minifix kit for in vitro diagnostic use product code:...

Insert Code: GIN045, Version: 13th September 2011, of 12

MINIFIX™ KIT

For in vitro diagnostic use

Product Code: XK004 Product manufactured by: The Binding Site Group Ltd., 8 Calthorpe Road, Edgbaston, Birmingham, B15 1QT, UK. www.bindingsite.co.uk Telephone: +44 (0)121 456 9500 Fax: +44 (0)121 456 9749 E-mail: [email protected]

FDA (USA) Information Analyte ID Code: 2802 Test System ID Code: 61115 Complexity Cat.: High MINIFIX™ is a trademark of The Binding Site Group Ltd., Birmingham, UK

1 INTENDED USE

This kit is designed for the in vitro identification of monoclonal immunoglobulins (IgG, IgA or IgM) and light chains (kappa or lambda) in serum and urine, thereby aiding in the diagnosis of monoclonal gammopathies. It may also be used with other Binding Site Immunofixation grade antisera (see catalogue). Two patient samples may be tested per gel.

2 SUMMARY AND EXPLANATION

Monoclonal gammopathy is a primary disease state in which a single clone of plasma cells produces raised levels of antibody. This antibody consists of a single heavy chain class and subclass, light chain type and idiotype, and is referred to as paraprotein, monoclonal immunoglobulin or M-protein. In urine, the antibody product is monoclonal free light chain, referred to as Bence Jones protein. The presence of monoclonal immunoglobulin in serum or urine is associated with malignancies such as myelomatosis, Waldenstrom‟s macroglobulinaemia and lymphoma, and less commonly with a number of benign conditions (ref. 1).

Immunofixation electrophoresis (IFE) involves the electrophoretic separation of proteins on a gel, followed by their immunoprecipitation with monospecific antisera. In this way, the IFE procedure can separate and identify various proteins in a biological fluid on the basis of their physicochemical and antigenic properties. The IFE technique was originally described by Afonso in 1964 (ref. 2) and was subsequently modified by Alper and Johnson (ref. 3). IFE is now used routinely to identify monoclonal immunoglobulins in serum and Bence Jones proteins in urine.

Immunofixation is usually employed as a second stage in the immunological analysis of biologocial fluids. The first stage normally involves screening of samples using serum protein electrophoresis (SPE). Samples showing abnormal results from this initial screening are further investigated by immunofixation and immunoglobulin quantification.

3 PRINCIPLE OF THE ASSAY

Initially, the proteins in a test sample are separated by electrophoresis in an agarose gel. Each sample is ran in six parallel tracks to allow subsequent fixation of IgG, IgA, IgM, kappa, lambda and total serum protein (TSP). Each electrophoresis track is then overlaid and incubated with a monospecific antiserum and immunofixation occurs, the resulting immune complexes becoming trapped in the gel‟s pore structure. The exception is the TSP track where a protein fixative is overlaid, which precipitates all of the major protein bands and therefore produces a reference electrophoretic pattern for the test sample.

Following fixation, non-precipitated protein and unbound antibody are removed by washing, and the gel is pressed and dried. The precipitated bands are then visualised by staining and the gel is dried to provide a permanent record. Interpretation is made by examining the precipitin bands present in each of the tracks.

4 REAGENTS

4.1 MINIFIX gels (supplied in individual foil wrapped boxes). These contain preservatives: 0.099% sodium azide, 0.1% E-amino-n-caproic acid (EACA), 0.01% benzamidine and 0.05% ProClin™ 300. ProClin™ 300 is a trademark of Rohm and Haas Corp. Philadelphia, PA.

4.2 Buffer powder. (Reconstituted: 50mmol/L 5,5-diethylbarbituric acid sodium salt, 10mmol/L 5,5-diethylbarbituric acid). Contains 0.099% (w/w) sodium azide. For use as electrophoretic cell buffer and as sample diluent.

4.3 Protein stain. This is supplied as a 10 x concentrate liquid consisting of Acid Blue 29 in dilute acetic acid.

4.4 Control serum. This is supplied as a liquid consisting of a mixture of human myeloma sera which gives a precipitin band in each of the IgG, IgA, IgM, kappa and lambda tracks. Preservatives: 0.1% EACA, 0.099% sodium azide, 0.01% benzamidine.

4.5 Antisera set. Consisting of monospecific sheep antisera to human IgG, IgA, IgM, heavy chains and kappa and lambda light chains. They are provided in colour coded dropper bottles. Preservatives: 0.1% EACA, 0.099% sodium azide, 0.01% benzamidine, and 1mmol/L EDTA.

4.6 Protein fixative. Consisting of 5% (w/v) sulphosalicylic acid in 5% (v/v) acetic acid solution.

5 CAUTION

All donors of human serum supplied in this kit have been serum tested and found negative for Hepatitis B surface antigen and antibodies to Hepatitis C Virus and Human Immunodeficiency Virus (HIV 1 & 2). The assays used were either approved by the FDA (USA) or cleared for in vitro diagnostic use in the EU (Directive 98/79/EC, Annex II); however these tests can not guarantee the absence of infective agents. Proper handling and disposal methods should be established as for all potentially infective material including (but not limited to) users wearing suitable protective equipment and clothing at all times. Only personnel adequately trained in such methods should be permitted to perform the procedures.

All reagents in this kit, with the exception of fixative and stain contain 0.099% sodium azide as a preservative and must be handled with caution - suitable gloves and other protective clothing should be worn at all times when handling this product. Do not ingest or allow contact with the skin (particularly broken skin or open wounds) or mucous membranes. If contact does occur wash with a large volume of water and seek urgent medical advice. Explosive metal azides may be formed with lead and copper plumbing; on disposal of reagent, flush with a large volume of water to prevent azide build up.

This product should only be used by suitably trained persons for the purposes stated. Adherence to the given procedure is recommended. The validity of results obtained using methods other than those stated cannot be guaranteed.

Reagents from different batch numbers of kits are NOT interchangeable. If large numbers of tests are performed care should be taken to ensure that all reagents are from the same batch.

6 STORAGE AND STABILITY

6.1 Box 1 contents (gels, buffer etc.) should be stored at room temperature (18-26°C).

6.2 Box 2 contents (antisera, control serum etc.) should be stored at 2-8°C. DO NOT FREEZE. Slight precipitation can occur in the antisera on storage, which may be removed by centrifugation and should not affect performance characteristics.

All components are stable until the expiry date given on the kit box label.

6.3 MINIFIX gels. Should be stored flat and must not be frozen. Avoid any extreme temperature changes. Where room temperature exceeds 26°C it is recommended that the gels are stored at 2-8°C.

6.4 Buffer powder. Once reconstituted, buffer may be stored at room temperature for up to sixty days in a closed container. The presence of precipitate in reconstituted buffer indicates deterioration, and such buffer should be discarded.

6.5 Protein stain. Once diluted for use can be stored at room temperature (18-26°C) for up to sixty days in a closed container.

7 SPECIMEN COLLECTION AND PREPARATION

Fresh or deep frozen serum or urine should be used. Plasma samples are not recommended as the presence of fibrinogen may confuse the interpretation. Blood samples should be collected by venepuncture, allowed to clot naturally and the serum separated as soon as possible to prevent haemolysis. The serum maybe stored at 2-8°C for up to 48 hours prior to assay or for prolonged storage kept undiluted at -20°C or below. Repeated thawing and freezing should be avoided. Microbially contaminated, haemolysed and lipaemic serum and samples containing particulate matter should not be used (as decreased titres on unclear staining patterns may occur).

8 METHODOLOGY

8.1 Materials provided

8.1.1 10 x MINIFIX gels (individually packaged) 8.1.2 1 x Buffer powder 8.1.3 1 x 100mL Protein stain 8.1.4 10 x MINIFIX Sample application masks 8.1.5 10 x MINIFIX Antisera templates 8.1.6 60 x Gel blotters 8.1.7 20 x Drying blotters 8.1.8 10 x Sample blotters 8.1.9 1 x 1.5mL Protein fixative 8.1.10 1 x 0.5mL Fix control serum 8.1.11 1 x Anti-Human IgG (Fix), Anti-Human IgA (Fix), Anti-Human IgM (Fix), Anti-Human

Kappa (Fix), Anti-Human Lambda (Fix), (Antisera) 8.1.12 1 x Instruction leaflet

8.2 Materials required but not provided

8.2.1 Electrophoresis tank and power supply.

8.2.2 Various pipettes, micropipettes, measuring cylinders.

8.2.3 Drying equipment or 45C incubator.

8.2.4 Gel washing and drying equipment.

8.2.5 5% v/v acetic acid for de-staining solution and protein stain diluent.

8.2.6 Moist box (e.g.sealable plastic box containing damp tissue paper) when not using a gel box and dryer.

8.2.7 Washing solution (0.85% saline).

8.2.8 Distilled water.

8.2.9 Gel press or press weight.

8.3 Reagent preparation

8.3.1 Buffer powder. Dispense into a container suitable to hold 1500mL. The buffer powder should be dissolved in 1500mL distilled water before use. This can be assisted by using a magnetic stirrer. Fresh aliquots of buffer should be used for each electrophoresis run.

8.3.2 Protein stain. Mix well and then dilute to a total volume of 1L with 5% (v/v) acetic acid before use.

8.3.3 Washing solution. 0.85% sodium chloride solution, freshly prepared. Use once and discard.

8.3.4 Antiserum and protein fixative. Supplied ready to use.

8.3.5 Control serum. The control serum should be treated exactly like test serum samples – see below. The control should be used for verifying the reactivity of the antisera and the electrophoresis run.

8.3.6 MINIFIX gels. To avoid contamination, the gels should be used in a dust-free environment. Take the gel box from the foil pouch and remove the lid. The gel should be removed from the box just before samples are to be assayed to prevent drying out. The gel should be removed from the box by bending back one corner of the box allowing the gel to be picked up from below. Avoid touching the surface of the gel. Retain gel boxes for use in the fixation procedure.

Two patient samples can be run per gel.

8.4 Sample preparation

8.4.1 Serum

8.4.1.1 For IgG, IgA, IgM, kappa and lambda identification, serum samples will require a 1/10 dilution with buffer (e.g. 25µL serum plus 225µL buffer) prior to application.

8.4.1.2 Samples should be applied to the reference track (total serum protein – TSP) at a 1/2 dilution (100µL sample + 100µL buffer).


8.4.1.3 Samples suspected of containing high concentrations of monoclonal protein (e.g. myeloma samples > 15g/L) should be diluted in buffer to give an approximate immunoglobulin concentration of 1g/L before application.

8.4.1.4 Samples suspected of containing low concentration monoclonal bands should be diluted as follows for optimum detection:

i) IgG <15g/L dilute 1/10 (10L + 90L buffer)

ii) IgA, IgM, kappa and lambda, dilute 1/5. (20L serum + 80L buffer)

8.4.2 Urine Urine samples may also be used with this kit, in order to detect the presence of Bence Jones proteins.

8.4.2.1 The urine will require concentrating to a minimum protein concentration of 1g/L.

8.4.2.2 The anti-kappa and anti-lambda included in the IgG, IgA, IgM, kappa and lambda immunofixation antisera set will precipitate these light chains whether free or bound to the immunoglobulin heavy chain.

8.4.2.3 Antibodies to free kappa and free lambda are required to establish if the light chains are in the free form (Binding Site codes: PX016, PX018).

8.5 Sample application

8.5.1 Remove excess moisture from the surface of the gel by briefly blotting with one of the gel blotters provided.

8.5.2 Align the sample application mask so that the slots are centred for each track and apply to the gel (see diagram below).

8.5.3 Gently run a finger from one side of the mask to the other to ensure a good seal

and to remove air bubbles.

NB: Careful alignment of the mask at this stage is essential for even running of the

gel.

8.5.4 Carefully apply 2.5µL of 1/2 diluted sample to the first slot, (TSP) and then 2.5µL of the appropriately diluted sample to each of the remaining mask slots using an appropriate pipette.

8.5.5 Allow five minutes for samples to diffuse into the gel. During this time prepare the electrophoresis tank as per section 8.6.

8.5.6 After 5 minutes, blot the sample template using a sample blotter. Remove and discard mask and blotter.

8.6 Electrophoresis

8.6.1 Fill compartment of an appropriate electrophoresis tank/cell with appropriate volume of reconstituted buffer. It is strongly recommended that the customers validate equipment for use with this kit.

8.6.2 Follow instructions provided with the equipment. Ensure to check leads of power pack and tank for damage prior to use.

8.6.3 Position the gel(s) on the electrophoretic bridge or carriage, with the agarose side up, ensuring the positive (+) and negative (-) marked ends of the gel are towards the positive and negative electrodes.

8.6.4 Electrophorese the gel(s) for the appropriate running time and voltage. It is important to validate and adhere to set times and voltage to ensure clear band resolution.

In-house combination tests of tank and power pack must be carried out to ensure the samples on the gels run to the correct position - see section 9.2.6.

8.6.5 After electrophoresing the gels, the electrophoresis buffer should be discarded and the tank rinsed according to equipment manual. Failure to clean the tank could lead to reduced migration of samples on the gel.

8.7 Immunofixation 8.7.1 Following electrophoresis, remove the gel from the tank and blot the surface gently

using a gel blotter. 8.7.2 The gel should then be immediately immunofixed, to prevent protein diffusion which

would otherwise reduce the definition of the bands. 8.7.3 Align an antiserum template over the gel, using the alignment marks at the top left

hand corner and TSP columns. Carefully run a finger over the template to ensure a complete seal with the gel surface.

8.7.4 Add one drop of distilled water into the gel box, and return gel to the gel box. The

water will ensure the gel is lying flat in the box. 8.7.5 Apply 1 drop of the protein fixative to the reference (TSP) track and one drop of

each antiserum to the appropriate antiserum track.

NB: The dropper bottle must be held vertically and gently squeezed to release 1

drop (50L). The bottle should be held just above the gel to allow the full 50L to be dispensed.

a-Hu-IgG applied a-Hu-IgM applied a-Hu-IgA applied at the bottom of at the bottom of at the top of the the IgG track the IgM track IgA track etc.

8.7.6 The antisera and fixative should be staggered when applied, to prevent carryover

into adjacent tracks (see above).

8.7.7 After every fixative or antiserum addition, tilt the gel to ensure all of track is covered. Care should be taken to prevent antisera spillage and touching the gel surface with the nozzle of the bottle.

