MECANISMO , AGRESIN Y DEFENSA I LABORATORIO 2

UNIVERSIDAD NACIONAL DE PIURAFacultad de Medicina Humana

DEPARTAMENTO DE CLNICA Y PATOLOGA

INFORME N2

CURSO : MECANISMOS, AGRESIN Y DEFENSA I

TEMA : COLORACIONES

PROFESOR : Dr. CSAR TORREZ DIAZ

ALUMNO : RIVERA JIMNEZ JAVIER ANTONIO

CICLO : IV

PIURA- 2008

INTRODUCCIN

En este informe vamos ha desarrollan los distintos procedimientos de cmo se elabora la coloracin Gram (principalmente) y la coloracin de wirtz, en el caso de la coloracin Gram nosotros mismos preparamos las muestras extradas previamente de uno de nuestros compaeros y las vimos al microscopio.

La coloracin Gram permite la clasificacin de las bacterias en Gram positivas y Gram negativas segn la composicin de su pared celular. Por esto el complejo de color formado con la pared de las bacterias gram positivas no puede ser removido con el agente decolorante que es el alcohol acetona. La clula permanece de color azul violeta, en cambio las bacterias Gram negativas, al decolorarse con el alcohol acetona, se dejan colorear con la fuscina safranina, quedando de color rosado.

OBJETIVOS

Aprender a tomar muestra.Aprender a usar los distintos colorantes y compuestos qumicos para la preparacin la coloracin Gram y la de wirtz.Aprender a distinguir las bacterias Gram positivas y las Gram negativas al microscopio.Aprender a distinguir las esporas de las bacterias al microscopio.Observar las endosporas y su disposicin en las formas vegetativas Dar a conocer y ensear el manejo de los elementos que se utilizan para la el estudio de la morfologa bacteriana con la ayuda del microscopio

MARCO TERICO

COLORACIN

Cromgena al colorante y grupos auxcromos que permiten que el colorante se una a las fibras o tejidos. Si la porcin coloreada (cromgeno) acta como base, se les denomina colorantes bsicos (catinicos) y s el cromgeno acta como cido se llaman colorantes cidos (aninicos).

Los ncleos de las clulas se tien mejor con colorantes bsicos y el citoplasma con colorantes cidos. Como la clula bacteriana tiene su material nuclear distribuido por toda la clula se colorea bien con los colorantes bsicos.

Las bacterias son clulas transparentes y por su tamao (0.1 a 5 m) se pueden observar en el microscopio en aumento de 40 X o ms. Por su constitucin tienen una carga negativa y al observarlas en las preparaciones en fresco se ven en continuo movimiento ya que se rechazan unas a otras (movimiento browniano)

Algunas bacterias disponen adems de flagelos polares o peritricos, lo que les permite un desplazamiento que se puede apreciar en el campo microscpico cuando se observan en fresco.

COLORACIN WIRTZ

Algunos gneros bacterianos, entre los que destacan Clostridium y Bacillus, producen en su interior formas de resistencia denominadas endosporas. Se producen cuando las condiciones ambientales son desfavorables (agotamiento de los nutrientes, temperaturas extremas, radiaciones, compuestos txicos, etc.) formndose una espora por cada forma vegetativa. Al finalizar el proceso de esporognesis, la clula vegetativa se lisa y libera la espora al exterior. Cuando el ambiente es favorable, la espora germina generando una nueva forma vegetativa. La capacidad de germinar perdura durante aos. Algunas de las bacterias productoras de endosporas son patgenas para el hombre, por lo que su estudio y observacin son de enorme inters.

Las endosporas poseen unas cubiertas exclusivas que las hacen resistentes a los factores ambientales adversos. Adems, estas cubiertas hacen que las esporas aparezcan en el microscopio ptico como estructuras refringentes y de difcil tincin.

La tincin especfica de esporas requiere dos colorantes: 1.- Verde malaquita: capaz de teir las esporas en caliente. 2.- Safranina: colorante de contraste que tie las formas vegetativas.

Las endosporas, tras la primera tincin, no perdern el colorante en el lavado con agua, y s lo harn las formas vegetativas, que quedarn teidas con el segundo colorante.

