met dgterapia

8/17/2019 Met DgTerapia

1/24

26. METODE DE STUDIU ŞI DE DIAGNOSTIC VIROLOGIC

Diagnosticul infecţiilor virale trebuie să fie rapid şi să identifice noile virusuri, multe necultivabile sau greucultivabile.

Metodele de studiu şi de diagnostic sunt directe şi indirecte.

26.1. Metode directe

1. Examenul la microscopul electronic: metoda coloraţiei negative, microscopia electronică în transmisie, imuno-electrono-microscopia, pentru studiul morfologiei virale şi al etapelor ciclului de multiplicare.

2. Examenul isto!citologic la microscopul optic: observarea efectului citopatic "li#$ celular$, vacuoli#are,sinciţii, inclu#ii%.

&. '#olarea virusului (n culturi de celule, (n oul embrionat de g$in$ sau prin inocularea animalelor de laborator.

26.1.1. Metode microscopice

Microscopia electronică "ME% este singura metodă directă de studiu care vi#uali#ea#ă virusurile şi antigenelevirale. Metoda este folosită pentru diagnosticul gastroenteritei virale, ai cărei agenţi etiologici se multiplică lent saunu se multiplică in vitro, pentru anali#a le#iunilor tegumentare produse de virusurile erpetice, pox şi papiloma şi

pentru studiul virusurilor care produc focare epidemice. Metoda a avut succes, (n special pentru examinarea

materiilor fecale, a le#iunilor tegumentare, a concentratelor de urină, (n care s!au evidenţiat virusuri care se cultivăcu dificultate: rota!, astro! şi alte virusuri mici sferice. )e poate folosi, de asemenea, pentru identificarea virusurilor i#olate (n cultură. *entru examinarea preparatelor la ME se folosesc două metode : ! metoda coloraţiei negative: suspensia virală se adsoarbe pe grilă de +u şi se colorea#ă cu un colorant electrono!dens "acid fosfotungstic sau acetat de uranil%. +olorantul colorea#ă fondul grilei, dar nu pătrunde (n particulelevirale intacte, care se pot astfel observa prin colorare negativă ! examinarea secţiunilor tisulare sau a depo#itului celular la microscopul electronic cu transmisie "-EM%.+elulele sau ţesutul se fixea#ă cu glutaraldeidă, se colorea#ă cu tetraoxid de osmiu şi se includ (n răşină Epox.)ecţiunile ultrafine obţinute la microtom se examinea#ă la -EM. Metoda are avanta/ul că detectea#ă infecţii mixte"comune (n celulele epiteliului intestinal%, oferă un diagnostic rapid pentru pentru gastroenterita cu rotavirusuri şi

pentru infecţiile erpetice ale tegumentului.

De#avanta/e: metoda este laborioasă şi nu permite prepararea unui număr mare de probe pentru ME frecventapar artefacte şi necesită experti#ă pentru interpretarea imaginilor este mai puţin sensibilă dec0t testele serologice

pentru evidenţierea antigenelor virale sau dec0t metoda i#olării virusului. *entru detectarea virusului prin metodaME sunt necesare 1& 13 particule virale4ml. )ensibilitatea metodei creşte prin centrifugarea suspensiei virale pe grilele de +u, prin concentrarea virusului

prin metoda ultrafiltrării5 sau prin metoda imuno!electrono!microscopiei "'EM%. 'n metoda 'EM, grila de +u setapetea#ă cu anticorpi specifici antivirali, cu rolul de a concentra virusul pe grilă.

56ltrafiltrarea este o metodă ce utili#ea#ă membrane semipermeabile pentru separarea materialelor di#olvate şi suspendate pe ba#adimensiunilor. *rocesul se desfăşoară sub acţiunea presiunii negative care se aplică probei. Metoda se foloseşte pentru separareamacromoleculelor "proteine, poli#aaride, lipide, polimeri sintetici% cu dimensiuni mai mici dec0t dimensiunile porilor membranei,virusurilor, coloi#ilor sau pentru concentrarea probelor diluate de aci#i nucleici "1!1 nm%. Membranele au pori cu diametrul cuprins (ntre,1!1 7m. 6ltrafiltrarea nu discriminea#ă (ntre macromoleculele cu dimensiuni asemănătoare şi nu se foloseşte pentru separarea

moleculelor care diferă cu mai puţin de un factor de 3. *entru separarea unor astfel de molecule se folosesc tenicile de cromatografie sau deelectrofore#ă.

Metode histo-citologice. Examenul microscopic direct al probelor colorate istologic sau citologic poate săofere indiciul că procesul patologic este determinat de un virus: de exemplu, inclu#iile nucleare evidenţiate (n

biopsiile de rinici transplantat de la pacienţii cu nefrită interstiţială se datorea#ă virusului polioma 89scimbările citologice ale epiteliului cervixului uterin asociate infecţiei cu *; inclu#iile nucleare (n celulele

precursoare eritroide infectate cu parvovirusul 81


2/24

tamponat, cu adaus >? ser fetal de viţel, antibiotice şi agenţi antifungici. *robele de urină pot fi plasate (n mediude transport cu &>? sorbitol.

*re#enţa virusului (n probele clinice se poate demonstra prin inocularea animalelor de laborator, a ouălor embrionate de găină sau în culturi de celule. Culturile de celule. @ varietate de celule pot fi cultivate pe suportul solid de material plastic sau sticlă. Este ceamai folosită metodă pentru diagnosticul virologic. Tipuri de culturi celulare. +ultura primară se obţine prin dispersia celulelor din ţesut, sub acţiunea en#imelor

proteolitice "tripsina şi colagena#a%. +ulturile primare sunt diploide şi se folosesc pentru producerea vaccinurilor virale. +ulturile de celule (n monostrat se desprind cu en#ime proteolitice şi cu agenţi celatori "ED-A B versen% şiapoi se subcultivă (n 2!& recipiente. Durata de viaţă a celulelor diferenţiate este limitată şi varia#ă (n funcţie detipul de celule şi de originea lor: celulele epiteliale umane pot fi subcultivate de circa 1 ori, iar fibroblastele de =!3 de ori. Aceste culturi se numesc linii celulare. +ulturile celulare pot să derive din ţesuturile maligne, dar au complement cromosomal eteroploid. Astfel deculturi au o durată de viaţă nelimitată şi se numesc linii celulare continui. Ciniile continui au pierdut inibiţia decontact. 'nocularea probelor adecvate (n linii celulare sensibile la virusul din probă, completată cu anali#a microscopicăa efectului citopatic "E+*% conferă metodei un grad superior de specificitate, care poate fi confirmat prin tenica

imunofluorescenţei. +ele mai utili#ate linii celulare sunt cele de rinici de maimuţă, liniile celulare epiteliale umane (n culturăcontinuă şi o linie de fibroblaste umane. 'nocularea acestor linii permite detectarea ma/orităţii virusurilor cultivabile de importanţă clinică: );, ;;, +M;, enterovirusuri, virusul respirator sinciţial ");%,adenovirusuri, parainfluen#a, influen#a şi rinovirusuri.

+ultivarea virusului dintr!o probă clinică aduce dovada pre#enţei virusului infecţios, dar antigenele virale pot persista perioade lungi de timp, după iniţierea terapiei antivirale. De exemplu, antigenele );!2 se detectea#ă (ntampoanele genitale un interval relativ mare, după iniţierea terapiei, c0nd virusul nu se mai i#olea#ă.

Metoda i#olării virusurilor (n cultură are c0teva avanta/e:! oferă posibilitatea examinării ulterioare, cu privire la sensibilitatea la agenţii antivirali sau tipi#are! oferă informaţii epidemiologice, importante pentru sănătatea publică! cultivarea oferă posibilitatea identificării unor virusuri noi "de exemplu, )A)%.

Ma/oritatea virusurilor umane cunoscute pot fi i#olate şi cultivate (n culturi sau prin inocularea animalelor delaborator. '#olatele de ); se multiplică (n & #ile pe fibroblastele umane, dar pentru cele mai multe i#olate clinicetimpul necesar exprimării E+* sau pentru emadsorbţie este de F!21 #ile.

Metoda cultivării nu se aplică virusurilor gastroenteritei "rotavirusuri etc.%, virusurilor epatitice, E8;, 3,F şi G, ';, ;8 şi papiloma. +oronavirusurile se multiplică puţin (n culturi celulare şi se pot i#ola (n cultură de organe, deşi metoda nu sefoloseşte (n mod obişnuit. *erfecţionarea continuă a tenicilor de cultivare a celulelor a sporit numărul virusurilor care pot fi cultivate.Descoperirea 'C!2, un factor stimulator al divi#iunii limfocitelor, a uşurat cultivarea celulelor limfoide, ceea ce adus la descoperirea retravirusurilor umane. '#olarea virusurilor (n cultură este metoda cu cea mai largă utili#are pentru diagnosticul virologic. EC . Modificările morfologice ale celulelor infectate se observă fără colorarea celulelor, dar pentru detalii

suplimentare este necesară colorarea istocimică. +oloraţia ematoxilină!eo#ină este cea mai adecvată. Modificări produse de E+* :! rotun/irea celulelor: multiplicarea virală induce modificări ale citosceletului, care duc la rotun/ire şi eventual

la li#a celulei! formarea sinciţiilor: membranele celulelor adiacente fu#ionea#ă şi re#ultă celule gigante cu c0ţiva nuclei

"virusul ru/eolei, ;), ';%. +elulele sunt unite prin punţi citoplasmatice "virusul erpes simplex%! rotun/irea şi agregarea celulelor (n aglomerări ciorcine, care se detaşea#ă de support "adenovirusuri%! formarea inclu#iilor: inclu#iile sunt agregate nucleare sau citoplasmatice de componente ale multiplicării

virale "fabrici de virus%, ce se pot vedea pe preparatele colorate, la microscopul optic. *ot fi inclu#ii ba#ofilesau acidofile.

