11

ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΚΟ ΕΚΠΑΙΔΕΥΤΙΚΟ ΙΔΡΥΜΑ ΛΑΡΙΣΑΣ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ & ΠΡΟΝΟΙΑΣ

ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΩΝ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΩΝ

ΣΗΜΕΙΩΣΕΙΣ ΤΟΥ ΜΑΘΗΜΑΤΟΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ ΙΙ, Δ’

ΕΞΑΜΗΝΟΥ

ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ : Δρ. ΒΑΣΙΛΕΙΟΣ ΚΡΙΚΕΛΗΣ

ΛΑΡΙΣΑ 2006

Χρώση Gram S. pyogenes

β’ αιμόλυση S. pyogenes

22

Κεφάλαιο 1ο –Καλλιέργειες Κλινικών Δειγμάτων 1-18 1.1 Εισαγωγή 1 1.2 Απαραίτητες Πληροφορίες που Συνοδεύουν το Δείγμα 2 1.3 Τρόπος Συλλογής του Δείγματος 2 1.4 Μεταφορά 4 1.5 Κριτήρια Καταλληλότητας του Δείγματος 5 1.6 Προετοιμασία 6 1.7 Μακροσκοπική εξέταση 7 1.8 Μικροσκοπική εξέταση 7 Πίνακες 1ου Κεφαλαίου 8

Κεφάλαιο 2ο - Καλλιέργειες Κλινικών Δειγμάτων Λοιμώξεων του Ανώτερου Αναπνευστικού Συστήματος

19-37

2.1 Συλλογή – Μεταφορά 19 2.2 Μικροσκοπική Εξέταση 22 2.3 Θρεπτικά Υλικά Επιλογής 23 2.4 Τεχνική καλλιέργειας 25 2.4.1 Εμβολιασμός στην επιφάνεια θρεπτικού υλικού σε τρυβλίο 25 2.4.2 Επώαση καλλιεργημάτων 27 2.5 Απομόνωση Παθογόνων Μικροβίων (Αιμολυτικός Στρεπτόκοκκος ομάδος Α ή Στρεπτόκοκκος πυογόνος (Streptococcus pyogenes)

28

2.5.1 Μακροσκοπική Εξέταση 28 2.5.2 Μικροσκοπική Εξέταση 29 2.5.3 Βιοχημικές Δοκιμασίες 29 2.5.4 Ορολογικές Δοκιμασίες 30 2.5.5 Οροδιαγνωστικές μέθοδοι αναζήτησης αντισωμάτων έναντι των Στρεπτοκόκκων στον ορό

32

2.5.6 Ταχεία Δοκιμασία Ανίχνευσης Αντιγόνου Α ( Rapid Test strip) 34 2.6 Corynebacterium Diphtheriae (Κορυνοβακτηρίδιο διφθερίτιδας) 35 2.6.1 Βιοχημικές Δοκιμασίες 35 2.6.2 Ορολογικές Μέθοδοι 36 2.6.3 Μέθοδοι μοριακής βιολογίας 37

Κεφάλαιο 3ο - Καλλιέργειες Κλινικών Δειγμάτων Λοιμώξεων του Κατώτερου Αναπνευστικού Συστήματος

38-51

3.1 Συλλογή – Μεταφορά 38 3.2 Μακροσκοπική Εξέταση 40 3.3 Μικροσκοπική Εξέταση 40 3.4 Μυκοβακτηρίδιο φυματίωσης (Mycobacterium tuberculosis) 42 3.4.1 Μακροσκοπική Εξέταση 43 3.4.2 Μικροσκοπική Εξέταση 44 3.4.3 Βιοχημικές Δοκιμασίες 45 3.4.4 Μέθοδοι Μοριακής Βιολογίας 45 Πίνακες 3ου Κεφαλαίου 48

33

Κεφάλαιο 4ο - Καλλιέργειες Κλινικών Δειγμάτων Λοιμώξεων του Γαστρεντερικού Συστήματος

52-70

4.1 Τρόπος λήψεως δειγμάτων 52 4.2 Μακροσκοπική εξέταση κοπράνων 53 4.3 Μικροσκοπική εξέταση κοπράνων 54 4.4 Θρεπτικά υλικά που χρησιμοποιούνται για την απομόνωση των εντερικών παθογόνων μικροοργανισμών

54

4.5 Ταυτοποίηση συχνότερων αιτιολογικών παραγόντων 58 4.5.1 Ταυτοποίηση Σαλμονελλών 59 4.5.1.1 Ορολογική ταυτοποίηση και οροτυπία Σαλμονελλών 61 4.5.1.2 Βιοχημική ταυτοποίηση σαλμονελών 61 4.5.1.3 Οι κύριες βιοχημικές ιδιότητες των Εντεροβακτηρίων 63 4.5.1.4 Οροδιάγνωση Σαλμονελών 64 4.5.1.5 Συγκολλητινοαντιδραση Widal 65 4.5.1.6 Λοιπές ορολογικές εξετάσεις στις Σαλμονελώσεις 66 4.5.2 Ταυτοποίηση Σιγκελλών 68 Κεφάλαιο 5ο - Καλλιέργειες Κλινικών Δειγμάτων Λοιμώξεων του Ουροποιητικού

Συστήματος 71-76

5.1 Συλλογή - Μεταφορά 71 5.2 Μακροσκοπική και μικροσκοπική εξέταση 72 5.3 Καλλιέργεια 73 5.4 Screening και μη καλλιεργητικές Μέθοδοι 75 5.5 Αξιολόγηση αποτελεσμάτων 76 Κεφάλαιο 6ο - Καλλιέργειες Κλινικών Δειγμάτων Από Γυναικολογικές Λοιμώξεις 77-88

6.1 Εισαγωγή - Κολπίτιδα 77 6.1.2 Λήψη – συλλογή κολπικού εκκρίματος 78 6.1.3 Whiff test 79 6.1.4 Μικροσκοπική εξέταση 79 6.1.4.1 Νωπό παρασκεύασμα 79 6.1.4.2 Gram χρωματισμένο παρασκεύασμα 80 6.1.5 Θρεπτικά υλικά καλλιέργειας κολπικού επιχρίσματος 80 6.1.6 Ταυτοποίηση της G.Vaginalis 81 6.1.6.1 Μικροσκοπική εξέταση 81 6.1.6.2 Μακροσκοπική εξέταση 81 6.1.7 Βιοχημικές ιδιότητες 81 6.2 Εισαγωγή - Τραχηλήτιδες 82 6.2.1 Λήψη – Μεταφορά τραχηλικού επιχρίσματος 82 6.2.2 Ταυτοποίηση του Γονόκοκκου ή Ναϊσσέρια γονόρροιας 83 6.2.2.1 Μικροσκοπική εξέταση 83 6.2.2.2 Βιοχημικές δοκιμές 84 6.2.3 Ταυτοποίηση του Χλαμυδίου του τραχώματος 87 6.2.3.1 Μικροσκοπική εξέταση Χρώση Giemsa 87

44

6.2.3.2 Καλλιέργεια σε κύτταρα McCoy 87 6.2.3.3 Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) 88

Κεφάλαιο 7ο - Καλλιέργειες Κλινικών Δειγμάτων Από Βακτηριαιμίες 89-106 7.1 Καλλιέργεια αίματος 89 7.2 Τρόπος λήψης της αιμοκαλλιέργειας 89 7.3 Σύστημα αιμοκαλλιεργειών 90 7.3.1 Κλασικό σύστημα αιμοκαλλιέργειας 90 7.3.2 Σύστημα Isolator ή σύστημα λύσεως και φυγοκεντρήσεως 91 7.3.3 Σύστημα BACTER αυτοματοποιημένης αιμοκαλλιέργειας 91 7.3.4 VITAL σύστημα της Merieux 92 7.3.5 SPP σύστημα της Difco 92 7.3.6 Σύστημα Signal 92 7.4 Χρόνος λήψης - Αριθμός αιμοκαλλιεργειών, Ποσότητα καλλιεργούμενου αίματος

93

7.4.1 Χρόνος λήψης αιμοκαλλιεργειών 93 7.4.2 Ποσότητα καλλιεργούμενου αίματος 93 7.4.3 Αριθμός αιμοκαλλιεργειών 94 7.5 Έλεγχος των φιαλών της αιμοκαλλιέργειας 95 7.6 Ταυτοποίηση απομονωθέντων μικροβίων 97 7.6.1 Staphylococcus aureus 7.6.1.1 Μικροσκοπική εξέταση 97 7.6.1.2 Μακροσκοπική εξέταση 97 7.6.1.3 Βιοχημικές δοκιμές 97 7.6.1.4 Οροδιάγνωση Σταφυλοκοκκικών νόσων 100 7.6.1.4.1 Προσδιορισμός τίτλου αντι-α-Αιμολυσίνης ή α-Τοξίνης ή Τίτλου αντισταφυλοσίνης (ASL)

100

7.6.1.4.2 Προσδιορισμός τίτλου αντι-Τειχϊκού οξέος 101 7.6.1.4.3 Προσδιορισμός τίτλου αντι-Λίπασης 101 7.6.2 Brucella melitensis & Br. Abortus 102 7.6.2.1 Μικροσκοπική εξέταση 103 7.6.2.2 Μακροσκοπική εξέταση 103 7.6.2.3 Βιοχημικές δοκιμές 103 7.6.2.4 Ορολογικές δοκιμές 103 7.6.2.5 Δοκιμή ευαισθησίας ή ανταχής στις χρωστικές 104 7.6.2.6 Ανάγκη παρουσίας CO2 105 7.6.2.7 Οροδιαγνωστική των βρουκελλώσεων 105 7.6.2.8 δοκιμή με αντισφαιρινικό ορό ή Coombs δοκιμή. 105

Κεφάλαιο 8ο - Καλλιέργειες Κλινικών Δειγμάτων Εγκεφαλονωτιαίου Υγρού (ΕΝΥ)

107-120

8.1 Λήψη του ΕΝΥ 107 8.2 Μικροσκοπική εξέταση 107 8.3 Θρεπτικά υλικά 109 8.4 Ταυτοποίηση του Haemophilus influenzae 110 8.4.1 Μικροσκοπική εξέταση 110 8.4.1.1 Τεχνική δοκιμής εξοιδήσεως του ελύτρου 111 8.4.2 Μακροσκοπική εξέταση 111

55

8.4.1 Δοκιμή δορυφορισμού 111 8.4.1 Δοκιμή εξαρτήσεως από τους Χ και V 112 8.4.2 Βιοχημικές δοκιμές 112 8.4.3 Οροτυπία του H.influenzae 114 8.4.4 Ανίχνευση αντιγόνου του Η.influenzae στο εγκεφαλονωτιαίο υγρό (ΕΝΥ) 116 8.4.5 Ορολογικές εξετάσεις για αντισώματα κατά του αιμόφιλου στο αίμα 117 8.5 Ταυτοποίηση της Neisseria menιgitidis (Ναϊσσέρια μηνιγγίτιδας ή Μηνιγγιτιδόκοκκος)

117

8.5.1 Μακροσκοπική εξέταση 117 8.5.2 Μικροσκοπική εξέταση 118 8.5.3 Βιοχημικές δοκιμές 118 8.5.3 Αναζήτηση αντιγόνων Mηνιγγιτιδοκόkκων 118 8.5.4 Ταυτοποίηση της ορολογικής ομάδας 119

Κεφάλαιο 9ο - Μέθοδοι Ελέγχου Ευαισθησίας των Μικροβίων στα Αντιβιοτικά 121-132 9.1 Εισαγωγή 121 9.2 Μέθοδοι ελέγχου ευαισθησίας στα αντιβιοτικά 121 9.2.1 Μέθοδος διαχύσεως στο άγαρ από δισκία χαρτιού εμποτισμένα με αντιβιοτικά (Μέθοδος KIRBY – BAUER ή αντιβιόγραμμα)

121

9.2.2 Προσδιορισμός ελάχιστης ανασταλτικής συγκεντρώσεως ή MIC (Minimal Inhibitory Concentration).

127

9.3 Εtest 128 9.4 Γρήγορη δοκιμή ελέγχου της αντιμικροβιακής ευαισθησίας – παραγωγή β- λακταμάσης

131

ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

66

ΚΚεεφφάάλλααιιοο 11οο :: ΚΚααλλλλιιέέρργγεειιεεςς ΚΚλλιιννιικκώώνν ΔΔεειιγγμμάάττωωνν

11..11 ΕΕιισσααγγωωγγήή

Η αιτιολογική διάγνωση των λοιμώξεων είναι απαραίτητη για τη σωστή

θεραπευτική αντιμετώπιση τους και τη λογική χρήση των αντιμικροβιακών

φαρμάκων, ενώ παράλληλα παρουσιάζει και επιδημιολογικό ενδιαφέρον. Η

αιτιολογική διάγνωση των λοιμώξεων προυποθέτει την άμεση ή έμμεση απόδειξη της

παρουσίας του αιτιοπαθογόνου μικροοργανισμού στην εστία της λοίμωξης.

Για να είναι η εργαστηριακή διάγνωση αξιόπιστη, θα πρέπει να έχει προηγηθεί

ο σωστός χειρισμός του κλινικού δείγματος ο οποίος περιλαμβάνει τα εξής στάδια:

συμπλήρωση του παραπεμπτικού σημειώματος και συλλογή του κλινικού

δείγματος,

μεταφορά του κλινικού δείγματος στο εργαστήριο και διατήρηση του εφ'

όσον δεν μπορεί να καλλιεργηθεί αμέσως,

έλεγχος της καταλληλότητας και χαρακτηρισμός της προτεραιότητας

του κλινικού δείγματος (επείγον ή σύνηθες),

προετοιμασία του κλινικού δείγματος, (εάν είναι αναγκαίο),

μικροσκοπική εξέταση,

ενοφθαλμισμός στα κατάλληλα Θρεπτικά υλικά, τα οποία στη συνέχεια

επωάζονται στην κατάλληλη θερμοκρασία και ατμόσφαιρα και για το

αναγκαίο χρονικό διάστημα,

ερμηνεία των αποτελεσμάτων της καλλιέργειας και ταυτοποίηση των

παθογόνων μικροοργανισμών και

αντιβιόγραμμα αυτών.

Στην ανίχνευση των παθογόνων μικροοργανισμών και στον προσδιορισμό της

υπάρχουσας λοίμωξης μπορούν να βοηθήσουν και άλλες, πλην της καλλιέργειας,

μέθοδοι, όπως μοριακής βιολογίας, π.χ. PCR, υβριδισμός DNA και ανοσοβιολογικές,

π.χ. ELISA.

77

11..22 ΑΑππααρρααίίττηηττεεςς ΠΠλληηρροοφφοορρίίεεςς πποουυ ΣΣυυννοοδδεεύύοουυνν ττοο ΔΔεείίγγμμαα

((ΠΠααρρααππεεμμππττιικκόό ΣΣηημμεείίωωμμαα))

Πριν τη συλλογή του κλινικού δείγματος, ο γιατρός θα πρέπει να συμπληρώσει

έντυπο σημείωμα στο οποίο θα αναγράφονται μια σειρά από πληροφορίες, οι οποίες

είναι απαραίτητες για την ερμηνεία του αποτελέσματος της καλλιέργειας και τη

συσχέτιση αυτού με τη λοίμωξη του ασθενούς.

Στις πληροφορίες αυτές πρέπει να περιλαμβάνονται:

το ονοματεπώνυμο του ασθενούς,

ο αριθμός μητρώου (στο νοσοκομείο),

η ηλικία και το φύλο,

η κλινική και ο αριθμός δωματίου ή η διεύθυνση κατοικίας,

το ονοματεπώνυμο του θεράποντος ιατρού και το τηλέφωνο του,

η ημερομηνία και ώρα λήψης του δείγματος,

η ανατομική περιοχή από την οποία ελήφθη το δείγμα,

η μέθοδος με την οποία έγινε η λήψη, π.χ. καλλιέργεια ούρων ληφθέντων με

υπερηβική παρακέντηση,

τα ειδικά παθογόνα που θα πρέπει να αναζητηθούν και τα οποία προφανώς

δεν ερευνώνται με τη συνήθη καλλιέργεια,

σημείωση για την πιθανή ύπαρξη λοίμωξης από μικροοργανισμούς ιδιαίτερα

επικίνδυνους για το προσωπικό του νοσοκομείου, π.χ. μυκοβακτηρίδιο της

φυματίωσης, βρουκέλλες, κ.ά. Στις περιπτώσεις αυτες το έντυπο σημείωμα

αλλά και το ίδιο το κλινικό δείγμα θα πρέπει να έχουν σημανθεί κατάλληλα,

σύντομο ιστορικό και πιθανή διάγνωση, και

η χορήγηση αντιβιοτικών και το είδος αυτών

11..33 ΤΤρρόόπποοςς ΣΣυυλλλλοογγήήςς ττοουυ ΔΔεείίγγμμααττοοςς

Η σωστή συλλογή του δείγματος είναι το πιο σπουδαίο στάδιο για τον προσδιορισμό

των υπεύθυνων για τη λοίμωξη μικροοργανισμών. Γι' αυτό είναι απαραίτητο να

ακολουθούνται πιστά οι παρακάτω κανόνες. Το δείγμα πρέπει να είναι αντιπροσωπευτικό της

88

λοίμωξης, δηλαδή να συλλέγεται από περιοχές όπου είναι πολύ πιθανόν να υπάρχουν

παθογόνοι μικροοργανισμοί.

Στον Πίνακα 1.1 αναφέρονται τα κατάλληλα, για κάθε ανατομική θέση, κλινικά

δείγματα(βλέπε σελ.8). Η συλλογή επαρκούς ποσότητας κλινικού δείγματος είναι

αναγκαία για τη σωστή καλλιέργεια. Ο όγκος του κλινικού δείγματος έχει εξαιρετική

σημασία στα υγρά κλινικά δείγματα (αίμα, ΕΝΥ, ούρα κ.ά.) ιδιαίτερα όταν

αναζητούνται απαιτητικά μικρόβια ή η συγκέντρωση των μικροοργανισμών είναι

μικρή. Η συλλογή κλινικού δείγματος με στυλεό, εκτός από λίγες περιπτώσεις

(φαρυγγικό, ουρηθρικό, κολπικό, κ.ά), δεν είναι η καλύτερη λύση. Οι ελάχιστες

αναγκαίες ποσότητες κλινικών δειγμάτων για την αναζήτηση των υπεύθυνων

μικροοργανισμών αναφέρονται στον Πίνακα 1.1(σελ.8). Ο χρόνος συλλογής του

κλινικού δείγματος είναι σημαντική παράμετρος, εξαρτάται δε από το είδος της

λοίμωξης αλλά και από τη δυνατότητα του εργαστηρίου να επεξεργάζεται κλινικά

δείγματα κατά τη διάρκεια του 24ώρου. Τα παθογόνα μικρόβια συνήθως εμφανίζουν

τις υψηλότερες συγκεντρώσεις στις πρώτες πρωινές εκκρίσεις, π.χ. πτύελα,

ουρηθρικό, κ.ά. Τέλος έχει ιδιαίτερη σημασία το κατάλληλο είδος του κλινικού

δείγματος να ληφθεί την κατάλληλη χρονική περίοδο. Ως παράδειγμα αναφέρεται ότι

στον τυφοειδή πυρετό την πρώτη εβδομάδα λοίμωξης, το πιο κατάλληλο κλινικό

δείγμα είναι το αίμα, ενώ τη δεύτερη και την τρίτη τα ούρα και κυρίως τα κόπρανα.

Η επιμόλυνση του κλινικού δείγματος από τη χλωρίδα του δέρματος και των

βλεννογόνων (πίνακας 1.4) επηρεάζει αρνητικά την καταλληλότητα του. Το

πρόβλημα αυτό είναι ιδιαίτερα σημαντικό στις καλλιέργειες αίματος και στείρων

υγρών όπου τα κλινικά δείγματα επιμολύνονται συχνά από σαπρόφυτα. Η επιμόλυνση

των ούρων μέσου ρεύματος από την περιουρηθρική και την περινεϊκή χλωρίδα των

γυναικών, η επιμόλυνση του δείγματος από το ενδομήτριο από τις κολπικές εκκρίσεις

και η επιμόλυνση των πτυέλων από τη χλωρίδα της στοματοφαρυγγικής κοιλότητας

είναι μερικά χαρακτηριστικά παραδείγματα. Ορισμένες φορές όμως είναι αδύνατο να

ληφθεί κλινικό δείγμα χωρίς να έχει επιμολυνθεί από τη φυσιολογική χλωρίδα.

Επιπλέον στους ανοσοκατασταλμένους ασθενείς οι λοιμώξεις μπορούν να οφείλονται

σε μικροοργανισμούς που είναι μέλη της φυσιολογικής χλωρίδας. Σ’ αυτές τις

περιπτώσεις η σωστή συλλογή του κλινικού δείγματος και η ημιποσοτική ή η

ποσοτική καλλιέργεια είναι η πλέον αξιόπιστη λύση.

99

Η συλλογή του κλινικού δείγματος γίνεται σε αποστειρωμένα δοχεία ή

σωληνάρια τα οποία κλείνουν ερμητικά, ούτως ώστε να μην υπάρχει απώλεια

κλινικού υλικού κατά τη μεταφορά. Η χρησιμοποίηση σύριγγας με βελόνα δεν

συνιστάται για λόγους ασφάλειας. Εάν όμως κριθεί αναγκαία η χρησιμοποίηση της, η

βελόνα αφαιρείται με τη βοήθεια ειδικού εξαρτήματος και το ρύγχος της σύριγγας

καλύπτεται με αποστειρωμένο πώμα. Τέλος εάν στην καλλιέργεια αναζητούνται και

αναερόβια βακτήρια, οι φυσαλίδες αέρα πρέπει να απομακρύνονται.

Η χρησιμοποίηση τρυβλίων Petri πρέπει γενικώς να αποφεύγεται επειδή

υπάρχει η πιθανότητα απώλειας ή επιμόλυνσης του κλινικού δείγματος. Οι στυλεοί

πρέπει να χρησιμοποιούνται με περίσκεψη διότι πολλές φορές η ποσότητα του

κλινικού υλικού που συλλέγεται είναι μικρή, ενώ τα μικρόβια καταστρέφονται αν

μείνουν σ’ επαφή με το στυλεό για αρκετό διάστημα χωρίς να χρησιμοποιηθεί υλικό

μεταφοράς. Τέλος, το υλικό από το οποίο είναι κατασκευασμένο το βύσμα του

στυλεού (βαμβάκι, αλγινικό ασβέστιο, πολυεστέρας) αλλά και το στέλεχος αυτού

δρουν τοξικά σ’ ορισμένες κατηγορίες μικροοργανισμών. Ως παράδειγμα, αναφέρεται

ότι στους στυλεούς που έχουν βύσμα από βαμβάκι, τα λιπαρά οξέα των ινών δρουν

τοξικά στα απαιτητικά βακτήρια και στα χλαμύδια.

11..44 ΜΜεεττααφφοορράά

Η μεταφορά του κλινικού δείγματος στο εργαστήριο πρέπει να γίνεται εντός 1-2

ωρών. Εάν η μεταφορά του κλινικού δείγματος στο εργαστήριο καθυστερήσει ή το

εργαστήριο δεν μπορεί να το επεξεργασθεί άμεσα, δημιουργούνται τα ακόλουθα:

Υπερβολική ανάπτυξη ταχέως αναπτυσσόμενων μικροβίων

Θάνατος μικροοργανισμών ως αποτέλεσμα της αλλαγής της θερμοκρασίας ή του

pH.

Ανακριβής ποσοτικός προσδιορισμός των μικροοργανισμών στα ούρα

Απώλεια μικροοργανισμών από την ξηρασία

Η προστασία από το οξυγόνο

Η προστασία από τη δημιουργία θρόμβων

1100

Η διατήρηση και η προστασία των κλινικών δειγμάτων προϋποθέτει την

παραμονή τους σε ορισμένη θερμοκρασία και για συγκεκριμένο χρονικό διάστημα

στα κατάλληλα υλικά μεταφοράς (Πίνακες 1.1,1.2,1.3 ).

Εάν το κλινικό δείγμα πρόκειται να μεταφερθεί εκτός νοσοκομείου,

τοποθετείται σε στεγανό και σφραγισμένο δοχείο και αυτό με τη σειρά του σε άλλο

δοχείο από πολυεστέρα το οποίο κλείνεται με ταινία. Μεταξύ των δυο δοχείων

τοποθετείται απορροφητικό υλικό το οποίο θα αποτρέψει τη διαφυγή του κλινικού

δείγματος σε περίπτωση καταστροφής του εσωτερικού δοχείου (Εικόνα 1-1). Σε όλα

τα δοχεία και τα συνοδά έγγραφα υπάρχουν πλήρη στοιχεία του αποστολέα και

του παραλήπτη.

Εικόνα 1-110

1111

11..55 ΚΚρριιττήήρριιαα ΚΚααττααλλλληηλλόόττηηττααςς ττοουυ ΔΔεείίγγμμααττοοςς

Μερικές φορές στο μικροβιολογικό εργαστήριο φθάνουν κλινικά δείγματα τα

οποία είναι ακατάλληλα για καλλιέργεια επειδή γίνονται λάθη κατά τη συλλογή, τη

μεταφορά ή τη διατήρηση τους. Το μικροβιολογικό εργαστήριο πρέπει να έχει

καθορίσει κριτήρια ακαταλληλότητας των κλινικών δειγμάτων (Πίνακας 1.5) και να

έχει ενημερώσει γι' αυτά τους κλινικούς γιατρούς.

Τα ακατάλληλα κλινικά δείγματα, με εξαίρεση εκείνα που είναι επικίνδυνα για

την υγεία του προσωπικού του εργαστηρίου, φυλάσσονται μέχρι ν' αποσταλούν νέα.

Σε περίπτωση που ο κλινικός γιατρός επιμένει να καλλιεργηθεί το ακατάλληλο

κλινικό δείγμα, στην απάντηση του το εργαστήριο πρέπει να συμπεριλάβει σημείωση

στην οποία θα επισημαίνεται η περιορισμένη αξία του αποτελέσματος της καλλιέρ-

γειας.

Ακατάλληλα κλινικά δείγματα θεωρούνται επίσης εκείνα στα οποία μία ή

περισσότερες από τις δοκιμασίες ή τεχνικές που χρησιμοποιούνται είναι εκτός

ποιοτικού ελέγχου. Τέλος ακατάλληλα, με λίγες εξαιρέσεις, θεωρούνται τα

περισσότερα του ενός κλινικά δείγματα τα οποία λαμβάνονται, εντός 24ώρου, από

την ίδια εστία λοίμωξης. Συνήθως μετά την αρχική διάγνωση, ένα νέο κλινικό δείγμα

από την ίδια εστία λοίμωξης δικαιολογείται εάν τα συμπτώματα επιμένουν για τρεις

τουλάχιστον ημέρες. Στην περίπτωση αυτή θα αναζητηθούν τα ήδη γνωστά παθογόνα

μικρόβια τα οποία έχουν αναπτύξει αντοχή στα χορηγούμενα αντιβιοτικά ή νέα

παθογόνα τα οποία προφανώς ενοχοποιούνται για την εξέλιξη της λοίμωξης.

11..66 ΠΠρροοεεττοοιιμμαασσίίαα

Το κλινικό δείγμα, πολλές φορές, δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την

εκτέλεση οποιασδήποτε μικροβιολογικής εξέτασης, εάν προηγουμένως δεν

προετοιμασθεί κατάλληλα, ο τρόπος δε της προετοιμασίας εξαρτάται από το είδος του

κλινικού δείγματος, αλλά και την ποσότητα αυτού. Τα στείρα υγρά όπως το ΕΝΥ

αλλά και άλλα υγρά κλινικά δείγματα όταν έχουν όγκο μεγαλύτερο από 1-2 ml πρέπει να

φυγοκεντρούνται στις 1500-2000 χ g για 15-30 λεπτά, η μικροσκοπική εξέταση δε και η

καλλιέργεια να γίνονται από το ίζημα. Επίσης, στην περίπτωση που για τη συλλογή του

κλινικού δείγματος χρησιμοποιήθηκε ένας μόνο βαμβακοφόρος στυλεός, τότε αυτός

1122

εναιωρείται σε ζωμό και απορρίπτεται. Για τη συλλογή και μεταφορά κλινικών υλικών για την

απομόνωση του μυκοπλάσματος της πνευμονίας και των χλαμυδίων (Πίνακας 1.2).

11..77 ΜΜαακκρροοσσκκοοππιικκήή εεξξέέτταασσηη

Με τη μακροσκοπική εξέταση ελέγχονται το χρώμα, η ποσότητα, η σύσταση και

η οσμή των πτυέλων. Βλεννοπυώδη πτύελα παρατηρούνται στη βακτηριακή

πνευμονία και βρογχίτιδα. Αντίθετα, στην πνευμονία που οφείλεται στο μυκόπλασμα

και στο χλαμύδιο της πνευμονίας, τα πτύελα είναι συνήθως υδαρή. Στην πνευμονία

από Klebsiella pneumoniae και πνευμονιόκκοκο τα πτύελα είναι βλεννώδη με

πρόσμειξη αίματος, στη λεγιωνέλλωση πυώδη ή βλεννώδη και στην πνευμονία από

εισρόφηση δύσοσμα.

11..88 ΜΜιικκρροοσσκκοοππιικκήή εεξξέέτταασσηη

Η χρώση Gram είναι άμεση, γρήγορη και πολύτιμη μέθοδος η οποία εκτελείται

σ’ όλα τα κλινικά υλικά που προέρχονται από το κατώτερο αναπνευστικό σύστημα,

προηγείται δε πάντοτε της καλλιέργειας.

Η μελέτη του χρωματισμένου παρασκευάσματος προσφέρει πολύτιμες

πληροφορίες διότι:

προσδιορίζει αφ’ ενός το βαθμό επιμόλυνσης του δείγματος από τη

στοματοφαρυγγική χλωρίδα (υποδηλώνεται από τα επιθηλιακά κύτταρα) και

αφ’ ετέρου την ύπαρξη εκκρίσεων από το κατώτερο αναπνευστικό σύστημα

(υποδηλώνεται από τα λευκά αιμοσφαίρια,

συμβάλλει στην προκαταρκτική διάγνωση της πνευμονίας με την προϋπόθεση

ότι ο υπεύθυνος μικροοργανισμός επικρατεί και η μορφολογία των μικροβιακών κυττάρων είναι τυπική και

βοηθά στην επιλογή των κατάλληλων θρεπτικών υλικών για την καλλιέργεια.

Πίνακας 1-1 :Οδηγίες συλλογής και μεταφοράς δείγματος για καλλιέργεια συνήθως βακτηρίων

1133

ΠΕΡΙΟΧΗ/ΤΥΠΟΣ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ ΟΔΗΓΙΕΣ ΣΥΛΛΟΓΗΣ ΑΠΟΣΤΕΙΡΩΜΕΝΟ

ΜΕΣΟ ΜΕΤΑΦΟΡΑΣ

ΕΛΑΧΙΣΤΗ ΠΟΣΟΤΗΤΑ

(ml) ΠΑΡΑΤΗΡΗΣΕΙΣ

1. Ουρά α) Μέσου ρεύματος Καλός καθαρισμός των

έξω γεννητικών οργάνων. Συλλογή από το μέσο της πρώτης πρωινής ούρησης

Ευρύστομο δοχείο 1-20 Διατήρηση στους 4°C για 24 ώρες

β) Από προσωρινό καθετήρα

Καθαρισμός ως 1α. Δεν συλλέγονται τα πρώτα 15ml

βλέπε 1 α βλέπε 1α Διατήρηση ως 1α. Δεν συνιστάται λόγω επιμολύνσεων και πρόκλησης βακτηριουρίας

γ) Από μόνιμο καθετήρα

Αντισηψία του τοιχώματος του καθετήρα με αλκοόλη 70%. Αναρρόφηση με σύριγγα και βελόνα

βλέπε 1α βλέπε 1α Διατήρηση ως 1α

δ) Από υπερηβική παρακέντηση

Αντισηψία του δέρματος, αναρρόφηση με σύριγγα και βελόνα από την πλήρη ουροδόχο κύστη

Φιαλίδιο με αναερόβιο υλικό μεταφοράς

βλέπε 1α Χρησιμοποιείται σε παιδιά, επί υποψίας αναερόβιας λοίμωξης και σε κακώσεις νωτιαίου μυελού

ε) Από νεφροστομία Αντισηψία εισόδου νεφροστομίας. Ο καθετήρας εισέρχεται σε βάθος μεγαλύτερο από το επίπεδο της περιτονίας

βλέπε 1α βλέπε 1α Διατήρηση ως 1α

στ) Από κυστεοσκόπηση και καθετηριασμό των ουρητήρων

Καθαρισμός ως 1α βλέπε 1α Βοηθά στον ακριβή εντοπισμό της λοίμωξης. Διατήρηση ως 1α

2. ΕΝΥ

Αντισηψία του δέρματος ή της περιοχής που βρίσκεται η συσκευή Ommaya

3 βιδωτά σωληνάρια, το δεύτερο για καλλιέργεια

1-2 Μεταφορά στους 25ο C σε 15 λεπτά

3. Αίμα

Αντισηψία δέρματος και απολύμανση του πώματος της φιάλης. Λήψη εντός ώρας προ του αναμενόμενου κύματος πυρετού ή με την έναρξη του πυρετικού κύματος και πριν την έναρξη χορήγησης αντιβιοτικών

Φιάλη με υγρό θρεπτικό υλικό. Για μύκητες

χρησιμοποιείται διφασικό υλικό

Ενήλικοι: 10-20, βρέφη: 1-2

Σήψη: 2-3 δείγματα από διαφορετικές φλέβες εντός 10 λεπτών.

4. Ανώτερο αναπνευστικό σύστημα

α) Ρινικό Εμβαπτισμένος σε φυσιολογικό ορό, στυλεός εισέρχεται 2 cm εντός της μύτης, όπου περιστρέφεται

Στυλεός με υλικό μεταφοράς

Σε ρινικές βλάβες ή για τη διερεύνηση φορέων S. aureus, S, pyogenes και Neisseria meningitidis

β) Ρινοφαρυγγικό Λήψη διαμέσου της μύτης η του φάρυγγα. Περιστροφή στυλεού για 5 δευτερόλεπτα ή αναρρόφηση εκκρίσεων

Άμεσος ενοφθαλμισμός θρεπτικών υλικών. Στυλεός με υλικό

μεταφοράς. Αναρρόφηση με καθετήρα. Περιορισμοί

στο είδος του στυλεού

Λοίμωξη από Bordetella pertussis, Corynebacterium diphtheriae, φορία από Ν. meningitidis. Τα εμβολιασμένα θρεπτικό υλικά μεταφέρονται στους 25°Cσε 15 λεπτά

1144

γ) Φαρυγγικό Λήψη από τον οπίσθιο φάρυγγα, τις αμυγδαλές και τις φλεγμαίνουσες περιοχές

Στυλεός με υλικό μεταφοράς

Λοίμωξη από S. pyogenes, C. diphtheriae, Neisseria gonorrhoeae, φορίο από S. aureus. Αντενδείκνυται σε επιγλωττίτιδα

δ) Στοματικό Καθαρισμός του στόματος με φυσιολογικό ορό. Λήψη του εξιδρώματος με στυλεό ή δείγμα από ελκωτική βλάβη με ξέστρο

Στυλεός με υλικό μεταφοράς, ξέσματα σε

βιδωτό δοχείο

Ανίχνευση Candida albicans (δοκιμασία ΚΟΗ). Διάγνωση κυνάγχης Vincent (αραιωμένη καρβοξυλική φουξίνη)

ε) Έξω ακουστικός πόρος

Καθαρισμός του έξω ακουστικού πόρου με στυλεό

Στυλεός με υλικό μεταφοράς, αναερόβιο σύστημα μεταφοράς

Ενδείκνυται σ' ορισμένες περιπτώσεις Διατήρηση στους 4°C για 24 ώρες

στ) Μέσο ους Καθαρισμός του έξω ακουστικού πόρου. Τυμπανοκέντηση ή λεπτός στυλεός επί ραγέντος τύμπανου

Αναερόβιο σύστημα μεταφοράς, στυλεός με

υλικό μεταφοράς

ζ) Παραρρίνιοι κόλποι Παρακέντηση της παραρρίνιας κοιλότητας

Αναερόβιο σύστημα μεταφοράς

5. Κατώτερο αναπνευστικό σύστημα

α) Πτύελα με απόχρεμψη

Καθαρισμός της στοματικής κοιλότητας με νερό. Συλλογή πτυέλων μετά από βήχα κατά την πρωινή έγερση

Ευρύστομο δοχείο 1-5 Διατήρηση στους 4°C για 24 ώρες. Για μύκητες λαμβάνονται πρωινά πτύελα σε 3 συνεχόμενες ημέρες. Στα παιδιά λαμβάνονται συνήθως με αναρρόφηση

β) Προκλητά πτύελα Καθαρισμός ως 5α. Ψεκασμός 25 ml στείρου φυσιολογικού ορού 3-10%

όπως 5α

To Histoplasma capsulatum και ο Blastomyces dermatitidis επιβιώνουν για λίγο μετά τη συλλογή

γ) Διατραχειακή αναρρόφηση

Αντισηψία και αναισθησία της περιοχής λήψης. Παρακέντηση της κρικοθυρεοειδούς μεμβράνης. Αναρρόφηση με τη βοήθεια καθετήρα

Σύριγγα ή σύστημα αναρρόφησης και

αναερόβιο σύστημα μεταφοράς

Μέθοδος εκλογής επί πνευμονίας. Χρησιμοποιείται σε ασθενείς σε κώμα, σε αναερόβια λοίμωξη, σε αποτυχία των 5α και 5β

δ) Δείγματα μέσώ βρογχοσκοπίου (βρογχοκυψελι-δικό έκπλυμα)

Λήψη με διπλού τοιχώματος εύκαμπτο καθετήρα. Η βούρτσα τοποθετείται σε φυσιολογικό ορό

Σωληνάριο ή δοχείο ≥ 1 Το βρόγχοκυψελιδικό έκπλυμα είναι η πιο αποτελεσματική μέθοδος για τη διάγνωση της πνευμονίας. Διαβρογχική βιοψία πνεύμονα για την αναζήτηση μυκήτων. Διατήρηση στους 4°C για 24 ώρες

1155

6. Γεννητικό σύστημα της γυναίκας

α) Τράχηλος μήτρας Απομάκρυνση της βλέννης και των εκκρίσεων. Λήψη επιθηλιακών κυττάρων με περιστροφική κίνηση του στυλεού

Υλικά μεταφοράς για γόνοκοκκο, χλαμύδια

β) Κόλπος Έκκριμα από τον οπίσθιο

θόλο Στυλεός με υλικό

μεταφοράς. Το σπείραμα αντισύλληψης

τοποθετείται σε δοχείο

Για τη διάγνωση της βακτηριακής κολπίτιδας αρκεί επίχρισμα σε αντικειμενοφόρο πλάκα και χρώση Gram

γ) Ουρήθρα Απομάκρυνση των εκκρίσεων. Μάλαξη της ουρήθρας και συλλογή υγρού.

Υλικά μεταφοράς για γόνοκοκκο, χλαμύδια

7. Γαστρεντερικό σύστημα

α) Ορθικό επίχρισμα Λήψη με στυλεό από κρύπτες του ορθού, σε βάθος τουλάχιστον 3 cm

Υλικά μεταφοράς για γονόκοκκο

Συνιστώνται 3 δείγματα. Εκτός των εντεροπαθογόνων,γίνεται έλεγχος φορίας για S. pyogenes και Streptococcus agalactiae (έγκυες)

β) Κόπρανα για συνήθη εντεροπαθογόνα

Ποσότητα κοπράνων που περιέχει πύον, αίμα ή βλέννη

Ευρύστομο δοχείο ή σύστημα μεταφοράς για εντεροπαθογόνα μικρόβια, όπως Cary-Blair

29 Λαμβάνονται 1 -2 δείγματα το πρώτο 3ήμερο Διατήρηση στους 4ο C για 24 ώρες. Διατήρηση στους 25ο C για 48 ώρες σε κατάλληλο υλικό μεταφοράς

γ) Κόπρανα για Clostridium difficile ή τοξίνη

Υδαρή ή ημίρρευστα κόπρανα

Ευρύστομο δοχείο ≥5g Τουλάχιστον 5 κενώσείς ημερησίως, διατήρηση στους 4οC

Πίνακας 1.2: Οδηγίες συλλογής και μεταφοράς κλινικών δειγμάτων για την καλλιέργεια απαιτητικών μικροοργανισμών

Bordetella pertussis, Β. paraperlussis (επίχρισμα ή αναρρόφηση από το ρινοφάρυγγα βρόγχοκυψελιδικό έκπλυμα): Άμεσος ενοφθαλμισμός του κλινικού δείγματος σε Θρεπτικό υλικό Bordet-Gengou ή Regan-Lowe. Εάν η μεταφορά διαρκεί λίγες ώρες, ο στυλεός, από αλγινικό ασβέστιο κατά προτίμηση, αναδεύεται σε υδρολυμένη καζεΐνη 1% και αφού πιεσθεί στα τοιχώματα του σωληναρίου απορρίπτεται ή τοποθετείται σε υλικό Amies με ζωικό άνθρακα. Η μεταφορά γίνεται σε Θερμοκρασία δωματίου. Εάν ο χρόνος μεταφοράς είναι μεγαλύτερος από 24 ώρες, ο στυλεός ενοφθαλμίζεται σε υλικό μεταφοράς Regan-Lowe το οποίο επωάζεται, στους 35°C, για 24 ώρες. Ακολουθεί η μεταφορά σε θερμοκρασία δωματίου, η οποία δεν πρέπει να υπερβαίνει τις 3 ήμερες. Το υλικό αναρρόφησης ή το βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα μεταφέρεται σε γυάλινο δοχείο πλυμένο με οξύ η σε πλαστικό αναμεμειγμένο με λίγο ρυθμιστικό διάλυμα χλωριούχου νατρίου-φωσφορικών αλάτων (SPB). Campylobacter spp (κόπρανα, επίχρισμα από το ορθό): Υλικό μεταφοράς Cary-Blair χρησιμοποιείται για δείγμα από το ορθό εάν υπάρχει καθυστέρηση μεγαλύτερη των 2 ωρών. Ο στυλεός με το υλικό μεταφοράς Cary-Blair διατηρείται στους 4°C για 24 ώρες.