8.7.8 Incubate the gel (with template in place) inside the gel box in a laboratory incubator for 30 minutes at 45°C. Alternatively place the gel in a “moist box” and incubate at 45°C in a laboratory incubator for 30 minutes.

Note: The overall time taken to perform the immunofixation process can be reduced by adopting the Quickfix procedure – see section 8.9. However, if the gel has been incubated for 30 minutes, it must then be washed and pressed as per the standard methods of 10 minutes for each step.

8.7.9 It is also possible to pipette antisera/fixative on to the gel. For this 50L of each antisera/fixative is applied.

8.8 Washing and staining

8.8.1 The following solutions are recommended for the washing and staining process in a suitable container:

Container Solution

1 2 3 4 5

0.85% saline 0.85% saline Protein stain (suitably diluted) Destain 1 (5% v/v acetic acid) Destain 2 (5% v/v acetic acid)

8.8.2 Following immunofixation, remove the antisera template and place the gel into an appropriate gel carriage.

8.8.3 Gently place into container 1 (0.85% saline). Leave to wash for 10 minutes.

8.8.4 Gels are pressed in a suitable gel press.

Recommendation for pressing gel:

One gel blotter under the gel.

One gel blotter on top of the gel. Avoid creasing the gel blotter as it is carefully placed on top of the gel.

One drying blotter on top of the second gel blotter.

Press gel(s) for 10 minutes.

8.8.5 Remove gel from gel press and discard the blotters. Replace the gel in the carriage and gently place into container 2 (0.85% saline, washing for 10 minutes).

8.8.6 Re-press the gel as described above.

Note: The overall time taken to perform the washing and pressing stages can be

reduced by adopting the Quickfix procedure – see section 8.9.

8.8.7 Dry the gel completely in a suitable dryer for approximately 5 minutes.

8.8.8 Return the gel to a gel carriage and immerse in container 3 (protein stain) for 1 minute.

8.8.9 Destain in container 4 (5% v/v acetic acid) until background staining clears.

8.8.10 Transfer to container 5 (5% v/v acetic acid) to ensure complete de-staining (approximately 1 minute for each de-stain step).

8.8.11 Dry the gel completely in a suitable dryer.

8.9 Quickfix procedure

To reduce the overall time taken to complete the immunofixation procedure when using this kit, adopt the times stated below:

Immunofixation at 45C 10 mins

1st Wash 5 mins

1st Press 5 mins

2nd

Wash 5 mins

2nd

Press 5 mins

Times for sample diffusion and electrophoresis stages are unchanged from those given in sections 8.5.6 and 8.6.4.

Caution: When using the Quickfix procedure, some IgM myeloma samples may show distinct

bands in all antisera tracks. This is caused by unfixed monoclonal protein not completely washing out of the gel. Where interpretation becomes difficult, the sample must be rerun adopting the full standard procedure.

9 RESULTS

9.1 The control sample

The control sample included in the antisera set should show a sharp band visible in each immunoglobulin and light chain track, and in the same positions in the TSP reference track. If any bands are absent see Trouble shooting, section 10.3.

9.2 Patient samples

The presence of a stained band results from the reaction between the antiserum and a protein (antigen) in the sample.

9.2.1 Normal samples give light or no staining in the gamma region.


9.2.2 Elevated polyclonal immunoglobulin may give strong but diffuse staining with no distinct bands.

9.2.3 Monoclonal protein appears as a sharp distinct band in the reference (TSP) track, and also in the same position in the appropriate immunoglobulin class and light chain tracks (see example below).

(IgG K) (IgM K)

9.2.4 Samples giving only a light chain band require further investigation, since this may be indicative of the presence of free light chain or monoclonal IgD or IgE (Binding Site codes PX013 and PX014).

9.2.5 High protein concentrations can result in a clear region in the centre of a strong band, due to antigen excess. These samples can if required, be reassayed at a higher dilution.

9.2.6 For all samples, the albumin band in the TSP Track should migrate to the 2nd

large integration mark from the top of the gel (see Trouble shooting 10.3, 10 and 12 if samples run too long or too short).

10 LIMITATIONS OF PROCEDURE

Diagnosis cannot be made and treatment must not be initiated on the basis of monoclonal immunoglobulin detection alone. Clinical history and other laboratory findings must also be taken into account.

10.1 Specific test limitations

10.1.1 Plasma samples should not be used as the fibrinogen will adhere to the gel in the beta region and thereby confuse the interpretation.

10.1.2 Samples containing high concentrations of rheumatoid factor or immune complexes can give unusual results by IFE, e.g. precipitin bands at the origin.

10.2 When using equipment, follow the manufacturer‟s instructions carefully. Particular attention should be given to the set up of the equipment and installation. Equipment must be maintained and serviced according to the manufacturers instructions.

10.3 For FDA (USA) information, see front page.

10.4 Trouble shooting

Problem Possible cause(s) Suggested action(s)

1 No distinct bands in any antisera track.

Normal sample. No action required.

2 Distinct band in all antisera tracks.

a) Fibrinogen present (usually in the beta region).

Repeat MINIFIX using serum.

b) Monoclonal protein sticking non-specifically to gel.

Identify monoclonal protein from strongest bands.

3 Monoclonal kappa or lambda band, but no IgG, A or M band.

a) Light chain myeloma, Bence Jones protein (with urine samples).

Repeat MINIFIX using anti-free light chain antisera, anti-IgD, anti-IgE.

b) IgD or IgE myeloma.

4 Monoclonal IgG, A or M band but no light chain band.

Weak light chain reaction or heavy chain disease.

Repeat light chain MINIFIX with sample more concentrated.

5 Dark elongated ring (pale or clear centre).

Monoclonal antigen excess.

Dilute sample and repeat MINIFIX.

6 Poorly resolved or weak bands.

a) Elevated polyclonal immunoglobulin.

Repeat MINIFIX to confirm results.

b) Incorrect electrophoresis and incubation times, poor antiserum application technique.

Repeat MINIFIX checking electrophoresis times, incubation time and temperature (45°C) and carefully apply antisera.

7 Atypical electrophoretic pattern.

Uneven gel. Repeat MINIFIX using even gel and ensure gels are stored flat.

8 Dark background. Insufficient washing prior to staining.

Repeat MINIFIX with correct washing times and fresh saline.

9 Distorted or split gel (after electrophoresis).

IFE buffer incorrectly reconstituted or buffer exhausted.

Repeat MINIFIX using fresh buffer.

10 Albumin band missing form TSP track.

a) Electrophoresis time too long.

Repeat MINIFIX and reduce electrophoresis time.

b) Voltage too high. Reduce the voltage.

c) Ends of gels immersed too deeply in buffer.

Reduce the volume of buffer used.

11 Bands missing with control sample.

a) Control sample or antiserum omitted or incorrectly diluted.

Repeat assay.

b) Deterioration of antiserum or control sample.

Refer to supplier.

12 Short migration of samples.

Salt build up on anode stopping current flow.

Repeat MINIFIX after carefully scrubbing salt deposits off the anode.

If a problem cannot be resolved, please refer to supplier.

11 EXPECTED VALUES & SPECIFIC PERFORMANCE CHARACTERISTICS

50 serum specimens previously identified as containing monoclonal immunoglobulins were tested in a controlled study using The Binding Site‟s IFE and MINIFIX (XK001 and XK004 respectively) together with two commercial kits. There was complete agreement between the kits with regards to the monoclonal protein‟s immunoglobulin class and light chain type in all cases.

12 BIBLIOGRAPHY

12.1 Milford Ward A. (Ed) (1990). Protein Reference Unit Handbook of Clinical

Immunochemistry, 5th Edn. Publ. PRU Publications, Sheffield, UK. P152.

12.2 Afonso, E (1964). Quantitative immunoelectrophoresis of serum proteins. Clin. Chem. Acta 10, 114-122.

12.3 Alper, CA & Johnson, AN. (1969). Immunofixation electrophoresis: A technique for the study of protein polymorphism. Vox. Sang. 17, 445-452.

12.4 Johnson AM (1982). Immunofixation electrophoresis and electrofocusing. Clin. Chem. 28, 1797-1800.

12.5 Khan S & Bina M (1988). Sensitivity of immunofixation electrophoresis for detecting IgM paraproteins in serum. Clin. Chem. 34, 1633-1635.

12.6 Monos DS et al (1989). Evaluation and optimisation of variables in immunofixation electrophoresis for the detection of IgG paraproteins. Clin. Biochem.22, 369-371.

12.7 Whicher JT et al (1980). Clinical applications of immunofixation: a more sensitive technique for the detection of Bence Jones protein. J. Clin. Pathol. 33, 779-780.

13 SUMMARY OF PROCEDURE

MINIFIX Quickfix

1 Fill electrophoresis tank with buffer (Section 8.6).

2 Blot gel and position sample application mask on gel.

3 Apply 2.5µL of 1/2 diluted sample to TSP slot, 2.5µL of appropriately diluted sample to other 5 slots.

4 Allow sample to soak in. 5 minutes 5 minutes

5 Blot and remove mask.

6 Electrophorese samples (*see section 8.6).

25-35 minutes* 25-35 minutes*

7 Blot, position antisera template on gel.

8 Apply 1 drop of protein fixative to TSP track, 1 drop of each antiserum to appropriate antiserum track.

9 Incubate at 45°C. 30 minutes 10 minutes

10 Wash and press dry. 10+10 minutes 5+5 minutes

11 Repeat step 10. 10+10 minutes 5+5 minutes

12 Dry gel and stain.


MINIFIX™ KIT

Zur in-vitro Diagnostik

Bestell-Nr.: XK004

In England hergestellt von: The Binding Site Group Ltd., 8 Calthorpe Road, Edgbaston, Birmingham, B15 1QT, UK. www.bindingsite.co.uk Vertrieb in Deutschland und Österreich durch: The Binding Site GmbH, Robert-Bosch-Straße 2A, D-68723 Schwetzingen, Deutschland Telefon: +49 (0) 6202 92 62 0 Fax: +49 (0) 6202 92 62 222 e-mail: [email protected] MINIFIX™ ist ein Warenzeichen von The Binding Site Group Ltd., Birmingham, UK

1 VERWENDUNGSZWECK

Dieser Kit dient zur in-vitro Bestimmung monoklonaler Immunglobuline (IgG, IgA oder IgM) und Leichtketten (Kappa oder Lambda) in Serum und Urin und unterstützt die Diagnose von monoklonalen Gammopathien. Die Reagenzien können auch zusammen mit anderen Antiseren für die Immunfixation (siehe Katalog) von The Binding Site verwendet werden. Auf jedem Gel können zwei Patientenproben getestet werden.

2 EINFÜHRUNG

Als monoklonale Gammopathie wird das primäre Stadium einer Krankheit bezeichnet, bei der ein bestimmter Plasmazell-Klon erhöhte Mengen an Antikörper produziert. Diese Antikörper werden anhand der Schwerkettenklasse und Subklasse, Leichtketten-Typ und Idiotyp klassifiziert. Dieser Antikörper wird als Paraprotein, monoklonales Immunglobulin oder M-Protein bezeichnet. Im Urin werden monoklonale freie Leichtketten, die sogenannten Bence-Jones-Proteine, gefunden. Die Anwesenheit eines monoklonalen Immunglobulins im Serum oder Urin ist mit verschiedenen Krankheiten assoziiert, wie z.B. Multiples Myelom, Waldenström's Makroglobulinaemie und Lymphom, seltener mit einigen gutartigen Erkrankungen (Ref. 1).

Die Methode der Immunfixation-Elektrophorese (IFE) besteht aus der elektrophoretischen Trennung der Proteine im Agarosegel und anschließender Immunpräzipitation mit monospezifischen Antiseren. Mit der IFE können deshalb unterschiedliche Proteine aus Körper-flüssigkeiten auf Grund ihrer physikochemischen und antigenen Eigenschaften getrennt und identifiziert werden. Die IFE-Technik wurde ursprünglich von Afonso entwickelt (1964, Ref. 2) und von Alper und Johnson (Ref. 3) weiterentwickelt. Heute wird die IFE routinemäßig angewendet, um im Serum monoklonale Immunglobuline und im Urin Bence-Jones-Proteine nachzuweisen.

Bei der Analyse von Körperflüssigkeiten ist die Immunfixation der zweite Schritt. Sie folgt normalerweise einem ersten Screening mit Hilfe der Serumeiweiβ-Elektrophorese (SPE). Proben, die bei der Serumeiweiβ-Elektrophorese abnormale Ergebnisse zeigen, sollten weiterführend durch Immunfixation untersucht und ihr Immunglobulingehalt quantifiziert werden.

3 PRINZIP

Im ersten Schritt werden die Proteine der Probe elektrophoretisch in einem Agarosegel aufgetrennt. Jede Probe wird auf 6 parallele Spuren aufgetragen, dadurch ist die gleichzeitige Immunfixierung von IgG, IgA, IgM, Kappa, Lambda und Gesamt-Serumprotein (TSP) möglich. Zum Nachweis von IgG, IgA, IgM, Kappa und Lambda werden diese Elektrophorese-Spuren mit je einem monospezifischen Antikörper beschichtet und anschließend inkubiert. Die durch die Immunfixation entstandenen Immunkomplexe werden durch die Gelstruktur festgehalten und können nicht herausgewaschen werden. Eine Elektrophorese-Spur (TSP-Spur) wird mit einem Protein-Fixierer inkubiert, der alle Proteinbanden präzipitiert und daher als elektrophoretisches Referenzmuster dieser Testprobe dient.

Nach der Fixation werden nicht-präzipitierte Proteine und ungebundene Antikörper durch Waschen entfernt und das Gel gepresst und getrocknet. Die Präzipitationsbanden werden durch Anfärben sichtbar gemacht. Das Gel wird nach dem Anfärben getrocknet, um es für die Dokumentation haltbar zu machen. Zur Auswertung des Tests werden die spezifischen Präzipitationsbanden in jeder Spur beurteilt.

4 REAGENZIEN

4.1 MINIFIX Gele werden einzeln, in Folie eingeschweißten Boxen geliefert. Enthaltene Konservierungsmittel: 0,099% Natriumazid, 0,1% E-amino-n-capronsäure (EACA),

0,01% Benzamidin und 0,05% ProClin 300. ProClin™ 300 ist ein Warenzeichen von Rohm and Haas Corp. Philadelphia, PA.