*entru identificarea pre#umtivă a i#olatului, de obicei E+* este suficient. -ipul de celule (n care se multiplicăşi produce E+* este un indiciu pentru identificarea virusului. De exemplu, ); se multiplică (n numeroase tipuride celule, iar +M;, numai (n culturi de fibroblaste umane. De aceea, pentru i#olare este necesară inocularea probei(n c0teva tipuri de culturi celulare.


3/24

De obicei, culturile inoculate sunt cele primare de rinici de maimuţă, de rinici uman sau fibroblaste deembrion uman. +ulturile renale pot fi (nlocuite cu o linie celulară continuă "eCa, ep!2%. *entru i#olarea virusurilor tractului respirator, culturile inoculate se incubea#ă la &2o sau la &Fo. 6nele virusuriortomxo! şi parainfluen#a nu produc E+* evident, deşi se multiplică intens. Multiplicarea lor se evidenţia#ă prinmetoda hemadsorbţiei: ematiile adăugate pe suprafaţa monostratului, aderă de celulele infectate. Aderenţa estemediată de spiculele de A inserate (n membrana citoplasmatică. 'nconvenientul ma/or al i#olării virusurilor (n cultură de celule este durata multiplicării: virusurile se potmultiplica (n 1!2 #ile, dar +M; necesită circa 2 săptăm0ni, prea mult pentru utili#are clinică. Alt inconvenient al metodei i#olării virusurilor constă (n faptul că succesul depinde de obţinerea probei lamomentul optim. +u c0t infecţia este (ntr!o fa#ă mai timpurie, cu at0t cantitatea de virus excretată este mai mare şişansa i#olării virusului creşte. Excreţia virusului, (n general, scade rapid după ce efectorii ' neutrali#ea#ă virusul.Alteori "de exemplu, virusurile enterice şi +M;%, pot fi excretate perioade lungi ! săptăm0ni sau luni ! dar (n acesteca#uri raportul etiologic cu maladia este greu de stabilit.

*acienţii imunocompromişi şi copiii infectaţi congenital elimină virusul pentru perioade lungi sau eliminareadevine cronică: de exemplu, o mare proporţie a acestor copii excretă +M; sau virusul rubeolei (n urină, prinsecreţia faringiană sau pe ambele căi, pentru un an. ;irusul rubeolei poate fi i#olat c0ţiva ani după naştere dincataracte sau din urecea internă a copiilor infectaţi congenital.

olul culturilor celulare convenţionale pentru diagnosticul de rutină al infecţiilor virale diminuea#ă, deoarecemulte laboratoare preferă diagnosticul prin detectarea antigenului viral cu anticorpi specifici marcaţi cufluorocromi sau prin detectarea genomului virusurilor de importanţă clinică "+M;, ;;%.

)!au elaborat metode pentru detectarea celulelor infectate cu virus, (nainte ca E+* să devină aparent.Metodologia utili#ării AM+ marcaţi cu fluorocromi combină specificitatea cu posibilitatea detectării timpurii a Agvirale. AM+ sunt reactivi cu specificitate (naltă şi au avanta/ul că pot fi folosiţi pentru evidenţierea antigenelor specific!virale. AM+ au fost utili#aţi pentru diagnosticul infecţiei cu +M;. +M; produce E+* vi#ibil după F!1#ile, dar Ag virale imediat! timpurii "'E% şi timpurii "E% pot fi detectate (n celulele infectate (n &!3 ore după infecţie,cu mult (nainte de producerea E+*. Embrionul de găină de G!11 #ile este inoculat şi incubat pentru 2!< #ile, durata variind (n funcţie de virus, decalea de inoculare. ;irusurile se identifică prin le#iunile pustulare ale membranei corioalantoice, iar pentru testelede emaglutinare "A% se foloseşte licidul amniotic sau alantoic.

Multe virusuri se cultivă (n oul embrionat, dar metoda este rareori folosită: pentru evidenţierea poxvirusurilor şi pentru propagarea orto! şi paramixovirusurilor. Inocularea animalelor de laborator se foloseşte numai pentru arbo! şi coxsacHievirusuri. 6nele coxsacHievirusuride grup A se multiplică greu (n cultură de celule, dar se multiplică prin inocularea intracerebrală la puii nou născuţide şoarece. -ipul de parali#ie poate fi folosit pentru identificarea grupului de coxsacHievirusuri.

26.2. Metode i$directe 1. Metode imunologice: detectarea antigenelor virale "utili#0nd AM+% sau a anticorpilor specifici "virusurile suntimunogene şi stimulea#ă ' intens% printr!o metodă adecvată.

2. Metode moleculare pentru detectarea genomului viral:! reacţia de polimerizare în lanţ " ol!merase Chain "eaction ! *+%

! hibridizarea cu sonde moleculare specifice pentru o secvenţ$ ţint$ unic$, pe preparate citologice4 istologice.

26.2.1. Metode im$o!o%ice &sero!o%ice'

Metodele imunologice sunt folosite (n virologie, cu c0teva scopuri:

! pentru a identifica un virus i#olat! pentru demonstrarea Ag virale (ntr!o suspensie sau (n celule! pentru diagnosticul serologic! pentru testarea capacităţii imunogene a unui virus.

*roteinele structurale virale, ca şi cele sinteti#ate (n celula infectată sunt foarte imunogene şi stimulea#ă sinte#aanticorpilor. In cursul răspunsului imun primar se sinteti#ea#ă predominant 'gM.

26.2.1.1. E"ide$(iere# #$ticorpi!or

-oate infecţiile virale sunt (nsoţite de sinte#a Ac, a căror evidenţiere (n infecţia primar$ "'gM% şi (nconvalescenţă se face prin următoarele metode:


4/24

! reacţia de fixare a complementului "J+%! emaglutinoinibarea! imunofluorescenţa! testul '*' "imunoperoxida#ei indirecte%! seroneutrali#area! contra!imunoelectrofore#a "+'EJ%! E'A "En#me linHed immunosorbent assa%! latex!aglutinarea! Kestern blot "L8%! 'A.

#eterminarea IgM speci$ic. 'gM este produs timpuriu (n răspunsul imun şi persistă &!= luni, iar 'g persistă totrestul vieţii. Detectarea 'gM este dovada directă a infecţiei recente cu un anumit virus. -estele de primă generaţieale determinării 'gM au fost laborioase pentru că necesită separarea fi#ică a 'gM de celelalte i#otipuri. Av0nd gr.mol. mai mare, 'gM se poate separa de 'g prin gel!filtrare sau prin centrifugare (n gradient de densitate desucro#ă. Jracţiile care conţin 'gM se colectea#ă şi se testea#ă pentru pre#enţa Ac specifici antivirali, prin metodele'JA sau A'. Anticorpii specifici clasei 'gM pot fi detectaţi prin teste imunologice, fără fracţionare prealabilă, folosind Ac

anti!'gM. Anticorpii anti!'gM sunt imobili#aţi pe o suprafaţă solidă şi se pun (n contact cu serul. 'gM seric estecaptat pe suportul solid. Metoda este mai sensibilă şi mai simplă, deoarece elimină etapa fracţionării. -oate metodele de separare a 'gM, dar mai ales metoda captării pe suportul solid, nu fac distincţia (ntre 'gM şiJ "'gM anti!'g%. J se găseşte (n serul unui procent mare de persoane adulte şi la toţi cei cu infecţii acute saucronice. De aceea, J se adsoarbe cu 'g agregat, pentru că altfel, re#ultatele determinării 'gM vor fi fals po#itive. Alte tenici serologice: emaglutino!inibarea "A'%, latex!aglutinarea şi 'J "(n special pentru diagnosticul"E8;%. )erul este proba pentru cele mai multe metode serologice, dar secreţia salivară se poate folosi pentrudetectarea Ac, (n special (n studiile de monitori#are la copii. De la pacienţii cu infecţii ale )N+, se poate testalicidul cefaloraidian "C+% pentru pre#enţa Ac antivirali, iar raportul titrului Ac faţă de titrul seric oferă indiciicu privire la situsul sinte#ei Ac. *entru diagnosticul imunologic sunt necesare 2 probe de ser: una recoltată (n fa#a acută "(nainte de #iua a F!adupă infecţie% şi o probă recoltată (n convalescenţă "recoltată la 1!2 săptăm0ni după fa#a acută%. +ele 2 probe setestea#ă concomitent. +reşterea de cel puţin = ori a titrului de Ac arată că infecţia s!a produs cu acel virus. Metodele imunologice sunt esenţiale pentru diagnosticul şi monitori#area acţiunii tratamentului asupra evoluţieiinfecţiilor persistente: anticorpii se detectea#ă (n infecţiile persistente (n condiţiile multiplicării virale ";8, ';,;+%. Metodele serologice au o valoare limitată (n diagnosticul infecţiilor virale la pacienţii imunocompromişi, undevirusul trebuie identificat.

