Dra. Alfonsina Morales

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Título: ¨Principios y práctica de la Microscopía Electrónica¨. 1ra. Edición. Autores: Sorrivas de Lozano, Viviana. Alfonsina Morales. María Julia Yañez Bahía Blanca: Viviana Sorrivas de Lozano, 2014. E-book.

ISBN:978-987-43-4752-7

1. Microscopía. 2. Manual.

1RA EDICIÓN Fecha: 2/10/2014 Queda hecho el depósito que establece la ley 11723. Prohibida la reproducción total o parcial de este libro , salvo con autorización escrita de los autores.

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¨Principios y práctica de la Microscopía Electrónica¨

autores

Autores: Prof. Viviana Sorrivas de Lozano Dra. Alfonsina Morales.

Ing. María Julia Yañez.

Colaboradores

Mg. Cecilia Gutierrez Ayesta. Téc. Carlos Alberto Jones.

Editado y diseñado por:

Viviana Sorrivas de Lozano

Diseño de tapa y gráficos del capítulo fundamentos: Carlos Alberto Jones.

ISBN:978-987-43-4752-7

1ra.edición: 2014

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Agradecimientos

En la elaboración de este libro participaron muchas personas que en mayor o menor medida contribuyeron a su realización y a quienes queremos tener presentes en este agradecimiento:

Al Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET) por posibilitarnos los recursos necesarios para crecer en la especialidad. Un recuerdo especial para el Ing. Martín Urbicain que siempre nos apoyó y estimuló en nuestra tarea. A nuestros colegas microscopistas con los cuales hemos intercambiado experiencias y conocimientos. A Carina Cano, nuestra mano derecha en el laboratorio de preparación de muestras. A Carlos Jones por el procesamiento de imágenes que es una parte muy importante de nuestro trabajo y por brindar su conocimiento en fotografía en el capítulo XI de éste libro, por los gráficos y el diseño de la tapa. AMg. Cecilia Gutierrez Ayesta por su aporte en seguridad en laboratorio , un tema tan importante a tener en cuenta en la labor diaria. Al Ing. Francisco Spinella por la asistencia y ayuda brindada en el mantenimiento y reparación de los equipos con los cuales trabajamos. A nuestros compañeros de las distintas áreas de servicios : electrónica, taller, administración, computación, vitroplastía y tranferencia. A la comunidad científico – tecnológica del país por depositar en nosotros la confianza en la asistencia de trabajos de microscopía electrónica. A los usuarios que durante más de 30 años compartieron con nosotros su conocimiento y nos permitieron publicar las imágenes de sus muestras en este libro. Y por supuesto con mucho cariño a nuestras familias. Las autoras.

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PREFACIO En las últimas décadas, el avance tecnológico ha posibilitado grandes adelantos en microscopía electrónica favoreciendo su aplicación en las

diversas áreas de la ciencia. La ampliación de las capacidades de los microscopios y el desarrollo de nuevas metodologías han sido de significativa importancia en estudios relacionados con la salud, producción, medio ambiente y nanotecnología.

A partir de la experiencia recogida en más de 30 años de trayectoria en la especialidad, se han observado algunas problemáticas relacionadas con la capacitación de recursos humanos. La formación integral en microscopía electrónica, con temáticas multidisciplinarias, ha demostrado brindar un plus de conocimientos que han ampliado los criterios para la realización de muchos trabajos. Por ejemplo, un Ingeniero que investiga polímeros biodegradables necesita conocer cómo se procesan las bacterias y a su vez el biólogo comprender las características estructurales y morfológicas del polímero. Un Ingeniero en alimentos requiere reconocer la ultraestructura del material que procesa para comprender los cambios en las propiedades que afectan al producto. Estos son sólo algunos ejemplos que muestran nuestro parecer.

Muchos de los libros disponibles tienen un alto contenido teórico y escasos protocolos de preparación de muestras, mientras otros, son netamente prácticos. Asimismo, abunda bibliografía dedicada a un tópico en particular. Se ha notado que quienes se inician en Microscopía Electrónica, encuentran problemas que parecen insalvables a la hora de procesar sus muestras e interpretar resultados. El aporte de los protocolos de laboratorio, tiene por objeto ayudar a resolver estos inconvenientes.

Este manual de distribución gratuita; ha sido realizado gracias a la permanente interacción con los integrantes del sistema científico y tecnológico, a experiencias adquiridas, bibliografía disponible y el equipamiento mayor y auxiliar con el que trabajamos perteneciente al CONICET.

Están a disposición los saberes que se consideran fundamentales para facilitar al lector la concreción de sus objetivos.

Los autores

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INDICE

INTRODUCCION

I.1-Breve reseña histórica de la microscopía electrónica. I.1.1-El rol de la mecánica de onda.

I.1.2- Los comienzos. I.2-Estado del arte.

I.2.1-Nuevas tecnologías en microscopios de transmisión. I.2.1.1-Atomic resolution Jeol Jem-arm200f tem. I.2.1.2-Low-voltage transmission-electron-microscopy.

I.2.1.3- Dynamic transmission electron microscope. I.2.1.4- Nuevo detector de electrones directo fei company (nasdaq: feic). I.2.1.5- Liquid scanning transmission electron microscope (stem). I.2.1.6-Los microscopios electrónicos de transmisión (TEM) actuales. I.3- Aplicaciones de la técnica que coadyuvaron al desarrollo de nuevos microscopios electrónicos de transmisión . I.3.1-Características notables que poseen los microscopios actuales con más capacidades.

I.4- Avances en la tecnología de microscopía electrónica de barrido. I.4.1-fib: (focused ion beam).

I.5- Conclusiones.

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Capítulo I : Fundamentos de la Microscopía Electrónica

I.1 Concepto de Resolución. I.2 Naturaleza de las ondas electrónicas. I.3 Componentes de un microscopio electrónico. 1.3.1 Emisión termoiónica. 1.3.2 Emisión de campo. I.4 Lentes electromagnéticas. I.5 Aberraciones: cromática, esférica, astigmatismo. I.6 Descripción del Microscopio Electrónico de Transmisión. I.7 Interacción haz de electrones –muestra. 1.7.1- Scattering elástico e inelástico. I.8 Comparación entre el microscopio óptico y el electrónico. I.9 Descripción del Microscopio Electrónico de Transmisión. 1.9.1-Tipos de contraste. 1.9.2- Teoría del contraste. 1.10 Interacción haz incidente muestra en el SEM. 1.11 Profundidad de campo y profundidad de foco en el MEB. 1.12 Tipos de contraste en MEB.

Capítulo II: Preparación de muestras biológicas y de materiales para su observación por Microscopía Electrónica de transmisión.

2-Fijación. 2.1 PH del buffer. 2.2 Osmolaridad. 2.2.1 Cómo ajustar la osmolaridad?. 2.3 Composición iónica de la solución fijadora: • Agregado de electrolitos. • Agregado de sustancias no-electrolíticas: como glucosa o sacarosa al 5%.

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2.4 Constitución iónica. 2.5 Factores que afectan una fijación. 2.5.1 Temperatura. 2.5.2 Duración de la fijación. 2.5.3 PH del fijador: 2.6 Vehículos. 2.6.1 Los vehículos más utilizados. 2.6.1.1 Tampón fosfato.

2.6.1.2 Tampón cacodilato: Na(CH3)2 AsO4.3 H2O .

2.6.1.3 Tampón Veronal-acetato.

2.6.1.4 Tampón colidina: (2,4,6 trimetil piridina).

2.7 Fijadores.

2.7.1- Aldehídos: formaldehído, glutaraldehído, acroleína. 2.7.1.1 Glutaraldehído (GA).

2.7.1.2 Formaldehído. 2.7.1.3 Acroleína:

2.7.2- Oxidantes: tetróxido de osmio, de rutenio, permanganato de potasio. 2.7.2.1 Tetróxido de osmio: (OsO4). 2.7.2.2 Tetróxido de Rutenio: RuO4 . 2.7.2.3 Permanganatos. 2.7.3- Sales de uranilo. 2.8 Tipos de fijación. 2.8.1 Por inmersión.

2.8.2 De un cultivo en monocapa. 2.8.3 Células aisladas en suspensión . 2.8.4 Criosustitución (TEM). 2.8.5 Material particulado.

2.8.6 Fracciones Subcelulares. 2.8.7 Vegetales. 2.9 Aditivos. 2.9.1 Tanino al 1 %.

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2.9.2 Ferrocianuro de potasio 0.05 M. 2.9.3 Hidróxido de lantano al 2%.

2-10 Fijación de carbohidratos. 2.11 Algunos protocolos. 2.11.1 - Fijación de muestras vegetales (TEM). 2.11.1.1 - Semillas. 2.11.1.2 - Semillas (otra opción TEM). 2.11.1.3 - Semillas secas (TEM). 2.11.1.4 - Hojas. 2.11.1.5 - Tejidos blandos vegetales.

2.11.1.6 - Granos de polen.

2.11.1.7 - Raíces 2.12- Preparación de muestras de materiales para su observación por Microscopía electrónica de Transmisión. 2.12.1-Contraste de polímeros (ver capítulo 6). 2.12.2-Caracterización de catalizadores soportados por TEM.

2.12.3- Interacción haz electrónico con el catalizador.

2.12.4-Contraste de la imagen. 2.12.5-Determinación de tamaños.

2.12.6-Efecto de la forma de las partículas.

Capítulo III. Deshidratación.

3.1 - Objeto de la deshidratación. 3.1.1- Métodos. 3.1.2- Método de diluciones infinitas.

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Capítulo IV: Infiltración con resinas

4. El medio de infiltración ideal. 4.1 Tipos de resina. 4.1.1 Resinas Poliéster. 4.1.1.1 Ej. “Vestopal” y 4.1.1.2 “Rigolac”. 4.1.2 Resinas Epoxi. 4.1.2.1 Epón . 4.1.2.2 Mezcla de Araldita: (araldita + DDSA + DMP 30). 4.1.2.3 Medcast (Epón). 4.1.2.4 Spurr. 4.1.3 Resinas Metacrilato. 4.1.3.1 Lowilcryl. 4.1.3.2 Unicryl. 4.1.3.3 London Resin: LR. 4.2 Seguridad en el uso de resinas. 4.3 Pre-infiltración. 4.3.1 Agar o agarosa. 4.3.1.1 Gelatina. 4.3.1.2 Otros soportes. 4.3.2 Tipos de moldes de inclusión. 4.4 Errores en la infiltración y la polimerización. 4.5 Protocolos tipo. 4.5.1 Lowilcryl K4M. 4.5.2 Embebido plano para monocapas celulares con LR White. 4.5.3 Monocapas de células en resina epoxi. 4.6 Tinción de cortes 1 µm para microscopía óptica. 4.6.1 Para cortes de resina epoxi. 4.6.2 Para cortes de resina metacrilato.

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Capítulo V: Ultramicrotomía

5.1 Introducción a la ultramicrotomía. 5.2 Las cuchillas. 5.3 Herramientas necesarias para ultramicrotomía. 5.3.1 Tipos de pinzas o bruselas. 5.3.2 Las grillas: 5.4 Sintetizando el proceso. 5.5 Cómo extraer el taco de su molde 5.6 Tallado del taco. 5.6.1 Tallado en “mesa”. 5.6.2 Alineación de la cuchilla. 5.7 Elección del ángulo libre.

5.8 Cortes semifinos (1 m). 5.9 Tinción de cortes de resina de 1 µm para microscopía óptica. 5.9.1 Azul de toluidina para cortes de resina epoxi.

5.9.2 Colorante policromo (azul y rojo). 5.9.3 Azul de toluidina para cortes de resina metacrilato.

5.10 Re tallado del taco manualmente. 5.10.1 Corte y recogida de secciones en una grilla. 5.11 ¿Cómo se sabe el grosor del corte? 5.11.1 Referencias de colores. 5.12 Preparación de grillas con film soporte 5.12.1 Film de Parlodion o Colodion. 5.12.2 Film de Formvar. 5.13-Problemas en el corte con el ultramicrótomo.

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Capítulo VI: Contraste.

6.1 Objetivo del contrastado de secciones. 6.1.1 Cómo se logra el contraste? 6.1.2 Condiciones que debe tener un medio de contraste. 6.1.3 Clasificación de medios de contraste:

6.1.3.1 Contraste intravital. 6.1.3.2 En bloque.

6.1.3.3 Contraste de cortes finos montados en grillas. 6.1.3.4 Contraste negativo.

6.1.4 Materiales difíciles de contrastar: técnica.

6.1.5 Medios de contraste para Microscopía Electrónica de Transmisión (TEM). 6.1.5.1 Acetato de Uranilo: U: PM=238. 6.1.5.2 Soluciones de plomo: (Pb=PM 207). 6.1.5.3 Ácido fosfotúngstico (PTA) (H 3 PO4.12 WO3.24H2O). 6.1.5.4 Permanganato de potasio: KMnO4 : (Mn=55). 6.1.5.5 Rojo de Rutenio. 6.1.5.6 Contraste de polímeros.

6.1.5.7 Tetróxido de Osmio. 6.1.5.8 Tetróxido de Rutenio.

6.1.5.9 Ácido clorosulfónico. 6.1.5.10 Ácido Fosfotúngstico.

6.2 Contraste de la imagen. 6.2.1 Factores que afectan el contraste. 6.2.2 Tiempo de acción y penetración del agente contrastante 6.2.3 Especificidad del contrastante 6.2.4 Factores que afectan al acetato de uranilo. 6.2.5 Contaminación de las secciones

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Capítulo VII: Inmunolocalización

7. Inmunolocalización. 7.1 La reacción a se puede realizar:

7.1.1 Antes de la fijación. 7.1.2 Luego de la fijación y antes de la infiltración en resina.

7.1.3 Luego de la fijación y polimerización en una resina epoxi. 7.1.4 Luego de la fijación y polimerización en una resina hidrofílica.

7.1.5 Sobre crio cortes. 7.2 ¿Cuándo utilizar lowilcryl y cuándo criocortes?

7.2.1 Usamos CUM (crio-ultramicrotomía). 7.2.1.1 Como patrón de ultraestructura. 7.2.1.2 Cuando tengo disponibilidad de nueva muestra.

7.2.1.3 Porque es más rápida (sin 2º fijación, sin deshidratación ni polimerización). 7.2.1.4 Para detectar antígenos muy lábiles o en baja cantidad.

7.2.1.5 Para hibridización in situ. 7.2.2 Fijación suave.

7.2.3 Preinfiltración. 7.2.4 Resinas metacrilato: Inmunolocalización luego de la fijación y polimerización. 7.2.5 Los criocortes. 7.2.5.1 ¿Qué ocurre cuando se congela una solución acuosa a distintas velocidades?. 7.2.5.2 ¿Qué ocurre cuando las células están en una solución acuosa?

7.2.6 Fijación. 7.2.7 Crioprotección. 7.2.8 Corte.

7.2.8.1 Problemas de corte. 7.2.8.2 Las cuchillas de diamante.

7.2.8.3 La cuchilla de vidrio. 7.3 Artefactos del corte. 7.4 Protocolo para obtener secciones por CUM. 7.5 Pasos del protocolo de inmunomarcación sobre secciones montadas en grillas.

7.5. 1 (CUM o Lowilcryl). 7.6 Tipos de contraste.

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7.7 Ventajas y desventajas de la técnica.

Capítulo VIII: Preparación de muestras para microscopía electrónica de barrido

8. Introducción. 8.1 Tipos de muestras y método de preparación (SEM).

8.2 Preparación de superficies. 8.3 Métodos para remover materiales extraños de la superficie de la muestra.

8.3.1 Desmineralización. 8.3.2 Para remover cilios o flagelos.

8.4 Fijación. 8.4.1 Fijación química.

8.4.1.1 Coagulantes. 8.4.1.2 No coagulantes.

8.4.2 Formas de utilización de los fijadores. 8.4.3 El vehículo ideal.

8.5 Deshidratación. 8.5.1 Objetivo de la deshidratación. 8.5.2 Métodos de deshidratación. 8.5.2.1 Un esquema típico de deshidratación es el siguiente. 8.5.2.2 Método de diluciones infinitas.

8.6 Secado. 8.6.1 Secado por congelamiento.

8.6.2 Secado al aire desde solventes orgánicos. 8.6.3 Secado por punto crítico. 8.6.3.1 Fluidos intermediarios y de transición. 8.6.3.2 Portamuestras para secado por punto crítico.

8.7 Montaje de especímenes para microscopía electrónica de barrido. 8.7.1 Adhesivos para sostener la muestra.

8.7.2 Montaje de la muestra. 8.7.2.1 Orientación de la muestra.

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8.8 Materiales para depositar. 8.9 Constantes físicas de varios elementos empleados en la formación de films conductores. 8.10 Cuidados para con la muestra después que ha sido montada. 8.11 Evaporador de metales en alto vacío.

8.11.1 Producción de films conductores delgados. 8.11.2 Evaporadora de metales en plasma de argón.

8.12 Comparación entre evaporador en vacío y evaporadora en plasma de argón.

Capítulo IX. Protocolos ejemplo para SEM.

9 guía para la preparación de muestras para Microscopía Electrónica de Barrido. 9.1 Tejidos blandos animales.

9.2 Células libres. 9.3 Microorganismos en suspensión. 9.4 Microorganismos en agar.

9.5 Bacterias. 9.6 Organismos acuáticos. 9.7 Plancton (Lab. de microscopía Electrónica de la UAT).

9.7.1 Protocolo para fijar zooplankton. (Laboratorio de Microscopía Electrónica UAT) 9.8 Vegetales. 9.8.1 Semillas. 9.8.2 Frutos. 9.8.3 Almidón.

9.9 Notas de interés. 9.10. Polvos particulados. 9.10.1 Polvos secos.

9.10.1.1Método 1: Espolvoreo. 9.10.1.2 Método 2.: Por corriente de aire. 9.10.1.3 Método 3. : Flujo en recipiente semi-cerrado.

9.10.2 Partículas en suspensión líquida. 9.11 Muestras filtradas. 9.12 Fractura (materiales poliméricos).

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9.13 Alimentos. Masas.

Capítulo X: Artefactos

10 Artefactos. Definición. 10.1 Artefactos causados por la fijación en Microscopía Electrónica de Transmisión. 10.2 Artefactos de fijación en TEM.

10.2.1 Tiempo de agonía. 10.2.2 Pérdida de sustancias. 10.2.3 Falsa localización. 10.2.4 Pérdida de la actividad biológica (enzimática o la antigenicidad). 10.2.5 Reacciones inespecíficas. 10.2.6 Alteración del volumen de las estructuras.

10.3 Artefactos causados por deshidratación e inclusión en TEM. 10.4 Resinas epoxi. 10.5 Artefactos en seccionamiento ultra fino. 10.6 Artefactos relacionados con la ultramicrotomía.

10.6.1 Parámetros para tener en cuenta. 10.6.1 Ambientales.

10.6.2 Chatter. 10.6.3 Compresión.

10.6.4 Marcas de cuchilla. 10.6.5 Arrugas al recoger la sección. 10.6.6 Secciones irregulares. 10. 7 No se logran cortes en serie.

10.8 Contaminación de las secciones debido a ultramicrotomía. 10.9 Artefactos debidos a la performance de los instrumentos utilizados.

10.9.1 Distorsión en las imágenes. 10.9.1.1 Problemas mecánicos.

10.9.1.2 Penetración del haz.

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10.9.1.3 Contaminación. 10.9.1.4 Deriva de la imagen e inestabilidades mecánicas. 10.9.1.5 Desviación térmica. 10.9.1.6 Vibración Mecánica. 10.9.1.7 Inestabilidades eléctricas y magnéticas. 10.10 Artefactos propios de la microscopía electrónica de barrido (SEM). 10.10.1 Artefactos más comunes durante la observación en el microscopio. 10.10. 2 Daños producidos en la muestra durante la preparación.

Capítulo XI. Aplicación de la fotografía digital a la Microscopía Electrónica.

11-La Micrografía Electrónica. 11.1 El cuarto oscuro electrónico: Imágenes digitales. 11.2 Importancia del tamaño del pixel. 11.3 Cómo se puede saber si todos los pixeles en una cámara CCD, contribuyen a mejorar la resolución ? 11.4 Publicación de las micrografías.

11. 5 Imagen digital. 11.5.1 Formación de la imagen digital. 11.5.2 El sistema binario y su funcionamiento. 11.5.3 Pixeles: Los puntos de una imagen. 11.5.4 La resolución, cantidad de pixeles. 11.5.5 La resolución de la impresión: Puntos por pulgada (ppp) Pixeles por pulgada (ppi).

11.5. 6 Pixelación. 11.5.7 Cómo guarda el color el pixel: El Bit y el color. 11.6 Formatos de archivos.

11.6.1 Imágenes Vectoriales. 11.6.2 Mapa de bits.

11.6.3 Compresión de los archivos digitales. 11.6.4 Formatos con pérdida de calidad. 11.6.5 Formato de archivo Tiff. 11.6.6 Formato de archivo BMP.

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11.6.7 Eps: Encapsulated Postscript. 11.6.8 Psd, formato de archivo de photoshop. 11.6.9 PDF, portable document format. 11.6.10 JPEG y la fotografía digital. 11.6.11 Formato de archivo GIF. 11.6.11.1 Normas a seguir antes de editar una imágen JPEG 11.6.12 Formato de archivo GIF 11.6.13 Formato PNG.

11.7 Procesos de mejora de las imágenes. 11.7.1 Procesos de modificación del brillo y contraste por transformación del histograma.

11.8 Filtros de convolución. 11.8.1 Teoría y definiciones.

Capítulo XII: Seguridad en el laboratorio de Microscopía Electrónica..

12-1.1. Reactivos 12.1.1.1. -Acetato de uranilo 12.1.1.2. -Acetona

12.1.1.3. -Alcohol etílico 12.1.1.4. -Azul de toluidina 12.1.1.5. -Buffer (fosfato y cacodilato) 12.1.1.6. -Citrato de plomo 12.1.1.7. -F.A.A. 12.1.1.8. -Glutaraldehído 12.1.1.9. -Permanganato de potasio. 12.1.1.10. -Resina Spurr (epoxi) 12. 1.1.11. -Solución Formvar (resina de polivinil formal-dicloruro de etileno) 12.1.1.12. -Tetróxido de osmio 12.1.1.13. -Tetróxido de rutenio 12-1.2. Gases comprimidos y licuados 12.1.2.1. - A argón

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12.1.2.2. - Nitrógeno gaseoso 12.1.2.3. -Dióxido de carbono líquido 12.1.2.4. -Nitrógeno líquido 12.1.3: Equipos 12.1.3.1 - Micro centrífuga 12.1.3.2 - Baño ultrasónico 12.1.3.3 - Horno y plato agitador/calefactor) 12.1.3.4 - Secador por punto critico 12.1.3.5 - Ultramicrótomo 12.1.3.6- Evaporación de metales 12.1.4: Microscopios electrónicos 12.1.5: Manipulación, transporte y envío de muestras y productos químicos 12.1.6: Gestión de residuos 12.1.7: Emergencia 12.1.8: Marco legal

Apéndice I : Soluciones de trabajo y reactivos necesarios.

A1). Tinción para observar secciones gruesas en el microscopio óptico. A2). Para contraste de secciones ultrafinas. A3). Fijadores. A3.a) Para formaldehido. A3.b) Glutaraldehído en buffer Sorensen 4 % (pH 7.25). A3.c) Formalina – Ácido acético – Alcohol (FAA). A3.d) Tetróxido de osmio 2%.

A4). Soluciones Tampón. A4. a) Sorensen. A4. b) Cacodilato de sodio 0.4 M.

A5). Soluciones para contraste. A5.a) Acetato de uranilo.

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A5.b) Citrato de plomo. A5.c) Solución de K2MnO4..-

A5.d) Solución de rojo de rutenio para contraste en bloque. A.6) Colorantes para cortes semifinos para microscopía óptica. A.7) Formación y remoción de precipitados formados por soluciones de contraste en cortes ultra finos. A.8) Pre-infiltración con agar. A.9) Resinas. A9.a) De baja viscosidad. Spurr. (1969). A9.b) Metacrilatos para estudios citoquímicos. A9.c) Epon, Araldite. A.10) Cómo quitar la resina epoxi de los cortes. A.11) Cómo quitar la resina epoxi de los tacos mal infiltrados. A.12) Técnica de desparafinización. A.13) Ejemplo de protocolo.

Apéndice II: Condiciones de operación

AII Mantenimiento y operación. AII.1 Condiciones de operación. AII.2 Selección del tamaño del haz ( spot size)en TEM AII.3 Limpieza del cañón. AII.4 Qué potencial utilizará en su muestra?. AII.5 Recambio de aperturas. AII.5.1 - Elección de aperturas. AII.6 Alineación del haz. AII.7 Corrección de astigmatismo. AII.8 Enfoque. AII.9 Adquisición de imágenes. AII.10 Con respecto al portamuestras. AII.11 Selección de la magnificación. AII.12 Foco. AII.12.1 Enfoque a baja magnificación.

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AII.12.2 Enfoque a alta magnificación. AII.12.3 Corrección de astigmatismo. AII.12.4 Corrección de astigmatismo en el SEM. AII.13 Alineación (TEM). AII.13.1 -Alineación SEM. AII.14 Alineación del cañón de electrones. AII.15 Alineación de la lente condensadora en TEM. AII.16 Sistema formador de imagen (TEM). AII.17 Alineación de la apertura de objetivo (TEM). AII.18 Campo oscuro. AII.19 Difracción de área selecta. AII.20 Mantenimiento de equipos accesorios. AII.20.1 -Mantenimiento de la evaporadora de metales en plasma de Argón. AII.20.2 -El aparato de secado por punto crítico. AII.21 Calibración. AII.21.1 -Calibración de la magnificación (TEM). AII.21.2 -Calibración de la magnificación (SEM).

Guía de trabajos prácticos. (Biología y Materiales)

Instrumentación necesaria. (Materiales) Microscopía Electrónica de Transmisión.(TEM). TP1 Fijación, deshidratación e inclusión. (Biología)

TP1.1 Fijación: Esquema tipo. (Biología) TP1.2 Deshidratación: Esquema tipo .(Biología) Tp1.3 Inclusión en resina y polimerización.(Biología)

TP1.4 Inclusión en resina. (Materiales). TP2. Contraste. (Biología y Materiales)

Tp2.1 Contraste con acetato de uranilo y citrato de plomo. (Biología). TP2.2 Contraste de polímeros. (Materiales). TP2.2.1 Tetróxido de Osmio. (Materiales).

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TP2.2.2 Tetróxido de Rutenio. (Materiales). (Para polímeros seccionados previamente). TP3 Film Soporte.

TP3.1 Preparación de grillas con soporte. (Biología y materiales). TP3.2 Cast films. (Materiales).

TP4. Tallado del taco de resina. (Biología y materiales). TP5. Preparación de polvos TEM. (Materiales).

Tp5.1 Molienda y Suspensión. (Materiales) . Microscopía de Barrido. (SEM)

TP6.1 Secado por punto crítico. (Biología). TP6.2 Operación del Desecador Modelo Polaron. (Modelo manual)(Biología). TP6.3 Montaje de especímenes para su observación por microscopía electrónica de barrido (SEM) (Biología y Materiales). TP6.4 Evaporación de metales en alto vacío. Evaporadora marca JEOL (Biología y Materiales). TP6.5 Evaporación de metales en plasma de Argón. (Biología y Materiales). TP7 Sección morfometría. TP8 Interpretación de imágenes.

Glosario

BIbliografia general

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INTRODUCCION

Prof. Viviana Sorrivas de Lozano

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I.1-Breve reseña histórica de la microscopía electrónica

Desde el año 1660 hasta la actualidad el microscopio óptico ha sido fundamental en el conocimiento de lo invisible a nuestros ojos. Aunque su poder de resolución aumentó a través del tiempo con la mejora en la calidad de las lentes, su factor limitante fue ¨la longitud de onda de la luz¨. En 1873, Ernst Abbe predijo: ¨ Quizá en el futuro se conozca algún principio que permita a través de diferentes caminos sobrepasar los límites que ahora nos parecen insalvables. Creo que los instrumentos que nos asistirán algún día, más suficientes que los microscopios actuales para explorar los elementos del mundo físico, no tendrán nada en común con ellos, salvo sus nombres¨ (3) • Realmente su predicción se cumplió ya que los instrumentos actuales permiten acceder al mundo molecular y atómico tan lejano para los investigadores de aquellos tiempos.

Fue gracias al descubrimiento de los principios físicos que llegaron a ser la base teórica de la microscopía electrónica, que se avanzó a pasos de gigante en el conocimiento de lo muy pequeño.

I.1.1-El rol de la mecánica de onda

Cuando en 1924 De Broglie publicó su teoría de longitud de onda asociada al movimiento del electrón, Ruska se sintió frustrado porque una vez más el límite del poder de resolución era gobernado por un fenómeno de ondas. Pero, aplicando la fórmula de De Broglie reveló que la longitud de onda asociada con el electrón era cinco órdenes de magnitud más pequeña que la onda de la luz, lo que implicaba de todas maneras un gran avance, al aumentar el poder de resolución.

Knoll y Ruska creían que el aumento del poder de resolución se debía a la pequeña dimensión del “corpúsculo ” electrón. Pensaban que la resolución óptima debía ser menor que la distancia entre dos moléculas o átomos adyacentes en líquidos o sólidos.

El trabajo realizado por Busch en 1927, permitió desarrollar la óptica electrónica. Demostró que: ¨ Un campo estático o magnético, que tenga simetría de revolución alrededor de un eje, ejerce una acción de enfoque real

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sobre el haz de electrones paraxiales y constituye una lente electrónica constructora de imágenes ¨.

Por los años 1930, las investigaciones llevadas a cabo para desarrollar la óptica electrónica siguieron dos caminos: El grupo que tuvo resultados exitosos fue el de Gaston Dupouy (3) y colaboradores, que en base a los trabajos de Busch construyó la primera lente electromagnética, pieza elemental de los futuros microscopios.

I.1.2- Los comienzos

En un trabajo traducido por Thomas Mulvey, Ernst Ruska (3), describió los esfuerzos que realizó con sus colaboradores para concebir y diseñar el Microscopio Electrónico. La construcción del Microscopio Electrónico fue el resultado de trabajos realizados sobre el oscilador catódico (osciloscopio)(2). Para lograr una densidad de electrones adecuada, el punto clave fue determinar el diámetro del spot y la concentración del haz. Este trabajo se llevó a cabo en el Instituto de Electrotecnia de la Universidad de Berlín. Varios jóvenes investigadores como D.Gabor, A.Mathias, Max Knoll y Bodo Von Borries, estudiaron el tema durante los años 1924-1929. La concentración del haz por un campo magnético se adoptó como el método más conveniente.

El 7 de Abril de 1931 Ernst Ruska, asombrado y feliz, (imagínense!) obtuvo la primera imagen de una grilla metálica con electrones. El modo de magnificación fue M= l6x. Basándose en el trabajo de Busch (1927), implementó las lentes electromagnéticas. En Diciembre de 1933 obtuvo imágenes de fibras de algodón M= 8.OOOx y una hoja de aluminio M= l2.000x (10).

Con los fundamentos teóricos para el desarrollo de la microscopía electrónica ya establecidos, se sucedieron acontecimientos, que llevaron a optimizar los instrumentos. Paralelamente se implementaron técnicas para preparación de muestras. El Dr. Bill Marton (Bruselas) ocupó un rol importantísimo, ya que ideó técnicas en las cuales las muestras no eran perjudicadas por el haz de electrones. Al observar las imágenes descubrió que había aumentado el contraste. Interpretó que era debido a la dispersión y no a la absorción en la interacción electrón-muestra. (7).

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6

El desarrollo del microscopio de barrido comenzó en 1933, cuando Manfred Von Ardenne, vio la posibilidad de construir un instrumento electrónico de Barrido que permitiera la observación de superficies sin los problemas que traía la preparación de muestras para transmisión (secciones ultrafinas).

Los Trabajos de Von Ardenne fueron truncados debido a la destrucción del microscopio durante un ataque aéreo en la Segunda Guerra Mundial. Por eso fue que recién en 1965 se produjo en Inglaterra el primer SEM comercial.

Según los Holandeses, el microscopio fue inventado por Zacharias Jansen, su invención fue en 1590 – 1595 (WIKIPEDIA), cuando trataba de encontrar un camino para magnificar las imágenes y ayudar a resolver el problema de la disminución de visión. Aunque el origen del microscopio también se lo atribuyen al italiano Galileo Galilei. La palabra microscopio se utilizó por primera vez en la ¨Academia dei Licei¨ una sociedad científica a la que pertenecía Galileo.

Fig.I.1- 1er. microscopio

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7

Fig.2- Galileo Galilei. Fig.3- Zacharias Jansen

En la tabla que continúa figuran los hechos más importantes en la historia de la Microscopia Electrónica.

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1660

Antonie Philips van Leeuwenhoek

(Octubre 24, 1632 – Agosto 26, 1723)

Comerciante y científico Holandés. Se lo conoce como “the Father of Microbiology”, y es considerado

el primer microbiólogo.

Alcanzó una magnificación con microscopio óptico de 250X observó:

Protozoos, células sanguíneas, espermatozoides.

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9

1665

Marcello Malpighi

(March 10, 1628 – November 29, 1694)

Malpighi: Anatomista italiano. Médico del

papa Inocencio 12, fue uno de los primeros en

aplicar el microscopio al estudio de los tejidos,

lo que le permitió descubrir nuevas

formaciones histológicas (corpúsculos de

Malpighi, del riñón). Estudió también los

órganos respiratorios de los insectos y diversos

aspectos del desarrollo embriológico. Dio a

conocer los resultados de su trabajo en varios

tratados.

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0

Robert Hooke

( 28 July 1635 – 3 March 1703) 1665

Publicó dibujos

de insectos, cristales, plumas en “Micrographia”.

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1

1873

Ernst Karl Abbe

(Enero 23, 1840 – Enero 14, 1905)

Definió los límites de resolución de la microscopia óptica. Fue un físico alemán, optometrista y

reformista. Junto con Otto Schott y Carl Zeiss fundaron la óptica moderna.

1897

Sir Joseph John Thomson,

(18 Diciembre 1856 – 30 Agosto 1940)

Fue un físico Inglés. Describió a los electrones como partículas que tienen carga eléctrica negativa. O sea que descubrió las partículas subatómicas. Ganó el

premio Novel en 1906.

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2

1924

Louis-Victor-Pierre-Raymond, 7th

Duc de Broglie,

(15 August 1892 – 19 March 1987) ( 5)

¨Teoría de la longitud de onda de los electrones¨.

Físico francés que contribuyó a definir la teoría cuántica, en 1924 en su tesis doctoral postuló la

naturaleza de onda de los electrones y sugirió que la materia tiene propiedades ondulatorias. Premio Novel

en 1929.

.

1926 H.Busch (5 )

Primera lente magnética. Dos años después de la

publicación de la tesis doctoral de De Broglie, en 1926, H. Bush, el padre de la óptica electrónica presentó el diseño de una lente electromagnética. Mediante este tipo de lente sería posible enfocar un haz de electrones de la misma forma que las lentes ópticas enfocan los rayos luminosos. Esta aportación abrió el camino al diseño por parte de Ruska y Knoll del primer microscopio electrónico, el TEM o microscopio electrónico de transmisión en 1932, consiguiendo en 1934 superar el poder resolutivo del microscopio óptico.

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3

1927 Davidson y Germer

Difracción de electrones.

1924-1929

Gabor-Mathias M.Knoll-Von Borries-Vodo ( 3)

Desarrollo del oscilador catódico para determinar el diámetro del spot y la concentración del haz

óptimas.

1929

M. Stintzing

Descripción teórica del SEM.

1930

Dupouy y Coltou.

( 3) (2)

Desarrollo de lentes electromagnéticas.

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4

1932

Helmut Philipp Georg Ruska (1908-1973) y

Primer TEM. d =2000Ǻ de resolución

Escrito por Ernst RUSKA: ¨My first completed

scientific work (1928-9) was concerned with the mathematical and experimental proof of Busch’s theory

of the effect of the magnetic field of a coil of wire through which an electric current is passed and which is then

used as an electron lens. During the course of this work I recognised that the focal length of the waves could be

shortened by use of an iron cap. From this discovery the polschuh lens was developed, a lens which has been

used since then in all magnetic high-resolution electron microscopes. Further work, conducted together with Dr

Knoll, led to the first construction of an electron microscope in 1931. With this instrument two of the most

important processes for image reproduction were introduced-the principles of emission and radiation. In

1933 I was able to put into use an electron microscope, built by myself, that for the first time gave better

definition than a light microscope. ¨

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5

1932

Max Knoll (17 de julio de 1897 - 6 de

noviembre de 1969)

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6

Marton (3)(7) (Bruselas)

Uso Os04 para fijar especímenes.

1932

Ruska y Von Borries (3)

Avances en las lentes electromagnéticas. (Re-ducción de aberraciones).

1933

Manfred von Ardenne (20 January 1907 – 26 May

1997) (9).

Primeros trabajos en SEM .

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7

1935

Knoll, Max

Demostración de la teoría de SEM. Introdujo me-joras. 3000 ev- 0,1 rnm-a 1mm de resolución.

1936

Krausse (3)

Primera imagen de Diatomeas y paredes de cé-lulas epiteliales.

1936

Morton

Observación de Chromobacterium al SEM . Difundió la Microscopía Electrónica

1936

Primer microscopio comercial: Siemens (11).

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8

1937

Primer ultramicrótomo.

1938

Manfred von Ardenne (20 January 1907 – 26 May

1997) (9 )

Primer microscopio de barrido (V.Ardenne vio en el SEM una vía para la observación de especímenes

grandes).

1938

Manfred von Ardenne (20 January 1907 – 26 May

1997) (9 )

Primer SEM profundidad de foco= 100 nm.

Primer STEM “ de” = 40 nm.

Reducción de vibraciones.

1939

Von Borries y Ruska

Primer TEM comercial.

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9

1940

Manfred von Ardenne (20 January 1907 – 26 May

1997) (9)

Introdujo el método de estereografías.

1942

Worykin, J.Hillier, RL.Synder

Introducción del detector de electrones se-

cundarios con post-aceleración (9 Kev), pantalla fluorescente y fotomultiplicador.

1942-1943

Manfred von Ardenne (20 January 1907 – 26 May

1997) Ernst Ruska (9 )

Mejoran la resolución en el TEM d res= 20 Å .

1944

1945

Segunda Guerra Mundial, finaliza el trabajo de Von Ardenne. Un ataque aéreo destruye las

instalaciones de microscopía.

William and Wyckoff introducen la técnica de sombreado metálico.

Porter (P.N. Fisiologia y Medicina 1972), Claude (P.N. Fisiologia y Medicina 1974) y Fullam utilizaron

el microscopio electrónico para examinar células en cultivo de tejidos luego de fijarlas y

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teñirlas con tetróxido de osmio.

1946

1948

1950

1952

Hillier Ramberg (9)

Philips introduce su primer prototipo de microscopio electrónico comercial en Oxford.

Introducción del corrector de astigmatismo. dres= 0,6 nm.

Pease y Baker preparan confiablemente secciones

biológico.

H. Latta y J. F. Hartman introducen la cuchilla de vidrio para ultramicrotomía.

1956

Palade (P. N. Fisiología y Medicina 1975) , Porter (P.N. Fisiología y Medicina 1972), y Sjöstrand desarrollan métodos de fijación y seccionamiento fino que permitieron ver por vez primera muchas estructuras intracelulares. En una de las primeras aplicaciones de estas técnicas, H. E. Huxley demostró que los músculos esqueléticos contienen un arreglo

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1

Hall

solapado de filamentos proteínicos, apoyando la hipótesis de los filamentos deslizantes de la contracción muscular.

Observó la doble hélice del ADN en TEM.

1956

Smith K.C.A

Producción de lentes electromagnéticas SEM.

Glauert y asociados demuestran que la resina epóxica Araldita era un agente efectivo para incluir

muestras para microscopía electrónica.

1956

V.E.Cosslell y P.Duncomb

Microanálisis con rayos x.

Singer utiliza anticuerpos acoplados a

ferritina para detectar moléculas en

las células utilizando el microscopio

electrónico.

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2

1959

d res =12Å (TEM).

Singer utiliza anticuerpos acoplados a ferritina para detectar moléculas en las células utilizando el

microscopio electrónico.

Brenner y Horne ampliaron la técnica de tinción negativa, inventada cuatro años antes por Hall, a una técnica de uso general para la

visualización de virus, bacterias y filamentos proteínicos.

1960

Everhart Thornley (9)

Introduce el centellador. SEM (disminuye el ruido

en la pantalla).

1960

Primer microscopio electrónico de alto voltaje (3)-1 MV (Tou1ousse). Se observaron bacterias vivas.

1965

Oatley (6)

Primer “stereoscan”. Resolución: 20 nm. Primer

SEM comercial ( Cambridge Instrument Company).

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3

1966

Branton

Demuestra que la crio-fractura permite

visualizar el interior de las membranas.

1970

Crewe-Wall (9)

Introduce el campo de emisión para el haz (SEM) dres = 0,5 nm.

1976

Microscopio Electrónico Analitico. SEM-TEM.

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4

STEM- Rayos X.(Instrumento hibrido).(10).

1980

Procesamiento de imagenes digitalizadas.

1987---a

------1993

60 microscopios de alto voltaje en todo el mundo.

Se logra la resolución de 1 Å en un Philips CM-200/300 en la Universidad de Tübingen

I.2-Estado del arte

I.2.1-Nuevas tecnologías en microscopios de transmisión Desde la comercialización del primer microscopio electrónico de transmisión, en la década del 30, la tecnología y aplicaciones de estos instrumentos han ido modificándose de acuerdo con los interrogantes plantados por los científicos. Es así que el Microscopio Electrónico de Transmisión (TEM) fue perfeccionándose a lo largo de décadas conforme a los descubrimientos y avances en el campo de la física y la electrónica. Se muestran aquí solo algunas de las novedades y futuros desarrollos en el campo de Microscopía Electrónica de Transmisión (TEM). I.2.1.1-Atomic resolution JEOL jem-arm200f tem: En febrero de 2010 se instaló, en la Universidad de Texas, el primer microscopio electrónico de transmisión de resolución atómica. El atomic resolution JEOL JEM-ARM200F permite tanto la resolución de imágenes átomo por átomo y el mapeo espacial de materiales

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químicos a nivel atómico. Posee un diseño completamente nuevo de columna de electrones que integra SEM / TEM.

I.2.1.2-Low-voltage transmission-electron-microscopy:

La construcción de un microscopio electrónico de transmisión de bajo voltaje es un proyecto Carl Zeiss SMT en conjunto con la Universidad de Ulm y CEOS (Heidelberg) iniciado en febrero de 2009 y con período estimado de realización de 5 años. El proyecto microscopios de transmisión (TEM) que produzcan imágenes con resolución atómica utilizando relativamente bajo voltaje de aceleración. Para el Profesor Harald Rose, encargado de diseñar los instrumentos de corrección de éste nuevo microscopio, SALVE significa un sueño hecho realidad para poder seleccionar el voltaje de aceleración basado en los requisitos de la muestra y el objetivo sin sacrificar resolución. Según comentarios del director del proyecto, en comparación con los TEM actuales de media tensión que destruyen las muestras sensibles a la radiación antes de que las imágenes puedan ser registradas, este nuevo microscopio de alto rendimiento permitirá por primera vez obtener imágenes electrónicas de muestras sensibles al haz de electrones y el seguimiento de los procesos moleculares que contribuyen a la decodificación de conversiones químicas. El conocimiento de estos procesos es fundamental para muchas áreas de aplicación en ciencias de los materiales, la investigación biomédica y en la tecnología de semiconductores.

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I.2.1.3-Dynamic transmission electron microscope:

Un equipo de científicos de la UC Davis propone desarrollar el primer microscopio electrónico del mundo capaz de filmar en vivo los procesos biológicos. Su plan es trabajar sobre el dynamic transmission electron microscope o DTEM para expandir sus capacidades. Los DTEMs son versiones avanzadas de los microscopios electrónicos de transmisión (TEM), que en lugar de tomar fotos estáticas capturan procesos en tiempo real mediante el uso de un láser pulsátil que produce ráfagas muy cortas de electrones para iluminar las muestras. El DTEM puede captar de 10 a 100 imágenes por millonésima de segundo, mientras que captura detalles tan pequeños como 10 nanómetros. La finalidad del proyecto es adaptar los DTEMs a células vivas y sistemas en movimiento, esto permitiría aumentar 100 veces la resolución actual, permitiendo a los científicos observar y registrar los procesos biológicos a nivel molecular.

I.2.1.4- Nuevo detector de electrones directo Fei company

En julio de 2009 se anunció el nuevo Falcon™ Direct Electron Detector para microscopios electrónicos de transmisión (TEM). Su funcionamiento se basa en la detección directa de electrones, lo que permite la adquisición de imágenes con poco ruido de muestras biológicas delicadas y otros materiales sensibles que requieren bajas dosis de electrones para prevenir del material.

I.2.1.5- Liquid scanning transmission electron microscope (stem).

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7

Esta nueva técnica utiliza dispositivos que contienen fluidos, con una ventana transparente a los electrones (silicon nitrate) que permite obtener imágenes de células en un medio líquido. Para demostrar su funcionamiento los investigadores utilizaron STEM para obtener la imagen de una molécula del factor de crecimiento epidérmico unido a un receptor de superficie celular, logrando una resolución de 4 nanómetros.

I.2.1.6-Los microscopios electrónicos de transmisión (TEM) actuales

Son capaces de resolver detalles de estructuras biológicas y no-biológicas a escalas micrométricas, nanométricas e incluso sub-

nanométricas. Estos microscopios, emplean muestras muy finas (500 Å o menores), las cuales son atravesadas por un haz de electrones que pasa por un sistema de lentes electromagnéticas. La imagen generada puede ser visualizada en una pantalla fluorescente, una placa fotográfica o una cámara digital, con altas magnificaciones y alcanzando ultra-altas resoluciones. Adicionalmente, esta capacidad puede ser mejorada con sistemas analíticos capaces de brindar información precisa sobre la composición y estructura de la muestra, el grosor, la composición química y elemental, la estructura electrónica y los niveles de energía, e incluso la distribución elemental-específica de los átomos de los especímenes.

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I.3- Aplicaciones de la técnica que coadyuvaron al desarrollo de nuevos microscopios electrónicos de transmisión

1. Determinación de estructura cristalina en minerales, metales, etc. 2. Estudio de catalizadores. 3. Determinación de impurezas, precipitados, etc. 4. Identificación de bordes de grano e interfaces en metales. 5. Estudio de fases y zonas cristalinas en polímeros. 6. Determinación de tamaño de partículas en catalizadores, minerales, etc. 7. Identificación de planos cristalinos. 8. Cambios estructurales de materiales sometidos a diferentes tratamientos térmicos. 9. Realización de estudios de histoquímica para identificar compuestos específicos. 10. Estudios de ultraestructura de tejidos vegetales y animales. 11. Reconocimiento de virus. 12. Estudios de cito química. 13. Estudios de estructuras moleculares. 14. Análisis elemental a nivel nanométrico. 16. Determinación de estructura cristalina a nivel nanométrico. 17. Estudios de interfases en recubrimientos, uniones de materiales semiconductores. 18. Estudios a nivel nanométrico de tratamientos térmicos In-Situ al interior del microscopio electrónico.

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I.3.1-Características notables que poseen los microscopios actuales con más capacidades.

• Ultra alta resolución (0.08 nm) • Alta magnificación (1.500.000x) • Gran aceleración de voltaje (hasta 300 kV) • Calentador de filamento automático • Alineación y saturación automática del haz • Gran contraste y brillo • Óptimo balance contraste/resolución • Modificación de la iluminación, el foco y la minimización del astigmatismo fácilmente • Corrector de aberraciones esféricas • Fácil manejo de controles • Operación automática • Análisis de alta sensibilidad • Gran cantidad de muestras a analizar • Mínimo daño de las muestras por el haz de electrones • Múltiples opciones de operación (inclinación, rotación, calentamiento, enfriamiento, crio muestras, etc.) • Aptos para aplicaciones de materiales biológicos y no biológicos • Exposición fotográfica automática • Adaptación de cámaras digitales que proveen imágenes instantáneas y de alta calidad con sólo apretar un botón • Información 2D y 3D y 3D-tomografía. Reconstrucción y visualización de imágenes • Almacenamiento de datos • Rápida adquisición de datos • Software con contenido de tutoriales, guías de manejo y operación remota • Goniómetro de alta estabilidad • Estabilidad eléctrica y mecánica

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• Estabilidad ante fluctuaciones magnéticas y térmicas • Versatilidad de detectores • Adaptación a bajas temperaturas (crio TEM) para muestras que pueden ser dañadas al ser tratadas con el protocolo tradicional (secado, fijado y tinción), además de la posible introducción de artefactos. • Observación de muestras no contrastadas. • Permite la adición de accesorios como binoculares, programas específicos, portamuestras especiales (eliminan el background), detectores ultra-sensibles, sistemas de crio-transferencia de temperatura, control de lentes individuales, scanning de las grillas para determinar una posición exacta, calibración semiautomática de la magnificación, programas de fotomontaje, operación remota, etc. • Se puede combinar con un equipo de barrido (STEM) • Obtención de resultados repetitivos y de alta calidad • Diseño ergonómico para el confort del operador El Microscopio Electrónico de Transmisión - TEM - se ha utilizado en todos los ámbitos de las investigaciones biológicas y biomédicas, por su capacidad para observar las estructuras más finas de la célula. También se utiliza como herramienta de diagnóstico en los laboratorios de patología de los hospitales. Los cristalógrafos, metalúrgicos y científicos que realizan investigación de semiconductores, usan preferentemente TEM de alto voltaje / de alta resolución, utilizando un voltaje de aceleración que va de 200 keV a 1 MeV. Se ha conseguido la proyección de imágenes de átomos, permitiendo a los investigadores supervisar los materiales y su diseño con propiedades a medida. Con la incorporación de análisis de energía dispersiva de rayos X (EDX) o espectrometría de pérdida de energía (EELS), el TEM también se puede utilizar como una herramienta de análisis elemental, capaz de identificar los elementos desde boro hasta Uranio.

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I.4 -Avances en la tecnología de microscopía electrónica de barrido:

I.4.1-FIB: ( Focused ion beam)

EL FIB o haz de iones enfocados es una técnica utilizada particularmente en la industria de los semiconductores, ciencia de los materiales y se está incrementando en el campo de la biología para realizar análisis de deposiciones y ablación de materiales. Es similar al microscopio electrónico de barrido. Lo que ocurre es que mientras el SEM usa un haz de electrones para obtener la imagen, un FIB usa un haz de iones por lo que debería denominarse Microscopio iónico.

Un uso típico es en la fabricación de semiconductores y se desarrollaron a partir de la necesidad creada por la industria de los microchips. La técnica utiliza una máscara para exponer una capa foto resistente sobre un sustrato hecho de un material semiconductor tal como dióxido de silicio o un arseniuro de galio – Este sello se revela para tener un positivo foto resistente. Las porciones expuestas son removidas con un proceso químico. El resultado es un patrón dejado sobre la superficie del sello que ha sido enmascarado para exponerlo. El sello se coloca en la cámara de vacío y se expone al haz de iones. El impacto de los iones erosiona la plantilla quitando áreas no cubiertas por el material foto resistente. Otra utilidad de estos instrumentos es realizar análisis de falla de semiconductores. Esta verificación combina el remover material o agregar material conductor, dieléctrico o aislante.

El instrumento posee un cañón de iones, un cañón de electrones y un micro manipulador. Con el de electrones se va observando la muestra, con el de iones se va horadando o calando la superficie. El micro manipulador se utiliza en el caso de que se desee obtener secciones finas o ultrafinas para Microscopia Electrónica de Transmisión. Los iones más utilizados son de Galio porque su punto de fusión es de 31 ° C pero puede depositarse, C, Pt, W, SiO2, etc.

Para idear este instrumento se basaron en la concepción de Gilbert (1600), y luego Taylor (1969). El principio de Gilbert decía que un fluido sometido a alta tensión formaba un cono, aun un fino hilo podía dispersarse en forma de jet. Taylor realizó la experimentación. Entonces el cono de Gilbert pasó a llamarse Gilbert-Taylor. El haz de Galio, que se forma en la punta del cono de Gilbert-Taylor logra una

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coherencia espacial transformándolo en un haz de iones. También puede hacerse el molido del material para grabar la superficie. Se utilizan Xe2 F, para Silicio y aislantes, I2, para metales, H2 O en el caso de C, polímeros.

Otras experiencias que pueden realizarse son: contactar estructuras microscópicas por deposición de metales, secciones no perpendiculares, repetir secciones para hacer imágenes 3 D, EDX en una línea de un área y EBSD: mapeo de una sección.

Figs. I. 2 e I.3 Los instrumentos modernos cuentan con un micro manipulador cuya función es extraer lamelas o secciones para TEM, realizar

mediciones eléctricas , manipular nano objetos, agregar o quitar otros, rotar, aplicar fuerzas , etc. También se pueden tallar muestras para observar su interior, grabar la superficie para realizar complejos patrones o agregar

materiales. Con respecto al Microscopio Electrónico de transmisión lo que sería importante mejorar es la resolución, sabemos que la resolución

depende de la longitud de onda de los electrones y la calidad de las lentes. La Long. de onda se achica aumentando el voltaje de aceleración o mejorando la corrección de la aberración esférica de la lente objetiva. El elemento clave del TEM ultra- alta resolución (UHRTEM) incluye tres nuevos componentes óptico electrónicos. El corrector Cs de aberración esférica de acuerdo al concepto de Rosew, que consiste de dos hexapolos y dos lentes dobles que proveen la completa compensación para la aberración esférica en las lentes objetiva. El segundo componente es un monocromador y se encuentra integrado en un sistema de emisión de campo. El monocromador reduce la dispersión del haz de electrones desde 0.7 eV a valores menores a 0.2 eV. La combinación del monocromador FE con el corrector Cs de la lente objetiva rompe la barrera de la resolución sub Angstrom. Finalmente el UHRTEM contiene en la columna un

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filtro de energía que dispersa los electrones de acuerdo a su energía. (Como un prisma dispersa los colores de la luz visible) y provee un espectro de energías perdidas (EELS).

Una imagen libre de artefactos. La habilidad de reducir los defectos de las lentes, la aberración esférica en tres órdenes de magnitud a un valor cercano a 0 no sólo incrementa la resolución sino que mejora la calidad de la imagen. (ref. reporte de Zeiss).

Los avances en preparación de muestras, instrumentación y metodología han llevado a ampliar las aplicaciones desde la escala sub nanométrica a la micrométrica. La tomografía electrónica (ET) por rayos X, la microscopía correlativa, difracción y holografía.

I.5- CONCLUSIONES De acuerdo a la información recabada, se observó que el fundamento por el cual funcionan los microscopios electrónicos de transmisión actuales es el mismo que el empleado por Ernst Ruska. No obstante estos equipos han evolucionado, y lo seguirán haciendo si se continúa mejorando la calidad de las lentes y se sigue multiplicando la versatilidad de aplicaciones que pueden alcanzar cuando trabajan combinados a otras técnicas y a otros avances tecnológicos de automatización, los cuales deben ir acompañados del perfeccionamiento en la adquisición de datos. Los principales proveedores de microscopios de transmisión electrónica en Argentina al momento de esta publicación son: JEOL, FEI Company (fusionada con Philips Electron Optics), Carl Zeiss y Hitachi. La mayoría de los actuales microscopios son multifuncionales y con controles computacionales, algunos ofrecen en un mismo equipo, TEM, STEM y EDX, otros ofrecen STEM, EDX, EELS y ADF, otros permiten STEM, EDX, EELS y ESI (electron spectroscopic imaging: imagen espectroscópica electrónica). El STEM es una modificación del microscopio de electrónico de transmisión, en el cual los electrones pasan por la muestra, pero, como en un SEM (microscopía electrónica de barrido), las lentes focalizan el haz de electrones un punto estrecho que es barrido sobre la muestra con un patrón o trama de barrido. La diferencia es que la acción de focalización del haz electrónico (y corrección de sus aberraciones) ocurre antes que éste impacte sobre el espécimen, a diferencia del TEM que ocurre después. El barrido del haz de electrones con una trama a través de la muestra, hace que estos microscopios sean convenientes para técnicas de análisis como el mapeo de la energía de los rayos-X dispersados (EDX), de la pérdida de energía de electrones (EELS) y la representación campo oscuro anular (ADF). Éste último es un detector de forma de disco con un agujero con el centro donde está instalado el detector convencional (bright field detector), y capta los electrones dispersados por la muestra en ángulos bajos, obteniéndose una imagen de contraste. También algunos equipos ofrecen como complemento un detector HAADF, que es similar al anterior, pero el diámetro y el agujero central son mucho mayores, de forma de detectar los electrones dispersados a altos ángulos, así, casi sólo la dispersión incoherente contribuye a la formación de la imagen. Estas señales (STEM, EDX, EELS, etc.) pueden ser obtenidas simultáneamente, permitiendo la correlación directa de imagen y datos cuantitativos.

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4

También muchos equipos TEM dan opción a “cryoholders” para analizar muestras a muy bajas temperaturas (< 100 K). Las resoluciones logradas, especialmente en STEM son de 1 Å o subangstroms para muestras ultra delgadas. Esto se logra con: potenciales de 100 a 300 KeV, con fuente de electrones del tipo emisión de campo (field emission gun), el cual fue desarrollado por Albert Crewe (década del 70) y crea un haz de electrones de mucho mayor brillo que la fuente tradicional termoiónica. Uso de monocromadores para evitar pérdidas de energía del haz de electrones. Correctores de aberraciones (esférica, cromática) que aumentan la densidad de corriente de la sonda de electrones mejorando la relación señal/ruido y aumentando la sensibilidad. Estos correctores fueron mejorados en los últimos 20 años por investigadores como Zach, Rose y Haider e incorporados a los TEM comerciales a partir de 2004. También los nuevos equipos cuentan con mecanismos para mejorar la estabilidad eléctrica y evitar fluctuaciones de temperatura y campo magnético en la columna del microscopio, reduciendo el tiempo empleado en el análisis de la muestra y aumentando la calidad del análisis. Las imágenes son obtenidas a través de detectores CCD (sistema para la captura de imágenes digitales). También hay que destacar que algunos microscopios pueden complementarse con un equipo FIB (haz de iones focalizado) usado en muestras grandes, lográndose láminas muy delgadas (algunos cientos de nanómetros) de un área de interés en una muestra como un semiconductor o metal.

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ina5

7

Capítulo I

Fundamentos de la microscopía electrónica

Ing. María Julia Yañez

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8

La mínima distancia

medible entre dos objetos para ser distinguidos

separadamente.

1.1-RESOLUCION

El concepto de resolución está relacionado con la capacidad de distinguir detalles finos en una imagen. Se puede definir como la mínima distancia medible entre dos objetos para ser distinguidos separadamente. Cuando rayos de luz emanan de un punto y pasan a través de una lente con apertura

semiangular , forman la imagen de un punto, con una intensidad difusa alrededor de él, llamada disco de Airy (Fig. 1). Este fenómeno es debido al efecto de difracción producido por las imperfecciones de la lente. Si se grafica la distribución de intensidades a su alrededor, se puede asumir que toda la intensidad está concentrada en una región de diámetro d1, siendo

1

1d

( diá metro apertura )

(i)

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9

Fig. 1.1 Si en lugar de un objeto tenemos dos objetos puntuales separados una distancia d. Según el criterio propuesto por Rayleigh, estos dos puntos

podrán distinguirse cuando el máximo de intensidad de un disco de Airy coincide con el primer mínimo del segundo disco. De acuerdo con esto, es fácil ver que la distancia d deberá ser mayor que d1/2 para reconocer los puntos como entidades individuales. El valor d1/2 se denomina límite de resolución. Para distancias menores que d1/2, los puntos aparecerán como una mancha difusa y será imposible discriminarlos.

De la teoría de difracción de Rayleigh , podemos derivar la relación (ii):

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0

r dsen

1 1 2

0 61/

.

(ii)

donde es la longitud de onda de la luz y µ es el índice de refracción del medio entre el objeto y la lente. El denominador de la expresión anterior se denomina apertura numérica (NA). Es importante notar, que la separación entre puntos no depende de alguna propiedad de la lente excepto de su apertura semiangular.

En un microscopio de luz usando aceite de inmersión para aumentar µ, empleando luz verde con una longitud de onda de 400 nm y una apertura numérica de 1.4, el límite de resolución es de 2000 Å aproximadamente.

En un microscopio electrónico, las lentes generan campos magnéticos y no hay cambio apreciable en el índice de refracción cuando los electrones pasan a través de ellos. Por esta razón, se asume un valor de µ=1. Además, los ángulos en los que se desvían los rayos al ser desviados por la lente son

pequeños y puede hacerse la aproximación sen( ) ( )tag con cierto grado de precisión. Con lo asumido anteriormente, la resolución teórica del microscopio electrónico es:

Para valores de = 0.037 Å y = 0.1 radianes, La resolución nominal es 0.2 Å.

1.2-NATURALEZA DE LAS ONDAS ELECTRONICAS

¨ La teoría cuántica de Max Planck y la teoría de la relatividad de Albert Einstein fueron dos grandes principios que permitieron asociar a electrones en rápido movimiento con una radiación de corta longitud de onda. Combinando ambos principios, De Broglie mostró que una partícula moviéndose a una velocidad cercana a la de la luz tenía una forma de radiación asociada con ella¨.

Esta relación está expresada por:

r1

0 61.

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1

h

m v

(iii)

donde es la longitud de onda, h la constante de Planck, m la masa de la partícula y v su velocidad.

Si la partícula es un electrón y su velocidad 1/3 de la velocidad de la luz, = 0.05 A, la resolución de un microscopio que emplee este tipo de radiación será mucho mejor que la de un microscopio de luz.

La naturaleza precisa de estas ondas de electrones es difícil de entender en términos de la física clásica y su descripción se hace mediante la mecánica cuántica. Las ondas de electrones no deben confundirse con radiación electromagnética se pueden pensar como un quantum o paquete de radiación que acompaña a cada electrón en su trayectoria, es parte de él y permanece con él. Las características de estas ondas dependen de la posición exacta de un dado electrón en el espacio y en el tiempo; puede expresarse como la probabilidad de encontrar al electrón en esa posición.

En el microscopio electrónico, la longitud de onda ( ), está relacionada con el voltaje de aceleración (Vr ) según:

12 26.

Vr

(iv) donde esta expresado en A° y Vr en eV.

1.3- Componentes fundamentales de un microscopio electrónico

Un microscopio electrónico (ya sea de barrido o de transmisión) está constituido, básicamente, por:

Cañón de electrones.

Lentes electromagnéticas.

Pantalla. El cañón de electrones de un microscopio electrónico es la responsable de la generación del haz de electrones. Debe reunir ciertos

requerimientos, entre ellos que produzca un alto brillo y tenga alta estabilidad. Las fuentes de electrones pueden ser termoiónicas o de emisión de campo.

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2

El tipo de generador electrónico más común es el de emisión termoiónica. Este está constituido por un filamento (F) (cátodo), un cilindro con una apertura central, llamado cilindro de Wehnelt (G) que rodea al filamento y tiene un potencial ligeramente más negativo que éste. El ánodo (A) se encuentra por debajo del cilindro de Wehnelt.

fig. 1.2

1.3.1 La emisión termoiónica:

En un emisor térmico, los electrones se emiten a partir de un material incandescente (termoiónica). La función de la corriente incandescente del filamento es dar a los electrones suficiente energía térmica para sobrepasar la barrera energética que evita que los electrones sean liberados. Todos los metales liberan electrones cuando se calientan a la temperatura adecuada, y cuanta mayor temperatura se aplica, mayor cantidad de electrones se emiten. Sin embargo, la mayoría de los materiales no sobreviven largo tiempo a las temperaturas requeridas para que sometidos a estos procesos, liberen una cantidad significativa de electrones. El Tungsteno (W) tiene una temperatura de fusión suficientemente alta (3650 Kelvin), lo que permite que el material soporte temperaturas elevadas por mayor tiempo (~ 2600- 3000K) y por tanto, es el material elegido para un emisor termoiónico típico.

El filamento es calentado por el pasaje de corriente. Los electrones emitidos termoiónicamente por el cátodo son acelerados hacia el ánodo, pasan por la apertura circular central de éste y un haz de alta energía es emitido hacia la columna del microscopio. El cilindro de Wehnelt tiene como función controlar el diámetro del área en la punta del filamento donde se emiten los electrones. Estos son concentrados en un plano de mínima sección transversal, en el cuál la densidad de electrones por unidad de área es la más alta, llamado punto de entrecruzamiento. Este es considerado ¨la fuente efectiva de electrones¨.

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3

El diámetro del haz en el entrecruzamiento depende del área del filamento desde donde se emiten los electrones y puede controlarse por la diferencia de potencial (bias) entre la punta del filamento y el cilindro de Wehnelt.

Otra manera de obtener emisión es reducir la “barrera energética de trabajo”, la cual limita la emisión. Materiales con bajas funciones de trabajo emiten a menores temperaturas (LaB6 por ejemplo). A estos materiales suele referírselos frecuentemente como emisores de campo parcial, ya que se explota el concepto de que su baja función de trabajo permite la operación a menores temperaturas que el tungsteno (~1400-2000 K). El uso del término “emisor de campo parcial” no es rigurosamente cierto, ya que el mecanismo primario de excitación sigue siendo activación térmica.

1.3.2 Emisión de campo

Las fuentes de emisión de campo operan mediante una reducción de la barrera de energía por un campo aplicado que permite la formación de túneles cuánticos de electrones a través de la barrera reducida hacia el vacío. Este es un proceso distinto a la emisión termoiónica. Existen dos tipos de emisores de campo: los asistidos térmicamente (también denominados Schottky) y los Emisores de campo frío, como lo implican sus nombres, los emisores asistidos térmicamente requieren calor, mientras que los de campo frío no. Ambos necesitan la aplicación de un campo externo para extraer el haz de electrones de una punta o extremo muy pequeño. Para el caso de los cañones termoiónicos y de hexaboruro de lantano (LaB6), se forma un sistema de tríodo con el filamento, cápsula de Wehnelt y ánodo. Mediante el diseño de la fuente de poder, la cápsula de Wehnelt es ligeramente negativa con el filamento y resulta un campo electrostático que funciona como una pequeña lente produciendo un enfoque de los electrones que son emitidos solamente desde una región limitada de punta caliente de la fuente de Tungsteno. Esta diferencia de voltaje es normalmente conocida como voltaje “desviado” del cañón. En los emisores de campo un sistema múltiple de ánodos es utilizado en lugar de la configuración de tríodo. En este caso se aplica un voltaje de extracción. Los voltajes de desviación son generalmente de unos cientos de volts, mientras que en el voltaje de extracción en un FEG (field emission gun) es generalmente en el rango de 3-5 kV.

