microbiologia de alimentos : laboratorios

Facultad de Ciencias Agropecuarias

Escuela Académico-Profesional de IngenieríaAgroindustrial

PRÁCTICA # 01 – RECUENTO EN PLACA

CURSO : MICROBIOLOGÍA DE LOS PAI.

DOCENTE : Blg – Mblg. GERARDO ALAYO ESPINOZA

ALUMNO : CAVA SALINAS, MARCO

CICLO : VII

TRUJILLO – PERÚ

2008

Cátedra de Microbiología y Tecnología de Alimentos UNT

I. INTRODUCCIÓN:

El método de recuento en placa, permite la determinación de los microorganismosviables presentes en una muestra, siempre que se utilice un medio de cultivo adecuado yque las condiciones de incubación sean correctas (nutrientes, atmósferas y temperatura).Por lo tanto, este método puede aplicarse al recuento de grupos distintos demicroorganismos. Así tenemos: microorganismos psicrófilos, mesófilos, termófilos,mohos y levaduras, enterocococos, estafilocococos, enterobacterias, etc. (Pelczar19).

Las técnicas de siembra más comúnmente usadas para el recuento de microorganismosviables, son el recuento estándar en placa por siembra por incorporación y el recuentoen placa de siembra por extensión en superficie. Es necesario indicar, que ninguna deestas formas de siembra es capaz de poner de manifiesto todos los microorganismosviables presentes en una muestra, debido a la variedad de necesidades nutritivas ycondiciones físicas exigidas por los diferentes tipos de microorganismos, por lo cual elrecuento en placa proporciona sólo una aproximación de la población total presente enla muestra.

Como las colonias pueden originarse tanto de una célula como de un grupo de células,para expresar el resultado se utiliza el término: “unidades formadoras de colonias”(u.f.c). Además, a fin de que todas las células que queden en una placa tengan unaadecuada disponibilidad de nutrientes, y que los errores del método sean menores, seestablece que las condiciones óptimas de conteo se dan cuando desarrollan entre 30 y300 colonias por placa. Cuando esto no se cumple se considera el valor obtenido comouna estimación del recuento.

Para estimar los materiales sólidos que son solubles en el agua o que formansuspensiones finas en este medio (como por ejemplo harina, leche en polvo, azúcar), sesuspende o se disuelve por agitación en un diluyente estéril una cantidad dada demuestra. Ciertos materiales sólidos como el queso y la carne, deben se triturados hastapequeñas partículas en diluyente estéril. Entre los diluyentes más comúnmenteempleados se encuentran la solución Ringer diluida a un cuarto, el diluyente agua depeptona y la Solución Salina Fisiológica Peptonada (S.S.F.P).

II. OBJETIVOS:

a. Adiestrar al estudiante con el método

b. Determinar el número de microorganismos viables presentes en unamuestra de alimento.


III. MATERIAL:

1. BIOLÓGICO:

- Muestra: Agua

2. DE LABORATORIO:

- Placas de petri estériles.

- pipetas.

- mechero

- Tubos de ensayo.

3. MEDIOS DE CULTIVO:

- Agar cuenta gérmenes (PCA)

- Solución Salina Fisiológica Peptonada (SSFP)

4. EQUIPOS:

- Contador Quebeck

- Incubadora regulada a 35 – 37ºC.

IV. PROCEDIMIENTO:

La muestra debe llegar al laboratorio convenientemente identificada cumpliendo losrequisitos de muestreo.

4.1 SIMBRA POR INCORPORACIÓN:

1. Desinfectar al lugar de trabajo con alcohol Yodado.

2. identificar la muestra con los siguientes datos: Nombre y/o número dellote, dilución, volumen sembrado, técnica de siembra, fecha, operador,etc.

3. Según la carga microbiana esperada elegir las diluciones a sembrar.Realizar no menos de tres diluciones consecutivas: 1:10, 1:10, 1:1000.Cada vez que se prepara una dilución cargar y descargar la pipeta cuandomenos tres veces.

4. depositar 1Ml de cada dilución en placas estériles, vacías, porduplicado.


5. Adicionar a cada placa 15 a 20 mL del medio de cultivo a emplear (porejemplo PCA, para bacterias aerobias mesófilas viables, u otro medio decultivo de acuerdo al microorganismos que se desee contar), previamentelicuado y enfriado a 45ºC.

6. Mezclar cuidadosamente el medio y el inoculo mediante unacombinación de movimiento giratorios y de vaivén, cobre la superficie dela mesa de trabajo. Deben tomarse precauciones para que durante estosmovimientos, el agar no toque la tapa de la placa de Petri. Dejarsolidificar.

7. Después de solidificado el agar, incubar las placas a 37ºC durante 24 a48 horas.

8. Para el recuento, escoger las placas en las que ha desarrollado entre 30a 300 u.f.c.

4.2 SIEMBRA POR EXTENSIÓN EN SUPERFICIE:

Si la siembra es en superficie, se deposita en la superficie de las placas que ya contieneel medio de cultivo solidificado, 0,1 mL de cada dilución. Se siembra por duplicadopara cada dilución. Luego de colocada la muestra, se procede a extenderla sobre lasuperficie de las placas con un asa adecuada. Incubar las placas a 37°C por 24 a 48horas, luego hacer la lectura e informar el resultado.

La técnica de siembra por extensión en superficie es más adecuada para recuentos depsicrótrofos y psicrófilos, o muestras en las que se supone hay patógenos para que losmicrobios no se inactiven con la temperatura del agar licuado.

V. ESQUEMA DE TRABAJO.

1° Paso:

Se procede a desinfectar las manos con el del que va a realizar elexperimento con el alcohol iodado y a desinfectar el ambiente con unmechero encendido por donde se han de pasar de manera cuidadosa losinstrumentos a utilizar como lo grafica el siguiente esquema:


2° Paso:

Acá se procede a tomar 1 ml de muestra con la pipeta y colocar en 1ºlugar a uno de los dos tubos que contienen a la solución salina fisiológicapara obtener la 1º solución 10-1 y de donde después se a de tomar 1 mlpar ser agregado en 2º lugar al segundo tubo para obtener la 2º solución10-2:

3° Paso:

Aquí se tomo como 1 ml de cada solución y se coloco en una placa petrixque a su vez contenía de 12 a 15 ml de agar. En este caso se graficadocomo si se hubiese realizado en dos placas pero en realidad solo serealizo una en la primera fecha del experimento:

4° Paso:

Como paso final se coloco a las placas petrix en una estufa a 37º C x 48horas para que incube y así puedan formar las colonias:

Muestr a


10-12 ml. Agar PCA

Homogenizar

Lectura


VI. RESULTADO.

En el presente experimento se obtuvo como resultado del recuento de bacterias lacantidad de 2000 u.f.c. / mL. Abajo observamos la placa con las colonias:

VII. COMENTARIO.Este método es muy sencillo y práctico ya que nos permite detectar lapresencia de microorganismos viables en los alimentos, como bacteriasaeróbias mesófilas, coliformes, clostridium, etc. sin ninguna dificultad.La ventaja del método de recuento en placa es su gran sensibilidad. Si se utiliza unmedio y unas condiciones de incubación adecuadas, puede detectarse incluso unaúnica célula viva. Además, el recuento en placa no requiere un equipo complicado.Un inconveniente es que el recuento en placa es lento y tedioso y no es muypreciso, porque la precisión depende del recuento de un número elevado decolonias. La precisión aumenta con el número de colonias que se recuentan, ya quedisminuye el error debido al muestreo.

VIII. CUESTIONARIO.

1. ¿Cuál es el fundamento del método de recuento en placa?

Este método se basa en contar el número de colonias desarrolladas en una placa demedio de cultivo sólido, donde se ha sembrado un volumen conocido de agua,transcurrido un tiempo y a una temperatura de incubación determinados.

2. ¿Por qué, para el recuento de bacterias viables, se escogen las placas quehan desarrollado entre 30 y 300 u.f.c.?

Por razones estadísticas. Para obtener resultados estadísticamente significativos.Para que ello sea posible, en el momento de la siembra debe tenerse una ideaaproximada del número de bacterias presentes en la muestra a fin de realizar lasdiluciones adecuadas. A la cantidad de bacterias contadas en los recuentos se ledebe de multiplicar por el inverso del factor de dilución y así poder reportar elresultado en UFC.


3. ¿Cuáles son las ventajas y desventajas de las siembras por incorporacióny superficie?

POR INCORPORACION POR SUPERFICIE

Mayor cantidad de muestra a procesar. Menor cantidad de muestra a procesar.

Menor error. Mayor error.

Mejor aprovechamiento de nutrientes porparte de los microorganismos.

Peor aprovechamiento de nutrientes por parte delos microorganismos.

Dificultad para subcultivar colonias. Facilidad para subcultivar colonias.

Difícil visualización de colonias. Fácil visualización.

La temperatura del agar puede afectar aciertos m.o.

No se afectan las células termosensibles.

Se desarrollan microaerofílicos. En aerobiosis solo crecen aerobios y anaerobiosfacultativos.

4. ¿Por qué se utiliza el término “unidades formadora de colonias” (u.f.c.)?

Este término se utiliza pues las colonias pueden originarse tanto de la célulacomo de un grupo de células. Además en las colonias son formadas a partirde un microorganismo y se multiplican tan rápido hasta formar una coloniaPor ejemplo en el recuento en placa con una disponibilidad adecuada denutrientes, se establece que el recuento bajo condiciones óptimas se logradesarrollar entre 30 y 300 colonias por placa.

5. ¿Por qué el método de recuento en placa, no nos permite determinar eltotal de la población viable de bacterias presentes en una muestra dealimento?

Un recuento de viables mide sólo las células vivas de una población, es decir,aquellas capaces de reproducirse (viable significa "que puede vivir"), bajo lascondiciones del medio.

Se basa en el principio de que una única célula viable originará una coloniavisible, cuando se siembre en una placa de agar; por lo tanto no será posiblela determinación del total de viables, debido a que en un alimento existe unavariada gama de microorganismos con requerimientos nutritivos yambientales diferentes, si alguno de ellos posee las condiciones adecuadaspara su desarrollo, otro de ellos puede no contar con estas.


La ventaja del método de recuento en placa es su gran sensibilidad. Si seutiliza un medio y unas condiciones de incubación adecuadas, puededetectarse incluso una única célula viva. Además, el recuento en placa norequiere un equipo complicado.

Un inconveniente es que el recuento en placa es lento y tedioso y no es muypreciso, porque la precisión depende del recuento de un número elevado decolonias. La precisión aumenta con el número de colonias que se recuentan,ya que disminuye el error debido al muestreo.

