacutemu anglicky chromosome

painting je špeciaacutelnou aplikaacuteciou chromozoacutemovej FISH proacuteba je koktail veľkeacuteho počtu rocircznych fluorescenčne značenyacutech DNA fragmentov hybridizujuacutecich pozdĺž celeacuteho konkreacutetneho chromozoacutemu (obr 36b 45) bdquoChromosomepaintingldquo analyzuje metafaacutezne chromozoacutemy V minulosti bola FISH vizualizaacutecia celyacutech chromozoacutemov limitovanaacute malyacutem množstvom rocirczne sfarbenyacutech fluorochroacutemov

V suacutečasnosti je možneacute detegovať množstvo cieľovyacutech sekvenciiacute naraz čo sa využiacuteva pri celogenoacutemovej chromozoacutemovej vizualizaacutecii (whole-chromosomepainting - WCP) metoacutedou multiplex FISH (M-FISH multicolor FISH o br 46) alebo spektraacutelnej karyotypizaacutecie (SKY) kedy možno rozliacutešiť všetky ľudskeacute chromozoacutemy ndash teda 24 rocircznych chromozoacutemov M-FISH a SKY patria medzi metafaacutezne formy FISH diagnostiky ktoreacute umožňujuacute simultaacutennu vizualizaacuteciu všetkyacutech ľudskyacutech chromozoacutemov v rocircznych farbaacutech čo predstavuje uľahčenie analyacutezy karyotypu hlavne pri komplexnyacutech zmenaacutech a markeroch neznaacutemeho pocircvodu Obe techniky vychaacutedzajuacute z použitia

46

celochromozoacutemovyacutech sond značenyacutech kombinaacuteciou viaceryacutech fluorochroacutemov Rozdiel medzi M-FISH a SKY spočiacuteva v technike ziacuteskania konečneacuteho obrazu

Obr 46 Multicolor FISH - každyacute chromozoacutemovyacute paacuter je zafarbenyacute inou farbou pričom na ich zafarbenie postačuje kombinaacutecia 5 fluorochroacutemov Na vyhodnocovanie je potrebnaacute špeciaacutelna sada fluorescenčnyacutech filtrov pre jednotliveacute fluorochroacutemy a špeciaacutelnyacute softweacuter Vľavo-štandardnyacute karyotyp vpravo karyotyp s mutaacuteciami (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

V molekulovej cytogenetike suacute komerčne dostupneacute sety M-FISH proacuteb umožňujuacutece

viacfarebneacute pruacutežkovanie chromozoacutemov (banding) s vysokyacutem rozliacutešeniacutem (multicolor-banding mBAND FISH MCB) čo umožňuje identifikaacuteciu intrachromozoacutemovyacutech prestavieb (Obr 47) Nevyhnutnosťou mBAND-u je mať chromozoacutemy v metafaacuteze Taacuteto metoacuteda bola prvyacutekraacutet uskutočnenaacute na chromozoacuteme 5 v roku 1999 mBAND FISH umožňuje rozliacutešiť špecifickeacute oblasti chromozoacutemov na uacuterovni pruacutežku - bandu a sub-bandu s detekciou 550 bandov haploidneacuteho karyotypu

Obr 47 A - mBAND chromozoacutemu 11 - inverzia duplikovanej oblasti 11q223-q25 B - mBAND chromozoacutemu 3 - na kruhovom chromozoacuteme deleacutecia oblasti 3p263 C - mBAND chromozoacutemu 2 - potvrdenie inverzie duplikovanej časti chromozoacutemu (poskytnuteacute RNDr Dagmar Landlovou Medirex)

FISH metoacuteda a jej varianty (M-FISH mBAND SKY) majuacute v suacutečasnosti širokeacute využitie v

klinickej genetike v onkologickej genetike na detekciu aberaacuteciiacute v čase diagnoacutezy počas liečby po

47

liečbe monitorovanie po transplantaacutecii kostnej drene v prenataacutelnej a postnataacutelnej diagnostike pri detekcii submikroskopickyacutech deleacuteciiacute (napr DiGeorge syndroacutem - 22q112 delečnyacute syndroacutem PraderndashWilli syndroacutem- chromozoacutem 15q11-13) prostredniacutectvom FISH je možnaacute detekcia numerickyacutech zmien chromozoacutemov (trizoacutemia chromozoacutemu 21 pri Downovom syndroacuteme trizoacutemia chromozoacutemu 15 pri Patauovom syndroacuteme trizoacutemia chromozoacutemu 18 pri Edwardsovom syndroacuteme) rocirczne zmeny v počte pohlavnyacutech chromozoacutemov (monozoacutemia X pri Turnerovom syndroacuteme Klinefelterov syndroacutem s X chromozoacutemom naviac - XXY) podobne v predimplantačnej diagnostike

83 DNA Microarray (DNA mikro čip biočip) DNA mikročipovanie je technika využiacutevajuacuteca hybridizaacuteciu skuacutemanej nukleovej kyseliny

(cieľovaacute vzorka) s veľkyacutem množstvom oligonukleotidovyacutech proacuteb (desať tisiacutec až milioacuten) ktoreacute suacute prichyteneacute na pevnyacute podklad najčastejšie sklenyacute silikoacutenovyacute alebo nylonovyacute (doštička čip) Skuacutemanaacute nukleovaacute kyselina je pred hybridizaacuteciou fragmentovanaacute označenaacute fluorofoacuterom a denaturovanaacute Po kontakte čipu s cieľovou vzorkou ktoraacute je vlastne zmes označenyacutech oligonukleotidov značeneacute oligonukleotidy hybridizujuacute s oligonukleotidovyacutemi sekvenciami prichytenyacutemi na čipe Potom suacute na zaacuteklade fluorescencie detekovaneacute miesta kde došlo k hybridizaacutecii čiže vzorka obsahovala takuacuteto nukleotidovuacute sekvenciu Z jedneacuteho mikročipu sa ziacuteska obrovskeacute množstvo daacutet ktoreacute je vždy nutneacute softveacuterovo spracovať V dnešnej dobe existuje niekoľko firiem poskytujuacutecich komerčne mikročipy na objednaacutevku alebo si ich laboratoacuteria produkujuacute sami

Mikročipovanie prebieha nasledovne

1) Vytvorenie DNA čipu ndash tisiacutece rocircznych jednovlaacuteknovyacutech DNA oligonukleotidov znaacutemych sekvencii sa kovalentne naviažu na povrch doštičky vždy v určitej lokalite je niekoľko rovnakyacutech oligonukleotidov veľkosť takejto lokality je ˂ 200 microm Proacutebami mocircže byť DNA cDNA alebo syntetizovaneacute oligonukleotidy Už hotoveacute mikročipy ponuacutekajuacute viacereacute firmy (Affymetrix Agilent Technologies Eppendorf Illumina) alebo si ich jednotliveacute laboratoacuteria vyraacutebajuacute sami pomocou robotickyacutech zariadeniacute DNA čip sa vytvaacutera buď nanaacutešaniacutem kvapiek oligonukleotidov na podklad alebo synteacutezou oligonukleotidov in situ na čipe 2) Priacuteprava vzorky ndash nukleovaacute kyselina (mRNA DNA) sa purifikuje určiacute sa jej kvantita a kvalita (spektrofotometericky) fragmentuje resp v priacutepade mRNA sa syntetizuje cDNA v priacutepade potreby sa mocircže DNA amplifikovať PCR reakciou štiepiť restrikčnyacutemi endonukleaacutezami 3) Fluorescenčneacute označenie (zriedkavejšie raacutedioaktiacutevne) fragmentov DNA prebieha počas reverznej transkripcie alebo PCR amplifikaacutecie za uacutečasti fluorescenčne značenyacutech nukleotidov Keď sa analyzujuacute dve rocirczne vzorky napr zdraveacute tkanivo a naacutedoroveacute tkanivo označenie nukleovyacutech kyseliacuten v tyacutechto tkanivaacutech byacuteva rozdielne a to použitiacutem dvoch rocircznych fluorescenčnyacutech farbiacutev (napr zeleneacute a červeneacute) Pred hybridizaacuteciou je potrebneacute vzorku denaturovať čiacutem sa vytvoriacute zmes jednovlaacuteknovyacutech DNA označenyacutech značkou 4) Hybridizaacutecia s mikročipom ndash v špeciaacutelnom hybridizačnom roztoku hybridizujuacute komplementaacuterne sekvencie zo vzorky s priacuteslušnyacutemi oligonukleotidovyacutemi sondami naviazanyacutemi na čipe Potom sa čip obmyje aby došlo k odstraacuteneniu čiastočne hybridizovanyacutech nukleovyacutech kyseliacuten 5) Skenovanie mikročipu ndash skenerom čipov docircjde k ožiareniu čipu laserom pričom v mieste hybridizaacutecie fluorescenčne značenyacutech DNA fragmentov s proacutebou docircjde k emisii svetla určitej vlnovej dĺžky ktoruacute skener zaznamenaacute 6) Analyacuteza daacutet prebieha metoacutedami bioinformatiky spracovaniacutem softveacutermi sa zistiacute ktoreacute lokality čipu navzaacutejom hybridizovali v priacutepade použitia dvoch vzoriek kontrolnej a skuacutemanej je možneacute analyzovať ich relatiacutevnu intenzitu hybridizaacutecie (expresie určiteacuteho geacutenu)

Existujuacute štyri typy mikročipov 1) Čipy ur čeneacute na analyacutezu expresie (obsahujuacute cDNA proacuteby) pre tzv dvojkanaacutelovyacute experiment kedy je vzorka určenaacute k hybridizaacutecii na čipe ziacuteskanaacute zmiešaniacutem DNA fragmentov kontrolnej a skuacutemanej vzorky pričom fragmenty suacute rozdielne fluorescenčne označeneacute (napr zelenyacute fluorofoacuter pre kontrolnuacute vzorku a červenyacute pre skuacutemanuacute) Na zaacuteklade intenzity a typu fluorescencie sa deteguje expresia geacutenov typickaacute pre kontrolnuacute vzorku (napr zelenaacute fluorescencia) pre skuacutemanuacute vzorku (napr

48

červenaacute fluorescencia) a expresia podobnaacute u oboch vzoriek (žltaacute fluorescencia) neexprimovaneacute geacuteny (čierna fluorescencia) rocirczne odtiene (v zaacutevislosti od prevažujuacutecej hybridizaacutecie) (obr 48) 2) Čipy ur čeneacute na analyacutezu mutaacutecii použije sa genoacutemovaacute DNA označenaacute jednou fluorescenčnou farbičkou na určenie jednonukleotidovej zmeny (SNP ndash Single Nukleotide Polymorphism) 3) Čipy na komparatiacutevnu genoacutemovuacute hybridizaacuteciu (aCGH array Comparative Genomic Hybridization) ndash použiacutevaneacute na zistenie zvyacutešenia alebo zniacuteženia množstva chromozoacutemovyacutech fragmentov obsahujuacutecich geacuteny zodpovedneacute za určiteacute ochorenie Na analyacutezu sa použije skuacutemanaacute gDNA a referenčnaacute (kontrolnaacute) DNA každaacute sa značiacute inou fluorescenčnou farbičkou (princiacutep ako pri analyacuteze expresie) (obr 49 50) 4) Čipy CGH - SNP kombinovaneacute čipy ur čeneacute na analyacutezu aj mutaacuteciiacute SNP aj na komparatiacutevnu genoacutemovuacute hybridizaacuteciu CGH

Mikročipy majuacute rozsiahle využitie napriacuteklad v identifikaacuteciiacute novyacutech geacutenov vo vyacuteskume ich funkciiacute expresie v rocircznych podmienkach pri diagnostike mnohyacutech ochoreniacute vo farmakogenomike vo vyacuteskume vplyvu toxiacutenov

Obr 48 Heatmapa geacutenovej expresie vybranyacutech geacutenov (mRNA) mikročip obsahuje 46000 cDNA proacuteb (poskytnuteacute Ing Helenou Gbelcovou PhD Uacutestav lekaacuterskej bioloacutegie genetiky a klinickej genetiky LF UK a UNB)

49

Obr 49 Princiacutep komparatiacutevnej genoacutemovej hybridizaacutecie (aCGH - array comparative genomic hybridization) Obr 50 A) Vyacutesledok komparatiacutevnej genoacutemovej hybridizaacutecie (aCGH - array comparative genomic hybridization) vzorky DNA izolovanej plodovej vody U plodu s abnormaacutelnym ultrasonografickyacutem vyšetreniacutem bola identifikovanaacute duplikaacutecia oblasti 3q261q29 (modryacute paacutes) a deleacutecia oblasti 5p1533p151 (červenyacute paacutes) Pre porovnanie chromozoacutem 1 bez aberaacutecie b) Ten istyacute pacient ale ineacute softveacuteroveacute spracovanie (poskytnuteacute RNDr Miroslavom Tomkom PhD Medirex)

50

Odporuacutečanaacute a použitaacute literatuacutera

Odborneacute knihy Klug W S Cummings M R Spencer Ch A Palladino M A Concepts of Genetics jedenaacuteste vydanie (2015) Carson S Molecular Biology Techniques tretie vydanie (2012) Strachan T Read A Human Molecular Genetics štvrteacute vydanie (2011) Sudbery P Sudbery I Human Molecular Genetics tretie vydanie (2009)

Internetoveacute straacutenky

wwwncbinlmnihgov wwwmlpacom wwwthermofishercom wwwilluminacom wwwpromegask wwwqiagencom wwwambioncom

Odborneacute člaacutenky Chacon-Cortes D Griffiths L R Methods for extracting genomic DNA from whole blood samples current perspectives Journal of Biorepository Science for Applied Medicine Volume 2 strany 1- 9 Viltrop T Krjutskov K Palta P Metspalu A Comparison of DNA extraction methods for multiplex polymerase chain reaction Anal Biochem 2010 Volume 398(2) strany 260-262 Ing Martin Čermaacutek Molekulaacuterna cytogenetika v problematike familiaacuternych maligniacutet Onkoloacutegia Volume 2 strany 77 - 83 Livak KJ Schmittgen TD Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method Methods 2001 Volume 25(4) strany 402 - 408 Bustin S A Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays J Mol Endocrinol 2000 Volume 25(2) strany169 - 193

MOLEKULAacuteRNE METOacuteDY AKTUAacuteLNE POUŽIacuteVANEacute V KLINICKEJ GENETIKE RNDr Andrea Pastoraacutekovaacute PhD RNDr Robert Petrovič PhD Vydala Univerzita Komenskeacuteho v Bratislave Lekaacuterska fakulta Rozsah 50 straacuten 246 AH prveacute vydanie ISBN 978-80-223-4231-5

42

Obr 37 Interfaacutezna FISH preimplantačnyacute genetickyacute skriacutening aneuploidiiacute ndash blastomeacutera 3-denneacuteho ľudskeacuteho embrya s normaacutelnym počtom chromozoacutemov 13 18 21 pohlavie XY použityacutech 5 sond pre chromozoacutemy 13 ndash orange 18 ndash aqua 21 ndash green X ndash blue a Y ndash yellow (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

