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CÁTEDRA DE BIOLOGÍA

Apunte Teórico:

MICROSCOPÍA

2007

Dra. Ofelia Naab

Ing. Agr. Carmen Torroba Lic. Valeria Caramuti

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MICROSCOPIO ÓPTICO COMPUESTO Un microscopio óptico es un instrumento que consiste básicamente en un tubo con lentes de aumento en ambos extremos. El objeto a observar es atravesado con luz visible, que es refractada por las lentes del microscopio y así se amplifica la imagen.

Permite visualizar estructuras pequeñas, cuyas dimensiones son inferiores al límite del poder de resolución del ojo humano. Un microscopio óptico tiene dos características fundamentales:

1. la amplificación (aumento) 2. el poder de resolución, que a su vez depende de:

a. la calidad de las lentes b. la longitud de onda de la luz que ilumina

Poder de resolución es la capacidad de separar dos puntos muy próximos y dar

de ellos imágenes claras y definidas. El del ojo humano es de 100µm y el de un microscopio óptico es de 0.24µm. En los microscopios ópticos el material biológico a examinar se observa por transparencia, significa que la luz debe atravesar los tejidos para formar imágenes. La consecuencia de esto es que se hace necesario estudiar:

- células aplanadas sobre la superficie de un vidrio o, - finos cortes de tejidos suficientemente delgados como para ser atravesados

por radiación luminosa. La gran mayoría de los componentes celulares no tienen color debido al gran contenido de agua. Esto plantea la necesidad del uso de colorantes selectivos, los cuales presentan a la vez la dificultad de matar a las células, ya que previamente los tejidos deben ser fijados, deshidratados, incluidos en un material endurecible y cortados.

Un microscopio óptico consta de una parte mecánica, una parte óptica y un sistema de iluminación:

1) Parte mecánica: Consta del pie, la columna o brazo, la platina, el tubo y los tornillos macrométrico y micrométrico. − El pie se encuentra en la base, suele tener forma de herradura y en él descansa el

resto del microscopio. − La columna o brazo, ubicada sobre el pie, sirve de soporte a los demás accesorios y

debe tomarse de la misma cuando se desea trasladar el microscopio. − La platina, ubicada en la parte media, de forma cuadrada o rectangular, soporta la

preparación y presenta un orificio en el centro que permite el paso de la luz; una pinza de sujeción para el preparado y sobrepuesta a ella una platina mecánica que permite mover la preparación a voluntad en dos direcciones (llamadas Norte-Sur y Este-Oeste), mediante el movimiento de tornillos ortogonales ubicados sobre la platina o pendientes de ella. Estos tornillos pueden funcionar independientemente o ser de comando coaxial (estar sobre el mismo eje). La mayor parte de las platinas presentan una escala y un nonio que facilitan la señalización de posiciones

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determinadas en la preparación. La escala presenta líneas marcadas a un milímetro de distancia. El nonio es una escala corta que presenta 10 líneas divisorias que se corresponden con 9 divisiones de la escala principal.

− El tubo sostiene al sistema óptico. En su parte superior se ubican las lentes oculares que pueden ser una (en los microscopios monoculares) o dos (en los microscopios binoculares). En su extremo inferior se ubica el revólver, que es una placa giratoria que sostiene las lentes objetivos de distintos aumentos que pueden cambiarse al girar el revólver.

− Los tornillos macrométrico y micrométrico se utilizan para efectuar el enfoque movilizando el tubo o la platina según el tipo de microscopio. El primero efectúa un ajuste rápido y grosero, y el segundo realiza un ajuste lento y preciso. Ambos tornillos pueden estar separados o bien ser coaxiales (dispuestos sobre un mismo eje).

2) Parte óptica: Consta de las lentes oculares, los objetivos y el condensador. - Objetivos:

Cada objetivo consiste en un conjunto de lentes que en realidad cumplen la función de una sola. Este sistema sirve para corregir errores de observación que derivarían del uso de una sola lente.

En los microscopios modernos es común que los objetivos sean parafocales, es decir, que si se encuentra enfocado uno de ellos, al girar el revólver y cambiar por otro objetivo, éste resulta prácticamente enfocado, siendo suficiente sólo una ligera corrección con el micrométrico para lograr el enfoque perfecto.