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El filamento y la cápsula de Wehnelt (o último ánodo para un FEG) se conectan también a la terminal negativa de la fuente de alto voltaje. Por lo tanto, el haz de electrones que abandona el Wehnelt se acelera por el alto voltaje hacia el ánodo, que se coloca en la base del cañón. Esta aceleración proporciona a los electrones su velocidad axial (Z). Algunos de estos electrones logran pasar por una pequeña apertura en el ánodo que es la entrada a la columna de electrones. Una vez que pasa el electrodo del cañón (con potencial de tierra) la aceleración Z de los electrones es esencialmente cero y viajan a velocidad constante (determinado por el alto voltaje) hasta que golpean la muestra. La función de las lentes remanentes y los deflectores en el cuerpo de un microscopio sirven para provocar la desviación y enfoque posterior del haz hacia el espécimen, de la forma en que el analista lo requiera. Finalmente, puede notar que los electrones son emitidos a partir de un filamento termoiónico de una manera muy similar a como ocurre en un foco. En el caso del foco, la falla del filamento se debe a la transferencia de masa y a la fusión. Esto involucra el movimiento de átomos metálicos alejándose del punto de la falla (aun cuando se esté abajo del punto de fusión). El sobrecalentamiento de los filamentos genera que este fenómeno se produzca con mayor rapidez, reduciendo por tanto, la vida útil del filamento.

1.4 -LENTES ELECTROMAGNETICAS

Una lente electromagnética está constituida, por un cilindro anular de hierro blando (pieza polar), rodeado por una bobina de cobre. Al circular una corriente por los enrollamientos de la bobina, se genera un campo magnético en el espacio anular de la pieza polar.

La longitud focal de la lente está determinada por el voltaje de aceleración aplicado y por la intensidad de campo magnético en la lente, el cuál es una función inversa del producto de la corriente (I) en la bobina y el número de vueltas de la misma (N).

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f KVr

NI2

( ) (v)

donde K es una constante, La distancia focal puede cambiarse variando la corriente que circula por los enrollamientos de la bobina. A medida que incrementamos la

corriente que pasa por la bobina, se incrementa el campo magnético, las lentes se hacen más potentes y la longitud focal decrece. Los electrones al llegar a la lente, son influenciados por el campo magnético y siguen una trayectoria helicoidal. Este movimiento, no afecta las

condiciones de focalización y pueden aplicarse las mismas leyes ópticas que rigen los diagramas de rayos de microscopía de luz.

Fig.1. 3

Los electrones viajan en el haz a una fracción apreciable de la velocidad de la luz y es necesario hacer una corrección relativística. La misma

puede ser expresada como:

Vr Vo Vo1 0978 10 6. . . (vi)

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6

1.5- ABERRACIONES

Las lentes que se emplean en un microscopio, ya sea de luz o electrónico, no son perfectas sino que tienen defectos que deterioran la resolución.

Los rayos que pasan por la porción de la lente más alejada del eje óptico son focalizados más cerca de la lente que aquellos rayos que la atraviesan cercanos al eje (paraxiales).

fig.1. 4

* Aberración esférica: Este tipo de defecto es la incapacidad de una lente para focalizar todos los haces incidentes en un punto.

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En la actualidad se ha logrado corregir en dos órdenes de magnitud la aberración esférica, mediante el uso de monocromadores. Hay un disco de diámetro mínimo, entre estos dos focos, en el que convergen los rayos, conocido como disco de mínima confusión. El diámetro del mismo está dado por la expresión:

d Cs s

3 (vii)

donde Cs es el coeficiente de aberración esférica que está relacionado con la energía del haz y la longitud focal f; y la apertura semiangular de la

lente. Como vemos, la aberración esférica puede ser minimizada, pero nunca eliminada. Se puede minimizar disminuyendo pero si se hace

demasiado pequeña, la resolución limitada por la difracción se hace importante. Hay un tamaño óptimo de apertura en la cual la aberración esférica es minimizada sin afectar la resolución.

opt s

opt s

C

r B C

0 67 1 4 1 4

3 4 1 4

. / /

/ /

(viii)

siendo B una constante.

Al decir diferencia de energías estamos significando diferencia de longitudes de onda, que a su vez está asociada con diferencias en la velocidad

de los electrones. Electrones más rápidos, de corta longitud de onda son menos desviados por la lentes que los electrones más lentos, de mayor longitud de onda. Hay por lo tanto, distintos puntos de focalización. Este efecto se traduce en una imagen borrosa, similar a la que está fuera de foco.

Si diferenciamos la expresión de la longitud focal obtenemos:

* Aberración cromática: Esta aberración es causada por la diferencia de energías que tienen los electrones del haz.

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8

f

f

V

V

I

I

r

r

(ix)

Se demuestra que: ¨ cualquier cambio en el voltaje de aceleración o en la corriente de las lentes, causará un cambio en la longitud focal de las

mismas ¨ (f: Long focal; V voltaje, I: intensidad de corriente). Estas variaciones afectan la resolución en mayor o menor medida según la sensibilidad que tenga la lente a tales cambios. El parámetro que representa esa cualidad es el coeficiente de aberración cromática (Cc). La resolución dc limitada por los defectos cromáticos está dada por:

d CV

V

I

Ic cr

r

2 (x)

Este tipo de efecto puede ser eliminado logrando una muy buena estabilidad en el voltaje de aceleración. El Cc puede reducirse incrementando la

intensidad de campo magnético en la lente.

Puede deberse a diversas causas, como por ejemplo baja precisión en el maquinado de la lente, falta de homogeneidad en el material de la pieza

polar, contaminación, incorrecta alineación del eje óptico. La imagen aparecerá borrosa y deformada y será imposible alcanzar un foco óptimo.

* Astigmatismo: se produce por la asimetría del campo magnético de la lente. Dicha asimetría hace que la longitud focal en una

dirección sea distinta a la longitud focal en la dirección perpendicular a la anterior.

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Fig. 1.5 La cantidad de astigmatismo está definida como la distancia entre las líneas focales.

Para corregir este defecto, suele colocarse, cercano a la lente, una serie de enrollamientos (corrector de astigmatismo), que aplican un débil campo magnético sobre el haz electrónico para alcanzar la simetría deseada. El corrector de astigmatismo corrige la asimetría tanto en magnitud como en dirección.

1.6- PROFUNDIDAD DE CAMPO Y PROFUNDIDAD DE FOCO

Entre las características principales que tiene un microscopio electrónico se encuentran la gran profundidad de campo y profundidad de foco que posee.

a) Profundidad de campo

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0

Fig.1.6

Una imagen aparecerá en foco cuando el objeto se encuentre

en un plano apropiado. Si parte del objeto se ubica por encima o por debajo de dicho plano, habrá partes de la imagen que estarán fuera de foco. En la figura 6, se pueden ver dos rayos paralelos O1 y O2, separados por una distancia límite de resolución (r1). La distancia Do se denomina profundidad de campo.

El rango de posiciones que puede tomar un objeto, sin que se perciban cambios en la nitidez de la imagen, se denomina profundidad de campo.

Por simple geometría se tiene:

Dr

01 (xi)

donde es la apertura semiangular.

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1

b) Profundidad de foco

Un término que suele confundirse con la profundidad de campo es la profundidad de foco (Df). Esta es análoga a la anterior pero para el rango de posiciones en que puede ubicarse la imagen sin aparecer fuera de foco, para una posición fija del objeto. La profundidad de foco (Df ) se relaciona con la magnificación (M) y con la profundidad de campo, (Do )

Según:

MDMr

D f 01 (12)

Tanto la profundidad de campo como la de foco son funciones inversas de la apertura semi-angular y directa de la resolución. Como se observa en la figura 6 Debido a las cortas longitudes de onda y las pequeñas aperturas que se utilizan en microscopía electrónica, tanto la profundidad de campo como la profundidad de foco son grandes comparadas con las de microscopía de luz. Esta es una de las razones por las cuales el microscopio electrónico de barrido es usado para estudios topográficos de un material.

1.7- INTERACCION HAZ DE ELECTRONES - MUESTRA

Cuando el haz de electrones incide sobre un material, hay interacciones entre los electrones incidentes y los átomos que componen la muestra. Es importante, conocer y entender la naturaleza de dichas interacciones para interpretar correctamente la imagen observada. Se adoptará el término “ scattering” para significar la dispersión de electrones producida por las interacciones electrón – átomos de la muestra.

La probabilidad de que un electrón sufra scattering está descripta en términos de la sección transversal ( ) o bien, como el camino libre medio

( ). La primera está expresada como el área en la que una partícula se presenta al electrón incidente para ser dispersada. Si hay N partículas

por unidad de volumen y ( ) es la sección transversal para un evento de scattering. La probabilidad de que un electrón sufra scattering en su

pasaje a través de un espesor dx, será: N. .dx, de manera análoga se define el camino libre medio, que es la distancia que viajará el electrón antes que ocurra un evento de scattering.

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2

1

N (12i)

En microscopía electrónica de transmisión, donde las muestras deben ser delgadas (espesor < 800 Å) para poder observarlas, el camino libre medio para scattering es similar al espesor de la muestra y los electrones sufrirán como máximo un sólo evento de scattering. En SEM, las muestras son gruesas y los electrones incidentes serán dispersados (scattering) más de una vez. La probabilidad que un electrón incidente sufra (n) eventos de scattering mientras viaja una distancia x está dada por la ecuación de Poisson:

/exp.!

1)( x

x

nnp

n

(xiv)

Cuanto mayor sea el número atómico de los átomos que componen la muestra, mayor será la densidad atómica y por lo tanto, mayor la probabilidad que se produzca un evento de scattering. Para scattering múltiple donde los electrones se asumen dispersados varias veces por diferentes mecanismos, una descripción más adecuada es la simulación de Monte-Carlo.

1.7.1- SCATTERING

Existen dos tipos de eventos de scattering:

a) Scattering elástico. b) Scattering inelástico.

Este tipo de proceso es causado, principalmente, por las interacciones de tipo Coulómbicas entre un electrón incidente, el núcleo y los electrones del átomo.

Si la energía del electrón incidente es Eo, la probabilidad p( ) que sufra scattering elástico en un ángulo está dada por:

a). Scattering elástico: Es un proceso en el cuál un electrón incidente, puede cambiar su dirección, sin pérdida apreciable de energía.

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3

pE sen

( )( )

1

04

(xv)

Si la interacción inelástica tiene lugar entre el núcleo y un electrón incidente, de alta energía, éste perderá parte de su energía cinética debido al efecto de frenado que ejerce el campo coulómbico del núcleo atómico. Si el electrón incidente, interactúa con un electrón del átomo las energías de ambos se distribuyen. El electrón incidente sufre una pérdida de energía, que provoca una disminución de su velocidad desviando su trayectoria en un pequeño ángulo.

b) Scattering inelástico: En este tipo de proceso, un electrón incidente sobre un átomo, pierde parte de su energía pero no sufre cambios significativos en su dirección.

Fig.1.7 Fig.1.8

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4

Hay muchos tipos de interacciones con pérdida de energía, la cual se transfiere a los electrones o átomos de la muestra. Este tipo de scattering es

el responsable del frenado de electrones observado en un sólido. Parte de la energía cinética del electrón incidente se transferirá como calor a la muestra. Una pequeña porción de la energía escapará como rayos x o como electrones secundarios.

Un electrón interacciona con la materia de diversas formas. Los electrones incidentes, chocan con la superficie de la muestra e interaccionan elástica e inelásticamente con los átomos que la componen. Como consecuencia de esto, se producen rayos x, luz visible, electrones Auger, electrones retrodifundidos, electrones secundarios y si la muestra es delgada, electrones difractados, electrones transmitidos y electrones no dispersados. Cada uno de estos fenómenos se conoce como señal, es portador de una información característica de la muestra y es captado por detectores específicos. De acuerdo al tipo de información que deseemos obtener, seleccionaremos los detectores y equipos adecuados para ello.

En la figura, se presentan las principales señales que tienen lugar en un sólido cuando es bombardeado por un haz de electrones.

Fig.1.9

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5

Evento Señal Información

Elástico E- retrodifundidos Contraste por Z

Contraste topográfico

Inelástico E- secundarios Topografía superficial

Rayos x característicos Composición elemental

E- Auger Composición superficial

Catodoluminiscencia Concentración impurezas

Elástico transmitidos

E- transmitidos Ultraestructura interna

E- difractados

cristalografía

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6

1.8- COMPARACION ENTRE MICROSCOPIOS ÓPTICO Y ELECTRONICO

MICROSCOPIO ÓPTICO

MICROSCOPIO ELECTRONICO

Iluminación

Haz de luz

Haz de electrones

Longitud de onda

2000 Å - 7500 Å

0.037 Å - 0.086 Å

Lentes

Vidrio

Electromagnéticas

Medio

Atmósfera

Vacío

Resolución

2000 Å

1nm Auriga por ej

Magnificación

10 x - 2000 x

100 x - 1.000.000 x

Focalización

Mecánica

Eléctrica

Contraste

Absorción – Reflexión

Scattering

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7

la fig.10 se muestra un esquema comparativo entre los tres microscopios

Fig.1.10

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8

- Cañón de electrones. -Sistema de lentes.

-Pantalla fluorescente. -Sistema de adquisición

de imágenes - Portamuestras.

1.9 MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE TRANSMISION El sistema óptico-electrónico del microscopio electrónico

de transmisión está constituido por las siguientes partes:

Estos componentes están ensamblados en una columna vertical la cual se encuentra en alto vacío.

Fig. 1.11

El cañón de electrones, es la fuente emisora del haz de electrones. Se encuentra ubicado en la parte superior de la columna.

Cañón de electrones Lente condensadora: enfoca el haz de e-

Lente objetivo : forma la imagen

Cápsula de Whenelt: focaliza y concentra el haz

Lente intermedia: magnificación final Lente proyectora: proyección final

Pantalla: imagen final imagen final.

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9

El sistema de lentes está formado por lentes denominadas por su función cómo: condensadoras, objetivas, intermedias y proyectoras. La primera de las condensadoras, proyecta la imagen del punto de entrecruzamiento demagnificada (tamaño del haz), mientras que la segunda controla su diámetro y el ángulo de convergencia en que incide sobre la muestra. Cuanto mayor sea la magnificación, menor será el spot de iluminación y por lo tanto, menor el área de la muestra que se podrá examinar. La segunda lente condensadora está equipada con una apertura física que limita al haz que incide sobre la muestra.

La lente objetivo forma la primera imagen, localizada debajo del espécimen. De ésta lente depende, en gran medida la resolución final. Esta lente, tiene dos componentes importantes: la apertura física (apertura de objetivo), localizada en el plano focal posterior de la lente, y un corrector de astigmatismo. Los diferentes tamaños de la apertura de objetivo, permiten variar la proporción de electrones que son detenidos por esta apertura, lo que modifica el contraste de la imagen.

Las lentes intermedia y proyectora son las encargadas de amplificar la imagen dada por la lente objetivo y proyectarla sobre la pantalla de observación.

1.9.1- TIPOS DE CONTRASTE

El haz de electrones está formado por electrones que tienen una onda característica, determinada por una fase y una amplitud. En la interacción entre el haz de electrones y la muestra, los electrones emergentes sufren un cambio en amplitud y en fase, generando distintos tipos de contraste.

1.9.1 A- CONTRASTE MASA – ESPESOR (POR AMPLITUD).

Si la muestra es suficientemente delgada, se puede asumir que la mayoría de los electrones que llegan a la misma emergen desde el fondo de ésta. La dispersión de energía y el rango angular, están asociadas a los eventos elásticos e inelásticos que se producen a medida que los electrones atraviesan el material.

El efecto de colocar una apertura en el plano focal imagen de la lente objetivo será detener los electrones que son dispersados en un ángulo

mayor que la apertura semiangular . Si la apertura está centrada sobre el eje óptico, se obtiene una imagen de campo claro. Zonas con igual número atómico promedio, con regiones de la muestra más gruesas o con mayor densidad de partículas provocarán mayor

dispersión de electrones. Similarmente, para un mismo espesor, regiones de alto número atómico (Z) promedio, dispersaran mas electrones que regiones de bajos Z. En ambos casos, las zonas de mayor dispersión aparecerán más oscuras, generando lo que se conoce como contraste masa-espesor.

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0

Fig.1. 12 Este tipo de contraste básicamente es generado por materiales no cristalinos tales como muestras biológicas y polímeros. Una manera de

mejorar el contraste masa-espesor en este tipo de muestras, es incorporar átomos pesados que reaccionan con grupos específicos de la estructura. Estas áreas aparecerán más oscuras que las demás regiones, facilitándose la identificación de las mismas. Un detalle de los métodos de preparación adecuados para distintos tipos de muestras se presenta en capítulos posteriores.

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1

1.9.1B - CONTRASTE POR DIFRACCION.

Si la muestra es cristalina un contraste adicional contribuye a la imagen debido a que las intensidades de la dispersión son reforzadas en ángulos particulares. Este tipo de fenómeno es lo que se conoce como difracción de Bragg, que se explica, muy someramente, a continuación. Si se considera un haz de electrones coherente, es decir que las ondas individuales están en fase, incidiendo sobre un cristal, las ondas dispersadas que están en fase unas con otras se combinarán constructivamente y se reforzarán. Aquellas ondas que no estén en fase, interactuarán destructivamente y formarán un haz menos intenso.

Fig. 1.13 Las ondas dispersadas estarán en fase si difieren en un número entero de longitudes de onda.

2 d nsen( ) (xvi)

Esta condición de interferencia constructiva se conoce como Ley de Bragg de la difracción.

d: espaciado interplanar. n: orden de difracción, por convención se toma n=1.

: ángulo de Bragg. Es el ángulo entre el haz incidente y el haz difractado. En el caso de microscopía electrónica, la relación anterior se expresa como:

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2

r d L. . (xvii)

L es conocida como la longitud de cámara, es la distancia efectiva recorrida por los electrones desde el lugar de difracción hasta la pantalla del

microscopio. y L son independientes de la muestra. El producto .L es llamada constante de cámara y debe ser calibrada para cada

microscopio. Conociendo .L y midiendo r podemos determinar el espaciado interplanar d. En resumen: un haz de electrones será fuertemente difractado por los planos cristalinos si éstos se encuentran casi paralelos al haz incidente. Las zonas de la muestra que difractan fuertemente, aparecerán como regiones más oscuras en la imagen. La importancia principal del contraste por difracción es la capacidad de hacer visibles y resaltar defectos cristalinos tales como dislocaciones, fallas de apilamiento y precipitados. En muestras amorfas, cuyos átomos están distribuidos al azar, el diagrama de difracción consistirá en una dispersión de intensidades alrededor del punto central. En materiales cristalinos podemos encontrar dos clases:

a) Cristales simples: los cuales tienen una estructura periódica de átomos, generarán patrones de difracción formado por un arreglo de puntos. b) Poli cristales: los cuales tienen un conjunto de áreas discretas, cada una de ellas con un determinado arreglo atómico y una orientación particular. En este caso, el difractograma será una serie de anillos concéntricos. También pueden existir diagramas de difracción con una orientación preferencial. Estos son característicos de materiales poli cristalinos cuyos granos están parcialmente orientados al azar, pero donde es posible se ubican en una orientación particular. El modelo de difracción consistirá de anillos concéntricos con ciertas zonas de los mismos más brillantes que otras.

1.9.2-CONTRASTE DE FASE

Este tipo de contraste se produce debido a las diferencias en fase de las ondas de electrones dispersadas por una muestra delgada. El mecanismo de contraste de fase es muy sensible a pequeños cambios en el espesor de la muestra, orientación de la misma, variaciones en el foco o astigmatismo de la lente objetivo. La mayoría de los mecanismos de scattering involucran un cambio de fase por lo tanto, algo de contraste de fase está presente en toda la imagen; pero es más visible a altas magnificaciones y es muy útil en la observación de detalles de muestras de bajos Z. Este contraste está asociado microscopía electrónica de transmisión de alta resolución con (HREM).

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1.10-MICROSCOPIA ELECTRONICA DE BARRIDO (SEM).

El microscopio electrónico de barrido (MEB) tiene componentes comunes con el Microscopio electrónico de Transmisión (MET) tales como el cañón de electrones, sistema de vacío, lentes condensadora y objetivo. La diferencia principal entre ellos es la manera en que forman y magnifican la imagen. Esto hace que la información que se obtiene de cada uno sea distinta. Mientras el MET permite el estudio de la ultraestructura de muestras delgadas, el MEB posibilita conocer la morfología superficial. En el microscopio electrónico de barrido (MEB), el haz electrónico, atraviesa la columna y llega a la muestra. Un generador de barrido es el responsable de producir el movimiento del haz, de manera que barra la muestra punto a punto. De la interacción entre los electrones incidentes con los átomos que componen la muestra se generan señales, las cuales pueden ser captadas con detectores específicos para cada una de ellas. El detector capta una señal y las convierte en una señal electrónica que es proyectada en una pantalla (CRT). El barrido del haz está sincronizado con el barrido del CRT y produce una relación uno a uno entre puntos de la muestra y puntos en el CRT.

Fig. 1.14

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El mecanismo por el cual la imagen es magnificada es simple. La zona barrida por el haz de electrones sobre la muestra es menor que la región mostrada en la pantalla. La magnificación lineal está dada por la relación entre la longitud barrida sobre la muestra (l) y la longitud del barrido sobre el tubo de rayos catódicos.( TRC)(L):

l L

Por ejemplo, si l= 10 y L = 180 mm la magnificación será de 18000 X.

1- INTERACCION HAZ INCIDENTE - MUESTRA EN EL SEM.

Fig.1.15

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La interacción haz incidente-muestra produce una variedad de señales, las cuales brindan distinta información sobre la superficie de la muestra. Dichas señales pueden ser captadas por sus correspondientes detectores. Volumen de excitación primaria: Cuando un haz de electrones choca contra una muestra, los electrones incidentes penetran en el material una distancia que es directamente dependiente de la energía del haz e inversamente dependiente del número atómico de los átomos que componen la muestra. La región en la cual los electrones penetran la muestra se conoce como volumen de excitación primaria. En la figura, se aprecian las variaciones de dispersión electrónica cuando se utilizan bajos y altos voltajes de aceleración en materiales de bajo y alto número atómico. La profundidad de penetración y el volumen de excitación aumentan con el incremento de la energía del haz incidente y decrece con el incremento del número atómico. Una muestra compuesta por átomos de alto número atómico tendrá más partículas disponibles para detener la penetración del haz, que un material compuesto de elementos de bajo número atómico. Con el incremento de la energía del haz los electrones pueden penetrar más profundamente en la muestra por lo tanto, el volumen de excitación aumenta su diámetro y profundidad. Esto provocará una pérdida del detalle de la estructura superficial en la imagen debido al incremento de la generación de señales adicionales (ruido). Esta es una de las razones por las cuales el voltaje de aceleración es uno de los elementos limitantes de la resolución en el MEB.

Naturaleza de la interacción: En el volumen de excitación primaria, ocurren interacciones que generan señales tales como: electrones secundarios, electrones retrodifundidos, rayos x característicos, electrones Auger, catodoluminiscencia.

Electrones secundarios: son emitidos desde la muestra como consecuencia de las ionizaciones surgidas de las interacciones inelásticas. Poseen

baja energía ( 50 ev). Brindan una imagen de la morfología superficial de la muestra.

Electrones retrodifundidos: provienen de las interacciones elásticas y por lo tanto, tienen alta energía. Estos electrones tienen energías cercanas a la del haz incidente. Pueden interactuar con átomos de la muestra para generar electrones secundarios y los otros tipos de señales nombradas anteriormente. Son empleados para obtener imágenes de contraste por número atómico y contraste topográfico.

Rayos x característicos: Este tipo de señal; se produce cuando un electrón de un orbital interno de un átomo es desalojado por un electrón del haz incidente. La vacancia es llenada con un electrón de un orbital más externo. En este salto el exceso de energía es liberado en forma de radiación electromagnética (rayos x). Se sabe que cada orbital tiene una cantidad discreta de energía que es característica para cada elemento. Por lo tanto, la diferencia de energía entre orbitales es también una cantidad discreta y característica de un átomo en particular. La espectroscopía de rayos x dispersiva en energía (EDX), brinda información sobre la composición elemental de la muestra.

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Electrones Auger: Cuando un electrón de una capa externa llena una vacancia de una capa más interna, el exceso de energía puede inducir la eyección de un electrón de una órbita externa; convirtiendo esta energía en energía cinética. Este electrón es llamado electrón Auger. La energía de este electrón es aproximadamente igual a la diferencia de energía entre los orbitales involucrados en la transición. Esta técnica es más adecuada que la espectroscopía de rayos x para los estudios de muestras de bajo número atómico. Por poseer baja energía los electrones Auger pueden dar información precisa de las monocapas cercanas a la superficie. La emisión Auger es más alta en elementos de bajo número atómico debido a que los electrones están débilmente ligados al núcleo.

Catodoluminiscencia: Es la emisión de fotones en longitudes de onda en los rangos del ultravioleta, visible o infrarrojo, para disipar el exceso de energía que se genera en la transición electrónica entre orbitales. Esta técnica permite realizar estudios de concentración de impurezas en un material. Además de las señales anteriores, las cuales dan una información útil sobre la muestra, también se presenta un fenómeno no deseado cuando se realizan estudios con rayos x. Esto ocurre cuando un electrón incidente interactúa inelásticamente con el núcleo atómico, como consecuencia de esto se desacelera y provoca la emisión de rayos x, que no son característicos de ningún elemento. Se denomina: radiación blanca (Bremsstrählung) o rayos x del continuo.

fig.1.16

En la siguiente tabla se resumen las principales señales y su aplicación:

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7

DISTANCIA DE TRABAJO Y PROFUNDIDAD DE CAMPO EN MEB

La lente objetivo, demagnifica la imagen del filamento produciendo un haz de diámetro d sobre la muestra. La distancia entre la parte inferior de la lente objetivo y la superficie de la muestra es llamada distancia de trabajo (wd).

INTERACCION SEÑAL APLICACION

e- .incid / e- muestra

- e- secundarios

- morfología superficial

e- . incid / núcleo

- e- retrodifundidos

- contraste por número atómico - contraste topográfico

e- .incid / vacancias

- catodoluminiscencia - rayos x característicos. - electrones Auger

- concentración de impurezas - composición elemental - compos superficial

e- incid. o retrodif / núcleo atómico

- rayos x continuo

- señal no útil

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8

Fig. 1.17

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9

Fig 1.18

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0

Fig 1.19

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1

Fig. 1.20

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2

La gran profundidad de campo, que está dada en función de la distancia de trabajo como:

hwd

A M

0 2.

. (xviii)

siendo A la apertura de objetivo y M la magnificación. Para valores típicos de wd = 20 mm, A=100 µ y M=1000 x , la profundidad de campo es 40

µ.; mientras que en un microscopio óptico a la misma magnificación, h es de 1 µ.

1-12-Tipos de contraste en MEB: CONTRASTE TOPOGRAFICO

El contraste obtenido en el MEB con la señal de electrones secundarios, está relacionado con la topografía de la muestra y se conoce como contraste topográfico. La emisión de electrones secundarios desde la superficie depende del ángulo de incidencia. Cuando la

muestra se inclina un cierto ángulo , la distancia x recorrida por los electrones desde una profundidad xo = 100 Å, hasta la superficie se

incrementa según la relación:

x = xo sec( ) ( xix)

Al aumentar el ángulo disminuye la distancia x cos( ) para que los electrones secundarios alcancen y salgan de la superficie, aumentando la cantidad de electrones emitidos desde la misma. El efecto de la topografía sobre la imagen está relacionado con la posición del detector. Podemos entender el mecanismo de contraste en términos del ángulo de incidencia y la difusión electrónica.

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Figs 1.21.a y 1.21b

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Fig. 1.22

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Los electrones emitidos a la izquierda del pico que se muestra en la figura, quedarán bloqueados por este último, en su camino hacia el detector Aquellos electrones emitidos desde la superficie de la muestra que miran al detector, a la derecha del pico, no serán detenidos en el camino hacia aquel. El efecto total en la imagen será una zona más iluminada a la derecha que a la izquierda del pico. Por su parte, el pico emite electrones más eficientemente que el resto de la muestra. La estructura más delgada aparece más iluminada. Por lo visto anteriormente, la imagen producida en el MEB depende de muchas variables: el contraste, el brillo, la emisión electrónica, la corriente de las lentes electromagnéticas, aperturas, y está afectado por los cambios en la composición de la muestra, la topografía y la inclinación.}

FIG.1.23. ( Microscopio Electrónico de Barrido )

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fig.1.24

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fig.1.25

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fig 1.26

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Capítulo II

Preparación de muestras biológicas y de materiales para su observación por Microscopía Electrónica de

Transmisión.

Dra. Alfonsina Morales, Prof. Viviana Sorrivas, Ing. María Julia Yañez

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2. Fijación

Dijo Marlene Benchimol, microscopista brasilera : ¨Esto tiene más de brujería que de ciencia”

La fijación del tejido tiene por objeto preservar la estructura fina celular, las relaciones entre las células y la arquitectura de las organelas. En la fijación se reemplazan las uniones lábiles de las moléculas dentro de la célula por otras más estables y con ello se evita el colapso del citoesqueleto y la desorganización de las organelas.

En el procesamiento para microscopía electrónica de Transmisión, no debería hacerse una fijación por coagulación como se utiliza para microscopía óptica, con metanol o por calentamiento, porque se desnaturalizarían las proteínas y se alteraría la ultraestructura. Por ello se aconsejan los fijadores no-coagulantes, que mantienen la estructura terciaria de las moléculas y producen ligamentos cruzados entre ellas. En Microscopía Electrónica de barrido se utiliza frecuentemente FAA (formol, ácido acético, alcohol) ya que se realizan observaciones de la topografía externa.

Un fijador ideal debe mantener el medio ambiente similar al que tenía el tejido en su estado vivo, respetando su pH, osmolaridad y constitución iónica. Para cubrir estos aspectos, al agente fijador se le agrega un vehículo que tiene por función mantener:

- El pH, ya que los cambios metabólicos

producen acidez, que altera las

proteínas. El vehículo es una solución

tampón.

- La osmolaridad dado que el medio

isotónico previene que las células se

expandan o se contraigan.

- La fuerza o constitución iónica,

previniendo las extracciones de

moléculas y precipitados.

Debe tener además máxima solubilidad

en el agua y mínima en membranas

biológicas, lo que aumenta su poder de

penetración. Es aconsejable utilizar un

vehículo que no sea tóxico, dado que entra

en la muestra antes que el fijador y podría

dañar el tejido que aún no está fijado.

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2.1 pH del buffer

Los fijadores en general se ajustan a un pH cercano a la neutralidad (6,5 -8) salvo el tetróxido de osmio que se recomienda usar a pH 6 para la preservación de material nuclear.

El punto isoeléctrico de las proteínas es menor que el pH neutro del fijador y quedan cargadas negativamente. Para evitar que las proteínas se repelan, se agregan cationes que permiten su acercamiento como para poder establecer las uniones transversales en la fijación.

2.2 Osmolaridad

Siempre se mide el pH final del fijador a temperatura ambiente

El término osmolaridad: Se refiere a

los ¨moles por litro de solución¨, que

tendrá una solución ideal de

sustancia no disociada, para poseer la

misma presión osmótica que una

solución control ¨.

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El término osmolaridad se utiliza en microscopía electrónica asociado al comportamiento del tejido sumergido en una solución. En general se selecciona el fijador según trabajos realizados con tejidos similares y luego se ajusta su osmolaridad si se observan signos de contracción o hinchamiento.

La osmolaridad del tampón juega un rol fundamental en la determinación de la presión osmótica y el glutaraldehído utilizado para la primera fijación, contribuye a esta presión.

La osmolaridad de las soluciones se determina midiendo la depresión del punto de congelamiento. El punto de congelamiento a presión ambiental es la temperatura a la cual las fases líquida y sólida permanecen en equilibrio. La osmolaridad del tampón juega un rol fundamental en la determinación de la presión osmótica, el glutaraldehído contribuye a esta presión.

2.2.1 Cómo ajustar la osmolaridad?

Se pueden agregar electrolitos o no electrolitos al tampón. Los más

comunes son: sacarosa, glucosa, polivinil pirrolidona (PVP) y electrolitos como cloruro de sodio y cloruro de magnesio. Los electrolitos pueden cambiar el pH así que habrá que medirlo y ajustarlo en la solución final. Las sustancias mencionadas se agregan en la primera fijación con Glutaraldehído o la segunda con tetróxido de osmio. Pero NO, si la primera es con tetróxido de osmio, porque pueden ocasionar la pérdida de materiales solubles del tejido durante la fijación. Si se agregan iones como Mg++ y CA++, se prefiere Mg++ porque no precipita las proteínas.

Cada tipo de célula requiere una osmolaridad diferente. Se determina por prueba y error. Excepto para tejidos en que ya se ha determinado con un osmómetro.

Cómo seleccionar la mejor osmolaridad?

Recordamos: Osmosis: Es el movimiento neto del agua a través de una

membrana semipermeable en respuesta a un gradiente de concentración del soluto (el agua se desplaza para diluir la solución más concentrada). Sólo se produce ósmosis cuando tenemos una solución hiperosmolar y una hiposmolar separadas por una membrana semipermeable.

Osmolaridad: La concentración del agua depende de la

concentración de partículas del soluto (en relación) y no de moléculas de soluto, ya que algunas moléculas se disocian en iones.

Su unidad es Os, osmol, o número de partículas (iones o moléculas intactas) por litro de solución. La concentración del agua es igual en una solución con 1 mol de glucosa y 1 mol de NaCl; 3 moles de glucosa; o 1,5 moles de NaCl. O sea son 3 Os de soluto /lt.

La osmolaridad es una propiedad coligativa de las soluciones, depende estrictamente del número de partículas /l de solución. La medida de osmolaridad sola no predice qué le ocurrirá a la célula en la solución, porque depende también de la cantidad de solutos no-penetrantes propios de la célula.

Tonicidad o estiramiento, en cambio, describe el volumen

celular cuando la célula ha alcanzado el equilibrio con la solución. La tonicidad no tiene unidades, solo es un término comparativo. Por ejemplo, si la célula pierde agua y se encoge cuando es puesta en una solución, se dice que la solución en hipertónica. Si no cambia su volumen es una solución isotónica.

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Para tejidos que poseen diferentes tipos de células, habrá que pensar cuáles son las que se necesitan preservar y ajustar la osmolaridad a ésas células solamente.

Ejemplo: si hablamos de los tejidos animales para fijar médula de riñón, necesitaremos osmolaridad diferente según el nivel que necesitemos

estudiar. En vegetales, por ejemplo, si se desea fijar una hoja, tendremos: epidermis, parénquima en empalizada, esponjoso, xilema y floema. Cada uno de esos tejidos posee una osmolaridad diferente.

En la tabla II-1 se detallan valores de osmolaridades tipo para tomar como base. (Principles and Techniques of Electron Microscopy. Biological applications. Fourth edition : MA Hayat. Pág:13 y 14).

Tabla 2.1- Osmolaridades aproximadas de vehículos

Vehículo osmolaridad en mOsm.

0.1M cacodilato de sodio +0 05%Ca2Cl +0.07M sacarosa 250

0.1M cacodilato de sodio +0 05%Ca2Cl +0.1 sacarosa 300

0.1M cacodilato de sodio +0 05%Ca2Cl +0.18M sacarosa 350

0.1M cacodilato de sodio +0 05%Ca2Cl +0.23M sacarosa 400

0.2M cacodilato de sodio 350

0.15M Sörensen 300

0.19M Sörensen 350

0.2M Sörensen 400

0.2M collidina+0.16M sacarosa 400

Tabla 2.2-Osmolaridades aproximadas (mOsm) de soluciones tampón y fijadores de glutaraldehído (Ga) (pH 6.85)

Tampón sólo tampon tampón +1%Ga tampón +2%Ga tampón +4%Ga

0.1M fosfato 212 345 472 710

0.1M cacodilato 220 340 470 720

Fosfato isotónico 310 441 575 800

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Caulfield 280 390 504 730

Dicromato de Dalton 345 503 630 895

Tabla 2.3-Osmolaridades del fijador Glutaraldehído en diferentes concentraciones y distintos vehículos

Glutaraldehído %

Vehículo osmolaridad (mOsm)

1.5 0.07M Sörensen+0.015% Cl Ca2 300

1.8 0.05M Sörensen 250

1.8 0.05M Sörensen + 0.05M sacarosa 300

1.8 0.05M Sörensen + 0.1M sacarosa 350

1.7 0.1M Sörensen 350

1.7 0.1M Sörensen + 0.05M sacarosa 400

2.5 0.05M Sörensen + 0.08M sacarosa 400

2.5 0.1M Sörensen + 0.13M sacarosa 450

2.0 0.05% Sörensen 300

1.8 0.1M Sörensen 350

2.0 0.1M Sörensen 400

1.8 0.08M Sörensen+0.015% Cl Ca2 350

2.2 0.08M Sörensen 400

1.8 0.1M cacodilato+0.05 Cl Ca2 350

2.0 0.1M cacodilato 400

1.5 0.1M colidina+0.05% Cl Ca2 350

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3.0 0.1M colidina+0.10 % Cl Ca2 400

2.5 0.1M colidina. 350

Tabla 2.4 -Osmolaridades promedio de soluciones tamponadas de glutaraldehído a diferentes concentraciones:

Ga % Miliosmoles pH

Fosfato 0.1M 230 7.4

1.2% a 370 7.2-7.3

2.3%Ga 490 7.2-7.3

4.0% Ga 685 7.1-7.3

Notas a tener en cuenta:

El vehículo de la solución fijadora es mejor que sea algo hipertónico, debido a que cambia la osmolaridad total por la penetración del fijador y por su dilución.

Para tejidos vegetales maduros, vacuolados: 800 mOsM (mesófilo), 400 mOsM (tejidos meristemáticos, ejemplo ápice de raíz). Para mamíferos, una Osmolaridad total de 500 a700 mOsM, donde la osmolaridad del vehículo sea aproximadamente 300 mOsM. Para

especímenes delicados: se prefiere 300-350 mOsm. El fijador de Karnovsky tiene una osmolaridad de 2010 mOsm. Para microscopía electrónica de barrido la solución debería ser isotónica.

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Fig.2.2 -En el cuerpo humano la solución isotónica a la sangre tiene 300

mOs/l aproximados: 0.3 OsM/l = 0.15 M NaCl = 0.3 M Sacarosa.

El volumen celular depende de :

1) las bombas de iones de la membrana (ATPasas)

2) presión osmótica intracelular.

-Riñón: 420 mOs -Cerebro:800 mOs.

volumen de glóbulos rojos cómo se encuentran en los fluidos del cuerpo.

Concentración osmolar de Cl Na 0

GA al 2%: 100 ml---2g 1000 ml—20g 100,11 g---1 mol glutaraldehído 20g---------- x= 0.2 mol/lt = 200 mOs

Fig.2.1 Bacterias y esporas. Barra 1 µ

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Fig.2.3- Así, si en un mol de Cl Na hay 58,443 gramos /litro, en 0.015 moles/l calculamos el % de la

solución salina isosmótica e isotónica. Que es al 0.9 % . Aporte teórico del glutaraldehído:

Por lo tanto contribuye poco a la osmolaridad, hay que controlar el vehículo agregándole sacarosa o sales. .

Aporte del teórico del buffer fosfato: En el caso del buffer no es tan sencillo porque al variar el pH, cambia el grado de ionización y,

por lo tanto la osmolaridad:

Buffer fosfato 0,1 M a pH 6,85 tiene una osmolaridad de 212 mOs 7,2 226 mOs. Aporte del teórico de la sacarosa:

Cuando la solución resulta muy hipo osmótica, se le puede agregar sacarosa al 5%: cuyo aporte es:

100 ml----5g

El osmio no contribuye a la osmolaridad prácticamente. Durante la fijación con osmio se liberan algunos lípidos de membrana y las proteínas empotradas a ellos. Por eso aumenta la permeabilidad a los iones y no hay cambios por osmolaridad. Se pierde la propiedad de membrana semipermeable. Es lo mismo usar un vehículo de alta o baja osmolaridad, aunque algunos autores sostienen que esto no es del todo cierto e igual conviene usar una solución en buffer.

GA al 5 %: 100 ml-----5g 1000 ml—50g 100,11 g---1 mol glutaraldehído 50g----------0.5 mol/l = 500 mOs.

Si la muestra es un riñón, por ejemplo, no habría que agregarle nada al vehículo.

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1000 ml—50 g

342.3 g---1 mol 50 g----x= 0.14 mol/ lt = 0.14 Os = 140 mOs

En resumen, según el aporte teórico, la osmolaridad total de la solución fijadora sería de 586 mOs:

*Buffer fosfato 0.1 M a pH 7,2……....226 mOs *Sacarosa 5%………………………...140 mOs *Glutaraldehído 2%...........................200 mOs

586 mOs Sin embargo, cuando se mezclan sustancias no se puede calcular la osmolaridad exactamente. Es por eso que es mejor medirla con un

osmómetro. Así, la osmolaridad total real del GA en buffer fosfato resulta: Concentración del GA pH osmolaridad

1-2% 7.4 370 mOs

2-3% 7.2-7.3 490 mOs 4% 7.1-7.3 685 mOs

Este resultado difiere del calculado teóricamente. Algunos autores calculan de este otro modo la osmolaridad:

Osmolaridad efectiva = mOs (GA) + mOs (vehículo) Y otros autores prefieren despreciar la osmolaridad del GA o FA y sólo consideran la del vehículo para los cálculos. OJO: cuando la osmolaridad es alta, aparecen las “células oscuras”, que han sido descriptas en sistema nervioso central, epidídimo y epidermis,

pero son artefactos.

En el caso de la 2º fijación con osmio al 1%: 100 ml----1g 1000 ml—10 g

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254,2 g--- 1 mol OsO4

2. ------- x= 0.04 mol/lt = 40 mOs.

2.3Composición iónica de la solución fijadora: 2.3.1: Agregado de electrolitos

Para el normal funcionamiento de las células se requiere un balance iónico perfecto. (Ca++, Mg++, K+, Na+). Hay poca información en la

literatura sobre los iones que deberían agregarse a la solución fijadora y en qué concentración, por lo que se realiza por prueba de acierto y error. Puede suceder que si no hay un balance exacto se pierda material de las células o se deposite fijador como precipitado.

2.3.2 Agregado de sustancias no-electrolíticas: como glucosa o sacarosa al 5%.

No deben ser usadas si se realiza una 1ra. fijación con tetróxido de osmio ya que inhiben la fijación de la albúmina.

2.4 Constitución iónica

Cuando la composición del fijador difiere del líquido extracelular normal del tejido puede haber extracción del material

Como se comentó anteriormente, son mejores los fijadores algo hipertónicos, ya que al fijar la célula se produce la pérdida de la semipermeabilidad de la membrana. Al inactivarse la bomba de sodio, este ión se mantiene dentro de la célula y en un medio isotónico penetraría agua en ella.

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celular o depósito del fijador. Esto ocurriría antes de que el tejido esté adecuadamente fijado, especialmente con los fijadores

que penetran o reaccionan lentamente (OsO4 y FA).

Se pueden explicar algunos efectos de extracción por la presencia de ciertos iones, como el ión bicarbonato, que

destruye específicamente los microtúbulos (Schultz y Case,1968).

En cambio, otros iones son beneficiosos, como los iones bivalentes Ca2+ y Mg2+ que son necesarios para mantener las

membranas lipídicas. Se prefiere usar el ión magnesio al calcio porque es una molécula de menor tamaño, y en

concentraciones adecuadas no precipita las proteínas (Millonig y Marinozzi-1968).

Por último, en la selección del ión que va a utilizarse se debería considerar que éste no produzca un efecto fisiológico

específico en ese tejido, como la secreción glandular o la contracción muscular.

Cómo determinar si la elección la osmolaridad fue la correcta observando las mitocondrias.

En el caso de elegirse el calcio, se debe agregar 1-3 mM de CaCl2 al glutaraldehído ya que a

mayor concentración se forman precipitados. Además, si se usa el buffer fosfato, el agregado de

CaCl2 puede dar lugar a la formación de cristales de fosfato de calcio que no se solubilizan en

los lavados.

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12

Baja concentración iónica

Alta concentración iónica Con Calcio

Con S-colidina Osmio a pH 7 En agua destilada Fig 2.4

2.5 Factores que afectan una fijación

2.5.1 Temperatura:

Lo más usual es trabajar de 4 a 10ºC y hasta 20 ºC. A mayor temperatura de fijación ocurre un aumento de la velocidad de difusión

del fijador dentro del tejido pero también se produce mayor autólisis y extracción de material. A bajas temperaturas pueden no preservarse estructuras lábiles como los microtúbulos.

En casos especiales, como en el estudio de algunos tipos de miosina, se aconseja trabajar a 37ºC. y no congelar el tejido. Para la preservación de enzimas muy lábiles, la fijación debe llevarse a cabo en frío. En el caso de fijación por perfusión el glutaraldehído debe utilizarse a temperatura corporal para que no se produzca vaso constricción.

2.5.2 Duración de la fijación

Depende tanto de la velocidad de penetración del fijador como de su rapidez de reacción. Generalmente se utiliza una

primera fijación de 1 a 4 horas a temperatura ambiente o a 4°C.

El tiempo óptimo va a estar controlado por: el tipo de fijador, el tamaño de la muestra, el tipo de espécimen, la

temperatura, el tampón, el método de contraste y el objetivo del estudio. El microscopista experimentado podrá aconsejar los

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tiempos de fijación de acuerdo a los parámetros antes indicados.

2.5.3 PH del fijador:

Las proteínas tienen carga eléctrica positiva o negativa y el punto isoeléctrico depende de los grupos ácidos y básicos presentes en las moléculas. En su punto isoeléctrico las proteínas son neutras, muestran menos solubilidad y viscosidad, menor presión osmótica y menos hinchamiento.

Las proteínas son capaces de combinarse con cationes en su fase alcalina y con aniones en su fase ácida. Una desviación del pH de su punto isoeléctrico resulta en un incremento de la ionización, la presión osmótica de la solución aumenta.

El tetróxido de osmio disminuye el punto isoeléctrico de las proteínas, probablemente debido a la destrucción de aminoácidos básicos. La red de cargas negativas de las proteínas aumenta con la fijación de tetróxido de osmio. Los fijadores como glutaraldehído, formaldehído y dicromato de potasio bajan el punto isoeléctrico de las proteínas.

Las células vegetales que contienen una gran vacuola tienen una alta presión osmótica en su interior.

El pH de las células varía entre 5.0 y 6.0 mientras que el pH del citoplasma de las mismas células varía

entre 6.8 y 7.1.

Un incremento del pH significa un aumento de la capacidad de entrecruzamiento del Glutaraldehído.

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Pequeños cambios en el pH de los fijadores producen cambios en el interior de las células, incluyendo la consistencia del protoplasma, la selectividad de la membrana y la actividad de las enzimas

Un pH de 8.0 parece ser más efectivo en vegetales.

Cómo aumentar el pH:

Los especímenes se fijan por inmersión del 3 al 6% de glutaraldehído en tampón a pH 7.0

por una hora a temperatura ambiente.

Luego se lleva el pH del Glutaraldehído a 8.0 en tres pasos, agregando a los 30´ y a los 60´

gotas de 0.1N de Na OH, mientras se agita la solución. Los especímenes se dejan en esta

solución por una hora más.

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Resumiendo:

Tabla 2.5

Fijador Carbohidrato

s

Ác. Nucleico

s.

Proteínas

Fosfolípidos Lípidos neutros

aldehídos

- +

(histonas) ++ - -

osmio - +

(histonas) ++ ++ -

permanganato

Sí, destruye destruye destruye destruye destruye

uranio Sí, destruye ++ + - -

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2.6 Vehículos

Los mismos líquidos propios de la muestra a los que se les agrega directamente el fijador son los indicados. Por ejemplo el plasma sanguíneo para ver glóbulos rojos o el agua de mar para estudiar algas marinas. En el caso de células en cultivo se aconseja utilizar el mismo medio, pero considerando que contienen proteínas que también serán fijadas y contrastadas y podrían llegar a entorpecer la observación. (SEM)

2.6.1 Los vehículos más utilizados:

2.6.1.1 Tampón fosfato:

Se usa en general el de Sörensen 0,067M. ( pH 7,2-7,4), de osmolaridad 226 a 230 mOs.

. El pH varía poco con la temperatura.

. No es tóxico (para células en cultivo).

. Económico.

. Bueno para perfundir, ya que es semejante al medio fisiológico.

. No se recomienda para estudios citoquímicos de enzimas.

. Se contamina fácil con microorganismos y más con el agregado de sacarosa.

. Precipita con acetona.

. No permite la adición de Ca++.

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2.6.1.2 Tampón cacodilato: Na(CH3)2 AsO4.3 H2O

. Se conserva largo tiempo porque no se contamina. . Permite la adición de Ca++. . Tiene mayor osmolaridad que el buffer fosfato. . Capacidad tampón máxima a pH 6.4-7.4.

. Es carcinogénico y tóxico, contiene arsénico. Tiene aroma a ajo. Se absorbe por piel.

. Destruye las vesículas sinápticas si se lava por más de 30 minutos.

2.6.1.3 Tampón Veronal-acetato:

. Cuando se usa uranilo en bloque, porque no produce precipitados.

. Tiene poco poder buffer entre pH 5-7.5.

. No se debe usar con aldehídos porque reacciona.

. Contiene barbitúrico.

. Desarrolla microorganismos durante el almacenamiento.

2.6.1.4 Tampón colidina: (2,4,6 trimetil piridina)

. Estable a temperatura ambiente. . Permite mayor penetración de fijador en grandes trozos de tejido.

. Muy mal olor. . Muy tóxico. . Extrae material celular, lisa las membranas.

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2.7 Fijadores

En general se recomienda realizar una primera fijación con un aldehído, de mayor rapidez de reacción, que fija proteínas y entre ellas las encargadas de iniciar la autolisis, y luego una fijación con un oxidante, como el Tetróxido de osmio, que fija los lípidos de las membranas. Si se sigue este esquema, entre las fijaciones con el aldehído y el oxidante en necesario realizar un lavado para que no se reduzcan los fijadores oxidantes del segundo paso.

2.7.1 Fijadores aldehídos:

2.7.1.1 Glutaraldehído (GA): Sus dos grupos aldehídos forman enlaces con los grupos amino de las proteínas y ácidos nucleicos.

Muy importante: En general se recomienda realizar una primera fijación con un aldehído, de mayor rapidez de reacción, que fija proteínas y entre ellas las encargadas de iniciar la autolisis, y luego una fijación con un oxidante, como el Tetróxido de osmio, que fija los lípidos de las membranas.

Si se sigue este esquema, entre las fijaciones con el aldehído y el oxidante en necesario realizar un lavado con buffer para que no se reduzcan los fijadores oxidantes del segundo paso.

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Reacciona con aminoácidos (Lys, Tyr, Trp, Hys, Phe) dando bases de Schiff, amarillas. Esta reacción permite chequear la profundidad de la fijación. Fija las proteínas, el glucógeno, los ácidos nucleicos y también algunos lípidos, como la fosfatidil etanolamina.

La osmolaridad del GA en buffer fosfato 0.1 M (230 mOsm, pH 7.4):

Concentración osmolaridad pH 1.2% 370 mOs 7.4

2.3% 490 mOs 7.2-7.3 4.0% 685 mOs 7.1-7.3

Cómo se almacena? Se debe mantener a 4 ºC y descartar si el pH cae por debajo de 3.5, que es debido a la formación de ácido glutárico o contaminación con CO2. Se vuelve amarillo cuando está polimerizado.

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Admite el agregado de sacarosa, que no demora su reacción, y también de Cl2Ca. . Penetra 1,5 mm/ h. a temperatura ambiente. Es lento al entrar al tejido aunque luego reacciona muy rápido.

. Irrita la piel, los ojos, las vías respiratorias. Es mutagénico, alergénico y sensibilizante. Produce dermatitis.

. No es apto para las técnicas de inmunolocalización porque tapa los epitopes, se utiliza en muy baja concentración.

2.7.1.2 Formaldehído: H2C=O

CH2=O R---NH2 + CH2=O R---NH---CH2---OH R---NH---CH2---NH---R La formalina o formol comercial es una solución al 38% de formaldehído que contiene metanol (11-16 %). Por eso conviene usar su forma polimérica, el paraformaldehído (PFA). Igual que con el GA, la permeabilidad de la membrana será parcialmente preservada y es conveniente cuidar la osmolaridad del vehículo.

. Es 10 veces más rápido como fijador que el GA. Se pueden tratar bloques mayores de tejido.

. Es bueno para las técnicas de inmunolocalización.

. Da una reacción reversible, por lo que no conviene prolongar el lavado. . No fija los polisacáridos. . La preservación de la ultraestructura celular es menor que con el uso de GA.

2.7.1.3 Acroleína:

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-Se prepara al 10% en buffer fosfato 0,025M. El producto comercial es líquido y puede ser purificado por destilación para remover la hidroquinona que se usa como estabilizante.

. Tiene muy buena penetración (1mm/h hasta en bajas temperaturas),

. Sirve para trozos grandes, células vegetales y microorganismos de paredes gruesas.

. Es muy soluble en agua.

. Es hipertónica: no es necesario usar aditivos

. Es tóxica e inflamable.

. Solubiliza los lípidos (es extractiva ) y altera los microtúbulos.

. Inhibe las enzimas: no se puede usar en histoquímica.

. También requiere una 2º fijación con osmio.

2.7.2 Fijadores oxidantes:

2.7.2.1 Tetróxido de osmio: (OsO4)

PM: 254.2 Fija las cadenas insaturadas de lípidos. Si se deja el tejido un tiempo prolongado, quiebra las uniones de las proteínas. Se deposita en las regiones

polares, hidrofílicas, de los fosfolípidos de membrana y se reduce a OsO2 de color negro. Lo que permite rastrear hasta dónde ha sido fijado el bloque de tejido.

El osmio también reacciona con los sulfihidrilos de las proteínas. No reacciona con los ácidos nucleicos, pero sí con las proteínas asociadas a ellos (histonas) y quedan atrapados.

Los primeros sitios de reacción son las ligaduras dobles alifáticas. Esta oxidación produce un monoéster del ácido ósmico acíclico, que se hidroliza hasta un diol, otro monoéster, que es inestable, reacciona con el diol dando un diéster estable.

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Durante la fijación con osmio se pierden algunos lípidos de membrana y las proteínas empotradas a ellos. Por eso aumenta la permeabilidad a los iones y no hay cambios por osmolaridad. Se destruye la propiedad de membrana semipermeable. Es lo mismo usar un vehículo de alta o baja osmolaridad, aunque algunos autores sostienen que esto no es del todo cierto e igual conviene utilizar una solución en tampón.

Si se usó tampón de lavado con el agregado de sacarosa al 5 % conviene hacer un último lavado sin sacarosa antes de fijar con osmio.

. Reacciona con los lípidos, proteínas y ácidos nucleicos.

. Da contraste.

. Facilita la ubicación del trozo de tejido en el taco de resina en el ultramicrótomo

. Es muy volátil y tóxico: produce daño pulmonar y renal, quemaduras en la piel. Es carcinogénico. . Penetra y reacciona muy lentamente (0.5 mm /h): hay que usar trozos de material muy pequeño, para que no se altere la ultraestructura antes de producirse la fijación.

. Produce la contracción de los nervios mielínicos.

. NO se debe usar con buffer TRIS porque explota.

. Por dar un taco opaco no se puede usar antes de la inclusión con resinas que deben polimerizarse con UV.

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. Disminuye la extracción de material celular con el agregado de CaCl2 o MgCl2, pero puede formar precipitados.

2.7.2.2 Tetróxido de Rutenio: RuO4

Es de penetración lenta y se debe usar buffer veronal o cacodilato para mejorar este aspecto. Costoso. Reacciona con lípidos polares, proteínas y

glucógeno. 2.7.2.3 Permanganatos:

Se reduce sobre los fosfolípidos y proteínas de la membrana a MnO2. No reacciona con los lípidos no-polares. Es de penetración lenta. Se debe fijar el tejido a 5-10º C. para evitar necrosar el material, y sólo por 15 min. a 2h, ya que el tejido se vuelve friable. Los tejidos fijados con permanganatos y embebidos en parafina son luego duros de cortar.

Permanganato de potasio:

. Sirve como contraste negativo. . Se conserva el ADN, aunque no la estructura de los cromosomas. . Fija y contrasta el glucógeno. . Se usa en botánica. . Extrae proteínas, ribosomas, microtúbulos y microfilamentos. . Se pierden lípidos y ARN. . Rompe las membranas.

Permanganato de sodio:

. Es mejor que el de potasio ya que preserva mejor las membranas.

. Forma gránulos sobre las membranas.

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2.7.3 Fijación y contraste en bloque con acetato de uranilo:

. Disminuye la extracción de material. . Se une a los grupos fosfato de los ácidos nucleicos y fosfolípidos. . Se une a los grupos carboxilos y aminos libres. . Fija las proteínas. . Aumenta el contraste.

. Aumenta la extracción de glucógeno citoplasmático. . Precipita con el buffer fosfato y cacodilato. Se lo usa al 0,5%- 5% en agua durante 2-24 h. luego de la post fijación con OsO4 a 4ºC. . Es foto lábil. . Es radiactivo.

2.8 Tipos de fijación

2.8.1 Por inmersión: La fijación por inmersión se realiza sumergiendo pequeños trozos de a muestra en un recipiente que contenga la solución fijadora (fijador + vehículo) en un volumen 10 veces mayor por lo menos.

2.8.2 De un cultivo en monocapa : Cuando se tiene un cultivo en monocapa de células sobre vidrio, plástico u otros soportes tales como filtros millipore, son fácilmente fijadas sumergiéndolas en el fijador. También se puede fijar con vapor por 10-15 min en glutaraldehído y luego con osmio.

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Fig.2.5

2.8.3 Células aisladas en suspensión: Las células aisladas en suspensión se colocan en la solución fijadora por sólo 10 o 15 minutos. Luego los pasos sucesivos se realizan centrifugando o embebiendo en agar las células (para microscopía electrónica de transmisión).

2.8.4 Crio sustitución (TEM): Tiene la ventaja que mantiene la actividad enzimática. Si se usa una resina soluble en agua se pueden hacer reacciones histoquímicas. Consiste en los siguientes pasos:

Tratamiento de la muestras con anticongelantes: glicerol, etilenglicol, dimetil-sulfóxido.

Inmersión en isopentano enfriado en nitrógeno líquido.

Sublimación del agua al vacío.

Infiltración con monómero plástico al vacío.

Polimerización.

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2.8.5 Material particulado: Se considera material particulado los virus, ribosomas, fragmentos de membranas obtenidos con técnicas de ultra centrifugación, proteínas fibrosas y enzimas. Y en lo que se refiere a materiales: arcillas, compuestos inorgánicos, catalizadores, etc. consultar preparación de muestras de materiales para TEM: capítulo II (2.12). Para estudiar el material particulado se hace una suspensión, y se coloca una gota directamente en una grilla con film en el caso de microscopía electrónica de transmisión o en un cubreobjetos con poli-l lisina para microscopía electrónica de barrido. (ver capítulo VIII, SEM). Para aumentar la dispersión de las partículas se puede agregar albúmina de suero bovino, glicerina o propilen-glicol. Cuando la grilla está seca, se sombrea con carbón o se le hace un contraste negativo, que consiste en sumergirla en acetato de uranilo y luego se deja secar sin lavarla. Queda lista para su observación en el TEM. Sólo se puede obtener información de la estructura de la superficie (ver contraste negativo).

2.8.6 Fracciones Subcelulares: Para microscopía electrónica de transmisión, en muestras tales: microsomas, bacterias, mitocondrias, etc. Se realiza igual que en materiales pequeños, sólo que para centrifugar se utilizan mayores velocidades. La fracción subcelular se fija mezclando con igual volumen de fijador, el cuál contiene la misma concentración de sacarosa que el medio de suspensión. Alternativamente se agrega glutaraldehído a la suspensión para llegar a una concentración final de 1%. La concentración no parece ser crítica en rangos de 0,5 a 3,0% en 0,1M de cacodilato de sodio con agregado de 2-3mM de Cloruro de Calcio. El pellet se fija de 30 min. a 1 hora. El tiempo depende de la medida del pellet, mientras que para suspensiones el tiempo es menor. Luego, para la segunda fijación, el pellet se achica cortando con una hoja de bisturí limpia y nueva.

2.8.7 Vegetales: La muestras vegetales no sufren cambios post-mortem, pero sí la desecación rápida. Es preferible cortar trozos menores de 1 mm3. Estas muestras contienen aire intercelular. Si flotan en el fijador, se deben colocar en vacío. Si son raíces, se pueden dejar a 1 atm por 1 min, y no más porque se separaría la membrana plasmática de la pared celular. Para absorber el aire se puede utilizar tampón hervido. Los tallos, hojas y flores están recubiertos por cera, que es hidrofóbica y pelos que producen burbujas de aire. Es por ello que no penetran los fijadores y hay que tratarlos previamente con un detergente diluido. Si no funciona la técnica convencional de fijación con GA y osmio de puede intentar fijar con KMnO4 0.6-5% en buffer veronal acetato por 1h 30 min. a 4-22 ° C. o acroleína. La pared celular y la vacuola mantienen una alta presión osmótica, por eso también se puede usar el buffer cacodilato. Sin embargo no conviene usar el buffer fosfato, porque en muestras vegetales extrae alrededor del 50% de fosfolípidos y proteínas.

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Un ejemplo seria: glutaraldehído (2-6%) en

buffer fosfato o cacodilato por 1 a 4 h. a temperatura ambiente seguida por una segunda fijación con 0s04 (1-2%) en el mismo buffer

1 a 2 h.

Al cortar las células se libera el contenido de la vacuola, de pH 5-6, al citoplasma, de pH 7. Por ello conviene hacer una primera fijación en buffer pH 8 y luego una segunda fijación en buffer a pH 7.

En comparación con tejidos animales, los vegetales pareciera que no son afectados al extraerlos de la planta pero se sabe que hay cambios ultraestructurales debido a la pérdida de agua que ocurre rápidamente. Trozos de hojas, tallos o raíces deben ser fijados inmediatamente al sacarlos de la planta. Se coloca una gota de fijador sobre la muestra, la cual, es luego cortada con una hoja de afeitar en finas rodajas (0,2 a 1,0 mm) o pequeños cubos 1,0 mm3). Luego esas piezas se sumergen en fijador fresco lo más rápido posible, teniendo cuidado de minimizar el daño estructural en esta etapa. Si los tejidos flotan, colocarlos en vacío. El primer éxito que se obtuvo en la fijación de vegetales fue usando permanganato de potasio (0,6-5,0%) con buffer veronal-acetato por 1 h y ½ a 2-4°C o a 22°C.

Cuando el fijador no penetra fácilmente se sugiere:

l. El uso de un fijador que contenga acroleina o permanganato.

2. Ruptura mecánica del tejido antes de la fijación.

La fijación con permanganato da excelentes resultados en la visualización de membranas celulares, pero causa

también remoción progresiva de otros componentes celulares y debe usarse sólo para propósitos especiales. Desde la introducción de los fijadores aldehídos se ha incrementado la preservación de detalles citoplasmáticos haciendo una post-fijación con 0s04. Los

tiempos de fijación varían según el espécimen.

Además de variar los tiempos y las temperaturas de fijación se pueden agregar sales o sacarosa para incrementar la osmolaridad. El modo de fijación depende

del tamaño de la muestra. Si son algas unicelulares o cloroplastos aislados, se fijan en pellet por centrifugación o en suspensión. Si la muestra es grande se fija por inmersión. Para lograr el esquema de fijación óptimo para determinada muestra, hay que realizar varias fijaciones e ir descartando por prueba y error.

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2.8.8 Fijación de muestras grandes

A veces es necesario fijar especímenes grandes. Se requiere un fijador que penetre rápidamente por lo que se eligen fijadores que contengan paraformaldehido al 2% en 0,11-1 M de buffer cacodilato, pH=7,4, con 0,2% de trinitrocresol y 2mM de cloruro de calcio.

2.9 Aditivos

Son soluciones que se utilizan junto a la fijación persiguiendo un fin determinado. Ya se han mencionado algunas sales, iones, usados para mantener la osmolaridad y la fuerza iónica. La adición de iones debería controlarse, ya que, por ejemplo, el CaCl2 con el buffer fosfato da cristales de fosfato de calcio que no se solubilizan en los lavados y luego se observan precipitados en las preparaciones.

2.9.1 Tanino al 1 %: Para TEM, aumenta el contraste de las membranas. Se usa luego de la post fijación con osmio, 30 min. a temperatura ambiente. Luego se lava en sulfato de sodio 1% por 5 minutos.

2.9.2 Ferrocianuro de potasio 0.05 M: (TEM) Da mayor contraste a las membranas y al glucógeno. Con ferrocianuro, Fe (CN)6 –4, el osmio se vuelve marrón, y con ferricianuro, Fe (CN)6

–3, el osmio se vuelve amarillo.

Muy importante: Cuando se aplican distintas fijaciones se hacen lavados para quitar el resto del fijador que no reaccionó, y con más razón si se usó primero glutaraldehído y luego osmio porque reaccionan entre ellos. Para la mayoría de los materiales, el vehículo del primer fijador es adecuado para el lavado, agregándole sacarosa 5% si es necesario para ajustar la osmolaridad, ya que se produjeron cambios en la membrana durante la fijación.

Después del tratamiento con glutaraldehído se puede dejar el material en el líquido de lavado durante toda la noche porque la reacción es irreversible.

Cuando se deba guardar el tejido en la solución de lavado durante mucho tiempo, se recomienda dejar al frío. En algunos casos puede ser perjudicial, por ejemplo, lavar con buffer cacodilato por más de 30 minutos puede destruir las vesículas sinápticas.

Conviene volver a cortar el tejido antes de la segunda fijación en trozos menores.

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Se utiliza junto con el osmio: 1 vol. tampón cacodilato 1 vol. ferrocianuro 1 vol. Osmio 2%

2.9.3 Hidróxido de lantano al 2%: (TEM) Para marcar los espacios intercelulares se utiliza la sal nitrato de lantano al 4% y se enturbia con gotas de hidróxido de sodio 0.1N.

2.10 Fijación de carbohidratos

Generalmente los carbohidratos se extraen durante la fijación, dan falsa localización o se colapsan, como los glucosamino-glucanos. Se puede utilizar el rojo rutenio o el ácido tánico para mejorar la observación del glucocálix. (TEM).

Para localizar carbohidratos conviene contrastar con plata,

que consiste en oxidar los azúcares a aldehídos, y luego revelarlos con Ag+ que se reduce a Ag°.

2.11.1 Convencional. Luego de la disección rápida, el tejido se corta en pequeños bloques de 1 mm 3, se sumerge en el primer fijador, glutaraldehído al 2, 5 % al 5 % en una solución de tampón cacodilato de sodio 0.1M o tampón fosfato de Sorensen 0,1 M a pH 7.2 a 7.4. Se dejan a 10ºC durante 2 a 10 hs. Se los coloca sobre una plancha de cera dental y se los cubre con unas gotas de glutaraldehído (bajo campana). En el espacio de 1 minuto se corta el tejido con una hoja de afeitar o de bisturí, nueva, en cubos de aproximadamente 1 mm3.