4.2 Pufferpulver. Puffer enthält nach dem Lösen 50mmol/L Natrium-5,5–Diethylbarbiturat, 10mmol/L 5,5-Diethylbarbitursäure. Enthält 0,099% (w/w) Natriumazid. Der Puffer wird zur Elektrophorese und zur Probenverdünnung verwendet.

4.3 Protein-Färbelösung. 10-fach Konzentrat mit Acid Blue 29 in verdünnter Essigsäure.

4.4 Kontrollserum. Liegt als stabilisierte Flüssigkeit vor und enthält eine Mischung humaner Myelomseren. Man erhält Präzipitationsbanden in den Spuren von IgG, IgA, IgM, Kappa und Lambda. Enthaltene Konservierungsmittel: 0,1% EACA, 0,099% Natriumazid und 0,01% Benzamidin.

4.5 Antiserum-Set. Besteht aus monospezifischen Schaf-Antiseren gegen humane IgG-, IgA- und IgM-Schwerketten und Kappa- und Lambda-Leichtketten. Die Antiseren werden in farbcodierten Tropffläschchen geliefert: Enthaltene Konservierungsmittel: 0,1% EACA, 0,099% Natriumazid, 0,01% Benzamidin und 1mmol/L EDTA.

4.6 Protein-Fixierer. Besteht aus 5%iger (w/v) Sulphosalicylsäure in 5%iger (v/v) Essigsäure.

5 WARNUNGEN UND VORSICHTSMAßNAHMEN

Jeder einzelne Spender wurden bezüglich Antikörpern gegen Human-Immunschwäche-Virus (HIV 1 & 2), Hepatitis-C-Virus und Hepatitis-B-Oberflächenantigene (HBsAG) untersucht und als negativ befunden. Die hierfür verwendeten Tests sind entweder von der FDA (USA) zugelassen oder für den Gebrauch in der in vitro Diagnostik in der EU freigegeben (Directive 98/79/EC, Annex II). Es gibt aber zur Zeit keine absolut sicheren Testmethoden zum Ausschluss von HIV, Hepatitis-C-Virus oder anderen Infektionsträgern. Deshalb sollten die Reagenzien als potentiell infektiös behandelt werden. Umgangs- und Entsorgungsmethoden sollten denen für potentiell infektiösem Material entsprechen, insbesondere dem ständigen

Tragen entsprechender Schutzkleidung. Der Test sollte nur von entsprechend geschultem Personal durchgeführt werden.

Alle Bestandteile des Kits, mit Ausnahme von Protein-Fixierer und Protein-Färbelösung enthalten 0,099% Natriumazid als Konservierungsmittel und müssen mit entsprechenden Vorsichtsmaßnahmen behandelt werden. Das Tragen von Handschuhen und anderer Schutzkleidung wird während des Umgangs mit diesem Produkt empfohlen. Verschlucken sowie Kontakt mit Haut (v.a. bei rissiger Haut oder Verletzungen) oder Schleimhäuten vermeiden.. Nach Kontakt die Hautstelle mit viel Wasser abspülen und ärztlichen Rat einholen. Natriumazid kann mit Blei- oder Kupferrohren explosive Metallazide bilden. Nach der Entsorgung mit ausreichender Menge Wasser nachspülen um Azidablagerungen zu vermeiden.

Dieses Produkt sollte nur von geschultem Personal für den angegebenen Verwendungszweck verwendet werden. Es wird empfohlen den Test gemäß der vorliegenden Arbeitsanleitung durchzuführen. Die Richtigkeit der Ergebnisse, die mit einer abgeänderten Vorschrift erhalten wurden, kann nicht garantiert werden.

Reagenzien unterschiedlicher Chargen dürfen NICHT untereinander gemischt oder gemeinsam verwendet werden. Bei großem Testdurchsatz muss darauf geachtet werden, dass alle Reagenzien der GLEICHEN Charge entstammen.

6 LAGERUNG UND STABILITÄT

6.1 Box 1 – Inhalt (Gele, Puffer usw.) bei Raumtemperatur (18-26°C) lagern.

6.2 Box 2 - Inhalt (Antiseren, Kontrollserum usw.) bei 2-8°C lagern. NICHT EINFRIEREN. Während der Lagerung kann sich in den Antiseren ein Präzipitat bilden. Dies kann durch Zentrifugation entfernt werden und beeinrächtigt nicht die Testqualität.

Alle Komponenten sind bis zu dem auf dem Außenetikett angegebenen Verfallsdatum verwendbar.

6.3 MINIFIX Gele: flach lagern und dürfen nicht eingefroren werden. Extreme Temperaturschwankungen vermeiden. Übersteigt die Raumtemperatur 26°C wird empfohlen die Gele bei 2-8°C zu lagern.

6.4 Pufferpulver. Nach dem Lösen kann der Puffer bis zu 60 Tage in einem geschlossenen Gefäß bei Raumtemperatur gelagert werden. Bildet sich ein Niederschlag in der Pufferlösung, darf er nicht mehr verwendet werden.

6.5 Protein-Färbelösung. Nach dem Herstellen der Gebrauchslösung, kann diese bis zu 60 Tage in einem geschlossenen Gefäß bei Raumtemperatur (18-26°C) aufbewahrt werden.

7 PROBENSAMMLUNG UND -VORBEREITUNG

Frisches oder tiefgefrorenes Serum oder Urin verwenden. Keine Plasmaproben verwenden, da Fibrinogen die Interpretation des Bandenmusters erheblich erschweren kann. Blutproben über Venenpunktur sammeln und auf natürliche Weise gerinnen lassen. Serum so schnell wie möglich vom Gerinnsel trennen um eine Hämolyse zu vermeiden. Die Seren können bei 2-8°C bis zu 48 Stunden gelagert werden. Für eine längere Lagerung die Seren unverdünnt bei mindestens -20°C einfrieren. Wiederholtes Einfrieren und Auftauen der Seren vermeiden. Keine mikrobiell oder mit Partikeln verunreinigte Seren, oder hämolytische oder stark lipämische Seren verwenden. (Dies kann zu einer Titererniedrigung oder einem ungewöhnlichen Bandenmuster führen.)

8 TESTDURCHFÜHRUNG

8.1 Gelieferte Materialien

8.1.1 10 x MINIFIX gels (MINIFIX Gele, einzeln verpackt) 8.1.2 1 x Buffer powder (Pufferpulver) 8.1.3 1 x 100mL Protein stain (Protein-Färbelösung) 8.1.4 10 x MINIFIX Sample application masks (Proben-Applikationsmasken) 8.1.5 10 x MINIFIX Antisera templates (Antiserum-Applikationsmasken) 8.1.6 60 x Gel blotters (Gel-Blotpapier) 8.1.7 20 x Drying blotters (Trocken-Blotpapier) 8.1.8 10 x Sample blotters (Proben-Blotpapier) 8.1.9 1 x 1,5mL Protein fixative (Protein-Fixierer) 8.1.10 1 x 0,5mL Fix control serum (Kontrollserum) 8.1.11 1 x Anti-Human IgG (Fix), Anti-Human IgA (Fix), Anti-Human IgM (Fix), Anti-Human

Kappa (Fix), Anti-Human Lambda (Fix) (Antiseren-Set) 8.1.12 1 x Arbeitsanleitung

8.2 Zusätzlich benötigte, nicht im Kit enthaltene Materialien

8.2.1 Elektrophorese-Kammer und Spannungsquelle. 8.2.2 Verschiedene Pipetten, Mikropipetten, Messzylinder. 8.2.3 Ausrüstung zum Trocknen oder ein 45°C Inkubator. 8.2.4 Ausrüstung zum Waschen und Trocknen von Gelen. 8.2.5 5% v/v Essigsäure als Entfärbelösung und zur Verdünnung der Protein-Färbelösung. 8.2.6 Feuchte Kammer (verschließbare Box, die angefeuchtetes Papier enthält) falls die

Gelbox und der Trockner nicht verwendet werden. 8.2.7 Waschlösung (0,85% Kochsalzlösung (NaCl)). 8.2.8 Destilliertes Wasser. 8.2.9 Gelpresse oder Gewicht um das Gel zu pressen.

8.3 Vorbereitung der Reagenzien

8.3.1 Pufferpulver. Das Pufferpulver in ein Gefäß geben und in 1500mL destilliertem Wasser lösen. Der Puffer löst sich schneller, wenn man die Lösung mit den Magnetrührer rührt. Für jede Elektrophorese frischen Puffer verwenden.

8.3.2 Protein-Färbelösung. Gut schütteln und vor Gebrauch mit 5% (v/v) Essigsäure auf 1L auffüllen.

8.3.3 Waschlösung. 0,85% Natriumchlorid-Lösung, vor Gebrauch frisch ansetzen und nur einmal verwenden.

8.3.4 Antiserum und Protein-Fixierer. Werden gebrauchsfertig geliefert.

8.3.5 Kontrollserum. Das Kontrollserum genauso wie eine Patientenprobe behandeln – siehe unten. Sie dient zur Überprüfung der Reaktivität der Antiseren und der Elektrophorese.

8.3.6 MINIFIX Gele. Um eine Verunreinigung der Gele zu vermeiden, sollte nach Möglichkeit in einer staubfreien Umgebung gearbeitet werden. Die Gelbox aus der Folie nehmen und den Deckel entfernen. Das Gel nur direkt vor dem Auftragen der Proben entnehmen um ein Austrocknen zu vermeiden. Zum Herausnehmen des Gels die zwei diagnonal gegenüberliegende Ecken nach unten biegen, so dass das Gel von unten herausgenommen werden kann. Die Oberfläche des Gels nicht berühren! Gelboxen für die Fixierung aufbewahren.

Es können zwei Patientenproben auf ein Gel aufgetragen werden.


8.4 Vorbereitung der Proben

8.4.1 Serum:

8.4.1.1 Zur Identifizierung von IgG, IgA, IgM, Kappa und Lambda die Proben vor dem Auftragen 1/10 mit Puffer verdünnen (z.B. 25µL Serum + 225µL Puffer).

8.4.1.2 Auf die Referenzspur (Total Serum Protein - TSP) werden die Proben mit einer 1/2-Verdünnung aufgetragen (z.B. 100µL Serum + 100µL Puffer).

8.4.1.3 Proben, bei denen eine hohe Konzentration eines monoklonalen Proteins erwartet wird, (z.B. Myelom Proben > 15 g/L) vor dem Auftragen mit Puffer derart verdünnen, dass sie eine ungefähre Immunglobulin-Konzentration von 1g/L aufweisen.

8.4.1.4 Proben, bei denen eine niedrige Konzentration eines monoklonalen Proteins erwartet wird, sollten für eine optimale Detektion folgendermaßen verdünnt werden:

i) IgG <15g/L 1/10 verdünnen (10L Serum+ 90L Puffer)

ii) IgA, IgM, Kappa and Lambda: 1/5 verdünnen (20L Serum + 80L Puffer).

8.4.2 Urin: Mit diesem Kit können ebenfalls Bence-Jones-Proteine in Urinproben nach gewiesen werden.

8.4.2.1 Den Urin auf eine Proteinkonzentration von mindestens 1g/L ankonzentrieren.

8.4.2.2 Die im Antiserum-Set des Kits enthaltenen anti-Kappa und anti-Lambda Antiseren präzipitieren sowohl freie als auch gebundene Leichtketten.

8.4.2.3 Zum spezifischen Nachweis von freien Leichtketten müssen spezielle Antiseren (anti-human Freie Leichtkette Kappa - Bestell-Nr. PX016; (anti-human Freie Leichtkette Lambda - Bestell-Nr. PX018) verwendet werden.

8.5 Auftragen der Proben

8.5.1 Überschüssige Feuchtigkeit auf der Geloberfläche mit dem Gel-Blotpapier entfernen. Dazu das Gel-Blotpapier vorsichtig auf die Geloberfläche legen und leicht darüberstreichen und wieder entfernen.

8.5.2 Die Proben-Applikationsmaske auf das Gel auflegen, wobei die Auftrags-Schlitze auf gleicher Höhe wie die Markierung an der Seite des Gels und genau über je einer Spur befinden (siehe Abbildung).

8.5.3 Vorsichtig mit einem Finger von einer Seite auf die andere Seite der Proben-Applikationsmaske streichen, so dass sie möglichst flach und ohne Luftblasen aufliegt. Hinweis: Das sorgfältige Auflegen der Proben-Applikationsmaske ist wichtig für eine gleichmäßige Elektrophorese des Gels.

8.5.4 2,5µL der 1/2 verdünnten Proben sorgfältig in den ersten Auftragsschlitz (TSP) der Applikationsmaske auftragen, dann je 2,5µL der Probe (in geeigneter Verdünnung) in die übrigen Schlitze auftragen. Geeignete Pipetten verwenden.

8.5.5 Die Proben fünf Minuten lang in das Gel diffundieren lassen. In der Zwischenzeit die Elektrophoresekammer, wie in Abschnitt 8.6 beschrieben, vorbereiten.

8.5.6 Nach 5 Minuten überschüssige Probe mit einem Proben-Blotpapier von der Proben-Applikationsmaske entfernen. Die Proben-Applikationsmaske entfernen. Blotpapier und Proben-Applikationsmaske entsorgen.

8.6 Elektrophorese

8.6.1 Die Kammern einer geeigneten Elektrophorese-Kammer mit Puffer füllen. Jedes Labor sollte das Elektrophoreseequipment bzgl. der Anwendung dieses Kits validieren.

8.6.2 Die Geräte-spezifischen Angaben beachten. Spannungsquelle, Kabel und Elektrophorese-Kammer vor Gebrauch auf mögliche Schäden überprüfen.

8.6.3 Gel(e) mit der Agarose-Seite nach oben in die Gelhalterung oder Elektrophoresebrücke einsetzen, dabei darauf achten, dass die mit + markierte Seite zur positiven und die mit – markierte Seite zur negativen Elektrode gerichtet ist. Elektrophorese-Kammer schließen.

8.6.4 Gel-Elektrophorese durchführen. Die Dauer und die Spannungseinstellung sind so zu wählen, dass eine klare Trennung der Banden erhalten wird. Dies sollte zuvor innerhalb der Validierung der Elektrophoreseeqipments (Tank und Stromversorgung) festgelegt werden. Ebenso sollte zuvor sichergestellt werden, daß die auf das Gel aufgetragenen Proben in der korrekten Position laufen (siehe Abschnitt 9.2.6).