En muchos casos conviene contar las células vivas, y esto en laboratorio sesuele hacer mediante el recuento de viables. (Una célula se define comoviable cuando, colocada en un medio adecuado, es capaz de dividirse y dardescendencia). El método habitual de lograr esto es sembrar pequeñasalícuotas de diluciones adecuadas de un cultivo original sobre placas de Petrixcon medio sólido (con agar).

Cada célula viable dará origen a una colonia visible después del tiempoadecuado de incubación. Contando las colonias visibles, teniendo en cuenta ladilución de la que proceden y el volumen de alícuota utilizado, es fácildeducir el número de células viables en la suspensión original.



PRACTICA # 02: RECUENTO POR EL MÉTODO DEL NÚMEROMÁS PROBLABLE



ALUMNO : GUEVARA ENRIQUEZ, JUAN

CICLO : VII

TRUJILLO – PERÚ

2008


I. INTRODUCCIÓN:

El método del Número Más Probable (NMP), o llamado también llamado método de lostubos múltiples, es un método alternativo que permite efectuar el recuento de cifrasbajas de microorganismos, viables, por ejemplo, menos de uno por mL. Proporcionauna idea aproximada del número de bacterias vivas presentes en una muestra dealimento, que pueden multiplicarse en una medio de cultivo líquido determinado. Elmedio de cultivo a elegir depende del tipo de microorganismo que se desea contar, portanto se pueden utilizar medios de enriquecimiento selectivos, ó medios de propagación.

El método del NMP, es útil para determinar el número de diversos tipos demicroorganismos presentes en una muestra de alimento. Así, utilizando los medios decultivo apropiados, se puede determinar el número de coliformes y E. Coli, enterococos,estafilococos, salmonella, etc.

El método se fundamente en la determinación de la presencia o ausencia de undeterminado tipo de microorganismo (en función de que crezcan o de que produzcandeterminada reacción en el medio o no), en diferentes cantidades de muestra en la quetodavía hay crecimiento microbiano.

Este método es útil para determinar cargas microbianas bajas, pero tamicen puedeemplearse para determinar cargas mayores utilizando las diluciones apropiadas. Asímismo, es el único método a utilizar en el caso de muestras como por ejemplo polvosinsolubles, en los que no es aplicable el método de filtración ni recomendable el deplacas debido a la presencia de partículas. Se prefiere también este método cuando losmicroorganismos son de lento crecimiento, o cuando han sido sometidos a condicionesadversas (temperatura alta, desecación, etc.). Es posible enumerar tambiénmicroorganismos anaerobio utilizando medio pre reducido, que se cubren con vaselina oparafina luego de inocular o incubar en condiciones anaerobias.

II. OBJETIVOS:

1. Adiestrar al estudiante en el método del Número Más Probable.

2. Determinar el número aproximado de bacterias viables presentes en unamuestra

III. MATERIAL:

1. BIOLÓGICO:

- Muestra: Agua


2. DE LABORATORIO:

- Placas de petri estériles.

- Tubos de ensayo 16 x 150

- Tubos de ensayo 13 x 100

- pipetas de 10 y 1 mL

- Campanas Durham de 10 x 75

- Mechero

3. MEDIOS DE CULTIVO:

- Caldo lactosado bilis verde brillante (BRILLA)

- Agar Violeta Rojo Bilis (VRBA)

- Agar Tres Azúcares Hierro (TSI)

- Caldo Triptonado o peptonado

4. EQUIPOS:

- Estufa regulada a 35 – 37 ºC

- Baño maría regulado a 44 ± 0.1ºC.

5. REACTIVOS:

- Kovac’s

IV. PROCEDIMIENTO:

El procedimiento a seguir, depende del tipo de microorganismos que se quiere enumeraren la muestra de alimento. Así para la presente práctica, se determinará en una muestrade agua el número de coliformes totales, coliformes fecales (termotolerantes) y E. Colifecal.

4.1 DETERMINACIÓN DE COLIFORMES TOTALES:

1. Desinfectar a mesa de trabajo con alcohol yodado.

2. Identificar la muestra.

3. Agitar el frasco que contiene la muestra.


4. Pipetear 10 mL de caldo BRILA doble concentrado, 1 ml a los tressiguientes tubos conteniendo BRILA a concentración normal y 0.1 mLa los tres tubos restantes con BRILA a concentración normal.

5. Homogeneizar la siembra adecuadamente e incubar los tubos a 35-37ºC durante 24 a 48 horas.

6. Anotar como positivos los tubos que muestren producción de gas enlas campanas de Durham.

7. Obtener el Número Más Probable (NMP) de la siguiente manera

Para valores de 3, 1 y 0 respectivamente, la tabla indica un NMP de 43/100 mL (Según tabla del NMP)

4.2 DETERMINACIÓN DE COLIFORMES FECALES Y E. Coli.

1. De cada tubo positivo (presencia de gas) del paso anterior, sembraruna alícuota en caldo Brila (Concentración simple) y otra alícuota encaldo triptonado.

2. Incubar en baño maría a 44 + 0.1 ºC durante 24-48 horas.

3. Luego del tiempo de incubación, efectuar la prueba del indol en lostubos con caldo triptonado, para lo cual se adiciona 2 a 3 gotas de reactivode Kovacs.

4. Agitar el tubo y Observar la Formación de un anillo color grosella en lainterface del medio de cultivo (reacción positiva); un color naranja, indicala presencia probable de escatol y puede ser reportado también como unaprueba positva.

5. los cultivos (tubos) que muestren producción de gas en caldo BRILA yla formación de indol en caldo triptonado son positivos a E, Coli fecal.

6. Los cultivos que sólo muestren producción de gas más no producciónde indol se consideran coliformes fecales.

7. Determinación del NMP de coliformes fecales y E. Coli en la tabla delNMP.



1° Paso:

En este primer paso se tomo 1 ml de muestra (agua potable) y se formaron dossoluciones de 10+1 y 10+2 respectivamente en cada tubo:

2° Paso:

Como segundo paso se coloco 10 ml de muestra en los tres primeros tubos quecontenían la solución brilla, luego se coloco 1 ml de solución 10-1 en cada uno delos tres tubos siguientes y finalmente 0.1 ml de solución 10-2 en los tres tubosfinales:

3° Paso:

Finalmente se deja incubar en una estufa por el periodo de 48 horas a una 37ºCpara luego observar los resultados:


VI. RESULTADO.

El resultado obtenido este caso fue de 3+, 3+, 0-, lo cual nos indica que el NMP esde 240/100ml y con un límite de confianza entre 36 y 1300. Abajo se muestra lostubos de ensayo del experimento:

Muestr a

Tubos 2 Tubos 3

Tubos 1

Incubación37ºC

(24-48h.)

Incubación 37ºC

(24-48h.)


VII. COMENTARIO.Es un método útil para determinar cargas microbianas bajas, puede serutilizado para cantidades mayores pero con diluciones apropiadasespecialmente para muestras de polvos. Esta técnica se usa principalmentepara la estimación de bacilos coliformes, empleando caldo de MacConkey, peropuede utilizarse casi para toda clase de gérmenes en muestras líquidas sipuede observarse fácilmente el crecimiento, por ejemplo, si hay turbidez yproducción de ácido. Ejemplos de ellos son las levaduras y hongos en jugos ybebidas de frutas, clostridios en emulsiones de alimentos, cadenas de esporosen suspensiones de harina. El método es popular aunque poco exacto.VIII. CUESTIONARIO.

1.- ¿Qué otras formas conoce, para realizar el método del NMP?

Existen diversas formas de realizar este método, en la práctica se realizarondiluciones consecutivas (10-1, 10-2, 10-3) de las 1 ml de muestras en 9 ml deagua pectonada (1%) en tres tubos, de los cuales se tomo para cada caso 1 mlde dilución y se le agregó a otros tres con caldo BRILA a concentraciónnormal. Otra forma es transferirse de la muestra original 10 ml a los tresprimeros tubos conteniendo 10 ml de caldo BRILA doble concentrado, 1ml alos tres siguientes y 0.1 ml a los tres restantes; ambos a concentración normal.

La muestra puede ser diluida ser seriadamente transfiriendo 1 ml a un tubo con9 ml de caldo. Cada transferencia corresponde a una dilución de 1 en 10. Sepuede dividir la placa petrix en cinco zonas de igual tamaño. Use una placa porcada muestra. Rotule cada zona con el factor de dilución a ser inoculado.

Transferir 5 µl de la dilución apropiada al área correspondiente. Repita estaoperación cinco veces por cada dilución. Permitir que el inoculó seque sobre elmedio de crecimiento. Selle la placa. Invierta la placa e incube a 25°C por 7días.

Las muestras a analizar no solo son liquidas, muchas veces son sólidas, enestos casos suele agregarse 10 g de muestra en 90 g de agua, se agita y alsedimentarse se trabaja con el sobrenadante, a partir de este se podrá realizarlas diluciones o trabajar directamente como el procedimiento antesmencionado.

En algunas ocasiones realizar tres diluciones consecutivas no es suficiente, porlo que es conveniente realizar las diluciones necesarias hasta obtener resultadosmás precisos.


2.- ¿Cuáles son las ventajas y desventajas del método de NMP?

VENTAJAS:

- La capacidad de estimar tamaños poblacionales basados en atributosrelacionados a un proceso (selectividad).

- Provee una recuperación uniforme de las poblaciones microbianas de suelosdiversificados.

- Determina solo organismos vivos y activos metabólicamente.

- Suele ser más rápido e igual de confiable que los métodos tradicionales deesparcimiento en platos de cultivo, entre otros.

- Determina cargas microbianas baja, pero también pueden emplearse paradeterminar cargas mayores utilizando las diluciones apropiadas.

- Presenta ventajas frente a otros métodos para el caso de muestras comopolvos insolubles.

- Preferible para microorganismos que presentan crecimiento lento o han sidosometidos a condiciones adversas.

- Es posible enumerar microorganismos anaeróbicos utilizando medio prereducido, cubriendo con vaselina.

DESVENTAJAS:

- No detectan las poblaciones con menos de una célula por mililitro, sólopermite microorganismos viables.

3.- ¿Qué otras formas de lectura, permiten determinar tubos positivos en elmétodo de NMP?

- Cambio de color (Verde brillante a verde celestino (verde nilo)).

- Cambio de aspecto (transparencia a turbidez).

- Por pruebas presuntiva y prueba confirmativa done existe formación de gas.

- Formación de ácido.