1166

Chlamydia spp επίχρισμα από τον τράχηλο της μήτρας, την ουρήθρα, τον κόλπο πριν την ήβη, το στοματοφάρυγγα και τον επιπεφυκότα. Υγρό αναρρόφησης από ρινοφάρυγγα, βρόγχο και πνεύμονα. Χρησιμοποιείται στυλεός από βαμβάκι ή πολυεστέρα. Ο στυλεός εναιωρείται σε 1-2 ml υλικού μεταφοράς χλαμυδίων (CTM) το οποίο είναι συνήθως το 2-SP (0,2Μ σουκρόζη -0,02 Μ φωσφορικά άλατα) και απορρίπτεται. Τα υγρά μεταφέρονται με ίση ποσότητα CTM Ως CTM έχει χρησιμοποιηθεί και το διάλυμα σουκρόζης-φωσφορικών αλάτων-γλουταμινικού οξέος εμπλουτισμένο με λευκωματίνη ορού βοός. Εάν το δείγμα δεν καλλιεργηθεί σε 4 ώρες, ψύχεται στους 4°C για 48 ώρες. Εάν η καλλιέργεια καθυστερήσει περισσότερο, το δείγμα καταψύχεται (-70°C).

Clostridium difficile (υδαρή ή μη σχηματισμένα κόπρανα, περιεχόμενο του αυλού του εντέρου): Η ελάχιστη ποσότητα κοπράνων είναι 5 ml ή 5 g και η καλλιέργεια πρέπει να γίνει εντός 2 ωρών, διαφορετικά τα κόπρανα μεταφέρονται με αναερόβιο φιαλίδιο ή στυλεό (Πίνακας 1.7) και φυλάσσονται στους 4°C μέχρι 2 ημέρες. Τα κόπρανα από τα οποία θα γίνει η ανίχνευση της τοξίνης διατηρούνται, στους 4°C, μέχρι 3 ημέρες ή στους -70°C για μεγάλο χρονικό διάστημα.

Francisella tularensis (φαρυγγικό επίχρισμα, πτύελα, βρογχικό έκπλυμα): Άμεσος ενοφθαλμισμός σε θρεπτικό υλικό Glucose Cystine Blood Agar (GCBA). Τα κλινικά δείγματα διατηρούνται στους -70°C, ενώ για τη μεταφορά τους χρησιμοποιείται ξηρός πάγος αφού πρώτα στο στυλεό προστεθούν λίγες σταγόνες ζωμού ή φυσιολογικού ορού. Σημειώνεται ότι η F. tularensis είναι ιδιαίτερα λοιμογόνο βακτήριο.

Mycoplasma pneumoniae (φαρυγγικό ή ρινοφαρυγγικό επίχρισμα, αναρρόφηση από τραχεία, πτύελα): Ο στυλεός αναδεύεται σε υλικό μεταφοράς (ζωμός τρυπτικάσης-σόγιας με λευκωματίνη ορού βοός 0,5% και 200 u/ml πενικιλλίνη) και στη συνέχεια απορρίπτεται. Η τραχειακή αναρρόφηση και τα πτύελα τοποθετούνται σε αποστειρωμένο δοχείο. Τα δείγματα μπορούν να παραμείνουν μέχρι 6 ώρες, στους 4°C, ενώ στους -70°C διατηρούνται για μεγάλο χρονικό διάστημα. Ως υλικό μεταφοράς χρησιμοποιείται και το διάλυμα σουκρόζης - φωσφορικών αλάτων - γλουταμινικού οξέος εμπλουτισμένο με λευκωματίνη ορού βοός.

Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum (επίχρισμα από τον κόλπο, τον τράχηλο της μήτρας και την ουρήθρα, ΕΝΥ, αίμα): Ο στυλεός αναδεύεται σε υλικό μεταφοράς (PPLO με εκχύλισμα μυκήτων, ορός αλόγου και αντιβιοτικά) και στη συνέχεια απορρίπτεται. Σημειώνεται ότι ο στυλεός από αλγινικό ασβέστιο είναι ακατάλληλος για το U. urealyticum. Το ΕΝΥ τοποθετείται σε αποστειρωμένο δοχείο χωρίς υλικό μεταφοράς. Η μεταφορά και διατήρηση των δειγμάτων είναι όμοια με εκείνη του Μ. pneumoniae. Για το αίμα, λαμβάνονται 2 ml με ηπαρίνη και αναμειγνύονται με 18 ml ζωμού αιμοκαλλιέργειας ή κατάλληλου ζωμού, π.χ. θρεπτικός ζωμός με ορό αλόγου 10-20%.

Neisseria gonorrhoeae (επίχρισμα από την ουρήθρα, τον τράχηλο της μήτρας, τον κόλπο πριν την ήβη, το στοματοφάρυγγα και τον επιπεφυκότα, ουρά, αίμα, πύον από τους βαρθολίνειους αδένες): Το δείγμα ενοφθαλμίζεται σε τροποποιημένο Thayer Martin (MTM) ή σε σοκολατόχρωμο άγαρ εμπλουτισμένο με Isovitalex. Εάν η μεταφορά διαρκεί λιγότερο από 5 ώρες το ενοφθαλμισμένο θρεπτικό υλικό διατηρείται σε θερμοκρασία δωματίου και σε ατμόσφαιρα 5-7% CO2, διαφορετικά προηγείται επώαση αυτού, στους 35 °C, για 18-24 ώρες. Η μεταφορά δεν μπορεί να διαρκέσει περισσότερο από 48 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Η χρησιμοποίηση στυλεού και υλικού μεταφοράς Amies ή Stuart δεν συνιστάται πλέον αν και ο γονόκοκκος μπορεί να διατηρηθεί για 6 ώρες περίπου.

Rickettsia spp (αίμα με ηπαρίνη, θρόμβος αίματος, ούρα, πτύελα): Η καλλιέργεια της ρικέτσιας είναι ιδιαίτερα επικίνδυνη. Το δείγμα φυλάσσεται στους -70°C και μεταφέρεται σε ξηρό πάγο. Ως υλικό μεταφοράς χρησιμοποιείται το διάλυμα σουκρόζης-φωσφορικών αλάτων-γλουταμινικού οξέος εμπλουτισμένο με λευκωματίνη ορού βοός 0,1-1% χωρίς προσθήκη αντιβιοτικών. Treponema pallidum (έλκη εκτός εκείνων που εντοπίζονται στο βλεννογόνο του στόματος, συφιλιδικές πλάκες): Διαυγείς ορώδες υγρό συλλέγεται από τη βλάβη αφού προηγηθεί καθαρισμός με φυσιολογικό ορό ή νερό της βρύσης. Πολλές φορές για να αναβλύσει το υγρό ξύνεται ελαφρά η βλάβη χωρίς να προκληθεί όμως αιμορραγία. Σταγόνα του υγρού ελέγχεται σε μικροσκόπιο σκοτεινού πεδίου εντός 20 λεπτών επειδή οι σπειροχαίτες χάνουν γρήγορα την κινητικότητα τους.

Yersinia pestis (αίμα, φαρυγγικό επίχρισμα, βρογχικό έκπλυμα, αναρρόφηση υλικού από λεμφαδένα): Άμεσος ενοφθαλμισμός σε θρεπτικά υλικά (αιματούχο και σοκολατούχο άγαρ). Εάν η μεταφορά του δείγματος διαρκεί περισσότερο από 2 ώρες πρέπει να ψύχεται στους 4°C.

Πίνακας1-3 : Συστήματα μεταφοράς κλινικών δειγμάτων για αναερόβια καλλιέργεια

1177

Αναρρόφηση με σύριγγα και βελόνη. Εάν ο όγκος του υγρού κλινικού δείγματος είναι μεγάλος (>2 ml) τα αναερόβια βακτήρια επιβιώνουν για 2-3 ώρες, διαφορετικά (<1 ml) για 30 λεπτά περίπου σε θερμοκρασία δωματίου. Από τη σύριγγα αφαιρούνται οι φυσαλίδες αέρα καθώς και η βελόνα με ειδικό μηχάνημα, ενώ το ρύγχος της σύριγγας κλείνεται αεροστεγώς με αποστειρωμένο πώμα. Είναι προτιμότερο όμως, για λόγους ασφάλειας του προσωπικού και διατήρησης της βιωσιμότητας των αναερόβιων μικροβίων, το δείγμα να ενίεται σε φιαλίδιο ή σωληνάριο

Φιαλίδιο ή σωληνάριο. Υπάρχει αναερόβια ατμόσφαιρα. Περιέχει βάση άγαρ και δείκτη οξειδοαναγωγικού δυναμικού, χρησιμοποιείται για τη μεταφορά υγρών κλινικών δειγμάτων. Αναερόβιος στυλεός. Το κλινικό δείγμα, το οποίο λαμβάνεται με το στυλεό, διατηρείται σε αναερόβιο υλικό μεταφοράς για 2-3 ώρες ή σε αναερόβια ατμόσφαιρα, παρουσία υγρασίας, για 1 ώρα. Ο "αναερόβιος" στυλεός, όπου είναι δυνατόν, πρέπει να αποφεύγεται.

Πίνακας 1.4: Μικροοργανισμοί μέλη της φυσιολογικής χλωρίδας του δέρματος και των βλεννογόνων

ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΟΙ

ΑΝΑΤΟΜΙΚΗ ΠΕΡΙΟΧΗ

ΣΤΟΜΑΤΟ-ΦΑΡΥΓΓΑΣ ΜΥΤΗ ΠΑΧΥ

ΕΝΤΕΡΟ ΟΥΡΗΘΡΑ ΚΟΛΠΟΣ ΕΞΩ ΑΚΟΥΣΤΙΚΟΣ ΠΟΡΟΣ

Micrococcus spp ++1 +

Staphylococcus spp ++ ++ + ++ ++ +

Streptococcus spp ++2 + + +3 +

Enterococcus spp ++ + +

Bacillus spp + +

Corynbacterium spp + ++ + + +

Lactobacillus spp + + + ++

Gardnerella vaginalis + +

Neisseria spp4 ++ + + + +

Moraxella spp + + +

Enterobacteriacae5 + ++ + ++ +

Acinetobacter spp5 + + + +

Pseudomonas spp5 + + +

Actinomyces spp ++ +

Propionibacterium spp + + +

Bifidobacterium spp + +

Clostridium spp + ++ +

Eubacterium spp +

Peptostreptococcus spp ++ + + + +

Veillonella spp ++ +

Bacteroides spp ++ ++ + +

Prevotella spp ++ ++

Porphyromonas spp ++ ++

Fusobacterium spp ++ ++ + +

Mycoplasma spp/ +/ +/+ +/+

U.urealyticum

Non Tuberculosis + + +

Mycobacteria

Candida spp + + + + +

Aspergillus spp + +

Άλλα βακτήρια +6 +7

Άλλοι μύκητες +8

1188

Παράσιτα +9 +10 1: ++: συνήθη, +: περιστασιακά μέλη της φυσολογικής χλωρίδας 2: Ο S.pneumoniae είναι σύνηθες μέλος της χλωρίδας του στοματοφάρυγγα 3: Ο S agalactiae είναι περιστασιακά μέλος της χλωρίδας του κόλπου 4: Σαπροφυτικά είδη. Στο στοματοφάρυγγα και στη μύτη μπορεί να ανευρίσκεται η N. meningitidis (φορέας) 5: Αποικίζουν συχνά νοσοκομειακούς ασθενείς 6: Είδη του γένους Aeromonas, Vibrio και Alcaligenes 8: Saccharomyces spp, Blastomyces hominis 9: Entamoeba gingivalis, trichomonas tenax 10: Chilomastix mesnili, Endolimax nana, Entamoeba coli, Entamoeba hartmanni, Iodamoeba butschlii καιTrichomonas hominis

Πίνακας 1.5: Ακατάλληλα, για καλλιέργεια και παρασιτολογική εξέταση, κλινικά δείγματα ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ Γενικά μη αναγραφή ή λάθος αναγραφή των στοιχείων του ασθενούς ακατάλληλο μέσο μεταφοράς (μη στείρο, απώλεια υλικού κ.ά). παρατεταμένη διάρκεια μεταφοράς, ακατάλληλα υλικά ή θερμοκρασία μεταφοράς ανεπαρκής ποσότητα ακατάλληλη πηγή δείγματος, π.χ. σίελος αντί πτύελα δείγμα από στείρα φυσιολογικά περιοχή, επιμολυσμένο με χλωρίδα δυο δείγματα εντός 24ώρου από την ίδια πηγή εκτός λίγων εξαιρέσεων, όπως αίμα, δείγματα μετά από βρογχοσκόπηση,

"στείρα" υγρά πλην ούρων κ.ά. δείγμα που έχει υποστεί κατάψυξη ή έχει αναμειχθεί με νερό βρύσης (επιμόλυνση από σαπροφυτικά μυκοβακτηρίδια) Ούρα διάρκειας >2 ωρών σε θερμοκρασία δωματίου και χωρίς συντηρητικό διάρκειας >24 ωρών σε θερμοκρασία 4°C χωρίς συντηρητικό επιμολυσμένα με κόπρανα από σάκκο συλλογής μόνιμου καθετήρα 24ωρη συλλογή, εκτός εάν αναζητούνται παράσιτα Αίμα με νατριούχο σουλφονική πολυανεθόλη (sodium polyanethol sulfonate, SPS) όταν αναζητούνται Neisseria spp,

Streptobacillus moniliformis, Bartonella hensellae και C. vaginalis (Η προσθήκη ζελατίνης 1.2% μπορεί να βοηθήσει την ανάπτυξη ορισμένων βακτηρίων)

πήγμα ή EDTA για Mycobacterium spp με κιτρικά άλατα για Leptospira spp χωρίς αέρα (unvented) για Pseudomonas spp ή μύκητες Κόπρανα διάρκειας >2 ωρών χωρίς συντήρηση επιμολυσμένα με ούρα με υλικό μεταφοράς Cary-Blair για C. difficile ορθικό επίχρισμα (στυλέος) για ανίχνευση τοξίνης C. difficile με συντηρητικό (φορμαλίνη, PVA κ.ά) Δείγματα από το αναπνευστικό σύστημα ρινικό επίχρισμα για παραρρινοκολίτιδα, μέση ωτίτιδα και λοίμωξη πνευμόνων ρινοφαρυγγικό ή φαρυγγικό επίχρισμα για μέση ωτίτιδα ή παραρρινοκολπίτιδα φαρυγγικό επίχρισμα για επιγλωτίτιδα ή κοκκύτη σταγονίδια βήχα άμεσα ενοφθαλμισμένα σε θρεπτικό υλικό (cough plates) για κοκκύτη πτύελα με >10 επιθήλια ανά οπτικό πεδίο (χ10) με χρώση Gram 24ωρη συλλογή πτυέλων <2 ml πτυέλων και όχι πυώδη πτύελα με φυσιολογικό ορό για Legionella spp

Δείγματα για την απομόνωση αναερόβιων μικροβίων ούρα μέσου ρεύματος ή μετά από καθετηριασμό της ουροδόχου κύστης ρινικό ή φαρυγγικό επίχρισμα ενδοτραχειακή αναρρόφηση ή τραχειοστομία βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα (χωρίς διπλού τοιχώματος βρογχοσκόπιο) πτύελα προκλητά ή μετά από βήχα αιδοίο κόλπος

1199

Κεφάλαιο 2ο : ΚΚααλλλλιιέέρργγεειιςς ΚΚλλιιννιικκώώνν ΔΔεειιγγμμάάττωωνν Λοιμώξεων του

Ανώτερου Αναπνευστικού Συστήματος

Οι αμιγώς βακτηριακές λοιμώξεις του ανωτέρου αναπνευστικού συστήματος,

δεν είναι συχνές και σχετίζονται κυρίως με φαρυγγοαμυγδαλίτιδα,

παραρρινοκοπλίτιδα, μέση πυώδη ωτίτιδα, διφθερίτιδα .

Η διάγνωσή τους συνίσταται στην απομόνωση του αιτιολογικού παράγοντα

ανάμεσα στα μέλη της πλούσιας μικροβιακής χλωρίδας της περιοχής. Η απομόνωση

όμως παθογόνου ή δυνητικά παθογόνου μικροοργανισμού δεν συνεπάγεται αυτόματα

και τη συμμετοχή του σε λοίμωξη π.χ. κορυνοβακτηρίδιο της διφθερίτιδας,

μυκόπλασμα και χλαμύδιο της πνευμονίας. Στις περιπτώσεις αυτές το ιστορικό και η

κλινική εικόνα έχουν αποφασιστική σημασία στη διάγνωση .

22..11 ΣΣυυλλλλοογγήή –– ΜΜεεττααφφοορράά

Τα δείγματα που λαμβάνονται από το ανώτερο αναπνευστικό σύστημα είναι :

Φαρυγγικά, Ρινοφαρυγγικά αναρροφήματα και επιχρίσματα, Ρινικά επιχρίσματα,

Αναρροφήματα παραρινικών κόλπων, Ωτικά δείγματα, Στοματικά δείγματα .

Α)Φαρυγγικά επιχρίσματα:Καλλιέργεια φαρυγγικού επιχρίσματος γίνεται κυρίως

για την απομόνωση του β – αιμολυτικού στρεπτόκοκκου της ομάδας Α και

σπάνια για την απομόνωση στρεπτόκοκκων των ομάδων C ή G, γονόκοκκου,

Staphylococcus haemolyticus, H. influenzae, κορυνοβακτηριδίου της

διφθερίτιδας.

Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιείται στυλεός με βύσμα από Dacron (οι ίνες

βάμβακος μπορεί να αναστείλουν την ανάπτυξη της ναισέριας). Επιχρίεται η

επιφάνεια του φάρυγγα, των αμυγδαλών ή οι παρίσθμιες καμάρες και περιοχές,

όπου διακρίνετε η παρουσία πύου, εξιδρώματος ή εξελκώσεων. (εικ.2.1)

Προκειμένου για διφθερίτιδα αν υπάρχει υμένιο, διφθέρα στα παρίσθμια γίνεται

προσπάθεια να αποσπασθεί12. Η χρήση γλωσσοπιέστρου θα εμποδίσει την

επιμόλυνση του δείγματος με μικροοργανισμούς του στοματικού βλεννογόνου.

Η χρησιμοποίηση αυτοτελούς συστήματος συλλογής ή συστήματος μεταφοράς,

2200

όπως το Culturette (Becton Dickinson) (εικ.2.2), καθιστά σχετικά απλή και

αξιόπιστη τη συλλογή και μεταφορά του υλικού καλλιεργειών. Η λήψη καλών

δειγμάτων για καλλιέργεια και η χρησιμοποίηση κατάλληλων εργαστηριακών

τεχνικών αυξάνουν την ευαισθησία για την απομόνωση ή ενοχοποίηση

στελεχών στρεπτόκοκκου ομάδας Α στο 95%. Μια πρόσφατη μελέτη έδειξε ότι

μια καλώς εκτελεσθείσα αερόβια καλλιέργεια φαρυγγικού επιχρίσματος σε

μονήρες τρυβλίο έχει ευαισθησία 96% και ειδικότητα 99,5%. Η ευαισθησία

μπορεί να είναι μικρή, μέχρι και 30%, όταν χρησιμοποιούνται ακατάλληλα

δείγματα υλικού από τον φάρυγγα και κακές εργαστηριακές τεχνικές.

Ο στυλεός σε υποψία στρεπτοκοκκικής φαρυγγίτιδας, αποστέλλεται

αμέσως στο εργαστήριο γιατί έτσι αυξάνεται η ευαισθησία της μικροβιολογικής

διάγνωσης. Εάν όμως η μεταφορά διαρκεί περισσότερο από τέσσερις ώρες,

τοποθετείται σε υλικό μεταφοράς (Amies ή Stuart). Παράλληλα λαμβάνεται και

δεύτερο φαρυγγικό επίχρισμα από το οποίο θα γίνει ο έλεγχος για

στρεπτοκοκκικό αντιγόνο.

Η χρησιμοποίηση υλικού μεταφοράς Amies ή Stuart για το γονόκοκκο δεν

συνιστάται πλέον, αν και ο μικροοργανισμός διατηρείται για 6 ώρες περίπου

στα υλικά αυτά. Όταν υπάρχει υπόνοια ότι ο ασθενής πάσχει από γονοκοκκική

φαρυγγίτιδα ή είναι φορέας του μηνιγγιτιδοκόκκου, το υλικό της καλλιέργειας

πρέπει αμέσως μετά τη λήψη να ενοφθαλμίζεται σε τρυβλίο JEMBEC, που

προηγουμένως έχει ζεσταθεί (ή σε άλλο κατάλληλο θρεπτικό μέσο). Στη

συνέχεια, τα τρυβλία πρέπει να επωάζονται κατά τη διάρκεια της νύκτας στους

35οC, και σε ατμόσφαιρα περιεκτικότητας 5 – 10 % σε CO2 , πριν σταλούν στο

εργαστήριο. Μια εναλλακτική λύση, όταν υπάρχει υπόνοια για γονόκοκκο,

είναι να μεταφέρεται στο εργαστήριο το βύσμα με το υλικό που θα

καλλιεργηθεί μέσα σε ειδικό σύστημα μεταφοράς με θρεπτικό υλικό.

Στη χρόνια αμυγδαλίτιδα το δείγμα λαμβάνεται από τον πυρήνα των

αμυγδαλών μετά από παρακέντηση. Σημειώνεται ότι το μικροβιακό υπόστρωμα

διαφέρει πολλές φορές στις δύο αμυγδαλές.

Στη διφθερίτιδα ο κοινός βαμβακοφόρος στυλεός μπορεί να

χρησιμοποιηθεί επειδή το βακτήριο δεν καταστρέφεται εύκολα. Ως υλικό

2211

μεταφοράς χρησιμοποιείται η silica gel. Το δείγμα στέλνεται στο εργαστήριο

γρήγορα. Προτιμότερο είναι να εμβολιασθεί ένα σωληνάριο με υλικό Loffler

(πηγμένος ορός αίματος βοδιού που περιέχει κατά 25% σακχαρούχο ζωμό) κατ’

ευθείαν στο ιατρείο του κλινικού γιατρού και να σταλεί στο εργαστήριο μαζί με

το στυλεό. Το υλικό αυτό, είανι στηνουσία ένα εμπλουτιστικό για τα

κορυνοβακτηρίδια υλικό, γιατί δεν ευνοεί την ανάπτυξη των απαιτητικών

βακτηρίων του φάρυγγα.

Β)Ρινοφαρυγγικά αναρροφήματα και επιχρίσματα: Αναζητούνται ο

αιμολυτικός Στρεπτόκοκκος της ομάδας Α, ο μηνιγγιτιδόκοκκος, το

Κορυνοβακτηρίδιο διφθερίτιδας, η Μπορντετέλλα του κοκκύτη. Λαμβανονται

με εύκαμπτο στυλεό που εισάγεται από τη μύτη και έχει βύσμα από αλγινικό

ασβέστιο ή πολυεστέρα. Αντίθετα στυλεοί από βαμβάκι ή τεχνητή μέταξα θα

πρέπει να αποφεύγονται γιατί περιέχουν τοξικές ουσίες. Ο ρινοφαρυγγικός

στυλεός εισέρχεται από τη μύτη και προωθείται μέχρι τον οπίσθιο ρινοφάρυγγα

όπου περιστρέφεται για ένα λεπτό. Ο χειρισμός αυτός προκαλεί τοπικά

υπερεκκρίσεις, οι οποίες συλλέγονται με τη δεύτερη είσοδο του στυλεού.

Εναλλακτικός τρόπος είναι η λήψη των ρινοφαρυγγικών εκκρίσεων με τη

βοήθεια λεπτού καθετήρα προσαρμοσμένου στην άκρη της σύριγγας

Γ) Ρινικά επιχρίσματα: Παίρνονται με λεπτό ρινικό στυλεό που εισάγεται στο

βάθος μέχρι να συναντήσει αντίσταση, περιστρέφεται και επαναλαμβάνεται η

λήψη και από τον άλλο ρώθωνα. Μικρόβιο που αναζητείται είναι κατά κύριο

λόγο ο S. aureus.

Δ) Αναρρόφηση παραρρινικών κόλπων: Παίρνεται από ειδικό ΩΡΛ γιατρό με

τεχνική αναρροφήσεως με σύριγγα από το μετωπιαίο ή τους μασητικούς ή

άλλους ιγμόριους κόλπους. Το δείγμα μπαίνει σε συσκευή μεταφοράς

αναερόβιων ή στέλνεται η σύριγγα με σφραγισμένο το στόμιο της βελόνης.

Γίνεται καλλιέργεια γενική και ειδική για αναερόβια.

Ε) Ωτικό έκκριμα: Είναι υλικό που παίρνεται από ΩΡΛ γιατρό με παρακέντηση

του τύμπανου σε περιπτώσεις μέσης ωτίτιδας που δεν υποχώρησε στη θεραπεία.

Καθαρίζεται ο εξωτερικός ωτικός πόρος με ελαφρό αντισηπτικό και

2222

παρακεντείται το τύμπανο. Το αναρρόφημα στέλνεται σε άσηπτα δοχεία ή

στέλνεται η σύριγγα με το δείγμα.

Αν το τύμπανο είναι σπασμένο συλλέγεται το έκκριμα με στυλεό που

εισάγεται μέσω ακουστικού speculum. Αναζητούνται αναερόβια και μύκητες12.

Ζ) Στοματικό επίχρισμα: Ξεπλένεται το στόμα με αλατοδιάλυμα, σκουπίζεται η

πάσχουσα περιοχή με αποστειρωμένη γάζα και με στυλεό παίρνεται το

επίχρισμα.

22..22 ΜΜιικκρροοσσκκοοππιικκήή ΕΕξξέέτταασσηη

Στη στρεπτοκοκκική και γονοκοκκική φαρυγγίτιδα η μικροσκοπική εξέταση

δεν προσφέρει καμία βοήθεια λόγω της παρουσίας πλούσιας μικροβιακής χλωρίδας.

Στη διφθερίτιδα το δείγμα επιστρώνεται σε δυο παρασκευάσματα, που το μεν

εάν χρωματίζεται με Gram και το άλλο με μια ειδική χρώση, όπως είναι η

Stoltenberg και η Neisser12. Το C.diphteriae χρωματιζόμενο με τη χρώση κατά

Gram, είναι Gram ασθενώς θετικό, δηλαδή τα μεταχρωματικά κοκκία (έτσι

ονομάζονται το κοκκίαστο μικροβιακό σώμα) κρατούν σταθερά τη χρώση ενώ το

υπόλοιπο σώμα αποχρωματίζεταο εύκολα και

χρωματίζεται με την ερυθρά χρωστική της

χρώσης Gram, έτσι εμφανίζεται ιώδες με

περιοχές δίκην διαφραγμάτων ερυθρές σε

αντίθεση με άλλα κορυνοβακτηρίδια τα οποία

είναι ισχυρώς Gram-θετικά6. Τα βακτήρια

σιατάσσονται σε μικρές αλυσίδες σε V ή Υ

σχηματισμούς ή κινέζικων γραμμάτων,έχουν

δε μερικά σαφή κορυνοειδή μορφή.

Για την ευκολότερη αναγνώριση του

c.diphteriae χρησιμοποιούνται ειδικές χρώσεις,

ώστε να χρωματιζόνται με διαφορετική

χρωστική τα κοκκία από το υπόλοιπο μικροβιακό σώμα. Έτσι στη χρώση κατά

Stoltenberg τα κοκκία χρωματίζονται ερυθροϊώδη, τα μικροβιακά σώματα πράσινα,

Εικόνα 2-1: Μορφολογία του

Kορυνοβακτηριδίου διφθερίτιδας μικροσκοπική μετά από χρώση. Α=Χρώση

Stoltenberg και Β=Χρώση Gram

2233

ενώ στη χρώση κατά Neisser τα μεταχρωματικά κοκκία παίρνουν κυανόμαυρη χριά,

ενώ το πρωτόπλασμα των μικροβίων κίτρινη προς καστανή (εικόνα 2.1).

Η εξέταση άμεσων παρασκευασμάτων (με κυανο του μεθυλενίου) είναι

παραπλανητική γιατί την ίδια περίπου μορφολογία με το Κορυνοβακτηρίδιο

διφθερίτιδας έχουν και τα κοινά Κορυνοβακτηρίδια της φυσιολογικής χλωρίδας, τα

γνωστά ως Διφθεροειδή.

Στον κοκκύτη ο άμεσος ανοσοφθορισμός για την ανίχνευση της B.pertussis

και της B.parapertussis, θεωρείται συμπληρωματική μικροσκοπική εξέταση επειδή

χαρακτηρίζεται από υψηλό ποσοστό (10-40%) ψευδώς θετικών αποτελεσμάτων.

Χρειάζεται ο ειδικός αντι-ορός συνδεδεμένος με το φθοριόχρωμα. Υπάρχει στο

εμπόριο. Ακολουθείται η τεχνική που υποδεικνύεται από τον κατασκευαστή του

αντιδραστηρίου.

Στην κυνάγχη Plaut-Vincent η διάγνωση γίνεται μικροσκοπικά με τη χρώση

του επιχρίσματος (από τη βλάβη) με αραιωμένη καρβοξυλική φουξίνη (χρώση Ziehl-

Neelsen αραιωμένη 1:10 με νερό). Παρατηρούνται πολλά πυοσφαίρια, Σπειροχαίτες

και οξύαιμα βακτηρίδια ροζ χρώματος .

22..33 ΘΘρρεεππττιικκάά ΥΥλλιικκάά ΕΕππιιλλοογγήήςς

Η καλλιέργεια του φαρυγγικού επιχρίσματος γίνεται στα ακόλουθα θρεπτικά

υλικά:

αιματούχο άγαρ, στο οποίο αναπτύσσονται όλοι οι μικροοργανισμοί

MacConkey 3 άγαρ, όπου αναπτύσσονται όλα τα Gram αρνητικά

μικρόβια (εντεροβακτηριακά)

Σοκολατόχρωμο άγαρ

Mannitol salt άγαρ ή Chapman άγαρ, όπου αναπτύσσονται οι κόκκοι και

ιδιαίτερα ο staphylococcus aureus, ο οποίος και αναγνωρίζετε εύκολα

Sabouraud άγαρ, όπου αναπτύσσονται φυσιολογικά μόνο μύκητες, διότι

περιέχει αντιβιοτικό, χλωραμφαινικόλη, το οποίο αναστέλλει την

ανα΄πτυξη όλων των άλλων μικροβίων.

2244

Θρεπτικά υλικά για αναερόβια μικρόβια, όπως brucella αγαρ

εμπλουτισμένο με 5% αίμα αλόγου, αιμίνη και βιταμίνη Κ, Columbia,

Schaedler άγαρ, CDC και Brain Heart infusion agar (BHIA).

Στην καθημερινή πράξη καλλιέργεια γίνεται μόνο για την απομόνωση των β-

αιμολυτικών στρεπτοκόκκων. Στην περίπτωση που αναζητούνται άλλα παθογόνα

μικρόβια πρέπει να ενημερώνεται το εργαστήριο.

Έτσι, για την ανάπτυξη του Γονόκοκκου χρησιμοποιείται το τροποποιημένο

Thayer - Martin άγαρ το οποίο επωάζεται για 48-72 ώρες, σε περιβάλλον με υγρασία

και συγκέντρωση CO2 5-10%. Το GC-Lect (BBL) είναι ένα νέο υλικό το οποίο,

συγκριτικά με το MTM άγαρ, καταστέλλει περισσότερο τη μικροβιακή χλωρίδα, ενώ

περιέχει και λιγότερη βανκομυκίνη με αποτέλεσμα να επιτρέπει την ανάπτυξη

μερικών στελεχών γονόκοκκου τα οποία είναι ευαίσθητα στο αντιβιοτικό αυτό.

Για την ανάπτυξη του Κορυνοβακτηριδίου διφθερίτιδας, το ρινοφαρυγγικό

επίχρισμα ενοφθαλμίζεται σε ένα

σωληνάριο με υλικό Loffler ή υλικό

Pai, αιματούχο άγαρ (αναζητείται ο β-

αιμολυτικός Στρεπτόκοκκος της

ομάδας Α επειδή ενιότε παράγει

ψευδομεμβράνη στο φάρυγγα) και

αιματούχο άγαρ με κυστείνη και

τελλουριώδες κάλιο (υλικό Hoyle ή

Tinsdale). Το τελλουριώδες κάλιο

παρεμποδίζει την ανάπτυξη των Gram

αρνητικών και πολλών Gram θετικών

βακτηρίων και επιτρέπει την ανάπτυξη του C. diphtheria, το οποίο σχηματίζει

γκρίζες ή μαύρες αποικίες11. Η ανάπτυξη μαύρων αποικιών με φαιοκάστανη άλω στο

υλικό tinsdale, θεωρείται σημαντικό ταυτοποιητικό στοιχείο12. Αν το δείγμα πάρθηκε

σε υλικό Loffler, τότε από αυτό θα γίνουν οι ανακαλλιέργειες. Τα καλλιεργήματα θα

επωασθούν στους 37ْC και την επόμενη θα γίνει η μικροσκοπική εξέταση. Τα

καλλιεργήματα στα τελλουριούχα υλικά θα εξετασθούν μετά από 48 ώρες (Εικόνα 2-

2).

Εικόνα 2-2:Αποικίες κορυνοβακτηριδίου διφθερίτιδας. Επάνω: Σε τελλουριούχο υλικό: είναι μαύρες. Κάτω. Σε αιματούχο άγαρ: είναι άσπρες μη αιμολυτικές

2255

Για την ανάπτυξη της Μπορντετέλλας του κοκκύτη το ρινοφαρυγγικό δείγμα

(εκκρίσεις, επίχρισμα) ενοφθαλμίζεται σε δυο τρυβλία άγαρ Bordet-Gengou ή Regan-

Lowe ( Oxoid, USA ), το ένα με και το άλλο χωρίς κεφαλεξίνη. Η χρησιμοποίηση δυο

υλικών είναι απαραίτητη διότι 10% περίπου των στελεχών Bordetella pertussis είναι

ευαίσθητα στην κεφαλεξίνη. Τα υλικά αυτά, όπως και το επίσης ενοφθαλμιζόμενο

αιματούχο άγαρ, επωάζονται αεροβίως για 5-7 ημέρες.

Στην επιγλωττίτιδα και στη χρόνια αμυγδαλίτιδα το κλινικό δείγμα (υλικό από

την επιγλωττίτιδα και τον πυρήνα της αμυγδαλής, αντίστοιχα) ενοφθαλμίζεται αφ’

ενός σε αιματούχο και σε σοκολατόχρωμο άγαρ, τα οποία επωάζονται για 24-48 ώρες

σε ατμόσφαιρα CO2 5% ,αφ’ ετέρου σε αναερόβιο αιματούχο άγαρ που επωάζεται

για 5 τουλάχιστον ημέρες σε αναερόβια ατμόσφαιρα.

Οι φορείς χρυσίζοντος σταφυλόκοκκου ελέγχονται με την καλλιέργεια των

δειγμάτων σε άγαρ με μαννιτόλη και χλωριούχο νάτριο (επώαση 48 ώρες αεροβίως)

και οι φορείς μηνιγγιτιδόκοκκου με την καλλιέργεια ρινοφαρυγγικού επιχρίσματος

κυρίως σε τροποποιημένο Thayer-Martin άγαρ ή GC-Lect υλικό (επώαση 48 ώρες,

ατμόσφαιρα CO2 5%) 8 .

22..44 ΤΤεεχχννιικκήή κκααλλλλιιέέρργγεειιααςς

22..44..11 ΕΕμμββοολλιιαασσμμόόςς σσττηηνν εεππιιφφάάννεειιαα θθρρεεππττιικκοούύ υυλλιικκοούύ σσεε ττρρυυββλλίίοο

Τα τρυβλία με το θρεπτικό υλικό πριν από την χρήση τους τοποθετούνται σε

κλίβανο στους 37οC για να στεγνώσει η επιφάνεια τους. Πρώτα ακουμπάμε το

κάλυμμα και λοξά πάνω σε αυτό το κύριο μέρος του τρυβλίου που περιέχει το

θρεπτικό υλικό ανεστραμμένο (εικόνα 2.3). Αφήνονται εκεί για 20-30 min, όχι

περισσότερο για να μην αφυδατωθεί το υλικό.

Εικόνα 2.3: Στέγνωμα επιφάνειας τρυβλίου με θρεπτικό υλικό.

2266

Για την επίστρωση στην επιφάνεια του στερεού θρεπτικού άγαρ που περιέχεται

σε ένα τρυβλίο, στο χώρο εργασίας θα πρέπει να υπάρχουν το λυχνάρι bunsen, ο

βιολογικός κρίκος, το υλικό που θα επιστρωθεί και τα τρυβλία με το στερεό θρεπτικό

μέσο. Με το αριστερό χέρι ανυψώνεται το καπάκι του τρυβλίου, ενώ με το δεξί χέρι

μπολιάζουμε με τον κρίκο ή κατ’ ευθείαν με τον στυλεό, με τον οποίο έγινε η λήψη

του δείγματος μια μικρή περιοχή κοντά στην περιφέρεια. Από το σημείο αυτό

επιστρώνουμε με τη βοήθεια αποστειρωμένου μεταλλικού κρίκου ή πλαστικού

κρίκου μιας χρήσεως, τραβώντας ίσιες παράλληλες γραμμές στη γειτονική περιοχή.

Αλλάζουμε πλαστικό κρίκο ή αν χρησιμοποιούμε μεταλλικό κρίκο, καίμε τον κρίκο

πάνω σε φλόγα και αφού το κρυώσουμε ακουμπώντας στο καπάκι του τρυβλίου ή στο

κέντρο του θρεπτικού υλικού, τραβάμε νέες παράλληλες γραμμές περνώντας από την

προηγούμενη περιοχή στην παραπέρα γειτονική περιοχή (Εικόνα 2-4).

Αλλάζουμε πάλι πλαστικό κρίκο ή ξανακαίμε τον μεταλλικό κρίκο και

επαναλαμβάνουμε την επίστρωση μέχρι να χρησιμοποιήσουμε όλη την επιφάνεια του

τρυβλίου. Ο τρόπος αυτός επίστρωσης με αραίωση του ενοφθαλμίσματος μπορεί να

γίνει στη μισή επιφάνεια του υλικού ώστε σε ένα τρυβλίο να γίνουν δύο καλλιέργειες.

Εικόνα2-4

2277

Παραλλαγή της μεθόδου αυτής είναι μηχανική περιστροφή του τρυβλίου οπότε

το πρώτο μπόλιασμα γίνεται στο κέντρο του τρυβλίου και η αραίωση κυκλικά προς

την περιφέρεια.

Στην αρχή της επίστρωσης οι μικροοργανισμοί είναι τόσο κοντά ο ένας στον

άλλο, έτσι ώστε να μη δίνουν, όταν αναπτυχθούν ξεχωριστές αποικίες. Καθώς όμως η

επίστρωση προχωρεί, απομένουν στον κρίκο όλο και λιγότεροι μικροοργανισμοί και

για αυτό οι μικροοργανισμοί που επιστρώνονται στην επιφάνεια του άγαρ είναι πιο

απομακρυσμένοι μεταξύ τους. Οι μικροοργανισμοί αυτοί όταν πολλαπλασιασθούν

δίνουν ξεχωριστές αποικίες.

Συμπερασματικά η σπορά των μικροβίων στα θρεπτικά υλικά επιτρέπει :

Την ανάπτυξη και τον πολλαπλασιασμό τους

Την απομόνωση και τον διαχωρισμό (ταυτοποίηση) εκείνων των μικροβίων που

έχουν παθογόνο δράση.

22..44..22 ΕΕππώώαασσηη κκααλλλλιιεερργγηημμάάττωωνν

Η επώαση των καλλιεργημάτων γίνεται σε κλίβανο θερμοκρασίας 35ο -37ο C

και με σχετική υγρασία 50%. Οι συνθήκες αυτές ισχύουν σχεδόν για όλες τις

καλλιέργειες. Αυτό που διαφέρει στην επώαση είναι η σύσταση των αερίων της

ατμόσφαιρας μέσα στον κλίβανο.

Για την καλλιέργεια του φαρυγγικού επιχρίσματος όλα τα τρυβλία επωάζονται

στους 37ο C για 24h στον επωαστικό κλίβανο ανεστραμμένα15. Με τον τρόπο αυτό οι

υδρατμοί που σχηματίζονται από την εξάτμιση του θρεπτικού υλικού

επαναρροφούνται από την εξέτμιση του θρεπτικού υλικού επαναρροφούνται από

αυτό ενώ αν δεν ήταν ανεστραμμένα θα συμπυκνώνονταν στο καπάκι του τρυβλίου12.

Εκτός από το σοκολατόχρωμο άγαρ το οποίο επωάζεται παρουσία διοξειδίου του

άνθρακα 5-10% και τα θρεπτικά υλικά για τα αναερόβια μικρόβια τα οποία

επωάζονται σε αναερόβιο περιβάλον.

2288

Σήμερα κάθε εργαστήριο μπορεί να κάνει αναερόβια καλλιέργεια σωστή με

κάποιον από τους εξής τρόπους επωάσεως.

1) Φιάλη Gas-Pak. Κλείνει ερμητικά και παράγεται μέσα σ' αυτήν υδρογόνο

με χημική αντίδραση που δεσμεύει το υπάρχον οξυγόνο. Υπάρχει στο εμπόριο η φιά-

λη και το φακελάκι με τα αντιδραστήρια για την παραγωγή του υδρογόνου καθώς και

ο καταλύτης. Φέρεται με το όνομα Gas-Pak και είναι της B-D Merieux. Καλύτερης

ανθεκτικότητας φιάλη παράγεται από την Oxoid. To Gas Pak σύστημα

χρησιμοποιείται από τα νοσοκομειακά εργαστήρια διεθνώς.

2) Κλίβανος ειδικός αερίων. Ο κλίβανος αυτός έχει αγωγούς για την εισαγωγή

αερίων ορισμένης συνθέσεως, στεγανά διαμερίσματα για την τοποθέτηση των

καλλιεργημάτων και ρυθμιστές της θερμοκρασίας. Χρησιμοποιούνται για

καλλιέργειες κυττάρων σε ατμόσφαιρα CO2 καιγια αναερόβιες καλλιέργειες. Το

μίγμα αερίων στην περίπτωση αυτή είναι: Αζωτο 85%, υδρογόνο 10%, C02 5%.