En cada objetivo se pueden observar una serie de numeraciones grabadas que indican:

a. Aumento b. Abertura numérica c. Espesor del cubreobjetos a utilizar,

en mm.

a. Aumento: puede ser variable (4X, 16X, 20X, 25X, 40X, 45X, 60X, 95X, 100X, éstos dos últimos se utilizan como objetivos de inmersión). Respecto del aumento hay que diferenciar: 1) Aumento primario : es el dado por el objetivo en sí. 2) Aumento total: es el que se obtiene multiplicando el aumento del ocular por el

del objetivo. Nos dice cuántas veces está amplificada la imagen que obtenemos del material examinado.

3) Aumento útil: es el aumento total del microscopio cuando no excede de cierta cantidad condicionada por la abertura numérica del objetivo. Significa que si el aumento total supera el aumento útil la imagen obtenida es muy grande, pero borrosa, sin definición. En los objetivos de tipo acromático el mayor aumento útil posible es de mil veces la abertura numérica (A.N. * 1.000), mientras que en

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los objetivos más perfeccionados, como los apocromáticos o los de fluorita, el límite de aumento útil es de 1. 500 veces la abertura numérica (A.N. * 1.500).

b. Abertura Numérica (AN) : cada objetivo tiene un determinado poder de resolución que se mide en términos de abertura numérica del objetivo. Cuando un objeto es iluminado, la luz emerge de él formando un cono que penetra en la lente frontal de un objetivo. Se lo denomina ángulo de abertura; y a la mitad de este ángulo de abertura se lo llama ángulo x. El medio en el que el objetivo trabaja (aire, aceite o agua) tiene un índice de refracción determinado al que designamos como N. La abertura numérica se determina entonces del siguiente modo:

A.N. (abertura numérica) = seno de x * N

Ángulo de abertura y abertura numérica

La abertura numérica determina las siguientes características ópticas:

1. Resolución: es la capacidad que posee un objetivo para separar dos puntos muy próximos entre sí.

2. Límite de resolución: es la mínima distancia en que dos puntos próximos se ven como separados.

Por lo tanto:

a menor límite de resolución, mayor poder resolutivo

El límite de resolución se calcula del siguiente modo:

L (límite de resolución): ..

*61.0

NA

λ

0.61 = constante λ = longitud de onda de la luz incidente A.N. = abertura numérica Si se pretende poder observar estructuras muy pequeñas se requiere el menor límite de resolución posible. Deduciendo de la fórmula esto se consigue a mayor abertura numérica y a menor longitud de onda de la luz incidente. - Oculares: Es un sistema de lentes que aumenta la imagen producida en el objetivo, aumento que está grabado en la parte superior (4X, 5X, 6X, 8X, 10X, 15X y 20X, siendo los más comúnmente usados los de 6X y 10X).

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- Condensador: Es el tercer elemento de la parte óptica, constituido por una lente que concentra los rayos de luz iluminando la preparación en la parte enfocada por el objetivo, de modo que el campo visual presente una iluminación uniforme. Además proporciona al objetivo un cono de luz adecuado en tamaño y naturaleza, para obtener óptimos resultados en la observación. El condensador presenta hacia uno o ambos lados un tornillo para subirlo o bajarlo según las necesidades. Además presenta un diafragma semejante al de una cámara fotográfica que deja penetrar sólo los rayos útiles y elimina los laterales que generalmente molestan. Antes de enfocar, el diafragma debe estar completamente abierto, graduándose a continuación su abertura según los aumentos del objetivo. Con altos aumentos el diafragma debe estar más abierto que con los bajos aumentos. 3) Sistema de iluminación: Los microscopios más antiguos presentan como sistema de iluminación un espejo con una cara plana y la otra cóncava. Este espejo recibe los rayos luminosos de una fuente natural o artificial y los envía hacia la parte óptica. Siempre que se use el condensador, el espejo debe enfocarse en su cara plana ya que la cara cóncava acentúa demasiado la convergencia de los rayos, cosa que ya cumple el condensador. Actualmente los microscopios presentan un sistema de iluminación incorporada con una bombilla de bajo voltaje y de intensidad regulable con un transformador. Tipos de observación: Según la forma de iluminación una observación con un sistema óptico de aumento puede ser:

a. Por reflexión: se realiza cuando la iluminación se hace desde arriba del objeto. Se utilizan pocos aumentos y el microscopio con el que se efectúa se denomina estereoscópico o lupa.

b. Por refracción o transparencia: se realizan con luz transmitida desde abajo. Para ello los objetos a ver deben ser lo suficientemente transparentes. Este es el caso del microscopio óptico.

