UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA

UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUAINGENIERIA AGROINDUSTRIALDOCENTE: NILS L. HUAMAN CASTILLA CURSO. QUMICA DE ALIMENTOSUNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA

CARRERA PROFESIONAL DE INGENIERIA AGROINDUSTRIAL

CURSOBIOQUIMICA DE ALIMENTOS

GUIA DE LABORATORIOCARACTERIZACION DE ANTOCIANIDINAS

2015

PRACTICA DE LABORATORIO EXTRACCION DE ANTOCIANINAS E IDENTIFICACION DE ANTOCIANIDINAS

I. OBJETIVOS

Extraer antocianinas, obtener e identificar antocianidinas.

II. FUNDAMENTO

Las antocianinas son un grupo de pigmentos solubles en agua ampliamente difundidas en el reino vegetal; son responsables del color atractivo que presentan muchos productos, como frutas, hortalizas, tubrculos, races y flores. El color de las antocianinas vara desde el rosado hasta el azul oscuro. Su incorporacin en alimentos tiene la ventaja de no solo impartir color, sino tambin por sus propiedades antioxidantes que poseen, se pueden considerar como alimentos funcionales. Su estructura qumica se caracteriza por un esqueleto carbonatado C6C3C6, posee dos anillos aromticos, unidos por un puente de tres carbonos a los cuales pueden estar unidos a uno o ms grupos hidroxilos, siendo esta la estructura bsica de todo polifenol.

Cuando se hidroliza la mitad del azcar de una antocianina, el aglicn (el producto no azcar de la hidrlisis) se conoce con el nombre de antocianidina. Se conocen 20 antocianidinas, pero solo 6 son importantes en los alimentos: cianidina, peonidina, pelargonidina, malvidina, delfinina y petunidina.

La utilizacin de estos compuestos como pigmentos se ha limitado por su susceptibilidad, entre otros factores, al pH y a la temperatura. De acuerdo al valor del pH, se presenta una variacin del color que adquieren las antocianinas cuando estn en solucin. Por consiguiente, es posible observar un color rojo o anaranjado a pH acido de aproximadamente 2 menor, con un pH de 5 la antocianina es incolora y cuando el pH se incrementa por arriba de 7, la antocianina se degrada de forma irreversible.

El descubrimiento de antocianinas de tipo acilado, que son mas estables a cambios de temperatura y pH que las no aciladas, ha venido a reactivar nuevamente la bsqueda de fuentes naturales de estos compuestos para su uso como pigmentos de los alimentos.

III. MATERIALES Y METODOS

3.1. MATERIALES

Materia prima Fuente de antocianina. Sugerencia: Oca morada.

Reactivos HCl 2N Metanol Etil Acetato Metanol acidificado: 0.01% (v/v) de HCl en metanol. Agua acidificada: 0.01% (v/v) Acetonitrilo grado HPLC Acido frmico Agua extrapura (Agua MiliQ) Estndares de antocianidina

Materiales Cartuchos C18 (con adsorbente C18 enlazado en silica: C18 Sep-Pack Cartidhe (360 mg de adsorbente, Waters Chromatography: ODS-4 Octadecyl Silane (500 mg adsorbente) o equivalentes. Material de vidrio: Pipetas de 10 ml, beaker de 20,50ml, embudo buchner

Equipos Balanza Analtica Rotavapor Sistema HPLC Filtros 0.45 m

3.2. METODOS

3.2.1. PROCESO DE EXTRACCIN DE ANTOCIANINAS

Este es el mtodo clsico de extraccin de antocianinas de los materiales vegetales. Este procedimiento consiste en la maceracin o empapado del material vegetal en metanol que contiene una pequea concentracin de cidos minerales (por ejemplo, HCl). La extraccin con metanol es un mtodo fcil, rpido y eficiente para la extraccin de antocianinas. Sin embargo se obtiene un extracto acuoso crudo con varios contaminantes y la evaporacin del metanol puede provocar una hidrlisis por ruptura de enlaces acilos lbiles lo cual podra agravarse por la presencia de HCl. Si fuera el caso ensayar otros mtodos de extraccin (por ejemplo extraccin por el mtodo de particin con acetona y cloroformo)