3) Θάλαμος διαφανής αναερόβιας εργασίας με γάντια. Στο θάλαμο αυτό

υπάρχει τράπεζα εργασίας, επωαστήρας, εισαγωγές χεριών. Εισάγεται το παραπάνω

μίγμα αερίων και η όλη εργασία από τη φάση της σποράς μέχρι την ταυτοποίηση του

αναερόβιου μικροβίου γίνεται σε περιβάλλον που εξασφαλίζει αναερόβιο

περιβάλλον. Είναι η καλύτερη προς το παρόν λύση αλλά η πιο δαπανηρή.

Την επομένη ημέρα γίνεται η ανάγνωση των τρυβλίων. Αν αναπτυχθούν μόνο

μικρόβια της φυσιολογικής χλωρίδας αναφέρεται στην απάντηση. Αν αναπτυχθούν

ύποπτα παθογόνα μικρόβια, θα γίνει ανακαλλιέργεια σε εκλεκτικά υλικά και την

επομένη ημέρα θα διαπιστωθεί η παρουσία ή όχι παθογόνου μικροοργανισμού.

22..55 ΑΑπποομμόόννωωσσηη ΠΠααθθοογγόόννωωνν ΜΜιικκρροοββίίωωνν ((ΑΑιιμμοολλυυττιικκόόςς ΣΣττρρεεππττόόκκοοκκκκοοςς

οομμάάδδοοςς ΑΑ ήή ΣΣττρρεεππττόόκκοοκκκκοοςς ππυυοογγόόννοοςς ((SSttrreeppttooccooccccuuss ppyyooggeenneess))

22..55..11 ΜΜαακκρροοσσκκοοππιικκήή ΕΕξξέέτταασσηη

Μετά από καλλιέργεια του παθολογικού υλικού σε αιματούχο άγαρ οι

στρεπτόκοκκοι της ομάδας Α κατά τη φάση της ανάπτυξης τους, ελευθερώνουν

αιμολυσίνες, οι οποίες καταστρέφουν (λύουν) τα ερυθρά αιμοσφαίρια. Αυτή είναι η

2299

γνωστή βήτα αιμόλυση και εμφανίζεται ως διαυγής περιοχή γύρω από την αποικία

στο αιματούχο άγαρ .( Εικόνα 2.5)

22..55..22 ΜΜιικκρροοσσκκοοππιικκήή ΕΕξξέέτταασσηη

Κατά τη μικροσκοπική εξέταση μετά από χρώση Gram διακρίνονται οι Gram

θετικοί κόκκοι, που διατάσσονται κατά ζεύγη ή αλυσίδες (Εικόνα 2.6)

22..55..33 ΒΒιιοοχχηημμιικκέέςς ΔΔοοκκιιμμαασσίίεεςς

Δοκιμή ευαισθησίας στη βακιτρακίνη

Προκαταρκτική βιοχημική ταυτοποίηση του πυογόνου στρεπτοκόκκου μπορεί

να γίνει με την τοποθέτηση ενός δισκίου βακιτρακίνης στο αρχικό καλλιέργημα του

κλινικού δείγματος. Η ευαισθησία του στρεπτοκόκκου της ομάδας Α στο αντιβιοτικό

αυτό χρησιμοποιείται ευρέως για την ταυτοποίηση του. Ωστόσο, υπάρχουν β-

αιμολυτικοί Στρεπτόκοκκοι της ομάδας Α ανθεκτικοί στη βακιτρακίνη (πάνω από το

10%) και β-αιμολυτικοί στρεπτόκοκκοι των ομάδων C και G (περίπου 3-5%)

ευαίσθητοι στο αντιβιοτικό αυτό. Β-αιμολυτικοί στρεπτόκοκκοι της ομάδας Β μπορεί

να είναι επίσης ευαίσθητοι στη βακιτρακίνη, αλλά διαχωρίζονται από την υδρόλυση

του ιππουρικού νατρίου και την CAMP δοκιμασία . (εικόνα col plate 9-2)(E)

Εικόνα2.6 : Χρώση Gram. Στρεπτόκοκκοι και πυοσφαίρια

Εικόνα2.5 : Αποικίες β-αιμολυτικών στρεπτοκόκκων

3300

Δοκιμή παραγωγής καταλάσης

Οι αποικίες του προς έλεγχο μικροοργανισμού καλύπτονται με 1-2 σταγόνες

διαλύματος 3% Η2Ο2 ή εναλλακτικά μια αποικία μεταφέρεται στο διάλυμα του Η2Ο2.

Η δοκιμή μπορεί να γίνει και πάνω σε αντικειμενοφόρο πλάκα όπου βάζουμε μια

σταγόνα από το οξυζενέ και με κρίκο μεταφέρουμε την αποικία. Ανακατεύουμε και

βλέπουμε την παραγωγή φυσαλίδων αερίου (12). Ο σχηματισμός φυσαλίδων μέσα σε

λίγα δευτερόλεπτα δείχνει διάσπαση του Η2Ο2 και σχηματισμό Ο2. Ο πυογόνος

στρεπτόκοκκος είναι καταλάση αρνητικός, δηλαδη δεν πρέπει να σχηματισθούν

φυσαλίδες .

Θα πρέπει να τονισθεί ότι ο έλεγχος της καταλάσης δεν πρέπει να γίνεται σε

μικροοργανισμούς που αναπτύσσονται σε αιματούχο άγαρ, διότι είναι δυνατόν να

πάρουμε εσφαλμένα θετική αντίδραση που οφείλεται στην καταλάση των ερυθρών

αιμοσφαιρίων.

Μάρτυρες: Θετικός Σταφυλόκοκκος, αρνητικός Εντερόκοκκος. (Eικόνα 2.7)

22..55..44 ΟΟρροολλοογγιικκέέςς ΔΔοοκκιιμμαασσίίεεςς

Οι ορολογικές μέθοδοι στις στρεπτοκοκκικές νόσους γίνονται συνήθως σαν

δεύτερης φάσης εξετάσεις γιατί η απομόνωση του μικροβίου ή η ανίχνευση της

παρουσίας του στα κλινικά δείγματα αποβαίνει τις περισσότερες φορές θετική.

Εικόνα 2.7

3311

Σχήμα 2.1

Ιζηματιναντίδραση κατά Lancefield

Είναι η μέθοδος αναφοράς για όλες τις άλλες μεθόδους. Χρησιμοποιείται για

την ταυτοποίηση της ορολογικής ομάδας στην οποία ανήκει ένας στρεπτόκοκκος που

απομονώθηκε στο κλινικό δείγμα.

Ο υπό εξέταση στρεπτόκοκκος καλλιεργείται μέσα σε 50 ml ζωμό Todd-Hewitt

αεροβίως για 48 ώρες και το σακχαριδικό αντιγόνο του στρεπτοκόκκου εκχυλίζεται.

Σε τριχοειδή σωληνάρια αναμιγνύεται το αντιγόνο που παρασκευάστηκε χωριστά με

κάθε έναν από τους αντιστρεπτοκοκκικούς ορούς όλων των ομάδων. Στην κλινική

πράξη αρκούν 5-6 οροί, των ομάδων A, B, C, D, G και F. Μετά από 2-10 min

διαβάζουμε το αποτέλεσμα ψάχνοντας να διακρίνουμε λευκό δακτύλιο στο σημείο

της επαφής των δύο υγρών στα τριχοειδή, λόγω καθιζήσεως του συμπλέγματος

αντιγόνο-αντίσωμα.

Η αντίδραση πρέπει να διαβαστεί μέσα σε 15 λεπτά το πολύ, γιατί μπορεί να

σχηματιστούν μη ειδικά ιζήματα.

Απλούστερες αλλά κυρίως ταχύτερες είναι οι ακόλουθες Δοκιμασίες:

Συγκόλληση

σταφυλοκόκκου ή

Fadebact

Τα περισσότερα στελέχη

του staphylococcus aureus

περιέχουν πρωτεΐνη Α, αλλά

ειδικότερα το στέλεχος cowan

1 παράγει την πρωτείνη με

μεγάλη επάρκεια γι’ αυτό και

προτιμάται στον έλεγχο της

συν-συγκόλλησης.

(σχήμα2.1)

3322

Η πρωτείνη αυτή συνδέεται με το Fc κλάσμα της IgG ανοσοσφαιρίνης. Στην

συν΄χεια από το μόριο της ανοσοσφαιρίνης προβάλλουν τα δυο ελεύθερα Fab

κλάσματα της με τα οποία συνδέονται τα ειδικά αντιγόνα. Αν ακολουθήσει ανάμειξη

των καλυμένων με αντίσωμα κυττάρων του S.aureus με το αντιγόνο θα υπάρξει

εμφανής συγκόλληση τους, εφ’ όσον φυσικά υπάρχει αντιστοιχία αντισώματος –

αντιγόνου.

Συγκόλληση σωματιδίων LATEX

Είναι η μέθοδος πρώτης εκλογής που αντικατέστησε πολλές από τις κλασσικές

ορολογικές διαγνωστικές μεθόδους . Σωματίδια Latex ευαισθητοποιημένα με

τα αντισώματα προς το σακχαριδικό αντιγόνο των διαφόρων ομάδων στρεπτοκόκκου,

όταν έλθουν σε επαφή με αντιγόνα ομόλογα με τα αντισώματα που φέρουν στην

επιφάνεια τους, σχηματίζουν συμπλέγματα και προκαλείται συγκόλληση ορατή με το

μάτι. Η μέθοδος έχει το προσόν ότι η συγκόλληση αυτή γίνεται ταχύτατα και πάνω σε

πλάκα. Η μέθοδος προσφέρεται στο εμπόριο σε Kits.

Ανοσοηλεκτροφόρηση αντίθετης φοράς (CIE)

Είναι συνδυασμός ηλεκτροφόρησης και διπλής διαχύσεως προς μια

κατεύθυνση. Στην οπή της καθόδου (-) τοποθετείται το αντιγόνο και στην οπή της

ανόδου (+) το αντίσωμα. Κάτω από την επίδραση ηλεκτρικού ρεύματος, το αντιγόνο

κινείται και διαχέεται προς την άνοδο και το αντίσωμα αντίθετα. Στο σημείο

συνάντησης σχηματίζεται γραμμή καθίζησης.

22..55..55 ΟΟρροοδδιιααγγννωωσσττιικκέέςς μμέέθθοοδδοοιι ααννααζζήήττηησσηηςς ααννττιισσωωμμάάττωωνν έέννααννττιι ττωωνν

ΣΣττρρεεππττοοκκόόκκκκωωνν σσττοονν οορρόό

Τα αντιγόνα για τα οποία αναζητούνται αντισώματα στον ορό είναι τα

ακόλουθα:

Αντιγόνα εξωκυτταρικά και η αντίστοιχη μέθοδος: 1. Στρεπτολυσίνη Ο Προσδιορισμός τίτλου Αντιστρεπτολυσίνης Ο (ASO) 2. Στρεπτοκινάση « « Αντιστρεπτοκινάσης (ASK) 3. Υαλουρονιδάση « « Αντιυαλουονιδάσης (ΑΗ) 4. DNαση Β « « Αντι-DΝασης Β

3333

5. ΝΑDάση « « Αντι-ΝΑDάσης Αντιγόνα κυττάρου και η αντίστοιχη μέθοδος: 6. Μ-πρωτείνη Προσδιορισμός τίτλου Αντι-Μ-πρωτείνης 7. Αντιγόνο ομάδας Α (Β, C. G αντιγόνα ομάδας)

« « Αντι Α-CHO (Carbohydrate O-αντογόνο Α)

Στο εμπόριο φέρονται τα αντιδραστήρια των ορολογικών αυτών δοκιμασιών

σε ειδικές συσκευασίες (Kits) με οδηγίες για την εκτέλεση και την αξιολόγηση τους .

Ενδεικτικά αναφέρουμε μια από τις πιο σύγχρονες μεθόδους για την

αναζήτηση των αντισωμάτων που είναι : σακχαριδικό

ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΑ ΠΡΟΣ ΤΟ Α-ΣΑΚΧΑΡΙΔΙΚΟ ΑΝΤΙΓΙΝΟ

Αναζητούνται αντισώματα προς το Α-σακχαριδικό (carbohydrate) αντιγόνο του

κυτταρικού τοιχώματος του στρεπτοκόκκου Α ομάδας με ELISA.

Ο έλεγχος ELISA γίνεται συνήθως σε δίσκους πολλαπλών θέσεων (96 θέσεις

με οριζόντιο πυθμένα). Το αντιγόνο επικαλύπτει την πλαστική επιφάνεια της κάθε

θέσης του δίσκου, μετά από παθητική προσρόφηση. Ειδικό αντίσωμα στο αντιγόνο

(ορός) προστίθεται και επωάζονται για να επιτρέψουν τον σχηματισμό ενός αρχικού

αντιγόνου-αντισώματος συμπλόκου. Ακολουθούν αρκετά πλυσίματα με φυσιολογικό

ορό για την απομάκρυνση των μη συνδεδεμένων αντισωμάτων. Στη συνέχεια

προστίθεται ένα αντίσωμα σεσημασμένο με ειδικό ένζυμο και επωάζονται επιπλέον

για να επιτρέψουν τον σχηματισμό ενός δευτερεύων αντιγόνου- αντισώματος-

ενζύμου συμπλόκου. Ακολουθούν πλυσίματα για να απομακρυνθούν τα μη

συνδεδεμένα αντισώματα. Τέλος προστίθεται το υπόστρωμα του ενζύμου και μετά

από λίγα λεπτά επώασης ένα ορατό χρώμα εμφανίζεται, λόγω της διάσπασης του

υποστρώματος από το ένζυμο στο δευτερεύων σύμπλοκο. Η ένταση του χρώματος

είναι ανάλογη με την ποσότητα του αντισώματος στο ελεγχόμενο δείγμα. Η εκτίμηση

του αποτελέσματος μπορεί να γίνει φωτομετρικά.

Αντιγόνο + αντίσωμα → αρχικό Ag – Ab σύμπλοκο

Ag – Ab σύμπλοκο + E – Ab σεσημασμένο → δευτερεύων Ag – Ab – E σύμπλοκο

Ag – Ab – E σύμπλοκο + υπόστρωμα→ έγχρωμο τελικό προϊόν

Όπου, Ab είναι αντίσωμα, Ag είναι αντιγόνο και E είναι ένζυμο.

3344

Εικόνα 2.8

22..55..66 ΤΤααχχεείίαα ΔΔοοκκιιμμαασσίίαα ΑΑννίίχχννεευυσσηηςς ΑΑννττιιγγόόννοουυ ΑΑ (( RRaappiidd TTeesstt ssttrriipp))

Αναφέρουμε τέλος μια ταχεία μέθοδο για την ποιοτική ανίχνευση του

αντιγόνου της ομάδας Α από το φαρυγγικό επίχρισμα που είναι το Rapid Test Strip,

μια ταχεία χρωματογραφική μέθοδος. Παρέχει αποτέλεσμα σε 5 λεπτά.

Ε Κ Τ Ε Λ Ε Σ Η

Σε ένα δοκιμαστικό σωλήνα προσθέτουμε 4 σταγόνες από το αντιδραστήριο Α

(2Μ νιτρώδες νάτριο), το οποίο έχει κόκκινο χρώμα. Στον ίδιο σωλήνα προσθέτουμε

και 4 σταγόνες από το αντιδραστήριο Β (0.4Μ οξικό οξύ), το οποίο είναι άχρωμο.

Ανακινούμε ελαφρά τον δοκιμαστικό σωλήνα και από την ανάμειξη των

αντιδραστηρίων προκύπτει ένα κίτρινο χρώμα. Αμέσως προσθέτουμε τον στυλεό με

το φαρυγγικό επίχρισμα τον οποίο αναδεύουμε καλά και τον αφήνουμε στον

δοκιμαστικό σωλήνα για 1 λεπτό. Αφαιρούμε τον στυλεό και εμβαπτίζουμε το test

strip και περιμένουμε μέχρι την εμφάνιση των κόκκινων γραμμών.

Το υδατανθρακικό αντιγόνο του στρεπτοκόκκου της ομάδας Α που τυχόν

υπάρχει στο φαρυγγικό

επίχρισμα αντιδρά με το

αντίστοιχο αντίσωμα με

το οποίο είναι

καλυμμένη η περιοχή

της γραμμής του

Test(T), με αποτέλεσμα

την παραγωγή κόκκινου

χρώματος. . Η παρουσία

αυτής της κόκκινης

γραμμής στην περιοχή του test καταδεικνύει ένα θετικό αποτέλεσμα, ενώ η απουσία

της δείχνει ένα αρνητικό αποτέλεσμα. Για να μπορούμε να ελέγχουμε την διαδικασία,

η κόκκινη γραμμή θα εμφανίζεται πάντα στην περιοχή του μάρτυρα, αν το test έχει

εκτελεστεί σωστά. Αν η κόκκινη γραμμή δεν εμφανιστεί, το αποτέλεσμα του test δεν

μπορεί να γίνει δεκτό.(Εικόνα 2.8)

3355

Αν και όλες αυτές οι δοκιμασίες χαρακτηρίζονται από μεγάλη ειδικότητα,

δεδομένης της μέτριας ευαισθησίας τους, όταν σημειώνεται αρνητικό αποτέλεσμα

πρέπει να γίνεται καλλιέργεια.

22..66 CCoorryynneebbaacctteerriiuumm DDiipphhtthheerriiaaee ((ΚΚοορρυυννοοββαακκττηηρρίίδδιιοο δδιιφφθθεερρίίττιιδδααςς))

22..66..11 ΒΒιιοοχχηημμιικκέέςς ΔΔοοκκιιμμαασσίίεεςς

Η μακροσκοπική και η μικροσκοπική εξέταση περιγράφτηκαν. Ακολουθούν οι

βιοχημικές δοκιμές με τις οποίες ταυτοποιείται το μικρόβιο που απομονώθηκε ως

Κορυνοβακτηρίδιο διφθερίτιδας. Περιγράφουμε τη ζυμωτική ικανότητα στα

σάκχαρα, που είναι ιδιότητες σταθερές για όλα τα στελέχη με πολύ λίγες περιπτώσει

ανώμαλων αντιδράσεων.

Για τη εκτέλεση της δοκιμής αυτής μπολιάζονται μερικές αποικίες του καθαρού

καλλιεργήματος μέσα σε λίγο ζωμό, γίνεται ένα παχύ εναιώρημα και από αυτό με

πιπέτα προστίθενται από μια-δύο σταγόνες σε καθένα από τα σωληνάρια με τα

σάκχαρα γλυκόζη, μαλτόζη, σουκρόζη. Θα πρέπει να μπαίνει ένας μάρτυρας θετικός

αν υπάρχει και οπωσδήποτε ένας μάρτυρας αρνητικός με δυο σταγόνες ζωμού, γιατί

καμμιά φορά τα σάκχαρα διασπώνται από μόνα τους στον κλίβανο. Το

κορυνοβακτηρίδιο της διφθερίτιδας διασπά τη γλυκόζη και την μαλτόζη, όχι όμως τη

σουκρόζη.

Στο εμπόριο προσφέρεται έτοιμο σύστημα ταυτοποιήσεως των

κορυνοβακτηριδίων, όπως είναι το σύστημα API.coryne με το οποίο ταυτοποιούνται

με υψηλούς βαθμούς αξιοπιστίας τα διφθεριτικά. Φέρουν αφυδατωμένα τα

υποστρώματα σε διαχωρίσματα. Συνοδεύονται από έντυπα για τον τρόπο της

χρησιμοποιήσεως, της αναγνώσεως του αποτελέσματος και ταυτοποιήσεως βάσει των

συνδυασμών των διαφοροδιαγνωστικών δοκιμών που περιλαμβάνουν.

3366

22..66..22 ΟΟρροολλοογγιικκέέςς ΜΜέέθθοοδδοοιι

Έλεγχος παραγωγής διφθεριτικής τοξίνης

Η τελική εργαστηριακή διάγνωση της διφθερίτιδας θα γίνει με τη δοκιμή

παραγωγής τοξίνης. Καθώς σήμερα στη χώρα μας όλα σχεδόν τα παιδιά είναι

εμβολιασμένα, η απομόνωση ενός κορυνοβακτηριδίου από το φάρυγγα παιδιού με

οξεία νόσο του ρινοφάρυγγα, που έχει τους χαρακτήρες του C. diphtheriae δεν αρκεί

για να χαρακτηρισθεί η νόσος σαν διφθερίτιδα αν δεν γίνει η δοκιμή παραγωγής

τοξίνης.

Ο έλεγχος παραγωγής τοξίνης μπορεί να γίνει με in vitro και in vivo

δοκιμασίες.

Η in vitro δοκιμασία είναι η ανοσοδιάχυση. Αυτή για πρώτη φορά

χρησιμοποιήθηκε από τον Elek (μέθοδος Elek). Για την εκτέλεση της δοκιμασίας

αυτής χρησιμοποιείται ταινία διηθητικού χαρτιού εμποτισμένη με διφθεριτική

αντιτοξίνη η οποία τοποθετείται στην επιφάνεια τρυβλίου με κατάλληλο θρεπτικό

υλικό και κάθετα προς την ταινία αυτήν καλλιεργούνται τα υπό εξέταση στελέχη και

αρνητικοί και θετικοί μάρτυρες. Μετά 24-48 ώρες, εάν το υπό εξέταση στέλεχος

παράγει διφθεριτική τοξίνη, σχηματίζεται στο θρεπτικό υλικό λευκή γραμμή

καθιζήσεως από την ένωση της τοξίνης που παράγεται από το βακτηρίδιο και

διαχέεται στο άγαρ, με την αντιτοξίνη που επίσης διαχέεται στο άγαρ από την

εμποτισμένη ταινία(6). Το υπόστρωμα

είναι ορούχο άγαρ (θρεπτικό άγαρ + 15%

ορός αίματος ανθρώπου ή αλόγου ή

βοδιού) (Εικόνα 2.9)

Η in vivo δοκιμασία ελέγχου

παραγωγής τοξίνης γίνεται δια

εμβολιασμού υποδορίως σε δύο

ινδοχοίρους εναιωρήματος καλλιέργειας

του βακτηριδίου σε υλικό Loeffler. Ο ένας

εκ των ινδοχοίρων προ του εμβολιασμού

ανοσοποιείται με διφθεριτική αντιτοξίνη. Εάν το υπό εξέταση στέλεχος είναι

τοξινιγόνο, παρατηρείται, 1-4 ημέρες μετά τον εμβολιασμό, θάνατος μόνο του μη

Εικόνα 2.9

3377

ανοσοποιημένου πειραματοζώου. Κατά τη νεκροψία παρατηρείται αιμορραγικό

οίδημα με νεκρωτική περιοχή στη θέση της ενέσεως, οι επιχώριοι λεμφαδένες και τα

κοιλιακά σπλάγχνα είναι διογκωμένα και συμφορημένα ενώ παρατηρούνται

διάσπαρτες αιμορραγίες στα επινεφρίδια, στο μυελό και εκφυλιστικές αλλοιώσεις

στον καρδιακό μυ.

Ανοσοφθορισμός

Χρησιμοποιείται μέθοδος άμεσου ανοφθορισμού με τη χρήση αντισωμάτων

κατά του κορυνοβακτηριδίου συνδεδεμένων με φθοριόχρωμα. Το εξεταστέο είναι

4ωρο καλλιέργημα, σε σακχαρούχο (0.05%) ζωμό, επιχρίσματος από την πάσχουσα

περιοχή. Αν στο επίχρισμα αυτό υπάρχει κορυνοβακτηρίδιο διφθερίτιδας αυτό θα

αναπτυχθεί. Ο ζωμός φυγοκεντρείται και από το ίζημα ετοιμάζονται

παρασκευάσματα σε αντικειμενοφόρες πλάκες. Αφήνονται να στεγνώσουν στον αέρα

και μονιμοποιούνται με οινόπνευμα 95%. Με τον ίδιο τρόπο παρασκευάζονται

επιχρίσματα από θετικό μάρτυρα.

Η περαιτέρω τεχνική της χρώσεως των παρασκευασμάτων γίνεται κατά τις

οδηγίες που συνοδεύουν τα αντιδραστήρια της δοκιμής που υπάρχουν στο εμπόριο.

Το κορυνοβακτηρίδιο θα δώσει τον αναμενόμενο φθορισμό. Τα άλλα

κορυνοβακτηρίδια του φάρυγγος δεν φθορίζουν. Η μέθοδος έχει το πλεονέκτημα ότι

είναι ταχύτερη από την καλλιέργεια, αλλά έχει το μειονέκτημα ότι δεν κάνει διάκριση

μεταξύ των τοξινογόνων και των μη τοξινογόνων στελεχών.

22..66..33 ΜΜέέθθοοδδοοιι μμοορριιαακκήήςς ββιιοολλοογγίίααςς

Για την ανίχνευση της διφθεριτικής τοξίνης μπορεί να χρησιμοποιηθεί η

αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) κατά την οποία ανιχνεύεται το γονίδιο

παραγωγής τοξίνης. Έχει τα πλεονεκτήματα ότι τα αποτελέσματα λαμβάνονται μέσα

σε 5-6 ώρες και η ανίχνευση μπορεί να γίνει απ’ ευθείας από μικτές καλλιέργειες ή

κλινικά δείγματα χωρίς να έχει προηγουμένως απομονωθεί το C. Diphteriae.

3388

ΚΚεεφφάάλλααιιοο 33οο::ΚΚααλλλλιιέέρργγεειιςς ΚΚλλιιννιικκώώνν ΔΔεειιγγμμάάττωωνν ΛΛοοιιμμώώξξεεωωνν ττοουυ

ΚΚααττώώττεερροουυ ΑΑννααππννεευυσσττιικκοούύ ΣΣυυσσττήήμμααττοοςς

33..11 ΣΣυυλλλλοογγήή –– ΜΜεεττααφφοορράά ΔΔεειιγγμμάάττωωνν

Τα δείγματα που λαμβάνονται από το κατώτερο αναπνευστικό σύστημα είναι :

Πτύελα αποβαλλόμενα φυσιολογικά και μετά από πρόκληση. Τα πτύελα είναι

το συνηθέστερο κλινικό υλικό που εξετάζεται για τη διάγνωση των λοιμώξεων

του κατώτερου αναπνευστικού συστήματος. Πτύελα 24ώρου συλλογής είναι

ακατάλληλα για καλλιέργεια. Το κατάλληλο δείγμα είναι το πρωινό εξαιτίας

του όγκου των εκκρίσεων που συγκεντρώνονται στους πνεύμονες κατά τη

διάρκεια της νύχτας. Ο ασθενής πρέπει να πλύνει τη στοματική κοιλότητα

μερικές φορές με νερό, στη συνέχεια να πάρει βαθιές εισπνοές κρατώντας

ενδιάμεσα την αναπνοή του μερικές φορές και τέλος να προσπαθήσει να

αποβάλει πτύελα, που να προέρχονται βαθιά από το βρογχικό δένδρο. Η

εισπνοή αερολύματος θερμανθέντος διαλύματος χλωριούχου νατρίου

περιεκτικότητας 3-10% μπορεί να βοηθήσει στην αποβολή πτυέλων (προκλητά

πτύελα) . (πίνακας 1.1) . Αν τα εκκρίματα είναι πολύ πυκνά, ο ψεκασμός με

αλατόνερο μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να γίνουν αραιότερα, με προσοχή

βέβαια για να αποφύγουμε την υπερβολική αραίωση τους . Τοποθετούνται τα

φιαλίδια με το δείγμα στο ψυγείο μέχρι που να γίνει η καλλιέργεια .

Βρογχοαναρροφήματα και υλικό τραχειοστομίας: Στέλνονται σαν δείγματα σε

φιαλίδια ή λεκάνες. Δεν είναι τα πιο κατάλληλα για καλλιέργειες. Προτιμότερα

είναι τα δείγματα εκπλύσεως βρόγχων ή κυψελίδων.

Δείγματα από βρογχοσκόπηση: Αυτά παίρνονται σε περιπτώσεις διαγνωστικής

βρογχοσκόπησης αλλά και για λήψη αξιόπιστων δειγμάτων για καλλιέργεια από

3399

το βρογχοπνευμονικό δένδρο. Στην κατηγορία αυτή υπάγονται τα εξής

δείγματα:

Έκπλυμα βρογχοκυψελιδικό

Έκπλυμα βρόγχων

Υλικό βουρτσίσματος βρόγχων

Δείγμα βιοψίας διαβρογχικής

Το βρογχοσκόπιο εισάγεται από τη μύτη ή από το στόμα ή από την τραχεία

απευθείας σε τραχειοτομηθέντες ασθενείς. Διαμέσου αυτού εισάγεται αλατοδιάλυμα

(0,8 % NaCl) (μη βακτηριοστατικό) 5-20 ml συνήθως και αναρροφάται ήπια,

μεταγγίζεται σε στείρο δοχείο και επαναλαμβάνονται οι εγχύσεις και οι

αναρροφήσεις 2-3 φορές. Το κάθε έκπλυμα μπαίνει σε χωριστό δοχείο. Χωριστά

στέλνονται τα δείγματα από διάφορες θέσεις ή λοβούς, ενώ τα εκπλύματα από το ίδιο

σημείο συγκεντρωμένα.

Το υλικό βουρτσίσματος βρόγχων παίρνεται μετά από έκπλυμα γιατί

προκαλείται αιμορραγία με το βούρτσισμα. Εισάγεται τηλεσκοπικός διπλής ροής

καθετήρας με βούρτσα στο άκρο .

Το πλευριτικό υγρό χρησιμοποιείται για τη μικροβιολογική διάγνωση, όταν η

πνευμονική λοίμωξη συνοδεύεται από εμπύημα θώρακα.

Τα προαναφερόμενα κλινικά υλικά λαμβάνονται με τη βοήθεια διαφόρων

επεμβατικών τεχνικών απ’ ευθείας από το κατώτερο αναπνευστικό σύστημα και ως

εκ τούτου δεν επιμολύνονται από τη χλωρίδα του στοματοφάρυγγα. Το είδος του

κλινικού υλικού που λαμβάνεται καθώς και η χρησιμοποιούμενη τεχνική εξαρτώνται

από την κατάσταση του ασθενούς, την εμπειρία του γιατρού, τις πιθανές επιπλοκές

και τη σχετική διαγνωστική αξία που έχει το κάθε κλινικό δείγμα στην απομόνωση

συγκεκριμένων μικροοργανισμών (πίνακες 3.1, 3.2, 3.3).

Γενικά αυτά τα κλινικά υλικά χρησιμοποιούνται για τη μικροβιολογική

διάγνωση όταν υπάρχουν ειδικές καταστάσεις, π.χ ανοσοκαταστολή και/ή όταν η ζωή

του ασθενούς κινδυνεύει άμεσα από τη πνευμονική λοίμωξη. Σημειώνεται ότι

ορισμένα εξ αυτών όπως το βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα έχουν υψηλή διαγνωστική

αξία σε συγκεκριμένες πνευμονικές λοιμώξεις (πίνακας 3.3).

4400

Όλα τα κλινικά υλικά λαμβάνονται σε αποστειρωμένα δοχεία. Στη βρογχική

βούρτσα και στο βρογχικό ή πνευμονικό βιοπτικό υλικό προστίθενται 1-2 ml

αποστειρωμένου φυσιολογικού ορού, εκτός εάν αναζητείται λεγιωνέλλα οπότε

χρησιμοποιείται αποστειρωμένο νερό. Το υλικό διατραχειακής ή πνευμονικής

αναρρόφησης είναι προτιμότερο να μεταφέρεται με αναερόβιο σύστημα (πίνακας

1.3).

33..22 ΜΜαακκρροοσσκκοοππιικκήή ΕΕξξέέτταασσηη

Με τη μακροσκοπική εξέταση ελέγχονται το χρώμα, η ποσότητα, η σύσταση

και η οσμή των πτυέλων. Βλεννοπυώδη πτύελα παρατηρούνται στη βακτηριακή

πνευμονία και βρογχίτιδα. Αντίθετα, στην πνευμονία που οφείλεται στο μυκόπλασμα

και στο χλαμύδιο της πνευμονίας τα πτύελα είναι συνήθως υδαρή. Στην πνευμονία

από Klebsiella pneumoniae και πνευμονιόκοκκο τα πτύελα είναι βλεννώδη με

πρόσμειξη αίματος, στη λεγιωνέλλωση πυώδη ή βλεννώδη και στην πνευμονία από

εισρόφηση δύσοσμα .

33..33 ΜΜιικκρροοσσκκοοππιικκήή ΕΕξξέέτταασσηη

Η χρώση Gram είναι μια άμεση, γρήγορη και πολύτιμη μέθοδος η οποία

εκτελείται σε όλα τα κλινικά υλικά που προέρχονται από το κατώτερο αναπνευστικό

σύστημα, προηγείται δε πάντοτε της καλλιέργειας.

Η μελέτη του χρωματισμένου παρασκευάσματος προσφέρει πολύτιμες

πληροφορίες διότι:

προσδιορίζει αφ’ ενός το βαθμό επιμόλυνσης του δείγματος από τη

στοματοφαρυγγική χλωρίδα (υποδηλώνεται από τα επιθηλιακά

κύτταρα) και αφ’ ετέρου την ύπαρξη εκκρίσεων από το κατώτερο

αναπνευστικό σύστημα (υποδηλώνεται από τα λευκά αιμοσφαίρια),

συμβάλλει στην προκαταρκτική διάγνωση της πνευμονίας με την

προϋπόθεση ότι ο υπεύθυνος μικροοργανισμός επικρατεί και η

μορφολογία των μικροβιακών κυττάρων είναι τυπική και

4411

βοηθά στην επιλογή των κατάλληλων θρεπτικών υλικών για την

καλλιέργεια.

Η καταλληλότητα των πτυέλων για καλλιέργεια –τα υπόλοιπα κλινικά υλικά

καλλιεργούνται ανεξάρτητα από τον αριθμό των παρατηρούμενων πλακωδών

επιθηλιακών κυττάρων- εκτιμάται με την καταμέτρηση του αριθμού των

πολυμορφοπύρηνων λευκών αιμοσφαιρίων και των πλακωδών επιθηλιακών

κυττάρων (ή μόνο των επιθηλιακών κυττάρων στους ανοσοκατασταλμένους

ασθενείς) με τον ξηρό φακό (x10) (πίνακας 3.4) .

Η αξιολόγηση αυτή γίνεται πάντοτε δεδομένου ότι κατά την δίοδο τους από τη

στοματική κοιλότητα επιμολύνονται από τη χλωρίδα της περιοχής. Ο σίελος περιέχει

σημαντική ποικιλία (περισσότερα από 200) και σε μεγάλους αριθμούς (107-108/ml)

αερόβια και αναερόβια μικροβιακά είδη, η γνώση δε της σύνθεσης της φυσιολογικής

χλωρίδας του στοματοφάρυγγα (πίνακας 1.4) είναι απαραίτητη για την ερμηνεία των

αποτελεσμάτων.

Η διάκριση μεταξύ πτυέλων και σιέλου μπορεί να γίνει με μικροσκόπηση σε

μικρή μεγέθυνσή. Η παρουσία περισσότερων των 25 πολυμορφοπύρηνων και

λιγότερων των 10 πλακωδών επιθηλιακών κυττάρων κατά οπτικό πεδίο μικρής

μεγεθύνσεως φανερώνει επαρκές δείγμα πτυέλων. Δεν πρέπει να καλλιεργείται

κανένα δείγμα που περιέχει περισσότερα από 25 κύτταρα πλακώδους επιθηλίου κ.ο.π

μικρής μεγεθύνσεως, διότι είναι επιμολυσμένο με μικροοργανισμούς των εκκρίσεων

του στοματοφάρυγγος.

Στη συνέχεια, στα κατάλληλα δείγματα και ιδιαίτερα σε περιοχές όπου

παρατηρείται μεγάλος αριθμός λευκών αιμοσφαιρίων εξετάζεται με τον καταδυτικό

φακό η μορφολογία του βακτηρίου το οποίο επικρατεί, π.χ. Gram-θετικός κόκκος σε

ζεύγη ή βοτρυοειδείς σχηματισμούς, πολύμορφα Gram-αρνητικά βακτηρίδια,

ελυτροφόρα ή μη Gram-αρνητικά βακτηρίδια και για το προκαταρκτικό αυτό

αποτέλεσμα ενημερώνεται ο κλινικός γιατρός. Αντίθετα, στις αναερόβιες πνευμονικές

λοιμώξεις συνήθως παρατηρείται ποικιλία στη μορφολογία τόσο στα Gram-θετικά

όσο και στα Gram-αρνητικά βακτήρια.

4422

33..44 ΜΜυυκκοοββαακκττηηρρίίδδιιοο φφυυμμααττίίωωσσηηςς ((MMyyccoobbaacctteerriiuumm ttuubbeerrccuulloossiiss))

Το πρώτο βήμα για τη δημιουργία καθαρής καλλιέργειας ενός συγκεκριμένου

μικροοργανισμού χαρακτηρίζεται ως εμπλουτισμός, με τον οποίο επιδιώκεται η

αύξηση του αριθμού του μικροοργανισμού που ενδιαφέρει σε σχέση με τους

αριθμούς των άλλων μικροοργανισμών στο ίδιο δείγμα. Συνεπώς ο εμπλουτισμός ως

προς ένα μικροοργανισμό θα είναι αποτέλεσμα, είτε της αύξησης του αριθμού του

ίδιου μικροοργανισμού, είτε της ελάττωσης του αριθμού των άλλων

μικροοργανισμών της καλλιέργειας.

Ο εμπλουτισμός του αιτιολογικού παράγοντα της φυματίωσης, του

Mycobacterium tuberculosis, γίνεται με κατεργασία του δείγματος, σε αλκαλικό

περιβάλλον (μέθοδος Petrof). Με τη μέθοδο αυτή επιτυγχάνεται η ρευστοποίηση των

βλεννωδών δειγμάτων, ενώ με το NaOH καταστρέφονται οι υπόλοιποι

μικροοργανισμοί, αφού το Mycobacterium είναι ανθεκτικό στην αλκαλική

κατεργασία.

ΕΚΤΕΛΕΣΗ

Σε σωληνάριο φυγοκέντρου με βιδωτό πώμα των 50 ml βάζουμε ποσότητα

πτυέλων από το πιο βλεννοπυώδες μέρος και προσθέτουμε ίση ή διπλάσια

ποσότητα NaOH 4%.

Βιδώνουμε το πώμα και ανακινούμε για 20 s σε Vortex ανακινητή σωληναρίων.

Αν δεν έχουμε το Vortex ανακατεύουμε με ένα γυάλινο ραβδάκι με προσοχή

ώστε να μην μολυνθούμε. Αν δεν πέτυχε η ομοιογενοποΐηση εξακολουθούμε να

ανακινούμε το σωληνάριο και στις επόμενες φάσεις της τεχνικής αυτής.

Αφήνουμε για 15 min σε θερμοκρασία δωματίου ή στον κλίβανο 37° C για να

συμπληρωθεί η ομοιογενοποΐηση ανακινώντας ενδιάμεσα και φυγοκεντρού με

στις 2.200-2.500 x g για τουλάχιστο 15 min (2.000-3.000 στροφές).

Αφαιρούμε το υπερκείμενο με πιπέττα ή το αδειάζουμε σε δοχείο με

αντισηπτικό. Σκουπίζουμε το στόμιο του σωληναρίου με βαμβάκι βρεγμένο με

φαινόλη 5%. Στον πυθμένα παραμένει το ίζημα όπου έχουν συγκεντρωθεί τα

4433

Εικόνα 3.1: Καλλιέργεια

μικοβακτηριδίου φυματίωσης σε υλικό

Lowenstein-Jensen

μυκοβακτηρίδια σε έντονα αλκαλικό περιβάλλον. Προσθέτουμε μια σταγόνα

ερυθρό της φαινόλης. Το ίζημα παίρνει ζωηρό κόκκινο χρώμα.

Με πιπέττα προσθέτουμε σταγόνα προς σταγόνα το ισχυρό όξινο διάλυμα του

HC1 8% μέχρις ότου εξαφανισθεί το κόκκινο χρώμα.

Το ίζημα είναι τώρα έτοιμο για μικροσκοπική εξέταση με επίστρωση μιας ή

δύο κρικιών σε αντικειμενοφόρο πλάκα, χρώση Ζ-Ν και για καλλιέργεια.

33..44..11 ΜΜαακκρροοσσκκοοππιικκήή ΕΕξξέέτταασσηη

Η απομόνωση των μυκοβακτηριδίων από τα κλινικά δείγματα παρουσιάζει

ιδιαίτερες δυσκολίες γιατί τα περισσότερα μυκοβακτηρίδια αναπτύσσονται πολύ αργά

σε αντίθεση με τα συνυπάρχοντα μικρόβια της φυσιολογικής χλωρίδας που

αναπτύσσονται γρήγορα και τα επικαλύπτουν. Για το λόγο αυτό στα κλινικά δείγματα

στα οποία συνυπάρχουν μικρόβια της φυσιολογικής χλωρίδας, όπως τα πτύελα

ακολουθείται η διαδικασία του εμπλουτισμού που περιγράφηκε πιο πάνω .

Αναπτύσσεται σε ειδικά θρεπτικά υλικά (υγρά και στερεά) στους 37ْC για 6-8

εβδομάδες σε ατμόσφαιρα 10% CO2, τα πιο κοινά από τα οποία είναι τα εξής:

Υλικό Lowenstein-Jensen(L-J). Σε αυτό το υλικό το μυκοβακτηρίδιο της

φυματίωσης αναπτύσσεται καλά αλλά αργά12, μετά από επώαση 3-8 εβδομάδων.

Δημιουργεί αποικίες ξηρές, ανώμαλες, ζαρωμένες με θηλές, με χρώμα κίτρινο ή

άσπρο.

Middlebrook 7H10 και 7H11 άγαρ. Χρησιμοποιούνται για την ταχεία

απομόνωση του μυκοβακτηριδίου, καθώς οι αποικίες ναι μεν αναπτύσσονται

αργότερα από ότι στο L-J, αλλά αναγνωρίζονται

ταχύτερα με εξέταση του καλλιεργήματος κάτω

από το μικροσκόπιο.

Middlebrook 7Η9. Είναι υγρό θρεπτικό υλικό

στο οποίο το μυκοβακτηρίδιο αναπτύσσεται και

προκαλεί ομοιογενή θολερότητα , ενώ σε άλλα

υγρά υλικά προκαλεί κροκυδώδη θολερότητα .