El fijador es de alto costo, conviene usar viales pequeños. Se removerá sólo el líquido del vial durante la fijación, deshidratación e infiltración. Se trasvasará el material a los moldes de resina para polimerizar en la última etapa. El volumen del fijador será 10 veces mayor que el de la muestra, para no diluirse el fijador con los componentes solubles del tejido. Para trabajar en frío se ponen los viales con el fijador en la heladera antes de comenzar. Lavado en el mismo buffer durante 30 minutos. Post fijación en tetróxido de osmio 1% en el mismo buffer, con el agregado de ferrocianuro de potasio al 1% en solución final, como agente auxiliar del contraste de membranas (Karnovsky, 1971), durante 1-2 h. bajo campana. El tejido se pondrá negro. Lavado en agua destilada o buffer (sin sacarosa) 3 veces, 5 minutos cada lavado.

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2.11- Algunos protocolos

El tamaño del bloque de tejido no es tan crítico (hasta de algunos milímetros cúbicos) para la primera fijación. Luego se recortan trozos más pequeños antes de la fijación con osmio.

El Glutaraldehído reacciona con el glucógeno y luego de la doble fijación su densidad es mucho mayor que la alcanzada con el osmio solamente.

Los lípidos no son fijados con el GA de la 1º fijación, pero sí en la segunda fijación con osmio. Si se demora la 2º fijación, los fosfolípidos no fijados pasan a la solución, se reorganizan en membranas espontáneamente y en la segunda fijación con tetróxido de osmio son inmovilizados fuera de su lugar de origen. A estos artefactos se los denomina “figuras mielínicas”, que se ven frecuentemente en bloques grandes de tejidos. Se pueden evitar con la adición de 1 a 3 mM de CI2Ca al GA.

Se recomienda cortar el tejido en trozos pequeños y elegir bien el vehículo del fijador. Esto se debe a que

- Los materiales biológicos se deben fijar rápido, antes de que se produzca su autólisis. - Generalmente los fijadores penetran lentamente en los tejidos y la región central del bloque puede quedar sin fijar. - El vehículo del fijador penetra más rápidamente y puede dañar el tejido, que todavía no está fijado.

Aclaración: La doble fijación con GA +OsO4 tiene ciertas ventajas sobre la fijación con osmio sólo.

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2.11.1 Fijación de muestras vegetales (TEM)

2.11.1 .1 Semillas: Después que el recubrimiento de la semilla es removido, piezas de tejido de 1mm3 de la parte periférica de los cotiledones se extraen y se colocan sobre un cubreobjetos. Para llevar a cabo la fijación por vapor se lleva la pieza a un desecador y se coloca una cápsula de Petri con el fijador. El desecador se sella y se deja durante 13 días.

2.11.1.2 Semillas (otra opción TEM)

Solución fijadora:

Los especímenes se fijan en esa solución por 5 min. a temperatura ambiente y se transfieren a una solución nueva a 4° C por otras 2 horas. Se lavan en el mismo tampón por 1 o 2 horas, se post fijan con tetróxido de osmio 1% de 2 a 12 h. a 4° C.

Glutaraldehído al 25% …………………25ml Formaldehído( 8%)……………….. ……25ml Tampón collidine(0.05M, pH7.3).. 100ml

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2.11.1.3 Semillas secas (TEM)

Se fijan en 1% glutaraldehído en 0.1M tampón cacodilato por 48 h. Se separan los cotiledones y se cortan en trozos de 1mm3. Se colocan en 5% glutaraldehído en el mismo tampón con 2% sacarosa y bajo vacío por 1 hora y otra hora a presión atmosférica. Se lava toda la noche en el mismo tampón conteniendo sacarosa, Se post fijan en tetróxido de osmio 2% en tampón por una hora. Se lavan varias veces en agua destilada.

2.11.1.4 Hojas:

Solución fijadora para TEM y SEM Glutaraldehído 25% ………………………..15ml. Formaldehído………............................25ml. Tampón cacodilato (0.2M, pH 7,2) ….18ml.

Ca Cl 2 ………………………… ….…...25mg.

Procedimiento para fijar hojas: Un aro metálico de 3 mm de alto y 12 mm de diámetro se pega con lanolina en la superficie superior de la hoja intacta, no debe haber lanolina en el interior del aro. Con el uso de una aguja hipodérmica se llena el espacio con la solución fijadora y se cubre con un cubreobjeto. Después de 45 minutos se cambia la solución y se continúa por otros 45 minutos a temperatura ambiente. La hoja que estuvo en contacto con el fijador se corta en tiras de 0.5mm. Estas tiras se colocan ahora en solución fijadora por 30 min. a 4° C . Luego se lavan con la solución tampón y se postfijan con tetróxido de Osmio al 2% por 2h.

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2.11.1.5 Tejidos blandos vegetales:

Prefijación por 1 hora con 5% glutaraldehído en 0.08M Pipes ( pH 6.8) y postfijación en tetróxido de osmio por 1 hora en 0.18M Pipes, la osmolaridad 800, 600 y 680 mOsM. Todos los tratamientos a temperatura ambiente, con agitación. La solución Pipes- tetróxido de Osmio se debe preparar un momento antes de usarla sino se deteriorara cambiando a color marrón.

2.11.1.6 Granos de polen:

Pared (TEM) : 2% Glutaraldehído y 0,5% ácido tánico en 0.1M de tampón fosfato 0.1M . Por 1 o 2 horas a temperatura ambiente. Después de lavar tres veces en tampón post fijar con tetróxido de osmio al 0.2% en el mismo tampón por 1h.

2.11.1.7 Raíces:

Se cortan las raíces en segmentos menores a 1mm de lado, se fijan en glutaraldehído al 3% en tampón Pipes 0.1M ( pH 8.0) con una osmolaridad de 750 mOsM . Se dejan fijar por una hora a Temperatura ambiente y luego se lavan en tampón por 30 min., se post fijan en tetróxido de osmio en el mismo tampón por 1 hora a 4°C.(TEM y SEM).

Referencias :Schultz y Case,1968; Millonig y Marinozzi-1968; Karnovsky, 1971;

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Principles and Techniques of Electron Microscopy. Biological applications. Fourth edition : MA Hayat. Pág:13 y 14.

2.12- Preparación de muestras de materiales para su observación por Microscopía electrónica de Transmisión.

2.12.1- Aplicaciones a polímeros, catalizadores y minerales

La preparación de muestras para microscopía electrónica de transmisión, requiere una atención especial, ya que de ella depende la calidad de los resultados que se obtengan. La principal condición que debe cumplir una muestra para observarla por TEM es que sea delgada. Entendiéndose por delgada cuando se tienen espesores menores de 1000 Å.

La diversidad de técnicas de preparación de muestras es muy amplia. Es importante considerar los factores que darán un máximo de información sobre la muestra para poder seleccionar la técnica de preparación más adecuada.

Entre las técnicas más usadas en la preparación de catalizadores, minerales y polímeros se pueden citar: Esta técnica consiste básicamente en efectuar cortes ultra finos de un material para poder estudiarlas por TEM. En la

sección de ultramicrotomía se dieron los fundamentos de esta técnica. La ultramicrotomía se ha comenzado a utilizar ampliamente para obtener secciones ultrafinas de polímeros y algunos casos

de minerales y catalizadores. Sin embargo, debe tenerse en cuenta el daño mecánico que puede ocurrir durante el corte. La deformación es el común en muchos materiales y en especial en los polímeros. Para evitar este tipo de artefacto, el material debe tener una temperatura de transición vítrea (Tv) mayor que la temperatura ambiente (Ta), a fin de que el material no sufran distorsión en su morfología. Si la Tv es menor que Ta, los cortes deberán realizarse en un crio-ultramicrótomo. El mismo permite realizar cortes ultra delgados a muy bajas temperaturas (menores que 0C). Para esto emplea nitrógeno líquido como refrigerante.

Las secciones obtenidas son colocadas en grillas sin film soporte.

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2.12.3-Molienda y Suspensión:

Este método es empleado para materiales en polvo. El mismo se muele en un mortero y el resultado de la molienda se dispersa

en un solvente inerte seleccionado teniendo en cuenta la composición del material. La suspensión resultante se coloca en un baño ultrasónico unos minutos para lograr una buena dispersión del material. Por último se deposita una gota de la solución anterior sobre una grilla con film soporte y se deja secar a temperatura ambiente.

Para polvos muy finos, o materiales que pueden sufrir daños en la micro estructura durante el mortereado, este paso no se realiza y directamente se coloca en el solvente y se lleva a baño ultrasónico mayor tiempo.

En el caso que el material no pueda suspenderse en ningún solvente adecuado, se puede realizar el mortereado, y colocar una pequeña cantidad del polvo resultante sobre una grilla con film soporte.

2.12.4-Contraste de polímeros

(Ver capítulo VI.1.5)

2.12.5-Caracterización de catalizadores soportados por TEM

La microscopía electrónica es ampliamente usada en la caracterización de catalizadores metálicos soportados. La principal ventaja de esta técnica es dar una imagen directa del catalizador, brindando información sobre forma, tamaño y estructura tanto de las partículas como del soporte.

Uno de los estudios que suelen realizarse utilizando TEM es la distribución estadística de tamaños de partícula. En este caso, se asume:

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1) El tamaño de la partícula relacionada a la escala en la imagen representa el tamaño real de la partícula. Esto contempla una correcta calibración de la magnificación y del microscopio.

2) Se detectaran todas las partículas que sean mayores que la resolución del microscopio. 3) Contraste por amplitud. Diferencia de contraste entre partícula y soporte. 4) Forma asumida de partícula.

Estas hipótesis son válidas para trabajos en TEM convencional, pero no para TEM de alta resolución (HREM) en el cual la detección de las partículas y el tamaño, son sensitivos al fuera de enfoque. Diversas consideraciones hay que tener en cuenta en el estudio de catalizadores con TEM convencional. Entre ellas podemos nombrar: definición de tamaño, definición de promedio, representatividad de la cantidad de catalizador observada respecto a la totalidad de la muestra, interacción haz electrónico con el material, preparación de la muestra, forma de las partículas, características del contraste, identificación de partículas. Todos estos puntos inciden sobre el resultado final. Teniendo en cuenta la definición de tamaño seleccionada, el tipo promedio y los errores inherentes de la técnica, es posible obtener un tamaño promedio de partícula metálica representativo. Si se obtienen promedios utilizando distintas técnicas experimentales, es importante conocer la definición de promedio empleada en cada una a fin de realizar una adecuada comparación. La principal dificultad que presenta el estudio por TEM de catalizadores soportados es la pequeña cantidad de material examinado. En una imagen típica de un catalizador soportado, la masa total de material observada es del orden de 10-17 gramos.

El problema de estimar el grado en que la población observada es representativa de la totalidad de la muestra, se debe tratar por métodos estadísticos de muestreo y análisis de datos.

2.12.6- Interacción haz electrónico con el catalizador.

En la observación por TEM de catalizadores soportados la interacción del haz electrónico con el catalizador puede causar alteraciones estructurales y morfológicas tanto del soporte como de las partículas.

Soportes como SiO2 y Al2O3 son aislantes térmicos y eléctricos, que los hace inadecuados para estudios por microscopía electrónica. La baja

conductividad térmica produce calentamiento de los cristales durante la irradiación, dando lugar a posible sinterización, evaporación o fusión de las partículas metálicas. También el haz electrónico puede inducir cambios estructurales en el soporte.

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Las propiedades aislantes de algunos soportes pueden causar carga eléctrica en la muestra y la misma actúa como una lente extra que degrada la imagen. Además la carga y el calentamiento pueden llevar a un corrimiento del material a través del film soporte lo cual impide obtener una imagen con buena definición.

2.12.4-Contraste de la imagen:

Hay dos consideraciones que deben hacerse respecto al contraste de la imagen en catalizadores soportados. Una es la apariencia de las partículas

metálicas; y la otra, como distinguir entre los granos de soporte y las partículas soportadas en él. En lo referente a la apariencia de las partículas se debe tener en cuenta que la imagen formada en la pantalla es 2D. Esta imagen contiene

partículas y material con orientaciones diferentes respecto del haz de electrones. Una partícula que aparece en la imagen redondeada se puede asumir como esférica, pero también se puede tratar de una partícula cilíndrica con su parte longitudinal paralelo a la dirección del haz primario.

Las partículas metálicas suelen distinguirse del soporte por diferencia de números atómicos y densidad atómica. Esto genera un contraste por masa espesor y, si existe cristalinidad, el contraste por difracción contribuirá también a la imagen. En estos casos la observación y el análisis de la imagen se debe efectuar con extremo cuidado. Técnicas de difracción electrónica y campo oscuro deben complementar el estudio por campo claro a fin de evitar errores de interpretación.

2.12.5-Determinación de tamaños:

Una vez seleccionada la definición de diámetro a usar, la determinación del tamaño promedio de partícula siempre involucra:

1- Medición de los tamaños de las partículas identificadas en una imagen. 2- Confección de una tabla tamaños vs. frecuencias. 3- Cálculo estadístico del tamaño promedio. 4- Distribución estadística de tamaños. Por ej. histograma de tamaños.

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Todos los pasos señalados anteriormente pueden realizarse manualmente o mediante programas de procesamiento y análisis de

imágenes. Las diferentes técnicas experimentales usadas para la caracterización de tamaños son sensitivas a distintas partes de la distribución, por eso

es importante que la definición de tamaño de partícula promedio que se emplee se corresponda con la técnica experimental que se utilice. En otras palabras, cuando se realizan experiencias de quimisorción y TEM, la definición de tamaño promedio más apropiada es el diámetro volumen-área que por su significado físico, permite asociar ambas técnicas directamente.

Cuando se comparan resultados de TEM con difracción de rayos X (XRD) se emplea el diámetro promedio volumen-pesado que surge de la fórmula de Scherer.

2.13.2-Efecto de la forma de las partículas:

En sistemas en los cuales hay variaciones en la forma de las partículas se debe tener recaudos al seleccionar la definición de diámetro a usar. Matyi y colaboradores muestrearon el efecto del descriptor de diámetro tamaño utilizado sobre la distribución de tamaños. Ellos tomaron como ejemplo partículas elípticas y compararon las distribuciones obtenidas empleando dos descriptores distintos. Demostraron que la distribución de tamaños está fuertemente influenciada por el descriptor de tamaño empleado y concluyeron que en el caso de partículas elípticas el diámetro del círculo equivalente fue el más adecuado.

Si la distribución de formas es más angosta que la de tamaños, se puede inferir que el efecto de la forma sobre el tamaño sea relativamente pequeño. Por el contrario, si las partículas fueran todas del mismo tamaño, cualquier cambio en la forma de las mismas, ensancharía la distribución de tamaños.

Referencias: The limitation of the Transmission Electron Microscope for characterization of supported metal catalysts. P.C. Flynn, S. Wanke, P. Turner. Journal of Catalysis. Volume 33, Issue 2, May 1974, Pages 233-248.

Particle size, particle size distribution and related measurements of supports metal catalysts. R.J. Matyi, L. Schwartz, J.B.Butt. Catalysis

reviewers vol. 29, issue 1, (1987) Pg.41-99.

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CAPITULO III

DESHIDRATACION

Prof. Viviana Sorrivas, Dra. Alfonsina Morales

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3.1 Objeto de la deshidratación

La deshidratación es un paso necesario e importante en la preparación de muestras para microscopía electrónica de transmisión ya que los medios de infiltración no son miscibles generalmente con el agua. Mientras que para microscopía electrónica de Barrido convencional es una etapa previa al montaje muy importante para que el tejido se mantenga en buenas condiciones para su observación. Para remover el agua de los tejidos se utilizan solventes orgánicos, como acetona y alcohol.

Muchas resinas epoxi utilizadas para infiltrar tejidos para microscopía electrónica de transmisión son solubles en etanol o acetona, pero se mezclan más rápidamente con óxido de propileno (1,2 epoxi propano), por eso puede usarse como intermediario en el último paso de la deshidratación. El xileno, tolueno y estireno son adecuados como intermediarios, pero se prefiere el óxido de propileno porque no se separa de la resina epoxi durante la polimerización. Este no se puede usar luego del acido fosfotúngstico.

NOTA: Los materiales que deben ser guardados de un día para otro o transladados, se dejan en alcohol o acetona 80%.

La extracción de lípidos y proteínas se acompaña con la contracción celular y subcelular (se ve la disminución de la periodicidad de la mielina de los nervios y el encogimiento de los cromosomas, encorvándose sobre su eje, se contraen los filamentos de músculo estriado, etc). Es menor la variación al usar acetona, pero no se sabe cuál de estos agentes preserva mejor las relaciones intermembranas que existen en vivo.

3.1 .1 Métodos

En el mismo vial donde se fijó el tejido, se quita el líquido fijador y se reemplaza por el primer líquido deshidratante, así hasta llegar al último, que es el puro. Se hace con pipeta Pasteur, cuidando que el volumen de la solución siempre sea mayor, por lo menos 10 veces, al del material.

Se trabaja a temperatura ambiente o en frío. Si se hace en frío, se debe elevar la temperatura hasta la ambiente cuando el material ya está en la solución al 90%. A bajas temperaturas hay que cuidar la condensación de H20.

El material se puede lavar luego de fijarlo y antes de deshidratarlo, pero eso no es necesario.

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Un esquema típico de deshidratación es el siguiente:

*EtOH o acetona 30% (sólo para embriones) ........................15min.

50% ........................................................... ...... 15min.

75% ........................................................... ... ... 15min.

95% ........................................................... .. ... 15min.

100%. ………………………………………………………………(tres veces 15min).

Fig.3.1

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Para acelerar el proceso de deshidratación:

• el tejido se seccionará en trozos pequeños.

• agitar los viales.

• hacerla a temperatura ambiente.

• usar más cambios de cada solución.

3.1.2 Método de diluciones infinitas

1.- La pieza se sumerge en líquido de lavado.

2.- Se lleva a alcohol 50%.

3.- Se agrega gota a gota alcohol 96°. ( se quita la mitad del volumen y se lleva a alcohol 75%

4.- Se quita todo el acohol dejando una delgada capa sobre el material y se agrega Et OH 100%.

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El alcohol no endurece los tejidos, la acetona SI

3.1.3 Deshidratación parcial

Para evitar la extracción de lípidos se omiten los pasos con EtOH más de 70% y de óxido de propileno. Se puede hacer porque la resina Epon-812 es soluble en etanol 70%. Además del EtOH y la acetona se pueden usar otros agentes deshidratantes, como etilenglicol, polietilen-glicol, óxido de propileno, acroleina y alcohol, etc. según el caso.

Notas útiles sobre deshidratación

• No dejar secar el tejido al recambiar los solventes.

• La diferencia de acción entre el etanol y la acetona es que el etanol no endurece los tejidos y la acetona sí.

• Una cierta cantidad de tetróxido de osmio puede quedar en el tejido cuando no se lavó con buffer, y es reducido a dióxido de osmio, de color negro por el alcohol. El dióxido de osmio es insoluble y produce un granulado fino o una suspensión coloidal en los 10’ primeros de la deshidratación con etanol (no se produce la precipitación de dióxido de osmio con acetona).

• Conviene terminar con dos cambios de etanol 100% (con sulfato de cobre anhidro para mantenerlo absoluto y que debe cambiarse al pasar a azul).

• El óxido de propileno es muy volátil y de baja viscosidad, por eso entra rápidamente en los tejidos y arrastra consigo a la resina. Se debe trabajar bajo campana. Puede dar polimerización irregular.

• Es mejor usar acetona, pero se usa etanol porque es más barato, y como es menos hidrofílico, el “ etanol absoluto” es más fiable.

- Para diferentes diluciones de etanol, partir del 95% y tratar como si fuese 100% - Cuando el material flota (como células vegetales) porque contiene aire, conviene evacuar las burbujas con vacío.

Se evita deshidratar con resinas miscibles en agua, algunas resinas disuelven componentes de la muestra (las epoxi reaccionan con proteínas y ácidos nucleicos, los metacrilatos disuelven los lípidos neutros y fosfolípidos).

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CAPITULO IV

Infiltración con resinas

Dra. Alfonsina Morales y Prof. Viviana Sorrivas

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El medio de infiltración ideal

En general los kits de resinas constan de 4 elementos que deben mantener anhidros:

. Monómero de resina. Endurecedor o provocador de entrecruzamientos: dianhídrido que produce uniones

covalentes con las moléculas de epóxido dando una matriz de un copolímero insoluble. Flexibilizador: es un endurecedor modificado para llenar los espacios en la matriz final y

disminuye el entrecruzamiento. No interviene en el polímero final. Catalizador: Debe coincidir la dureza del bloque de resina con la del tejido: se prepara

una mezcla más dura en los tejidos que tienen mayor cantidad de colágeno, por ejemplo.

El óxido de propileno y El ácido fosfotúngstico mezclados forman un complejo explosivo.

También llamada embebido o inclusión, se denomina al proceso mediante el cual la resina líquida (con distintas viscosidades según el tipo) penetra en el material completamente. Entacado se refiere a cuando se coloca el material ya infiltrado en moldes apropiados. Luego se polimeriza la resina y se vuelve sólida, formando el taco.

Cumple con los siguientes requisitos:

No debe ser solvente de los componentes celulares (las resinas epoxi extraen proteínas y ácidos nucleicos, y las resinas metacrilato a los lípidos neutros y fosfolípidos no fijados).

Debe ser soluble en los agentes deshidratantes.

El monómero debe tener baja viscosidad para aumentar su infiltración

Debe polimerizar uniformemente, sin polos.

Debe sufrir la mínima variación de volumen al polimerizar

Debe ser fácil de cortar (en general, cuando es un polímero lineal corto y con pocas ligaduras transversales se corta más fácil).

Las secciones deben ser estables al haz de electrones.

Una vez polimerizado debe ser químicamente inerte y permitir el contraste, reacciones histoquímicas e inmunohistoquímicas.

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4.1 Tipos de resina:

1. poliéster 2. epoxi 3. metacrilato

4.1.1 Resinas Poliéster:

4.1.1.1 Ej. “Vestopal” y 4.1.1.2 “Rigolac”

Sufre una contracción menor al 2 % al polimerizar.

Tiene componentes inestables que es necesario recambiar periódicamente.

El catalizador es el peróxido de benzoílo.

Pueden producirse explosiones al mezclar los componentes.

Son más viscosos porque se usan parcialmente polimerizados.

No son solubles en etanol, pero sí en acetona.

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4.1.2 Resinas Epoxi:

Forman un polímero tridimensional estable al calor y a los solventes. La polimerización es irreversible y uniforme.

Mantienen la ultraestructura.

Sufren poca contracción, menor del 2%

Tienen alta viscosidad .

necesitan largos tiempos de infiltración.

viscosidad Araldita

Epon Spurr

4.1.2.1 Epón

Se encuentra comercialmente como Epón 812, Epicote, EMBED, Polybed, Medcast, o Maraglás.

La mezcla final se hace con:

. endurecedor: DDSA

. flexibilizador: DBP

. catalizador: DMP-30, que como se inactiva con el agua Se reemplazó por BDMA (0.2 g DMP-30 = 0.4 g BDMA).

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La resina Epón polimeriza a 60°C en 48 hs. Su viscosidad 150-210 cp a 25ºC. La resina Spurr, de menor viscosidad, tiene mejor penetración. Viscosidad: 7,8 cp.

Componente: mezcla media mezcla blanda

Resina ERL-406(dióxido de vinil ciclohexano) DRL-4206 o VCD

flexibilizador: DER-736(diglicidil éter polipropilenglicol) DER-736

endurecedor NSA (anhídrido nonenil-succínico) NSA

catalizador DMAE DMAE

polimeriza 70°C – 16 hs- 70°C – 8 hs.

Tabla4.1

Se prepara con el método gravimétrico (pesando los componentes en la balanza). Si se forman burbujas de aire se puede aplicar un poco de vacío,

pero si se exagera se pueden evaporar algunos de los componentes. La mezcla puede guardarse varios meses a -20°C, en el freezer, cuidando de que tome temperatura ambiente antes de usar para que no se hidrate y vuelva a bajar la viscosidad.

Se puede mezclar directamente con etanol o acetona luego de la deshidratación.

La mezcla es fácil de preparar.

Es fácil de cortar una vez polimerizado el taco.

Sus secciones son estables al haz de electrones.

Mejor penetración

El NSA se altera al aire. Conviene polimerizar en tacos cerrados o se vuelve quebradizo. Cuesta el contraste con uranilo y hay que usar la solución.

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4.1.2.2 Mezcla de Araldita: (araldita + DDSA + DMP 30)

Es miscible en etanol.

Se puede mezclar con Epón.

Tiene baja contracción durante la polimerización.

Polimeriza mal luego de la deshidratación con etanol. Requiere óxido de propileno

En la tabla se puede observar las cantidades de los componentes a usar respecto de la dureza que se requiere utilizar: DUREZA

Epón o Araldita 9.44 g 9.44 g

9.44 g 9.44 g 9.44 g

DDSA 20 g 15 g 10g 5 g -

NMA - 3.33 6.67 10 13.3

DMP-30 0.2 g 0.2 g 0.2 g 0.2 g 0.2 g

Las reacciones inmunocitoquímicas se pueden realizar:

Antes de la fijación: Sirve para localizar antígenos superficiales de

células aisladas. Es muy caro para trozos de tejidos. Inmediatamente debe fijarse la muestra y continuar con la técnica convencional. Su ventaja es que se obtienen imágenes con el mejor contraste.

Luego de la fijación y antes de la infiltración en resina: Con una fijación suave. Se puede permeabilizar

luego la membrana plasmática de las células para permitir el ingreso de anticuerpos al interior. Se continúa con la técnica convencional. Sólo para células aisladas. Se altera la estructura de las membranas.

Luego de la fijación y polimerización en una resina epoxi: 2. Con una fijación suave. Luego de la

polimerización se “carcome” (etching) la resina de las secciones ultrafinas con KOH o H2O2 al 2% por 15 min. La desventaja es que el oro pega inespecíficamente sobre las resinas hidrofóbicas, y disminuye el marcado. Se corta en ultramicrótomo. La reacción se hace sobre las grillas.

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Tabla 4.2

En resumen: tabla 4.3

Resina Epón Araldita Spurr (ERL 406, DRL 4206)

endurecedor DDSA o NMA DDSA o NMA NSA

flexibilizador DBP DBP DER-736

catalizador BDMA o DMP-30 BDMA o DMP-30 DMAE

3.

Luego de la fijación y polimerización en una resina hidrofílica:

Con una fijación suave. Se incluye la muestra en una resina hidrofílica, que se polimeriza y se corta en ultramicrótomo. La reacción se hace sobre las grillas. Las secciones son muy inestables al haz. Esta fijación suave no preserva la estructura óptimamente, y sin osmio el contraste es pobre. Permite usar colorantes acuosos en los preparados de microscopía óptica-

Crioultramicrotomía. Fijación suave. El material se coloca en un crioprotector y se

congela en LN2. Se corta el taco en crioultramicrótomo. Se hace la reacción sobre la grilla y luego se cubre con un film plástico que incluye uranilo para darle algo de contraste. : sirve para estudiar células libres o en trozos de tejidos, y para antígenos internos.

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No mezclar el catalizador con el endurecedor porque puede explotar.

4.1.2.3 Medcast (Epón):

Medcast 6.14 g

DDSA 1.64 g

NMA 4.34 g

DMP-30 0.2 g Tabla 4.4

4.1.2.4 Spurr:

ERL VCD 5 g

DER 3 g

NSA 13 g

DMAE 0.2 g Tabla 4.5

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4.1.3 Resinas Metacrilato

Pertenece a la familia de los acrílicos.

R: ---CH3 : metil-metacrilato R: ---(CH2)3---CH3 : butil-metacrilato. Proporción Butil-metil metacrilato dureza del bloque 1:4 duro 1:2 medio 1:1 blando. Luego apareció el glicol-metacrilato o estireno, mejor para cortar.

También existen los monómeros metacrilatos solubles en agua, pero son difíciles de cortar. Sirven para infiltrar en un gradiente creciente de resina a un trozo de tejido en buffer, sin deshidratar.

Las resinas metacrilato, una vez polimerizadas, se pueden quitar con cloroformo.

4.1.3.1 Lowilcryl:

Existe en varias versiones. La K4M es hidrofílica, y se mantiene líquida hasta –35°C. La HM20 es hidrofóbica, se mantiene líquida hasta –70°C y se usa en crio sustitución.

Está formado por los componentes A: agente de ligaduras cruzadas

B: monómero

C: catalizador.

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Baja viscosidad, aún a bajas temperaturas. Es un líquido transparente. Infiltra la quitina de insectos y las paredes de células vegetales.

• Sirve para inmunohistoquímica porque una vez polimerizado es un material no soluble en agua pero sí permeables al agua.

También se pueden hacer todas las coloraciones acuosas sobre los cortes de 1 µm, como la hematoxilina eosina.

No se necesita una deshidratación completa, incluso un poco de agua (hasta un 10 %) conviene para las reacciones Se deshidrata en la heladera.

Es soluble en etanol y en acetona pero conviene usar etanol para deshidratar porque la acetona interfiere con la polimerización.

Igual que Historesin, permite obtener cortes de 1µm para microscopía óptica, de gran calidad. Polimeriza con luz UV 360 nm, a bajas temperaturas, temperatura ambiente o a 60°C cambiando el catalizador por peróxido de Benzoílo.

En la fijación no se puede usar Osmio porque toma color negro que interfiere con UV.

Las resinas hidrofílicas traen problemas con los antígenos solubles en agua.

Los metacrilatos son los que más contraen (+20%) durante la polimerización. Esto mejora con una pre-polimerización con 15 min. en estufa, pero se usarían más viscosos.

Produce dermatitis agudas cuando todavía no están polimerizados.

Los metacrilatos son solventes fuertes de lípidos, aún a bajas temperaturas.

El oxígeno del aire inhibe su polimerización, usar moldes cerrados. Anaeróbicas.

Las secciones de metacrilato son inestables al haz de electrones, se contaminan las aperturas. Esto mejora usando la trampa de LN2 en el microscopio, evaporando carbono sobre la grilla o usando film de PVA.

Como no se usó osmio en la fijación el contraste que se obtiene es pobre.

Tanto las secciones montadas sobre las grillas como los tacos absorben agua del ambiente y se ablandan: hay que Mantenerlos en un recipiente hermético con sílica gel o en vacío.

Ningún anticuerpo penetra la resina. El éxito del Lowilcryl es que es más rugoso que el Epon, que tiene superficie más lisa. También tiene menor

pegado inespecífico al oro.

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4.1.3.2 Unicryl:

Es el mejor para cito química. Es un líquido de baja viscosidad hasta –20°C

Tiene un solo componente, lo que evita la manipulación de varias sustancias.

Es el más tóxico. USAR GORRO PORQUE SE CAE EL CABELLO.

4.1.3.3 London Resin: LR

Existen en las versiones Gold, de bajas temperaturas, y White, que polimeriza a temperatura ambiente. Es la menos irritante de las resinas hidrofílicas.

4.2- Seguridad en el uso de resinas:

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Seguridad en el laboratorio Usar guantes: de nitrilo con los metacrilatos y de vinilo o látex con las

resinas epoxi. LOS GUANTES DE LATEX NO SIERVEN PARA LAS RESINAS METACRILATO. -Observar que LOS GUANTES DE NITRILO SE DISUELVEN CON ACETONA.

-No limpiar la piel con solventes orgánicos porque la resina penetra más rápido. -El descarte de las resinas, puras o las mezclas con acetona, debe hacerse en un recipiente que una vez lleno se polimeriza antes de disponerse en la basura común. -Preparar la mezcla en recipientes plásticos que no se disuelvan, por el método gravimétrico. El recipiente se puede reusar polimerizando previamente los restos de resina.

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Los componentes más tóxicos son los aceleradores, en general aminas, como el BDMA, DMP-30, DMAE o S1. Son muy volátiles y producen asma. (ver 1)

No flamear las botellas con monómeros por peligro de explosión. El óxido de propileno lastima la córnea, produce dermatitis y es muy inflamable. Es un epóxido que se usa

como intermediario entre la deshidratación y la resina, pero conviene sustituirlo por acetonitrilo o bien no usarlo, como en el caso de la resina Spurr.

También como agente deshidratante y de transición en las resinas acrílicas se usa la dimetil-formamida, pero es tóxico para la piel, pulmones e hígados.

El estireno es solvente de transición en las resinas poliéster: es irritante de los ojos y mucosas, deprime el SNC. El Spurr es cancerígeno. El VCD (dióxido de vinil ciclohexano) que contiene produce anticuerpos. Produce

problemas nasales, oculares, de piel y tórax. Las resinas acrílicas producen reacciones neurotóxicas y parestesias por destrucción de los lípidos de la mielina.

También hay que cuidar de no inhalar las virutas que se forman al tallar los tacos, ya que produce alveolitos. Cuando se use el molde de embebido plano conviene dejarlo en la estufa dentro de una caja de Petri, para

evitar aspirar sus vapores. Los tacos de acrílico a veces están pegoteados al sacarlos de los moldes porque atraparon O2 y no

polimerizaron en su superficie: CUIDADO. Desmoldar con guantes. Se puede burbujear también N2 para desplazar el O2.

Se prepara y se utiliza la mezcla de resinas bajo campana.

Manipular los reactivos siempre con medidas de seguridad extrema

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4.3. Pre-infiltración

La pre infiltración se puede hacer antes de la fijación, entre la primera y segunda fijación (recomendado) o antes de la deshidratación. El medio usado para pre infiltrar no interfiere con la penetración de los fijadores ni toma color con el osmio en general, se deshidrata y se embebe junto con la muestra incluida.

Algunos soportes:

4.3.1- agar o agarosa:

Se prepara una suspensión de agar al 2% en agua o solución fisiológica, calentando en BM hasta disolver, agitando, sin que se queme. Se puede alicuotar en viales y auto clavar para luego guardarse hermético en la heladera. En el momento de usar se vuelve a poner en baño maría o en el microondas hasta disolver. Esperar a que baje la temperatura a 43-45°C antes de agregárselo al material.

Luego de la fijación en aldehído, se lava en buffer con un poco de glicina para neutralizarlo.

Se centrifuga el material en un tubo eppendorf y se desecha el sobrenadante.

Se utiliza en el caso que los especímenes no sean lo suficientemente grandes o cohesivos para formar un buen pellet, o demasiado frágiles como para manipularse con las pinzas. Si el material está formado por células aisladas, organelas, microorganismos, etc. se evitan las múltiples centrifugaciones que implica la deshidratación y por otro lado permite orientar mejor el material. El material se trata como si fuera un bloque de tejido compacto a partir de este paso.

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Se deja tomar 40 °C en un baño de María.

Se agrega agar al 2% a 43°C en el mismo volumen que la muestra, y se re suspende.

TODO DEBE QUEDAR A LA MISMA TEMPERATURA, INCLUSO LAS PIPETAS QUE SE USAN.

Sacar del baño y centrifugar el eppendorf dentro de un tubo falcón con agua caliente.

Dejar enfriar hasta solidificar. Puede ayudar la heladera cuidando de no congelar.

Quitar el bloque de agar con una jeringa con agua fría.

Cortar el bloque y continuar con el protocolo general como si fuese un trozo de tejido.

Para ver le material dentro del bloque de agar o agarosa (opacas) se puede teñir previamente con fucsina leuco

base (Schiff) o con ácido pícrico. Se usa también la agarosa de bajo punto de fusión, con punto de ebullición de 62-68°C, y punto de solidificación a

27-29°C, que también se usa a 43°C (más bajo se vuelve viscoso). Aún así algunos antígenos pueden deteriorarse. La viscosidad útil está relacionada con la concentración y la temperatura de la suspensión de agarosa:

Fig.2.1

6.2 .Gelatina:

Se usa una solución al 10%, que es líquida hasta 37°C.

La ventaja es que si queda mal embebido se vuelve otra vez líquida calentándola a 37°C.

Infiltra mejor el material biológico que la agarosa.

Se puede quitar de la muestra con agua.

Es más económico.

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Para mantener el bloque sólido hay que trabajar sobre hielo, porque a temperatura ambiente es líquida. Sirve para crioultramicrotomía.

No se puede retirar del eppendorf con una jeringa con agua como la agarosa porque se disuelve. Hay que cortar el tubo.

Si luego de la pre infiltración se continúa con la técnica convencional, el osmio oscurece la gelatina y no la agarosa: cuidado con la orientación de la muestra.

4.3.2- otros soportes.

Otro método para pre infiltrar muestras muy pequeñas es aumentar su volumen con algo claramente distinguible que luego pueda ser ignorado, como unas gotas de sangre. En este caso se mezcla y se centrifuga hasta tener un pellet compacto. También se puede usar fantasmas de glóbulos rojos, queratina, coágulo de fibrina, etc. Todos estos soportes toman color negro con el osmio.

Idea

Forrar un portaobjetos con parafilm. Poner 2 barritas de cera o parafilm pegándolas con calor.

Poner una gotita de material sobre el porta, y luego agregar la gelatina al 10%.

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Fig.4.2

Hacer un sándwich con el otro porta. Sostener con un clip para que no se separen.

Enfriar en hielo y mantenerlo así.

Seleccionar la región que nos interesa y orientarla.

Fig.4.3

Otra idea: Sobre un portaobjetos poner una gota chica de agar líquido. Mantener tibio. Antes que endurezca inyectar una suspensión de células con una pipeta en el interior de la gota de agar. Dejar enfriar. La muestra quedará encapsulada.

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4.3.3.- Tipos de moldes de inclusión:

1) cápsulas Beem de polipropileno con o sin tapa. Se cortan antes del ultramicrótomo. 2) Cápsulas de gelatina (grageas transparentes). Se disuelven en agua caliente. 3) Pirotines de papel aluminio, moldes de portaobjetos de resina, etc. 4) Moldes de infiltrado plano de goma o silicona. 5) Para muestras muy pequeñas, sólo visibles en el microscopio óptico, se puede usar un cubreobjetos de plástico o vidrio con un

círculo grabado para localizar la muestra y con polilisina, silane o alcian blue para que la muestra se pegue. Fijar la muestra, deshidratar, y colocarle una gota de resina. Polimerizar. Luego se quita el cubreobjeto sumergiéndolo en LN2 si es de vidrio o disolviéndolo en solvente si es de plástico.

Moldes de portaobjeto:

Forrar 2 portaobjetos con parafilm o tratarlos con un agente esmerilante. Separarlos con dos palitos (fósforos).

Entre los dos portas colocar y polimerizar la muestra

Variante: Con un portaobjetos marcar papel aluminio para hacer un molde de “portaobjeto de resina” que tendrá incluida la muestra.

1 2 3 4 5

Fig.4.4-Moldes para inclusión, (1,2, y 3), cápsulas ¨beem¨ (4) y cápsula de gelatina(5)

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. 6 7 Fig.4.5-Cámara para polimerizar con luz ultravioleta casera (6) y guantes de nitrilo ( 7) .

4.4- Errores en la infiltración y la polimerización:

Resina mal mezclada: hay tacos duros y tacos blandos.

Resina vieja o pre-polimerizada: no infiltra.

Burbujas de aire: produce agujeros.

Aumento de la temperatura de la estufa. Da tacos marrones.

Cuando la dureza del tejido no coincide con la de la resina se producen desgarros al cortarse.

Mala deshidratación: impide la infiltración de la resina. El centro del material queda blando.

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4.5-Protocolos tipo.

4.5.1-Lowilcryl K4M

El kit se mantiene al resguardo de la luz y no se guarda en la heladera. Preparar la resina antes de usar en un recipiente oscuro. Mezclar suavemente para evitar la entrada de aire con una varilla el crosslinker A, el

monómero B. Agregar el catalizador C. Pre enfriar. La resina metacrilato DISUELVE EL POLIESTIRENO de las cajitas de Petri. Los trozos de material deben ser menores de 0.5 mm3 para poder polimerizarse.

Esquema de deshidratación: (Lowilcryl es miscible en etanol).

Etanol Temperatura tiempo

30% 0° 30 min

50% -20°C 60 min

70% -35°C 60 min

95% -35°C 60 min

100% -35°C 60 min

100% -35°C 60 min TABLA 4.6

La temperatura de –20°C se puede conseguir en un congelador o bien con la mezcla de Hielo a NaCl 3:1 mantenido en la heladera. La temperatura de cada paso está por encima del punto de congelamiento de la solución posterior. Infiltración. Seguimos en el freezer.

Mezcla Temperatura tiempo

Resina a etanol 1:1 -35°C 60 min

Resina a etanol 2:1 -35°C 60 min

Resina pura -35°C 60 min

Resina pura -35°C 60 min TABLA 4.7

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Inclusión: se llenan las cápsulas de gelatina FRIAS hasta el tope y se cierran. Acomodar las cápsulas en la cámara de UV. Conviene usar cápsulas de gelatina, que son más transparentes que las Beem. Polimerización:

Foto polimeriza en UV a 360 nm. La cámara debe tener una lámpara de 15 a 20 W de la muestra, porque a menor distancia los tacos se vuelven frágiles. Se coloca a una distancia entre 15 y 30 cm (que hay que estandarizar previamente). Si hay mucha contracción de la resina en las paredes de las cápsulas es porque polimerizó muy rápido y hay que aumentar la distancia de la lámpara. Si es posible, que la lámpara quede por debajo de los tacos. Hay que invertir los tacos cada 3 o 4 días hasta la polimerización completa. Los tacos son polimerizados a la misma temperatura que se usó en la infiltración, en el freezer. Ultramicrótomo:

Usar guantes. Limpiar bien la superficie del taco.

Evitar el agua: bajar el nivel del agua del bote de la cuchilla y juntar rápido las secciones.

Cortar a baja velocidad para evitar que se astille: 2-5 mm/seg.

Usar grillas de níquel con más de 400 # (mesh) sin film para las reacciones inmunocitoquímicas.

Conservar las grillas con los cortes y los tacos en un recipiente hermético con sílica gel. Contraste: Puede hacerse con uranilo y plomo, pero con tiempos más cortos para que no se arruguen las secciones.

Idea:

4.5.2 -Embebido plano para monocapas celulares con LR White:

Las resinas metacrilato no son compatibles con los soportes plásticos donde se cultivan las células. Por otro lado, las células de cultivo pueden

ser levantadas con tripsina, pero quedan muy alteradas. Entonces:

Cortar un cubreobjeto (10x10) en un extremo para saber dónde están las células. Lavarlos bien y esterilizarlos.

Cultivar las células sobre ellos dentro de una caja de Petri de vidrio chica.

Allí mismo fijar, deshidratar en etanol, embeber en monómero de LR White.

Cubrir con el monómero de resina y dejar la caja cubierta toda la noche a 4°C.

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Fig. 4.6 Por otro lado:

Con el catalizador se hace un “frotis” sobre un portaobjeto e inmediatamente se colocan cápsulas de gelatina invertidas sobre él para infiltrar el borde en catalizador.

Se llena las 2/3 partes de cada cápsula con resina (sin catalizador) cuidando de no tocar los bordes.

Poner los cubreobjetos con las células ya embebidas en el monómero tapando cada cápsula, con las células hacia abajo. El catalizador del borde sella rápidamente la cápsula al cubre.

Luego de 30 min se invierten las cápsulas

Se polimeriza a 50°C por 1-2 hs.

Con la contracción de la resina se abollaría la cápsula: hay que clavar una aguja de odontología. Se deja 24 hs sin acelerador.

Sumergir en LN2 o enfriar a –40°C para estallar el vidrio.

Los tacos pueden quedar 4 meses antes de ser cortados y hacer la reacción de inmunohistoquímica.

Fig.4.7

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Otra idea: 4.5.3- Monocapas de células en resina epoxi. Cultivar las células sobre un cubreobjeto estéril. Allí mismo fijar, deshidratar y colocar una gota de resina sin ensuciar el reverso del cubreobjeto. Recortar la punta de una cápsula Beem y pararla sobre la gota de resina. Dejar polimerizar en la estufa toda la noche. Si se quiere una imagen tangencial de la mono capa, se llena la cápsula con resina y se vuelve a polimerizar. Romper el vidrio con LN2. Si, en cambio, se quiere obtener una imagen transversal de la mono capa, sólo se llena la cápsula 1 mm con resina y se procede de igual modo.

Una vez polimerizado, se retira el vidrio, se cortan con una sierra dos trocitos, se enfrentan las monocapas y se re-entacan en otra cápsula Beem.

Fig.4.8

4.6- Tinción de cortes 1 µm para microscopía óptica

Estos cortes de resina sirven para orientarnos sobre el estado del material y conocer la zona que luego vemos en el TEM. Además, por ser tan finos, permiten sacar fotos de células que están en foco en todo el campo, con mayor grado de detalle.

Las secciones se juntan con un ansa del bote.

Se reciben en una gota de agua sobre un portaobjeto.

Por debajo del porta se marca la localización con una fibra.

Se deja secar el porta sobre un plato caliente hasta que las secciones se adhieran al vidrio.

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Se agrega una gota de azul de toluidina, también en caliente, hasta que se forma un borde iridiscente (sólo unos segundos), cuidando de no aspirar directamente sus vapores.

Se enjuaga con agua destilada.

Los cortes así teñidos se pueden ver directamente en el microscopio óptico o con un líquido de montaje y un cubreobjeto, cuidando de que no se formen burbujas.

Los preparados deben resguardarse de la luz.

4.6.1- Para cortes de resina epoxi:

Azul de Toluidina ......................1g Borato de sodio.........................1g AD (cnp).............................100 ml

También:

0.5 % en Na2CO3 0.1% a pH 11.1

0.25 % en borato de sodio 0.25 %

Azul de toluidina ( tinción cortes gruesos)

Borato de sodio

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4.6.2-Para cortes de resina metacrilato:

diluir 1:10 la suspensión usada para resinas epoxi.

Azul de Toluidina 0.05% en buffer benzoato de sodio, a pH 4,4.

Buffer benzoato: ácido benzoico........0.25 g Benzoato de sodio..0.29 g AD..........................200 ml

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CAPÍTULO V:

Ultramicrotomía

Dra. Alfonsina Morales

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5.1- Introducción a la ultramicrotomía:

La imagen en el microscopio electrónico de transmisión se forma por contraste de masa, es decir que los puntos de luz en la pantalla fluorescente corresponden a los electrones del haz que lograron atravesar la muestra, los electrones transmitidos, y los puntos oscuros corresponden a los electrones que fueron retenidos por ella.

Los electrones acelerados entre 60 y 100 kV deberán atravesar una lámina muy delgada de la muestra, a lo sumo 150 nm, o serán totalmente absorbidos.

Por otro lado, el microscopio electrónico de transmisión tiene escasa profundidad de campo (para una resolución de 1nm es de 50 nm a 60 kV) y con secciones más gruesas no obtendríamos imágenes en foco.

Por todo ello es necesario cortar nuestro material en láminas delgadas, de alrededor de 70 nm, con la ayuda del ultramicrótomo.

Fig.5.1

Los ultramicrótomos son totalmente automáticos y pueden hacer secciones de la muestra entre 40 y 1000 nm, aunque el grosor también depende de la calidad de la cuchilla, la dureza del bloque de resina y de la experiencia del operador.

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El ultramicrótomo tiene un diseño de corte similar al micrótomo de parafina de rotación, pero mucho más preciso y sofisticado. Consiste fundamentalmente en un brazo oscilatorio que sostiene el taco, un soporte para la cuchilla y un sistema de iluminación.

fig.5.2

El plano de corte se determina orientando tanto la cuchilla como el taco. La cuchilla se ajusta firmemente a su soporte, que gira sobre la base para ubicarse paralelo al frente del taco. La base de la cuchilla también tiene un movimiento manual lateral y de avance hacia el brazo del taco. La posición final de la cuchilla se fija antes de iniciar el corte.

Un sistema delicado hace avanzar el bloque sobre la cuchilla con pasos de algunos nanómetros según el grosor de corte establecido y describe ciclos de rotación en el plano vertical donde al bajar el brazo, se corta el taco, y luego sufre una retracción en el retorno para no volver a rozar la cara posterior de la cuchilla.

El avance del taco puede ser mecánico con un tornillo o por expansión térmica por dilatación del brazo. En el último caso, el avance es continuo: si existe mayor tiempo entre 2 ciclos de corte, la sección será más gruesa.

Brazo del ultramicrótomo que Sostiene la muestra y avanza

Cuchilla de diamante

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Fig.5.3

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El sistema de iluminación consiste en una lupa binocular estereoscópica y una fuente de luz con un tubo fluorescente (luz fría que no dilata la resina del taco) que pueden cambiar de posiciones. El ultramicrótomo también contiene un foco de tungsteno debajo de la cuchilla para poder identificar las mellas y alinear la cuchilla.

El ultramicrótomo debe situarse en una habitación donde no haya vibraciones ni cambios de temperatura para evitar dilataciones del brazo que porta la muestra. Todos los ultramicrótomos actuales tienen un panel de control externo al aparato desde donde se controla electrónicamente el proceso de corte: inicio de corte, grosor de la sección, velocidad de corte, ventana de corte, iluminación de la muestra, etcétera.

En el panel de control de los ultramicrótomos automáticos se selecciona:

el grosor de corte.

la velocidad de corte: entre 0.2 y 90 mm/seg. La velocidad baja permite cortar tacos con frentes amplios y la velocidad alta sirve para tacos muy elásticos.

La ventana de corte: es el sector del arco que describe el brazo portamuestra desde 1 mm por encima a 1 mm por debajo del borde de la cuchilla. Es la zona donde se respeta la velocidad seleccionada. El resto del ciclo se realiza más rápido.

5.2-Las cuchillas:

Las cuchillas empleadas para hacer secciones deben tener filos muy agudos. Las más comúnmente usadas son de un vidrio especial, que

se comercializa en barras de un grosor fijo. Con un aparato adecuado se cortan cuadrados de vidrio y luego se parten al medio, dando las cuchillas, dos triángulos rectángulos.

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fig.5.4

Las barras de vidrio se deben limpiar previamente con acetona o alcohol. No conviene dejar las cuchillas de vidrio armadas sin usar.

figs.5.5 y 5.6

Barra de vidrio

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Fig.5.7 Corte de los triángulos a partir de un cuadrado de vidrio

Fijar la barra de vidrio en el aparato. Seleccionar el corte cuadrado. Bajar con cuidado el brazo con la rueda de diamante hasta el vidrio. Hacer la marca de corte. Cortar. Levantar el brazo. Liberar los sostenes de la barra. Retirar el cuadrado de vidrio y girarlo 45º en sentido anti horario. Volver a trabarlo al equipo. Seleccionar el corte diagonal. Bajar el brazo y hacer la marca de corte. Cortar. Levantar el brazo. Liberar los sostenes. Retirar los dos triángulos.

Hay que examinar las aristas. La inferior puede tener un zócalo, que debe ser menor de 1 mm. La superior es el filo. Vista de frente, la cuchilla tiene una débil línea de fractura.

La cara posterior debe ser lisa y sin defectos, si no, ha sido mal rotado el vidrio.

Luego de hacer las cuchillas las evaluamos bajo lupa vistas de frente y con la luz inferior: los ángulos deben ser rectos y el filo debe estar libre de imperfecciones (aparece como una línea brillante continua).

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i

Figs. 5.7, 5.8 y 5.9 Se pueden usar las cuchillas malas para tallar el taco, sin el bote.

A las cuchillas buenas hay que agregarles una cubeta para retener el agua donde flotarán los cortes. Las cubetas las podemos hacer con una cinta de 3 cm por 0,5 cm y luego lo sellamos con parafina. Hay que pegar la cinta a nivel exacto del filo. Figs. 5. 10

También se pueden adquirir cubetas de plásticos comerciales que se fijan al vidrio con parafina o esmalte de uñas. Aunque son descartables se los puede reutilizar lavándolos previamente para quitarles los restos de cortes pegados.

La mejor calidad de cortes ultra finos se consigue con cuchillas de diamante, pero son mucho más caras porque se fabrican con auténticos diamantes de 3 a 5 quilates. Se usan sólo para hacer cortes ultra finos. Tienen larga vida y se pueden re afilar. Están diseñadas con una cubeta metálica incluida, pero no en el caso de las cuchillas para crio cortes. Cuchilla de diamante para crio cortes, sin bote:

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Fig.5.10

Los ángulos de las cuchillas de diamante son de 40 a 60º. Los ángulos menores se usan para tacos blandos, como los de material biológico, y los ángulos mayores para los materiales más duros. En general se usan de 45 º, con un ángulo libre de 5º.

Una vez usada la cuchilla de diamante se debe limpiar el bote con un chorro de agua destilada y el filo, pasando a lo largo una barrita de “poliestireno” mojada en alcohol etílico en un solo sentido.

fig. 5..11

diamante

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Nunca se debe tocar su filo, especialmente con la pinza o con la grilla al juntar los cortes.

Nunca se debe parar el ultramicrótomo cuando se está cortando una sección.

Nunca hay que tratar a estas cuchillas con solventes porque se puede disolver el cemento que une el diamante. Sí se puede usar alcohol etílico al 10% en un baño ultrasonido por 30 minutos.

5.3-Herramientas necesarias para ultramicrotomía:

Fig.5.12

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Una jeringa para cargar el agua de la cubeta, un ansa para recolectar los cortes semifinos, palitos con un cabello pegado en la punta, caja de grillas, caja Petri con un papel de filtro, portaobjetos y un juego de cuchillas (acero, vidrio y diamante)

5.3.1-Tipos de pinzas o bruselas:

Fig.5.13

5.3.2-Las grillas:

Las grillas o rejillas son discos circulares de 3 mm de diámetro con un enrejado de hilos (que llamamos “barras”) que dejan ventanas de distinto tamaño según el ”mesh” o malla, que es la cantidad de ventanas por pulgada cuadrada. Normalmente se usan de 200 o 300 mesh. Estas grillas sostienen los cortes de tejido y los electrones los atraviesan cuando pasan por las ventanas. Sin embargo, la porción de sección que caiga sobre la barra quedará oculta.

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En ciertas ocasiones necesitaremos usar grillas cubiertas con un film plástico, como en el caso de elegir grillas de ventanas más grandes.

fig.5.14

Hay distintos diseños de grillas y están fabricadas con distintos materiales. Las más comúnmente usadas son las de cobre, aunque existen también de níquel, oro e incluso de nylon para hacer sobre ellas reacciones especiales, como inmunocitoquímica. En resumen, teniendo ya listas :

cuchillas nuevas de vidrio

cubetas pegadas en las cuchillas

grillas limpias con o sin film de plástico,

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5.4-Sintetizando el proceso

1. Quitar el taco de su molde (Beem, gelatina, etc.) 2. Comprobar la dureza de taco al marcarlo con una uña. 3. Tallado grueso del taco manualmente. 4. Colocar el taco en el ultramicrótomo y ajustar la cuchilla de vidrio con bote. 5. Alinear la cuchilla al taco 6. Elección del ángulo libre de la cuchilla 7. Llenar la cubeta con agua

8. Hacer cortes semifinos, de 1 m. Recolectarlos y ponerlos en un portaobjetos. 9. Tinción con azul de toluidina. 10. Seleccionar la zona de interés en el microscopio óptico. 11. Retallar el taco manualmente con una cuchilla de acero o en el ultramicrótomo con una cuchilla mala sin cubeta 12. Colocar el taco nuevamente en el ultramicrótomo. Cambiar la cuchilla por una de vidrio buena con cubeta o la

cuchilla de diamante. 13. Alinear la cuchilla al taco 14. Llenar el bote con agua 15. Hacer los cortes ultra finos. 16. Estirar los cortes con cloroformo 17. Recolectar los cortes con la grilla flameada. 18. Dejar secar sobre papel de filtro.

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5.5-Cómo extraer el taco de su molde

Para retirar el taco de su molde, si se usaron cápsulas Beem hay que hacer una ranura con una cuchilla de acero y si se usaron cápsulas de gelatina hay que sumergirlas en agua caliente hasta que la gelatina se disuelva.

5.6-Tallado del taco:

Antes de realizar el primer corte de una muestra, al igual que ocurría con los cortes de parafina, es necesario desbastar el bloque (llegar hasta la muestra) y tallar una pirámide truncada.

Fig.5.15- Desvastado

En general, el tallado se puede hacer manualmente con una cuchilla de acero pero también se suele utilizar un aparato denominado piramitomo que lima y crea las caras de la pirámide con un dispositivo a modo de torno.

El tallado es un paso muy preciso porque la superficie de corte o “frente del taco” debe ser muy pequeña, de unos 0,5 mm2. Se prefieren los frentes con forma de trapecio para que las secciones una vez cortadas y ya flotando sobre el agua del bote, formen tiras rectas que llamamos “tenias”. Posición del soporte para tallar el taco de resina manualmente:

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Fig.5,16

También se puede tallar en el mismo ultramicrótomo, con cuchillas de acero en un soporte adecuado o con cuchillas de vidrio sin la cubeta. El taco se coloca en su soporte horizontal y se enfrenta a la cuchilla. Primero se desvasta la punta del taco. Se gira la cuchilla 45º .

hacia un lado y se talla un lado del trapecio. Luego se gira la cuchilla 45º hacia el otro lado y se talla el lado paralelo. Ahora se gira el taco de modo de poder tallar los otros dos lados oblicuos.

fi

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fig.5. 17 Fig.5.18

Cuando se acumula mucha viruta de resina, se limpia el taco y la cuchilla con un pincel de pelo suave o una pera de goma.

fig.5.19

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5.6-Tipos de pirámides talladas-5.6.1-Tallado en “mesa”: 5.6.2-Alineación de la cuchilla:

fig.5.20

Cuando se coloca la cuchilla en su soporte en el ultramicrótomo es conveniente alinear el filo para asegurarse que los planos son paralelos al plano del frente del taco. Para ello, cuando iluminamos el taco con una luz inferior, aprovechamos el hecho que la banda de luz reflejada en el frente del taco, que actúa como un espejo, tiene un grosor igual a la distancia que separa la cuchilla del taco en cada punto.

fig.5.21

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d

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Cuando se aproxima el taco a la cuchilla, el grosor de su reflejo disminuye. Se debe primero rotar el taco para que los lados del trapecio sean paralelos al filo de la cuchilla. Se corrige el foco de la lupa en cada paso. Vista desde el frente:

fig.5.22

Alineación en el plano vertical: (vista desde el costado)

fig.5.23

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En el caso A está más lejos de la cuchilla la parte superior del trapecio, por eso se vería su reflejo desde el frente así:

Figs.5.24 y5.25: Se debe girar el taco hasta que el brillo tenga el mismo grosor en toda la altura del trapecio.

corregido

Fig.5.26

Alineación en el plano horizontal: (vista desde arriba)

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Fig.5.27

En este caso la cuchilla está más lejos de la parte B del trapecio, por eso se vería su reflejo desde el frente así:

Fig.5.28: Se debe rotar la cuchilla hasta que el brillo quede parejo:

corregido- Fig. 5.29

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5.7-Elección del ángulo libre:

Los ángulos que aparecen en la escala del soporte de la cuchilla sólo indican el ángulo libre de dejan paredes posteriores de las cuchillas con la normal.

Un ángulo libre muy angosto da cortes frágiles, quebradizos y que pueden mostrar vibración. Generalmente se usan ángulos libres entre 1 y 5º, pero los tacos blandos necesitan ángulos mayores o sufrirían mucha retracción.

Se ajusta cuando la cara del bloque no está en contacto con la cuchilla.

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Figs.5.31 y 5.32

Fig.5.30

5.8-Cortes semifinos (1 m)

Una vez alineada la cuchilla al taco, avanzamos lentamente hasta hacer una sección delgada. Se llena el bote con agua destilada con una jeringa. Seleccionamos la velocidad de corte, el grosor de 1 µm y realizamos secciones semifinas para tener una imagen de la muestra observable al microscopio óptico que sirven para identificar el tejido, ver su conservación, la orientación de la sección (longitudinal o transversal) y también para seleccionar el área que nos interesa estudiar luego en el microscopio electrónico.

Además, por ser cortes tan finos, permiten sacar fotos de células que están en foco en todo el campo, con mayor grado de detalle.

Los cortes semifinos que flotan en el bote quedan adheridas unas a otras formando una tira. Con la ayuda de un cabello pegado en un palito se puede separar la tira de cortes del borde de la cuchilla.

Los cortes semifinos se tiñen con azul de toluidina en un medio alcalino, porque los colorantes comunes acuosos, como hematoxilina y eosina, no pueden penetrar en el plástico..

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5.9-Tinción de cortes de resina de 1 µm para microscopía óptica

Las secciones se juntan con un ansa o una varilla de punta redonda del bote donde están flotando en el agua.

Se reciben en una gota de agua sobre un portaobjeto.

Por debajo del portaobjeto se marca la localización con una fibra.

Se deja secar el portaobjeto sobre un plato caliente varios minutos para que las secciones se adhieran al vidrio.

Se agrega una gota de azul de toluidina sobre los cortes, también en el plato caliente, hasta que se forme un borde iridiscente (sólo unos segundos), cuidando que no se seque y de no aspirar directamente sus vapores.

Se enjuaga con agua destilada.

Los cortes así teñidos se pueden ver directamente en el microscopio óptico o con un líquido de montaje y un cubreobjeto, cuidando de que no se formen burbujas. Al líquido de montaje no se le debe agregar xilol para hacerlo más fluido porque esto puede virar el color de la toluidina.

Los preparados deben resguardarse de la luz.

Fig.5.34

Estos preparados así teñidos se pueden decolorar con una gota de etanol 96º o colocándolos nuevamente en el plato caliente.

El azul de toluidina teñirá las estructuras

basófilas y además las osmiofílicas (membranas), por lo tanto, la imagen que resulta es semejante a la de la micrografía de TEM: el azul en el microscopio óptico corresponde con la densidad electrónica.

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5.9.1- Azul de toluidina para cortes de resina epoxi:

Azul de Toluidina ......................1g

Borato de sodio.........................1g

AD (ccp).............................100 m

5.9.2- Colorante policromo (azul y rojo)

Una vez que se tiñeron los cortes con azul de toluidina como se indicó anteriormente, se puede optar por teñir también con fucsina básica, colocando una gota de la solución colorante roja sobre el portaobjeto y lavando inmediatamente con agua destilada. La solución colorante roja se prepara antes de usar mezclando: Un volumen de fucsina básica 0,1% +Un volumen de borato de sodio 0.1%

La fucsina básica 0,1% se prepara disolviendo 0.1 g de la droga seca en 100 ml de agua destilada, se disuelve a 100ºC y se filtra una vez fría. Dura casi un año a temperatura ambiente.

5.9.3-Azul de toluidina para cortes de resina metacrilato:

Lo más conveniente es diluir 1:10 la suspensión usada para resinas epoxi. Otra forma es teñir con la solución de Azul de Toluidina 0.05% en buffer benzoato de sodio, a pH 4,4.

Buffer benzoato: ácido benzoico........0.25 g Benzoato de sodio..0.29 g AD..........................200 ml

También:

0.5 % en Na2CO3 0.1% a pH 11.1

0.25 % en borato de sodio 0.25 %

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Fig.5.35

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5.10-Re tallado del taco manualmente con una cuchilla de acero o en el ultramicrótomo con una cuchilla sin cubeta.

Una vez hechos los cortes semifinos y seleccionado el sector que nos interesa en el microscopio óptico, debemos volver a tallar el taco con un frente mucho más chico para hacer los cortes ultra finos.

Fig.5.36

Colocar el taco nuevamente en el ultramicrótomo. Cambiar la cuchilla por una de vidrio buena con cubeta o la cuchilla de diamante.

Alinear la cuchilla al taco.

Llenar la cubeta con agua.

Hacer los cortes ultra finos.

Las secciones ultrafinas no se recogen sobre portaobjetos sino directamente sobre las grillas.

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5.10.1-Corte y recogida de secciones en una grilla.

Se coloca el taco retallado en el ultramicrótomo. Se elige la mejor cuchilla de vidrio con bote o la cuchilla de diamante y se alinea al taco. Se avanza muy lentamente la cuchilla hacia el taco y se selecciona la velocidad de corte y el grosor de alrededor de 60-70 nm.

Se llena la cubeta con agua hasta que la superficie aparece espejada con la luz superior. Se conecta el avance automático.

Figs. 5.37 y 5.38: Se hacen los cortes ultra finos y se obtiene la “tenia” que flota sobre el agua

Antes de recolectar los cortes, conviene flamear las grillas para disminuir su carga estática y aumentar la adherencia de los cortes. Esto se consigue sosteniendo cada grilla por su borde con una pinza y pasándola rápidamente por la zona fría (azul) de la llama de un encendedor.

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Estirar los cortes con cloroformo

Recolectar los cortes con la grilla flameada.

Los cortes se estiran con los vapores de un solvente epoxi o cloroformo. Para eso se moja un palillo en el solvente y se pasa por encima de los cortes, sin tocarlos.

Se recolectan del bote sumergiendo la grilla por debajo de ellos y levantándola con cuidado:

fig. 5.39

También se puede recolectar la tira tocando por encima con la grilla invertida y levantándola junto a una gota de agua por tensión superficial. Las secciones de la muestra siempre se adhieren a la cara opaca de la grilla.

Fig. 5.40

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Poniendo la grilla perpendicular a la superficie del agua se descarga el exceso de agua. Las grillas se dejan secar con los cortes hacia arriba sobre un papel de filtro en una caja Petri de vidrio.

Cuando se juntan muchas secciones sobre el agua podemos retirarlas agregando más agua en el bote hasta tener una superficie convexa y apoyando suavemente un trocito de papel que no deje pelusa sobre ella.

5.11-¿Cómo se sabe el grosor del corte?

Aunque los ultramicrótomos actuales tienen mecanismos de corte precisos, durante el proceso de corte se pueden obtener secciones de distinto grosor. El grosor de una sección ultra fina se conoce por el color que produce el reflejo de la luz sobre su superficie. Este color puede ser gris (menos de 60 nm), plata (60 a 90 nm), oro pálido (90 a 120 nm), oro intenso (120 a 150 nm), púrpura (150 a 190 nm), etcétera.

Fig.5.41

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Fig. 5.42

El color del corte se debe al fenómeno de interferencia entre las distintas ondas que surgen de su superficie por la reflexión y refracción de la luz

incidente. Al incidir sobre el corte de resina la luz que proviene del foco del ultramicrótomo, una parte del rayo luminoso se refleja directamente, y otra

parte se refracta hacia el interior de la resina, acercándose a la normal por pasar a un medio más denso. Al contactar con el agua, una parte se refracta y otra se refleja, volviendo a la superficie. Aquí, nuevamente, una parte se refleja hacia el interior del corte y otra parte se refracta, pero en este caso alejándose de la normal por pasar de resina a aire.

A nuestros ojos llegan entonces las ondas emergentes. Al sumarse las ondas que emergen, pueden anularse por interferencia negativa, o se obtiene una nueva onda, cuya longitud de onda determina el color final. El desfasaje de las ondas emergentes es por la distinta trayectoria de estas ondas, que a su vez depende del grosor del corte.

Los colores se hacen más intensos al aumentar el grosor, pasando por el azul, verde y amarillo. Las secciones con colores por encima del púrpura son demasiado gruesas para usarlas en microscopía electrónica.