8.6.5 Nach der Elektrophorese sollte der Puffer entsorgt und der Tank entsprechend der gerätespezifischen Anleitung gereinigt werden. Fehlerhafte Reinigung des Tanks kann zu einer reduzierten Migration der Proben auf dem Gel führen.

8.7 Immunfixation

8.7.1 Nach der Elektrophorese das Gel aus dem Elektrophorese-Tank nehmen und die überschüssige Feuchtigkeit auf der Geloberfläche mit einem Gel-Blotpapier entfernen.

8.7.2 Die Immunfixation sofort durchführen, da ansonsten die Banden aufgrund der

Diffusion der Proteine unscharf werden.

8.7.3 Eine Antiserum-Applikationsmaske auf das Gel legen. Dabei an der Markierung in der linken oberen Ecke und an der TSP Spur orientieren. Vorsichtig mit einem Finger über die Maske streichen, um sie überall gleichmäßig an das Gel anzudrücken.

8.7.4 Einen Tropfen destilliertes Wasser in die Gelbox geben, damit das Gel flach aufliegt und dann das Gel in die Gelbox legen.

8.7.5 Einen Tropfen Protein-Fixierer auf die Referenzspur (TSP) und je einen Tropfen des entsprechenden Antiserums auf die vorgesehene Spur auftragen.

Hinweis: Dabei die Tropffläschchen senkrecht über das Gel halten und durch sanftes Drücken jeweils ein Tropfen (ca. 50µL) auftropfen.

a-Hu-IgG am unteren a-Hu-IgM am unteren a-Hu-IgA am Rand der IgG- Rand der IgM- oberen Rand der Spur aufgetragen Spur aufgetragen IgA-Spur aufgetragen

usw.

8.7.6 Die Antiseren und Fixierlösung versetzt auftragen, d.h. in einer Spur wird das Antiserum unten, in der nächsten oben aufgetragen. Dadurch wird eine Vermischung der Reagenzien vermieden (siehe Abbildung oben).

8.7.7 Nach jedem Auftropfen das Gel leicht schräg halten, damit sich das Antiserum bzw. die Fixierlösung sich gleichmäßig auf der Spur verteilen kann. Darauf achten, das kein Reagenz verschüttet und die Geloberfläche nicht mit der Tropfflasche berührt wird.

8.7.8 Das Gel (mit aufgelegter Applikationsmaske) in der geschlossenen Gelbox 30 Minuten in einem Inkubator bei 45°C inkubieren. Alternativ kann das Gel in einer feuchten Kammer bei 45°C in einem Laborinkubator für 30 Minuten inkubiert werden.

Hinweis: Durch Verwendung der ‚QuickFix-Methode„ kann die Zeit für die Immunfixation verkürzt werden (siehe Abschnitt 8.9). Bei einer Inkubationsdauer von 30 Minuten muss das Gel nach Standardvorschrift gewaschen und gepresst werden (10 Minuten pro Schritt).

8.7.9 Die Antiseren und Protein-Fixierer können auch auf das Gel pipettiert werden.

Jeweils 50L auftragen.

8.8 Waschen und Färben

8.8.1 Zum Waschen und Färben werden die folgenden Lösungen empfohlen, die in ein geeignetes Gefäß gefüllt werden sollten:

Behälter Lösung

1 2 3 4 5

0,85% Kochsalzlösung (NaCl) 0,85% Kochsalzlösung (NaCl) Protein-Färbelösung (entsprechend verdünnt) Entfärber 1 (5% v/v Essigsäure) Entfärber 2 (5% v/v Essigsäure)

8.8.2 Nach der Immunfixation die Antiserum-Applikationsmaske entfernen und das Gel in eine geeignete Gelhalterung schieben.

8.8.3 Gelhalterung in den Behälter 1 (0,85% Kochsalzlösung) eintauchen und dort für 10 Minuten belassen.

8.8.4 Gel aus der Gelhalterung nehmen und in einer geeigneten Gelpresse pressen.

Empfehlungen zum Pressen der Gele:

Ein Gelblottpapier unter das Gel legen.

Ein Gelblottpapier auf das Gel legen. Darauf achten, daß das Gelblottpapier faltenfrei auf dem Gel aufliegt.

Ein Trockenpapier auf das obere Gelblottpapier auflegen.

Gel(e) 10 Minuten in Gelpresse belassen.

8.8.5 Gel aus der Gelpresse nehmen, Blotpapiere verwerfen und wieder in die Gelhalterung einsetzen. Gelhalterung in den Behälter 2 (0,85% Kochsalzlösung) eintauchen und dort für 10 Minuten belassen.

8.8.6 Gel wie unter Punkt 8.8.4 beschrieben pressen (Frische Blotpapiere verwenden).

Hinweis: Bei Verwendung der QuickFix-Methode kann die Zeit für das Waschen

und Pressen der Gele reduziert werden – siehe Abschnitt 8.9.

8.8.7 Das Gel ca. 5 Minuten in einem geeigneten Trockner mit vollständig trocknen.

8.8.8 Das Gel wieder in die Gelhalterung setzen und in Behälter 3 (Proteinfärber) eintauchen bis es ausreichend gefärbt ist (ca. 1 Minute).

8.8.9 Gel in Behälter 4 (5% Essigsäure) entfärben bis die Hintergrund-Färbung nachlässt.

8.8.10 Gelhalterung anschließend in Behälter 5 (5% Essigsäure) eintauchen, um eine vollständige Entfärbung zu gewährleisten (ca. 1 Minute für jeden Entfärbe-Schritt).

8.8.11 Das Gel in einem geeigneten Trockner vollständig trocknen.

Hinweis: Das Waschen und Anfärben kann auch in anderen geeigneten Behältern durchgeführt werden. Das Gel kann auch alternativ in einem Labortrockner getrocknet werden.

8.9 QuickFix-Methode

Die Gesamtdauer der Immunfixation, inklusive Waschen und Trocknen, kann folgendermaßen verkürzt werden.

Immunfixation bei 45C 10 min.

1. Wascschritt 5 min.

1. Pressschritt 5 min.

2. Waschschritt 5 min.

2. Pressschritt 5 min.

Die Zeiten für die Diffusion der Probe in das Gel und die Elektrophorese, wie in den Abschnitten 8.5.6 und 8.6.4 angegeben, bleiben unverändert.


Achtung: Bei Verwendung der QuickFix-Methode können bei IgM-Myelom-Seren in allen Spuren Banden auftreten. In solchen Fällen wurde unfixiertes, monoklonales Protein nicht vollständig ausgewaschen. Ist ein Gel schwierig zu interpretieren, dann sollte die Probe mit der Standardmethode erneut getestet werden.

9 ERGEBNISSE

9.1 Das Kontrollserum Das im Kit enthaltene Kontrollserum sollte in jeder Immunglobulin- und Leichtkettenspur eine scharfe Bande zeigen. Die TSP-Referenzspur sollte in denselben Positionen entsprechende Banden aufweisen. Bei Fehlen einer Bande: siehe Trouble Shooting, Abschnitt 10.3. 9.2 Patientenproben Eine angefärbte Band entsteht durch die Reaktion zwischen dem Antiserum und einem Protein (Antigen) in der Probe.

9.2.1 Normale Proben zeigen eine schwache oder keine Anfärbung in der Gamma-Zone. 9.2.2 Erhöhte Konzentration an polyklonalem Immunglobulin: dies kann eine starke aber

diffuse Anfärbung ohne klare Bande erzeugen. 9.2.3 Monoklonales Protein erscheint als eine scharfe, abgegrenzte Bande sowohl in der

TSP-Spur, als auch in der Spur der entsprechenden Immunglobulin-Klasse und Leichtkette. Die Position ist in allen Spuren gleich, siehe nachfolgendes Beispiel.

(IgG K) (IgM K)

9.2.4 Proben, bei denen nur ein Leichtketten-Bande gefunden wird, müssen weiter

untersucht werden, da dies als Hinweis auf freie Leichtketten oder monoklonales IgD oder IgE ist (Antiseren von Binding Site, Bestell-Nr. PX013 and PX014).

9.2.5 Bei sehr hohen Proteinkonzentrationen kann eine klare Zone im Zentrum einer

starken Bande aufgrund eines Antigenüberschusses auftreten (Pro-Zonen-Effekt). Diese Proben (falls erforderlich) mit in einer höheren Verdünnung erneut testen.

9.2.6 Bei allen Proben sollte die Albumin-Bande in der TSP-Spur bei der 2. großen

Markierung (von oben ausgehend) liegen (siehe Trouble Shooting 10.3: Punkte 10 und 12 falls Proben zu weit oder zu kurz während der Elektrophorese gewandert sind).

10 GRENZEN DER METHODE

Dieser Kit dient nur zur Unterstützung der Diagnose. Ein positives Ergebnis weist auf bestimmte Erkrankungen hin, die durch den klinischen Befund und andere serologische Befunde bestätigt werden müssen. Die mit diesem Kit erhaltenen Ergebnisse sind kein Beweis für das Vorhandensein/Nicht-Vorhandensein einer Krankheit. 10.1 Spezifische Grenzen des Tests

10.1.1 Keine Plasmaproben verwenden, da das Fibrinogen in der Beta-Region im

Agarosegel anhaften und dadurch die Interpretation erschweren kann.

10.1.2 Proben mit hohem Gehalt an Rheumafaktoren oder Immunkomplexen können in der IFE ungewöhnliche Ergebnisse erzeugen, z.B. Präzipitationsbanden am Anfang der Spur.

10.2 Bei der Benutzung des Elektrophoreseequipments bitte die Angaben des

Herstellers sorgfältig beachten. Besondere Aufmerksamkeit ist der Installation der Geräte zu widmen. Die Geräte müssen den Vorschriften des Herstellers nach gewartet und gepflegt werden.

10.3 FDA (USA) Informationen siehe englische Arbeitsanleitung. 10.4 Trouble Shooting

Problem Mögliche Ursache(n) Mögliche Lösung(en)

1 Keine scharfen Banden in allen Antiserum-Spuren.

Normale Probe. Keine Wiederholung notwendig.

2 Scharfe Banden in allen Antiserum-Spuren.

a) Fibrinogen anwesend (normalerweise in Beta-Region).

MINIFIX mit Serum wieder-holen.

b) Monoklonales Protein haftet unspezifisch am Gel.

Monoklonales Protein ahand der stärksten Bande identifizieren.

3 Monoklonale Kappa- oder Lambda-Bande, aber keine IgG-, A- oder M-Bande.

a) Leichtketten-Myelom, Bence-Jones Protein (bei Urin-Proben).

MINIFIX mit Antiseren gegen freie Leichtketten, anti-IgD und anti-IgE wiederholen.

b) IgD- oder IgE-Myelom.

4 Monoklonale IgG-, A- oder M-Bande, aber keine Leichtketten-bande.

Schwache Reaktion der Leichtketten oder Schwerketten-Erkrankung.

Leichtketten-Immunfixation mit stärker konzentrierten Probe wiederholen.

5 Dunkler, länglicher Ring (blasses oder klares Zentrum).

Überschuss an monoklonalem Antigen.

Probe verdünnen und MINIFIX wiederholen.

Problem Mögliche Ursache(n) Mögliche Lösung(en)

6 Banden mit schlechter Auflösung.

a) Erhöhte Konzentration an polyklonalen Immun-globulinen.

MINIFIX zur Bestätigung wiederholen.

b) Vorgegebene Elektro-phorese- und Inkuba-tionszeiten nicht eingehalten Fehlerhaftes Auftragen des Antiserums.

MINIFIX wiederholen Elektrophorese-, Inku-bationszeiten und -temperatur (45°C) überprüfen. Antiseren sorgfältig auftragen.

7 Atypisches Elektro-phoresemuster.

Unebenes Gel. MINIFIX mit ebenen Gel wiederholen, sicherstellen, dass Gele flachliegend gelagert werden.

8 Dunkler Hintergrund. Waschen vor dem Anfärben nicht ausreichend.

MINIFIX mit der korrekten Waschdauer und frischer Kochsalzlösung wiederholen.

9 Verzogenes oder gerissenes Gel (nach der Elektrophorese).

Puffer nicht korrekt gelöst oder Puffer ist verdorben.

MINIFIX mit frischem Puffer wiederholen.

10 Keine Albumin-Bande in der TSP-Spur.

a) Elektrophoresedauer zu lang.

Mit verkürzter Elektro-phoresedauer wiederholen.

b) Spannung zu hoch. Spannung reduzieren.

c) Gel-Enden zu tief in den Puffer eingetaucht.

Kleineres Puffervolumen einfüllen.

11 Fehlende Bande(n) bei Kontrollserum.

a) Kontrollserum oder Antiserum nicht auf-getragen oder nicht korrekt verdünnt.

MINIFIX wiederholen.

b) Antiserum oder Kontroll-serum unbrauchbar.

Lieferfirma informieren.

12 Probe zu kurz gewandert.

Salzablagerung an der Anode (verminderter Stromfluss).

MINIFIX mit gründlich gereinigter Elektrophorese-Kammer wiederholen.

Kann ein Problem nicht gelöst werden, wenden Sie sich bitte an Ihre Lieferfirma.

11 ERWARTETE ERGEBNISSE UND LEISTUNGSDATEN

50 Serumproben, die monoklonale Immunglobuline enthalten, wurden in einer kontrollierten Studie mit dem IFE-Kit und dem MINIFIX-Kit von The Binding Site (Bestell-Nr. XK001 und XK004) zusammen mit zwei Kits anderer Hersteller getestet. Es gab mit allen Kits hinsichtlich der Immunglobulin-Klasse und des Typs der Leichtkette des monoklonalen Proteins vollständige Übereinstimmung..

12 REFERENZEN

12.1 Milford Ward A. (Ed) (1990). Protein Reference Unit Handbook of Clinical Immunochemistry, 5

th Edn. Publ. PRU Publications, Sheffield, UK. P152.



12.4. Johnson AM (1982). Immunofixation electrophoresis and electrofocusing. Clin. Chem. 28, 1797-1800.

12.5. Khan S & Bina M (1988). Sensitivity of immunofixation electrophoresis for detecting IgM paraproteins in serum. Clin. Chem. 34, 1633-1635.

12.6. Monos DS et al (1989). Evaluation and optimisation of variables in immunofixation electrophoresis for the detection of IgG paraproteins. Clin. Biochem.22, 369-371.

12.7. Whicher JT et al (1980). Clinical applications of immunofixation: a more sensitive technique for the detection of Bence Jones protein. J. Clin. Pathol. 33, 779-780.