4444

Υλικό Dorset ή όξινου αυγού. Το μυκοβακτηρίδιο αναπτύσσεται κατά τον ίδιο

τρόπο όπως και στο L-J.

Ζωμός με γλυκερίνη και ασπαραγίνη. Σε αυτό το μυκοβακτηρίδιο αναπτύσσεται

στην επιφάνεια του υγρού σαν αυστηρά αερόβιο μικρόβιο που είναι και

σχηματίζει υμένιο.

Middlebrook 13A. Υγρό υλικό για αιμοκαλλιέργεια Mυκοβακτηριδίων

(BACTEC).

Ταχύτερο αποτέλεσμα λαμβάνεται με τον ειδικό θρεπτικό ζωμό του

συστήματος BACTEC, χρησιμοποιεί 14C-σημασμένο παλμιτικό οξύ και απαιτεί

χρονικό διάστημα μόλις οκτώ ημερών για την απομόνωση του M. tuberculosis. Η

ανάπτυξη των Mυκοβακτηριδίων καταγράφεται με τη βοήθεια μηχανήματος, που

ανιχνεύει το ραδιοσημασμένο CO2 που ελευθερώνεται όταν ο μικροοργανισμός

μεταβολίζει το παλμιτικό οξύ. (Εικόνα 3.1)

3.4.2 Μικροσκοπική Εξέταση

Η μικροσκοπική παρατήρηση των

οξεάντοχων βακτηριδίων αποτελεί

σημαντικό βοήθημα στη γρήγορη

επιβεβαίωση της μυκοβακτηριδιακής

λοίμωξης. Στην οξυάντοχη χρώση (Ziehl-

Neelsen) το μυκοβακτηρίδιο έχει ζωηρό

κόκκινο χρώμα, ενώ όλο το φόντο του

οπτικού πεδίου έχει γαλάζιο χρώμα (Εικόνα

3.2). Μεγαλύτερη ευαισθησία παρουσιάζει

η φθορίζουσα χρώση, αφού τα φθορίζοντα

μικρόβια γίνονται αντιληπτά πολύ πιο

εύκολα. Επίσης στη μέθοδο φθορισμού, με

τη χρήση μικρής μεγέθυνσης, δίνεται η

Εικόνα 3.2: Μικροσκοπική εικόνα πτυέλων με οξυάντοχα βακτήρια (χρώση Ziehl-Neelsen)

4455

δυνατότητα εξέτασης περισσότερων οπτικών πεδίων στο ίδιο χρονικό διάστημα.

Στη συνέχεια μπορεί να επιβεβαιωθεί η ύπαρξη οξεάντοχου βακτηριδίου με τη

χρήση μεγαλύτερης μεγέθυνσης .

33..44..33 ΒΒιιοοχχηημμιικκέέςς ΔΔοοκκιιμμαασσίίεεςς

Οι βιοχημικές ιδιότητες που επιτρέπουν τον διαχωρισμό των διαφόρων ειδών

μυκοβακτηριδίων και χρησιμοποιούνται για την ταυτοποίηση τους αναγράφονται

στον πίνακα (Πίνακας 3.5).

Το M. tuberculosis δίνει θετικές τις αντιδράσεις αναγωγής νιτρικών,

παραγωγής νιασίνης και πυραζιναμιδάσης και αναπτύσσεται στο Τ2Η υλικό. Δεν

παράγει πολύ και θερμοανθεκτική καταλάση, αρυλσουλφατάση και δεν αντέχει την

παρουσία NaCl 5/dl .

Όλες οι βιοχημικές ιδιότητες γίνονται με έτοιμα υλικά που υπάρχουν στο

εμπόριο. Το σύστημα που κυρίως χρησιμοποιείται είναι το σύστημα API .

33..44..44 ΜΜέέθθοοδδοοιι ΜΜοορριιαακκήήςς ΒΒιιοολλοογγίίααςς

Το μεγάλο προσόν των μεθόδων αυτών έναντι των κλασσικών μεθόδων

ταυτοποιήσεως των μυκοβακτηριδίων είναι η ταχύτητα του αποτελέσματος και το

μεγάλο εύρος των μυκοβακτηριακών ειδών που ταυτοποιούν.

DNA ανιχνευτές (DNA probes)

Ο DNA ανιχνευτής είναι ένα ελεύθερο κομμάτι από το DNA του μικροβίου, με

συγκεκριμένη αλληλουχία νουκλεοτιδίων που όταν συναντήσει ένα άλλο κομμάτι

DNA που έχει τη συμπληρωματική αλληλουχία νουκλεοτιδίων ενώνεται με εκείνο

και σχηματίζει ένα καινούργιο μόριο DNA, δηλαδή ένα υβρίδιο.

Οι DNA ανιχνευτές παρασκευάζονται με αποκοπή από το μόριο του DNA με

ένζυμα που δρουν σε περιοχές συγκεκριμένες ευάλωτες στη δράση τους. Τέτοια

ένζυμα είναι οι αποκοπτικές ή περιοριστικές ενδονουκλεάσες.

Μια από τις εφαρμογές των DNA ανιχνευτών στην κλινική μικροβιολογία

είναι η ταυτοποίηση μικροβίου που ομοιάζει φαινοτυπικά (καλλιέργεια, βιοχημικές

ιδιότητες κ.α.) με το M. tuberculosis (Εικόνα 3.3).

4466

Σε πρώτη φάση εκχυλίζεται το DNA των υπό ταυτοποίηση βακτηριδίων,

κομματιάζεται με ενδονουκλεάσες και τα κομμάτια υποβάλλονται σε διάσπαση της

διπλής αλυσίδας του DNA σε μονές αλυσίδες που γίνεται υπό την επίδραση υψηλής

θερμοκρασίας. Αυτές συλλέγονται πάνω σε ένα φίλτρο και κατόπιν προστίθεται ο

σεσημασμένος DNA ανιχνευτής που φέρει αλληλουχίες χαρακτηριστικές του M.

tuberculosis και αφήνεται να αντιδράσει. Αν η αλληλουχία του DNA του μικροβίου

είναι συμπληρωματική της αλληλουχίας των νουκλεοτιδίων του DNA ανιχνευτή, θα

ενωθούν και θα σχηματισθεί πάνω στο φίλτρο το υβρίδιο, στο μόριο του οποίου

περικλείεται και το σήμα του ανιχνευτή. Μετά από τα σχετικά πλυσίματα για την

απομάκρυνση περίσσειας ανιχνευτή αναζητούμε στο φίλτρο επάνω το σήμα. Αν το

σήμα ήταν ραδιενεργό σημείο εύκολα αναγνωρίζεται αυτό στο μηχάνημα, αν ήταν

Εικόνα 3.3: 1. Δυο μικρόβια με φαινότυπους χαρακτήρες μυκοβακτηριδίου (Α και Β) 2. Παραλαβή του DNA του χρωμοσώματος ή του πλακιδίου των 3. Διάσπαση της διπλής αλυσίδας σε μονές (denaturation) 4. Προσθήκη σημασμένου DNA ανιχνευτή του Μ.tuberculosis και υβριδισμός 5. Αναζήτηση του σήματος 6. Αποτέλεσμα: το Α είναι Μ.tuberculosis. Το Β ενώ μοιάζει δεν είναι

4477

ένζυμο ακολουθεί προσθήκη του χρωμογόνου υποστρώματος για παραγωγή

χρώματος.

Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR)

Είναι η ταχύτερη μέθοδος αναγνωρίσεως και ταυτοποιήσεως

μυκοβακτηριδίου στο κλινικό δείγμα. Το βασικό προσόν της μεθόδου έγκειται στο ότι

επιτρέπει τον πολλαπλασιασμό και των ελαχίστων μορίων DNA που υπάρχουν στο

κλινικό δείγμα, ώστε να είναι δυνατή η αναγνώριση του είδους του μυκοβακτηριδίου

με κάποια από τις μεθόδους υβριδισμού.

Όλες οι φάσεις της PCR γίνονται σε ένα μηχάνημα θερμικής ανακυκλώσεως

όπου αναπτύσσονται και ρυθμίζονται θερμοκρασίες από 4-95ْC. Στην 1η φάση, στη

θερμοκρασία των 95ْC, γίνεται η διάσπαση της διπλής έλικας του DNA του μικροβίου

σε δύο μονές αλυσίδες. Στη δεύτερη φάση, στους 20-50ْC, γίνεται η αγκίστρωση

ζεύγους αφετηριών(συγκεκριμένο κομμάτι αλληλουχίας νουκλεοτιδίων ενός DNA για

την έναρξη συνθέσεως αντίστοιχης αλληλουχίας) σε ένα σημείο της κάθε μιας από τις

μονές αλυσίδες. Στην τρίτη φάση γίνεται η επέκταση των αφετηριών κατά μήκος της

μονής αλυσίδας στην οποία κόλλησαν, με την τοποθέτηση νέων νουκλεοτιδίων στο

καλούπι της μονής αυτής αλυσίδας με τη δράση της πολυμεράσης. Έτσι η κάθε μια

αρχική μονή αλυσίδα γίνεται διπλή, δηλαδή παράγεται ένα νέο κομμάτι DNA

παρόμοιο με το αρχικό.

Ο κύκλος αυτός των τριών φάσεων γίνεται μέσα σε λίγα λεπτά της ώρας και

επαναλαμβάνεται 30 ή περισσότερες φορές μέσα σε 3-4 ώρες. Κ’αθε φορά ο αριθμός

των κομματιών του DNA διπλασιάζεται κατά γεωμετρική πρόοδο. Το DNA που

παράχθηκε ηλεκτροφορείται και μαζεύεται πάνω σε γέλη πολυακρυλική ή αγαρόζης.

Κατόπιν γίνεται η ταυτοποιήση του με διάφορες μεθόδους υβριδισμού (Σχήμα 3.1).

Μια απλοποιημένη μορφή είναι ο DNA υβριδισμός, σε πλάκες μικροαραιώσεων. Σε

αυτή τη μέθοδο γίνεται υβριδισμός του DNA του υπό εξέταση μυκοβακτηριδίου

(καθαρό καλλιέργημα) με το DNA των προτύπων στελεχών διαφόρων ειδών

μυκοβακτηριδίων στα βυθίσματα της πλάκας. Αυτός γίνεται ορατός από την

εμφάνιση χροιάς στο βύθισμα που περιέχει την συμπληρωματική αλληλουχία

νουκλεοτιδίων με αυτή του DNA του εξεταζόμενου μυκοβακτηριδίου. Η μέθοδος

προσφέρεται στο εμπόριο.

4488

Σχήμα 3.1: Η Αρχή της PCR

4499

ΠΠίίνναακκεεςς 33οουυ ΚΚεεφφααλλααίίοουυ

Πίνακας 3.1: Πλεονεκτήματα και μειονεκτήματα των μεθόδων λήψης δειγμάτων για καλλιέργεια από το κατώτερο αναπνευστικό σύστημα

ΜΕΘΟΔΟΙ ΛΗΨΗΣ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ

ΠΛΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ - ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑ

ΠΤΥΕΛΑ ΑΠΟΧΡΕΜΨΗ

ΑΝΑΡΡΟΦΗΣΗ ΒΡΟΓΧΟ-ΣΚΟΠΗΣΗ

ΔΙΑΘΩΡΑΚΙΚΗ ΠΑΡΑΚΕΝΤΗΣΗ ΕΝΔΟΤΡΑΧΕΙΑΚΗ ΔΙΑΤΡΑΧΕΙΑΚΗ

Ευχερής λήψη + Αξιοπιστία όταν επικρατεί ένας μικροοργανισμός + + + + +

Χρήση σε αδυναμία απόχρεμψης + + + +

Αποφυγή επιμολύνσεων + + + Διάγνωση μικτών λοιμώξεων + +

Κατάλληλη για αναερόβια + + + Επιλεκτική λήψη δείγματος (υψηλή διαγνωστική αξία)

+ +

Επιμολύνσεις από χλωρίδα + + Ακατάλληλη για αναερόβια + +

Εμπειρία γιατρού και συνεργασία ασθενούς + + + +

Επιπλοκές (Αιμορραγία, πνευμοθώρακας κ.α) + + +

Επίπονη για τον ασθενή + + Ειδικός εξοπλισμός +

Πίνακας 3.2: Κλινικά δείγματα που χρησιμοποιούνται για τη διάγνωση των πνευμονικών λοιμώξεων σε συνδυασμό με τους αναζητούμενους μικροοργανισμούς

ΚΛΙΝΙΚΑ ΔΕΙΓΜΑΤΑ ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΟΙ Πτύελα Βακτήρια,Νοκάρδιες,Μυκοβακτηρίδια, Μ.pneumoniae, Μύκητες

(Blastomyces, Coccidioides, Cryptococcus,Ζυμομύκητες)

Προκλητά πτύελα Μυκοβακτηρίδια, P carinii Βιοπτικό υλικό Legionella spp,Νοκάρδιες, Μ.pneumoniae,Μμύκητες

(Aspergillus, Candida), Πρωτόζωα Διατραχεριακή αναρρόφηση Βακτήρια, Νοκάρδιες, Μ.pneumoniae,Πρωτόζωα Βρογχικό έκπλυμα Νοκάρδιες, Legionella spp, Μύκητες (P.carinii), Πρωτόζωα,

CMV Διαθωρακική αναρρόφηση Legionella spp, C.pneumoniae Πλευριτικό υγρό Βακτήρια (Ρινο)Φαρυγγικό επίχρισμα M.pneumoniae, Ιοί, C.pneumoniae

5500

Πίνακας 3.3: Διαγνωστική αξία βρογχοσκοπικά ληφθέντων κλινικών υλικών στις πνευμονικές λοιμώξεις

ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΟΙ ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΗ ΑΞΙΑ ΚΛΙΝΙΚΩΝ ΥΛΙΚΩΝ

ΒΡΟΓΧΙΚΗ ΠΛΥΣΗ

ΒΡΟΓΧΙΚΗ ΒΟΥΡΤΣΑ

ΒΡΟΓΧΟΚΥΨΕΛΙΔΙΚΟ ΕΚΠΛΥΜΑ

ΒΙΟΠΤΙΚΟ ΥΛΙΚΟ

P.carinii 2 1 3 3 CMV 1 1 3 2 Άλλοι ιοί 1 1 2 1 Μυκοβακτηρίδια 3 - 2 3 Candida spp 0 0 1 2 Aspergillus spp 0 0 1 2 Άλλοι μύκητες 2 1 2 1 Συνήθη βακτήρια 0 3 2 0 Legionella spp 1 1 2 1 Nocardia spp 3 - 2 -

Πίνακας 3.4: Κριτήρια καταλληλότητας των πτυέλων για καλλιέργεια

ΟΜΑΔΑ ΠΤΥΕΛΩΝ

ΚΥΤΤΑΡΑ/ΟΠΤΙΚΟ ΠΕΔΙΟ (Χ10)

ΠΛΑΚΩΔΗ ΕΠΙΘΗΛΙΑ ΠΟΛΥΜΟΡΦΟΠΥΡΗΝΑ

1 0 0 2 1-9 10 3 10-24 25 4 1 0-9 5 10 10-24 6 25 25

1: Σε ουδετεροπενικούς ασθενείς η παρουσία κροσσωτών επιθηλιακών κυττάρων υποδηλώνει την καταλληλότητα του δείγματος. Τα κριτήρια δεν ισχύουν στην καλλιέργεια της λεγιωνέλλας και του μυκοβακτηριδίου της φυματίωσης επειδή η κυτταρική σύνθεση δεν προδικάζει το αποτέλεσμα της

2: Κατάλληλες για καλλιέργεια είναι οι ομάδες πτυέλων 1,2,3

5511

Πίνακας 3.5: Διαχωριστικοί χαρακτήρες μυκοβακτηριδίων

5522

ΚΚεεφφάάλλααιιοο 44οο :: ΚΚααλλλλιιέέρργγεειιςς ΚΚλλιιννιικκώώνν ΔΔεειιγγμμάάττωωνν ΛΛοοιιμμώώξξεεωωνν ττοουυ

γγαασσττρρεεννττεερριικκοούύ σσυυσσττήήμμααττοοςς

44..11 ΤΤρρόόπποοςς λλήήψψεεωωςς δδεειιγγμμάάττωωνν

Από το γαστρεντερικό σύστημα τα δείγματα που παίρνονται προς

καλλιέργεια είναι τα εξής:

Κόπρανα

Αυτά συλλέγονται είτε με κατ’ ευθείαν αποπάτηση σε ευρύστομο

αποστειρωμένο δοχείο, είτε με μεταφορά από το δοχείο αποπατήσεως με

μικρό αποστειρωμένο πωματιζόμενο φιαλίδιο. Φυλάγεται στο ψυγείο μέχρι

την ώρα της καλλιέργειας. Αν η καλλιέργεια θα καθυστερήσει πέραν από 1

ώρα από τη λήψη του δείγματος ανακατεύεται με το υλικό μεταφοράς Cary

Blair ή με γλυκερινούχο αλατοδιάλυμα. Δείγμα που πάρθηκε με χαρτί

τουαλέτας είναι ακατάλληλο γιατί στο χαρτί αυτό υπάρχουν άλατα βαρίου

ανασταλτικά αναπτύξεως των μικροβίων. Επίσης τα δείγματα δεν πρέπει να

ληφθούν από τον ασθενή εντός 4 ημερών από τη λήψη βαρίου. Το βάριο θα

εμφανισθεί σαν λευκή (με χαρακτηριστικά κιμωλίας) ουσία10. Παίρνονται

τουλάχιστον τρία δείγματα. Στις καλλιέργειες κοπράνων αναζητούνται όλα τα

εντεροπαθογόνα Ε.coli, τα καμπυλοβακτηρίδια, οι σιγκέλλες – σαλμονέλλες,

το Clostridium difficile, οι υερσίνιες, τα δονάκια, τα είδη aeromonas κα.

Ορθικά επιχρίσματα

Εισάγεται το άκρο στείρο στυλεού, βαμβακοφόρου ή αλγινισμένουθ ή με

ζωικό άνθρακα, σε βάθος περί τα 2-3cm από το σφιγκτήρα, επιχρίεται το

τοίχωμα του ορθού με συστροφές του στυλεού, εξάγεται και μπαίνει σε

σωληνάριο με υλικό μεταφοράς, το βύσμα του στυλεού πρέπει να έχει

χρωματισθεί από τα κόπρανα. Ο τρόπος αυτός χρησιμοποιείται στην

παιδιατρική, στους δε ενήλικες σε περιπτώσεις αναζητήσεως γονοκόκκου,

αλλά και για φορείς s.aureus και σιγκελλών. Δεν είναι κατάλληλος για

καμπυλοβακτηρίδια και υερσίνιες.

5533

Υλικό σιγμοειδοσκόπησης

Εισάγεται στο ορθό σιγμοειδοσκόπιο, σκληρό ή μαλακό. Λαμβάνονται

δείγματα βιοψίας από οποιαδήποτε βλάβη. Αναρροφάτε υγρό από τις

φλεγμαίνουσες περιοχές με πιπέττα μέσω του οργάνου. Αν το υλικό αυτό

είναι ελάχιστο ξεπλένεται σε αλατοδιάλυμα στείρο. Αναζητείται το c.difficile,

η ιστολυτική αμοιβάδα, διάφορα είδη μυκοβακτηριδίων και ταυτόχρονα όλα

τα εντεροπαθογόνα.

44..22 ΜΜαακκρροοσσκκοοππιικκήή εεξξέέτταασσηη κκοοππρράάννωωνν

Είναι ένας έλεγχος μεγάλης σημασίας και δεν πρέπει ποτέ να παραλείπεται.

Είναι δυνατόν και μόνο με την προσεκτική μακροσκοπική εξέταση των κοπράνων να

αποκομίσουμε στοιχεία που θα μας οδηγήσουν στη διάγνωση. Ελέγχουμε τα

ακόλουθα στοιχεία:

Χρώμα: αυτό βέβαια ποικίλει ανάλογα με την διατροφή και ιδιαίτερα φυτικής

προέλευσης (φρούτα-χόρτα) και την καλή ή όχι λειτουργία της χολής.

Κόπρανα άχροα σαν στόκος: υπόνοια αποφράξεως του χοληδόχου

πόρου

Κόπρανα σκούρα μαύρα σαν πίσσα: ύπαρξη αιμοσφαινίνης, σημαίνει

αιμορραγία στομάχου ή μοίρας του λεπτού ή του παχέως εντέρου (όχι

του σιγμοειδούς και του ορθού)

Αίμα νωπό: όταν αυτό επαλείφει τα κόπρανα σημαίνει αιμορραγία

σιγμοειδούς ή ορθού ή ύπαρξη αιμορροϊδων

Βλέννη: στοιχείο φλεγμονής, όταν δε συνδυάζεται και με αίμα τότε θα

σκεφτούμε έλκη στο παχύ έντερο.

Τέλος, η επισκόπηση των κορπάνων που προηγείται της μικροσκοπικής

εξέτασης μας οδηγεί στην επιλογή των σημείων λήψης με τον κρίκο μας για την

εκτέλεση των καλλιεργειών πχ αίμα, βλέννη.

5544

44..33 ΜΜιικκρροοσσκκοοππιικκήή εεξξέέτταασσηη κκοοππρράάννωωνν

Δεν είναι απαραίτητο να γίνει μικροσκοπική εξέταση νωπού παρασκευάσματος

των κοπράνων. Η εξέταση αυτή γίνεται για διαγνωστικούς σκοπούς στην

παρασιτολογική εξέταση κοπράνων.

44..44 ΘΘρρεεππττιικκάά υυλλιικκάά πποουυ χχρρηησσιιμμοοπποοιιοούύννττααιι γγιιαα ττηηνν ααπποομμόόννωωσσηη ττωωνν

εεννττεερριικκώώνν ππααθθοογγόόννωωνν μμιικκρροοοορργγααννιισσμμώώνν

Α. Κοινά υλικα

ΑΙΜΑΤΟΥΧΟ ΑΓΑΡ

επιτρέπει την ανάπτυξη όλων των βακτηρίων – έλεγχος για υπεανάπτυξη

MAC CONKEY ΑΓΡΑ

επιτρέπει την ανάπτυξη Gram(-) εντεροβακτηριακών, δονακίων και άλλων

εντεροπαθογόνων. Από την oxoid φέρεται σαν Mac Conkey no3

MANNITOL SALT AGAR ή CHAPMAN ΑΓΑΡ

όπου αναπτύσσονται κόκκοι και ιδιαίτερα ο staphylococcus aureus, τον

οποίο και αναγνωρίζουμε εύκολα

BISMUTH SULFITE ΑΓΡΑ (BS)

υλικό για απομόνωση salmonella typhi

SORBITOL MAC CONKEY ΑΓΡΑ

χρησιμεύει για την απομόνωση του κυτταροτοξινογόνου ορότυπου

COLI 0157:Η7

ο οποίος δεν ζυμώνει τη σορβιτόλη

SALMONELLA-SHIGELLA ΑΓΑΡ

στο οποίο αναπτύσσονται οι σαλμονέλλες και οι σιγκέλλες

5555

HEKTOEN ENTRIC (HE) ΑΓΑΡ

αναστέλλεται η ανάπτυξη των περισσότερων εντεροβακτηριακών

ανιχνεύονται τα είδη salmonella & shigella

Β. Ειδικά

Campy-blood ΑΓΑΡ

χρησιμεύει για την απομόνωση του C.jejuni και του C.coli

τα τρυβλία επωάζονται σε μικροαερόφιλη ατμόσφαιρα, στους 42ο C

και εξετάζονται κάθε 24-48h για ύποπτες αποικίες

TCBS ΑΓΑΡ

χρησιμεύει για την απομόνωση του V.cholerae και άλλων δονακίων

τα τρυβλία επωάζονται στους 37ο C μέχρι 48h

οι αποικίες είναι μεγάλες, επίπεδες και κιτρινοπράσινες (χρώμα ελιάς)

CINA ΑΓΑΡ

χρησιμεύει για την απομόνωση της Y.enterocolitica

τα τρυβλία επωάζονται σε θ.δωματίου μέχρι 48h

οι αποικίες έχουν λαμπερό ροζ χρώμα με κόκκινο κέντρο

CCFA ΑΓΑΡ

χρησιμεύει για την απομόνωση του C.difficile

τα τρυβλία επωάζονται σε αυστηρά ανερόβιες συνθήκες μέχρι 48h

οι αποικίες είναι μεγάλες (4mm), κίτρινες και διαυγείς

BRILLIANT GREEN αγαρ

για σαλμονέλλες

DCA (Deoxycholate citrate agar)

για εντεροβακτηριακά

EMB (Eosin methylene blue agar)

για εντεροβακτηριακά

XLD ΑΓΑΡ

δεν είναι κατάλληλο για πρωτοκαλλιέργεια κοπράνων γιατί δεν είναι

πολύ ανασταλτικό για τα κολοβακτηριοειδή. Είναι κατάλληλο για την

ανάπτυξη σαλμονελλών και σιγκελλών σε ανακαλλιέργειες από τα

υγρά εμπλουτιστικά υλικά. Οι σαλμονέλλες παράγουν κόκκινες

αποικίες με μαύρο κέντρο, ενώ οι σιγκέλλες άχρωμες.

5566

SKIRROW

για τα Campylobacter.

Γ. Τεχνική καλλιέργειας κοπράνων

Το δείγμα των κοπράνων που φθάνει στο μικροβιολογικό εργαστήριο,

εμβολιάζεται στα προαναφερθέντα υλικά, με τη βοήθεια βαμβακοφόρου στυλεού. Ο

ενοφθαλμισμός γίνεται κατ’ ευθείας από το βαμβακοφόρο στυλεό με τον οποίο

λαμβάνεται μια μικρή ποσότητα δείγματος και στη συνέχεια με τη βοήθεια

αποστειρωμένου μεταλλικού κρίκου ή πλαστικού κρίκου μιας χρήσεως, γίνονται οι

διαδοχικές αραιώσεις, έτσι ώστε να επιτευχθεί δημιουργία μεμονωμένων αποικιών.

Μετά τον ενοφθαλμισμό του δείγματος στα θρεπτικά υλικά, ετοιμάζεται και πλακάκι

(ξηρό παρασκεύασμα) για χρώση Gram και ο βαμβακοφόρος στυλεός που περιέχει

ποσότητα δείγματος εισάγεται στα υγρά θρεπτικά υλικά (εμπλουτισμού).

Όλα τα τρυβλία επωάζονται στους 37ο C για 24h στον επωαστικό κλίβανο

ανεστραμμένα. Την επόμενη ημέρα γίνεται η αναγνώριση τους.

Δ. Υγρά θρεπτικά υλικά (εμπλουτισμού)

Selenite F ΖΩΜΟΣ

για τον εμπλουτισμό salmonella, shigella & campylobacter

επωάζεται στους 37ο C για 18h. Μερικές σταγόνες ανακαλλιεργούνται

στα ειδικά στερεά θρεπτικά υλικά

β ΕΝ ΖΩΜΟΣ (Gram-negative broth)

για τον εμπλουτισμό σαλμονέλλων και σιγκελλών

γίνεται ανακαλλιέργεια μετά επώαση 4-6h σε εκλεκτικό υλικό όπως το

ΜΕ, XLD ή SS αγαρ

Κρυο-εμπλουτισμός

Campylobaster: το selenite ψύχεται όλη τη νύχτα και κατόπιν

ανακαλ/ται στο campy ΑΓΑΡ

5577

Y.enterocolitica: ο στυλεός με τα κόπρανα – σε 5 ml φωσφορικού

buffer (ph 7,2) – στο ψηγείο για 21 μέρες. Κάθε 4 ημέρες μερικές

ανακαλ/νατι σε CIN ΑΓΑΡ (επώαση θ.δωματίου, 3 ημέρες).

Ε. Ανάγνωση καλλιεργειών

Στο αιματούχο άγαρ γίνεται αμέσως η δοκιμή παραγωγής οξειδάσης σε

Gram(-) αποικίες για τη διάγνωση aeromonas. Οι αποικίες που σχηματίζονται

καλύπτονται με φρέσκο διάλυμα tetra-methyl-p-phenylene-diamine hydrochloride

1% για λίγα δευτερόλεπτα. Η θετική αντίδραση αποκαλύπτεται με μεταβολή του

χρώματος του αντιδραστηρίου σε βαθύ ιώδες.

Στο εμπόριο φέρονται έτοιμα το αντιδραστήριο, καθώς και δισκία ή ταινίες

διηθητικού χαρτιού εμποτισμένοι με αυτό. Το δισκίο τοποθετείται πάνω στο

καλλιέργημα. Παρουσία οξειδάσης εμφανίζεται μπλε χρώμα. Η ταινία

διαβρέχεται με το αντιδραστήριο και με κρίκο μεταφέρεται καλλιέργημα πάνω σε

αυτή. Σε θετική αντίδραση θα εμφανισθεί μπλε χρώμα. (εικόνα 4.1)

Στο Mac Conkey ΑΓΑΡ

Τα διασπώντα τη λακτόζη γένη των εντεροβακτηριακών (escherichia,

klebsiella, enterobacter) παράγουν αποικίες κόκκινες. Τα μη ζυμούντα τη λακτόζη

(salmonella, shigella, citrobacter, proteus-providencia, edwardsiella, serratia)

Εικόνα 4.1:

5588

παράγουν άχρωμες διαφανείς αποικίες. Στα γένη τα μη ζυμούντα τη λακτόζη

υπάρχουν πάντοτε μερικά στελέχη ή τυποθ που ζυμώνουν αργά τη λακτόζη, όπως

τα Citrobacter, Providencia, Serratia, Hafhia που μετά 24 ώρη επώαση

παράγουν αποικίες άχρωμες ή ελαφρά ρόδινες μετά 48h.

Στο Chapman ΑΓΑΡ

ο S.aureus και μερικά στελέχη του S.epidermidis που ζυμώνουν τη μαννιτόλη

κάνουν αποικίες ποτροκαλί-κίτρινες ενώ οι άλλοι Σταφυλόκκοκοι λευκές12

Στο ΒS ΑΓΑΡ

οι αποικίες της S.typhi είναι αργυρές, μεταλικές και περιβάλλονται από μαύρη

άλων

Στο SS ΑΓΑΡ

οι αποικίες των μικροβίων που ζυμώνουν τη λακτόζη παίρνουν χρώμα

κόκκινο. Οι αποικίες των Σαλμονελλών είναι άχρωμες με μαύρο κέντρο. Οι

Σιγκέλλες παράγουν άχρωμες αποικίες

Στο HE ΑΓΑΡ

οι Σαλμονέλλες παράγουν πράσινες αποικίες, εντονότερα χρωματισμένες στο

κέντρο, ενώ οι Σιγκέλλες επίσης πράσινες αλλά ζωηρότερου χρώματος

44..55 ΤΤααυυττοοπποοίίηησσηη σσυυχχννόόττεερρωωνν ααιιττιιοολλοογγιικκώώνν ππααρρααγγόόννττωωνν

Στη συνέχεια θα περιγραφεί η ταυτοποίηση των συχνότερων αιτιολογικών

παραγόντων των εντερολοιμώξεων που είναι οι Σαλμονέλλες, οι Σιγκέλλες και τα

Καμπυλοβακτηρίδια, δεδομένου ότι ευθύνονται για το 1/3 τουλάχιστον των

περιπτώσεων οξείας διάρροιας.

4.5.1 Ταυτοποίηση Σαλμονελλών

Πίνακας 4.1: Βιοχημικός διαχωρισμός του γένους των σαλμονελλών σε υπογένη ή υποομάδες ή είδη Υπογένη

Ιδιότητες Ι* ΙΙ ΙΙΙ IV V VI

Οξύ από λακτόζη - - +/x - - -/+

5599

δουλσιτόλη + + - - + -/+ σαλικίνη - - - +

Παραγωγή ONGP - x + - + + Ζύμωση του

d-tarlrate + - - - mucate + + d - + + malonate - + + - - -

Ρευστοποίηση της πηκτής - (+) (+) (+) - +

Ανάπτυξη στο KCN υλικό - - - + + -

Λύση από φάγο ΟΙ + + -/+ - +/- +

(+)=Βραδέως θετική πάντοτε x=Βραδέως θετική αλλά όχι πάντοτε θετική Υπογένος ή Ομάδα Ι: Περιλαμβάνει όλες τις τυφοπρατυφικές Σαλμονέλλες καθώς και αυτές των εντεριτίδων του ανβρώχου και όλες αυτές που περιλαμβάνονται στον πίνακα 10.2 του είδους Salmonella ή Salmonella, cholerasuis Υπογένος II: Περιλαμβάνει πολλά στελέχη αφρικανικής προελεύσεως του είδους Salmonella salamae. Υπογένος III: Περιλαμβάνει όλους τους οροτύπους της υποομάδας Arizona και Diarizona Υπογένος IV: Περιλαμβάνει λίγα είδη των τελευταίων με αραβικούς αριθμούς αναγραφομένων ομάδων όπως είναι η Salmonella houtenae Υπoγένος ή Είδος V: Salmonella bongor Υπογένος ή Υποομάδα VI: Salmonella indica

Η ταυτοποίηση των σαλμονελλών αρχίζει από τη φάση της καλλιέργειας κατά

την οποία έχουμε καθαρό καλλιέργημα μικροβίου Gram αρνητικού και γίνεται με

ορολογικές μεθόδους και με βιοχημικές και άλλες δοκιμές.

4.5.1.1 Ορολογική ταυτοποίηση και οροτυπία Σαλμονελλών

Για την oροτυπία κάθε σαλμονέλας χρειάζονται άπειροι οροί αλλά για την

ορολογική ταυτοποίηση του μικροβίου σαν σαλμονέλας και την οροτυπία των κοινών

σαλμονέλων όπως του τυφοειδούς, των παρατύφων Α. Β, και C και μερικών συχνών

έντερο παθογόνων σαλμονέλων που απαντούν στη χώρα μας χρειάζονται λίγοι οροί

που προσφέρονται στο εμπόριο από πολλούς Οίκους. Είναι όλοι οροί ζώων

ανοσοποιηθέντων με τα αντιγόνα των σαλμονελλών από τους οποίους με

προσροφήσεις έχουν παρασκευασθεί οι μονοδύναμοι οροί.

6600

Είναι οροί συγκολλητικοί αραιωμένοι στον τίτλο τους.

Όροι συγκολλητικοί Αριθ. ορών Αντισώματα που περιέχουν

Πολυδύναμος ορός 1 Αντισώματα προς τα Ο-αντιγόνα των ομάδων Α, Β, C1, C2, D,E1,E2,Vi

Μονοδύναμοι οροί αντι-Ο 9 Αντισώματα σε κάθε ορό χωριστά για τα A,B,C1,C2,D1,D2,E1,E2,E3

Μονοδύναμοι οροί αντι-Η 12 Αντισώματα προς τα Η-αντιγόνα 1ης φάσεως

a,b,c,d,eh,I,k,1v,r,y,gm,gst 1ης φάσεως Μονοδύναμοι οροί αντι-Η

5 Αντισώματα προς τα Η-αντιγόνα2ης φάσεως 1,2 1,5 1,6 enx, Z6 2ας φάσεως

Μονοδύναμος αντι-Vi 1 Αντισώματα προς το Vi

Με τους όρους αυτούς γίνεται η ταυτοποίηση των περισσοτέρων Σαλμονελλών.

ΤΕΧΝΙΚΗ

Το καλλιέργημα του μικροβίου για την ταυτοποίηση πρέπει να είναι καθαρό,

ελεγμένο, άφθονο πάνω σε θρεπτικό άγαρ, κατά προτίμηση 24h.

Πάνω σε μια αντικειμενοφόρο πλάκα παρασκευάζουμε δύο σταγόνες πυκνό

εναιώρημα του μικροβίου που εξετάζουμε σε ισότονο διάλυμα NaCI.

Στη μια προσθέτουμε μια σταγόνα από τον πολυδύναμο ορό και ανακατεύουμε

με ιόν κρίκο ή με μια οδοντογλυφίδα καλά. Η άλλη σταγόνα παραμένει σαν μάρτυρας

τυχόν αυτοσυγκόλλησης. Κινούμε την πλάκα μπρος πίσω για να βοηθήσουμε τη

συγκόλληση. Αν το μικρόβιο είναι σαλμονέλα θα προκληθεί σαφής συγκόλληση στη

σταγόνα όπου έχουμε βάλει τον πολυδύναμο ορό. Αν δεν γίνει καμία συγκόλληση θα

βάλουμε στην άλλη σταγόνα τον αντι-Vi ορό και θα ξανανακατέψουμε για να

πεισθούμε ότι η μη συγκόλληση με τον πολυδύναμο ορό δεν οφείλεται σε παρουσία

Vi αντιγόνου στην επιφάνεια του μικροβίου που παρεμποδίζει Ο-συγκόλληση.

Αν το μικρόβιο συγκολλήθηκε με τον πολυδύναμο ορό θα προχωρήσουμε στις

δοκιμές συγκολλήσεως με τους μονοδύναμους αντι-Ο ορούς αρχιζοντας από τους

αντι-Β ορούς και αντι-Dκαι εφόσον σεν συγκολληθεί με αυτούς θα δόκιμασουμε. με

τους άλλους αντι-Ο ορούς που διαθέτουμε.

6611

Το μικρόβιο θα συγκολληθεί με κάποιον από αυτούς. Στη συνέχεια θα κάνουμε

τις δοκιμές συγκολλήσεως με τους αντι-Η ορούς της αντίστοιχης ομάδας. Στις

περισσότερες περιπτώσεις θα πάρουμε ένα τελικό αποτέλεσμα ικανοποιητικό.

Παράδειγμα ταυτοποίησεως και οροτυπίας μιας σαλμονέλας:

Πολυδύναμος ορός: (+)

Μονοδύναμοι αντι-Ο: αντι-D(-) αντι-Β(+)

Μονοδύναμοι αντι-Η: αντι-b(-), αντι-i(+)

Μονοδύναμοι αντι-Η 2ας φάσεως: αντι-1,2(+)

Συμπέρασμα: salmonella typhimurium αντιγονική φόρμουλα = 1,5,5,12: i:1,2

Αν ήταν S.typhi θα έδινε τις εξής συγκολλήσεις

Πολυδύναμος (+) αντι-d(+)

Αντι-D(+) αντι-1,2(-)

4.5.1.2 Βιοχημική ταυτοποίηση σαλμονελών

Οι βασικές βιοχημικές δοκιμές μπορούν να γίνουν σε πρώτη φάση με τον

εμβολισμό των ύποπτων αποκιών στο Kliglet ή στο TSI υλικό ή με περισσότερες

δοκιμές όπως ινδόλης (-), MR (ερυθρό του μεθυλίου) δοκιμή (+), VP (Voges-

Proskauer) δοκιμή (-), H2S (+), ONPG υδρόλυση ή παραγωγή β-γαλακτοσιδάσης (-),

λυσίνη (+), PPA δοκιμή απαμινώσεως της φαινυλαλανίνης (-).

Η S-typhi δίνει τις δοκιμασίες IMViC (-+--), σε αντίθεση με τα άλλα δυο κύρια

είδη S.cholerae-suis και S.enteritidis που δίνουν IMViC (-+-+). (Πίνακας )

Πίνακας :Μεταβολές αναμενόμενες από την καλιέργεια Εντεροβακτηριακών στο Kligler (K1)

Escherichia coli Οξινη επιφάνεια - όξινος πυθμένας χωρίς μαύριομα (H2S-)

Ζύμωση λακτόζης

Kiebsiella - Cinterobacter Αλκαλική επιφάνεια - όξινος πυθμένας Μαύρισμα του πυθμένα

Ζύμωση γλυκόζης -

6622

(H2S + )

Salmonella - Citrobacier » » » » Μη ζύμωση λακτόζης Proteus mirabilis » » » » Παραγωγή H2S

αέριο

Shigella spp και άλλα μη ζυμούντα τη λακιόζη

Αλκαλική επιφάνεια - όξινος κυθμίνας χωρίς μαύρισμα

Ζύμωση γλυκόζης όχι όμως λακτόζης

Pseudomonas aeruginosa Αλκαλική επιφάνεια - αλκαλικός πυθμένας χωρίς μαύρισμα

Δεν ζυμώνει τα σάκχαρα και δεν παράγει H2S

Το triple sugar iron agar (TSI αγαρ) είναι το ίδιο με το kligger iron (KI) με τη

διαφορά ότι περιέχει επιπλέον εκτός της γλυκόζης, λακτόζη και σουκρότη.

Η αναγνώριση γίνεται μετά 18-24h επώαση στους 35ο C με αναζήτηση της

μεταβολής του χρώματος στην επιφάνεια και τον πυθμένα του υλικού (από κόκκινο

σε κίτρινο), την εμφάνιση μαύρου χρώματος στον πυθμένα από την παραγωγή H2S

και την παραγωγή αερίου.

ΠΙΝΑΚΑΣ 8

Οι τέσσερις δοκιμές που καλούνται διεθνώς δοκιμές IMViC είναι:

Η δοκιμασία παραγωγής ινδόλης από την οξείδωση του αμινοξέως

τρυπτοφάνη

Η δοκιμασία ερυθρού του μεθυλενίου (MR), όπου σε θετική αντίδραση

έχουμε εμφάνιση ερυθρού χρώματος δείχνοντας την παρουσία οξέως (pH

4-4,5), ενώ σε αρνητική αντίδραση εμφανίζεται κίτρινο χρώμα και το pH

τουτ υλικο΄θ είναι μεγαλύετρο του 4,5

Η δοκιμασία Voger-Proskauer, κατά την οποία ελέγχεται η παραγωγή

ακετυλομεθυλοκαρβινόλης από τη ζύμωση της γλυκόζης και

Η δοκιμασία των κιτρικών, κατά την οποία ελέγχεται αν ένα μικρόβιο

μπορεί να αναπτυχθεί σε υλικό με κιτρικό νάτριο, ως μόνη πηγή άνθρακα

Η ταυτοποίηση σε δεύτερη φάση ή και εξαρχής γίνεται με το API 20.

6633

Σύστημα ΑΡΙ. Είναι πλαστικά πλακίδια που έχουν έτοιμα τα αντιδραστήρια 20

ή 32 βιοχημικών δοκιμασιών. Το ύποπτο υλικό προστίθεται σε φυσιολογικό ορό και

τοποθετείται σε όλες τις θήκες του συστήματος ΑΡΙ και αφήνεται για ορισμένο

χρονικό διάστημα. Έπειτα, με τη βοήθεια εγχειριδίου, όπου αναγράφονται όλοι οι

πιθανοί συνδυασμοί βιοχημικών αντιδράσεων που εμφανίζουν τα διάφορα

Εντεροβακτηριακά, ταυτοποιείται όχι μόνο το είδος του Εντεροβακτηριακού, αλλά

και το ακριβές στέλεχος. Οι συνδυασμοί αυτοί εκφράζονται με αριθμού, καθένας από

τους οποίους αντιστοιχεί σε ένα είδος μικροβίου.

