Medios de cultivo y pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias

LUIS RAÚL RÍOS MADRID

MICROBIOLOGIA MÉDICA

Catedrático: M.C. Georgina Escudero Hermosillo

Cultivo de microorganismos

Proporcionar a un microorganismo los nutrientes que le aporten energía y elementos químicos para la síntesis de sus constituyentes celulares, para su cultivo o crecimiento en un medio controlado.

Medios de cultivo no selectivos enriquecidosMedios de cultivo selectivos y diferenciales

Medios especializados

Tipos de medios de cultivo

Medios de cultivo no selectivos enriquecidos

Están diseñados para permitir el crecimiento de la mayor parte de gérmenes que no necesitan condiciones exigentes.

Agar sangre: Contiene dos compuestos, un medio basal (soja, cerebro-corazón) y sangre de

oveja, caballo o conejo.

La presencia de sangre permite la determinación de la hemólisis, criterio básico en la orientación hacia la identificación bacteriana.

Ejemplo de hemólisis características:-Streptococcus pneumoniae: α-hemólisis, con una coloración verdosa alrededor de la colonia.-Streptococcus pyogenes: ß-hemólisis, con una zona transparente alrededor o debajo de la colonia.

Agar chocolate: Un agar modificado. Agregar sangre o hemoglobina al

medio de base calentado, este se vuelve marrón. Permite el crecimiento de mayor parte de las bacterias.

Agar Mueller-Hinton: Recomendado para estudios convencionales de

susceptibilidad bacteriana (sensibilidad a los antimicrobianos). Su composición incluye extractos de ternera y caseína, sales, cationes divalentes y almidón.

Medio de tioglicolato: Medio de cultivo de enriquecimiento para empleados

para recuperar cantidades pequeñas de bacterias aerobias y anaerobias, se compone de caseína, glucosa, extracto de levadura, cisteína y tiogliconato sódico. El suplemento de Hemina vitamina K mejora la recuperación de las bacterias anaerobias.

Agar de dextrosa de Sabouraud: Medio enriquecido que contiene caseína y tejido animal

digeridos suplementados con glucosa, se emplea para aislar hongos y levaduras, utiliza un pH bajo y concentración baja de glucosa lo que elimina bacterias y así el cocimientos de hongos.

Medios de cultivo selectivos y diferenciales

Se utilizan para recuperar gérmenes específicos que pueden estar presentes en una mezcla de otros gérmenes. Los medios se enriquecen con inhibidores que suprimen el crecimiento de los gérmenes no deseados. Estos medios se hacen diferenciales añadiendo ingredientes específicos que permiten la identificación del fermen en una mezcla.

Agar MacConkey:

Para las bacterias gramnegativas y diferencial para distinguir las bacterias que fermentan la lactosa y las que no. Este medio incluye peptonas digeridas, sales biliares y el violeta cristal inhiben las bacterias grampositivas. Las bacterias que fermentan la lactosa producen ácidos, que precipitan las sales biliares y provocan un color rojo del indicador rojo neutro.

Colonias típicas: Las colonias de los microorganismos fermentadores de lactosa (coliformes) en agar MacConkey son de color rojo ladrillo, eventualmente rodeadas de bilis precipitada.

Agar sal manitol:

Se trata de un medio de cultivo selectivo empleado para aislamiento de estafilococos. El medio incluye extractos de caseína y tejidos animales digeridos, extracto de ternera, manitol, sales y rojo fenol. Los estafilococos pueden crecer en presencia de una elevada concentración de sal y S. aureus puede fermentar manitol, produciendo colonias de color amarillo e este agar.

Agar Xilosa-lisina-desoxicolato (XLD)

Agar selectivo utilizado en la detención de Salmonella y Shigella en cultivos entéricos. Es un extracto de levaduras con xilosa, lisina, lactosa, sacarosa, desoxicolato sódico, tiosulfato sódico, citrato amónico férrico y rojo fenol.

El desoxicolato sódico inhibe el crecimiento de la mayor parte de las bacterias no patógenas. Las bacterias que crecen típicamente fermentan la lactosa, la sacarosa o la xilosa y dan lugar a colonias amarillas. Shigella no fermenta estos carbohidratos, de forma que sus colonias serán rojas. Salmonella fermenta la xilosa, pero también descarboxila la lisina y genera el producto alcalino diamino cadaverina, las colonias serán rojas. La mayor parte de Salmonellas las colonias se vuelven negras lo que permite diferenciar Salmonella de Shigella.

Medio de Lowenstein-Jansen (Lj)

Utilizado para aislar microbacterias, contiene gliseron, harina de patata, sales y huevos coagulados. Se añade verde malaquita para inhibir las bacterias grampositivas.