Onda incidente

Ondas emergentes

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5.11.1- Referencias de colores:

5.12-Preparación de grillas con film soporte

Como ya dijimos, el mesh o malla de la grilla (#) es el número de ventanas por unidad de área. Las grillas de 200#, 300# o más, soportan bien las secciones de resina, pro aparecen frecuentemente las barras que interrumpen la imagen. Cuando queremos tomar fotos panorámicas de cortes de resina, se prefieren grillas de menor mesh, pero podemos perder el material. Obviamente es necesario suministrar un soporte para que la sección no se cuele por la cavidad. El soporte es normalmente una membrana muy fina de plástico, que debe ser lo suficientemente resistente para sostener las secciones y lo suficientemente “transparente” al paso de los electrones, de modo que permita que los electrones del haz lo atraviesen sin ser absorbidos.

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Fig.5.43

También se usan grillas con film plástico para ubicar cortes seriados para hacer una reconstrucción tridimensional (se usan grillas con un agujero), o depositar directamente sobre la grilla una suspensión de partículas (virus, organelas aisladas, etc.) o dar mayor resistencia a las secciones de resina metacrilato o criocortes.

5.12.1-Film de Parlodion o Colodion:

Las grillas deben estar limpias y flameadas con el encendedor. Es muy importante hacer este proceso en un ambiente seco, para que el film que se va a realizar no se agujeree y sin corrientes de aire.

Llenar un vaso de precipitado con agua destilada limpia.

Colocar una lámpara para que la luz llegue tangencialmente a la superficie del agua.

Echar una gota de la solución de plástico suavemente hasta que se extienda la película y retirarla con la pinza, para limpiar la superficie.

Echar otra gota y observar la zona de la película más delgada (color gris por interferencia de la luz) y que no tenga arrugas. Tratar de no respirar encima. Colocar suavemente sobre esta zona las grillas. Cuando se haya completado, poner un pedazo de papel aluminio y retirarlo, para levantar las grillas.

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Dejar secar en una caja Petri con papel de filtro. Chequear bajo lupa y separar las grillas con una pinza fina.

Chequear en el TEM que el film esté limpio, fino y sin demasiados agujeros.

5.12.2-Film de Formvar:

Solución de Formvar al 0.5%:

0.5 g Formvar y llevar a 100 ml. con cloroformo. No agitar. Dejar disolver de 2 hs a toda la noche.

Sumergir un portaobjetos 5 segundos y dejar escurrir en un ambiente saturado de cloroformo.

Una vez seco el film, cortar los cantos con otro portaobjetos.

Sumergir el portaobjeto en un recipiente con agua limpia lentamente con un ángulo de 45° hasta desprender la película, y que quede flotando sobre el agua. Con una luz incidente tangencial colocar las grillas limpias con la cara brillante hacia el film. De no ser así quedan las dos caras de la grilla brillantes y no se pueden reconocer. Recoger con una etiqueta blanca, parafilm o papel tipo manteca. Quedará el film hacia arriba. Figs. 37 y 38

fig.5.44

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Fig.5.45

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5.13-Problemas en el corte con el ultramicrótomo:

1. las secciones quedan separadas en el agua del bote y no forman una tenia-

los lados del trapecio no están paralelos entre sí

el lado inferior del trapecio no es paralelo al filo de la cuchilla.

El nivel del líquido es demasiado alto.

2. la tenia se curva hacia un lado.

los lados del trapecio no están paralelos entre sí

un lado de las secciones está comprimida, y puede ser porque en ese sector le falte filo a la cuchilla.

3. Cuando pasa el bloque por la cuchilla se superpone el nuevo corte a los que estaban flotando.

El taco de la muestra está demasiado blando y pegajoso.

El filo tiene rugosidades que no permiten despegar los cortes de él

.El nivel del líquido es demasiado alto.

4. Al pasar el bloque por la cuchilla queda una gota de agua mojando el frente. No aparecen

nuevos cortes o se hunden.

.El nivel del líquido es demasiado alto. Hay que ir secando el frente del taco con una tira de papel de filtro, sin tocar la cuchilla.

El frente del taco es muy rugoso o tiene agujeros por burbujas que quedaron de la polimerización.

5. Agujeros en las secciones.

burbujas que quedaron de la polimerización.

La resina plástica no infiltró bien la muestra.

Hay diferencia de dureza dentro de la muestra, por ejemplo un cristal que no fue infiltrado.

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2

3

4

5.

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7

8

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6. Aparecen ranuras y rayas verticales en los cortes, perpendiculares al filo de la cuchilla.

Defecto en el filo de la cuchilla. Hay que correrlo a otro sector.

Se ha ensuciado el filo. Retirar y limpiar la cuchilla.

7. Aparecen secciones con bandas de distintos colores perpendiculares al filo de la cuchilla.

El filo de la cuchilla no es parejo. Seleccionar otro sector de la cuchilla.

8. Colores irregulares en las secciones.

Consistencia desigual entre la muestra y la resina o entre distintas zonas de la muestra. Hay que retallar seleccionando sólo una zona homogénea.

9. Aparecen secciones con bandas de distintos colores paralelas al filo de la cuchilla.

Se producen vibraciones entre el taco y la cuchilla. Se debe revisar el ajuste de todos los tornillos de los soportes. Puede ser que el frente del taco sea demasiado grande. También se puede probar cortar con una velocidad más baja.

11. las pequeñas mellas de la cuchilla a veces produce rayas en el corte que sólo se ven en el TEM, y que se abren como agujeros alineados cuando impacta el haz de electrones sobre ellas.

9

10 “Chatter”: Vibraciones de alta frecuencia durante

el corte, que produce bandas gruesas y finas alternadas (oscuras y claras). Puede ser que se observe sólo al TEM

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Capítulo VI:

Contraste.

Dra. Alfonsina Morales , Prof. Viviana Sorrivas e Ing. María Julia Yañez

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6.1-Objetivo del contrastado de secciones:

Los tejidos biológicos están constituidos por elementos livianos, por lo tanto, para realizar observaciones en el TEM tradicional, la contribución al contraste debida a los átomos endógenos en insignificante. Los elementos químicos que constituyen las células son carbón, hidrógeno, oxígeno y nitrógeno entre los mayoritarios. De todas maneras las células pueden ser observadas sin contraste con metales pesados por STEM ( scanning transmisión electron microscopy) o EELS (energy loss espectrometer).

Además de facilitar el estudio de la ultraestructura, puede realizarse un contraste selectivo para un tipo particular de célula de un tejido u otra organela. Históricamente se han llevado a cabo procedimientos empíricos que luego por ensayos de prueba y error fueron aprobados para su utilización en microscopía electrónica.

El contraste en la imagen se produce por una dispersión diferencial de los electrones que atraviesan una fina sección de muestra incluida en resina. Es obvio que una sustancia que se agregue a la muestra incrementará la masa o la densidad de ciertos sitios selectivamente tendrá valor como agente de contraste en el microscopio electrónico de transmisión (TEM).

La dispersión en la sección por átomo para electrones varía a diferentes potenciales de trabajo. Como la estructura bajo estudio tiene muchos sitios de unión para el agente de contraste, el que tenga más masa o densidad será el más eficiente. Por eso los agentes de contraste de mayor número atómico son mejores. Otro factor que influye en el contraste es el tamaño de las aperturas.

Otra ventaja del contraste consiste en que contribuye a mejorar la resolución y estabiliza los componentes de manera que se tornan más resistentes al daño por el haz.

6.1.1- Cómo se logra el contraste?

El contraste se logra por medio de:

Iones de metales pesados que reaccionan con constituyentes celulares o simplemente quedan adsorbidos. Por ejemplo: El acetato de uranilo se combina con proteínas y ácidos nucleicos, el hidróxido de plomo se adsorbe selectivamente sobre el material lipídico.

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Grupos orgánicos que reaccionan directamente o transportando átomos pesados sobre compuestos de coordinación específicos (ej.: moléculas per yodadas).

Anticuerpos específicos contra una cierta estructura, ligados a un metal pesado.

Reacciones enzimáticas o sustratos con átomos pesados: se produce la precipitación del metal en el sitio de reacción. La enzima debe estar localizada en una estructura (no difusa). Sirven para interpretar el estado de actividad en una célula normal o patológica. Ej.: se determinan fosfatasas en el aparato de Golgi y en los lisosomas.

6.1.2-Condiciones que debe tener un medio de contraste:

1. Dar adecuado contraste. 2. Permitir el depósito de metales pesados por reacción selectiva. 3. No producir artefactos por precipitación o distorsión de la estructura fina. 4. No extraer constituyentes celulares. 5. No reaccionar con los fijadores. 6. Permitir el contraste uniforme. 7. Ser de aplicación y preparación simple. 8. Ser estable en condiciones normales.

Los factores que intervienen son:

El fijador: el hidróxido de plomo contrasta más cuando el tejido ha sido fijado con tetróxido de osmio y se preservaron los fosfolípidos que cuando se utiliza formaldehído.

El pH: la alcalinidad favorece la precipitación de los metales como hidróxidos.

La temperatura: modula la penetración y reactividad del contrastante.

La concentración y tiempo de aplicación del agente de contraste permiten distinguir zonas más o menos reactivas (sensibles) a adquirir contraste.

Los inhibidores: removedores enzimáticos, agentes bloqueantes o que disuelven específicamente algún componente celular.

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6.1.3-Clasificación de medios de contraste:

1. No selectivos: acetato de uranilo, citrato de plomo, etc. 2. Específicos para una determinada estructura:

el tetróxido de osmio en uso prolongado aumenta el contraste del aparato de Golgi y lisosomas. Una vez diferenciadas

estas estructuras, se podrán aplicar métodos cuantitativos, como el microanálisis dispersivo de rayos x.

Además de aumentar el contraste, dan idea de la estructura química de la organela.

Se han clasificado por su forma de aplicación en:

intravital. en bloque: durante la fijación o el lavado, antes o durante la deshidratación. En cortes montados en grillas. Negativo.

6.1.3.1- Contraste intravital.

Consiste en administrar al animal, por vías naturales o artificiales (vía bucal, intraperitoneal, intraocular o intravenosa) sustancias de alta densidad electrónica, que pueden ser detectadas en los tejidos luego de asimiladas y metabolizadas. Su aplicación está limitada a unos pocos organismos vivos porque se necesitan dosis altas que alteran los procesos metabólicos normales.

6.1.3.2-En bloque:

Luego de la fijación con tetróxido de Osmio y antes de la deshidratación. Se realiza con U, Bi, Fe, KMnO4 (permanganato de potasio) o PTA (ácido fosfotúngstico) al 1%.

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Las piezas de tejido fijadas y lavadas se sumergen en acetato de uranilo al 2% en solución tampón o PTA al 2% en etanol. Esta solución de acetato de uranilo a pH =6 contiene partículas coloidales y cristales que lo enturbian, sin importancia. Se puede lavar el tejido previamente con agua destilada (A.D) y utilizar acetato de uranilo al 2% en agua para que no se precipite con el tampón fosfato o el de cacodilato de sodio. Se deja 12 a 24h. a 60° C ( o a 4°C para mantener el DNA y ciertas organelas) , en oscuridad. Así penetra 15μ en cada cara. Se debe deshidratar rápido en etanol o acetona y embeber. Este método se utiliza para evitar

futuras contaminaciones. También se puede aplicar para secciones gruesas para microscopía de alto voltaje. Se preservan las membranas y las nucleoproteínas, pero pueden extraer algunos elementos, si el tiempo se prolonga. Luego de tener las secciones finas sobre la grilla se aplicará una segunda fase de contraste con citrato de plomo.

Otra opción es usar acetato de uranilo en bloque al 2%, 2h. a 60°C en etanol absoluto después de la deshidratación.

6.1.3.3- Contraste de cortes finos montados en grillas:

Presenta las siguientes ventajas:

La extracción o distorsión que produce el medio de contraste después de la infiltración es mínima.

Actúa más rápido el agente contrastante.

La distribución del contrastante es más uniforme.

Se pueden controlar mejor los factores que intervienen en el contraste.

6.1.3.4 Contraste negativo

Protocolo : 1.- dilución de la muestra ( 1/1.000.000 para bacterias y virus) 2.- colocar una gota de muestra en la grilla y secar el excedente

3.- colocar sobre una gota de agente de contraste, acetato de uranilo o ácido fosfotúngstico en parafilm.

Nota: el fosfato de uranilo es insoluble, por lo tanto no se puede hacer una tinción con acetato de uranilo inmediatamente después de haber usado un fijador tamponado con fosfato

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4.- dejar actuar 3 minutos, lavar con agua destilada y secar.

Fig 6.1

6.1.4-Materiales difíciles de contrastar: técnica.

Cuando un material es difícil de contrastar se puede probar con el siguiente método:

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1. Tratamiento previo de las secciones con solventes orgánicos: someter las grillas con los cortes a vapores de bicloruro de etileno, acetato de amilo por 30 minutos. No se aconseja utilizar grillas con film porque se disuelve.

2. Hacer flotar las grillas con los cortes hacia abajo, en acetona o etanol por 20-30 minutos. Permite una mejor penetración del agente contrastante.

3. Usar agentes quelantes, tratar con acetato de uranilo, luego dejar flotar en EDTA ( 0,2M) tratar con citrato de plomo ( cuidar que no se separen los cortes de la grilla). Estos quelantes aumentan la capacidad de contraste.

4. Utilizar los medios de contraste diluidos en alcohol. 5. Calentar el sistema grilla-gota de contrastante (acetato de uranilo) de 37°C a 42°C.

Técnica: Todo el material debe estar escrupulosamente limpio, sin grasa. Las soluciones de contraste se filtran o centrifugan. Se pueden guardar en jeringas hipodérmicas para evitar su contaminación, sin aire y

con la aguja clavada en un tapón de goma. Estas contaminaciones podrían interferir en la interpretación de las imágenes. Lavar las grillas con A.D antes de contrastarlas. Conviene que las grillas estén húmedas hasta finalizar el contraste, bien tapadas para que la suciedad no se adhiera en ellas.

La caja de Petri de vidrio contendrá un papel de filtro embebido en solvente para evitar que precipite por evaporación el agente de contraste. Encima se colocará una placa de toque o cera dental o se puede utilizar una caja de Petri de plástico descartable. Se colocan las grillas con los cortes hacia abajo, para que floten por tensión superficial sobre la gota o se pueden sumergir con los cortes hacia arriba. Para varias grillas se usan recipientes comunes a todas ellas. No hay peligro de evaporación como con las gotitas, pero se pueden mezclar las grillas o sea que conviene utilizar este método con grillas del mismo tratamiento.

Nota: Para que no se contamine la muestra con la gota que queda en la pinza, se puede secar con un triángulo de papel de filtro o lavar con agua bidestilada descarbonatada.

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Las grillas contrastadas se dejan secar en un papel de filtro, debidamente rotulado en una caja de Petri.

6.1.5-Medios de contraste para Microscopía Electrónica de Transmisión (TEM )

Los más usados son:

6.1.5.1-Acetato de Uranilo: U: PM=238

Da un excelente contraste para trabajar a alta resolución, pero siendo radiactivo, tóxico y muy foto lábil se deben tomar medidas de seguridad extremas. Se une a los ácidos nucleicos por sus grupos fosfato y a las proteínas por sus grupos aminos libres. Reacciona específicamente con los ácidos nucleicos en células ya fijadas a pH= 3,5 y concentración de 1.10 -5 M de acetato de uranilo. Al aumentar el pH o la concentración, aumenta su reactividad, pero disminuye su selectividad. El acetato de uranilo puede unirse a varias proteínas, como histonas, ribo–núcleo-proteínas, fibras colágenas y fosfoproteínas (por eso contrasta las membranas). Ocurre una reacción diferencial de las ribo-núcleo-proteínas en tejidos fijados con glutaraldehído, tratados con EDTA ( ácido

etilendiaminotetraacético ) como quelante y luego contrastados con plomo, porque el EDTA ¨ destiñe ¨ o ¨ lava ¨ el DNA. Para una contrastación común el acetato de uranilo es más efectivo que el ácido fosfotúngstico, pero menos que el citrato de plomo. La solución más usada es la saturada en etanol 50-70% (solubilidad de acetato de uranilo en etanol 50%=5% a 15 °, porque tiene mayor

penetración en 15-30´ a temperatura ambiente. Las otras soluciones necesitan mayor tiempo (con mayor probabilidad de contaminación) y son más fotolábiles. En etanol 50% -70% es más vigoroso que el absoluto. Para evitar la evaporación conviene la técnica de los recipientes comunes a varias grillas. La solución que tiene mayor solubilidad en agua destilada es el acetato de Magnesio y Uranilo que es muy estable (se mantiene varios meses en oscuridad a temperatura ambiente. Se usan al 7,5% en agua, 3h a 40° C (el acetato de uranilo es soluble en agua hasta 7,7% a 15° C). Cuando el acetato de uranilo se utiliza en bloque también tiene efecto fijador:

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Preserva la estructura del DNA, membranas y uniones celulares, mitocondrias, miofibrillas y pared de las células vegetales, pero utilizado un mayor tiempo puede extraer fosfolípidos y proteínas durante la deshidratación posterior con etanol.

6.1.5.2-Soluciones de plomo: (Pb=PM 207)

Si el tejido fue fijado solo con aldehídos no habrá reacción con las membranas. Sólo se contrastan cuando han sido fijadas con tetróxido de Osmio, o sea que es necesaria la reducción a dióxido de osmio OS O2 para que el plomo reaccione con los grupos polares de fosfolípidos. El OS O4 reacciona con los grupos no saturados de los lípidos, rompiendo enlaces diéster y dando grupos polares acídicos que reaccionan con el OS O2. Estos sitios son muy reactivos con compuestos positivos como los cationes de plomo.

Al glucógeno le da aspecto de gránulos por reacción de los iones de plomo con grupos hidroxilos (efecto quelante) y luego se acumulan hidróxidos de plomo sobre el quelato (el OS O4 no contrasta el glucógeno). También reacciona con carbohidratos y proteínas.

No extrae componentes celulares y da buen contraste en la segunda tinción. En contacto con CO2 produce carbonato de plomo insoluble, por eso se utiliza agua hervida descarbonatada por lo menos por 10´. Se centrifuga a 6000 rpm. por15´ o se filtra con millipore un gran volumen y se descarta la primera porción del filtrado antes de usar estas soluciones.

6.1.5.3 Acido fosfotúngstico (PTA) (H 3 PO4.12 WO3.24H2O)

Es una contrastación aniónica con alto grado de unión al hidrógeno. Sirve para estudiar fibras proteicas. Su desventaja es que el taco de resina es más difícil de seccionar y puede producir explosiones si se utiliza

óxido de propileno en la infiltración, porque el PTA cataliza la reacción entre el etanol que se utiliza en la deshidratación y el óxido de propileno.

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También puede utilizarse en bloque y para ver vesículas sinápticas, al 1% en etanol (1h.), luego de fijar el contenido en glutaraldehído, sin OS O4 .

Tanto en solución etanólica como acuosa, es selectivo al colágeno y elastina cuando se usa luego del OS O4 .Se usa más en soluciones alcohólicas porque las acuosas distorsionan el tejido. Se puede distinguir la estructura macromolecular de las membranas.

El PTA reacciona con los grupos hidroxilos. Su especificidad es relativa a su pH, siendo más efectiva a pH ácido (1-3). Los grupos fosfóricos del PTA reaccionan con grupos de carga positiva como las proteínas de membrana. También reacciona con glucógeno,

aminoácidos básicos como lisina, arginina e histonas.

En Bloque:

Fijación con Glutaraldehído. Deshidratación con etanol

absoluto (este tratamiento previo hace más efectiva la contrastación).

PTA 2% en etanol absoluto durante ½ h-1h. con agitación.

Lavado del etanol para evitar la explosión con óxido de propileno.

Lavado con oxido de propileno rápido a 4°C.

Lavado con etanol, no más de 1´. Lavado con hidróxido de sodio en

óxido de propileno, 2 veces de 5-10´. ( no fijar con OS O4 , porque enmascara la fijación).

Infiltración en resina epoxi.

Secciones:

El PTA no reacciona con las resinas polimerizadas. Contrasta intensamente la matriz mitocondrial, retículo endoplásmico rugoso, miofibrillas y bandas Z del músculo. El glucógeno,

-Doble contraste con Acetato de uranilo y citrato de plomo

Protocolo:

1. La grilla con las secciones ya montadas se colocan en una gota del contrastante. 2. Por 15 a 45 minutos. 3. Se lava a grilla con golpes suaves en agua destilada filtrada y se coloca en un

papel de filtro. 4. Sin dejar secar se traspasa la grilla a una gota de citrato de plomo ( ph 12) .

preparar cámara libre de anhídrido carbónico colocando en una cápsula de Petri un papel de filtro embebido en Na OH 1N y con algunos pellets de OH Na dispersos en la cápsula.

5. El tiempo será de 1 minuto a 20. 6. Si precipita el citrato de plomo, se puede extraer el precipitado sumergiendo las

grillas en ácido acético 10 % por 1 minuto.

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las gotas de lípidos y las demás estructuras de membrana no se contrastan. Dejar las secciones en ácido fosfotúngstico (PTA) 1% en etanol 10% por 15 a 30 min

6.1.5.4-Permanganato de potasio: KMnO4 : (Mn=55)

Es un fuerte oxidante. Es fijador y medio de contraste al 3% en tampón veronal acetato (pH=7,4) 2 h. a temperatura ambiente. Contrasta las membranas y los lisosomas, pero es malo para observar núcleo y estructuras citoplasmáticas. Se utiliza para visualizar vesículas sinápticas densas de las terminaciones nerviosas adrenérgicas.

El material fijado con OsO4 y contrastado con KMnO4 muestra los tonofilamentos, vaina de mielina, membranas basales, glucógeno, desmosomas y citomembranas. En vegetales es común su uso.

Se aplica en grillas o en bloque:

a.) en bloque: el tejido es fijado con OsO4 y ya deshidratado con acetona, se trata con el KMnO4 al 1% en acetona absoluta por 10 min. El bloque se lava con agente reductor como una solución de metacrilato con acetona ( 2 gotas de metacrilato en 25 ml. de acetona) durante 5 -10 min para quitar el exceso de permanganato de potasio.

b.) en secciones: se usa KMnO4 1% en solución acuosa.

No hay que filtrar el contrastante porque aumenta la oxidación y precipitación. (Se toma con una pipeta desde el centro del frasco). El triple contraste: produce una gran dispersión de electrones por alteración de las proteínas cuando el KMnO4 reacciona con el acetato de

uranilo y el citrato de plomo.

Las grillas previamente mojadas con agua destilada se dejan en KMnO4 0,9% en tampón fosfato 0,1M a pH=6,5 y se lavan en el tampón inmediatamente. Luego se enjuagan con etanol 50% y se contrastan con acetato de uranilo y citrato de plomo.

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6.1.5.5-Rojo de Rutenio :

Es un compuesto inorgánico, cuya fórmula empírica es:

Ru2 (OH) 2 Cl 4 .7NH3. 3H2 O y su PM= 551,3.

Se utiliza para contrastar glicocálix ( polisacáridos extracelulares) de células de alvéolos pulmonares, microvellosidades intestinales, o pared celular de vegetales. Si se hacen cortes semifinos para M.O se ven depósitos marrones extracelulares. El rojo de rutenio contrasta en bloque, mezclándolo con las soluciones fijadoras, con 1500-3000ppm ( VER APÉNDICE DE RECETAS)

Luego de la deshidratación se embebe el tejido rápidamente. No debe usarse EPON 812 o el endurecedor NMA ( anhídrido metil

nádico) Se utiliza agua destilada hervida y se evita el contacto con vidrio. Formación y remoción de precipitados formados por soluciones de contraste en cortes ultrafinos . ver apéndice

contraste método solución tiempo T pH lavado características

Acetato de uranio

*DNA NRA (pH 3.5) *Fibras de colágeno. *Todas las proteínas.

Flotación *Et(OH) 50% Me(OH) 25% *Acetato de Mg y U 7,5% AD

15-30´ 15´ 3h.

Amb Amb 40°

3,5 4,8 -

*ET(OH) 50% y AD *AD *AD

* Fotolábil *radiactivo *Tóxico *Usar pizas de acero inox. *el Me(OH) disuelve

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el formvar y es tóxico. *El pp se lava con CH3COOH 2% o CH3COOU 10% de 1 a 5 ´.

¨

¨

Bloque 2% buffer pH=6 o AD ( antes de la deshidratación)

12-24 horas en oscuridad

-60°C -4°C para DNA

- * AD o Buffer * La solución buffer

queda turbia conviene

lavar el buffer con AD.

y usar AU en AD.

¨

¨

Bloque *2% ET(OH) 100% (después de la deshidratación)

* 2h. *Et(OH) 100% * Puede extraer lípidos. * Actúa como fijador de Proteínas y DNA.

KMnO4 *Membrana basal *Tonofibrillas *Glucógeno *Barrera Terminal *Desmosoma *Vesículas Sinápticas

*Flotación

*bloque

*0.1-1% en AD descarbonatada. Sin filtrar

*1% en acetona 100% ( después de dehidratar)

15´- 2h.

10´

6,5

am

amb 1.-AD 2.-Ácido cítrico 30´,3-AD

Metacrilato en acetona

* Fuerte oxidante deja cortes sensibles al bombardeo de electrones *pp: AD hervida

Plomo *DNA y RNA 5-10´, 0°C *Desmosomas

Flotación *Pb (OH) 2 mayor amb 12+- 0.1

1-Na 0.02N 2-AD descarbonatada

*tóxico Forma PBCO3

*Actúa previo

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*Glucógeno * Membrana

Basal *Ribosomas *Queratina

tratamiento con OS O4

* No extrae elementos celulares.

Rojo Rutenio

*Glicocálix *Microvellosidades * Pared células vegetales

Flotación

Bloque

*1% AD

1.-En GA/Buffer 2.-En OS O4

/buffer 1mg/ml

De fijación

De fijación

*Buffer

*En cortes gruesos. También produce contraste. *No usar buffer fosfato. *Admite triple contraste con U y Pb. *Evitar el contacto con el vidrio. *Evitar el endurecedor NMA.

FIJADOR CONTRASTANTE DNA - RNA

MEMBRANA NUCLEAR Y REG

AP GPOLGI Y REL

MEMBRANA PLASMÁSTICA Y DERIVADOS

MITOCONDRIAS LÍPIDOS POLISACÁRIDOS PROT.

Os O4 - Pb(OH)2

+ ++

+ ++

+ ++

+ ++

+ ++

++ +++

- ++

+ ++

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Citrato de Pb PTA UO2

+++ + +++

+++ + ++

+++ + ++

+++ ++ ++

+++ + ++

+++ + +

+++ + +

+++ +++ +++

Formaldehído - Pb(OH)2

Citrato de Pb PTA UO2

+ ++ ++ ++ ++

- + +++ ++ +++

- - - - -

- + + ++ +

- ++ ++ ++ ++

- + + + +

- ++ ++ ++ ++

- ++ ++ ++ ++

Notas:

DNA Y RNA en muchas células están asociados a proteínas y la coloración puede deberse a ellas.

Cuando se ha fijado con formaldehído las membranas no se contrastan. En el retículo endoplasmático rugoso se observan límites

debido a los ribosomas.

Se puede ver la membrana plasmática, las vesículas pinocíticas, vacuolas fagocíticas, etc. con tinción con ácido fosfotúngstico si antes

del contraste se quita el OsO4 con H2O2 al 2%.

En un material fijado con formaldehído, al contrastarlo, aparece una imagen negativa de las mitocondrias, ya que se contrastó su matriz

pero no las membranas.

Los lípidos son a veces extraídos en la fijación con formaldehído, dejando vacías las vacuolas. Las grasas naturales se pueden perder

luego de la fijación con Os O4 y luego no se contrastan.

El glucógeno es fuertemente contrastado por el plomo. Las cubiertas superficiales se tiñen porque contiene proteínas y polisacáridos.

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Los derivados de la membrana plasmática son: vacuolas fagocíticas y pinocíticas, microvellosidades, etc.

Referencia: Mercer, EH.1963 ¨a écheme for section staining in electrón microscopy¨ J.Roy. Micros.Soc.81:179-182

6.1.5.6-Contraste de polímeros

Como ocurre con los materiales biológicos, el contraste de polímeros en el TEM es débil debido a los elementos de bajo número

atómico que los componen, y que producen escasa dispersión de electrones (scattering electrónico). Esto constituye un factor limitante en la observación de este tipo de materiales.

La técnica de teñido permite mejorar el contraste mediante la incorporación de átomos pesados que reaccionan selectivamente con ciertas características estructurales de la muestra. Esto produce un alto scattering electrónico local que realza el contraste.

. La mayoría del teñido de polímeros es por contraste positivo. En este tipo de contraste, la región de interés es teñida (oscura) por una interacción química en la cual el agente contrastante penetra en las algunas regiones debido a una mayor velocidad de difusión.

El contraste negativo, es empleado en algunos materiales como por ejemplo emulsiones en los cuales las partículas se encuentran en un sustrato. En este caso, el teñido se efectúa en las zonas circundantes de las partículas revelando la forma de las mismas.

En los polímeros el agente de contraste a utilizar dependerá del tipo de polímero y las condiciones óptimas de teñido que en muchos casos se deben obtener experimentalmente.

En la tabla I se presentan los agentes de contraste para los distintos grupos funcionales de polímeros.

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Tabla I

Polímero Agente contrastante

Ácidos Hidracina y después tetróxido de osmio

Alcoholes Tetróxido de rutenio

Amidas Acido fosfotúngstico

Aminas Tetróxido de rutenio

Aromáticos Tetróxido de rutenio

Ésteres Hidracina y después tetróxido de osmio

Éteres Tetróxido de rutenio

Hidrocarburos no saturados Tetróxido de osmio

Hidrocarburos saturados

Tetróxido de rutenio Ácido clorosulfónico Ácido fosfotúngstico

Poliésteres Ácido fosfotúngstico

Resinas epoxi Tetróxido de rutenio

El teñido se puede efectuar antes o después del seccionamiento. Cuando se realiza antes, la muestra cortada en pequeños bloques (1-3mm espesor) es colocada en la solución o en el vapor del agente contrastante. Si el teñido se hace después del seccionamiento, los cortes depositados sobre la grilla se colocan en contacto sobre una gota del contrastante.

Referencia: Polymer Microscopy . Sawyer, L., Grubb, D. Chapman & Hall Publ., 2nd. Ed. (1996).

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6.1.5.7- Tetróxido de Osmio

Polímeros multifase conteniendo fase goma no saturada es uno de los grupos de polímeros más estudiados por microscopia electrónica de transmisión. El tetróxido de Osmio (OsO4) ha sido ampliamente utilizado como agente de contraste para este tipo de material.

El OsO4 reacciona químicamente con los dobles enlaces de las fases no saturadas produciendo un excelente contraste. Esto es debido a un incremento del scattering electrónico generado por la presencia de los átomos de Osmio en la fase no saturada comparado con la matriz que no reacciona con el agente de tinción.

La reacción fija y tiñe el polímero. La fijación es un entrecruzamiento químico de la fase goma que produce endurecimiento e incremento de la densidad en esa zona. Este efecto es ventajoso en particular para aquellos polímeros que se deforman al seccionarlos a temperatura ambiente, tales como elastómeros con fase goma, resinas ABS y HIPS.

Es importante destacar que los tiempos de teñido dependen del espesor y forma del espécimen, de la temperatura y el grado de insaturación.

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Método:

El OsO4 es volátil y tóxico, por lo que deben seguirse las normas de seguridad sugeridas para este tipo de compuesto. El procedimiento debe realizarse bajo campana, con guantes, antiparras y guardapolvo.

El OsO4 se vende en pequeñas ampollas de 0.5g. 1- Se forma una solución al 2% disolviendo la ampolla en agua. 2-El espécimen (bloque) se sumerge en frasco herméticamente cerrado conteniendo la solución. 3- Se deja 1 semana aproximadamente. 4- Se retira cuidadosamente del frasco y se hacen lavados sucesivos en agua bidestilada. 5- La solución de OsO4 usada se neutraliza con aceite y se guarda en frasco herméticamente cerrado en un lugar apartado. En el caso de haber seccionado el material previamente al teñido, se coloca una gota de solución de OsO4 al 2% en contacto con las secciones

del espécimen montado sobre la grilla. El tiempo de teñido puede variar entre 1-3 h. También pueden usarse los vapores de la solución de OsO4 al 2%. Para esto se siguen los mismos pasos enunciados anteriormente. En

general, los tiempos de teñido son mayores a los empleados con la solución líquida. Un procedimiento similar puede realizarse para el teñido de suspensiones diluidas de partículas látex . En este caso, el tiempo de teñido

estimativo es de 30 min para el teñido en solución liquida.

6.1.5.8-Tetróxido de Rutenio

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El tetróxido de Rutenio (RuO4) es un agente oxidante más fuerte que el OsO4. Este agente oxida los anillos aromáticos produciendo ácidos

mono o dicarboxílicos. En la bibliografía se encuentran reportadas distintas aplicaciones de teñido con RuO4 para alcoholes, aromáticos y aminas. En algunos polímeros, como resinas ABS se utiliza la combinación de RuO4 con OsO4 para revelar detalles estructurales.

Las reacción química que ocurre durante el teñido con este agente contrastante se muestra en la fig: Método : Las soluciones de RuO4 son poco estables por lo que es necesario trabajar con soluciones frescas. Existen dos formas de obtener soluciones

de RuO4. Una de ellas es a partir de la oxidación de Dióxido de Rutenio (RuO2) hidratado usando Periodato de Sodio. La reacción se completa a las 3-4 h. Sin embargo esta reacción es muy inestable. Por esta razón, se suele utilizar una solución al 2% de RuO4 a partir de la reacción de Tricloruro de Rutenio (RuCl3) hidratado e Hipoclororito de Sodio (NaClO). El teñido se realiza con los vapores del RuO4 resultante.

El RuO4 es volátil y muy tóxico, por lo que deben seguirse las normas de seguridad sugeridas para este tipo de compuesto. El procedimiento

Debe realizarse bajo campana, con los elementos de seguridad necesarios (guantes, antiparras, guardapolvo, máscara).

1- Se colocan, en un recipiente de vidrio (de 10 ml), 0.02g de RuCl3 y las grillas conteniendo los especímenes a contrastar. Los

bordes de las mismas se sujetan a un vidrio portaobjetos con una cinta doble faz. 2- Se cierra el envase. Es importante que el recipiente pueda cerrarse herméticamente y permita la entrada de líquido mediante una

jeringa. 3- Se inyecta 1ml de (NaClO) y se retira la jeringa. Se formará una solución color marrón. 4- Se deja actuar durante 1.0 h. Este tiempo puede variar de acuerdo al tipo de polímero que se desee contrastar. 5- Se abre con cuidado el recipiente, se retiran los especímenes y se vuelve a cerrar. 6- Se neutraliza la solución de RuO4 con una solución acuosa de Sulfato de Sodio (NaSO4) al 10 % w/w. Se deja en la misma 1

semana. Posteriormente se lava con agua destilada. El agua de lavado se coloca en bidones destinados a residuos de este tipo. 7- Todos los elementos descartables utilizados se guardan como residuo en un recipiente cerrado y se coloca en un área específica

para residuos tóxicos.

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6.1.5.9-Ácido clorosulfónico

Este agente contrastante ha sido ampliamente usado para el mejoramiento de contraste en muestras de polietileno (PE), el cual es inestable

frente al haz de electrones debido al daño por radiación que sufre. Para poliolefinas cristalinas, en general, la reacción del ácido Clorosulfónico con el PE produce entrecruzamientos, estabiliza y tiñe el material facilitando de esta forma el seccionamiento y la estabilidad durante la observación.

El acido clorosulfónico difunde selectivamente en las regiones amorfas en polímeros semicristalinos, incrementando la densidad en dichas regiones y creando un contraste adicional que permite diferenciar estas regiones del resto del material.

El método, tiñe las lamelas debido a la incorporación de cloro (Cl) y azufre (S). El tratamiento con solución salina resulta en una reacción con grupos polares e iones metálicos se depositan e incrementan la densidad electrónica. Asimismo un tratamiento posterior con Acetato de Uranilo intensifica y estabiliza el contraste.

Método: El teñido de PE con ácido Clorosulfónico tiene como procedimiento general el siguiente: 1- Se coloca la muestra en ácido Clorosulfónico a 60 °C durante 6-9 h. 2- La muestra teñida, se lava en acido sulfúrico concentrado y posteriormente en agua. 3- Se seca y embebe la muestra en resina epoxi. 4- Se realizan cortes ultradelados con cuchilla de diamante. 5- Se colocan las secciones en solución acuosa de acetato de uranilo al 0.7 %. durante 3 h.

6.1.5.10-Ácido Fosfotúngstico

El Acido Fosfotúngstico (PTA) es un agente contrastante aniónico con alto peso molecular que produce una alta densidad al material teñido. No se encuentra bien determinada la forma de interacción de este agente con el material orgánico. Existen dos interpretaciones: una es la

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precipitación iónica y la otra es la formación de un complejo en solución acuosa. Sin embargo, en ambos casos la especificidad del teñido está relacionada al pH de la solución.

El PTA (solución al 2%) reacciona con grupos funcionales como hidróxidos, carbóxidos, y aminas como un agente contrastante positivo. Se han reportado en la literatura aplicaciones de este agente contrastante en látex y nylon 6.

6.2-Contraste de la imagen

Para entender y apreciar una micrografía electrónica es esencial familiarizarse con la física de la producción de la imagen. Para comenzar se debe aclarar que las fotografías tomadas con electrones son en blanco y negro (niveles de grises) y en Microscopía óptica obtenemos imágenes en colores y también en blanco y negro. La diferencia fundamental de la formación de la imagen entre los dos sistemas es la manera en la cual los fotones de la luz visible y los electrones interactúan con la materia orgánica. Una fotomicrografía resulta de la interacción de fotones con grupos específicos químicos en la muestra, en contraste, una micrografía electrónica deriva de interacciones no específicas entre electrones y átomos en vez de moléculas. En el microscopio de luz, un fotón es absorbido por un cromóforo (grupo químico específico) o pasa inalterado a través de la muestra. En el microscopio electrónico el electrón interactúa con la muestra elástica o inelásticamente. (Ver capítulo II). Un electrón dispersado pasa muy cerca del núcleo de un átomo y no pierde energía. Es reflejado por atracción electrostática, su paso es desviado por un ángulo mayor a medio grado, suficiente para no pasar por la apertura de objetivo. La dispersión inelástica ocurre a través de la interacción con un electrón del orbital de la muestra. La pérdida de energía es alrededor de 20 – 40 eV y la desviación es menor a medio grado. Entonces estos electrones atraviesan la columna, tienen diferente foco porque han perdido energía. Los que realmente contribuyen al contraste son los que fueron desviados sin pérdida de energía.

Cuanto más lento va el electrón y más cargada la molécula, el electrón será desviado en un ángulo más grande, suficiente para no pasar por la apertura de objetivo, contribuyendo así al contraste. Esto se hace muy claro cuando uno disminuye el potencial para obtener más contraste. También los elementos pesados como el Osmio que poseen alto número atómico y mucha carga nuclear producen más contraste que las muestras con elementos livianos que constituyen la totalidad de los especímenes. Esta es la razón por la cual los colorantes orgánicos que han contribuido al conocimiento celular en la Microscopía Óptica no sirven en Microscopía Electrónica.

En el caso de bajar el potencial para mejorar el contraste, las desventajas son que como los electrones de baja energía tienen menores longitudes de onda, se afecta la resolución y la aberración cromática. Por otro lado si se utilizan pequeñas aperturas que sacarán más electrones periféricos aumentará el contraste. (La relación ruido-señal se incrementará) La desventaja es que aumentará el astigmatismo.

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6.2.1-Factores que afectan el contraste:

El contraste de la imagen en TEM se debe a la dispersión sufrida por los electrones cuando interactúan con la muestra. Cuando el haz de electrones pasa a través de una muestra, interactúa con el núcleo del átomo o con los electrones de las capas externas,

pero la primera es más importante. Estos electrones se dispersan cuando se aproximan al núcleo atómico cargado positivamente. Los electrones dispersados siguen una trayectoria hiperbólica alrededor del núcleo como un punto focal. Electrones de una velocidad dada que pasan a una distancia dada del núcleo serán más reflectados por un núcleo cuya carga positiva es alta (alto número atómico). Entonces: el contraste de la imagen a un dado potencial y determinado tamaño de apertura es proporcional al número atómico. La medida del núcleo atómico está directamente relacionada con el número atómico y con la densidad. Consecuentemente cuando mayor es la densidad del espécimen, mayor será la dispersión de electrones.

Bajo número atómico en la muestra causa dispersión inelástica, acompañada por aberración cromática. Este efecto tiene como consecuencia una imagen sin bordes definidos con menos contraste y menos resolución. Se puede solucionar utilizando elementos pesados como Osmio.

Otro factor que influencia el grado de dispersión es el grosor de la muestra. Esto ocurre ya que al pasar los electrones se encuentran con más material de la muestra produciendo más dispersiones. Pero hay que tener en cuenta que el contraste se deberá al producto de la densidad del espécimen con el grosor. Lo que se denomina contraste de masa por grosor (mass thickness) del espécimen. Como los especímenes biológicos tienen una densidad menor que 1, si queremos observarlos sin contraste deben tener un espesor de 10nm aproximadamente. (secciones doradas). Hay un número fijo de sitios de unión en los tejidos que depende de la densidad de la muestra y del espesor de la sección. La eficiencia de un agente contrastante será determinada por la masa del contrastante agregado al sustrato biológico. Los agentes de mayor masa son más eficientes como contrastantes para microscopía electrónica. Estas son las razones por las cuales se usan metales pesados.

El pH de la solución es otro tema muy importante que tiene que ver con el grado de incremento del contraste del tejido. Se conoce que sales de metales pesados se hidrolizan a niveles de pH incrementados y forman iones polinucleares. (Son agregaciones de iones que se forman cuando pierden protones durante la hidrólisis). Estos iones precipitan como hidróxidos lo que lleva a incrementar el contraste.

Las variaciones en el contraste de diferentes zonas de la muestra pueden deberse también a pérdida diferencial de partes del tejido y del medio de inclusión durante la exposición al haz de electrones. Ambos tipos de pérdidas incrementan el contraste. Algunos elementos celulares son más resistentes a la radiación que otros. (ADN y algunas proteínas)

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Variando el pH de la solución, (PTA). Cuando se

usa a pH 2.0, muestra afinidad por polisacáridos,

mientras que a pH 3.0-3.5 la muestra con proteínas y

nucleoproteínas

.2.3-Tiempo de acción y penetración del agente contrastante.

Tiene que ver con la velocidad de absorción de los iones de metal, las alteraciones de las soluciones de contraste y la posible extracción de elementos celulares.

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La gran profundidad de campo del microscopio de transmisión hace que se pueda enfocar las estructuras celulares en todos niveles de la sección al mismo tiempo. La profundidad de foco de un TEM de 0.6 nm de resolución es 400nm. Permite focalizar enteramente una sección de 80nm.

La penetración del agente de contraste no es uniforme, ni completa. El medio de inclusión es uno de los mayores obstáculos en la penetración del contrastante ya que la mayoría de las resinas son no polares, mientras que los agentes de contraste son polares o iónicos.

El citrato de plomo penetra en la resina de inclusión mucho más rápido que el ácido fosfotúngstico (PTA) o el acetato de uranilo. La penetración del PTA está limitada a 100nm desde la superficie de la sección.

6.2.4-Especificidad del contrastante.

Probablemente la especificidad del contraste sea una de las técnicas más importantes para la determinación de la composición química de las estructuras celulares. La mayoría de los contrastantes conocidos son multipropósito, por lo que no son muy específicos. Aunque se ha reportado (Monneron y Bernhard, 1969) que se puede diferenciar entre RNA y DNA usando acetato de uranilo en condiciones muy especiales.

La especificidad del contrastante se puede demostrar utilizando muy bajas concentraciones, generalmente se utilizan las soluciones saturadas. Otro método es controlando estrictamente los tiempos de contraste. En este caso el vehículo en que es disuelto el contrastante también es importante.

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6.2.5-Factores que afectan al acetato de uranilo

Con respecto al PH: Los grupos fosfato y carboxilo se unen a los iones de acetato de uranilo, se debe tener en cuenta que depende del pH de la solución ya que a pH 3,5 la unión con el DNA es muy fuerte y específica. A pH de 4 o 5 se une a grupos fosfato y carboxilo mientras que a valores menores que 4 se une a grupos fosfato.

Con soluciones tampón: Cuando se realiza un contraste con acetato de uranilo antes de la infiltración ( en bloque) conviene lavar muy bien el tejido con acetona o alcohol diluido ya que el acetato de uranilo precipita con los tampones tradicionales como fosfato y cacodilato de sodio haciendo precipitar sus sales. Se ha comprobado que utilizando esta técnica se incrementa el contraste además de estabilizar la estructura fina.

6.2.6-Contaminación de las secciones

Contaminación superficial:

La sección se ve sucia, con partículas que pueden provenir de

aceite, partículas del agua de lavado, precipitados de los contrastantes, etc

Contaminación debida a la fijación:

Una de las causas de que aparezcan finos

precipitados en la sección del preparado es que el

tejido haya sido mal lavado antes de la segunda

fijación con tetróxido de osmio o también puede

deberse a la presencia de tetróxido de osmio que

pasó a dióxido. Este artefacto puede reducirse

sometiendo la sección a ácido periódico 1% o H2O2

al 3% por 5 a 10 minutos.

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Contaminación por los agentes de contraste. Generalmente el acetato de uranilo no precipita (sólo si

se expone a la luz directa)

Un prolongado contraste de más de 10 minutos con citrato de plomo provoca precipitados de carbonato

de plomo electrodensos y esféricos. Para extraerlos se expone la grilla contaminada a acetato de uranilo

acuoso por 7 minutos o con ácido acético acuoso al 10% por 1 minuto. (puede dañar las secciones). Esta

última es efectiva para quitar otros contrastantes precipitados. Hay que volver a contrastar. Si se contrasta

con citrato de plomo y no se lavó bien el acetato de uranilo, se ven unos precipitados con forma de agujas

que son insolubles en agua. Pueden disolverse con0.5% de ácido oxálico, 10% de ácido acético por 1 minuto

o mejor aún, aplicar una solución alcohólica de acetato de uranilo por un minuto. Se puede prevenir

utilizando EDTA al 1% antes de contrastar.

Precauciones necesarias para no tener contaminación:

1. Descartar soluciones de citrato de plomo si se ven opacas o con cristales (pueden centrifugarse).

2. Utilizar envases de plástico para las soluciones de citrato de plomo.

3. Usar pellets nuevos de OH Na en la caja de contraste de Citrato de plomo.

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Capítulo VII:

Inmunolocalización

Dra. Alfonsina Morales

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7.- inmunolocalización

Se usa esta técnica para identificar el sitio donde se encuentra determinada molécula, con ayuda de anticuerpos marcados con una partícula electrodensa, como el oro.

Puede usarse peroxidasa o ferritina, pero en estudios cualitativos, porque dan una marca menos definida. Cuando se utiliza peroxidasa, hay que poner cuidado en anular con H2O2 la peroxidasa endógena y los peróxidos dejados por la

fijación con aldehídos.

7.1-La reacción inmunocitoquímica se puede realizar:

7.1.1-Antes de la fijación: Se hace la inmunolocalización e inmediatamente debe fijarse la muestra y continuar con la técnica convencional. Sirve para localizar antígenos

superficiales de células aisladas. Es muy caro para trozos de tejidos porque consume mucho anticuerpo. Su ventaja es que se obtienen imágenes con el mejor contraste.

7.1.2-Luego de la fijación y antes de la infiltración en resina: Con una fijación suave. Se puede permeabilizar luego la membrana plasmática de las células para permitir el ingreso de anticuerpos al interior y

detectar antígenos internos. Se continúa con la técnica convencional. Sólo para células aisladas. Se altera la estructura de las membranas.

7.1.3-Luego de la fijación y polimerización en una resina epoxi: Con una fijación suave. Luego de la polimerización se “carcome” (etching) la resina de las secciones ultrafinas con KOH o H2O2 al 2% por 15 min. La

desventaja es que el oro pega inespecíficamente sobre las resinas hidrofóbicas y disminuye el marcado (hay que concentrar más el oro). Sirve para secreciones y productos del Golgi, que toleran la temperatura.

7.1.4-Luego de la fijación y polimerización en una resina hidrofílica: Con una fijación suave. Se incluye la muestra en una resina hidrofílica, que se polimeriza y se corta en ultramicrótomo. La reacción se hace sobre

las grillas. Las secciones son muy inestables al haz. Esta fijación suave no preserva la estructura óptimamente y sin osmio y plomo el contraste es pobre.

7.1.5-Sobre crio cortes.

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Fijación suave con aldehídos. El material se coloca en un crioprotector y se congela en LN2. Se corta el taco en el crio ultramicrótomo. Se hace la reacción sobre la grilla y luego se cubre con un film plástico que incluye uranilo para darle contraste.

Se necesita disponer de una cámara de crio cortes. Salvo cuando la reacción se hace antes de la fijación, todas las demás alternativas sirven para estudiar células libres o trozos de tejidos, y para

antígenos internos o superficiales. De ellas, son recomendables la técnica de resina hidrofílica y la de crio cortes.

7.2-¿Cuando utilizar Lowicryl y cuando crio-cortes?

7.2.1Usamos CUM (crio-ultramicrotomía)

• Como patrón de ultraestructura. • Cuando tengo disponibilidad de nueva muestra. • Porque es más rápida (sin 2º fijación, sin deshidratación ni polimerización). • Para detectar antígenos muy lábiles o en baja cantidad. • Para hibridización in situ.

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Fig.7.1

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7.2.2-Fijación suave:

Una fijación con glutaraldehído 5 % seguida por osmio escondería los epitopes que se busca identificar. Es por ello que se utiliza sólo una fijación suave con formaldehído 2-4 %, y a lo sumo, con el agregado de 0.1 % de glutaraldehído para mejorar la conservación de la

estructura siempre y cuando el antígeno esté en suficiente cantidad y lo permita.

7.2.3-Preinfiltración:

En el caso de tener células, partículas u organelas aisladas conviene agregar este paso de preinfiltración en agarosa o gelatina para procesarlas incluidas en un pequeño bloque (ver apartado de “Preinfiltración”). Si se elige el camino de las resinas metacrilato como el camino de los crio-cortes, recomendamos usar la gelatina, ya que ambos procesos continúan a baja temperatura y si el material ha sido mal ubicado, el bloque de gelatina es reversible. No es necesario el paso de preinfiltración cuando nuestro material es un trozo de tejido compacto.

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7.2.4-Resinas metacrilato: Inmunolocalización luego de la fijación y polimerización:

Se usan para esta técnica las resinas metacrilato, como Lowilcryl, cuyo protocolo completo aparece en capítulo de “Infiltración”. En resumen:

• Aislamiento del material.

• 1º fijación suave.

• (Preinfiltración agarosa o gelatina en el caso de células aisladas).

• Deshidratación EtOH a bajas temperaturas.

• Resinas hidrofílicas a bajas temperaturas.

• Entacado y polimerizado UV.

• Ultramicrotomía.

• Inmunomarcado.

• Contraste.

• Observación en TEM. La preservación de la antigenicidad es buena.

• Es posible realizar distintas reacciones en cortes sucesivos en TEM. • Permite usar colorantes acuosos en los preparados de microscopía • óptica.

• La fijación suave con aldehídos seguida de la deshidratación no • preserva bien la ultraestructura, especialmente de • membranas.

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• Las resinas metacrilato producen dermatitis graves. • La polimerización es engorrosa y poco reproducible. • Como no se usó osmio en la fijación, el contraste final es pobre.

Las secciones son muy inestables al haz.

7.2.5- Los criocortes:

¿Qué ocurre cuando se congela agua pura a distintas velocidades? Diagrama teórico que muestra la relación entre los estados del agua a presiones normales:

fig.7.2

H2O LÍQUIDA HIELO

HEXAGONAL

100 m3

Enfriamiento

lento

Enfriamiento muy

rápido de microgotas

HIELO CÚBICO (10 nm3)

> -140 ºC

> -110 ºC Posibilidad teórica

HIELO AMORFO O VÍTREO

Velocidad de enfriamiento: >

105 ºC/s

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El hielo hexagonal o cúbico tiene estructuras cristalinas confirmadas con rayos X característicos y esquema de difracción.

El congelamiento súper-rápido se hace con un enfriado a una velocidad mayor que 105 ºC/ seg.

El estado vítreo no es cristalino, sino que solidifica cada molécula en el sitio donde estaba en el estado líquido (como el vidrio). Para alcanzar el estado vítreo hay que saltar la franja de -40ºC a -130 ºC.

¿Qué ocurre cuando se congela una solución acuosa a distintas velocidades?

Cuando una solución acuosa se congela, se forma un núcleo de cristal de agua

(hexagonal o cúbico) que crece con otras moléculas de agua, sin el soluto. El soluto entonces se va concentrando en el resto de la solución. Al final también solidifica este resto con soluto, sin cristalizar, es el eutectoide entre los cristales de agua pura.

¿Qué ocurre cuando las células están en una solución acuosa?

En sistemas biológicos todo esto se complica por la presencia de membranas semipermeables y porque aproximadamente el 15 % del agua total está asociada a la superficie de otras moléculas, como “hidratación” y no quedan disponibles para formar cristales. Esto es una ventaja, ya que dentro de la célula hay crioprotectores naturales (proteínas, azúcares), disminuyendo la franja a -40 ºC a -80ºC.

Fig.7.3

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A baja velocidad de congelamiento se forman cristales hexagonales fuera de la célula, se concentran los solutos y hace que el agua salga de la célula para lograr el equilibrio osmótico. En consecuencia, la célula se deshidrata y concentra sus propios solutos.

A velocidad media de congelamiento los cristales se forman fuera de la célula también, pero antes que difunda el agua desde el interior, se

nuclean cristales hexagonales dentro de ella, de 100 m y bordes irregulares, que rompen su estructura. A velocidad ultrarrápida de congelamiento, -10 000 ºC/seg., se forman cristales cúbicos chicos, de aproximadamente 10 nm3 o “vítreos” (no se

distinguen en TEM). Las moléculas son detenidas en el mismo lugar que en el estado hidratado. En experimentos con embriones se comprobó que luego de la desvitrificación las estructuras se mantienen vivas.

En la práctica se usa el término “vitrificación” como el enfriamiento que no deja daños por formación de cristal a nivel de TEM. En realidad solo

sería posible con tejido hidratados más chicos que 10-20 m! (una capa de células). Esto se consigue solamente con

una técnica sin fijación donde los criocortes se mantienen a -150 ºC, que no sirve para inmunohistoquímica hasta ahora, pero sí como referencia de estructura.

fig.7.4

ºT amb -5 ºC

Lento: -1ºC/ min

Velocidad media

Ultrarrápido: 10000ºC/seg

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Si se quiere cortar un tejido (hidratado) sin fijar y sin el tratamiento con sacarosa, se necesitaría:

o Congelamiento ultrarrápido todos los pasos por debajo de -140°C para evitar la desvitrificación. o Las secciones se transfieren de la cuchilla a la grilla dentro de la criocámara, y luego se presionan sobre la grilla . Las grillas se

transfieren bajo nitrógeno líq. directamente al TEM enfriado a -140°C Estos cortes sufren más compresión, se mellan más, y también tienen muy bajo contraste al no estar teñidos, por eso se usa el contraste de fase en TEM.

o El método de congelamiento a alta presión. La alta presión (2100 bar) previene el aumento de volumen que ocurre cuando el agua congela a presión normal, y esto permite achicar la velocidad de -106 0C/ s a -100°C/ s.

El aparato es un Balzers, que deja el tejido en un sandwich de 600 rn entre 2 metales que lo presionan a 2100 bar menos de 10 milisegundos antes que reciba una corriente de N-liq. durante 0.5 s. Tampoco se lo usó todavía para inmunocitoquímica pero habría que combinarlo con una criosustitución.

Se soluciona el problema con la técnica de Tokuyasu, que agrega el paso de crioprotección:

• Fijación química suave.

• Pre-inclusión de células o tejidos en gelatina.

• Crioprotección y congelamiento.

• Criultramicrótomo.

• Recuperación de las secciones, descongelado y montaje en las grillas con Formvar.

• Reacción de inmunomarcación.

• Contraste positivo-negativo con metil celulosa .

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7.2.6-FIJACION:

• Ya con el 2% de paraformaldehído durante 1 h. hay buena morfología y permeabilidad a la sacarosa. Si la célula no estuviese fijada, la

• Presencia de la sacarosa en el medio extracelular la deshidrataría.

• Si se va a hacer inmunohistoquímica en TEM, hay que chequear la antigenicidad a nivel óptico para estandarizar la fijación con

cortes de CUM o crióstato de 5 m.

• Para células de cultivo se puede usar 4-8% de formaldehído directamente en 2.1 M sacarosa para que se fije durante la infusión

• Si el material son células aisladas, se necesita preinfiltrar con agarosa o gelatina antes de poner la sacarosa.

7.2.7-CRIOPROTECCIÓN:

Los crioprotectores son compuestos que interfieren en la formación de cristales de agua.

La franja a saltar pasa de ser -40 a -130ºC a ser de -15 a -70 ºC, pero igual se trabaja a -90. ºC por seguridad

Como crioprotectores se usan:

1) PVP (polivinil pirrolidona). No atraviesa la membrana de las células vivas.

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2) Sacarosa: las células fijadas son permeables a ella. Si no se fija, la sacarosa es

muy densa y deshidrataría a las células.

3) Glicerol

4) DMSO (dimetil sulfóxido)

El glicerol y DMSO son permeables en células vivas y al descongelarse continúan vivas. Paradójicamente destruyen o modifican parcialmente la organización de la célula, pero las células vivas pueden repararlo.

Los bloques tienen mayor plasticidad con PVP- Sacarosa

Mezclar 1.8M Sac y 20% CNN) PVP (MW: 10000) Y preparar una pasta:

PVP .................................................. 20 G

Carbonato de sodio 1.1 M en buffer fosfato .4 mI.

Sacarosa 2.3 M en igual buffer ....... 80 mi

Dejar toda la noche para que escapen burbujas a temperatura ambiente. (si no salen hay que sonicar o centrifugar)Ajustar el pH con NaOH 1 N

Dejar el bloque de tejido de 1 mm3 por lo menos 2 hs.

Congelar en N-liquido.

Se hacen cortes semifininos a -60 a-80°C, y ultra- finos de -80 a -120°C.

Tanto en esta solución o la de sacarosa sola, se puede dejar el tejido toda la noche a 4°C. Los pedazos de tejido que no han sido bien embebidos se reconocen luego del congelamiento porque los cristales hexagonales le confieren un aspecto opaco y arenoso. En el

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caso que la sacarosa no difunda dentro del bloque probar con dimetil sulfóxido, de mucha menor viscosidad, que puede entrar en las membranas, aún en las no fijadas. Con 0.6M de sacarosa la célula puede tener dentro cristales cúbicos y por fuera hexagonales, y con 1 M sacarosa también habría c cristales hexagonales por fuera y dentro. La concentración óptima es 2,3 mM de sacarosa. Con mucha más sacarosa los bloques se vuelven muy blandos y hay que cortarlos a menor temperatura, aunque a -120°C se tornan quebradizos.

7.2.8-Corte

Conviene más tallar el bloque antes del congelamiento. No conviene cubrir todo el bloque con sacarosa, sólo pegarlo con una gota al tornillo.

Tallar el taco puntiagudo. Poner la cuchilla y la muestra en la cámara y esperar 10 minutos a que se

estabilice la temperatura. Poner lo más angosto del frente del bloque hacia la cuchilla.

Es importante asegurarse que el bloque no avance térmicamente por la diferencia de temperatura entre el bloque, la cuchilla o la cámara: poner AVANCE en O y ver que no corte.

Sirven los cortes de interferencia dorada (aunque mucho se debe a la compresión) y hasta el rojo, púrpura y azul para inmunomarcado.

Fig.7.5 -Ultramicrótomo con una cámara de criocorte instalada.

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7.2.8.1- Problemas de corte:

Pobre la cuchilla (las crío-secciones sin medio de infiltración, son muy vulnerables)

Temperatura inestable en la criocámara.

Mal congelamiento del tejido.

7.2.8.2 Las cuchillas de diamante

Cargan mas estática, y los cortes se le pegan

Los ciclos de enfriamiento y calentamiento de la cámara pueden romper el pegamento del diamante al bote, por lo tanto hay usar las especiales disponibles comercialmente.

Se usan con un ángulo libre de 6°.

7.2.8.3-La cuchilla de vidrio

Usar en el centro, donde no hay estrías ni cuña.

La ideal es la que tiene una contraparte con zócalo menor de 0.1 mm.

Conviene que los cortes se deslicen más fácil sobre el vidrio con cubierta de tungsteno.

Que No se acumulen restos de tejido o hielo, que aumenta la fricción.

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7.3-Artefactos del corte:

1) compresión: da un corte más bajo, igual de ancho, pero más grueso, se recupera al levantarlo en sacarosa (hasta las células se vuelven otra vez circulares).

Sería mejor juntar los cortes con un líquido que se mantuviese así a la temperatura de corte, pero el Freón o etano tienen menor

tensión superficial, y los cortes se hundirían.

2) agrietamiento: sobre el taco, después del último corte. Son paralelos al borde de la cuchilla. Aparecen en muestras cristalizadas o

cuando la cuchilla no es buena.

3) “Chatter”: es una variación periódica del grosor del corte. Hay que disminuir el ángulo libre de la cuchilla. LAS MANOS FUERA DE LA

CAMARA.

4) Mellas de la cuchilla.

5) Deformación de la superficie: se fractura o craquea la sección.

Fig.7.6

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A muy baja temperatura se necesita mucha fuerza para cortar y se puede fracturar el bloque. A temperatura intermedia, el taco no es tan duro, se corta mejor pero es algo más grueso.

Por lo tanto, conviene trabajar a menor velocidad de corte (0.1 mm/s) por debajo de -120°C para que no fracture. Hay que cortar el taco por debajo de la temperatura de recristalización, que es -135°C para el agua pura, y mayor para material biológico, o sea cuando está vitrificado y tratar que no se genere calor por fricción al pasar la cuchilla (desvitrifica).

Con sacarosa el bloque tiene mayor elasticidad, y no es tan crítico lo de la velocidad de corte.

Por lo tanto:

Tejido sin sacarosa trabajar por debajo -135°C (a -100 además el agua evapora por sublimación.)

Con 2-2.3M Sac cortes finos: -100°C

0.5 um (500nm): -60°C

CONVIENE USAR CUCHILLAS DE 45°, AUNQUE AUMENTEN LA FRICCION. Esto puede dar mayor estática.

Antiestática:

Cuando hay carga estática los cortes de desprenden de la cuchilla y se pegan al bloque. Hay un dispositivo comercial que emite una corriente eléctrica pequeña que permite escapar a los electrones acumulados. Si no se cuenta con este dispositivo, se puede utilizar la chispa de un encendedor cerca de la cuchilla.

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7.4-PROTOCOLO PARA OBTENER SECCIONES POR CUM

A las células en cultivo nuevo en suspensión o adheridas a un soporte, se le agrega igual volumen de fijador (2x) a 37ºC. Puede ser formaldehído 2% o 4% + glutaraldehído 0.4 % + CaCl2 5mM en buffer cacodilato 0,1 M. No se puede usar el calcio con PBS. Se puede teñir también con ácido pícrico 0,2 %para poder luego identificarlas por su color amarillo. Dejar 1 hora a la temperatura óptima de las células y luego de 1- 12 hs en la heladera. (Si fuese un trozo de tejido, de 3 mm3 , se le agrega directamente el fijador en buffer). Lavar 3 veces en PBS + 0.15 M Gly con 5 minutos cada cambio. Si fuese un cultivo de células adherentes, se tratan en este momento con un lavado en PBS + 1% gelatina a 37ºC por 30 min que ayuda a despegar las células. Se pasan a un tubo Falcon de 15 ml y se centrifuga 3 min a 3000 rpm.

Fig.7.7

Nota: Usar pipetas de vidrio porque las células se adhieren al plástico.

No usar pipetas automáticas, que pueden romper las células.

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Conviene pre-infiltrar las células libres en gelatina:

• Resuspender el pellet en gelatina 10% en agua en un eppendorf. • Centrifugar 3 min a 3000 rpm. • Enfriar 30 min en hielo hasta que solidifique la gelatina • Cortar el eppendorf y remover el pellet. • Cortar en cubos, siempre sobre hielo.

Pasar los cubos de gelatina o los trozos de tejido a un eppendorf con 1 ml de sacarosa 2.3 M. Dejar toda la noche en la heladera. Tallar los cubos aproximadamente, siempre sobre hielo. Pasar a un tornillo portamuestra limpio Sumergir en LN2 con una pinza apropiada. Transferir con la pinza pre-enfriada a la crio-cámara entre -90ºC a -120ºC. CUM: Cortar secciones de 80 nm a velocidad 0.6-2mm/seg. Mientras, la solución de sacarosa se mantiene en hielo.

Los cortes se separan con una pestaña del borde de la cuchilla y se levantan con un anza de 2 mm con una gota de la solución de sacarosa 2.3 M. Al acercar el anza al corte no hay que tocar la cuchilla porque se congela la gota de sacarosa y se forma una banda de hielo sobre la cuchilla.

La grilla debe estar recubierta con un film de Formvar (formato de polivinilo). Las anzas grandes llevan cortes hacia la periferia de la grilla, pero las anzas demasiado chichas se congelan muy rápidamente.

EL FILM DE FORMVAR SE HA PUESTO SOBRE LA CARA BRILLANTE DE LA GRILLA, Y SOBRE ÉSTA LOS CORTES. Si se pusiese el Formvar sobre la opaca quedarían las 2 caras brillantes y no se podría distinguir dónde están los cortes. Girar el anza y dejar la grilla flotando sobre gelatina 2% por 30 min a 37ºC. Con esto se disuelve la gelatina al 10% y la sacarosa.

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El descongelamiento es muy rápido el paso de agua vitrificada a líquida y no trae mayor problema.

Antes de hacer la reacción de inmunomarcado conviene chequear el estado de una de las grillas en el TEM: De la criocámara se pasa con la sacarosa a la grilla y de allí al agua algunos minutos. Poner en la mezcla de acetato de uranilo y metil

celulosa. Las grillas se guardan hasta la inmunoreacción:

Flotando sobre la superficie de buffer fosfato salino (PBS) frío

Sobre un capa sólida hecha de gelatina 2% sobre hielo. Antes de empezar la marcación se lo deja a temperatura ambiente y se vuelve líquido, con lo que también se evita el paso del bloqueo por saturación de los sitios inespecíficos.

Sobre 1-5 % de suero fetal de cabra o neonato en PBS sobre hielo por 1-2 hs a 4°C y hasta 24 hs.

Flotando sobre sacarosa 2.3 M y dejarlo a -20°C. Antes del inmunomarcado se lo equilibra a temperatura. Es la mejor manera).

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Fig.7.8- Criosección de Tripanosoma brucei incubada con transferrina bobina conjugada

con oro 5 nm.