Por otro lado, una observación también puede ser seca o por inmersión: Observación seca: se realiza sin colocar líquido alguno entre el cubreobjetos del preparado y el objetivo. Observación por inmersión: en ella se coloca entre el cubreobjetos y el objetivo una gota de aceite de inmersión (con índice de refracción de 1.5, que es el del vidrio) que mejora la imagen por aumento de la abertura numérica. De este modo, todos los medios atravesados por la luz tienen un mismo índice de refracción. La imagen obtenida es más luminosa y más clara. Para hacer inmersión se utiliza el objetivo de mayor aumento (95X o 100X).

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Técnica de la inmersión: Consiste en colocar una gota de aceite de inmersión entre el cubreobjetos y la lente frontal del objetivo de máximo aumento. Para ello, teniendo ya enfocado el objeto en un aumento menor, se gira levemente el revólver, se coloca una pequeña gota de aceite sobre el cubreobjetos, luego se sigue girando hasta enfocar el objetivo de mayor aumento y se procede al ajuste con tornillo micrométrico. Terminada la observación se eleva el tubo o se baja la platina y se limpia el objetivo con papel de seda o género suave que puede estar humedecido en un detergente especial para lentes. Nunca debe utilizarse para limpiar la lente alcohol ni xilol, ya que éstos deterioran el cemento que aglutina las lentes. Dada la reducida distancia de trabajo que existe cuando se utilizan objetivos de 40X a 100X (que llega a ser tan sólo 0.12 mm) puede suceder que la lente frontal tome contacto con el cubreobjetos con lo cual dicha lente puede rayarse o desplazarse hacia atrás. Por ello es necesario evitar todo contacto entre el objetivo y el cubreobjetos. Para evitar estos peligros en la actualidad estos objetivos cuentan con un muelle protector situado en el interior del tubo del objetivo. Sin embargo se debe tener precaución pues los microscopios antiguos no presentan este mecanismo de seguridad.

MANEJO DEL MICROSCOPIO Procedimiento 1. Levantar el tubo o bajar la platina. 2. Colocar la preparación microscópica en la platina. 3. Colocar el objetivo de rastreo (menor aumento). 4. Bajar el tubo (o subir la platina), observando por el costado, (no por el ocular), hasta

hacer tope o bien hasta que la lente frontal del objetivo se encuentre más o menos a 1 mm del cubreobjeto.

5. Regular la iluminación: a. Colocar la lámpara a unos 25 cm. b. Usar el espejo plano y centrarlo mirando por el tubo hasta que el campo

quede uniformemente iluminado. c. Abrir completamente el diafragma. d. Subir del todo el condensador.

6. Centrar el objeto debajo del objetivo mirando por el costado. 7. Levantar el tubo con el tornillo macrométrico hasta lograr una observación lo más

nítida posible, posteriormente ajustar la misma con el tornillo micrométrico. 8. Ajustar la iluminación:

a. bajando levemente el condensador. b. cerrando el diafragma lo necesario.

9. Buscar el mejor lugar para observar (bordes). 10. Cambiar de objetivo, sin levantar el tubo, hasta obtener el aumento deseado.

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Recomendaciones para el uso del microscopio óptico 1. Comience siempre las observaciones con el objetivo de menor aumento. Esto le dará

una visión integral del preparado y le permitirá seleccionar las mejores áreas o las de especial interés, que luego observará con mayores aumentos.

2. La iluminación debe ser homogénea y de buena intensidad, pero no excesiva y deberá modificarla de acuerdo con el objetivo que está utilizando.

3. Nunca acerque el objetivo al preparado si no está mirando por el costado del microscopio. Así evitará la destrucción de muestras y lentes.

4. Siempre que haga una observación, ajuste el enfoque con el tornillo micrométrico, aun cuando ya haya sido enfocado por otra persona previamente (es usual que existan diferencias de enfoque entre un observador y otro).

5. Recuerde que el microscopio óptico otorga imágenes invertidas del objeto, por lo tanto el movimiento que realice de la platina será inverso al corrimiento de la imagen.

6. Todo dibujo que realice de la observación debe ser esquemático, respetando las proporciones de los elementos que observa. Evite sobrecargarlo de detalles de cuyo origen no está seguro (burbujas de aire, granos de colorante u otras imperfecciones del preparado). Evite sombrearlo.

