Regulación Postranscripcionalen Procariotas

Biología Molecular2009

Mecanismos de regulación de la expresión en procariotas

•• InicioInicio•• ElongaciElongacióónn•• TerminaciTerminacióónn•• EstabilidadEstabilidad•• FuncionalidadFuncionalidad

•• ProteProteíínasnas•• RibozimasRibozimas//RiboswitchesRiboswitches//sRNAssRNAs

ActoresActores

Hambraeus et al. (2003) MGG 269:706-714

Estabilidad de los ARNm

La vida media de los ARNm en Bacillus subtilis es muy variable

Mecanismo típico de degradación de ARNm en E. coli Influencia de la concentración de RNase E sobre la tasa de degradaciónde ciertos ARNm

vida media (min)en RNase E efecto

ARNm 1X 0.15X estabil.

ompA 8.3 ± 0.5 10.3 ± 2.3 1.2

rpsO 2.3 ± 0.2 5.6 ± 0.5 2.4

tetR 1.9 ± 0.4 6.2 ± 1.3 3.3

RNAI 4.0 ± 0.8 7.4 ± 1.1 1.9

Señales estabilizadoras

- Horquilla en el extremo 3’ evita acceso de exoribonucleasas

- Horquilla en el extremo 5’ evita acceso de RNase E

- Traducción eficiente

Señales desestabilizadoras

- Sitios de corte de endoribonucleasas

- Colas poliA

- Extremo 5’ expuesto (no apareado)

- Traducción ineficiente

Jiang et al. (2000) J. Bact. 182:2468- 2475

P P P

P

1

Tasa relativade corte

10

P

P P P1

1

Vida media (min)

3

13

3

Bouvet & Belasco (1992) Nature 360:488- 491

1

Tasa relativa de corte

25

Jiang & Belasco (2004) PNAS USA 101:9211- 9216

Caracterización de RNasa E

Sharp and Bechhofer (2003) J. Bact. 185:5372-9

Las enzimas

- RNase Eendo

- RNase III

- PNPaseexo

- RNase II

- PolyA Polimerasa

- RhlB helicasa

- PPK

Modificado de Symmons et al. (2002) TIBS 27:11-8

5’

Callaghan et al. (2005) Nature 437:1187-1191

Court (1993) Control of mRNA stability. Chapt 5

Sitio consenso de corte de RNase III

W - WN - NU - AC - GW - WC - GN - NN - NG - CW - WA - UN - NN - NN - NN - NU - AW - WC - GN - NN - NG - CW - WG - CA - UN - NW - WW = A o U

distal box

proximal box

- Ortólogo de RNase III en eucariotas es Dicer(procesa microRNA y degrada dsRNA duranteRNAi)

- proximal y distal boxes son sitios de contactocon RNase III

- los loops (entre los boxes proximales) internosrepresentan epítopes adicionales

Polinucléotido Fosforilasa – PNPase- Fosforólisis reversible con liberación de NDP--------pNpNpN + PO4 -------pNpN + ppN

RNase II- Mecanismo es de hidrólisis liberando NMP

PoliA Polimerasa (PAP I- pcnB)-PAP facilita la degradación por 3’ ya que crea colas simple cade

donde PNPase puede unirse, colas suelen ser homogéneas (poentre 14-60 nt

Polifosfato quinasa PPK-cataliza la polimerización reversible del γP del ATP en poli(P)

NDP + poli(P) NTP

RppH

Modificado de Mata et al TIBS 2005

Degradacion del mensaje en eucariotas

• Ribozimas/Riboswitches/sRNAs

Sid AltmanMolecular Biology

Discovered catalytic RNA, for which he won the Nobel Prize in 1989

tRNA Synthesis & Processing

1. tRNA is transcribed by RNA polymerase III. The transcription product, the pre-tRNA, contains additional RNA sequences at both the 5’ and 3’-ends. These additional sequences are removed from the transcript during processing. The additional nucleotides at the 5’-end are removed by an unusual RNA containing enzyme called ribonuclease P (RNase P).