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7.5-Pasos del protocolo de inmunomarcación sobre secciones montadas en grillas

7.5.1-(CUM o Lowilcryl)

1. PBS/ Gly o ClNH4 -“quenching” o bloqueo de los grupos aldehídos.

2. PBS con BSA - satura los sitios inespecíficos

3. 1º anticuerpo

4. PBS con BSA - eliminar el anticuerpo no pegado

5. Proteína A-oro (PAG) o 2º Ac-oro - marca electrodensa

6. PBS - eliminar la PAG o 2º Ac no pegada y lavar el BSA que quitaría nitidez en el TEM.

7. GA/PBS - estabilizar el inmuno-complejo

8. agua destilada - lava el fijador

9. acetato de uranilo - contraste

10. acetato de uranilo + metil-celulosa - cubrir el corte (sólo para CUM)

Tomar la grilla con el ansa de diámetro mayor que el de ella y pasarla por las siguientes gotas de 100 l sobre una plancha de

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parafilm:

5 gotas de PBS con 0.15 M Gly por 2 min en cada una. Esto es por el “quenching” o bloqueo de los grupos aldehídos. También se puede usar ClNH4 50 mM por 30 min.

1 gota de PBS con 1% BSA por 3 min. También se puede usar suero fetal de cabra (10% por 10 min.), gelatina de peces de fondo de mar o leche condensada (pero la lactosa pega mucho oro). Esto satura los sitios inespecíficos.

Los cortes tienen que ser neutros porque las cargas positivas, como el núcleo o el citoesqueleto, pegan oro inespecíficamente. Para ver una marca en el núcleo conviene usar heparán sulfato 1mg/ml por 30 min.

1 gota de 5 l del 1º anticuerpo, a temperatura ambiente, desde 40 min a toda la noche en concentración aprox. 0.2 g/ml en

PBS/ 1% BSA. Probar distintas diluciones hasta 20 g/ml. Los anticuerpos monoclonales vienen más diluidos que los policlonales: se puede usar 1:5 el monoclonal y 1: 50 los policlonales.

En cortes de Lowilcryl no se deja más de 3 hs o se agujerea la resina.

5 gotas de PBS/ 1% BSA, con 3 min cada una, para eliminar el anticuerpo no pegado.

1 gota de 10 l de proteína A-oro (PAG) de 10 nm en PBS/ 1% BSA por 20 – 40 min. Hay que usar un puente si el 1º anticuerpo no es afín a la proteína A (como los de ratón). Por ejemplo, si el tejido con el que trabajo es de rata, y el 1 anticuerpo es de ratón, se pone el 2º anticuerpo conejo a- ratón y luego la PAG. El oro-coloidal no se congela porque precipita.

También se puede usar un 2º anticuerpo-oro, en cuyo caso a menor tamaño del oro se usa mayor dilución: 5nm 1:50 10 1:100 15 1:75 20 1.50 El 2º anticuerpo se usa más diluido que el 1º.

5 gotas de PBS por 3 min para eliminar la PAG o 2º Ac no pegada y lavar el BSA que quitaría nitidez en el TEM.

1 gota de GA 1% /PBS por 5 min para estabilizar el inmuno-complejo

5 gotas agua destilada con 2 min cada una.

1 gota acetato de uranilo 4% pH 7 por 5 min. Si el corte es de Lowilcryl se deja secar y se contrasta al día siguiente con acetato de uranilo solamente.

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1 gota acetato de uranilo 4% pH 4/ metil-celulosa 2% por 10 min sobre el parafilm sobre hielo. Se usa 1 gota de acetato de uranilo + 9gotas de metil celulosa.

También puede usarse 1 gota de acetato de uranilo 5% + 9gotas de PVA (polivinil alcohol), donde se sumerge la grilla a ºT ambiente.

Tomar la grilla con un ansa mayor a su diámetro y pasarla a 45º por un papel de filtro Whatman 1 (o de café) hasta descargarla y ver el film azul/amarillo iridiscente. Se deja secar la grilla con el ansa suspendida al aire.

Se quita la grilla del ansa una vez seca sosteniendo con una pinza.

7.6-Tipos de contraste:

• Contraste positivo –negativo: metil-celulosa 2% + acetato de uranilo. • Contraste positivo: polietilenglicol 2% + metilcelulosa 0,2 % + acetato de

uranilo 0,02%. • Contraste negativo: metilcelulosa 2% + molibdato de amonio 1% Fig.7.9

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7.7-Ventajas y desventajas de la técnica de CUM.

Llas ventajas del CUM con la técnica de congelamiento y descongela miento de Tokuyasu son:

Es más fácil el corte.

No se trabaja a tan baja °T

La compresión del corte se compensa al descongelar.

Y respecto a la técnica con resina:

Es mucho más sensible para inmunohistoquímica. Preservación de los epitopes antigénicos

Mejor preservación de la ultraestructura

Se termina todo el procedimiento en un día. Evita varias etapas del procedimiento de rutina para TEM.

Mejor accesibilidad de sondas macromoleculares como anticuerpos, oligonucleótidos, etc.

Se puede usar para microscopía óptica de fluorescencia.

Al no haber deshidratación, se conservan los lípidos y, al no haber movimiento del agua, se mantienen también los antígenos en su lugar de origen.

Las desventajas son:

• Técnica muy laboriosa y de bajo rendimiento.

• Disponibilidad de un buen crioultramicrótomo

• Consumo de LN2

• Las imágenes tienen poco contraste y necesitan una interpretación diferente.

• Se necesita mayor cuidado porque el material cortado queda desprotegido.

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Capítulo VIII:

Preparación de muestras para microscopía electrónica de barrido

Prof. Viviana Sorrivas e Ing.María Julia Yañez

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Fig.8.1 Bacterias y esporas de Alga.

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8.Introducción

¨La metodología que se emplee para preparar la muestra que será observada por microscopía electrónica de barrido, tendrá como objetivo lograr que la misma se encuentre en condiciones idénticas a su estado natural, sin que aparezcan artefactos que introduzcan errores durante la interpretación de las imágenes¨.

Para seleccionar el método a usar, se deberá elegir la ruta de acuerdo a la naturaleza de la muestra (ver esquema 8.1). Para obtener información de la topografía superficial se podrá realizar observaciones por microscopía electrónica de barrido con detector de electrones secundarios o retrodifundidos, si se necesita realizar reconstrucción tridimensional, los nuevos instrumentos poseen incorporado un haz de ¨Galio¨ que va liberando zonas de observación y si se requiere conocer los elementos químicos que la componen se decidirá por un sistema de microanálisis con detector de rayos x. Las condiciones de operación del equipo que se utilizará para su observación dependerán del tipo de muestra y la clase de instrumento utilizado.

Fig.8.2 -Pulpa de manzana.

La preparación de las muestras para microscopía electrónica de barrido es un proceso muy delicado en el que interactúan muchos aspectos. Tener éxito dependerá del control y de la exactitud de todos los parámetros que se utilizan.

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Fig.8.3

metalizado

deshidratado

químicamente

metalizado

deshidratado

mecánicamente

(congelación)

fijado

metalizado

montaje

fresco

vpsem

metalizado

montaje

secado al aire

Hidratado

metalizado

montaje

no conductora

montaje

conductora

seca

biológicas no biológica

muestras

8.1- Tipos de muestras y método de preparación (SEM)

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8.2-Preparación de superficies:

8.2.1-Superficies no biológicas:

Selección de la muestra: se toma una porción de la muestra representativa. Se elige la zona a observar, si es necesario se lava, ya sea lavado simple, o bien con aparato limpiador de ultrasonido, pulido o lavado con solventes. Puede secarse al aire, en estufa a 25° C, fracturarse por congelamiento, etc. Se acondiciona la superficie que se desea observar de la mejor manera posible.

8.2.2-Superficies de especímenes biológicos:

Selección de la muestra: la muestra será tomada de acuerdo al detalle que necesita ser observado, cuando más pequeña mejor se mantendrá la estructura. (1,2 mm aproximadamente como tamaño óptimo para tejidos). Se tendrán en cuenta las limitaciones en el tamaño de la cámara del microscopio en que se observará y las posibilidades de inclinación y rotación. Se pueden diseñar portamuestras especiales para orientar de la mejor manera posible lo que desea observarse. Será importante prever que la muestra puede contener suciedad superficial que imposibilite la observación de la superficie de estudio. Se lavan las superficies con los líquidos adecuados en cada caso particular. Deberá tenerse en cuenta al lavar, la osmolaridad de la solución, el tampón, el pH, la duración del lavado, la cantidad de los mismos, si usar ultrasonido, el tiempo y por último la temperatura.

Un simple lavado puede ser efectivo para remover contaminantes solubles conteniendo partículas tales como proteínas, sales, eritrocitos, etc. Técnicas más drásticas pueden usarse cuando la muestra posee en su superficie estructuras inorgánicas resistentes, como por ejemplo: diatomeas, (la taxonomía de estas algas depende de la identificación de finos detalles estructurales que pueden estar ocultos por sedimentos o material orgánico adherido). En ese caso, lavados sucesivos con equipo de ultrasonido, seguido de centrifugados suaves son muy efectivos.

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8.3-Métodos para remover materiales extraños de la superficie de la muestra:

Durante la preparación de especímenes acuáticos, es necesario remover materiales de la superficie tales como mucus y partículas. Estas pueden ser restos de animales, suciedad, fragmentos de tejido, bacterias y detritos que casi siempre están adheridos al mucus o a los cilios.

Un método que puede utilizarse es el de lavados múltiples con solución tampón. También se pueden tratar las muestras con glicerol para extraer mucus de cnidarios, moluscos y teleósteos marinos. Se utilizan soluciones ácidas, ej: 1% CL H o ácido ascórbico para remover el mucus de ciliados y gasterópodos. Los acantocéfalos se pueden limpiar lavando con 0,005 M de EDTA. Para rotíferos se usa 0,1% de hipoclorito de sodio.

El tiempo de lavado variará según el grado de contaminación y debe determinarse empíricamente. Un método que ha dado excelentes resultados es el tratamiento con ultrasonido (desde 5 a 30 seg.) para nemátodos, artrópodos, vertebrados, larvas y otros tipo de muestras . El único cuidado que hay que tener es no pasarse con el tiempo. El mismo método se utiliza para limpiar superficies de rocas, metales, piezas con corrosión, etc.

8.3.1-Desmineralización:

Se realiza con EDTA (ácido etilen- diamina-tetraacético). Otra técnica es utilizar una solución 1N de ClH o una solución de ácido ascórbico 1% para remover gránulos de calcio o esqueletos calcáreos.

8.3.2-Para remover cilios o flagelos:

Suspender y agitar en agua de mar fría e hipertónica (conteniendo 30 mg /l de Na Cl adicionales) por 2 minutos. Aspirar varias veces con una jeringa los especímenes (protozoos).

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Para manipularlos:

Luego de secado por punto crítico, con una pestaña pegada a un palillo se tocan suavemente, bajo lupa estereoscópica.

Conviene ir chequeando con lupa a medida que se lava.

En el caso de tejidos animales o vegetales, es necesario volver a cortar el tejido antes de la segunda fijación en trozos

menores para facilitar el secado. Si se necesitara aplicar anestésicos, utilizar locales como: novocaína, xilocaína y otros.

8.4-Fijaciónde especímenes biológicos:

La mayoría de las muestras biológicas que se necesita observar al microscopio electrónico convencional, cuando se colocan en la cámara en alto vacío, debido al gran contenido de agua que poseen, se ven colapsadas y a medida que transcurre el tiempo de observación se van deteriorando. En la actualidad, con los microscopios ambientales se puede observar la muestra sin tratamiento previo pero hay que tener en cuenta que también sufre una deshidratación al ser sometida al haz de electrones. Hay que considerar los tiempos de observación en los cuales el espécimen sufre naturalmente una deshidratación. Algunos instrumentos actuales poseen un sistema de congelamiento de la muestra que permite fijarla y es muy aconsejable. En el caso de no poseer este accesorio o un equipo de secado por congelamiento externo, se recurre a la fijación química. Esta es la técnica más complicada y crítica en la observación con microscopios convencionales.

8.4.1-Fijación química:

¨Tiene por objeto mantener la estructura estable para lo cual se fijan las proteínas y lípidos¨. Se utilizan fundamentalmente dos tipos de fijadores: 8.4.1.1-. coagulantes 8.4.1.2-. no coagulantes.

¨Congelar¨ la imagen en el momento que se necesita estudiar la muestra.

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Nota: Los conceptos anteriores son muy generales, cada muestra en particular tendrá su fijador óptimo. Un conocimiento íntimo del material, del medio en que se desarrolla y todos los parámetros fisiológicos ayudará al momento de decidir cuál será el mejor procedimiento para tratarla. En la mayoría de los casos se utiliza el método de prueba y error.

8.4.1.1. coagulantes:

Actúan coagulando las proteínas, formando en el nucleoplasma y citoplasma una

intrincada red en donde quedan atrapadas las organelas. (Similar a la clara de huevo duro). Es muy conveniente cuando se desea observar sólo superficies. Tener en cuenta que no sirve

para Microscopía Electrónica de Transmisión, ya que la ultraestructura interna se deteriora. Es útil también para recolectar muestras a campo, muy usado en vegetales. Su acción visible es un

endurecimiento de la muestra.

La fijación por coagulación, desnaturaliza las proteínas y altera la ultraestructura.

F.A.A : formol-ácido acético –alcohol C.R.A.F: ácido crómico-formol-ácido acético

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Una vez fijadas las proteínas con fijadores no-coagulantes que mantienen la estructura terciaria de las moléculas, sí se puede usar etanol o acetona en la deshidratación.

Porqué se agregan cationes?

El punto isoeléctrico de las proteínas es menor que el pH neutro del fijador y las proteínas quedan cargadas negativamente. Para evitar que las proteínas se repelan, se agregan cationes que permiten su acercamiento como para poder establecer las uniones transversales en la fijación.

Cómo fijar ?

● ● ● Para organismos marinos, agregar:

sales de magnesio: 7,5% Mg Cl2. 6H2 O

20% Mg SO4 7H2 O

Para animales de agua dulce.

2,5%Mg Cl 6H2 O

● ● ●

1. Como vapor: Tetróxido de Osmio (Os O4 ) 2. Por inmersión: (Os O4) Tetróxido de Osmio,

glutaraldehído, F.A.A, etc. 1. Por perfusión: Glutaraldehído, Karnovsky,

formaldehído.

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8.4.1.2-No coagulantes:

Mantienen la estructura en mejores condiciones, similares a su estado natural. Pertenecen a esta clase: glutaraldehído, tetróxido de osmio, etc. Ver en capítulo de fijación (capítulo III).Actúan formando entrecruzamientos entre las moléculas lo que da estabilidad a las estructuras.

8.4.2-Formas de utilización de los fijadores:

1) Como vapor: Generalmente se utiliza cuando por alguna razón no se puede sumergir la muestra en el fijador. Para realizar este método se deben tomar todos los recaudos de seguridad (ver Capítulo XII de seguridad en laboratorio) A saber: se colocará la muestra en una cámara cerrada, debajo de campana extractora y el espécimen se expondrá a los vapores durante determinado tiempo, dependerá de su tamaño. Considerar que el tetróxido de osmio tarda en penetrar 0.5mm en una hora cuando está en solución. Es muy volátil y como vapor fija muy rápido. Se utiliza por ejemplo en tejidos muy frágiles como hifas de hongos, esporas y granos de polen.

2) Por inmersión: Requiere una cuidadosa disección del espécimen como primer paso. Luego se sigue el procedimiento indicado en LINK para doble fijación o simplemente sólo con glutaraldehído.

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8.4.3-El vehículo ideal:

Los fijadores tendrán que ir diluidos en un vehículo. Debe ser una solución con las siguientes características:

Que mantenga el pH: de esa manera no se alteran las proteínas. (Siempre se mide el pH final del fijador a temperatura ambiente).

Que mantenga la fuerza o constitución iónica: como es muy diferente la del vehículo a la de la célula se pueden producir extracción de materiales celulares o precipitados. Conviene acortar el tiempo de fijación y es por eso que el 1º fijador es GA, que entra y reacciona más rápido que el osmio.

Que tenga máxima solubilidad en agua y mínima en membranas biológicas. Esto aumenta su poder de penetración.

Que no sea tóxico: el vehículo entra antes que el fijador y podría dañar el tejido que aún no está fijado.

Que posea una osmolaridad que mantenga un medio isotónico a las células y prevenga que las mismas se hinchen o se contraigan.

UNO DE LOS FACTORES DE ÉXITO EN LA OBSERVACION SERÁ APLICAR LA OSMOLARIDAD JUSTA A CADA TIPO DE TEJIDO

NOTA :

Los materiales que deban ser guardados de un día para otro o transladados, se almacenan en alcohol o acetona 80%..

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8.5-Deshidratación- 8.5.1-Objetivo de la deshidratación

Es una etapa muy importante, previa al montaje para microscopía electrónica de barrido convencional, con el objetivo de que el tejido se mantenga en buenas condiciones para su observación. Para remover el agua de los tejidos se utilizan solventes orgánicos, como acetona o alcohol.

La extracción de lípidos y proteínas se acompaña con la contracción celular y subcelular. Es menor la variación al usar acetona, pero no se sabe cuál de estos agentes preserva mejor las relaciones intermembranas que existen en vivo.

8.5.2-Métodos de deshidratación

En el mismo vial donde se fijó el tejido, se extrae el líquido fijador (sin dejar la muestra al aire) y se reemplaza por el primer líquido deshidratante, así hasta llegar al último, que es el puro (100%). Se hace con pipeta Pasteur, cuidando que el volumen de la solución siempre sea mayor, por lo menos 10 veces, al del material. (Capítulo IV). Se trabaja a temperatura ambiente o en frío. Si se hace en frío, se debe elevar la temperatura hasta la ambiente cuando el material ya está en la solución al 96%. A bajas temperaturas hay que cuidar la condensación de H2 O. El material se puede lavar luego de fijarlo y antes de deshidratarlo.

● ● ●

Para acelerar el proceso de deshidratación:

- El tejido se secciona en trozos pequeños.

- Se agitan los viales.

- Se realiza a temperatura ambiente.

- Se usan más cambios de cada solución. ● ● ●

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8.5.2.1-Un esquema típico de deshidratación es el siguiente:

*Etanol o acetona 30% (sólo para embriones) ...................... 15min.

50% ...................................................................................... 15min.

75% ...................................................................................... 15min.

95%............................................................…………………………….............. 15min.

100%. ( tres veces) ....................................................................................15min.

8.5.2.2-Método de diluciones infinitas

Quitar todo dejando una delgada capa sobre el material y agregar Et OH 100% gota a gota.

Notas:

• La diferencia de acción entre el etanol y la acetona es que el etanol no solidifica los tejidos y la acetona si.

• En el caso de utilizar sólo alcohol, conviene finalizar con dos cambios de etanol 100%

Muy importante! NUNCA dejar al aire la muestra una vez fijada.

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(con sulfato de cobre anhidro para mantenerlo absoluto y que debe cambiarse al pasar a azul).

• Es mejor usar acetona, pero se usa etanol porque es más económico, y como es menos hidrófilo, el “ etanol

absoluto” es más fiable.

• Para diferentes diluciones de etanol, partir del 96% y tratar como si fuese 100%. • Cuando el material flota, como las células vegetales, porque contienen aire, utilizar las muestras que no flotan o someterlas a vacío.

Fig.8.4

. Hifas de hongos, sin fijar, deshidratados dentro de la cámara del microscopio, modo VP.

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8.6-Secado - 8.6.1 Secado por congelamiento:

El espécimen se congela rápidamente en nitrógeno líquido y el hielo es sublimado a baja temperatura y alto vacío. Cuando el hielo se ha vaporizado completamente, la muestra se lleva a temperatura ambiente y se prepara para su observación.

Los líquidos para congelarla pueden ser: Nitrógeno líquido, propano y otros. Como el nitrógeno líquido burbujea mucho cuando entra en contacto con un elemento más caliente hay que agitarlo sostenido por una pinza para favorecer el enfriamiento rápido. Pueden utilizarse crioprotectores como glicerol, glicerol más sacarosa, solución saturada de cloroformo en agua destilada, etanol, acetona, polivinil pirrolidona, hidroxietil y dextrano. Reducen la formación de cristales de hielo pero pueden producir artefactos.

Procedimientos:

Varían de acuerdo a la instrumentación que se utilice. I . El tejido congelado se traspasa a una cámara de vacío enfriada con nitrógeno líquido.

II. El espécimen puede permanecer en nitrógeno líquido para prevenir la condensación de vapor de agua sobre la superficie fría y para evitar un cambio drástico en la temperatura. Se incrementa el vacío, el nitrógeno líquido se vaporiza y la temperatura se lleva a tal punto que permita la sublimación del hielo ( 60 a 70 °C). El proceso se completa en varios días. Ver condiciones de seguridad para trabajar con nitrógeno líquido

8.6.2-Secado al aire desde solventes orgánicos:

La muestra se fija en glutaraldehído ( 2 a 4 horas) y se deja en tampón por toda la noche, se deshidrata en etanol o acetona. Se seca al aire.

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8.6.3-Secado por punto crítico:

Esta técnica utiliza la propiedad de los líquidos de cambiar de la fase líquida a la gaseosa sin generar calor latente de vaporización o cambio de densidad. La temperatura y presión a la cual este fenómeno ocurre se denomina ¨ punto crítico ¨.

Aparato de secado por punto crítico marca POLARON (ENGLAND)

8.6.3.1-Fluidos intermediarios y de transición:

En la mayoría de los casos el solvente a ser removido desde una muestra para microscopía de barrido es agua. Pero como el punto crítico del agua llega a una temperatura de 374° C y la presión crítica a 3184 psi, no se utiliza ésta sino líquidos que posean un punto crítico en parámetros más bajos y fáciles de alcanzar. Pueden ser: CO2 (temperatura crítica 31° C y presión crítica 1072 psi ) , Freón 13 (TC= 28,9° C y PC 561 psi) y Freón TF 113 ( T=214 ° C y PC= 495 psi ). Estos últimos están prohibidos porque aumentan la capa de Ozono.

Como fluidos intermediarios, que son miscibles en agua y en el líquido de transición se utilizan: etanol, acetato de amilo o acetona. ( generalmente se usan los mismos solventes de la deshidratación) .

8.6.3.2-Portamuestras para secado por punto crítico:

El instrumento posee unos recipientes metálicos para colocar las muestras y se pueden fabricar fácilmente portamuestras adaptados al tipo y tamaño del espécimen. (foto)

Fig.8.5

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Cápsulas beem modificadas: estas cápsulas se compran en los proveedores de artículos de microscopía electrónica y se adecuan a las necesidades. Hay de varios tipos y de acuerdo a la muestra que se va a procesar se pueden fabricar diferentes. foto)

Ejemplo: con cápsulas beem cilíndricas, se corta la base y con las tapas de dos cápsulas se fabrican aros en los cuales se coloca malla de plancton con un determinado tamaño de poro que no deje escapar la muestra y a su vez permita un buen intercambio de fluidos. Es conveniente realizar con una aguja muy fina recalentada orificios en las paredes del cilindro. Se venden cápsulas porosas.

Otra forma de sostener muestras para ser procesadas en el secador por punto crítico es adhiriéndola por medio de polilisina u otra proteína a un cubreobjeto, recortado del tamaño que quepa en la cámara del secador. O utilizar jeringas con filtros nucleopore que no se disuelvan con acetona.

8.7-Montaje de especímenes para microscopía electrónica de barrido

Fig.8.6

El soporte para la muestra es generalmente un cilindro de bronce, aluminio, o

carbón. Los hay de diferentes tamaños. Los convencionales son de 1cm y 2,5 cm de diámetro. En algunos instrumentos tiene una base de menos diámetro que se utiliza para fijar el portamuestra con un tornillo a la platina de la cámara del SEM.

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8.7.1-Adhesivos para sostener la muestra:

Una vez que la muestra está seca, se fija al portamuestra con un material adhesivo. Entre los adhesivos más utilizados se mencionan: cintas adhesivas conductoras de aluminio, carbón, doble faz, esmalte para uñas, pintura de plata y proteínas que adhieren la muestra por carga eléctrica.

La muestra se debe fijar al portamuestra con un adhesivo, preferentemente, conductor. Si se utiliza un adhesivo no conductor, se puede realizar un puente con pintura de plata (conexión) entre la muestra y el portamuestra para facilitar la conducción.

En primer lugar, se deberá considerar el propósito del estudio, las características de la muestra y del adhesivo. Las características de la muestra que deben tenerse en cuenta son: tamaño, porosidad, estado de hidratación, solubilidad, resistencia al daño del haz, área de interés y conductividad. Con este conocimiento se buscara el adhesivo más adecuado. El mismo deberá cumplir ciertas condiciones como: viscosidad apropiada para evitar que la muestra se hunda en el sustrato, proveer estabilidad de la muestra, resistir el calentamiento causado por el haz, rápido tiempo de secado, baja presión de vapor para que no contamine el sistema de vacío y no interferir con la composición de la muestra.

Materiales como pintura de plata son líquidos viscosos que pueden aplicarse sobre el portamuestra antes de colocar la misma. Sin embargo, el adhesivo puede cubrir inadvertidamente o ser absorbido por la muestra oscureciendo áreas de interés. Por esta razón, no es conveniente montar con un adhesivo líquido pequeñas partículas sobre el portamuestras. En estos casos, se emplea la cinta doble faz. Esta se adhiere al portamuestra y las partículas son esparcidas cuidadosamente sobre su superficie.

Los adhesivos que contienen carbón producen baja señal de electrones secundarios si se comparan con pintura de plata. Como resultado de esto, el fondo en la imagen aparecerá más oscuro si usamos el segundo. Entre las propiedades que tienen estos adhesivos figuran su buena adherencia y conducción.

Las cintas doble faz comunes y las de aluminio son las más usadas en el montaje para SEM. Entre las ventajas se pueden citar: facilidad de aplicación, no requieren tiempo de secado, suficiente adherencia para proveer buena estabilidad, se mantienen durante largos períodos de tiempo, alta viscosidad que minimiza el hundimiento de la muestra. Las cintas de aluminio se utilizan para minimizar los efectos de carga y el daño causado por el haz electrónico en la cinta. Son fáciles de aplicar, delgadas, muy lisas y económicas.

Entre las desventajas que presentan las cintas adhesivas doble faz, figuran: posibilidad de producir contaminación en el sistema de vacío, poca adherencia para muestras esféricas, susceptibles al haz electrónico, baja conductividad térmica. Las cintas más delgadas son menos susceptibles al daño causado por calentamiento por el haz que las cintas gruesas.

Todos los adhesivos tienen sus ventajas y desventajas, pero las cintas pueden utilizarse como un medio de montaje si se usan en condiciones apropiadas. Los proveedores de insumos para microscopía electrónica ofrecen gran variedad de adhesivos.

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En la tabla siguiente se presentan los adhesivos más comunes :

MEDIO PROPIEDADES

Pintura en base carbón

Buena adherencia. Buena conducción. Rápido tiempo de secado.

Pintura de plata

Baja adherencia. Excelente conducción. Recomendable para muestras no porosas.

Adhesivos de PVC

Rápido secado. Buena firmeza. Adherencia moderada. Superficie lisa.

Buena para partículas menores de 1 .

Cinta doble faz

Baja conducción eléctrica y térmica. Fácil aplicación. Excelente adherencia. Puede vaporizar levemente en la columna. Viscosa (ideal para partículas). La superficie puede agrietarse.

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8.7.2-Montaje de la muestra:

La muestra seleccionada seca y limpia, debe ser adherida al portamuestra de manera tal que no se mueva durante la observación. Hay varios factores para tener en cuenta antes que la muestra sea montada en el portamuestras. Entre ellos podemos citar: el tipo de material, el tamaño del portamuestra, la señal que se detectará, el adhesivo a emplear, y la orientación de la muestra dentro del microscopio.

El portamuestra, es de material conductor, generalmente bronce o aluminio. El montaje involucra además, seleccionar el adhesivo apropiado. Del mismo dependerá el fondo de la imagen adquirida. Por ejemplo, cuando se requiere realizar una determinación de tamaño de partículas es importante elegir un adhesivo que tenga superficie lisa.

La muestra debe montarse y mantenerse cubierta en un lugar libre de polvos contaminantes. Si no es conductora la superficie de la muestra se debe cubrir con un film de material conductor para facilitar el flujo de cargas (metalización) durante la observación.

Las muestras pueden guardarse por un tiempo bajo ciertas condiciones. Para protegerlas de ser dañadas deben manejarse con cuidado y evitar su contaminación con polvo en suspensión. Muchas muestras son mantenidas en desecador bajo vacío durante varios meses, sin que se deterioren.

Otra opción para solucionar el problema del deterioro que sufren las muestras al guardarlas durante mucho tiempo es colocarlas sobre plataformas que puedan ser fácilmente ubicadas y retiradas del portamuestras. Una posibilidad es poner la muestra sobre un cubreobjeto. Este se montará sobre el portamuestra con cinta doble faz o pintura de plata cuando se quiera observar nuevamente. La pintura debe ser aplicada de forma tal que cubra no sólo el fondo del cubreobjeto sino también los bordes superiores del mismo para garantizar una buena conducción de cargas desde la muestra hasta el portamuestra. Una buena opción es cortar discos de aluminio con un sacabocado y utilizarlo como si fueran los portamuestras, de esa manera se podrán guardar e incluso, a raíz del bajo costo, el usuario puede quedarse con la muestra preparada.

8.7.2.1-Orientación de la muestra:

Es importante, que la muestra haga buen contacto con el portamuestra. Un contacto insuficiente provocará efecto de carga, distorsión de la imagen o desprendimiento de la misma dentro del microscopio. La muestra deberá montarse cuidadosamente exponiendo las

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áreas de interés . En todos los casos que se tengan dudas sobre la conducción, por ejemplo muestras esféricas o con pocos puntos de contacto con el portamuestras es aconsejable realizar ¨puentes ¨ de plata conductores entre la muestra y el portamuestras.

Un paso importante es colocar el sitio de la muestra que queremos observar hacia arriba, de manera que podamos enfrentarla al detector, rotarla e inclinarla. De esta manera se facilitará la toma de imágenes y la calidad de los resultados que obtengamos.

Fig.8.7- Portamuestras para Microscopía electrónica de barrido

8.8-Preparación de muestras no conductoras para microscopía electrónica convencional

La mayoría de los materiales no son buenos conductores del calor y de la electricidad y causan dificultades durante la observación en el SEM. La manera más simple y difundida de convertir a éstos materiales en conductores, es cubrir su superficie con una capa delgada de algún metal. Mediante este procedimiento, además de evitar problemas de carga se mejora la señal de electrones secundarios.

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8.8.1-Materiales para depositar

Para elegir el metal apropiado y el método de aplicación deben tenerse en cuenta varios factores, que se enumeran a continuación:

1) El tipo de observación que se realizará (SEM de alto vacío, presión variable o ambiental). La señal de electrones secundarios se mejora con una cubierta de metal pesado como por ejemplo Au, Pd, Pt, o aleación de Au-Pd.

2) Las propiedades de la muestra (tamaño, peso molecular, susceptibilidad al calor y al haz de electrones, etc.) determinarán el tipo de metal y el método de deposición a emplear.

3) La información que se desea obtener. Por ejemplo, para estudios de pequeñas partículas (menores a 0.5 micras) el metal más adecuado es el Au-Pd dado que posee un tamaño de grano que permite visualizar las partículas a altas amplificaciones.

Fig.8.8-

La principal condición que debe cumplir el material que se utilizará para depositar es que conduzca el calor y la electricidad desde la superficie de la muestra hacia el portamuestra.

Plaqueta de oro

Portamuestras

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Los films obtenidos deben cumplir ciertas características, entre las que se pueden citar:

Conductividad: El film conductor debe ser continuo y uniforme en toda la superficie cubierta. Cuanto mayor es la conductividad entre el portamuestra, el adhesivo y la superficie, mayor será la remoción de las cargas en exceso y del calor generado evitando problemas de deterioro de la imagen durante la observación.

Estabilidad: El metal conductor no deberá reaccionar con la superficie de la muestra u oxidarse durante un período largo de tiempo. Entre los materiales conductores los más usados son el Au y el Au-Pd. Otros excelentes conductores, tales como Ag y Al se utilizan menos por su rápida oxidación a estados menos conductores.

Compatibilidad: El material empleado para cubrir la superficie de la muestra debe ser compatible con los requerimientos del estudio a realizar. Los metales pesados son usados para imágenes de electrones secundarios, mientras que el C se emplea en microanálisis de rayos X,

debido a que la señal de C no interfiere con la de algunos elementos (S, Pt,Mo,Pb, Nb) en el espectro obtenido. Para imágenes de electrones retrodifundidos, se emplean elementos de bajo peso molecular, como el Al y C.

Los distintos materiales para depositar han sido utilizados para distintos propósitos, considerando aspectos como:

Capacidad de conducción térmica y eléctrica en la muestra. Capacidad para mejorar la señal. Interacción con la superficie de la muestra. Capacidad para permanecer inalterable durante un período de tiempo. Capacidad para formar cubiertas delgadas, uniformes y estables. Facilidad de deposición sobre la superficie de la muestra.

El depósito conductor además, debe ser suficientemente delgado para evitar enmascarar detalles de la muestra. En trabajos de rutina, los espesores oscilan en los 200 Å.

Una tabla conteniendo los principales materiales utilizados para depositar y las principales propiedades de los mismos, se muestra a continuación:

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8.9-CONSTANTES FISICAS DE VARIOS ELEMENTOS EMPLEADOS EN LA FORMACION DE FILMS CONDUCTORES.

Al

C

Au

Pd

Pt

Número Atómico

13

6

79

46

78

Densidad

Kg/m³ x 10-3

2.70

2.26

19.30

12

21.5

Conductividad Térmica 300 KW/ cm ºK 300

2.37

1.29

3.17

0.718

0.716

Temperatura vaporización en 1.3 Pa (ºK)

1273

2954

1734

1839

2363

8.10-Cuidados con la muestra después que ha sido montada:

Si no se va a evaporar metales inmediatamente hay que mantenerla seca, puede ser en un desecador de vacío, o en una cápsula con un agente deshidratante. Hay muestras que son muy higroscópicas y es necesario observarlas inmediatamente a su metalización. Ejemplos: sedimentos y arcillas.

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Los dos métodos más usados para cubrir la superficie de la muestra con un metal que la convierta en conductora del calor y de la electricidad son: evaporación en vacío y metalización por plasma de Argón. Se explican a continuación los principios básicos de cada uno de ellos.

8.11-Evaporador de metales en alto vacío

Mediante esta técnica, el metal a depositar es calentado hasta su punto de fusión. Un evaporador de vacío típico, es el que se muestra en la figura. El sistema está compuesto por una cámara de evaporación, un sistema eléctrico y un sistema de vacío. Dentro de la cámara de evaporación se encuentran cuatro electrodos dos de ellos sostienen a una barra de C y los otros dos una canastita de tungsteno (W ) en la que se coloca el metal a evaporar (Au, Au/Pd, Pt, etc.). También dentro de esta cámara se halla un soporte para ubicar los portamuestras. El mismo puede girar e inclinarse desde el exterior.

El sistema de vacío está constituido por una bomba mecánica y una difusora. La acción combinada de ambas permite alcanzar una presión

dentro de la cámara de evaporación de 10-5 Torr.

.figs. 8.9 + + +

Alto vacío

Electrodos muestra

Metal a depositar

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Todo el sistema debe mantenerse en condiciones de óptima limpieza que proteja a la muestra de la contaminación externa. El fenómeno de

retrodifusión de vapores de aceite de la bomba difusora puede minimizarse mediante una trampa fría de nitrógeno líquido. La deposición térmica se basa en el principio por el cual el calor producido es el resultado de la resistencia que ofrece un material al paso de una

corriente eléctrica. El calor es producido gradualmente incrementando la diferencia de voltaje entre dos electrodos. Esto resulta en la producción de una corriente desde un electrodo hacia el otro. La resistencia se incrementa a medida que el diámetro del material decrece y el calor producido será mayor en el punto más angosto de la barra de C, comenzando su sublimación.

Los electrodos que se emplean para evaporar el metal elegido para depositar, están unidos por una canasta de tungsteno cuyo punto de fusión es más alto que el del metal a depositar. Al circular corriente, la canastita se calienta hasta que el metal se funde y vaporiza.

La cantidad de metal depositado puede ser estimado según la siguiente expresión:

W sen d x. ( ) . . .4 2

siendo W: peso del metal

: densidad del metal. d: distancia entre muestra y metal.

: ángulo entre muestra y metal. x : espesor de la capa metálica depositada.

Por ejemplo: para una distancia entre muestra y metal de 8 cm y una cantidad de Au de 0.014 grs. se obtiene un espesor típico de 300 Å. Esta técnica ha sido ampliamente usada para producir films conductores delgados. Sin embargo, presenta ciertas desventajas entre las que

podemos citar: Requiere extremada limpieza. Expone a la muestra a una fuente de calor que puede deteriorarla. La continuidad y la conductividad del film depositado para capas delgadas puede no ser de óptima calidad. En muestras con mucha rugosidad algunas áreas no son expuestas al evaporante durante la deposición. Consume mucho tiempo

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8.11.1- Producción de films conductores delgados

Un film depositado puede pensarse originado desde múltiples puntos en la superficie de la muestra. La formación de un film delgado sobre la superficie de la muestra es un efecto complejo y puede pensarse en tres pasos: nucleación, migración y coalescencia. Cuando los primeros átomos que llegan a la superficie de la muestra, permanecerán allí , sólo si pueden difundir, colisionar y adherirse unos con otros para formar sitios de nucleación. Cuanto más fuerte es el enlace entre estos átomos adsorbidos y el sustrato, mayores serán las frecuencias de nucleación y menor el tamaño de estos núcleos. A medida que continúa este proceso, los centros de nucleación crecen y se convierten en islas, las que coalescen gradualmente para dar un film contínuo. La afinidad del metal con la superficie de la muestra juega un rol importante, ya que la capacidad de la misma para absorber humedad determinará la textura del film depositado. Films metálicos con pobre adhesión y/o discontinuos se presentan en superficies húmedas o contaminadas . Fig. 8.10 con hidrocarburos, por ej. Plastificantes

Daño por calentamiento: Si bien la cámara de evaporación trabaja en vacío, el calor irradiado alcanza la muestra. Los cortos tiempos de evaporación empleados rutinariamente hacen que el daño por calentamiento no sea un problema serio. Sin embargo, el evaporador en alto vacío, es una herramienta útil para la producción de films delgados, especialmente depósitos de C.

1.1.2-Evaporadora de metales en plasma de Argón:

Estos sistemas se diseñaron para depositar films delgados de metal sobre muestras sensibles al calor, como lo son los materiales biológicos y los materiales poliméricos, en la actualidad su uso se extendió a la mayoría de los materiales. La técnica mantiene la muestra a temperatura ambiente, mientras se deposita metal sobre su superficie.

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El sistema consta de una cámara dentro de la cual se encuentra adosado el metal que se desea depositar y el soporte del portamuestra. En

dicha cámara, se hace un vacío de 10-3 Torr. por medio de una bomba mecánica y se introduce un gas inerte, generalmente Argón (Ar). La excitación de las moléculas de gas, involucra la aplicación de un campo eléctrico entre polos cargados positiva y negativamente. El metal a depositar está localizado en el polo negativo (cátodo) y el portamuestra en el polo positivo (ánodo). (Ver esquema). Al aplicar una diferencia de potencial, el campo eléctrico producido cerca del cátodo hace que las moléculas de gas se ionicen y produzcan iones positivos y electrones libres. Los primeros bombardean el metal cargado negativamente, removiendo partículas del mismo. Estas continúan colisionando con moléculas de gas y se mueven al azar. Muchas de estas partículas llegan a la superficie de la muestra desde distintos ángulos produciendo un film metálico uniforme. El instrumento contiene en la cámara unos imanes que dirigen en todas direcciones las partículas cargadas colaborando en la deposición del metal en forma pareja. El evaporador de metal en plasma de Argón, es ampliamente usado para depositar materiales conductores, tales como metales pesados (Au, Au/Pd). El estado excitado de las moléculas de gas entre el cátodo y el ánodo se conoce como plasma y se caracteriza por una luminiscencia color púrpura cuando se usa gas Argón (Ar). Esta es producida por la generación de iones positivos y electrones libres durante las colisiones entre las moléculas de gas y los electrones que se mueven dentro de la cámara. La operación de deposición es monitoreada midiendo la corriente producida entre ánodo y cátodo (corriente de plasma) y se mide en mA. Los parámetros de operación del instrumento generalmente los provee el fabricante. Las muestras para estudios morfológicos de rutina tienen una cubierta de aproximadamente 300 Å. La expresión para determinar el espesor del film metálico depositado sobre la superficie esta dada por: siendo: d: espesor del film k: constante experimental, función del metal. Tiene el valor 0.17 para Au. i: constante de plasma (mA). v: voltaje aplicado. t: tiempo (seg.). Para valores de rutina tales como: i:18 mA; v: 1 kv, t:60 sg. y k: 0.17, el espesor obtenido es de 360 Å.

d= k. i.v. t

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Fig.8.11- Evaporadora de metales en plasma de Argón

8.12-Comparación entre evaporador en vacio y evaporadora en plasma de argón.

La comparación entre ambas técnicas de deposición se basa en considerar la uniformidad del film para evitar efectos de carga de la muestra durante la observación, el calentamiento de la misma y la producción de artefactos durante la deposición.

Ambos procedimientos incluyen contaminación y pobre adhesión del film a la superficie de la muestra. Estos problemas pueden minimizarse con el uso cuidadoso y apropiado de los instrumentos. La contaminación proveniente de la retrodifusión de vapores de aceite de las bombas de vacío es un problema de ambos sistemas. La evaporadora en plasma de Argón emplea menor vacío durante la deposición y los contaminantes son más fácilmente removidos de la cámara de vacío que en la deposición térmica la cual emplea mayor grado de vacío.

Vacío

Átomos de metal

Moléculas de

gas ionizadas

Alto voltaje

Cátodo

Anodo

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Contaminantes en la cámara de vacío, pueden ser responsables de la poca adherencia de los depósitos. Hidrocarburos, vapor de agua u otros materiales sobre la superficie de la muestra puede prevenir la deposición de films delgados. Debe ponerse mucha atención en el mantenimiento y limpieza de estos sistemas como así también en el secado y composición de la muestra. Materiales volátiles y líquidos no volátiles deben ser eliminados antes de hacer el depósito.

Respecto de la uniformidad de films delgados sobre superficies rugosas, la evaporadora en plasma de Argón, tiene ventajas sobre el evaporador en vacío.

Evaporadora de Carbón:

Es el mismo sistema similar a la que la evaporadora de metales de alto vacío pero con presiones de alrededor de 10-3 torr. Trabaja con dos electrodos. Se utilizan barras o fibras de carbón dependiendo de los cabezales que posea el evaporador.

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Capítulo IX

Protocolos ejemplo para SEM

Prof. Viviana Sorrivas e Ing. María Julia Yañez.

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9- Protocolos guía para la preparación de muestras para Microscopía Electrónica de Barrido:

9.1-Tejidos blandos animales:

Doble fijación: Primera fijación con glutaraldehído y segunda fijación con tetróxido de osmio. Procedimiento:

Cortar un trozo de tejido y lavar en solución fisiológica. Lavar la sangre, mucosidad y cortar en trozos más pequeños ( menor que 1mm de

diámetro ya que los fijadores tardan una hora para penetrar 1mm) Colocar el tejido en glutaraldehído: 2,5% en tampón fosfato 0,1M pH 7,2 por 48 horas. Lavar con tampón fosfato 0,1M en 3 cambios de 30 minutos. Remuever el tejido y colocarlo en una solución de OS O4 1% para llevar a cabo la

segunda fijación durante 2 horas. Lavar con agua bi destilada en tres lavados de 30 min. cada uno. Deshidratar en una serie de concentraciones crecientes de acetona ( 50,75, 95 y 100%

tres veces) por 10 min. cada uno. Secar en el desecador por punto crítico. Montar el espécimen asegurando una buena adherencia, si hace falta agregar puentes

de pintura de plata. Dejar secar. Metalizar con oro u oro-paladio. (dependiendo de la resolución que se requiera, al oro-

paladio es para mayor resolución).

Fig.9.1-Imagen de células de epitelio ciliar ( Atn: Dra. Elena Galindez)

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9.1.1 Protocolo para procesar geles.

Las muestras fueron recibidas en solución fijadora de Glutaraldehído 2,5% en buffer fosfato de Sorensen 0,1M, ph 7,2. Eran discos de 1 cm de alto por 2,5 cm de diámetro ( aprox.), se tomaron varios cubos de 2mm. de lado de zonas más internas de la muestra.

Se procedió a pasar las muestras re- seccionadas a una solución fresca de fijador con buffer. Se lavaron 3 veces buffer fosfato de Sörensen. por espacio de 30 minutos. Se comenzó la deshidratación desde 30% alcohol ( 50, 75 , 100% tres veces) y 1 acetona /1 alcohol y pura un cambio. Se realizó el secado por punto crítico ( Critical point dryer) desde acetona 100% y con CO2 como líquido intermediario, en un equipo Polaron (

England) . Se evaporó oro en una evaporadora de metales en plasma de argón ( Sputter coater ) aproximadamente 300 angstrom de espesor. La observación se realizó en un microscopio electrónico de barrido a un potencial de aceleración de 5 Kv.

9.2 Células libres:

Algunos tipos de células son muy sensibles a la presión osmótica del fijador, como por

ejemplo: los eritrocitos y los espermatozoides. Por ejemplo, algunos eritrocitos aparecerán esféricos si la presión osmótica es baja, mientras que aparecerán verrugas si es alta, estas formaciones son las llamadas ARTEFACTOS en microscopía electrónica.

Procedimiento:

Colocar las células libres en una solución de glutaraldehído al 1% en 0,1M de tampón

Separar las células libres por centrifugación (1.500 rpm.) y descartar el sobrenadante. Fig9.2-.espermatozoide humano

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Colocar el tampón fosfato, pH 7,4 en el tubo de centrífuga, agitar, dejar unos minutos (10 a 15min.) en suspensión, centrifugar nuevamente y desechar el sobrenadante.

Deshidratar en una serie de concentraciones crecientes de acetonas (60, 70, 80, 90, 95, y 100%) por lo menos 10 min. cada uno. Resuspender las células en 100% acetona. luego haga gotear con una pipeta la solución sobre un cubreobjeto, secar rápidamente bajo

corriente de aire. Evaporar metal sobre la muestra.

Una variante: (Laboratorio de UAT) Colocar las células libres en una solución de glutaraldehído al 2,5% en 0,1M de tampón fosfato pH 7,2 agitar y colocar una gota

conteniendo una concentración adecuada para que las células se dispersen bien, sobre un cubreobjetos con poli-l-lisina claramente identificado. Deje fijar por 20 o 30 min. a una hora.

Desde este momento y en todos los pasos subsiguientes, tratar el portaobjetos como si fuera la muestra sin dejarla al aire. Quitar la solución fijadora absorbiendo el líquido con una pipeta Pasteur. Lavar con tampón fosfato, pH 7,4 (10 a 15min.) . Espermatozoide humano

Deshidratar en serie de concentraciones crecientes de acetonas (25, 50, 70, 90 y 3 veces 100%) por lo menos 10 min. cada uno. Realizar el secado por punto crítico. Montar la muestra adhiriendo el cubreobjeto al portamuestras del microscopio. Evaporar metal sobre la muestra.

9.3-Microorganismos en suspensión:

Procedimiento utilizado en el lab. de Microscopia Electrónica UAT:

Concentración óptima: 10 organismos por ml. Agregar 3 gotas a 1,5ml de fijador ( glutaraldehído 2,5% en tampón fosfato 0.067M pH 7,2). Fijar a un soporte y dejar con la solución fijadora 30min. Como se trata de microorganismos utilizar un cubreobjeto con poli-l-lisina o un

filtro nucleopore que no se disuelva con solventes orgánicos, si es un cultivo en agar, raspar y resuspender en solución salina. Lavar con tampón fosfato. Realizar la deshidratación gradual ( 25%, 50%, 75% y 3 veces 100%).

Secar por punto crítico. Montar en un portamuestras adecuado según el microscopio se vaya a utilizar.

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Generalmente la penetración de los fijadores no es un problema. Se ha obtenido una buena fijación en tiempos tan cortos como 10 minutos en GA, 3% seguido de OsO4 10 minutos. Si se realiza un procedimiento de rutina que lleva involucrado TEM y SEM, se puede fijar con ambos fijadores por espacio de una hora y no presenta problemas. Puede realizarse colocando el cultivo en la solución fijadora o cambiando el medio de cultivo por la misma. El cultivo en fijador puede almacenarse por una semana. Luego se reaizan tres lavados con buffer fosfato o cacodilato de sodio 0.1M + 0.1M de sacarosa. La molaridad del vehículo es de 300 mOs, seguido de la fijación con OSO4 en el mismo buffer por 1 hora. La deshidratación se realiza en alcoholes.

Fig.9.3- bacterias.

9.4-Microorganismos en agar:

Los medios sólidos para cultivos son muy utilizados. Ya sea agar o metilcelulosa, mientras tenga una viscosidad de 1500 a 6000 centipoise. En estos casos lo que se hace es realizar una primera fijación en el medio de cultivo, luego se filtra y se prosigue como si el filtro fuera la muestra.

Yamatori,T Para no romper la morfología de la colonia realiza la fijación con vapores de OS O4 al 2% por 10 min. ( ver fijación por vapores ) Funciona muy bien con hongos.

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9.5-Bacterias

Ref: Postek 1.- Seleccionar los especímenes adheridos al agar. 2.- Sumergir en FAA (formol-acido acético- alcohol) por 24 horas a

temperatura ambiente. 3.- Lavar en agua destilada. 4.- Deshidratar por 24 horas en 2,2 dimetoxy-propano acidificado (DMP) acidificado con Cl H (1 gota de CLH 750 ml. DMP). 4.- Transferir la muestra a acetona, dejar 48 horas y secar por punto crítico. Fig..9..4-bacilos

Imagen de bacteria de tos convulsa ¨Bordetella Pertussis¨ Gentileza: Dra. Daniela Bottero.

9.6-Organismos acuáticos

REF: Maugel,T.K 1980 Métodos de relajación:

El anestésico debe aplicarse gradualmente hasta que el organismo esté suficientemente anestesiado y no reaccione cuando se lo estimula. El tiempo depende de la muestra, desde pocos minutos a varias horas. Luego debe realizarse la fijación de inmediato. Anestésicos locales: novocaína, xilocaína y otros.

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9.7-Plancton ( Lab. de microscopía Electrónica de la UAT)

1. Filtrar la muestra con un filtro que no se disuelva con solvente orgánicos. 2. Colocar los filtros en recipientes adecuados para el secado por punto

crítico. 3. Fijar con una solución de glutaraldehído 2, 5% en 0.1M de tampón

fosfato preparada con agua de mar filtrada. 4. Para eliminar las sales transferir las muestras a concentraciones

decrecientes de agua de mar. Después de la fijación. 5. Deshidratar en series crecientes de etanol. 6. Secar en el desecador por punto crítico. 7. Montar y evaporar oro.

Fig. 9.5- diatomea

9.7.2-Protocolo para fijar zooplancton. (Laboratorio de Microscopía Electrónica UAT)

1. Filtrar bajo vacío (suave) el agua de mar con jeringa para filtros (por ejemplo Nucleopore) tener en cuenta que no se disuelva con acetona.

2. Colocar los filtros cápsulas para secado por Punto crítico (adaptar el tamaño del filtro a la cápsula, si se corta no exponer al aire).

3. Sumergir los filtros en 2% solución de Glutaraldehído en agua de mar filtrada ( muy importante) 4. Luego de la fijación, lavar en concentraciones decrecientes de agua de mar, para quitar las sales que pueden haber quedado. Cambiar las soluciones sin exponer al aire las muestras.

Fig:9.6 radiolario

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5. Deshidratar los filtros (la muestra) con series de etanol en agua desde 25% , 50 % 75% y 96% y dos cambios en acetona 100%. 6. Realizar el secado por punto crítico. 7. Montar los filtros y evaporar oro u oro/paladio. 8. Observar de en el microscopio de Barrido entre 5 y 7 KV:

9.7.2.1 Protocolo SEM para huevos de copépodos

1-Prefijar huevos de copépodos en: agua de mar –formol 4% ( formalina). Se pueden preservar en formalina o en FAA. (ver receta). 2-Enjuagar con agua de mar filtrada (0.20 µm) 3-PROCESO DE LIMPIEZA: 1º ULTRASONIDO 30 SEGUNDOS (Lozano y Morales, 1986), 2º Acido clorhídrico 1%( 30 minutos)(Técnica de palinización Van- Waveren y Marcus, 1993; Lozano y Morales, 1986). 3-Enjuagar con agua destilada.

4-Deshidratar en alcoholes. Ethanol 30%, 50%, 75%,95%, 100% (tres veces) Cada 15 minutos, realizado a temp. ambiente agitando los viales.

6-Punto crítico y metalización con oro en evaporadora de metales en plasma de argón por 60 ¨.

Fig.9.7 huevo copépodo

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9.8-Vegetales:

El tratamiento que se le realice a los vegetales dependerá de lo que se quiera observar y de la naturaleza del tejido u órgano. Algunos puntos importantes para tener en cuenta:

Si se va a estudiar la muestra por microscopia electrónica de Transmisión y también por barrido conviene realizar una sola fijación, la misma para ambos. Si se fijan separadamente, para barrido se recomienda usar soluciones de fijación isotónicas y para transmisión, algo hipertónicas.

Tampones, los más usados son: fosfato de sodio y cacodilato de sodio. pH : cerca de la neutralidad. Temperatura: algunos autores ( HAYAT) recomiendan fijar a temperatura

ambiente, mientras que otros de 0 a 4°C.- Duración: una fijación prolongada con glutaraldehído endurece los tejidos y

puede ser una ventaja para microscopía electrónica de barrido, pero al realizar la deshidratación pueden extraerse constituyentes lipídicos.

Deshidratación: los agentes para deshidratación más utilizados son acetona y alcohol.

Secado: a. - al aire desde solventes orgánicos b. - secado por punto crítico. c. – en estufa de vacío.

Fig9.8:. Imagen de corte transversal de una hoja

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9.8.1 Procesamiento para la observación de semillas por SEM

Las semillas se colocaron en Nitrógeno líquido y se fracturaron con cuchilla de acero. Se montaron en portamuestras de aluminio se adhirieron con cinta conductora adhesiva doble faz. Se montaron de manera que la superficie de corte se orientara hacia el detector de electrones secundarios. Se evaporó oro con una evaporadora de metales en Plasma de Argón y se observaron en un Mic de barrido a 5 kv.

Fig.9.9 Corte longitudinal de semilla de quinoa

9.8.2 procesamiento de frutos (arándanos, cerezas, guindas, frutos rojos, etc.)

Solución fijadora: Glutaraldehído al 4% en tampón cacodilato de sodio 0.1 M ( pH 7,2)- Una pieza de tejido se cortó según la necesidad de observación con una hoja de afeitar en gajos de 2mm x de lado y se colocó inmediatamente en el fijador.

Se dejó 2 horas a temperatura ambiente. Se lavaron las muestras con la solución tampón cacodilato de sodio 0.1 M ( pH 7,2).

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Se deshidrataron en pasos de 30 minutos con: acetona 30%, 50%, 75% y 100%t tres veces.)

Se secaron por punto crítico en un equipo POLARON ( ENGLAND) Fluído intermediario, CO2 .

Se montaron sobre cinta adhesiva doble faz con la cara a observar hacia arriba. Se evaporó oro en una evaporadora en plasma de Argón.

Las muestras se observaron en un Microscopio de Barrido a un potencial de aceleración de 5 KV.

Fig.9.10 Cereza.

9.8.3allmidón

Las muestras fueron recibidas en seco. Se realizó el montaje en portamuestras de bronce con cinta adhesiva doble faz

de aluminio. Se dispersaron los granos de almidón . Se vaporó oro en una evaporadora de metales en plasma de argón. ( Sputter

coater ) aproximadamente 300 Angstrom de espesor. La observación se realizó en un microscopio electrónico de barrido a un

potencial de aceleración de 5 Kv. Fig.9.11 – almidón

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9.9-Notas de interés (vegetales)

Pelos, glándulas, células epidérmicas: es mejor verlas en microscopio ambiental o en presión variable, pero se pueden observar con el de alto vacío también realizando el protocolo de fijación y secado por punto crítico.

En el caso de ceras, se ha tenido buenos resultados secando es estufa a 30 ° por varios días las hojas y luego metalizando oro, un detalle es la observación con bajo voltaje, menor a 5 KV.

En el caso de órganos florales, si no se posee un instrumento ambiental o de -presión variable se puede fijar con FAA deshidratar y secar por punto crítico. Es importante atender a las instrucciones del secado por punto crítico y no dejar la muestra nunca al aire. (ver secado por punto crítico). El caso de las diatomeas que deben ser observadas a altos aumentos para poder se requiere de una clasificarlas

buena limpieza por lo que son recomendados el baño ultrasónico y diversos lavados.

Dado que el tetróxido de osmio es un reactivo caro además de muy peligroso y difícil de disponer como residuo, se trata de utilizarlo lo menos posible. Por esa causa, generalmente, se fija con glutaraldehído o FAA, se deshidrata con Fig.9.12 Alga Anabaena. acetonas y se seca por punto crítico.

9.10-Polvos particulados

El material particulado puede encontrarse: seco, con un cierto contenido de humedad o en suspensión. En función de estas características se seleccionará procedimiento de preparación de muestras adecuado. Se deberá considerar: la información que se desea obtener, las características del material (morfología, distribución de tamaños, detalles superficiales, etc.), el soporte o adhesivo en el cual se colocará la muestra, la cantidad de especímenes a preparar, el tipo de metal que se empleará en la metalización.

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9.10.1- Partículas en seco

9.10.1.1-Método 1: Dispersión por espolvoreo

Este método es ampliamente utilizado en la preparación de particulas secas para observación en SEM. Es rápido, sencillo y no requiere agentes dispersantes. Procedimiento: Con la ayuda de una espátula se esparce el material particulado sobre una cinta adhesiva doble faz adherida al portamuestras SEM. Las partículas caen, al azar, por gravedad sobre la superficie de la cinta (Fig.9.11.1).

Fig. 9.10.1 Método de dispersión por espolvoreo La dispersión obtenida del material sobre la cinta, depende, en gran medida, de la velocidad de espolvoreo, la distancia a la cual se realiza y del tamaño promedio de las partículas.

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El método presenta algunas desventajas, como por ejemplo, la inhomogeneidad de la dispersión observada como acumulación de partículas en algunas zonas y la escases de las mismas en otras. Otro efecto no deseado del método es la superposición de partículas, en sistemas con una amplia diversidad de tamaños.

9.10.1.2-Método 2:Dispersión bajo corriente de aire

Una variante del método de espolvoreo, es la dispersión bajo corriente de aire. Procedimiento: El material particulado es arrastrado por una suave corriente de aire facilitando que el mismo se disperse sobre una cinta adhesiva doble faz adosada al portamuestras SEM. (Fig.9.11.2)

Fig.9.10.2: Método de dispersión bajo corriente de aire

La dispersión de partículas obtenida sobre la cinta depende de la densidad de las partículas, el flujo de aire aplicado, la distancia entre el portamuestra y las partículas, la forma y el tamaño de las partículas.

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Las desventajas que se presentan con este método de preparación en general están ligadas con la mala dispersión de las partículas en el portamuestra. La diferencia de densidad, tamaño y formas de las mismas ocasiona disparidad en el arrastre que sufren las partículas, dando como resultado ausencia de partículas con similares características y extrema presencia de otras. Otro efecto negativo del método es la pérdida de material que no queda adherido a la cinta adhesiva.

9.10.3-Método 3:Dispersión en recipiente semi-cerrado:

El método consiste en generar un movimiento envolvente de las partículas en un recipiente semi-cerrado. Procedimiento: se coloca la muestra particulada en un recipiente abierto. Se ubica una cinta adhesiva cubriendo parte de la abertura del mismo. Se hace circular una corriente de aire para provocar el movimiento de las partículas, las cuales quedan adheridas aleatoriamente a la cinta. Posteriormente, se retira la misma y se coloca la cara sin partículas sobre el portamuestra SEM . (Fig. 9.11.3)

Fig. 9.10.3: Método de dispersión en recipiente semi-cerrado.

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La densidad, el tamaño de las partículas y el caudal de aire aplicado tienen una fuerte incidencia en la dispersión lograda. Se encontró que en sistemas particulados con diversidad de tamaños, las partículas más grandes escapan fácilmente del recipiente, quedando adheridas a la cinta, mayoritariamente las partículas pequeñas. Otra desventaja del método es la acumulación de material sobre los bordes del recipiente.

fig.9.10.4- Cenizas volcánicas

9.10.2-Partículas en suspensión líquida

Si se desea obtener una buena dispersión de las partículas utilizar el método por suspensión. Para su preparación es necesario seleccionar un líquido inerte en el cual se suspenderá el material. Por esta razón será importante tener en cuenta la composición química de la muestra de manera tal que no sufra alteración al contacto con el líquido. Alcohol etílico, agua bi-destilada y alcohol isopropílico son los más utilizados. Los alcoholes se prefieren sobre el agua dado que poseen una tensión superficial menor que el agua y ayudan a una mejor dispersión del material durante la evaporación del líquido.

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Procedimiento:

1. Dispersar el polvo se en un líquido inerte escogido formando una suspensión. 2. La suspensión se coloca en un baño ultrasónico 15 - 30 minutos aproximadamente para lograr una buena dispersión del

material. 3. Con una pipeta se deposita una gota de la solución anterior sobre un vidrio cubreobjetos limpio. 4. Se deja secar a temperatura ambiente en ambiente limpio. 5. Se evapora metal en su superficie.

Para muestras que ya se encuentran en suspensión se sigue el procedimiento anterior a partir del paso 2. Es importante que la muestra esté suficientemente diluida para evitar la aglomeración de partículas. Se aconseja preparar muchos especímenes de suspensiones diluidas en lugar de pocos con diluciones concentradas. Si no se conoce la naturaleza de las partículas ni la concentración es conveniente preparar varios especímenes a distintas diluciones.

9.11-Muestras filtradas

Muchas muestras de partículas son colectadas sobre un filtro, por ej. partículas ambientales. La preparación de esta clase de muestras para su observación en SEM, depende de la naturaleza del filtro y de las partículas.

Existen diferentes tipos de filtros los cuales son utilizados en diversas aplicaciones. Entre los más usados se pueden citar:

a) Filtros nucleopore de policarbonato: Son lisos y permiten la observación directa de las partículas, sin necesidad de removerlas del mismo. b) Filtros de camino tortuoso: las partículas entran en el interior del filtro, siendo necesaria la remoción o exposición de las mismas para su

observación SEM. Con este propósito se puede realizar un ataque químico parcial del filtro, exponiendo uno de los lados del filtro a vapores de un solvente adecuado (por ej. cloroformo).

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fig 9.11.1. Filtro

Si se desea remover las partículas se pueden realizar los siguientes pasos:

1- las partículas expuestas se cubren con un film de carbón (por evaporación). 2- el film obtenido se da vuelta y se aplica solvente de ataque en el lado del filtro sin atacar hasta disolución completa del mismo. 3- film de carbón con las partículas unidas al mismo se transfiere a un portamuestra provisto de cinta adhesiva doble faz.

Un método alternativo para remover partículas desde un filtro es colocar al mismo en un líquido inerte con ambos materiales y utilizar un aparato de ultrasonido por 1-2 hs. Las partículas se desprenderán y quedarán suspendidas en el líquido. Se toma una alícuota de esta suspensión y se coloca en un cubreobjetos de vidrio. Se deja secar a temperatura ambiente. Este método tiene la desventaja que no todas las partículas logran desprenderse y si se realiza una distribución de tamaños la misma puede verse afectada en determinados rangos de tamaños.

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9.13-Fractura (materiales poliméricos)

Entre las características de los materiales poliméricos se pueden citar: están compuestos por elementos de bajo peso molecular (C, H, O, etc.), su bajo punto de fusión, baja emisividad electrónica y pobre conductividad térmica y eléctrica. La preparación de este tipo de muestras, para su observación SEM, deberá tener en cuenta dichas características, en especial la temperatura de transición vítrea (Tg). Caracterización del tipo de fractura, superficie interna y distribución de fases de polímeros compuestos son algunos estudios que se pueden realizar por SEM.El método de preparación de muestra utilizado con estos propósitos, se realiza fracturando el material por medios mecánicos. Polímero con inclusión de goma

Si la Tg (temperatura de transición vítrea) es menor que la temperatura ambiente, se debe fracturar el material en condiciones criogénicas a fin de evitar deformaciones del material mediante el siguiente procedimiento:

1- Llenar un recipiente térmico aislante (puede ser de telgopor) con nitrógeno líquido hasta que deje de burbujear.

2- Colocar el polímero dentro del nitrógeno. El cese de burbujas indica que el polímero alcanzó la temperatura de enfriamiento adecuada.

3- Tomar los extremos de material polimérico con pinzas y dejar enfriar las mismas. 4- Aplica una fuerza suficiente para fracturar el material. 5- Retirar las partes fracturadas y se dejar secar a temperatura ambiente.

Es importante, poner atención cual superficie es la de fractura a fin de realizar el montaje

correcto.

Fig. 9.13.1- polímero con goma incluida

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9.14 Protocolo para procesar muestras de masas húmedas( alimentos) .

Se preparó la solución fijadora glutaraldehído al 2.5% en tampón fosfato de sodio 0.67 M (pH 7,2).

Se colocaron trozos de masa menores a dos milímetros de diámetro en el fijador.

Se dejaron 2 horas a temperatura ambiente. Se lavaron 3 veces con el mismo buffer. Se comenzó la deshidratación desde 30% alcohol ( 50 ,75 , 100% tres veces) y

acetona pura dos cambios. Se realizó el secado por punto crítico ( Critical point dryer) en un equipo Polaron

(England) . Se vaporó oro en una evaporadora de metales en plasma de argón ( Sputter

coater ) marca Pelco 91000 (aproximadamente 300 angstrom de espesor). La observación se realizó en un microscopio electrónico de barrido a un potencial de aceleración de 5 Kv.

Fig.9.14.1- Imagen de masa de pan con distintos tipos de granos de almidón.

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Capítulo X:

Artefactos

Prof.Viviana Sorrivas , Dra. Alfonsina Morales e Ing. María Julia Yañez

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10. Artefactos : Definición.

10- Factores que inducen alteraciones de la ultraestructura celular anteriores a la fijación.

La disección y el procedimiento experimental provocan alteraciones en la distribución o forma de organelas especificas. La acumulación de productos de metabolismo anormal se ven como inclusiones irregulares, presencia de bacterias, virus, parásitos, etc. Los efectos post mortem son referidos al cambio de nutrientes y desperdicios entre células y sus organelas a través de sus membranas, que se encuentran perturbadas.