7. No siempre es ideal el máximo aumento. 8. Los portaobjetos y cubreobjetos deben estar limpios y secos. 9. Debe ser prudente con la cantidad de líquido de montaje que utiliza. 10. Cuando deba realizar un corte hágalo siempre lo más fino posible, así evitará la

superposición de capas. 11. Luego de su uso, limpie los objetivos con un paño. VARIANTES EN MICROSCOPÍA ÓPTICA

a. Campo brillante (muestra no coloreada). La luz pasa directamente a través de la muestra. A menos que la célula esté naturalmente pigmentada o teñida de forma artificial, la imagen tiene poco contraste.

b. Campo brillante (muestra coloreada). La tinción con varios colorantes refuerza el contraste, pero la mayoría de los procedimientos de tinción exigen que las células sea fijadas (preservadas) lo que implica la muerte celular.

c. Contraste de fases. Aumenta el contraste en las células no coloreadas amplificando las variaciones en la densidad dentro de la muestra; es especialmente útil para examinar células vivas, no pigmentadas.

d. Contraste de interferencia diferencial (Nomarski). Como el anterior, utiliza modificaciones ópticas para exagerar las diferencias de densidad, lo que hace que la imagen parezca casi tridimensional.

e. Fluorescencia. Muestra la localización de moléculas específicas en la célula marcándolas con colorantes o anticuerpos fluorescentes. Estas sustancias fluorescentes absorben la radiación ultravioleta y emiten luz visible.

f. Confocal. Utiliza láseres y ópticas especiales para la “sección óptica” de muestras teñidas con sustancias fluorescentes. Sólo se ilumina un único plano del foco; la fluorescencia fuera de foco por arriba y por debajo de este plano se sustrae mediante ordenador. El resultado es una imagen más nítida.

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Observación de células epiteliales de la mucosa interna de la mejilla humana con distintos tipos de microscopios ópticos (*). En b) con campo brillante (luz transmitida), en c) con campo oscuro, en d) con contraste de fases y en e) con interferencia diferencial de Nomarski. Los microscopios de contraste de fases y de interferencia diferencial intensifican las diferencias de densidad óptica en distintas regiones de la célula. *Extraído de Solomon et al. 2001.

UNIDADES DE USO CORRIENTE EN MICROSCOPIA − mm (milímetro)= 0.001 m = 1 * 10-3 m − µm (micrómetro, micrón o micra) = 0.001 mm = 1 * 10-3 mm = 1 * 10-6 m − nm (nanómetro) = 0.001 µm = 1 * 10-3 µm = 1 * 10-6 mm = 1 * 10-9 m − Å (Angström) = 0.l nm = 1 * 10-1 nm = 1 * 10-4 µm = 1 * 10-7 mm = 1 * 10-10 m.

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MICROSCOPIO SIMPLE, ESTEREOSCÓPICO O LUPA Consta de dos microscopios completos, cada uno con su objetivo y su ocular, cuyos ejes forman un ángulo de 15°. Por tal razón las imágenes de los oculares son distintas, como ocurre con la visión normal de una persona. Con ello se logra una imagen tridimensional, o sea, con longitud, anchura y profundidad (imagen estereoscópica). Produce imágenes derechas, diferencia principal con el microscopio óptico, facilitando la manipulación del material ya que todo se ve en su posición real. Los tubos son separables para adaptarlos a las distintas distancias interpupilares de los usuarios. Además, uno de los tubos posee un tornillo de ajuste del enfoque para compensar las posibles diferencias ópticas entre los dos ojos. En cuanto a los aumentos, la gama de ellos es menor que la que se puede lograr con los microscopios corrientes, En general el tenor de aumentos va desde el que se puede lograr con una lupa de mano (2.5X) hasta 100X o 140X. Presenta un límite de resolución de 3µm.

Este instrumento es muy útil para observar órganos florales, nervaduras de hojas y, en general, para hacer observaciones referidas a organografía.

Observación de un ácaro en una hoja utilizando microscopio estereoscópico

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MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA

En 1924 de Broglie descubrió el carácter ondulatorio de los rayos de electrones

lo que constituyó un prerrequisito para la construcción del microscopio electrónico. El primer microscopio electrónico (ME) fue construido por Knoll & Ruska, en Berlín (1932) y uno de los primeros objetos biológicos descriptos fue el virus del mosaico del tabaco. La primera imagen de una célula fue publicada en 1945.