Tomar 50 60 g de muestra Homogenizar el material con dos volmenes de metanol acidificado (p/v) proteger en todo momento de la luz. Dejar la muestra una hora con agitacin continua de lo contrario 24 horas bajo refrigeracin. Filtrar en un embudo buchner con papel Whatman No. 1. Reextraer en el residuo con suficiente solucin de metanol acidificado hasta agotar el residuo. Combinar y concentrar el filtrado bajo vacio a 40 C en un rotavapor. Deber evitarse tiempos prolongados en esta etapa para minimizar la degradacin del pigmento. Redisolver el residuo remanente con una solucin acuosa de HCL al 0.01%. Si la muestra no es analizada de forma inmediata se recomienda almacenar a 18C.

3.2.2. PURIFICACIN DE ANTOCIANINAS

Esta operacin es necesaria antes de la identificacin debido a que los solventes usados en la extraccin no son especficos para las antocianinas. Considerables cantidades de materiales acompaantes pueden ser tambin extraidos y concentrados con los extractos coloreados, los cuales pueden influir en la estabilidad y/o anlisis de estos pigmentos (Jackman y Smith, 1996). La purificacin de antocianinas usando la metodologa de extraccin en fase slida permite la remocin de varios componentes de interferencia en el extracto crudo. Mini columnas conteniendo cadenas C-18 enlazadas en silica retienen componentes orgnicos hidrofbicos (antocianinas, fenlicos), permitiendo el paso de interferentes como azcares y cidos. El lavado posterior de los pigmentos retenidos con acetato de etilo permite la remocin de otros compuestos fenlicos diferentes a la antocianina. Este proceso de purificacin puede observarse esquemticamente en la Figura 1.

Figura 2. Purificacin de antocianinas.

Activar el cartucho pasando dos volmenes de columna de metanol y tres volmenes de agua desionizada acidificada Inyectar el extracto acuoso de antocianina. El volumen de la muestra aplicada depender principalmente de la cantidad de muestra, el contenido de antocianina y la cantidad de absorbente empacado en el cartucho. Usualmente un volumen de muestra de 5 a 10 ml es usado para cartuchos de extraccin fase slida conteniendo 360 mg de absorbente. Sin embargo esto deber ajustarse para cada caso en particular. Lavar el cartucho con dos volmenes de agua acidificada para remover los componentes no adsorbidos (azcar, acidos y otros solubles) Seguidamente pasar por el cartucho dos volmenes de acetato de etilo para remover componentes polifenlicos tales como cidos fenlicos y favonoles. Extraer las antocianinas adsorbidas en el cartucho con solucin de metanol acidificado y colectar en un baln de vidrio. Remover el metanol en un rotavapor a 40C bajo vacio. Redisolver el pigmento en agua acidulada. Almacenar el extracto purificado a 4 C si ser analizado en las prximas 24 horas, para periodos ms prolongados almacenar bajo congelacin a 15C o mas bajas temperaturas.

IV. RESULTADOS Y DISCUSIONESAnalizar los espectros de absorcin y discutir todos los resultados obtenidos en base a otras investigaciones revisadas.

V. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

VI. BIBLIOGRAFA

1. Cevallos Casals, B. y Cisneros Zevallos, L. (2003). Stoichiometric and Kinetic Studies of Phenolic Antioxidants from Andean Purple Corn and Red-Fleshed Sweet potato. J. Agric. Food Chem. Vol. 51. pp. 3313 3319.2. Giusti MM and Wolrstad RE., (2001). Anthocyanins. Characterization and measurement with UV-Visible Spectroscopy. In Current protocols in Food Analytical Chemistry; Wrolstad, R.E., Ed.; John Wiley & Sons: New York.3. Jakman, R.L. y Smith. J.l. 1996. Anthocyanins and betalains. In Natural Food Colorant, 2nd ed. (G.A.F. Hendry and J.D. Houghton, eds) pp. 244-309. Blackie and Son.Ltd.,London.