PRÁCTICA # 04: RECUENTO EN TUBO DE ANAEROBIOSSULFITO REDUCTORES



ALUMNO : LEÓN PICÓN, BRUCE

CICLO : VII

TRUJILLO – PERÚ

2008


I. INTRODUCCIÓN:

El método de recuento en tubo, es otro método que permite la determinación del númerode microorganismos viables presentes en muestras de alimentos. Este método, esparticularmente útil para el recuento de microorganismos anaerobios, tales como losclostridios sulfito reductores, siempre y cuando se utilice el medio adecuado y lascorrectas condiciones de incubación.

En este método, es necesario colocar la muestra o una dilución de la misma, en un tuboestéril, para luego, homogeneizar. Con la finalidad de darle las condiciones deanaerobios, después de solidificado el medio de cultivo, se debe agregar una sobrecapade agar agar o del mismo medio de cultivo empleado. Después de la incubación secalcula el número de bacterias por mililitro o gramo de muestra original contando lascolonias negras que se observan en el tubo.

Los medios de cultivo empleados para el recuento de anaerobios (por ejemploclostridios sulfito reductores), son el medio Triptona Sulfito Neomicina Agae (TSNAgar), o el medio Sulfito Polimixina Sulfadiacina Agar (SPS Agar)

Es pertinente aclarar, que el recuento de microorganismos anaerobios, también se puederealizar por el método de recuento en placa, para lo cual se debe emplear el mediocultivo adecuado y las adecuadas condiciones de incubación y se pueden contar de igualmanera esporos de anaerobios sulfito reductores, pasteurizando la muestra original o lasdiluciones por 10 minutos a 80oC antes de añadir el medio de cultivo.

II. OBJETIVOS.

1. Adiestrar al estudiante con el manejo del método de recuento en tubo paraanaerobios.

2. Determinar el número de microorganismos viables (anaerobios sulfitoreductores) presentes en una muestra de alimento.


III. MATERIAL.

1. BIOLÓGICO:- Muestra (Por ejm., agua estancada).

2. DE LABORATORIO:- Tubos con agua de dilución (9 mL de agua peptonada).- Tubos de ensayo de 15 x 150 vacios estériles.- Pipetas de 1 y 5 mL.- Gradilla.

3. MADIOS DE CULTIVO:- Agar SPS ó Agar TSN.- Agar agar.

4. EQUIPO:- Incubadora regulada 35 – 37°C.

IV. PROCEDIMIENTO.:

1. A partir de la muestra de agua estancada realizar tres diluciones consecutivas 10-1

10-2 y 10-3.

2. De cada una de las 3 diluciones pipetear por duplicado 1 mL en cada uno de los tubosestériles.

3. Verter en cada tubo 12 a 15 mL de SPS ó TSN fundido a una temperaturaaproximada de 45°C y homogeneizar suavemente sin agitar. Dejar solidificar lostubos en posición vertical.

4. Adicionar una capa de 2 a 3 mL de SPS ó agar agar.

5. Dejar solidificar. Incubar a 37°C por 24 a 48 hs.

6. Después del periodo de incubación, contar las colonias negras, seleccionando lostubos que presenten entre 1 a 20 colonias; sacar el promedio y multiplicar por elinverso de la dilución.

7. Informar como anaerobios sulfito reductores totales por mililitro de muestra.

Nota:

a. Para el recuento de esporulados realizar un previo calentamiento de la muestra (paso2) a 80°C durante 5 a 10 minutos y luego seguir el mismo procedimiento que paraanaerobios sulfito reductores totales.

b. Si se desea identificar el tipo anaerobio sulfito reductor, seleccionar cinco coloniasnegras al azar y sembrarlas en caldo tioglicolato.


Incubar en baño maría a 46 ± 0.1°C durante 3 a 4 horas, no siendo necesario incubaren condiciones de anaerobiosis.Realizar la coloración Gram y determinar: La fermentación de la lactosa, movilidad,licuefacción de la gelatina y reducción de nitratos.


1° Paso:

Se toma 1 ml de la muestra y se forma soluciones 10-1 y 10-2:

2° Paso:

En cada uno de los tubos anteriores se coloca 2 ml de agar agua y 12 agar previamentecalentados:

3° Paso:

Una vez que se ha solidificado se lleva a incubación por 18-24 horas a 37 ºC:

Desinfección de manos einstrumentos a usar


Agua potable

1 ml

Tubos estériles

Toma de muestra

Adición a cada tubode agar agua y agarSPS (los quepreviamente fueroncalentados hastafundirse)

Agaragua

AgarSPS

10 ml

2 – 3 mlSe deja solidificar y luego se lleva

a incubar a 37°C por 3 días.

Se hace lectura contandolas colonias negras


VI. RESULTADO.

Se encontró que si existían colonias de bacteria y se observaron por la formación depuntos negros que es producido por la reducción de sulfitos. Abajo se observa eltubo con las colonias que son los puntos negros: Se obtuvo en promedio 68colonias por mililitro de muestra

VII. COMENTARIO.

En este experimento se ha demostrado que es útil para el recuento de colonias debacterias especialmente anaerobias en especial los clostridium sulfito reductores.

Este método nos permite determinar el número de microorganismos viablespresentes en alimentos, es útil particularmente útil para el recuento demicroorganismos anaerobios, tales como los clostridios sulfito reductores, siemprey cuando empleemos un medio adecuado y las correctas condiciones de incubación.

VIII. CUESTIONARIO.

1.- ¿Qué otros microorganismos se puede enumerar mediante el método derecuento en tubo?

Se pueden enumerar los siguientes:

E. Coli

Bacillaceae Anaerobios

Clostridium Perfingers.

Clostridium Sulfito Reductores

Esporas de Clostridium Sulfito Reductores


2.- ¿Cuál es la importancia de enumerar microorganismos anaerobios en unamuestra de alimento?

Para tener en consideración en qué grado de contaminación se encuentra lamuestra de alimento y poder decidir si es capaz de producir intoxicación,además que sirve como método de identificación de indicadores decontaminación fecal.

3.- ¿A que se deber el color negro de las colonias que aparecen en el medio decultivo?

Como los microorganismos se encuentran en estado de anaerobiosis y sualimento se encuentra en el medio el cual contiene sulfito, dichosmicroorganismos consumen los sulfitos mediante la reducción a dichossulfitos.



PRÁCTICA #05: INVESTIGACIÓN DE Salmonella ENALIMENTOS



ALUMNO : GASTAÑADUÍ VÁSQUEZ, ROBERTO

CICLO : VII

TRUJILLO – PERÚ

2008


I. INTRODUCCIÓN:

Las salmonellas pertenecen a la familia de Enterobacteriaceae. Son bacilos Gram (-),oxidasa (-), móviles o inmóviles. Hasta el momento existen más de 2 200 tiposserológicamente diferentes y continuamente se añaden a la lista de serotipos nuevos.No obstante se observan de manera regular unos 100 serotipos. La presencia decualquiera de los serotipos de salmonellas en una alimento deberá ser considerado comopeligro potencial.

Estudios de administración por la vía orla de cultivos puros con los alimentos handemostrado que se requieren comúnmente grandes dosis de microorganismos paraproducir la enfermedad en adultos. No obstante, en niños, ancianos y personasdebilitadas; números reducidos de células son suficientes para determinar laenfermedad; por esta razón, la presencia de salmonellas cualquiera que sea su númeroen un alimento preparado yapara el consumo se considera siempre como un peligrograve para la salud.

Las salmonelosis puede ser dividida en dos grupos principales: (1) las infeccionessepticémicas que producen fiebres tifoideas y paratifoideas, producidas por Salmonellatyphi y S. Paratyphi A, B y C, y (2) las infecciones entéricas no septicémicasproducidas por la otras salmonellas. Esta división la usa la OMS en su sistema deestadísticas sanitarias.

La puerta de entrada de las salmonellas, lo mismo que la de otros agentes de infeccionesgastrointestinales, es casi exclusivamente la vía oral. El microorganismo se transmitepor la excretas, principalmente por la heces del hombre y algunos animales, peritambién por la orina. La epidemiología de la salmonelosis es extremadamente compleja.Por ejemplo S. typhi y S. Paratyphi infectan al hombre principalmente, mientras queotras salmonellas infectan a un gran número de animales, tanto de sangre caliente comode sangre fría.

Por lo general, los animales, son solo portadores que eliminan salmonellas de formaregular aunque en pequeña cantidad. El medio ambiente humano y animal secontaminan por excretas humanos y animales. A través de aguas superficiales, de losinsectos, las aves, y los roedores, pueden contaminarse tanto como los piensos,estableciéndose así ciclos de infección.


Prácticamente todos los alimentos de origen animal pueden ser vehículo de transmisiónde salmonellas al hombre. Además, las salmonellas pueden ser a veces vehiculizadaspor alimentos de origen vegetal, tales como los cereales y los frutos del cocotero, y porproductos farmacéuticos. Sin embrago, los vehículos dominantes son la carne (ternera,cerdo, aves, etc.), los huevos, la leche y los productos industrializados que contienenestas materias primas básicas.

Los métodos para el aislamiento e identificación de salmonellas a partir de los alimentospueden considerarse divididos en siete etapas sucesivas:

1. Enriquecimiento no selectivo.

2. Enriquecimiento selectivo.

3. Aislamiento selectivo.

4. Bioquímica presuntiva.

5. Bioquímica confirmativa.

6. Serología.

7. Tipificación por medio de bacteriófagos.

El enriquecimiento no selectivo tiene por finalidad la revitalización de las salmonellasdañadas por las diferentes condiciones de tratamientos industriales o dealmacenamiento.

El enriquecimiento selectivo sirve para favorecer el crecimiento de las salmonellas enuna ambiente que puede contener gran número de bacterias diferentes de ellas mismas.

La siembra en placa, (aislamiento selectivo), permite la “visualización” de las coloniassospechosas, por su aspecto característico.

El valor de los resultados, como en cualquier procedimiento analítico, dependerá de laadecuada elección de la muestra en representación del lote y de la cantidad de alimentomuestreado.

II. OBJETIVO:

-Muestra (por ejemplo agua u algún alimento sólido)


III. MATERIAL.

1. BIOLÓGICO:- Muestra (Por ejm., agua u algún alimento sólido).

2. DE LABORATORIO:- Tubos de ensayo de 13 x 100- Tubos de ensayo de 15 x 150 vacios estériles.- Pipetas de 1 y 5 mL.- Placas de petri estériles.- Matraz de 500 Ml.