Hacia el 1950 se mejoraron las técnicas y los microscopios electrónicos y se comenzó a estudiar los detalles finos de la estructura celular o ultraestructura.

Mientras el MO aumenta un objeto hasta 1.000 veces, el ME lo hace hasta 250.000 veces, siendo su capacidad de resolución 10.000 veces superior a la del ojo humano.

La gran diferencia entre el MO y el ME se estableció cuando se logró modificar la fuente de iluminación: mientras que para el MO es la luz visible, cuya longitud de onda (λ) va de los 380 nm a los 750 nm, el ME utiliza un haz acelerado de electrones, cuya λ se reduce a 0,005 nm. Sin embargo, la estrecha apertura numérica impuesta por la gran aberración de las lentes electromagnéticas, fija los valores corrientes para el límite de resolución del ME en alrededor de los 0,3 nm.

El ME utiliza la propiedad que tienen los haces de electrones de ser desviados

por un campo electrostático o electromagnético, de la misma forma que un rayo de luz es refractado al atravesar una lente.

Existen dos tipos de microscopios electrónicos (ME):

� Microscopio Electrónico de Transmisión (MET ), en el cual el preparado está interpuesto en el trayecto electrónico pudiéndose observar la estructura interna del mismo y sus detalles ulraestructurales. � Microscopio Electrónico de Barrido (MEB ), en el que un fino haz de electrones recorre la superficie de la preparación y brinda imágenes de tipo tridimensional.

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Microscopio Electrónico de Transmisión El MET brinda imágenes planas y monocromáticas (en distintas tonalidades de

gris) de cortes ultradelgados. Por lo tanto, a fin de reconstruir el aspecto tridimensional de una célula, es

necesario estudiar muchos cortes transversales consecutivos (llamados cortes seriados) del objeto. Esto constituye el equivalente a reconstruir el contenido de una casa a partir del conjunto de una centena de cortes consecutivos de 5 cm.

El funcionamiento de este ME es el siguiente: Si se coloca un filamento de tungsteno en un tubo al vacío y luego se lo calienta,

ese filamento emite electrones que pueden ser acelerados por medio de un potencial eléctrico. En estas condiciones un haz de electrones tiende a seguir una trayectoria rectilínea y presenta algunas propiedades similares a las de la luz.

El filamento de tungsteno (o cátodo) del microscopio electrónico emite una corriente de electrones que actúa como fuente termoiónica.

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Por medio de una bobina electromagnética, que hace las funciones de condensador, los electrones se concentran en el plano donde se coloca el objeto.

La segunda bobina funciona como una lente objetivo y da una imagen agrandada del objeto.

Esta es recibida por una tercera lente electromagnética que actúa como ocular o lente de proyección, que aumenta la imagen que proviene del objetivo.

La imagen final se ve sobre una pantalla fluorescente y eventualmente se registra sobre una placa fotográfica. Una cámara de televisión acoplada puede recoger también la imagen y transferirla a un monitor, a una impresora de video o a un analizador digital de imágenes.

Una de las diferencias entre el ME y el MO es en cuanto al mecanismo de

formación de la imagen. En el ME la imagen se debe principalmente a la dispersión de los electrones

cuando estos chocan con las moléculas de la muestra. Generalmente, cuando los electrones se aproximan a los átomos del objeto son desviados por éstos porque:

� son repelidos por la nube de electrones, � atraídos por la carga positiva de los núcleos atómicos, o � dispersados en forma elástica o inelástica por colisiones atómicas.

La imagen observada en la pantalla fluorescente es el resultado de la ausencia de esos electrones, que fueron detenidos por caer fuera de la abertura de la lente objetivo o por haber perdido gran parte de su energía en las colisiones. La dispersión de electrones depende del espesor y la densidad molecular del objeto, y en especial del número atómico de los átomos que entran en su composición. A mayor número atómico, mayor dispersión.

Ahora bien, gran parte de los átomos que componen las estructuras biológicas son de bajo número atómico (como el hidrógeno, el carbono, el oxígeno, el nitrógeno y el fósforo) y contribuyen poco a la formación de la imagen. Por esta razón se deben agregar átomos pesados a la estructura molecular para aumentar el contraste.

Otra diferencia con el MO es que el ME tiene mayor profundidad de foco, lo que se ha usado para desarrollar la microscopía tridimensional de cristales de proteína y hasta de organelas celulares, como los ribosomas. Esta propiedad es especialmente importante en el microscopio electrónico de barrido.