2. Some tRNA precursors contain an intronlocated in the anticodon arm. These intronsare spliced out during processing of the tRNA.

3. All mature tRNAs contain the trinucleotide CCA at their 3’-end. These three bases are not coded for by the tRNAgene. Instead, these nucleotides are added during processing of the pre-tRNAtranscript. The enzyme responsible for the addition of the CCA-end is tRNA nucleotidyltransferase and the reaction proceeds according to the following scheme:

tRNA +CTP --> tRNA-C + PPi(pyrophosphate)tRNA-C +CTP --> tRNA-C-C + PPitRNA-C-C +ATP --> tRNA-C-C-A + PPi

4. Mature tRNAs can contain up to 10% bases other than the usual adenine (A), guanine (G), cytidine (C) and uracil (U). These base modifications are introduced into the tRNA at the final processing step. The biological function of most of the modified bases is uncertain and the translation process seems normal in mutants lacking the enzymes responsible for modifying the bases.

Figure 1. RNA- based feedback inhibition.The glmS ribozyme can cleave off a portion of the 5' UTR of the glmS gene, leading to reduced expression (gray X) of the GlmS protein. GlmS ribozyme activity is enhanced in the presence of GlcN6P, the metabolic product of this gene.

Nature Structural & Molecular Biology 11, 301 - 303 (2004) doi:10.1038/nsmb0404- 301 Ribozyme déjà vuScott M Knudsen & Andrew D Ellington

Riboswitches: elemento RFN- En B. subtiliselemento RFN actúa porterminación de la transcripción prematuradel operón ribDEAHT

- FMN molécula efector

Winkler et al. (2002) PNAS USA 99:15908-15913

Riboswitches

Sistemas regulatorios que usan interacción directade pequeñas moléculas con el ARN

genes efector respuesta regulatoria

aaRS tRNA descargado induccióncobalamina AdoCbl represiónTiamina TPP represiónriboflavina FMN represiónmetionina SAM represiónpurinas Guanina represiónLisina Lisina represiónGlicina Glicina represiónsint GlcN6P GlcN6P represión

Nudler & Mironov TIBS 2004

sRNA (small RNA)- funcionan en forma homóloga a microRNA o siRNA en eucariotas

- En bacterias, un solo sRNA puede controlar la expresión de múltiples genes, relacionados con condiciones de estrés o virulencia

- difíciles de encontrar durante el secuenciado de genomas, debido a su pequeño tamaño escapan a screenings mutacionales

- Alrededor de 60 sRNA confirmados en E. coli, 1-2% de los genes que codifican para proteínas.

- Las búsquedas se simplifican ya que generalmente los sRNA estánen regiones intergénicas, son monocistrónicos y están muyconservados. Confirmación: Northern blot

- sRNA se unen a Hfq (chaperona de ARN, Sm-like protein), estapropiedad es usada para aislar nuevos candidatos de sRNA

-la transcripción de los sRNA suele ser regulada, por ej: OxyS esregulado por OxyR, y RyhB es regulado por Fur.

Geissmann & Touati (2004) EMBOJ 23:396-405

- la interacción sRNA-mRNA termina en la rápida degradación de ambos por RNase E, sRNA no actúa en forma catalítica

Gottesman (2005) TIG 21:399-404

Gottesman (2005) TIG 21:399-404

• Estabilidad del mensaje• Ribozimas/Riboswitches/sRNAs

Texto:Molecular Biology of the Gene, Watson et al., 6 Ed. 2008

Artículos Complementarios:Kushner, S.R. (2004) mRNA decay in prokaryotes and

eukaryotes: different approaches to a similar problem.Carpousis, A. (2007) The RNA Degradosome of Escherichia

coli: An mRNA-Degrading Machine Assembled on RNase E. Annu. Rev. Microbiol. 61,71–87

Serganov, A., Patel, D.J. (2007) Ribozymes, riboswitchesand beyond: regulation of gene expression withoutproteins. Nature Rev. Gen. 776, 790