6neori Ac sunt neutrali#anţi "poliovirus%. Multe infecţii sunt controlate mai eficient de celulele -, iar detectareaAc este o metodă cu importanţă secundară.

Metodele de determinare a Ac nu disting (ntre 'g şi 'gM. Diagnosticul unor infecţii virale se ba#ea#ă peseroconversie, adică pe creşterea semnificativă a titrului Ac (ntre proba din fa#a acută şi cea din convalescenţă "lainterval de 1!1= #ile%. J+ a fost folosită pe scară largă, dar lipsa de sensibilitate şi reactivitatea (ncrucişată a

multor Ag utili#ate (n test a limitat utili#area metodei (n laboratorul clinic.Diagnosticul se poate pune numai după fa#a acută a infecţiei.*entru primele 2 obiective "identificarea unui virus i#olat şi demonstrarea antigenelor virale (n suspensie sau

(n celule%, se foloseşte serul specific standard. *entru obiectivele & şi = "diagnosticul serologic şi testarea capacităţiiimunogene a unui virus%, probele de ser de la pacienţi se testea#ă pentru pre#enţa Ac, folosind Ag virale cunoscute.

-estele de neutralizare măsoară titrul de Ac care neutrali#ea#ă infecţio#itatea virusului. -estul constă (ndiluarea serului şi incubarea diluţiilor cu o do#ă fixă de virus "de obicei >? do#e infecţioase% pentru 1 oră la &F o

sau peste noapte la =o. Amestecul este inoculat (n culturi sensibile. Diluţia de ser care inibă multiplicarea virusului(n >? din culturi este considerată ca fiind titrul neutrali#ant.

Evidenţierea antigenelor virale. Antigenele virale (n suspensie "s0nge, urină, fecale, suspensii tisulare% se potdemonstra prin testul imuno!en#imatic "E'A%, testul latex!aglutinării sau 'A. 'n aceste teste, Ac specifici suntadsorbiţi pe un suport solid "granule de plastic, godeuri, particule de latex% şi au rolul de a lega Ag din probă. Ag

legat se detectea#ă adăug0nd un Ac specific marcat cu o en#imă sau cu un i#otop.


5/24

Metoda late%-aglutinării pentru detectarea &g (n fa#ă solidă se foloseşte pe scară largă. *articulele mici delatex tapetate cu Ac specifici aglutinea#ă (n pre#enţa Ag. eacţia se observă cu ociul liber. Metoda latexaglutinării se foloseşte pentru diagnosticul infecţiei cu rotavirusuri.

Metodele E'I(&, EI&. rincipiu. Anticorpul indicator sau Ag este con/ugat cu o en#imă. *re#enţa lor se detectea#ă prin adăugarea unuisubstrat care este convertit la un produs colorat, sub acţiunea en#imei. eacţia de culoare poate fi (nregistratăvi#ual sau se măsoară spectrofotometric. En#imele cele mai folosite sunt peroxida#a şi fosfata#a alcalină, careutili#ea#ă substraturi incolore. Metoda este larg utili#ată pentru detectarea Ag de suprafaţă a 8; şi mai recent pentru detectarea proteinei +"a regiunii centrale% a virusului epatitei + ";+% (n laboratorul de anali#ă a donorilor de s0nge.

E'I(& în $aza solidă se foloseşte pe scară tot mai mare (n laboratorul de diagnostic. )e folosesc Ag peptidicesintetice sau Ag recombinante, (n locul li#atului viral brut. Jormatul testului EC')A este foarte versatil. In esenţăsunt comerciali#ate & tipuri de teste automati#ate: 1% -estul indirect: antigenul viral este imobili#at pe fa#ă solidă. Anticorpii din ser se leagă cu antigenul şi dupăspălare, anticorpii sunt detectaţi cu 'g antiumană marcată. )e detectea#ă 'g şi 'gM (n funcţie de 'g indicatoare.Dacă proba este po#itivă pentru J, re#ultatul poate fi fals po#itiv pentru 'gM.

2% +aptarea anticorpilor: 'g antiumană este fixată pe fa#a solidă, cu rolul de a capta 'g sau 'gM din probă. )eadaugă antigenul, iar (n final anticorpul marcat. &% -estul competiţiei antigenelor: (n sistemul EC')A, Ag este imobili#at, iar un Ac marcat intră (n competiţie

pentru legarea Ag, cu anticorpii din proba clinică. Diagnosticul serologic al infecţiei acute "fig. =>% este indicat (n ca#ul (n care detectarea virusului este dificilă,necesită prea mult timp sau (n ca#urile (n care producerea virusului a (ncetat "virusul epatitei A, virusul rubeoleisau parvovirusul 81


6/24

Ac marcaţi "monoclonali sau policlonali%. De cele mai multe ori, Ac sunt nemarcaţi şi se detectea#ă cu al ''!lea Acmarcat "metoda indirectă% anti!catenă .

26.1.2.2. E"ide$(iere# #$ti%e$e!or

#etectarea antigenului prin metoda 'J este o variantă rapidă de diagnostic. 'niţial s!au folosit seruri policlonale,

iar ulterior AM+. Metoda directă foloseşte ca indicator, Ac marcat, iar cea indirectă, un Ac anti!specie marcat, pentru a evidenţiaAg viral. MarHerul este fluoresceina.

Metoda I* indirecte "'J'% este mai sensibilă, deoarece pe celula infectată se fixea#ă o cantitate mai mare demarHer. e#ultatele pot fi disponibile (n 1!2 ore după primirea probei. Metoda se foloseşte pentru diagnosticulinfecţiilor tractului respirator "cu ;), cu parainfluen#a, cu influen#a A şi 8%, pielii, ociului şi creierului"erpesvirusuri, adenovirusuri% şi oferă un diagnostic rapid, (n c0teva ore, dacă frotiul cu celule infectate se obţinerepede "spălătură bronşică, sediment urinar, racla/ tegumentar sau material din biopsie%. Este mai sensibilăcomparativ cu metoda ME sau cu metoda inoculării (n cultura de celule, (n special pentru detectarea ;). *robaideală este aspiratul na#ofaringian de la copiii cu bronşiolită, pentru care re#ultatul rapid este esenţial, iar antigenele virusurilor respiratorii se exprimă (n celulele epiteliale.

Metoda I* directe permite detectarea semi!cantitativă a celulelor sanguine infectate cu +M;. -enica

presupune separarea leucocitelor mononucleare din s0nge, fixarea pe lamă şi colorarea cu AM+ anti!proteinamatriceală pp3> umană. Jrecvenţa celulelor po#itive este indiciul infecţiei cu +M; la pacienţii imunocompromişi.Metoda este laborioasă şi necesită prelucrarea rapidă a probelor. Din aceste motive, antigenemia se determină prinmetoda *+.

Testul imunopero%idazei indirecte "'*'%, asemănător cu 'J', foloseşte complexul format din peroxida#a de reancuplată cu 'g de iepure anti!'g umană, (n locul colorantului fluorescent. *eroxida#a de rean idroli#ea#ăsubstratul specific adăugat (n reacţie şi formea#ă un precipitat la locul legării complexului. Jaţă de 'J', metoda '*' are avanta/ul că preparatul se observă la microscopul cu fond clar, lama se păstrea#ăindefinit, dar are de#avanta/ul că pero%idaza endogenă poate să producă re#ultate fals po#itive. Metodele imunoblot se folosesc pentru confirmarea infecţiei cu '; "Lestern blot% şi cu +;. Metoda se

ba#ea#ă pe detectarea Ac (n proba de ser faţă de epitopii multipli (n preparatul blot pe o membrană.

26.2.2. Metode mo!ec!#re. Detect#re# #ci)i!or $c!eici

Demonstrarea directă a pre#enţei virusurilor (n probele clinice, p0nă recent, s!a făcut prin metoda ME, 'JA"'ndirect Jluorescent Antibod%, metoda istologică şi citologică. Diagnosticul istologic este postmortem. Acestemetode au fost (nlocuite de cele care folosesc AM+ şi tenologia ADN recombinant.

'nfecţia, asimptomatică sau simptomatică, este definită de pre#enţa virusului (ntr!o probă clinică. *entrudiagnostic este esenţială sensibilitatea testului şi are ca scop detectarea genomului viral. 6n test calitativ sensibileste relevant pentru diagnosticul '; la copii, sub forma ADN proviral (n leucocitele periferice sau al infecţiei cu+;, sub forma AN seric.

Diagnosticul rapid al infecţiilor virale se reali#ea#ă prin metodele care utili#ea#ă ADN recombinant şi deamplificare moleculară, care oferă re#ultate calitative şi cantitative, cu o sensibilitate superioară celorlalte metode.