Agar Middlenrook

Para aislar micobacterias, contiene sales, vitaminas, ácido oleico, albúmina, catalasa, glicerol, glucosa y verde malaquita par a inhibir grampositivas. Se solidifica con agar.

CHROMagar:

Agar selectivo diferencial para aislar e identificar especies distintas de lavadura Candidia. Contiene cloranfenicol para inhibir las bacterias y una mezcla se sustratos cromogénicos especiales.

Unos ejemplos son: C. albicans genera colonias verdes, C. tropicalis genera colonias moradas y C. Krusei las genera todas

Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias

consisten en distintos test químicos aplicados a medios biológicos, los cuales, conocida su reacción, nos permiten identificar distintos microorganismos presentes.

Su sistema de funcionamiento generalmente consiste en determinar la actividad de una vía metabólica a partir de un sustrato que se incorpora en un medio de cultivo y que la bacteria al crecer incorpora o no.

Para realizar las pruebas bioquímicas se dispone de múltiples medios, los cuales se deben aplicar de acuerdo a las exigencias del microorganismo en estudio.

De la amplia variedad de pruebas bioquímicas, nosotros en laboratorio utilizaremos 10, aplicados a 5 especies de microrganismos.

Además estudiaremos los resultados que estos test arrojan, comparando resultados experimentales entre los distintos grupos de trabajo de nuestro laboratorio.

•Prueba de la OxidasaEl objetivo de la prueba “Oxidasa” es buscar la presencia de la enzima Citocromo C oxidasa.Se trata de un enzima que oxida el citocromo C de la cadena transportadora de e-. Este se detecta utilizando el tetra para fenilendiamina: el reactivo de oxidasa contiene este compuesto que va a ser oxidado por la citocromo C oxidasa. En estado reducido es incolora, pero cuando se oxida vira a púrpura.Procedimiento:Con un pequeño papel de filtro añadimos reactivo de Kovacs, lo impregnamos y a partir del tubo con la bacteria problema tomamos un poco con el asa de platino y ponemos en el papel. Tras unos 30 segundos, observamos si ha ocurrido algún cambio.

Las bacterias que dan positivo a esta prueba tienen generalmente un ciclo respiratorio oxidativo.Se considera positiva esta prueba cuando toma un color púrpura la muestra.Resultados:(+) Pseudomonas aeruginosa( - ) Escherichia coli

•Prueba de la CatalasaEl Objetivo es buscar la presencia de la enzima catalasaEl peróxido de hidrógeno se produce al utilizar la bacteria el azúcar por vía oxidativa. Al ser éste un compuesto muy oxidante las bacterias la eliminan mediante la producción de la enzima catalasa (H2O2 -> H2O + ½ O2).

Procedimiento:Agregamos aproximadamente 5 ml. de peróxido de hidrógeno al 3% a un tubo de ensayo previamente esterilizado a continuación tomamos una muestra de la cepa del microorganismo a estudiar y la introducimos por el tubo de ensayo, la muestra solamente debe aclararse a la muestra de la solución liquida de peróxido de hidrogeno y debemos observar la reacción de esta.

La prueba se considera como positiva si observamos burbujas de oxígeno.Resultados:(+) Staphylococcus aureus( - ) Streptococcus spp.

•Prueba de la CoagulasaLa coagulasa es un enzima capaz de desnaturalizar la bibrina del plasma. El objetivo es buscar en factor de aglutinación de los microorganismos cuando estos se mezclan con el plasma. Esta prueba se utiliza para diferenciar microorganismos del genero Staphylococcus.Procedimiento:Preparamos una mezcla de 0,1 ml. de CCC (caldo cerebro corazón) y 0,3 ml. de plasma de conejo en un tubo de ensayo previamente esterilizado. La muestra ya contiene cepas de St. Aureus. Tapamos el tubo de ensayo con algodón hidrofóbico y lo llevamos a baño María a 37° C durante una hora, observando la muestra cada 15 minutos. Al completa la hora, sacamos las muestras y observamos sus resultados.

