modeliranje vpliva cikliČnega gvanozin ...ne besede: fizikalno-matematični model, ciklični...
TRANSCRIPT
MODELIRANJE VPLIVA CIKLIČNEGA
GVANOZIN MONOFOSFATA NA MEHANIZME
IZMENJAVE KALCIJA MED CITOPLAZMO IN
SARKOPLAZEMSKIM RETIKULUMOM TER
NA RAZVOJ SILE V GLADKI MIŠICI ARTERIJ
Diplomski seminar na študijskem programu 1. stopnje Fizika
Tanja Vajs
Mentor: doc. dr. Aleš Fajmut
Maribor, 2017
ii
ZAHVALA
Iskreno se zahvaljujem mentorju doc. dr. Alešu Fajmutu za vso znanje, trud, potrpežljivost in
za ves čas, ki mi ga je posvetil pri izdelavi diplomskega seminarja.
Zahvaljujem se staršema Nadi in Milanu, ki sta mi omogočila študij in me pri tem ves čas
podpirala ter mi stala ob strani. Hvala tudi Lorisu, sestri Bernardi in babici Angeli za vso
podporo in vzpodbudo.
iii
VAJS, T.: Modeliranje vpliva cikličnega gvanozin monofosfata na mehanizme izmenjave
kalcija med citoplazmo in sarkoplazemskim retikulumom ter na razvoj sile v gladki mišici
arterij
Diplomski seminar, Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in matematiko, Oddelek
za fiziko, 2017.
POVZETEK
V delu predstavimo nadgradnjo fizikalno-matematičnega modela za razlago od cikličnega
gvanozin monofosfata (cGMP) odvisno relaksacijo gladke mišične celice arterije pod vplivom
holinergične stimulacije. Model, ki ga v tem delu nadgrajujemo, je ustrezno napovedal
relaksacijo pri nizkih, ne pa tudi pri visokih vrednostih koncentracije cGMP. Model
nadgradimo tako, da upoštevamo še vpliv cGMP na aktivnost črpanja Ca2+ iz citoplazme celice
v sarkoplazemski retikulum (SR) skozi črpalke Ca2+-ATP-aze (SERCA), vpliv cGMP na od
Ca2+ in inozitol 1,4,5-trifosfata (IP3) odvisen izpust Ca2+ iz SR v citoplazmo celice skozi IP3
receptorske kanale (IP3-R) oz. t.i. kanale tipa ICICR ter vpliv cGMP na aktivnost encima
fosfataze lahkih verig miozina. Izkaže se, da je najbolj ključna prva nadgradnja, saj izniči
neželeni porast sile pri visokih vrednostih koncentracije cGMP, tretja nadgradnja pa dodatno
prispeva k izničenju koničastih porastov sile v področju fizioloških koncentracij cGMP. Vpliv
druge nadgradnje je zanemarljiv.
Ključne besede: fizikalno-matematični model, ciklični gvanozin monofosfat, kalcij, dušikov
oksid, znotrajcelična signalizacija, kontrakcija, relaksacija, gladke mišične celice žil, arterija.
ABSTRACT
In this work we present an upgrade of the mathematical model for the interpretation of the cyclic
guanosine monophosphate (cGMP)-dependent relaxation of the arterial smooth muscle cells
under the influence of cholinergic stimulation. The model, which is being upgraded in this
work, properly predicted relaxation at low, but not at high concentration of cGMP. In the
upgraded model we additionally consider the effect of cGMP on the activity of Ca2+ pumping
from the cytoplasm into the sarcoplasmic reticulum (SR) through the Ca2+-ATPases (SERCA),
the effect of cGMP on the Ca2+ and the inositol 1,4,5-triphosphate (IP3) dependent release of
Ca2+ from the SR into the cytoplasm through the IP3 receptor channels (IP3-R) or the so called
ICICR channels as well as the effect of cGMP on the myosin light chain phosphatase activity.
It turns out that the first upgrade is the most important one since it eliminates the unwanted
increase of force at high cGMP concentrations, while the third upgrade additionally smooths
sharp peaks in the force dependency within the interval of physiological cGMP concentrations.
The effect of the second upgrade is negligible.
Key words: mathematical model, cyclic guanosine monophosphate, calcium, nitric oxide,
intracellular signalling, contraction, relaxation, vascular smooth muscle cells, artery.
iv
POGOSTO UPORABLJENE OKRAJŠAVE
OKRAJŠAVA POLNO IME OPIS
ACh acetilholin nevrotransmiter v holinergičnih
sinapsah
CaM kalmodulin beljakovina z visoko afiniteto za
Ca2+ ione
cAMP ciklični adenozin monofosfat nukleotidni sekundarni prenašalec
cGK
od cGMP odvisne proteinske kinaze
(ang. cGMP-dependent protein
kinases)
družina encimov od cGMP
odvisnih proteinskih kinaz
cGMP ciklični gvanozin monofosfat nukleotidni sekundarni prenašalec
eNOS endotelijska sintaza dušikovega
oksida
encim, ki v endoteliju proizvaja
dušikov oksid NO
iNOS inducibilna sintaza dušikovega
oksida
oblika encima NOS, ki se inducira
v celicah in ni konstitutivno
izražena
nNOS nevronska sintaza dušikovega oksida encim, ki v nevronih proizvaja
dušikov oksid NO
ER/SR endoplazemski/sarkoplazemski
retikulum celični organel, shramba za Ca2+
GMC gladka mišična celica
GTP gvanozin trifosfat nukleotid
ICICR/IP3-R
IP3-receptorski kanal;
(ang. IP3 and Ca2+ induced Ca2+
release)
receptorski kanal na membrani
ER/SR, katerega odprtost
modulira količina IP3 in Ca2+ v
celici
IP3 inozitol 1,4,5-trifosfat sekundarni prenašalec, ki se veže
na IP3-R receptor kanalov ICICR
IRAG z IP3-R-povezan substrat za encim
PKG
protein, ki je povezan s kanalom
IP3-R in se fosforilira pod
vplivom encima PKG
L-Arg L-arginin aminokislina, ki je substrat za
encim NOS, ki proizvaja NO
MLC lahke verige miozina;
(ang. myosin light chain)
del proteina miozina, ki
predstavlja mesto fosforilacije
miozina
MLCK encim kinaza lahkih verig miozina fosforilira lahke verige miozina
(MLC)
MLCP encim fosfataza lahkih verig miozina defosforilira lahke verige miozina
NO dušikov oksid signalna molekula v celicah
evkariotov (plin)
v
PKA proteinska kinaza A od cAMP odvisna proteinska
kinaza
PKG proteinska kinaza G od cGMP odvisna proteinska
kinaza
PLB fosfolamban protein v pentamerni obliki, ki je
povezan s črpalkami SERCA
SERCA
Ca2+-ATP-aza sarkoplazemskega/
endoplazemski retikuluma;
(ang. sarco-endoplasmic reticulum
calcium ATPase)
črpalka za Ca2+ ione v SR/ER
sGC v vodi topna gvanilat ciklaza encim, ki ob aktivaciji z NO
producira cGMP
vi
Kazalo vsebine
1 Uvod ........................................................................................................................................ 1
2 Teoretično ozadje obravnavane teme ...................................................................................... 3
3 Izhodiščni model za od kalcija odvisni razvoj sile v gladkih mišicah celic arterij pod vplivom
cGMP ...................................................................................................................................... 5
3.1 Tokovi kalcija preko membrane sarkoplazemskega retikuluma ...................................... 8
3.2 Modeliranje razvoja sile v gladki mišični celici arterij .................................................. 10
4 Nadgrajeni model .................................................................................................................. 11
4.1 Tok kalcija skozi črpalke SERCA .................................................................................. 11
4.2 Tok kalcija skozi od IP3 odvisne kanale ICICR ............................................................. 14
4.3 Razvoj sile v gladki mišični celici - vpliv na encim MLCP oz. defosforilacijo ............ 17
5 Rezultati in razprava .............................................................................................................. 19
6 Zaključek ............................................................................................................................... 24
1
1 Uvod
Stene arterij v grobem sestavljajo tri plasti (slika 1). Zunanja plast vsebuje pretežno vezivno
tkivo, katerega glavni gradnik je kolagen, srednja plast je sestavljena pretežno iz gladke
mišičnine in elastičnega tkiva, na lumen žile, po katerem se pretaka kri, pa meji plast endotelnih
celic. Že v začetku druge polovice prejšnjega stoletja so ugotovili, da endotelna plast ključno
prispeva k regulaciji tonusa žile. Ugotovili so, da odstranjena endotelna plast onemogoča
relaksacijo žilne stene. Molekul, ki jih tvori endotelna plast in ki najbolj bistveno vplivajo na
regulacijo tonusa žile, dolgo časa niso poznali. Poimenovali so jih kar endotelijsko pridobljeni
relaksacijski faktor (ang. endothelial-derived relaxing factor, EDRF). Šele v 80-ih letih
prejšnjega stoletja pa so odkrili, da je ključna molekula, ki je odgovorna za relaksacijo žilnih
sten, plin dušikov oksid (NO). Produkcijo molekule NO lahko sprožijo mehanska stimulacija
ob spremembi strižne napetosti krvi na stene žile, hormoni, živčni prenašalci in drugi
biokemijski stimuli. NO je ena izmed najmanjših, najbolj enostavnih, najhitreje difundirajočih,
a razmeroma kratkoživih biološko aktivnih molekul. Ima vlogo nadziranja in reguliranja
mnogih funkcij in mehanizmov v celicah. V endotelnih celicah žil nastaja v encimski reakciji
iz aminokisline L-arginin, ki jo katalizirata encima endotelijska sintaza dušikovega oksida
(eNOS) in inducibilna sintaza dušikovega oksida (iNOS). Obstaja še tretja izoforma tega
encima, ki se nahaja v nevronih (nNOS). NO nato iz endotelne plasti z difuzijo prehaja v gladke
mišične celice (GMC) žilne stene, kjer učinkuje kot njihov relaksant [1, 2].