Otros artefactos pueden deberse a la falta de oxígeno (anoxia) del tejido y a problemas en las técnicas de obtención de la muestra. Los artefactos producidos por la anoxia son:

1. Compactación de la cromatina nuclear. 2. Vacuolización, ruptura del retículo endoplásmico liso, aparición de gránulos que contienen enzimas hidrolíticas, crestas mitocondriales y del

R.E. rugoso disgregados. 3. Lisis de las membranas nuclear y plasmática.

10.1- Artefactos causados por la fijación:

Recordamos que fijación es el proceso por el cual se “intenta” mantener la integridad de la muestra a estudiar. El proceso de fijación se realiza por medios químicos o físicos. La aparición de precipitados en la fijación química es frecuente observándose como

cambios en el citoplasma o en las organelas.

Se denominan así a errores o malformaciones que aparecen durante la observación de las muestras y pueden ser debidos

al proceso de fijación, deshidratación, inclusión, seccionamiento, contraste, irradiación o adquisición de imágenes.

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Uno de los más comunes es la aparición de espacios vacíos en el citoplasma, organelas o entre membranas del núcleo o entre crestas y matriz mitocondriales. En los tejidos vivos, todos los espacios están rellenos con una solución acuosa de coloide de proteínas y sales (fluido tisular).

Discontinuidad en las membranas: Si se observan membranas segmentadas, seguramente es un artefacto debido probablemente a una diferencia de osmolaridad entre el medio y el tejido. Los fijadores son transportados a la célula por un buffer, ya que si se realiza la primera fijación en una solución acuosa cambia radicalmente el pH fisiológico de la célula y los efectos osmóticos que se producirán serán muy notables, viéndose como hinchazón o contracción de la muestra. Palade, (1952); Caulfield, (1957); Tooze, (1964); O’Brien et al, (1973); Arborgh et al (1976). Claude (1961) y Malora (1962) determinaron que el pH caía de 6.2 a 4.4 cuando las células eran fijadas con solución de Osmio acuosa. Una caída del pH, ya sea por muerte natural de la célula o por otro mecanismo reduce las macro proteínas en pequeños fragmentos ionizados. Como la ultraestructura es una función de las proteínas, si la conformación de éstas se pierde aparecerán disrupciones a nivel morfológico. El efecto es similar al de la muerte natural de la célula, donde una caída del pH por disociación macromolecular comienza la autolisis.

Entonces hay que usar buffers artificiales para acomodar los iones generados en la reacción hacia un nivel cercano a los valores fisiológicos. La tonicidad (respuesta volumétrica de las células sumergidas en una solución) es también controlada por el buffer. El buffer cumple el propósito de llevar también electrolitos tales como Calcio o Magnesio o no electrolitos como glucosa o sacarosa. Generalmente los tejidos vegetales tienen un pH de 6.8 a 7 y los animales de 7.0 a 7.4.

10.2) Artefactos de fijación en TEM

10.2.1- Tiempo de agonía Anoxia: Se produce cuando el bloque de tejido es de tamaño grande. Las células de la superficie del bloque se fijan, pero las centrales sufren

anoxia o por déficit de glicólisis aeróbica baja el ATP se alteran las bombas de Na+/K+ aumenta el Na+ intracelular edema celular. 10.2.2-Pérdida de sustancias:

Los azúcares se metabolizan antes de la fijación. Los aminoácidos y ATP difunden. Los lípidos no fijados se lavan en la deshidratación. Se preservan mal las mucosustancias.

10.2.3- Falsa localización: el glucógeno o el hierro en el hígado, por ejemplo. 10.2.4-Pérdida de la actividad biológica (enzimática o la antigenicidad): la fijación puede esconder epitopes o centros activos. En este caso se

puede intentar con crioultramicrotomía, tripsina, fijación en presencia de sustratos o microondas.

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10.2.5- Reacciones inespecíficas: La fijación con glutaraldehído deja un exceso de aldehídos (cuidado con las reacciones con plata) y peroxidasa, que luego dan marcajes inespecíficos. La fijación con formaldehído aumenta el marcaje de aminoácidos tritiados.

10.2.6-Alteración del volumen de las estructuras:

La mala regulación de la osmolaridad trae errores al hacer morfometría. La célula es sensible, dependiendo de las bombas Na/K- ATPasas, y las organelas, por ejemplo dependen de la ATPasa que concentra calcio dentro de la mitocondria.

También depende de la presión osmótica de las proteínas intracelulares,que disminuyen la concentración de agua dentro de la célula.

Fig.10.1

EJEMPLO: En este caso se realizó la primera fijación con glutaraldehído al 2 % en tampón fosfato 0.1 M a pH7.3, la segunda fijación con tetróxido de osmio al 1%, se deshidrató con etanol y se embebió en resina araldite. Las retracciones del tejido que se observaron fueron las que se muestran en el gráfico

Las retracciones máximas se vieron en hígado y

páncreas.

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10.3-Artefactos causados por deshidratación e inclusión para TEM

Es importante el paso de deshidratación ya que luego continúa la infiltración en resina y no puede quedar agua en el tejido ya que la mayoría de las resinas son hidrofóbicas. SI queda algo de agua la polimerización será discontinua y habrá problemas en los pasos

subsiguientes. Además podrán aparecer agujeros grandes y pequeños. Como se ha referido en el capítulo de deshidratación hay fluidos deshidratantes como acetona, alcohol etílico que son los más comunes. El óxido de propileno se considera también de uso común. (Se usa en los pasos previos a la inclusión desde acetona o alcohol 100% porque es inmiscible en agua).

10.4-Resinas epoxi:

Uno de los artefactos más comunes es la alteración en el tamaño de las organelas por problemas en la formulación de la resina o

por separación de los constituyentes de la resina durante la infiltración. Mezclado: Si los componentes de la resina no están bien mezclados habrá

problemas en la polimerización. Estabilidad de la resina: Las epoxi son muy inestables (Mollenhauer, 1986)

Artefactos más comunes:

desplazamiento de elementos del tejido en el bloque.

movimiento de secciones bajo el haz.

desvío en el contraste de la imagen y cambios de dimensión de la muestra.

El agente deshidratante debe ser lo más anhidro posible y guardarse a

temperatura ambiente

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Desplazamiento: movimiento relativo de los elementos del tejido con respecto a la matriz de inclusión. Bajo el haz: inmediatamente de expuesta la sección al haz, puede moverse cientos de angstrom. La primera causa es inducida por el

calentamiento y vaporización de la resina y también las cargas eléctricas. Las cargas del haz de electrones atrapadas en la sección se repelen entre sí, esto genera fuerzas que mueven la sección. Los efectos de carga son más pronunciados inmediatamente de expuesta la sección al haz de electrones mientras la resina sigue siendo buena aislante y antes de que las secciones se carbonicen o calienten.

Probablemente las resinas epoxi se hacen conductoras cuando son calentadas. Una manera de prevenir cuando hay mucha carga es evaporar carbón sobre las grillas de ambos lados. Contraste: Varía de acuerdo a la fórmula de la resina. Algunas pueden rechazar los agentes de contraste.

Puede ocurrir pérdida de masa de la secciones o que los constituyentes de la resina se evaporen cuando el haz calienta los cortes. Dependiendo de la fórmula de la resina y de la intensidad del haz la muestra puede perder hasta un 20% de la masa total. Si la imagen electrónica es primariamente el resultado de la diferencia de masa, el contraste de la imagen sería proporcional a la pérdida de masa.

10.5-Artefactos en seccionamiento ultra fino

Todos los pasos que llevan a obtener buenos resultados en la obtención de imágenes de transmisión son importantes. El seccionamiento de las muestras biológicas es un paso fundamental que requiere de la habilidad y paciencia del ultramicrotomista.

“Un bloque duro requiere velocidades de corte más bajas”.

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Perfil del Ultramicrotomista:

1. Paciencia 2. Desarrollo de

la habilidad. 3. Dedicación 4. Pulcritud

10.6-Artefactos relacionados con la ultramicrotomía

Cuando la cuchilla ¨toca ¨ la zona del taco de resina tallado para realizar la sección, ejerce una presión que puede llegar a deformar el corte. Hay dos tipos de deformación según Black (1971): elástica (reversible) y plástica (irreversible).

La muestra que se seccionará se encontrará embebida en una resina que deberá estar perfectamente polimerizada

Una pobre infiltración y embebido darán como

resultado la aparición de artefactos.

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10.6.1-Parámetros para tener en cuenta

10.6.1-AMBIENTALES:

El ultra micrótomo deberá estar ubicado en una sala aislada, en donde no haya corrientes de aire, ni vibraciones, no debe estar cerca de áreas de mucho tránsito.

10.6.2-Chatter

Entre los artefactos que se presentan al variar las condiciones ambientales podemos encontrar por ejemplo : diferencias en el grosor de las secciones alternantes, denominadas chatter, que se observan como bandas más oscuras (gruesas) y más claras (más finitas) que se forman cuando se realizan los cortes y se resalta la diferencia durante la observación al Microscopio Electrónico de transmisión. Las bandas claro-oscuras pueden observarse en un área del espécimen o en toda la sección. En este último caso se debe a una diferente composición del espécimen con respecto a los alrededores. El chatter se ve y se reconoce por ser paralelo al borde de la cuchilla. Entre las posibles causas del chatter se incluyen una vibración de alta frecuencia que ocurre cuando la cuchilla y el bloque de resina interactúan, o la vibración de componentes del ultra micrótomo tales como el block que contiene la muestra, el porta muestras, la cuchilla que no está bien asegurada, etc. Otro problema puede ser que la cara de corte del bloque sea demasiado grande, habrá que tratar de reducirla a un tamaño menor de 0.5mm de longitud en la parte más larga del trapezoide y los demás lados menores a 0.5mm.

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Fig.10.2 chatter

Para corregir este artefacto primero el ultramicrotomista deberá asegurarse que los parámetros anteriores estén controlados, de esa manera si

no se soluciona el problema del chatter podrá: cambiar el ángulo de la cuchilla o la velocidad de corte, Otros parámetros a tener en cuenta son la temperatura y humedad del ambiente en donde se encuentra el ultramicrótomo. Si el ambiente se

encuentra muy húmedo, o muy cálido será más difícil conseguir secciones viables.

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Las cargas estáticas debidas a la sequedad del aire pueden dificultar el seccionamiento o la recolección de las secciones. Para evitarlo se pueden hacer descargas de chispas con un encendedor piezoeléctrico ( magiclic)

Fig.10.3 mellas

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El trapezoide se ve acortado en su alto con respecto a su ancho (borde que da a la cuchilla) y el grado de compresión depende de la dureza del bloque las zonas más blandas se comprimen más. Al microscopio se ven como ondas y arrugas. Para prevenir este artefacto, la resina deberá ser de la dureza adecuada respecto de la muestra. Una vez cortadas las secciones se puede remediar estas arrugas utilizando lo que se denomina ¨planchado¨ que se realiza con vapores de cloroformo, xileno o tricloro etileno con un papel enroscado en un palillo y pasado por encima de las secciones embebido en el solvente. (sin tocarlas y muy rápido) cuando las secciones están todavía flotando en el agua. Se puede ver este efecto de planchado observando el color de la sección al cambiar su grosor.

10.6.4- Marcas de cuchilla:

Se reconocen al TEM como rasguños perpendiculares al filo de la cuchilla y pueden deberse a imperfecciones de la cuchilla, mellas, debido a sus reiterado uso (cuchilla de diamante) o zonas de la muestra de mayor dureza que se arrastran en el corte (sílice en gramíneas,)uesos, semillas etc).

10.6.6- Arrugas al recoger la sección:

Las arrugas son provocadas al colocar los cortes en la grilla. Hay dos formas de capturar los cortes: 1), tocando los cortes con la grilla por arriba y 2) recogiendo los corte por debajo. Por supuesto no es tan fácil, requiere habilidad que se adquiere con experiencia.

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10.6.3- Compresión:

fig.10.5

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10.6.7- Secciones irregulares:

Las secciones en corte salen gruesas y finas en forma alternada. Puede deberse a que el boque es muy blando, se remedia aumentando la velocidad de corte, pero puede provocar mayor compresión. También observar el nivel de agua de la cubeta en la que caen los cortes. Una solución para los tacos blandos es colocarlos en la estufa a polimerizar nuevamente hasta que endurezcan.

El trapezoide deberá estar bien tallado con las dimensiones apropiadas. Los bordes del trapezoide no deben tener superficie irregular para favorecer la formación de la cinta (ribbon)

Fig.10.6- Imagen superior: corte delgado, imagen inferior: corte grueso

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10. 7- No se logran cortes en serie:

Si no se consiguen es debido a que la cara de corte ha sido mal tallada, por lo tanto es necesario seguir las indicaciones apropiadas. La superficie de corte de la cuchilla debe ser perfecta, sin mellas ni basura. Por eso conviene tallar una trapezoide lo más pequeño posible.

<0.5mm <0.5mm 0.5mm posición correcta zona dura posición incorrecta zona dura

10.8-Contaminación de las secciones debido a ultramicrotomía:

Puede ser en forma de partículas presentes en el aire, bacterias o productos químicos como solventes, grasa, etc. Es conveniente que el instrumento no esté expuesto a corrientes de aire y el ambiente se encuentre lo más limpio posible. Cuando el operador se encuentra con un proceso infeccioso deberá usar máscara además del protector de acrílico para los cortes. Ref: Klomparens Karen. L. from Michigan , State University , East Lansing, Michigan.

10.9.1-Distorsión en las imágenes por:10.9.1.1- problemas mecánicos

Pueden ocurrir por una mala operación del microscopio en sí mismo o por problemas de manufactura del equipo o del tubo de rayos catódicos. Las primeras se deben a que las condiciones de operación no son las adecuadas para tomar la imagen. Las variaciones en la velocidad de barrido

pueden deberse a fallas en el generador de barrido o movimiento de la muestra por no estar ésta debidamente sostenida, contener humedad o que la carga producida en la muestra por una mala metalización produzca una desviación del haz de electrones. Podría pensarse que la causa de esas fallas es fácil de detectar pero no es así.

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Una distorsión de la imagen también puede ser causada por una desviación del foco, producida por el movimiento de la muestra o por la inestabilidad del voltaje de aceleración o variaciones en la corriente de las lentes. Si el foco cambia en el medio de una foto dará la impresión al observador que una parte esta a otro nivel.

10.9.1.2-Penetración del haz:

La mayoría de las investigaciones en SEM son realizadas con muestras que han sido deshidratadas. Al remover el agua de los tejidos cambia la densidad. La penetración del haz es un problema importante. El haz penetrará varias capas dentro de la muestra y puede suceder que los electrones emerjan de zonas más internas entonces la superficie puede aparecer transparente. Puede reducirse este problema utilizando metales pesados en su fijación, pero lo más conveniente es reducir el voltaje de aceleración. También una gruesa capa de metalizado reduce la penetración del haz, pero enmascara detalles superficiales. El propósito de metalizar es hacer la muestra conductora y no detener la penetración del haz.

10.9.1.3-Contaminación

Astigmatismo, tanto como disminución del contraste son causados por la contaminación de la columna y del espécimen con material de baja conductividad eléctrica, el cual se carga cuando es golpeado por electrones dispersados y esto introduce campos electrostáticos que pueden variar en fuerza durante la carga y descarga del material contaminado. La variación en la fuerza del campo puede hacer que la imagen se mueva en determinada dirección. La contaminación de la columna, usualmente del porta muestras, produce un movimiento en la imagen cuando se mueve la iluminación del haz. Con el tiempo, pequeñas estructuras de la muestra se oscurecen con una capa de contaminación y el contraste del espécimen se reduce totalmente debido a la deposición de una capa de contaminación. El grosor resultante produce un efecto de aberración cromática que limita la resolución. Afortunadamente, la contaminación se elimina cuando se usa un accesorio anticontaminante.

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Fig.10.7. Contaminaciones

10.9.1.4- Deriva de la imagen e inestabilidades mecánicas.

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Tiempos de exposición de 1 a 4 segundos son los requeridos para adquirir una imagen que implica que el movimiento del espécimen por unos nm por Segundo puede limitar la resolución de la imagen. El movimiento de la imagen pueden ser provocado por inestabilidad del porta muestras y el soporte del mismo.

10.9.1.5-Desviación térmica.

Se debe a la expansión o contracción del film soporte o la expansión asimétrica de la grilla cuando

son expuestos al haz, es una causa común de imágenes borrosas. El desplazamiento térmico se puede deber a que los films soporte son demasiados finos, la presencia de partículas de suciedad, el contacto entre el film soporte y la grilla, a la presencia de agujeros o roturas. Una forma de minimizar el daño térmico es reducir el área de la muestra que será expuesta al haz, de esa manera se disminuye el calentamiento del espécimen. Por eso conviene usar grillas con film y carbón o grillas de cobre, que son buenas conductoras del calor.

Desviaciones ínfimas pueden no verse durante la observación, pero sí, al obtener la fotografía como una imagen borrosa en una dirección. La cantidad de desviación puede medirse haciendo exposiciones múltiples en determinado período de tiempo. Se puede distinguir de astigmatismo comparando las imágenes obtenidas bajo determinadas condiciones de enfoque.

10.9.5.6-Vibración Mecánica

El sitio donde está ubicado el instrumento puede tener vibraciones debido al tráfico exterior, a golpeteo de puertas, terremotos, etc. causando una imagen borrosa en la dirección de la vibración. Una apropiada ubicación de los instrumentos es indispensable para obtener buenos resultados. Las vibraciones de la bomba mecánica deben ser anuladas así como las vibraciones en la columna del microscopio.

Fig.10.8- Una doble exposición de un agujero de carbón que muestra el movimiento entre las dos exposiciones y también el depósito de una lámina de contaminación que demuestra una disminución en el diámetro del agujero. Magnificación ~300,000X. (de Agar)

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10.9.5.7- Inestabilidades eléctricas y magnéticas.

Las variaciones de la corriente de la lente inducen fluctuaciones en la longitud focal. Estas fluctuaciones son rápidas, e imágenes de diferentes magnificaciones y rotaciones se superponen. El uso de lentes superconductoras con un pulso de voltaje simple, hace que la corriente fluya por un tiempo indefinido y reduce las fluctuaciones de corriente. Las columnas de los Microscopios Electrónicos están construidas de materiales diseñados para aislar el haz de electrones de campos exteriores, magnetos, equipos eléctricos grandes, etc. El efecto del campo ambiental será uniforme a través del campo de visión y con respecto a esto, será similar en apariencia al efecto de la vibración mecánica. Si el origen del problema es una campo, la imagen borrosa será reducida a altos voltajes, mientras que si el borroso resulta de vibraciones mecánicas la magnitud del efecto no cambiará a diferentes voltajes, aún como grillas no-ferromagnéticas como de cobre, imágenes de regiones de la muestra que están cercanas a la grilla no serán registradas.

10.10-Artefactos propios de la microscopía electrónica de barrido (SEM)

10.10.1-Artefactos más comunes durante la observación en el microscopio

• Astigmatismo: El campo de la lente magnética no es simétrico y deforma en un sentido más que en otro. Puede ser causado por suciedad en

la columna, apertura o porta espécimen. Con los correctores de astigmatismo del instrumento se corrige esta asimetría. .

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Fig.10.9- La imagen de la derecha aparece borrosa y deformada. No tiene buen foco. Una pequeña cantidad de astigmatismo imperceptible a bajas magnificaciones es muy notable a altas. Este tipo de aberración no permite

tener una imagen con foco nítido. Aparece completamente deformada. Se evita con el microscopio escrupulosamente limpio y con la debida corrección de astigmatismo.

Carga: en grano de polen : Euphorbia sp Fig-10.10

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Fig.10.11- Carga

• Cambios estructurales.

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Daño por radiación. Fig.10.12- cambios estructurales

Hifas de hongos que al deshidratarse cambian su estructura.

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Este daño es irreversible, ya que daña la superficie de la muestra. Se puede ver como grietas, burbujas o manchas. Varía de una muestra a otra. También se observa en muestras donde el haz craquea las capas contaminantes sobre la superficie, especialmente a altas amplificaciones. Aparece como una mancha oscura del tamaño él área irradiada. Se demostró ( Thornton, 1968) que algunos films de óxidos sobre semiconductores pueden absorber una capa de aceite de las bombas difusoras o mecánicas. El haz craquea esta capa. Por este efecto se ve un área oscura al bajar la magnificación ( fig. de la izquierda). Una forma de evitar el daño hecho por el haz primario es reduciendo la energía del haz o bien su intensidad mediante la disminución del tamaño de la apertura final o incrementando la corriente de las lentes.

• Daños por vacío.

Fig.10.13- Epidermis de hoja después de ser observada a presión variable unos minutos. Este tipo de año es irreversible y el grado de deterioro de la muestra se puede determinar si se tiene una idea previa de la apariencia superficial.

Conociendo los bordes agudos, estos podrían perder agudeza. Y también se perderá turgencia. Se deberá preparar la muestra nuevamente teniendo especial cuidado en el secado.

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Daño por fallas en la columna:

La mayoría de las fallas en la columna provocan distorsiones en la imagen, debidas a una mala alineación del haz de electrones respecto del eje óptico o a suciedad. También cuando la apertura final está desalineada se presentan efectos similares. Una imagen ruidosa puede reconocerse por su granulosidad. Se origina por varias razones: carga de la muestra, pobre contacto eléctrico en el sistema colector, reducción de la sensibilidad del detector (centellador) o rápida velocidad de barrido.

Fig.10.14- Defectos de carga debido a la esfericidad de la partícula.

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• Pobre emisión electrónica.

Fig…

Fig.10.15- Si la imagen se presenta ruidosa, se dificulta la observación de pequeños detalles. Para que la imagen no presente este tipo de problemas se debe saturar bien el filamento, chequear el funcionamiento del sistema colector y tomar las micrografías a una baja velocidad. Se aconseja utilizar filtros para quitar el ruido. La mejor resolución se obtendrá con un haz de mucha energía y pequeño tamaño. Sin embargo la elección del potencial de aceleración depende del material que vaya a estudiarse. Para un tamaño pequeño de haz, se ajustan las lentes condensadoras, se disminuye la apertura final y se acorta la distancia de trabajo para reducir la profundidad de foco.

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Vibraciones en la columna del microscopio

Fig.10.16

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10.10.2 -Daños producidos en la muestra durante la preparación

Algunas causas probables:

Las burbujas sobre la superficie, pueden deberse a que el lavado inicial fue mal realizado o el fijador hipotónico. Las burbujas explotadas son causadas por el uso de un fijador hipotónico. Las depresiones en la superficie de las células aparecen cuando el secado al aire es incipiente. Los cristales sobre la superficie pueden deberse a la precipitación de los electrolitos del buffer. La separación de las células, si el tejido fue congelado, se debe a un congelamiento mal realizado. La ruptura de células o la presencia de arrugas se debe a una pobre fijación, congelamiento o secado por aire incipiente. Si la superficie no ha sido bien preparada, limpia y seca se puede presentar carga. Si el secado no fue bien realizado aparecen arrugas y deformidad en la forma de las células o en el caso de materiales

inorgánicos, carga. Una mala ubicación de la muestra en el portamuestra puede no permitir la observación del detalle que quiere

observarse. Una mala adhesión de la muestra al portamuestra provoca movimiento de la misma cuando es fotografiada y rayas de

carga. Si la muestra es de partículas y está mal calculada la dilución puede haber superposición de partículas, una mala

evaporación de metal lo que hace que no sea buena conductora. Hay que lograr que el portamuestra sea conductor, se pueden hacer puentes de pintura de plata. Si la muestra tenía en su superficie mucus y no fue bien preparada, el detalle que quiere observarse quedará oculto.

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Capítulo XI

Micrografía Electrónica

Téc. Carlos Alberto Jones

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11-La Micrografía Electrónica

11.1-El cuarto oscuro electrónico: Imágenes digitales.

Un sensor CCD no detecta directamente los electrones primarios rápidos, los electrones deben ser primero convertidos a una señal de luz, usando una fina capa de material, conocida como “centellador”. Los electrones rápidos sufren un proceso de dispersión en el centellador al generar luz en este proceso, se desvían significativamente de su camino original, luego de la dispersión al azar. Como resultado, la resolución de la imagen de luz es inferior a la imagen original de la muestra. El control y minimización de esta pérdida de resolución de la imagen durante la conversión de electrones a luz, es una tecnología crítica en el diseño de una cámara de CCD de alta resolución.

Hay además una pérdida de resolución, debida al sistema de transmisión de la luz (por fibra óptica o lentes ópticos) En otras palabras, un electrón que afecta al centellador, genera una mancha de luz, debido a la pérdida global de resolución, mas que un punto

solo. Esta mancha es lo que forma la imagen en el sensor CCD.

11.2-Importancia del tamaño del pixel:

Para entender la resolución de una cámara de CCD, se debe tener en cuenta la pérdida de resolución explicada anteriormente y también el tamaño del pixel. En un diseño óptimo, el tamaño del pixel del sensor CCD, debería ser del tamaño de la mancha. Ya que esta es generada por un único punto, producido por un único electrón en la imagen original. Idealmente, esta mancha debería corresponder a un único pixel en la imagen detectada. Si no es así y el pixel es menor que esa mancha, el punto invadirá más de un pixel en el sensor. Esto se llama “untado” y genera una pérdida de definición en los bordes (sharpness). En este caso, la cámara tendrá una pobre resolución, a pesar del alto número de pixeles de su sensor. (Resolución: la mínima distancia que hay entre dos puntos contiguos para ser distinguidos como entidades separadas).

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11.3-Cómo se puede saber si todos los pixeles en una cámara CCD, contribuyen a mejorar la resolución?

La mejor forma de comprobar esto es usar el “test de resolución de línea”, como se realiza en los instrumentos ópticos. La idea básica es ver cuál es la mínima distancia entre líneas que el sensor puede resolver. (Resolución del sensor)

Solamente cuando un par de líneas es resuelta con aproximadamente 2 pixeles, se puede concluir que todos los pixeles en la cámara CCD contribuyen a mejorar la resolución.

Conclusión:

El número de pixeles de la cámara no define su resolución. La resolución verdadera y significativa se puede obtener solamente por la

correspondencia del tamaño del pixel y el de la mancha generada por el electrón.

11.4-Publicación de las micrografías:

En las publicaciones se debe colocar siempre la barra indicadora del tamaño. Salvo que se trate de una imagen artística. También en la publicación debe constar el instrumento utilizado, con marca, modelo y su año de fabricación. El procesamiento de la muestra para la obtención de la micrografía y los detalles operativos, como potencial, distancia de trabajo, ángulo de inclinación, detector utilizado y todo lo que el científico considere importante para poder repetir la foto publicada.

El teorema del muestreo digital de Nyquist de “2 pixeles por par de líneas ”, describe el límite de usar puntos discretos para representar señales continuas.

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11.5-Imagen digital:

En la fotografía tradicional, al revelarse la película obtenemos una imagen impresa sobre papel fotográfico. En cambio con la imagen

digital tenemos un archivo informático. (Con extensiones : .jpg, .bmp, .tiff, etc)

¨La imagen digital está formada por una serie de matrices numéricas de ceros y unos que se almacenan en una memoria informática y

que definen las características de una fotografía¨.

Una vez que esta imagen es interpretada (leída), el software apropiado la transforma en una imagen visible a través de la pantalla e

imprimible a través de cualquier dispositivo de salida. La gran ventaja del archivo digital es que puede duplicarse y copiarse tantas veces

como se quiera.

11.5.1-Formación de la imagen digital

La trayectoria que sigue la información en la cámara para formar la imagen digital es la siguiente: La luz que detecta el objetivo de la cámara llega hasta el sensor de imagen, denominado CCD, formado por multitud de receptores fotosensibles denominados “fotodiodos”. La luz incidente genera una pequeña señal eléctrica a cada receptor. Posteriormente, esta señal se transformará en datos digitales por el conversor ADC, como una serie de cadenas de números ceros y unos, denominados dígitos binarios. Estos números binarios (O,1 ), se representan como pequeños cuadraditos, en forma de mosaico individual denominados píxeles.

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Fig. 11.1

11.5.2-El sistema binario y su funcionamiento

La información que procede del sensor de nuestra cámara digital está formada por datos analógicos. Para que estos datos se puedan almacenar en la tarjeta de memoria y que el software pueda interpretarlos se deben convertir a formato binario “bytes”. El software reconoce un estado activo que lo representa con el (1) y otro estado inactivo que lo representa con el (0). Las cifras binarias se forman por un número total de ceros y unos. Estos ceros y unos tienen el doble del valor que el primero “potencia de 2”, 8, 16 etc. Un BIT es igual a la unidad mínima de información del sistema binario, siendo el 0 y el 1. Un byte es igual a 8 bits u octeto. En esta imagen se puede observar cómo se forma un Byte y el valor de cada bit.

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El número de esta cadena de bits, es el resultado de multiplicar cada BIT por su valor de posición, (1x1), (1x2), (0x4), (1x8), y así sucesivamente hasta llegar a obtener el resultado final el 43.

11.5.3-Pixeles: Los puntos de una imagen

Si comparamos con la fotografía tradicional, observamos que una película fotográfica está formada por pequeños granitos formados por haluros de plata sensibles a la luz, éstos al encontrarse muy juntos forman la imagen que vemos. Cada uno de estos granitos es la unidad más pequeña que hay en una fotografía tradicional.

Pero en el caso de la fotografía digital, este granito pequeñito es substituido por el pixel. La imagen que obtenemos ya sea a través de una pantalla, o un escáner o una cámara digital, es un enorme mosaico lleno de millones de pixeles. Cada pixel o “cuadrito” contiene la información del color de esa pequeña porción. El pixel solo puede ser de color rojo, verde o azul (RGB). Un pixel, solo tiene un color no puede tener dos colores.

Al visualizar todos los píxeles juntos, uno al lado de otro, dan la impresión de continuidad respecto a la tonalidad del color, formando así la imagen.

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11.5.4-La resolución, cantidad de píxeles

La resolución de la imagen, es la cantidad de pixeles. La resolución se utiliza también para clasificar casi todos los dispositivos relacionados con la imagen digital ya sean pantallas de computadora o televisión, impresoras, escáneres, cámaras, etc. La resolución expresa el número de pixeles que forman una imagen de mapa de bits. La calidad de una imagen, también depende de la resolución que tenga el dispositivo que la capta. El número de pixeles que contenga una imagen depende de cuántos pixeles utilice el sensor CCD de la cámara para captar la imagen.

Fig.11.2

La resolución de una imagen digital se expresa

multiplicando su ancho por la altura en pantalla. Por ejemplo la

imagen de 1200 x 1200 píxeles = 1.440.000 píxeles, expresado

en Mp megapixel es igual a 1,4 Mp. Conviene tener en cuenta

que 1 Megapixel = 1024 pixeles.

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11.5.5-La resolución de la impresión: Puntos por pulgada (ppp) Píxels por pulgada (ppi)

La resolución expresada en (ppp) o (ppi), son pixeles por unidad de longitud, es decir, los pixeles por pulgada. La pulgada mide 2,54 cm. La resolución define la cantidad de pixeles que contiene una imagen y la dimensión de estos pixeles expresan de qué forma se reparten en el espacio. La resolución es la relación entre las dimensiones digitales (los pixeles) y las físicas, las que tendrá una vez impresa sobre papel. Para calcular el tamaño en píxeles a tamaño en centímetros para la impresión podemos aplicar la siguiente fórmula: * Tamaño de impresión= Número de píxeles/ Resolución (PPI pixeles por pulgada) Podemos poner como ejemplo la imagen siguiente:

Fig.11.3

Existen diferentes resoluciones, depende del trabajo o destino que le demos a la imagen. Se recomiendan las siguientes: * Imágenes para visualizar en pantalla ordenador o subir a Internet : 72 ppp * Imágenes para impresión de 150 ppp como mínimo, pero se aconseja los 300 ppp, dan óptimos resultados.

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11.5.6-Pixelación

En la fotografía tradicional se producía el famoso efecto de granulación cuando se ampliaba la fotografía, en cambio en la imagen digital este efecto es substituido por el de pixelado.

Si reproducimos una imagen con baja resolución quiere decir que el pixel ocupa más espacio y deforma la imagen con el efecto de pixelado, (píxeles de gran tamaño) aportando poca definición a la imagen. En cambio si la resolución en ppp, es más alta, existe más

detalle y más definición.

11.5.7- Cómo guarda el color el pixel: El Bit y el color

Sabemos que el pixel es una pequeña porción de una imagen y que a su vez guarda en él una pequeña parte del tono de color de esa misma imagen. La profundidad del BIT o profundidad del pixel o profundidad del color, estima los valores que puede llegar a tener cada pixel que forma la imagen. Si tiene más cantidad de bits por pixel más colores, mayor resolución de imagen y mayor tamaño del archivo

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La profundidad del BIT se puede medir en:

1 BIT, blanco o negro

8 bits de color y

256 matices de color

24 bits de color o colores RGB, imágenes en color

32 bits CMYK, para impresión de las imágenes La imagen digital puede ser en escala de grises o en color. La imagen digital que utiliza un solo BIT para definir el color de cada pixel, solamente podrá tener dos estados de color el blanco y el negro.

fig.11.4-

8 bits 256 tonos de grises

Con 8 bits se muestra una imagen de 256 tonos de grises diferentes y comparable con una imagen de las tradicionales en blanco y negro. Cuantos más bits tenga una imagen mayor número de tonos podrá contener la imagen. Lo normal es 8 0 16 bits. Utilizando los 8 bits sólo existe

256 tonos o estados.

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24 bits de color

Una imagen digital en color se crea con los parámetros en R G B, por la síntesis aditiva, el color rojo, verde y azul. Síntesis aditiva

Si anteriormente necesitábamos 8 bits para captar una imagen de 256 tonos de un solo color, ahora precisamos 8 bytes, es decir 24 bits: * 8 bits de color rojo. * 8 bits de color verde. * 8 bits de color azul. para llegar a representar el tono adecuado a cada pixel de la fotografía en color.

Una imagen de 24 bits de color, mostrará 16,7 millones de colores, los suficientes para mostrar cualquier matiz de color que se necesite. Los 16,7 millones de colores los traduciríamos a 256 tonos de color azul x 256 tonos de verde y 256 tonos de rojo, el resultado de esta operación es lo que da los 16,7 millones de colores.

11.6-Formatos de archivos

Al captar una nueva imagen a través de nuestra cámara digital o bien a través cualquier otro dispositivo de entrada como el escáner, obtenemos una imagen digital en dígitos binarios, tal y como hemos explicado anteriormente. Actualmente existen muchas clases de archivos del tipo informático, pero para guardar el archivo existen muchísimos formatos y cada programa informático utiliza su propio tipo . En este apartado explicaremos algunos de los formatos de archivos de imágenes que utilizan las cámaras digitales, así como los archivos que utilizan diferentes clases de software, programas informáticos.

11.6.1-Imágenes Vectoriales

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Las imágenes digitales pueden ser mapa de bits o vectoriales. Las imágenes vectoriales son gráficos formados a base de curvas y líneas a través de elementos geométricos definidos como vectores. La gran ventaja de las imágenes vectoriales es que no sufren pérdida de resolución al producirse una ampliación de los mismos. Se utiliza mucho para trabajos de rotulación, rótulos, iconos, dibujos, logotipos de empresa etc. Esta clase de imagen tiene poco peso como archivo informático, medido en Kilobytes.

Este tipo de archivos lo utilizan programas de dibujo y de diseño tales como: El Adobe Ilustrator, Freehand, Corel Draw entre otros. Otra particularidad de esta clase de archivos es que solo pueden visualizarse a través del programa que los creó, sino se transforman en mapa de bits.

11.6.2-Mapa de bits

Los archivos de las imágenes se guardan normalmente en forma de mapa de bits o mosaico de pixeles. Cada pixel guarda la información de color de la parte de imagen que ocupa. Este tipo de imágenes son las que crean los escáneres y las cámaras digitales. Esta clase de archivos ocupan mucha más memoria que las imágenes vectoriales.

El principal inconveniente que presenta esta clase de archivos es el de la ampliación, cuando un archivo se amplia mucho, se distorsiona la imagen mostrándose el mosaico de “ pixeles” y una degradación en los colores llegando al efecto pixelado (definido en el apartado de imagen digital), debido a la deformación de la fotografía.

La imagen de mapa de bits, al ampliar excesivamente su tamaño pierde nitidez y resolución.

11.6.3-Compresión de los archivos digitales

Los formatos de archivos digitales almacenan la información codificando en toda la imagen cada pixel de forma individual, esto ocasiona que el archivo pese mucho (ocupa mucho espacio en MB a la PC) y no pierda ninguna clase de información. Las cámaras digitales suelen realizar una forma de compresión del archivo para reducir el tamaño del mismo, eliminan lo que carece de valor, pero una vez que se visualiza de nuevo la imagen, el proceso de compresión se invierte. Existen diferentes clases de archivos digitales, unos sufren pérdida de calidad y otros no.

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Las cámaras digitales utilizan un formato que mantiene el archivo de la imagen en su estado virgen, en el cuál no realizan ninguna clase de compresión y el archivo se mantiene en su máxima calidad, igual que en el momento que se captó la imagen. Podemos citar el formato RAW y el TIFF. Otros formatos sin pérdida de calidad: BMP,EPS, PSD, PDF.

11.6.4-Formatos con pérdida de calidad

En la imagen y archivos digitales, existen formatos de archivo que desechan información innecesaria al almacenarlas sufriendo una pérdida de calidad, pero con la ventaja de que obtienen archivos informáticos con menor peso y espacio en las computadoras, haciéndolas más manejables. Algunos de estos formatos: JPEG, GIF, PNG.

11.6.5-Formato de archivo Tiff

TIFF, viene de Tagged Image File Format, es un formato que lo desarrollo Aldus, una Compañía propiedad actualmente de Adobe. Es un tipo de archivo estándar para guardar imágenes de alta calidad, ya que es compatible con los sistemas operativos Windows, Linux, Mac, etc. Se encuentra reconocido por muchos programas de retoque y edición gráfica, tales como Paint Shop Pro, Adobe, Quark, Corel etc. No obstante si tenemos alguna duda sobre como enviar un archivo para su impresión o edición, optaremos por el formato universal TIFF, para que se pueda abrir y editar sin problemas. Al almacenar un archivo en formato TIFF, este lo guarda con 48 bits de color incluyendo capas y canales alfa.

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fig.11.5

No obstante el formato TIFF empieza a no utilizarse en lo que respecta a algunas cámaras fotográficas profesionales, porque al procesar una foto con tanta información, resulta difícil de moverla, visualizarla etc., este proceso lo ralentiza muchísimo, además de que ocupa mucho espacio en la tarjeta de memoria de la cámara, por esto las cámaras incluyen el formato JPEG y el formato RAW para la calidad del archivo. En cambio utilizar el formato TIFF para escanear una imagen, es adecuado porque el archivo se manejará directamente en la PC, y puede destinarse también para la impresión precisando para ello de la máxima resolución posible.

11.6.6-Formato Raw

El formato RAW, sólo se encuentra disponible en cámaras digitales sofisticadas, indicadas para fotógrafos profesionales. Este formato ofrece la máxima calidad ya que contiene los pixeles en bruto tal y como se han adquirido. Normalmente en el funcionamiento de los otros formatos que utilizan las cámaras digitales (Tiff y JPEG) participa el sensor para transmitir la señal eléctrica y convertir los datos de analógicos a digitales, pero en cambio los pixeles que capta el procesador de la cámara en el caso del RAW, no se procesan ni transforman, se mantienen tal cual. A éste proceso se le llama también negativo digital.

Los datos del archivo RAW, no han sufrido ninguna clase de compresión, lo que hace que este archivo mantenga el máximo detalle de la imagen. Estos archivos son de tipo ópticos para imágenes de especial importancia. Uno de los inconvenientes que presenta el formato RAW: El peso del archivo, ocupa mucho espacio y no podremos guardar la misma cantidad de imágenes en nuestra tarjeta en este formato. Este archivo RAW, no se puede imprimir ni visualizar directamente, precisa del tratamiento informático

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y realizar conversión que se pueda utilizar. La gran ventaja es que los datos del formato RAW son puros del sensor de la cámara. Uno de los programas que trata los archivos RAW, es el camera Raw de Adobe.

11.6.7-Formato de archivo BMP

Esta clase de formato lo utiliza el sistema de Windows y el Ms-Dos, para guardar sus imágenes. Este sistema de archivo puede guardar imágenes de 24 bits (millones de colores), 8 bits (256 colores) y menos. Para esta clase de archivos puede seleccionarse una compresión RLE (Run Length Encoding) sin pérdida de calidad.

El uso más común de este formato, es generar imágenes de poco peso y no se aconseja utilizarlo en imágenes recién captadas, sino en imágenes una vez reducidas a los 24 bits. Se utiliza mucho para crear fondos para el escritorio de Windows.

11.6.8-Eps: Encapsulated Postscript

Este archivo lo ha desarrollado la compañía Adobe y se pueden guardar en este formato, tanto mapa de bits como imágenes vectoriales. Es muy utilizado en la impresión profesional y en otras aplicaciones llegando hasta la impresora de tipo Postcript. EPS es adecuado para realizar intercambio de archivos entre programas de maquetación, tales como page Maker o quarkxpress incluyendo los de dibujo vectorial (Freehand o corel). Es junto con el formato TIFF, uno de los estándares en el mundo de la autoedición. Aunque fue creado por Adobe, una vez que se abre el archivo con Photoshop los datos de la imagen y los gráficos vectoriales que pueda contener el encapsulado se rasterizan, es decir se convierten a pixeles.

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Si se quiere imprimir un archivo EPS directamente, debemos utilizar una impresora compatible con PostScript. Estos archivos a su vez son más lentos en procesarlos que los TIFF, pero en los programas de maquetación la visualización se procesa más rápida. Los datos guardados se encuentran dentro de una cápsula, encapsulados, por lo que si se quieren modificar, se deben tratar con el programa que los creó.

11.6.9-Psd, formato de archivo de photoshop

El PSD es un formato nativo de photoshop y permite guardar todas las presentaciones, retoques, nuevas creaciones realizadas con este

programa. Guarda los archivos con 48 bits de color y permite almacenar todas las capas, canales etc. que exista en el archivo de imagen.

PSD casi no tiene compatibilidad con otros programas, por lo que se recomienda tener dos archivos: uno en el propio formato nativo

(.PSD), y otro en algún formato compatible con otros programas, como JPGE o TIFF. En algunos casos puede ser que tengamos alguna

versión antigua de photoshop y que necesitamos abrir una imagen guardada en PSD y que esta no sea compatible con otras versiones,

con lo que se aconseja activar las siguientes opciones:

* Para Windows, abrimos Photoshop> seleccionamos> Edición>Preferencias>Manejo de archivos.

* Luego marcamos la casilla de verificación: compatibilidad para los archivos de Photoshop.

De este modo serán compatibles los archivos con distintas versiones del programa.

11.6.10-PDF, portable document format.

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Este formato lo creó Adobe para poder intercambiar archivos entre diferentes sistemas operativos. Por ejemplo: un archivo o documento creado con algún programa de Windows, puede verse en la plataforma Linux o Mac, con sólo tener el visualizador de PDF, (Acrobat Reader) disponible gratuitamente en Adobe y muchos otros sitios. Este formato guarda con toda precisión el diseño del archivo incluyendo sus fuentes, imágenes y demás gráficos.

fig.11.6

.PDF, se utiliza cada vez más y es considerado otro formato de los estándares junto con EPS y TIFF. Se encuentra muy extendido entre la red, en la que encontramos numerosos archivos con éste formato.

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11.6.11-JPEG y la fotografía digital

Este formato lo creó ¨The Joint Photographers Experts Group¨. Es uno de los formatos más conocidos para la compresión de fotografías digitales. Es uno de los pocos formatos que se soporta en Internet (Web) Todas las cámaras digitales y escáneres almacenan las imágenes en formato JPEG, no obstante y dado que la compresión de este formato afecta a la calidad de imagen, se puede escoger diferentes niveles de compresión: A más baja compresión mayor calidad. A más alta compresión menor calidad. Cuando se opta por una compresión alta, es para crear archivos que ocupen poco espacio para la Web o enviarlas por correo electrónico. JPEG es el único formato de archivo, que puede llegar a comprimir una imagen hasta sólo un 10% de su tamaño

fig.11.7

original, sin que el ojo humano pueda percibir diferencias, antes y después del proceso de compresión. JPEG soporta 24 bits.

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11.6.11.1-Normas a seguir antes de editar un JPEG

Antes de editar una imagen en JPEG, conviene que tengamos en cuenta los siguientes puntos, para no perder calidad en el archivo: * No guardar imágenes en formato JPEG si se van a modificar. * Cada vez que abramos un archivo o lo editemos, la imagen sufre una compresión y pérdida de calidad. * Antes de editar una imagen en JPG, la guardaremos inicialmente una copia en formato BMP o TIFF con la máxima profundidad de color.

11.6.12-Formato de archivo GIF

.GIF, es un formato de archivo bastante antiguo. Lo desarrolló ¨Compuserve¨ para su propia red comercial. Este tipo de archivo se creó con la finalidad de obtener archivos de tamaño muy pequeños. GIF es muy indicado para guardar imágenes no fotográficas tales como: logotipos, imágenes de colores planos, dibujos, etc. El formato GIF guarda imágenes de 8 bits, no 8 bits por cada color RGB, sino que indexa solo 256 colores cómo máximo. Para guardar una imagen en formato GIF utilizaremos la opción ¨Guardar para la Web¨. Una gran ventaja de este formato, es que podemos realizar transparencias en la paleta de colores, haciendo que ese color quede invisible. Este formato permite crear animaciones a través de fotogramas secuenciales.

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11.6.13-Formato PNG

Considerado un formato para sustituir al famoso .GIF, debido a que el PNG utiliza sistemas de compresión estándares gratuitos, como el método ZIP, y permite al mismo tiempo mayor profundidad de color en las imágenes, llegando hasta los 24 bits de profundidad de color, mientras que el formato GIF solo recoge 8 Bits. Si utilizamos PNG, para comprimir imágenes de 24 bits podremos realizar una interesante compresión sin pérdida alguna de calidad. Este formato también posee la característica de reconocer los navegadores, pero en el caso del Internet Explorer, opera a partir de la versión 5.0. Lo único que debemos tener en cuenta es que si utilizamos éste formato para la red, los usuarios que posean versiones anteriores del Internet Explorer, no podrán visualizarlas

11.7-Procesos de mejora de las imágenes

Los procesos de mejora de imagen pueden agruparse en distintas categorías, teniendo en cuenta el efecto que producen sobre la imagen (modificación del brillo y contraste, mejora del contraste, reducción de ruido, desenfoque o suavizado de bordes, mejora del enfoque o realce de contornos, delineación de contornos, detección de microestructuras, iluminación de masas, etc. ). Pero también pueden agruparse en categorías teniendo en cuenta el mecanismo que utilizan para la modificación de la imagen digital. Así, existen algoritmos que modifican el histograma o función de distribución de las intensidades, algoritmos que filtran determinadas frecuencias y otros que modifican el contenido de cada píxel de la imagen de acuerdo con el valor de los píxeles colindantes aplicando una función predeterminada.

La única diferencia que estriba entre GIF a PNG, es que en PNG, no permite archivos animados

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11.7.1-Procesos de modificación del brillo y contraste por transformación del histograma.

Mejora del contraste de una imagen por normalización o expansión del histograma Frecuentemente, los niveles de gris de una imagen en b/n o los niveles de intensidad en cada componente RGB, no ocupan todo el rango posible

(generalmente 256 niveles), sino sólo una pequeña parte de los mismos. Esto produce en la imagen un efecto de falta de contraste, debido a la cercanía de las distintas intensidades. El ojo humano no puede diferenciar intensidades muy próximas en un rango de 256 niveles, ya que en general se admite que el ojo humano distingue menos de 64 niveles de intensidad en una misma imagen.

La operación de expandir el histograma de valores de intensidad, de tal manera, que sin modificar su forma, se logre que ocupe todo el rango disponible en el equipo de visualización (monitor o impresora) produce un efecto de mejora o aumento del contraste. Este efecto de mejora del

contraste puede ser útil para corregir efectos de neblina o ciertos defectos de exceso de luz de Fondo.

Fig.11.8

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Tablas de transformación de grises Cuando se genera una imagen en forma digital, se utiliza una función que transforma las distintas intensidades de luz irradiadas desde el objeto y

que llegan al sensor de digitalización, a valores numéricos discretos entre unos umbrales determinados. El umbral inferior corresponde a la cantidad de luz mínima necesaria para activar el sensor y suele digitalizarse con un valor cero, mientras que el umbral superior corresponde al nivel de saturación (nivel por encima del cual no puede distinguir entre distintas intensidades de energía) y se digitaliza con el máximo valor de la escala de digitalización correspondiente al color blanco. Este máximo valor de digitalización depende del número de bits que se empleen para codificar cada pixel. En la mayoría de los sistemas comerciales, cada pixel se codifica con 8 bits y por lo tanto al nivel máximo o blanco se le asigna el valor 255. La función que realiza esta transformación de valores de energía luminosa recibidos a valores digitales, se denomina función de transferencia.

Cuando se quiere visualizar la imagen digital en un monitor o pantalla es necesario utilizar una nueva función de transformación, que convierta

los valores numéricos discretos (digitales) de la imagen digital en intensidades de energía que activan los puntos sensibles del monitor o de la pantalla. Utilizando una función rectilínea de pendiente 1, se pretende que la función de transformación reproduzca los mismos niveles de intensidad luminosa que digitalizó la función de transferencia, o por lo menos que se mantengan las mismas proporciones y relaciones entre los distintos niveles de intensidad presentes en la imagen y en el objeto convertido en imagen.

Sin embargo, esta relación de equivalencia 1 a 1, entre los valores de intensidad luminosa del objeto y los valores de reproducción de la imagen, no es siempre la más adecuada para obtener unos resultados de visualización óptimos. Por esto, con frecuencia, suelen emplearse funciones de transformación más o menos complejas (logarítmicas, exponenciales, polinómicas), que modifican estas relaciones y mejoran los resultados de visualización.

Las funciones de transformación pueden almacenarse como tales funciones y cada vez que se visualiza la imagen se calcula para cada valor digital

de cada pixel, cual debe ser el valor de visualización, o en muchas ocasiones se almacenan en tablas. Estas tablas, denominadas tablas de transformación de grises, guardan para cada valor digital de entrada el valor correspondiente de salida o de visualización. En los programas de proceso de imagen suelen incluirse instrumentos para generar estas tablas de transformación.

En el ejemplo siguiente, puede observarse el efecto de una transformación polinómica de grado 5 sobre una imagen de microscopia electrónica

de transmisión.

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Comparación de la imagen original muy poco contrastada (izquierda), debido a la poca luminosidad del microscopio, con la imagen transformada (derecha).

Fig 11.9

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Fig.11.10

11.8-Filtros de convolución

11.8.1- Teoría y definiciones

Una parte muy importante de los procesos de mejora se basan en la aplicación de funciones, cuyo resultado depende únicamente de los niveles de intensidad de cada pixel de la imagen pero no de la posición dentro de la imagen (position-invariant), que permiten resaltar determinados elementos de la imagen (como resaltar los contornos de los objetos), mejorar el enfoque o reducir el ruido de fondo.

Fig.11.10

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Estas funciones, a las que por analogía con la teoría de señales se las denomina comunmente “filtros”, se basan en el proceso de convolución y en las propiedades de la convolución respecto a la transformación de Fourier, lo que simplifica el cálculo matemático y los tiempos de computación. Por esto, a muchos de estos filtros, se les solía denominar según su acción en el espacio de las frecuencias (filtros de baja o alta frecuencia, filtros direccionales) . Sin embargo, cada vez es más frecuente, en los sistemas de proceso de imagen, adjudicarles nombres más de acuerdo con el resultado visual que producen sobre la imagen “filtrada” (filtros de enfoque, desenfoque).

Un filtro de convolución, para una imagen digital, en el espacio real (X,Y), puede representarse como una matriz cuadrada o rectangular (matriz de convolución), de dimensiones (M,N) mucho más pequeñas que la de la imagen. La matriz de convolución se desplaza sobre la imagen de tal forma que el elemento central de la matriz de convolución coincida con cada uno de los pixeles de la imagen. En cada posición, se multiplica el valor de cada pixel de la imagen, que coincide en posición con un elemento de la matriz de convolución, por el valor de este. El pixel de la imagen, que coincide con el elemento central de la matriz de convolución, es substituido por la suma de los productos.

Así por ejemplo, si tenemos la siguiente matriz de convolución:

El resultado de su aplicación será sustituir cada pixel de la imagen por el promedio de dicho pixel con los ocho pixeles de su inmediato alrededor.

1/9

1/9

1/9

1/9

1/9

1/9

1/9

1/9

1/9

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Fig.11.12-Ej: filtrado de realce de contornos en Photoshop, aplicándole una matriz de convolución de 3x3

-1 -1 -1

-1 7 -1

-1 -1 -1

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Fig.11.14- Reducción de ruido y artefactos de JPEG

Fig.11.15- Aplicación de Máscara de enfoque

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Capítulo XII

Seguridad en el laboratorio de microscopía

electrónica

Mg. Cecilia Gutierrez Ayesta

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El laboratorio de microscopía electrónica constituye un lugar potencialmente peligroso, siendo fundamental la adopción de

medidas preventivas para garantizar la seguridad de los trabajadores. Existen precauciones universales que se aplican a

cualquier tipo de laboratorio y otras específicas en base a la clase de estudio que se realiza. Además de los peligros propios

que conlleva el trabajo en un laboratorio de procesamiento de muestras biológicas y/o químicas, los protocolos más

comúnmente empleados para microscopía electrónica engloban cuidados especiales. A continuación se enumerarán los ms

destacados, en base a la información hallada y a la práctica obtenida.

12-1.1. Reactivos

Los reactivos empleados en los diferentes pasos de preparación de muestras para microscopía electrónica (fijación, lavado,

deshidratación, inclusión, contraste) poseen distintos grados de peligrosidad. La mayoría de estas sustancias puede ingresar al organismo

al ser inhaladas, ingeridas y/o absorbidas por piel. Como regla general e independientemente del tiempo de exposición o del tipo de

actividad que se realice con el producto, se deben manipular bajo campana y usando los elementos de protección personal adecuados.

Utilizar SIEMPRE guardapolvo de mangas largas, anteojos de seguridad,

calzado cerrado o zapatos de seguridad y guantes (caucho, látex,

neopreno, nitrilo, etc).

En presencia de altas concentraciones, aerosoles, vapores o polvos

químicos también usar protección respiratoria.

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Se recomienda leer las instrucciones de la etiqueta impresa en el producto y las

hojas de seguridad antes de usarlo, prestando especial atención en conocer el manejo

seguro de cada sustancia y sus peligros potenciales. Se debe usar las menores

cantidades posibles y en caso de trasvasarlos, rotular los recipientes inmediatamente.

Cabe aquí recordar las normas generales dispuestas para el

laboratorio químico, entre las cuales se destacan :

En el caso que existiese un derrame o salpicaduras se debe actuar con rapidez para

lograr la neutralización, absorción y eliminación del producto. Los elementos de

protección empleados serán en función de la peligrosidad del producto y se debe tener

la precaución de quitarse las ropas contaminadas. Es conveniente alejar todas las

fuentes de calor, especialmente si el producto derramado es inflamable. El laboratorio debe disponer de duchas y lavaojos accesibles y

cada trabajador debe conocer en dónde se encuentra el equipo para la atención de emergencias.

Mantener la higiene del lugar, no comer, beber ni fumar dentro del mismo y no guardar productos alimenticios en donde se almacenan los reactivos y drogas.

Nunca se debe pipetear con la boca, tocar con la mano o probar las sustancias químicas. El lavado de manos debe ser frecuente y en especial al finalizar el trabajo y antes de salir del laboratorio.

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A continuación se enumeran algunas recomendaciones para el manejo de los reactivos más empleados en la preparación de muestras

en nuestro laboratorio de microscopía electrónica:

12.1.1.1. Acetato de uranilo

Cancerígeno. Química y radiológicamente tóxico. Posee una toxicidad mayor en relación a su radioactividad, aunque ambos

peligros deben ser altamente considerados.

Produce trastornos de riñón, hígado, pulmón y tracto respiratorio. Acumulativo en el organismo.

Trabajar bajo campana. Emplear protección personal adecuada (guantes de goma y anteojos de seguridad).

Almacenar a temperatura ambiente en un recipiente apropiado, lejos de la luz y en un ambiente ventilado.

Descartar en un frasco de vidrio rotulado bajo campana.

12.1.1.2. Acetona

Produce efectos nocivos en la salud por inhalación, ingestión y contacto. Afecta la piel, los ojos, el sistema respiratorio y el SNC.

Trabajar bajo campana y con elementos de protección.

No inhalar. Evitar la formación de aerosoles y/o vapores.

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Almacenar en un recipiente cerrado, en un lugar bien aireado.

Mantener alejado de fuentes de ignición. Evitar la carga electrostática

Evitar las temperaturas elevadas, la exposición a la luz y la formación de peróxidos.

Evitar su eliminación por el desagüe. Riesgo de explosión.

Descartar en un frasco de vidrio rotulado bajo campana.

12.1.1.3. Alcohol etílico

Produce efectos nocivos en la salud por inhalación, ingestión y contacto.

Trabajar bajo campana y con elementos de protección.

Mantener el lugar ventilado, fresco y seco, para asegurar que la concentración no exceda los límites de exposición ocupacional.

Rotular los recipientes adecuadamente. Depositar en contenedores herméticamente cerrados.

Evitar toda fuente de ignición o calor y separar los contenedores de los materiales incompatibles.

Descartar en un frasco de vidrio rotulado bajo campana.

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12.1.1.4. Azul de toluidina

Irritante de ojos y piel. Se absorbe por inhalación, a través de la piel y por ingestión. Puede causar efectos en la sangre dando

lugar a la formación de metahemoglobina.

Trabajar bajo campana. Emplear protección personal adecuada.

Se descompone al calentarlo intensamente, produciendo humos tóxicos, incluyendo óxidos de nitrógeno. Reacciona

violentamente con oxidantes, especialmente con el ácido nítrico. Pueden formarse mezclas explosivas vapor/aire.

Ventilar los ambientes donde se manipula.

Almacenar en recipientes bien cerrados a temperatura ambiente.

Descartar en un frasco de vidrio rotulado bajo campana.

12.1.1.5. Buffer (fosfato y cacodilato)

Tóxicos y cancerígenos. El cacodilato contiene arsénico.

Evitar el contacto con la piel, los ojos y la ropa.

Trabajar bajo campana con elementos de protección adecuados.

Almacenar en recipientes cerrados en áreas secas, templadas y bien ventiladas.

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En caso de derrames, quitarse las ropas contaminadas. Lavarse las manos entre las pausas y al finalizar el trabajo.

Descartar junto con el glutaraldehído, en frasco de vidrio bajo campana y bidón etiquetado.

12.1.1.6. Citrato de plomo

Cancerígeno. Tóxico. Nocivo por inhalación e ingestión. Irritante de piel y mucosas. Acumulativo.

Riesgo durante el embarazo para el feto. Puede perjudicar la fertilidad.

Trabajar bajo campana. Emplear protección personal adecuada (guantes y protección ocular).

Su uso es restringido a personas técnicamente cualificadas.

Realizar una buena ventilación (no si es polvo). Evitar la inhalación de polvo fino y niebla (protección respiratoria).

Almacenar en recipientes bien cerrados, en ambiente seco y bien ventilado. Mantener alejado de sustancias inflamables, fuentes

de ignición y calor, sustancias oxidantes y ácidas.

Descartar en un frasco de vidrio rotulado bajo campana. Eliminar el producto y su recipiente como residuo peligroso. Evitar su

liberación al medio ambiente. Muy tóxico para los organismos acuáticos.

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12.1.1.7. F.A.A.

Tóxico por inhalación, ingestión y contacto con la piel, los ojos y la ropa.

Trabajar bajo campana. Usar protección personal. En caso de formarse vapores/aerosoles, usar protección respiratoria.

Manipular alejado de fuentes de ignición y calor. Evitar las temperaturas elevadas.

Emplearlo en lugares secos, ventilados y frescos. Asegurar que la concentración no excede los límites ocupacionales.

Conservar el recipiente que lo contiene bien cerrado.

En caso de derrames o fugas recoger con materiales absorbentes o en su defecto arena o tierra secas. Quitarse las ropas

contaminadas.

Descartar en un frasco de vidrio bajo campana o bidón etiquetado.

12.1.1.8. Glutaraldehído

Carcinógeno, alergénico y sensibilizante. Minimizar la exposición.

Trabajar bajo campana. Utilizar guantes de látex, caucho butílico, neopreno, o PVC y máscara para vapores orgánicos.

Mantener una buena ventilación.

Eliminar toda fuente de ignición.

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Almacenar en recipientes bien cerrados y en lugar fresco, alejado del calor y de material incompatible.

Para su transporte utilizar etiqueta de precaución. No transportar con sustancias explosivas, sustancias que en contacto con agua

puedan desprender gases inflamables, comburentes y peróxidos orgánicos, radioactivas, sustancias incompatibles ni alimentos.

En caso de derrame neutralizar con glicina.

Utilizar material descartable o en su defecto lavar con agua. Recoger la primera solución de lavado para descartarla.

Descartar dentro de un frasco de vidrio o bidón rotulado y cerrado bajo campana, junto con la solución de lavado y las soluciones

buffers.

12.1.1.9. Permanganato de potasio

Oxidante fuerte. Se absorbe por inhalación y por ingestión. Corrosivo para los ojos, la piel, el tracto respiratorio y digestivo. Puede

afectar los pulmones, produciendo bronquitis y neumonía.

Trabajar bajo campana. Emplear protección personal adecuada.

Manipularlo en lugares ventilados y/o con ventilación mecánica. Luego lavarse las manos con abundante agua.

Almacenar en envase cerrado, en un lugar seco, aireado y a la sombra, lejos de fuentes de calor y llama viva.

Reacciona violentamente con materiales combustibles y reductores y con metales en forma de polvo (peligro de incendio o

explosión).

No colocarlo en contacto con sustancias inflamables. Se descompone al calentarlo intensamente, produciendo gases tóxicos y

humos irritantes.

Descartar en un frasco de vidrio rotulado bajo campana.

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12.1.1.10. Resina Spurr (epoxi)

Cancerígena. Irritante. Afecta los ojos y la piel. Posibilidad de sensibilización. Evitar su contacto e inhalación.

Trabajar bajo campana. Emplear protección personal (guantes de de nitrilo, cloropreno o latex, anteojos de seguridad y máscara).

Procurar suficiente ventilación y aireación. Evitar la formación de polvo.

Almacenar en su embalaje original cerrado y respetar las medidas de separación.

Una vez abierto, almacenar dentro de una campana hasta su desecho, protegido de la humedad y en lugar fresco. Se puede

emplear una lata o una botella.

Evitar el calor intenso, las aminas, alcoholes y bases.

En caso de derrame usar avena o vermiculita.

Cubrir el área de trabajo con papel y limpiar los derrames inmediatamente con alcohol.

No emplear alcohol para remover resina de la piel debido a que incrementa su velocidad de penetración. Usar agua y jabón.

Evitar su liberación al medio ambiente y al alcantarillado.

Descartar la resina y los elementos contaminados (viales, pipetas, tubos) polimerizados, en recipientes cerrados (cajas de cartón),

etiquetados y bajo campana. Polimerizar cuidadosamente todos los restos de resina antes de descartarlos.

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12. 1.1.11. Solución Formvar (resina de polivinil formal-dicloruro de etileno)

Tóxico. Irritante. Cancerígeno. Evitar el contacto con la piel y con los ojos. Se absorbe por inhalación y por ingestión. La exposición

prolongada puede causar dermatitis y/o conjuntivitis. Afecta a los riñones, el SNC, la córnea y el hígado.

Trabajar bajo campana. Emplear protección personal adecuada (protección respiratoria).

Manipular en ambientes ventilados.

Lavar las manos y la cara luego de emplearla. Quitarse las ropas contaminadas.

Almacenar en lugar fresco, seco y alejado de la luz solar. Separar de materiales oxidantes, agentes reductores, aluminio, aminas,

ácido nítrico, peróxidos orgánicos y soluciones alcalinas. La mezcla del polvo con el aire puede ser explosiva. Produce combustión

con monóxido de carbono, dióxido de carbono, formaldehido, ácido acético y acroleína.

Fácilmente inflamable. Evitar fuentes de ignición como el calor o las llamas.

Recoger los derrames inmediatamente con material absorbente inerte (vermiculita, arena o tierra).

Descartar el producto y los elementos contaminados en recipientes cerrados, rotulados y bajo campana.

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12.1.1.12.Tetróxido de osmio

Carcinogénico y teratogénico.

Altamente peligroso, volátil y reactivo. Su vapor es extremadamente riesgoso y posee límites de exposición muy bajos.

Trabajar bajo campana. Utilizar guantes de nitrilo, protección respiratoria y ocular.

Almacenarlo refrigerado, en los frascos originales y separado de las sustancias combustibles y reductoras.

Limpiar cuidadosamente el exterior de la ampolla con acetona antes de romperla, con el fin de remover cualquier contaminación.

Para preparar la solución de trabajo, verter la mezcla de tetróxido de osmio y agua en una botella de vidrio con tapón envuelto

con film y a su vez colocarla dentro de otra botella. Colocar la botella de vidrio exterior dentro de una tercera botella de plástico

opaco. Dejar bajo campana y después de doce horas, la solución está lista para usarse (disolución completa).

Verificar regularmente la botella que contiene la solución y reemplazar las envolturas del film, con el fin de evitar la fuga de los

vapores de tetróxido de osmio. En el caso que esto suceda, se observara un ennegrecimiento y se debe retirar inmediatamente el

recipiente hacia otro almacenamiento.

Descartar neutralizado con aceite vegetal (preferentemente de maíz), junto con el agua de lavado. Colocarlo en un frasco de vidrio

tapado bajo campana o bidón etiquetado. En aproximadamente dos días, se produce la reducción del osmio.

Utilizar material descartable o en su defecto dejar actuar el aceite y luego lavar con detergente y agua. Los objetos contaminados

(guantes, frascos vacíos) deben almacenarse de forma separada.

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12.1.1.13. Tetróxido de rutenio

Irritante de ojos, piel, vías respiratorias y tracto digestivo. Evitar el contacto con la piel, los ojos y la ropa. No inhalar los vapores.

Trabajar bajo campana. Emplear protección personal adecuada. Los guantes (neopreno, nitrilo, látex) deben controlarse antes de

su utilización y quitarse sin tocar la superficie exterior. En caso de formarse vapores/aerosoles, usar equipo respiratorio

adecuado.

Lavar las manos y la cara antes de las pausas y al finalizar el trabajo Quitarse las ropas contaminadas.

Asegurar una buena ventilación.

Almacenar en lugar fresco, seco y bien ventilado y en recipientes bien cerrados (no metálicos). En caso de incendio pueden

formarse vapores tóxicos de HCl.

No permitir el paso al sistema de desagües. Evitar la contaminación del suelo y el agua.