Το κλασσικό αυτό σχήμα ταυτοποίησης απαιτεί τουλάχιστον 48h. Προσπάθειες

για ταχύτερη βιοχημική ταυτοποίηση στρέφονται στη χρησιμοποίηση πολύ ειδικών

εκλεκτικών υλικών ή αντιδραστηρίων που ανιχνεύουν την παρουσία σαλμονελών στο

πρωτοκαλλιέργημα. Μια τέτοια δοκιμή είναι η MUCAP δοκιμή. Αυτή ανιχνεύει την

C8 εστεράση, ένζυμο που παράγεται μόνο από σαλμονέλες. Το αντιδραστήριο

προσφέρεται από την Biolife Italiana. Πέντε ml του αντιδραστηρίου πλημμυρίζουν

την επιφάνεια του καλλιεργήματος κοπράνων στο SS άγαρ. Μετά 5 min εμφανίζεται

φθορισμός των αποικιών των σαλμονέλων που γίνεται ορατός με φωτισμό 365nm.

Μια φθορίζουσα αποικία μεταφέρεται στο Kligler και ανακαλλιεργείται στο άγαρ ή

στο MacConkey για περαιτέρω ορολογικές ή βιοχημικές δοκιμές. Ανάλογη ταχεία

μέθοδος προκαταρκτικής αναγνωρίσεως σαλομονελών είναι η δοκιμή καπρθυλικής

εστεράσης με τη μέθοδο κηλίδας σε διηθητικό χαρτί εμποτισμένο με το ειδικό

αντιδραστήριο. Η ύποπτη αποικία που αναπτύχθηκε στο DCA άγαρ μεταφέρεται στο

χαρτί αυτό οπότε σε θετική αντίδραση εμφανίζεται ζωηρό κόκκινο χρώμα.

Πιο αξιόπιστα δεύτερης φάσης ΑΡΙ συστήματα είναι τα ΖΥΜ συστήματα που

ανιχνεύουν ποικιλία ενζύμων χαρακτηριστικών του γένους όπως την καπρυλική

εστεράση.

Δοκιμή ευπάθειας στον βακτηριοφάγο Ο-1. όλα τα στελέχη των σαλμονέλων

ανεξαρτήτως οροτύπων ή οροομάδων λύονται υπό την επίδραση του πολυδύναμου Ο-

1 βακτηριφάγου είναι ένας τρόπος ταχείας αναγνωρίσεως των σαλμονελών από το

πρωτοκαλλιέργημα και φθηνός,

4.5.1.3 Οι κύριες βιοχημικές ιδιότητες των Εντεροβακτηρίων

6644

4.5.1.4 Οροδιάγνωση Σαλμονελλών

Κατά την πορεία των διεισδυτικών σαλμονελώσεων εντερικών και

εξωεντερικών αναπτύσσονται αντισώματα στο αίμα σε αυξανόμενο τίτλο.

Οι ορολογικές μέθοδοι που εφαρμόζονται για τον προσδιορισμό του τίλτου των

αντισωμάτων έχουν ποικίλλουσα ειδικότητα και ευαισθησία γι’ αυτό υπάρχουν

πολλές. Η αρχαιότερη από αυτές είναι η Widal, νεώτερες δε αυτές που αναζητούν

Πίνακας : Οι κύριες βιοχημικές ιδιότητες των Εντεροβακτηριακών

6655

αντισώματα προς τα συγκεκριμένα αντιγόνα της εξωτερικής μεμβράνης και του

κυτταρικού τοιχώματος όπως τις πρωτείνες και το LPS.

4.5.1.5 Συγκολλητινοαντιδραση Widal

Αρχή μεθόδου

Ορός πάσχοντος από γενικευμένη σαλμονέλωση (τυφοειδή ή παράτυφο)

συγκολλά in vitto εναιώρημα της Σαλμονέλλας που προκάλεσε τη νόσο.

Η ένωση αυτή οφείλεται σε ένωση αντιγόνου με αντίσωμα. Τα αντισώματα στις

σαλμονελώσεις στρέφονται προς τα σωματικά (ο), τα βλεφαριδικά (Η) και τα

περιβλητικά αντιγόνα (Α,Β και άλλα). Τα αντισώματα που ανιχνεύονται με τη

συγκολλητινοαντίδραση Widal είναι οι IgM ανοσοσφαιρίνες.

Δυο τύποι συγκολλητινοαντίδρασης Widal είναι διαθέσιμοι: πάνω σε πλάκα

και σε σωλήνες.

Widal πάνω σε πλάκα: χρησιμοποιούμε τα διαθέσιμα στο εμπόριο αντιγόνα, το

σωματικό (ο) και το βλεφαριδικό (Η) αντιγόνο της S.typhicto και ΤΗ αντίστοιχα και

τα αντιγόνα των παρατύφων Α και Β (PA & PB αντίστοιχα). Μια σταγόνα

αντιγόνουθ προστίθεται σε ελαττούμενες ποσότητες του εξεταστέου ορού (80μL,

40μL, 20μL, 10μL και 5μL). Η συγκόλληση γίνεται ορατυή από τον σχηματισμό

κρικίδων και βαθμολογείται από 0 έως 4+ που σημαίνουν:

0 (απουσία συγκόλήσεως) 1+ (25% συγκόλληση)

2+ (50% συγκόλληση) 3+ (75% συγκόλληση) και

4+ (100% συγκόλληση)

η μικρότερη αραίωση του ορού που δίνει συγκόλλης 2+ δηλ 50% συγκόλληση

θεωρείται το τελικό σημείο ή ο τίτλος συγκολλήσεως.

Σε σωληνάρια γίνονται διαδοχικές υποδιπλάσιες αραιώσεςι του ορού.

Προστίθεται ίσος όγκος αντιγόνου. Επωάζονται στους 37ο C για 2 έως 20h. Οι

συγκολλήσεις απεικονίζονται υπό μορφή σβόλων, που συγκεντρώνονται στο

6666

κατώτερο σημείο του σωλήνα, τα αποτελέσματα σημειώνονται επίσης από 0 έως 4+.

Η τελευταία αραίωση που δείχνει ορατή συγκόλληση θεωρείται σαν τίτλος της

δοκιμής 16.

Η Widal χαρακτηρίζεται από πολλές ψευδώς θετικές αλλά και ψευδώς

αρνητικές αντιδράσεις, που χρησιμοποιείται όταν η απομόνωση της σαλμονέλας από

τα κλινικά υλικά αποτυγχάνει. Το θετικό της αποτέλεσμα θεωρείται μόνο

προκαταρκτική διάγνωση της λοίμωξης.

4.5.1.6 Λοιπές Ορολογικές Δοκιμασίες Σαλμονελλώσεις

Μικροσυγκολλητιναντίδραση τύπου Widal

Γίνεται μέσα στις πλάκες μικροτιτλοποιήσεων με τα U βυθίσματα.

Χρησιμοποιούνται μικρές ποσότητες ορού και αντιγόνων προτυποποιημένων. Είναι

κατάλληλη για εργαστήρια που έχουν προσαρμόσει τις ορολογικές τους μεθόδους σε

μικρομεθόδους. Τα αποτελέσματα είναι συγκρίσιμα με της κλασικής Widal που

παραμένει η μέθοδος αναφοράς.

Συγκολλητιναντίδραση σωματιδίων l.atex

Γίνεται πάνω σε αντικειμενοφόρο πλάκα. Τα σωματίδια Latex Είναι

ευαισθητοποιημένο με τα Ο και Η αντιιγόνα των σαλμονέλων. Είναι μέθοδος ταχεία,

προκαταρκτική, κατατοπιστική.

Έμμεση αιμοσυγκόλληση

Ερυθρά αιμοσφαίριο ανθρώπου ευαισθητοποιούνται προς τα Ο και Η αντιγόνα

σαλμονελών. Αυτά συγκολλούνται παρουσία των ομόλογων αντισωμάτων. Η

μέθοδος δεν είναι ειδική. Δεν υπερτερεί από τη Wida σε τίποτε.

Συγκολλητιναντίδραση δράση Felix

Γίνεται όπως η Widal με περισσότερο αντιγόνα σαλμονελλικά. Συνήθως

περιλαμβάνονται τα αντιγόνα της S. paratyphi C δηλαδή CO και CH αντιγόνο, το Η

αντιγόνο της S.enteritidis ήτοι το αντι-Η (gm), τα Ο και Η αντιγόνα των ομάδων Ε.

6677

Mε τ« αντιγόνα αυτά δεν παίρνονται πολύ ειδικές αντιδράσεις αλλά μπορεί να

χρησιμοποιηθούν κατά περίπτωση. Πχ σε περίπτωση οστεομυελίτιδος που δεν

υποχωρεί στην αντισταφυλοκοκκική θεραπεία μπορεί να γίνει η Widal με αντιγόνα

CO κα CΗ παράλληλα με την προσπάθεια απομονώσεως Σαλμονέλλας από το αίμα ή

το πύο.

ELISA με LPS αντιγόνο

Το αντιγόνο: Είναι ένα παρασκεύασμα από το LPS λιποπολυσακχαριδικό

αντιγόνο της S.typhi 0901 που προσφέρεται στο εμπόριο (Difco) (5μg/ml σε 0,05 Μ

ρυθμιστικό ανθρακικό pΗ 9,6).

Ο ορός: Αραιώνεται 1:200 σε φωσφόρο - NaCI ρυθμιστικό με Tween 20 και

4% βόειο αλβουμίνη.

Αλκαλική φωσφατάση. Συνδεδεμένη με αντι-ανθρώπειο IgM αραιωμένη

1:1000 στο ως άνω ρυθμιστικό με Tween και αλβουμίνη υλικό.

Υπόστρωμα του ενζύμου, p-nitro-φαινυλ-φωσφορικό (Sigma 104) σε 1μg/ml

σε ανθρακικό ρυθμιστικό pΗ 9,8 με 0,001 Μ MgCl2. Η εκτέλεση γίνεται κατά τις ο-

δηγίες του κατασκευαστή των αντιδραστηρίων. Όλες οι επωάσεις γίνονται στη

θερμοκρασία δωματίου.

H σημασία και η διαγνωστική αξία της μεθόδου αυτής είναι παρόμοια με αυτήν

της Widal. Ψευδώς θετικές και ψευδώς αρνητικές συμβαίνουν όπως και με τη Widal,

ΕΙΑ με πρωτεϊνικό αντιγόνο της εξωτερικής μεμβράνης (22α). Η μέθοδος

ανιχνεύει αντισώματα μέσα στην πρώτη εβδομάδα της νόσου· είναι πιο ειδική από

την παραπάνω ΕLISA με TO LPS αντιγόνο γιατί το πρωτεϊνικό αντιγόνο είναι

καθαρότερο. Άλλωστε μελέτες μοριακές με εφαρμογή ανοσο-ηλεκτρο-αποτυπωπικών

μεθόδων χρησιμοποιούνται για την ταυτοποίηση της S.typhi.

6688

4.5.2 Ταυτοποίηση Σιγκελλών

Η ταυτοποίηση των Σιγκελλών γίνεται με συνδυασμό ορολογικών και βιοχημικών

δοκιμασιών.

Πίνακας : Ταξινόμηση Σιγλελλών

Οροτυπϊα Σιγκελλών. Η οροσυγκόληση στην πλάκα είναι το πρώτο βήμα στην

ταυτοποίηση των σιγκελλών. Γίνεται με τους πολυδύναμους ορούς ομάδων για την

ταυτοποίηση και με μονοδύναμους ορούς για τον ορολογικό διαχωρισμό των

διαφόρων οροτύπων μέσα σε κάθε υποομάδα Σιγκελλών.

Η τεχνική είναι της συγκολλήσεως πάνω στην πλάκα. Το εναιώρημα της

σιγκέλλας γίνεται από καλλιέργημα σε θρεπτικό άγαρ μέσα σε σταγόνα ισοτόνου

NaCI ή σε διάλυμα ιωδιούχου υδράργυρου, πάνω σε αντικειμενοφόρο πλάκα.

Παρασκευάζονται τόσες σταγόνες τέτοιου εναιωρήματος όσοι οι οροί που διαθέτουμε

συν μια σταγόνα σαν μάρτυρας. Σε κάθε ένα από τα εναιωρήματα αυτά προτίθενται

σταγόνα των αντίστοιχων ορών, ανακατεύονται με κρίκο ή με οδοντογλυφίδα,

ανακινούνται στο χέρι και διατάζεται η εμφάνιση ή όχι σαφούς συγκολλήσεως.

Βιοχημική ταυτοποίηση Σιγκελλών

Η πρώτη προκαταρκτική ταυτοποίηση αρχίζει πριν από κάθε άλλη ενέργεια,

ορολογική ή βιοχημική, με τον εμβολιασμό των αποικιών των υπόπτων για

εντεροπαθογόνο μικρόβιο στο Kligler ή το TSI υλικό με νύξη του υλικού μέχρι τον

Υποομάδες και είδη Ορότυποι Βιότυποι και παλιές Αριθμοί Σιγκελλών ονομασίες οροτύπων οροτύπων Υποομάς Α 1 S. shigae 13 Shigella dysenteriae 2 S.schmitzi, S.ambigua 3,4,5,6,7,8.9 και 10 S. largei. S. Arabinotatra κα. Υποομάς Β 1,2,3.4,5 V,VZ.W.WX.Z 6 Shigella flexneri 1,1,2α.2β,3α,3β,4α,4β,6 S. newcastle, S.manchester Υποομάς C 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 Ρ288,170,DI,Ρ274, P143 18 Shipgella boydii 13,14 και 15 (Βoyd) κ. ά. π. S. etousae ΥποoμάςD Φάση Ι και Φάση ΙΙ Shigella sonnei

6699

πυθμένα και λίγων κινήσεων επιστρώσεως στη λοξή επιφάνεια.. Αν το μικρόβιο είναι

σιγκέλλα θα δώσει τις εξής αντιδράσεις:

Επιφάνεια αλκαλική (κόκκινο). Δεν ζυμώνει τη λακτόζη. Στήλη όξινη (κίτρι-

νο) Αέριο όχι. Μαύρισμα όχι.

Στη φάση αυτή μπορεί να γίνουν και άλλες 2-3 προκαταρκτικές δοκιμές όπως η

παραγωγή ουρεάσης, η διάσπαση της λυσίνης, η παραγωγή ινδόλης, η δοκιμή

κινητικότητας με μεμονωμένες αντιδράσεις ή με σύνθετα υλικά όπως είναι το LIA

υλικό (Lysine-Iron-Agar), το UMI (Urea-Indole-Motility) ημίρρευστο υλικό κ.ά.

Η δεύτερη φάση της βιοχημικής ταυτοποίησης των Σιγκελλών γίνεται α) για

ταυτοποίηση του γένους και β) για ταυτοποίηση του είδους της Σιγκέλλας.

Οι πιο απαραίτητες ταυτοποιητικές δοκιμές του γένους είναι οι εξής:

H2S (-) Κινητικότητα (-)

Ουρία (-) Λυσίνη (-)

Ινδόλη (- / +) Γλυκόζη (αέριο) (- / +)

MR (-) Λακτόζη (οξύ) (- / +)

ΡΡΑ (-) Μαννιτόλη (οξύ) (+ / -)

Οι ταυτοποιητικές δοκιμές του είδους της Σιγκέλλας περιλαμβάνονται στον

πίνακα 9.6 και είναι δοκιμές ζυμώσεως διαφόρων σακχάρων. Μπορούν να

χρησιμοποιηθούν τα έτοιμα συστήματα βιοχημικών δοκιμών, όπως είναι το API

σύστημα και άλλα παρόμοια στη φάση αυτή.

Ανίχνευση παρουσίας Σιγκελλών στα κόπρανα. Με την αλυσιδωτή αντίδραση

πολυμεράσης (PCR) κυρίως αλλά και με άλλες μεθόδους μοριακής τεχνολογίας είναι

δυνατή η ανίχνευση της παρουσίας σιγκελλών στο κλινικό δείγμα (κόπρανα). Ήδη

έχει παρασκευασθεί αφετηρίες (primers) που’ επιτρέπουν την πολλαπλασίαση

(amplification) του υπάρχοντος σιγκελλικού DNA και την αναγνώριση του ταχύτατα

ακόμη και σε κόπρανα με αρνητική την καλλιέργεια

7700

Πίνακας 10.1: Αίτια και μορφές των κυριότερων εντερίτιδων από Gram-αρνητικά Εντεροπαθογόνα βακτηρίδια

ΕΝΤΕΡΟΠΑΘΟΓΟΝΑ ΒΑΚΤΗΡΙΔΙΑ

Escherichia cοli

Εντεροτοξινογόνος (ETEC) Εντεροπαθογόνος (EPEC) Εντεροδιεισδυτική (EIEC) Εντεροαιμορραγική (STEC)

Salmonella ορότυπος Typhi Salmonella spp Shigella dysenteriae S. flexneri, S. boydii και S. Sonnei Yersinia enterocolitica Campylobacter jejuni Vibrio cholerae Vibrio parahaemolyticum Aeromonas hydrophila

ΟΡΦΗ ΕΝΤΕΡΙΤΙΛΑΣ Χολεροειδής διάρροια ταξιδιωτών Γαστρεντερίτιδα βρεφών Δυσεντερικό σύνδρομο Αιμορραγική κολίτιδα, αιμολυτικό ουραιμικό σύνδρομο Τυφοειδής πυρετός1

Εντερίτιδες παιδιών και ενηλίκων, διάρροια ταξιδιωτών, τροφιμογενείς - υδατογενείς επιδημίες γαστρεντερίτιδας Δυσεντερία Δυσεντερία, εντερίτιδα, διάρροια ταξιδιωτών, τροφιμογενής γαστρεντερίτιδα Εντερίτιδα, ψευδοσκωληκοειδίτιδα, κοιλιακά άλγη Γαστρεντερίτιδα βρεφών, διάρροια ταξιδιωτών, τροφιμογενείς - υδατογενείς γαστρεντερίτιδες Χολέρα Τροφική δηλητηρίαση, χολεροειδής εντερίτιδα Διάρροια ταξιδιωτών, εντερίτιδα παιδιών και ενηλίκων

1: Όμοιο σύνδρομο προκαλούν και οι ορότυποι Paratyphi Α, Β και C.

Πίνακας 10.2: Αίτια και μορφές εντερίτιδων από Gram-θετικά βακτήρια και ιούς

ΕΝΤΕΡΟΠΑΘΟΓΟΝΟΙ ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΟΙ

Gram ΘΕΤΙΚΟ βακτήρια Staphylococcus aureus Clostridium perfringens Bacillus cereus Clostridium difficile Mycobacterium avium-intracellulare Ιοί Rota, Aδενοϊοί κ. ά. Norwalk, Aδενοϊοί κ. ά. CMV, HSV κ.ά.

ΜΟΡΦΗ ΕΝΤΕΡΙΤΙΔΑΣ Τροφική δηλητηρίαση Τροφική δηλητηρίαση Τροφική δηλητηρίαση Ψευδομεμβρανώδης κολίτιδα, διάρροια από αντιβιοτικά Χρόνια διάρροια σε πάσχοντες από AIDS Γαστρεντερίτιδα βρεφών και παιδιών Διάρροια σε υγιείς ενηλίκους Διάρροια σε πάσχοντες από AIDS

7711

ΚΚεεφφάάλλααιιοο 55οο :: ΚΚααλλλλιιέέρργγεειιςς ΚΚλλιιννιικκώώνν ΔΔεειιγγμμάάττωωνν ΛΛοοιιμμώώξξεεωωνν ττοουυ

ΟΟυυρροοπποοιιηηττιικκοούύ ΣΣυυσσττήήμμααττοοςς

55..11 ΣΣυυλλλλοογγήή –– ΜΜεεττααφφοορράά ΔΔεειιγγμμάάττωωνν

Η βασικότερη προϋπόθεση για την επιτυχία της ουροκαλλιέργειας είναι η

καταλληλότητα του δείγματος που εξαρτάται από τον τρόπο λήψης και συντηρήσεως

του μέχρι την έναρξη της καλλιέργειας, με τρόπο που να μην επιτρέπει τον

πολλαπλασιασμοί των μικροβίων που υπάρχουν στο δείγμα. Οι τρόποι λήψεως είναι

οι εξής:

Ούρα μέσου ρεύματος: λαμβάνονται αφού προηγηθεί επιμελής καθαρισμός των

έξω γεννητικών οργάνων με νερό και σαπούνι. Το κατάλληλο δείγμα είναι τα

πρώτα πρωινά ούρα.

Ο εξεταζόμενος προτρέπεται να ουρήσει και το δείγμα (20-25ml) ούρων παίρνεται

σε αποστειρωμένο φιαλίδιο από το μέσο ρεύμα, μετά την αρχή και προ του τέλους

της ουρήσεως. Είναι η μέθοδος εκλογής αλλά δεν μπορεί να εφαρμοσθεί σε

νεογνά, σε βρέφη και σε νήπια που δεν ελέγχουν την ούρηση τους καθώς και σε

άνδρες με ουρηθρίτιδα, παιδιά με φίμωση ή αιδοιίτιδα, γυναίκες με

αιδοιοκολπίτιδα, σε καθητηριασμένους, σε αρρώστους με ακράτεια ούρων.

Ούρα με καθετηριασμό της κύστης: εφαρμόζεται μόνο σε ασθενείς κλινήρεις,

ανάπηρους κ.α12 Προηγείται ομοίως καλός καθαρισμός των έξω γεννητικών

οργάνων και μετά τον καθετηριασμό απορρίπτονται από το στόμιο του καθετήρα

τα πρώτα 15-30 ml της γεμάτης ουροδόχου κύστης. Ο περιορισμός της χρήσης της

μεθόδου αυτής συνίσταται στο γεγονός ότι είναι συχνές οι επιμολύνσεις.

Ούρα με παρακέντηση υπερηβική της κύστης: είναι ο καλύτερος τρόπος για να

έχουμε δείγμα που θα εξασφαλίσει ένα αποτέλεσμα αναμφισβήτητα σωστό. Είναι

η μέθοδος εκλογής για νεογνά και όταν αναζητούνται αναερόβια είναι το πιο

αξιόπιστο και αντιπροσωπευτικό δείγμα. Γίνεται εύκολα στα παιδιά ακόμα και σε

έγκυες γυναίκες. Η γεμάτη ουροδόχος κύστη παρακεντάται αφού προηγηθεί

7722

αντισηψία του δέρματος. Στο δείγμα αυτό δεν χρειάζεται να γίνει ποσοστική

καλλιέργεια. Όσα και όποια μικρόβια αναπτυχθούν θα αξιολογηθούν. Τα ούρα από

μόνιμο καθετήρα λαμβάνονται με σύριγγα και βελόνα αφού προγηουμένως το

τοίχωμα του καθετήρα καθαρισθεί με διάλυμα αλκοόλης 70% (σχήμα 5.1)Με

ουροσυλλέκτη-σακουλάκι τοποθετείται μετά από σχολαστικό πλύσιμο./ γίνεται

στα βρέφη και παιδιά που δεν ελέγχουν την ούρηση. Συνοδεύεται από μεγάλο

ποσοστό επιμολύνσεων. Για το λόγο αυτό το θετικό αποτέλεσμα αξιολογείται

μόνο απομονώνεται το ίδιο

ουροπαθογόνο μικρόβιο σε

δυο διαδοχικές καλλιέργειες.

Αντίθετα, όταν το

αποτέλεσμα είναι αρνητικό,

μια καλλιέργεια είναι αρκετή.

Τα ούρα πρέπει να

καλλιεργούνται αμέσως μετά τη

συλλογή τους. Σε αντίθετη περίπτωση διατηρούνται 24h σε θερμοκρασία 4ο C.

Δείγμα ούρων που παρέμεινε περισσότερες από δυο ώρες σε θερμοκρασία δωματίου

απορρίπτεται. Ούρα 24h, η ούρα από δοχείο νυκτός είναι ακατάλληλα για

μικροβιολογική εξέταση.

55..22 ΜΜαακκρροοσσκκοοππιικκήή κκααιι μμιικκρροοσσκκοοππιικκήή εεξξέέτταασσηη

Η πυουρία προκαλεί θολερότητα των ούρων, ενώ η βακτηριουρία μπορεί να

προκαλέσει ιριδισμό. Η μικροσκοπική αιματουρία είναι υπεύθυνη για τη γκριζωπή

θολερότητα των ούρων, ενώ το κυανοπράσινο χρώμα μπορεί να οφείλεται σε

λοίμωξη από ψευδομονάδα.

Η πυουρία προσδιορίζεται με την κυτταρομετρική πλάκα Neubauer σε

αφυγοκέντρητα και καλά αναδευμένα ούρα Σημαντική θεωρείται η πυουρία όταν τα

πυοσφαίρια είναι 8-10/μΙ ούρων, συγκέντρωση που αντιστοιχεί σε απέκκριση

περισσότερων από 400.000 πυοσφαιρίων την ώρα. Μια πιο απλή και πρακτική

μέθοδος είναι η τοποθέτηση μιας σταγόνας αφυγοκέντρητων ούρων σε

Σχήμα 5.1: Λήψη ούρων από μόνιμο

καθετήρα

7733

αντικειμενοφόρο πλάκα και η άμεση μικροσκόπησή τους. Στη σημαντική πυουρία

ανευρίσκονται 30 και 1-2 πυοσφαίρια ανά οπτικό πεδίο, με τις μεγεθύνσεις x400 και

x1000, αντίστοιχα. Επίσης πρέπει να σημειώνεται η παρουσία πυωδών κυλίνδρων.

Η μικροσκοπική εξέταση του ιζήματος των ούρων δεν θα πρέπει να

παραλείπεται. Η παρουσία και ο αριθμός λευκών και ερυθρών αιμοσφαιρίων είναι

ένας από τουςπαράγοντες που μαζί με το αποτέλεσμα της ουροκαλλιέργειας θα

βοηθήσουν στον χαρακτηρισμό του είδους της ουρολοίμωξης και επομένως στο τύπο

και τη δοσολογία της χημειοθεραπείας.

Η χρώση Gram εκτελείται με την τοποθέτηση 10μl καλά αναδευμένων και

αφυγοκέντρητων ούρων σε αντικειμενοφόρο πλάκα. Τα ούρα αφήνονται να

στεγνώσουν χωρίς να απλωθούν και στη συνέχεια χρωματίζονται. Η χρώση Gram

είναι πολύ ευαίσθητη μέθοδος (95%) όταν η βακτηριουρία είναι σημαντική. Στην

περίπτωση αυτή η ανεύρεση ενός τουλάχιστον βακτηρίου ανά πεδίο (x1000)

αντιστοιχεί σε συγκέντρωση βακτηρίων >105/ml ούρων.

Η χρώση Cram είναι πάντα χρήσιμη και πρέπει να συνδυάζεται με την

καλλιέργεια, σ’ ορισμένες όμως περιπτώσεις είναι απολύτως αναγκαία: α) όταν

πρόκειται να χορηγηθεί εμπειρικά αντιμικροβιακή χημειοθεραπεία, β) για την

εκτίμηση τυχόν επιμόλυνσης των ούρων και γ) όταν υπάρχει κλινική

συμπτωματολογία και πυουρία, ενώ η συνήθης καλλιέργεια είναι στείρα. Στην

τελευταία περίπτωση αναζητούνται οι μορφολογικοί χαρακτήρες ασυνηθών

μικροβίων (βλέπε Πίνακα 2.1) και με άλλες χρώσεις, π.χ. Ziehl-Neelsen ή αναζη-

τούνται άλλα μικρόβια, π.χ. χλαμύδιο του τραχώματος με άλλες μικροβιολογικές

μεθόδους.

55..33 ΚΚααλλλλιιέέρργγεειιαα

Τα ούρα καλλιεργούνται ποσοστικά ή ημιποσοστικά σε θρεπτικά υλικά. Για την

ημιποσοτική καλλιέργεια των ούρων μέσου ρεύματος και των ούρων που

προέρχονται από μόνιμο καθετήρα και από καθετηριασμό της ουροδόχου κύστης

χρησιμοποιείται μικροβιολογική αγκύλη σταθερού όγκου 0.001 ml. Για την

ημιποσοτική καλλιέργεια των ούρων που προέρχονται από υπερηβική παρακέντηση

7744

χρησιμοποιείται μικροβιολογική αγκύλη σταθερού όγκου 0.01 ml. Ανάλογα με τη

μικροβιολογική αγκύλη που χρησιμοποιείται κάθε αποικία που αναπτύσσεται σε κάθε

θρεπτικό υλικό αντιστοιχεί σε 1000 ή 100 CFU (Colony forming units) δηλ.ζωντανά

μικρόβια/ml ούρων Η όλη διαδικασία ενοφθαλμισμού των ούρων φαίνεται στο

Σχήμα 5.2.

Για την ποσοτική ουροκαλλιέργεια γίνεται ανάμειξη 0.1 rnl ούρων με 9.9 ml

αποστειρωμένου φυσιολογικού ορού. Από το μείγμα αυτό, 0.1 ml (τελική αραίωση

1:1000) ενοφθαλμίζεται σε κάθε θρεπτικό υλικό και επιστρώνεται με τη βοήθεια

αποστειρωμένου κρίκου ή αποστειρωμένης γυάλινης ράβδου, όπως και στην

ημιποσοτική ουροκαλλιέργεια.

To MacConkey και το αιματούχο άγαρ είναι τα θρεπτικά υλικά που

χρησιμοποιούνται συνήθως. Τα υλικά αυτά επωάζονται, στους 35°C, για 24-48 ώρες,

το μεν πρώτο αεροβίως το δε δεύτερο σε ατμόσφαιρα CO2 5%. Τα ούρα που

προέρχονται από υπερηβική παρακέντηση ενοφθαλμίζονται και σε αιματούχο άγαρ

εμπλουτισμένο με αιμίνη και βιταμίνη Κ, το οποίο είναι κατάλληλο για την ανάπτυξη

των αναερόβιων μικροβίων. Το υλικό αυτό επωάζεται αναεροβίως (Ν2 85%, CO2 5%,

Σχήμα 5.2: Διαδικασία ενοφθαλμισμού των ούρων

7755

Η2 10%) για 5 τουλάχιστον ημέρες. Τέλος για τη διερεύνηση της καντιντουρίας

χρησιμοποιείται το Sabouraud dextrose άγαρ το οποίο επωάζεται στους 25ο -30ο για 7

ημέρες.

55..44 SSccrreeeenniinngg κκααιι μμηη κκααλλλλιιεερργγηηττιικκέέςς ΜΜέέθθοοδδοοιι

Σημασία: 60%-80% των δειγμάτων ούρων που έρχονται στο εργαστήριο για καλλιέρ-

γεια είναι επί μολυσμένα ή δεν περιέχουν τον αιτιολογικό παράγοντα της

λοίμωξης.

α. η χρώση Gram

• εύκολη, φθηνή, ευαίσθητη, αξιόπιστη

• επιστρώνεται μια σταγόνα καλά αναμειγμένων, αφυγοκέντρητων ούρων

στεγνώνει στον αέρα χρωματίζεται μικροσκοπείται με

ελαιοκαταδυτικό φακό

• εξετάζονται 20 πεδία ≥1 βακτήριο/πεδίο σημαντική βακτηριουρία

β. χημικές μέθοδοι

• "Grless test:" : έλεγχος παρουσίας ενζύμων που ανάγουν τα νιτρικά

• δοκιμασία εστεράσης των λευκοκυττάρων (ένζυμο των

πολυμορφοπύρηνων)

γ. αυτοματοποιημένες μέθοδοι

• Bac-T-Screen Bacterturla Detection Device (χρωμογόνος μέθοδος φίλτρου)

δ. αριθμός πολυμορφοπύρηνων λευκοκυττάρων σε αφυγοκέντρητα ούρα

• ουρολοίμωξη : ≥8 ΡΜΝ / mm3 ούρων

ε. αριθμός πολυμορφοπύρηνων λευκοκυττάρων σε ίζημα ούρων (≥8-10 ΡΜΝ/

ο.π.)

7766

55..55 ΑΑξξιιοολλόόγγηησσηη ααπποοττεελλεεσσμμάάττωωνν

ελέγχεται αν πρόκειται για μονοκαλλιέργημα (ανάπτυξη ενός είδους

μικροβίου)

> από 2 είδη μικροβίων επιμόλυνση

2 είδη μικροβίων αξιολογούνται και τυποποιούνται ,

σε μονοκαλλιέργημα ή διπλοκαλλιέργημα

Αριθμος αποικιών x 1000

αποικίες ≥ 100 ≥ 105 cfu/ml ούρων ουρολοίμυξη

10 < αποικίες < 100 104 < cfu/ml < 10s ουρολοίμωξη αν

μονοκαλλιέργημα

Γ C.alblcans

αποικίες < 10 =>103< cfu/ml < 104 ουρολοίμωξη αν

αποικίες < 103 cfu/ml ούρων Κ/α ούρων αρνητική

το μονοκαλλιέργημα S.aureus αξιολογείται ανεξάρτητα από αριθμό αποικιών

το τριπλοκαλλιέργημα των ασθενών με μόνιμο ουροκαθετήρα αξιολογείται

τυποποίηση και αντιβιόγραμμα

C.alblcans Οξύ ουρηθρικό σύνδρομο

7777

ΚΚεεφφάάλλααιιοο 66οο :: ΚΚααλλλλιιέέρργγεειιςς ΚΚλλιιννιικκώώνν ΔΔεειιγγμμάάττωωνν ΑΑππόό ΓΓυυννααιικκοολλοογγιικκέέςς

ΛΛοοιιμμώώξξεειιςς

66..11 ΕΕιισσααγγωωγγήή -- ΚΚοολλππίίττιιδδαα

Οι εξετάσεις του κολπικού επιχρήσματος βοηθούν στην αιτιολογική διάγνωση

της χρόνιας ή οξείας κολπίτιδας.

ΚΟΛΠΙΤΙΔΑ Μύκητες

Αίτια:

Ειδική

Trichomonas vaginalis Μη ειδική Gardenerella

G.vaginalis + αναερόβια βακτήρια

(Bacteroides, Prevotella, Πεπτοστρεπτόκοκκοι,κ.α.)

7788

Η G.Vaginalis απομονώνεται στο 98% των γυναικών με μη ειδική κολπίτιδα

(Bacterial Vaginosis, BV) και στο 70% ασυμπτωματικών γυναικών. Οι

ασυμπτωματικοί φορείς δεν έχουν αποικιστεί από αναερόβια.

Η G.Vaginalis δεν είναι το αποκλειστικό αίτιο της BV. Εκτός από τα

αναερόβια βακτήρια, συχνά υσυνυπάρχουν μυκοπλάσματα και Χλαμύδια.

Άλλο αίτιο της BV μπορεί να είναι ο S.aureus.

Υπάρχει άφθονη μικροβιακή χλωρίδα στην οποία επικρατούν οι

γαλακτοβάκιλλοι αλλά υπάρχει επίσης και μια μεγάλη ποικιλία από αερόβια και

αναερόβια βακτήρια (σχήμα 6.1). Για το λόγο αυτό η καλλιέργεια του κολπικού

εκκρίματος δεν έχει διαγνωστική σημασία, παρά μόνο όταν από την απλή

μικροσκοπική εξέταση διαπιστωθεί ότι υπάρχουν άφθονα πυοσφαίρια και

αποκλεισθεί η κολπίτιδα από τριχομονάδες και μύκητες .

Σχήμα 6.1: Φυσιολογική μικροβιακή χλωρίδα του Γεννητικού συστήματος

Γυναίκες

πριν από την ήβη & μετά την εμμηνόπαυση

Σταφυλόκκοκοι Κορυνοβακτηρίδια

στην αναπαραγωγική ηλικία

Σταφυλόκοκκοι Στρεπτόκοκκοι Εντεροβακτηριακά

αναερόβια Γαλακτοβάκιλλοι

Κλωστηρίδια Streptococcus agalactiae

66..11..22 ΛΛήήψψηη –– σσυυλλλλοογγήή κκοολλππιικκοούύ εεκκκκρρίίμμααττοοςς

Το δείγμα παίρνεται με δυο στυλεούς βαμβακοφόρους ή αλγινισμένους από τα

τοιχώματα του κόλπου και εάν είναι δυαντό από τον οπίσθιο θόλο του κόλπου. Οι

στυλεοί τοποθετούνται σε υλικό μεταφοράς (Amies ή stuart), ώστε να αποφευχθεί η

7799

ξήρανση του δείγματος. Από το ένα δείγμα θα γίνουν οι μικροσκοπικές εξετάσεις

(νωπό, Gram, και ανοσοφθορισμός) και από το άλλο η καλλιέργεια.

66..11..33 WWhhiiffff tteesstt

Με την ανάμειξη των κολπικών εκκρίσεων με διάλυμα ΚΟΗ 10% παρατηρείται

«μυρωδιά ψαριού» λόγω της απελευθέρωσης αμινών. Η δοκιμασία αυτή είναι θετική

στο 70% των περιπτώσεων μη ειδικής βακτηριακής κολπίτιδας, παρατηρείται όμως

και στην τριχομοναδική κολπίτιδα.

66..11..44 ΜΜιικκρροοσσκκοοππιικκήή εεξξέέτταασσηη

6.1.4.1 Νωπό παρασκεύασμα

Πάνω σε αντικειμενοφόρο πλάκα ανακατεύεται το δείγμα του κολπικού

εκκρίματος με σταγόνα φ.δ.Nacl και μικροσκοπείται. Στη μη ειδική κολπίτιδα θα

παρατηρηθούν:

απουσία ή πολύ μικρός αριθμός πυοσφαιρίων και γαλακτοβακίλλων

παρουσία των clue cells σε ποσοστό περί τα

20% και πλέον του συνόλου των κυττάρων.

Τα clue cells είναι μεγάλα κολπικά

επιθηλιακά κύτταρα, στην επιφάνεια των

οποίων έχει προσκολληθεί μεγάλος αριθμός

κοκκοβακτηριδίων (εικόνα 6.1)

παρουσία μεγάλου αριθμού μικρών κινούμενων κυρτών βακτηριδίων

(Mobiluncus). Η παρουσία τους αποτελεί βέβαιο διαγνωστικό στοιχείο

βακτηριακής κολπίτιδας.

Στη τριχομοναδική κολπίτιδα, η ταυτοποίηση των τριχομονάδων βασίζεται στη

μικροσκοπική εξέταση του νωπού παρασκευάσματος, όπου οι τριχομονάδες

εμφανίζονται σαν κινούμενα σωματίδια, μεγαλύτερα από τα πυοσφαίρια, στρογγυλά

Εικόνα 6.1: Clue cells

8800

ή μακρουλά. Η κίνηση τους είναι ζωηρή και με κατεύθυνση. Αν κινούνται αργά,

[πράγμα που συμβαίνει όταν αρχίζουν να καταστρέφονται, διακρίνονται και τα

μαστίγια τους και ιδιαίτερα η κυματοειδής μεμβράνη που αρχίζει από το μπροστινό

άκρο της τριχομονάδας και φθάνει μέχρι τα μισά του σώματος της.

6.1.4.2 Gram χρωματισμένο παρασκεύασμα

Το χαρακτηριστικό στοιχείο είναι αφενός η απουσία ή ο πολύ μικρός αριθμός

των γαλακτοβακίλλων και αφ’ ετέρου σημαντική αύξηση της συγκέντρωσης των

αναερόβιων βακτηρίων και της G.vaginalis. φυσικά αναγνωρίζονται και τα clue cells.

Συγκριτικές μελέτες για την ευαισθησία, ειδικότητα και θετική και αρνητική

προγνωστική αξία της Gram χρώσεως σε σχέση με την καλλιέργεια και τη

χρωματογραφία έδειξαν ότι η Gram έχει υψηλότερους συντελεστές ειδικότητας

(95%) και θετικής προγνωστικής αξίας (76%) από ότι η καλλιέργεια με 69% και 41%

αντίστοιχα. Προτείνεται μάλιστα βαθμολόγηση σε σταυρούς από 1+ έως 4+ του

αριθμού των βακτηριδίων κατά οπτικό πεδίο, χωριστά για τους τρεις μορφοτύπους

βακτηρίων.

Μικρά Gram θετικο-αρνητικά βακτηρίδια για την G.vaginalis.

Μεγάλα Gram θετικά για τους γαλακτοβακίλλους.

Κεκαμμένα Gram αρνητικά ή θετικο-αρνητικά για τα Mobilluncus.

Η ποσοτική Gram μπορούσε να αντικαταστήσει την καλλιέργεια.

66..11..55 ΘΘρρεεππττιικκάά υυλλιικκάά κκααλλλλιιέέρργγεειιααςς κκοολλππιικκοούύ εεππιιχχρρίίσσμμααττοοςς

Αιματούχο άγαρ, στο οποίο αναπτύσσονται όλοι οι μικροοργανισμοί (αερόβιο

και αναερόβιο)

Mac Conkey 2 άγαρ, όπου αναπτύσσονται όλα τα Gram αρνητικά μικρόβια

και ο εντερόκοκκος

8811

Chapman άγαρ, όπου αναπτύσσονται κόκκοι και ιδιαίτερα o staphylococcus

aureus, το οποίο και αναγνωρίζουμε εύκολα.

Sabouraud άγαρ, για την ανάπτυξη μόνο μυκήτων

σοκολατόχρωμο άγαρ, στο οποίο αναπτύσσονται εκείνα τα μικρόβια που

απαιτούν ατμόσφαιρα CO2 5-10% για να αναπτυχθούν

ΗΒΤ άγαρ (Human Blood Bilayed with Tween 80) για Gardnerella vaginalis

BHIA (Brain Heart Infusion agar)

Brucella αιματούχο

Schaedler αγαρ

CDD άγαρ

66..11..66 ΤΤααυυττοοπποοίίηησσηη ττηηςς GG..VVaaggiinnaalliiss

6.1.6.1 Μικροσκοπική εξέταση

Είναι Gram θετικο-αρνητικό βακτηρίδιο ή κοκκοβακτηρίδιο. Διατάσσεται

μοναχικά ή κατά ζεύγη ή σε σχηματισμούς V και L

6.1.6.2 Μακροσκοπική εξέταση

Αναπτύσσεται πολύ φτωχά στο αιματούχο άγαρ όπου προκαλεί αιμόλυση α ή β

αν το αίμα είναι ανθρώπου ή κουνελιού. Στο σοκολατόχρωμο άγαρ αναπτύσσεται

καλύτερα αν επωασθεί παρουσία Co2 5%. Δεν αναπτύσσεται στο MacConkey. Στο

ΗΒΤ μετά 48h επώαση, στους 37ο C, με Co2 5% αναπτύσσει β-αιμολυτικές αποικίες

με διάχυτα το όρια της ζώνης αιμολύσεως.