Microscopio Electrónico de Barrido

Permite el estudio de superficies, otorgando imágenes tridimensionales y

monocromáticas (en distintas tonalidades de gris). En el MEB el haz de electrones no atraviesa la muestra, sino que ésta es

recubierta por una delgada película de oro u oro-paladio. Cuando el haz de electrones se topa con diversos puntos de la superficie de la muestra, se emiten electrones secundarios cuya intensidad varía según el contorno de la superficie. Los patrones de emisión registrados de los electrones secundarios generan una imagen tridimensional de la superficie de la muestra que es recogida en una pantalla de televisión. Este tipo de micrografía permite obtener información respecto de la forma y características externas de la muestra que no pueden obtenerse con el MET.

La utilidad del MEB es similar a la que presenta la lupa o microscopio estereoscópico, pero con un poder de resolución muy superior, del orden de los 60 Å, profundidad de campo y magnificación de la imagen (hasta 150.000 aumentos).

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Consiste en: - Un filamento de tungsteno que emite electrones y un ánodo que los atrae y

acelera. - Bobinas deflectoras que desplazan el haz de electrones de manera tal que

exploran la superficie de la muestra mediante un barrido horizontal y otro vertical.

- Los electrones llegan a la superficie de la muestra, interaccionan con átomos de la misma, emitiéndose electrones secundarios de baja energía.

- La cantidad de electrones secundarios emitidos por cada punto es proporcional al tipo de superficie (las hendiduras emiten menos electrones que las proyecciones).

- Un detector colecta los electrones secundarios. Luego se produce una amplificación y los electrones envían su impulso eléctrico a un monitor dando distintos tonos (gris cuando llega regular cantidad de electrones, blanco cuando llegan muchos y negro cuando llegan pocos), pudiéndose obtener luego fotomicrografías.

Cabe recalcar que los electrones no atraviesan la muestra sino que interaccionan

con ella para que emita otros electrones. Por ello la muestra no presenta limitaciones de tamaño ni de espesor. Además, toda la trayectoria de los electrones se cumple en un tubo de alto vacío.

En la siguiente ilustración se muestra una comparación entre el MO, MET y MEB(*). Las fotomicrografías corresponden al protista Paramecium. En a) observado con un microscopio óptico de contraste de fases. En b) observado mediante MET, se obtiene una imagen de alta resolución que puede amplificarse mucho; debido a ello, en la micrografía sólo se observa una parte de la célula de Paramecium. En c) con el MEB se observan claramente características superficiales. *Extraído de Solomon et al. 2001.

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Observación de granos de polen de girasol con MO, MEB y MET

MO

MEB

MET

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ESCALA LOGARITMICA DE LAS DIMENSIONES MICROSCÓPICAS Cada división principal representa un tamaño diez veces menor que la precedente. A la izquierda se indica la posición de las diferentes longitudes de onda del espectro electromagnético y los limites de resolución del ojo humano, la luz y el microscopio electrónico. A la derecha se da el tamaño de diferentes células y átomos (según De Robertis y otros, 1977).

GENERALIDADES DE TÉCNICAS HISTOLÓGICAS

PARA MICROSCOPÍA ÓPTICA: FIJACION DEL MATERIAL A OBSERVAR El material a observar puede ser fresco o encontrarse fijado. La fijación es una operación destinada a matar las células lo más rápidamente posible y conservarlas en el estado más parecido al que tenían mientras estaban vivas. Un fijador debe tener rápido poder de penetración de modo que la fijación se efectúe tanto en la parte superficial como en los tejidos profundos, y debe ser ácido para producir la coagulación paulatina y total de las proteínas a los efectos de que las células no sufran contracciones.

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Los fijadores más comúnmente utilizados son: − FAA: es una mezcla de formol, alcohol etílico, ácido acético y agua. − Farmer: es una mezcla de alcohol etílico absoluto y ácido acético glacial. − Carnoy: es una mezcla de alcohol etílico 96º, ácido acético glacial y cloroformo.

CORTES DE MUESTRAS Orientación: Los cortes de muestras cilíndricas (tallo, raíz) pueden realizarse en los siguientes sentidos:

a. Transversal: en un plano perpendicular al eje mayor del órgano. b. Longitudinal radial: en un plano paralelo al eje mayor del órgano cuando el

plano de corte coincide con un diámetro. c. Longitudinal tangencial: en un plano paralelo al eje mayor del órgano cuando el

plano de corte es paralelo a un diámetro.