3. MEDIOS DE CULTIVO:- Caldo Lactosado- Caldo selenito.- Caldo tetrationato verde brillante.- Agar Salmonella-Shigella (SS)- Agar VRBA ó Mac Conkey- Agar TSI.- Agar LIA.- Agar Común.

4. REACTIVOS:- Solución de yodo y yoduro de potasio.- Solución de verde brillante

5. EQUIPO:- Estufa regulada 35 – 37°C.

IV. PROCEDIMIENTO:

4.1 Enriquecimiento no selectivo:

Pipetear 25 mL de agua a analizar y vertido en 225 mL caldo lactosado.

Incubar a 35-37ºC por 6 a 8 horas.

4.2 Enriquecimiento selectivo:

Llevar 1 mL del cultivo anterior a 10 mL de caldo selenito y a 10 mL de solución

yodo yodura. Incubar a 37°C por 24 horas.

4.3 Aislamiento en medios sólidos selectivos:

a. A partir de los cultivos incubados sembrar en agar SS y agar VRBA ó Mac

Conkey por estría. Incubar a 35-37°C por 24 a 48 horas.


b. Después del periodo de incubación examinar en las placas las colonias

sospechosas de salmonella.

En agar SS las colonias incoloras y transparentes corresponden a la mayoría

de las Salmonelas; las colonias transparentes con centro negro

corresponden a Proteus y algunas salmonelas.

En agar VRBA se eligen las colonias transparentes (lactosas negativas).

Elegir 2 ó más colonias sospechosas de cada placa.

c. Sembrar en agar común inclinado e incubar a 35-37°C por 24 horas

Comprobar la pureza de los cultivos mediante coloración Gram.

d. Inocular en agar TSI y LIA Incubar a 35-37°C por 24 horas (Bioquímica

Presuntiva).

Los cultivos sospechosos de ser salmonella en agar TSI presentan reacción

alcalina en la parte superior del medio (lactosa y sacarosa negativos) y

reacción ácida en la columna de agar (color amarillo a consecuencia de la

degradación de la glucosa) (K/A) con o sin producción de H2S

(ennegrecimiento del medio).

En agar LIA los tubos son de color púrpura con o sin ennegrecimiento.

e. La identificación serológica de las cepas sospechosas se realiza mediante el

uso del antisuero O polivalente, de los antisueros O específicos de grupo y

de los antisueros H. algunas salmoneras cuentan con antígenos capsulares

(K), conocidos como Vi, que pueden interferir en la aglutinación por

antisueros O.



1° Paso:

Se toma una pequeña muestra de caldo lactosado (crecimiento no selectivo) paraluego ser colocado en los tubos de ensayo que contienen caldo tetrationato verdebrillante y caldo selenito. Previamente antes de cada experimento se desinfecta elambiente y los utensilios con alcohol y fuego con el mechero:

2° Paso:

Luego se toma una gota de cada tubo y se extiende en una placa petrix quecontiene agar salmonella-shigella y se deja incubar a 37 ºC por 24 horas:

3° Paso:

Después que se ha incubado la placa y se observa lo que podría ser las colonias desalmonella y shigella, se toma una pequeña muestra y se coloca en un tubo deensayo conteniendo TSI y se pone a incubar nuevamente a 37 ºC por 24 horas:


Enriquecimiento no selectivo

Se pipeteó 25 ml de agua y severtió en 225 ml de caldo lactosado,luego se incubo a 37 °C x 8 h.

Se lleva 1 ml de lamuestra anterior a 10 mlde caldo selenito y a 10ml de caldo tetrationatoverde brillante al que sele añadió 0.1 ml desolución yodo yodurada.

Se incuba a37°C por 24h.

Aislamiento en medios sólidos selectivos

caldo selenito

caldo tetrationatoverde brillante.

Se siembra cada cultivo en agar SS yagar VRBA ó Mac Conkey por estría.

Se incuba a 37 °C por 48horas, luego se hace lectura

En agar SS, las colonias incoloras y transparentes corresponden a lassalmonellas y en agar VRBA las colonias transparentes son Lactosa -

En agar SS, las colonias rojas corresponden a las shigelas yen agar VRBA las colonias rojas son Lactosa +


VI. RESULTADO.

Se obtuvo como resultado en la placa puntos blanquecinos que son consideradoscomo lactosa positivos y puntos rojizos claros que son lactosa negativos. Luego enel tubo de TSI observamos que si existía la presencia de salmonella además de laformación de gas y acido sulfhídrico. Abajo se muestra el tubo del experimento:Como se puede observar existe presencia de glucosa el cual se identifica por elcolor amarillo y una coloración amarilla lo cual indica que se ha metabolizado lalactosa por tanto podemos decir que es una presencia de salmonella.

VII. COMENTARIO.La presencia de salmonellas en un alimento deberá considerare como unpeligro potencial, por lo cual su identificación es de vital importancia. Estudiosde administración por vía oral de cultivos puros con los alimentos hasdemostrado que se requieren comúnmente grandes dosis para producir laenfermedad en adultos.No obstante, en niños, ancianos y personas debilitadas; números reducidos decélulas son suficientes para determinar la enfermedad, por esta razón la presenciade salmonellas cualquiera que sea su número en un alimento preparado ya para elconsumo se considera siempre como un peligro grave para la salud.

Se tomó una colonia de laplaca anterior y se loestrío en la superficie enun tubo que contenía TSI(Tres azucares hierro:Glucosa, Lactosa ysacarosa), luego se loincubo a 37°C y luego sehizo la lectura.

G

L

S

GLUCOSA +

H2S +

LACTOSA -

Bioquímica presuntiva


Por las razones antes mencionadas es importante que los alumnos sepan comoidentificar este tipo de microorganismo para ser así más competitivos a nivellaboral.

Este método es útil para la detección de salmonellas que son se encuentranafectando a los alimentos que consumimos y se observa que mediante este métodose puede detectar la presencia de estos.

VIII. CUESTIONARIO.

1.- ¿Qué alimentos que se consumen en nuestro medio, están relacionadoscon Salmonella?

Una de las fuentes principales son los alimentos de origen animal y losvegetales regados con aguas contaminadas con éste microrganismoespecialmente los alimentos.

Es responsable de millones de casos al año de enfermedades transmitidas poralimentos; Origen: huevo crudo y mal cocido, pollos y carnes mal cocidas,productos lácteos, mariscos, frutas y vegetales.

Los alimentos que se consumen en nuestro medio son los comúnmenteasociados a intoxicaciones:

carne (vacuno, cerdo, pollo),

productos cárneos (jamón, salame, vienesas),

ensaladas (papas, porotos verdes, jamón, pollo),

productos de pastelería (cremas) y

productos lácteos (queso, queso de cabra, etc).


Todos los alimentos, principalmente de origen; animal (carnes, aves y huevo) overduras crudas o que sea sospechoso de brotes de intoxicaciones: Queso deCabra, Embutidos, Comidas preparadas, pasteles, Aguas, Mariscos frescos ocongelados, Leche en polvo, Verduras crudas y congeladas.

2.- ¿Cuál es la importancia del enriquecimiento no selectivo, en el aislamientode Salmonella?

Es importante porque el número de células son usualmente bajas en loslaboratorios esto debido a los procesos tecnológicos que se aplican a losalimentos debilitan a la bacteria, la constitución propia del alimento: nutrientes,pH, aw influyen en la sobrevivencia o en su multiplicación, la presencia en elalimentos de substancias tóxicas para las bacterias por lo tanto aquí sepreenriquecen las células en medios líquidos.

3.- ¿Cuál es la importancia del enriquecimiento selectivo, en el aislamiento deSalmonella?

El enriquecimiento selectivo está destinado a inhibir la flora acompañante. Alestar adicionados de substancias químicas inhibidoras y sumado a los tiemposy temperatura de incubación óptimas permite su desarrollo por sobre otrosmicroorganismos, lo que se confirma en los medios selectivos elegidos o porotras pruebas de identificación. Normalmente el rango de Tº de incubación váde 35ºC a 43ºC por períodos de 16 a 24 h. Comúnmente los caldos selectivosusados son selenito con cistina (SC), verde brillante, tetrationato (TT), y elcaldo cloruro de magnesio-verde malaquita de Rappaport-Vassiliadis (RV).

4.- De modo general, ¿Cuáles son los pasos para el aislamiento eidentificación de Salmonella?

Enriquecimiento no selectivo. Enriquecimiento selectivo. Aislamiento selectivo. Bioquímica presuntiva. Bioquímica confirmativa.


Serología. Tipificación por medio de bacteriófagos.



PRACTICA # 06: INVESTIGACIÓN DE Vibrio Cholerae Y Vibrioparahaemolyticus EN ALIMENTOS



ALUMNO : NEIRA BERNALES, JORGE

CICLO : VII

TRUJILLO – PERÚ

2008


I. INTRODUCCIÓN:

El género Vibrio está formado por bacilos Gram negativos, oxidasa positivos, curvadoso rectos, anaerobios facultativos. Muchas especies de vibrios son patógenos para elhombre y han sido implicadas en enfermedades transmitidas por los alimentos. Lasespecies de vibrio que no sean V. Cholerae y V. mimicus no crecen en medios a los queno se les haya añadido cloruro de sodio, y son denominadas “halofílicas” (ICMF 200)

V. Cholerae fue descrito por primera vez por Pacini como la causa del cólera en 1854, yen 1960 el mundo sufrió la séptima pandemia del cólera. Cuando se ingiere un grannúmero de células de V. Cholerae, estas se multiplican en el revestimiento intestinalsegregue grandes cantidades de fluido que se excreta en forma de diarrea acuosa en laque hay hasta 108 células de V. Cholerae por mL. Sin embargo, la mayoría de las hecesde los pacientes de cólera en periodo de convalecencia pasada de una semana sonnegativas y en casi todos los casos a las tres semanas.

La resistencia de V. cholerae a las influencias ambientales no es grande, sin embargo,este microorganismo puede sobrevivir en los alimentos y en el agua el tiempo suficientepara transmitir la enfermedad e igualmente pueden sobrevivir en alimentos refrigeradoscon actividad de agua elevada y acidez escasa por un periodo de dos semanas o más.

El tiempo de supervivencia en alimentos de acidez elevada es generalmente menor deun día y en alimentos deshidratados menor de dos días. En utensilios y equipos de 4 a48 horas.

V. Cholerae no se multiplica en el agua pero sobrevive en este elemento desde algunosdías a semanas, dependiendo del número de organismos existentes en el agua, de ladisponibilidad de oxígeno, de la temperatura, del pH, del contenido en sal, de la materiaorgánica, de la irradiación solar, de la presencia de bacterias competidoras, etc.