Obr 38 Interfaacutezne jadro po hybridizaacutecii s centromeacuterovou sondou pre chromozoacutem 8 (Vysis Abbott) V pravom jadre je priacutetomnaacute trizoacutemia chromozoacutemu 8 (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex) Obr 39 Metafaacutezna (A) a interfaacutezna FISH (B) použitaacute centromeacuterovaacute sonda CEPX spectrum orangeCEPY spectrum green (Vysis Abbott) Sonda hybridizuje k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (červenyacute signaacutel) a Y (zelenyacute signaacutel) (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

43

Obr 40 Interfaacutezna FISH vyšetrenie spermiiacute použiteacute sondy CEPX greenCEPY orange (Aneuscore Metasystems) Sondy hybridizujuacute k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (zelenyacute signaacutel) Y (červenyacute signaacutel) vľavo ndash dve haploidneacute spermie (majuacutece jedna spermia X druhaacute Y chromozoacutem) vpravo ndash dve patologickeacute spermie obsahujuacutece gonozoacutemovyacute komplement XY (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

Obr 41 Interfaacutezna FISH vyšetrenie spermiiacute použiteacute sondy CEPX greenCEPY orange a CEP18 aqua (Aneuscore Metasystems) Sondy hybridizujuacute k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (zelenyacute signaacutel) Y (červenyacute signaacutel) a 18 (modryacute signaacutel) vľavo ndash normaacutelne haploidneacute ľudskeacute spermie - 1x chromozoacutem X alebo Y a jedenkraacutet chromozoacutem 18 v strede ndash patologickaacute spermia obsahujuacuteca gonozoacutemovyacute komplement XY a jeden chromozoacutem 18 vpravo ndash patologickaacute diploidnaacute spermia s chromozoacutemami X Y a dvoma chromozoacutemami 18 (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

bull lokusovo špecifickeacute sondy ndash hybridizaacutecia prebehne na konkreacutetnom mieste geacutenu (lokuse) (obr 42-44) použiacutevajuacute sa k vyšetreniu mikrodeleacuteciiacute (straty malyacutech častiacute chromozoacutemu pri mikrodelečnyacutech syndroacutemoch) k zisteniu amplifikaacutecie onkogeacutenov a niektoryacutech špecifickyacutech translokaacuteciiacute prestavby geacutenov umožňujuacute interfaacuteznu FISH na nedeliacich sa bunkaacutech bull subtelomeroveacute ndash vaumlzba na koncoveacute časti chromozoacutemu ndash telomeacutery bull celochromozoacutemoveacute alebo celomaľovacie sondy ndash sondy hybridizujuacute s mnohopočetnyacutemi chromozoacutemovyacutemi sekvenciami pričom sa fluorescenčne tak bdquovymaľujeldquo celyacute chromozoacutem (Obr 45) Použiacutevajuacute sa na vyšetrenie chromozoacutemovyacutech prestavieb k analyacuteze translokaacuteciiacute a k detekcii pocircvodu tzv marker chromozoacutemov (malyacutech nadpočetnyacutech chromozoacutemov neznaacutemeho pocircvodu) K použitiu sondy suacute potrebneacute metafaacutezne chromozoacutemy nepoužiacutevaju sa pre interfaacuteznu FISH

Pri konvenčnej chromozoacutemovej FISH suacute homogeacutenne DNA proacuteby hybridizovaneacute s fixovanyacutem metafaacuteznym alebo prometafaacuteznym chromozoacutemomchromozoacutemami na skliacutečku (Obr 36a) Maximaacutelna rozlišovacia schopnosť metafaacuteznej FISH je niekoľko megabaacutez (Obr 39a 45) využitiacutem viac

44

natiahnutyacutech prometafaacuteznych chromozoacutemov sa dosiahne 1 Mb rozliacutešenie Prostredniacutectvom fiber FISH konkreacutetne artificiaacutelne deproteinizovanej natiahnutej DNA pripravenej in situ z celyacutech buniek na mikroskopickom skliacutečku je možneacute vizualizovať individuaacutelne geacuteny maleacute DNA elementy na chromozoacuteme s rozliacutešeniacutem okolo 1000 bp

Obr 42 Interfaacutezne jadro po hybridizaacutecii s lokusovo-špecifickou sondou LSI 5q31 Spectrum Orange5p12 Spectrum Green (Vysis Abbott) Na ľavom obraacutezku suacute priacutetomneacute dva červeneacute (5q31) a dva zeleneacute signaacutely (5p12) v pravom jadre je priacutetomnaacute deleacutecia 5q31 oblasti chyacuteba jeden červenyacute signal (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

Obr 43 Interfaacutezna FISH použitaacute lokusovo-špecifickaacute sonda ndash translokačnaacute - XL BCRABL1 plus (Metasystems) dvojfarebnaacute dvojfuacutezna kde červenaacute označuje lokus ABL1 na chromozoacuteme 9 a zelenaacute oblasť BCR na chromozoacuteme 22 Sonda deteguje fuacuteziu protoonkogeacutenu ABL1 (9q34) a geacutenu BCR (22q11) v priacutepade že červenyacute a zelenyacute signaacutel suacute pri sebe (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

45

Obr 44 Interfaacutezna FISH Použitaacute lokusovo-špecifickaacute sonda- typ break apart pre IGH geacuten V docircsledku translokaacutecie došlo k rozskočeniu geacutenu pričom translokačneacuteho partnera nepoznaacuteme vieme určiť len percento v koľkyacutech jadraacutech je geacuten prestavanyacute (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex) Obr 45 Použiteacute celochromozoacutemoveacute sondy WCP 15 (červenyacute chromozoacutem) a WCP 17 (zelenyacute chromozoacutem) Na metafaacuteze je potvrdenaacute reciprokaacute translokaacutecia t(1517)(q2221) (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

FISH vizualizaacutecia celeacuteho chromozoacutemu maľovanie chromozoacutemu anglicky chromosome

painting je špeciaacutelnou aplikaacuteciou chromozoacutemovej FISH proacuteba je koktail veľkeacuteho počtu rocircznych fluorescenčne značenyacutech DNA fragmentov hybridizujuacutecich pozdĺž celeacuteho konkreacutetneho chromozoacutemu (obr 36b 45) bdquoChromosomepaintingldquo analyzuje metafaacutezne chromozoacutemy V minulosti bola FISH vizualizaacutecia celyacutech chromozoacutemov limitovanaacute malyacutem množstvom rocirczne sfarbenyacutech fluorochroacutemov

V suacutečasnosti je možneacute detegovať množstvo cieľovyacutech sekvenciiacute naraz čo sa využiacuteva pri celogenoacutemovej chromozoacutemovej vizualizaacutecii (whole-chromosomepainting - WCP) metoacutedou multiplex FISH (M-FISH multicolor FISH o br 46) alebo spektraacutelnej karyotypizaacutecie (SKY) kedy možno rozliacutešiť všetky ľudskeacute chromozoacutemy ndash teda 24 rocircznych chromozoacutemov M-FISH a SKY patria medzi metafaacutezne formy FISH diagnostiky ktoreacute umožňujuacute simultaacutennu vizualizaacuteciu všetkyacutech ľudskyacutech chromozoacutemov v rocircznych farbaacutech čo predstavuje uľahčenie analyacutezy karyotypu hlavne pri komplexnyacutech zmenaacutech a markeroch neznaacutemeho pocircvodu Obe techniky vychaacutedzajuacute z použitia

46

celochromozoacutemovyacutech sond značenyacutech kombinaacuteciou viaceryacutech fluorochroacutemov Rozdiel medzi M-FISH a SKY spočiacuteva v technike ziacuteskania konečneacuteho obrazu

Obr 46 Multicolor FISH - každyacute chromozoacutemovyacute paacuter je zafarbenyacute inou farbou pričom na ich zafarbenie postačuje kombinaacutecia 5 fluorochroacutemov Na vyhodnocovanie je potrebnaacute špeciaacutelna sada fluorescenčnyacutech filtrov pre jednotliveacute fluorochroacutemy a špeciaacutelnyacute softweacuter Vľavo-štandardnyacute karyotyp vpravo karyotyp s mutaacuteciami (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

V molekulovej cytogenetike suacute komerčne dostupneacute sety M-FISH proacuteb umožňujuacutece

viacfarebneacute pruacutežkovanie chromozoacutemov (banding) s vysokyacutem rozliacutešeniacutem (multicolor-banding mBAND FISH MCB) čo umožňuje identifikaacuteciu intrachromozoacutemovyacutech prestavieb (Obr 47) Nevyhnutnosťou mBAND-u je mať chromozoacutemy v metafaacuteze Taacuteto metoacuteda bola prvyacutekraacutet uskutočnenaacute na chromozoacuteme 5 v roku 1999 mBAND FISH umožňuje rozliacutešiť špecifickeacute oblasti chromozoacutemov na uacuterovni pruacutežku - bandu a sub-bandu s detekciou 550 bandov haploidneacuteho karyotypu

Obr 47 A - mBAND chromozoacutemu 11 - inverzia duplikovanej oblasti 11q223-q25 B - mBAND chromozoacutemu 3 - na kruhovom chromozoacuteme deleacutecia oblasti 3p263 C - mBAND chromozoacutemu 2 - potvrdenie inverzie duplikovanej časti chromozoacutemu (poskytnuteacute RNDr Dagmar Landlovou Medirex)

FISH metoacuteda a jej varianty (M-FISH mBAND SKY) majuacute v suacutečasnosti širokeacute využitie v

klinickej genetike v onkologickej genetike na detekciu aberaacuteciiacute v čase diagnoacutezy počas liečby po

47

liečbe monitorovanie po transplantaacutecii kostnej drene v prenataacutelnej a postnataacutelnej diagnostike pri detekcii submikroskopickyacutech deleacuteciiacute (napr DiGeorge syndroacutem - 22q112 delečnyacute syndroacutem PraderndashWilli syndroacutem- chromozoacutem 15q11-13) prostredniacutectvom FISH je možnaacute detekcia numerickyacutech zmien chromozoacutemov (trizoacutemia chromozoacutemu 21 pri Downovom syndroacuteme trizoacutemia chromozoacutemu 15 pri Patauovom syndroacuteme trizoacutemia chromozoacutemu 18 pri Edwardsovom syndroacuteme) rocirczne zmeny v počte pohlavnyacutech chromozoacutemov (monozoacutemia X pri Turnerovom syndroacuteme Klinefelterov syndroacutem s X chromozoacutemom naviac - XXY) podobne v predimplantačnej diagnostike

83 DNA Microarray (DNA mikro čip biočip) DNA mikročipovanie je technika využiacutevajuacuteca hybridizaacuteciu skuacutemanej nukleovej kyseliny

(cieľovaacute vzorka) s veľkyacutem množstvom oligonukleotidovyacutech proacuteb (desať tisiacutec až milioacuten) ktoreacute suacute prichyteneacute na pevnyacute podklad najčastejšie sklenyacute silikoacutenovyacute alebo nylonovyacute (doštička čip) Skuacutemanaacute nukleovaacute kyselina je pred hybridizaacuteciou fragmentovanaacute označenaacute fluorofoacuterom a denaturovanaacute Po kontakte čipu s cieľovou vzorkou ktoraacute je vlastne zmes označenyacutech oligonukleotidov značeneacute oligonukleotidy hybridizujuacute s oligonukleotidovyacutemi sekvenciami prichytenyacutemi na čipe Potom suacute na zaacuteklade fluorescencie detekovaneacute miesta kde došlo k hybridizaacutecii čiže vzorka obsahovala takuacuteto nukleotidovuacute sekvenciu Z jedneacuteho mikročipu sa ziacuteska obrovskeacute množstvo daacutet ktoreacute je vždy nutneacute softveacuterovo spracovať V dnešnej dobe existuje niekoľko firiem poskytujuacutecich komerčne mikročipy na objednaacutevku alebo si ich laboratoacuteria produkujuacute sami

Mikročipovanie prebieha nasledovne

1) Vytvorenie DNA čipu ndash tisiacutece rocircznych jednovlaacuteknovyacutech DNA oligonukleotidov znaacutemych sekvencii sa kovalentne naviažu na povrch doštičky vždy v určitej lokalite je niekoľko rovnakyacutech oligonukleotidov veľkosť takejto lokality je ˂ 200 microm Proacutebami mocircže byť DNA cDNA alebo syntetizovaneacute oligonukleotidy Už hotoveacute mikročipy ponuacutekajuacute viacereacute firmy (Affymetrix Agilent Technologies Eppendorf Illumina) alebo si ich jednotliveacute laboratoacuteria vyraacutebajuacute sami pomocou robotickyacutech zariadeniacute DNA čip sa vytvaacutera buď nanaacutešaniacutem kvapiek oligonukleotidov na podklad alebo synteacutezou oligonukleotidov in situ na čipe 2) Priacuteprava vzorky ndash nukleovaacute kyselina (mRNA DNA) sa purifikuje určiacute sa jej kvantita a kvalita (spektrofotometericky) fragmentuje resp v priacutepade mRNA sa syntetizuje cDNA v priacutepade potreby sa mocircže DNA amplifikovať PCR reakciou štiepiť restrikčnyacutemi endonukleaacutezami 3) Fluorescenčneacute označenie (zriedkavejšie raacutedioaktiacutevne) fragmentov DNA prebieha počas reverznej transkripcie alebo PCR amplifikaacutecie za uacutečasti fluorescenčne značenyacutech nukleotidov Keď sa analyzujuacute dve rocirczne vzorky napr zdraveacute tkanivo a naacutedoroveacute tkanivo označenie nukleovyacutech kyseliacuten v tyacutechto tkanivaacutech byacuteva rozdielne a to použitiacutem dvoch rocircznych fluorescenčnyacutech farbiacutev (napr zeleneacute a červeneacute) Pred hybridizaacuteciou je potrebneacute vzorku denaturovať čiacutem sa vytvoriacute zmes jednovlaacuteknovyacutech DNA označenyacutech značkou 4) Hybridizaacutecia s mikročipom ndash v špeciaacutelnom hybridizačnom roztoku hybridizujuacute komplementaacuterne sekvencie zo vzorky s priacuteslušnyacutemi oligonukleotidovyacutemi sondami naviazanyacutemi na čipe Potom sa čip obmyje aby došlo k odstraacuteneniu čiastočne hybridizovanyacutech nukleovyacutech kyseliacuten 5) Skenovanie mikročipu ndash skenerom čipov docircjde k ožiareniu čipu laserom pričom v mieste hybridizaacutecie fluorescenčne značenyacutech DNA fragmentov s proacutebou docircjde k emisii svetla určitej vlnovej dĺžky ktoruacute skener zaznamenaacute 6) Analyacuteza daacutet prebieha metoacutedami bioinformatiky spracovaniacutem softveacutermi sa zistiacute ktoreacute lokality čipu navzaacutejom hybridizovali v priacutepade použitia dvoch vzoriek kontrolnej a skuacutemanej je možneacute analyzovať ich relatiacutevnu intenzitu hybridizaacutecie (expresie určiteacuteho geacutenu)