Tipos de corte: 1. Corte a mano libre o a mano alzada: se realizan con hoja de afeitar o navaja. Se

utilizan para observaciones rápidas y sin mucho detalle pues su espesor generalmente es mayor de 20 µm. Se puede efectuar directamente sobre el material o bien utilizando médula de saúco o hinojo, o trozos de raíz como la zanahoria, que actúan como soporte del material acortar.

2. Cortes con micrótomo de mano: poco usado actualmente pues con él se logran cortes semejantes en espesor a los cortes a mano libre. Consta de una platina circular en cuyo interior existe una pinza de sujeción que actúa mediante un tornillo exterior y en la que se ubica el elemento a cortar. Mediante otro tornillo se coloca a nivel de platina el objeto a cortar y luego se lo hace sobresalir de acuerdo al espesor que se desea obtener, mediante la escala ubicada en el pie del micrótomo. El corte se efectúa con navaja bien afilada, realizando primeramente un corte de limpieza y luego los definitivos.

3. Cortes con micrótomo de cuchilla metálica: se obtienen cortes de entre 5 y 20 µm de espesor según el tipo de micrótomo, pudiéndose obtener cortes en serie con

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espesor controlado. El material a cortar puede ser fresco o fijado, blando o duro (madera), incluido o no en parafina, según las características del micrótomo. Entre ellos se encuentran:

a. Micrótomo de deslizamiento. b. Micrótomo de congelación. c. Micrótomo rotario o Minot.

4. Cortes con ultramicrótomo: emplea cuchillas de vidrio o diamante y permite obtener cortes de 750 Å a 1µm de espesor. Se utilizan para efectuar observaciones con Microscopio Electrónico de Transmisión.

PREPARADOS

Para obtener un preparado microscópico se procede, una vez realizado el corte, al montaje. Esto consiste en colocar entre el portaobjetos y el cubreobjetos un medio apropiado para la observación y conservación del mismo. Estos medios pueden ser líquidos o sólidos y serán más apropiados cuando su índice de refracción sea más parecido al del vidrio empleado en el instrumental óptico (1.5 -1.6). Los preparados microscópicos se pueden clasificar en: a. Preparados de contraste: son aquellos en los que se utiliza algún colorante que tiñe

las distintas partes del objeto creando entre ellas un gran contraste. b. Preparados de fase: no reciben coloración y es necesario observarlas con el

Microscopio de Contraste de Fase. Según el tiempo de duración del preparado, éste puede ser: a. Transitorio: cuando se utiliza como líquido de montaje agua con algún colorante. b. Semipermanente: cuando el medio de montaje es agua glicerinada (al 50%). c. Permanente: cuando el medio de montaje puede ser gelatina-glicerina, bálsamo de

Canadá o resinas artificiales. COLORACION Colorante es una sustancia que posee color y es capaz de cederlo al combinarse con otra. Puede ser natural (ej.: carmín, hematoxilina, orceína) o artificial (safranina, verde rápido o “fast-green”, rojo neutro). Si el material teñido presenta color semejante al del colorante se dice que este es ortocromático (ej.: safranina). Si el colorante tiñe de distinto color estructuras diferentes, se dice que es metacromático (ej.: violeta de cresilo que tiñe de verde paredes celulares secundarias y de violeta paredes celulares primarias). Colorantes más utilizados en estudios de Anatomía Vegetal: − Safranina: tiñe de rojo intenso paredes celulares lignificadas y cutículas,

cromosomas y núcleo, y de color rosado el citoplasma. − Verde Rápido o Fast Green: tiñe de color celeste verdoso el citoplasma, las

paredes primarias y las paredes secundarias no lignificadas. − Carmín: tiñe cromosomas. − Hematoxilina: tiñe cromosomas y núcleo.

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− Verde Jano: tiñe mitocondrias de verde brillante y las paredes celulares de verde. − Azul de anilina: tiñe la calosa. − Floroglucinol: tiñe la lignina. Según su acción sobre el metabolismo celular los colorantes se clasifican en: b. Vitales: permiten la observación en vivo de la célula, pues no dañan su estructura.

