método de diagnóstico para laringotraqueítis … · enfermedad aguda del aparato respiratorio...

- 2010

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�Postgrado – Investigación II - Autor: Magali Salas

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TABLA DE CONTENIDO

I.� ��Presentación ................................................................................................................ 2�II.� Etiología ..................................................................................................................... 3�III.� Características del virus ............................................................................................. 3�IV.� Patogenia .................................................................................................................... 4�V.� Signos clínicos ............................................................................................................ 5�VI.� Diagnóstico ................................................................................................................. 6�VII.��Prevención y control ................................................................................................... 8�VIII.��Conclusiones .............................................................................................................. 9�IX.� Literatura citada ........................................................................................................ 10�

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I. PRESENTACIÓN

Este documento revisa la información actual y disponible sobre los métodos de diagnóstico, prevención, y control de la Laringotraqueítis infecciosa aviar (ILT) (Bérmudez, 2006). La Laringotraqueítis infecciosa (ILT) es una enfermedad aguda del aparato respiratorio superior del pollo, causada por un Herpesvirus tipo 1. Esta enfermedad afecta aves jóvenes y adultas, siendo la línea mas suceptible las aves de postura comercial, el cuadro se caracteriza por disnea (dificultad de respirar) conjuntivitis, mortalidad y perdida del desempeño (Bermúdez, 2006).El diagnóstico de laboratorio depende del asilamiento del virus, de la demostración de la presencia del virus o de antígenos víricos y de la detección de anticuerpos específicos en el suero.

Existen a la mano diversas herramientas diagnosticas, la interpretación de los resultados es muy simple, en el sentido de que los resultados positivos indican en todo los casos, que el virus de ILT está circulando y está presente en las muestras de campo. La única situación en la que puede generarse confusión es

cuando se quiere determinar si la infección es causada por algún virus vacunal o de campo, en cuyo caso es necesario hacer pruebas de secuenciación de nucleótidos y/o pruebas de determinación del Polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP, por su sigla en inglés) que permitan diferenciar los virus de campo de los vacunales. Estudios acerca del comportamiento del herpesvirus tipo 1, han demostrado que algunos virus vacunales son capaces de revertir a la virulencia y por ello debe prestarse especial atención a los métodos de vacunación para evitar que las aves mal vacunadas den oportunidad a los virus vacunales para replicarse más allá de lo deseable (Saif, 2008). Es de suma importancia que el proceso de vacunación se lleve a cabo de manera controlada y constantemente supervisado, toda vez que un error en cualquier fase del proceso de vacunación puede hacer que un brote empeore en lugar de mejorarlo (Saif, 2008). La mayoría de brotes en Estados Unidos son causados por virus similares a las vacunas a partir de embrión de pollo (CEO), de ahí el nombre de “Laringotraqueítis vacunal” (LTV).

Método de Diagnóstico para Laringotraqueítis infecciosa aviar

Magali Salas Martínez ([email protected])

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El uso de vacunas CEO en lotes de aves adultas dentro de las zonas de crianza de alta densidad tiende a mantener el virus alrededor, el cual adquiere el potencial de infectar al lote de aves jóvenes, las cuales son más susceptibles.

II. ETIOLOGÍA

La Laringotraqueítis infecciosa aviar, es causada por un Gallid herpesvirus 1, sensible al calor y desinfectantes, el período de incubación de la enfermedad es largo, lo que contribuye a su propagación ya que pueden estar infectadas las aves y no mostrar signos clínicos por 6-12 días. El virus se propaga a través de secreciones respiratorias que contaminan jaulas, equipo y ropa. El virus se puede también propagar mediante el viento y los camiones que acarrean aves vivas infectadas. Las altas concentraciones de granjas en una zona avícola, a menudo contribuyen a la propagación del virus (Chacón, 2008).

Los factores de diseminación del virus incluyen a las aves afectadas y portadoras y entre ellas a las parvadas de traspatio. Las aves enfermas y las vacunadas son portadoras de por vida las cuales pueden excretar el virus en cualquier momento, especialmente después de periodos de estrés tales como el transporte. (Bermúdez, 2006)

Una vez que una de las aves portadoras queda sometida a la inmunosupresión estrés o la disminución

natural de la inmunidad inducida por la vacuna, la infección del virus puede recrudecerse lo que significa que el virus, que hasta ese momento ha permanecido latente. Empieza a replicarse y a inducir signos clínicos. Los virus vacunales propagados en embriones de pollo pueden revertirse a virulentos a través de pasajes entre aves. Cuando uno de estos virus infecta a una parvada suceptible, lentamente se propaga dentro de esta, lo que aumenta la patogenicidad y conduce a la enfermedad (Saif, 2008).

