microarreglos de dna completa
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MICROARREGLOS DE DNABIOLOGIA MOLECULAR
DRA. MA. DE LA LUZ MIRANDA BELTRÁN
Mayra Janeth Hernández González
Octavio Yair Robles Meléndez
Fernando Daniel Rosas Reyes
UNIVERSIDAD DE
GUADALAJARA
CU LAGOS
¿QUE SON LOS MICROARREGLOS?
Es un conjunto ordenado
de genes en una pequeña
superficie (10,000
muestras por cm2). Los
microarreglos de DNA son
una nueva herramienta de
la biología molecular y las
ciencias genómicas.
SECUENCIACIÓN SISTEMÁTICA DE LOS
GENOMAS
La secuenciación sistemática de los genomascompletos y los avances en la síntesisartificial de DNA, ya sea por la reacción encadena de la polimerasa (PCR), o la síntesisquímica de desoxioligonucleotidos,actualmente es posible obtener en ellaboratorio el genoma completo de unorganismo, generando cada uno de losmarcos de lectura abierta completos ofragmentos de cada uno de ellos.
SECUENCIACIÓN SISTEMÁTICA DE LOS
GENOMAS
Actualmente se pueden
adquirir las colecciones
completas de los genes
de varios organismos
como: Humano,
Arabidopsis thaliana,
Saccharomyces
cerevisiae y E. coli.
SECUENCIACIÓN SISTEMÁTICA DE LOS
GENOMAS
Arabidopsis thaliana E. coli.
IMPRESIÓN DE MICROARREGLOS
En la actualidad existen varios tipos de
impresores para los microarreglos y los
podemos separar en dos clases principales:
Los de contacto
Los piezoeléctricos Estos últimos son tecnologías muy recientes y no
abundaremos en ellos
IMPRESORES DE CONTACTO
Son los más económicos; su uso es
relativamente sencillo y no se requiere una gran
infraestructura para fabricar microarreglos de
DNA con estos equipos.
Básicamente se trata de un brazo robótico con
movimiento en los ejes X, Y y Z y su
característica más importante es, poderse
desplazar en cualquiera de estas direcciones con
una resolución de una décima de milímetro
Diagrama de un impresor de microarreglos de contacto. En este tipo de
robot la superficie (c) conteniendo la microplaca con las muestras (a) y las
laminillas (b), se desplaza en las direcciones X y Y, mientras que la cabeza
con los aplicadores (d) sube y baja, depositando las muestras , siguiendo el
eje Z.
Diagrama de un impresor de microarreglos de contacto. En este tipo de robot
la superficie (c) conteniendo la microplaca con las muestras (a) y las
laminillas (b) es fija, mientras que la cabeza con los aplicadores (d) es un
brazo mecánico con movimiento en las tres direcciones (X, Y y Z).
IMPRESORES DE CONTACTO
Los robots impresores de contacto cuentan
con una cabeza en la que se pueden colocar
de 1 a 48 aplicadores.
APLICADORES DE CONTACTO
Los aplicadores, sonpequeñas agujas con unaranura en la punta similar ala punta de una plumafuente y al igual que enésta, la muestra se toma yse deposita porcapilaridad. Losaplicadores más comunestienen una capacidad de0.25 μl y pueden hacer almenos 100 aplicaciones,es decir 0.0025 μl poraplicación.
ASPECTOS IMPORTANTES PARA LA IMPRESION
DE LOS MICROARREGLOS
De la biblioteca genómica que se desea imprimirse debe tener la mayor cantidad de información decada gen y esta información tiene que estarordenada en una base de datos;
El DNA que se va a imprimir, debe tener la mismacalidad que se requiere cuando se va asecuenciar;
La cantidad de DNA de cada muestra debe ser lamisma y en una solución con un contenidoespecifico de sales.
Controlar la humedad y la temperatura
ASPECTOS IMPORTANTES PARA LA IMPRESION
DE LOS MICROARREGLOS
Una vez impresas las laminillas, el DNA
debe ser fijado a la superficie. Esto se
puede lograr horneando los microarreglos
a 80°C por cuatro horas o con un
entrecruzador de luz ultravioleta.