REALIZACIN

Se emplearn cultivos en fase estacionaria para dar lugar a que las bacterias produzcan las esporas. Esta tincin es delicada en su realizacin y para poder obtener unos resultados satisfactorios hay que seguir cuidadosamente las instrucciones.

1. 1. Preparar los frotis bacterianos indicados.

2. 2. Teir con verde malaquita. Con unas pinzas de madera colocar la muestra encima de la llama del mechero de forma que el colorante humee durante 5 min.

Nota: evitar que la muestra hierba. Aadir ms colorante si ste se evapora; es importante que la muestra no se seque.

3. 3. Lavar con abundante agua el exceso de colorante.

4. 4. Teir con safranina 1 min.

5. 5. Lavar con abundante agua el exceso de colorante.

6. 6. Secar la preparacin.

7. 7. Observar la preparacin al microscopio. Anotar la disposicin y la morfologa de las tres especies del gnero Bacillus.

COLORACION GRAM

Es un mtodo emprico desarrollado en 1884 por el fsico dans Hans Christian Gram para diferenciar las especies de bacterias pneumococos y klebsiella pneumoniae. Pero a la vez clasifica estos microbios en dos grandes grupos basado en las propiedades fsicas y qumicas de la pared celular.

La coloracin de Gram, descubierta hace ms de 100 aos, se usa principalmente para el examen microscpica directo de muestras y subcultivos. Es una tincin diferencial que se emplea para demostrar las propiedades de membrana de todo tipo de bacteria. La tincin de Gram es una tcnica muy til para la diferenciacin de las bacterias Gram positivas y las Gram negativas, como primer paso para determinar la identidad de una muestra bacteriana particular. Adems permite al clnico clasificar las bacterias segn su morfologa.

No es una herramienta infalible para el diagnstico, identificacin o filognesis, siendo sustituido por tcnicas moleculares, debido a la variabilidad de algunas bacterias (pueden teirse de violeta o rojo; o no ser susceptibles a la tincin de Gram). Puede ser realizada en fluidos corporales o biopsias cuando se sospecha de infeccin e incluso a medios de cultivos bacterianos.

Las bacterias Gram + retienen el cristal violeta despus de la decoloracin y aparecen de color azul intenso. Las bacterias Gram- no son capaces de retener el cristal violeta despus de la decoloracin, y son teidas de rojo con el colorante de cntraste safranina. Las caractersticas de la coloracin de Gram pueden ser atpicas en cultivos muy jvenes, viejos, muertos o degenerados.

El cristal violeta (violeta de genciana) sirve como colorante primario, y se une a la pared celular bacteriana luego de un tratamiento con una solucin dbil de yodo, que sirve como mordiente para la unin del colorante. En medio acuoso el cristal violeta (CV) se disocia en CV+ e iones de Cl-. Estos iones penetran a travs de la pared celular y la membrana citoplasmtica a las bacterias tanto Gram + como -. El in CV+ interacta negativamente con las cargas de los componentes de la clula bacteriana tindolas de color violeta. Luego el in yodo (I- o I3-) aadido en el segundo paso se une al in CV+ formando un complejo grande y queda atrapado por las capas celulares

Algunas especies de bacterias, debido a la naturaleza qumica de sus paredes celulares, tienen la capacidad de retener el cristal violeta incluso luego del tratamiento con un decolorante orgnico, como por ejemplo una mezcla en partes iguales de alcohol etlico al 95% y acetona. Las bacterias que retienen el colorante se ven negroazuladas cuando se observan al microscopio, y se denominan entonces gram positivas (+). Algunas bacterias pierden la coloracin primaria con cristal violeta cuando son tratadas con el decolorante, presumiblemente debido al alto contenido de lpidos de su pared celular Cuando la solucin alcohol-acetona se aplica este diluye parcialmente la capa de lpidos de las Gram negativas, permitiendo que el complejo sea removido. Este paso de descolocacin es critico y su tiempo debe ser medido correctamente; es solo cuestin de segundos para que tanto las Gram + y se descoloren. Estas bacterias decoloradas toman el colorante de contraste, la safranina, y se ven rojas cuando se observan al microscopio, denominadas gram negativas (-). La coloracin de Gram tambin pueden ser utilizadas para identificar formas no bacterianas, como las tricomonas, las larvas estrongiloides, los quistes de Pneumocysti carinii y los trofozotos de Toxoplasma gondii, si bien no es tan sensitiva como otras tinciones especficas utilizadas para la vizualizacin de estos parsatos.