Cuando se introduce el virus a una parvada de pollo de engorde por la vacunación, se puede propagar dentro de esta y llevar a reacciones graves imposibles de distinguir de la enfermedad, especialmente si no se aplicó bien la vacuna. De esta forma es fundamental que la cobertura de la vacuna sea excelente, para que no se dé oportunidad al virus vacunal de revertir a su virulencia al pasar de aves vacunadas a las que por alguna razón se saltaron y no se vacunaron. Las aves vacunadas o las que se han recuperado de la enfermedad son portadoras de por vida de tal forma que pueden dispersar el virus durante periodos de estrés. A veces estas aves son la fuente de virus para los brotes (Bermúdez, 2006).

III. CARACTERÍSTICAS DEL VIRUS

Algunas características del virus incluyen su supervivencia como filtrado a partir de exudados traqueales y

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suspendidos en caldo nutritivo hasta por 4-8 horas. En tráqueas de animales muertos en descomposición el virus puede sobrevivir hasta 3 meses.

Puede mantener su actividad a baja temperatura (4-10ºC) hasta por 30 días, y en altas temperaturas (37ºC) por 44 horas, sin embargo es vulnerable a la luz, a la mayoría de desinfectantes sin presencia de materia orgánica

La recuperación viral se ha puede llevar a cabo a partir de hisopos traqueales almacenados de 0-5ºC

IV. PATOGENIA

El virus de Laringotraqueítis infecciosa aviar puede infectar aves suceptibles a partir de los 10 días de edad aproximadamente. El periodo de incubación es de 7 a 14 días post infección natural de campo. Esta enfermedad puede ser de origen vacunal, desencadenada por errores en la aplicación de vacunas comerciales. Pueden ocurrir pases regresivos en pollos no vacunados o que no hayan recibido una dosis infectante, con lo que la virulencia de las cepas vacunales puede incrementarse y causar enfermedad clínica. Investigaciones recientes han demostrado que el virus vacunal puede circular y ser detectable en aves no vacunadas en contacto con aves vacunadas por un periodo de hasta 21 días. (Kaleta, 2008).

El virus (vacunal o de campo) se disemina activamente antes de la presentación de los primeros signos

clínicos y la mortalidad. Por ello, es muy importante obtener muestras de tráquea y conjuntiva al inicio del cuadro clínico, para el diagnóstico por histopatología o PCR, ya que un ave enferma en fase crónica no es de gran ayuda para el diagnostico de laboratorio, porque las lesiones en esa etapa destruyen epitelio traqueal el cual es importante para la toma de muestras ya que existe una gran posibilidad de encontrar el virus a partir de este órgano en ambas pruebas (Hilbkin, 1987).

La replicación viral, se lleva a cabo en la tráquea, y en estados más avanzados el virus puede alojarse en el nervio trigémino y mantenerse ahí latente hasta que un cuadro de inmunosupresión lo reactive y desencadene el cuadro. (Hilbkin, 1987).

En la Figura 1, se esquematiza la patogenia del virus de Laringotraqueítis, este virus ingresa vía aerógena y coloniza la parte superior del tracto respiratorio, donde se replica y toma la tráquea por 3-6 días, luego de lo cual se presenta una descamación y destrucción del epitelio ciliado traqueal y como respuesta a la replicación el organismo genera exudado en el lumen de la tráquea en grandes cantidades, la reacción inflamatoria, lleva niveles que van de catarral, fibrinosa hasta hemorrágico, luego de lo cual el ave, puede recuperarse y mantenerse como portador del virus o morir

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V. SIGNOS CLÍNICOS

En el pollo de engorde, la enfermedad se caracteriza por conjuntivitis, secreción espumosa en los ojos y parpados con adherencias a manera de costras alrededor de estos. (Fig. 2a y 2b). El ave efectúa movimientos de cabeza a manera de sacudidas con el fin de eliminar las secreciones de nariz, ojo y exudado en tráquea, el cual muchas veces es espumoso y sanguinolento, por ello suele observarse salpicaduras de sangre en las plumas, paredes y equipo de la caseta. Las alas pueden estar manchadas con moco, ya que a menudo las aves infectadas se limpian los ojos y

narinas en ellas. Presentan también una profunda depresión y las aves pueden mostrarse renuentes a comer o a respirar y hay un pitido característico de tono alto (estertor traqueal) que producen las aves afectadas al intentar despejar las vías respiratorias (Fahey et al., 2001).