66..11..77 ΒΒιιοοχχηημμιικκέέςς ιιδδιιόόττηηττεεςς

Ειδικά υλικά για καλλιέργεια αναερόβιων 12

8822

Οι χαρακτηριστικές ιδιότητες της είναι η υδρόλυση του ιππουρικού οξέος, του

αμύλου και η παραγωγή β-γλυκοσιδάσης και λιπάσης. Η ανάπτυξη του αναστέλλεται

παρουσία χολής 10%, ιδιότητα που τη διαχωρίζει από τους γαλακτοβακίλλους του

κόλπου.

Άμεσος ανοσοφθορισμός έχει εφαρμοσθεί με επιτυχία τόσο για την αναζήτηση

της gardnerella στο κολπικό έκκριμα όσο και για την ταυτοποίηση της G.Vaginalis

που απομονώθηκε από την καλλιέργεια.

Τα προς ανίχνευση βακτήρια που είναι μονιμοποιημένα σε αντικειμενοφόρο

πλάκα επικαλύπτονται με αντισώματα του ειδικού αντιορού που έχουν συνδεθεί με

φλουοροσκεϊνη. Η φλουοροσκεϊνη είναι μια χρωστική η οποία όταν ακτινοβοληθεί με

υπεριώδες φως μήκους κύματος 290-495nm, εκπέμπει ορατό φως μεγαλύτερου

μήκους κύματος (525nm). Ύστερα από πολλά ξεπλύματα με φυσιολογικό ορό για

απομάκρυνση του μη συνδεδεμένου αντισώματος, ακολουθεί παρατήρηση στο

μικροσκόπιο υπεριώδους φωτός.

Η υγρή αέριος χρωματογραφία σαν συμπληρωματική μέθοδος στην

ταυτοποίηση της G.Vaginalis, δίνει αρκετές πληροφορίες.

66..22 ΕΕιισσααγγωωγγήή -- ΤΤρρααχχηηλλήήττιιδδεεςς

Ο Γονόκοκκος (Ναισσερία γονόρροιας) και το Χλαμύδιο τραχώματος είναι τα

συχνότερα αίτια τραχηλίτιδας.

66..22..11 ΛΛήήψψηη –– ΜΜεεττααφφοορράά ττρρααχχηηλλιικκοούύ εεππιιχχρρίίσσμμααττοοςς

Γίνεται με τη βοήθεια κυτταρολογικής βούρτσας ή στυλεού από την μεταβατική

ζώνη του τραχηλικού επιθηλίου και τον ενδοτράχηλο, με την προϋπόθεση ότι

προηγουμένως έχουν απομακρυνθεί όλες οι εκκρίσεις ούτως ώστε να είναι δυνατή η

συλλογή κυττάρων.

Ο στυλεός δεν πρέπει να είναι ο κοινός ξύλινος βαμβακοφόρος γιατί στο

βαμβάκι και το ξύλο υπάρχουν ουσίες ανασταλτικές της αναπτύξεως του γονόκοκκου

8833

αλλά στυλεός με ζωικό άνθρακα ή με αλγινικό άλας. Παίρνουμε τουλάχιστον δυο

δείγματα. Πριν από την λήψη δεν πρέπει να χρησιμοποιηθούν αντισηπτικές ουσίες

στον κόλπο.

Η μεταφορά του δείγματος στο εργαστήριο γίνεται με την εμβατική του

στυλεού σε υλικό μεταφοράς 2-SP (sucrose-phoshate) ρυθμιστικό με 5% ορό αίματος

εμβρύου βοός.

66..22..22 ΤΤααυυττοοπποοίίηησσηη ττοουυ ΓΓοοννόόκκοοκκκκοουυ ήή ΝΝααϊϊσσσσέέρριιαα γγοοννόόρρρροοιιααςς

6.2.2.1 Μικροσκοπική εξέταση

Ετοιμάζονται 2 έως 3 επιχρίσματα του κλινικού υλικού πάνω σε καθαρές

αντικειμενοφόρες πλάκες. Η επίστρωση γίνεται με ελαφρά πίεση και περιστροφή του

στυλεού προς μια κατεύθυνση για να μη καταστραφούν τα πολυμορφοπύρηνα

Χρώση Gram

Η ύπαρξη τραχηλίτιδας διαπιστώνεται κατ’ αρχήν με την αρίθμηση των

πολυμορφοπύρηνων σε περιοχές του επιχρίσματος όπου υπάρχει μονόστοιβο

επιθήλιο. Η ανεύρεση περισσότερων από 20 πολυμορφοπύρηνων κ.ο.π/x1000

είναι ενδεικτικό σημείο τραχηλικής φλεγμονής. Η παρουσία βλέννης είναι ένα

επιπρόσθετο στοιχείο φλεγμονής, δεδομένου ότι ο κόλπος δεν έχει

βλεννοπαραγωγούς αδένες.

Για την γονοκοκκική τραχηλίτιδα η χρώση Gram δεν αποτελεί ευαίσθητη

μέθοδο, επειδή ενδοκυττάριοι Gram-αρνητικοί διπλόκοκκοι ανευρίσκονται σε

λιγότερες από τις μισές γυναίκες. Και αυτό γιατί δύσκολο αναγνωρίζεται ο

γονόκοκκος λόγω της παρουσίας και άλλων μικροβίων και της σπανιότητας

της παρουσίας ενδοκυτταρίων μορφών.

8844

Ακόμη απλούστερα γίνεται χρώση όχι Gram αλλά ταχεία αυτοχρωματίζονται

ζωηρά βαθυγάλαζα οι γονόκοκκοι ενώ δεν προφταίνουν να χρωματισθούν τα

άλλα μικρόβια και αχνά χρωματίζονται οι πυρήνες τωνκυττάρων.

Χρώση κατά Sandifor

Είναι ειδική χρώση κατά την οποία οι γονόκοκκοι χρωματίζονται κόκκινοι

ενώ το υπόστρωμα με τα πυοσφαίρια γαλαζοπράσινα

Άμεση ανοσοενζυμική ανίχνευση Γονοκόκκου (gonozyme test)

Γίνεται κατ’ ευθείαν στο επίχρισμα του ενδοτραχήλου. Έχει διαμορφωθεί και

φέρεται στο εμπόριο με την ονομασία gonozyme test από την Abbott Lab.

Είναι εξίσου ειδική και ευαίσθητη με την Gram. Ανιχνεύει την πρωτεΐνη Ι της

εξωτερικής μεμβράνης του γονοκόκκου.

Καλλιέργεια του Γονόκοκκου

Η καλλιέργεια θα γίνει σε ένα από τα ειδικά εκλεκτικά θρεπτικά υλικά όπως

το MTM, ML & NYC που είναι υλικά Thayer-Martin εμπλουτισμένα με αίμα

ή ορό αίματος και διάφορα αντιβιοτικά για την αναστολή αναπτύξεως των

ανεπιθύμητων κοινών μικροβίων της χλωρίδας του δείγματος. Το δείγμα με το

στυλεό ή με τον κρίκο επιστρώνεται σε όλη την επιφάνεια του θρεπτικού

υλικού, πυκνά χωρίς αραίωση. Η επώαση θα γίνει σε περιβάλλον με παρουσία

μικρής συγκέντρωσης διοξειδίου του άνθρακα 3-5% και παρουσία υδρατμών.

Η ανάγνωση των τρυβλίων θα γίνεται καθημερινά επί τρεις ημέρες. Θα

αναζητηθούν οι χαρακτηριστικές γκριζωπές γυαλιστερές αποικίες από τις

οποίες θα γίνει Gram χρώση και μικροσκόπηση.

Εάν το εργαστήριο δεν διαθέτει τα ειδικά θρεπτικά υλικά μπορεί να γίνει η

σπορά του γονοκόκκου και στα άλλα κοινά αιματούχα θρεπτικά υλικά όπως

το Columbia άγαρ, το ΒΗΙ άγαρ. Μπορεί να γίνει σπορά καις ε ΒΗΙ ζωμό,

ενώ ο γονόκοκκος αναπτύσσεται και στους ζωμούς του Bactec συστήματος

της Becton-Dickinson.

6.2.2.2 Βιοχημικές δοκιμές Δοκιμή παραγωγής οξειδάσης

8855

Γίνεται από την ύποπτη αποικία του πρωτοκαλλιεργήματος. Βρέχουμε με

μερικές σταγόνες του αντιδραστηρίου της οξειδάσης ένα κομμάτι διηθητικού

χαρτιού και τρίβουμε στην περιοχή αυτή μέρος της αποικίας που το παίρνουμε

με κρίκο πλατίνης ή με

γυάλινο στυλάκι. Θα

εμφανισθεί αμέσως σε

10s μοβ χρώμα με το

τετραμεθυλικό

αντιδραστήριο.

Με το διμεθυλικό

αντιδραστήριο η χροιά

εμφανίζεται λίγο αργότερα. Εξελίσσεται από ροζ σε καστανό και μαύρο. Το

αντιδραστήριο αυτό είναι πιο τοξικό. Υπάρχουν στο εμπόριο ταινίες

διηθητικού χαρτιού εμποτισμένες με τα αντιδραστήρια της δοκιμής οξειδάσης

(εικόνα 6.2)

Δοκιμή διασπάσεως σακχάρων

Είναι η βασικότερη ταυτοποιητική δοκιμή. Στηρίζεται στο γεγονός ότι από

όλες τις ναϊσσέριες ο γονόκοκκος είναι ο μόνος που διασπά μόνο τη γλυκόζη.

Γίνεται με την καλλιέργεια του καθαρού καλλιεργήματος σε σωληνάρια

(φιαλίδια) που περιέχουν το ειδικό θρεπτικό υλικό με ξεχωριστό σάκχαρο το

καθένα.

Το υλικό που συνηθέστερα χρησιμοποιείται είναι το CTA (Cystin Trytic

Agar) ή TCD (D=Modified) και τα σάκχαρα σε συγκέντρωση 1% είναι η

γλυκόζη, η μαλτόζη, η λακτόζη και σουκρόζη. Μπορεί να χρησιμοποιηθεί στο

CTA με περισσότερο άγαρ και επομένως σκληρότερο, σαν λοξό άγαρ και 2%

τα σάκχαρα.

Ο ενοφθαλμισμός γίνεται συνήθως από ένα πυκνό εναιώρημα του καθαρού

καλλιεργήματος σε 0,5ml φυσιολογικού ορού από το οποίο ενσταλάσσουμε

ανά μια σταγόνα στην επιφάνεια της στήλης του ημίσκληρου CTA άγαρ ή

στην επιφάνεια του σκληρού λοξού CTA. Μπορεί να γίνει και με κρίκο και

βούτηγμα αυτού μέσα στο άγαρ. Θα πρέπει να υπάρχει και ένας μάρτυρας του

Εικόνα 6.2: Oxidase-positive

8866

CTA υλικού χωρίς σάκχαρο. Η επώαση γίνεται στους 35ο έως 37ο C χωρίς

παρουσία CΟ2 και η ανάγνωση γίνεται κατά διαστήματα ωρών και

παρατείνεται το πολύ μέχρι την άλλη ημέρα. Σε θετική αντίδραση εμφανίζεται

αλλαγή του χρώματος του υλικού από ροζ σε κίτρινο.

Σειρά από φιαλίδια ή σωληνάρια ή πλαστικά διαχωρίσματα με το CTA με τα

διάφορα σάκχαρα και σαφείς οδηγίες για τον τρόπο χρήσεως των και

αναγνώσεως του αποτελέσματος προσφέρονται πολλά στο εμπόριο σχεδόν

από όλους τους Οίκους παραγωγής διαγνωστικών υλικών (εικόνα 6.3).

Δοκιμές παραγωγής ενζύμων

Τρία από τα ένζυμα που παράγονται από τις ναϊσσέριες είναι διαχωριστικά για

τα τρία κυρίως παθογόνα είδη των ναϊσσερίων, ήτοι το γονόκοκκο, το

μηνιγγιτιδόκοκκο, τη N.lactamica, και τη Branhamella catarrhalis.

Τα ένζυμα αυτά είναι η β-γαλακτοσιδάση, η γ-γλουταμυλαμινοπεπτιδάση και

η υδροξυ-προπυλ-αμινοπεπτιδάση. Το τελευταίο αυτό παράγεται μόνο από το

γονόκοκκο, η γλουταμυλαμινοπεπτιδάση από το μηνιγγιτιδόκοκκο και κανένα

από τη B.catarrhalis. η δοκιμή της παραγωγής των ενζύμων αυτών γίνεται με

τη χρησιμοποίηση υποστρωμάτων που κατά την υδρόλυση τους παράγεται

έγχρωμη ουσία ή ουσία που την ανιχνεύουμε με τη προσθήκη

αντιδραστηρίου. Τα αντιδραστήρια αυτά φέρονται έτοιμα στο εμπόριο. Η

μέθοδος λέγεται Chromogenic Enzyme Substrate System.

Σύστημα πολλαπλών δοκινών τύπου ΑΡΙ

Στο εμπόριο προσφέρονται και συστήματα πολλαπλών διαχωριστικών

δοκιμών που συνδυάζουν τις δοκιμές διασπάσεως σακχάρων με τις δοκιμές

χρωμογόνων ενζύμων για το διαχωρισμό των ναϊσσεριών όχι μόνο από την

μπρανχαμέλλα αλλά και από αιμόφιλους.

Δοκιμή άμεσου ανοσοφθορισμού

Εικόνα 6.3: Acid only from glucose

8877

Αναγνωρίζεται ο γονόκοκκος από την ένωση του με ειδικά μονοκλωνικά

αντισώματα προς το πρωτεϊνικό αντιγόνο (πρωτεΐνη Ι) της εξωτερικής του

μεμβράνης. Οι σχετικοί οροί, οι μάρτυρες, τα αντιδραστήρια και οι σχετικές

πλάκες προσφέρονται έτοιμα στο εμπόριο. Η τεχνική είναι απλή. Αραιό

εναιώρημα που παρασκευάζεται από μια αποικία του καθαρού

καλλιεργήματος τοποθετείται στη πλάκα, ξηραίνεται, προστίθεται το φθορίζον

αντίσωμα, επωάζεται για 15min, στεγνώνεί, σκεπάζεται με καλυπτρίδα και

διαβάζεται σε μικροσκόπιο φθορισμού. Σε θετική αντίδραση εμφανίζονται

διπλόκοκκοι με πράσινο φθορισμό.

Οροδιαγνωστικές εξετάσεις

Αντισώματα προς τα αντιγόνα του κυτταρικού τοιχώματος (LPS), της

κυτταρικής μεμβράνης (πρωτείνες) και των ινιδίων ανευρίσκονται στον ορό

των πασχόντων, με ανοσολογικές μεθόδους ELISA.

66..22..33 ΤΤααυυττοοπποοίίηησσηη ττοουυ χχλλααμμυυδδίίοουυ ττοουυ ττρρααχχώώμμααττοοςς

6.2.3.1 Μικροσκοπική εξέταση Χρώση Giemsa: Θα αναζητήσουμε τα

επιθηλιακά κύτταρα και μέσα σ’ αυτά θα βρούμε το πρωτοπλασματικό κυτταρικό έγκλειστο.

Το έγκλειστο είναι ένα μεγάλο πυκνό πορφυρόχρωμο μόρφωμα που εντοπίζεται κοντά στο

πυρήνα του κυττάρου. Έχει μέγεθος κάτι μικρότερο από τον πυρήνα του κυττάρου.

Άμεσος ανοσοφθορισμός

Το παρασκεύασμα χρωματίζεται με φθορίζον/αντιχλαμυδιακό αντίσωμα

μονοκλωνικό προς LPS αντιγόνο και εξετάζεται στο μικροσκόπιο φθορισμού.

Το κυτταρικό έγκλειστο φαίνεται πολύ καθαρά με σαφή φθορισμό. Η μέθοδος

είναι κατά 50-100% πιο ευαίσθητη από τη χρώση Giemsa.

Χρώση ανοσοπεροξειδάσης. Είναι μέθοδος εξίσου ευαίσθητη όσο και ο

ανοσοφθορισμός. Έχει το πλεονέκτημα ότι η χρώση στο παρασκεύασμα

διατηρείται ενώ ο φθορισμός γρήγορα εξαφανίζεται και δεν χρειάζεται

μικροσκόπιο φθορισμού. Άλλες χρώσεις είναι η Macchiavello, η Castaneda.

6.2.3.2 Καλλιέργεια σε κύτταρα McCoy

8888

Το δείγμα παίρνεται με στυλεό και εμβολιάζεται αμέσως σε υλικό μεταφορά.

Παίρνουμε δυο δείγματα. Το σύνηθες υλικό μεταφοράς είναι ρυθμιστικό φωσφορικό

υγρό με σουκρόζη και ορό εμβρύου βοός. Προκειμένου για δείγμα με μικροβιακή

χλωρίδα που υπάρχει σχεδόν σε όλα προστίθενται αντιβιοτικά. Το «θρεπτικό» υλικό

της καλλιέργειας είναι καλλιέργημα κυττάρων McCoy πάνω σε καλυπτρίδες που

βρίσκονται σε φιάλη ειδική (shell). Το δείγμα με το υλικό μεταφοράς ανακινείται λίγο

σε Votrex κινητήρα 0,25ml του υγρού εμβολιάζονται στη φιάλη με το

κυτταροκαλλιέργημα. Μπολιάζονται 2 φιάλες. Οι εμβολιασθείσες φιάλες

φυγοκεντρούνται σε 2800Kg για 1 ώρα, για να κολλήσουν τα χλαμύδια πάνω στα

κύτταρα και επωάζονται για μια άλλη ώρα στους 25ο C. Αναρροφάτε το υπερκείμενο

και στα παραμείναντα στη φιάλη προστίθενται 1 ml υλικό καλλιέργειας που περιέχει

κυκλοεξαμίδη και 10% ορό εμβρύου βοός. Επωάζονται γι 48-72 ώρες στους 35ο C.

Στο διάστημα αυτό τα χλαμύδια που υπάρχουν στο δείγμα μπαίνουν στα McCoy

κύτταρα, πολλαπλασιάζονται και παράγουν τα χαρακτηριστικά κυτταρικά έγκλειστα.

Η ταυτότητα των αναγνωρίζεται με φθορίζοντα μονοκλωνικά αντισώματα προς το

λιποπολυσακχαριδικό αντιγόνο του χλαμυδίου. Σε περίπτωση που η εξέταση αποβεί

αρνητική, γίνεται τυφλή ανακαλλιέργεια από τη δεύτερη φιάλη πρωτοκαλλιέργειας.

Για την ανακαλλιέργεια αυτή παραλαμβάνονται ξέματα των κυττάρων McCoy από

τις καλυπτρίδες. Το αποτέλεσμα διαβάζεται από τη δεύτερη αυτή καλλιέργεια. Η

καλλιέργεια μπορεί να γίνει και σε HeLa 229 κύτταρα. Η ευαισθησία της

καλλιέργειας σε σύγκριση με τις νεώτερες μεθόδους ανιχνεύσεως αντιγόνων στο

δείγμα είναι γύρω στα 95%.

6.2.3.3 Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR)

Πρόσφατα διαμορφώθηκε τεχνική ανιχνεύσεως της παρουσίας χλαμυδίων της

ουρογεννητικής περιοχής με την Παρασκευή δυο αφετηριών (primers), μιας που

συνίσταται από αλληλουχίες του πλασμιδικού DNA του C.trachomatis και μιας

δεύτερης αλληλουχίας από το χρωμοσωμικό γόνο που κωδικοποιεί την παραγωγή της

πρωτεΐνης της εξωτερικής μεμβράνης του χλαμυδίου. Με τις αφετηρίες αυτές γίνεται

ο πολλαπλασιασμός (amplification) του υπάρχοντος χλαμυδιακού DNA στο δείγμα.

Σε σύγκριση με τις ανοσοενζυμικές και την κυτταροκαλλιέργεια η PCR είναι κατά

100% πιο ευαίσθητη και πιο ειδική. Με βελτιώσεις στην τεχνική της PCR, ιδιαίτερα

στην εκλογή της περιοχής του πλασμιδικού DNA από την 7,5kD περιοχή και του

8899

γεννώματος από το 16,9rRNA επιτυγχάνεται η αναγνώριση του χλαμυδίου στο

κλινικό δείγμα έστω και αν πρόκειται για στέλεχος χωρίς πλασμίδιο.

ΚΚεεφφάάλλααιιοο 77οο :: ΚΚααλλλλιιέέρργγεειιςς ΚΚλλιιννιικκώώνν ΔΔεειιγγμμάάττωωνν ΑΑππόό ΒΒαακκττηηρριιααιιμμίίεεςς

77..11 ΚΚααλλλλιιέέρργγεειιαα ααίίμμααττοοςς

Η καλλιέργεια του αίματος γίνεται σε υγρό υλικό γιατί είναι μικρός ο

αριθμός των μικροβίων στο δείγμα, συνήθως κάτω του ενός ζωντανού μικροβίου

κατά ml (< lcfu/ml) στις διάφορες μικροβιαιμικές ή σηψαιμικές νόσους. Ο

αριθμός αυτός είναι μεγαλύτερος στις μικροβιαιμίες των παιδιών.

Σε αντίθεση με όλα σχεδόν τα άλλα δείγματα το αίμα εμβολιάζεται αμέσως

και επί τόπου στο θρεπτικό υλικό της καλλιέργειας του μετά τη λήψη του12.

Το θρεπτικό υλικό είναι πάντα ένας ζωμός που εκτός από τις θρεπτικές ουσίες

περιέχει αντιπηκτική ουσία, ουσίες σταθεροποιητικές της ωσμωτικής πίεσης και

εξουδετερωτικές των αντιβιοτικών αν ο άρρωστος παίρνει αντιβιοτικά.

Αυτά φέρονται σε φιαλίδια έτοιμα στο εμπόριο ή παρασκευάζονται στο

Εργαστήριο.

77..22 ΤΤρρόόπποοςς λλήήψψηηςς ττηηςς ααιιμμοοκκααλλλλιιέέρργγεειιααςς

Πριν από την απολύμανση του δέρματος, επιλέγεται με ψηλάφηση η φλέβα που

θα παρακεντηθεί.

Ο ιατρός ή ο νοσηλευτής φορά αποστειρωμένα γάντια μιας χρήσης.

9900

Η περιοχή του δέρματος καθαρίζεται με 70% αλκοόλης (έντονο τρίψιμο, κυκλικά

σε ακτίνα 5 cm).

Η περιοχή του δέρματος καθαρίζεται με βάμμα ιωδίου 2% ή ιωδιούχο ποβιδιόνη

(κυκλικά, αρχίζοντας από το κέντρο του κύκλου με τέτοιο τρόπο ώστε από το

κέντρο προς την περιφέρεια να καλυφθεί η περιοχή και να κορεστεί με το ιώδιο).

Το ιώδιο αφήνεται να στεγνώσει για τουλάχιστον 1 min (ΠΡΟΣΟΧΗ! ο χρόνος

παραμονής του ιωδίου είναι σημαντικός). Αν είναι γνωστό ότι το άτομο έχει

υπερευαισθησία στο ιώδιο, η περιοχή καθαρίζεται αποκλειστικά με 70%

ισοπροπυλικής αιθυλικής αλκοόλης.

Γίνεται η αιμοληψία με τη σύριγγα και τη βελόνη.

Σε περίπτωση που δε βρεθεί φλέβα και χρειαστεί δεύτερη παρακέντηση, τότε

πρέπει οπωσδήποτε να χρησιμοποιηθεί καινούργια σύριγγα και βελόνη και να

γίνει από την αρχή η διαδικασία απολύμανσης της περιοχής του δέρματος.

Το πώμα της φιάλης της αιμοκαλλιέργειας απολυμαίνεται με 70% αλκοόλη,

αλλάζεται η βελόνη της αιμοληψίας με μία καινούργια και το αίμα της σύριγγας

εμβολιάζεται στη φιάλη της αιμοκαλλιέργειας.

Το δέρμα του ασθενούς καθαρίζεται με αλκοόλη. Η περιοχή δεν πρέπει να

επιδένεται ή να καλύπτεται με συγκολλητική ταινία, γιατί μπορούν να

προκληθούν εγκαύματα από το βάμμα ιωδίου.

Η φιάλη της αιμοκαλλιέργειας ανακινείται ελαφρά για να μην πήξει το αίμα.

Επάνω στη φιάλη της αιμοκαλλιέργειας αναγράφονται καθαρά: τα στοιχεία του

ασθενούς, η κλινική στην οποία νοσηλεύεται, η ημερομηνία κι η ώρα λήψης του

αίματος, όπως επίσης, ολογράφως, το όνομα του ιατρού που παρακολουθεί τον

ασθενή.3

77..33 ΣΣύύσσττηημμαα ααιιμμοοκκααλλλλιιεερργγεειιώώνν

77..33..11 ΚΚλλαασσιικκόό σσύύσσττηημμαα ααιιμμοοκκααλλλλιιέέρργγεειιααςς

9911

Μετά την αιμοληψία το αίμα μεταγγίζεται σε ένα ή δύο φιαλίδια με δύο δια-

φορετικούς ζωμούς, το ένα για την ανάπτυξη των αερόβιων (ΒΗΙ ζωμός) και το άλλο

για προαγωγή αναπτύξεως αναερόβιων (Columbia ή θειογλυκολικός ζωμός).

Προκειμένου για βραδείας αναπτύξεως μικρόβια το αίμα μπολιάζεται σε φια-

λίδιο με διφασικό υλικό (ζωμός και άγαρ κατά Castaneda). Στο υλικό αυτό το μι-

κρόβιο αναπτύσσεται διάχυτα στο ζωμό και αναπτύσσει αποικίες στο άγαρ. Απο-

φεύγονται τα πολλά ανοίγματα για ανα-καλλιέργειες.

Νεώτερα συστήματα διαμορφώθηκαν με στόχο την αύξηση της ευαισθησία; της

αιμοκαλλιέργειας δηλαδή περισσότερες θετικές και την ταχύτητα του αποτελέσματος.

Τα συστήματα για τα οποία υπάρχουν τα απαιτούμενα στο εμπόριο και στην ελληνική

αγορά είναι τα ακόλουθα

77..33..22 ΣΣύύσσττηημμαα IIssoollaattoorr ήή σσύύσσττηημμαα λλύύσσεεωωςς κκααιι φφυυγγοοκκεεννττρρήήσσεεωωςς

Κατ’ αυτό το δείγμα αίματος λαμβάνεται απευθείας σε σωληνάριο στο οποίο

υπάρχει όχι ζωμός αλλά μίγμα ουσιών που θα προκαλέσουν λύση όλων των κυττάρων

του αίματος όπως οι ουσίες SPS, EDTA, σαπωνίνη κ.ά. Ανακατεύεται το αίμα με

αναποδογυρίσματα ώστε να γίνει η λύση των ερυθρών αιμοσφαιρίων και των άλλων

κυττάρων. Στο εργαστήριο φυγοκεντρείται σε γωνιακή φυγόκεντρο για 30 min σε

3000 g. To ίζημα περιέχει τα μη λυθέντα στοιχεία μεταξύ των οποίων είναι και τα

μικρόβια. Αυτό εμβολιάζεται πια στην επιφάνεια δύο τρυβλίων με αιματούχο άγαρ ή

άλλα εκλεκτικά υλικά. Με το σύστημα αυτό βγαίνουν θετικές οι αιμοκαλλιέργειες και

με λίγα μικρόβια κάτω των 3 cfu/ml αίματος. Η απομόνωση και η ταυτοποίηση του

μικροβίου γίνεται από το υλικό της πρώτο καλλιέργειας.

77..33..33 ΣΣύύσσττηημμαα BBAACCTTEERR ααυυττοομμααττοοπποοιιηημμέέννηηςς ααιιμμοοκκααλλλλιιέέρργγεειιααςς

Με το σύστημα αυτό αναγνωρίζεται ταχύτατα η έναρξη αναπτύξεως μικροβίων

στο ζωμό της αιμοκαλλιέργειας με την ανίχνευση παραγωγής CO2 από το μεταβο-

λισμό των. Η α να καλλιέργεια γίνεται μόνο από τις φιάλες στις οποίες εμφανίσθηκε

η παραγωγή CO2. Είναι σύστημα κατάλληλο για εργαστήρια με μεγάλο αριθμό

αιμοκαλλιεργειών περί τις 100 ημερησίως.

9922

Το σύστημα προσφέρει έτοιμα τα φιαλίδια με τους ζωμούς και το μηχάνημα ό-

που θα τοποθετηθούν τα πολυάριθμα φιαλίδια και θα επωασθούν. Υπάρχουν φιαλίδια

με ζωμούς χωριστά για την ανάπτυξη των αναερόβιων και των μυκοβακτηριδίων.

Στα παλαιά BACTEC ανίχνευση του CO2 γινόταν ραδιομετρικά. Ο ζωμός

περιείχε ανθρακούχο ουσία σημασμένη με ραδιενεργό άνθρακα C. To CO2 που

παράγεται από το μεταβολισμό της ουσίας αυτής φέρει το σήμα CO2 και αναγνω-

ρίζεται με εξέταση στο ραδιόμετρο. Έχει το μειονέκτημα ότι αφήνει ραδιενεργά κα-

τάλοιπα.

Το νεώτερο BACTEC, αντί ραδιενέργειας, χρησιμοποιεί υπέρυθρες ακτίνες για

την ανίχνευση παρουσίας CO2 στον αέρα της φιάλης της αιμοκαλλιέργειας. Τόσο το

CO2 όσο και το αέριο CO2 αναγνωρίζονται με εξέταση δείγματος που παίρνεται από

τη φιάλη της αιμοκαλλιέργειας. Υπάρχουν πιθανότητες επιμολύνσεων.

Ήδη διαμορφώνονται τρόποι μη παρεμβατική; ανιχνεύσεως της παραγωγή; του

CO2 χωρίς δηλαδή να ανοιχθεί η φιάλη αιμοκαλλιέργειας.

77..33..44 VVIITTAALL σσύύσσττηημμαα ττηηςς MMeerriieeuuxx

Στο σύστημα αυτό προστίθεται ουσία φθορίζουσα στον θρεπτικό ζωμό. Καθώς

τα μικρόβια αναπτύσσονται το CO2 και τα οξέα που .παράγονται από το μεταβολισμό

του αδρανοποιούν τη φθορίζουσα ουσία. Η μείωση ή εξαφάνιση του φθορισμού

αναγνωρίζεται κοιτάζοντας τις φιάλες αιμοκαλλιέργειας με λάμπα υπεριωδών

ακτινών. 12

77..33..55 SSPPPP σσύύσσττηημμαα ττηηςς DDiiffccoo

Το σύστημα αυτό στηρίζεται στην ανίχνευση μεταβολής της πιέσεως ηλεκτρο-

νικά, που γίνεται κατά την ανάπτυξη μικροβίων στο ζωμό BACTEC 9240 & Baxter,

με μη-παρεμβατικά συστήματα που στηρίζονται στην αλλαγή χρώματος δείκτου του

ρΗ12.

9933

77..33..66 ΣΣύύσσττηημμαα SSiiggnnaall

Κατ’ αυτό στη φιάλη αιμοκαλλιέργειας, μετά τη λήψη του αίματος,

προσαρμόζεται ένας «σημαντήρας» (signal) αναπτύξεως. Είναι μια κατασκευή που

εφαρμόζεται στο στόμιο της φιάλης της αιμοκαλλιέργειας. Αποτελείται από ένα

κλειστό ευρύστομο σωλήνα με βιδωτό πώμα που το κάτω μέρος του συνδέεται με μια

βελόνη. Η βελόνη του ανιχνευτή βυθίζεται στο ζωμό και το φιαλίδιο επωάζεται σε

κλίβανο με ανακινητήρα. Σε περίπτωση που αρχίζει ανάπτυξη μικροβίων τα αέρια

που παράγονται κατά τον μεταβολισμό των αυξάνουν την πίεση στη φιάλη και ο

ζωμός μέσα από τη βελόνη ανεβαίνει στο σωλήνα του Signal. Η άνοδος αυτή γίνεται

ορατή. Από το ζωμό αυτό που μπήκε στο σωλήνα της συσκευής γίνονται οι

ανακαλλιέργειες απομονώσεως και ταυτοποιήσεως. Το σύστημα (035^.) προσφέρεται

έτοιμο μαζί με τις φιάλες αιμοκαλλιέργειας που περιέχουν τον ειδικά

πολυεμπλουτισμένο ζωμό.

77..44 ΧΧρρόόννοοςς λλήήψψηηςς -- ΑΑρριιθθμμόόςς ααιιμμοοκκααλλλλιιεερργγεειιώώνν,, ΠΠοοσσόόττηητταα

κκααλλλλιιεερργγοούύμμεεννοουυ ααίίμμααττοοςς

77..44..11 ΧΧρρόόννοοςς λλήήψψηηςς ααιιμμοοκκααλλλλιιεερργγεειιώώνν

Σε περιπτώσεις παροδικής βακτηριαιμίας π.χ, από ένα απόστημα, το αίμα

πρέπει να λαμβάνεται ακριβώς πριν από την αναμενόμενη εμφάνιση του

πυρετού.

Αν ο ασθενής αναφέρει στο ιστορικό του πυρετικά κύματα. που εμφανίζονται

σε κανονικά χρονικά διαστήματα κατά τη διάρκεια της μέρας, τότε το αίμα

πρέπει να λαμβάνεται ακριβώς πριν από την αναμενόμενη εμφάνιση του

πυρετικού κύματος.

Σε βακτηριακή ενδοκαρδίτιδα και άλλες ενδαγγειακές λοιμώξεις, η συνεχής

βακτηριαιμία δεν επιβάλλει κάποιο συγκεκριμένο χρόνο λήψης του αίματος3.

77..44..22 ΠΠοοσσόόττηητταα κκααλλλλιιεερργγοούύμμεεννοουυ ααίίμμααττοοςς

9944

Η πιθανότητα απομόνωσης ενός παθογόνου μικροοργανισμού στο αίμα

αυξάνεται αν αυξηθεί η ποσότητα του αίματος που καλλιεργείται.

Το αίμα πρέπει να αραιώνεται αρκετά ώστε να εξουδετερώνονται επαρκώς τόσο

οι μικροβιοκτόνοι παράγοντες του ορού όσο και τα αντιμικροβιακά

χημειοθεραπευτικά που πιθανόν υπάρχουν σε αυτό.

Η αναλογία 1:10 (αίμα : ζωμός καλλιέργειας) είναι η κατάλληλη αραίωση που

εξασφαλίζει τις παραπάνω προϋποθέσεις.

77..44..33 ΑΑρριιθθμμόόςς ααιιμμοοκκααλλλλιιεερργγεειιώώνν

Όταν η κλινική κατάσταση του ασθενούς επιβάλλει την άμεση έναρξη

θεραπευτικής αγωγής, τότε - πριν από τη χορήγηση οιασδήποτε αντιβιοτικής

αγωγής -:

o εφάπαξ συνολική λήψη 30 ml αίματος, που λαμβάνοντα ι ανά 10 ml με

3 διαφορετικές φλεβοκεντήσεις από 3 διαφορετικές φλέβες με

διαφορετικές σύριγγες και βελόνες και που εμβολιάζονται σε 3

διαφορετικές φιάλες αιμοκάλλιέργειας.

Αν η θεραπεία του ασθενούς μπορεί να καθυστερήσει, τότε:

o λαμβάνονται 3 αιμοκαλλιέργειες σε μεσοδιαστήματα μίσης ως μιας

ώρας και μετά από παρακέντηση διαφορετικών φλεβών (π.χ. αριστερό

χέρι, δεξιό χέρι) και άλλες 3, με τον ίδιο τρόπο, την επόμενη μέρα.

Σε περιπτώσεις "πυρετού άγνωστης αιτιολογίας"

o 4 συνολικές αιμοκαλλιέργειες είναι κατά κανόνα αρκετές για να

απομονωθεί ο λοιμώδης αιτιολογικός παράγοντας. Οι

αιμοκαλλιέργειες λαμβάνονται ανά δύο σε διάστημα δύο ημερών.

Από τα παιδιά συνήθως λαμβάνονται 5 ml αίματος/αιμοκαλλιέργεια, ενώ από

τα νεογνά και τα πρόωρα 1-2 ml/αιμοκαλλιεργεία..

o οι παιδικές σηψαιμίες κατά κανόνα συνοδεύονται από ψηλή

βακτηριαιμία ( > 10 CFU βακτηρίων/ml αίματος).

9955

77..55 ΈΈλλεεγγχχοοςς ττωωνν φφιιααλλώώνν ττηηςς ααιιμμοοκκααλλλλιιέέρργγεειιααςς

Οι φιάλες αιμοκαλλιέργειας επωάζονται, στους 35°C, για 7 ημέρες, ελέγχονται

δε καθημερινά για την παρουσία μακροσκοπικά ορατών σημείων ανάπτυξης

(αιμόλυση, θόλωση, παραγωγή αερίου, σχηματισμός υρενίου ή θρόμβου, αποικίες8.

Στην περίπτωση όμως που αναζητούνται απαιτητικά παθογόνα μικρόβια, η

αιμοκαλλιέργεια διαφοροποιείται ανάλογα με τις συνθήκες ανάπτυξης των

μικροβίων. Έτσι:

οι αιμοκαλλιέργειες για Brucella ελέγχονται για 28 μέρες

οι καλλιέργειες για Leptospira ελέγχοντα ι για 4-6 εβδομάδες σε κλίβανο με

θερμοκρασία 28-30 "C

οι καλλιέργειες για Listeria παρακολουθούνται για περισσότερες από 7

μέρες και μετά από επώαση των φιαλών στους 35-37*C και άλλων φιαλών

στους 4οC3.

Θετικές αιμοκαλλιέργειες: από το ζωμό που έχει θολώσει ή από την ανάπτυξη

στη στερεή φάση του υλικού γίνονται παρασκευάσματα και χρωματίζονται με τη

χρώση Gram.

Η χρώση Gram αποτελεί την πρώτη εργασία που γίνεται σε

μια θετική αιμοκαλλιέργεια και δίνει πολύτιμες πληροφορίες, που

επιτρέπουν στον κλινικό ιατρό να αρχίσει αμέσως τη θεραπεία της

σηψαιμίας, πριν τα αποτελέσματα της καλλιέργειας είναι διαθέσιμα.

Από το ζωμό που έχει θολώσει ή από την ανάπτυξη στη στερεή φάση του

υλικού γίνονται ανακαλλιέργεια σε στερεά θρεπτικά υλικά (αιματούχο,

σοκολατόχρωμο, MacCnkey άγαρ, Chapman και αναερόβιο αιματούχο άγαρ) για να

9966

διαπιστωθεί με βεβαιότητα ότι ένα και μόνο είδος βακτηρίου ήταν το αίτιο της

σηψαιμίας.

Η συχνότητα της πολυμικροβιακής βακτηριαιμίας ανέρχεται σε 3-20% του

αριθμού των θετικών αιμοκαλλιεργειών.

Τυφλή ανακαλλιέργεια σε κατάλληλα θρεπτικά υλικά για αερόβια μικρόβια,

επιβάλλεται να γίνει μετά από 48 ώρες επώασης ακόμα και στην περίπτωση που δεν

υπάρχουν ενδείξεις μικροβιακής ανάπτυξης. Η διαδικασία αυτή θεωρείται

απαραίτητη γιατί πολλά μικρόβια, όπως οι αιμόφιλοι και οι ναϊσσέριες, δεν

προκαλούν μακροσκοπικά ευρήματα θετικότητας, ούτε αναπτύσσονται στα διφασικά

υλικά αιμοκαλλιεργειών.

Ειδικότερα, επί υποψίας πνευμονιοκοκκικής μικροβιαιμίας επιβάλλεται να γίνει

ανακαλλιέργεια πριν τις 18 ώρες επώασης, γιατί το μικρόβιο μπορεί να αυτολυθεί.

Δεύτερη τυφλή ανακαλλιέργεια θεωρείται περιττή εκτός από ορισμένες περιπτώσεις,

π.χ. ενδοκαρδίτιδα (7η ημέρα).

Προκαταρκτικές δοκιμασίες μπορούν και πρέπει να γίνουν αμέσως με τις

αποικίες ή τον τάπητα που έχει αναπτυχθεί στη στερεή φάση του υλικού. Το είδος

των δοκιμασιών θα εξαρτηθεί από το αποτέλεσμα της χρώσης Gram.

αν πρόκειται για Gram θετικό κόκκο:

παραγωγή καταλάσης (+) σταφυλόκοκκος

(-) στρεπτόκοκκος.

δοκιμασία της πηκτάσης

σε αντικειμενοφόρο πλάκα (+) S.aureus

(-) S.epidermidis.

αν πρόκειται για Gram αρνητικό βακτηρίδιο:

δοκιμασία της οξειδάσης (+) κάποιο είδος ψευδομονάδας.

(-)κάποιο είδος της οικογένειας των

εντεροβακτηριοειδών

Την επόμενη μέρα το εργαστήριο πρέπει να προχωρήσει στην τυποποίηση και

στην ευαισθησία του συγκεκριμένου στελέχους στα αντιβιοτικά.

Πιθανή τροποποίηση της αντιμικροβιακής θεραπείας.

9977

77..66 ΤΤααυυττοοπποοίίηησσηη ααπποομμοοννωωθθέέννττωωνν μμιικκρροοββίίωωνν

77..66..11 SSttaapphhyyllooccooccccuuss aauurreeuuss 7.6.1.1 Μικροσκοπική εξέταση

Ο S.aureus είναι Gram θετικός κόκκος που

διατάσσεται σε μικρές ομάδες (τσμπιά σταφυλιού) ή

σε σειρά τεσσάρων το πολύ κόκκων (εικόνα 7.1).