Slika 1. Prečni prerez človeške arterije [3]
Motnje v produkciji in signalizaciji molekule NO povezujejo z razvojem številnih srčno-žilnih
bolezni, kot so hipertenzija, ateroskleroza, srčna in možganska kap, pljučna hipertenzija,
erektilna motnja idr. [1]. V zadnjem času pa spoznavajo tudi velik potencial v molekuli NO pri
diagnosticiranju in zdravljenju raznih drugih kroničnih bolezni, kot sta npr. astma in sladkorna
bolezen.
2
Vpliv molekule NO na mehanizem relaksacije gladke mišičnine žilnih sten večinoma ni
direkten, temveč poteka preko aktivacije encima topne gvanilat ciklaze (sGC), ki v GMC
producira posrednega prenašalca ciklični gvanozin monofosfat (cGMP). Slednji ima številne
učinke na mehanizme, ki regulirajo kontrakcijo/relaksacijo gladke mišičnine v steni arterije.
Učinki so lahko direktni ali posredni preko številnih fosforilacij drugih proteinov, ki jih
regulirajo različne izoforme encima - od cGMP odvisne proteinske kinaze (cGK). Te
mehanizme bomo z modelom teoretično proučevali in analizirali v diplomskem seminarju.
Prvi znanstveniki, ki so se ukvarjali z raziskovanjem signalne poti molekule NO, so leta 1968
odkrili strukturo in vlogo prvega nukleotidnega sekundarnega prenašalca cAMP, ki ima zelo
pomembno signalizacijsko vlogo, saj aktivira proteinsko kinazo (PKA), ki ima ključno vlogo
pri različnih presnovnih in kontraktilnih mehanizmih, med drugim tudi v srcu. Za to odkritje je
bila podeljena Nobelova nagrada. Leto kasneje so odkrili še drugi ciklični nukleotid cGMP, ki
aktivira drugi tip proteinske kinaze (PKG oz. cGK). Istega leta je bil odkrit in delno opisan tudi
encim, ki katalizira produkcijo cGMP iz gvanozin trifosfata (GTP), t. j. topna gvanilat ciklaza.
Leta 1979 so izvedli prvi eksperiment, s katerim so pokazali direkten vpliv NO na relaksacijo
GMC žil. Relaksacija je bila povezana z aktivacijo sGC in tvorbo cGMP. Ugotovili so, da lahko
kajenje tobaka, katerega dim vsebuje 800 ppm NO, aktivira sGC in povzroči relaksacijo gladke
mišičnine žil. Leta 1981 so pokazali, da izoliran NO aktivira sGC, kar je povzročilo povišanje
koncentracije cGMP in posledično relaksacijo gladkih mišic žil [1]. Za ta odkritja je bila
raziskovalcem Robertu F. Furchgottu, Louisu J. Ignarru in Feridu Muradu leta 1998 podeljena
Nobelova nagrada.
Do sedaj s fizikalno-matematičnimi modeli še ni bilo moč v celoti razložiti vseh mehanizmov,
ki bi ob povišani koncentraciji NO ([NO]) in s tem posledično tudi ob povišani koncentraciji
cGMP ([cGMP]) v GMC napovedali relaksacijo GMC, kar je bilo eksperimentalno nedvomno
potrjeno [1]. Zato v tem delu obravnavamo nadgradnjo obstoječega modela, ki ga je v
magistrskem delu, ki je nastalo na Oddelku za fiziko FNM UM, obravnavala Nina Šutar [4]. Ta
model pa temelji na do sedaj najbolje poznanih mehanizmih učinka cGMP na regulacijo
koncentracije znotrajceličnega kalcija ([Ca2+]) (Jacobsen in sod. [5] ter Kapela in sod. [6]), pri
čemer ta dva modela za razliko od modela v [4] ne opisujeta vseh mehanizmov in tudi ne učinka
cGMP na razvoj sile. Tudi model [4] ni popoln, saj ustrezno napove relaksacijo zgolj pri nizkih
ne pa tudi pri visokih vrednostih [cGMP]. Razlog za to je, da tako modela Jacobsena in Kapele
kot tudi obstoječi model, opisan v [4], ne upoštevajo nekaterih manj raziskanih mehanizmov
vpliva cGMP na regulacijo koncentracije znotrajceličnega kalcija ([Ca2+]) in na regulacijo
kontraktilnega mehanizma v GMC. Zato se v tem delu osredotočimo na modeliranje le-teh. Prvi
izmed mehanizmov, ki ga omenja literatura [7], a še ni bil eksplicitno modeliran, je vpliv cGMP
na aktivnost črpanja kalcija (Ca2+) iz citoplazme celice v sarkoplazemski retikulum (SR), ki je
znotrajcelična shramba za Ca2+ v GMC. Drugi tak mehanizem [8] je vpliv cGMP na od Ca2+ in
inozitol 1,4,5-trifosfata (IP3) odvisen izpust Ca2+ iz SR v citoplazmo celice skozi IP3 receptorske
kanale (IP3-R) oz. t.i. kanale tipa ICICR (ang. IP3 and Ca2+ induced Ca2+ release). Tretji
mehanizem, ki ga omenja literatura [2], in še tudi ni bil eksplicitno upoštevan v tovrstnih
modelih, pa je vpliv cGMP na aktivnost encima fosfataza lahkih verig miozina (MLCP), ki
defosforilira miozinske molekule in s tem zmanjšuje število na aktin pripetih in aktivnih prečnih
3
mostičkov, ki generirajo silo v GMC. Prva dva izmed treh opisanih učinkov cGMP vplivata na
regulacijo koncentracije znotrajceličnega Ca2+ in se nahajata na ravni kodacije signala Ca2+,
medtem ko je tretji učinek na ravni kontraktilnega mehanizma, kjer poteka dekodacija signala
Ca2+.
Cilj diplomskega seminarja je ugotoviti, kateri izmed teh treh predlaganih mehanizmov lahko
dodatno pojasni relaksacijo GMC pri višjih koncentracijah cGMP. V ta namen bomo obstoječi
model postopno nadgrajevali s posameznimi mehanizmi, t. j. z nadgradnjo opisov tokov Ca2+
preko črpalk Ca2+-ATP-az v SR (SERCA; ang. Sarco-Endoplasmic reticulum calcium ATPase)
in skozi kanale IP3-R v odvisnosti od cGMP ter z dodatnim opisom posredne regulacije
aktivnosti encima MLCP preko cGMP. Nadgrajeni model, ki bi v celoti pojasnil relaksacijsko
vlogo cGMP, bi omogočil izgradnjo celostnega modela signalne poti NO v stenah arterij.
V nadaljevanju najprej opišemo signalno pot NO (poglavje 2). Sledi kratek povzetek tistega
dela obstoječega fizikalno-matematičnega modela [4], ki ga bomo tukaj nadgradili (poglavje
3), in opis nadgradnje tega modela (poglavje 4). Nato sledijo prikaz in analiza rezultatov
nadgrajenega modela ter primerjava s predhodnim modelom (poglavje 5) ter zaključek
(poglavje 6).
2 Teoretično ozadje obravnavane teme
Sintezo molekule NO v endotelnih celicah žil sprožijo kemični (npr. hormoni, acetilholin
(ACh), bradikinin) ali mehanski stimuli (npr. strižna napetost krvi na površini endotelne plasti
žil). Le-ti vplivajo na aktivacijo encima eNOS, ki poteka ali preko vezave kompleksa
Ca2+/kalmodulin (Ca2+/CaM) nanj ali preko njegove fosforilacije z od cAMP odvisno
proteinsko kinazo (PKA) (slika 2). NO nastaja kot stranski produkt encimske reakcije, v kateri
se aminokislina L-arginin (L-Arg) s pomočjo aktivne oblike eNOS pretvarja v citrulin.
Molekula NO nato difundira preko membran v GMC, kjer aktivira encim sGC. Aktivna oblika
tega encima pa katalizira pretvorbo GTP v cGMP in pirofosfat (slika 2) [2].
NO preko sekundarnega prenašalca cGMP posredno regulira delovanje cGK in proteinov
ionskih kanalov, ki regulirajo pretok različnih ionov (Ca2+, Na+, K+, Cl-) preko celične
membrane [2].
Po pregledu različnih virov naj bi sekundarni prenašalec cGMP sam ali pa posredno preko
aktivne oblike encima PKG in deloma tudi preko encima PKA vplival na regulacijo
prepustnosti od Ca2+ odvisnih kanalov za K+ in Cl- na celični membrani, na aktivnost
izmenjevalcev Na+/Ca2+ in aktivnosti črpalk Na+/K+-ATP-az na celični membrani. Vpliva pa
tudi na regulacijo prepustnosti kanalov tipa L za Ca2+ na celični membrani (posredno preko
encima PKA – kontraktilni učinek), na aktivnost encima MLCK (posredno preko encima PKA
– relaksacijski učinek) in encima MLCP, na prepustnost kanalov ICICR v SR in aktivnosti
črpalk SERCA na SR. Z regulacijo vseh navedenih mehanizmov se zmanjša koncentracija Ca2+
4
v citoplazmi in odzivnost kontraktilnega mehanizma na Ca2+, kar oboje posledično vodi do
relaksacije GMC arterij (slika 2) [1, 2, 5, 6].