13 KURZARBEITSANLEITUNG

MINIFIX QuickFix

1 Elektrophorese-Kammer mit Puffer füllen (Abschnitt 8.6).

2 Überschüssige Feuchtigkeit mit dem Gel-Blotpapier entfernen und Proben-Applikationsmaske auflegen.

3 Probenauftrag: 2,5µL (1/2 verdünnte Probe) auf die TSP-Spur und je 2,5µL Probe (empfohlene Verdünnung: 1/10) auf die übrigen fünf Spuren auftragen.

4 Probe in das Gel diffundieren lassen. 5 Minuten 5 Minuten

5 Überschüssige Probe mit Proben-Blotpapier entfernen, Proben-Applikationsmaske entfernen.

6 Elektrophorese der Proben (*siehe Abschnitt 8.6)

25-35 Minuten* 25-35 Minuten*

7 Gel blotten, Antiserum-Applikations-maske auf das Gel legen.

8 1 Tropfen Protein-Fixierer auf die TSP-Spur, je 1 Tropfen von jedem Antiserum auf die vorgesehene Spur auftragen.

9 Inkubation bei 45°C. 30 Minuten 10 Minuten

10 Waschen und pressen. 10+10 Minuten 5+5 Minuten

11 Schritt 10 wiederholen. 10+10 Minuten 5+5 Minuten

12 Gel trocknen und anfärben.


COFFRET MINIFIX™

Pour une utilisation en diagnostic in vitro

Référence : XK004 Produit fabriqué par : The Binding Site Group Ltd., 8 Calthorpe Road, Edgbaston, Birmingham, B15 1QT, UK. www.bindingsite.co.uk Distribué en France par la société : The Binding Site France, 14 rue des Glairaux, BP226, 38522 Saint-Egrève Cedex. Téléphone : 04.38.02.19.19 Fax : 04.38.02.19.20 e-mail : [email protected]

MINIFIX est une marque déposée par The Binding Site Group Ltd., Birmingham, UK.

1 UTILISATION

Ce coffret est destiné à l‟identification in vitro des immunoglobulines monoclonales (IgG, IgA ou IgM) et des chaînes légères (kappa ou lambda) dans le sérum et les urines, aidant ainsi au diagnostic des gammapathies monoclonales. Il peut également être utilisé avec d‟autres antisérums pour immunofixation Binding Site (cf. catalogue). Deux patients par gel peuvent être testés.

2 RESUME ET EXPLICATIONS

Une gammapathie monoclonale est un état primaire de maladie dans lequel un seul clone de plasmocytes produit des taux élevés d‟anticorps. Cet anticorps primaire comprend une seule classe et sous-classe de chaîne lourde et un seul idiotype et type de chaîne légère. Il est appelé paraprotéine, immunoglobuline monoclonale ou protéine M. Dans les urines, l‟anticorps produit est une chaîne légère libre monoclonale appelée protéine de Bence Jones. La présence d‟immunoglobuline monoclonale dans le sérum et les urines est associée à des malignités telles que la myélomatose, la macroglobulinémie de Waldenstrom et les lymphomes et moins communément avec d‟autres conditions bénignes (réf. 1).

L‟immunofixation est la séparation électrophorétique des protéines sur gel, suivie de leur immunoprécipitation avec des antisérums mono-spécifiques. De cette façon, la procédure IFE permet de séparer et d‟identifier différentes protéines dans un liquide biologique sur la base de leurs propriétés physico-chimiques et de leurs propriétés antigéniques. La technique IFE a été décrite par Afonso in 1964 (réf. 2) et a été modifiée par Alper et Johnson (réf. 3). IFE est utilisée maintenant en routine pour identifier les immunoglobulines monoclonales dans le sérum et les proteines de Bence Jones dans les urines.

L‟immunofixation est actuellement employée comme seconde étape dans l‟analyse immunologique des liquides biologiques. La première étape comprend normalement le dépistage des échantillons par électrophorèse des protéines sériques (SPE). Les échantillons montrant des résultats anormaux lors du dépistage sont testés en immunofixation et en quantification d‟immunoglobulines.

3 PRINCIPE DU TEST

Initiallement, les protéines dans un échantillon sont séparées par électrophorèse dans un gel d‟agarose. Chaque échantillon est déposé dans 6 pistes parallèles pour permettre la fixation consécutive des IgG, IgA, IgM, kappa, lambda et des protéines sériques totales (TSP). Chaque piste de l‟électrophorèse est recouverte et incubée avec une antisérum mono-spécifique et l‟immunofixation a lieu. Les complexes immuns en résultant sont bloqués dans la structure des pores du gel. L‟exception est la piste TSP dans laquelle un fixateur de protéines est déposé qui permet de précipiter toutes les principales bandes de protéines et par conséquent produit un tracé électrophorétique de référence pour l‟échantillon.

Après immunofixation, les protéines non précipitées et les anticorps non liés sont éliminés au lavage et le gel est pressé et séché. Les bandes précipitantes sont alors visualisées par marquage et le gel est séché pour fournir un enregistrement permanent. L‟interprétation est réalisée en examinant les bandes précipitantes présentes dans chacune des pistes.

4 REACTIFS

4.1 Gels MINIFIX (fournis dans des boîtes individuelles). Ils contiennent les conservateurs suivants : azide de sodium 0,099%, acide E-amino-n-caproïque

(EACA) 0,1%, benzamidine 0,01% et ProClin 300 à 0,05%. ProClin™ 300est une marque déposée par Rohm and Haas Corp. Philadelphie, PA.

4.2 Tampon en poudre. (Reconstitué : 50mmol/L 5,5 – sel de sodium d‟acide diéthylbarbiturique, acide 5,5 diéthylbarbituric 10mmol/L). Contient 0.099% (poids/poids) d‟azide de sodium. Pour une utilisation comme tampon d‟électrophorèse et comme diluant échantillon.

4.3 Marqueur de protéines. Il est fourni sous forme liquide concentrée 10 fois (Acid Blue 29 dans l‟acide acétique diluée).

4.4 Sérum de contrôle. Il est fourni sous forme liquide et comprend un mélange de sérums de myélomes humains qui donnent une bande précipitante dans chacune des pistes : IgG, IgA, IgM, kappa et lambda. Conservateurs : 0,1% EACA, 0,099% azide de sodium, 0,01% benzamidine.

4.5 Ensemble d‟antisérums. Comprenant des antisérums de mouton monospécifiques pour des chaînes lourdes humaines IgG, IgA et IgM et des chaînes légères libres kappa et lambda. Ils sont fournis en flacon à goutte colorés. Conservateurs : 0,1% EACA, 0,099% azide de sodium, 0,01% benzamidine et 1mmol/L EDTA.

4.6 Fixateur de protéines, comprenant de l‟acide sulphosalicylique à 5% (poids/volume) dans la solution d‟acide acétique à 5% (vol/vol).

5 PRECAUTIONS

Tous les sérums humains fournis dans ce coffret ont été testés et trouvés négatifs pour l‟antigène de surface de l‟hépatite B (Ag HBs), pour le virus de l‟hépatite C et pour les anticorps anti-virus de l‟immunodéficience humaine (HIV1 and HIV2). Les tests utilisés ont soit été approuvés par la FDA (USA) ou accepté pour un usage en diagnostic in-vitro par l‟union européenne (Directive 98/79/EC, Annexe II); néanmoins ces tests ne peuvent garantir l‟absence d‟agents infectieux Tous les échantillons doivent donc être manipulés comme des produits potentiellement infectieux. Seul un personnel qualifié dans la manipulation d‟échantillons potentiellement infectieux est autorisé à utiliser ce coffret.

Tous les réactifs de ce coffret à l‟exception du fixateur et du marqueur, contiennent 0,099% d‟azide de sodium comme conservateur et doivent être manipulés avec précaution – des gants appropriés et d‟autres vêtements de protection doivent être portés lors de toutes manipulation. Ne pas ingérer ou avoir de contact avec la peau (spécialement sur les zones

abîmées) ou des muqueuses. En cas de contact, laver à grande eau et consulter un médecin. Des azides de métaux explosifs peuvent se former avec le cuivre et le plomb. Laver à grande eau les récipients ayant contenu ces réactifs afin d‟éviter la formation des azides.

Ce réactif doit être utilisé uniquement par un personnel averti. Il est recommandé de suivre scrupuleusement la procédure. La validité des résultats obtenus en utilisant d‟autres méthodes que celles établies ne peuvent être garanties.

Des réactifs ayant différents numéros de lot ne sont pas interchangeables. Si de grandes séries de tests sont réalisées, s‟assurer que tous les réactifs proviennent du même lot.

6 STOCKAGE ET STABILITE

6.1 Contenu de la boîte 1 (gels, tampon etc) doit être stocké à température ambiante (18-26°C).

6.2 Contenu de la boîte 2 (antisérums, sérum de contrôle etc) doit être stocké à 2-8°C. NE PAS CONGELER. De légères précipitations peuvent se produire dans les antisérums lors du stockage. Elles peuvent être éliminées par centrifugation et n‟affectent en rien les performances.

Tous les composants sont stables jusqu‟à la date de péremption indiquée sur l‟étiquette du flacon.

6.3 Gels MINIFIX. Les gels doivent être stockés à plat et ne doivent pas être congelés. Eviter les températures extrêmes. Lorsque la température de la pièce dépasse 26°C, il est recommandé que les gels soient stockés à 2-8°C.

6.4 Tampon en poudre. Une fois reconstitué, le tampon doit être stocké à température ambiante pendant 60 jours dans un récipient fermé. La présence de précipité dans le tampon reconstitué indique une détérioration et un tel tampon doit être éliminé.

6.5 Marqueur de protéines. Une fois dilué, il peut être stocké à température ambiante (18-26°C) pendant 60 jours dans un récipient fermé.

7 COLLECTE ET PREPARATION DES ECHANTILLONS

Des sérums frais ou congelés doivent être utilisés. Les échantillons de plasma ne sont pas recommandés à cause de la présence de fibrinogène. Les échantillons doivent être collectés par ponction veineuse. Laisser coaguler naturellement et séparer le sérum dès que possible afin d‟éviter l‟hémolyse. Le sérum peut être stocké à 2-8°C pendant 48 heures ou pour une période prolongée à -20°C ou à une température inférieure. Les congélations et décongélations successives doivent être évitées. Les sérums lipidiques, hémolysés, contaminés par des bactéries ou contenant des particules de matiére ne doivent par être utilisés.

8 METHODOLOGIE

8.1 Matériel fourni

8.1.1 10 x MINIFIX gels (gels MINIFIX emballés individuellement) 8.1.2 1 x Buffer powder (tampon en poudre) 8.1.3 1 x 100mL Protein stain (marqueur de protéine) 8.1.4 10 x MINIFIX Sample application masks (masques de dépôt des échantillons) 8.1.5 10 x MINIFIX Antisera templates (masques de dépôt des antisérums) 8.1.6 60 x Gel blotters (buvards pour gel) 8.1.7 20 x Drying blotters (buvards de séchage) 8.1.8 10 x Sample blotters (buvards échantillon) 8.1.9 1 x 1,5mL Protein Fixative (protéine fixative) 8.1.10 1 x 0,5mL Fix control serum (sérum de contrôle) 8.1.11 1 x Anti-Human IgG (Fix), Anti-Human IgA (Fix), Anti-Human IgM (Fix), Anti-Human

Kappa (Fix), Anti-Human Lambda (Fix), (ensemble d‟antisérums) 8.1.12 1 x fiche technique

8.2 Matériel nécessaire et non fourni

8.2.1 Cuve d‟électrophorèse et alimentation. 8.2.2 Différentes pipettes, micro-pipettes, cylindres de mesure. 8.2.3 Equipement séchant ou incubateur à 45°C. 8.2.4 Equipement de lavage et séchage du gel. 8.2.5 Acide acétique 5% vol/vol comme solution de décoloration et comme diluant du

marqueur de protéines. 8.2.6 Chambre humide (boîte plastique contenant du papier humide) lorsque l‟on n‟utilise

pas une boîte à gel et un sécheur. 8.2.7 Solution de lavage (tampon salin à 0,85%). 8.2.8 Eau distillée. 8.2.9 Presse à gel ou poids.

8.3 Préparation des réactifs

8.3.1 Tampon en poudre. Mettre tout le tampon en poudre dans un récipient pouvant contenir 1500mL. La poudre doit être dissoute avec 1500mL d‟eau distillée avant utilisation. Le mélange peut être facilité par l‟utilisation de barreaux aimantés. Des aliquots frais de tampon doivent être utilisés à chaque électrophorèse.

8.3.2 Marqueur de protéines. Mélanger bien et ajouter de l‟acide acétique 5% (vol/vol) qsp 1 litre avant utilisation.

8.3.3 Solution de lavage. Solution de chlorure de sodium à 0,85% fraîchement préparée.

A n‟utiliser qu‟une fois et éliminer. 8.3.4 Antisérum et fixateur de protéines. Fournis prêts à l‟emploi. 8.3.5 Sérum de contrôle. Le sérum de contrôle doit être traité exactement comme un

échantillon (cf. ci-dessous). Le contrôle doit être utilisé pour vérifier la réactivité des antisérums et pour vérifier que l‟électrophorèse a fonctionné.

8.3.6 Gels MINIFIX. Afin d‟éviter les contaminations, les gels doivent être utilisés dans un

environnement sans poussière. Sortir la boîte du gel du sachet aluminium et enlever le couvercle. Le gel doit être sorti de la boîte juste avant de déposer les échantillons afin d‟éviter le dessèchement. Le gel doit être enlevé de la boîte en glissant le doigt sous un coin du gel. Eviter de toucher la surface du gel. Garder la boîte pour la procédure de fixation.

8.4 Préparation des échantillons

8.4.1 Sérum

8.4.1.1 Pour l‟identification des IgG, IgA, IgM, kappa, lambda, les échantillons de sérum doivent être dilués au 1/10 dans du tampon (25µL de sérum plus 225µL de tampon) avant dépôt.

8.4.1.2 Les échantillons doivent être déposés dans la piste de référence (TSP) à une dilution au 1/2 (100µL d‟échantillon + 100µL de tampon).

8.4.1.3 Les échantillons suspectés de contenir des concentrations élevées en protéines monoclonales (ex : échantillons de myélomes >15g/L) doivent être dilués dans du tampon afin d‟obtenir une concentration approximative en immunoglobulines de 1g/L avant dépôt.