Adicionalmente se delimita la región donde
se encuentra el microarreglo y se identifica
cada laminilla, ya sea con un código de
barras o un numero se serie.
OBTENCION DE RNA
El aislamiento del RNA para su utilización en microarreglos, se deben tener en cuenta los siguientes aspectos:
Obtenerlo lo más concentrado posible;
Que la banda ribosomal grande sea al menos dos veces mas que la banda pequeña (este relación nos permite tener una idea de la integridad del mRNA);
Se requieren al menos 30μg de RNA total para realizar un experimento;
No se requiere aislar el RNA mensajero y puede no ser importante la presencia de DNA genómico.
OBTENCION DE RNA
Fotografía de RNA total de levadura, corrido en un gel
desnaturalizante de agarosa 1%.
MARCADO DE RNA
Para el marcado del RNA se utiliza la síntesis invitro decDNA de cadena sencilla.
Se coloca el RNA total junto con un deoxioligonucleótidopoli T y un conjunto de hexámeros al azar, permitiendoque reconozcan sus sitios en el RNA mensajero.
Posteriormente se agregan los deoxinucleótidos A, C, Gy T, mas una proporción de deoxinucleótido T marcadocon una molécula fluorescente.
A la mezcla se agrega transcriptasa inversa que sintetizael cDNA a partir del mRNA, incorporando eldeoxinucleótido T marcado en dos reacciones estándar.
Finalmente el cDNA marcado se purifica para eliminar eldeoxinucleótido fluorescente no incorporado al cDNA yse tiene la sonda marcada, lista para probarla en unmicroarreglo.
MARCADORES FLUORECENTES
dUTP-Cy3
dUTP-Cy5
dUTP-alexa3
dUTP-alexa5
También se pueden obtener los mismos
fluoróforos unidos a dCTP)
MARCADO DE RNA
Gel de electroforesis en el que se corrieron RNA total y RNA mensajero, marcados con los fluoróforos descritos.
Sondas marcadas con los fluoróforos Cy3 rojo y Cy5 verde, corridas en un gel
desnaturalizante de poliacrilamida de 12.5%.
LECTURA DE MICROARREGLOS
LECTURA DE MICROARREGLOS
En los lectores con
cámaras digitales se
registra la imagen
fluorescente como si
se tomara una
fotografía común.
LECTURA DE MICROARREGLOS
Lectores confocales hacen la
reconstrucción de la imagen
utilizando los principios de la
microscopía confocal, que
consiste en la utilización de
fotomultiplicadores para
registrar la señal
Permiten obtener una imagen
de muy alta resolución
LECTURA DE MICROARREGLOS
En dos tipos de lectores se utiliza un láser paraexcitar las moléculas fluorescentes unidas alcDNA y poder obtener la imagen de cada una delas muestras contenidas en el microarreglo.
Este procedimiento se hace para cada uno de losfluoróforos obteniéndose dos imágenes
Para la obtención de estas imágenes se debeajustar la intensidad del láser y la sensibilidad dela cámara o de los fotomultiplicadores, de talforma que ambas imágenes den valoressemejantes de fluorescencia total.
LECTURA DE MICROARREGLOS
LECTURA DE MICROARREGLOS
LECTURA DE MICROARREGLOS
Para este experimento se marcó la muestra experimental en rojo y la control en verde, todos aquellos puntos que se ven rojos o tonalidades anaranjadas, pueden ser interpretados como genes que aumentaron su expresión.
Los puntos verdes o tonalidades entre el amarillo y el verde serán aquellos genes que disminuyeron su expresión. Y finalmente los puntos amarillos representan a los genes que en ambas condiciones se expresan de igual forma.
LECTURA DE MICROARREGLOS
Cámara de hibridización para microarreglos
LECTURA DE MICROARREGLOS
Fluorescencia para un microarreglo hibridizado con una sonda marcada
con dUTP-Cy3 (rojo) y una sonda marcada con dUTP-Cy5 (verde).