Tehnicile recombinant permit demonstrarea acidului nucleic viral (n probele anali#ate, ca o alternativă la

detectarea Ag virale. -enica este adecvată virusurilor al căror genom se integrea#ă (n ADN celular sau persistăsub forma genomului viral episomal. Expresia genelor papiloma este foarte limitată şi infecţia nu poate fidiagnosticată prin metodele de detectare a Ag. ADN viral se evidenţia#ă prin ibridi#area dot!blot sau ibridi#arein situ.

rincipiu. Metoda ibridi#ării dot-blot şi in situ se ba#ea#ă pe principiul conform căruia AN monocatenar seva renatura cu catenele complementare obţinute prin tenologia ADN recombinant. 'n metoda hibridizării dot-blot , AN este extras din celule "ţesut% şi imobili#at pe filtru de nitrocelulo#ă saunlon. ADN este foarte stabil şi re#istent la tratamente dure cu ,& M Na@ la 3o, folosite pentru eliberarea ADNde proteine, de AN şi de membranele celulare, (n probele clinice. )e adaugă proba, selectată pentru o regiunespecifică a AN viral, care se va alinia cu catenele complementare, timp de circa 3 ore. *roba poate fi marcată cuun radioi#otop, cu biotină sau cu coloranţi fluorescenţi "DA*' B =P,3!diamidino!2!penlindole%, care se colorea#ăalbastru sau cu acetl aminofluorene "AAJ%, ce se colorea#ă roşu la lumina uv. Cegarea probei marcate de AN seevidenţia#ă ca o pată neagră pe membrană. Metoda detectea#ă p0nă la circa 1 copii de AN viral.

ibridi#area in situ se foloseşte pentru evidenţierea AN viral, direct (n secţiunea tisulară.


7/24

*0nă acum, metoda a fost folosită (n special pentru virusurile cu genom ADN. AN este denaturat prinmetodele de extracţie şi este mai sensibil la atacul nuclea#ei dec0t ADN. -enica se foloseşte pentru diagnosticareainfecţiilor cu *;, ce nu pot fi cultivate, iar expresia Ag (n ţesutul infectat este foarte limitată şi pentrudiagnosticul infecţiilor cu erpesvirusuri, mult mai rapidă dec0t metoda i#olării (n cultura de celule.

Metoda ibridi#ării AN nu este la fel de sensibilă ca metoda detectării Ag, deoarece (n ciclul multiplicării sesinteti#ea#ă mai puţine molecule de AN dec0t proteine. Acest nea/uns a fost eliminat prin metoda *+. Avanta/ulma/or al metodei este că -aQ ADN!polimera#a i#olată de la bacteria Thermus auaticus este re#istentă latemperatură, ceea ce permite succesiunea ciclurilor de denaturare a ADN şi alungirea primerilor, ceea ce produce oamplificare de p0nă la 1 million de ori a segmentelor de ADN. *+ poate să detecte#e un singur genom viral (ntr!osuspensie celulară sau (n secţiune tisulară.

C" "eacţia de polimeri#are (n lanţ% este o metodă simplă şi rapidă de a copia şi a amplifica secvenţelespecifice de ADN cu lungimea de p0nă la 1 Hb. Este o tenică preparativă şi analitică folosită (n toate domeniile

biologiei moleculare. *entru utili#area metodei este necesară cunoaşterea secvenţei unei scurte regiuni de ADN de la fiecare capăt alsecvenţei mai mari care trebuie copiată şi amplificată. )ecvenţele scurte se folosesc pentru sinte#a primerilor oligonucleotidici specifici. rincipiu "fig. =>1%. Metoda constă din cicluri repetate ale denaturării ADN, reasocierii catenelor ADN şi

sinte#ei ADN. *+ implică & etape: 1% ADN dublu catenar este denaturat şi convertit la ADN monocatenar 2% primerii seasocia#ă cu ADN ţintă &% ADN se sinteti#ea#ă prin adăugarea nucleotidelor la primeri sub acţiunea catalitică aADN!polimera#ei. *rimerii oligonucleotidici au o secvenţă care le permite să ibride#e cu capetele &P şi >P ale uneigene ţintă. *rimerii se extind pe secvenţa ţintă, reacţia de sinte#ă fiind catali#ată de ADN!polimera#ă (n pre#enţadeoxinucleotid!trifosfaţilor. e#ultatul este duplicarea secvenţei ţintă de origine. Denaturarea ADN dublu catenar re#ultat după primul ciclu şi repetarea procesului de multe ori au ca re#ultat creşterea exponenţială a cantităţii deADN ţintă.

ADN dublu catenar care conţine secvenţa ce urmea#ă a fi copiată şi amplificată, se amestecă cu un mare excesmolar a două oligonucleotide de ADN monocatenare ! primerii. *rimul primer este identic cu secvenţa capătului >P al catenei sens al ADN ce va fi copiat, iar al ''!lea primer este identic cu secvenţa de la capătul &P al catenei opuse. *entru că ADN dc este antiparalel, al ''!lea primer este

complementul inversat al catenei sens. eacţia de polimeri#are (n lanţ este iniţiată prin denaturarea "RtopireaS% ADN la temperatură (naltă şi răcireaamestecului pentru a permite reasocierea şi formarea dublei catene. 'n timpul reasocierii, primul primer, pre#ent (nmare exces molar, va ibrida la capătul >P al catenei sens, iar al ''!lea primer, de asemenea pre#ent (n mare excesmolar, va ibrida cu capătul &P al catenei antisens.

Amestecul reasociat pe ba#a complementarităţii ba#elor se incubea#ă cu ADN polimera#a ' şi cu toate cele =deoxinucleotid!trifosfaţi "A, -, şi +%. )e sinteti#ea#ă ADN nou: ADN polimera#a ' va extinde capătul &P alfiecărui primer legat şi se sinteti#ea#ă complementul matriţei de ADN monocatenar. +atena sens originală are rolul de matriţă pentru sinte#a unei noi catene antisens, iar catena antisens originală arerolul de matriţă pentru sinte#a unei noi catene sens. +u aceasta se (nceie ciclul ' al reacţiei de polimeri#are. +iclul '' al reacţiei este iniţiat după ce amestecul de reacţie este denaturat din nou şi catenele, at0t cele originalec0t şi cele sinteti#ate (n ciclul ', se alinia#ă cu primerii. 'n treapta de sinte#ă a ADN din ciclul '', fiecare lanţ

sinteti#at (n primul ciclu, dar şi catenele originale au rol de matriţă după ce au ibridat cu primerii adecvaţi. Numărul matriţelor (n reacţie se dublea#ă la fiecare ciclu şi de aici derivă numele de Rreacţie (n lanţS. +iclul al ''!lea al reacţiei se (nceie c0nd ADN!polimera#a ' extinde primerii şi sinteti#ea#ă catenecomplementare matriţelor. eacţia de polimeri#are poate fi condusă pentru 2 sau un număr mai mare de cicluri. -eoretic, fiecare rund de replicare dublea#ă numărul moleculelor de ADN, dar procesul rareori are eficienţă de1? datorită pre#enţei inibitorilor ADN!polimera#ei, care (n rundurile ulterioare limitea#ă randamentul reacţiei.


8/24

Jig. =>1. 'lustrarea scematică a principiului şi etapele tenicii *+ "după 9. Oeffer and Emma Aarons, 2=%. Aceste reacţii sunt automati#ate, folosind termocicluri cu temperatură controlată pentru reglarea denaturării,reasocierii şi sinte#ei ADN. )e utili#ea#ă -aQ!polimera#a "o ADN polimera#ă '% care suportă temperatura dedenaturare a ADN, i#olată de la bacteriile termofile. eacţia de polimeri#are (n lanţ are multe utili#ări. De exemplu, folosind primerii adecvaţi poate fi amplificatăorice secvenţă de ADN. După amplificare, ADN poate fi legat (ntr!un vector adecvat şi astfel secvenţa ADN sedetermină fără să necesite i#olarea genei ADN. Acesta a fost principalul obiectiv al introducerii acestei metode. *+ poate fi folosit pentru clonarea genelor cunoscute sau a genelor (nrudite cu genele cunoscute pentrudetectarea şi ciar cuantificarea unei secvenţe particulare de ADN (ntr!o probă "de exemplu, detectarea pre#enţeisecvenţelor virale (ntr!o probă clinică%. Nivelul ANm poate fi de asemenea cuantificat după transcrierea inversă şi obţinerea unei copii de ADNc a

moleculei de ANm. *+ poate amplifica ADN numai c0nd cei doi primeri sunt apropiaţi unul de celălalt "adică sunt situaţi (ninteriorul unei unei secvenţe de 1 Hb%. +omponentele esenţiale ale *+ sunt: -aQ ADN!polimera#a, primerii oligomerici, deoxinucleotidele "dN-*s%,matriţa de ADN şi ionii de Mg. Condiţiile C". ;ariaţia recomandată a concentraţiei -aQ ADN!polimera#ei este 1,!2,> unităţi41 7l. @concentraţie prea mare a en#imei favori#ea#ă formarea produselor nespecifice, iar o concentraţie prea mică aen#imei determină formarea unei cantităţi insuficiente de produs. -aQ ADN!polimera#a are activitate optimă la F şi nu este inactivată la temperatura de 7M ale primerilor. +oncentraţiile mai mari de primer pot favori#aformarea produselor nespecifice şi (n special pot creşte rata asocierii primer!dimer. *rodusele nespecifice şi