8.4.1.4 Les échantillons suspectés de contenir de faibles concentrations de protéines monoclonales doivent être dilués comme suit pour une détection optimale :

i) IgG <15g/L dilué au 1/10 (10µL + 90µL de tampon) ii) IgA, IgM, kappa et lambda dilué au 1/5 (20µL de sérum + 80µL de tampon

8.4.2 Urines

Les urines peuvent également être testées avec ce coffret pour détecter la présence de protéines de Bence Jones.

8.4.2.1 Les urines doivent être concentrées jusqu‟à obtenir une concentration minimum en protéines de 1g/L.

8.4.2.2 Les antisérums anti-kappa et anti-lambda inclus dans l‟ensemble des antisérums d‟immunofixation permettent de précipiter les chaînes légères libres ou liées à des chaînes lourdes.

8.4.2.3 Des anticorps dirigés contre les kappa et les lambda libres sont requis pour savoir si les chaînes légères sont sous forme libre (références Binding Site PX016 et PX018).

8.5 Dépôt des échantillons

8.5.1 Eliminer l‟excès d‟humidité à la surface du gel en utilisant un buvard à gel fourni.

8.5.2 Aligner les fentes aux extrémités du masque de dépôt de l‟échantillon au niveau des marques présentes sur les côtés du support du gel et déposer le sur le gel (cf. ci-dessous).

8.5.3 Passer doucement le doigt d‟un bord à l‟autre du masque pour assurer une bonne étanchéité et pour éliminer les bulles d‟air.

NB : L‟alignement du masque est essentiel.

8.5.4 Déposer doucement 2,5µL de l‟échantillon dilué au 1/2 dans la piste TSP et 2,5µL d‟échantillon dilué de façon appropriée dans les fentes restantes en utilisant une pipette appropriée.

8.5.5 Attendre 5 minutes que les échantillons aient diffusés dans le gel. Pendant ce temps, préparer la cuve d‟électrophorèse comme indiqué au paragraphe 8.6.

8.5.6 Après 5 minutes, déposer un buvard à échantillon. Enlever et éliminer le masque et le buvard.

8.6 Electrophorèse

8.6.1 Remplir chaque compartiment d‟une cuve à électrophorèse adaptée avec du tampon reconstitué en volume approprié. Il est fortement recommandé que les clients valident leurs équipements pour utilisation avec ces coffrets.

8.6.2 Suivre les instructions fournies avec l‟équipement. Vérifier les fusibles de l‟alimentation de la cuve avant utilisation.

8.6.3 Positionner les gels sur le support de l‟électrophorèse avec le gel orienté vers le haut en s‟assurant que les marques (+) et (-) sur le gel soient dirigées vers les électrodes positive et négative respectivement.

8.6.4 Procéder à l‟électrophorèse avec la durée et le voltage appropriés. Il est important de valider le temps et le voltage afin d‟obtenir la meilleure résolution possible des bandes.

Les associations « maison » entre cuve à électrophorèse et alimentation doivent être vérifiées pour s‟assurer que les échantillons sont testés sur les positions correctes – voir section 9.2.6.

8.6.5 Après l‟électrophorèse, le tampon d‟électrophorèse doit être éliminé et la cuve rincée avec de l‟eau du robinet. Les électrodes, particulièrement l‟anode doivent être nettoyées et nettoyage induit des migrations réduites des échantillons dans le gel.

8.7 Immunofixation

8.7.1 Après l‟électrophorèse, enlever le gel de la cuve et déposer un buvard doucement sur la surface du gel.

8.7.2 Le gel doit être immédiatement immunofixé afin d‟éviter la diffusion des protéines qui pourrait réduire la définition des bandes.

8.7.3 Aligner le masque pour antisérum sur le gel et faire adhérer doucement le masque au gel avec le doigt.

8.7.4 Ajouter une goutte d‟eau distillée dans la boîte du gel et remettre le gel dans la boîte. L‟eau permet que le gel soit déposé à plat au fond de la boîte.

8.7.5 Ajouter 1 goutte de la protéine fixative à la piste de référence (TSP) et 1 goutte de chaque antisérum à la piste d‟antisérum appropriée.

NB : Le flacon à goutte doit être tenu verticalement et pressé doucement pour

déposer une goutte (50µL). Le flacon doit être maintenu juste au-dessus du gel pour déposer complètement les 50µL.

Anti-IgG humain Anti-IgM humain Anti-IgA humain déposé en bas déposé en bas de la déposé en haut de de la piste IgG piste IgM la piste IgA etc.

8.7.6 Les antisérums et le fixateur de protéine doivent être déposés en quinconce afin d‟éviter les débordements des pistes adjacentes (cf. diagramme ci-dessus).

8.7.7 Après chaque addition d‟antisérum ou de protéine fixative, incliner le gel afin de s‟assurer que toute la piste soit recouverte. Eviter de verser l‟antisérum sur le gel ou de toucher la surface du gel avec l‟embout du flacon.

8.7.8 Incuber le gel (avec le masque en place) dans la boîte à gel fermée dans l‟incubateur pendant 30 minutes à 45°C. Vous pouvez également placer le gel dans une boîte humide et incuber à 45°C dans un incubateur de laboratoire pendant 30 minutes.

Note : La durée de l‟immunofixation peut être réduite en adoptant la procédure

Quickfix – cf. paragraphe 8.9. Cependant, si le gel a été incubé pendant 30 minutes, il doit être lavé et pressé comme la méthode standard pendant 10 minutes à chaque étape.

8.7.9 Il est également possible de pipeter les antisérums ou le fixateur de protéines ; 50µL de chaque antisérum/fixateur de protéines doivent être déposés dans chaque piste.

8.8 Lavage et marquage

8.8.1 Les solutions suivantes sont recommandées pour la procédure de lavage et de marquage dans un récipient adéquat :

N° de récipient Solution

1 2 3 4 5

Tampon salin à 0,85% Tampon salin à 0,85% Marqueur de protéines (correctement dilué) Décolorant 1 (acide acétique 5% vol/vol) Décolorant 2 (acide acétique 5% vol/vol)

8.8.2 Après l‟immunofixation, enlever le masque pour antisérum et placer le gel sur un support de gel.

8.8.3 Le placer doucement dans le récipient 1 (tampon salin à 0,85%). Laver 10 minutes.

8.8.4 Les gels sont pressés dans une presse à gel adaptée.

Recommendations pour la presse à gel :

Un buvard sous le gel

Un buvard au dessus du gel. Eviter de plissser le buvard en le pacant prudemment sur le gel.

Un buvard de séchage sur le ddessus du second buvard à gel.

Presser les gels pendant 10 minutes.

8.8.5 Enlever le gel de la presse et éliminer les buvards. Replacer le gel dans le support et le placer dans le récipient 2 (tampon salin à 0,85%) pendant 10 minutes.

8.8.6 Re-presser le gel comme décrit ci-dessus.

Note : La durée des étapes de lavage et de pression peut être réduite en adoptant

la procédure Quickfix – cf. paragraphe 8.9.

8.8.7 Sécher le gel complètement dans un incubateur pendant 5 minutes.

8.8.8 Remettre le gel sur le portoir et l‟immerger dans le récipient 3 (marqueur de protéines) pendant 1 minute.

8.8.9 Décolorer dans le récipient 4 jusqu‟à ce que le bruit de fond disparaisse.

8.8.10 Transférer dans le récipient 5 pour une décoloration complète (approximativement 1 minute pour chaque étape de décoloration).

8.8.11 Sécher le gel complètement dans un incubateur.

8.9 Procédure Quickfix

Pour réduire la durée de l‟immunofixation en utilisant ce coffret, adopter les temps indiqués ci-dessous :

Immunofixation à 45C 10 minutes

1er

lavage 5 minutes

1ère

pression 5 minutes

2ème

lavage 5 minutes

2ème

pression 5 minutes

Les durées des étapes de diffusion de l‟échantillon et d‟électrophorèse restent inchangées (cf. paragraphe 8.5.6 et 8.6.4).

Précautions : En utilisant la procédure Quickfix, certains échantillons avec des myélomes à IgM peuvent donner des bandes distinctes dans toutes les pistes d‟antisérums. Ceci est dû à la présence de protéine monoclonale non fixée qui n‟a pas été éliminée lors du lavage. Si l‟interprétation est difficile, l‟échantillon doit être retesté avec la procédure classique.

9 RESULTATS

9.1 Contrôle

Le contrôle inclus dans le set d‟antisérums doit montrer une bande distincte dans chaque piste et à la même position y compris dans la piste de référence. Si une bande est absente, cf. problèmes possibles paragraphe 10.3.


9.2 Echantillons de patients

La présence d‟une bande résulte de la réaction entre l‟antisérum et la protéine (antigène) dans l‟échantillon.

9.2.1 Les échantillons normaux ne donnent aucun marquage dans la région gamma.

9.2.2 Des immunoglobulines polyclonales peuvent donner un marquage fort mais diffus avec aucune bande distincte.

9.2.3 Une protéine monoclonale apparaît comme une bande distincte dans la piste de référence (TSP) et également dans la même position pour la classe d‟immunoglobuline appropriée et la chaîne légère (cf. exemple ci-dessous).

(IgG K) (IgM K)

9.2.4 Les échantillons donnant seulement une bande dans les chaînes légères requièrent d‟autres tests car ils peuvent être indicatifs de la présence de chaînes légères libres ou monoclonales IgD ou IgE (références Binding Site PX013 et PX014).

9.2.5 Les concentrations élevées en protéines peuvent induire une région claire au centre d‟une bande importante due à un excès d‟antigène. Ces échantillons peuvent si nécessaire être testés à nouveau à une dilution supérieure.

9.2.6 Pour tous les échantillons, la bande albumine dans la piste TSP doit migrer jusqu‟à la seconde grande marque d‟intégration à partir du haut du gel (cf. problèmes possibles 10.3, 10 et 12 si les échantillons migrent trop ou pas assez).

10 LIMITES DE LA PROCEDURE

Un diagnostic ne peut être fait et un traitement initié sur la base d‟une détection des immunoglobulines monoclonales seulement. L‟histoire clinique ainsi que d‟autres tests doivent être pris en considération.

10.1 Limites des tests spécifiques

10.1.1 Les plasmas ne doivent pas être utilisés car le fibrinogène adhère au gel dans la région béta et par conséquent gêne l‟interprétation.

10.1.2 Les échantillons contenant des concentrations élevées en facteur rhumatoïde ou en complexes immuns peuvent donner des résultats inhabituels en IFE, c‟est-à-dire des bandes de précipitation à l‟origine.

10.2 Lors de l‟utilisation d‟équipement, suivre prudemment les instructions du fabricant. Une attention particulière doit être accordée à la mise en place et à l‟installation du matériel. Les équipements doivent être maintenus et entretenus suivant les indications du fabricant.

10.3 Information FDA (USA), cf. première page.

10.4 Problèmes possibles

Problèmes possibles Cause(s) possible(s) Action(s) suggérées

1 Aucune bande distincte dans aucune piste.

Echantillon normal. Aucune action requise.

2 Bande distincte dans toutes les pistes.

a) Fibrinogène présent (habituellement dans la région béta).

Répéter l‟IFE en utilisant le sérum.

b) Protéine monoclonale collant de façon non spécifique au gel.

Identifier les protéines monoclonales pour les bandes les plus fortes.

3 Bande monoclonale kappa ou lambda, mais pas de bande IgG, A ou M.

a) Myélome à chaîne légère, protéine de Bence Jones (avec des échantillons urinaires).

Répéter l‟IFE en utilisant un antisérum anti-chaîne légère libre, un anti-IgD ou un anti-IgE.

b) Myélomes à IgD ou IgE.

4 Bande monoclonale IgG, A ou M mais pas de bande de chaîne légère.

Faible réaction en chaîne légère ou maladie des chaînes lourdes.

Répéter l‟immunofixation des chaînes légères avec un échantillon plus concentré.

5 Anneau allongé sombre (avec une région pâle ou claire au centre).

Excès d‟antigène monoclonal.

Diluer l‟échantillon et répéter l‟immunofixation.

6 Mauvaise résolution ou bandes faibles.

a) Immunoglobuline polyclonale élevée.

Repétér l‟immunofixation pour confirmer le résultat.

b) Electrophorèse et temps d‟incubation, mauvaise technique de dépôt de l‟antisérum.

Répéter l‟immunofixation, vérifier le temps d‟électrophorèse et le temps et la température d‟incubation

(45C) et déposer les antisérums avec précaution.

7 Aspect électrophorétique atypique.

Gel inégal. Répéter l‟immunofixation en utilisant un gel égal et s‟assurer que les gels sont stockés à plat.

8 Bruit de fond sombre. Lavage insuffisant avant coloration.

Répéter l‟immunofixation avec des temps de lavage corrects et une nouvelle solution saline.

Problèmes possibles Cause(s) possible(s) Action(s) suggérées

9 Gel déformé ou plié (après électrophorèse).

Tampon IFE mal reconstitué ou tampon épuisé.

Répéter l‟IFE avec du tampon frais.

10 Bande albumine manquante dans la piste TSP.

a) Temps d‟électrophorèse trop long.

Répéter l‟IFE et réduire le temps d‟électrophorèse.

Voltage trop élevé. Réduire le voltage.

Extrémités du gel immergées trop profondément dans le tampon.

Réduire le volume de tampon utilisé.

11 Bandes manquantes avec le contrôle.

a) Contrôle ou antisérum omis ou incorrectement dilué.

Répéter le test.

b) Détérioration de l‟antisérum ou du contrôle.

Se référer au fournisseur.

12 Migration courte des échantillons.

Dépôt de sel à l‟anode stoppant le courant.

Répéter l‟IFE après avoir nettoyé l‟anode.

Si un problème ne peut être résolu, se référer au fournisseur.

11 VALEURS ATTENDUES & PERFORMANCES SPECIFIQUES

50 sérums identifiés au préalable comme contenant des immunoglobulines monoclonales ont été testés avec les coffrets The Binding Site IFE et MINIFIX (XK001 et XK004 respectivement) et deux coffrets concurrents ont été utilisés. Il existe une corrélation parfaite entre les coffrets par rapport à la classe d‟immunoglobuline monoclonale et le type de chaîne légère obtenus dans tous les cas.