Existujuacute štyri typy mikročipov 1) Čipy ur čeneacute na analyacutezu expresie (obsahujuacute cDNA proacuteby) pre tzv dvojkanaacutelovyacute experiment kedy je vzorka určenaacute k hybridizaacutecii na čipe ziacuteskanaacute zmiešaniacutem DNA fragmentov kontrolnej a skuacutemanej vzorky pričom fragmenty suacute rozdielne fluorescenčne označeneacute (napr zelenyacute fluorofoacuter pre kontrolnuacute vzorku a červenyacute pre skuacutemanuacute) Na zaacuteklade intenzity a typu fluorescencie sa deteguje expresia geacutenov typickaacute pre kontrolnuacute vzorku (napr zelenaacute fluorescencia) pre skuacutemanuacute vzorku (napr

48

červenaacute fluorescencia) a expresia podobnaacute u oboch vzoriek (žltaacute fluorescencia) neexprimovaneacute geacuteny (čierna fluorescencia) rocirczne odtiene (v zaacutevislosti od prevažujuacutecej hybridizaacutecie) (obr 48) 2) Čipy ur čeneacute na analyacutezu mutaacutecii použije sa genoacutemovaacute DNA označenaacute jednou fluorescenčnou farbičkou na určenie jednonukleotidovej zmeny (SNP ndash Single Nukleotide Polymorphism) 3) Čipy na komparatiacutevnu genoacutemovuacute hybridizaacuteciu (aCGH array Comparative Genomic Hybridization) ndash použiacutevaneacute na zistenie zvyacutešenia alebo zniacuteženia množstva chromozoacutemovyacutech fragmentov obsahujuacutecich geacuteny zodpovedneacute za určiteacute ochorenie Na analyacutezu sa použije skuacutemanaacute gDNA a referenčnaacute (kontrolnaacute) DNA každaacute sa značiacute inou fluorescenčnou farbičkou (princiacutep ako pri analyacuteze expresie) (obr 49 50) 4) Čipy CGH - SNP kombinovaneacute čipy ur čeneacute na analyacutezu aj mutaacuteciiacute SNP aj na komparatiacutevnu genoacutemovuacute hybridizaacuteciu CGH

Mikročipy majuacute rozsiahle využitie napriacuteklad v identifikaacuteciiacute novyacutech geacutenov vo vyacuteskume ich funkciiacute expresie v rocircznych podmienkach pri diagnostike mnohyacutech ochoreniacute vo farmakogenomike vo vyacuteskume vplyvu toxiacutenov

Obr 48 Heatmapa geacutenovej expresie vybranyacutech geacutenov (mRNA) mikročip obsahuje 46000 cDNA proacuteb (poskytnuteacute Ing Helenou Gbelcovou PhD Uacutestav lekaacuterskej bioloacutegie genetiky a klinickej genetiky LF UK a UNB)

49

Obr 49 Princiacutep komparatiacutevnej genoacutemovej hybridizaacutecie (aCGH - array comparative genomic hybridization) Obr 50 A) Vyacutesledok komparatiacutevnej genoacutemovej hybridizaacutecie (aCGH - array comparative genomic hybridization) vzorky DNA izolovanej plodovej vody U plodu s abnormaacutelnym ultrasonografickyacutem vyšetreniacutem bola identifikovanaacute duplikaacutecia oblasti 3q261q29 (modryacute paacutes) a deleacutecia oblasti 5p1533p151 (červenyacute paacutes) Pre porovnanie chromozoacutem 1 bez aberaacutecie b) Ten istyacute pacient ale ineacute softveacuteroveacute spracovanie (poskytnuteacute RNDr Miroslavom Tomkom PhD Medirex)

50

Odporuacutečanaacute a použitaacute literatuacutera

Odborneacute knihy Klug W S Cummings M R Spencer Ch A Palladino M A Concepts of Genetics jedenaacuteste vydanie (2015) Carson S Molecular Biology Techniques tretie vydanie (2012) Strachan T Read A Human Molecular Genetics štvrteacute vydanie (2011) Sudbery P Sudbery I Human Molecular Genetics tretie vydanie (2009)

Internetoveacute straacutenky

wwwncbinlmnihgov wwwmlpacom wwwthermofishercom wwwilluminacom wwwpromegask wwwqiagencom wwwambioncom

Odborneacute člaacutenky Chacon-Cortes D Griffiths L R Methods for extracting genomic DNA from whole blood samples current perspectives Journal of Biorepository Science for Applied Medicine Volume 2 strany 1- 9 Viltrop T Krjutskov K Palta P Metspalu A Comparison of DNA extraction methods for multiplex polymerase chain reaction Anal Biochem 2010 Volume 398(2) strany 260-262 Ing Martin Čermaacutek Molekulaacuterna cytogenetika v problematike familiaacuternych maligniacutet Onkoloacutegia Volume 2 strany 77 - 83 Livak KJ Schmittgen TD Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method Methods 2001 Volume 25(4) strany 402 - 408 Bustin S A Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays J Mol Endocrinol 2000 Volume 25(2) strany169 - 193

MOLEKULAacuteRNE METOacuteDY AKTUAacuteLNE POUŽIacuteVANEacute V KLINICKEJ GENETIKE RNDr Andrea Pastoraacutekovaacute PhD RNDr Robert Petrovič PhD Vydala Univerzita Komenskeacuteho v Bratislave Lekaacuterska fakulta Rozsah 50 straacuten 246 AH prveacute vydanie ISBN 978-80-223-4231-5

43

Obr 40 Interfaacutezna FISH vyšetrenie spermiiacute použiteacute sondy CEPX greenCEPY orange (Aneuscore Metasystems) Sondy hybridizujuacute k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (zelenyacute signaacutel) Y (červenyacute signaacutel) vľavo ndash dve haploidneacute spermie (majuacutece jedna spermia X druhaacute Y chromozoacutem) vpravo ndash dve patologickeacute spermie obsahujuacutece gonozoacutemovyacute komplement XY (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

Obr 41 Interfaacutezna FISH vyšetrenie spermiiacute použiteacute sondy CEPX greenCEPY orange a CEP18 aqua (Aneuscore Metasystems) Sondy hybridizujuacute k centromeacuterovej oblasti chromozoacutemov X (zelenyacute signaacutel) Y (červenyacute signaacutel) a 18 (modryacute signaacutel) vľavo ndash normaacutelne haploidneacute ľudskeacute spermie - 1x chromozoacutem X alebo Y a jedenkraacutet chromozoacutem 18 v strede ndash patologickaacute spermia obsahujuacuteca gonozoacutemovyacute komplement XY a jeden chromozoacutem 18 vpravo ndash patologickaacute diploidnaacute spermia s chromozoacutemami X Y a dvoma chromozoacutemami 18 (poskytnuteacute RNDr Ivetou Černaacutekovou PhD Reprogen)

bull lokusovo špecifickeacute sondy ndash hybridizaacutecia prebehne na konkreacutetnom mieste geacutenu (lokuse) (obr 42-44) použiacutevajuacute sa k vyšetreniu mikrodeleacuteciiacute (straty malyacutech častiacute chromozoacutemu pri mikrodelečnyacutech syndroacutemoch) k zisteniu amplifikaacutecie onkogeacutenov a niektoryacutech špecifickyacutech translokaacuteciiacute prestavby geacutenov umožňujuacute interfaacuteznu FISH na nedeliacich sa bunkaacutech bull subtelomeroveacute ndash vaumlzba na koncoveacute časti chromozoacutemu ndash telomeacutery bull celochromozoacutemoveacute alebo celomaľovacie sondy ndash sondy hybridizujuacute s mnohopočetnyacutemi chromozoacutemovyacutemi sekvenciami pričom sa fluorescenčne tak bdquovymaľujeldquo celyacute chromozoacutem (Obr 45) Použiacutevajuacute sa na vyšetrenie chromozoacutemovyacutech prestavieb k analyacuteze translokaacuteciiacute a k detekcii pocircvodu tzv marker chromozoacutemov (malyacutech nadpočetnyacutech chromozoacutemov neznaacutemeho pocircvodu) K použitiu sondy suacute potrebneacute metafaacutezne chromozoacutemy nepoužiacutevaju sa pre interfaacuteznu FISH

Pri konvenčnej chromozoacutemovej FISH suacute homogeacutenne DNA proacuteby hybridizovaneacute s fixovanyacutem metafaacuteznym alebo prometafaacuteznym chromozoacutemomchromozoacutemami na skliacutečku (Obr 36a) Maximaacutelna rozlišovacia schopnosť metafaacuteznej FISH je niekoľko megabaacutez (Obr 39a 45) využitiacutem viac

44

natiahnutyacutech prometafaacuteznych chromozoacutemov sa dosiahne 1 Mb rozliacutešenie Prostredniacutectvom fiber FISH konkreacutetne artificiaacutelne deproteinizovanej natiahnutej DNA pripravenej in situ z celyacutech buniek na mikroskopickom skliacutečku je možneacute vizualizovať individuaacutelne geacuteny maleacute DNA elementy na chromozoacuteme s rozliacutešeniacutem okolo 1000 bp

Obr 42 Interfaacutezne jadro po hybridizaacutecii s lokusovo-špecifickou sondou LSI 5q31 Spectrum Orange5p12 Spectrum Green (Vysis Abbott) Na ľavom obraacutezku suacute priacutetomneacute dva červeneacute (5q31) a dva zeleneacute signaacutely (5p12) v pravom jadre je priacutetomnaacute deleacutecia 5q31 oblasti chyacuteba jeden červenyacute signal (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

Obr 43 Interfaacutezna FISH použitaacute lokusovo-špecifickaacute sonda ndash translokačnaacute - XL BCRABL1 plus (Metasystems) dvojfarebnaacute dvojfuacutezna kde červenaacute označuje lokus ABL1 na chromozoacuteme 9 a zelenaacute oblasť BCR na chromozoacuteme 22 Sonda deteguje fuacuteziu protoonkogeacutenu ABL1 (9q34) a geacutenu BCR (22q11) v priacutepade že červenyacute a zelenyacute signaacutel suacute pri sebe (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

45

Obr 44 Interfaacutezna FISH Použitaacute lokusovo-špecifickaacute sonda- typ break apart pre IGH geacuten V docircsledku translokaacutecie došlo k rozskočeniu geacutenu pričom translokačneacuteho partnera nepoznaacuteme vieme určiť len percento v koľkyacutech jadraacutech je geacuten prestavanyacute (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex) Obr 45 Použiteacute celochromozoacutemoveacute sondy WCP 15 (červenyacute chromozoacutem) a WCP 17 (zelenyacute chromozoacutem) Na metafaacuteze je potvrdenaacute reciprokaacute translokaacutecia t(1517)(q2221) (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

FISH vizualizaacutecia celeacuteho chromozoacutemu maľovanie chromozoacutemu anglicky chromosome

painting je špeciaacutelnou aplikaacuteciou chromozoacutemovej FISH proacuteba je koktail veľkeacuteho počtu rocircznych fluorescenčne značenyacutech DNA fragmentov hybridizujuacutecich pozdĺž celeacuteho konkreacutetneho chromozoacutemu (obr 36b 45) bdquoChromosomepaintingldquo analyzuje metafaacutezne chromozoacutemy V minulosti bola FISH vizualizaacutecia celyacutech chromozoacutemov limitovanaacute malyacutem množstvom rocirczne sfarbenyacutech fluorochroacutemov

V suacutečasnosti je možneacute detegovať množstvo cieľovyacutech sekvenciiacute naraz čo sa využiacuteva pri celogenoacutemovej chromozoacutemovej vizualizaacutecii (whole-chromosomepainting - WCP) metoacutedou multiplex FISH (M-FISH multicolor FISH o br 46) alebo spektraacutelnej karyotypizaacutecie (SKY) kedy možno rozliacutešiť všetky ľudskeacute chromozoacutemy ndash teda 24 rocircznych chromozoacutemov M-FISH a SKY patria medzi metafaacutezne formy FISH diagnostiky ktoreacute umožňujuacute simultaacutennu vizualizaacuteciu všetkyacutech ľudskyacutech chromozoacutemov v rocircznych farbaacutech čo predstavuje uľahčenie analyacutezy karyotypu hlavne pri komplexnyacutech zmenaacutech a markeroch neznaacutemeho pocircvodu Obe techniky vychaacutedzajuacute z použitia

46

celochromozoacutemovyacutech sond značenyacutech kombinaacuteciou viaceryacutech fluorochroacutemov Rozdiel medzi M-FISH a SKY spočiacuteva v technike ziacuteskania konečneacuteho obrazu

Obr 46 Multicolor FISH - každyacute chromozoacutemovyacute paacuter je zafarbenyacute inou farbou pričom na ich zafarbenie postačuje kombinaacutecia 5 fluorochroacutemov Na vyhodnocovanie je potrebnaacute špeciaacutelna sada fluorescenčnyacutech filtrov pre jednotliveacute fluorochroacutemy a špeciaacutelnyacute softweacuter Vľavo-štandardnyacute karyotyp vpravo karyotyp s mutaacuteciami (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

V molekulovej cytogenetike suacute komerčne dostupneacute sety M-FISH proacuteb umožňujuacutece

viacfarebneacute pruacutežkovanie chromozoacutemov (banding) s vysokyacutem rozliacutešeniacutem (multicolor-banding mBAND FISH MCB) čo umožňuje identifikaacuteciu intrachromozoacutemovyacutech prestavieb (Obr 47) Nevyhnutnosťou mBAND-u je mať chromozoacutemy v metafaacuteze Taacuteto metoacuteda bola prvyacutekraacutet uskutočnenaacute na chromozoacuteme 5 v roku 1999 mBAND FISH umožňuje rozliacutešiť špecifickeacute oblasti chromozoacutemov na uacuterovni pruacutežku - bandu a sub-bandu s detekciou 550 bandov haploidneacuteho karyotypu

Obr 47 A - mBAND chromozoacutemu 11 - inverzia duplikovanej oblasti 11q223-q25 B - mBAND chromozoacutemu 3 - na kruhovom chromozoacuteme deleacutecia oblasti 3p263 C - mBAND chromozoacutemu 2 - potvrdenie inverzie duplikovanej časti chromozoacutemu (poskytnuteacute RNDr Dagmar Landlovou Medirex)

FISH metoacuteda a jej varianty (M-FISH mBAND SKY) majuacute v suacutečasnosti širokeacute využitie v

klinickej genetike v onkologickej genetike na detekciu aberaacuteciiacute v čase diagnoacutezy počas liečby po

47

liečbe monitorovanie po transplantaacutecii kostnej drene v prenataacutelnej a postnataacutelnej diagnostike pri detekcii submikroskopickyacutech deleacuteciiacute (napr DiGeorge syndroacutem - 22q112 delečnyacute syndroacutem PraderndashWilli syndroacutem- chromozoacutem 15q11-13) prostredniacutectvom FISH je možnaacute detekcia numerickyacutech zmien chromozoacutemov (trizoacutemia chromozoacutemu 21 pri Downovom syndroacuteme trizoacutemia chromozoacutemu 15 pri Patauovom syndroacuteme trizoacutemia chromozoacutemu 18 pri Edwardsovom syndroacuteme) rocirczne zmeny v počte pohlavnyacutech chromozoacutemov (monozoacutemia X pri Turnerovom syndroacuteme Klinefelterov syndroacutem s X chromozoacutemom naviac - XXY) podobne v predimplantačnej diagnostike