artefactele primer!dimer sunt substraturi pentru *+ şi re#ultatul este scăderea cantităţii de produs specific. *rimerii tipici au o lungime de 1G!2G nucleotide, cu o proporţie de T+ de >!3?. *rimerii trebuie să aibătemperaturi asemănătoare de denaturare "-m%. +oncentraţiile dN-* care dau specificiate şi fidelitate optimă sunt de 2!2 7M, iar a ionilor de Mg, de ,>!2,>mM. *+ presupune un ciclu repetitiv (ntre o temperatură (naltă necesară denaturării ADN, o temperatură relativscă#ută pentru a permite primerilor să se ibride#e cu regiunea complementară a ADN şi o temperaturăintermediară pentru extensia primerilor. eglarea temperaturii şi durata de timp a fiecărui interval depind decompo#iţia (n ba#e, lungimea şi concentraţia primerilor. -emperatura de ibridare de >>!F2 dă cele mai bunere#ultate. Ca o concentraţie de ,2 7M, ibridarea necesită numai c0teva secunde. Activitatea en#imei varia#ă cu două ordine de mărime (ntre 2 şi G> +. Extensia primerilor are loc la F2 , optimă

pentru -aQ ADN!polimera#ă. +ondiţiile tipice pentru denaturare sunt la


9/24

prelungită prea mult, duce la pierderea activităţii en#imei. -impul de (n/umătăţire a activităţii -aQ ADN! polimera#ei este de = min. la . 6n număr prea mare de cicluri de reacţie poate creşte cantitatea şicomplexitatea produselor nespecifice, iar un număr prea mic de cicluri furni#ea#ă o cantitate prea mică de produsfinal. Alegerea corectă a primerilor este foarte importantă. -rebuie cunoscută secvenţa genomului cel puţin a uneiregiuni, iar primerii trebuie să ţintească o regiune bine conservată. *rodusul reacţiei de amplificare are dimensiuni cunoscute şi poate fi detectat pe gel de agaro#ă, (n comparaţie cuo scară de greutăţi moleculare cunoscute. 'n produsul de amplificare se poate evidenţia mai mult dec0t o bandă sau

banda nu are locali#are corectă.

26.*. C#$ti+ic#re# m!tip!ic,rii "ir#!e

Metode $izice. C" "metodă ba#ată pe detectarea aci#ilor nucleici% poate să determine numărul copiilor genomice ale virionilor infecţioşi şi neinfecţioşi (ntr!o probă. -estele serologice 'A şi EC')A ! pot să determine cantitatea de virus dintr!o probă. Aceste metode nudisting (ntre particulele infecţioase şi neinfecţioase şi uneori detectea#ă proteinele virale neasamblate. 6nele virusuri posedă o proteină cu funcţie aglutinantă pentru ematiile umane şi animale. -estele de A suntmetode uşoare şi rapide pentru cuatificarea acestor virusuri. emaglutinarea este produsă de virionii infecţioşi şi

neinfecţioşi. Numărul de virioni poate fi evaluat direct prin metoda microscopiei electronice, prin comparaţie cu osuspensie standard de particule de latex de dimensiuni asemănătoare.

Metodele biologice se ba#ea#ă pe inocularea animalelor sau culturilor celulare sensibile:! determinarea dozei letale ./ "DC>% "do#a de virus care produce moartea a >? din numărul total de animale

infectate% sau determinarea dozei in$ecţioase > "D'>%! determinarea EC (n culturi de celule la o serie de diluţii ale virusului. -itrul este exprimat (n D'>! metoda pla0elor este cea mai folosită. Monostratul de celule este inoculat cu diluţii adecvate de virus. După

adsorbţia virusului, stratul de celule este acoperit cu mediu agari#at sau cu carboxi!metilcelulo#ă "+M+% pentru a (mpiedica diseminarea virusului pe suprafaţa monostratului. După c0teva #ile, celulele infectateiniţial produc virus ce infectea#ă numai celulele (nvecinate. +iclurile succesive de multiplicare urmate demoartea celulelor produc o pla/ă de li#ă. Durata de timp p0nă la apariţia pla/elor depinde de durata ciclului de

multiplicare a virusului şi varia#ă de la c0teva #ile "poliovirus%, p0nă la două săptăm0ni sau mai mult "); =%.In condiţii controlate, o pla/ă de li#ă poate să re#ulte prin multiplicarea unei singure particule virale, denumită1* . *la/ele pot fi numărate macroscopic. aportul numărului de particule infecţioase faţă de numărul totalde particule virale varia#ă de la 1 la mai mult de 141, cu o medie de 14c0teva sute

! unele virusuri "erpes, vaccinia% formea#ă pustule pe membrana corioalantoică a embrionului de găină. Ele pot fi Quatificate prin raportarea numărului de pustule calculat la diluţia virusului inoculat.

26.-. ri+ic#re# /i ide$ti+ic#re# "irsri!or

In vederea purificării, virusul se cultivă (ntr!un substrat celular permisiv sau se inoculea#ă la ga#de sensibile pentru obţinerea unei cantităţi mari de virus.

*rima treaptă a purificării este concentrarea particulelor virale. +oncentrarea se face prin metoda precipitării

cu sulfat de amoniu, etanol sau *E sau prin metoda ultrafiltrării.*entru concentrarea virusurilor emaglutinante se foloseşte metoda hemaglutinării, urmată de eluţia virusului.@dată concentrat, virusul poate fi separat de materialele probei prin centrifugare diferenţială, centrifugare (n

gradient de densitate, cromatografie (n coloană şi electrofore#ă.*entru o purificare adecvată este necesară mai mult dec0t o etapă. *urificarea preliminară are scopul de a

(ndepărta cel mai mult material neviral, prin centrifugare. -reapta finală include totdeauna centrifugarea (n gradientde densitate.

;irusurile pot să fie purificate prin centrifugare la vite#ă (naltă (n gradiente de densitate de clorură de cesiu,tartrat de potasiu, citrat de potasiu sau sucro#ă.

+antităţi mici de material celular tind să se adsoarbă pe particulele virale şi să co!purifice. +riteriul minim de puritate este aspectul omogen la microscopul electronic. 'dentificarea unei particule ca virus se face pe ba#a următoarelor principii:

! particula poate fi obţinută numai din celule sau din ţesuturi infectate! particulele obţinute din diferite surse sunt identice, indiferent de substratul (n care se cultivă


10/24

! inactivarea infecţio#ităţii sub acţiunea factorilor fi#ici sau cimici este asociată pierderea activităţii virale! serul imun anti!virus infecţios reacţionea#ă cu particulele virale! pasa/ul particulelor (n cultura celulară permisivă duce la producerea virusului progen.

26.0. Ac(i$e# +#ctori!or +i)ici /i cimici #spr# "irsri!or

eacţia la temperatură este foarte diferită: virusurile ico#aedrice nude tind să fie stabile, pentru că pierd puţindin infecţio#itate după c0teva ore la &Fo. ;irusurile (nvelite sunt mai temosensibile: titrul infecţios scade rapid la&Fo.

'nfecţio#itatea virală, (n general, este anulată la >!3o pentru & min. Excepţiile sunt ;8, poliomavirusurile. ;irusurile pot fi conservate la temperaturi sub!(ngeţ şi unele suportă liofili#area "(ngeţarea prin uscare% şi potfi păstrate (n stare uscată la =o sau la temperatura camerei. ;irusurile care suportă liofili#area sunt maitermore#istente, dacă sunt supuse (ncăl#irii (n stare uscată. ;irusurile (nvelite pot să!şi piardă infecţio#itatea după

păstrare prelungită la !


11/24

cimioterapia infecţiilor virale răm0ne o problemă ma/oră a cercetării biomedicale. 'nsuccesele terapiei infecţiilor virale, comparativ cu succesele terapiei infecţiilor bacteriene, se datorea#ă diferenţelor fundamentale (ntre bacteriişi virusuri: bacteriile sunt organisme autonome, cu metabolism propriu, iar virusurile sunt entităţi cu organi#areacelulară, care interacţionea#ă cu substratul celular viu (ntr!o modalitate specifică, pre#ent0nd un parazitismabsolut, de nivel genetic, ne(nt0lnit la bacteriile para#ite. )tudiile de biologie moleculară identifică funcţiilespecific virale ce pot servi ca ţinte pentru acţiunea agenţilor cimioterapeutici: ataşarea, de#velirea, sinte#a aci#ilor nucleici virali, traducerea, asamblarea şi eliberarea virusurilor. 'n contrast cu infecţiile bacteriene, la care semneleşi simptomele maladiei (nsoţesc multiplicarea bacteriană, (n ca#ul infecţiilor virale, simptomele clinice apar numaidupă o perioadă de incubaţie adecvată, timp (n care multiplicarea virală atinge o rată maximă "-ople şi LilsonPs,1


12/24

iar mielosupresia este accentuată la aproape toţi indivi#ii trataţi. 'nsă, compusul este mult mai eficient şi are otoxicitate mult mai scă#ută atunci c0nd este administrat local "(n Heratite erpetice%.4idarabina este analogul adeno#inei. )!a sinteti#at şi s!a studiat ca agent antitumoral.

)tructura moleculară a ba#ele a#otate componente ale aci#ilor nucleici. +aracterul aromatic al inelelor purinice şi pirimidiniceface ca nucletidele să absoarbă lumina 6; cu spectre caracteristice, ceea ce permite detectarea, identificarea şi Quantificareanucleotidelor şi a derivaţilor lor.