Resultados:Estratificaremos los resultados en 4 distintos niveles:1: pequeños coágulos no organizados2: pequeños coágulos organizados3: gran coágulo organizado4: todo el contenido aparece coagulado y se mantiene cuando invierte el tubo.Se consideran positivos los niveles 3 y 4.(+) Staphylococcus aureus( - ) Staphylococcus epidermis

Reacción Interpretación

Enturbiamiento delAgar. Hay movilidad

Agar transparente de-sarrollo solo en picada

No hay movilidad

Azul (alcalino) Descarboxila ornitina

Coloración Amarilla (ácido) No descarboxila

Rojo (anillos) Indol (+)

Amarillo (anillos) Indol ( - )

Prueba MIO (Motility-Indole-Ornitine ó Motilidad-Indol-Ornitina)

Esta prueba bioquímica permite identificar bacterias de acuerdo a su motilidad a la reacción de Indol a la descarboxilación de la ornitina.Procedimiento:Inocular en picada las cepas de microorganimos en el medio de cultivo e incubar por 24 horas a 37° .Interpretación y Resultados:

•Prueba TSI (Triple Sugar Iron ó Triple Azúcar Hierro)El TSI es un medio nutriente y diferencial que permite estudiar la capacidad de producción de ácido y gas a partir de glucosa, sacarosa y lactosa en un único medio. También permite la identificación de la producción de SH2.Esta es una prueba específica para la identificación a nivel de género en la familia Enterobacteriaceae, con objetivo de diferenciar entre:•bacterias fermentadoras de la glucosa•bacterias fermentadoras de la lactosa•bacterias fermentadoras de sacarosa•bacterias aerogénicas•bacterias productoras de SH2 a partir de sustancias orgánicas que contengan azufre.

Prodedimiento:Inocular los tubos de TSI con punta (alambre recto). Para eso introducir la punta hasta 3 a 5 mm. del fondo del tubo. Tras retirar el alambre del fondo, estriar el pico con un movimiento hacia uno y otro lado. Incubar a 35° durante 24 horas. Posteriormente se debe medir el pH de los cultivos.

Resultados:•Pico alcalino/fondo alcalino : no hay fermentación de azucares. Característica de bacterias no fermentadoras como Pseudomonas sp.•Pico alcalino/fondo ácido : Glucosa fermentada, lactosa ni sacarosa fermentadas. Shigella spp.•Pico alcalino/fondo negro : Glucosa fermentada, ni lactosa ni sacarosa fermentadas, producción de ácido sulfhídrico. Salmonela spp.•Pico ácido/fondo ácido: Glucosa y lactosa y/o sacarosa fermentadas. Puede producirse SH2 o no. Escherichia coli.A estos resultados se les agrega el resultado de la producción de gas.

Reacción Interpretación

Azul (alcalino) Hay movilidad

Rojo No hay movilidad

Engreimiento Descarboxila ornitina

Ruptura del Agar No descarboxila

Fondo Amarillo yTendido púrpura Descarboxilación de lisina

•Prueba LIA (Lisien Iron Agar ó Agar Lisina Hierro)Esta prueba permite diferenciar los microorganimos que producen descarboxilación o desaminación de la lisina. Se pude detectar ademas la produccion de SH2 y es más sensible que el TSI para la detección de SH2. Es muy utilizado par descartar Salmonella de aislamientos primaros.

Procedimiento:Inocular en forma de estría las cepas de microorganimos en el medio de cultivo e incubar por 24 horas a 37° .

Interpretación y Resultados:

Pruebas Bioquímicas IMViC:

Son cuatro pruebas bioquímicas. Se emplean fundamentalmente para la identificación de las Enterobacterias (bacilos Gram negativos, anaerobios facultativos con metabolismo fermentador). Dependiendo de las condiciones, las enterobacterias, pueden realizar un metabolismo aerobio (si disponen de oxígeno), realizar una respiración anaerobia (si hay nitratos u otro aceptor de electrones) y distintas fermentaciones.

•Agar Citrato

La utilización de citrato como única fuente de carbono es una prueba útil en la identificación de enterobacterias. La utilización de citrato como única fuente de carbono se detecta en un medio de cultivo con citrato como única fuente de carbono mediante el crecimiento y la alcalinización del medio. Este aumento de pH se visualiza con el indicador azul de bromotimol que vira al alcalino a pH 7,6.

Procedimiento:Se inocula el agar inclinado en una sola estría en el pico. Utilizar un cultivo de 24 horas en un medio sólido y cuidando no arrastrar medio de cultivo, ya que se pueden producir  falsos positivos por crecimiento a partir del medio de cultivo del inóculo. Incubar a 35°C durante 4 días. El ensayo es positivo cuando se observa crecimiento a lo largo de la estría, acompañado o no de un viraje del indicador al azul.

Resultados:(+)Klebsiella spp.( - ) Escherichia Coli

•Indol

El indol es uno de los productos de degradación metabólica del aminoácido triptofano. Las bacterias que poseen la triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el triptofano con producción de indol, ácido pirúvico y amoníaco. La producción de indol es una característica importante para la identificación de muchas especies de microorganismos. La prueba de indol está basada en la formación de un complejo rojo cuando el indol reacciona con el grupo aldehído del p-dimetilaminobenzaldehído. Este es el principio activo de los reactivos de Kovacs y Ehrlich. El medio de cultivo utilizado debe ser rico en triptofano.