83 DNA Microarray (DNA mikro čip biočip) DNA mikročipovanie je technika využiacutevajuacuteca hybridizaacuteciu skuacutemanej nukleovej kyseliny

(cieľovaacute vzorka) s veľkyacutem množstvom oligonukleotidovyacutech proacuteb (desať tisiacutec až milioacuten) ktoreacute suacute prichyteneacute na pevnyacute podklad najčastejšie sklenyacute silikoacutenovyacute alebo nylonovyacute (doštička čip) Skuacutemanaacute nukleovaacute kyselina je pred hybridizaacuteciou fragmentovanaacute označenaacute fluorofoacuterom a denaturovanaacute Po kontakte čipu s cieľovou vzorkou ktoraacute je vlastne zmes označenyacutech oligonukleotidov značeneacute oligonukleotidy hybridizujuacute s oligonukleotidovyacutemi sekvenciami prichytenyacutemi na čipe Potom suacute na zaacuteklade fluorescencie detekovaneacute miesta kde došlo k hybridizaacutecii čiže vzorka obsahovala takuacuteto nukleotidovuacute sekvenciu Z jedneacuteho mikročipu sa ziacuteska obrovskeacute množstvo daacutet ktoreacute je vždy nutneacute softveacuterovo spracovať V dnešnej dobe existuje niekoľko firiem poskytujuacutecich komerčne mikročipy na objednaacutevku alebo si ich laboratoacuteria produkujuacute sami

Mikročipovanie prebieha nasledovne

1) Vytvorenie DNA čipu ndash tisiacutece rocircznych jednovlaacuteknovyacutech DNA oligonukleotidov znaacutemych sekvencii sa kovalentne naviažu na povrch doštičky vždy v určitej lokalite je niekoľko rovnakyacutech oligonukleotidov veľkosť takejto lokality je ˂ 200 microm Proacutebami mocircže byť DNA cDNA alebo syntetizovaneacute oligonukleotidy Už hotoveacute mikročipy ponuacutekajuacute viacereacute firmy (Affymetrix Agilent Technologies Eppendorf Illumina) alebo si ich jednotliveacute laboratoacuteria vyraacutebajuacute sami pomocou robotickyacutech zariadeniacute DNA čip sa vytvaacutera buď nanaacutešaniacutem kvapiek oligonukleotidov na podklad alebo synteacutezou oligonukleotidov in situ na čipe 2) Priacuteprava vzorky ndash nukleovaacute kyselina (mRNA DNA) sa purifikuje určiacute sa jej kvantita a kvalita (spektrofotometericky) fragmentuje resp v priacutepade mRNA sa syntetizuje cDNA v priacutepade potreby sa mocircže DNA amplifikovať PCR reakciou štiepiť restrikčnyacutemi endonukleaacutezami 3) Fluorescenčneacute označenie (zriedkavejšie raacutedioaktiacutevne) fragmentov DNA prebieha počas reverznej transkripcie alebo PCR amplifikaacutecie za uacutečasti fluorescenčne značenyacutech nukleotidov Keď sa analyzujuacute dve rocirczne vzorky napr zdraveacute tkanivo a naacutedoroveacute tkanivo označenie nukleovyacutech kyseliacuten v tyacutechto tkanivaacutech byacuteva rozdielne a to použitiacutem dvoch rocircznych fluorescenčnyacutech farbiacutev (napr zeleneacute a červeneacute) Pred hybridizaacuteciou je potrebneacute vzorku denaturovať čiacutem sa vytvoriacute zmes jednovlaacuteknovyacutech DNA označenyacutech značkou 4) Hybridizaacutecia s mikročipom ndash v špeciaacutelnom hybridizačnom roztoku hybridizujuacute komplementaacuterne sekvencie zo vzorky s priacuteslušnyacutemi oligonukleotidovyacutemi sondami naviazanyacutemi na čipe Potom sa čip obmyje aby došlo k odstraacuteneniu čiastočne hybridizovanyacutech nukleovyacutech kyseliacuten 5) Skenovanie mikročipu ndash skenerom čipov docircjde k ožiareniu čipu laserom pričom v mieste hybridizaacutecie fluorescenčne značenyacutech DNA fragmentov s proacutebou docircjde k emisii svetla určitej vlnovej dĺžky ktoruacute skener zaznamenaacute 6) Analyacuteza daacutet prebieha metoacutedami bioinformatiky spracovaniacutem softveacutermi sa zistiacute ktoreacute lokality čipu navzaacutejom hybridizovali v priacutepade použitia dvoch vzoriek kontrolnej a skuacutemanej je možneacute analyzovať ich relatiacutevnu intenzitu hybridizaacutecie (expresie určiteacuteho geacutenu)

Existujuacute štyri typy mikročipov 1) Čipy ur čeneacute na analyacutezu expresie (obsahujuacute cDNA proacuteby) pre tzv dvojkanaacutelovyacute experiment kedy je vzorka určenaacute k hybridizaacutecii na čipe ziacuteskanaacute zmiešaniacutem DNA fragmentov kontrolnej a skuacutemanej vzorky pričom fragmenty suacute rozdielne fluorescenčne označeneacute (napr zelenyacute fluorofoacuter pre kontrolnuacute vzorku a červenyacute pre skuacutemanuacute) Na zaacuteklade intenzity a typu fluorescencie sa deteguje expresia geacutenov typickaacute pre kontrolnuacute vzorku (napr zelenaacute fluorescencia) pre skuacutemanuacute vzorku (napr

48

červenaacute fluorescencia) a expresia podobnaacute u oboch vzoriek (žltaacute fluorescencia) neexprimovaneacute geacuteny (čierna fluorescencia) rocirczne odtiene (v zaacutevislosti od prevažujuacutecej hybridizaacutecie) (obr 48) 2) Čipy ur čeneacute na analyacutezu mutaacutecii použije sa genoacutemovaacute DNA označenaacute jednou fluorescenčnou farbičkou na určenie jednonukleotidovej zmeny (SNP ndash Single Nukleotide Polymorphism) 3) Čipy na komparatiacutevnu genoacutemovuacute hybridizaacuteciu (aCGH array Comparative Genomic Hybridization) ndash použiacutevaneacute na zistenie zvyacutešenia alebo zniacuteženia množstva chromozoacutemovyacutech fragmentov obsahujuacutecich geacuteny zodpovedneacute za určiteacute ochorenie Na analyacutezu sa použije skuacutemanaacute gDNA a referenčnaacute (kontrolnaacute) DNA každaacute sa značiacute inou fluorescenčnou farbičkou (princiacutep ako pri analyacuteze expresie) (obr 49 50) 4) Čipy CGH - SNP kombinovaneacute čipy ur čeneacute na analyacutezu aj mutaacuteciiacute SNP aj na komparatiacutevnu genoacutemovuacute hybridizaacuteciu CGH

Mikročipy majuacute rozsiahle využitie napriacuteklad v identifikaacuteciiacute novyacutech geacutenov vo vyacuteskume ich funkciiacute expresie v rocircznych podmienkach pri diagnostike mnohyacutech ochoreniacute vo farmakogenomike vo vyacuteskume vplyvu toxiacutenov

Obr 48 Heatmapa geacutenovej expresie vybranyacutech geacutenov (mRNA) mikročip obsahuje 46000 cDNA proacuteb (poskytnuteacute Ing Helenou Gbelcovou PhD Uacutestav lekaacuterskej bioloacutegie genetiky a klinickej genetiky LF UK a UNB)

49

Obr 49 Princiacutep komparatiacutevnej genoacutemovej hybridizaacutecie (aCGH - array comparative genomic hybridization) Obr 50 A) Vyacutesledok komparatiacutevnej genoacutemovej hybridizaacutecie (aCGH - array comparative genomic hybridization) vzorky DNA izolovanej plodovej vody U plodu s abnormaacutelnym ultrasonografickyacutem vyšetreniacutem bola identifikovanaacute duplikaacutecia oblasti 3q261q29 (modryacute paacutes) a deleacutecia oblasti 5p1533p151 (červenyacute paacutes) Pre porovnanie chromozoacutem 1 bez aberaacutecie b) Ten istyacute pacient ale ineacute softveacuteroveacute spracovanie (poskytnuteacute RNDr Miroslavom Tomkom PhD Medirex)

50

Odporuacutečanaacute a použitaacute literatuacutera

Odborneacute knihy Klug W S Cummings M R Spencer Ch A Palladino M A Concepts of Genetics jedenaacuteste vydanie (2015) Carson S Molecular Biology Techniques tretie vydanie (2012) Strachan T Read A Human Molecular Genetics štvrteacute vydanie (2011) Sudbery P Sudbery I Human Molecular Genetics tretie vydanie (2009)

Internetoveacute straacutenky

wwwncbinlmnihgov wwwmlpacom wwwthermofishercom wwwilluminacom wwwpromegask wwwqiagencom wwwambioncom

Odborneacute člaacutenky Chacon-Cortes D Griffiths L R Methods for extracting genomic DNA from whole blood samples current perspectives Journal of Biorepository Science for Applied Medicine Volume 2 strany 1- 9 Viltrop T Krjutskov K Palta P Metspalu A Comparison of DNA extraction methods for multiplex polymerase chain reaction Anal Biochem 2010 Volume 398(2) strany 260-262 Ing Martin Čermaacutek Molekulaacuterna cytogenetika v problematike familiaacuternych maligniacutet Onkoloacutegia Volume 2 strany 77 - 83 Livak KJ Schmittgen TD Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method Methods 2001 Volume 25(4) strany 402 - 408 Bustin S A Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays J Mol Endocrinol 2000 Volume 25(2) strany169 - 193

MOLEKULAacuteRNE METOacuteDY AKTUAacuteLNE POUŽIacuteVANEacute V KLINICKEJ GENETIKE RNDr Andrea Pastoraacutekovaacute PhD RNDr Robert Petrovič PhD Vydala Univerzita Komenskeacuteho v Bratislave Lekaacuterska fakulta Rozsah 50 straacuten 246 AH prveacute vydanie ISBN 978-80-223-4231-5

44

natiahnutyacutech prometafaacuteznych chromozoacutemov sa dosiahne 1 Mb rozliacutešenie Prostredniacutectvom fiber FISH konkreacutetne artificiaacutelne deproteinizovanej natiahnutej DNA pripravenej in situ z celyacutech buniek na mikroskopickom skliacutečku je možneacute vizualizovať individuaacutelne geacuteny maleacute DNA elementy na chromozoacuteme s rozliacutešeniacutem okolo 1000 bp

Obr 42 Interfaacutezne jadro po hybridizaacutecii s lokusovo-špecifickou sondou LSI 5q31 Spectrum Orange5p12 Spectrum Green (Vysis Abbott) Na ľavom obraacutezku suacute priacutetomneacute dva červeneacute (5q31) a dva zeleneacute signaacutely (5p12) v pravom jadre je priacutetomnaacute deleacutecia 5q31 oblasti chyacuteba jeden červenyacute signal (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

Obr 43 Interfaacutezna FISH použitaacute lokusovo-špecifickaacute sonda ndash translokačnaacute - XL BCRABL1 plus (Metasystems) dvojfarebnaacute dvojfuacutezna kde červenaacute označuje lokus ABL1 na chromozoacuteme 9 a zelenaacute oblasť BCR na chromozoacuteme 22 Sonda deteguje fuacuteziu protoonkogeacutenu ABL1 (9q34) a geacutenu BCR (22q11) v priacutepade že červenyacute a zelenyacute signaacutel suacute pri sebe (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

45

Obr 44 Interfaacutezna FISH Použitaacute lokusovo-špecifickaacute sonda- typ break apart pre IGH geacuten V docircsledku translokaacutecie došlo k rozskočeniu geacutenu pričom translokačneacuteho partnera nepoznaacuteme vieme určiť len percento v koľkyacutech jadraacutech je geacuten prestavanyacute (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex) Obr 45 Použiteacute celochromozoacutemoveacute sondy WCP 15 (červenyacute chromozoacutem) a WCP 17 (zelenyacute chromozoacutem) Na metafaacuteze je potvrdenaacute reciprokaacute translokaacutecia t(1517)(q2221) (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

FISH vizualizaacutecia celeacuteho chromozoacutemu maľovanie chromozoacutemu anglicky chromosome

painting je špeciaacutelnou aplikaacuteciou chromozoacutemovej FISH proacuteba je koktail veľkeacuteho počtu rocircznych fluorescenčne značenyacutech DNA fragmentov hybridizujuacutecich pozdĺž celeacuteho konkreacutetneho chromozoacutemu (obr 36b 45) bdquoChromosomepaintingldquo analyzuje metafaacutezne chromozoacutemy V minulosti bola FISH vizualizaacutecia celyacutech chromozoacutemov limitovanaacute malyacutem množstvom rocirczne sfarbenyacutech fluorochroacutemov

V suacutečasnosti je možneacute detegovať množstvo cieľovyacutech sekvenciiacute naraz čo sa využiacuteva pri celogenoacutemovej chromozoacutemovej vizualizaacutecii (whole-chromosomepainting - WCP) metoacutedou multiplex FISH (M-FISH multicolor FISH o br 46) alebo spektraacutelnej karyotypizaacutecie (SKY) kedy možno rozliacutešiť všetky ľudskeacute chromozoacutemy ndash teda 24 rocircznych chromozoacutemov M-FISH a SKY patria medzi metafaacutezne formy FISH diagnostiky ktoreacute umožňujuacute simultaacutennu vizualizaacuteciu všetkyacutech ľudskyacutech chromozoacutemov v rocircznych farbaacutech čo predstavuje uľahčenie analyacutezy karyotypu hlavne pri komplexnyacutech zmenaacutech a markeroch neznaacutemeho pocircvodu Obe techniky vychaacutedzajuacute z použitia

46

celochromozoacutemovyacutech sond značenyacutech kombinaacuteciou viaceryacutech fluorochroacutemov Rozdiel medzi M-FISH a SKY spočiacuteva v technike ziacuteskania konečneacuteho obrazu

Obr 46 Multicolor FISH - každyacute chromozoacutemovyacute paacuter je zafarbenyacute inou farbou pričom na ich zafarbenie postačuje kombinaacutecia 5 fluorochroacutemov Na vyhodnocovanie je potrebnaacute špeciaacutelna sada fluorescenčnyacutech filtrov pre jednotliveacute fluorochroacutemy a špeciaacutelnyacute softweacuter Vľavo-štandardnyacute karyotyp vpravo karyotyp s mutaacuteciami (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

V molekulovej cytogenetike suacute komerčne dostupneacute sety M-FISH proacuteb umožňujuacutece

viacfarebneacute pruacutežkovanie chromozoacutemov (banding) s vysokyacutem rozliacutešeniacutem (multicolor-banding mBAND FISH MCB) čo umožňuje identifikaacuteciu intrachromozoacutemovyacutech prestavieb (Obr 47) Nevyhnutnosťou mBAND-u je mať chromozoacutemy v metafaacuteze Taacuteto metoacuteda bola prvyacutekraacutet uskutočnenaacute na chromozoacuteme 5 v roku 1999 mBAND FISH umožňuje rozliacutešiť špecifickeacute oblasti chromozoacutemov na uacuterovni pruacutežku - bandu a sub-bandu s detekciou 550 bandov haploidneacuteho karyotypu