Slika 2. Signalna pot dušikovega oksida (NO). Pomen oznak: acetil holin (ACh), ciklični adenozin monofosfat
(cAMP), ciklični gvanozin monofosfat (cGMP), črpalka Ca2+-ATP-aza v celični membrani (PMCA; ang. plasma
membrane Ca2+-ATPase), črpalka Ca2+-ATP-aza v membrani sarkoplazemskega retikuluma (SERCA), encim
fosfataza lahkih verig miozina (MLCP), encim kinaza lahkih verig miozina (MLCK), endotelijska sintaza
dušikovega oksida (eNOS), fosfolamban (PLB), gvanozin trifosfat (GTP), inozitol 1,4,5-trifosfat (IP3), IP3-
receptorski kanal (IP3-R) oz. t.i. kanal tipa ICICR (ang. IP3 and Ca2+ induced Ca2+ release), kompleksi
Ca2+/kalmodulin (Ca2+/CaM), L-arginin (L-Arg), molekula kisika (O2), napetostno odvisni Ca2+ kanali (VOCC;
ang. voltage-operated calcium channels), protein kinaza A (PKA), protein kinaza G (PKG) in topna gvanilat
ciklaza (sGC), ioni natrija (Na+), klora (Cl-), kalcija (Ca2+) in kalija (K+) [2, 7, 9].
Vsi učinki cGMP oz. PKG na ionske kanale, izmenjevalce in črpalke bodisi na membrani celice,
bodisi na membrani SR naj bi vodili do znižanja koncentracije znotrajceličnega Ca2+. S
koncentracijo Ca2+ je namreč povezana magnituda sile v GMC. Če je koncentracija Ca2+ višja,
5
se razvije večja sila (do saturacije). Od količine Ca2+ je namreč odvisna količina aktivne oblike
encima MLCK, na katerega se vežejo kompleksi Ca2+/CaM in ga aktivirajo. Encim MLCK pa
fosforilira lahke verige miozina (MLC) oz. poenostavljeno kar miozin. Le fosforiliran miozin
pa lahko aktivno generira silo v GMC. Vsi mehanizmi, ki torej zmanjšujejo količino Ca2+ v
celici, vodijo do relaksacije GMC (če ni drugih mehanizmov, ki bi vplivali na kontrakcijo
GMC).
V manjši meri lahko cGMP aktivira tudi encim PKA, ki ga sicer primarno aktivira cAMP.
Aktivna oblika encima PKA fosforilira encim MLCK, kar zmanjša afiniteto do kompleksov
Ca2+/CaM in posledično se zmanjša hitrost fosforilacije miozina, kar vodi do relaksacije
(slika 2) [3, 10]. Ker pa naj bi aktivna oblika encima PKA povečevala prepustnost kanalov tipa
L za Ca2+ na celični membrani, bi se naj ta dva mehanizma nekako izničila. Drugače pa je v
GMC dihalnih poti, kjer kanali tipa L niso tako izraženi. Tam ima aktivacija encima PKA
močan relaksacijski učinek, kar se s pridom izkorišča za bronhodilacijo z beta-adrenergičnimi
agonisti.
Aktivna oblika encima PKG na specifičnih mestih fosforilira encim MLCP. Razlika med
fosforilacijo encimov MLCK in MLCP je v tem, da se ob fosforilaciji aktivnost encima MLCP
poviša, medtem ko se aktivnost encima MLCK zniža. Oba procesa pa vodita do relaksacije.
Mehanizem tovrstne aktivacije encima MLCP je precej zapleten, pa vendar ga z nekaj besedami
opišimo. Encim MLCP je v času holinergične stimulacije, ki je najpogostejša vrsta stimulacije
GMC žil, delno inhibiran. Ob tovrstni stimulaciji se namreč aktivirajo različni encimi (RhoK,
ZipK, PKC…), ki fosforilirajo encim MLCP na specifičnih mestih, ta fosforilirana mesta na
encimu MLCP pa zaradi konformacijskih značilnosti encima predstavljajo substrat za
katalitično podenoto encima samega. To pomeni, da encim defosforilira samega sebe, namesto
da bi defosforiliral miozin oz. MLC. S tem je zmanjšana hitrost defosforilacije miozina, kar
vodi do razvoja večje sile v GMC. Vloga encima PKG v tem procesu pa je, da aktivna oblika
encima PKG fosforilira encim MLCP na takih specifičnih mestih na encimu, ki onemogočajo
fosforilacijo encima MLCP na avtoinhibitornih mestih. Na ta način se zviša aktivnost encima
MLCP in posledično zviša tudi hitrost defosforilacije miozina, kar vodi do relaksacije.
V tem delu se bomo osredotočili na modeliranje vpliva cGMP na prepustnost kanalov ICICR
za izpust Ca2+ iz SR, na aktivnost SERCA za črpanje Ca2+ v SR in na aktivnost encima MLCP,
ki fosforilira miozin in vpliva na količino na aktin pripetih miozinskih glav, ki aktivno
generirajo silo.
3 Izhodiščni model za od kalcija odvisni razvoj sile v gladkih mišicah celic
arterij pod vplivom cGMP
Model [4], obravnavan v magistrskem delu Nine Šutar, je bil delno povzet po modelu Jacobsena
in sod. [5] ter Kapele in sod. [6], nekatere mehanizme pa so v magistrskem delu modelirali
sami. Modela Jacobsena in sod. ter Kapele in sod. obravnavata zgolj znotrajcelično kalcijevo
6
signalizacijo, model v magistrskem delu Nine Šutar, ki ga v tem delu vzamemo za izhodiščni
model, ki ga bomo nadgradili, pa vključuje tudi model za razvoj sile. Enačbe bomo reševali
numerično z metodo Runge Kutta 4. reda v programu Berkely Madonna 8.3.18 [4].
Razlog za nadgradnjo izhodiščnega modela je, da le-ta ne napove ustrezno magnitude sile pri
visokih koncentracijah cGMP v celici. Model ustrezno napove padec sile z višanjem
koncentracije cGMP zgolj v področju nizkih vrednosti, tj. med približno 0,01 in 6 mmol/m3, ne
pa tudi pri visokih vrednostih, tj. med približno 6 in 100 mmol/m3 (slika 3) [4]. Za enoto
koncentracije v nadaljevanju ves čas uporabljamo zapis mol/m3, pri čemer je 1 mmol/m3 enako
1 µmol/L, kar se krajše zapiše kot 1 µM. V nadaljevanju bomo opisali model v [4].
Slika 3. Odvisnost velikosti sile v GMC (FGMC_final) od znotrajcelične koncentracije cGMP ([cGMP]), kot jo napove
izhodiščni model [4].
V modelu upoštevamo električne tokove preko celične membrane, molarne tokove Ca2+ preko
membrane SR ter izmenjavo Ca2+ s proteini v citoplazmi in SR. Seznam tokov vključno z
oznakami, ki jih bomo uporabljali v nadaljevanju, je v tabeli 1.
Tri glavne modelne spremenljivke so: koncentracija Ca2+ v citoplazmi 2
CCa ,
koncentracija Ca2+ v SR ( 2
SRCa in membranska napetost oz. membranski potencial (Vm). V
model pa so vključene še naslednje spremenljivke: koncentracijo prostih vezavnih proteinov v
citoplazmi ([Pr]C) in v SR ([Pr]SR), koncentracija proteinov, na katere je vezan Ca2+ v
citoplazmi ([PrCa]C) ter koncentracija proteinov, na katere je vezan Ca2+ v SR ([PrCa]SR). Za
vse modelne spremenljivke so zapisali diferencialno enačbo prvega reda, ki opisuje hitrost
spremembe posamezne spremenljivke. Poleg tega je model za opis znotrajcelične kalcijeve
signalizacije sklopljen še z modelom za od Ca2+/CaM odvisno aktivacijo encima MLCK in
7
razvojem sile v GMC, ki je v celoti povzet po modelu Fajmuta in sod. [11] in temelji na modelu
Haia in Murphyja [10]. Celoten model vsebuje 21 diferencialnih enačb prvega reda, prav toliko
spremenljivk in 151 parametrov.
Vrsta tokov Oznaka Opis
električni tokovi preko
celične membrane
VOCCI tok Ca2+ skozi napetostno regulirane Ca2+ kanale
(VOCC; ang. voltage-operated calcium channels)
CaClI tok Cl- skozi od Ca2+ odvisne Cl- kanale
CaKI tok K+ skozi od Ca2+ odvisne K+ kanale
NCXI tok Na2+ in Ca2+ skozi izmenjevalce Na+ in Ca2+ (NCX)
Na/KI tok Na+ in K+ skozi črpalke Na+/K+-ATP-aze
PMCAI tok Ca2+ skozi črpalke Ca2+-ATP-aze (PMCA; ang.
plasma membrane Ca2+-ATPase
pas_NaI , pas_KI ,
pas_ClI , pas_CaI pasivni tokovi ionov: Na+, K+, Cl- in Ca2+
molarni tokovi Ca2+ preko
membrane SR
ICICRJ tok Ca2+ skozi od IP3 in od Ca2+ odvisne kanale ICICR
oz. IP3-R
SERCAJ tok Ca2+ skozi črpalke SERCA
pas_SRJ pasivni tok Ca2+ v citoplazmo skozi pore v membrani
SR (t. i. pasivni tok)
izmenjava Ca2+ s proteini v
citoplazmi in SR
PrCJ neto tok vezave/disociacije Ca2+ na/z vezavnih
proteinov (PrC)
PrSRJ neto tok vezave/disociacije Ca2+ na/z vezavnih
proteinov (PrSR) v SR
Tabela 1. Električni tokovi preko celične membrane, molarni tokovi Ca2+ preko membrane SR ter izmenjava Ca2+
s proteini v citoplazmi in SR [4].