Sobrevive muy bien en agua de mar y por tiempos mayores en cubitos de hielo que enagua fresca no congelada.

Debido a que esta especie puede crecer en medios carentes de cloruro de sodio no esconsiderado un vibrio halofílico, aunque se requiere de trazas de ión de sodio paradeterminar su crecimiento.

V. parahaeolyticus es un microorganismo Gram negativo halofílico encontradanaturalmente en aguas de estuarios marinos y animales. Fue descrita primero como lacausa de una intoxicación alimentaria en Japón originada por el consumo de pescado ymoluscos crudos.


Tiene una distribución a nivel mundial en ambientes de estuarios y costeros y ha sidoaislada a muchas especies de peces, moluscos y crustáceos. V. Parahaemolyticus hasido implicado en numerosos brotes de gastroenteritis transmitida por el consumo demariscos en los EEUU, que pueden haber sido originados por el consumo de mariscoscrudos o insuficientemente cocidos, o mariscos apropiadamente cosidos contaminadosdespués de su cocción (Norma Técnica Peruana NTP).

El agar tiosulfato –citrato-sales biliares-sacarosa (TCBS) es uno de los medios decultivo empleados para el aislamiento de V. Cholerae, V. Parahaemolyticus y otrosvibrios en donde las elevadas concentraciones de tiosulfato y citrato, así como el mediofuertemente alcalino, inhiben notablemente a las enterobacteriáceas. La bilis del buey yel colato reprimen, sobre todo, a los enterococos. Los coliformes que eventualmentepueden crecer no degradan a la sacarosa. Únicamente algunas razas de Proteussacarosa-positivos pueden dar lugar a la aparición de colonias amarillas, semejante a lasde los vibriones. El indicador azul de bromotimol-Azul de timol presenta un claro virajea amarillo por la producción de ácido, incluso en medio fuertemente alcalino.

II. OBJETIVO:

- Adiestrar el estudiante con la metodología para el aislamiento eidentificación de V. cholerae y V. Parahaemolyticus.

III. MATERIAL.

1. BIOLÓGICO:- Muestra (Por ejm., agua o pescado).

2. DE LABORATORIO:- Placas petri estériles.- Tubos de ensayo de 13 x 100- Balones de 300 mL.

3. MEDIOS DE CULTIVO:- Agua Peptonada Alcalina (APA) al 3% de cloruro de sodio.- Agua Peptonada Alcalina (APA) al 0.5% de cloruro de sodio.- Agar Tiosulfato Citrato Bilis Sacarosa (TCBS).- Agar TSI.

4. EQUIPOS:- Estufa regulada a 35-37°.


IV. PROCEDIMIENTO.

1. Medir 25 mL de agua o pesar 25 g de pescado y ponerlos en 225 mL de APA al 0.5%de NaCl y 25 g en APA al 3% de NaCl.

2. Incubar a 35 – 37 °C durante 10 – 12 horas.3. Transcurrido el periodo de incubación y sin agitar el frasco, transferir una asada e

inóculo a partir de la película (crecimiento superficial) a dos placas de agar TCBS.4. Incubar a 35-37°C drante 18-24 horas.5. Examinar las placas para determinar las características de las colonias.

Realizar lectura:- V. cholerae (El tor y clásico): colonias de color amarillo (sacarosa positivas), de

bordes regulares, aspecto cremoso, ligeramente planas, grandes (2 – 3 mm dediámetro), con centros opacos y periferie translúcida.

- V. parahaemolyticus: colonias con el centro de color verde azuladas (sacarosanegativas) pequeñas, de bordes regulares, filantes.

6. Realizar la bioquímica presuntiva de cada una de las colonias característicassembrando en agar TSI. Incubar a 35-37 °C durante 18 a 24 horas:

V. parahaemolyticus: K/a--, sin gas, H2S negativo.V. cholerae: A/A--, sin gas, H2S negativo.

7. Realizar la bioquímica confirmativa realizando las siguientes pruebas:Voges Proskauer, Rojo de Metilo (VPRM), test de oxidasa, arginina dihidrolasa,indol, etc.

8. Realizar la serología con sueros polivalentes y monovalentes.



1° Paso:

Se toma una muestra de agua peptonadaalcalina (sembrado) y se coloca en una medioTCBS (agar tiosulfato citrato bilis sacarosa) yse pone a incubar a 37 ºC por 24 horas:

Colocar 25 ml o 25 g de lamuestra en 225 ml de APA al0.5% de NaCl ó en APA al 3%de NaCl. Luego se incuba a37°C por 12 horas.

APA

Después de incubar y sinagitar el frasco, se transfirióuna asada de inóculo apartir de la película(crecimiento superficial) ados placas de agar TCBS.

Se estrió en 4 cuadrantes.

Se incuba a 37°C por 24 horasy luego se hace lectura.

AgarTCBS

Las colonias con el centro de colorverde azuladas (sacarosa negativa)pequeñas, de bordes regulares yfilantes, indican la presencia devibrio parahaemolyticus.

Las colonias de color amarillo (sacarosapositiva), grandes, de bordes regulares,aspecto cremoso, ligeramente planas, concentros opacos y periferie translúcida,indican la presencia de vibrio cholerae.


VI. RESULTADO.En este caso se observo la presencia de vibrión choleare y de vibriónparahemolyticus. Abajo se puede observar como el vibrión choleare degrado lasacarosa y se torno de color amarillento, mientras que en el otro caso elvibrión parahemolyticus se observa por la formación de los puntos blancos enla placa.Se puede observar que en el vibrio choleraeun color casi uniforme deamarillo con una pequeña definición de color rojo lo que indica unametabolización de la sacarosa a diferencia de vibrio parahaemolyticus que seobserva un color más definido a rojo lo que indica presencia de glucosa (+) yun color negro indica sulfihidro (-).

VII. COMENTARIO.

Este es un método fácil y económico de realizar para investigar y reconocer vibriocholeraeun y vibrio parahaemolyticus. Estos microorganismos son capaces de crecer enmedio TCBS (tiosulfato-citrato-sales biliares-sucrosa), el cual es específico a dichosorganismos.

Bioquímica presuntiva

Se tomó una colonia de cada placa anterior y se loestrío en la superficie en un tubo que contenía TSI(Tres azucares hierro: Glucosa, Lactosa y sacarosa),luego se lo incubo a 37°C y luego se hizo la lectura.

G

L

S

GLUCOSA +

SACAROSA +

LACTOSA +

GLUCOSA +

SACAROSA -

LACTOSA -

vibrio parahaemolyticus

vibrio cholerae


Es un buen método de detección del v. choleare y v. parahemolyticus debido a lasreaccione que estos tienen frente a la sacarosa, lactosa y glucosa y que nos permitedetectar su presencia. Para estudiar su distribución en sus medios naturales marinosse utiliza la técnica de inmunoflourescencia, usada principalmente cuando losmétodos de cultivo han sido poco efectivos.

VIII. CUESTIONARIO.

1. Que alimentos que se consumen en nuestro medio están relacionados con v.choleare y parahemolyticus: Aquellos que se consumen crudos. Aquellos que se sospechara de alguna forma que podrían estar contaminados

por haber sido irrigados con aguas no potables (ya se trataran directamentede aguas servidas o de aguas de sistemas de riego contaminados conexcretas).

Y otros como acelga, albahaca, apio, berro, cebolla, espinaca, frutilla,lechuga, perejil, repollo, tomate, zanahoria y zapallito.

2. Cuáles son las formas de contaminación con v. choleare y parahemolyticus:

En el caso del de v. choleare se produce por manipulación de los alimentosdespués de haber realizado las necesidades fisiológicas y no haber tenido unaadecuad limpieza posterior y de esta forma haberse contaminado con las hecesfecales, además aquellos productos que son regados con aguas servidas tambiénson focos de infección. En el caso del v. parahemolyticus se produce más quetodo por el consumo de productos provenientes del mar como pescado,moluscos, etc.

3. Como se explica el color que toman las colonias de v. choleare y v.parahemolyticus en el agar TCBS:

Es este el medio selectivo más adecuado para el aislamiento de las especies deVibrio e inhibidor para la mayoría de las enterobacterias. Esta inhibición se basaen las altas concentraciones de tiosulfato y citrato, la presencia de las salesbiliares y un pH fuertemente alcalino. La degradación de la sacarosa es variableentre las especies de Vibrio y las colonias son verdes para las cepas que noutilizan la sacarosa y amarillas para aquellas que producen ácido a partir de esteazúcar. Sin embargo la proporción de la sacarosa en el medio está equilibrada enforma tal que no les inhiba el crecimiento por exceso de ácido. Aumentando laconcentración de cloruro de sodio y disminuyendo la temperatura de incubación,pueden aislarse especies marinas sin importancia sanitaria.


4. De modo general cuales son los pasos para el aislamiento de v. choleare y v.parahemolyticus:

Tomar una muestra de agua y colocarla en un medio de cultivo APA y dejarloincubar, luego tomar una asada de la APA y colocarlo en una placa con TCBS ydejarlo incubar a 37 ºC por 24 horas y luego observar los resultados.

Características del medio Medio preparado: verde azulado.



PRACTICA #08: ANÁLISIS BACTERIOLÓGICO DEL AGUAPOTABLE



ALUMNO : PUGLISEVICH SALAZAR, JUAN

CICLO : VII

TRUJILLO – PERÚ

2008


I. INTRODUCCIÓN

El análisis bacteriológico del agua, se lleva a cabo con la finalidad de probar supotabilidad. Las bacterias que se encuentran en el agua son principalmente de tres tipos:bacterias naturales, microorganismos residentes en el suelo y microorganismos quenormalmente habitan el intestino del hombre y otros animales.

La transmisión a través del agua de microorganismos patógenos ha sido la fuente másgrave de epidemias de algunas enfermedades. Entre las enfermedades más conocidascuyos gérmenes pueden ser transmitidos por el agua están las siguientes: fiebre tifoideay paratifoidea, cólera, gastroenterítitis, disentería amebiana, giardiasis, criptosporidiosis,diarrea viral, hepatitis infecciosa, etc.

A los fines de determinar la potabilidad de un suministro de agua, es necesarioestablecer que el agua no se halla contaminada con microorganismos patógenos. Por lotanto el análisis bacteriológico del agua es vital en la prevención de epidemias comoresultado de la contaminación del agua.