Procedimiento:Inocular el caldo triptofano con el organismo en estudio e incubar a 35°C durante 18 a 24 horas. Al finalizar este período, añadir 5 gotas de reactivo de Kovacs por la pared interior del tubo. El desarrollo de un vivo color rojo fucsia en la interfase del reactivo y el caldo, segundos después de añadir el reactivo indica la presencia de indol y una prueba positiva.

Resultados:(+) Escherichia coli( - ) Klebsiella pneumoniae

•Rojo Metilo

Una de las características taxonómicas que se utilizan para identificar los diferentes géneros de enterobacterias lo constituyen el tipo y la proporción de productos de fermentación que se originan por la fermentación de la glucosa. Se conocen 2 tipos generales: La fermentación ácido-mixta y la fermentación del 2,3 butanodiol. En la fermentación ácido mixta se forman fundamentalmente láctico, acético y succínico, además de etanol, H2 y CO2. En la vía del butanodiol se forman cantidades menores de ácido (acetato y succinato) y los principales productos son el butanodiol, etanol, H2 y CO2.  El rojo de metilo es un indicador de pH con un intervalo entre 6,0 (amarillo) y 4,4 (rojo), que se utiliza para visualizar la producción de ácidos por la vía de fermentación ácido mixta.

Procedimiento:Inocular el caldo Rojo Metilo con un cultivo puro de no más de 24 horas del microorganismo en estudio. Incubar a 35°C durante 48 horas. Luego de finalizado el tiempo de incubación agregar unas gotas del reactivo de rojo de metilo. La prueba es positiva si se desarrolla de un color rojo estable. Esto indica que la producción de ácido es suficiente para producir el viraje del indicador y el microorganismo fermentó la glucosa por la vía de ácido mixta. Un color anaranjado, intermedio entre el rojo y el amarillo no es considerado como positivo.

Resultados:(+) Escherichia coli ( - ) Enterobacter aerogenes

•Vogues Proskauer

En la prueba de Voges-Proskauer se determina la vía de fermentación del butanodiol descripta en la prueba de rojo de metilo. El acetil-metil-carbinol (o acetoína) es un producto intermediario en la producción de butanodiol. En medio alcalino y en presencia de oxígeno la acetoína es oxidada a diacetilo. Este se revela en presencia de alfa-naftol dando un color rojo-fucsia.

Procedimiento:Inocular el caldo RMVP con un cultivo puro de no más de 24 horas del microorganismo en estudio. Incubar a 35°C durante 24 horas. Luego de finalizado el tiempo de incubación transferir 1 ml del caldo RM/VP a un tubo limpio y agregar 0,6 ml de alfa-naftol al 5% y 0,2 ml de KOH al 40%. Agitar el tubo cuidadosamente para exponer el medio al oxígeno atmosférico y dejarlo reposar durante 10 a 15 minutos. El desarrollo de un color rojo-fucsia  luego de 15 minutos indica la presencia de diacetilo, producto de oxidación de la acetoína y por lo tanto una prueba VP positiva.

Resultados:(+) Enterobacter aerogenes(-)Escherichia coli 

Fuentes de consultas:• Microbiología médica Murray• Microbiología Brock• http://milksci.unizar.es/bioqui• mica/temas/azucares/agar.html

• http://www.unavarra.es/genmic/microgral/Tema%2002.-%20Cultivo%20de%20microorganismos.pdf• Microbiología General• Tema 2.- Cultivo de microorganismos.

• http://www.biomerieux.es/servlet/srt/bio/spain/dynPage?open=SPN_CLN_PRD&doc=SPN_CLN_PRD_G_PRD_CLN_93&pubparams.sform=5&lang=es

• https://www.google.com.mx/search?q=AGAR+SABOURAUD+DEXTROSA&espv=210&es_sm=122&source=lnms&tbm=isch&sa=X&ei=sOn8UqHxCMmCygHznoDQBg&ved=0CAkQ_AUoAQ&biw=1366&bih=667#facrc=_&imgdii=_&imgrc=FQ4uU1H4VJM_NM%253A%3B77XyCnZydQYfyM%3Bhttp%253A%252F%252Fupload.wikimedia.org%252Fwikipedia%252Fcommons%252F6%252F62%252FSporothrix_schenckii_PHIL_3943_lores.jpg%3Bhttp%253A%252F%252Fes.wikipedia.org%252Fwiki%252FAgar_Sabouraud%3B700%3B484

• http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facultad_farmacia/catedraMicro/macconkey.pdf

• http://html.rincondelvago.com/pruebas-bioquimicas.html