Z modelom obravnavamo pritekajoče in odtekajoče tokove Ca2+ v oz. iz citoplazme. Pritekajoči
tokovi so: neto molarni tok Ca2+ preko celične membrane (JPM), tok Ca2+ preko kanalov ICICR
na membrani SR (JICICR), pasivni tok Ca2+ preko membrane SR (JpasSR) in tok sproščanja z
vezavnih proteinov v citoplazmi (JPrC_OFF). Odtekajoča tokova pa sta: tok vezave Ca2+ na
vezavne proteine v citoplazmi (JPrC_ON) in tok Ca2+ preko črpalk SERCA (JSERCA).
Hitrost spremembe koncentracije Ca2+ v citoplazmi 2
C
d Ca dt je enaka razliki vsote
pritekajočih in odtekajočih tokov Ca2+ v citoplazmo celice in iz nje, kar opišemo z navadno
diferencialno enačbo 1. reda:
OFF ON
2
CPM ICICR pasSR PrC PrC SERCA( ) ( )
d CaJ J J J J J
dt. (1)
8
V modelu je privzeto, da je Vm po celotni membrani celice enak, hitrost spreminjanja
membranskega potenciala na celični membrani mdV dt pa je odvisna od vsote električnih
tokov ionov v celico in iz nje:
Ca CaNa/K PMCA NCX VOCC Cl K pas
m
m 1(
x
x
dVI I I I I I I
dt C ,
(2)
pri čemer pasxI označuje pasivne ionske tokove, kjer x označuje vrsto posameznega iona,
mC
pa je kapaciteta celotne celične membrane.
V izhodiščnem modelu je SR privzet kot enovita shramba, ki predstavlja 5 % volumna celice
in vsebuje kanale ICICR ter črpalke SERCA, ki pričnejo ob povišani koncentraciji Ca2+ v
citoplazmi le-tega črpati nazaj v SR in s tem poskrbijo, da se kalcijeva shramba SR povsem ne
izprazni. Vendar pa izhodiščni model ne upošteva vpliva cGMP na izmenjavo Ca2+ med
citoplazmo in shrambami za Ca2+. Z izhodiščnim modelom torej ne opišemo toka Ca2+ preko
črpalk SERCA in kanalov ICICR v odvisnosti od cGMP ter ne upoštevamo vpliva cGMP na
aktivnost encima MLCP.
V nadaljevanju bomo zapisali zgolj tiste enačbe izhodiščnega modela, ki jih bomo v seminarju
nadgradili (glej poglavje 4).
3.1 Tokovi kalcija preko membrane sarkoplazemskega retikuluma
Neto molarni tok Ca2+ iz SR v citoplazmo je v izhodiščnem modelu zapisan kot razlika vsote
pritekajočih tokov (ICICRJ , pas_SRJ ) in odtekajočega toka (
SERCAJ ):
SR ICICR pas_SR SERCAJ J J J . (3)
V našem delu bomo nadgradili izraza za tok skozi črpalke SERCA in tok skozi kanale tipa
ICICR. Tok Ca2+ skozi črpalke SERCA je v izhodiščnem modelu modeliran z izrazom:
2
CSERCA SR,V SERCA
2
SERCAC
n
nn
CaJ R r
Ca k
,
(4)
pri čemer je SERCAr maksimalna hitrost črpanja Ca2+ skozi črpalke SERCA, n je Hillov
koeficient, SERCAk je konstanta polovične zasičenosti in SR,VR je razmerje volumnov SR in
citoplazme.
Tok skozi kanale tipa ICICR je v izhodiščnem modelu modeliran z izrazom:
9
2 2
ICICR SR,V ICICR ICICR SR C( )J R r P Ca Ca , (5)
kjer je ICICRr hitrostna konstanta za izpust Ca2+ iz SR v citoplazmo skozi kanale tipa ICICR.
ICICRP je verjetnost za odprtost kanalov ICICR, ki je direktno odvisna od koncentracij IP3 v
citoplazmi ([IP3]) in Ca2+ v SR ([Ca2+]SR) ter od deleža odprtih kanalov s hitro kinetiko (Af ) in
deleža aktivnih kanalov s počasno kinetiko (I1 f ):
SRIP3
IP SRIP3 3 SR
3
2
3
ICICR A 12
3 IP SRSR
(1 )
nn
SR
n nn n
CaIPP f f
IP k Ca k
,
(
(6)
kjer sta 3IPk in
SRk konstanti polovične zasičenosti, SRn in
3IPn pa Hillovi konstanti.
Delež odprtih kanalov s hitro kinetiko se s časom skoraj ne spreminja, zato privzamemo, da je
kar enak ravnovesni vrednosti ( Af ), ki pa je odvisna od koncentracije Ca2+ v citoplazmi:
A
AA
2
CA
2
C
x
xx
A
Caf
Ca k
,
(7)
kjer je Ak konstanta polovične zasičenosti za 2
CCa in
Ax Hillov koeficient v mehanizmu
aktivacije kanala v odvisnosti od 2
CCa .
Delež odprtih kanalov s počasno kinetiko je izražen z deležem zaprtih kanalov (If ). Ker je
proces zapiranja teh kanalov počasnejši, se delež zaprtih kanalov počasi spreminja s časom,
zaradi česar je ta spremenljivka izražena z diferencialno enačbo:
I I I
I
df f f
dt
,
(8)
kjer je I karakteristični čas inhibicije kanala ICICR, delež zaprtih kanalov v ravnovesnem
stanju ( If ) pa je podan z izrazom:
I2
CI
2
C
II
x
xx
I
Caf
Ca k
,
(9)
10
kjer je Ix Hillov koeficient v mehanizmu inhibicije kanala v odvisnosti od 2
CCa in
Ik
konstanta polovične zasičenosti za 2
CCa v procesu inhibicije.
V obeh izrazih (enačba (7) in enačba (9)) nastopa koncentracija 2
CCa kot spremenljivka, pri
čemer se mehanizem zapiranja kanalov aktivira pri višjih, mehanizem za odpiranje pa pri nižjih
koncentracijah 2
CCa . To razliko ustvarjata različni vrednosti konstante polovične
zasičenosti v Hillovi funkciji Ik oz.
Ak ter različna Hillova koeficienta Ix oz.
Ax . I predstavlja
karakteristični čas za zaprtje kanalov s počasnejšo kinetiko. Na ta način je graf odprtih kanalov
ICICRP v odvisnosti od 2
CCa ˝zvonasta˝ krivulja.
3.2 Modeliranje razvoja sile v gladki mišični celici arterij
Kontrakcija oz. relaksacija gladkih mišic je direktno odvisna od interakcij med aktinom in
miozinom, kar je regulirano s procesoma fosforilacije MLC z encimom MLCK in
defosforilacije MLC z encimom MLCP [2].
Do skrčitve mišic pride po tem, ko se različni kompleksi Ca2+/CaM vežejo na encim MLCK in
ga aktivirajo. Aktivna oblika tega encima, na katerega mora biti vezan Ca4CaM, nato fosforilira
MLC (oz. miozin (M) na sliki 4), s čimer se vzpostavi interakcija med aktinom (A) in miozinom
(slika 4) [12]. Istočasno poteka tudi proces defosforilacije MLC z encimom MLCP, ki pa je od
Ca2+ neodvisen. V primeru, ko je koncentracija Ca2+ v citoplazmi visoka, je hitrejši proces
fosforilacije, kar vodi do razvoja sile, v nasprotnem primeru pa je hitrejši proces defosforilacije,
kar vodi do relaksacije.
Slika 4. Dopolnjeni 4-stanjski model Hai-a in Murphy-a za razvoj aktivne sile v gladki mišični celici. A in M sta
prosti nepovezani obliki aktina in miozina, Mp je fosforiliran prost miozin, AMp je fosforiliran miozin, ki je pripet
na aktinski filament, AM pa predstavlja kompleks defosforiliranega miozina pripetega na aktin (t. i. zaskočeni
prečni mostiček). MLCK je encim kinaza lahkih verig miozina, MLCP je encim fosfataza lahkih verig miozina,
PKG je protein kinaza G, Ca2+/CaM pa predstavlja različne komplekse kalcija in kalmodulina. Povzeto po [12].
11
Pri opisu od Ca2+ odvisnega razvoja sile v GMC je pri izhodiščnem modelu uporabljen model
Fajmuta in sod. [11], ki opisuje aktivacijo MLCK in je nadgrajeni 4-stanjski model Haia in
Murphyja [10]. Pri izhodiščnem modelu sta hitrosti defosforilacije fosforiliranega miozina, ki
je vezan na aktin (AMp) *
2k , ali pa je prost (Mp) *
5k enaki in opisani z enačbo:
catD_mlcp tot*
2
mD
k MLCPk
K Mp AMp
,
(10)
pri čemer je catD_mlcpk hitrostna katalitična konstanta, mDk Michaelis-Mentenina konstanta,
totMLCP totalna koncentracija encima MLCP, [Mp] in [AMp] pa sta koncentraciji
fosforiliranega miozina, pri čemer je prvi prost, drugi pa vezan na aktinski filament.
4 Nadgrajeni model
V modelu, ki smo ga opisali v prejšnjem poglavju, nadgradimo izraze za JSERCA in JICICR v
odvisnosti od cGMP ter z vplivom cGMP na aktivnost encima MLCP ( *
2k oz. *
5k ). V tem
poglavju so v podpoglavjih opisane posamezne komponente, ki smo jih dodali v izhodiščni
model.
Pri nadgradnji modela se soočimo z nekaterimi omejitvami. Z modelom namreč opišemo manj
raziskane procese, zato v modelu uporabljene vrednosti parametrov niso natančno definirane.
Prav tako model ne upošteva difuzije ionov in v vseh primerih modeliramo direktni vpliv cGMP
na tarčne mehanizme, čeprav vemo, da v več primerih cGMP deluje posredno preko aktivacije
encima PKG, ki s fosforilacijo tarčnih proteinov vpliva na njihovo delovanje.