12 BIBLIOGRAPHIE









13 RESUME DE LA PROCEDURE

MINIFIX Quickfix

1 Remplir la cuve d‟électrophorèse avec du tampon (paragraphe 8.6).

2 Utiliser un buvard à gel et positionner le masque de dépôt de l‟échantillon sur le gel.

3 Déposer 2,5µL d‟échantillon dilué au 1/2 à la piste TSP et 2,5µL d‟échantillon dilué de façon appropriée dans les 5 autres pistes.

4 Laisser l‟échantillon pénétrer dans le gel.

5 minutes 5 minutes

5 Utiliser un buvard et enlever le masque.

6 Réaliser l‟électrophorèse des échantillons (*cf. paragraphe 8.6).

25-35 minutes* 25-35 minutes*

7 Utiliser un buvard, positionner le masque à antisérums sur le gel.

8 Déposer 1 goutte de fixateur de protéine à la piste TSP et 1 goutte de chaque antisérum à la piste de l‟antisérum approprié.

9 Incuber à 45°C. 30 minutes 10 minutes

10 Laver, presser et sécher le gel. 10+10 minutes 5+5 minutes

11 Répéter l‟étape 10. 10+10 minutes 5+5 minutes

12 Sécher le gel et colorer-le.


KIT MINIFIX™

Para el uso en el diagnóstico in vitro

Código de producto: XK004 Producto fabricado por: The Binding Site Group Ltd., 8 Calthorpe Road, Edgbaston, Birmingham, B15 1QT, UK. www.bindingsite.co.uk The Binding Site Spain S.L.U. C/ Balmes 243 4º 3ª, 08006 Barcelona Teléfono 902027750 Fax: 902027752 e-mail: [email protected] web: www.bindingsite.es MINIFIX™ es una marca de The Binding Site Group Ltd., Birmingham, UK

1 PROPÓSITO

Este kit es para la identificación in vitro de las inmunoglobulinas monoclonales (IgG, IgA o IgM) y de las cadenas ligeras (kappa o lambda) en suero u orina como apoyo en el diagnóstico de gamopatías monoclonales. Puede también utilizarse con otros antisueros Binding Site de Inmunofijación (ver catalogo). Deben testarse dos muestras de paciente por gel.

2 RESUMEN Y EXPLICACION

La gamopatía monoclonal es un estado primario de la enfermedad en la cual un solo clon de células de plasma provoca un aumento de los niveles de anticuerpos. Estos anticuerpos se clasificaron según la clase de cadena pesada y subclase, tipo de cadena ligera así como de idiotipo. Este anticuerpo se denomina paraproteína, inmunoglobulina monoclonal o proteína M. En la orina se detectan las cadenas ligeras monoclonales libres, es decir las proteínas Bence-Jones. La presencia de inmunoglobulina monoclonal en el suero o en la orina está asociada a diversas enfermedades, como por ejemplo: mieloma multiple, macroglobulinemia Waldenstrom‟s y linfoma, raramente con algunas enfermedades benignas (ref. 1).

El método de la electroforesis inmunofijación (IFE) se compone de la división por electroforesis de las proteínas en el gel seguido de una precipitación inmunológica con antisueros monoespecificos. Por ello, con la IFE se pueden dividir e identificar las diferentes proteínas en los líquidos biológicos por sus propiedades físico-químicas y antigénicas. La técnica IFE se desarrollo originariamente por Afonso en 1964 (ref. 2) y posteriormente modificada por Alper y Johnson (ref. 3). Actualmente, la IFE se emplea en la rutina para la determinación en suero de inmunoglobulinas monoclonales y en orina de proteínas Bence-Jones.

La IFE se emplea como segundo paso en el análisis de los fluidos biológicos. El primer paso, generalmente, es un screening por medio de electroforesis de proteínas séricas (SPE). Las muestras analizadas por SPE y con resultados anormales se analizaran posteriormente por inmunofijación cuantificándose el nivel de inmunoglobulina.

3 PRINCIPIO

Primeramente, las proteínas de la muestra se separan por electroforesis en gel de agarosa. Cada muestra se aplica a 6 pistas paralelas con el fin de fijar al mismo tiempo las inmunoglobulinas (IgG, IgA e IgM), cadenas kappa y lambda así como la proteína de suero total (TSP). Para la determinación de IgG, IgA, IgM, kappa y lamda se fija en cada una de las pistas con un anticuerpo monoespecífico e incubándose a continuación. Los complejos producidos por la inmunofijación se fijan por medio de la estructura del gel no pudiendo eliminarse por medio del lavado.

Tras la fijación, las proteínas no-precipitadas y anticuerpos no fijados se eliminan por lavado. Después se presiona y se deja secar. Las bandas de precipitación se pueden visualizar tras la tinción. Tras la tinción se seca el gel con el fin de obtener una documentación permanente. La interpretación se efectúa mediante la evaluación de las bandas de precipitación de cada una de las pistas.

4 REACTIVOS

4.1 Geles MINIFIX, (suministrados en bolsas individuales de aluminio). Conservantes: 0,099% de azida sódica, 0,1% de ácido E-amino-n-caproico (EACA), 0,01% de benzamidina y 0,05% ProClin™ 300. ProClin™ 300 es una marca de Rohm and Haas Corp. Philadelphia, PA.

4.2 Tampón en polvo, (reconstituido: 50mmol/L 5,5-sal sódica de ácido dietilbarbitúrico, 10mmol/L ácido 5,5-dietilbarbitúrico). Contiene 0,099% (p/p) azida sódica. Para usar como tampón de electroforesis y diluyente de muestra.

4.3 Colorante de proteínas. Se suministra en forma líquida en una concentración de 10 x consistente en Acid Blue 29 diluido en ácido acético.

4.4 Suero control. Suministrado en forma líquida consistente en una mezcla de sueros de mieloma humano dando una banda de precipitación en cada una de las pistas de IgG, IgA, IgM, kappa y lambda. Conservantes: 0,1% EACA, 0,099% de azida sódica, 0,01% benzamidina.

4.5 Conjunto de antisueros. Antisueros monoespecíficos de oveja a IgG, IgA, IgM humano, cadenas pesadas y cadenas ligeras kappa y lambda. Suministrados en botellas con código de colores. Conservantes: 0,099% de azida sódica, 0,1% EACA, 0,01% benzamidina y 1mmol/L de EDTA.

4.6 Fijador de proteína. 5% (w/v) de ácido sulfosalicílico en solución al 5% (v/v) de ácido acético.

5 ADVERTENCIAS

Los sueros humanos suministrados en el kit han sido sometidos a screening para donantes, resultando negativos a la presencia del antígeno de superficie de la hepatitis B y a la presencia de los anticuerpos de la ante los virus HIV1, HIV2 y HCV. Las técnicas usadas están aprobadas por la FDA (USA) o para el diagnóstico in vitro por la UE (Directiva 98/79/EC, Anexo II). Sin embargo los sobredichos ensayos no garantizan la ausencia de agentes infecciosos. Por lo tanto, deben tratarse los reactivos como potencialmente infecciosos. Tanto la manipulación como los métodos de eliminación de desechos deberán

realizarse conforme a la normativa de materiales infecciosos y solo personal adecuadamente instruido deberá efectuar el test. Todos los reactivos del kit, a excepción del fijador y colorante, contienen azida sódica 0,099% como conservante y deben ser manipulados con precaución, use guantes y vestuario protector adecuado en todo momento al manipular este producto. No trague ni permita el contacto con la piel o las mucosas (especilamente si hay heridas). En caso de contacto, lave con abundante agua y consulte a un médico.. La azida sódica puede formar azidas metálicas explosivas en contacto prolongado con tubos de plomo o cobre. Tras la eliminación aclarar con gran cantidad de agua con el fin de evitar depósitos de azida.

Se recomienda seguir el procedimiento descrito en estas instrucciones de empleo. De no seguir estas instrucciones, no se pueden garantizar los resultados.

NO SE PUEDEN mezclar reactivos con diferentes números de lote ni utilizar conjuntamente. En caso de realizar gran cantidad de pruebas, deberá tenerse en cuenta que todos los reactivos sean del MISMO LOTE.

6 ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD

6.1 Contenido caja 1 (geles, tampón, etc.) deben almacenarse a temperatura ambiente (18-26°C).

6.2 Contenido caja 2 (antisueros, suero control, etc.) deben almacenarse a 2-8°C. NO CONGELAR. Durante el almacenamiento puede aparecer una ligera precipitación, la cual puede eliminarse por centrifugación no afectando a las caracteristicas de realización.

Todos los componentes son estables hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta.

6.3 Geles MINIFIX. Deben almacenarse planos y NO DEBEN CONGELARSE. Evitar cambios de temperatura extremos. Si la temperatura ambiente sobrepasase los 26°C se recomienda almacenar los geles a 2-8°C.

6.4 Polvo de tampón. Una vez reconstituido se debe almacenar a temperatura ambiente hasta máximo 60 días en un recipiente cerrado. La presencia de precipitación en el tampón reconstituido indica deterioro del mismo y por lo tanto se debe deshechar.

6.5 Colorante de proteína. Una vez diluido se puede guarda a temperatura (18-26°C) ambiente hasta maximo 60 días en un recipiente cerrado.

7 TOMA Y PREPARACIÓN DE MUESTRAS

Para este test utilizar muestras de suero u orina recientes o congeladas (-20°C). No debe emplearse el plasma dado que la presencia de fibrinógeno puede dar resultados erróneos. Las muestras de suero se deben recolectar mediante extracción intravenosa, dejar coagular de forma natural y separar rápidamente el suero del coagulo con el fin de evitar hemólisis. Las muestras pueden almacenarse entre 2-8°C hasta 48 horas antes del análisis. Para una conservación más prolongada se recomienda congelar a -20°C o temperatura inferior sin diluir. Evitar repetidas congelaciones y descongelaciones. Evitar el uso de sueros lipémicos, hemolizados o contaminados por microbios (ya que se podrían obtener títulos inferiores o patrones de coloración poco claros).

8 METODOLOGÍA

8.1 Materiales suministrados

8.1.1 10 x MINIFIX gels (geles, embalados individualmente) 8.1.2 1 x Buffer powder (polvo de tampón) 8.1.3 1 x 100mL Protein stain (colorante) 8.1.4 10 x MINIFIX Sample application masks (plantilla aplicación muestras) 8.1.5 10 x MINIFIX Antisera templates (plantillas antisueros) 8.1.6 60 x Gel blotters (secantes de geles) 8.1.7 20 x Drying blotters (papeles secantes) 8.1.8 10 x Sample blotters (secantes de muestra) 8.1.9 1 x 1,5mL Protein Fixative (fijador de proteínas) 8.1.10 1 x 0,5mL Fix Control Serum (suero control) 8.1.11 1 x Anti-Human IgG (Fix), Anti-Human IgA (Fix), Anti-Human IgM (Fix), Anti-Human

Kappa (Fix), Anti-Human Lambda (Fix) (conjunto de antisueros) 8.1.12 1 x instrucciones

8.2 Materiales necesarios adicionalmente – no suministrados

8.2.1 Tanque de electroforesis y suministro eléctrico. 8.2.2 Pipetas, micropipetas y cilindros medidores. 8.2.3 Equipo para el secado o incubador a 45°C. 8.2.4 Equipo de lavado y secado de gel. 8.2.5 Ácido acético 5% v/v para la solución decolorante y diluyente colorante de proteína. 8.2.6 Cámara húmeda (p.ej. caja de plástico con cierre conteniendo papel de filtro

humedecido) cuando no se utilice una caja de gel y secador. 8.2.7 Solución de lavado (salina 0,85%). 8.2.8 Agua destilada. 8.2.9 Prensa para gel o peso.

8.3 Preparación de reactivos

8.3.1 Tampón en polvo. Dispense todo el polvo en un recipiente que pueda contener 1500mL. A continuación añadir 1500mL de agua destilada y disolver. El tampón se disuelve mejor y más rápido si se emplea agitador magnético. Emplear para cada electroforesis tampón recién hecho.

8.3.2 Solución colorante de proteínas. Agitar bien y añadir antes de usar ácido acético al 5% (v/v) hasta obtener 1 litro en total.

8.3.3 Solución de lavado. Solución 0,85% de cloruro sódico, preparación reciente. Utilizar una vez y descartar.

8.3.4 Fijador de antisuero y de proteínas. Listo para usar.

8.3.5 Suero control. Manipular el control igual que una muestra. Este sirve para la verificación de la reactividad de los antisueros y de la electroforesis.

8.3.6 Geles MINIFIX. Con el fin de evitar contaminación, deberán utilizarse los geles en ambientes libres de polvo. Extraer del embalaje la caja de gel y quitar la tapa. Extraer el gel solo inmediatamente antes de aplicar las muestras, para así evitar que se seque. Para sacar el gel doblar las esquinas diagonalmente opuestas hacia abajo, pudiendo extraerlo desde abajo. ¡NO TOCAR LA SUPERFICIE DEL GEL! Guardar las cajas para la fijación.

Pueden emplearse dos muestras en un mismo gel.

8.4 Preparación de las muestras

8.4.1 Suero

8.4.1.1 Para la determinación de IgG, IgA, IgM, kappa y lambda las muestras antes de la aplicación deben tener una dilución de 1/10 (p.ej. 25µL suero + 225µL tampón).

8.4.1.2 Sobre la pista de referencia (proteínas séricas totales – TSP) se aplican las muestras con una dilución a 1/2 dilución (100µL muestra + 100µL tampón).

mailto:[email protected]

http://www.bindingsite.es/


8.4.1.3 En muestras que se sospeche contengan altas concentraciones de proteína monoclonal (p.ej. Muestras de mieloma > 15g/L) antes de su aplicación, se deben diluir de tal forma que den una concentración de inmunoglobulina aproximada de 1g/L.

8.4.1.4 En muestras que se sospeche contengan concentraciones bajas deberán diluirse

según sigue:

i) IgG <15g/L diluir 1/10 (10L + 90L tampón)

ii) IgA, IgM, kappa y lambda, diluir 1/5 (20L suero + 80L tampón) 8.4.2 Orina

Con este kit también se pueden determinar proteínas Bence-Jones en orina. 8.4.2.1 Concentrar la orina a una concentración de proteínas de mínimo 1g/L. 8.4.2.2 Los antisueros anti-kappa y anti-lambda contenidos en el conjunto de antisueros,

precipitan tanto las cadenas ligeras libres como ligadas. 8.4.2.3 Para la determinación especifica de cadenas ligeras deberán emplearse antisueros

especiales (anti-kappa free – número de artículo PX016; anti-lambda free - número de artículo PX018).