7.6.1.2 Μακροσκοπική εξέταση

Στο αιματούχο άγαρ οι αποικίες του είναι σχετικά μεγάλες και περιβάλλονται

από ζώνη αιμόλυσης. Στο macConkey(νο3) αναπτύσσει αποικίες με ελαφρό ροζ

χρώμα από τη διάσπαση της λακτόζης.

Το πιο χαρακτηριστικό είναι οι κίτρινες αποικίες που παράγει στο αλατούχο

άγαρ Chapman, ενώ παρατηρείται αλλαγή του χρώματος του υποστρώματος (από

φούξια κίτρινο). Αυτό και μόνο αρκεί ίσως για ο χαρακτηρισμό ενός μικροβίου ως

staphylococcus aureus, διότι μόνο αυτό το είδος από τους σταφυλόκοκκους διασπά

την μαννιτόλη και προκαλεί την αλλαγή του χρώματος.

7.6.1.3 Βιοχημικές δοκιμές

Δοκιμή παραγωγής καταλάσης: είναι η πρώτη κατατοπιστική διαχωριστική

δοκιμή προκειμένου για Gram θετικούς κόκκους. Είναιθετική για όλους τους

στρεπτοκόκκους.

Εικόνα 7.1: Staphylococcus aureus

9988

Δοκιμή παραγωγής κοαγκουλάσης: η κοαγκουλάση είναι μια εξωκυτταρική

πρωτείνη, προκαλεί πήξη του πλάσματος του κουνελιού και του ανθρώπου, χωρίς

την παρουσία ασβεστίου (αντίθετα με την προθρομβίνη).

Γίνεται με δύο μεθόδους, μια ταχεία πάνω σε αντικειμενοφόρο πλάκα και

μια βραδεία στο σωληνάριο. Με την πρώτη ανιχνεύουμε τη συνδεδεμένη

κοαγκουλάση ενώ με τη δεύτερη την ελεύθερη κοαγκουλάση. Η ελεύθερη

εκκρίνεται από το σταφυλόκοκκο που αναπτύσσεται σε ζωμό, ενώ η

συνδεδεμένη βρίσκεται πάνω στο μικροβιακό κύτταρο σταφυλοκόκκων που

αναπτύχθηκαν σε στερεό θρεπτικό υλικό και λέγεται παράγων

αδροσυγκολλήσεως.

α) Δοκιμή πάνω στην πλάκα. Σε μια αντικειμενοφόρο πλάκα βάζουμε μια

ρανίδα νερό και σ’ αυτήν ομοιογενοποιούμε 1-2

αποικίες του σταφυλόκοκκου. Στο πυκνότατο

αυτό εναιώρημα μεταφέρουμε με ένα σύρμα

ελάχιστη ποσότητα από πλάσμα ανθρώπου ή

κουνελιού και ανακατεύουμε. Αν ο

σταφυλόκοκκος παράγει κοαγκουλάση

παράγοντα αδροσυγκολλήσεως στο εναιώρημα

θα σχηματισθούν πήγματα μικρά και μεγάλα

καθώς ανακατεύουμε ακόμη με το σύρμα.(εικόνα

7.2)

β) Δοκιμή μέσα σε σωληνάριο. Σε ένα σωληνάριο βάζουμε 0,5 ml ζωμό

(χωρίς γλυκόζη) και κάνουμε εναιώρημα του σταφυλόκοκκου μέσα σ' αυτό ή

ακόμη καλλίτερα κάνουμε καλλιέργεια του σταφυλόκοκκου σε ζωμό και μετά

από 24ωρο μεταφέρουμε 0,1 ml από to καλλιέργημα σε σωληνάριο.

Προσθέτουμε 0,5 ml αραιωμένο πλάσμα με ζωμό σε αναλογία: 1:5.

Ανακατεύουμε και βάζουμε το στατό σε υδατόλουτρο ή κλίβανο 37° C. Στο ίδιο

στατό βάζουμε και ένα σωληνάριο με θετικό μάρτυρα (σταφυλόκοκκο γνωστό

κοαγκουλάση - θετικό) και ένα με αρνητικό μάρτυρα. Αφήνουμε τα σωληνάρια

για επώαση 30 min οπότε κάνουμε την πρώτη ανάγνωση. Αν δεν έχει πήξει το

υγρό το αφήνουμε για 4 ώρες συνολικά, και εφ' όσον ακόμη είναι αρνητική η

Εικόνα 7.2: Staphylococcus: coagulase test

9999

αντίδραση αφήνουμε το στατό στο μπάγκο, στη θερμοκρασία του δωματίου,

μέχρι το άλλο πρωινό.

Θετική είναι η αντίδραση όταν παρατηρηθεί πήξη ομοιογενής σαν από

ζελατίνα. Το πήγμα μπορεί να είναι μικρότερο ή αν το δούμε την άλλη ημέρα να

είναι απλώς ένα κομμάτι ινικής κατακαθισμένο στον πυθμένα του σωληναρίου.

Αν η δοκιμή βγει σαφώς θετική το μικρόβιο χαρακτηρίζεται σαν S.aureus

και δεν χρειάζεται να γίνουν άλλες εξετάσεις.(εικόνα 7.3)

Δοκιμή παραγωγής θερμοανθεκτικής DN-άσης ή l-DN-άσης: Το ένζυμο αυτό

είναι θερμοανθεκτικό και δεν αδρανοποιείται με το βρασμό για 15 min.

Παράγεται μόνο από το S.aurous. ΕΚΤΕΛΕΣΗ. ο υπό εξέταση σταφυλόκκοκος

καλλιεργείται σε ζωμό και επωάζεται στους 37ο C. Την άλλη ημέρα το

καλλιέργημα τοποθετείται σε βραστό νερό για 15 min. Ταυτόχρονα καλλιεργείται

και ένας σταφυλόκοκκος κουαγκουλάση θετικός γνωστός ότι παράγει την t-DN-

άση για να χρησιμεύσει σαν θετικός μάρτυρας.

Στην επιφάνεια ενός τρυβλίου με το DN-άση υλικό ανοίγονται 3 τρύπες διαμέ-

τρου 3 mm η καθεμιά.

Με πιπέττα Pasteur γεμίζουμε την 1η τρύπα με το βρασμένο καλλιέργημα του ε-

ξεταζόμενου σταφυλόκοκκου, τη 2η τρύπα γεμίζουμε με το καλλιέργημα του

γνωστού κοαγκουλάση θετικού σταφυλόκοκκου και την 3η τρύπα με ένα άλλο

μικρόβιο ή με σταφυλόκοκκο γνωστό που δεν παράγει την t-DN-άση.

Εικόνα 7.3

110000

Μεταφέρουμε το τρυβλίο (χωρίς να το γυρίσουμε ανάποδα) στον κλίβανο των

37° C, το αφήνουμε για 4 ώρες και διαβάζουμε.

Αν ο σταφυλόκοκκος παράγει t-DN-άση θα εμφανισθεί μεταβολή της χροιάς του

υλικού γύρω από την τρύπα όπου μπολιάσθηκε αυτό. Ο θετικός μάρτυρας πρέπει

να παρουσιάσει τη μεταβολή της χροιάς ενώ ο αρνητικός δεν πρέπει να πα-

ρουσιάσει καμία μεταβολή.

Δοκιμή ζυμώσεως / οξειδώσεως ή F/O δοκιμή. Ο χρυσίζων σταφυλόκοκκος

ζυμώνει και οξειδώνει, δηλαδή διασπά αναεροβίως και αεροβίως, τη γλυκόζη και

τη μαννιτόλη. Κανένας άλλος από τους άλλους σταφυλόκοκκους (S. epider-midis

ή S. saprophyticus) ή κανένας μικρόκοκκος δεν δίνει την αντίδραση αυτή. Για την

εκτέλεση της δοκιμής μπολιάζονται αποικίες από το 24ωρο καλλιέργημα κάθετα με

νύξη σε δύο σωληνάρια. Στο ένα από τα δύο σωληνάρια προσθέτουμε ποσότητα

αποστειρωμένης παραφίνης (δοκιμή ζυμώσεως = F). Επωάζονται τα σωληνάρια για

1-3 ημέρες στους 37° C. Η οξείδωση του σακχάρου (Ο), ήτοι παραγωγή οξέος από

το σάκχαρο, θα διαβασθεί στο χωρίς παραφίνη υλικό (αλλαγή χροιάς του υλικού).

Ζύμωση (F) του σακχάρου θα διαβασθεί στο με παραφίνη σωληνάριο. Αλλαγή

χροιάς θα εμφανισθεί και στα δύο σωληνάρια..

7.6.1.4 Οροδιάγνωση Σταφυλοκοκκικών νόσων

Με τις ορολογικές εξετάσεις αναζητούνται αντισώματα στον ορό του αίματος

των πασχόντων σαν συμπλήρωμα στην εργαστηριακή διαγνωστική των σταφυλο-

κοκκικών λοιμώξεων αλλά και για το διαχωρισμό μια; παροδικής σταφυλοκοκκικής

μικροβιαιμία; από μια ενεργό σταφυλοκοκκική ενδοκαρδίτιδα με την προϋπόθεση ότι

θα παρθούν πολλά, τουλάχιστο 6ύο, δείγματα αίματος. Μόλις διαπιστωθεί

μικροβιαιμία παίρνεται αίμα και προσδιορίζεται ο τίτλος αντισωμάτων (προς την α-

τοξίνη ή προς το τειχοίκό οξύ, ή τη λιπάση). Δίνεται χημειοθεραπεία για δύο

εβδομάδες οπότε παίρνεται ένα νέο δείγμα αίματος και προσδιορίζεται και σε αυτό ο

τίτλος αντισωμάτων. Αν ο τίτλος δεν αυξηθεί και παραμείνει δεν πρόκειται για

ενδοκαρδίτιδα ή άλλη εν τω βάθει σταφυλοκοκκική λοίμωξη.

110011

7.6.1.4.1 Προσδιορισμός τίτλου αντι-α-Αιμολυσίνης ή α-Τοξίνης ή Τίτλου

αντισταφυλοσίνης (ASL)

Αρχή: Η σταφυλοκοκκική α-αιμολυσίνη ή σταφυλολυσίνη αιμολύει τα ερυθρά

αιμοσφαίρια ανθρώπου και κουνελιού. Η αντισταφυλολυσίνη, δηλαδή το ειδικό

αντίσωμα της α-αιμολυσίνης, εξουδετερώνει in vitro την αιμολυτική ιδιότητα της

σταφυλολυσίνης.

Αν σε ένα δείγμα ορού πάσχοντος από σταφυλοκοκκική νόσο προσθέσουμε

γνωστή ποσότητα σταφυλολυσίνης, εφ’ όσον στον ορό αυτόν υπάρχει

αντισταφυλολυσίνη θα εξουδετερωθεί η σταφυλολυσίνη που προσθέσαμε. Αυτό θα το

διαπιστώσουμε εύκολα αν στη συνέχεια προσθέσουμε στο μίγμα αυτό ερυθρά

αιμοσφαίρια ανθρώπου ή κουνελιού. Δεν θα αιμολυθούν όπως θα έπρεπε αν δεν

υπήρχε αντισταφυλολυσίνη. Όσο περισσότερα αντισώματα υπάρχουν τόσο σε

μεγαλύτερες αραιώσεις του ορού θα εμφανίζεται η αναστολή της αιμολύσεως.

7.6.1.4.2 Προσδιορισμός τίτλου αντι-Τειχϊκού οξέος

Το τειχοϊκό οξύ συνδεδεμένο με την πεπτιδογλυκάνη του κυτταρικού τοιχώμα-

τος του σταφυλόκοκκου προκαλεί την παραγωγή αντισωμάτων ειδικών κατά την

πορεία πολλών σταφυλοκοκκικών νόσων. Τα αντισώματα αυτά είναι ειδικά για το S.

aureus.

Εμφανίζονται ταυτόχρονα με τα αντισώματα προς την α-αιμολοσίνη, αυξάνει ο

τίτλος τους κατά την πορεία της νόσου ακόμη και σε περιπτώσεις που δεν εμφα-

νίζεται αντι-α-αιμολυσίνη. Για το λόγο αυτόν τα αντιτειχοίκά αντισώματα θεωρούν-

ται πιο ειδικά από την αντι-α·αιμολυσίνη και η μέθοδος είναι δύο φορές πιο ευαίσθη-

τη από ό,τι ο προσδιορισμός του τίτλου της αντι-α-αιμολυσίνης. Ο προσδιορισμός

τους γίνεται με διάφορες ανοσολογικές μεθόδους.

Η ανοσοηλεκτροφόρηση αντίθετης φοράς είναι η προτιμότερη. Τίτλοι από 1:8

και άνω θεωρούνται θετικοί. Σε ασθενείς με σταφυλοκοκκική ενδοκαρδίτιδα βρέθη-

καν τίτλοι από 1:16- 1:64. Στο εμπόριο φέρεται έτοιμη, καθώς και μέθοδοι ανοσο-

ενζυμική, και διπλής ανοσοδιαχύσεως.

110022

7.6.1.4.3 Προσδιορισμός τίτλου αντι-Λίπασης

Έχει μεγάλη ειδικότητα η οποία βελτιώνεται με την επιτυχή επιλογή και

συνδυασμό αντιγόνων. Δίνει αποτελέσματα που πλησιάζουν περισσότερα προς αυτά

που δίνει ο προσδιορισμός των αντι-τειχοϊκών οξέων. Χρησιμοποιείται μέθοδος

ανοσοενζυμική που προσφέρεται στο εμπόριο. Τα αντισώματα που εξετάζονται με τις

τρεις αυτές μεθόδους βρίσκονται στο αίμα και υγιών ατόμων αλλά σε χαμηλούς

τίτλους κάτω των 1:8.

77..66..22 BBrruucceellllaa mmeelliitteennssiiss && BBrr.. AAbboorrttuuss

Για την διάγνωση της βρουκελλώσεως, η αιμοκαλλιέργεια είναι η πιο

αξιολογήσιμη εξέταση. Όταν βγει θετική θέτει τη διάγνωση της νόσου χωρίς καμία

αμφιβολία.

Επειδή η μικροβιαιμία δεν είναι συνεχής, συνιστάται να λαμβάνονται

τουλάχιστον 3 δείγματα αίματος σε 3 συνεχείς ημέρες.

Το ποσό του αίματος πρέπει να αυξηθεί η πιθανότητα αναπτύξεως του

μικροβίου.

Το θρεπτικό υλικό της αιμοκαλλιέργειας θα πρέεπι να έιναι brucella ή

Trypticase soy broth3. Προτιμότερα είναι τα έτοιμα φιαλίδια με διφασικό

υλικό για να αποφύγουμε τα πολλά ανοίγματα της φιάλης για τις

ανακαλλιέργειες και γιατί στα έτοιμα αυτά φιαλίδια αιμοκαλλιεργειών

υπάρχει λίγο κενό και λίγο CO2. Το κενό βοηθά στη λήψη του αίματος κατ’

ευθείαν μέσα στο φιαλίδιο με μια συσκευή λήψεως και το CO2 βοηθάς στην

ανάπτυξη των Βρουκελλών και ιδιαίτερα της B.abortus.

Οι φιάλες πρέπει να επωάζονται σε ατμόσφαιρα 5-10% CO2 στους 37ο C για 4

τουλάχιστον εβδομάδες3.

110033

Την ΄τεταρτη μέρα της επώασης γίνονται τυφλές ανακαλλιέργειες καισε

περιπτώση αρνητικού αποτελέσματος, οι ανακαλλιέργειες επαναλαμβάνονται

κάθε 4 μέρες.

Οι ανακαλλιέργειες γίνονται σε τρυπτικάση-σόγια άγαρ και βρουκέλλα άγαρ,

τα οποία επωάζονται σε ατμόσφαιρα 5-10% CO2, στους 37ο C για 10 ημέρες.

7.6.2.1 Μικροσκοπική εξέταση

Οι Βρουκέλλες είναι Gram- αρνητικά, μικρά, ωοειδή με αποστρογγυλεμένα

άκρα βακτηρίδια που διατάσσονται μοναχικά και μοιάζουν σαν κόκκοι

(κοκκοβακτηρίδια) ή κατά ζεύγη.

7.6.2.2 Μακροσκοπική εξέταση

Στα ειδικά θρεπτικά υλικά που αναπτύσσονται (trypticase soya agar (TSA),

Brucella αγαρ) παράγουν αποικίες περιγραμμένες, λίγο φουσκωτές, άχρωμες και με

επιφάνεια λεία και γυαλιστερή.

7.6.2.3 Βιοχημικές δοκιμές

Το μικρόβιο θα δώσει θετικές τις δοκιμές οξειδάσης (όχι πάντοτε), αναγωγής

νιτρικών, παραγωγής ουρίας, δεν θα παράγει ούτε οξύ ούτε αέριο από τη γλυκόζη και

θα δώσει αρνητικές όλες τις άλλες δοκιμές. Ίσως να δώσει θετική τη δοκιμή

υδρόθειου.

7.6.2.4 Ορολογικές δοκιμές

Γίνονται με τους αντιβρουκελλικούς ορούς. Οι αντι-οροί αυτοί φέρονται στο

εμπόριο. Είναι μονοδύναμοι για τον Β. melitensis βιότυπος 1, και Β.abortus βιότυπος

1. Η δοκιμή γίνεται στην πλάκα και στα σωληνάρια.

Συγκόλληση στην πλάκα. Παρασκευάζεται πυκνό εναιώρημα του

καλλιεργήματος της βρουκέλλας σε φ.δ. NaCl με 5% φαινόλη και αδρανοποιείται με

θέρμανση στους 60°C για μια ώρα. Σε γυάλινη πλάκα ανακατεύονται μια σταγόνα

του αντιορού με μια σταγόνα του μικροβιακού εναιωρήματος, ανακινείται το μίγμα.

110044

Σε θετική αντίδραση θα εμφανισθεί συγκόλληση μέσα σε 1 min. Ταυτόχρονα γίνεται

η δοκιμή και με τους δύο αντιορούς. Μάρτυρες μπαίνουν καλλιεργήματα των

προτύπων στελεχών των δύο Βρουκελλών.

Συγκόλληση στα σωληνάρια. Παρασκευάζεται εναιώρημα του

καλλιεργήματος της βρουκέλλας σε λοςό άγαρ με διάλυμα φαινολούχου (5%)φ.δ.

NaCl και θερμαίνεται στους 60°C για αδρανοποίηση. Αραιώνεται με το ίδιο

αραιωτικό υγρό μέχρι θολερότητας 78°/ο διέλευση (Τ) φωτός σε 650nm.

Παρασκευάζονται σειρές υποδιπλασίων αραιώσεων (από 1:5 και άνω) των αντι-ορών

μέχρι του τίτλου των. Προστίθενται στα σωληνάρια ίσοι όγκοι του εναιωρήματος και

επωάζονται τους 37° C για 24 ώρες. Ταυτόχρονα μπαίνουν μάρτυρες των ορών {φ.δ.

NaCl). Θετική θεωρείται η αντίδραση αν το εξεταζόμενο μικρόβιο, δηλαδή η

Βρουκέλλα, συγκολληθεί με τον έναν από τους δύο ορούς μέχρι του τίτλου του. Η

Β. melitensis βιότυπος 3 συγκολλάται με τους δύο αντι-ορούς σε διάφορους τίτλους.

7.6.2.5 Δοκιμή ευαισθησίας ή ανταχής στις χρωστικές

Η ορθόδοξη δοκιμή απαιτεί ενσωμάτωση των χρωστικών αυτών σε άγαρ

τρυπτικάσης-σόγιας όταν είναι ακόμη λειωμένο σε θερμοκρασία 45°C, σε

συγκέντρωση 1:50.000 από τη θειονίνη και 1:25.000 από τη φουξίνη. Τα διαλύματα

των χρωστικών αυτών αποστειρώνονται με διήθηση.

Πιο απλή και σίγουρη είναι η ακόλουθη μέθοδο; ενσωματώσεως έτοιμων δι-

σκίων με τις χρωστικές που προσφέρονται στο εμπόριο.

α) Ετοιμάζουμε ένα τρυβλίο με TSA (άγαρ τρυπτικάσης - σόγια;) και

τοποθετούμε πάνω στην επιφάνεια ένα δισκίο θειονινης και ένα φουξίνης.

β) Κάνουμε ένα πυκνό εναιώρημα της βρουκέλλας που εξετάζουμε σε 0,1 ml

αποστειρωμένο φ.δ. NaCl και μπολιάζουμε με αυτό 10 ml λειομένο TSA

θερμοκρασίας 45° C. Ανακατεύουμε και το ρίχνουμε πάνω στο τρυβλίο με

τα δισκία των χρωστικών.

γ) Αφήνουμε να πήξει το νέο στρώμα και επωάζουμε στους 37ο C σε

ατμόσφαιρα CO2 για 2-3 ημέρες και διαβάζουμε.

110055

δ) Αν το μικρόβιο μας είναι Β. melitensis δεν θα παρατηρηθεί ζώνη αναστολής

γύρω από τα δύο δισκία. Αν είναι Β. abortus θα εμφανισθεί ζώνη

αναστολής μόνο γύρω από το δισκίο θειονίνης.

7.6.2.6 Ανάγκη παρουσίας CO2

Ένα τρυβλίο καλλιεργημένο με το εξεταζόμενο μικρόβιο θα επωασθεί στον

αερόβιο κλίβανο και ένα άλλο παρουσία CO2. Αν είναι β. abonus δεν θα αναπτυχθεί

στην αερόβιο επώαση.

7.6.2.7 Οροδιαγνωστική των βρουκελλώσεων

Οι ορολογικές εξετάσεις αν και υστερούν σε ευαισθησία σε σύγκριση με την

καλλιέργεια χρησιμοποιούνται ευρύτερα και στις περισσότερες βρουκελλώσεις.

Οι ορολογικές μέθοδοι που χρησιμοποιούνται είναι οι εςής:

1. Συγκολλητιναντίδραση ή αντίδραση Wright

2. Σύνδεση συμπληρώματος

3. Συγκόλληση με αντισφαιρινικό ορό ή αντίδραση Coombs

4. Λοκιμή μερκαπτοαιθανόλης

7.6.2.8 δοκιμή με αντισφαιρινικό ορό ή Coombs δοκιμή.

Αρχή. Τα δεσμευτικά αντισώματα είναι μικροσφαιρίνες φυσιολογικές

ουγκολλητίνες που αναπτύσσονται στον ορό μερικών αρρώστων που πάσχουν από

βρουκέλλωση. Παρεμβαίνουν οτη συγκολλητιναντίδραση Wright γιατί

παρεμποδίζουν τη συγκόλληση βρουκελλών από τις IgG και IgM ειδικές

αντιβρουκελλικές ανοσοσφαιρίνες του ορού.

Τα δεσμευτικά αυτά αντισώματα αναγνωρίζονται από τον ανθρώπινο

αντισφαιρινικό ορό οπότε προκαλείται συγκόλληση των βρουκελλών επί των οποίων

είχαν προσκολληθεί.

110066

Απαιτούμενα. Αντισφαιρινικός ορός ανθρώπινος. Υπάρχει στο εμπόριο.

Αντιγόνο. Είναι εναιώρημα νεκρό Β.abortus διεθνές στέλεχος για

συγκολλητιναντίδρα-ση. Οι αραιώσεις γίνονται με φ.δ. NaCl.

Εκτέλεση:

α) Γίνονται υποδιπλάσιες αραιώσεις του εξεταζομένου ορού σε όγκο 0,5 ml από

1:10 μέχρι 1:2560 σε μια σειρά από 9 σωληνάρια. Το 10ο σωληνάριο είναι μάρτυς

του αντιγόνου.

β) Προστίθενται από 0,5 ml αντιγόνο σε όλα τα σωληνάρια.

γ) Αφήνεται το στατό σε υδατόλουτρο 37° C για 2 ώρες.

δ) Φυγοκεντρούνται τα σωληνάρια.όλα και ο μάρτυρα; στις 3.000 στροφές για

5 min. Πετιέται το υπερκείμενο, προστίθεται 1 ml φ.δ. NaCl, ξαναφυγοκεντρείται.

Επαναλαμβάνεται το πλύσιμο αυτό τρεις φορές, για να φύγει κάθε ίχνος από τον ορό

και τελικά επαναιωρούνται τα ιζήματα σε 1 ml φ.δ. NaCl

ε) Προστίθεται σε κάθε σωληνάριο από 1 σταγόνα από τον αντισφαιρινικό ορό

αραιωμένο 1:50.

στ) Φέρεται το στατό στον κλίβανο των 37ο C όπου αφήνεται μέχρι την άλλη

ημέρα και διαβάζουμε.

Ανάγνωση. Διαβάζουμε όπως κάθε συγκολλητιναντίδραση. Ο μάρτυρας πρέπει

να είναι ομοιόμορφα θολός με οπαλισμό. Αν δεν υπάρχουν αντιβρουκελλικά

αντισώματα δεν θα παρατηρηθεί συγκόλληση σε κανένα σωληνάριο. Αν υπάρχουν θα

εμφανισθεί συγκόλληση πλήρης με διαύγαση του υγρού στο σωληνάριο. Η τελευταία

αραίωση του ορού που δείχνει πλήρη συγκόλληση δηλώνει τον τίτλο. Ζώνη δεν

παρατηρείται.

Ερμηνεία. Η δοκιμή αυτή βγαίνει συχνότερα θετική από ό,τι η Wright και σε

υψηλότερο τίτλο. Θετικός θεωρείται τίτλος 1:160 και άνω. Μπορεί να γίνει και με

λιγότερα σωληνάρια αρχίζοντας από αραίωση 1:20 και τελειώνοντας στην 1:640.

Καλό είναι να βάζουμε θετικό μάρτυρα.

110077

ΚΚεεφφάάλλααιιοο 88οο :: ΚΚααλλλλιιέέρργγεειιςς ΚΚλλιιννιικκώώνν ΔΔεειιγγμμάάττωωνν ΕΕγγκκεεφφααλλοοννωωττιιααίίοουυ

ΥΥγγρροούύ ((ΕΕΝΝΥΥ))

88..11 ΛΛήήψψηη ττοουυ ΕΕΝΝΥΥ

Αυτό παίρνεται από γιατρό της κλινικής με οσφυονωτιαία παρακέντηση μεταξύ

3ου και 4ου οσφυϊκού σπονδύλου μετά από σχολαστική απολύμανση του δέρματος με

betadine ή οινόπνευμα και μετά με

ιώδιο12 (εικόνα 8.1). Το υγρό που

συλλέγεται (2-4ml) ανακατανέμεται

σε 3-4 αποστειρωμένα σωληνάρια

wasserman στα οποία επικολλάται

ταινία αναγνώρισης και σειράς. Ο

όγκος του συλλεγόμενου ΕΝΥ έχει

σημασία στη διάγνωση ορισμένων

αιτιών, όπως προκειμένου για αναζήτηση M.tuberculosis (περίπου 10ml).

Τα δείγματα του ΕΝΥ φέρονται αμέσως και ιδιοχείρως στο εργαστήριο. Η

εξέταση του αρχίζει αμέσως μετά την προσκόμιση του, πρέπει να ολοκληρώνεται σε

1/2h και τα αποτελέσματα δίνονται τηλεφωνικά στο θεράποντα ιατρό (η άμεση

έναρξη της θεραπείας σώζει τη ζωή του ασθενούς). Αν για οποιοδήποτε λόγο δεν

γίνει αμέσως η καλλιέργεια το δείγμα θα φυλαχτεί στο εργαστήριο στους 30-37ο C

(κλίβανο) και όχι στο ψυγείο για να μην αυτολυθούν οι ναϊσσέριες. Το υπόλοιπο το

μετά την καλλιέργεια, παραμείναν ποσό του ΕΝΥ ή άλλο άθικτο δείγμα φυλάσσεται

μέχρι την επόμενη στον κλίβανο, για την ανάπτυξη και τον πολλαπλασιασμό των

τυχόν ολιγάριθμων μικροβίων. Σε περίπτωση που η καλλιέργεια βγει αρνητική

γίνεται εκ νέου καλλιέργεια από το επωασθέν δείγμα.

Εικόνα 8.1: οσφυονωτιαία παρακέντηση

110088

88..22 ΜΜιικκρροοσσκκοοππιικκήή εεξξέέτταασσηη

Είναι απαραίτητη και αναντικατάστατη εξέταση και προηγείται ή γίνεται

ταυτόχρονα με την καλλιέργεια. Το δείγμα φυγοκεντρείται σε 3000rpm περίπου (ή

500x9) για 8-10min. Το υπερκείμενο μεταφέρεται σε άλλο σωληνάριο και σταγόνα

από το ίζημα τοποθετείται σε αντικειμενοφόρο πλάκα και αφού στεγνώσει

χρωματίζεται κατά Gram.

Αν η ποσότητα του εγκεφαλονωτιαίου υγρού είναι μικρή μπορεί να μην

δημιουργηθεί ίζημα κατά την φυγοκέντρηση. Τότε τοποθετούμε μια σταγόνα του

ΕΝΥ σε αντικειμενοφόρο πλάκα και αφού στεγνώσει προσθέτουμε μια δεύτερη

σταγόνα δημιουργώντας έτσι ένα επίχρισμα σε στιβάδες (layered smear) 10.

Η ευαισθησία της χρώσης

Gram μπορεί να αυξηθεί με την

κυτταροφυγοκέντρηση.

Η κυτταροφυγοκέντρηση, που

γίνεται με συσκευές όπως Cytospin

2 (εικόνα 8.2) ή Aerospray Gram

Slide stainer/cytocentrifuge, είναι

μια τεχνική με την οποία

συγκεντρώνονται τόσο τα κύτταρα

όσο και τα μικρόβια σε μια πολύ μικρή περιοχή αντικειμενοφόρου πλάκας, έτοιμης

για χρώση και μικροσκόπηση.

Τα μικρόβια που αναζητούνται κατά τη μικροσκοπική εξέταση είναι τα

εξής:

Διπλόκοκκοι, Gram αρνητικοί ενδοκυττάριοι ή εξωκυττάριοι. Σχεδόν

πάντοτε πρόκειται για Μηνιγγιτιδόκοκκο. Συνήθως βρίσκονται λίγοι κόκκοι

εξωκυττάριοι, δηλαδή ένας ή δύο διπλόκοκκοι και όχι απαραίτητα σε κάθε οπτικό

πεδίο, αλλά δεν αποκλείεται να μην βρεθούν καθόλου κόκκοι, παρόλο που ο

άρρωστος πάσχει από μηνιγγιτιδοκοκκική μηνιγγίτιδα. Εφόσον βρεθούν οι

κόκκοι αυτοί, δίνεται αμέσως τηλεφωνική απάντηση για να κατευθυνθεί η

θεραπεία, αλλά δεν χαρακτηρίζεται το μικρόβιο σαν Μηνιγγιτιδόκοκκος, παρά

Εικόνα 8.2

110099

μόνο όταν αναπτυχθεί στην καλλιέργεια και δοκιμασθεί με βιοχημικές και

ορολογικές δοκιμασίες. Αυτές οι προφυλάξεις είναι απαραίτητες όταν πρόκειται

για μηνιγγίτιδα ή υποσκληρίδιες συλλογές, σε άτομα που έχουν υποβληθεί σε

χειρουργική επέμβαση στο κεντρικό νευρικό σύστημα (Κ.Ν.Σ.), σε παιδιά με

υδροκέφαλο που υποβλήθηκαν σε παροχέτευση, σε παιδιά που υποβάλλονται σε

συχνές οσφυονωτιαίες παρακεντήσεις. Στις περιπτώσεις αυτές, παρατηρήθηκαν

μολύνσεις των μηνίγγων με μικρόβια της ομάδας των Ανιτροβακτηριδίων, όπως

είναι η Mima polymorpha. Το μικρόβιο αυτό μοιάζει με το Μηνιγγιτιδόκοκκο

μορφολογικά, δίνει θετική την αντίδραση οξειδάσης, αλλά είναι ανθεκτικό στην

πενικιλίνη και στα άλλα αντιβιοτικά που χρησιμοποιούνται στη θεραπεία της

μηνιγγίτιδας. Σε τέτοια μικρόβια οφείλονται μερικές από τις περιπτώσεις

μηνιγγίτιδων που δεν υποχωρούν στη χημειοθεραπεία και χρονίζουν.

Διπλόκοκκοι λογχοειδείς ή μη, ή κόκκοι σε κοντές αλυσίδες, Gram θετικοί.

Σχεδόν πάντοτε πρόκειται για Πνευμονιόκκοκο. Συνήθως βρίσκονται πολλοί σε

κάθε οπτικό πεδίο. Δίνεται αμέσως τηλεφωνική απάντηση για την παρουσία

Πνευμονιόκοκκαυ και την επόμενη ημέρα ταυτοποιείται το μικρόβιο, από την

καλλιέργεια που είναι πάντοτε θετική, και διαχωρίζεται από άλλους

Στρεπτόκοκκους.

Βακτηρίδια λεπτά με έντονο πολυμορφισμό (κόκκοι κοντοί και μακριά

βακτηρίδια), Gram αρνητικά. Σχεδόν πάντοτε πρόκειται για Αιμόφιλο, εφόσον

βέβαια υπάρχει ο πολυμορφισμός. Συνήθως υπάρχουν αρκετά σε κάθε οπτικό

πεδίο. Η καλλιέργεια, που συνήθως βγαίνει θετική, δίνει τη δυνατότητα να

ταυτοποιηθεί και αμέσως μετά δίνεται τηλεφωνική απάντηση για παρουσία Gram

αρνητικών βακτηριδίων, για να στραφεί η χημειοθεραπεία προς την ομάδα αυτή

των μικροβίων.

88..33 ΘΘρρεεππττιικκάά υυλλιικκάά

Μερικές σταγόνες του ιζήματος καλλιεργούνται στα ακόλουθα θρεπτικά

υλικά:

Αιματούχο άγαρ, στο οποίο αναπτύσσονται όλοι οι μικροοργανισμοί

111100

MacConkey 3 άγαρ, στο οποίο αναπτύσσονται όλα τα Gram(-) βακτήρια

Chapman άγαρ, όπου αναπτύσσονται κόκκοι και ιδιαίτερα ο staphylococcus

aureus, τον οποίο και αναγνωρίζουμε εύκολα

Σοκολατόχρωμο άγαρ

Sabouraud άγαρ, όπου αναπτύσσονται φυσιολογικά μόνο οι μύκητες

Lewinthal άγαρ και ζωμός. Είναι υλικό κατάλληλο για απαιτητικά μικρόβια όπως

οι αιμόφιλοι και οι μηνιγγιτιδόκοκκοι

Θειογλυκολικός ζωμός ή tpypticase soy broth (TSB) ¨η ζωμό BHIB (brain heart

infusion broth)

Fildes άγαρ ζωμός. Είναι υλικό κατάλληλο για την ανάπτυξη αιμοφίλων

Ειδικό αιματούχο άγαρ, όπως το Columbia, το brucella για τα αναερόβια

μικρόβια 12,15.

Τα θρεπτικά υλικά επωάζονται στους 37ο C, σε ατμόσφαιρα CO2 5-10% για 24

ώρες, εκτός από το σοκολατόχρωμο άγαρ το οποίο επωάζεται παρουσία CO2 και το

ειδικό αιματούχο άγαρ το οποίο επωάζεται αναερόβια. Μετά την 24h επώαση

ανακαλλιεργείται το δείγμα, στο οποίο προστέθηκε ζωμός στα ίδια θρεπτικά υλικά15.

88..44 ΤΤααυυττοοπποοίίηησσηη ττοουυ HHaaeemmoopphhiilluuss iinnfflluueennzzaaee

88..44..11 ΜΜιικκρροοσσκκοοππιικκήή εεξξέέτταασσηη

Gram αρνητικό μικρό κοκκοβκτηρίδιο με πολυμορφισμό δηλαδή με

νηματοειδείς μορφές ανάμεσα στα μικρά κοκκοβακτήρια στο εγκεφαλονωτιαίο υγρό

(ίζημα) θέτει μια προκαταρκτική διάγνωση μηνιγγίτιδας από Αιμόφιλο(εικόνα 8.3).

Αν με τη μικροσκοπική εξέταση βρεθούν πολλά Gram αρνητικά μικρά με

πολυμορφισμό βακτήρια, μπορεί να γίνει κατ’ ευθείαν στο ίζημα του ΕΝΥ δοκιμή

εξοιδήσεως του ελύτρου. Αν βγει θετική δίνεται θετική απάντηση για Αιμόφιλο σε

λίγες ώρες από τη λήψη του ΕΝΥ.

111111

8.4.1.1 Τεχνική δοκιμής εξοιδήσεως του ελύτρου

Πάνω σε αντικειμενοφόρο πλάκα ανακατεύονται μια σταγόνα από ίζημα του

φυγοκεντρηθέντος δείγματος ΕΝΥ με μια σταγόνα του αντι-b ορού (επειδή στις

μηνιγγίτιδες ο αιμόφιλος είναι σχεδόν κατά κανόνα του ορότυπου b, ο ορός που θα

χρησιμοποιηθεί θα είναι αντι-b ορός) και εξετάζονται μικροσκοπικά. Σε θετική

αντίδραση οι αιμόφιλοι θα φαίνονται σα μπαλίτσες στρογγυλές ή μακρουλές που

διαθλούν το φως. Καλύτερη εικόνα παίρνεται με μικροσκόπιο αντιθέσεως των

φάσεων καθώς και με δοκιμή άμεσου ανοσοφθορισμού.

Άλλες μέθοδοι για την ανίχνευση του αντιγόνου του ελύτρου στο ΕΝΥ είναι η

ανοσοηλεκτροφόρηση αντίθετης φοράς σε πλάκα αγαρόζης, η επισυγκόλληση

σταφυλοκόκκου, η Latex συγκόλληση κ.α.

88..44..22 ΜΜαακκρροοσσκκοοππιικκήή εεξξέέτταασσηη

Ο Ηaemophilus influenzae τόσο στο υλικό Levinthal όσο και στο fildes

παράγει αποικίες με έντονο ιριδισμό. Αν αναπτυχθούν ύποπτες για Aιμόφιλο αποικίες

στις πρωτοκαλλιέργειες θα προχωρήσουμε στις δοκιμές ταυτοποιήσεως χωρίς να

περιμένουμε την απομόνωση του με ανακαλλιέργεια, προκειμένου να συντομευτεί ο

χρόνος της λήψεως αποτελέσματος.

8.4.1 Δοκιμή δορυφορισμού

Στην επιφάνεια τρυβλίου με σοκολατόχρωμο άγαρ ή Columbia αιματούχο άγαρ,

μπολιάζουμε ομοιόμορφα τον υπό εξέταση πιθανόν Aιμόφιλο. Με κρίκο μπολιάζουμε

στην κεντρική περιοχή της καλλιεργημένης επιφάνειας έναν σταφυλόκοκκο, κατά

προτίμηση S.aureus. Το τρυβλίο επωάζεται αεροβίως μέχρι την άλλη ημέρα ή το πολύ

για 2 ημέρες στους 37ο C. Αν το μικρόβιο είναι αιμόφιλος οι αποικίες που είναι κοντά

στην περιοχή αναπτύξεως του σταφυλόκοκκου θα είναι μεγαλύτερες από ότι είναι οι

αποικίες στην υπόλοιπη περιοχή. Το φαινόμενο αυτό οφείλεται στο ότι ο

111122

σταφυλόκοκκος καθώς αναπτύσσεται εκκρίνει τον V παράγοντα που διαχέεται γύρω

από το σημείο της αναπτύξεως του. Ο παράγων αυτός προάγει την ταχύτερη και

αφθονότερη ανάπτυξη του Aιμόφιλου (εικόνα 8.4).

Θετική δίνουν τη δοκιμή δορυφορισμού οι Aιμόφιλοι H.influenzae,

H.prainfluenzae, H.haemolyticus και H.parahaemolyticus.

Εκτός των Αιμοφίλων και άλλα γένη μικροβίων δίνουν θετική τη δοκιμή αυτή

όπως μερικοί Στρεπτόκοκκοι και Κορυνοβακτηρίδια, η Pasteurella multocida.

Αντί του Σταφυλοκόκκου μπορεί να τοποθετηθεί δισκίο χάρτινο εμποτισμένο

με NAD. Ο δορυφορισμός θα εμφανισθεί στις γύρω από το δίσκο αποικίες.

8.4.1 Δοκιμή εξαρτήσεως από τους Χ και V

Στην επιφάνεια τρυβλίου με άγαρ χωρίς τους X και V παράγοντες όπως είναι το

ΒΗΙ ή TSA άγαρ μπολιάζουμε το υπό εξέταση μικρόβιο καλλιεργημένο σε ζωμό

Lewinthal και όχι πάνω σε σοκολατόχρωμο άγαρ για να αποφύγουμε μεταφορά X

παράγοντα. Πάνω στην καλλιεργημένη αυτή επιφάνεια τοποθετούμε δισκία (ή ταινίες

διηθητικού χαρτιού) εμποτισμένα ένα με τον παράγοντας Χ, ένα άλλο δισκίο με τον

παράγοντα V και ένα τρίτο με τους δυο παράγοντες XV. Επωάζεται το τρυβλίο για

24-48 h αεροβίως και διαβάζουμε το αποτέλεσμα.

Το μικρόβιο δεν θα αναπτυχθεί σε όλη την επιφάνεια του τρυβλίου εφόσον

είναι αιμόφιλος αλλά θα αναπτυχθεί γύρω από τα δισκία όπου υπάρχουν οι

παράγοντες από τους οποίους έχει ανάγκη12.

Ο H.influenzae πού έχει ανάγκη και των δυο παραγόντων, θα αναπτυχθε΄θ

μόνο γύρω από το XV δισκίο.

8.4.2 Βιοχημικές δοκιμές

Οι δοκιμές αυτές είναι οι εξής (πίνακες 8.1 και 8.2)

Παραγωγή ινδόλης

Παραγωγή ουρεάσης

111133

Παραγωγή β-γαλακτοσιδάπης (ΐ)ΝΙΗί)

Απόκαρβοξυλίωπη της ορνιθίνης

Παραγωγή προφυρίνης ή χρησιμοποιήσεως του d-ALA.

Για τις δοκιμές αυτές χρειάζεται καθαρό και άφθονο καλλιέργημα.

Παρασκευάζεται πυκνό εναιώρημα αυτού σε λίγης σταγόνες ζωμού μέσα σε

σωληνάριο και από αυτό με πιπέττα Pasteur εμβολιάζονται τα υλικά των παραπάνω

βιοχημικών δοκιμών.