4.1 Tok kalcija skozi črpalke SERCA
Črpalke SERCA regulirajo prehod Ca2+ ionov iz citoplazme v SR. Že v 80. in 90. letih 20.
stoletja so ugotovili, da encima PKG in PKA fosforilirata fosfolamban (PLB). PLB je protein,
ki je vezan na SERCA in vpliva na njegovo strukturo in s tem tudi na hitrost prečrpavanja Ca2+
v SR. Encima PKA ali PKG fosforilirata PLB na aminokislini Ser-16 in s tem povzročita ločitev
PLB od SERCA, s čimer se zviša aktivnost črpanja Ca2+ v SR (slika 2) [1]. Dosedanji modeli
tega vpliva niso upoštevali.
PLB je membranski protein z atomsko maso 5 kDa in pentamerno obliko in je vezan na črpalke
SERCA tipa II, ki so pretežno izražene v mišičnih celicah srca in gladkih mišičnih celicah ter
še nekaterih drugih tkivih. Vezava PLB na SERCA alosterično inhibira SERCA, s čimer se
zmanjša transport Ca2+ iz citoplazme v SR. To naj bi vodilo do zvišanja koncentracije
znotrajceličnega kalcija in posledično do skrčitve mišičnih celic [7, 13].
12
Leta 2002 so naredili podrobno raziskavo na GMC govejih trahej, pri čemer so ugotovili, da je
SERCA II v membrani SR povezana še z nekaterimi drugimi proteini in sicer z α-aktinom,
kalponinom H1 in PLB. Prav tako so ugotovili, da od cGMP odvisna proteinska kinaza (PKG)
fosforilira PLB, kar vodi do ločitve proteina PLB od SERCA II [13].
V raziskavi iz leta 2013 so na umetnih membranah in na membranah izvzetih iz SR srčnih
miocitov preučevali vpliv povezave med SERCA in PLB, t. i. kompleksa SERCA/PLB, na
hitrost prečrpavanja Ca2+. Ugotovili so, da je aktivnost SERCA odvisna od molarnega razmerja
SERCA:PLB (slika 5), ki določa konformacijsko obliko črpalk SERCA in s tem njihovo
aktivnost [7].
Molarno razmerje SERCA:PLB, ki znaša 1:0, predstavlja stanje SERCA z najvišjo hitrostjo
prečrpavanja Ca2+ iz citoplazme v SR (SERCAv ). Temu stanju ustreza krivulja SERCA_1:0v ,
označena s črno barvo na sliki 5. Molarno razmerje SERCA:PLB, enako 1:5, pa predstavlja
stanje SERCA z najmanjšo aktivnostjo. Temu ustreza krivulja SERCA_1:5v , označena z modro
barvo na isti sliki, povzeti po viru [7]. V raziskavi so ugotovili, da se razmerje SERCA:PLB
spremeni pri β-adrenergični stimulaciji srčnih miocitov. Tovrstna stimulacija v preučevanih
celicah sproži produkcijo sekundarnega prenašalca cAMP, ki aktivira encim PKA, ta pa
fosforilira PLB na Ser-16 in s tem povzroči spremembo njegove konformacije v t. i. stanje B,
v katerem PLB disociira s SERCA. Na ta način se zmanjša inhibicija SERCA, kar poveča hitrost
črpanja Ca2+ v SR [7].
Slika 5. Normalizirana aktivnost črpalk SERCA oz. hitrost črpanja Ca2+ ( SERCAv ) v odvisnosti od koncentracije
Ca2+ ([Ca2+]), pri različnih molarnih razmerjih kompleksa SERCA:PLB; točke: eksperimentalne meritve [7];
krivulje: prilagojene Hillove funkcije (enačba (11)). Parametri so podani v tabeli 2.
Izmerjenim vrednostim na sliki 5 prilagodimo Hillovo funkcijo:
13
2
SERCA max2
m
n
nn
Cav v
k Ca
,
(11)
ki opisuje aktivnost encima, izmerjenim vrednostim na sliki 5 in določimo parametre vmax
(maksimalna hitrost prenosa Ca2+ ionov skozi SERCA), km (Michaelis-Mentenina konstanta
polovične zasičenosti za 2
CCa ) in n (Hillov koeficient). Parametre določimo za vse tri
meritve posebej. Vrednosti so podane v tabeli 2.
razmerje
SERCA:PLB
vmax km [mmol/m3] n
1:0 1,02 0,34 1,43
1:1 1,03 0,68 1,49
1:5 1,03 0,84 1,55
Tabela 2. Vrednosti Hillovega koeficienta (n), Michaelis-Mentenine konstante polovične zasičenosti za 2
CCa
(km) in maksimalna hitrost prenosa Ca2+ ionov skozi SERCA (vmax), ki jih pri različnih molarnih razmerjih
SERCA:PLB dobimo s prilagoditvijo Hillove funkcije (enačba (11)) izmerjenim vrednostim vSERCA v odvisnosti
od koncentracije 2Ca [7].
Ugotovimo, da se parametra vmax in n pri različnih molarnih razmerjih SERCA:PLB bistveno
ne razlikujeta, se pa bistveno spremeni parameter km, ki se v primerih molarnih razmerij 1:0 in
1:5 razlikuje za faktor približno 2 (tabela 2). Da bi v razponu fizioloških koncentracij cGMP,
ki so tipično med 0,1 in 1 mmol/m3, dosegli znižanje parametra kSERCA za faktor 2 in približno
linearen odziv v logaritemski skali, določimo vrednosti kSERCA tako, da se z vsako spremembo
cGMP za faktor 10, kSERCA spremeni za približno faktor 2 (tabela 3). Tem točkam prilagodimo
Hillovo funkcijo, ki ima naslednjo obliko:
_
SERCA SERCA_init SERCA_end SERCA_init __
d_cGMP
n c
n cn c
cGMPk k k k
K cGMP
,
(12)
pri čemer je kSERCA_init začetna, kSERCA_end pa končna vrednost parametra kSERCA, _n c Hillova
konstanta in Kd_cGMP konstanta polovične zasičenosti. Pri tem za vrednost kSERCA_init uporabimo
enako vrednost kot v izhodiščnem modelu (poglavje 3), končna vrednost kSERCA_end pa je
približno za velikostni razred manjša. Na prvi pogled se sicer zdi, kot da je modelna odvisnost
kSERCA od [cGMP] nekoliko prevelika v primerjavi z izmerjenimi vrednostmi, vendar je
potrebno omeniti, da je bil v eksperimentu [7] uporabljen modificiran PLB (zgolj peptid), ki je
raziskovalcem omogočal, da so sploh izvedli meritve. V takih primerih so odzivi sistema
navadno veliko manjši kot v primerih, ko bi učinkovale nemodificirane molekule.
14
3
mmol/mcGMP 3
SERCAmmol/mk
0,01 7,0·10-2
0,1 3,5·10-2
1 1,5·10-2
10 0,7·10-2
Tabela 3. Izbrane vrednosti polovične zasičenosti za koncentracijo Ca2+ v citoplazmi (kSERCA) pri izbranih
fizioloških vrednostih kocentracije cikličnega gvanozin monofosfata ([cGMP]).
Slika 6. Odvisnost polovične zasičenosti za koncentracijo Ca2+ v citoplazmi (kSERCA) od koncentracije cikličnega
gvanozin monofosfata ([cGMP]); točke: eksperimentalne meritve [5]; krivulja: prilagojena Hillova funkcija
(enačba (12)). Parametri: začetna polovična zasičenost za 2
CCa (kSERCA_init = 7,0·10-2 mmol/m3), končna
polovična zasičenost za koncentracijo 2
CCa (kSERCA_end = 1,0·10-3 mmol/m3), Hillov koeficient v odvisnosti
aktivnosti črpalke SERCA od koncentracije 2
CCa ( _n c = 1,2), disociacijska konstanta polovične zasičenosti
za cGMP (Kd_cGMP = 9,0·10-2 mmol/m3).
Enačbo (12), s parametri zapisanimi v opisu slike 6, vstavimo v nadgrajeni model, pri čemer je
parameter kSERCA po novem izražen kot funkcija [cGMP].
4.2 Tok kalcija skozi od IP3 odvisne kanale ICICR
Ob holinergični stimulaciji se Ach veže na muskarinske receptorje, ki se nahajajo v plazemski
membrani in so povezani z G-proteinom, kar pospeši proizvodnjo sekundarne signalne
molekule IP3, ki se veže na IP3-R receptor kanalov ICICR. Le-ta se nato veže na receptorje v
membrani SR, kar povzroči odprtje kanalov za izpust Ca2+ v citoplazmo, koncentraciji Ca2+ v
citoplazmi in SR pa nadalje regulirata odprtost teh kanalov. Od tod tudi ime za te kanale »z IP3
15
in s Ca2+ inducirani kanali za izpust Ca2+« (ang. IP3 and Ca2+ induced Ca2+ release, ICICR), ki
jih nekateri imenujejo tudi kanali IP3-R (slika 2) [4].
Leta 2000 so naredili raziskavo, s katero so pokazali, da sta signalna pot NO in signalna pot
IP3, ki se veže na kanale IP3-R med seboj povezani. Regulacija naj bi potekala posredno preko
od NO odvisne fosforilacije oz. defosforilacije proteina, ki je povezan s kanalom IP3-R in se
fosforilira pod vplivom encima PKG (IRAG), kar posledično vpliva na prepustnost kanalov
IP3-R. Encim, ki fosforilira protein IRAG je PKG (oz. natančneje izoforma cGKI-β), katerega
aktivna količina je odvisna od cGMP, le-ta pa od količine NO. Raziskovalci so ugotovili, da je
ob fosforiliranem proteinu IRAG prepustnost Ca2+ skozi kanale IP3-R veliko manjša kot ob
nefosforiliranem proteinu IRAG. Z rezultati raziskav, ki so jih opravili na GMC aorte, sapnika
in maternice, so pokazali, da je bila fosforilacija proteina IRAG deloma odgovorna za znižanje
znotrajceličnega Ca2+, kar je vodilo do relaksacije GMC v teh tkivih [14].