Obr 47 A - mBAND chromozoacutemu 11 - inverzia duplikovanej oblasti 11q223-q25 B - mBAND chromozoacutemu 3 - na kruhovom chromozoacuteme deleacutecia oblasti 3p263 C - mBAND chromozoacutemu 2 - potvrdenie inverzie duplikovanej časti chromozoacutemu (poskytnuteacute RNDr Dagmar Landlovou Medirex)

FISH metoacuteda a jej varianty (M-FISH mBAND SKY) majuacute v suacutečasnosti širokeacute využitie v

klinickej genetike v onkologickej genetike na detekciu aberaacuteciiacute v čase diagnoacutezy počas liečby po

47

liečbe monitorovanie po transplantaacutecii kostnej drene v prenataacutelnej a postnataacutelnej diagnostike pri detekcii submikroskopickyacutech deleacuteciiacute (napr DiGeorge syndroacutem - 22q112 delečnyacute syndroacutem PraderndashWilli syndroacutem- chromozoacutem 15q11-13) prostredniacutectvom FISH je možnaacute detekcia numerickyacutech zmien chromozoacutemov (trizoacutemia chromozoacutemu 21 pri Downovom syndroacuteme trizoacutemia chromozoacutemu 15 pri Patauovom syndroacuteme trizoacutemia chromozoacutemu 18 pri Edwardsovom syndroacuteme) rocirczne zmeny v počte pohlavnyacutech chromozoacutemov (monozoacutemia X pri Turnerovom syndroacuteme Klinefelterov syndroacutem s X chromozoacutemom naviac - XXY) podobne v predimplantačnej diagnostike

83 DNA Microarray (DNA mikro čip biočip) DNA mikročipovanie je technika využiacutevajuacuteca hybridizaacuteciu skuacutemanej nukleovej kyseliny

(cieľovaacute vzorka) s veľkyacutem množstvom oligonukleotidovyacutech proacuteb (desať tisiacutec až milioacuten) ktoreacute suacute prichyteneacute na pevnyacute podklad najčastejšie sklenyacute silikoacutenovyacute alebo nylonovyacute (doštička čip) Skuacutemanaacute nukleovaacute kyselina je pred hybridizaacuteciou fragmentovanaacute označenaacute fluorofoacuterom a denaturovanaacute Po kontakte čipu s cieľovou vzorkou ktoraacute je vlastne zmes označenyacutech oligonukleotidov značeneacute oligonukleotidy hybridizujuacute s oligonukleotidovyacutemi sekvenciami prichytenyacutemi na čipe Potom suacute na zaacuteklade fluorescencie detekovaneacute miesta kde došlo k hybridizaacutecii čiže vzorka obsahovala takuacuteto nukleotidovuacute sekvenciu Z jedneacuteho mikročipu sa ziacuteska obrovskeacute množstvo daacutet ktoreacute je vždy nutneacute softveacuterovo spracovať V dnešnej dobe existuje niekoľko firiem poskytujuacutecich komerčne mikročipy na objednaacutevku alebo si ich laboratoacuteria produkujuacute sami

Mikročipovanie prebieha nasledovne

1) Vytvorenie DNA čipu ndash tisiacutece rocircznych jednovlaacuteknovyacutech DNA oligonukleotidov znaacutemych sekvencii sa kovalentne naviažu na povrch doštičky vždy v určitej lokalite je niekoľko rovnakyacutech oligonukleotidov veľkosť takejto lokality je ˂ 200 microm Proacutebami mocircže byť DNA cDNA alebo syntetizovaneacute oligonukleotidy Už hotoveacute mikročipy ponuacutekajuacute viacereacute firmy (Affymetrix Agilent Technologies Eppendorf Illumina) alebo si ich jednotliveacute laboratoacuteria vyraacutebajuacute sami pomocou robotickyacutech zariadeniacute DNA čip sa vytvaacutera buď nanaacutešaniacutem kvapiek oligonukleotidov na podklad alebo synteacutezou oligonukleotidov in situ na čipe 2) Priacuteprava vzorky ndash nukleovaacute kyselina (mRNA DNA) sa purifikuje určiacute sa jej kvantita a kvalita (spektrofotometericky) fragmentuje resp v priacutepade mRNA sa syntetizuje cDNA v priacutepade potreby sa mocircže DNA amplifikovať PCR reakciou štiepiť restrikčnyacutemi endonukleaacutezami 3) Fluorescenčneacute označenie (zriedkavejšie raacutedioaktiacutevne) fragmentov DNA prebieha počas reverznej transkripcie alebo PCR amplifikaacutecie za uacutečasti fluorescenčne značenyacutech nukleotidov Keď sa analyzujuacute dve rocirczne vzorky napr zdraveacute tkanivo a naacutedoroveacute tkanivo označenie nukleovyacutech kyseliacuten v tyacutechto tkanivaacutech byacuteva rozdielne a to použitiacutem dvoch rocircznych fluorescenčnyacutech farbiacutev (napr zeleneacute a červeneacute) Pred hybridizaacuteciou je potrebneacute vzorku denaturovať čiacutem sa vytvoriacute zmes jednovlaacuteknovyacutech DNA označenyacutech značkou 4) Hybridizaacutecia s mikročipom ndash v špeciaacutelnom hybridizačnom roztoku hybridizujuacute komplementaacuterne sekvencie zo vzorky s priacuteslušnyacutemi oligonukleotidovyacutemi sondami naviazanyacutemi na čipe Potom sa čip obmyje aby došlo k odstraacuteneniu čiastočne hybridizovanyacutech nukleovyacutech kyseliacuten 5) Skenovanie mikročipu ndash skenerom čipov docircjde k ožiareniu čipu laserom pričom v mieste hybridizaacutecie fluorescenčne značenyacutech DNA fragmentov s proacutebou docircjde k emisii svetla určitej vlnovej dĺžky ktoruacute skener zaznamenaacute 6) Analyacuteza daacutet prebieha metoacutedami bioinformatiky spracovaniacutem softveacutermi sa zistiacute ktoreacute lokality čipu navzaacutejom hybridizovali v priacutepade použitia dvoch vzoriek kontrolnej a skuacutemanej je možneacute analyzovať ich relatiacutevnu intenzitu hybridizaacutecie (expresie určiteacuteho geacutenu)

Existujuacute štyri typy mikročipov 1) Čipy ur čeneacute na analyacutezu expresie (obsahujuacute cDNA proacuteby) pre tzv dvojkanaacutelovyacute experiment kedy je vzorka určenaacute k hybridizaacutecii na čipe ziacuteskanaacute zmiešaniacutem DNA fragmentov kontrolnej a skuacutemanej vzorky pričom fragmenty suacute rozdielne fluorescenčne označeneacute (napr zelenyacute fluorofoacuter pre kontrolnuacute vzorku a červenyacute pre skuacutemanuacute) Na zaacuteklade intenzity a typu fluorescencie sa deteguje expresia geacutenov typickaacute pre kontrolnuacute vzorku (napr zelenaacute fluorescencia) pre skuacutemanuacute vzorku (napr

48

červenaacute fluorescencia) a expresia podobnaacute u oboch vzoriek (žltaacute fluorescencia) neexprimovaneacute geacuteny (čierna fluorescencia) rocirczne odtiene (v zaacutevislosti od prevažujuacutecej hybridizaacutecie) (obr 48) 2) Čipy ur čeneacute na analyacutezu mutaacutecii použije sa genoacutemovaacute DNA označenaacute jednou fluorescenčnou farbičkou na určenie jednonukleotidovej zmeny (SNP ndash Single Nukleotide Polymorphism) 3) Čipy na komparatiacutevnu genoacutemovuacute hybridizaacuteciu (aCGH array Comparative Genomic Hybridization) ndash použiacutevaneacute na zistenie zvyacutešenia alebo zniacuteženia množstva chromozoacutemovyacutech fragmentov obsahujuacutecich geacuteny zodpovedneacute za určiteacute ochorenie Na analyacutezu sa použije skuacutemanaacute gDNA a referenčnaacute (kontrolnaacute) DNA každaacute sa značiacute inou fluorescenčnou farbičkou (princiacutep ako pri analyacuteze expresie) (obr 49 50) 4) Čipy CGH - SNP kombinovaneacute čipy ur čeneacute na analyacutezu aj mutaacuteciiacute SNP aj na komparatiacutevnu genoacutemovuacute hybridizaacuteciu CGH

Mikročipy majuacute rozsiahle využitie napriacuteklad v identifikaacuteciiacute novyacutech geacutenov vo vyacuteskume ich funkciiacute expresie v rocircznych podmienkach pri diagnostike mnohyacutech ochoreniacute vo farmakogenomike vo vyacuteskume vplyvu toxiacutenov

Obr 48 Heatmapa geacutenovej expresie vybranyacutech geacutenov (mRNA) mikročip obsahuje 46000 cDNA proacuteb (poskytnuteacute Ing Helenou Gbelcovou PhD Uacutestav lekaacuterskej bioloacutegie genetiky a klinickej genetiky LF UK a UNB)

49

Obr 49 Princiacutep komparatiacutevnej genoacutemovej hybridizaacutecie (aCGH - array comparative genomic hybridization) Obr 50 A) Vyacutesledok komparatiacutevnej genoacutemovej hybridizaacutecie (aCGH - array comparative genomic hybridization) vzorky DNA izolovanej plodovej vody U plodu s abnormaacutelnym ultrasonografickyacutem vyšetreniacutem bola identifikovanaacute duplikaacutecia oblasti 3q261q29 (modryacute paacutes) a deleacutecia oblasti 5p1533p151 (červenyacute paacutes) Pre porovnanie chromozoacutem 1 bez aberaacutecie b) Ten istyacute pacient ale ineacute softveacuteroveacute spracovanie (poskytnuteacute RNDr Miroslavom Tomkom PhD Medirex)

50

Odporuacutečanaacute a použitaacute literatuacutera

Odborneacute knihy Klug W S Cummings M R Spencer Ch A Palladino M A Concepts of Genetics jedenaacuteste vydanie (2015) Carson S Molecular Biology Techniques tretie vydanie (2012) Strachan T Read A Human Molecular Genetics štvrteacute vydanie (2011) Sudbery P Sudbery I Human Molecular Genetics tretie vydanie (2009)

Internetoveacute straacutenky

wwwncbinlmnihgov wwwmlpacom wwwthermofishercom wwwilluminacom wwwpromegask wwwqiagencom wwwambioncom

Odborneacute člaacutenky Chacon-Cortes D Griffiths L R Methods for extracting genomic DNA from whole blood samples current perspectives Journal of Biorepository Science for Applied Medicine Volume 2 strany 1- 9 Viltrop T Krjutskov K Palta P Metspalu A Comparison of DNA extraction methods for multiplex polymerase chain reaction Anal Biochem 2010 Volume 398(2) strany 260-262 Ing Martin Čermaacutek Molekulaacuterna cytogenetika v problematike familiaacuternych maligniacutet Onkoloacutegia Volume 2 strany 77 - 83 Livak KJ Schmittgen TD Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method Methods 2001 Volume 25(4) strany 402 - 408 Bustin S A Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays J Mol Endocrinol 2000 Volume 25(2) strany169 - 193

MOLEKULAacuteRNE METOacuteDY AKTUAacuteLNE POUŽIacuteVANEacute V KLINICKEJ GENETIKE RNDr Andrea Pastoraacutekovaacute PhD RNDr Robert Petrovič PhD Vydala Univerzita Komenskeacuteho v Bratislave Lekaacuterska fakulta Rozsah 50 straacuten 246 AH prveacute vydanie ISBN 978-80-223-4231-5

45

Obr 44 Interfaacutezna FISH Použitaacute lokusovo-špecifickaacute sonda- typ break apart pre IGH geacuten V docircsledku translokaacutecie došlo k rozskočeniu geacutenu pričom translokačneacuteho partnera nepoznaacuteme vieme určiť len percento v koľkyacutech jadraacutech je geacuten prestavanyacute (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex) Obr 45 Použiteacute celochromozoacutemoveacute sondy WCP 15 (červenyacute chromozoacutem) a WCP 17 (zelenyacute chromozoacutem) Na metafaacuteze je potvrdenaacute reciprokaacute translokaacutecia t(1517)(q2221) (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

FISH vizualizaacutecia celeacuteho chromozoacutemu maľovanie chromozoacutemu anglicky chromosome

painting je špeciaacutelnou aplikaacuteciou chromozoacutemovej FISH proacuteba je koktail veľkeacuteho počtu rocircznych fluorescenčne značenyacutech DNA fragmentov hybridizujuacutecich pozdĺž celeacuteho konkreacutetneho chromozoacutemu (obr 36b 45) bdquoChromosomepaintingldquo analyzuje metafaacutezne chromozoacutemy V minulosti bola FISH vizualizaacutecia celyacutech chromozoacutemov limitovanaacute malyacutem množstvom rocirczne sfarbenyacutech fluorochroacutemov

V suacutečasnosti je možneacute detegovať množstvo cieľovyacutech sekvenciiacute naraz čo sa využiacuteva pri celogenoacutemovej chromozoacutemovej vizualizaacutecii (whole-chromosomepainting - WCP) metoacutedou multiplex FISH (M-FISH multicolor FISH o br 46) alebo spektraacutelnej karyotypizaacutecie (SKY) kedy možno rozliacutešiť všetky ľudskeacute chromozoacutemy ndash teda 24 rocircznych chromozoacutemov M-FISH a SKY patria medzi metafaacutezne formy FISH diagnostiky ktoreacute umožňujuacute simultaacutennu vizualizaacuteciu všetkyacutech ľudskyacutech chromozoacutemov v rocircznych farbaacutech čo predstavuje uľahčenie analyacutezy karyotypu hlavne pri komplexnyacutech zmenaacutech a markeroch neznaacutemeho pocircvodu Obe techniky vychaacutedzajuacute z použitia

46

celochromozoacutemovyacutech sond značenyacutech kombinaacuteciou viaceryacutech fluorochroacutemov Rozdiel medzi M-FISH a SKY spočiacuteva v technike ziacuteskania konečneacuteho obrazu

Obr 46 Multicolor FISH - každyacute chromozoacutemovyacute paacuter je zafarbenyacute inou farbou pričom na ich zafarbenie postačuje kombinaacutecia 5 fluorochroacutemov Na vyhodnocovanie je potrebnaacute špeciaacutelna sada fluorescenčnyacutech filtrov pre jednotliveacute fluorochroacutemy a špeciaacutelnyacute softweacuter Vľavo-štandardnyacute karyotyp vpravo karyotyp s mutaacuteciami (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