)tructura moleculară a nucleo#idelor

)tructura moleculară a nucleotidelor

)tructura moleculară a vidarabinei )tructura moleculară a idoxuridinei

6lterior s!a evidenţiat că vidarabina este activă faţă );, ;;, +M;, virusul vaccinal şi unele retravirusuritumorale. Mecanismul de acţiune implică fosforilarea nucleo#idului de către en#imele celulare şi (ncorporarea (ncatena de ADN viral şi celular, (n curs de sinte#ă, re#ultatul fiind (ncetinirea ratei sinte#ei ADN. ;idarabin!trifosfatul este un inibitor competitiv al ADN!polimera#ei celulare şi virale. Este mai activ faţă de en#imele virale,ceea ce face să aibă efect inibitor selectiv faţă de sinte#a ADN viral. ;idarabina inibă şi alte trepte ale sinte#eiaci#ilor nucleici: poliadenilarea AN şi deoxinucleotidil!transfera#a terminală. 'nibă o en#imă de metilare aANt şi ANm. Acest efect face ca vidarabina să fie toxică pentru celulele mononucleare. )e foloseşte ca unguent

ocular pentru tratamentul ceratitei erpetice. *entru tratamentul infecţiilor erpetice prin administrareintravenoasă, vidarabina a fost (nlocuită de acclovir, datorită slabei solubilităţi (n apă şi toxicităţii relativ ridicate.


13/24

"ibavirina, un analog sintetic al nucleo#idelor purinice"1!β!D!ribofurano#il!1,2,=!tria#ol!&!carboxiamida%,a fost sinteti#ată la (nceputul anilor XF. Din punct de vedere structural se aseamănă cu guano#ina şi ino#ina. Invitro este activă faţă de o gamă foarte variată de virusuri ADN şi AN: adeno!, erpesvirusuri, influen#a A şi 8,virusul respirator sinciţial, buniavirusuri, arenavirusuri, reovirusuri şi ';.

)tructura moleculară a ribavirinei

)!au propus trei mecanisme de acţiune, ceea ce explică spectrul său larg de activitate.a% Medicamentul difu#ea#ă uşor (n celulele eucariote, unde este convertit de către en#imele celulare, la mono!,

di! şi trifosfat. ibavirin!monofosfatul este un inhibitor puternic al IM )inozin-mono$os$at % dehidrogenazei, oen#imă esenţială pentru sinte#a -*. e#ultatul este scăderea concentraţiei celulare a guano#in!nucleotidului,necesar replicării ADN celular şi viral

b% 'nibă procesul de bonetare "capping % al ANm viral, etapa esenţială a traducerii mesa/ului (n proteinevirale c% 'nibă direct &"-polimeraza dependentă de AN a virusurilor influen#a şi (nt0r#ie iniţierea şi alungireacopiilor de ANm. ibavirina nu este (ncorporată (n structura aci#ilor nucleici şi nici nu determină terminarea transcrierii ANm.ibavirina este toxică: produce anemie şi este embriotoxică. Anemia apare ca o consecinţă a difu#iei şi acumulăriiacestui compus (n eritrocit , unde nu este inactivat prin defosforilare, deoarece eritrocitul nu posedă fosfata#e.Astfel, eritrocitele sunt scoase prematur din circulaţie. Ca do#e mari, ribavirina inibă eritropoe#a (n măduvaosoasă. Efectele toxice sunt reversibile după oprirea tratamentului, dar timpul de (n/umătăţire al ribavirinei este de= de #ile şi efectele se prelungesc după oprirea tratamentului. Nu se administrea#ă gravidelor, deoarece puii de

şoarece se nasc cu malformaţii sceletice şi probabil efecte asemănătoare s!ar produce asupra fătului uman.ibavirina se foloseşte (n tratamentul $ebrei de 'assa. ata morţii pacienţilor infectaţi cu arenavirusul febrei deCassa este de >>!F3?, dar scade la >!


14/24

)tructura moleculară a acclovir )tructura moleculară a guano#inei

Acclovir difu#ea#ă liber (n toate celulele, infectate şi neinfectate, dar se activea#ă şi se acumulea#ă numai(n celulele infectate cu erpesvirusuri, deoarece prima treaptă a activării sale, $os$orilarea (n po#iţia >P a cateneilaterale, este reali#ată numai de o timidin-5inaza "en#imă care catali#ea#ă fosforilarea +>P al pento#ei, prima etapăa modificării nucleo#idelor pirimidinice pentru (ncorporarea (n ADN% specific virală şi (n măsură nesemnificativă,de timidin!Hina#a celulară.

Afinitatea -H ); pentru acclovir este de circa & milioane de ori mai mare dec0t a -H celulare. Acclovir este fosforilat mult mai rapid şi de aceea este (ncorporat preferenţial (n ADN. Josforilările ulterioare la formeledifosfat şi respectiv trifosfat "activ% sunt catali#ate de 5inazele celulare. 'n cursul replicării ADN, acclovir!trifosfatul intră (n competiţie cu d-*, care este substratul natural al ADN!polimera#ei virale. ADN!polimera#elecatali#ea#ă (ncorporarea nucleotid!trifosfaţilor: cele specific virale sunt de circa & de ori mai sensibile la acţiuneainibitorului, dec0t ADN!polimea#ele umane. Datorită faptului că molecula de acclovir (ncorporată nu oferăgruparea &P@, următoarea nucleotidă nu mai este legată şi replicarea ADN este blocată. @dată cu legareamoleculei de acclovir la ADN, se formea#ă un comple% ternar la care participă acclovir, ADN!polimera#a şiurmătorul nucleotid, ceea ce duce la scăderea amplă a sinte#ei ADN viral. -oate aceste proprietăţi fac caacclovirul să aibă acţiune foarte selectivă asupra multiplicării virale, efectele sale asupra replicării ADN celular fiind nesemnificative "fig. =>2%. eplicarea ADN al ); este de & de ori mai sensibilă dec0t replicarea ADNcelular.

ADN

'ni bar easinte#ei ADN

AD N pol imer a#avir a l ă

! -r if os f at

! M onof osf a t

-i midi n!Hina#avir a lă

A+;

9ina#ecel ular e

A+;

A+;

A+;

ACV

Jig. =>2. 'lustrarea scematică a mecanismului de acţiune a acclovir "A+;%. -imidin!Hina#a virală catali#ea#ă conversia A+; la A+;!monofosfat, iar treapta a ''!a a fosforilării este catali#ată de Hina#ele celulare. ADN!polimera#a virală (ncorporea#ă A+;!trifosfat (n ADN şi blocea#ă sinte#a ADN.

;irusurile care codifică sinte#a unor en#ime ale căror omologe există şi (n celulă, au avanta/ul că se potmultiplica (n celulele care nu se divid. erpesvirusurile se deosebesc foarte mult (ntre ele, (n privinţa sensibilităţiila acclovir "8acon şi colab., 2&%. ); este un amestec de tulpini -H T şi -H !. -ulpinile -H ! au capacităţi limitatede a stabili infecţii latente (n neuroni, care să se şi active#e. *redomină tulpinile -H T, deoarece sunt maineurovirulente şi au avanta/ul selectiv de a stabili infecţii latente (n ganglionii sen#itivi, cu capacitatea dereactivare. Astfel, );!1 şi );!2 sunt extrem de sensibile, necesit0nd in vitro concentraţii de ,=!,= µg4ml

pentru a obţine inibiţia replicării cu >?. 'n scimb, -H ;; nu fosforilea#ă acclovir la fel de eficient ca

en#ima omologă de la );!1 şi );!2. Astfel se explică sensibilitatea de G!1 ori mai mică a ;; la acclovir.+M; necesită concentraţii foarte mari de acclovir pentru blocarea multiplicării virale, deoarece acest virus nu


15/24

codifică o -H proprie. Nu se ştie dacă virusul Epstein!8arr codifică o -H capabilă să active#e acclovir.Acclovirul nu poate acţiona (n fa#a de latenţă a nici unuia dintre virusurile erpetice. 6n avanta/ ma/or altratamentului cu acclovir (l repre#intă absenţa unor efecte grave de toxicitate. Administrarea intravenoasă produceo creştere tran#itorie a nivelului seric de creatinină, datorată probabil unei obstrucţii la nivelul tubulilor renali. 'nliteratura de specialitate a mai fost descris un sindrom neurologic tran#itoriu, ale cărui manifestări clinice suntconfu#ia, letargia, rareori alucinaţii şi comă. Acest sindrom apare la pacienţii imunosupresaţi, care primescintravenos do#e foarte mari de acclovir. Acclovirul previne recurenţa erpetică. După aplicare #ilnică, (n do#emici, sunt suprimate aproape complet recurenţele frecvente. Nu produce efecte secundare, ciar după administrare

prelungită. Dacă este administrat profilactic, la pacienţii expuşi radiaţiei 6; solare sau artificiale, acclovirul oralscade frecvenţa le#iunilor erpetice, care se declanşea#ă (n intervalul 2!F #ile, dar nu influenţea#ă le#iunile careapar (n primele =G de ore de la expunerea la agenţii declanşatori. Ce#iunile care apar (n primele =G de ore suntconsecinţa reactivării unor tulpini mai virulente, pe fondul unei reactivităţi imunitare suboptimale. Acclovirulreduce la 1=? morbiditatea encefalitei erpetice.