Leta 2002 so opravljali študije [8] na gladkih mišicah žil. Ugotovili so, da encima PKG in PKA
fosforilirata kanale IP3-R in jih s tem posledično inhibirata. Opravljeni eksperimenti »in vitro«
pa so pokazali, da samo encim PKG (oziroma njegovi izoformi cGKI-α in cGKI-β) fosforilirata
kanale IP3-R, pri čemer izoforma cGKI-β spoji protein IRAG s kanalom IP3-R tipa I. cGKI-α
najdemo v človeških, govejih, zajčjih in mišjih tkivih in je 10-krat bolj občutljiv za aktivacijo
s cGMP kot cGKI-β in je tudi bolj dovzeten za aktivacijo s prenašalcem cAMP [8].
Z opravljenimi eksperimenti na mikrosomih gladkih mišic želodca [8] so kot rezultat predstavili
normirani tok Ca2+ skozi kanale IP3-R tipa I v odvisnosti od koncentracije IP3 [IP3] v kontrolni
skupini in ob dodani aktivni obliki encima PKG oz. njegove izoforme cGKI-α [8].
Slika 7. Normirani tok Ca2+ skozi kanale IP3-R tipa I ICICR( )J v odvisnosti od koncentracije prenašalca [IP3] v
kontrolni skupini (črna krivulja) in ob dodani aktivni obliki encima PKG oz. njegove izoforme cGKI-α (rdeča
krivulja). Eksperiment je bil izveden na mikrosomih gladkih mišic želodca [8]. Vrednosti parametrov, ki jih
dobimo, če meritvam prilagodimo Hillovo funkcijo: črna krivulja: vmax = 105, 3d_IP _cGMPk = 1,49·10-3 mmol/m3 in
m = 0,45, rdeča krivulja: vmax = 100, 3d_IP _cGMPk = 2,39 mmol/m3 in m = 0,41.
16
Meritvam prikazanim na sliki 7, prilagodimo Hillovo funkcijo oblike
3
3
ICICR max
d_IP _cGMP 3
m
mm
IPv v
k IP
,
(13)
kjer je vmax normirana maksimalna hitrost prenosa Ca2+ ionov skozi kanal, kd_IP3_cGMP konstanta
polovične zasičenosti in m Hillov koeficient. Vrednosti parametrov za krivulji, ki jih dobimo,
če meritvam prilagodimo Hillovo funkcijo so podani pri sliki 7.
Vidimo, da se je konstanta polovične zasičenosti kd_IP3_cGMP ob prisotnosti aktivne oblike
cGKI-α spremenila za faktor več kot 1000. V modelu zato uvedemo normirni faktor Rk_IP3, ki
bo konstanto polovične zasičenosti kIP3 v enačbi (6) spremenil z začetne vrednosti za faktor
1000. Glede na to, da v viru [11] ni natančnega podatka o koncentraciji encima cGKI-α, pri
kateri je bil izveden eksperiment, sklepamo, da je bila količina uporabljenega aktivnega encima
na zgornji meji fizioloških koncentracij, kar posledično velja tudi za cGMP. Privzamemo, da je
vrednost normirnega faktorja 1000 dosežena pri vrednosti [cGMP] = 10 mmol/m3. Izhodiščna
vrednost normirnega faktorja 1 pa je dosežena pri koncentraciji, ki je za velikostni razred pod
normalno fiziološko koncentracijo cGMP, t. j. pri 0,01 mmol/m3. Da bi imeli tri točke, kar je
minimum, če želimo prilagoditi Hillovo funkcijo, ki ima tri parametre, tretjo točko izberemo na
sredini intervala fizioloških vrednosti koncentracije cGMP, ki je med 0,1 in 1 mmol/m3 (t. j. pri
0,5 mmol/m3) ter tej točki pripišemo polovično vrednost normirnega faktorja (glej tabelo 4).
Na ta način je odzivnost sistema v področju fizioloških koncentracij cGMP največja.
3
mmol/mcGMP k_IP3R
0,01 1
0,5 500
10 1000
Tabela 4. Izhodiščne vrednosti za izračun normirnega faktorja za polovično zasičenost odprtosti kanalov tipa
ICICR od količine prenašalca IP3 v enačbi (6) (Rk_IP3) v odvisnosti od koncentracije [cGMP].
S prilagoditvijo Hillove funkcije oblike:
3 3
3
k_IP k_IP max
d_IP
h
h h
cGMPR R
cGMP k
(14)
točkam iz tabele 4 (glej sliko 8) določimo parametre te funkcije. To so: maksimalna vrednost
Rk_IP3 (Rk_IP3max), konstanta polovične zasičenosti kd_IP3 in Hillov koeficient h. Vrednosti teh
parametrov so: Rk_IP3max = 1000, h = 3,2 in 3d_IP _cGMPk = 0,5 mmol/m3.
17
Slika 8. Funkcijska odvisnost normirnega faktorja za polovično zasičenost odprtosti kanalov tipa ICICR od
količine IP3 v enačbi (6) (Rk_IP3) v odvisnosti od [cGMP]. Krivulja je prilagojena Hillova funkcija (14), s parametri:
Rk_IP3max = 1000, h = 3,2 in 3d_IP _cGMPk = 0,5 mmol/m3.
Parameter polovične zasičenosti kIP3 v enačbi (6) izrazimo kot:
3 3 3IP IP _init k_IP k k R , (15)
pri čemer je vrednost parametra kIP3_init enaka vrednosti parametra kIP3 iz izhodiščnega modela
in znaša 6,5 mmol/m3.
4.3 Razvoj sile v gladki mišični celici - vpliv na encim MLCP in posledično na
hitrost defosforilacije miozina
Magnituda razvoja sile v gladkih mišicah žil je predvsem odvisna od količine fosforiliranih, na
aktinski filament vezanih miozinskih glav (prečnih mostičkov). Količina le-teh je uravnavana
s stopnjo fosforilacije dela proteina miozina MLC, ki pa jo regulirata encima MLCK in MLCP
[2]. Količino aktivnega encima MLCK regulira koncentracija znotrajceličnega Ca2+ preko
vezave na protein CaM, aktivnost encima MLCP pa je tudi odvisna od različnih specifičnih
fosforilacij na samem encimu MLCP. Eno izmed fosforilacij katalizira tudi od cGMP odvisen
encim PKG, kar zviša aktivnost encima MLCP.
Učinek cGMP na encim MLCP v našem nadgrajenem modelu povzamemo po modelu Yanga
in sod. [2]. To naredimo z uporabo normalizacijskega faktorja, ki je odvisen od koncentracije
prenašalca cGMP (RcGMP), ki modulira katalitično aktivnost encima MLCP (kcatD).
Normalizacijski faktor RcGMP mora zadoščati dvema pogojema. Ko je koncentracija cGMP
majhna, aktivnosti encima PKG ni, pri čemer tudi ni učinkov na aktivnost encima MLCP. Zato
sem mora v primeru manjšanja koncentracije cGMP vrednost R približevati 0. Ko je
koncentracija cGMP velika, je aktivnost encima PKG maksimalna, pri čemer je tudi učinek na
18
aktivnost encima MLCP maksimalen. Pri velikih koncentracijah [cGMP] gre torej vrednost R
proti 1. Na ta način obravnavamo cGMP kot molekularno stikalo, ki preko vpliva na aktivnost
encima PKG učinkuje na tarčne proteine. Pri tem je upoštevano, da je od cGMP odvisen proces
aktivacije encima PKG hiter proces v primerjavi s procesi v kontraktilnem aparatu, zaradi česar
v enačbah ne nastopa količina aktivnega encima PKG temveč kar koncentracija prenašalca
cGMP.
Odvisnost normalizacijskega faktorja RcGMP opišemo s Hillovo enačbo [2]:
H
H HcGMP
m_cGMP
n
n n
cGMPR
cGMP K
,
(16)
kjer je Km_cGMP konstanta polovične zasičenosti in Hn Hillov koeficient. Vrednosti teh dveh
parametrov (tabela 5) sta povzeti po [2].
Parameter Vrednost
m_cGMPK 31 mmol/m
Hn 2
Tabela 5. Vrednosti parametrov m_cGMPK (konstanta polovične zasičenosti) in Hn (Hillov koeficient) v enačbi
(16) povzamemo po viru [2].
Katalitična hitrostna konstanta encima MLCP (kcatD_mlcp) se izraža na sledeč način:
catD_mlcp catD_mlcpB catD_mlcpC cGMPk k k R ,
(17)
pri čemer je kcatD_mlcpB bazalna katalitična hitrostna konstanta ob odsotnosti prenašalca cGMP
oz. aktivnega encima PKG in kcatD_mlcpC variabilni del hitrostne katalitične konstante, za
katerega se lahko maksimalno poveča celotna katalitična hitrostna konstanta ob prisotnosti
aktivne oblike encima PKG. Enačbo (17) vstavimo v enačbo (10) izhodiščnega modela in
dobimo:
catD_mlcpB catD_mlcpC cGMP tot*
2
mD
k k R MLCPk
K Mp AMp
, (18)
pri čemer je * *
2 5k k .