El examen bacteriológico de abastecimientos de agua no implica la búsqueda directa delos gérmenes patógenos. El ensayo se basa en el supuesto de que todas las aguascontaminadas con aguas residuales son potencialmente peligrosas. Por consiguiente, elcontrol sanitario del agua se hace con métodos bacteriológicos para determinar lapresencia de contaminación fecal. Ensayos para determinación de patógenos no se usanrutinariamente debido a que detectarlos en diluciones altas es muy difícil y además seencuentran en número muy inferior al de las bacterias entéricas las cuales tienen unatasa de mortalidad menor.

El examen bacteriológico del agua usualmente involucra dos ensayos: la estimación delnúmero de bacterias de acuerdo con el conteo total en placa y a determinación, mássignificativa, de la presencia o ausencia de miembros del grupo coliforme.


Los criterios de calidad bacteriológica del agua potable que es recomendado paranuestro país es: 0 coliformes/100 mL y no más de 500 bacterias heterotróficas/ mL.

II. OBJETIVOS:

1. Determinar la calidad bacteriológica del agua potable que se consume ennuestra ciudad.

2. Familiarizar al estudiante con la toma de muestra, transporte y análisis deuna muestra de agua potable.

III. MATERIAL.

1. BIOLÓGICO:- Agua potable

2. MEDIOS DE CULTIVO:- Agar cuanta gérmenes (PCA).- Caldo Lactosado Bilis Verde Brillante (BRILA)- Agar Violeta Cristal Rojo Neutro Bilis (VRBA).- Agar tres Azúcares (TSI).- Agua triptonada ó peptonada.

3. REACTIVOS:- Reactivo de Kovac’s.

4. EQUIPOS:- Autoclave.- Contador Québec.- Estufa regulada a 35-37°.- Baño maría regulado 44,5ºC.

IV. PROCEDIMIENTO:

4.1 TOMA DE MUESTRA:1. Desinfectar el grifo con un algodón embebido en una solución de hipoclorito ó

flamear el grifo a la llama del mechero.2. Abrir el grifo, dejar correr el agua durante 2 a 3 minutos.3. Recolectar el agua en frascos de vidrio neutro o plástico, estéril de boca ancha

con tapa protectora y cierre hermético. La capacidad de los frascosrecolectores debe ser por los menos 250 ml de capacidad con el objeto dedejar un espacio que facilite la homogenización de la muestra antes delanálisis.


4. Para inactivar el cloro residual presente en el agua potable, agregar tiosulfatode sodio en cantidad de 0.1 ml de una solución al 10% por cada 100 ml demuestra en l frasco antes de esterilizar.

5. Rotular la muestra, conteniendo los siguientes datos: Lugar de muestreo, fecha,hora exacta del mismo, y alguna condición especial que pueda sugerir laposibilidad de contaminación a fin de orientar el análisis.

4.2 TRANSPORTE Y CONSERVACIÓN DE LA MUESTRA:

1. Después del acopio de la muestra ésta debe transportarte al laboratorio a unatemperatura aproximada de 4ºC.

2. Al llegar la muestra al laboratorio debe ser refrigerada y/o analizadainmediatamente, caso contrario, debe conservarse en refrigeración a la mismatemperatura hasta por un tiempo máximo de 6 horas.

4.3 ANÁLISIS DE LA MUESTRA:

1. Agitar el frasco que contiene la muestra y anotar las características de lamisma.

2. Prepara las diluciones decimales con agua peptonada.

3. Efectuar las siguientes determinaciones:

a) Numeración de bacterias heterótrofas (RTBAMV).

b) Numeración de bacterias coliformes totales: Determinación mediante elmétodo del Número Más Probable (NMP).

c) Numeración de coliformes fecales: Dterminación mediante el métododel NMP.


V. ESQUEMA DE TRABAJO:

Se procede a desinfectar la zona de trabajo con alcohol iodado. Una vezrealizado esto se procede a tomar una muestra de agua potable de 10 ml. Y se coloca en3 tubos de ensayo que contienen BRILLA 2M, después se forman diluciones 10-1 y 10-2,de las cuales se van a colocar 1 ml de cada una en 3 tubos que contienen cada una deellas el BRILLA normal y es colocada en la estufa regulada a 37º C por 24 horas. Estose hace para la detección de microorganismos a través del método del número másprobable. Y para finalizar se toma 1 ml de dilución 10-1 y se coloca en una placa petrixal cual luego se va a colocar el AGAR diluido en calor y luego es colocado en la estufaregulada a 45º C. Esto es para realizar el método del recuento en placa. En la graficaulterior se ilustra todo el proceso seguido:

Proceso de Análisis Bacteriológico de Agua Potable


VI. RESULTADOS:

En el caso del método del numero más probable no se encontró ningún rastro enel los tubos (resultado negativo), lo que indica la poca o casi nula presencia demicroorganismos en la muestra del agua potable.

En el caso del método del recuento en placa se encontró la presencia de 3colonias lo que corrobora el resultado anterior con la casi nula presencia debacterias en el agua potable, tanto para dilución de 10-2 y 10-3.

VII. COMENTARIO:

Solo quedaría por mencionar la importancia de realizar los análisis del aguapotable, pues como se sabe es de consumo humano y de vital importancia para laexistencia del hombre.

Además estos tipos de análisis son también de gran importancia y primordialesen lo referente a la industria de los alimentos puesto que esto contribuye a tenerun producto final de buena calidad y en optimas condiciones para el consumo.

VIII. CUESTIONARIO:

1º. Aparte de bacterias heterotróficas (RTBAMV) y de coliformes y E. coli.¿Qué otros microorganismos pueden investigarse en una muestra de aguapotable?

Se pueden investigar a las amebas que producen la amebiasis, la salmonella queproduce la salmonelosis, la salmonella tiphy que causa la tifoidea,enterobacterias, gérmenes saprofilos, los virus.


2º. ¿Cómo se procede para recoger muestras de aguas y ríos?

Se procede tomando varias muestras de diferentes puntos del rio en frascos estériles ysellados para evitar que se contaminen. Luego deben de ser trasladados al laboratoriopara su análisis.

3º. ¿Qué pasos se siguen en la potabilización del agua, en las plantas detratamiento de agua?

En siguiente cuadro se muestran los pasos a seguir:

4º. ¿Que otros métodos se emplean para la determinación de coliformes?

Tenemos el método de la membrana filtrante.



PRACTICA #09: CONTROL DE CALIDAD HIGIENICA DE LALECHE: PRUEBA DE LA REDUCTASA



ALUMNO : ROJAS GARCÍA, HOLMER

CICLO : VII

TRUJILLO – PERÚ

2008


I. INTRODUCCIÓN:

La leche es un excelente medio de cultivo para el crecimiento microbiano, gracias a suelevada actividad de agua, su pH (6.4 – 6.6) y su abundante cantidad y calidad y calidadde nutrientes. Esto exige unas rigurosas normas de higiene tanto en su producción comoen su tratamiento.

La leche aunque proceda de vacas sanas y se haya obtenido en las mejores condicioneshigiénicas, siempre está contaminada con microorganismos en mayor o menor grado.Los microorganismos que se encuentran en la leche tienen tres orígenes: el interior de laubre, el exterior de los pezones y sus alrededores próximos, y el ordeño y los utensiliosque se utilizan normalmente para manipular la leche.

Normalmente, se trata de gérmenes saprofíticos del pezón y de los canales galactóforos,como micrococos, estreptococos lácticos y lactobacilos. En caso de enfermedad delanimal, se pueden presentar otros microorganismos patógenos y peligrosos desde elpunto de vista sanitario, por ejemplo, los agentes de la mastitis tales como:Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Escherichia coli, Corinebacteriumbovis, etc.

Por otra parte, entre los microorganismos patógenos para el ser humano procedentes deanimales se encuentran Mycobacterium bovis, M. Tuberculosis, Brucella abortus, etc.

El análisis microbiológico de la leche proporciona datos muy útiles que reflejan lascondiciones en las que se han obtenido y conservado. Los recuantos bacterianoselevados no inician necesariamente que la leche contenga bacterias patógenas, perirevelan intensa contaminación o temperaturas de conservación defectuosas.

Toda vez que la leche fresca es un producto perecedero, no puede controlarse alicandocriterios microbiológicos porque, indudablemente, el alimento habrá sido distribuido yprobablemente consumido antes de conocer los resultados de los análisismicrobiológicos. Por lo tanto, para tener una idea de la calidad de la leche, se recurre ala prueba de reducción de colorante (prueba de la reductasa), una prueba para ladeterminación rápida de la calidad higiénica de la calidad de la leche fresca.

Los métodos de reducción de colorantes (prueba de la reductasa) dependen de lacapacidad de los microorganismos para alterar el potencial de oxido reducción de laleche. Consecuentemente miden la actividad de los microorganismos más que sunúmero presente en la muestra. Entre los colorantes más apropiados figura el azul demetileno y la resazurina.

La cantidad de tiempo necesaria para reducir el colorante depende de la cantidad y de laactividad de las bacterias que se encuentran en la muestra, siendo más corto este tiempo

cuanto mayor sea el número de bacterias presentes. Existen, sin embargo, otros factoresimportantes, como son: la naturaleza de la muestra, el medio utilizado y el tipo debacteria presente.

Uno de los indicadores de oxido reducción que se emplea para la prueba de la reductasa,es el azul de metileno, que en su forma oxidada es azul y en su forma reducida esincoloro.

II. OBJETIVOS:

1. Determinar la calidad higiénica de la leche fresca empleando azul demetileno como indicador de óxido reducción.

2. Familiarizar al estudiante con la realización de la prueba de la reductasa.

III. MATERIAL.

1. BIOLÓGICO:- Leche

2. DE LABORATORIO:- Tubos de 150x15 mm con tapones de jebe o tapa rosca.- pipetas de 1 y 10 mL.- Gradilla de acero inoxidable.

3. EQUIPOS:- Baño maría regulado a 35-37ºC.

4. COLORANTE:- Solución de azul de metileno al 2.5% de la solución madre.

IV. PROCEDIMIENTO:

4.1 CONTROL POSITIVO:Pipetear 1 mL de agua destilada estéril y 10 mL de leche hervida a un tuboestéril. Invertir el tubo suavemente sin agitar.

4.2 CONTROL NEGATIVO:

Pipetear 1 mL de azul de metileno y 10 mL de leche hervida a un tubo estéril.Invertir el tubo suavemente sin agitar.