MORFOLOGA BACTERIANA

Segn su forma se clasifican en: *Cocos: esfricos *Bacilos: bastones (algunos bacilos pequeos se denom cocobacilos) *Espirales: coma, forma S o espiral *Pleomrficas: adoptando diferentes formas (aspecto gelatinoso)

Existen 6 grupos de bacterias Gram positivas Que causan enfermedades en el humano, 2 de ellas son cocos y las 4 restantes son bacilos.

En el grupo de los cocos estn:

Estreptococos cocos agrupados en forma de cadenas. Estafilococos cocos agrupados en forma de racimos.

En el grupo de los bacilos 2 producen esporas:

Bacillus Clostridium Y 2 no producen esporas:

Corynebacterium Listeria (nica Gram + formadora de endotxinas)

En las bacterias Gram negativas existen:

Un grupo de cocos: Neisseria (eventualmente se agrupan en 2 diplococos)

Un grupo de espirales: Espiroquetas (Treponemas, Borrelias y Leptospiras)

El gran grupo de los bacilos en su mayora son entricos:

Eschericha coli * Proteus * Campylobacter Shigella * Enterobacter * Helicobacter Salmonella * Serratia * Pseudomonas Yersinia * Vibrio * Bacteroides Haemophilus * Bordetella * Brucella Legionella * Pasteurella * Gardnerella Francisella

EXCEPCIONES DE BACTERIAS A LA TINCIN DE GRAM

Micobacteria: bacteria dbilmente Gram positiva. La mejor tincin para este grupo especial es la tincin cido-alcohol resistente. Espiroquetas: son Gram negativas por poseer pared celular fina, pero son tan pequeas que no se pueden ver a la luz del microscopio, por lo que se visualizan mejor en microscopa de campo oscuro. Micoplasma: grupo de bacterias con ausencia de pared celular, solo poseen su membrana citoplasmtica. No pueden ser Gram + o -. *Clamidias y Ricketsias: bacterias pleomrficas intracelulares LA PARED CELULAR DE LAS BACTERIAS GRAM POSITIVAS La red de murena esta muy desarrollada y llega a tener hasta 40 capas Los aminocidos implicados varan de una especie a otra. La constitucin del esqueleto es caracterstica de la especie y constituye una buen parmetro taxonmico Es frecuente la presencia de los aminocidos L-diaminopimlico o de lisina Los poliscaridos estn unidos por enlaces covalentes (en el caso de tenerlos) Su contenido proteico es bajo. En ella se encuentran cidos teicoicos LA PARED CELULAR DE LAS BACTERIAS GRAM NEGATIVAS La red de murena presenta una sola capa La constitucin del saco de murena es igual en todas las bacterias Gram negativas. Contiene siempre nicamente meso-diaminopimlico Nunca contiene lisina No se encuentran puentes interpeptdicos. Se encuentran grandes cantidades de lipoprotenas y lipopolisacridos que representan hasta el 80 % del peso seco de la pared celular. Para mantener la estabilidad de las capas de lipopolisacridos es necesario el in Ca++. En las bacterias Gram negativas la capa de murena puede ser atacada por la lisozima cuando se las trata con EDTA (Etilen-diamino-tetractico). Este agente, al quelar el Ca++ libera una parte de los lipopolisacridos y permite la accin de la enzima.. Hasta ahora no han podido demostrarse cidos teicoicos.

Nota: Para que esta reaccin ocurra es necesario que las bacterias que se van a colorear tengan su pared ntegra, para esto se deben utilizar cultivos jvenes.