)tructura moleculară a cito#in!arabino#idei

"ezistenţa la acclovir se instalea#ă după administrarea pentru perioade lungi de timp, a do#elor care nusuprimă multiplicarea virală, In condiţiile presiunii selective, datorată administrării acclovirului, tulpinile -H T nuse pot multiplica şi o proporţie importantă de virioni suferă conversie de la -H T la -H ! sau la forme care aucapacitate redusă de a codifica -H. Astfel de mutante sunt re#istente, deoarece nu fosforilea#ă acclovir. Dupăoprirea tratamentului, tulpinile -H ! reversea#ă la -H T! 6n alt mecanism de re#istenţă este expresia unei ADN!

polimera#e cu afinitate redusă pentru acclovir!trifosfat şi respectiv expresia unei -H cu proprietăţi alterate delegare a medicamentului. 'n aceste ca#uri, se recomandă administrarea $oscarnet , cu un mecanism de acţiunediferit.7anc!clovir "1,&!diidroxi!2!propoximetil guanina%, este un analog nucleo#idic asemănător acclovirului, cudeosebirea că mai conţine o grupare hidro%imetil ce se comportă asemănător cu gruparea &Pidroxil aribofurano#ei. Este activ faţă de toate virusurile erpetice umane şi este de 1 de ori mai eficient (n comparaţiecu acclovir, faţă de +M; uman. -oxicitatea este (nsă mult mai mare dec0t a acclovir şi din această cau#ă estefolosit doar (n ca#ul pacienţilor imunocompromişi cu infecţii severe provocate de +M;.

)tructura moleculară a gancclovir

Nu se cunoaşte mecanismul care face ca ganc!clovir să fie mult mai eficient dec0t acclovir (n tratamentulinfecţiilor produse de +M;. ancclovir este activat specific (n celulele infectate cu virusuri erpetice, dar (nspecial de -H codificată de gena 6C


16/24

&damantanii )amantadina şi derivatul ei α -metil-amantadina sau rimantadina8 sunt utili#aţi pentrutratamentul infecţiilor cu virusul influen#a. Din punct de vedere cimic, sunt amine ciclice care derivă formal de laidrocarbura policiclică adamantan2 &mantadina este o amină triciclică, derivatul 1!amino al adamantanului, un compus complex cu 1 atomide +, cu o structură de colivie.

"imantadina este un derivat aproape identic, metilat, al amantadinei. Ambele inibă multiplicarea virusuluiinfluen#a A in vitro şi in vivo, dar nu inibă virusul influen#a 8.

)tructura moleculară a amantadinei )tructura moleculară a rimantadinei

Mecanismul de acţiune şi spectrul activităţii antivirale sunt identice, (nsă rimantadina este metaboli#ată diferit

de amantadină şi produce efecte secundare "febră, insomnie, dificultăţi de concentrare%. Amantadina blocea#ă fa#atimpurie a infecţiei dezvelirea- dar influenţea#ă şi fa#ele tardive ale multiplicării: asamblarea virionilor şi(nmugurirea "8rad şi colab., 1


17/24


18/24

everstranscripta#a este en#ima virală care converteşte informaţia genetică virală AN, (ntr!o moleculăcomplementară de ADN dublu catenară. 'nibiţia reverstranscripta#ei este produsă de analogii nucleo#idelor:#idovudina "a#idotimidina ! A-%, dideoxiino#ina "DD'% "analogă guano#inei%, dideoxicitidina "DD%.

)tructura moleculară a dideoxiino#inei )tructura moleculară a dideoxicitidinei

Analogii nucleo#idelor se aseamănă cu substanţele naturale care intră (n compo#iţia ADN al ';, dar trebuie să fie fosforilaţi de en#imele celulare, deoarece virusul nu codifică -H. Dincolo de punctul (ncorporăriianalogilor ba#elor, reacţia de polimeri#are şi de sinte#ă a ADN '; este blocată. )electivitatea acţiunii lor s!adatorat inibiţiei reverstranscrierii. +ompuşii din prima generaţie au produs toxicitate pe termen lung:mitocondrială "didano#ina%, nefrotoxicitate "cidofovir%. 6lterior s!au selectat analogi ai nucleo#idelor şinucleotidelor mai puţin toxici. *rimul compus al grupului este #idovudina "ot#sce, 1


19/24

nucleo#id!difosfat "+un şi colab., 21%. De aceea, (n celulele infectate şi (n cele normale, nivelul intracelular denucleo#id di! şi trifosfaţi scade, ceea ce duce la scăderea ratei sinte#ei ADN.A- este toxică pentru măduva osoasă. Efectele secundare ale administrării acestui compus sunt: anemie severă,neutropenie, dureri de cap, miopatie manifestată clinic prin diminuarea capacităţii contractile a musculaturii, iar anatomic, prin apariţia mitocondriilor anormale (n fibrele musculare. Ca pacienţii supuşi tratamentelor cu#idovudină creşte riscul de a de#volta limfoame non!odgHin, probabil ca o consecinţă a imunosupresiei(ndelungate "oggard şi colab., 21%. Ca pacienţii cu )'DA, supuşi unui tratament de lungă durată cu #idovudină,s!a constatat instalarea unei re#istenţe a virusului '; faţă de acest compus. A- se foloseşte pentru tratamentultuturor stadiilor infecţiei cu ';. Do#ele mari de 12!1> mg4#i prelungesc supravieţuirea, reduc frecvenţainfecţiilor oportuniste, bolnavul c0ştigă (n greutate, viremia diminuea#ă, iar funcţia imunitară se ameliorea#ă"9aHuda şi colab., 21%.

In pre#ent, A- se administrea#ă (n do#e mici "&!> mg4#i% şi are efecte secundare limitate. Do#aoptimă este de 3 mg4#i "+ato şi colab., 1


20/24

nucleic şi blocea#ă sinte#a proteinelor. Deoarece gena rev are rol reglator esenţial, s!a obţinut AN!anti ANm alacestei gene. Efectul a fost inibiţia sinte#ei proteinelor (n celulele infectate cronic, in vitro. 'nterferenţa cu prima treaptă a ciclului infecţios legarea '; de receptorul +D= al membranei limfocitare

a fost propusă ca o modalitate de tratament. +D= solubil recombinat este o moleculă incompletă, din care lipsescsecvenţele transmembranară şi citosolică, care se leagă cu gp12 şi (mpiedică legarea virusului de limfocitele - +D=.*reparatul nu este toxic, dar timpul de (n/umătăţire este foarte scurt. )trategia curentă pentru terapia infecţiei '; este denumită AA- " 3ighl! &ctive &nti-"etraviral Therap!% şi utili#ea#ă combinaţii ale diferitelor medicamente: un inhibitor al proteazei, asociat cu doi analoginucleozidici inhibitori ai reverstranscripta#ei "8la#evic şi colab, 21%. Ca pacienţii supuşi terapiei AA-,infecţia unor noi celule nu este complet blocată. '; persistă, cu o rată foarte scă#ută a multiplicării (n rezervorul celular repre#entat de macrofage, celule - +D= neanga/ate şi ciar celulele - +D= de memorie, ceea ce permiteeliberarea virionilor progeni şi infecţia unor noi celule. Dove#ile multiplicării '; la pacienţii trataţi AA- sunturmătoarele:! mulţi pacienţi au nivele plasmatice scă#ute ale AN viral, sub limita de detectare prin testele convenţionale

"2!> copii4ml%, dar detectabile prin metode sensibile care determină cantităţi de 1!> de copii AN4ml! pacienţii trataţi cu AA- devin aviremici, dar prin metoda ibridi#ării in situ sau -!*+ se detectea#ă

celule infectate productiv, care exprimă AN ';!1 ")ervais şi colab., 21%

! diferenţele cantitative dintre ADN!'; total şi integrat (n celulele -+D= sugerea#ă existenţa celulelor infectate recent cu ';!1, (n care ADN este neintegrat. Acestea sunt copii lineare complete revers!transcrise,care suferă o reacţie aberantă de legare cap la cap, (n loc să se integre#e (n cromosomul ga#dei.

*entru eliminarea re#ervorului de virus se impune creşterea do#ei terapeutice combinate care să inibecomplet multiplicarea virusului. Dar re#ervorul de virus are o persistenţă (ndelungată, iar terapia AA- estetoxică. *entru eliminarea re#ervoarelor de virus se propune stimularea transcrierii şi multiplicării virale (n celuleleinfectate latent, sub acţiunea cito5inelor . @dată cu multiplicarea virusului, celulele mor datorită efectului citopaticsau expun antigene virale şi devin ţinta acţiunii litice a limfocitelor -+D = citolitice. Astfel, o combinaţie de 'C!2,'C!3 şi -NJα poate induce activarea şi multiplicarea virusului (n celulele infectate latent, in vitro. 'C!2 producecreşterea numerică a celulelor - +D=, dar nivelul viremiei a rămas nemodificat. +elulele infectate latent cu ';!1nu exprimă receptori de (naltă afinitate pentru 'C!2, citoHina poate activa multiplicarea virală prin intermediulreceptorilor de mică afinitate sau indirect prin alte citoHine ale cascadei. Asocierea AA- cu un agent care să

active#e specific numai celulele -+D= infectate latent, ar fi soluţia terapeutică ideală. -erapia multiplă reduce risculemergenţei unei tulpini virale cu re#istenţă multiplă. -erapia anti!'; este ineficientă datorită unor particularităţi moleculare şi biologice ale ';:! genomul viral se integrea#ă (ntr!un cromosom celular şi infecţia răm0ne latentă o perioadă nedefinită! virusul se poate disemina prin transfer intercelular direct, fără o fa#ă extracelulară! virusul infectea#ă celule circulante "limfocite, macrofage% şi se diseminea#ă sistemic! virusul poate infecta celule ale )N+ şi agenţii terapeutici ar trebui să depăşească bariera emato encefalică! virusul scapă acţiunii Ac specifici şi răm0ne infecţios! apariţia frecventă a variantelor antigenice.