4.3 TUBO CON MUESTRA PROBLEMA:

1. Pipetear 1 mL de azul de metileno y 10 mL de leche cruda a un tuboestéril. Invertir el tubo suavemente sin agitar.

2. Colocar todos los tubos en una gradilla y llevarlos a baño marçia a 35-37 ºC.

3. Realizar la primera lectura a los 30 minutos. Ver si hay decoloración(reducción) del azul de metileno.

4. Cada 30 minutos invertir los tubos que no muestren reducción y colocarlos enposición normal en el baño.

4.4 INTERPRETACIÓN:

Durante la incubación se observan cambios de color, dependiendo deltiempo transcurrido desde el inicio de la incubación hasta decoloracióncompleta.

Se considera el inicio de la reducción por comparación de los tubos quecontienen la muestra con el tubo negativo y como decoloración completaa la comparación con el tubo que indica el final de la reducción (tubopositivo) ó si presentan color blanco a partir de 0.5 cm debajo de lasuperficie. Cualquier vestigio o residuo de color en el fondo del tubocarece de valor si no se extiende hacia arriba más de 5 mm.

Los tubos en que ha comenzado la decoloración deben permanecer enel baño sin invertir hasta que la decoloración sea completa, los demástubos deben invertirse una vez para redistribuir la crema superficial enla leche y se vuelven a colocar al baño maría. La inversión excesivadebe evitarse desde el momento que origina la reoxidación del azul demetileno y en consecuencia invalida el resultado.

TABLA DE CALIFICACIÓN DE LA LECHE CRUDA (Según Ratto, 1983)

Más de 4 horas Muy buena A

De 3 a 4 horas Buena B

Más de 30 minutos y

Menos de 3 horasAceptable C


IV. ESQUEMA DE TRABAJO:

El siguiente experimento se dividió en 2 partes: con leche hervida y leche sin hervir.

Leche hervida:En este caso se procedió a hervir la leche y luego a tomar 10 ml de leche ycolocarlo en 1 tuvo. A continuación se procedió a hacer la prueba de la reductasaagregando el azul de metileno en el tubo, para luego ser llevado a baño maríapor 30 minutos.

Leche sin hervir:En este caso se utilizo la leche sin hervir, el procedimiento es el mismo que en elcaso anterior. En el presente grafico se muestran los dos pasos seguidos:

Para el caso de leche hervida el procedimiento sigue el siguiente esquema:


Para el caso de leche sin hervir o cruda el procedimiento sigue el siguienteesquema:

V. RESULTADOS:

El resultado fue el siguiente:

Nosotros trabajamos con leche cruda, en ambos tubos puestos a incubar a 30 – 37ºC,decimos que los dos tubos pertenecientes al control positivo que contenía la leche cruda,el color azulino viró a blanco después de media hora lo que indicaba que la leche no eraaceptable para el consumo (no apta para el consumo humano), tal como indica la tablade calificación de la leche cruda. Si se hubiese esperado más tiempo quizás se hubiesevisto como resultado final que la leche realmente si era no apta para el consumohumano, con lo cual hubiéramos perdido tiempo en el análisis.

En nuestro experimento se trabajo con leche cruda únicamente, en la anterior figuraapreciamos que los dos tubos de ensayos a los cuales se le agregó azul de metileno y seles llevó a incubar a Tº de 30 – 37ºC, viro el color a blanco, esto nos indica que no esapta para el consumo humano


VI. COMENTARIOS:

No cabe duda que el análisis de la leche es de gran importancia para determinar lacalidad de esta y esto debido a que el consumo de esta en especial de aquellas queprovienen directamente de las vacas suelen estar expuestas a muchos agentes decontaminación que pueden hacer que esta resulte ser dañina para el consumidor.También es muy importante este análisis en leche a usarse en la elaboración deproductos industriales de consumo masivo para la obtención de un buen producto final.

VII. CUESTIONARIO:

1º. ¿Cuáles son los factores de los que depende la variación del potencial oxidoreducción de la leche, durante la prueba de la reductasa?

Entre los factores tenemos:

El medio utilizado.

El tipo de bacteria que se va a detectar.

La naturaleza de la muestra.

2º. ¿Cuáles son las precauciones que se deben de tener durante la prueba de lareductasa?

Se deben de tener las siguientes precauciones:

No se debe de exponer a la luz solar porque es oxidante. No se debe de agitar el tubo problema. Se debe de observar la muestra cada 20 minutos. El agua no debe de exceder la cantidad de la leche en el tubo. Se debe de estar atento al viraje de la muestra analizada.

3º. ¿En que otros tipos de alimento se puede realizar la prueba de lareductasa?

Se pueden realizar no solo en la leche sino en todos los productos derivados de laleche como queso, yogurt, etc.

4º. ¿Cuáles son las limitaciones que presenta los métodos de reducción decolorantes?

Sus limitantes son:

La naturaleza de la muestra. El método utilizado. El tipo de bacteria presente.



PRÁCTICA # 12 – CONTROL DE ESTERILIDADMICROBIOLÓGICA DE CONSERVAS



INTEGRANTES :

CAVA SALINAS, MARCO

GASTAÑADUÍ VÁSQUEZ, ROBERTO

GUEVARA ENRIQUEZ, JUAN

LEÓN PICÓN, BRUCE

NEIRA BERNALES, JORGE

PUGLISEVICH SALAZAR, JUAN

ROJAS GARCÍA, HOLMER

CICLO : VII

TRUJILLO – PERÚ

2008


I. INTRODUCCIÓN:

La incidencia de daños en alimentos enlatados es baja, pero cuando ocurre debe serinvestigada apropiadamente. Las latas hinchadas indican que el producto está dañado.Durante el daño las latas pueden ir de normales a saltadoras, lanzadoras, a levementehinchadas, y fuertemente hinchadas. Como fuere que el daño microbiano no es la únicacausa de latas anormales, el sobrellenado, el mal sellado, las abolladuras o el cerrado alfrío pueden ser también las responsables. El desarrollo microbiano y el hidrógenoproducido por la interacción del ácido del alimento con los metales de la lata, son lasprincipales fuentes de hinchazón. Algunos microorganismos que crecen en losalimentos enlatados no producen gas y por lo tanto no causan una apariencia anormal dela lata, no obstante causan daño en el producto.

El daño es causado por el crecimiento de microorganismos es, usualmente, debido afugas o a un proceso deficiente. El agua de enfriamiento contaminada a veces fluyehacia el interior a través de agujeros a costuras pobres e introduce la bacteria que causael daño. Una microflora mixta de cocos viables y bacilos bacterianos es indicadora deescapes, los que pueden ser usualmente confirmados con un examen de la lata.

Un proceso deficiente puede ser causado por una cocción deficiente; por operacionesrutinarias que fallan por la inexactitud o el funcionamiento inapropiado de algún equipoo por excesiva contaminación del producto para el cual, los procesos normalmenteadecuados son insuficientes; por cambios en la formulación o tratamiento del productoque resulta en un producto más viscoso o en un empaque más compacto en el envase,con la consecuente prolongación del tiempo de penetración del calor, o, a veces pordesviaciones accidentales de las operaciones de rutina. Cuando la lata contiene unproducto dañado el proceso o los microorganismos causantes del daño han podido morirdurante el almacenamiento.

Las latas con procesos deficientes o con fugas son de mayor importancia y ambasplantean riesgos potenciales para la salud.

Normalmente si se encuentran Clostridium botulinum (esporas, toxina o ambas), elriesgo es obvio.

Las latas intactas que contienen sólo bacilos mesófilos, Gram positivos formadores deesporas serán consideradas deficientemente procesadas, a menos que se pruebe locontrario. Se debe determinar que la lata esté intacta (costuras comercialmenteaceptables y sin microfugas) y que otros factores que pueden conducir a un procesodeficiente, como el peso drenado y la formulación del producto, hayan sido evaluados.


El número de latas examinadas bacteriológicamente deberá ser suficientemente grandecomo para obtener resultados confiables. Cuando la causa del daño está definida puedeser adecuado analizar 4-6 latas, pero en algunos casos puede ser necesario analizar 10 a15 latas antes de que la causa del daño sea determinada.

En ocasiones especiales, estos procedimientos no pueden producir toda la informaciónrequerida y tiene que trazarse test adicionales para recolectar los datos necesarios.

Puede examinarse bacteriológicamente latas no dañadas para determinar la presencia deorganismos viables pero latentes.

II. OBJETIVOS:

- Familiarizar al estudiante de Ingeniería Agroindustrial con el análisis, queson muy frecuentes en el campo alimentario.

III. MATERIAL.

1. BIOLÓGICO:- Lata de conserva (Graté, fruta en almíbar, puré, etc.)

2. DE LABORATORIO:- Abrelatas.- Placas petri estériles.- Papel de filtro.- Embudo.- Tubos de ensayo- Jabón, cepillo, toalla estéril.- Gradilla.-Espátula.

3. MEDIOS DE CULTIVO:- Caldo Infusión Cerebro Corazón (BHI).- Agar nutritivo.- Agar casoy.- Agar cisteinado.

4. EQUIPOS:

- Estufas reguladas a: 37 º C y 55 º C- Cámara de flujo laminar.

5. COLORANTES:

- Azul de metileno, cristal violeta ó colorante Gram.

Cátedra de Microbiología y Tecnología de Alimentos UNT6. Otros:

- Parafina.

IV. PROCEDIMIENTO.

4.1 TOMA DE MUESTRA:

Se debe seleccionar un número representativo de envases de cada lote.Llevar al laboratorio para su análisis previa identificación.

4.2 PRE – INCUBACIÓN (Latas normales):

a. Remover etiquetas.

b. Con el lapicero marcador transferir subnúmeros al lado de la plata paraayudar en el hallazgo correlativo con los códigos.

c. Marcar las etiquetas de tal forma que puedan ser repuestas en suposición original en la lata para ayudar a localizar defectos indicados portintes en la etiqueta.

d. Separar todas la latas por números codificados y registrar tamaño delenvase, código, producto, condición evidencia de escapes, agujeros omohos, abolladuras, curvados u otra anormalidad, y todas las marcas deidentificación en la etiqueta.

e. Antes de observar las latas para su clasificación, asegurarse de queellas estén a temperatura ambiente.

f. Lavar las latas con abundante agua y jabón y sacr bien las superficiesde la misma. Incubar las latas entre dos hojas de papel de filtro, una a 55º C por 10 días y la otra a 35 º C por 3 o 4 semanas.

g. Si durante la incubación de las latas se presentaran manifestaciones decrecimiento microbiano, ejemplo, abombamiento o microfugas, retirar laslatas con tales alteraciones y proceder a su examen.