LECTURA DE MICROARREGLO
Combinación
de
microarreglo
CUANTIFICACIÓN DE MICROARREGLOS
Para la obtención de los valores cuantitativos
de cada una de las señales de fluorescencia
contenidas en el microarreglo, se requiere
del análisis de las imágenes y de programas
de computo
CUANTIFICACIÓN DE MICROARREGLOS
CUANTIFICACIÓN DE MICROARREGLOS
Se debe considerar la aplicación de un
filtro para depurar la imagen de pequeñas
imperfecciones o señales no deseadas que
pudieran encontrarse entre las muestras.
Posteriormente se genera una retícula en
la que se definen las áreas que se van a
cuantificar
CUANTIFICACION DE MICROARREGLOS
En el cuadro dentro del circulo amarillo,
está la zona para obtener la densidad
real, entre el
circulo amarillo y el azul está la zona no
considerada y entre él circulo azul y el
rojo la zona
para determinar la señal de fondo.
Cuantificación de la señal de
un microarreglo, definición y
ajuste de la retícula.
CUANTIFICACION DE MICROARREGLOS
Definidos estos parámetros el programa
calcula la densidad de los pixeles en cada
área definida, dando como resultado una
tabla con las coordenadas, los valores de
densidad, fondo y señal para cada una de
las muestras en el microarreglo
CUANTIFICACION DE MICROARREGLOS
Las primeras cuatro columnas corresponden a las coordenadas de cada gen en el
microarreglo y estas coordenadas nos permiten relacionar ambas tablas
CUANTIFICACION DE MICROARREGLOS
EJEMPLO DEL USO DE LOS
MICROARREGLOS DE DNA
Estudio con microarreglos de cáncer cérvico uterino. De una paciente con diagnóstico de cáncer cérvico uterino se obtuvo un fragmento de biopsia fresca y sin incluir en parafina. También se consiguió una muestra de la misma región de tejido de una paciente sana (de cadáver) manteniendo las mismas condiciones para ambas muestras.
De las muestras se aisló el RNA total y se marco (comúnmente se marca la sonda control con el fluoróforo Cy5 y la experimental con Cy3). Ambas sondas marcadas, se juntaron y se hibridizó un microarreglo con 10,000 de los genes mejor identificaos en el humano.
De la lectura de este microarreglo se obtuvieron las imágenes y se cuantificó la señal de fluorescencia para cada sonda. Con los datos obtenidos se obtuvo la grafica de fluorescencia, donde se puede comprobar que los valores de fluorescencia son simétricos, lo que significa que tanto la reacción de marcado así como la hibridización y la lectura del microarreglos son correctos.
IMAGEN OBTENIDA DE MICROARREGLO
Fragmento del microarreglo hibridizado, en donde vemos la señal de
fluorescencia de Cy3 (rojo) para el RNA de la biopsia del paciente
enfermo (C); la señal de fluorescencia de Cy5 (verde) para el RNA sin
cáncer (N) y la combinación de ambas imágenes para ver la relación
(C/N). A estas imágenes se hizo el procedimiento previamente
descrito para obtener los valores numéricos.
TABLA OBTENIDA DE MICROARREGLO
Grafica del logaritmo de la señal “N” eje X contra la señal “C” eje Y. Se
observa que ambas señales se ajustan a una recta con un coeficiente de
0.9986, lo que indica un buen marcado, hibridización y lectura
CONCLUSIÓN
Un microarreglo es una distribución ordenada degenes en una pequeña superficie, y mediante conhibridación con el ADN problema se puedeobtener respuesta instantánea de la actividad o laexpresión de múltiples genes en un solo análisis.
La intensidad de la fluorescencia es directamenteproporcional al nivel de expresión del gen.
La interpretación de los marcajes indicara unpatrón de colores, así cada punto en el soporte delmicroarreglo se asocia con el gen localizadosegún su color
GRACIAS POR SU ATENCION