manual de procedimientos separ, 11

MANUAL SEPARDE PROCEDIMIENTOS

(SEPAR)

SOCIEDAD ESPAÑOLADE NEUMOLOGIAY CIRUGIA TORACICA

Coordinadores Módulo 11:

Pere CasanFelip Burgos

PRUEBAS PARA EL ESTUDIO DE LA INFLAMACIÓN DE LAS

VÍAS AÉREAS

11

Actividad acreditada, en base a la encomienda de gestión concedida por los Ministerios de Educación Cultura y Deporte, y de Sanidad y Consumo

al Consejo General de Colegios Oficiales de Médicos, con 2,9 créditos, equivalentes a 17 horas lectivas


SOCIEDAD ESPAÑOLADE NEUMOLOGIAY CIRUGIA TORACICA(SEPAR)

PRUEBAS PARA EL ESTUDIO DE LA INFLAMACIÓN DE LAS

VÍAS AÉREAS

11

Coordinadores:Pere Casan y Felip Burgos

Edición realizada para:Novartis Farmacéutica S.A.Gran Via de les Corts Catalanes, 76408013 Barcelona

Participantes:Jose BeldaNúria CalafTeresa FeixasAna M.a FortunaJordi GinerFederico P. Gómez YerónMercedes GonzálezYolanda Torralba GarcíaMontserrat Torrejón

2007 P. PermanyerMallorca, 310 - 08037 BarcelonaTel.: 93 207 59 20 Fax: 93 457 66 42E-mail: [email protected]

ISBN Obra completa: 84-7989-152-1ISBN Módulo 11: 978-84-96762-12-1Dep. Legal: B-21.029-2007Ref.: 543AB055

Impreso en papel totalmente libre de cloro Impresión: Comgrafic

Este papel cumple los requisitos de ANSI/NISO Z39.48-1992 (R 1997) (Papel Permanente)

© Copyright 2004. SEPAREditado y coordinado por Publicaciones Permanyer para Novartis Farmacéutica S.A.Reservados todos los derechos. Ninguna parte de esta publicación puede ser reproducida ni transmitida en ninguna forma o medio alguno, electrónico o mecánico, incluyendo las fotocopias, grabaciones o cualquier sistema de recuperación de almacenaje de información, sin el permiso escrito del titular del copyright.

Manual SEPAR de Procedimientos

Pruebas para el estudio de la inflamación de las vías aéreas11.

Índice

1. Introducción 5

P. Casan, F. Burgos

2. Procedimiento para la inducción del esputo para el estudio de la inflamación de las vías aéreas 6

J. Belda, J. Giner, M. Torrejón, P. Casan

2.1. Introducción 6

2.2. Fundamentos 7

2.3. Espacio físico 8

2.4. Equipos y material 9

2.5. Personal 10

2.6. Procedimiento 11

2.7. Seguridad 13

2.8. Recomendaciones 14

2.9. Limpieza del equipo 15

2.10. Procedimiento de recuento celular para las preparaciones de esputo y otras muestras biológicas respiratorias 20

2.11. Interpretación de los resultados del recuento celular 21

3. Medición de óxido nítrico en aire espirado 27

A.M.a Fortuna, N. Calaf, T. Feixas, M. González, P. Casan


3.2. Fundamentos 29

3.3. Indicaciones, limitaciones, complicaciones y contraindicaciones 30

3.4. Ámbitos de realización 32

3.5. Personal: cualificación y preparación 33

3.6. Equipos 34


3.8. Resultados 40

4. Condensado exhalado 47

Y. Torralba García, F.P. Gómez Yerón


4.2. Fundamentos 48


4.4. Personal: cualificación y preparación 57

4.5. Indicaciones y complicaciones 58

4.6. Estandarización 59

4.7. Mantenimiento y limpieza de equipos 65

4.8. Símbolos y unidades de medida 66

CUESTIONARIO Preguntas de formación continuada C1

Test de provocación con metacolina

�

Introducción

Pere CasanHospital de la Santa Creu i Sant Pau. Barcelona

Felip Burgos Hospital Clínic i Provincial de Barcelona

Los procesos inflamatorios de las vías aéreas, especialmente el asma y la EPOC, se diagnostican a partir de los datos que proporcionan los procedimientos fisiológicos clásicos (espirometría, prueba broncodilatadora, pruebas de provocación bronquial, transferencia al CO, gases en sangre arterial, etc.). Y diríamos más, no sólo se diag-nostican, sino que con estos mismos procedimientos se efectúa el seguimiento, se establece un pronóstico, se evalúa la respuesta terapéutica, y se toman decisiones relevantes (ingreso, alta clínica, oxigenoterapia, etc.).

Sin embargo, se conoce desde hace ya unos años el papel especialmente rele-vante de la inflamación como base patogénica de estas enfermedades, consideradas clásicamente como «obstructivas». El papel protagonista de las propias células que tapizan el epitelio bronquial, las células de defensa localizadas en su entorno cerca-no, las células llegadas desde la sangre, junto al enorme caudal de mediadores in-flamatorios, señales químicas y mensajes cifrados entre unas y otras células y entre ellas y los diferentes fármacos, han transformado el entramado fisiológico clásico en uno más amplio y general. Todo este complejo mundo de la inflamación bronquial merece ser evaluado de una forma directa, sin necesidad de cuantificar la magnitud de los cambios que por su medio se han producido en las vías aéreas.

De esta forma toma cuerpo la creciente aparición de procedimientos que pretenden medir el tipo y la magnitud de la inflamación bronquial en diferentes procesos. De entre todos ellos, unos ya con amplia experiencia clínica y otros aún en fase de evaluación ex-perimental, debemos destacar los que se analizan en esta monografía. El esputo inducido y la cuantificación del tipo y el número de células existentes en este material, la determi-nación de la concentración de óxido nítrico en el aire espirado y, finalmente, la cuantificación de diferentes sustancias obtenidas de la condensación del aire exhalado son tres magní-ficos ejemplos que merecen ya ser estandarizados en la práctica neumológica.