4.3 APERTURA DE LA LATA:

Abrir la lata en una cámara de flujo laminar

a. Latas con hinchazón leve, latas con hinchazón fuerte y latas saltarinas.

b. Latas lanzadoras y planas.

c. Siembra.

d. Examen microscópico.

e. Lectura.



En el presente experimento se utilizo 2 latas de conservas de atún a las cuales se lesretiro en primer lugar la etiqueta, ya que esta por ser la que mas contacto tiene con lasmanos de las personas es la que tiene la mayor cantidad de microorganismos patógenos.Una vez hecho esto se procedió a lavar las latas con detergente, esto ante la ausencia dea jabón, pero que también sirvió como desinfectante. Luego se envolvieron con papelpara evitar que se vuelvan a contaminar. Luego fueron guardados a una Tº de 37-38 ºCx 21 días para una de las latas y a la otra a 55ºC x 10 días. Esto para detectar a losmicroorganismos anaerobios y aerobios que se pudieran encontrar en las conservas. Enel siguiente grafico se puede observar el proceso:


VI. RESULTADOS:

- Anaerobio 3 (–) No cumple con el control de esterilidad por losaerobios. Al encontrar 2 probablemente seacepte, pero 3, ya es inaceptable.

- Aerobio 3 (+)


VII. COMENTARIO:

Ha sido muy interesante el analizar microbiológicamente una conserva, ya que estasmuchas veces por su apariencia externa suelen dar la apariencia de encontrarse en buenestado, pero en realidad al interior de esta se pueden llegar a producir una gran variedadde alteraciones que son nocivas para la salud del consumidor.

VIII. CUESTIONARIO:

1º. ¿Qué diferencia hay entre esterilidad biológica y esterilidad comercial?

En la esterilidad biológica debe de existir ausencia total de microorganismos.También decimos que elimina a todos los microorganismos existentes en elproducto, como patógenos y viables, a temperatura desde 60ºC hasta 90ºC.

En la esterilidad comercial debe de existir toda ausencia de formasvegetativas de bacterias. De igual modo para este caso decimos que eliminasólo a los microorganismos causantes del deterioro del producto almacenado

2º. Defina control de estabilidad y cuál es su interpretación:

Es aquella que le da la vida útil al producto y se interpreta como el tiempo deinhibición de microorganismos que no son capaces de desarrollar. Se dice que es elresultado de la autorregulación, la cual depende del grado de complejidad yheterogeneidad del ecosistema. La estabilidad de un ecosistema es relativa, ya quese encuentra en un equilibrio dinámico, en el cuál los consumidores bióticos, se vanadaptando a las variaciones bióticas y abióticas del medio. Cuando el hombre lopermite, los sistemas evolucionan hacia una mayor estabilidad.

3º. ¿Cuando se considera que un producto es estable comercialmente y establemicrobiológicamente?

Se da cuando la esterilidad comercial y la esterilidad biológica están en formaparalela y cumplen sus objetivos. También se lleva a cabo cuando el productoresponde óptimamente a las condiciones de almacenamiento a los que se somete, sinproducirse alteraciones de ningún tipo.



PRÁCTICA # 13: ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE CEREALESY PRODUCTOS DERIVADOS



INTEGRANTES :

CAVA SALINAS, MARCO

GASTAÑADUÍ VÁSQUEZ, ROBERTO

GUEVARA ENRIQUEZ, JUAN

LEÓN PICÓN, BRUCE

NEIRA BERNALES, JORGE

PUGLISEVICH SALAZAR, JUAN

ROJAS GARCÍA, HOLMER

CICLO : VII

TRUJILLO – PERÚ

2008


I. INTRODUCCIÓN:

Se la denominación de cereal a las plantas gramíneas y a sus frutos maduros, enteros,sanos y secos, que debido a sus características, en la mayoría de los casos los cerealesno pueden ser consumidos tal como se producen en la naturaleza, sino que tienen queestar previamente transformados.

El consumo de cereales enteros con fines nutricionales es excepcional en nuestro medio,salvo el caso del arroz y en menor medida el del maíz. Lo habitual es que los cerealessean molidos y transformados en harina para elaborar un gran número de productos.

Las características físico químicas de los cereales, tal como su escaso contenido acuoso,impide la multiplicación bacteriana en el interior del grano y limita mucho laproliferación de mohos, siempre que se hayan recolectado en buenas condicioneshigiénicas, se hayan desecado rápidamente hasta alcanzar una actividad de agua queimpida la absorción de humedad. En la práctica, todas estas premisas a veces no secumplen y puede observarse con relativa frecuencia crecimiento de mohos. Entre ellos,los que provocan una mayor preocupación son los productores de micotoxinas.

El procesado que pueden sufrir los granos y las harinas es muy variable y estacircunstancia también afectará a los niveles de mohos presentes en estos alimentos. Laenumeración de mohos en semillas y harinas puede proporcionar datos muy útiles paradecidir en qué alimentos formularse y en cuáles no.

Las salmonellas son contaminantes reconocidos de semillas y harinas de oleaginosas,así como de concentrados (por ejemplo semillas de soja). A pesar del tratamientotérmico antes de su consumo, pueden ser fuente de contaminación con salmonellas.

Bacillus cereus es un microorganismo del suelo y se le considera un contaminanteinevitable de harinas y granos de cereales. Aunque la cantidad de de B. cereus en estosalimentos puede controlarse y reducirse en cierta medida mediante el lavado de losgranos, su eliminación total resulta imposible.

Es muy frecuente detectar bacterias termófilas esporuladas en harinas y, sobre todo, enalmidones; estas bacterias pueden causar la alteración de los alimentos enlatados cuandola temperatura de almacenamiento sobrepasa los 37 ºC.

Las variantes mucoides de Bacillus subtilis y B. licheniformis, son las bacteriascausantes del ahilado del pan las que más preocupan en la industria de la panificación.


El protocolo de análisis microbiológico de cereales y productos derivados influye:

1. Recuento de bacterias aerobias mesófilas viables (RTBAMV).

2. Recuento de enterobacteriáceas totales.

3. Recuento de E. Coli.

4. Recuento de B. cereus.

5. Investigación de Salmonella y,

6. Recuento de mohos y levaduras.

Los límites recomendados para cereales y harina de cereales son: Mohos, entre 102 a104, salmonella, debe de estar ausente; B cereus, 103/gramo.

II. OBJETIVOS:

1. Determinar la calidad microbiológica de harinas que se consumen ennuestro medio.

2. Familiarizar al estudiante con la toma de muestra, transporte y análisis deuna muestra de harina.

III. MATERIAL.

1. BIOLÓGICO:- Muestra de cereal (grano o harina)

2. DE LABORATORIO:- Placas petri estériles.- Pipetas de 1 mL.- Asa extensora de vidrio.

3. MEDIOS DE CULTIVO:- Agar selectivo para B. cereus.- PCA (Agar cuanta gérmenes).- OGA (Agar Glucosa Oxitetraciclina).- Solución Salina Fisiológica Peptonada (SSFP)

4. EQUIPOS:

- Estufas reguladas a: 35 º C y 37 º C- Autoclave.- Contador de Québec.


IV. PROCEDIMIENTO:

4.1 TOMA DE MUESTRA:

Las muestras de granos o harinas se deben recepcionar en bolsas deplástico de primer uso y trasladadas al laboratorio para su análisis.

4.2 TRANSPORTE DE LA MUESTRA.

Mayormente no se necesita mayor cuidado, sin embrago, debe cuidarseque no haya contaminación adicional.

4.3 ANÁLISIS DE LA MUESTRA:

1. Homogeneizar adecuadamente la muestra.

2. Pesar 25 gramos y preparar una dilución al 1/100 en SSFP.

3. Preparar las diluciones decimales que sean pertinentes, en SSFP.

4. Efectuar las siguientes determinaciones:

a) Recuento de Bacterias Aerobias Mesófilas. Mediante el Método deRecuento en Placa en PCA.

b) Recuento de B. cereus. Mediante el Método de Recuento en Placa enAgar Selectivo para Bacillus cereus.

c) Recuento de Mohos y levaduras. Mediante el Método de Recuentoen Placa en OGA.



Se coloca 45 ml de agua peptonada en una botella para luego agregarle 5 g. de avena.Luego se le agita y se deja reposar. A continuación se toma 0.1 ml de esta muestra y sele coloca en una placa petrix que contiene oxitetraciclina (sirve como inhibidor debacterias). En el siguiente esquema se muestra el proceso:

Homogeneizamos adecuadamente la muestra, posteriormente pesamos 25 gramos ypreparamos las diluciones 1/10, para efectuar nuestras respectivas determinaciones.


VI. RESULTADOS:

Como podemos observar en las figuras que representan los resultados, se realizó unRecuento en Placa en PCA, para hacer un recuento de Bacterias Aerobias Mesófilaspresentes en nuestro cereal, el cual resulto en 120 u.f.c/ gramos de producto.

También Se realizó Mediante el Método de Recuento en Placa en OGA, un recuento deMohos y Levaduras presentes en nuestro cereal, el cual resulto en la presencia de 4colonias de hongos.

VII. COMENTARIOS:

Es de importancia para un estudiante de Ingeniería Agroindustrial saber la metodologíadel proceso que conlleva el análisis microbiológico de cereales y productos derivados,dado que en el procesamiento que requiere un cereal para ser transformado se dan lugarcondiciones que influyen con relativa frecuencia al crecimiento de mohos. Entre elloslos que provocan una mayor preocupación son los productores de micotoxinas, es allídonde este conocimiento cumple efecto proporcionando una solución preventiva quenos puede ser muy benéfica en varios aspectos.


VIII. CUESTIONARIO:

1. Cuál es la importancia de detectar bacterias termófilas esporuladas encereales y harinas:

Porque estas pueden formar enterotoxinas como las esporas de B. cereus queresisten al tratamiento térmico y afectan el sistema digestivo del hombreproduciendo la gastroenteritis al consumirlas y que las encontramos en loscereales y arroz mal refrigerados.

2. En que tipos de productos derivados de cereales se justifica la investigaciónde staphylococcus aureus:

En el pan, pasteles con relleno, galletas, pastas, etc. Que han sido malrefrigeradas.

3. Haga un breve comentario sobre la importancia de microorganismos engranos de cereales:

Es importante el estudio de estos puesto que gran parte de estos estánrelacionados con bacterias termófilas resistentes a tratamientos térmicos y quehacen de los cereales y sus derivados, fuentes de cultivo y posteriormentecausantes de fuertes enfermedades en sus principales consumidores que son laspersonas.

microbiologia de alimentos : laboratorios

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