Vrednost za KmD je povzeta po izhodiščnem modelu, vrednosti za kcatD_mlcpB in kcatD_mlcpC pa sta
enaki prepolovljeni vrednosti parametra kcatD_mlcp iz izhodiščnega modela. Primerljive vrednosti
so bile izbrane že v enem od predhodnih modelov [15], na katerem temelji izhodiščni model.
19
Model [15] na podoben način obravnava inhibitorni vpliv RhoK na aktivnost encima MLCP
kot je bilo predlagano v tej nadgradnji.
Parameter Vrednost parametra in
enota
Opis parametra
catD_mlcpBk -18 s bazalna katalitična hitrostna
konstanta ob odsotnosti
cGMP oz. aktivnega encima
PKG
catD_mlcpCk -18 s variabilni del hitrostne
katalitične konstante
mDK 310 mmol/m Michaelis-Mentenina
konstanta za encim MLCP
Tabela 6. Vrednosti parametrov v enačbah (17) in (18) [4].
5 Rezultati in razprava
V tem poglavju bomo analizirali rezultate, dobljene z nadgrajenim modelom. Kot glavni
rezultat predstavimo magnitudo sile (FGMC_final), t. j. maksimalno silo, ki se razvije v GMC po
daljšem času (v našem primeru t = 300 s), oziroma po tem, ko sistem že preide v stacionarno
stanje ali pa niha okrog njega s konstanto amplitudo, v odvisnosti od [cGMP] v celci. Simulacije
so izvedene za primer holinergične stimulacije srednje jakosti pri tipični koncentraciji
sekundarnega prenašalca [IP3] = 2 mmol/m3 [8]. Vse simulacije so izvedene s programom
Berkeley Madonna 8.3.18, ki sta ga razvila Robert I. Macey in George F. Oster iz Univerze v
Kaliforniji.
Izhodiščni model [4] ni ustrezno napovedal padca magnitude sile v področju visokih [cGMP]
(črna krivulja na sliki 9), t. j. med vrednostmi 10 in 100 3mmol/m , zato smo model postopno
nadgrajevali z enačbami, opisanimi v poglavju 4. Simulacijo z izhodiščnim modelom [4] smo
izvedli pri originalnih vrednostih parametrov rSERCA = 3 mol/m3s in rICICR = 30 s-1. Pri
simulacijah z nadgrajenim modelom pa smo vrednosti teh dveh parametrov bili primorani
spremeniti že pri prvi nadgradnji, to je nadgradnji toka Ca2+ skozi črpalke SERCA. Spremembi
smo uvedli, ker v modelu nismo dobili oscilacij in fizioloških znotrajceličnih koncentracij Ca2+.
Uporabili smo vrednosti parametrov rSERCA = 1,5 mol/m3s in rICICR = 15 s-1, pri katerih so bile
ob nadgradnji parametra kSERCA lastnosti signala Ca2+ podobne referenčnim iz izhodiščnega
modela v širokem razponu [cGMP]. Pri ostalih nadgradnjah se je nato sicer izkazalo, da pri teh
dveh vrednostih parametrov v modelu izgubimo oscilacije, vendar so koncentracije Ca2+ vrha
in platoja v dvofaznem signalu ostale na fizioloških ravneh. Zaradi tega smo ohranili enako
vrednost teh dveh parametrov pri vseh nadaljnjih nadgradnjah.
Najprej smo torej model nadgradili z dodatkom v matematičnem opisu za črpalke SERCA
(enačba (12)) (rdeča pikčasta krivulja na sliki 9), pri čemer se je odvisnost sile od cGMP pri
20
visokih koncentracijah cGMP vidno izboljšala, kljub vsemu pa je še bil viden majhen koničast
porast sile pri [cGMP] = 1 mmol/m3.
Slika 9. Magnituda sile v GMC, razvita po daljšem času (FGMC_final), v odvisnosti od koncentracije cikličnega
gvanozin monofosfata ([cGMP]) v izhodiščnem modelu [4] (črna krivulja) in po različnih nadgradnjah: s konstanto
polovične zasičenosti za 2
CCa (kSERCA) kot funkcijo [cGMP] v izrazu za aktivnost črpanja Ca2+ iz citoplazme
v SR (enačba (12)) (rdeča pikčasta krivulja), s konstanto polovične zasičenosti za [IP3] (kIP3) kot funkcijo [cGMP]
v izrazu za prepustnost kanalov ICICR na membrani SR (enačba (15)) (modra krivulja), s konstanto katalitične
aktivnosti encima MLCP (kcatD) kot funkcije [cGMP] (enačba (17)) (vijolična krivulja) in z vsemi tremi zgoraj
opisanimi spremembami (kSERCA, kIP3, kcatD) (zelena krivulja).
Nato smo izhodiščni model nadgradili zgolj v delu, ki se nanaša na vpliv [cGMP] na tok Ca2+
skozi kanale ICICR (enačba (15)) (modra krivulja na sliki 9). Pri tej nadgradnji so izginile
oscilacije Ca2+ v področju fizioloških koncentracij cGMP. Odvisnost sile od [cGMP] pa se je
zaradi tega v tem področju »zgladila«. Pri vrednosti [cGMP] = 10 mmol/m3 pa je bil prisoten
še večji relativni porast sile.
Pri tretji nadgradnji smo v modelu simulirali še vpliv [cGMP] na aktivnost encima MLCP
(enačba (17)) (vijolična krivulja na sliki 9). Ta nadgradnja načeloma ne vpliva na signal Ca2+,
saj je nadgradnja na strani dekodacije signala Ca2+. Ker pa smo pri tej nadgradnji uporabili nove
vrednosti parametrov rSERCA = 1,5 mol/m3s in rICICR = 15 s-1, so oscilacije v modelu izginile.
Zaradi tega je odvisnost sile od koncentracije [cGMP] v področju fizioloških [cGMP] zglajena,
pri [cGMP] = 10 mol/m3 pa je še vedno prisoten vrh v tej odvisnosti. S spremembo aktivnosti
encima MLCP se je spremenila tudi magnituda pri nizkih vrednostih [cGMP], vendar je to
predvsem zato, ker se normalizacijski faktor v izračunu relativne sile, ki jo prikazujemo na
grafu, ni spremenil.
21
Če v modelu upoštevamo vse tri zgoraj opisane spremembe (zelena krivulja), dobimo glede na
izhodiščni model pri nizkih [cGMP] nekoliko večjo magnitudo sile, ki je pretežno posledica
normalizacije sile, v področju fizioloških [cGMP] je odvisnost sile nekoliko bolj zglajena,
oziroma je koničasti porast relativno nižji glede na okolico, v področju visokih [cGMP] pa ni
dodatnega porasta. V področju fizioloških [cGMP] pa so zopet prisotne oscilacije
znotrajceličnega Ca2+. Majhen koničast porast je ravno posledica pojava oscilacij.
Povprečna vrednost koncentracije Ca2+ 2
CCa v citoplazmi 2
C,pov.Ca dokaj dobro
korelira s FGMC_final. Pri višji 2
C,pov.Ca je sila višja in obratno. Obe spremenljivki pa se z
višanjem [cGMP] znižujeta (slika 10). Do majhnega odstopanja prihaja le pri vrednosti 2
C,pov.Ca okrog 31 mmol/m , česar trenutno še ne znamo natančno pojasniti. Možno pa je, da
izračuna vrednosti 2
C,pov.Ca in FGMC_final nista povsem natančni, saj je izračun numerično
zelo zamuden in smo zato model zaganjali le za manjše število točk. Hkrati pa je izračun
2
C,pov.Ca tudi manj natančen, saj je v izračun povprečne vrednosti vključena celotna
časovna odvisnost signala Ca2+, ki vsebuje intervale mirovnega stanja, interval porasta 2
CCa
v trenutku stimulacije in interval oscilacij s konstantno amplitudo oziroma stacionarne
vrednosti v primeru, ko oscilacij ni. Za bolj pravilen izračun bi morali upoštevati samo interval
oscilacij s konstantno amplitudo oz. interval stacionarnega stanja, ki imata po dolgem času
edina vpliv na magnitudo sile. Za ta primer pa bi morali samostojno izdelati računalniški
program, kar pa bi ob velikem številu spremenljivk presegalo vsebino tega diplomskega
seminarja.
Slika 10. Odvisnost magnitude sile, razvite po daljšem času v GMC (FGMC_final) in povprečne vrednosti
koncentracije kalcija (Ca2+) v citoplazmi 2
C,pov.Ca od koncentracije cikličnega gvanozin monofosfata
([cGMP]) v nadgrajenem modelu.
22
Primerjava odvisnosti koncentracije 2
C,pov.Ca od [cGMP] med izhodiščnim [4] in
nadgrajenimi verzijami modela pokaže, da se z nadgradnjami 2
C,pov.Ca pri nizkih [cGMP]
zmanjša za faktor 3 (slika 11). To je s fiziološkega stališča bolj pravilno, saj so povprečne
vrednosti koncentracij nad vrednostjo 2 μM v celicah zelo redke in celo citotoksične. K tej
spremembi je zagotovo vplivalo tudi znižanje parametrov SERCAr = 1,5 mol/m3s in 115 s ,ICICRr
ki smo jih uporabili ravno zaradi tega, ker se je z nadgradnjo parameter SERCAk signal Ca2+ tako
spremenil, da ni bil več fiziološko ustrezen.