Recoger con materiales absorbentes (arena o tierra seca) y depositar en contenedores para su posterior eliminación. Limpiar los

restos con abundante agua. Neutralizar con solución de carbonato sódico.

Descartar neutralizado con sulfato de sodio al 10 % en frasco de vidrio bajo campana y bidón etiquetado. Los envases y

embalajes contaminados tendrán el mismo tratamiento que los propios productos contenidos.

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Fuentes de información:

http://iio.ens.uabc.mx/hojas-seguridad/alcohol_etilico.pdf

http://merck.com.ar

http://www.2spi.com.mx/catalog/chem/osmium-tetroxide.shtml

http://www.2spi.com.mx/catalog/chem/Uranyl_Acetate.shtml

http://www.aga.com.ar/International/Web/LG/VE/Likelgagave.nsf/repositorybyalias/pdf_msds_n/$file/Nitrogen.pdf

http://www.analytyka.com.mx/spanish/FDS/R/775994.htm

http://www.apolo.es/pdf/resifix/epoxipure.pdf

http://www.asociart.com.ar/Capacitacionasociart/documentos/Cartel_EPP.pdf

http://www.cicarelli.com

http://www.cisproquim.org.co/HOJAS_SEGURIDAD/Acido_acetico.pdf

http://www.corquiven.com.ve

http://www.emsdiasum.com/microscopy/technical/datasheet/safety.aspx

http://www.fichasdeseguridad.com

http://www.ilpi.com/MSDS

http://www.laddresearch.com/wsmsds/10835msds.pdf

http://www.mtas.es/insht

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74

http://www.pancanal.com/esp/legal/reglamentos/security/safety/116.pdf

http://www.proscitech.com.ar

http://www.scif.com/safety/safetymeeting/Article.asp?ArticleID=161

http://www.sigmaaldrich.com

http://www.tedpella.com/

1.2. Gases comprimidos y licuados

El manejo de cilindros constituye un riesgo para el trabajador debido a su considerable peso y/o tamaño, pudiendo generar lesiones

músculo-esqueléticas, aplastamiento, golpes, cortes, fracturas y sobre esfuerzo. Asimismo, puede generar explosiones e incendios.

Muchos gases empleados en el laboratorio, al ser envasados a altas presiones, pueden liberarse de forma repentina y dañar tejidos

humanos o producir que el cilindro caiga sobre una persona. Se debe tener siempre presente que la liberación del contenido de un

cilindro es una amenaza física y representa un peligro químico.

Todo cilindro es potencialmente explosivo

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El personal que manipula cilindros debe recibir capacitación permanente sobre los peligros y las acciones a seguir en caso de emergencia,

siendo ésta una práctica de vital importancia. Las reglas de seguridad que rigen a los cilindros llenos deben ser también aplicadas para los

cilindros vacíos. Entre ellas se destacan la utilización del equipo de protección personal (guantes industriales, anteojos de seguridad y

botas con puntera de acero); la señalización (“Prohibido fumar” y “Peligro explosión”) y protección del área de almacenamiento (daños

físicos, químicos y/o mecánicos); el manejo de matafuegos y su mantenimiento a cargo de personal calificado. Para casos que sean

necesarios debe emplearse protección respiratoria (máscara o equipos de respiración autónoma).

A continuación se enumeran algunas recomendaciones generales, con el fin de lograr una manipulación y un uso seguro de los tubos o

cilindros contenedores de gases:

Fijarlos individualmente a la pared empleando cadenas, correas o jaulas a aproximadamente las 2/3 partes de la altura del

cilindro.

Ante una eventual fuga: * se deben abrir todas las ventanas, * encender las campanas de extracción del laboratorio y * apagar las fuentes de ignición, especialmente si el contaminante es volátil e inflamable

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Rotularlos mediante una etiqueta impresa que identifique su contenido y el tipo de gas (la codificación por colores no se halla

estandarizada).

Manipularlos cuidadosamente, evitando caídas o golpes y libres de grasa o aceite (especialmente los de oxígeno). Los cilindros

que presentan fugas, daños o dificultades en el funcionamiento de la válvula no deben ser utilizados.

Almacenarlos en posición vertical, en espacios delimitados, secos, frescos y bien ventilados (puede ser a la intemperie, protegidos

de la humedad). Deben separarse los cilindros vacíos de los llenos (rotularlos como “Vacio”) y de materiales incompatibles,

fuentes de llama, calor o chispas. Retirarlos en orden de llegada.

Emplearlos lejos de fuentes de calor y en ambientes ventilados.

Trasladarlos en una carretilla, en posición vertical, atados y con sus válvulas cerradas. No se deben arrastrar, cargar, rodar ni

deslizar sobre el piso. Cada cilindro se debe mover individualmente.

Transportarlos en vehículos que aseguren una buena ventilación, separados de las personas, en una posición segura, atados y con

sus válvulas cerradas. El conductor debe estar informado sobre los riesgos potenciales y el proceder en caso de accidente. Nunca

deben ser transportados en baúles, compartimientos cerrados, cabinas o compartimientos de pasajeros.

Ajustar las válvulas de forma segura. Deben estar completamente abiertas o cerradas. Abrirlas lentamente y colocarse al costado

del cilindro. Cerrarlas luego de emplear el cilindro, antes de moverlo y cuando se encuentra vacío (se recomienda dejar una

presión residual).

Inspeccionar el sistema para escapes empleando agua jabonosa o productos o detectores específicos para el gas (no usar fósforos,

mecheros, aceites, grasas).

Jamás descargar el contenido del cilindro hacia las personas, equipos, fuentes de ignición, material incompatible o a la atmósfera.

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No usar adaptadores ni herramientas que generen chispas o calienten el cilindro. No forzar las roscas de conexión y no alterar los

dispositivos de seguridad.

En el laboratorio de microscopía, trabajamos actualmente con cuatro cilindros; dos conteniendo gases comprimidos: Argón

(evaporadora de metales) y Nitrógeno (microscopio electrónico de barrido) y dos conteniendo gases licuados: Dióxido de carbono

(secador por punto crítico) y Nitrógeno (criofractura y enfriamiento del detector del sistema de análisis elemental por rayos X, acoplado

al SEM). Las principales especificaciones de seguridad para cada uno de ellos se mencionan seguidamente:

12.1.2.1. Argón

Gas inerte. Asfixiante simple. Puede absorberse por inhalación.

A altas concentraciones en el aire puede producirse una deficiencia de oxígeno con riesgo de pérdida de conocimiento o muerte.

En exposiciones de corta duración, el líquido puede producir congelación.

12.1.2.2. Nitrógeno gaseoso

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Asfixiante simple. No tóxico.

La liberación de una gran cantidad en un área confinada podría desplazar la concentración de oxígeno necesario para mantener la

vida.

12.1.2.3. Dióxido de carbono líquido

Al producirse pérdidas en zonas confinadas, el líquido se evapora muy rápidamente originando una saturación total del aire y

produciendo congelación.

En estado líquido se condensa rápidamente para formar hielo seco el cual es extremadamente frío.

La exposición prolongada puede afectar al metabolismo.

Gas estable. Asfixiante y poderoso vasodilatador cerebral. Puede absorberse por inhalación y originar hiperventilación, pérdida de

conocimiento y muerte por deficiencia de oxígeno.

Al calor intenso produce humos tóxicos de monóxido de carbono.

A niveles de flujo rápido pueden generarse cargas electrostáticas y provocar una explosión en presencia de una mezcla

inflamable.

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12.1.2.4. Nitrógeno líquido

Líquido extremadamente frío. A – 150 ºC puede producir congelamiento y/o quemaduras en los tejidos expuestos.

Al producirse pérdidas, el líquido se evapora rápidamente originando una saturación total del aire y causando deficiencia de

oxígeno con riesgo de pérdida de conocimiento o muerte.

El contacto prolongado con la piel es muy nocivo. Nunca debe tocarse nada que haya sido congelado con nitrógeno líquido.

Gas asfixiante. Su gas puede absorberse por inhalación.

El gas puede reaccionar en presencia de chispas con oxígeno e hidrógeno dando lugar a la formación de óxido nítrico y amoníaco.

Trasvasar el contenido a un termo pequeño para trabajar en la mesada del laboratorio empleando la protección adecuada (cubrir

brazos, piernas y pies, usar protección ocular y guantes aislantes). En muchos casos el daño es menor si se manipula rápidamente

sin guantes debido a que puede alojarse dentro de ellos.

Manipular cuidadosamente el termo que contiene el nitrógeno líquido y tapar su boca con un material que permita el flujo de

nitrógeno hacia afuera y evite la entrada de aire y humedad.

Evitar la acumulación de sobrepresión dentro del termo.

Fuentes de información:

http://www.slideshare.net/cbastyle/gases-comprimidos-y-licuados

http://descom.jmc.utfsm.cl/cparitario/manipulacion%20de%20gas.htm

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12.1.3: Equipos

Nuestro servicio de microscopía electrónica cuenta con diversos equipos secundarios para la preparación de las muestras. Entre ellos

se encuentran: una microcentrífuga (Beckman, USA), un sonicador (Bransonic 221), un horno (Sybron OV 10600 Thermolyne Corp, USA),

un secador por punto crítico (E3000, Polaron), un ultramicrótomo (LKB Bromma 2088 ultratome V, Alemania) y dos evaporadoras de

metal en plasma de Argón (Sputter coater 91000 Pelco y Carbon coater SPI, USA). Cada uno de ellos debe ser operado cumpliendo ciertas

normas de seguridad inherentes a su funcionamiento. A continuación serán detalladas las principales.

12.1.3.1: Microcentrífuga

Para lograr un buen funcionamiento de las centrífugas es necesario aplicar las recomendaciones propuestas por el fabricante. Algunas

de ellas son:

Conocer los manuales de los rotores, equipo y tubos, antes de ser utilizados y cumplir con las indicaciones de uso, velocidad

máxima, densidad de muestras y cuidado especificados. En algunos laboratorios, es conveniente realizar un registro que contenga

los parámetros de operación.

Nunca se debe operar un equipo sin tener conocimiento previo de las instrucciones de uso y sin haber leído

cuidadosamente el manual de operación.

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Suministrar un voltaje estable y con capacidad adecuada al consumo del equipo y disponer de un ambiente limpio, libre de polvo,

con piso firme y nivelado.

La ocupación de la centrífuga debe realizarse de forma adecuada, con cargas balanceadas, para evitar vibraciones durante el

proceso de centrifugación y aumentar la preservación del rotor. Las cargas que poseen la misma masa o peso deben colocarse en

forma opuesta en el rotor.

El mecanismo de seguridad de la puerta debe ser controlado, así como el funcionamiento de los controles de tiempo y velocidad,

el freno de emergencia, la corriente eléctrica y la presencia de vibraciones.

Nunca se debe abrir la tapa de la centrífuga en funcionamiento ni tratar de detener el rotor con la mano. La tapa debe

permanecer cerrada durante todo el proceso de centrifugación, aún cuando se produzca la ruptura de alguna de las muestras.

La limpieza debe realizarse con un paño húmedo sobre la superficie externa e interna y luego realizar la misma operación para el

secado empleando un paño suave. Lavar el rotor inmediatamente en el caso de ocurrir derrames de sustancias corrosivas. Es

necesario mantener la centrífuga limpia, libre de restos de muestras, vidrios, polvo, etc.

Lubricar periódicamente las roscas y anillos, de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Es conveniente el uso de

repuestos originales del equipo. Si contiene recipientes metálicos, éstos no deben estar deformados debido a que producen una

presión no uniforme sobre el tubo, mientras que si los recipientes son de vidrio no deben contener grietas o ralladuras.

La rutina de mantenimiento depende de diversos factores como la frecuencia de uso, la capacitación de los usuarios, la corriente

eléctrica y las condiciones del ambiente en donde se halla colocada. Pueden ser mensuales o anuales. Mensualmente se debe

verificar la ausencia de polvo o manchas, el estado del mecanismo de los rotores y el cierre de la tapa. Anualmente se debe

comprobar el buen funcionamiento de los controles del equipo, el freno y la instalación eléctrica.

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12.1.3.2: Baño ultrasónico

Los baños utrasónicos poseen amplios usos en el laboratorio para la preparación de muestras, como la disrupción de células y la

dispersión de materiales particulados. Adicionalmente, la limpieza ultrasónica del material de laboratorio constituye un método rápido y

seguro para el lavado de la mayoría de los pequeños elementos empleados en microscopía electrónica (piezas del microscopio, tornillos,

grillas, etc). Mediante este procedimiento es posible remover una amplia variedad de contaminantes (residuos proteicos, aceites, grasas,

moho, etc), tanto de la superficie expuesta como de cavidades internas. Este tipo de limpieza resulta muy adecuada para el lavado de

materiales duros como vidrio, cerámica, metales y plásticos, siendo menos eficiente en materiales porosos y blandos, como goma y

fibras.

Los dos principales peligros asociados al sonicador son:

El daño causado por el sonido de alta frecuencia. Las ondas de sonido generadas escapan el rango normal de audición y el ruido

característico es producido por la cavitación del líquido dentro del contenedor de la muestra, pudiendo ser considerado como

riesgo acústico de contaminación sonora. Con el fin de evitar daños auditivos se recomienda usar tapones en los oídos y cerrar las

puertas del laboratorio donde se encuentra el sonicador.

La generación de aerosoles durante su funcionamiento. Siempre se debe operar el equipo utilizando los elementos de protección

personal (guantes, gafas y guardapolvo) y en el caso de emplear soluciones que desprendan vapores, el equipo debe ser operado

bajo campana, siguiendo las hojas de seguridad de cada sustancia y evitando el contacto con las mismas. Tapar los recipientes que

se están sonicando y esperar 5 minutos para destaparlos luego que el equipo se detiene.

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Para su correcto funcionamiento se requiere de cuidados especiales, considerando las precauciones y recomendaciones del

fabricante. Algunos consejos útiles son:

No accionar el sonicador en seco y emplear sólo soluciones de limpieza compatibles con el equipamiento, evitando los solventes o

líquidos inflamables.

Cargar con líquido el tanque a una distancia de 2 cm y medio por debajo del borde, evitando el rebalse.

No emplear otros recipientes ajenos el equipo y no colocar los objetos a limpiar directamente en el fondo del tanque, sino utilizar

el accesorio adecuado según el tamaño del mismo.

No tratar de repararlo y/o desarmarlo si no se halla calificado para tal fin.

Operar el equipo enchufado con la toma a tierra y no introducir las manos dentro del tanque limpiador.

Desconectar el equipo de la corriente antes del llenado o vaciado del tanque.

12.1.3.3: Horno y plato agitador/calefactor)

El horno y el plato calefactor del laboratorio son empleados frecuentemente a altas temperaturas con el fin de evaporar agua o

solventes (Figura 1). Las quemaduras, especialmente en las extremidades superiores, y otros daños pueden ocurrir cuando estos

dispositivos son manipulados incorrectamente.

El manual de operación suministrado por el fabricante debe ser leído, entendido y seguido por el operador antes de accionarlo. En la

práctica, no es recomendable emplear termómetros de mercurio para monitorear la temperatura del horno debido a que la ruptura

accidental producirá una rápida volatilización de su contenido.

Los hornos o platos calefactores requieren de ciertas condiciones de operación, entre ellas se encuentran:

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La temperatura ambiente (entre 0 ºC a 30 ºC).

La humedad relativa (50-80 %).

Las distancias recomendadas entre la pared y el techo, etc.

Figura 1. Horno (http://www.hitechtrader.com).

Además de operarlo empleando protección personal (en base a la sustancia que se esta manipulando), es necesario contar con una

buena instalación eléctrica. Un mal uso puede deteriorar al equipo así como producir serios daños personales.

Recomendaciones:

Mantener el dispositivo limpio y seco.

Desenchufar la unidad para su limpieza (emplear limpiadores no abrasivos).

Nunca sumergirlo en agua.

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Desenchufar inmediatamente la unidad ante el derrame o caída de material dentro de la misma. Recoger el material siguiendo las

recomendaciones de seguridad de cada sustancia.

Conocer el peso límite que soporta. Si bien su parte superior cerámica es resistente a ralladuras, corrosión y químicos, ésta puede

romperse ante un alto impacto.

Nunca calentar recipientes sellados ni calentar o agitar sustancias volátiles o inflamables o emplear el equipo en lugares próximos

a ellas.

Ubicar el horno en un lugar seguro, alejado de fuentes de combustión.

Evitar el uso de materiales metálicos sobre la placa calefactora.

Colocar los recipientes que contienen las sustancias en el centro del plato. En el caso que se empleen recipientes poco estables,

será necesario el uso de dispositivos que lo fijen en su lugar (pinzas, soportes). El tamaño de los recipientes no debe ser mayor al

del plato que lo sostiene.

Agitar a bajas revoluciones los materiales con alta viscosidad con el fin de evitar salpicaduras y proyecciones hacia el operador. La

viscosidad del material que se coloca en el agitador debe ser tenida en cuenta, debido a que afectará al magnetismo entre el imán

del agitador y el del plato calefactor.

Luego de emplear el plato calefactor, éste permanece caliente durante un tiempo, aunque el botón de temperatura se encuentre

completamente apagado. La manipulación debe realizarse cuando el dispositivo se encuentre a temperatura ambiente.

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Fuentes de información:

http://www.labx.com/v2/spiderdealer2/vistaSearchDetails.cfm?LVid=20895799#MoreDesc

http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ac60335a732

http://www.industrycortex.com/datasheets/profile/18844952/digital-hot-plates-stirring-hot-plates-stirrers-with-digital-di

http://ebookbrowse.com/hot-plate-and-oven-cleaner-pdf-d406961159

12.1.3.4: Secador por punto critico

El secador por punto crítico es un dispositivo que emplea presiones en el rango de los 800 a 2000 psi. La alta presión que alcanza es

potencialmente peligrosa debido a que se pueden generar proyectiles ante la ruptura del cristal de cuarzo de la ventana. Las cámaras que

posee el equipo están probadas a niveles de presión superiores a los que son sometidas y algunas unidades están protegidas mediante

discos de ruptura. Sin embargo, la secadora de punto crítico (también llamada “bomba de presión”) constituye un peligro potencial tanto

para el operador como así también para las personas que se encuentran a su alrededor.

Recomendaciones:

Conocer y cumplir con las recomendaciones del fabricante.

Examinar la ventana de cuarzo antes de cada uso con el fin de asegurar la ausencia de grietas. Nunca remover la protección de la

misma (si posee).

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Nunca mirar directamente hacia la ventana. Emplear un espejo.

Examinar diariamente la unidad en busca de fugas en válvulas, sellos, etc.

Mantener bien cerradas las cámaras durante su empleo, controlar la temperatura y la presión del CO2, cuidando que esta última

no se dispare cuando el CO2 pasa al estado gaseoso.

Colocar el equipo dentro de una campana (idealmente) o proveerle una protección adecuada ante la ocasional explosión del

mismo, como por ejemplo una jaula metálica (Figura 2).

Figura 2. Secador por punto crítico.

Estos equipos no poseen esencialmente partes móviles, a excepción del ocasional reemplazo de “O” rings o sellos. En algunos modelos,

las válvulas de entrada y salida pueden ser controladas manualmente, y la ventana permite ver lo que sucede en el interior. Si se emplea

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agua caliente como control de temperatura (en lugar de un calentador eléctrico), el riesgo de sobrecalentamiento y sobrepresión de la

cámara puede reducirse debido a la temperatura límite impuesta por el agua.

Si es necesario emplear solventes diferentes del CO2, como en la preparación de materiales inorgánicos, se debe tener en cuenta las

consideraciones especiales de cada solvente; aunque la mayoría de las secadoras se encuentran preparadas para soportar solventes más

agresivos. Los químicos potencialmente peligrosos, deben ser manipulados según sus hojas de seguridad.

Recordar siempre que una inadecuada operación del equipo puede ocasionar serios daños o hasta la muerte.

Fuentes de información:

Instruction Manual, Polaron Equipment Limited, 1984, Watford, England.

http://www.usask.ca/biology/scopes/CDP%20instruction.html

http://www.polaron-range.com/

http://www.quorumtech.com/pdf/criticalPointDrying/CPD_technical_brief.pdf

http://www3.ncc.edu/faculty/BIO/becks/Path3f/EM_Manual.pdf

http://www.sunysb.edu/facilities/ehs/lab/cs.shtml

http://www.2spi.es/catalog/instruments/critical-point-dryer.shtml

12.1.3.5: Ultramicrótomo

El empleo del ultramicrótomo requiere de personal capacitado y entrenado para cada modelo específico. Debido a los peligros asociados,

se deben tomar precauciones en cada paso del proceso para proteger, especialmente, las manos y los dedos del operador y prevenir la

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exposición innecesaria a solventes y/o material biológico. Se recomienda la consulta del manual del equipo para realizar su

mantenimiento, procurar un uso adecuado e informarse sobre el manejo seguro.

Recomendaciones:

Las cuchillas deben ser manipuladas cuidadosamente cuando son removidas o instaladas. Dependiendo del material, algunas

pueden atravesar hasta el calzado si caen de punta. Asimismo, deben almacenarse en cajas especiales para cuchillas, las cuales

poseen guías para mantenerlas paradas y una tapa para evitar cortes. Al emplear el ultramicrotomo, deben ser colocadas después

de la muestra y el freno del equipo debe estar asegurado para evitar que se libere sobre la mano del operador.

La limpieza de las cuchillas debe realizarse regularmente para evitar marcas por compresión, empleando una barra de poliestireno

y evitado su contacto con los dedos.

Para retirar los cortes del bote con agua se debe emplear un ansa o elementos que posean un cabo para su manipulación, con el

fin de mantener los dedos fuera de las partes móviles del ultramicrotomo.

Si el laboratorio también cuenta con el equipo generador de cuchillas, partiendo de la ruptura de una barra de vidrio, ésta debe

ser manipulada con guantes durante el lavado y la fractura.

El tallado del taco de resina, previo al uso del ultramicrótomo, también debe realizarse con sumo cuidado. Se deben emplear hojas de

afeitar nuevas y prestar especial atención a los ángulos de corte y a la fuerza aplicada. El taco debe estar fijo en su soporte para poderlo

trabajar y la resina debería poseer una consistencia firme como sostén de la muestra pero manejable para ser tallada. Asimismo, algunos

restos de resina pueden proyectarse hacia los ojos durante el tallado, recomendando el uso de antiparras o gafas de seguridad.

Para la manipulación de sustancias químicas se deben consultar las hojas de seguridad y si existe contacto con material biológico

potencialmente contaminante, deben seguirse los recaudos necesarios para cada caso.

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Fuentes de información:

http://www.bcbiolibrary.icapture.ubc.ca/pathologists-

researchers/docs/BL.LAB.GN.001.01%20Sectioning%20of%20Paraffin%20Embedded%20Tissue.pdf

http://ehs.unl.edu/sop/s-microtome_safety.pdf

12.1.3.6: Evaporación de metales

La evaporación de metales en atmósfera de plasma de argón y en alto vacío posee sus ventajas y desventajas. El manejo y el

mantenimiento de ambos equipos se asemejan y por ello son considerados aquí como uno.

Recomendaciones:

Mantener limpia la cámara. Es conveniente frotar suavemente la parte vítrea con un paño humedecido en agua jabonosa y luego

secarla. También pueden usarse solventes, aunque constituyen una opción menos saludable y más costosa.

Las partes metálicas pueden ser lavadas con alcohol isopropílico en reemplazo de la acetona, con el fin de reducir la generación

de vapores y mejorar el vacío de la cámara.

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Asegurarse siempre que el equipo este seco y que la bomba de vacío funcione correctamente antes de colocar las muestras, para

evitar su contaminación y una deficiente deposición del metal. La mayoría de los equipos poseen una bomba que mantiene el

vacío aun cuando se hallan apagados. La falla sobre este sistema aumenta el riesgo de retrosucción de los hidrocarburos

provenientes del aceite de la bomba sobre la cámara, aumentando la contaminación. Por ello resulta necesario controlar las

bombas regularmente por personal capacitado.

La contaminación del filtro y del aceite depende de la frecuencia de uso y del tipo de muestras que se procesen dentro del equipo.

Es recomendable cambiar el aceite por lo menos una vez al año. El aceite viejo adquiere un color amarillo oscuro o marrón,

mientras que el aceite nuevo posee un aspecto transparente, incoloro o ligeramente amarillento.

Al manipular el equipo se recomienda el uso de guardapolvo, gafas de seguridad y guantes. En algunas personas se puede

producir sensibilidad, irritación mecánica o reacción alérgica al mantener contacto con metales (dermatitis, rash cutáneo). En el

caso de emplear carbón, también es necesario usar protección respiratoria y trabajar bajo campana debido a que la inhalación de

las fibras o del polvo puede ser peligrosa para la salud. Asimismo, se debe evitar mirar a ojo desnudo la cámara cuando se evapora

el metal, debido a que el brillo intenso que se produce cuando está en funcionamiento puede dañar la retina.

Algunos equipos emplean un gas inerte y de alta pureza para asegurar un rápido recubrimiento y un buen tiempo de vacío.

Generalmente el gas Argón cumple con estos requisitos debido a su relativamente elevado peso atómico y a su disponibilidad en

el mercado. La entrada del gas a la cámara debe ser suave y en todo momento se debe evitar forzar las válvulas. Un mal manejo

de la válvula del cilindro puede dañarla y producir una entrada brusca de gas.

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Fuentes de información:

http://www.emsdiasum.com/microscopy/technical/datasheet/sputter_coating.aspx

http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/equipment/carbon_coater.aspx

http://www.2spi.com/catalog/msds/msds01701.html

http://users.ece.gatech.edu/~alan/ECE6450/Lectures/ECE6450L12-Physical%20Deposition.pdf

12.1.4: Microscopios electrónicos

En algunos laboratorios de microscopía electrónica de nuestro país, incluyendo el nuestro, existen actualmente instrumentos antiguos

(adquiridos hace mas de 30 años) que son empleados cotidianamente. Estos equipos no son tan estables como los nuevos y por ello

requieren de una frecuente limpieza y mantenimiento. En comparación, los equipos nuevos poseen una mayor estabilidad,

principalmente en el sistema de lentes y el sistema de vacío. Muchos microscopios cuentan con una cobertura y/o garantía suministrada

por parte de la compañía vendedora al momento de la compra, la cual incluye la asistencia técnica. El correcto uso y el frecuente

mantenimiento de los microscopios a partir del momento de su adquisición, es una buena práctica para prolongar su vida útil y mejorar el

funcionamiento diario.

A continuación se enumeran algunos factores a tener en cuenta para realizar un manejo seguro de los microscopios electrónicos:

Los rayos X que son emitidos durante el uso del microscopio no deberían constituir un inconveniente, siempre que el instrumento

sea empleado adecuadamente y se halle dentro de los estándares de emisión. Los microscopios modernos se hallan diseñados

como seguros aunque no se debe olvidar que el instrumento constituye un peligro potencial debido a los niveles de radiación que

genera. Si el sellado del equipo es deficiente, la emisión de rayos-X por el haz de electrones puede alcanzar y dañar al operador

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durante el empleo repetido del microscopio. El fabricante debe asegurar la protección total de los usuarios evitando pérdidas de

radiación, siendo conveniente la inspección regular de la columna del equipo. Nunca se debe modificar la estructura del

microscopio y se debe llevar a cabo la rutina de fuga de radiación periódicamente. No es recomendable operar un equipo que

exhiba fisuras (principalmente en la ventana de observación) o sin la primera apertura condensadora colocada. La presencia de

fugas puede manifestarse cuando alguna unidad de la columna fue removida (excluyendo la operación de cambio de filamento) y

en este caso debe evitarse el uso del microscopio. Cuando es detectada alguna falla en el funcionamiento del equipo, se debe

parar su operación y llamar al técnico calificado para prestar asistencia. Este procedimiento constituye una manera de prevenir

accidentes, daños al microscopio y reducir los costos debido a operaciones deficientes.

La mayoría de los problemas de salud asociados al manejo de microscopios electrónicos se presenta en los operarios que emplean

largas horas en la observación de especímenes. La escasez de luz en la habitación donde se halla el microscopio, los prolongados

turnos (mayores de tres horas) y/o las altas magnificaciones durante la observación, contribuyen a la fatiga visual y al progresivo

deterioro de la vista del operador. Los riesgos ergonómicos asociados a la mala postura, la gran cantidad de tiempo sentado y el

manejo del teclado, mouse y/o joystick son causa de enfermedades asociadas a los microscopios. Una postura incorrecta puede

ocasionar desórdenes músculo-esqueléticos produciendo dolor en hombros, cintura, brazos, cuello o muñecas. Los movimientos

repetitivos realizados durante el manejo del microscopio pueden causar daños en las extremidades superiores como el síndrome

del túnel carpiano. Estos peligros pueden reducirse mediante la adopción de medidas preventivas. La toma de descansos cortos

cada media hora es recomendable para combatir la fatiga ocular y postural. Asimismo la reducción del brillo de la pantalla del

monitor y el contraste entre la pantalla del microscopio y la luz ambiental ayuda al cuidado ocular cotidiano de los operadores.

El cambio de filamentos es un proceso crítico que debe ser realizado con precaución para evitar quemaduras y descargas

eléctricas. Se recomienda el empleo de guantes de gamuza para protegerse de la alta temperatura alcanzada por el cátodo y una

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especial atención al alto voltaje generado en la cámara. La maniobra del cambio de filamento en sí misma debe desarrollarse de

manera segura. En algunos modelos de microscopios el cañón se halla ubicado en altura, siendo imprescindible el empleo de una

escalera y evitando el uso de sillas u otros objetos de escasa estabilidad.

Es de vital importancia conocer las conexiones eléctricas que posee el microscopio y asegurarse que al momento de realizar

reparaciones se encuentren cortadas. La desconexión total del microscopio consiste en un buen primer paso para realizar los

mantenimientos de rutina o solucionar problemas técnicos.

Como en cualquier procedimiento que exponga al operador a algún tipo de peligro, es conveniente la presencia de otra persona

cercana para pedir auxilio en el caso de ser necesario.

Las sales de uranio, utilizadas frecuentemente para el contraste de estructuras biológicas (acetato de uranilo), constituyen una

fuente de radiación . En este caso además de consultar y seguir las recomendaciones de las hojas de seguridad, es necesario

implementar un protocolo de trabajo adecuado que contemple el menor tiempo posible de exposición con la menor cantidad de

reactivo.

Muchos equipos utilizan nitrógeno líquido para operar, en particular los que poseen detectores que deben ser refrigerados de

esta manera, siendo necesario el empleo de la protección adecuada para su manipulación. Adicionalmente, el detector en sí

mismo también pude ser un peligro potencial, ocasionando lesiones en el operador dependiendo de su posición, tamaño y lugar

que ocupe en el microscopio.

Los humos y vapores emitidos durante el funcionamiento de las bombas rotatorias también deben ser considerados debido a que

pueden generar productos cancerígenos y/o contaminantes. Con el fin de evitarlos es necesario revisar periódicamente el aceite y

el filtro de las mismas y cambiarlos en el caso que se encuentren contaminados. Es recomendable colocar mangueras en las bocas

de las bombas de manera tal que estos productos de combustión sean evacuados dentro de campanas de extracción.

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La cámara en donde se coloca la muestra, principalmente en los microscopios electrónicos de barrido, requiere de cierta

precaución debido a que es posible tener contacto con alto voltaje (en el caso que existan problemas en el equipo). En

condiciones seguras, cuando el aire ingresa a la cámara, el alto voltaje debería ser automáticamente apagado.

El mantenimiento del microscopio también requiere de ciertos cuidados, en particular cuando se realiza la limpieza de las piezas.

El uso de cremas de pulir y solventes debe ser considerado como potencialmente peligroso y deben emplearse siguiendo las

recomendaciones que figuran en las hojas de seguridad correspondientes.

El derrame de líquidos sobre el microscopio puede causar cortocircuitos y descargas eléctricas, las cuales exponen al peligro tanto

al operador como al equipo. Se debe evitar posar recipientes con líquidos cerca de los controles del microscopio como vasos con

agua o refrescos, tazas con té o café, etc.

Fuentes de información:

http://www.aiha.org

http://www.emcourses.com/safety.htm

http://www.ammrf.org.au/myscope/sem/practice/safety/hazards.php

http://www.ehow.com/list_7319635_hazards-handling-microscope.html

http://www.ammrf.org.au/myscope/sem/practice/safety/example2.php

http://www.ammrf.org.au/myscope/sem/practice/safety/hazards.php

Racker, Darlene K. Transmission Electron Microscopy. Methods of Application. (1983) Charles C. Thomas – Publisher.

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12.1.5: Manipulación, transporte y envío de muestras y productos químicos

El manejo y transporte inadecuado de muestras biológicas o sustancias químicas no sólo significa un riesgo para el bienestar de las

personas que trabajan en el laboratorio, sino también para todos los ciudadanos y para la conservación del planeta.

Existen diferentes reglamentaciones que regulan el transporte de muestras y productos químicos por vía aérea (WHO: World Health

Organization, IATA: International Air Transport Association, ICAO: International Civil Aviation Organization) o terrestre (IRAM: Instituto

Argentino de Normalización y Certificación, ANMAT: Administración Nacional de Medicamentos, Alimentos y Tecnología, SENASA:

Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria). Las mismas, dividen a las sustancias en diferentes clases según sus

características predominantes (químicas, radioactivas, tóxicas, infecciosas, etc.). Asimismo, dentro de estas clases existen categorías, por

ejemplo para las sustancias infecciosas, donde se describen especificaciones como el tipo de embalaje, la documentación requerida, etc.

En el laboratorio de microscopía electrónica, es necesario tener especial cuidado con la manipulación de las muestras cuando éstas

llegan a destino. Siempre se debe tener la precaución de conocer específicamente de qué muestra se trata y en qué medio se encuentra.

Los tubos y frascos, preferentemente de plástico, deben ser enviados cerrados y en posición vertical para evitar derrames. Los recipientes

de vidrio deben colocarse dentro de recipientes plásticos o de Telgopor , con el objeto de contener los pedazos pequeños ante una

eventual ruptura. Las muestras que necesiten refrigeración deben colocarse en recipientes que garanticen la conservación de la cadena

de frío y rodeadas de geles refrigerantes. Además, es recomendable colocar material absorbente en los alrededores para contener los

posibles derrames. La recepción de agentes patógenos potencialmente activos debe ser evitada en aquellos laboratorios que, como el

nuestro, no se encuentran preparados para recibir ese tipo de muestras.

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Fuentes de información:

http://www.habitat-ecologico.com.ar/

http://www.desleronline.com/html/espanol/ipes/ipes_centro_ipes.html

12.1.6: Gestión de residuos

La generación de residuos, independientemente del volumen generado, es inherente a cualquier laboratorio y por ello no debe ser

minimizada. Los residuos químicos, si no son tratados adecuadamente, pueden constituir una amenaza para la salud de los trabajadores,

de la comunidad y para el medioambiente.

El tratamiento y la gestión de los residuos obedecen a las características, peligrosidad y posibilidad de recuperación de los mismos.

Los residuos pueden clasificarse como inocuos (desechos domiciliarios) o peligrosos (residuos con riesgo biológico o químico). Para cada

uno de ellos existe un código de colores de las bolsas de desecho, en base al riesgo potencial que engloban, pudiendo ser depositados en

distintos contenedores: riesgo biológico en bolsa roja, riesgo químico en bolsa amarilla (o azul) o sin riesgo, en bolsa negra. Existen

diferentes métodos de tratamiento de residuos: incineración, por procesos térmicos (calor húmedo o calor seco), procesos químicos

(cloro, O3), procesos biológicos (enzimas) o irradiación (UV, Co 60). Los residuos patogénicos con riesgo biológico infeccioso deben poseer

como destino final un tratamiento que destruya toda actividad biológica (esterilización). Si son sólidos deben descartarse directamente

en recipientes que contengan bolsa roja; si son líquidos deben recolectarse en envases de paredes rígidas conteniendo lavandina (5 g/L) y

luego de esperar una hora como mínimo, descartar el envase tapado en un recipiente con bolsa roja. Los residuos de riesgo químico

sólidos deben ser descartados en bolsas amarillas y ser tratados como residuos industriales. Los líquidos deben ser recolectados en

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bidones, respetando la reactividad de cada sustancia e indicar siempre el contenido del bidón. Ambos tipos de residuos pueden necesitar

ser neutralizados antes de su descarte. Es recomendable conocer la información contenida en las hojas de seguridad de cada sustancia.

Los contenedores de residuos peligrosos deben estar perfectamente identificados y ubicarse en zonas de poco tránsito y alejados de

fuentes de calor. Nunca deben presentar derrames o fugas o estar deteriorados.

Los objetos corto-punzantes deben descartarse en recipientes de paredes rígidas, con tapa sellada y preferiblemente que no puedan

ser reabiertos. Los vidrios rotos u objetos filosos de mayor tamaño deben ser colocados en cajas con envoltorios de protección como

bolsas, papeles, etc. Siempre es necesario rotularlos y se descartarán en base al riesgo que posea el material con el cual estuvieron en

contacto.

En el Centro Científico Tecnológico Bahía Blanca, los residuos patológicos son retirados mensualmente por una empresa que se

encarga de los servicios de recolección, transporte, tratamiento (autoclave o incineración) y disposición final (rellenos sanitarios o de

seguridad). Los residuos químicos son recogidos por otra empresa, en relación al flujo generado (2.000 L o 1.500 kg sólidos). La frecuencia

de recolección se estima cada seis meses a un año en función del volumen acumulado. Allí los residuos son procesados, redestinados o

tratados para su disposición final como residuos industriales. Existen algunos compuestos altamente contaminantes, como tetróxido de

osmio y tetróxido de rutenio, que no son recolectados debido a que actualmente ninguna empresa se encarga de su transporte y/o

disposición. Adicionalmente, en el Centro se realizan muestreos periódicos de los efluentes de las piletas de laboratorios químicos a fin

de determinar las concentraciones de los principales contaminantes.

Con respecto a la disposición de residuos, en el Centro Científico Tecnológico Bahía Blanca el ente regulador es el Organismo

Provincial para el Desarrollo Sostenible (OPDS). Este organismo posee la facultad de emitir un certificado de aprobación cuando el

proceso de tratamiento de residuos concluye, el cual omite de toda responsabilidad al generador del mismo, quien hasta el momento

debe responder por ellos.

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Una conducta responsable a seguir por parte de los trabajadores, consiste en

sustituir las sustancias peligrosas por otras menos nocivas, modificando los

protocolos de trabajo y disminuyendo al mínimo el volumen empleado y la

frecuencia de uso. Asimismo, la adquisición de sustancias peligrosas debe ser

estrictamente vigilada con el fin de reducir su stock y evitar su innecesaria

manipulación.

La higiene del laboratorio también debe ser considerada, siendo conveniente

realizarla una vez por día y luego de un derrame. Se recomienda el empleo del

lampazo o de elementos que no generen polvo y evitar el uso de escobas,

escobillones y plumeros. Además, es necesario contar con un equipo de limpieza

accesible ante un eventual derrame, como toallas, envases para descartes, etc.

1- Identificación del peligro.

2-Aviso de la situación de

emergencia.

3-Movilización del coordinador o

líder del sector.

4- Llamada de emergencia (911).

5-Corte de suministro de gas y

electricidad.

6- Apertura de salidas de

emergencia

7- Coordinación de la evacuación.

8- Recuento de personas en el

punto de reunión.

9- Informe de la situación a

servidores públicos, servicio de

emergencia, etc.

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12.1.7: Emergencia

Las tareas habituales dentro del laboratorio químico y particularmente en nuestro servicio de microscopía electrónica, involucra la

utilización de productos químicos y protocolos de trabajo muy diversos, en base a las distintas muestras en estudio. Es por ello que ante

una falla o incumplimiento de las medidas de prevención, es muy probable que exista una emergencia. Las emergencias más comunes en

el laboratorio incluyen incendio, fuga de gases y accidentes personales. Si el empleo de los elementos apropiados para combatir la

emergencia (mantas ignífugas, extintores, duchas de seguridad, sistema lavaojos, neutralizadores) no son suficientes, entonces se debe

aplicar un plan de evacuación. El mismo consiste en desalojar a todo el personal hacia un lugar seguro en el menor tiempo posible (desde

que se detecta la emergencia hasta que alcanzan el punto de reunión), y puede describirse según las siguientes etapas:

Con el fin de lograr un exitoso plan de evacuación, previamente se deben distribuir

1) los roles de evacuación de cada uno de los integrantes del laboratorio.

2) Individualmente, cada persona debe conocer el plan de evacuación, las vías de escape y los medios de extinción con los que cuenta.

3). Asimismo debe comprometerse a dar aviso de la emergencia al encargado del sector.

4). Cada sector deberá contar con un líder que conozca la cantidad de personas (y en lo posible sus horarios) que se desempeñan en el

laboratorio y

5). Será encargado de coordinar la evacuación,

6). Activar el plan de emergencia .

7). informar a los servidores públicos.

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Existen consignas a seguir durante la evacuación, las cuales facilitan notablemente el desalojo del personal. Entre ellas se encuentran:

A) Suspender inmediatamente las actividades,

B) dirigirse hacia las vías de evacuación más cercanas,

C) Actuar con calma pero con decisión (evitar el pánico, no gritar),

D) Atender las indicaciones del líder del sector,

E) Caminar rápido (no correr),

F) Usar las escaleras (bajar siempre),

G) No retornar,

H) No detenerse,

I) Contar a las personas del sector y

J) Colaborar con las autoridades.

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La implementación de simulacros de evacuación regulares es altamente recomendable ya que permite no sólo entrenar a los empleados

ante una posible emergencia, sino que también contribuye a detectar y reparar las

posibles falencias del procedimiento.

Ante la presencia de un accidentado o una emergencia médica, es conveniente capacitar al personal para que realice

los primeros auxilios hasta que arribe al lugar del siniestro la asistencia médica.

Como norma general no se debe mover al accidentado ni suministrarle agua, alimentos o

medicamentos. Se debe tratar de mantenerlo caliente, en un lugar protegido y verificar que este consiente,

respirando y con pulso.

Ante un accidente de trabajo dentro del Centro Científico Tecnológico Bahía Blanca, se deberá llamar al servicio de emergencia contratado y completar la planilla de accidente laboral (denuncia), realizando copias para el empleador (CONICET), el prestador del servicio (ART) y el centro de derivación (convenio con hospitales, especialistas, centros de medicina laboral, etc

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Debido a la existencia de un convenio entre el empleador (CONICET) y la Aseguradora Riesgos de Trabajo (ART), TODOS los trabajadores

(becarios, investigadores, personal de planta permanente o transitoria, etc) se hallan cubiertos. Cada empleado posee una credencial de

la ART donde figuran sus datos personales y del empleador. La cobertura incluye accidente laboral dentro del lugar de trabajo, accidente

in itinere y enfermedad laboral. Para este último caso debe documentarse la encuesta de exposición anual del empleado y los debidos

exámenes donde coste su exposición a los diferentes agentes: físicos, químicos y/o biológicos. Si fuera necesario, y en cualquiera de los

casos, es posible iniciar una licencia laboral.

Fuentes de información:

http://www.gruposancorseguros.com/web/ES/preguntasfrecuentes_gss.aspx

Plan de Evacuación. Arrieta & Madies S.A. consultora en Ingeniería.

12.1.8: Marco legal

Resulta conveniente conocer las leyes que regulan aspectos esenciales para el manejo de sustancias peligrosas como la clasificación

de los residuos, el transporte, los operadores, las empresas y los requerimientos necesarios para las habilitaciones. A modo informativo

sólo se mencionará que existen leyes y normas dentro de la Constitución Nacional y Provincial, ordenanzas municipales, del Ministerio de

Salud, asociaciones médicas, institucionales y contratos, así como leyes de higiene y seguridad, de riesgos del trabajo, resoluciones, etc.

Para obtener una información mas minuciosa de la guía de análisis de riesgo, se recomienda la lectura de: Normas nacionales e

internacionales (IRAM 3800, BS 8800), Ley nacional de higiene y seguridad en el trabajo Nº 19587, Decreto reglamentario Nº 351/79 y

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04

Resolución Nº 1069/91, Ley nacional de accidentes de trabajo Nº 24028, Leyes y reglamentaciones provinciales y municipales y Convenios

colectivos de trabajo vigentes para la actividad media sanatorial.

Fuentes de información:

http://www.fcen.uba.ar http://www.guindo.pntic.mec.es http://www.icv.csic.es http://www.personal.us.es http://www.quiminet.com http://www.swisscontact.bo http://www.unirioja.es http://www.webs.uvigo.es http://www.odon.uba.ar http://www.opds.gba.gov.ar/ Manual de H&S en el Laboratorio C.I.F – Servicio de prevención de Riesgos Laborales. Ing. Pedro D. Villagrán – Departamento de

Mantenimiento.

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APÉNDICE I: Soluciones de trabajo y reactivos necesarios.

Dra. Alfonsina Morales y Prof. Viviana Sorrivas

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A1). Tinción para observar secciones gruesas en el microscopio óptico

A2). Para contraste de secciones ultrafinas:

Solución de azul de toluidina en borato de sodio Azul de toluidina ---------------------- 1g

Borato de sodio ---------------------- 1g Agua destilada (c.n.p.)------------------- 100 ml.

citrato de plomo: Agua destilada (recién hervida 10 min) 25 ml. NaOH 0.1-0.2 g Citrato de plomo 0.18 g

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A3). Fijadores

A3.a). Paraformaldehído

Solución stock acuosa (extemporánea): por ej. al 40%.(o cualquier múltiplo de 4, como 16%) .

Calentar a 65 °C agitando bajo campana hasta disolver totalmente.

Aclarar con gotas de NaOH 0.1 N. Enfriar.

Se puede alicuotar y congelar.

Al usar se diluye con buffer hasta el 4 % (1:10) y controlar el pH.

Si se deja la muestra mucho tiempo conviene usarlo al 8%.

Si se va a preparar en el momento: solución tamponada al 5%.

Calentar 45 ml de buffer fosfato o cacodilato 0.2 M, pH 7,4, a 65°C.

Agregar 2.5 g PFA, agitar bajo campana.

Aclarar con gotas de NaOH 1N. Enfriar.

Llevar al 50 ml.

Solución saturada de acetato de uranilo (2%)

Acetato de uranilo 1g

Agua destilada (c.n.p.)

50ml.

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A3.b). Glutaraldehído en buffer Sorensen 4 % (pH 7.25)

GA 25 % 16 mL

NaH2PO2.H2O 0.74 g

Na2HPO4.12H2O 5.52 g

AD (cnp) 100 mL

Karnovsky Paraformaldehído2%- glutaraldehído 2 % Buffer 0.2 M...........50 ml PFA 8%.................…25 ml GA 25%……………… 8 ml AD………………………17 ml

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Karnovsky modificado Paraformaldehído – Glutaraldehído

Buffer fosfato o cacodilato 0.2 M (pH 7.4)

50 mL

Paraformaldehído 10 % en agua

20 mL

Glutaraldehído 25 % en agua

10 mL

AD (cnp) 100 mL

Para preparar 20 mL de paraformaldehído 10 %,

disolver 2 g de paraformaldehído en 20 ml de AD y calentar a 60-65 ºC bajo campana. Agregar NaOH 1 N de a gotas hasta que la solución se aclare. Dejar enfriar la solución antes de usarla.

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A3.c) .Formalina – Ácido acético – Alcohol (FAA)

Para Microscopía Electrónica de

BarridoAlcohol etílico (50 %)

90 mL

Ácido acético glacial 5 mL

Formaldehído (40 %) 5 mL

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A3.d) Tetróxido de osmio 2%:

El osmio se vende en solución o en cristales de 1 y 0.5 gr en ampollas de vidrio.

Para preparar la solución es importante lavar bien las ampollas y enjuagarlas en agua destilada. Se puede disolver el cristal dentro de la ampolla porque funde a 40ºC. Se abre la ampolla bajo campana y se sumerge entera en agua destilada ya medida en un frasco de vidrio color caramelo. El frasco debe estar limpio, tratado con lavandina y muy bien enjuagado. Tendrá una tapa hermética (sus vapores atraviesan el plástico). Se deja un día hasta que se disuelva el cristal, aunque se puede acelerar con ultrasonido y calentando hasta 60ºC (CUIDADO!!). Se debe descartar la solución cuando presenta un color gris. Para descartar el osmio se usa aceite vegetal (mejor de maíz) en un frasco bajo campana por 2 días. Se comprueba que el osmio ha sido reducido totalmente colocando una gota de esta muestra en un papel de filtro también embebido en aceite: si se pone negro todavía está activo.

Tetróxido de osmio

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A.4. Soluciones Tampón

A4. a). Sorensen

Ajustar el pH según la siguiente Tabla:

MgCl2 2 mM (agregarlo en el momento de utilizarlo)

pH A (mL) B (mL)

6.0 1.4 8.6

6.2 2.0 8.0

6.4 3.0 7.0

6.6 4.0 6.0

6.8 5.0 5.0

7.0 6.1 3.9

7.2 7.0 3.0

7.4 7.8 2.2

7.6 8.5 1.5

7.8 9.1 0.9

Fosfato 0.067 M

Soluciones stock: A: Na2HPO4.12H2O __________ 5.97 g

AD (cnp) __________ 250 mL

B: Na H2PO4.2H2O __________ 2.61 g

AD (cnp) __________ 250 mL

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A4. b) cacodilato de sodio 0.4 M

Na(CH3)2AsO3.3H2O __________ 21.4 g

AD (cnp) ___________________ 250 mL Ajustar el pH con HCl

A5. Soluciones para contraste

A5.a) Acetato de uranilo

Preparar la Solución de acetato de uranilo en forma acuosa al 2 % (con AD y hervida).

A5.b) Citrato de plomo

AD hervida 10 minutos y filtrada 50 mL

NaOH 1 lenteja (0.1-0.2 g)

Citrato de plomo 0.25 g

Controlar el pH final a 11.2. Centrifugar antes de usar. Mantener en heladera en frasco de cierre hermético.

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A5. c) Solución de K2MnO4

Hacer solución al 0.1 % en AD descarbonatada. Dejar en digestión 25 minutos. Centrifugar. Mantener a temperatura ambiente. Desechar cuando aparezca brillo metálico en la superficie.

A5.d) Solución de rojo de rutenio para contraste en bloque

(Lewis P. R. y Knight D. P. Staining Methods for Selectioned Material) Solución A:

Glutaraldehído 3.6 % 0.5 mL

Buffer 0.2 M (cacodilato, s-colidina, bicarbonato,

Veronal-acetato o glicerofosfato)

0.5 mL

Rutenio rutenio en AD (1500 – 3000 ppm) 0.5 mL

Solución B:

OsO4 5 % en AD 0.5 mL

Buffer 0.2 M (pH = 7.3) 0.5 mL

Rojo rutenio en AD (1500 – 3000 ppm) 0.5 mL

Fijar el tejido con la solución A.

Fijar el tejido con la solución A.

Lavar con tres cambios de 10 minutos de buffer.

Fijar 3 horas en la solución B a temperatura ambiente.

Lavar con buffer.

Deshidratar con etanol.

Infiltrar con resina.

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Lavar con tres cambios de 10 minutos de buffer. Fijar 3 horas en la solución B a temperatura ambiente. Lavar con buffer. Deshidratar con etanol. Infiltrar con resina.

A.6) Colorantes para cortes semifinos para microscopía óptica

Si la resina usada fue Epon o Spurr se recomienda la secuencia:

1. Azul de toluidina 1 % con Na2CO3 2.5 % a pH 11.0. 2. Fucsina básica 5 % con acetona (7 min.).

A.7 Formación y remoción de precipitados formados por soluciones de contraste en cortes ultrafinos.

Al contrastar con uranilo y plomo, pueden formarse precipitados que se clasifican según su morfología en: 1. Partículas electrodensas: causadas por el uso prolongado de las sales de plomo. Se remueven con CH3COOH 10 % o CH3COOH 2 %

durante 2-8 min.

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2. Redes amorfas: se producen durante el contraste doble con sales acuosas o alcohólicas de uranilo y plomo. Se remueven con la misma solución de uranio o bien con (COOH)2 5-10 % hasta 10 min.

3. Agujas cristalinas: resultan del doble contraste con soluciones alcohólicas de uranio y plomo. No pueden removerse.

Por ello es aconsejable usar soluciones de contraste de uranio en metanol o etanol sólo si es absolutamente necesario, y evitar los contrastes prolongados.

A.8) Pre-infiltración con agar

Infiltación previa: Agar

- Agregar 1 gr. de agar a 50 mL de agua destilada. - Calentar en baño de agua hirviente agitando hasta completa disolución (la solución deja de ser turbia). - Pasar la solución a viales y autoclavarlos. Mantenerlos en heladera, herméticamente cerrados. - Antes de usar, calentar el agar nuevamente en baño de agua hirviente hasta que este líquido.

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El catalizador (DMAE) puede agregarse último luego de mezclar bien los otros tres componentes. Las burbujas pueden eliminarse por vacío. La preparación se deberá usar

inmediatamente. En caso de existir algún sobrante, se guardará en una jeringa bien cerrada, clavando la aguja en un tapón de goma, sin aire. De esta manera, puede

conservarse en freezer, por varios meses. Este medio es compatible con varios agentes deshidratantes como acetona, etanol, alcohol isopropílico y óxido de propileno

A.9) Resinas

A9.a) de baja viscosidad. Spurr. (1969).

El método gravimétrico es más conveniente para prepararlo, por ser más preciso. Se deben agregar en orden los diferentes componentes dentro de un recipiente plástico.

Standard Duro Blando Curado rápido

Menor viscosidad

ERL 4206 (g) 10 10 10 10 10

DER 736 (g) 6 4 8 6 6

NSA (g) 26 26 26 26 26

DMAE (g) 0.4 0.4 0.4 1 0.2

Hs. (a 70 ºC) 8 8 8 3 16

duración 3 - 4 3 - 4 3 - 4 2 7

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A9.b): Metacrilatos para estudios citoquímicos

Para evitar la polimerización durante el almacenamiento, se agrega hidroquinona como inhibidor al 1 %.

Dureza Proporción N-butilmetil/metacrilatos

Más duro Bueno Más blando

¼ ½

1/1

La mezcla puede permanecer un año en la heladera sin inhibidor y con el catalizador agregado hasta dos meses antes que polimerice. Si el catalizador es 1,1´- azobis (1 – ciclohexano – nitrilo) se conserva hasta un año a temperatura ambiente.

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A9.c) Epon Araldite

Mollenhauer, mod. E. H. Newcomb. Stain Technology 39:11, 1964.)

Para preparar la solución stock, mezclar los siguientes componentes: 10 partes EPON 812

10 partes Araldite 6005 24 partes DDSA La mezcla se realiza a 60 ºC de manera vigorosa. Luego se almacena en la heladera. Para realizar la inclusión, agregar una mezcla de 2 mL de DMP y 30 a 100 mL de solución stock. Calentar los bloques durante toda la noche a 60 ºC en horno (para obtener un mayor endurecimiento, calentar por más tiempo).

A.10) Cómo quitar la resina epoxi de los cortes

Solución stock

Na metálico 2.5 g

MeOH (alcohol metílico) 20 mL

Preparar la solución bajo campana, en un frasco de boca ancha y hervirla.

Luego agregar MeOH hasta completar un volumen de 25 ml.

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Tener precaución, debido a que es una reacción violenta y puede explotar si existe polvo en suspensión. Adicionar 25 ml de benceno y agregar benceno extra para su almacenamiento (hasta que la solución aclare) en una botella oscura.

Solución de trabajo

Después de recoger los cortes sobre la grilla, sumergirlos en la siguiente solución durante 30 segundos, sosteniéndola con las pinzas:

Solución metanol:benceno (1:1) 2 veces

100 % acetona

AD.

Dejar secar

Si luego de quitar la resina se sombrean los cortes con una aleación de Pt-Pd, se podrán visualizar en relieve las subunidades de celulosa o materia ósea.

Solución stock 1 parte

Solución alcohol metílico/benceno

2 partes

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A.11) Cómo quitar la resina epoxi de los tacos mal infiltrados

(Ogura-ODU, 1973) Mezclar lentejas de NaOH con EtOH hasta saturación. Dejar varios días hasta obtener un color caoba (quedarán lentejas en el fondo del recipiente).

Tratar el taco de tejido como sigue:

Ractivo Tiempo (min.)

NaOH/EtOH sat. 20

EtOH 96 % 5

EtOH 70 % 5

A.D. 2 -3

Para volver a infiltrar se debe retomar a partir del paso de deshidratación en adelante. Si falló la polimerización y el taco quedó blando, se lo puede dejar en óxido de propileno hasta disolverlo.

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A.12) Técnica de desparafinización

Para poder observar en TEM un tejido que ya ha sido montado en un taco de parafina para microscopía óptica, primeramente se debe quitar la parafina. El tejido debe haber sido fijado con formaldehído o glutaraldehído, realizándose una post-fijación con OsO4.

El taco de parafina se trata con xilol durante una hora en estufa a 70 ºC. Fuera de la estufa se agrega:

Luego se continúa, según el proceso estándar, con los pasos de lavado, deshidratación e infiltración en resina.

Ractivo Tiempo (min.)

Buffer cacodilato o fosfato 30

OsO4 1 % 2

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A.13) Ejemplo

Soluciones de trabajo

1º fijador:

Glutaraldehído 25 % 1ml Tampón cacodilato de sodio 4ml

2º fijador:

Tetróxido de osmio 2% 1 vol. Ferrocianuro de potasio 3% 1 vol. Buffer cacodilato de sodio 1 vol.

Soluciones madre para preparar las de trabajo

Tetróxido de osmio 2%:

OsO4 0,5 Agua destilada 25 ml

Solución de ferrocianuro de potasio 3%:

K4 Fe(CN)6.3 H2O 3.43g

Agua destilada (cnp) 100 ml

Tampón cacodilato de sodio 0,1 M ( pH 7,3-7,4)

Na (CH3)2 As O3.3H2O 21.40 g

Agua destilada (cnp) 1l

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APENDICE II-Mantenimiento y operación.

Prof. Viviana Sorrivas e Ing. María Julia Yañez

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AII.1-condiciones de operación

El objetivo de este espacio es colaborar con quien va a iniciarse en Microscopía Electrónica o el ya iniciado, para llegar a una comprensión del porqué de la importancia en la selección de los parámetros operativos en la observación de una muestra y además cómo realizar el mantenimiento de rutina para lograr una utilización óptima del microscopio. Este apéndice seguramente quedará desactualizado rápidamente debido a los avances en la tecnología, pero creemos que hay muchos instrumentos cuya antigüedad sobrepasa los 25 años y funcionan perfectamente gracias a los cuidados en la operación y el mantenimiento que realizan sus operadores.

Los microscopios poseen sistemas totalmente automáticos de vacío. Poseen bombas mecánicas rotativas que realizan un vacío ¨grueso¨ hasta 10-3 Torr. y también bombas de alto vacío que en los instrumentos más antiguos eran difusoras de aceite y en los modernos son turbomoleculares o iónicas. Estas últimas no requieren mantenimiento mientras que las rotativas y difusoras necesitan cambios en el aceite al menos una vez al año y una limpieza rigurosa. Una vez completada la secuencia de vacío correspondiente, el encendido es habilitado. Hay en la actualidad una variedad muy extensa de microscopios electrónicos, en esta sección sólo mencionaremos algunos modos. En realidad no es necesario conocer los principios fundamentales de la microscopía electrónica para poder utilizar los instrumentos, pero un conocimiento básico de cómo son y cómo funcionan otorga un beneficio extra al usuario y al operador.

Los principios fundamentales se trataron en el capítulo I .

Si nos referimos al microscopio electrónico de barrido, y llegamos al paso en que la muestra ya ha sido montada y metalizada, llega el momento de observarla al microscopio electrónico. Todo aparenta estar perfecto. El operador se sienta al microscopio, rompe el vacío, es decir deja que entre aire a la columna, y coloca la o las muestras que va a observar en el portamuestras del instrumento, se fija que hagan contacto muestra y porta muestra, cierra la cámara, selecciona: bombear (hacer vacío). Elije el potencial que va a utilizar, se fija que el instrumento lo habilite y comienza a saturar el haz, lo templa de a poco y llega al punto en que dándole la mínima corriente obtiene el máximo brillo. En los filamentos nuevos generalmente se utiliza el primer punto de saturación por una hora y media y luego se pasa al segundo punto. Todo esto para lograr una buena vida útil del filamento de tungsteno.

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Se corta la emisión, no hay imagen. Qué ocurre?. Es probable que el filamento haya cumplido sus horas de vida útil. (Cuántas horas serán? (Investiga) . Se requiere cambiar el filamento. Todo en el caso que sea el común de tungsteno. El filamento de hexaboruro de Lantano tiene una vida útil más larga y el de mayor precio. ( Requiere un vacío mejor) . El operador se dirije al laboratorio. Si tuviese uno preparado sería muy rápido, siempre se debería tener uno de repuesto, listo para estos casos.

Capsula de Whenelt

Toma una cápsula de Whenelt, la limpia escrupulosamente con pasta de pulir, luego con una solución acuosa con detergente, la coloca en el equipo de lavar con ultrasonido, un baño de acetona, uno de alcohol y por último de acetona nuevamente, la observa bajo lupa estereoscópica, mira muy detalladamente el orificio por donde sale el haz, la seca con aire a presión y comienza a armar la cápsula.

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Todo con guantes descartables quirúrgicos, en la campana extractora. Ensambla todas las partes (en todos los equipos son distintos, si es la primera vez que lo hacés, consultá el manual del microscopio y tomá fotos con tu celular).

Es sumamente importante que el filamento, que generalmente (el de tungsteno) y no es precentrado quede exactamente en el centro, para lo cual se hace girar, mientras se observa en la lupa estereoscópica. Además es importante fijarse en el manual a qué distancia del borde del orificio de la cápsula tiene que estar la punta del filamento de tungsteno. En el caso de los filamentos que se usan en emisión de campo ( field emission) es diferente.

A medida que el voltaje de aceleración aumenta hay muchos factores que se ven afectados.

Por ejemplo:

a. Existe una mayor penetración del haz que permite estudiar especímenes más gruesos. (TEM)

b. El contraste por amplitud decrece.

c. El brillo del haz de electrones se incrementa.

d. La eficiencia de la pantalla de fósforo mejora. (TEM)

Cápsula de whenelt

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e. La dispersión inelástica decrece, por ende, la aberración cromática decrece, mejorando la resolución y el daño por irradiación disminuye aumentando el tiempo de vida útil de la muestra.

f. El haz de electrones es más sensitivo al vacío por lo que la estabilidad de voltaje disminuye.

g. El límite de resolución debido al efecto de difracción mejora. (TEM) En general, se prefieren altos voltajes de aceleración (de 80 a 100 kV) cuando se estudian especímenes sensibles a la radiación electrónica, porque se reduce el daño a la muestra y se mejora la resolución. Para aumentar el contraste se colocarán aperturas más pequeñas de objetivo o se utilizarán técnicas de contraste específicas antes que disminuir el voltaje de operación.

Cuando se coloca el TEM en un determinado kilovoltaje (kV), el filamento tiene que estar apagado (es decir, inicialmente no debe circular corriente) para prevenir el daño al mismo o a la muestra debido al voltaje. Cuando más alto el KV elegido la corriente tardará más en estabilizarse y habrá descargas debido a la desorción de gases residuales. Una vez realizado este paso el filamento puede saturarse incrementando la corriente. El haz tendrá que ser ajustado y alineado para dar el máximo brillo posible en el voltaje y el bias elegido. El bias puede cambiarse para dar una señal más fuerte o débil dependiendo de las condiciones de trabajo (grosor de la muestra, magnificación deseada, etc.).

h. En el caso del SEM, el potencial que se elegirá va a depender del tipo de detector y el material. Si es espectrometría por rayos x, el potencial variará desde 10 kV hasta 39 kV. Si se trabaja a presión variable desde 10 kV en adelante. Si es el detector de electrones secundarios convencional dependerá de la muestra y la resolución a la que se quiere llegar. Hasta 7kv para muestras biológicas a una magnificación menor a 20k. y se podrá subir el potencial a medida que se requiere aumentar la magnificación.

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AII.2-Selección del Tamaño del haz (spot size)en TEM

En la siguiente tabla se presenta un ejemplo de tamaños de spot referidos al tipo de estudio.

Spot size Tipo Observación

grande Especímenes gruesos

medio Observación normal

pequeño Observación especímenes sensitivos al haz electrónico

Trabajos de alta resolución.

Campo claro

En las siguientes tablas se presentan diversas variantes de las acciones que se sugieren tomar para obtener una imagen de buena calidad, de

acuerdo a la magnificación de trabajo y el contraste que se observa en la pantalla del TEM.

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Para muestras biológicas y polímeros:

Magnificación Contraste observado Apertura objetivo sugerida Kilovoltaje sugerido

Baja magnificación buen contraste Grande 60 KV

Baja magnificación poco contraste Media 60-80KV

Alta magnificación buen contraste Grande 80-100kv

Alta magnificación poco contraste Pequeña 80-100KV

Para muestras no biológicas:

Magnificación Contraste observado Apertura objetivo sugerida Kilovoltaje sugerido

Baja magnificación buen contraste Grande 80 kV

Baja magnificación poco contraste Pequeña 80 kV

Alta magnificación bueno Media 100 kV

Alta magnificación bajo Pequeña 100 kV

AII.2.1-En el caso del SEM

El tamaño del haz se hará más pequeño a medida que aumentamos la magnificación, para obtener una mejor resolución. Para detectar rayos x, se utilizará un tamaño de spot mayor.

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AII.3-Elección de aperturas:

Apertura fija de 100 µ si es presión variable. Aperturas de 30µ para análisis por rayos X y de 20µ para observación normal. a) De condensador Esta define la máxima apertura de iluminación que puede usarse. La mayoría de los microscopios de transmisión usa aperturas en lentes condensadoras en el rango de 100 a 300 µm. A medida que se reduce el tamaño de la apertura, la medida del haz se hace más pequeña en el punto de entrecruzamiento y el número total de electrones se reduce. Las aperturas más pequeñas proveen las mejores condiciones para obtener alta resolución ya que el haz será más coherente. En la siguiente tabla se presentan, de manera general, los tamaños de apertura más adecuados para la clase de estudio que se quiere realizar.

Diámetro apertura

condensador (µm)

Tipo Observación

400 Alta corriente del haz

300 Observación normal

200 Observación especímenes sensitivos al haz electrónico

Trabajos de alta resolución

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b) de objetivo La apertura de objetivo se usa para mejorar el contraste por dispersión. Mide entre 25 y 75 µm. Cuanto más pequeña la apertura, es mayor el contraste porque hay más electrones dispersados. Aperturas más pequeñas mejoran la resolución debida a las aberraciones cromática y esférica pero reduce la resolución debida a efectos de difracción. Entonces, hay una medida óptima de apertura en la cual esos defectos se balancean. La aperturas más pequeñas son más difíciles de alinear y se contaminan fácilmente, introduciendo astigmatismo. Algunos microscopios poseen mecanismos de autolimpieza de las aperturas que disminuyen la contaminación. A modo de referencia, en la siguiente tabla se muestran valores de diámetro de apertura en función del tipo de estudio que se realice.