Πίνακας 8.1: Διαχωριστικές ιδιότητες ειδών του γένους Ηaemophilus

Πίνακας 8.2: Βιότυποι του H.influenzae και του H.parainfluenzae

111144

Για τις δοκιμές ινδόλης, ουρίας και ONPG χρησιμοποιούνται τα κοινά

υλικά των δοκιμών αυτών. Για τη δοκιμή αποκαρβοξυλίωσης της ορνιθίνης

μπορούμε να προσθέσουμε Χ και V παράγοντα στο υλικό της συνήθους

δοκιμής αν και παίρνονται θετικές δοκιμές και χωρίς την προσθήκη των

παραγόντων με πολύ πυκνή εναιώρημα. Ειδική υλική για τη δοκιμή αυτή

προσφέρεται στο Εμπόριο.

Δοκιμή παραγωγής πορφυρίνης ή χρησιμοποιήσεως ton d-Al.A Η δοκιμή

παραγωγής προφυρίνης είναι ειδική δοκιμή και γίνεται ως εξής:. Αρχή.

Στελέχη αιμοφίλων που δεν απαιτούν τον Χ παράγοντα για την ανάπτυξη των

μπορούν να χρησιμοποιήσουν το d-ALA (d-Amino Levulinic Acid) μια ουσία

πρόδρομο της προφυρίνης και να συνθέσουν πρωτοπορφυρίνη IX, μια ουσία

που φθορίζει ήταν εκτεθεί σε υπεριώδεις ακτίνες. Στελέχη αιμοφίλων που

απαιτούν τον Χ παράγοντα δεν μπορούν να χρησιμοποιήσουν το d-ALA και

δεν φθορίζουν.

Εκτέλεση. To d-ALA προσφέρεται στο εμπόριο (Sigma Chemicals Co).

Παρασκευάζεται ένα διάλυμα των 2 mΜ με ρυθμιστικά άλατα, διαμοιράζεται

σε σωληνάριο ανά 0,5 ml και φυλάσσεται στην κατάψυξη των -20ο C. Το

ρυθμιστικό διάλυμα είναι 0,1mM Soerensen ρΗ 6,9. Προστίθεται 0.8mΜ

θειικό μαγνήσιο. Σε ένα σωληνάριο με το διάλυμα του ALA ενοφθαλμίζεται

το εξεταζόμενο βακτήριο, επωάζεται για 4-7 ώρες στους 17οC και εξετάζεται

για φθορισμό κάτω από λάμπα Wood φθορισμού. Μπαίνει ένας θετικός

μάρτυς και ένα τυφλό. Αν ο αιμόφιλος που εξετάζουμε είναι Η.parainfluenzae

ή Η.parahacmolyticus θα δώσει θετική την αντίδραση δηλαδή φθορισμό ενώ

αν είναι Η.influenzae ή Η.haemolyticus θα είναι αρνητική. Για τις βιοχημικές

δοκιμές το σύτημα ΑΡΙ είναι το σύστημα επιλογής για την ταυτοποίηση του

στελέχους του H.influenzae.

8.4.3 Οροτυπία του H.influenzae

111155

Η οροτυπία του αιμοφίλου που απομονώσαμε είναι απαραίτητη τόσο γιατί

βοηθά στην αξιολόγηση του σαν παθογόνου ή όχι, όσο και για επιδημιολογικούς

σκοπούς.

Για την οροτυπία χρησιμοποιούνται οι 6 αντι-οροί που προσφέρονται στο

εμπόριο και είναι οι a, b. c, d, e και f. Είναι οροί κουνελιών που ανοσοποιήθηκαν με

τα αντιγόνα ελύτρου του H.influenzae.

Η οροτυπία με τους ορούς αυτούς γίνεται με τους εξής τρόπους:

Συγκόλληση πάνω σε πλάκα

Δοκιμή εξοιδήσεως ελύτρου

Δοκιμή συγκολλήσεως σωματίδων Latex

Δοκιμή ανοσοδιαχύσεως σε άγαρ

Δοκιμή ανοσοηλεκτροφορήσεως αντίθετης φοράς

Ανοσοφθορισμός

Η συγκολλητιναντίδρααη γίνεται πάνω σε αντικειμενοφόρο πλάκα. Παρα-

σκευάζεται πυκνό εναιώρημα νεαρού καλλιεργήματος 6-18 ωρών του εξεταζομένου

αιμοφίλου. Προστίθεται μια σταγόνα αντι-b ορού. Ανακατεύεται η σταγόνα με

οδοντογλυφίδα, ανακινείται και διαβάζεται η εμφάνιση συγκολλήσεως. Αν είναι

αρνητική δοκιμάζονται και οι άλλοι πέντε οροί.

Είναι η απλούστερη μέθοδος οροτυπιας αλλά όχι η πιο ακριβής. Συχνά in

συγκολλήσεις δεν είναι σαφείς, ή είναι πολύ ασθενείς αν δεν έχει αναπτυχθεί καλά το

έλυτρο. Μπορεί να συμβεί και αυτοσυγκόλληση του εναιωρήματος.

Η δοκιμή συγκολλήσεως σωματιδίων Latex είναι και αυτή μια ταχεία μέθοδος.

Τα σωματίδια Latex είναι επικαλυμμένα με αντι-b αντισώματα.

Η δοκιμή ανοσοδιαχύσεως μέσα στο άγαρ γίνεται με ενσωμάτωση του αντι-b

ορού μέσα στο άγαρ Lewinthal. Σε μια περιοχή του υλικού αυτού μπολιάζεται υπό

οροτυπία αιμόφιλος. Αν είναι του b τύπου τότε γύρω από το σημείο της αναπτύξεως

του θα παρατηρηθεί θόλωση του υλικού από την ένωση του αντιγόνου του ελύτρου

τύπου b με τον ορό που βρίσκεται μέσα στο άγαρ. Η μέθοδος έχει το μειονέκτημα ότι

ξοδεύει πολύν ορό αλλά στο ίδιο τρυβλίο μπορεί να μπολιασθούν πολλά στελέχη

αιμιιφίλων.

111166

Η δοκιμή ανοσοηλεκτροφορήσεως αντίθετης φάρας γίνεται σε πλάκα

αγαρόζης όπου από τη μια μεριά μπαίνει στις οπές το καλλιέργημα του αιμόφιλου σε

ζωμό Lewinthal από την άλλη μια σειρά από τους 6 αντι-ορούς καθώς και ο θετικός

μάρτυς και το τυφλό. Μετά την ηλεκτροφορητική όδευση για 30 min διαβάζεται η

παρουσία λευκής γραμμής καθιζήσεως με τον ορό του τύπου στον οποίο ανήκει το

εξεταζόμενο στέλεχος.

Η δοκιμή εξοιδήσεως του ελύτρου γίνεται καλύτερα από το καθαρό

καλλιέργημα με την ίδια τεχνική που γίνεται με το κλινικό δείγμα (ΕΝΥ), όπως

περιγράφεται παραπάνω.

Η δοκιμή επισυγκολλήσεως αταφυλοκόκκου επικαλυφθέντες με αντι-b ορό

(σύτημα Fadebact) γίνεται όπως η Latex. Τα αντιδραστήρια και οι οδηγίες για την

εκτέλεση της δοκιμής προσφέρονται σε kit, όπως και για τους μηνιγγιτιδοκόκκους. Η

μέθοδος εφαρμόζεται άμεσα με ΕΝΥ που έχει Gram αρνητικά βακτηρίδια με

πολυμορφισμό.

8.4.4 Ανίχνευση αντιγόνου του Η.influenzae στο εγκεφαλονωτιαίο υγρό (ΕΝΥ)

Η μέθοδος εκλογής για το σκοπό αυτό είναι η ανοσοηλεκτροφόρηση αντίθετης

φοράς (CIE). Το αντιγόνο είναι το ίδιο το ΕNY του αρρώστου στο οποίο με τη

μικροσκοπική εξέταση βρήκαμε Gram αρνητικά μικρά με ή χωρίς πολυμορφισμό

βακτήρια. Αν το βακτήριο αυτό είναι αιμόφιλος της γρίππης στο ΕΝΥ θα υπάρχει

διαλυμένη ελεύθερη ουσία ελύτρου. Επειδή στις μηνιγγίτιδες ο αιμόφιλος που τις

προκαλεί είναι σχεδόν κατά κανόνα του οροτύπου b ο ορός που θα

χρησιμοποιήσουμε για την εξέταση θα είναι ο αντι-b ορός του Η. influenzae. Θα

προσθέσουμε ένα θετικό μάρτυρα εφόσον έχουμε πρόσφατο καλλιέργημα αιμόφιλου

b-οροτύπου.

Αν το μικρόβιο που είδαμε είναι αιμόφιλος της γρίπης οροτύπου b, μέσα σε 30-

40 min θα έχουμε τη λευκή γραμμή καθιζήσεως στην πλάκα αγαρόζης όπου έγινε η

ηλεκτροφόρηση.

111177

Η ίδια τεχνική εφαρμόζεται και για την οροτυπία του καλλιεργήματος, του

αιμόφιλου που απομονώσαμε.

Αρνητική CIE, δεν σημαίνει ότι το μικρόβιο που είδαμε με τη μικροσκοπική

εξέταση δεν είναι H.Influenzae. Μπορεί να είναι άλλου οροτύπου εκτός του b αλλά

μπορεί να μη απελευθερώθηκε αρκετό ποσό ουσίας ελύτρου για να αντιδράσει σε

αρίστη αναλογία με τον αντι-b ορό που διαχέεται στην πλάκα της ηλεκτροφορήσεως.

Η συνήθως στην πράξη εφαρμοζόμενη μέθοδος είναι η Fadebact

επισυγκολλήσεως Σταφυλόκοκκου.

8.4.5 Ορολογικές εξετάσεις για αντισώματα κατά του αιμόφιλου στο αίμα

Αντισώματα προς το πολυσακχαριδικό αντιγόνο ελύτρου αναπτύσσονται στους

νοσούντες και σ’ αυτούς που μπολιάσθηκαν σε τίτλο αξιολογήσιμο. Είναι

αντισώματα προστατευτικά, διέρχονται τον πλακούντα και προσφέρουν προστασία

στο νεογνό για 3-9 μήνες.

Μέθοδοι ανιχνεύσεως και προσδιορισμού του τίτλου των υπάρχουν πολλοί, και

δοκιμάζονται συνεχώς όλες οι σύγχρονες τεχνικές.

Καλά αποτελέσματα πάρθηκαν με τις εξής μεθόδους:

Μέθοδος συγκολλήσεως σωματιδίων Latex

Μέθοδος παθητικής αιμοσυγκολλήσεως

Μέθοδος μικροβιοκτονίας

Μέθοδος ηλεκτροφορήσεως αντίθετης φοράς

Μέθοδος ραδιοανοσολογική

88..55 ΤΤααυυττοοπποοίίηησσηη ττηηςς NNeeiisssseerriiaa mmeennιιggiittiiddiiss ((ΝΝααϊϊσσσσέέρριιαα μμηηννιιγγγγίίττιιδδααςς ήή

ΜΜηηννιιγγγγιιττιιδδόόκκοοκκκκοοςς))

88..55..11 ΜΜαακκρροοσσκκοοππιικκήή εεξξέέτταασσηη

111188

Ο μηνιγγιτιδόκοκκος θα αναπτυχθεί στα υλικά της γενικής καλλιέργειας

παθολογικού κλινικού υλικού, όπως είναι τοαιματούχο και το σοκολατόχρωμο άγαρ.

Επίσης θα αναπτυχθεί στο ζωμό μετρυπτικάση και σόγια, στο θειογλυκολικό ζωμό

καθώς και στο Lewinthal άγαρ (βρασμένο αιματούχο άγαρ).

Οι αποικίες του μηνιγγιτιδοκόκκου αναγνωρίζονται εύκολα. Είναι μεγάλες,

στρόγγυλες, φουσκωτές με σαφή περιφέρια, ελαφρά γυαλιστερές, σαφώς δε

γκριζωπές. Όταν είναι πολλές λευκάζουν. Κάτω και γύρω από τηναποικία το υλικό

μπορεί να πρασινίζει. Έχουν σ΄συταση μαλακή, κρεμοειδή. Αν παραταθεί η επώαση

οι αποικίες σκληραίνουν και μυξιάζουν.

88..55..22 ΜΜιικκρροοσσκκοοππιικκήή εεξξέέτταασσηη

Κατά τη μικροσκοπική διακρίνουμε τους Gram αρνητικούς διπλοκόκκους

εξωκυττάριους ή και ενδοκυττάριους (εικόνα 8.5). Σε πυκνό παρασκεύασμα μπορεί

να μην αποχρωματισθούν καλά τα μικρόβια και να εμφανισθούν οι μηνιγγιτιδοκόκκοι

σαν Gram θετικοί.

88..55..33 ΒΒιιοοχχηημμιικκέέςς δδοοκκιιμμέέςς

Είναι μικρόβιο που δίνει θετική τη δοκιμή οξειδάσης (εικόνα 8.6) όπως όλες οι

ναϊσσέριες. Είναι καταλάση θετικό. Διασπά τη γλυκόζη και τη μαλτόζη, όχι όμως τη

λακτόζη, τη σουκρόζη και τη φρουκτόζη. Η δοκιμή διασπάσεως σακχάρων γίνεται

όπως περιγράφεται για το γονόκοκκο. Χρησιμοποιούνται κατά προτίμηση τα έτοιμα

αντιδραστήρια του εμπορίου στα οποία μπορεί να διαβασθεί και η αντίδραση DNA-

άσης, την οποία ο μηνιγγιτιδόκοκκος δίνει αρνητική.

88..55..33 ΑΑννααζζήήττηησσηη ααννττιιγγόόννωωνν MMηηννιιγγγγιιττιιδδοοκκόόkkκκωωνν

Γίνεται με διάφορες μεθόδους, και στηρίζεται στην παρουσία του

πολυσακχαοιδικού αντιγόνου του μηνιγγιτιδοκόκκου ατό Κ Ν Υ

111199

Μέθοδος συγκολλήσεως σωματιδίων Latex. Ευαισθητοποιημένα σωματίδια

Latex με αντισώματα προς τα πολυσακχαριδικά αντισώματα μηνιγγιτιδοκόκκων

όταν έλθουν σε επαφή με το ομόλογο αντιγόνο τους συγκολλώνται.

Μέθοδος συγκολλήσεως Σταφυλοκόκκων (Fadebact) ή μέθοδος

επισυγκολλήοεως. Κατ’ αυτήν αντί σωματιδίων Latex ευαισθητοποιούνται

σταφυλόκοκκοι με αντισώματα και συγκολλώνται όταν έλθουν σε επαφή με τα

ομόλογα αντιγόνα. Στο εμπόριο κυκλοφορούν kits που προσφέρουν Latex και

Fadebaci ευαισθητοποιηθέντα με τους αντι-ορούς των πολυσακχαριδίων των

μηνιγγιτιδοκόκκων ομάδων A, C, Υ και W-135 και χωριστά με το της ομάδας Β.

Η δοκιμή γίνεται πάνω σε πλάκα ή σε λακουβάκια. Στο kit υπάρχουν όλα τα

απαιτούμενα και οι γραπτές οδηγίες για την εκτέλεση και την αξιολόγηση του

αποτελέσματος. Σε σύγκριστη με την Gram παρουσιάζουν μερικά

πλεονεκτήματα αλλά δεν την αντικαθιστούν. Δίνουν μικρότερα ποσοστά θετικών

που σημαίνει μεγαλύτερη ειδικότητα αλλά σημειώνονται και περιπτώσεις

ψευδώς θετικών .

Δοκιμή άμεσου ανοσοφθορισμού. Έχει αντικατασταθεί στο νοσοκομειακά

εργαστήρια από το Latex και τη Fadebact.

Ανοσοενζυμική μέθοδος. Προσφέρεται στο εμπόριο kit από Σουηδικό Οίκο σαν

Meningitis ΕΙΑ 10.

Δοκιμή αλυσοδωτής αντίδρασης χολυμεράσης (PCR). Είναι η νεώτερη ταχεία

μέθοδος που μπορεί να ανιχνεύσει την ύπαρξη και ελαχιστότατου κομματιού του

DNA του μηνιγγίτιδα κόκκου στο ΕΝΥ. Στηρίζεται στην ενίσχυση της in vitro

σύνθεσης και πολλαπλασιασμού του υπάρχοντος DNA στο υλικό. Η δοκιμή

γίνεται σε ειδικό όργανο, τον θερμικό ανακυκλωτή, με την εισαγωγή δύο

ολιγονουκλεοτιδίων τον dhps γόνου σαν primers (αφετηρία) και της

θερμοανθεκτικής πολυμεράσης, σε τρεις φάσεις που τελειώνουν σε 3-4 ώρες.

88..55..44 ΤΤααυυττοοπποοίίηησσηη ττηηςς οορροολλοογγιικκήήςς οομμάάδδααςς

112200

Η δοκιμή αυτή γίνεται με τη χρήση ενός πολυδυνάμου και μερικών

μονοδυνάμων ορών κατά του πολυσακχαριδικού αντιγόνου του ελύτρου των. Οι οροί

αυτοί διατίθενται στο εμπόριο.

Η ανιίδραση γίνεται πάνω σε πλάκα ή σε λακουβάκια και είναι

συγκολλητιναντίδραση. Μία σταγόνα πυκνού εναιωρήματος του υπό ομαδοποίηση

μηνιγγιτιδοκόκκου ανακατεύεται με μια σταγόνα πολυδυνάμου ορού κατή των A,C,

Y και W-135 αντιορών και μια άλλη σταγόνα με αντι-Β ορό. Ανακινείται και σε 1min

διαβάζεται το αποτέλεσμα. Ακολουθεί δοκιμή με μονοδύναμους ορούς.

Μέθοδος ανηφόρας για την ορολογική ταυτοποίηση των οροομάδων του

μηνιγγιτιδοκόκκου είναι η δοκιμή ανοσηλεκτροφορήσες αντιθέτου φοράς.

112211

ΚΚεεφφάάλλααιιοο 99οο :: ΜΜέέθθοοδδοοιι εελλέέγγχχοουυ εευυααιισσθθηησσίίααςς ττωωνν μμιικκρροοββίίωωνν σστταα

ααννττιιββιιοοττιικκάά

99..11 ΕΕιισσααγγωωγγήή

Ο έλεγχος της ευαισθησίας των μικροβίων στα αντιβιοτικά είναι από τις πιο

συχνές εξετάσεις που εκτελούνται στα νοσοκομειακά και ιδιωτικά Μικροβιολογικά

εργαστήρια.

Η δοκιμασία αυτή αποτελεί πολύ σημαντική εξέταση για τον καθορισμό της

αντιμικροβιακής αγωγής των ασθενών με λοιμώξεις17 με στόχο:

Τη σωστή θεραπευτική των λοιμώξεων χρησιμοποιώντας το καλύτερο

διαθέσιμο για την κάθε περίπτωση αντιβιοτικό, στη σωστή δόση και διάρκεια

θεραπείας, με μειωμένη επίπτωση ανεπιθύμητων ενεργειών και τοξικότητας

Την αποφυγή της επικράτησης ανθεκτικών στελεχών μικροβίων ή την μείωση

των ήδη επικρατούντων τόσο στην κοινότητα όσο και στο νοσοκομειακό

περιβάλλον και

Την «ιδανική» προσφορά υπηρεσιών υγείας με λογικό κόστος.

Αν και θεωρείται – ίσως εσφαλμένα – απλή εξέταση, η εκτέλεση της και ακόμη

περισσότερο η ερμηνεία των αποτελεσμάτων της υπόκεινται συχνά σε σφάλματα που

οδηγούν συνήθως σε θεραπευτικές αποτυχίες.

99..22 ΜΜέέθθοοδδοοιι εελλέέγγχχοουυ εευυααιισσθθηησσίίααςς σστταα ααννττιιββιιοοττιικκάά

99..22..11 ΜΜέέθθοοδδοοςς δδιιααχχύύσσεεωωςς σσττοο άάγγααρρ ααππόό δδιισσκκίίαα χχααρρττιιοούύ εεμμπποοττιισσμμέένναα μμεε

ααννττιιββιιοοττιικκάά ((ΜΜέέθθοοδδοοςς KKIIRRBBYY –– BBAAUUEERR ήή ααννττιιββιιόόγγρρααμμμμαα))

112222

Είναι η μέθοδος εκλογής για την δοκιμή ευαισθησίας των αερόβιων και ταχείας

αναπτύξεως, μη απαιτητικών μικροβίων. Με αυτή διαχωρίζονται τα μικρόβια σε

ευαίσθητα, μέτρια ευαίσθητα και ανθεκτικά. Δεν εφαρμόζεται σε μικρόβια

διατροφικά απαιτητικά, όπως οι αιμόφιλοι και οι ναϊσσέριες, σε αναερόβια, σε ειδικές

ομάδες μικροβίων με διαφορετική χημική δομή των επιφανειακών τους στοιχείων,

όπως στα μυκοβακτηρίδια βραδείας αναπτύξεως και άλλα παρεμφερή.

Αρχή: Είναι μέθοδος διαχύσεως του αντιβιοτικού σε στερεό υλικό από δισκία

διηθητικού χαρτιού εμποτισμένα με αντιβιοτικά. Η μέθοδος είναι προτυποποιημένη.

Αυτό σημαίνει πως αν τηρηθούν όλες οι τεχνικές οδηγίες, τότε το μέγεθος της

διαμέτρου αναστολής αναπτύξεως του μικροβίου που σχηματίζεται γύρω από το

δισκίο είναι ανάλογο με την MIC του αντιβιοτικού ( η μικρότερη συγκέντρωση του

αντιβιοτικού που αναστέλλει μακροσκοπικά την ανάπτυξη του βακτηρίου).

Εκτέλεση: Παρασκευή του ενοφθαλμίσματος. Από καθαρό καλλιέργημα του

υπό εξέταση μικροβίου σε άγαρ, λαμβάνονται 4-5 αποικίες με κρίκο και

εναιωρούνται σε 4-5ml. Κατάλληλα για την ανάπτυξη του μικροβίου ζωμού 12. Το

εναιώρημα επωάζεται στους 35ο C μερικές ώρες ώστε να αρχίσει ο πολλαπλασιασμός

του και να θολώσει ο ζωμός. Η θολερότητα του εναιωρήματος των μικροβίων πρέπει

να ισοδυναμεί με 0,5 της θολομετρικής κλίμακας McFarland και ρυθμίζεται με

αραίωση με αποστειρωμένο ισότονο διάλυμα Nacl ή με ζωμό ή με νέο εναιώρημα του

ίδιου μικροβίου12. Το εναιώρημα πρέπει να προέρχεται από 24h καλλιέργημα των

μικροβίων, γιατί σε μεγαλύτερο διάστημα επώασης συμβάλλουν στη θολερότητα και

μη ζωντανά μικροβιακά κύτταρα. Η χρήση θολωσιμέτρων για καθαρισμό της

θολερότητας προσφέρει μεγαλύτερη ακρίβεια και επαναληψιμότητα στα

αποτελέσματα του ελέγχου ευαισθησίας έναντι της οπτικής σύγκρισης με τα πρότυπα

διαλύματα θολερότητας.

Σπορά: Το θρεπτικό υλικό είναι το Muller-Hinton (MH) άγαρ, σε τρυβλίο.

Στυλεός βαμβακοφόρος (μη τοξικό βαμβάκι) βυθίζεται στο μικροβιακό εναιώρημα,

αποστραγγίζεται το βύσμα με πιέσεις στις παρειές του σωληναρίου και επιστρώνεται

σε όλη την επιφάνεια του τρυβλίου12. Η σπορά αυτή πρέπει να γίνει αμέσως μετά την

Παρασκευή του μικροβιακού εναιωρήματος, διότι η θολερότητα του αυξάνει με το

χρόνο, λόγω πολλαπλασιασμού των μικροβίων17. Σκεπάζεται το κάλυμμα του

τρυβλίου και αφήνεται στο μπάγκο για 3-5min για να στεγνώσει η επιφάνεια του.

112233

Τοποθέτηση δισκίων: Δισκία εμποτισμένα με τα αντιβιοτικά τοποθετούνται

ένα – ένα με λαβίδα ή με μικροσυσκευή πολλαπλών δισκίων, πάνω στην επιφάνεια

του άγρα. Πιέζουμε ελαφρά τα δισκία για να κολλήσουν στο άγαρ, αναστρέφουμε τα

τρυβλία και τα βάζουμε για 18-24h επώαση στους 35ο C12. Η συντήρηση των

αντιβιοτικών πρέπει να γίνεται με σχολαστικότητα. Ειδικά τα β-λακταμικά

αντιβιοτικά πρέπει να διατηρούνται σε κατάψυξη, αλλά πριν από τη χρήση πρέπει

υποχρεωτικά να έρχονται σε θερμοκρασία δωματίου.

Ανάγνωση: Μετριούνται οι διάμετροι των ζωνών αναστολής αναπτύξεως γύρω

από κάθε δισκίο (συμπεριλαμβανομένου και του δισκίου) με την πιο δυνατή ακρίβεια,

με διαβήτη, κανόνα ή ειδικό όργανο, με γυμνό μάτι από την πίσω πλευρά του

κλειστού τρυβλίου τοποθετημένου σε σκούρα επιφάνεια12. από την έκταση της ζώνης

γίνεται ο χαρακτηρισμός του μικροβίου σαν ευαίσθητο, μέτρια ευαίσθητο ή

ανθεκτικό βάσει προκατασκευασμένων πινάκων. Στον πίνακα 9.1 αναγράφεται η

έκταση των ζωνών αναστολής που αναμένεται να έχουν τα ταχείας αναπτύξεως μη

απαιτητικά μικρόβια, βάσει της οποίας θα χαρακτηρισθούν αυτά σαν ευαίσθητα,

μέτρια ευαίσθητα ή ανθεκτικά.

Πίνακας 9.1: Ζώνες αναστολής και τιμές της MIC αντιβιοτικών που χαρακτηρίζουν την αντιμικροβιακή δράση αυτών έναντι των συνήθων αεροβίων μικροβίων (εκτός αιμοφίλου και ναϊσσερίων)

112244

Ταυτόχρονα αναγράφονται και οι τιμές των MIC που αντιστοιχούν στις

διάφορες ζώνες αναστολής. Η διπλή ζώνη αναστολής, παρότι σπάνια εμφανίζεται,

μπορεί να οφείλεται:

Σε επιμόλυνση από δεύτερο μικρόβιο, οπότε ο έλεγχος ευαισθησίας πρέπει να

επαναλαμβάνεται ή

Σε παρουσία διπλού πληθυσμού μικροβίων (η εσωτερική ζώνη αντιστοιχεί στα

πιο ανθεκτικά μικρόβια)

Γενικά συνιστάται να λαμβάνεται υπόψη η εσωτερική ζώνη αναστολής. Η

διπλή ζώνη αναστολής πρέπει να αγνοείται σε παρουσία ερπυσμού ορισμένων

μικροβίων (πχ Proteus spp)17. Στο εμπόριο φέρονται έτοιμα τρυβλία με το ΜΗ υλικό

με θέσεις για 8 δισκία αντιβιοτικών με διαγραφήσεις των αναμενόμενων ζωνών

αναστολής των χαρακτηριστικών για κάθε ένα από τα αντιβιοτικά. Βοηθά πολύ στην

ανάγνωση της διαμέτρου των ζωνών αυτών που δεν είναι πολύ εύκολη.

Μέθοδοι ελέγχου ποιότητας πρέπει να εφαρμόζονται σε όλα τα στάδια της

διαδικασίας.

Μέθοδοι ελέγχου ποιότητας, πρέπει να εφαρμόζονται σε όλα τα στάδια της

διαδικασίας του ελέγχου ευαισθησίας. Όμως τη μεγαλύτερη σημασία έχει ο τακτικός

έλεγχος ευαισθησίας προτύπων στελεχών μικροβίων (τουλάχιστον ανά εβδομάδα και

σε κάθε αλλαγή παρτίδας αντιβιοτικών), για εξακρίβωση της δραστικότητας των

αντιβιοτικών.

Αυτό γίνεται γιατί τα αντιβιοτικά μπορεί να εμφανίζουν μειωμένη

δραστικότητα, παρά τη σωστή φύλαξη τους και τη χρήση τους πριν την ημερομηνία

λήξης, για διάφορους άλλους συνήθως τεχνικούς λόγους (πίνακας 9.2).

Όταν υπάρχουν ισχυρές ενδείξεις ότι αιμοκαλλιέργειες ή καλλιέργειες

εγκεφαλονωτιαίου υγρού είναι θετικές, π.χ. όταν η χρώση κατά Gram είναι θετική,

τότε η απάντηση του αντιβιογράμματος μπορεί να επιταχυνθεί με την εκτέλεση

άμεσης ευαισθησίας. Το μικροβιακό εναιώρημα γίνεται αραιώνοντας κατ' ευθείαν το

κλινικό υλικό (ούρα - ΕΝΥ - θολό υπερκείμενο ζωμών αιμοκαλλιέργειας μετά

φυγοκέντρηση) σε ζωμό με ρύθμιση κατά προσέγγιση της θολερότητας σε 0,5 της

112255

κλίμακας Mc Farland. Όμως ο έλεγχος της ευαισθησίας του μικροβίου πρέπει να

επαναλαμβάνεται σε δεύτερο χρόνο με την κλασική μέθοδο, μετά την ανάπτυξη του

μικροβίου.

Πίνακας 9.2: Τα όρια των διαμέτρων ζωνών αναστολής για τη ρύθμιση του ποιοτικού ελέγχου για τη δοκιμή ευαισθησίας στο Mueller-Hinton υλικό χωρίς αίμα ή άλλες ουσίες που προτείνονται από την NCCLS

112266

Πίνακας 9.2 (συνέχεια)

112277

99..22..22 ΠΠρροοσσδδιιοορριισσμμόόςς εελλάάχχιισσττηηςς αανναασσττααλλττιικκήήςς σσυυγγκκεεννττρρώώσσεεωωςς ήή MMIICC ((MMiinniimmaall

IInnhhiibbiittoorryy CCoonncceennttrraattiioonn))..

Η μέθοδος αυτή είναι πιο ειδική από το αντιβιόγραμμα κατά Kirby-Bauer, διότι

δείχνει όχι μόνο σε ποια αντιβιοτικά είναι ευαίσθητο το μικρόβιο που απομονώθηκε,

αλλά και την ελάχιστη ποσότητα του αντιβιοτικού που αναστέλλει την ανάπτυξη του

μικροβίου αυτού. Προσφέρει λοιπόν, πολύ σημαντικές πληροφορίες στον κλινικό

γιατρό, σχετικά με τη δόση του αντιβιοτικού που θα χορηγηθεί στον ασθενή για τη

θεραπεία της νόσου15.

Αρχή: Σε σειρά διαδοχικών αραιώσεων του αντιβιοτικού προστίθεται

προτυπωμένο (γνωστής περιεκτικότητας σε Cf u/ml) εναιώρημα του υπό εξέταση

μικροβίου. Η τελευταία αραίωση του αντιβιοτικού που ακόμη αναστέλλει την

ανάπτυξη του μικροβίου δείχνει την MIC12. Υπάρχει η μακρομέθοδος που είναι

παλαιότερη, εκτελείται σε σωληνάρια με Παρασκευή διαδοχικών αραιώσεων του

αντιβιοτικού και η νεότερη μικρομέθοδος, που έχει αντικαταστήσει πλέον την

μακρομέθοδο, που εκτελείται σε ειδικές πλάκες μικροτιτλοποίησης.

Τεχνική μικρομεθόδου: Οι αραιώσεις των αντιβιοτικών προσφέρονται έτοιμες

σε πλαστικές πλάκες μικροτιτλοποιήσεων για Gram θετικά και Gram αρνητικά

μικρόβια. Σε κάθε σειρά βυθισμάτων υπάρχουν φθίνουσες αραιώσεις ενός

αντιβιοτικού, έτσι σε μια πλάκα υπάρχουν 4,5,6 ή 8 διαφορετικά αντιβιοτικά. Το

ενοφθάλμισμα παρασκευάζεται με εναιώρημα 4-5 αποικιών 18-24h καλλιεργήματος

σε ζωμό Muller-Hinton και ρυθμίζεται η θολερότητα έτσι που να αντιστοιχεί στην 0,5

θολερότητα της κλίμακας McFarland.

Η σπορά του ενοφθαλμίσματος στα βυθίσματα με τις αραιώσεις των

αντιβιοτικών θα γίνει είτε χειρονακτικά με αυτόματη πιπέτα σε όγκους 0,05-0,1ml ή

με ειδικό κατανεμητή.

Κατά την επώαση (35οC για 16-20h) επειδή χρησιμοποιούνται μικροί όγκοι,

φροντίζουμε να μην εξατμισθούν τα εναιωρήματα κλείνοντας με διάφανη ταινία κάθε

πλάκα ή πακετάροντας (μέχρι πέντε) τις πλάκες και τελειώνουμε με κενή πλάκα ή

κλείνουμε πάλι με διάφανη ταινία την τελευταία.

112288

Μπαίνουν μάρτυρες: Μάρτυρας αναπτύξεως: Ένα βύθισμα με μικροβιακό

ενοφθάλμισμα χωρίς αντιβιοτικό και ένας Μάρτυρας στειρότητας: ένα βύθισμα

μόνο με τον ζωμο.

Ανάγνωση: Παρατηρούνται με καθρέπτη (βλέπουμε τους πυθμένες των

βυθισμάτων) ή φακό τα βυθίσματα. Ανάπτυξη μικροβίου υπάρχει στα βοθρία που

είναι θολά ή έχουν «κομβίο» από μικρόβια στον πυθμένα. Έτσι καταγράφεται η

ελάχιστη συγκέντρωση αντιβιοτικού που δεν παρατηρείται ανάπτυξη (MIC)

(πίνακας 9.3).

99..33 ΕΕtteesstt

To Etest, αποτελεί τη νεότερη από τις τεχνικές μελέτης αντοχής των μικροβίων

στα αντιβιοτικά. Συνδυάζει ουσιαστικά την κλασική μέθοδο του αντιβιογράμματος

κατά Kirby - Bauer και την MC.

To Etest αποτελείται από ένα λεπτό, πλαστικά strip, το οποίο περιέχει ένα

αντιβιοτικό, σε πάρα πολλές υποδιπλάσιες αραιώσεις. Η όλη διαδικασία της τεχνικής

αυτής αναγράφεται κατωτέρω:

Λαμβάνεται η ύποπτη αποικία με τη βοήθεια αποστειρωμένου

βαμβακοφόρου στυλεού και εισάγεται σε σωληνάριο που περιέχει

εμπλουτιστικό ζωμό Muller-Hinton. Με τον τρόπο αυτό παρασκευάζετε το

μικροβιακό εναιώρημα.

Μια ποσότητα του μικροβιακού εναιωρήματος ενοφθαλμίζεται, στο Muller-

Hinton άγαρ, με τη βοήθεια του στυλεού αυτού, και στρώνεται σε όλο το

τρυβλίο, όπως και κατά την εκτέλεση του κλασικού αντιβιογράμματος.

Στο ενοφθαλμισμένο πλέον Muller-Hinton άγαρ, προστίθεται ένα ή

περισσότερα strips, ανάλογα με τα αντιβιοτικά στα οποία ελέγχεται η

ευαισθησία του μικροβίου. Το πλαστικό strip τοποθετείται στην επιφάνεια του

θρεπτικού υλικού με ιδιαίτερη προσοχή, με τη βοήθεια μιας λαβίδας.

112299

Πίνακας 9.3: Παραδείγματα ελάχιστης ανασταλτικής πυκνότητας (μg/ml)

113300

Τελικά, το τρυβλίο επωάζεται στον επωαστικό κλίβανο για 24 ώρες

ανεστραμμένο και την επόμενη ημέρα αξιολογείται το αποτέλεσμα.

Αξιολόγηση αποτελέσματος: Η ανάγνωση του αποτελέσματος γίνεται μετά την 24h

επώαση, όπου αξιολογείται η διαυγής ζώνη που δημιουργείται γύρω από το strip. To

σημείο όπου τελειώνει η διαυγής ζώνη δείχνει την ελάχιστη συγκέντρωση του

αντιβιοτικού (MIC), η οποία αναστέλλει τη δράση του μικροβίου. Πάνω στο strip

αναγράφονται όλες οι υποδιπλάσιες αραιώσεις του αντιβιοτικού και έτσι είναι εύκολο

να βρεθεί η ελάχιστη ανασταλτική συγκέντρωση του. Ιδιαίτερη προσοχή χρειάζεται

στις περιπτώσεις εκείνες που εμφανίζονται αποικίες στην ζώνη αναστολής. Σε αυτές

τις περιπτώσεις το μικρόβιο θεωρείται ανθεκτικό. Μετά την ανάγνωση αναγράφεται

στην απάντηση η ελάχιστη ανασταλτική συγκέντρωση του αντιβιοτικού για το

συγκεκριμένο μικρόβιο.

Τα τελευταία χρόνια το Etest, χρησιμοποιείται συχνά για τον έλεγχο της MIC

σε πολλά αντιβιοτικά, με πολύ καλά

αποτελέσματα, αλλά με το μειονέκτημα του

μεγάλου κόστους. Προσοχή χρειάζεται κατά την

ανάγνωση της ευαισθησίας των μικροβίων, όταν

δημιουργείται το φαινόμενο "dip effect", κατά το

οποίο φαινομενικά η αναστολή ανάπτυξης του

μικροβίου επεκτείνεται παράλληλα και πολύ

κοντά στην ταινία ευαισθησίας προς τις

χαμηλότερες συγκεντρώσεις (σημείο Ζ της

εικόνας 9.1), μετά το προφανές σημείο τομής

του πραγματικού κύκλου αναστολής με την

ταινία (σημείο Χ), όπου αντιστοιχεί η MIC. Η

επέκταση αυτή πρέπει να αγνοείται. Το

φαινόμενο εμφανίζεται συχνότερα κατά τον

έλεγχο πνευμονία κόκκων, εντεροκόκκων και

σταφυλοκόκκων.

Εικόνα 9.1:Το φαινόμενο

«dip effect» κατά την εκτέλεση του E-test)

113311

99..44 ΓΓρρήήγγοορρηη δδοοκκιιμμήή εελλέέγγχχοουυ ττηηςς ααννττιιμμιικκρροοββιιαακκήήςς εευυααιισσθθηησσίίααςς ––

ππααρρααγγωωγγήή ββ--λλαακκττααμμάάσσηηςς

Εκτός των κλασσικών μεθόδων ελέγχου ευαισθησίας των μικροβίων, πολύ

χρήσιμος φαίνεται να είναι ο έλεγχος παραγωγής β-λακταμασών με τη μέθοδο

χρωμογόνου κεφαλοσπορίνης πχ νιτροσεφίνης. Είναι μέθοδος απλή, γρήγορη και

ακριβής για ορισμένα μικρόβια πχ για ναϊσσέριες, αιμοφίλους και εντεροκόκκους και

πρέπει να είναι διαθέσιμη σε όλα τα εργαστήρια. Είναι ιδιαίτερα χρήσιμη σε σοβαρές

λοιμώξεις όπου απαιτείται άμεση έναρξη εμπειρικής χημειοθεραπέιας.

Στηρίζεται στην αλλαγή του ph από τη διάσπαση του δακτυλίου της β-

λακτάμης κάποιου β-λακταμικού αντιβιοτικού από τη δράση της β-λακταμάσης του

μικροβίου και παραγωγή πενικιλλοϊκού οξέος.

Φέρεται στο εμπόριο σε κίτρινα δισκία χαρτιού. Μια κρικιά του

καλλιεργήματος επαλείφεται στο δισκίο. Αυτό τοποθετείται μέσα σε τρυβλίο κλειστό

(για να εμποδιστεί η ταχεία εξάτμιση). Μέσα σε 30sec έως 15min αλλάζει το χρώμα.

Το δισκίο από κίτρινο γίνεται κόκκινο αν το μικρόβιο παράγει β-λακταμάση.

113322

ΒΒΙΙΒΒΛΛΙΙΟΟΓΓΡΡΑΑΦΦΙΙΑΑ

1. Patrick R. Murray, Ellen JO baron, James H Jorgensen et.al. Manual of clinical

microbiology. – Washington DC:ASM PRESS

2. Encyclopedia of microbiology. – Academic Press

3. Ν.Μ.Καποτάς.. Πρακτική άσκηση στην ιατρική μικροβιολογία . - Αθήνα, 1997

4. James Barrett. Βασικές αρχές Μικροβιολογίας και Ανοσολογίας , (Μετάφραση,

Α. Ν. Μανιάτης), Επιστημονικές εκδόσεις Παρισιάνου, Αθηνα, 2002.

5. Journal of Clinical Microbiology, 2003

6. Αντωνιάδης Α., Λεγάκης Ν., Τσελεντής Ι. Ιατρική μικροβιολογία. - 2ος τόμ. -

Αθήνα: Πασχαλίδης

7. Carl E. Speicher, M.D. Η κατάλληλη διαγνωστική δοκιμασία: Οδηγός

εργαστηριακής ιατρικής. – 2η εκδ. - Αθήνα: Ζεβελεκάκης, 2000

8. Γ.Β.Χριστάκης, Ν.Ι.Λεγάκης. Κλινική μικροβιολογία & Λοιμώξεις. -

Αθήνα:Παρισιάνου ΑΕ, 2002

9. www.poc-services.co.uk /PDA/strep-a.htm

10. Connie R.Mahon, George Manuselis. Textbook of Diagnostic Microbiology

11. Κολιαης Σ. Πρακτική μικροβιολογία. – University studio press

12. Αρσένη Α. Κλινική μικροβιολογία και εργαστηριακή διάγνωση λοιμώξεων. –

Αθήνα: Ζήτα

13.http://gsbs.utmb.edu/microbook/ch013.htm

14. Ανευβαλής Ε. Κλινική Λοιμωξιολογία. – Αθήνα:Λίτσας

113333

15. Κρικέλης Β. Σημειώσεις Ιατρικής Μικροβιολογίας

16. http://serologyonline.tripod.com/idd.html

17. Εφαρμοσμένη κλινική μικορβιολογία και εργαστηριακή διαγνωστική. – 1998

Περίοδος Β΄, 3(4)

18. Ιατρική του σήμερα 2000 27 (1)

19. Περόγαμβρος Η.Π., Λεγάκης Ν.Ι. Μέθοδοι χρήσιμες στην αντιμικροβιακή

χημειοθεραπεία.