Imunoglobulinele antivirale sunt disponibile (n & variante:! preparatul de globuline imune "'% pentru in/ectare intramusculară! preparatul de imunoglobuline pentru in/ectare intravenoasă "';'% ! preparate de imunoglobuline in/ectabile intravenos, cu titru (nalt de anticorpi.

-oate variantele se obţin din plasma umană şi conţin predominant 'g, dar şi alte i#otipuri. )e pot obţine preparate cu un titru (nalt de imunoglobuline faţă de anumite antigene virale, prin imuni#area animalelor.*reparatul ' nu poate fi administrat intravenos, datorită tendinţei 'g de a forma agregate, care, in vivo, fixea#ăcomplementul. 'munoglobulinele sunt mai eficiente dacă sunt administrate profilactic, dec0t terapeutic. *reparatele' se folosesc (n primul r0nd pentru prevenirea epatitei A şi se administrea#ă pacienţilor, (n c0teva #ile dupăconsumul alimentelor contaminate. *reparatele ' iperimune obţinute prin imuni#area animalelor seadministrea#ă postexpunere la ;8 şi rabie. *reparatul ' specific antirabic se obţine din plasma donorilor iperimuni#aţi.

29.6. Im$oter#pi#

;ariabilitatea genetică a '; a (mpiedicat de#voltarea unui protocol al imuni#ării )'DA. )!au obţinutanticorpii anti!proteină de (nveliş gp12, pentru blocarea interacţiunii gp12 şi implicit a infecţiei "-aHeda şi


21/24

colab., 1


22/24

(nlocuit cu codonul "6'% pentru sinte#a -rp. ANm modificat, codifică o proteină mai mare antigenul # de ;l<aminoacizi, o proteină ba#ică, fosforilată care se acumulea#ă (n nucleul celulei infectate. *entru virusurile cu genom AN de polaritate negativă, hipermutaţia datorată dezaminării & este asociată cu

persistenţa infecţiei. *entru virusurile cu genom ADN dc, modificarea repre#intă un mecanism prin care copiile deANm timpuriu sunt inactivate. Marea diversitate a ribovirusurilor se explică prin mutabilitatea accentuată şi adaptabilitatea lor. +u puţineexcepţii, virusurile capabile să infecte#e insecte şi animale superioare sau insecte şi plante au genom AN.Adaptabilitatea Quasispeciilor le permite deplasarea (ntre diverse medii selective. Joarte adesea, numai una sauc0teva scimbări mutaţionale permit unui virus să dob0ndească virulenţă, să!şi scimbe tropismul şi să devinăre#istent la un medicament antiviral sau la anticorpii specifici. ;ariaţiile secvenţei de ba#e a Quasispeciilor potinfluenţa severitatea in$ecţiei virale. Japtul este extrem de important pentru cercetători şi pentru clinicieni, caretind să considere virusul ru/eolic, ';, virusul epatitei + sau polio, ca entităţi infecţioase unice, la care diferiţii

pacienţi răspund diferit. )e ignoră natura fundamentală a ribovirusurilor, adică mutabilitatea lor accentuată,materiali#ată (n existenţa Quasispeciilor. eterogenitatea Quasispeciilor, caracterul tran#itoriu, (nt0mplător,nedeterminat şi imprevi#ibil al apariţiei lor, creea#ă o genetică aleatorie, contraintuitivă. 8a#a ubicvităţiiribovirusurilor este ciar eterogenitatea lor genetică. Existenţa Quasispeciilor ridică probleme insurmontabilecontrolului ma/orităţii infecţiilor cu ribovirusuri, prin intermediul vaccinurilor. ;accinarea a avut succes pentru

unele viro#e "produse de virusul polio, ru/eola, oreionul, variola%, deoarece anumiţi epitopi antigenici ai proteinelor virale, au o probabilitate mică de a se modifica fără să compromită infecţio#itatea lui. Dar pentru alte ribovirusuri"JMD;, ';1, virusul epatitei +% natura efemeră a Quasispecilor pune probleme dificile (n calea identificăriiepitopilor stabili "sau puţin variabili% şi imuni#anţi "stimulatori ai răpunsului imun protector%. +ele mai multevirusuri AN, suferă o divergenţă evolutivă, prin substituţia ba#elor cu o rata de l4l 2!l=4nucleotide4an. ataevoluţiei virusurilor nu este constantă. Apariţia unor noi ribovirusuri (n viitor, este o certitudine. 6nele apariţii sevor datora contactului omului cu virusuri RveciS de la animalele /unglei neexplorate, iar altele vor apărea prinrecombinare, reasortare sau prin mutaţie. Apariţia este (nsă condiţionată de evoluţia rapidă a Quasispeciilor şi decapacitatea lor de adaptare rapidă la ga#da umană. Adaptarea rapidă va determina transmiterea epidemică sau

pandemică la om, aşa cum se (nt0mplă cu influen#a A, ';1, sau va implica omul ca o ga#dă sporadică "virusulfebrei emoragice etc.%. Este foarte probabil ca ma/oritatea ribovirusurilor umane, să fi evoluat (n ultimele mii sau#eci de mii de ani, dar unele sunt mult mai recente. După 8roKn "l


23/24

genelor cataboli#ea#ă o varietate largă de substraturi. Modificările constau (n oxidări, peroxidări, reduceri. Ca om,medicamentele sunt metaboli#ate de produsele a &> gene +W* "1, 2, & şi mai puţin =%. De exemplu, codeina estemetaboli#ată la morfină "un analge#ic%. +ei cu deficit al +W*2D3 nu resimt efectul analge#ic al codeinei.Antidepresivele triciclice "nortriptilina%, dacă sunt metaboli#ate rapid au efect terapeutic minim, iar cei care lemetaboli#ea#ă insuficient resimt efectele secundare. Agenţii cimici ce reglea#ă contracţiile inimii induc efectesecundare, dacă nu sunt metaboli#ate suficient.

i3!io%r#+ie

Le$i$%er A. L. 1. 8iocimie, vol. ', -raducere după ediţia a ''!a, Editura -enică 8ucureşti.8o%%#rd .G.7 S#!es S.D.7 i3oo$3#$#>it D.7 L!o5d 4.7 M#er .A.7 oo S.8.7 ?i!>i$s E.7 C#re5 .7 8#rt C. A.7 #c> D. 4 . 21.'nfluence of *rior Exposure to idovudine on )tavudine *osporlation 'n ;ivo and Ex ;ivo ! Antimicrobial Agents and +emoterap,=>"2%: >FF!>G2.#>d# T. N.7 #%e L. M.7 A$derso$ . L.7 8e$r5 .7 Sc#c>er T. ?.7 R#me :. S.7 Acost# E. .7 r$d#%e R. C.7 :!etcer C. V. 21.*armacological 8asis for +oncentration!+ontrolled -erap Kit idovudine, Camivudine, and 'ndinavir ! Antimicrobial Agents and+emoterap. =>"1%: 2&3!2=2.r5#$t M. L.7 rid%es E. G.7 !#cidi L.7 :#r#@ A.7 Loi A. G. #$d co!#3 . 21. Antiviral l!Nucleosides )pecific for epatitis 8 ;irus'nfection ! Antimicrobial Agents and +emoterap =>"1%: 22.C#to A. III7 i#$ 4.7 8s A.7 Le"5 .7 Leo$#rd 4.7 Gr#$$em#$ R . 1es M.7 Soo ?.7 C!eme$ts M. L. 1 . M.7 Lc#s S. .7 Lc#s S.7 A%$ess 4.7 #dio A.7 G#5!e 8. D . 1 R. A.7 !#tt :. M . 1e!e"ic S.7 Stei$3er% S. M.7 4#co3se$ :.7 #rco#$ R.7 Se#rer G. M . 21. igl Active Antiretroviral -erap inuman 'mmunodeficienc ;irus -pe 1!'nfected +ildren: Analsis of +ellular 'mmune esponses ! +linical and Diagnostic Caborator'mmunolog G">%:


24/24

Ser"#is 4.7 L#m3ert C.7 :o$t#i$e E.7 !essHri# 4. M.7 Ro3ert I. 21. +omparison of DNA )eQuencing and a Cine *robe Assa for Detection of uman 'mmunodeficienc ;irus -pe 1 Drug esistance Mutations in *atients Jailing igl Active Antiretroviral -erap !Oournal of +linical Microbiolog &!F=>.8irsc M.7 #p!#$ 4.C.7 DAFi!# R.T. 1

met dgterapia

Documents