La mortalidad aumenta a diario conforme se propaga lentamente la enfermedad dentro de la galpón afectada y también a las adyacentes. Al hacer la necropsia, las lesiones características son conjuntivitis y traqueítis que según el grado de la enfermedad puede ser catarral o

Figura 1. Esquema de la patogenia del virus de Laringotraqueítis infecciosa aviar

Control de laringotraqueitis infecciosa. (Miguel Negrete, 2008)

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fibrinohemorrágica (Fig. 3). La cavidad abdominal, generalmente, está libre de lesiones durante la fase aguda. Las complicaciones bacterianas pueden observarse posterior al inicio de los signos clínicos, cuando el sistema respiratorio bajo esta comprometido, que incluye a los sacos aéreos. Sin embargo, en ausencia de complicaciones, la ILT es básicamente una enfermedad del sistema respiratorio superior, sin que participen los pulmones y sacos aéreos. (Kirkpatrick et al., 2006)

En reproductoras y ponedoras,

los signos clínicos son similares, los exudados traqueales y de la laringe tienden a contener más fibrina. La producción de huevo por día por gallina puede disminuir temporalmente durante la evolución aguda de la enfermedad, debido a la mayor mortalidad y al menor consumo de alimento y agua. (Kaleta, 2008)

VI. DIAGNÓSTICO

La enfermedad se diagnostica con base en los signos clínicos, lesiones anatomopatológicas y pruebas de detección del virus (Zavala, 2007).

Inmonufluorescencia directa

La inmunofluorescencia directa requiere anticuerpos contra el virus que deben estar marcados con isotiocianto de fluoresceína. Esta prueba requiere

muestras de aves con signos clínicos muy incipientes y generalmente no funciona en aves con infecciones de más de 5 o 7 días. Las tráqueas y laringes son sometidas a un raspado para desprender las células epiteliales. Las células son colocadas sobre una lámina portaobjetos, fijada y tenida con los anticuerpos fluorescentes. Al observarlas al microscopio de luz fluorescente las células infectadas fluorescen y ofrecen un diagnóstico positivo. El costo es mínimo y puede producirse un diagnostico positivo en espacio de 3 a 4 horas. La inmunofluorescencia directa tiene una correlación de más de 90% con histopatología y PCR tiempo real (Hitcher, 1975) (Timurkaan et al., 2003).

PCR y PCR de tiempo real Resta prueba requiere de

hisopados traqueales o tráquea de aves con sintomatología o lesiones sospechosas de Laringotraqueítis. Para estas pruebas se hace una extracción y purificación de ADN para lograr la detección molecular de alguno de los genes del virus. Existen varias opciones que detectan genes de expresión temprana, genes reguladores, o genes responsables de la expresión de proteínas estructurales. Ambas pruebas (PCR y PCR de tiempo real) son sumamente sensibles y pueden ofrecer resultados concluyentes en espacio de 2 a 4 horas. La correlación de la detección molecular con la inmunofluorescencia o

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con la histopatología es de más del 90% (Creeland et al., 2006) (Ivomar et al., 2008) (Neff et al., 2008).

Figura 2a. Conjuntivitis leve en broiler con 11 días post infección

Figura 2b. La secreción ocular se torna viscos y tiende apegarse en las plumas cercanas al ojo, a manera de costras.

Figura 3. Traqueítis catarral fibrinopurulenta.

(Fotografías: Magali Salas). Aislamiento viral Para realizar esta prueba se

necesitan tráqueas, conjuntiva o trigémino de aves con sintomatología sospechosa de Laringotraqueítis. Aunque el aislamiento e identificación viral es la prueba estándar requiere muchas veces de varios pasajes del virus en embriones de pollo o en cultivos celulares, es poco sensible, costosa y su correlación con otras pruebas diagnosticas es muy baja (menos del 80%) (Guy, et al., 2003).

Histopatología

El examen microscópico de tejidos sospechosos es muy sencillo, rápido, económico, sensible y fácil de interpretar. El herpesvirus de la Laringotraqueítis infecciosa en pollos causa necrosis extensiva de las células

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epiteliales y frecuentemente hemorragias. Es fundamental obtener para este propósito muestras de conjuntiva, laringe y tráquea de aves con Laringotraqueítis aguda evitando los órganos con exceso de exudado fibrinopurulento, ya que esto complica el diagnóstico. La correlación de los resultados de histopatología con los de inmunofluorescencia o detección molecular es muy alta (más del 90%) y por ello debe considerarse como la primera opción. Las lesiones microscópicas son características e incluyen la formación de sincitios y la presencia de corpúsculos de inclusión intranucleares Cowdry tipo A en células individuales o en los núcleos de células sincitiales largas características en el epitelio de la conjuntiva, tráquea y/o epitelio bronquial, especialmente en la unión de los sacos aéreos. (Fletcher, 2008)