Diámetro apertura objetivo

(µm )

Tipo Observación

120 Especímenes con alto contraste

60 Observación normal

40 Especímenes con bajo contraste

20 Trabajos de alto contraste

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c) de lente intermedia

La apertura de lente intermedia deberá ser colocada cuando se desea realizar difracción de área selecta(SAD). Se seleccionará el tamaño de apertura de acuerdo al área del cual se quiere obtener el patrón de difracción.

AII.2.4-Limpieza del cañón.

Cada vez que se cambia el filamento hay que limpiar el cañón de electrones, que implica limpiar los contactos en la cápsula de Wehenlt y toda la superficie con acetona de excelente calidad y una tela que no deje pelusa. También limpiar el cátodo. Ya se puede colocar el nuevo filamento en el microscopio. Rompe el vacío de la zona del filamento y lo inserta. Esta parte del equipo es el ánodo, adonde se aplicará una diferencia de voltaje para que se emita el haz de electrones.

Se puede continuar observando una vez que se restaure el vacío.

AII.3-Selección de parámetros operativos

Elección del Voltaje de aceleración: Para acelerar los electrones en la columna del microscopio se utiliza alto voltaje que se aplica al filamento o fuente emisora. Será desde ese punto de donde se desprenden los electrones. En la mayoría de los Microscopios electrónicos de transmisión, los voltajes que se pueden utilizar van desde 20kV a 200 Kv. La mayoría de los trabajos de rutina en biología se realizan a 60 u 80 KV, mientras que en materiales a 100 o 120 KV y más. En Microscopía electrónica de barrido se puede seleccionar el potencial desde 0.1kv hasta 39 Kv, dependiendo del tipo de muestra la elección que se realice.

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AII.4-Qué potencial utilizará en su muestra?

Es interesante que repase cómo interactúa el haz con la muestra a diferentes potenciales. Se puede anticipar que la experiencia con muestras biológicas y aquellos minerales que contienen humedad en su constitución es muy buena trabajando a potenciales bajos cómo: 3, 5, 7KV. Si se requiere llegar a altas magnificaciones será necesario aumentar el potencial a 15 KV. Si por alguna causa no ha quedado bien la metalización la muestra puede llegar a cargarse (Ver artefactos) y además hay que evaluar el posible riesgo de daño por irradiación con respecto al tiempo que se necesita para lograr la imagen que se busca.

Una vez elegido el potencial se dará emisión al filamento. (Siendo nuevo, la saturación se realizará más despacio y es muy importante realizar éste paso con cuidado).El operador comienza a observar la muestra a baja magnificación, toma una imagen panorámica para lograr la ubicación del punto de interés. A continuación buscar lo que interesa estudiar y lo enfoca a magnificaciones más altas. Elige la más representativa para los requerimientos del trabajo.

Guarda los archivos de imágenes en un directorio nombrado como el ¨dueño de la muestra¨, y cada imagen con el nombre que permita ubicar muy rápido el tipo de material y la magnificación a la que fue obtenida. El interesado es conveniente que registre: el nombre de la imagen, la fecha y el protocolo que se realizó para prepararla y cualquier otro dato de interés. Generalmente el turno dura una hora y se toman todas las imágenes que se pueda en ese tiempo. Luego se estudiarán y cuanto mucho se repetirá el turno. Las muestras bien guardadas sirven para varias observaciones.

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AII.5-Recambio de aperturas

Cuando las aperturas están sucias, se complica enfocar la imagen y se muestra muy astigmática. Una de las opciones es cambiar las aperturas. Las hay fijas dentro de la columna y las de objetivo, que son las que podrá cambiar el operador. No se aconseja al operador inexperto desarmar el microscopio. Lo ideal es contar con juegos nuevos de aperturas pero en el caso de no tenerlas se pueden limpiar. Siempre hay que evaluar el estado de las mismas con un microscopio óptico. Consultar los manuales de cada equipo.

AII.5.1-Elección de aperturas:

a) de condensador. Esta define la máxima apertura de iluminación que puede usarse. La mayoría de los microscopios de transmisión usa aperturas en

lentes condensadoras en el rango de 100 a 300 µm. Cuando se va reduciendo el tamaño de la apertura, la medida del haz se hace más pequeña en el punto de entrecruzamiento y el número total de electrones disminuye. Las aperturas más pequeñas proveen las mejores condiciones para obtener alta resolución ya que el haz será más coherente.

En la siguiente tabla se presentan, de manera general, los tamaños de apertura más adecuados para la clase de estudio que se quiere realizar.

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Diámetro apertura

condensador (µm)

Tipo Observación

400 Alta corriente del haz

300 Observación normal

200 Observación especímenes sensitivos al haz electrónico

Trabajos de alta resolución

b).La apertura de objetivo se usa para mejorar el contraste por dispersión. Mide entre 25 y 75 µm. Cuanto más pequeña la apertura, es mayor el contraste porque hay más electrones dispersados. Aperturas más pequeñas mejoran la resolución debida a las aberraciones cromática y esférica pero reduce la resolución debida a efectos de difracción.

Entonces, hay una medida óptima de apertura en la cual esos defectos se balancean. La aperturas más pequeñas son más difíciles de alinear y se contaminan fácilmente, introduciendo astigmatismo. Algunos microscopios poseen mecanismos de autolimpieza de las aperturas que disminuyen la contaminación.

A modo de referencia, en la siguiente tabla se muestran valores de diámetro de apertura en función del tipo de estudio que se realice.

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Diámetro apertura objetivo

(µm )

Tipo Observación

120 Especímenes con alto contraste

60 Observación normal

40 Especímenes con bajo contraste

20 Trabajos de alto contraste

c) de lente intermedia La apertura de lente intermedia deberá ser colocada cuando se desea realizar difracción de área selecta (SAD). Se seleccionará el

tamaño de apertura de acuerdo al área del cual se quiere obtener el patrón de difracción.

AII.6-Alineación del haz.

Alinear el haz consiste en: primeramente saturarlo, o sea llevarlo a la posición en que emite con el máximo brillo y está bien centrado en la pantalla. El mecanismo es sencillo y hay que verificar mientras se trabaja que no se desalinee.

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AII.7-Corrección de astigmatismo

Cómo darse cuenta de que la imagen está astigmática?. Qué es el astigmatismo ?. (Ver capítulo de Fundamentos). Cómo se corrige? La corrección no es automática, generalmente se sube la magnificación a más de 6000x y se corrige cambiando el foco fino y ajustando la corriente en el sentido de las Y y de las X. Cuando la imagen se sale de foco pero no fluctúa en uno de los ejes se considera que está corregido.

AII.8-Enfoque

Lo ideal para enfocar una imagen es utilizar una pantalla más pequeña y variar el foco fino hasta que los bordes se vean bien enfocados. Si no es así se corrige el astigmatismo. En SEM es importante tener en cuenta la distancia de trabajo (WD). A menores distancias de trabajo mejor foco.

AII.9-Adquisición de imágenes

Una vez obtenida la zona buscada, mediante barridos rápidos tipo TV, enfoca a alta magnificación una zona aledaña, por el riesgo que corre la muestra de sufrir daño por radiación. La contaminación de especímenes examinados en el microscopio electrónico es el resultado de la reacción entre haz y materia adsorbida en la superficie irradiada. El material que se ve como un cuadrado negro en SEM, consiste de moléculas de hidrocarburos, que puede contener algunas moléculas de agua que existen en las superficies de todos los sistemas desmontables de vacío. (Artefactos). Se baja la magnificación, se elige la velocidad de barrido para tomar la foto y la resolución a la que va a adquirir la misma. En el caso de los TEM si no se posee sistema de adquisición de imágenes se toma una microfotografía tradicional, con la cámara CCD se adquiere la imagen a la resolución deseada.

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AII.10-Con respecto al porta muestras.

En el Microscopio Electrónico de transmisión, de goniómetro de entrada lateral se colocan dos grillas.

Hay algunos puntos importantes para tener en cuenta.

nunca usar las manos directamente para trabajar ya que la grasa que contienen contamina la columna.

Estar seguro de que la grilla que contiene el espécimen está plana y bien sostenida.

La muestra generalmente se introduce al microscopio con el alto vacío (HV) en ON (prendido), el haz y las aperturas alineadas, el haz expandido y la magnificación baja. Para irradiar muestras sensitivas a la irradiación utilizar el haz menos concentrado y la menor magnificación posible.

Portamuestras TEM (entrada lateral)

Grilla con la muestra. Grilla con la muestra.

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AII.11-Selección de la magnificación:

La elección de la magnificación depende de la naturaleza de las observaciones que se llevan a cabo. a. Baja magnificación: (<10,000X) se requiere para obtener un campo panorámico (>10 µm) de un espécimen en una sola micrografía.

También se puede realizar un foto montaje para obtener una imagen de un espécimen completo a mayor magnificación. b. Para estudios estadísticos como determinar poblaciones relativas o medidas de diferentes partículas es necesario observar mayor

cantidad de muestra. Lo mejor es usar la menor magnificación posible en la cual las partículas a medir pueden identificarse perfectamente.

c. Cuando la muestra que se observa es sensible a la radiación habrá que usar la menor magnificación posible y el nivel de iluminación que permita adquirir la imagen.

d. Cuando se requiere adquirir una imagen de mucha resolución se utilizará una magnificación en la que el microscopio pueda resolver los detalles que se necesitan ver y no mayor. Una magnificación excesiva llevará a una exposición innecesaria a la radiación.

e. Para tomar imágenes a baja magnificación conviene enfocar al mayor aumento posible, verificar la corrección de astigmatismo y luego bajar la magnificación.

AII.12-Foco

Una imagen en foco se caracteriza por la nitidez de los detalles característicos de la muestra. Lo más evidente de la imagen TEM fuera de foco es la aparición de bordes claros (bajofoco) u oscuros (sobrefoco) en el contorno de una característica determinada. Los cambios de intensidad no deben ser interpretados como cambios en el espesor o en la densidad de la muestra.

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La puesta en foco es una de los más importantes ítems en la obtención de micrografías en TEM y es dependiente de la variación de corriente de las lentes objetivas.

AII.12.1-Enfoque a baja magnificación: (<10,000X)

Hay dos métodos que pueden recomendarse: Enfocar con la ayuda del wobbler que produce un movimiento cíclico del haz incidente que hace que se vean dos imágenes vibrando cuando la lente objetiva se enfoca por encima o por debajo del plano del espécimen y con los controles apropiados hay que juntarlas, cuando la imagen permanece quieta la lente objetiva está en foco.

AII.12.2- Enfoque a alta magnificación:

Un método excelente para lograr un buen foco a altas magnificaciones es enfocar una característica del film de soporte (por ej. un agujero) y una vez enfocado y corregido astigmatismo moverse a la muestra propiamente dicha.

AII.12.3Corrección de astigmatismo:

Es un paso fundamental para obtener micrografías en foco. Además cuando no puede corregirse da una señal de que la columna de microscopio está contaminada.

La imagen astigmática se observa como una deformación direccional (en x y/o en y), como se presenta en las siguientes micrografías:

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Para corregir se operan los controles de astigmatismo, para lograr si usamos el caso del Halo de Fresnel (ver imágenes siguientes) que cuando se enfoca y desenfoca el halo se vea del mismo grosor en todo el agujero y sea concéntrico. Esta operación se realiza por encima de los 50.000x, observando con el microscopio estereoscópico que aumenta 10 x.

El corrector de astigmatismo de la lente objetiva se usa para compensar el astigmatismo en la imagen. Hay dos protocolos comunes para corregir astigmatismo:

1. Con una grilla con un film de carbón micro agujereada, se va obteniendo una imagen sobre enfocada (over focus) de un pequeño agujero a 100.000x , pasar de bajo foco (under focus) a sobre foco, ver el halo de Fresnel y mover los controles de astigmatismo de manera que el grosor del halo quede parejo en todo su espesor.(ver imágenes siguientes)

Deformación en x x

Deformación en y

Imagen no astigmática

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Corrección de astigmatismo;

a) Imagen astigmática (note detalle del fondo) b) Corrector de astigmatismo en ON. Desviación del c) Halo de Fresnel en un sentido. d) Desviación en otro sentido. e) Imagen sin astigmatismo.

La compensación por asimetría se transforma en un proceso de prueba y error, requiere experiencia y habilidad. Los operadores con experiencia corrigen astigmatismo sin la ayuda de una grilla de agujeros a la que se le vaporizó carbón.

Directamente lo hacen observando un detalle de la muestra.

2.- ajustar el corrector de astigmatismo de manera de reducir el contraste de fase en la imagen. Cuando la imagen está astigmática no habrá un punto con bordes nítidos. Una vez que se obtuvo esa imagen se utilizan los correctores para corregir el foco fino y minimizar el contraste. Cuando la imagen está en foco el contraste se incrementa en cada condición cercana al foco. Este método es muy útil porque se puede usar la muestra y no tratar de encontrar un agujero.

AII.12.4-Corrección de astigmatismo en el SEM:

La corrección de astigmatismo es fundamental para obtener un buen foco en la imagen. Se corrige con los controles en X e Y del corrector de astigmatismo, hasta que cambiando de foco la imagen, a bajo y sobre foco, la misma se salga de foco sin deformarse. Se va controlando el foco a medida que se aumenta la magnificación.

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AII.13-Alineación (TEM)

Una mala alineación de la columna del TEM puede interferir en el poder de resolución por inestabilidades en el alto voltaje o la corriente de las lentes produce movimientos en la imagen que se incrementan con la calidad de la alineación. Que el haz esté desalineado significa que no está centrado alrededor del eje de la lente. Al estar alineadas las lentes formadoras de imagen, el centro óptico de la imagen coincidirá con el centro físico de la pantalla de observación. La columna desalineada provoca serios inconvenientes tales como movimientos del campo de visión durante cambios en la magnificación o enfoque.

El microscopista deberá poder realizar las siguientes operaciones sin problemas:

1 . Cambiar la magnificación sin que se pierda el centro del campo de visión. 2. Variar la iluminación del objeto sin que se desvíe el haz. 3. Enfocar la imagen sin que se salga de la pantalla. 4. Cambiar de un modo de operación a otro sin que se pierda iluminación. Idealmente, los elementos ópticos de cualquier microscopio deben ser coaxiales. Esto es, los ejes de simetría de cada lente deben coincidir

exactamente. El centro de la lente objetiva y el centro de la pantalla constituyen dos puntos que definen el eje óptico. Y si se puede verificar la columna estará

alineada.

AII.13.1-Alineación SEM:

Si la columna del SEM no está bien alineada no se podrá saturar bien el filamento. Las aperturas deberán alinearse con el woobler, de modo que cambiando el foco la imagen no se mueva.

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AII.14-Alineación del cañón de electrones

La alineación del cañón (gun) consiste en centrar una imagen del filamento emitiendo, pero no saturado en la pantalla de observación. El agujero en la cápsula de Whenelt es menor que 1mm y por lo tanto un pequeño desplazamiento, movimiento en x o en y o una inclinación (tilt) del filamento va a distorsionar la emisión y reducirá la intensidad de la iluminación.

AII.15-Alineación de la lente condensadora en TEM:

Implica centrar la iluminación en todos los niveles de corriente de condensador. Cuando está desalineada la iluminación se escapa del campo de observación cuando se cambia la corriente de la lente.

Para que la iluminación sea pareja también habrá que alinear la apertura de condensador. Si la apertura esta desalineada, al ir variando desde la posición de bajo foco a sobre foco, la imagen del haz de electrones sobre la pantalla se mueve fuera del eje (centro) y se distorsiona. Una buena alineación existe cuando el haz está centrado y al expandirse permanece en el centro de la pantalla. Esto se realiza con ayuda de controles externos que permiten desplazar la apertura hasta centrarla.

También puede estar astigmática la lente condensadora, se verá elíptica cuando el haz se desenfoca y se podrá corregir con los correctores de astigmatismo de la lente condensadora.

AII.16-Sistema formador de imagen (TEM):

Si el sistema formador de imagen no está correctamente alineado, la imagen en el centro de la pantalla se deslizará al ir cambiando la amplificación. El procedimiento de alineación resultará en que el eje óptico del sistema formador de imágenes esté en línea con el eje mecánico del instrumento. Una vez alineado un objeto puntual en el eje de la lente objetiva se verá como una imagen en el centro de la

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pantalla a cualquier magnificación. Procedimientos específicos de alineación son llevados a cabo de acuerdo a las características del microscopio.

AII.17-Alineación de la apertura de objetivo (TEM):

La apertura de objetivo se centra usando los controles finos de x e y. EL borde de la apertura deberá contener en forma concéntrica al haz de electrones, el cual incide en el centro de la pantalla.

AII.18.-Campo oscuro

Las alineaciones y procedimientos descriptos valen para campo claro, campo oscuro y difracción de área selecta. Como se estudio en secciones anteriores, una imagen de campo oscuro se forma interceptando los electrones transmitidos con la

apertura de objetivo y dejando pasar los electrones dispersados en determinados ángulos. La imagen de campo oscuro tiene un alto contraste (en especial en las zonas cristalinas) y su resolución es comparable con la imagen de campo claro.

Controles específicos del TEM permiten pasar de una imagen de campo claro a campo oscuro en forma relativamente simple. Dada sus características de baja luminosidad en la pantalla, el registro de tales imágenes necesita de mayores tiempos de exposición.

AII.19-Difracción de área selecta

Para obtener un patrón de difracción se deberá ajustar el sistema de lentes tal que el plano focal imagen de la lente objetivo actúe como plano objeto de las lentes intermedias. Esto se realiza directamente con controles específicos del microscopio.

El procedimiento básico para obtener el patrón de difracción por área selecta es: se selecciona un área específica del espécimen, se inserta una apertura para SAD en el plano imagen de la lente objetivo y se ajusta la lente intermedia para focalizar.

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Se deberán tener en cuenta parámetros como la longitud de cámara y la magnificación. La primera se seleccionará de forma tal que los espaciados en el patrón de difracción sean discernibles sobre la pantalla. La magnificación puede cambiarse ajustando las lentes intermedias con los controles correspondientes.

Un valor típico de longitud de cámara es 60 cm. Es de destacar que los modos de observación anteriormente dados, requieren la calibración de la magnificación real y de la longitud

de cámara del microscopio.

AII.20-Mantenimiento de equipos accesorios.

AII.20.1-Mantenimiento de la evaporadora de metales en plasma de Argón

Este equipo requiere estar muy limpio para su buen desempeño. El vacío que se realiza en la campana donde se ubican las muestras es alcanzado por una bomba mecánica. Observar siempre que la bomba tenga el nivel de aceite requerido. Los o-rings, que sellan para que haya un buen vacío deben estar escrupulosamente limpios y lubricados con una capa ínfima de aceite de vacío. (Marca Apiezon). El disco del metal que se evaporará debe estar limpio y hacer buen contacto.

AII.20.2-El aparato de secado por punto crítico

Cómo limpiarlo dependerá del tipo de equipo, generalmente hay que tener en cuenta que el fluido intermediario, en nuestro caso CO2, sea de buena calidad, es decir esté limpio. La cámara donde va la muestra debe estar inmaculada y las canastitas en donde se coloca cada espécimen también.

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AII.21-CALIBRACION

La primera calibración de un TEM es cuando se instala. Calibraciones posteriores deben ser realizadas cada vez que se realiza el mantenimiento anual del equipo, o se efectúan reparaciones.

Estas calibraciones deben hacerse posteriormente a una adecuada alineación.

AII.21-1Calibración de la magnificación (TEM)

Las magnificaciones mostradas en el microscopio (magnificaciones nominales), dada por el fabricante, pueden diferir de las reales, debido a variaciones en la tensión , la localización precisa del espécimen y las variaciones de la corriente de lentes debido a corrimientos del voltaje de referencia.

Para la calibración de la magnificación se utilizan estándares. Hay de distintos tipo, dependiendo del rango de magnificaciones que se quiera calibrar. Uno de los mas comunes son las réplicas de carbón de espaciado conocido (pueden ser de líneas paralelas o cuadriculado), las cuales tienen 2160 líneas por mm, con un espaciado de línea de 0.463 micras y permiten calibraciones hasta 50000 x aprox. para el patrón de líneas paralelas y hasta 200000x para el cuadriculado.

El estándar de cristal de catalasa, contraste negativo, es otro patrón que suele utilizarse para calibraciones entre 50000x a 200000x. El espaciado entre planos es de 8.75 nm y 6.85nm.

Otros patrones están disponibles para este tipo de calibraciones. Entre ellos podemos nombrar: carbón grafitizado blanco, cristal de oro orientado y ferritina.

El procedimiento básico para realizar la calibración de la magnificación es el siguiente:

Se alinea el TEM. Para cada magnificación, se focaliza la imagen del estándar que se seleccione y se toma una imagen del mismo. Se miden los espaciados y se obtiene la magnificación real. Con el set de datos de todas las magnificaciones se realiza un gráfico de magnificación nominal vs magnificación real.

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La calibración debe ser realizada debido a que el sistema de lentes puede tener variaciones relacionadas con la corriente y vinculadas

a la temperatura ambiente, a la eficiencia del sistema de enfriamiento de las lentes y el ciclo de histéresis de las mismas. Si se tienen que realizar mediciones precisas, es aconsejable calibrar la magnificación en simultáneo con las mediciones a fin de asegurar las mismas condiciones operativas.

Errores menores del 10% en la medida de la magnificación son aceptables.

En la siguiente tabla se presentan valores de magnificaciones calibradas a 100 kV.

Mag. real

Mag. nominal

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Mag. Teórica Mag. Real

2000 2040,00

4000 4080,00

5000 5100,00

6700 6834,00

10000 10200,00

20000 20400,00

50000 51000,00

80000 81600,00

100000 102000,00

140000 142800,00

200000 204000,00

270000 275400,00

AII.21.2-CALIBRACIÓN DE LA CONSTANTE DE CÁMARA

La relación empleada para determinar los espaciados ¨d¨ a partir de una imagen de difracción electrónica ha sido mostrada es la sección de difracción electrónica. :

R.d = .L

La constante de cámara ( .L) es característica de cada instrumento y debe ser calibrada. Para esto se utilizan patrones tales como films delgados de oro o aluminio. Los mismos dan un patrón de difracción electrónica de anillos. Se mide la distancia R desde cada anillo al punto central y se realiza un gráfico. 1/d vs R.

La pendiente de la recta dará el valor de .L. La bondad de este procedimiento depende del método de ajuste de curvas que se emplee. El más adecuado para tener buena precisión en la medida es el de cuadrados mínimos.

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AII.21.3-Rotación de la imagen relativa al patrón de DIFRACCIÓN

Imágenes en diferentes magnificaciones rotarán en un ángulo con respecto al patrón de difracción fijo. Para determinar esta

rotación se emplea una muestra de MoO3 cuyo lado de mayor longitud es paralelo a la dirección 001 en el cristal. Se coloca la apertura para difracción de área selecta (SAD) y se focaliza la imagen. Se pasa a modo difracción con el haz defocalizado y se focaliza hasta obtener un patrón bien definido. Se hace una doble exposición de la imagen y del patrón de difracción. Se repite el procedimiento para diferentes magnificaciones. Se aconseja realizar esto con un valor fijo de longitud de cámara (L).

Se realiza un gráfico magnificación vs. Rotación (en grados). Es importante tener en cuenta la rotación de 180° producida en la imagen cuando se incrementa la magnificación. La imagen directa

y su correspondiente patrón de difracción están rotados 180° más un ángulo y esta rotación debe ser incluida en la calibración. Por lo

tanto, para lograr una correspondencia real entre ambos registros es necesario girar el diagrama de difracción 180° + en el sentido de las agujas del reloj.

AII.21.4-Calibración de la magnificación (SEM)

Generalmente para calibrar el microscopio de barrido se usan muestras patrones, con tamaños adecuados para calibrar y se constata que la escala que marca el microscopio coincida con el tamaño de la muestra utilizada. Se hace una vez cuando el equipo se instala.

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Guía de trabajos prácticos Para Biología y Materiales

Dra. Alfonsina Morales, Ing.María Julia Yañez y Prof.Viviana Sorrivas

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Instrumentación necesaria Pinza con punta muy fina, adecuada para manipular grillas.

Pipetas descartables o pipetas Pasteur con bulbo plástico (varias).

Cuchillas de acero sin usar limpiadas con lavadas en alcohol.

Cera dental (para cortar la muestra sobre una gota de buffer).

Recipientes para lavar.

Papel de filtro .

Palillos de madera.

Cápsulas Beem.

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Nota: Recordar que el OsO4 no debe usarse en un área abierta, sino bajo campana. Para la preparación de drogas ver Apéndice de recetas.

Microscopía Electrónica de transmisión

TP1.1-Fijación: Esquema típico

Objetivo: Realizar una doble fijación a tejidos biológicos frescos con glutaraldehído y tetróxido de osmio. Materiales:

Pipetas Pasteur, varias. Glutaraldehido al 2,5 % en buffer fosfato. Solución de trabajo de tetróxido de osmio (OsO4) al 1 %. Hojas de afeitar nuevas, lavadas con acetona. Cera dental (un trozo). Procedimiento:

Coloque todo el material que necesitara durante la fijación bajo campana. A mano dejará la cera dental y las hojas de afeitar.

1. Disecte el órgano que estudiará rápidamente. Trozos de 1 o 2 cm. de tejido se lavarán con buffer. 2. Transfiera el tejido a una “gota” de glutaraldehído al 3 % en buffer fosfato. Fíjese que el material quede

bien sumergido en la gota. 3. Usando una cuchilla de acero limpia y nueva, corte el tejido en piezas pequeñas (menores a 1 mm2). 4. Prepare con un palillo de madera una espátula, haciendo roma su punta, para poder manipular el tejido

sin estropearlo. 5. Levante rápidamente los pequeños trozos y colóquelos en un frasquito que contenga solución fijadora. 6. Etiquete el frasco con su nombre y la hora en que colocó la muestra en fijador. 7. Deje que se fije el tejido durante dos horas a temperatura ambiente o toda la noche en heladera. 8. Lave el tejido en buffer fosfato en tres cambios de 15 minutos cada uno para remover el glutaraldehído. 9. Descarte el último cambio y agregue 1 ml de OsO4. Deje actuar una hora bajo campana, tapado. El tejido se pondrá negro.

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10. Cubra de inmediato el tejido con buffer fosfato. 11. Descarte el OsO4 en un frasco con aceite mezcla comestible.

TP1.2-Deshidratación: Esquema típico

Objetivos: * Extraer el agua libre de los tejidos fijados, ya que la mayoría de los medios de infiltración que se utilizan no son miscibles en agua.

*Infiltrar el tejido deshidratado con un medio de inclusión plástico. *Endurecer el espécimen infiltrado con el medio.

Materiales:

Frascos de alcohol etílico en las siguientes proporciones: 50 %, 70 %, 95 % y 100 %. Pipetas Pasteur. Mezcla de resina. Cápsulas Beem.

El propósito de la doble fijación es preservar la estructura del tejido de manera tal que las secciones que se observen al microscopio sean un reflejo fehaciente de las estructuras vivas. Tan rápido como un organismo vivo muere, comienza la autolisis. El fijador debe llegar al interior del tejido lo más rápido posible. Como sabemos, el glutaraldehído penetra más rápido que el osmio, es por eso que se utiliza en la primera fijación.

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Nota:

Durante el tiempo en que le tejido está siendo fijado, conviene preparar el medio de inclusión. Planificar el procedimiento de manera que sea posible dejar los especímenes en resina al finalizar el día de trabajo.

(Nota: Ver en Apéndice de recetas la preparación de resinas).

Procedimiento:

1. Extraiga bajo campana la muestra del líquido fijador. 2. Lave la muestra con agua destilada o directamente colóquela en el primer medio de deshidratación (50 % alcohol). Agite y deje

durante 15 min. 3. Realice los cambios sin permitir que la muestra quede sin líquido.

Solución Duración

50 % acetona 15 min.

70 % acetona 15 min.

100% acetona 15 min.

2 acetona: 1 resina 30 min.

1 acetona: 1 resina 30 min.

Resina pura Toda la noche

Polimerizar en estufa a 70° Toda la noche

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Nota: este es un protocolo típico. El alumno puede

haber seleccionado un esquema de acuerdo a la muestra que va a procesar y seguir su propio protocolo.

Nota: durante el tiempo en que se está deshidratándola muestra, prepare las cápsulas Beem o los moldes que vaya a utilizar para incluir.

Tp1.3-Inclusión en resina y polimerización

Procedimiento:

1. Sobre una hojita de papel de aluminio, ubique:

Las cápsulas Beem. Coloque el rótulo en cada cápsula que vaya a utilizar, enroscando un papel en un lápiz y colocándolo como indica la figura. Debe escribirse a máquina o con lápiz.

Una jeringa descartable para colocar la resina.

Un recipiente con resina.

Un trozo de cera dental y un palillo con punta roma. 2. Extraiga la mezcla resina de la muestra. 3. Agregue 1-2 ml de mezcla de resina fresca, mezcle el tejido e invierta la cápsula sobre un trozo de cera dental. 4. Usando el palillo elija el trozo de tejido óptimo para incluir. 5. Cargue resina en la jeringa y coloque unas gotas en cada cápsula embebiendo y acomodando el rótulo. Con un palillo saque las

burbujas del fondo de la cápsula.

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6. Tomando el tejido con el palillo coloque un trozo en cada una de las cápsulas. 7. Agregue con la jeringa más resina hasta 1 o 2 mm. del borde. 8. Inspeccione la posición del tejido. 9. Coloque el bloque en un horno a 70°C. Deje que los bloques se endurezcan por lo menos 24 hs. Pueden dejarse 2 o 3 días porque no

se verán dañados. 10. Chequee la dureza del bloque cuando esté frío: al clavarle una uña no debería marcarse. En caso contrario deje en estufa por más

tiempo.

T1.4 Inclusión en resina. (Materiales).

Materiales a utilizar:

Grillas.

Vial o molde plástico.

Estufa.

Hoja de afeitar.

Pinza.

Palillos de naranjo.

Cuchilla de diamante.

Ultramicrótomo.

1- Se sumerge dentro de un vial con resina (araldite o Spurr) parte del mineral o catalizador en polvo.

2- Se lo deja en este medio entre 6 a 8 h. Es importante no superar este tiempo ya que la resina puede empezar a polimerizar.

3- Se lo lleva a estufa a 60° C durante toda la noche, para curar la resina, es decir se transforma en un sólido transparente que contiene el material que se desea seccionar.

4- Se retira de estufa y se talla la pirámide. 5- Se realizan cortes delgados a temperatura ambiente en un

ultramicrótomo.

Nota: El uso de cuchilla de diamante favorece la obtención de secciones

delgadas de 60nm aproximadamente.

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anotaciones datos Tiempos

Fecha

Nombre del experimentador

Espécimen utilizado

Fijador 1°

Solución tampón

Fijador 2°

Agente deshidratantes (%)

Resina ( tipo)

Polimerización (t°)

Rótulos

Observaciones

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TP2-Contraste.

TP2.1-Contraste con acetato de uranilo y citrato de plomo. (Biología).

Objetivo: Debido a la baja nube de electrones que presentan los átomos de las muestras biológicas es necesario incrementar el contraste de los

tejidos a ver en el microscopio de transmisión por deposición de metales pesados en la ultraestuctura.

Materiales:

- Solución 3% de acetato de uranilo (centrifugada). - Solución citrato de plomo 0.5%, pH=11,2 (centrifugada). - 2 recipientes de 50 ml con agua destilada, hervida y filtrada. - Cápsula Petri con pellets de OHNa - Pipetas descartables o Pasteur con bulbo. - 1 pinza de punta fina. - Reloj con alarma (timer). - Las fórmulas para la preparación de los agentes de contraste figuran en Apéndice de Recetas. Procedimiento:

Colocar sobre una hoja de papel de aluminio todos los elementos necesarios:

1. Centrifugar el citrato de plomo a 600 rpm por 15 min.

Nota:

Existen problemas de precipitación sobre la muestra si no se tiene los cuidados indicados en la Técnica.

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Nota: si la solución no es clara, descartarla. 2. Tomar dos cajas o cápsulas de Petri y colocar un trozo de cera dental en cada caja. En una de las cajas, que se usará para el plomo,

rodear la cera con pellets de NaOH. La caja que contendrá acetato de uranilo, debe protegerse de la luz. Tapar las cajas para saturar la atmósfera.

3. Colocar tantas gotas como grillas se vaya a contrastar. No exponer a la luz en el caso de acetato de uranilo. 4. Tomando las grillas una por una sumergirlas en la gota. 5. Dejar actuando por lo menos 4 a 5 minutos el acetato de uranilo. 6. Una vez pasado ese tiempo, sostenga firmemente la primera grilla por su borde y lave en los recipientes que contienen agua

destilada, sumergiéndola con movimiento vertical varias veces en cada baño. El motivo de estos baños es extraer el exceso de acetato de uranilo.

7. Dejar secar las grillas teniendo cuidado de no mezclarlas. Para eso roturar un papel de filtro en una caja de Petri de la siguiente manera:

8. En la segunda caja coloque gotas de citrato de plomo sobre la plancha de cera. Tape inmediatamente la caja porque el carbonato del aire precipita el plomo.

9. Agregue las grillas, 1 por gota, como en el caso anterior. 10. Dejar actuar 1 a 10 min. 11. Lave la solución 0,04 N de NaOH en el primer baño y luego en el segundo varias veces 12. Dejar secar. 13. Observar.

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Nota: El OsO4 se vende en pequeñas ampollas de 0.5g.

Anotaciones Datos

tiempos

Acetato de uranilo

Citrato de plomo

Observaciones

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TP2.2-Contraste de polímeros. (Materiales)

TP2.2.1-Tetróxido de Osmio

Método I:

Para polímeros en bloque.

Materiales a utilizar:

Grillas.

Recipiente hermético.

Caja de Petri.

Pinza.

Papel de filtro.

Solución de OsO4.

Agua destilada.

Tubito de rollo fotográfico o recipiente opaco a la luz con tapa .

1- Se forma una solución al 2% de tetróxido de osmio disolviendo la ampolla en agua .

2- El espécimen (bloque) se sumerge en frasco herméticamente cerrado conteniendo la

solución. Es importante que el bloque sea del menor tamaño posible ( 3mm3 es

aceptable).

3- Se deja alrededor de 1 semana dependiendo este tiempo del tipo de polímero.

4- Se retira cuidadosamente del frasco y se hacen lavados sucesivos en agua bidestilada.

5- La solución de OsO4 usada se neutraliza con aceite vegetal y se guarda en depósito.

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Método II : para polímeros seccionados previamente.

Materiales a utilizar:

Grillas.

Recipiente para contraste.

Caja de Petri.

Pinza.

Papel de filtro.

Solución de OsO4.

Agua bidestilada.

Tubitos de rollo fotográfico o envases opacos a la luz con tapa.

1- Se coloca en un recipiente para contraste, una gota de solución de OsO4 al 2% sobre la grilla conteniendo los cortes. El tiempo de teñido puede variar entre 1-2 h según el polímero.

2- Se retira cuidadosamente del recipiente y se hacen lavados sucesivos en agua bidestilada. 3- También pueden usarse los vapores de la solución de OsO4 al 2%. Para esto se siguen el paso 1 pero los tiempos de teñido

pueden ser mucho mayores a los empleados con la solución líquida.

Un procedimiento similar puede realizarse para el teñido de partículas látex o emulsiones diluidas. En este caso, el tiempo de teñido

estimativo es de 30 min para el teñido en solución líquida.

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TP2.2.2 Tetróxido de Rutenio ( polímeros seccionados previamente).Materiales a utilizar:

Grillas.

Recipiente hermético de vidrio.

Portaobjetos.

Cinta adhesiva doble faz.

Caja de Petri.

Pinza.

Aguja.

Jeringa.

Papel de filtro.

RuCl3.

Agua bidestilada.

Hipoclorito de Sodio (nueva solución).

1. Se colocan, en un recipiente de vidrio (de 10 ml de capacidad ), 0.02g de RuCl3 y las grillas conteniendo los especimenes a contrastar. Los bordes de las mismas se sujetan a un vidrio portaobjetos con una cinta doble faz.

2. Se cierra el envase. Es importante que el recipiente pueda cerrarse herméticamente y permita la entrada de liquido mediante una jeringa.

3. Se inyectan 1ml de (NaClO) y se retira la jeringa. Se formará una solución color marrón. Es importante que el NaClO sea lo mas recientemente obtenido posible.

4. Se deja actuar durante 1.30 h. Este tiempo puede variar de acuerdo al tipo de polímero que se desee contrastar. Se abre con cuidado el recipiente, se retiran los especimenes y se vuelve a cerrar .

5. La solución RuO4 se neutraliza con una solución de sulfato de sodio (NaSO4) al 10 %. Se deja neutralizar 1 semana. 6. Posteriormente se lava con agua destilada. El agua de lavado se coloca en bidones destinados a residuos de este tipo. 7. Todos los elementos descartables utilizados se guardan como residuo en una recipiente cerrado y se coloca en un área

especifica para residuos tóxicos.

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Anotaciones Datos

tiempos

Tetróxido de osmio. Método I

Tetróxido de osmio. Método II

Observaciones

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TP3- Film Soporte.

TP3.1-Preparación de grillas con soporte. (Biología y materiales).

Objetivo: Cubrir las grillas con un film delgado transparente a la radiación para sostener los cortes ultrafinos y material particulado.

Para poder observar el área total de una sección sin que las barras de la grilla interfieran, pueden utilizarse aquellas que poseen desde un solo agujero, hasta 200 y 300#. Quedan más estables al haz de electrones si se deposita una fina capa de carbón sobre el colodion.

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Método I

Materiales:

Grillas de 200 mesh. Realizar un lavado en cloroformo (4 veces) seguido de un lavado en etanol. Colocar las rejillas sobre papel de filtro para que se sequen.

Formvar o colodion. Solución 0.25% (entre 0.31-1%) de Formvar en 1,2-dicloro etano o acetato de etilo.

Pipetas descartables.

Cristalizador.

Agua destilada.

Papel encerado.

Vaso de precipitado.

Lámpara.

Pinza. Procedimiento: 1. Coloque agua destilada hasta el borde del cristalizador. 2. Vierta una gota de la solución de formvar sobre el agua dejando que se forme una película fina. 3. Descarte la primera película y haga una segunda. Observe que sea parejo su espesor, con el reflejo de la lámpara.

4. Deje secar la película unos minutos al calor de la lámpara.

5. No hable encima de la lámina mientras se seca para que no se formen agujeros.

6. Tome las grillas (previamente lavadas con acetona) con la pinza y colóquelas sobre el film con su lado opaco hacia abajo.

7. Sumerja un trozo de papel encerado en el cristalizador perpendicular a la superficie, en la mitad del film o bien apóyelo

directamente sobre el film con las grillas y retire.

8. Deje secar las grillas.

9. Observe los resultados al microscopio óptico.

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Método II

1. Sumergir un portaobjeto en la solución de formvar en el equipo especialmente diseñado. ( FIG…) 2. Retirar el portaobjeto y dejar secar por 5-10 minutos.

3. Para permitir que se desprenda la película: retirar los bordes del portaobjeto con una hoja de afeitar. 4. Llenar un cristalizador con agua destilada. Introducir muy lentamente el portaobjeto en el agua, en un ángulo de 30-45° (algunos autoes sugieren un ángulo mucho más pequeño, casi paralelo a la superficie del agua). El desprendimiento de la película ocurre por acción capilar.

5. El film debe aparecer gris o gris plata cuando se refleja la luz. Si aparece amarillento o el color es desigual, entonces es inadecuado y debe prepararse nuevamente.

6. Transferir el film a la grilla apoyando el lado opaco de la misma en el film. 7. Levantar el film con la rejilla con un papel de filtro, o un Parafilm o un portaobjetos de vidrio y ponerlo a secar en un lugar libre de

polvo.

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TP3.2-Cast films.

Método I

Materiales a utilizar:

Grillas.

Caja de Petri.

Pinza.

Portaobjetos o parafilm.

Solución de polímero.

i. Se llena una caja de Petri con un líquido que sea inerte con la solución polimérica .

ii. Se coloca una gota de la misma sobre la superficie líquida y se deja secar a temperatura ambiente. iii. Se ubican la cara mate de las grillas sin Formvar sobre el film iv. Se levantan las grillas con la ayuda de un portaobjetos o un parafilm. Es importante destacar que la elección del

líquido inerte debe tener en cuenta la total incompatibilidad química del mismo con la solución polimérica. v. Se guardan las grillas en un portamuestras TEM o en una caja de Petri cerrada.

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Método II

Materiales a utilizar:

Grillas.

Pinza.

Papel de filtro.

Solución de polímero.

i. Se coloca una gota de la solución polimérica directamente sobre una grilla sin film.

ii. Se inclina la grilla de modo tal que uno de sus bordes contacte un papel de filtro, a fin de eliminar el excedente de solución. Este paso debe hacerse con mucho cuidado para evitar que la solución sea absorbida totalmente.

iii. Dependiendo de la naturaleza de la solución polimérica el paso anterior puede obviarse y directamente dejar secar la gota sobre la grilla sin necesidad de utilizar el papel de filtro.

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Anotaciones concentración

Solución utilizada

Condiciones del laboratorio ( temperatura, humedad)

Color del film

Método.

Observaciones

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TP4:Tallado del taco de resina Objetivos:

a) Producir una cara trapezoidal para seccionar. b) Reducir el tamaño del frente de la muestra.

Materiales:

a) bloques de tejido sin tallar. b) Cuchillas de acero. c) Acetona. d) Soporte vertical del taco. e) Lupa estereoscópica.

Conocer cómo se realiza el tallado de un

taco de resina es importante para saber ubicar la muestra cuando se realiza la inclusión. Para formar una cara trapezoidal, la cual se seccionará, es necesario tallar primeramente una pirámide y luego truncar a su ápice.

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Es importante que sean exactamente paralelos, si no, no saldrán “tiras” rectas de secciones ultrafinas con el ultramicrótomo.)

Procedimiento:

1. Extraiga el taco de la resina de la cápsula Beem haciéndole un corte con cuchilla de acero. 2. Coloque el taco de resina en el soporte adecuado. 3. Coloque la lupa e ilumine de manera que pueda observar la punta del taco. 4. Con una cuchilla de acero nueva lavada con acetona comience a extraer en capas finas la resina de la punta del taco sin tocar el

tejido. 5. A continuación realice cortes paralelos (lado superior e inferior del trapecio). 6. El próximo paso será tallar los lados laterales del trapecio. 7. La cara final deberá ser más pequeña que 0.5 mm²

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Anotaciones RÓTULO DEL TACO

TIPO DE CUCHILLA

GRILLAS (MESH)

RÓTULO GRILLAS

NOMBRE PORTAMUESTRAS

ARCHIVO DE PORTAMUESTRAS

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TP5: Preparación de polvos TEM. (Materiales)

Tp5.1-Molienda y Suspensión:

Materiales a utilizar:

Grillas.

Mortero.

Caja de Petri.

Pinza.

Pipeta.

Papel de filtro.

Frasco de vidrio de 10 ml.

Dispersante líquido.

Baño de ultrasonido.

1- El material en polvo se muele en un mortero hasta obtener un polvo de consistencia de talco. A la vista se verá un cambio de color del mismo.

2- El resultado de la molienda es dispersado en un solvente inerte, escogerá teniendo en cuenta la composición del material (etanol, agua bidestilada, etc).

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3- La suspensión resultante se coloca en un baño ultrasónico 15 - 30 minutos aproximadamente para lograr una buena dispersión del material.

4- Con una pipeta se deposita una gota de la solución anterior sobre una grilla con film soporte colocada sobre un papel de filtro para remover el exceso de material.

5- Se deja secar a temperatura ambiente aproximadamente 30 minutos. 6- La grilla conteniendo el material se guarda en portamuestras TEM hasta el momento de observar. Una alternativa es guardarlas

en un Petri cerrado. Notas: Polvos muy finos, o materiales que pueden sufrir daños en la microestructura el paso 1 no se realiza y el polvo se coloca en el solvente. Se lleva a baño ultrasónico mayor tiempo.

Polvos que no pueden suspenderse en ningún dispersante, se puede realizar el mortereado, y colocar una pequeña cantidad del polvo resultante sobre una grilla con film soporte. Polvos que no pueden morterearse ni suspenderse en dispersantes, se colocan directamente sobre la grilla con film soporte y se le aplica un corriente de aire débil ( el empleo de nitrógeno gaseoso seco es recomendable) para sacar el material sobrante.

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anotaciones Concentración

muestra

Condiciones del laboratorio ( temperatura, humedad)

solvente

Método.

Observaciones

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Microscopía Electrónica de Barrido (SEM)

TP6.1- Secado por punto crítico (Biología)

Objetivo: Familiarizarse con el principio de secado por punto crítico para muestras biológicas húmedas que se observarán en el

microscopio electrónico de barrido. Materiales: 2.5% GA. En buffer fosfato. ( ver apéndice de recetas).

Series graduales de alcohol desde 30% hasta absoluto.

Acetona .

Viales de vidrio para manejar las muestras.

Desecador de punto crítico.

Notas: Debido a que las muestras biológicas poseen un gran contenido de agua que se evapora durante el secado al aire o cuando se colocan en el microscopio de barrido a alto vacio; es necesario prever las disrupciones que se producen en el tejido. La mayoría de estas disrupciones son causadas por la tensión superficial del agua en el interior y en los alrededores de las células. En el secado por punto crítico se coloca la muestra en un ambiente donde el fluido celular pasa a fase gaseosa en un punto, en el que la tensión superficial es cero. El agua de la muestra se reemplaza gradualmente, primero por alcohol, luego por acetona y finalmente por el fluido de transición, que puede ser CO2.

El aparato de secado por punto crítico consiste en esencia en una cámara fuertemente sellada en la cual se colocan la muestra y el fluido de transición (CO2), 1 o 2 hs. La cámara se recalienta, haciendo circular agua, para llevar a la temperatura critica del líquido transicional. (Este es el punto en que la fase liquida y la fase vapor tiene la misma densidad).

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Se utiliza CO2 por ser más ecológico y económico

que los demás.

La fase del vapor fluido de transición se extrae por medio de la válvula de ventilación del equipo, muy despacio. Luego se puede extraer la muestra de la cámara, montarla en los porta muestras y metalizarlas.

Algunos de los fluidos de transición que pueden usarse son:

Fluido de transición Punto crítico CO2 liquido 31.0 ºc - 1072 psi. Freón 116 19.7 ºc - 432 psi. Freón 23 25.9 ºc - 702 psi. Oxido Nitroso 36.5 ºc – 1048 psi.

Procedimientos:

1. Escoja el tejido que va a preparar. 2. Lave la superficie con buffer fosfato (para extraer la suciedad que pueda tener). 3. Haga cortes si quiere observar la estructura interna. 4. Sumerja el tejido en 2,5% glutaraldehído en buffer fosfato 0.1M. 5. Deje fijar el tejido por lo menos 1 hora. 6. Lave con buffer para extraer el glutaraldehído (por lo menos 3 veces). 7. Deshidrate pasando por serie de alcohol desde 25% 50%, 80%, 95% y acetona 100% por 10-*15 min. , cada uno (depende de las

dimensiones de la muestra). 8. Coloque la muestra a 100% de acetona y luego en la cámara del desecador por punto crítico. 9. Coloque la muestra en las canastitas o en cápsulas Beem modificadas (con agujeros pequeños) en el equipo. 10. Nunca deje el tejido al aire. Siempre cubierto con líquido.

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TP6.2-Operación del Desecador Modelo Polaron. (Modelo manual)( Biología)

1. Haga circular agua fría para mantener la cámara a 20ºc. 2. Llene con C0₂ líquido la cámara, abriendo la válvula de entrada (debe llenarse rápidamente). 3. Deje la válvula de entrada abierta y abra la válvula de ventilación.

Mantenga un flujo constante sin que baje el nivel del líquido. 4. Abra la válvula de drenaje para que salga el líquido de sustitución (etanol o acetona). Esta acción deberá llevarse a cabo por 3 a 5

minutos. 5. Llene la cámara y cierre todas las válvulas. 6. Deje 1 hora para lograr una buena impregnación de la muestra. (tejidos menores a 1 mm³) 7. Repita la operación.(4 y 5) Siempre asegurándose que la muestra este sumergida en el líquido. 8. Cierre la válvula de entrada y permita que el líquido llegue al nivel superior. 9. Complete la corrida de secado, calentando despacio hasta 36 o 38ºC con todas las válvulas cerradas. 10. Muy lentamente ventile el CO2 (no permita que se produzca condensación). Mantenga la temperatura a 38 ºC. 11. Remueva los tejidos con cuidado, móntelos y metalícelos.

TP6.3- Montaje de especímenes para su observación por Microscopio Electrónico de Barrido(SEM).(Biología y Materiales)- Objetivos:

Ubicar la muestr de manera de poder observar la superficie de interés sin que haya problemas de carga.

Materiales: Material seco (al aire o punto crítico).

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Porta-muestras.

Cinta adhesiva doble faz.

Pintura de plata

Pinza.

Hoja de afeitar.

Notas: El montaje de las muestras es un paso muy importante para la observación en el SEM de las mismas. Primero, porque debe quedar

bien adherida para que luego de metalizarla sea buena conductora, y segundo, debido a que las dimensiones del espécimen varían de acuerdo a lo que quiere observarse y el tamaño de la cámara del espécimen que tiene el microscopio. Deberá seleccionarse el área de interés con mucho cuidado.

Procedimiento: 1. Rotule los porta muestras pegando en su cara inferior una etiqueta pequeña sin que sobresalga. 2. Si elige montar su muestra con cinta doble faz, corte la misma más pequeña que la cara superior del porta muestra. 3. Observe bien su muestra, deberá estar limpia y el tamaño no excederá el de la porta muestras (altura: 1 o 1,5 cm). 4. Si elige pegarlo con algún adhesivo (depende del tipo de muestra), coloque la cantidad necesaria y apoye la muestra. 5. Lleve a metalizar.

TP6.4 -Evaporación de metales en alto vacío. Evaporadora marca JEOL (Biología y Materiales)

Objetivos: Evaporar una capa de carbón y metal (Au, Au/Pd, Pt, etc.) sobre las muestras con el fin de hacerlas conductoras para su futura

observación en el microscopio de barrido.

Materiales:

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varilla de carbón.

canasta de tungsteno.

cantidad necesaria de metal (hilo trefilado)

evaporadora de metales en alto vacío. Nota: La evaporadora de metales en alto vacío es un accesorio muy útil para las técnicas de preparación de muestras de microscopia

electrónica. El instrumento está compuesto de tres secciones: la cámara de evaporación, el sistema de vacío para obtener las condiciones

necesarias en la cámara y en el sistema eléctrico.

La cámara de evaporación consta de:

El sistema de vacío: El instrumento posee una bomba difusora altamente eficiente y una bomba rotativa.

Un alto grado de vacio dentro de la campana (2x torr aproximadamente); puede obtenerse fácilmente y permanecer estable por

un largo período. El sistema de válvulas es manual y la operación es relativamente simple. Cuando la presión llega al rango de Torr. , el medidor Penning de vacío enciende la lámpara que indica que ya puede procederse a metalizar.

Operación:

1. Coloque en ON la llave MAIN.

2. Cierre la válvula de admisión.

3. Ponga en marcha la bomba mecánica y espere 10 segundos hasta que el sonido de la bomba pare.

4. Abra la válvula v3 ‘para evacuar la bomba difusora.

5. Deje abierta refrigeración mediante el agua fría de la bomba difusora.

6. Prenda la bomba difusora y el medidor de presión y deje actuar por 20 minutos para calentar la bomba difusora suficientemente.

7. Para colocar la muestra y preparar la cámara de evaporación deje entrar aire a la cámara mediante la válvula de ventilación y saque

la campana.

8. Coloque el carbón y el metal que se evaporará. Para lo cual ha calculado (#)el peso relacionado con el grosor del film a depositar.

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9. Coloque las muestras en el soporte.

10. Coloque en su lugar la campana y cierre la válvula de ventilación.

11. Cierre la válvula V3 y abra la V2 para evacuar la campana.

12. Después de 2 minutos, la campana, la lámpara del medidor Pirani se enciende, indicando que está en .

13. Cierre la válvula V2.

14. Abra la V3 y la válvula principal. Con este procedimiento las bombas mecánica y difusora se conectan con la campana funcionando

paralelamente y creando un vacio de Torr.

15. Lea el grado de vacío y si es el correcto comience a evaporar el carbón y luego el metal seleccionado..

Evaporación :

1. Coloque en ON el calentador. 2. Ponga en posición 1 para evaporar carbón y 2 para metales. 3. Haga pasar corriente, calentando despacio, evapore el tiempo necesario. 4. Espere 1 o 2 minutos, posiciones la perilla en 2 para evaporar metal. 5. Apague el control de temperatura. 6. Ya esta lista la muestra para ser observada.

Nota: La fórmula que se utiliza para calcular la cantidad de metal a depositar es: W sen t = 4 d2 px o w = 4d2 px (#)

sen t w= peso de metal. p= densidad de metal. d= distancia entre espécimen y metal. t= ángulo de espécimen al metal. x= grosor de la capa de metal sobre la superficie.

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TP6.5- Evaporación de metales en plasma de Argón. (Biología y Materiales).

Objetivos: Conocer el sistema ideal para evaporar metales sobre muestras para observar por el Microscopio electrónico de barrido (SEM) con el

fin de hacerlas conductoras. Materiales:

6. Sputter Coater. 7. Plaqueta de oro.

NOTA: El uso de un evaporador de metales por plasma de argón ha simplificado el proceso de recubrimiento en muestras para SEM. El

tiempo de bombeo es relativamente corto. Este método elimina la necesidad de manipulación mecánica de las muestras.

La evaporación se realiza a altas presiones (0.1 Torr). Las colisiones de metal o carbón con el gas hacen que los átomos viajen en todos sentidos, lo que asegura un recubrimiento parejo. El metal que se evaporara proviene de una plaqueta de 4 cm de diámetro (Au, Au/Pd, C, Pt, etc.). El metal se desprende de la plaqueta cuando se aplica un potencial altamente negativo entre el electrodo de la plaqueta, y un segundo electrodo en la cámara a una presión de 0.05 a 0.6 Torr. El grosor de la capa a evaporar se determina por la duración del proceso.

Procedimiento:

1. Chequee que la válvula “leak” esta cerrada (en el sentido de las agujas del reloj). 2. Coloque el reloj en la posición mínima (30 segundos). 3. Chequee que el regulador del cilindro de Argón este abierto y que la presión sea alrededor de 5 psi. (si no se usa aire).

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4. Prenda, la bomba mecánica empezara a trabajar de inmediato, después de 10-15 segundos la aguja del registrador de vacio marcará la caída de presión en la cámara. Cuando marque 0.2 Torr, la lámpara de neón “ready” se iluminara. Se debe dejar que bombee hasta que el vacio sea de 0.03 a 0.04 Torr.

5. Lleve la aguja hasta que indique 0.06 Torr. Esto requiere tres o cuatro vueltas en sentido antihorario. En esta etapa, mientras se mueve la aguja, se aprieta intermitentemente “test”, la corriente de plasma debe ajustarse a 18 mA.

6. Presione “start” (el tiempo en 30 segundos). La descarga será visible de un tono azul o purpura. La corriente de plasma de aproximadamente 1 pmA puede variar pero se ajustara la corriente con la válvula “leak”. La descarga causara la lluvia de oro, (después de 30 segundos parará), puede realizarse otra.

7. Después de evaporar colocar la perilla “power” en “off”. La válvula “leak” cerrada y se admite aire inclinando “vent”.

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TP7-SECCION MORFOMETRIA Morfometría : Cálculo de tamaños. Errores de medición e instrumentales. Cálculo de ampliación de una copia y selección de

escala. Preguntas frecuentes:

Qué errores al medir están involucrados en la medición de una imagen?

La magnificación final cómo se relaciona con las magnificaciones de cada lente?

Cómo se calcula la amplificación de una copia (ya sea en papel o digital)?

Como se define tamaño? Qué tipos de definiciones existen?. En qué se basan estas definiciones?.

Cuando se emplea una distribución de tamaños?. Qué sentido físico tiene?. EVALUACION

1-a) La siguiente imagen fue tomada con una magnificación de 10000x. Calcule el tamaño de la partícula señalada.

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b) La imagen anterior fue ampliada. Cuántas veces?

2) En la siguiente tabla se presentan las magnificaciones reales y los tamaños correspondientes a cada una de ellas. La imagen que se muestra , a que magnificación del TEM fue tomada?.

tamaños

Mag. Teórica Mag. Real 1 cm =... micras

2000 1954,00 5,12

4000 3908,00 2,56

6700 6545,90 1,53

10000 9770,00 1,02

14000 13678,00 0,73

20000 19540,00 0,51

27000 26379,00 0,38

40000 39080,00 0,26

50000 48850,00 0,20

67000 65459,00 0,15

80000 78160,00 0,13

100000 97700,00 0,10

200000 195400,00 0,05

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3) Un detalle mide 2 micras a una magnificación de 10000x. Cuántas micras medirá el mismo detalle a 50000x?

4) Si una distribución de tamaños es muy dispersa, que solución propone a fin de tener una buena representatividad de tamaños?

5) Una forma circular en una imagen TEM, que posibles geometrías espaciales puede sugerir?.

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TP8-Interpretación de imágenes

En esta sección se profundizará el análisis de imágenes. Preguntas frecuentes…

Qué es una imagen? .

Cuál es la máxima información que puede obtenerse de ella?.

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GLOSARIO

Aberración: Desviación en el enfocado de la imagen en un sistema óptico, causado por la imperfección en las lentes o por falta de uniformidad del haz electrónico. Aberración cromática: derivada de la longitud de onda de los electrones y de la velocidad aplicada a los electrones. Longitudes de onda más rápidas y de menor amplitud son menos desviadas que las que son lentas y de mayor longitud de onda. Aberración esférica: el defecto se debe a que los electrones periféricos se desvían más que aquellos que viajan cercanos al eje de la lente. Angstrom: Unidad de longitud: 1 A =0,1nm. (1nm = millonésima de milímetro) . Ánodo: parte del cañón , con carga positiva, hacia donde son acelerados los electrones emitidos desde la fuente de energía ( filamento). Aperturas: discos o láminas metálicas que poseen orificios que van desde 20 micrones hasta 100 micrones de diámetro y que permiten el paso de algunos electrones dependiendo de las necesidades de observación de la muestra. Artefactos: Durante los procesos de preparación de la muestra u observación se producen errores que pueden llevar a interpretaciones erróneas y se denominan artefactos Astigmatismo: Aberración derivada de las lentes que no son absolutamente simétricas. En una dirección, la longitud focal es diferente a la dirección opuesta ocasionando una distorsión de la imagen en algunos de los ejes (x o y). Efecto: la imagen no puede enfocarse correctamente. Átomo: formado por un núcleo cargado positivamente (PROTONES) y NEUTRONES (neutros), rodeado de electrones con carga negativa girando en órbitas discretas. ) Auger: electrones de muy baja energía que dan información sobre una capa muy fina superficial de la muestra. Barrido: relacionado con la microscopía electrónica se refiere al haz de electrones pasando por la superficie de una muestra punto a punto y obteniendo una imagen de la estructura superficial. Bomba difusora de aceite: Bombas para obtener vacío en la columna que produce el bombeo por el arrastre de vapor de aceite a través de una conexión a la columna. Bomba Iónica de vacío: Bomba para realizar vacío en la que el movimiento de iones en un fuerte campo magnético arrastra las moléculas de gas y las introduce en el cátodo de la bomba. Bomba rotativa: Bomba para hacer vacío en que la acción de bombeo se produce por el movimiento de volúmenes de aire de un lado a otro de un cilindro rotatorio mediante un tambor exéntrico. Bomba turbomolecular: El alto vacío que genera se produce por la acción de discos que giran a altas velocidades y fuerzan el movimiento de las moléculas del eje hacia la periferia.

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Catodoluminiscencia: Emisión de fotones desde un material que es bombardeado por electrones. Cápsula BEEM : son cápsulas comerciales de PVC cuyo nombre es BEEM y se utilizan como moldes para incluir muestras o se pueden transformar en cápsulas para realizar secado por punto crítico. Cápsula de Wehnelt: En la cápsula se produce la diferencia de potencial entre el cátodo (filamento) y el ánodo (tierra) dando lugar a la emisión primaria del haz de electrones. Carga: efecto que se produce al no ser la muestra conductora observándola en un microscopio electrónico convencional de barrido. En el Microscopio electrónico de Presión variable o ambiental las cargas se compensan y no es necesario metalizar. Cinta doble faz adhesiva: cinta que puede ser conductora o no, adhesiva por dos de sus caras, muy práctica para adherir las muestras para microscopía electrónica de barrido. Citoquímica: método utilizado para estudiar la actividad enzimática por microscopía electrónica. Columna: Parte del microscopio electrónico que contiene las lentes electromagnéticas, el espécimen y las aperturas. Contraste por amplitud: debido a la absorción de determinadas longitudes de onda, este proceso físico contribuye al contraste de la imagen. Contraste por difracción: Contraste de fase: se debe a fenómenos de interferencia en la formación de la imagen. Deshidratación: Extracción del agua que contienen las muestras húmedas. Detector: Dispositivo para detectar señales, en el caso de los microscopios electrónicos electrones de distintas energías, fotones y rayos x. Difracción: Dispersión periódica de un objeto que se mueve cuando choca con un patrón ordenado de objetos fijos. La difracción siempre sigue la Ley de Bragg: En Microscopía Electrónica el espaciado se determina entre los átomos de un cristal punto a punto. Distancia de trabajo: Distancia que se mide entre la superficie del espécimen y la lente objetiva. Menor distancia de trabajo, mayor resolución. Distancia focal de una lente: distancia medida desde el centro de la lente en la que un haz incidente paralelo es enfocado. EDX: espectrometría dispersiva por rayos X en el que se genera un espectro de los rayos x emitidos por la muestra en función de su energía pudiendo analizarse los elementos químicos que la componen en un punto, área o línea. Electrón: Partícula atómica fundamenta que gira alrededor del núcleo del átomo y tiene carga eléctrica negativa. Electrones retrodispersados: electrones que han sido desviados por el espécimen en un ángulo mayor a 180 º con poca o ninguna pérdida de energía. Electrones secundarios: Se originan en el espécimen y dan información sobre la topografía de la muestra. Enfoque: Ajustando la lente objetiva y corrigiendo astigmatismo se logra una imagen enfocada. ESEM: Microscopía electrónica ambiental. Evaporadora de metales en plasma de Argón: Instrumento que sirve para recubrir el espécimen que no es conductor con una capa uniforme muy

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fina de un elemento conductor, que puede ser oro, oro / paladio, plata. Platino, etc. FEG: El cañón de emisión de campo. (sigla :Field Emission Gun) FIB: Haz de iones focalizados (galio u otro gas) que sustituye al haz de electrones. Fijación: se realiza mediante un proceso físico o químico con el objeto de preservar las estructuras lo más parecido posible al estado natural. Filamento: hilo en forma de ¨v¨ que al calentarse en vacío emite electrones constituyéndose en una fuente de electrones del microscopio. Fotomultiplicador: Dispositivo electrónico en el que la luz es amplificada sin interferencias para producir una señal eléctrica. Fractura en frío: se utiliza para observar el medio interno o externo de superficies. Goniómetro: Platina del espécimen que permite movimientos en varias direcciones dependiendo del instrumento. Interacción elástica: Interacción inelástica: Ión: Un átomo en su estado cargado. Puede tener carga positiva o negativa.

Lente: Una pieza metálica rodeada de un alambre de cobre que al hacer pasar energía por ella se transforma en un campo magnético capaz de desviar la trayectoria de lo s electrones.

Lente condensadora: Lente diseñada para concentrar el haz de electrones. Lente objetiva: Es la lente más importante del microscopio. La que forma la imagen. Longitud de onda: La distancia entre dos puntos de una onda periódica que están en fase. Material Mesoporoso: Material que posee poros regularmente acomodados que varían entre 2 y 50mm de diámetro. Microencapsulación: Pequeñas partículas encapsuladas individualmente. Micrómetro: Unidad de longitud que es la milésima parte del milímetro o 1.000nm.

Microscopía correlativa: se utiliza para observar la misma célula por microscopía óptica (generalmente por fluorescencia) y electrónica. Nanocompuestos: los compuestos inorgánicos o polímeros formados por dos o más componentes físicamente distintos, con dimensiones

promedio diferentes y más pequeñas que 100nm. Nanocristal: sólido compuesto por estructura molecular o atómica repetitiva con un patrón 3D . Nanómetro: Unidad de longitud que es igual a la millonésima de milímetro. 1x10-9metros.

Plaqueta de oro: Es una plancha de pocos milímetros de espesor de oro y del diámetro del accesorio del instrumento, que se coloca en el aparato de evaporación de metales para evaporar el metal sobre la superficie de las muestras.

Poder de resolución: La capacidad de distinguir dos puntos que se encuentran a una mínima distancia entre sí. (Varía según el instrumento que se utilice). Rayos X característicos: Un rayo X que tiene una energía única emitida por un átomo durante la ionización de uno de sus electrones. Secador por punto crítico: Equipo que se utiliza para secar muestras biológicas a ser observadas por microscopía electrónica de barrido.

Tomografía Electrónica: Se utilizan secciones de 1 m para obtener imágenes tridimensionales y realizar reconstrucción tridimensional usando un software de computación.

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Torr: unidad de medida de presión: 760Torr es la presión estándar a nivel del mar. Vacío: espacio en el que se han eliminado la mayor parte de los gases y vapores. Voltaje de aceleración: Es la diferencia de potencial entre el ánodo y el cátodo de un cañón de electrones mediante el cual los electrones son acelerados. A mayor aceleración mayor velocidad de los electrones, menor long. de onda y mayor resolución.

Bibliografía

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2. Scanning Electron Microscopy and x-ray microanalysis. J-Goldstein et all. Plenum Press. New York. 2nd.ed. (1992). 3. Electron microscopy and Analysis. P. J. Goodhew , F.J.Humphreys, R. Beanland . Taylor & Francis.. London. 2ND Ed. (1988). 4. Principles and techniques of electron microscopy´. Biological applications. M.Hayat. Van Nostrand Ed. (1978).

5. Sample Preparation Handbook for Transmission Electron Microscopy:Techniques. J. Ayache,L.Beaunier,J.Boumendil,G.Ehret,

D.Laub. Springer, NY. (2010).

6. Electron Microscopy: Principles and Techniques for Biologists. J. J. Bozzola and L. D. Russel. Jones and Bartlett Publishers Inc. 2ndEd. (1999).

7. Practical Electron Microscopy for biologist. G. Meek. 2nd Ed. John Wiley (1977). 8. Inmunogold-silver staining´M.Hayat CRC Press, Inc. (1995).

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(1974). 15. Scanning Electron Microscopy. M Postek. Ladd Research Ind. (1980). 16. Introducción a la Microscopía Electrónica. A.Morales, V.Sorrivas. ISBN 950-43-2205-0.CRIBABB (1986).

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Algunos sitios sobre Microscopia Electronica disponibles en la web:

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Este libro se terminó de editar el 24 de Septiembre de 2014 en Bahía Blanca.

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