Entre ellos tenemos los vacuolares, como el azul de metileno soluble en agua y en alcohol, rojo neutro, violeta neutro, azul brillante de cresilo.

c. Subletales: dañan la célula en un tiempo relativamente largo, permitiendo observarla como en vivo. Son los colorantes como el Verde Jano y el Violeta de metilo que colorean las mitocondrias, el Violeta dalia y el Violeta cristal que colorean el núcleo y la Rodamina que colorea los cloroplastos.

d. Letales: permiten la observación de estructuras una vez muerta la célula. En general son ácidos. Ej.: Eosina, Fucsina, Safranina, Hematoxilina y Carmín.

Fotomicrografía de la epidermis de Allium sp (“cebolla”) en vista superficial.

Fotomicrografía de un corte transversal de hoja de

Nerium sp, coloreada con tinción doble Safranina – Fast Green.

PARA MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA DE TRANSMISIÓN: La preparación del material biológico para MET incluye: - Fijación habitual y refijación con tetróxido de osmio (que fija la porción lipídica y a

la vez aumenta el contraste posterior) y aldehídos (que fijan la porción proteica). - Deshidratación: esto es necesario ya que de lo contrario se calcinaría la muestra

debido a la exposición al alto vacío que provoca la ebullición del agua (principal componente de los materiales biológicos).

- Inclusión en resinas epoxi; de éstas la más utilizada actualmente se llama Spurr. - Curado: es la polimerización de la sustancia de inclusión. Esta etapa y la anterior

son necesarias para realizar la siguiente, el corte. - Corte con ultramicrótomo provisto de cuchilla de cristal o diamante, que permite

obtener cortes de un espesor de los 50 a los 100 nm. Este espesor permite el paso de los electrones.

- Montaje de los cortes en una pequeña rejilla metálica. - Impregnación con sales de metales pesados, como plomo y uranio para aumentar el

contraste. Estas sales como “colorantes electrónicos”, comparables con los

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colorantes histológicos, al combinarse selectivamente con determinadas regiones del espécimen

PARA MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA DE BARRIDO: Para la preparación del material a observar con MEB, los pasos son: - Fijación - Deshidratación: también es necesaria para evitar que el alto contenido de agua de los

materiales biológicos entre en ebullición al colocarlos en el alto vacío. - Secado - Adhesión a un soporte. - Metalización de la superficie de la muestra, con una delgada capa de oro-paladio o

de oro, efectuado en alto vacío en aparatos de evaporación. Este paso es necesario ya que el material biológico no emite electrones al ser irradiado y mediante la metalización se logra que la superficie de la muestra quede eléctricamente conductora.

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Robertis". El Ateneo. Bs. As. ROBINSON et. al. 1987. Methods of preparation for electron microscopy. An

introduction for the biomedical sciences. Springer-Verlag. Berlin. SOLOMON, BERG, MARTIN. 2001. “Biología” 5ª ed. Mc Graw Hill. Mexico.

20

Características MO LUPA MET MEB

Fuente de iluminación

Lámpara de incandescencia

(fotones)

Lámpara de incandescencia

(fotones)

Filamento de tungsteno

(electrones)

Filamento de tungsteno

(electrones)

Proporciona imágenes

Invertidas, planas y

policromáticas (dependiendo de la

muestra y/o coloración empleada)

Directas, tridimensionales

y policromáticas

(dependiendo de la muestra y/o coloración

empleada)

Directas, planas y

monocromáticas

Directas, tridimensionales

y monocromáticas

Imagen dada por

Refracción de rayos

luminosos

Reflexión de rayos luminosos

Dispersión de electrones

Dispersión de electrones

Límite de resolución

0,25 µm 3 µm 1,4 a 3 Å 60 Å

Longitud de onda empleada

550 nm 550 nm 0,005 nm 0,005 nm

Aumentos 40 a 1500 100 a 140 Hasta 1.000.000 150.000

Material biológico

Vivo o muerto Vivo o muerto Muerto Muerto

Tubo Con aire Con aire Alto vacío Alto vacío

Fijadores FAA

Faramey Carnoy

- Tetróxido de

osmio y aldehídos

-

Medios de inclusión

Gelatina-glicerina

Bálsamo de Canadá

- Resinas Epoxi -

Aparatos para efectuar los

cortes Micrótomo -

Ultramicrótomo con cuchilla de

cristal o de diamante

-

Espesor de los cortes

5 – 20 µm - 50 – 100 nm (hasta 1000 nm)

-