V molekulovej cytogenetike suacute komerčne dostupneacute sety M-FISH proacuteb umožňujuacutece

viacfarebneacute pruacutežkovanie chromozoacutemov (banding) s vysokyacutem rozliacutešeniacutem (multicolor-banding mBAND FISH MCB) čo umožňuje identifikaacuteciu intrachromozoacutemovyacutech prestavieb (Obr 47) Nevyhnutnosťou mBAND-u je mať chromozoacutemy v metafaacuteze Taacuteto metoacuteda bola prvyacutekraacutet uskutočnenaacute na chromozoacuteme 5 v roku 1999 mBAND FISH umožňuje rozliacutešiť špecifickeacute oblasti chromozoacutemov na uacuterovni pruacutežku - bandu a sub-bandu s detekciou 550 bandov haploidneacuteho karyotypu

Obr 47 A - mBAND chromozoacutemu 11 - inverzia duplikovanej oblasti 11q223-q25 B - mBAND chromozoacutemu 3 - na kruhovom chromozoacuteme deleacutecia oblasti 3p263 C - mBAND chromozoacutemu 2 - potvrdenie inverzie duplikovanej časti chromozoacutemu (poskytnuteacute RNDr Dagmar Landlovou Medirex)

FISH metoacuteda a jej varianty (M-FISH mBAND SKY) majuacute v suacutečasnosti širokeacute využitie v

klinickej genetike v onkologickej genetike na detekciu aberaacuteciiacute v čase diagnoacutezy počas liečby po

47

liečbe monitorovanie po transplantaacutecii kostnej drene v prenataacutelnej a postnataacutelnej diagnostike pri detekcii submikroskopickyacutech deleacuteciiacute (napr DiGeorge syndroacutem - 22q112 delečnyacute syndroacutem PraderndashWilli syndroacutem- chromozoacutem 15q11-13) prostredniacutectvom FISH je možnaacute detekcia numerickyacutech zmien chromozoacutemov (trizoacutemia chromozoacutemu 21 pri Downovom syndroacuteme trizoacutemia chromozoacutemu 15 pri Patauovom syndroacuteme trizoacutemia chromozoacutemu 18 pri Edwardsovom syndroacuteme) rocirczne zmeny v počte pohlavnyacutech chromozoacutemov (monozoacutemia X pri Turnerovom syndroacuteme Klinefelterov syndroacutem s X chromozoacutemom naviac - XXY) podobne v predimplantačnej diagnostike

83 DNA Microarray (DNA mikro čip biočip) DNA mikročipovanie je technika využiacutevajuacuteca hybridizaacuteciu skuacutemanej nukleovej kyseliny

(cieľovaacute vzorka) s veľkyacutem množstvom oligonukleotidovyacutech proacuteb (desať tisiacutec až milioacuten) ktoreacute suacute prichyteneacute na pevnyacute podklad najčastejšie sklenyacute silikoacutenovyacute alebo nylonovyacute (doštička čip) Skuacutemanaacute nukleovaacute kyselina je pred hybridizaacuteciou fragmentovanaacute označenaacute fluorofoacuterom a denaturovanaacute Po kontakte čipu s cieľovou vzorkou ktoraacute je vlastne zmes označenyacutech oligonukleotidov značeneacute oligonukleotidy hybridizujuacute s oligonukleotidovyacutemi sekvenciami prichytenyacutemi na čipe Potom suacute na zaacuteklade fluorescencie detekovaneacute miesta kde došlo k hybridizaacutecii čiže vzorka obsahovala takuacuteto nukleotidovuacute sekvenciu Z jedneacuteho mikročipu sa ziacuteska obrovskeacute množstvo daacutet ktoreacute je vždy nutneacute softveacuterovo spracovať V dnešnej dobe existuje niekoľko firiem poskytujuacutecich komerčne mikročipy na objednaacutevku alebo si ich laboratoacuteria produkujuacute sami

Mikročipovanie prebieha nasledovne

1) Vytvorenie DNA čipu ndash tisiacutece rocircznych jednovlaacuteknovyacutech DNA oligonukleotidov znaacutemych sekvencii sa kovalentne naviažu na povrch doštičky vždy v určitej lokalite je niekoľko rovnakyacutech oligonukleotidov veľkosť takejto lokality je ˂ 200 microm Proacutebami mocircže byť DNA cDNA alebo syntetizovaneacute oligonukleotidy Už hotoveacute mikročipy ponuacutekajuacute viacereacute firmy (Affymetrix Agilent Technologies Eppendorf Illumina) alebo si ich jednotliveacute laboratoacuteria vyraacutebajuacute sami pomocou robotickyacutech zariadeniacute DNA čip sa vytvaacutera buď nanaacutešaniacutem kvapiek oligonukleotidov na podklad alebo synteacutezou oligonukleotidov in situ na čipe 2) Priacuteprava vzorky ndash nukleovaacute kyselina (mRNA DNA) sa purifikuje určiacute sa jej kvantita a kvalita (spektrofotometericky) fragmentuje resp v priacutepade mRNA sa syntetizuje cDNA v priacutepade potreby sa mocircže DNA amplifikovať PCR reakciou štiepiť restrikčnyacutemi endonukleaacutezami 3) Fluorescenčneacute označenie (zriedkavejšie raacutedioaktiacutevne) fragmentov DNA prebieha počas reverznej transkripcie alebo PCR amplifikaacutecie za uacutečasti fluorescenčne značenyacutech nukleotidov Keď sa analyzujuacute dve rocirczne vzorky napr zdraveacute tkanivo a naacutedoroveacute tkanivo označenie nukleovyacutech kyseliacuten v tyacutechto tkanivaacutech byacuteva rozdielne a to použitiacutem dvoch rocircznych fluorescenčnyacutech farbiacutev (napr zeleneacute a červeneacute) Pred hybridizaacuteciou je potrebneacute vzorku denaturovať čiacutem sa vytvoriacute zmes jednovlaacuteknovyacutech DNA označenyacutech značkou 4) Hybridizaacutecia s mikročipom ndash v špeciaacutelnom hybridizačnom roztoku hybridizujuacute komplementaacuterne sekvencie zo vzorky s priacuteslušnyacutemi oligonukleotidovyacutemi sondami naviazanyacutemi na čipe Potom sa čip obmyje aby došlo k odstraacuteneniu čiastočne hybridizovanyacutech nukleovyacutech kyseliacuten 5) Skenovanie mikročipu ndash skenerom čipov docircjde k ožiareniu čipu laserom pričom v mieste hybridizaacutecie fluorescenčne značenyacutech DNA fragmentov s proacutebou docircjde k emisii svetla určitej vlnovej dĺžky ktoruacute skener zaznamenaacute 6) Analyacuteza daacutet prebieha metoacutedami bioinformatiky spracovaniacutem softveacutermi sa zistiacute ktoreacute lokality čipu navzaacutejom hybridizovali v priacutepade použitia dvoch vzoriek kontrolnej a skuacutemanej je možneacute analyzovať ich relatiacutevnu intenzitu hybridizaacutecie (expresie určiteacuteho geacutenu)

Existujuacute štyri typy mikročipov 1) Čipy ur čeneacute na analyacutezu expresie (obsahujuacute cDNA proacuteby) pre tzv dvojkanaacutelovyacute experiment kedy je vzorka určenaacute k hybridizaacutecii na čipe ziacuteskanaacute zmiešaniacutem DNA fragmentov kontrolnej a skuacutemanej vzorky pričom fragmenty suacute rozdielne fluorescenčne označeneacute (napr zelenyacute fluorofoacuter pre kontrolnuacute vzorku a červenyacute pre skuacutemanuacute) Na zaacuteklade intenzity a typu fluorescencie sa deteguje expresia geacutenov typickaacute pre kontrolnuacute vzorku (napr zelenaacute fluorescencia) pre skuacutemanuacute vzorku (napr

48

červenaacute fluorescencia) a expresia podobnaacute u oboch vzoriek (žltaacute fluorescencia) neexprimovaneacute geacuteny (čierna fluorescencia) rocirczne odtiene (v zaacutevislosti od prevažujuacutecej hybridizaacutecie) (obr 48) 2) Čipy ur čeneacute na analyacutezu mutaacutecii použije sa genoacutemovaacute DNA označenaacute jednou fluorescenčnou farbičkou na určenie jednonukleotidovej zmeny (SNP ndash Single Nukleotide Polymorphism) 3) Čipy na komparatiacutevnu genoacutemovuacute hybridizaacuteciu (aCGH array Comparative Genomic Hybridization) ndash použiacutevaneacute na zistenie zvyacutešenia alebo zniacuteženia množstva chromozoacutemovyacutech fragmentov obsahujuacutecich geacuteny zodpovedneacute za určiteacute ochorenie Na analyacutezu sa použije skuacutemanaacute gDNA a referenčnaacute (kontrolnaacute) DNA každaacute sa značiacute inou fluorescenčnou farbičkou (princiacutep ako pri analyacuteze expresie) (obr 49 50) 4) Čipy CGH - SNP kombinovaneacute čipy ur čeneacute na analyacutezu aj mutaacuteciiacute SNP aj na komparatiacutevnu genoacutemovuacute hybridizaacuteciu CGH

Mikročipy majuacute rozsiahle využitie napriacuteklad v identifikaacuteciiacute novyacutech geacutenov vo vyacuteskume ich funkciiacute expresie v rocircznych podmienkach pri diagnostike mnohyacutech ochoreniacute vo farmakogenomike vo vyacuteskume vplyvu toxiacutenov

Obr 48 Heatmapa geacutenovej expresie vybranyacutech geacutenov (mRNA) mikročip obsahuje 46000 cDNA proacuteb (poskytnuteacute Ing Helenou Gbelcovou PhD Uacutestav lekaacuterskej bioloacutegie genetiky a klinickej genetiky LF UK a UNB)

49

Obr 49 Princiacutep komparatiacutevnej genoacutemovej hybridizaacutecie (aCGH - array comparative genomic hybridization) Obr 50 A) Vyacutesledok komparatiacutevnej genoacutemovej hybridizaacutecie (aCGH - array comparative genomic hybridization) vzorky DNA izolovanej plodovej vody U plodu s abnormaacutelnym ultrasonografickyacutem vyšetreniacutem bola identifikovanaacute duplikaacutecia oblasti 3q261q29 (modryacute paacutes) a deleacutecia oblasti 5p1533p151 (červenyacute paacutes) Pre porovnanie chromozoacutem 1 bez aberaacutecie b) Ten istyacute pacient ale ineacute softveacuteroveacute spracovanie (poskytnuteacute RNDr Miroslavom Tomkom PhD Medirex)

50

Odporuacutečanaacute a použitaacute literatuacutera

Odborneacute knihy Klug W S Cummings M R Spencer Ch A Palladino M A Concepts of Genetics jedenaacuteste vydanie (2015) Carson S Molecular Biology Techniques tretie vydanie (2012) Strachan T Read A Human Molecular Genetics štvrteacute vydanie (2011) Sudbery P Sudbery I Human Molecular Genetics tretie vydanie (2009)

Internetoveacute straacutenky

wwwncbinlmnihgov wwwmlpacom wwwthermofishercom wwwilluminacom wwwpromegask wwwqiagencom wwwambioncom

Odborneacute člaacutenky Chacon-Cortes D Griffiths L R Methods for extracting genomic DNA from whole blood samples current perspectives Journal of Biorepository Science for Applied Medicine Volume 2 strany 1- 9 Viltrop T Krjutskov K Palta P Metspalu A Comparison of DNA extraction methods for multiplex polymerase chain reaction Anal Biochem 2010 Volume 398(2) strany 260-262 Ing Martin Čermaacutek Molekulaacuterna cytogenetika v problematike familiaacuternych maligniacutet Onkoloacutegia Volume 2 strany 77 - 83 Livak KJ Schmittgen TD Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method Methods 2001 Volume 25(4) strany 402 - 408 Bustin S A Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays J Mol Endocrinol 2000 Volume 25(2) strany169 - 193

MOLEKULAacuteRNE METOacuteDY AKTUAacuteLNE POUŽIacuteVANEacute V KLINICKEJ GENETIKE RNDr Andrea Pastoraacutekovaacute PhD RNDr Robert Petrovič PhD Vydala Univerzita Komenskeacuteho v Bratislave Lekaacuterska fakulta Rozsah 50 straacuten 246 AH prveacute vydanie ISBN 978-80-223-4231-5

46

celochromozoacutemovyacutech sond značenyacutech kombinaacuteciou viaceryacutech fluorochroacutemov Rozdiel medzi M-FISH a SKY spočiacuteva v technike ziacuteskania konečneacuteho obrazu

Obr 46 Multicolor FISH - každyacute chromozoacutemovyacute paacuter je zafarbenyacute inou farbou pričom na ich zafarbenie postačuje kombinaacutecia 5 fluorochroacutemov Na vyhodnocovanie je potrebnaacute špeciaacutelna sada fluorescenčnyacutech filtrov pre jednotliveacute fluorochroacutemy a špeciaacutelnyacute softweacuter Vľavo-štandardnyacute karyotyp vpravo karyotyp s mutaacuteciami (poskytnuteacute RNDr Andreou Blahovou Medirex)

V molekulovej cytogenetike suacute komerčne dostupneacute sety M-FISH proacuteb umožňujuacutece

viacfarebneacute pruacutežkovanie chromozoacutemov (banding) s vysokyacutem rozliacutešeniacutem (multicolor-banding mBAND FISH MCB) čo umožňuje identifikaacuteciu intrachromozoacutemovyacutech prestavieb (Obr 47) Nevyhnutnosťou mBAND-u je mať chromozoacutemy v metafaacuteze Taacuteto metoacuteda bola prvyacutekraacutet uskutočnenaacute na chromozoacuteme 5 v roku 1999 mBAND FISH umožňuje rozliacutešiť špecifickeacute oblasti chromozoacutemov na uacuterovni pruacutežku - bandu a sub-bandu s detekciou 550 bandov haploidneacuteho karyotypu

Obr 47 A - mBAND chromozoacutemu 11 - inverzia duplikovanej oblasti 11q223-q25 B - mBAND chromozoacutemu 3 - na kruhovom chromozoacuteme deleacutecia oblasti 3p263 C - mBAND chromozoacutemu 2 - potvrdenie inverzie duplikovanej časti chromozoacutemu (poskytnuteacute RNDr Dagmar Landlovou Medirex)

FISH metoacuteda a jej varianty (M-FISH mBAND SKY) majuacute v suacutečasnosti širokeacute využitie v

klinickej genetike v onkologickej genetike na detekciu aberaacuteciiacute v čase diagnoacutezy počas liečby po

47

liečbe monitorovanie po transplantaacutecii kostnej drene v prenataacutelnej a postnataacutelnej diagnostike pri detekcii submikroskopickyacutech deleacuteciiacute (napr DiGeorge syndroacutem - 22q112 delečnyacute syndroacutem PraderndashWilli syndroacutem- chromozoacutem 15q11-13) prostredniacutectvom FISH je možnaacute detekcia numerickyacutech zmien chromozoacutemov (trizoacutemia chromozoacutemu 21 pri Downovom syndroacuteme trizoacutemia chromozoacutemu 15 pri Patauovom syndroacuteme trizoacutemia chromozoacutemu 18 pri Edwardsovom syndroacuteme) rocirczne zmeny v počte pohlavnyacutech chromozoacutemov (monozoacutemia X pri Turnerovom syndroacuteme Klinefelterov syndroacutem s X chromozoacutemom naviac - XXY) podobne v predimplantačnej diagnostike