DESARROLLO

EXPERIMENTO EN EL LABORATORIO

COLORARION DE WIRTZ

En esta muestra ya estaba preparada, solo lo vimos en el microscopio. Pero los pasos que se siguieron fueron los siguientes:

se coloca la muestra en el porta objeto se fija al aire o con un mechero. se le agrega verde malaquita luego se le hecha alcohol- acido clorhdrico luego el colorante de contrate la safranina.

Parece ser el Bacillus. sp

COLORACIN DE GRAM Bueno para realizar este experimento requerimos de un voluntario de uno de nuestros compaeros para realizar el experimento, puesto que necesitbamos un individuo par extraer la muestra, escogimos a dos compaeros.

MATERIALES:

El frotis preparado en la primera parte del laboratorio Mechero Colorantes y reactivos de Gram: Cristal Violeta Solucin de Lugol Alcohol-acetona Safranina Agua corriente

PROCEDIMIENTO DE LA COLORACIN

El hisopo que estaba cubierto con un papel, puesto que estaba esterilizado, lo mojamos en un a solucin salina previamente, para luego introducirlo en nuestro compaero, ms o menos en la porcin de la orofaringe y raspamos.

Pipeta envuelta completamente

La muestra lo pusimos en un porta objetos limpio y sin grasa, debidamente marcado

Dejar secar el frotis al medio ambiente.

Fijamos pasndolo por la llama con la muestra hacia arriba, de izquierda a derecha.

Dejamos enfriar el frontis antes de colorear

Vertimos el cristal violeta sobre el portaobjetos y dejamos actuar por 1 minuto.

Enjuagamos en agua corriente y dejamos escurrir

Agregamos la solucin de Lugol y dejamos actuar por 1 minuto

Escurrimos la solucin y enjuagar el portaobjetos con agua corriente

Decoloramos con el alcohol-acetona por 5 segundos y enjuagamos con agua corriente.

Agregamos la solucin de Safranina y dejamos actuar por 30 segundos, enjuagamos , escurrimos y dejamos secar al aire.

observamos al microscopio. RESULTADOS

En la muestra de nuestros compaeros se pudieron observar bacterias en forma de cocos de color violeta, pero en otra muestra aparte de eso se vieron bacterias de la boca que tenan forma alargada de color rojizo abundante en toda la muestra.

DISCUSIN

El color de las bacterias vistas al microscopio depende de la pared celular, mas especficamente de los peptidoglucanos que se encuentran en la membrana celular. en las gran positivas los pptidogucanos se encuentran en un porcentaje de aproximadamente 70 a 80 % es por eso que retiene mas el colorante cristal violeta y se resiste a la decoloracin al agregarle alcohol acetona. Por el contrario las bacterias Gam negativas tiene 25-20 % de peptidoglucanos en su pared celular y es casi incapaz de retener el colorante cristal violeta cuando se le agrega el alcohol acetona (decolorante), y se vuelve transparente, es por eso que se le debe agregar un colorante de contrate con es la safranina que lo pinta de olor rojo.

GRAM (+) GRAM (-)

CONCLUSIN

La toma de muestra tiene que ser representativa y exacta, para que veamos lo que realmente esperamos ver y no otra cosa. Cada coloracin es especfica par observar una determinada muestra, por ejemplo si quieres observar esporas se debe utilizar la coloracin de wirtz o si quieres clasificarlas se utiliza la coloracin Gram. Cada tipo de coloracin tiene un procedimiento especfico, y si no se cumple puede provocar fallas en los resultados. Los tiempos par cada compuesto qumico que se hecha deben ser casi exacto porque si duran mas de lo necesario pueden malograr la muestra. En la coloracin Gram la tincin de las bacterias se debe principalmente por su pared celular, es decir especficamente por la cantidad de pptidoglucanos que tiene.

BIBLIOGRAFIA

http://www.pucmmsti.edu.do/cienciasfisiologicas/Tinci%C3%B3n%20Gram%20-%20Pensum%20IV.pdf (2008). Gua de estudio para el Laboratorio Microbiologa, Santiago, Repblica Dominicana

http://www.bio-nica.info/Biblioteca/TincionBacterias.pdf

http://fai.unne.edu.ar/biologia/bacterias/micro4.htmUNIVERSIDAD NACIONAL DE PIURA FACULTAD DE MEDICINA HUMANA