8.5 Aplicación muestra

8.5.1 Eliminar con suavidad la humedad excesiva de la superficie del gel con uno de los secantes de geles suministrados.

8.5.2 Colocar sobre el gel la plantilla de aplicación de las muestras, de tal forma que las

ranuras estén a la misma altura que la marca lateral y justo sobre cada una de las pistas (ver diagrama).

8.5.3 Con un dedo presionar cuidadosamente de un lado a otro la plantilla de aplicación,

asegurándose un buen cierre y la eliminación de burbujas.

Nota: Es muy importante para una electroforesis homogénea, que la plantilla esté bien.

8.5.4 Aplicar con cuidado 2,5µL de la muestra diluidas 1/2 a la primera ranura (TSP) de

la plantilla de aplicación y a continuación 2,5µL de muestra (con dilución apropiada) en las demás ranuras.

8.5.5 Dejar las muestras se difundan el gel durante 5 minutos. Mientras tanto, preparar la

cámara de electroforesis según se describe en el punto 8.6. 8.5.6 Tras 5 minutos, eliminar el exceso de muestra con un secante de muestra. Retirar

la plantilla de aplicación de muestra. Retirar la plantilla y el secante. 8.6 Electroforesis

8.6.1 Llene un compartimento de una cubeta de electroforesis adecuada, con un

volumen adecuado o tampón reconstituido. Se recomienda que los clientes validen el equipo de uso de este kit.

8.6.2 Siga las instrucciones suministradas con el equipo. Compruebe las conexiones de

la fuente de alimentación y de la cubeta antes de su uso. 8.6.3 Colocar los geles sobre el puente o contenedor de la cámara electroforética, con la

agarosa cara arriba, asegurándose que los extremos marcados como positivo (+) y negativo (-) del gel coinciden con los electrodos positivo y negative.

8.6.4 Realice la electroforesis del gel(es) en las condiciones adecuadas de tiempo y

voltaje, como se indica a continuación. Es importante ajustarse a los tiempos y voltaje para asegurar una resolución clara de las bandas. El usuario debe hacer pruebas de combinación con las cubetas y fuente de alimentación para asegurar que las muestras en los geles migran hasta la posición correcta – ver sección 9.2.6.

8.6.5 Después de la electroforesis de los geles, se debe eliminar el tampón de

electroforesis y limpiar la cubeta con agua del grifo, según el manual de instrucciones del equipo. Si no se limpia la cubeta se pueden producir migraciones cortas de las muestras en el gel.

8.7 Inmunofijación

8.7.1 Tras la electroforesis sacar el gel de la cubeta y eliminar la humedad excesiva de la superficie con un secante de gel.

8.7.2 Realizar inmediatamente la inmunofijación, para prevenir difusión de proteínas la

cual reduce la nitidez de la migración. 8.7.3 Colocar una plantilla de antisuero sobre el gel siguiendo las marcas de

alineamiento en la parte superior izquierda y del TSP. Pasar con cuidado con un dedo sobre la plantilla con el fin de cerrarla homogéneamente.

8.7.4 Añadir una gota de agua destilada a la caja del gel y devolver el gel a la caja. El

agua asegura que el gel está liso para el uso dentro de la caja.

8.7.5 Aplicar una gota del fijador de proteína sobre la pista de referencia (TSP) y una gota del antisuero a cada una de las pistas correspondientes.

Nota: Mantener la botella dispensadora verticalmente sobre el gel y presionando ligeramente aplicar una gota (aproximadamente 50µL).

a-Hu IgG aplicada a-Hu IgM aplicada a-Hu IgA aplicada en la base de la en la base de la en la parte superior banda de IgG banda de IgM de la banda de IgA, etc.

8.7.6 Los antisueros y los fijadores se deben aplicar alternativamente para prevenir contaminacion cruzada en las pistas adyacentes (ver esquema).

8.7.7 Tras cada adición de fijador o antisuero, mantener el gel ligeramente inclinado, para que se pueda distribuir homogéneamente el antisuero o el fijador sobre la pista. Tener cuidado de no salpicar reactivo y de que la botella dispensadora toque la superficie del gel.

8.7.8 Incube el gel (con el aplicador) dentro de la caja del gel en un incubador de laboratorio durante 30 minutos a 45°C. Como alternativa, coloque el gel en una cámara húmeda e incube a 45°C en un incubador de laboratorio durante 30 minutos.

Nota: El tiempo de la inmunofijación se puede acortar empleando el método Quickfix (ver sección 8.9). Con una duración de incubación de 30 minutos el gel debe ser lavado y prensado según el método estándar (10 minutos para cada paso).

8.7.9 También es posible pipetar los antisueros y fijadores de proteína sobre el gel. Para

ello se aplica un volumen de 50L.

8.8 Lavado y tinción

8.8.1 Se recomiendan las siguientes soluciones para el proceso de lavado y coloración en un contenedor adecuado:

Contenedor Solución

1 2 3 4 5

Salina al 0,85% Salina al 0,85%

Colorante de proteínas diluído Decolorante 1 (5% v/v ácido acético) Decolorante 2 (5% v/v ácido acético)

8.8.2 Después de la inmunofijación, retire el aplicador de antisuero y coloque el gel en uno de los soportes para gel.

8.8.3 Con cuidado colocar el soporte en el contenedor 1 (solución salina al 0,85%). Dejar dentro 10 minutos.

8.8.4 Los geles se prensan en una prensa de gel adecuada.

Recomendaciones para presionar el gel:

Un secante de gel debajo del gel.

Un secante de gel encima del gel. Evite la formación de pliegues en el segundo secante de gel al colocarlo con cuidado sobre el gel.

Un papel secante sobre el segundo secante de gel.

Presione el gel(es) durante 10 minutos.

8.8.5 Extraer el gel de la prensa y deshechar los secantes colocar de nuevo en el soporte. Sumergir el soporte en ela cubeta 2 (solución salina al 0,85%) y dejar 10 minutos dentro.

8.8.6 Prensar el gel según descripción antes citada (usar para ello nuevos secantes gel).

Nota: Con el empleo del método Quickfix se puede reducir el tiempo de lavado y prensado de los geles – ver sección 8.9.

8.8.7 Seque el gel completamente en un secador adecuado, durante unos 5 minutos.

8.8.8 Colocar el gel de nuevo en el soporte y sumergir en la cubeta 3 (colorante) durante 1 minuto.

8.8.9 Decolorar el gel en la cubeta 4 (5% v/v ácido acético) hasta que el color de fondo se aclare.

8.8.10 Sumergir en la cubeta 5 (5% v/v ácido acético) hasta garantizar una completa decoloración (aproximadamente 1 minuto por cada paso decolorante)

8.8.11 Secar completamente el gel en un secador adecuado.

8.9 Método Quickfix

El tiempo total de la innumofijación, incluido lavado y secado se puede acortar según sigue:

Inmunofijación a 45C 10 mins

1o lavado 5 mins

1o prensado 5 mins

2o lavado 5 mins

2o prensado 5 mins

Los tiempos para la migración de las muestras y los pasos de la electroforesis no cambian – ver secciones 8.5.6 y 8.6.4.

Atención: Cuando se emplea el método Quickfix, algunas muestras de mieloma IgM pueden

aparecer bandas en todas las pistas de antisuero. En estos casos, la proteína monoclonal no fijada no ha sido completamente lavada. En caso de difícil interpretación del gel, se recomienda analizar de nuevo pero con el método estándar.


9 RESULTADOS

9.1 Control El control incluido en el conjunto de antisueros debe dar una banda nítida en cada una de las pistas de inmunoglobulina y cadena ligera. En la pista de referencia TSP deberá observarse las bandas en las mismas posiciones. Si falta la banda, ver Resolución de problemas, sección 10.3. 9.2 Muestras

Por la reacción entre antisuero y antígeno en la muestra se produce una banda coloreada.

9.2.1 Muestras normales presentan una coloración muy débil, incluso sin coloración en la

zona gamma. 9.2.2 Concentración elevada de inmunoglobulina policlonal: Esto puede provocar una

coloración fuerte pero difusa sin una banda nítida. 9.2.3 Proteína monoclonal: aparece como una banda nítida distintiva tanto en la pista de

referencia como en las pistas correspondientes a la inmunoglobulina y cadena ligera. La posición es siempre la misma, ver el ejemplo siguiente:

(IgG K) (IgM K)

9.2.4 Aquellas muestras que den sólo una banda de cadena ligera deberán seguirse

examinando, dado que esto puede indicar la presencia de cadena ligera libre o IgD o IgE monoclonal (Antisueros de The Binding Site, números del artículos PX013 y PX014).

9.2.5 Concentraciones elevadas de proteína pueden dar en el centro de una banda

fuerte una zona clara causada por el exceso de antígeno. Si fuera necesario, volver a analizar con mayores diluciones.

9.2.6 Para todas las muestras: la banda de albúmina in la pista TSP deberá haber

migrado a la segunda marca desde arriba. (Ver Resolución de problemas 10.3: puntos 10 y 12 si las muestras han migrado poco o demasiado.)

10 LIMITACIONES

Este test no es suficiente para un diagnóstico y tratamiento por sí solo, sino que debe utilizarse como un medio más. Debe tenerse en cuenta el cuadro clínico así como otros análisis.

10.1 Limitaciones específicas 10.1.1 No deben emplearse muestras de plasma, dado que el fibrinógeno se adhiere al

gel en la región beta y por lo tanto dificultará la interpretación. 10.1.2 Muestras que contengan concentraciones altas de factor reumatoide o

inmunocomplejos, pueden dar unos resultados inusuales de IFE, p.ej. bandas de precipitación al principio de la pista.

10.2 Al usar el equipo, siga con atención las instrucciones del fabricante. Se debe

prestar especial atención a la configuración e intalación del equipo. El mantenimiento del equipo se debe llevar a cabo de acuerdo a las instrucciones del fabricante.

10.3 FDA (USA) Advertencia: ver la primera página de la metódica en inglés.

10.4 Resolución de problemas

Problema Causa(s) posible(s) Sugerencia(s)

1 No hay bandas distintivas en ninguna pista.

Muestra normal.

2 Banda distintiva en todas las pistas

a) Presencia de fibrinógeno (generalmente en la region beta).

Repetir MINIFIX empleando suero.

b) Fijaciones no específicas de proteínas monoclonales al gel.

Identificar las proteínas monoclonales en las bandas más fuertes.

3 Banda monoclonal kappa o lambda, pero no banda IgG, A o M.

a) Mieloma de cadena ligera, proteínas de Bence Jones (con muestras de orina).

Repetir MINIFIX utilizando antisueros anticadenas ligeras libres, anti-IgD, anti-IgE.

b) Mieloma IgD o IgE.

4 Banda monoclonal IgG, A o M, pero no banda kappa o lambda.

Reacción débil a cadenas ligeras, o patología de cadenzas pesadas.

Repetir MINIFIX de cadenzas ligeras con muestra más concentrada.

5 Aro oscuro alargado (centro pálido o claro).

Exceso de antígeno monoclonal.

Diluir la muestra y repetir MINIFIX.

6 Poca resolución en las bandas débiles.

a) Inmunoglobulina policlonal elevada.

Repetir MINIFIX para confirmar resultados

Problema Causa(s) posible(s) Sugerencia(s)

b) Electroforesis incorrecta, tiempos de incubación erroneous, inadecuada aplicación de antisuero, poca cantidad.

Repetir MINIFIX comprobando los tiemos de electroforesis e incubación y la temperatura (45°C) y aplicar el antisuero con cuidado.

7 Patrón electroforético atípico.

Gel desigual. Repetir MINIFIX utilizando gel homogéneo y asegurándose de que los geles se almacenan en posición plana.

8 Color de fondo oscuro.

Lavado insuficiente antes de la tinción.

Repetir MINIFIX con tiempos de lavado correctos y salina fresca.

9 Gel distorsionado o agrietado después de la electroforesis.

Tampón IFE mal reconstituido o agotado.

Repetir MINIFIX usando tampón fresco.

10 Banda de Albúmina ausente en la pista TSP.

a) Tiempo de electroforesis excesivo.

Repetir MINIFIX y reducir el tiempo de electroforesis.

b) Voltaje demasiado alto. Reducir el voltaje.

c) Extremos de los geles demasiado sumergidos en el tampón.

Reducir el volumen de tampón utilizado.

11 Ausencia de bandas en la muestra control.

a) Omisión del control o del antisuero o dilución incorrecta.

Repetir análisis.

b) Antisuero o control deteriorados.

Consultar al proveedor.

12 Migración de las muestras muy corta.

Acumulación de sales en el ánodo.

Repetirt MINIFIX después de eliminar cuidadosamente el depósito salino del ánodo.

Si no puede resolver el problema consulte al proveedor.

11 VALORES ESPERADOS

En un estudio controlado usando IFE de Binding Site y MINIFIX (XK001 y XK004 respectivamente) junto con otros dos kits comerciales, se analizaron 50 muestras de suero previamente identificadas, conteniendo inmunoglobulinas monoclonales. Se encontró una completa coincidencia entre los kits en cuanto a las inmunoglobulinas de proteínas monoclonales y las cadenas ligeras en todos los casos.

12 BIBLIOGRAFÍA









13 RESUMEN PROCEDIMIENTO

MINIFIX Quickfix

1 Llenar el recipiente de electroforesis con tampón (sección 8.6).

2 Secar el gel y colocar la plantilla de aplicación sobre el gel.

3 Aplicar 2,5µL de muestra diluida 1/2 diluida a la pista TSP, 2,5µL de muestra apropiadamente diluida a las otras 5 pistas.

4 Dejar que las muestras se absorban. 5 minutos 5 minutos

5 Secar y retirar la plantilla.

6 Procesar las muestras en la electroforesis (*ver sección 8.6).

25-35 minutos* 25-35 minutos*

7 Secar la posición del antisuero en el gel.

8 Aplicar 1 gota del fijador de proteína a la pista TSP, 1 gota de cada uno de los antisueros a las pistas correspondientes.

9 Incubar a 45°C. 30 minutos 10 minutos

10 Lavar y prensar seco. 10+10 minutos 5+5 minutos

11 Repetir el paso 10. 10+10 minutos 5+5 minutos

12 Secar el gel y colorear.

minifix kit for in vitro diagnostic use product code:...

Documents