83 DNA Microarray (DNA mikro čip biočip) DNA mikročipovanie je technika využiacutevajuacuteca hybridizaacuteciu skuacutemanej nukleovej kyseliny

(cieľovaacute vzorka) s veľkyacutem množstvom oligonukleotidovyacutech proacuteb (desať tisiacutec až milioacuten) ktoreacute suacute prichyteneacute na pevnyacute podklad najčastejšie sklenyacute silikoacutenovyacute alebo nylonovyacute (doštička čip) Skuacutemanaacute nukleovaacute kyselina je pred hybridizaacuteciou fragmentovanaacute označenaacute fluorofoacuterom a denaturovanaacute Po kontakte čipu s cieľovou vzorkou ktoraacute je vlastne zmes označenyacutech oligonukleotidov značeneacute oligonukleotidy hybridizujuacute s oligonukleotidovyacutemi sekvenciami prichytenyacutemi na čipe Potom suacute na zaacuteklade fluorescencie detekovaneacute miesta kde došlo k hybridizaacutecii čiže vzorka obsahovala takuacuteto nukleotidovuacute sekvenciu Z jedneacuteho mikročipu sa ziacuteska obrovskeacute množstvo daacutet ktoreacute je vždy nutneacute softveacuterovo spracovať V dnešnej dobe existuje niekoľko firiem poskytujuacutecich komerčne mikročipy na objednaacutevku alebo si ich laboratoacuteria produkujuacute sami

Mikročipovanie prebieha nasledovne

1) Vytvorenie DNA čipu ndash tisiacutece rocircznych jednovlaacuteknovyacutech DNA oligonukleotidov znaacutemych sekvencii sa kovalentne naviažu na povrch doštičky vždy v určitej lokalite je niekoľko rovnakyacutech oligonukleotidov veľkosť takejto lokality je ˂ 200 microm Proacutebami mocircže byť DNA cDNA alebo syntetizovaneacute oligonukleotidy Už hotoveacute mikročipy ponuacutekajuacute viacereacute firmy (Affymetrix Agilent Technologies Eppendorf Illumina) alebo si ich jednotliveacute laboratoacuteria vyraacutebajuacute sami pomocou robotickyacutech zariadeniacute DNA čip sa vytvaacutera buď nanaacutešaniacutem kvapiek oligonukleotidov na podklad alebo synteacutezou oligonukleotidov in situ na čipe 2) Priacuteprava vzorky ndash nukleovaacute kyselina (mRNA DNA) sa purifikuje určiacute sa jej kvantita a kvalita (spektrofotometericky) fragmentuje resp v priacutepade mRNA sa syntetizuje cDNA v priacutepade potreby sa mocircže DNA amplifikovať PCR reakciou štiepiť restrikčnyacutemi endonukleaacutezami 3) Fluorescenčneacute označenie (zriedkavejšie raacutedioaktiacutevne) fragmentov DNA prebieha počas reverznej transkripcie alebo PCR amplifikaacutecie za uacutečasti fluorescenčne značenyacutech nukleotidov Keď sa analyzujuacute dve rocirczne vzorky napr zdraveacute tkanivo a naacutedoroveacute tkanivo označenie nukleovyacutech kyseliacuten v tyacutechto tkanivaacutech byacuteva rozdielne a to použitiacutem dvoch rocircznych fluorescenčnyacutech farbiacutev (napr zeleneacute a červeneacute) Pred hybridizaacuteciou je potrebneacute vzorku denaturovať čiacutem sa vytvoriacute zmes jednovlaacuteknovyacutech DNA označenyacutech značkou 4) Hybridizaacutecia s mikročipom ndash v špeciaacutelnom hybridizačnom roztoku hybridizujuacute komplementaacuterne sekvencie zo vzorky s priacuteslušnyacutemi oligonukleotidovyacutemi sondami naviazanyacutemi na čipe Potom sa čip obmyje aby došlo k odstraacuteneniu čiastočne hybridizovanyacutech nukleovyacutech kyseliacuten 5) Skenovanie mikročipu ndash skenerom čipov docircjde k ožiareniu čipu laserom pričom v mieste hybridizaacutecie fluorescenčne značenyacutech DNA fragmentov s proacutebou docircjde k emisii svetla určitej vlnovej dĺžky ktoruacute skener zaznamenaacute 6) Analyacuteza daacutet prebieha metoacutedami bioinformatiky spracovaniacutem softveacutermi sa zistiacute ktoreacute lokality čipu navzaacutejom hybridizovali v priacutepade použitia dvoch vzoriek kontrolnej a skuacutemanej je možneacute analyzovať ich relatiacutevnu intenzitu hybridizaacutecie (expresie určiteacuteho geacutenu)

Existujuacute štyri typy mikročipov 1) Čipy ur čeneacute na analyacutezu expresie (obsahujuacute cDNA proacuteby) pre tzv dvojkanaacutelovyacute experiment kedy je vzorka určenaacute k hybridizaacutecii na čipe ziacuteskanaacute zmiešaniacutem DNA fragmentov kontrolnej a skuacutemanej vzorky pričom fragmenty suacute rozdielne fluorescenčne označeneacute (napr zelenyacute fluorofoacuter pre kontrolnuacute vzorku a červenyacute pre skuacutemanuacute) Na zaacuteklade intenzity a typu fluorescencie sa deteguje expresia geacutenov typickaacute pre kontrolnuacute vzorku (napr zelenaacute fluorescencia) pre skuacutemanuacute vzorku (napr

48

červenaacute fluorescencia) a expresia podobnaacute u oboch vzoriek (žltaacute fluorescencia) neexprimovaneacute geacuteny (čierna fluorescencia) rocirczne odtiene (v zaacutevislosti od prevažujuacutecej hybridizaacutecie) (obr 48) 2) Čipy ur čeneacute na analyacutezu mutaacutecii použije sa genoacutemovaacute DNA označenaacute jednou fluorescenčnou farbičkou na určenie jednonukleotidovej zmeny (SNP ndash Single Nukleotide Polymorphism) 3) Čipy na komparatiacutevnu genoacutemovuacute hybridizaacuteciu (aCGH array Comparative Genomic Hybridization) ndash použiacutevaneacute na zistenie zvyacutešenia alebo zniacuteženia množstva chromozoacutemovyacutech fragmentov obsahujuacutecich geacuteny zodpovedneacute za určiteacute ochorenie Na analyacutezu sa použije skuacutemanaacute gDNA a referenčnaacute (kontrolnaacute) DNA každaacute sa značiacute inou fluorescenčnou farbičkou (princiacutep ako pri analyacuteze expresie) (obr 49 50) 4) Čipy CGH - SNP kombinovaneacute čipy ur čeneacute na analyacutezu aj mutaacuteciiacute SNP aj na komparatiacutevnu genoacutemovuacute hybridizaacuteciu CGH

Mikročipy majuacute rozsiahle využitie napriacuteklad v identifikaacuteciiacute novyacutech geacutenov vo vyacuteskume ich funkciiacute expresie v rocircznych podmienkach pri diagnostike mnohyacutech ochoreniacute vo farmakogenomike vo vyacuteskume vplyvu toxiacutenov

Obr 48 Heatmapa geacutenovej expresie vybranyacutech geacutenov (mRNA) mikročip obsahuje 46000 cDNA proacuteb (poskytnuteacute Ing Helenou Gbelcovou PhD Uacutestav lekaacuterskej bioloacutegie genetiky a klinickej genetiky LF UK a UNB)

49

Obr 49 Princiacutep komparatiacutevnej genoacutemovej hybridizaacutecie (aCGH - array comparative genomic hybridization) Obr 50 A) Vyacutesledok komparatiacutevnej genoacutemovej hybridizaacutecie (aCGH - array comparative genomic hybridization) vzorky DNA izolovanej plodovej vody U plodu s abnormaacutelnym ultrasonografickyacutem vyšetreniacutem bola identifikovanaacute duplikaacutecia oblasti 3q261q29 (modryacute paacutes) a deleacutecia oblasti 5p1533p151 (červenyacute paacutes) Pre porovnanie chromozoacutem 1 bez aberaacutecie b) Ten istyacute pacient ale ineacute softveacuteroveacute spracovanie (poskytnuteacute RNDr Miroslavom Tomkom PhD Medirex)

50

Odporuacutečanaacute a použitaacute literatuacutera

Odborneacute knihy Klug W S Cummings M R Spencer Ch A Palladino M A Concepts of Genetics jedenaacuteste vydanie (2015) Carson S Molecular Biology Techniques tretie vydanie (2012) Strachan T Read A Human Molecular Genetics štvrteacute vydanie (2011) Sudbery P Sudbery I Human Molecular Genetics tretie vydanie (2009)

Internetoveacute straacutenky

wwwncbinlmnihgov wwwmlpacom wwwthermofishercom wwwilluminacom wwwpromegask wwwqiagencom wwwambioncom

Odborneacute člaacutenky Chacon-Cortes D Griffiths L R Methods for extracting genomic DNA from whole blood samples current perspectives Journal of Biorepository Science for Applied Medicine Volume 2 strany 1- 9 Viltrop T Krjutskov K Palta P Metspalu A Comparison of DNA extraction methods for multiplex polymerase chain reaction Anal Biochem 2010 Volume 398(2) strany 260-262 Ing Martin Čermaacutek Molekulaacuterna cytogenetika v problematike familiaacuternych maligniacutet Onkoloacutegia Volume 2 strany 77 - 83 Livak KJ Schmittgen TD Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method Methods 2001 Volume 25(4) strany 402 - 408 Bustin S A Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays J Mol Endocrinol 2000 Volume 25(2) strany169 - 193

MOLEKULAacuteRNE METOacuteDY AKTUAacuteLNE POUŽIacuteVANEacute V KLINICKEJ GENETIKE RNDr Andrea Pastoraacutekovaacute PhD RNDr Robert Petrovič PhD Vydala Univerzita Komenskeacuteho v Bratislave Lekaacuterska fakulta Rozsah 50 straacuten 246 AH prveacute vydanie ISBN 978-80-223-4231-5

47

liečbe monitorovanie po transplantaacutecii kostnej drene v prenataacutelnej a postnataacutelnej diagnostike pri detekcii submikroskopickyacutech deleacuteciiacute (napr DiGeorge syndroacutem - 22q112 delečnyacute syndroacutem PraderndashWilli syndroacutem- chromozoacutem 15q11-13) prostredniacutectvom FISH je možnaacute detekcia numerickyacutech zmien chromozoacutemov (trizoacutemia chromozoacutemu 21 pri Downovom syndroacuteme trizoacutemia chromozoacutemu 15 pri Patauovom syndroacuteme trizoacutemia chromozoacutemu 18 pri Edwardsovom syndroacuteme) rocirczne zmeny v počte pohlavnyacutech chromozoacutemov (monozoacutemia X pri Turnerovom syndroacuteme Klinefelterov syndroacutem s X chromozoacutemom naviac - XXY) podobne v predimplantačnej diagnostike

83 DNA Microarray (DNA mikro čip biočip) DNA mikročipovanie je technika využiacutevajuacuteca hybridizaacuteciu skuacutemanej nukleovej kyseliny

(cieľovaacute vzorka) s veľkyacutem množstvom oligonukleotidovyacutech proacuteb (desať tisiacutec až milioacuten) ktoreacute suacute prichyteneacute na pevnyacute podklad najčastejšie sklenyacute silikoacutenovyacute alebo nylonovyacute (doštička čip) Skuacutemanaacute nukleovaacute kyselina je pred hybridizaacuteciou fragmentovanaacute označenaacute fluorofoacuterom a denaturovanaacute Po kontakte čipu s cieľovou vzorkou ktoraacute je vlastne zmes označenyacutech oligonukleotidov značeneacute oligonukleotidy hybridizujuacute s oligonukleotidovyacutemi sekvenciami prichytenyacutemi na čipe Potom suacute na zaacuteklade fluorescencie detekovaneacute miesta kde došlo k hybridizaacutecii čiže vzorka obsahovala takuacuteto nukleotidovuacute sekvenciu Z jedneacuteho mikročipu sa ziacuteska obrovskeacute množstvo daacutet ktoreacute je vždy nutneacute softveacuterovo spracovať V dnešnej dobe existuje niekoľko firiem poskytujuacutecich komerčne mikročipy na objednaacutevku alebo si ich laboratoacuteria produkujuacute sami

Mikročipovanie prebieha nasledovne

1) Vytvorenie DNA čipu ndash tisiacutece rocircznych jednovlaacuteknovyacutech DNA oligonukleotidov znaacutemych sekvencii sa kovalentne naviažu na povrch doštičky vždy v určitej lokalite je niekoľko rovnakyacutech oligonukleotidov veľkosť takejto lokality je ˂ 200 microm Proacutebami mocircže byť DNA cDNA alebo syntetizovaneacute oligonukleotidy Už hotoveacute mikročipy ponuacutekajuacute viacereacute firmy (Affymetrix Agilent Technologies Eppendorf Illumina) alebo si ich jednotliveacute laboratoacuteria vyraacutebajuacute sami pomocou robotickyacutech zariadeniacute DNA čip sa vytvaacutera buď nanaacutešaniacutem kvapiek oligonukleotidov na podklad alebo synteacutezou oligonukleotidov in situ na čipe 2) Priacuteprava vzorky ndash nukleovaacute kyselina (mRNA DNA) sa purifikuje určiacute sa jej kvantita a kvalita (spektrofotometericky) fragmentuje resp v priacutepade mRNA sa syntetizuje cDNA v priacutepade potreby sa mocircže DNA amplifikovať PCR reakciou štiepiť restrikčnyacutemi endonukleaacutezami 3) Fluorescenčneacute označenie (zriedkavejšie raacutedioaktiacutevne) fragmentov DNA prebieha počas reverznej transkripcie alebo PCR amplifikaacutecie za uacutečasti fluorescenčne značenyacutech nukleotidov Keď sa analyzujuacute dve rocirczne vzorky napr zdraveacute tkanivo a naacutedoroveacute tkanivo označenie nukleovyacutech kyseliacuten v tyacutechto tkanivaacutech byacuteva rozdielne a to použitiacutem dvoch rocircznych fluorescenčnyacutech farbiacutev (napr zeleneacute a červeneacute) Pred hybridizaacuteciou je potrebneacute vzorku denaturovať čiacutem sa vytvoriacute zmes jednovlaacuteknovyacutech DNA označenyacutech značkou 4) Hybridizaacutecia s mikročipom ndash v špeciaacutelnom hybridizačnom roztoku hybridizujuacute komplementaacuterne sekvencie zo vzorky s priacuteslušnyacutemi oligonukleotidovyacutemi sondami naviazanyacutemi na čipe Potom sa čip obmyje aby došlo k odstraacuteneniu čiastočne hybridizovanyacutech nukleovyacutech kyseliacuten 5) Skenovanie mikročipu ndash skenerom čipov docircjde k ožiareniu čipu laserom pričom v mieste hybridizaacutecie fluorescenčne značenyacutech DNA fragmentov s proacutebou docircjde k emisii svetla určitej vlnovej dĺžky ktoruacute skener zaznamenaacute 6) Analyacuteza daacutet prebieha metoacutedami bioinformatiky spracovaniacutem softveacutermi sa zistiacute ktoreacute lokality čipu navzaacutejom hybridizovali v priacutepade použitia dvoch vzoriek kontrolnej a skuacutemanej je možneacute analyzovať ich relatiacutevnu intenzitu hybridizaacutecie (expresie určiteacuteho geacutenu)