Pruebas serológicas

La prueba de Elisa indirecta tiene muy poca utilidad, pues pueden presentarse resultados positivos en lotes no infectados o sin signos clínicos. Además la prueba Elisa no tiene ningún valor predictivo en cuanto a protección, dado que la inmunidad no depende exclusivamente de la presencia de anticuerpos. Es decir el titulo de anticuerpo no refleja el nivel de protección. La única circunstancia en la que la prueba de Elisa podría ser de utilidad es cuando existen zonas avícolas en donde no se practica la

vacunación y donde esta prueba indica que existen niveles de anticuerpos muy altos. En este último caso la prueba Elisa puede ayudar a orientar el diagnóstico pero este nunca debe depender exclusivamente de los resultados de serología. (Sander y Tayer, 1997)

VII. PREVENCIÓN Y CONTROL

La enfermedad en reproductoras y ponedoras se controla mediante la vacunación durante la fase de crianza de pollonas. La aplicación individual de vacunas de origen de embrión de pollo (CEO) de origen de cultivo de tejidos (TCO) o recombinantes (REC) generalmente conduce a una inmunidad duradera en las aves. Las vacunas CEO tienden a revertirse a virulencia a través de pasajes entre aves cuando no se aplican adecuadamente y por lo tanto necesitan ser muy buenas las técnicas de vacunación. Las vacunas TCO contiene virus vivo de ILT, la forma de administración se reduce a la gota ocular o nasal, debido a las reacciones fuertes tipo necrosis muscular que se podrían provocar por la vía intramuscular o una viremia acelerada por la vía endovenosa. Las vacunas recombinantes son prometedoras, porque protegen a las aves sin propagar más virus vivo en las parvadas. (Robertson, 1999)

Durante un brote en pollo de engorde llega a ser necesaria la aplicación en masa de vacunas CEO

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para poder proteger a grandes cantidades de pollos de forma simultánea. Sin embargo aunque las vacunas CEO pueden ser eficaces en prevenir la enfermedad, pueden causar reacciones graves que conducen a problemas de desempeño si nos e aplican correctamente o si se administran de manera concomitante con la enfermedad en pollos o si se administran por métodos de aplicación masiva en aves de más de 3 semanas de edad. Se espera que la protección de la vacunación dure 20 semanas o más (Fulton et al., 2000). Bajo la mayor parte de las circunstancias no es necesaria la revacunación. La protección es adecuada para la vida económica de los pollos de engorde y reproductoras y al menos durante el primer ciclo de postura de las ponedoras comerciales (Ivomar et al., 2007).

Es de importancia fundamental que todas las aves dentro de una zona geográfica dada sigan los mismos programas todo el tiempo para que puedan tener éxito. Tales programas de control que se aplican en la industria avícola funcionan bien para mantener bajo el número de casos pero no siempre controlan rápidamente los brotes. Algunas consideraciones de estos programas se centran en recordar que los pollos adultos vacunados son portadores del virus. Tales aves se transportan junto con aves suceptibles. Es de suma importancia evitar cualquier tipo de contacto directo o indirecto con estas aves suceptibles ya que esto

puede acarrear la diseminación del virus e infectar a otra población de aves suceptible. Los machos jóvenes vacunados de repoblación podrían también diseminar el virus e infectar indebidamente gallinas vacunadas. En contraste las gallinas viejas que diseminan virus pueden indebidamente infectar machos jóvenes vacunados que usan en repoblación. Las aves portadoras a menudo sirven de fuente del virus particularmente cuando se venden y entran en contacto directo con aves suceptibles. (Dufour-Zavala, 2008)

VIII. CONCLUSIONES

Las nuevas técnicas de diagnóstico para Laringotraqueítis infecciosa han cobrado importancia hoy en día por la rapidez y especificidad de sus resultados, el avance tecnológico a jugado a favor en el diagnóstico certero, rápido y confiable, hoy pruebas como PCR tiempo real, RFPL-PCR y el secuenciamiento de genes, son utilizadas no sólo para determinar la causa del problema, sino su origen y relación filogenética con otras cepas a nivel mundial, lo cual está contribuyendo en gran medida a prevenir y controlar esta enfermedad en varios países. El Perú tiene a su disposición laboratorios de diagnóstico con alta tecnología, el uso de la combinación de estas pruebas con la epidemiologia en nuestro país puede ser un gran paso para poder controlar la ILT en el Perú

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IX. LITERATURA CITADA

1. Bermudez AJ.2006. Infectious Laryngotracheitis. En: Avian Disease Manual. 6a ed. Georgia: American Association of Avian Pathologist. p 52-54.

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3. Creelan JL, Calvert VM, Graham DA, McCullough JS. 2006. Rapid detection and characterization from field cases of Infectious Laryngotracheitis Virus by Real-Time Polymerase Chain Reaction and Restriction Fragment Length Polymorphism. Avian Pathology, 35(2), 173-179.

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