Slika 11. Povprečna koncentracija Ca2+ v citoplazmi 2
C,pov.Ca
v odvisnosti od koncentracije cikličnega
gvanozin monofosfata ([cGMP]) v izhodiščnem modelu [4] (črna krivulja) in po različnih nadgradnjah: s konstanto
polovične zasičenosti za 2
CCa (kSERCA) kot funkcijo [cGMP] v izrazu za aktivnost črpanja Ca2+ iz citoplazme
v SR (enačba (12)) (rdeča krivulja), s konstanto polovične zasičenosti za [IP3] (kIP3) kot funkcijo [cGMP] v izrazu
za prepustnost kanalov ICICR na membrani SR (enačba (15)) (modra krivulja) in z obema dvema zgoraj opisanima
spremembama (kSERCA, kIP3) (vijolična krivulja). V simulaciji z izhodiščnim modelom [4] so uporabljene vrednosti
parametrov rSERCA = 3 mol/m3s in rICICR = 30 s-1, v vseh ostalih primerih pa rSERCA = 1,5 mol/m3s in rICICR = 15 s-1.
Pri različnih koncentracijah [cGMP] se časovna odvisnost koncentracije Ca2+ v citoplazmi
2
CCa oz. signal Ca2+ spreminja. Spremembe so vidne v obliki, amplitudi in frekvenci
signala. Na sliki 12 so prikazane tri različne časovne odvisnosti 2
CCa s področja oscilacij.
Le-te se začnejo pri vrednosti [cGMP] = 0,56 mmol/m3 (slika 12a), kar je v področju tipičnih
fizioloških vrednosti [cGMP]. Z naraščanjem [cGMP] se amplituda oscilacij zmanjšuje
(slika 12b,c), o frekvenci oscilacij pa je težko govoriti, saj so oscilacije kompleksne in so
23
superpozicija oscilacij z različnimi frekvencami, kar je razvidno s slik 12 a) in c). V teh primerih
oscilacije Ca2+ imenujemo brstične oscilacije, v primeru slike 12 b) pa navadne oscilacije.
a)
b)
c)
Slika 12. Odvisnost koncentracije kalcija v citoplazmi 2
CCa od časa (t) pri različnih koncentracijah
cikličnega gvanozin monofosfata [cGMP]: a) [cGMP] = 0,85 mmol/m3, b) [cGMP] = 1 mmol/m3,
c) [cGMP] = 10 mmol/m3.
24
6 Zaključek
Namen diplomskega seminarja je bil nadgraditi model za razvoj sile v GMC arterij pod vplivom
cGMP, ki bi odprl nadaljnje možnosti za celostno modeliranje signalne poti NO v stenah arterij.
Izhodiščni model [4], ki smo ga tukaj nadgrajevali, je ustrezno napovedal padec magnitude sile
z višanjem [cGMP] zgolj v področju nizkih vrednosti, tj. med približno 0,01 in 6 mmol/m3, ne
pa tudi pri visokih vrednostih, tj. med približno 6 in 100 mmol/m3 (slika 3). Najverjetnejši vzrok
zato je, da v njem niso upoštevali vseh vplivov cGMP na kodacijo signala Ca2+ in njegovo
dekodacijo v silo, ki se razvije v GMC. Zaradi tega smo izhodiščni model [4] nadgradili s tremi
poznanimi vplivi cGMP, ki pa še niso bili upoštevani v modelu. Pri prvi nadgradnji smo v izrazu
za tok Ca2+ preko črpalke SERCA (JSERCA) konstanto polovične zasičenosti kSERCA zapisali kot
funkcijo [cGMP] (enačba (12)). Podobno smo storili pri drugi nadgradnji, kjer smo v izrazu za
tok Ca2+ skozi kanale ICICR (JICICR) konstanto polovične zasičenosti kIP3 zapisali kot funkcijo
[cGMP] (enačba (15)). V tretji nadgradnji pa smo upoštevali, da cGMP vpliva na katalitično
aktivnost encima MLCP in s tem na hitrost defosforilacije MLC. Pri tem smo katalitično
hitrostno konstanto encima MLCP (kcatD_mlcp) zapisali kot funkcijo [cGMP] (enačba 18).
Podatke za prvi dve nadgradnji smo samostojno pridobili z analizo meritev [7,8,13,14], pri tretji
nadgradnji pa smo se zgledovali po drugem podobnem modelu [2].
Ugotovili smo, da ima zgolj prva izmed uporabljenih nadgradenj vpliv na znižanje magnitude
sile v področju visokih koncentracij cGMP. Kljub vsemu pa je v odvisnosti magnitude sile od
[cGMP] še vedno viden majhen koničast porast sile pri približno 31 mmol/m .cGMP Druga
nadgradnja ima sicer navidezen vpliv na zgladitev odvisnosti sile v področju fizioloških
vrednosti [cGMP], kar pa je zgolj posledica tega, da v modelu pri izbranih vrednostih
parametrov ni oscilacij Ca2+. Ta nadgradnja nima nobenega učinka na znižanje sile pri visokih
vrednostih [cGMP]. Tretja nadgradnja vpliva zgolj na hitrost defosforilacije miozina, kar
nekoliko vpliva na magnitudo sile, nima pa vpliva na signal Ca2+. Tudi v tem primeru je videti,
kot da ima ta nadgradnja močan zglajevalni učinek na odvisnost sile v področju fizioloških
[cGMP], kar pa je, enako kot pri drugi nadgradnji, zgolj posledica odsotnosti oscilacij. Podobno
kot druga tudi tretja nadgradnja nima učinka na porast sile pri visokih [cGMP]. Ob uporabi vseh
treh nadgradenj hkrati se koničasti porast sile v območju fizioloških koncentracij cGMP delno
zgladi, pri visokih [cGMP] pa se v celoti odpravi.
Rezultati nadgradenj kažejo na to, da je najbolj ključna prva nadgradnja, saj izniči neželeni
porast v odvisnosti sile pri visokih [cGMP]. Kljub vsemu pa ob tej nadgradnji ostaja v
odvisnosti sile od [cGMP] še en koničast porast v področju fizioloških vrednosti [cGMP]. Tretja
nadgradnja deloma prispeva k zgladitvi te konice, medtem ko druga nadgradnja nima
bistvenega vpliva na silo. Zgladitev koničastih porastov v odvisnosti sile in približanje h kar se
da fiziološkim odzivom sistema ostaja še izziv za nadaljnje delo.
25
LITERATURA IN VIRI
[1] L. J. Ignarro, Nitric oxide: biology and pathobiology (Academic Press, San Diego,
London, 2000).
[2] J. Yang, J. W. Clark, R. M. Bryan in C. S. Robertson, Mathematical modeling of the
nitric oxide/cGMP pathway in the vascular smooth muscle cell, Am. J. Physiol. Heart.
Circ. Physiol. 289, H886-897 (2005).
[3] DDclinic S.n.c., Metabolismo Lipidico. Pridobljeno 20.8.2017, iz
http://www.ddclinic.it/test-diagnostici/nutrigenetica/metabolismo-lipidico/.
[4] N. Šutar, Modeliranje vpliva cikličnega gvanozin monofosfata (cGMP) na od kalcija
odvisen tonus gladkih mišičnih celic arterij, Magistrsko delo (Fakulteta za naravoslovje
in matematiko Univerze v Mariboru, Maribor, 2015).
[5] J. C. B. Jacobsen, C. Aalkjaer, H. Nilsson, V. V. Matchkov, J. Freiberg in N. H.
Holstein-Rathlou, Activation of a cGMP-sensitive calcium-dependent chloride channel
may cause transition from calcium waves to whole cell oscillations in smooth muscle
cells, Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 293, H215-228 (2007).
[6] A. Kapela, A. Bezerianos in N. M. Tsoukias, A mathematical model of Ca2+ dynamics
in rat mesenteric smooth muscle cell: agonist and NO stimulation, J. Theor. Biol. 253,
238-260 (2008).
[7] M. Gustavsson, R. Verardi, D. G. Mullen, K. R. Mote, N. J. Traaseth, T. Gopinath in G.
Veglia, Allosteric regulation of SERCA by phosphorylation-mediated conformational
shift of phospholamban, PNAS 110, 17338-17343 (2013).
[8] K. S. Murthy in H. Zhou, Selective phosphorylation of the IP3-R-I in vivo by cGMP-
dependent protein kinase in smooth muscle, Am. J. Physiol. Gastrointest Liver Physiol.
284, G221-G230 (2002).
[9] A. Fajmut, M. Brumen in S. Schuster, Theoretical model of the interactions between
Ca2+, calmodulin and myosin light chain kinase, FEBS Lett. 579, 4361-4366 (2005).
[10] C. M. Hai in R. A. Murphy, Cross-bridge phosphorylation and regulation of latch state
in smooth muscle, Am. J. Physiol. 254, C99-106 (1988).
[11] P. Mbikou, A. Fajmut, M. Brumen in Etienne Roux, Theoretical and experimental
investigation of calcium-contraction coupling in airway smooth muscle, Cell. Biochem.
Biophys. 46, 233-251 (2006).
[12] A. Fajmut, Modeliranje biokemijskih procesov kot sestavnih elementov kalcijeve
signalizacije v procesu skrčitve gladkih mišičnih celic dihalnih poti, Doktorska
disertacija (Pedagoška fakulteta Univerze v Mariboru, Maribor, 2006).
[13] A. Koller, J. Schlossmann, K. Ashman, S. Uttenweiler-Joseph, P. Ruth in F. Hofmann,
Association of phospholamban with a cGMP kinase signaling complex, Biochem.
Biophys. Res. Commun. 300, 155-160 (2003).
[14] J. Schlossmann, A. Ammendola, K. Ashman, X. Zong, A. Huber, G. Neubauer, G.
Wang, H. Allescher, M. Korth, M. Wilm, F. Hofmann in P. Ruth, Regulation of
intracellular calcium by a signalling complex of IRAG, IP3 receptor and cGMP kinase
Iβ, Nature 404, 197-201 (2000).
26
[15] P. Mbikou, A. Fajmut, M. Brumen in E. Roux, Contribution of Rho kinase to the early
phase of the calcium–contraction coupling in airway smooth muscle, Exp. Physiol.
96(2), 240-258 (2010).