Existujuacute štyri typy mikročipov 1) Čipy ur čeneacute na analyacutezu expresie (obsahujuacute cDNA proacuteby) pre tzv dvojkanaacutelovyacute experiment kedy je vzorka určenaacute k hybridizaacutecii na čipe ziacuteskanaacute zmiešaniacutem DNA fragmentov kontrolnej a skuacutemanej vzorky pričom fragmenty suacute rozdielne fluorescenčne označeneacute (napr zelenyacute fluorofoacuter pre kontrolnuacute vzorku a červenyacute pre skuacutemanuacute) Na zaacuteklade intenzity a typu fluorescencie sa deteguje expresia geacutenov typickaacute pre kontrolnuacute vzorku (napr zelenaacute fluorescencia) pre skuacutemanuacute vzorku (napr

48

červenaacute fluorescencia) a expresia podobnaacute u oboch vzoriek (žltaacute fluorescencia) neexprimovaneacute geacuteny (čierna fluorescencia) rocirczne odtiene (v zaacutevislosti od prevažujuacutecej hybridizaacutecie) (obr 48) 2) Čipy ur čeneacute na analyacutezu mutaacutecii použije sa genoacutemovaacute DNA označenaacute jednou fluorescenčnou farbičkou na určenie jednonukleotidovej zmeny (SNP ndash Single Nukleotide Polymorphism) 3) Čipy na komparatiacutevnu genoacutemovuacute hybridizaacuteciu (aCGH array Comparative Genomic Hybridization) ndash použiacutevaneacute na zistenie zvyacutešenia alebo zniacuteženia množstva chromozoacutemovyacutech fragmentov obsahujuacutecich geacuteny zodpovedneacute za určiteacute ochorenie Na analyacutezu sa použije skuacutemanaacute gDNA a referenčnaacute (kontrolnaacute) DNA každaacute sa značiacute inou fluorescenčnou farbičkou (princiacutep ako pri analyacuteze expresie) (obr 49 50) 4) Čipy CGH - SNP kombinovaneacute čipy ur čeneacute na analyacutezu aj mutaacuteciiacute SNP aj na komparatiacutevnu genoacutemovuacute hybridizaacuteciu CGH

Mikročipy majuacute rozsiahle využitie napriacuteklad v identifikaacuteciiacute novyacutech geacutenov vo vyacuteskume ich funkciiacute expresie v rocircznych podmienkach pri diagnostike mnohyacutech ochoreniacute vo farmakogenomike vo vyacuteskume vplyvu toxiacutenov

Obr 48 Heatmapa geacutenovej expresie vybranyacutech geacutenov (mRNA) mikročip obsahuje 46000 cDNA proacuteb (poskytnuteacute Ing Helenou Gbelcovou PhD Uacutestav lekaacuterskej bioloacutegie genetiky a klinickej genetiky LF UK a UNB)

49

Obr 49 Princiacutep komparatiacutevnej genoacutemovej hybridizaacutecie (aCGH - array comparative genomic hybridization) Obr 50 A) Vyacutesledok komparatiacutevnej genoacutemovej hybridizaacutecie (aCGH - array comparative genomic hybridization) vzorky DNA izolovanej plodovej vody U plodu s abnormaacutelnym ultrasonografickyacutem vyšetreniacutem bola identifikovanaacute duplikaacutecia oblasti 3q261q29 (modryacute paacutes) a deleacutecia oblasti 5p1533p151 (červenyacute paacutes) Pre porovnanie chromozoacutem 1 bez aberaacutecie b) Ten istyacute pacient ale ineacute softveacuteroveacute spracovanie (poskytnuteacute RNDr Miroslavom Tomkom PhD Medirex)

50

Odporuacutečanaacute a použitaacute literatuacutera

Odborneacute knihy Klug W S Cummings M R Spencer Ch A Palladino M A Concepts of Genetics jedenaacuteste vydanie (2015) Carson S Molecular Biology Techniques tretie vydanie (2012) Strachan T Read A Human Molecular Genetics štvrteacute vydanie (2011) Sudbery P Sudbery I Human Molecular Genetics tretie vydanie (2009)

Internetoveacute straacutenky

wwwncbinlmnihgov wwwmlpacom wwwthermofishercom wwwilluminacom wwwpromegask wwwqiagencom wwwambioncom

Odborneacute člaacutenky Chacon-Cortes D Griffiths L R Methods for extracting genomic DNA from whole blood samples current perspectives Journal of Biorepository Science for Applied Medicine Volume 2 strany 1- 9 Viltrop T Krjutskov K Palta P Metspalu A Comparison of DNA extraction methods for multiplex polymerase chain reaction Anal Biochem 2010 Volume 398(2) strany 260-262 Ing Martin Čermaacutek Molekulaacuterna cytogenetika v problematike familiaacuternych maligniacutet Onkoloacutegia Volume 2 strany 77 - 83 Livak KJ Schmittgen TD Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method Methods 2001 Volume 25(4) strany 402 - 408 Bustin S A Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays J Mol Endocrinol 2000 Volume 25(2) strany169 - 193

MOLEKULAacuteRNE METOacuteDY AKTUAacuteLNE POUŽIacuteVANEacute V KLINICKEJ GENETIKE RNDr Andrea Pastoraacutekovaacute PhD RNDr Robert Petrovič PhD Vydala Univerzita Komenskeacuteho v Bratislave Lekaacuterska fakulta Rozsah 50 straacuten 246 AH prveacute vydanie ISBN 978-80-223-4231-5

48

červenaacute fluorescencia) a expresia podobnaacute u oboch vzoriek (žltaacute fluorescencia) neexprimovaneacute geacuteny (čierna fluorescencia) rocirczne odtiene (v zaacutevislosti od prevažujuacutecej hybridizaacutecie) (obr 48) 2) Čipy ur čeneacute na analyacutezu mutaacutecii použije sa genoacutemovaacute DNA označenaacute jednou fluorescenčnou farbičkou na určenie jednonukleotidovej zmeny (SNP ndash Single Nukleotide Polymorphism) 3) Čipy na komparatiacutevnu genoacutemovuacute hybridizaacuteciu (aCGH array Comparative Genomic Hybridization) ndash použiacutevaneacute na zistenie zvyacutešenia alebo zniacuteženia množstva chromozoacutemovyacutech fragmentov obsahujuacutecich geacuteny zodpovedneacute za určiteacute ochorenie Na analyacutezu sa použije skuacutemanaacute gDNA a referenčnaacute (kontrolnaacute) DNA každaacute sa značiacute inou fluorescenčnou farbičkou (princiacutep ako pri analyacuteze expresie) (obr 49 50) 4) Čipy CGH - SNP kombinovaneacute čipy ur čeneacute na analyacutezu aj mutaacuteciiacute SNP aj na komparatiacutevnu genoacutemovuacute hybridizaacuteciu CGH

Mikročipy majuacute rozsiahle využitie napriacuteklad v identifikaacuteciiacute novyacutech geacutenov vo vyacuteskume ich funkciiacute expresie v rocircznych podmienkach pri diagnostike mnohyacutech ochoreniacute vo farmakogenomike vo vyacuteskume vplyvu toxiacutenov

Obr 48 Heatmapa geacutenovej expresie vybranyacutech geacutenov (mRNA) mikročip obsahuje 46000 cDNA proacuteb (poskytnuteacute Ing Helenou Gbelcovou PhD Uacutestav lekaacuterskej bioloacutegie genetiky a klinickej genetiky LF UK a UNB)

49

Obr 49 Princiacutep komparatiacutevnej genoacutemovej hybridizaacutecie (aCGH - array comparative genomic hybridization) Obr 50 A) Vyacutesledok komparatiacutevnej genoacutemovej hybridizaacutecie (aCGH - array comparative genomic hybridization) vzorky DNA izolovanej plodovej vody U plodu s abnormaacutelnym ultrasonografickyacutem vyšetreniacutem bola identifikovanaacute duplikaacutecia oblasti 3q261q29 (modryacute paacutes) a deleacutecia oblasti 5p1533p151 (červenyacute paacutes) Pre porovnanie chromozoacutem 1 bez aberaacutecie b) Ten istyacute pacient ale ineacute softveacuteroveacute spracovanie (poskytnuteacute RNDr Miroslavom Tomkom PhD Medirex)

50

Odporuacutečanaacute a použitaacute literatuacutera

Odborneacute knihy Klug W S Cummings M R Spencer Ch A Palladino M A Concepts of Genetics jedenaacuteste vydanie (2015) Carson S Molecular Biology Techniques tretie vydanie (2012) Strachan T Read A Human Molecular Genetics štvrteacute vydanie (2011) Sudbery P Sudbery I Human Molecular Genetics tretie vydanie (2009)

Internetoveacute straacutenky

wwwncbinlmnihgov wwwmlpacom wwwthermofishercom wwwilluminacom wwwpromegask wwwqiagencom wwwambioncom

Odborneacute člaacutenky Chacon-Cortes D Griffiths L R Methods for extracting genomic DNA from whole blood samples current perspectives Journal of Biorepository Science for Applied Medicine Volume 2 strany 1- 9 Viltrop T Krjutskov K Palta P Metspalu A Comparison of DNA extraction methods for multiplex polymerase chain reaction Anal Biochem 2010 Volume 398(2) strany 260-262 Ing Martin Čermaacutek Molekulaacuterna cytogenetika v problematike familiaacuternych maligniacutet Onkoloacutegia Volume 2 strany 77 - 83 Livak KJ Schmittgen TD Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method Methods 2001 Volume 25(4) strany 402 - 408 Bustin S A Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays J Mol Endocrinol 2000 Volume 25(2) strany169 - 193

MOLEKULAacuteRNE METOacuteDY AKTUAacuteLNE POUŽIacuteVANEacute V KLINICKEJ GENETIKE RNDr Andrea Pastoraacutekovaacute PhD RNDr Robert Petrovič PhD Vydala Univerzita Komenskeacuteho v Bratislave Lekaacuterska fakulta Rozsah 50 straacuten 246 AH prveacute vydanie ISBN 978-80-223-4231-5

49

Obr 49 Princiacutep komparatiacutevnej genoacutemovej hybridizaacutecie (aCGH - array comparative genomic hybridization) Obr 50 A) Vyacutesledok komparatiacutevnej genoacutemovej hybridizaacutecie (aCGH - array comparative genomic hybridization) vzorky DNA izolovanej plodovej vody U plodu s abnormaacutelnym ultrasonografickyacutem vyšetreniacutem bola identifikovanaacute duplikaacutecia oblasti 3q261q29 (modryacute paacutes) a deleacutecia oblasti 5p1533p151 (červenyacute paacutes) Pre porovnanie chromozoacutem 1 bez aberaacutecie b) Ten istyacute pacient ale ineacute softveacuteroveacute spracovanie (poskytnuteacute RNDr Miroslavom Tomkom PhD Medirex)

50

Odporuacutečanaacute a použitaacute literatuacutera

Odborneacute knihy Klug W S Cummings M R Spencer Ch A Palladino M A Concepts of Genetics jedenaacuteste vydanie (2015) Carson S Molecular Biology Techniques tretie vydanie (2012) Strachan T Read A Human Molecular Genetics štvrteacute vydanie (2011) Sudbery P Sudbery I Human Molecular Genetics tretie vydanie (2009)

Internetoveacute straacutenky

wwwncbinlmnihgov wwwmlpacom wwwthermofishercom wwwilluminacom wwwpromegask wwwqiagencom wwwambioncom

Odborneacute člaacutenky Chacon-Cortes D Griffiths L R Methods for extracting genomic DNA from whole blood samples current perspectives Journal of Biorepository Science for Applied Medicine Volume 2 strany 1- 9 Viltrop T Krjutskov K Palta P Metspalu A Comparison of DNA extraction methods for multiplex polymerase chain reaction Anal Biochem 2010 Volume 398(2) strany 260-262 Ing Martin Čermaacutek Molekulaacuterna cytogenetika v problematike familiaacuternych maligniacutet Onkoloacutegia Volume 2 strany 77 - 83 Livak KJ Schmittgen TD Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method Methods 2001 Volume 25(4) strany 402 - 408 Bustin S A Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays J Mol Endocrinol 2000 Volume 25(2) strany169 - 193

MOLEKULAacuteRNE METOacuteDY AKTUAacuteLNE POUŽIacuteVANEacute V KLINICKEJ GENETIKE RNDr Andrea Pastoraacutekovaacute PhD RNDr Robert Petrovič PhD Vydala Univerzita Komenskeacuteho v Bratislave Lekaacuterska fakulta Rozsah 50 straacuten 246 AH prveacute vydanie ISBN 978-80-223-4231-5

50

Odporuacutečanaacute a použitaacute literatuacutera

Odborneacute knihy Klug W S Cummings M R Spencer Ch A Palladino M A Concepts of Genetics jedenaacuteste vydanie (2015) Carson S Molecular Biology Techniques tretie vydanie (2012) Strachan T Read A Human Molecular Genetics štvrteacute vydanie (2011) Sudbery P Sudbery I Human Molecular Genetics tretie vydanie (2009)

Internetoveacute straacutenky

wwwncbinlmnihgov wwwmlpacom wwwthermofishercom wwwilluminacom wwwpromegask wwwqiagencom wwwambioncom

Odborneacute člaacutenky Chacon-Cortes D Griffiths L R Methods for extracting genomic DNA from whole blood samples current perspectives Journal of Biorepository Science for Applied Medicine Volume 2 strany 1- 9 Viltrop T Krjutskov K Palta P Metspalu A Comparison of DNA extraction methods for multiplex polymerase chain reaction Anal Biochem 2010 Volume 398(2) strany 260-262 Ing Martin Čermaacutek Molekulaacuterna cytogenetika v problematike familiaacuternych maligniacutet Onkoloacutegia Volume 2 strany 77 - 83 Livak KJ Schmittgen TD Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method Methods 2001 Volume 25(4) strany 402 - 408 Bustin S A Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays J Mol Endocrinol 2000 Volume 25(2) strany169 - 193

MOLEKULAacuteRNE METOacuteDY AKTUAacuteLNE POUŽIacuteVANEacute V KLINICKEJ GENETIKE RNDr Andrea Pastoraacutekovaacute PhD RNDr Robert Petrovič PhD Vydala Univerzita Komenskeacuteho v Bratislave Lekaacuterska fakulta Rozsah 50 straacuten 246 AH prveacute vydanie ISBN 978-80-223-4231-5

MOLEKULAacuteRNE METOacuteDY AKTUAacuteLNE POUŽIacuteVANEacute V KLINICKEJ GENETIKE RNDr Andrea Pastoraacutekovaacute PhD RNDr Robert Petrovič PhD Vydala Univerzita Komenskeacuteho v Bratislave Lekaacuterska fakulta Rozsah 50 straacuten 246 AH prveacute vydanie ISBN 978-80-223-4231-5