Esperamos y deseamos que este manual permita el uso más amplio de los proce-dimientos mencionados. La perfecta conjunción entre los autores, la labor editorial de Publicaciones Permanyer y la colaboración de los Laboratorios Novartis han hecho que nuestra coordinación haya resultado satisfactoria. A todos ellos, muchas gracias.

1

6


Procedimiento para la inducción del esputo para

el estudio de la inflamación de las vías aéreas

Jose Belda*Jordi Giner

Montserrat TorrejónPere Casan

Hospital de la Santa Creu i Sant Pau. Facultat de Medicina. UAB. Barcelona*Actualmente en Hospital Provincial, Valencia

Hasta hace relativamente poco tiempo, el único método para investigar la inflama-ción de las vías aéreas eran la historia clínica y la fibrobroncoscopia, con sus distintas técnicas como el lavado bronquial o el broncoalveolar, las biopsias y los cepillados bron-quiales o la aspiración de secreciones. Desde hace unos años, diferentes autores1-4 han demostrado que los hallazgos inflamatorios en el esputo inducido pueden apor-tar información relevante para la enfermedad respiratoria y se correlacionan acepta-blemente con muestras clásicas como los lavados bronquiales�,6, por lo que el examen del esputo inducido puede ser de gran utilidad al ser un método directo, no invasivo, válido y reproducible que nos sirve, entre otras cosas, para medir la inflamación de las vías aéreas e investigar células y otros marcadores en el examen del esputo, ya sea espontáneo o inducido7.

El éxito de la inducción del esputo depende de varios factores8, unos relacionados con las características del paciente (fumador, sano/enfermo, el grado de inflamación de la vía aérea); de aspectos del procedimiento como el débito del nebulizador9, el tamaño de las partículas producidas, la concentración de solución salina, la duración de la inhalación y las indicaciones del técnico; del procesado de la muestra10: la selec-ción del esputo de la saliva11 y la efectividad del procesado posterior12. El procedimien-to descrito a continuación13,14 tiene éxito, aproximadamente, en el 80% de los asmáticos estables o pacientes sanos, que no son capaces de producir espontáneamente espu-to, y puede llegar a ser del 100% cuando se aplica en asmáticos no controlados, en pacientes sanos con infección respiratoria y en fumadores o ex fumadores1�.

2

Introducción2.1.

Procedimiento para la inducción del esputo

7

El esputo procedente de las vías aéreas está compuesto de células y diferen-tes sustancias, intra o extracelulares. El procesado del esputo permite separar el sedimento celular del líquido sobrenadante. En el líquido sobrenadante se pueden determinar sustancias producidas por las mismas células (ECP, MBP, interleucinas y quimiocinas, etc.) así como sus marcadores de activación. En sedimento se puede determinar el recuento total de células no escamosas, la viabilidad celular y el recuento diferencial celular como eosinófilos, neutrófilos, linfocitos, macrófagos.

El recuento celular del esputo en personas sanas nos muestra un predominio de macrófagos y de neutrófilos, con muy pocos eosinófilos y linfocitos16. ¿Qué nos pue-de aportar el examen de esputo inducido en el manejo del paciente asmático?:

• Poder diferenciar el tipo de inflamación y sus diferentes causas. Identificar si hay o no eosinófilos en el esputo, orientar hacia el tipo de tratamiento, ya que la eosinofilia responde muy bien al tratamiento corticoideo y a la evitación alergé-nica. Además, varios estudios han demostrado que la eosinofilia en esputo pre-cede, incluso semanas, a los síntomas y a los cambios funcionales (espirome-tría)17-19. Pero en el esputo, además de eosinófilos, pueden aparecer incrementos de otras células como los neutrófilos y los linfocitos, que nos orientan hacia otro tipo de inflamación neutrofílica (infección, fumadores…) o linfocítica (sarcoidosis, Chlamidia pneumoniae…)20.

• Ajustar dosis de corticoides, puesto que los eosinófilos son muy sensibles a los corticoides, y una dosis adecuada los reducirá a los límites de la normalidad. La eosinofilia persistente en esputo puede ser indicador de que el paciente no cum-ple bien el tratamiento o que la dosis es insuficiente21,22.

• En enfermedad laboral, nos ayudará a llegar al diagnóstico realizando mediciones seriadas durante el trabajo y en los periodos de fiesta o vacaciones23-2�.

• Puede ser útil para desenmascarar, en algunos pacientes que reciben corticoi-des y/o β2 de larga duración, una inflamación subyacente, puesto que los β2 mejoran la función pulmonar y los síntomas, pero no reducen la eosinofilia del esputo26.

• Valorar si mejora o no la inflamación en esputo en pacientes que siguen trata-miento con antileucotrienos27.

• También nos puede ayudar el esputo sobre la existencia de inclusiones especí-ficas en macrófagos (lípidos28, hemosiderina29,30).

Fundamentos2.2.

8


La zona de trabajo debe ser independiente para garantizar la individualidad del paciente, proporcionándole el máximo confort, y estar bien ventilada para evitar con-centraciones excesivas ocasionadas por el nebulizador.

Por otra parte, el personal que realice la prueba debe permanecer aproximada-mente a 1 m de distancia, mientras el paciente realice la nebulización y las posterio-res maniobras de toser.

Espacio físico2.3.


9

• Solución salina isotónica (0,9%) e hipertónica (3, 4, �%).• Jeringas de 10 ml y agujas de transferencia (19 G).• Nebulizador ultrasónico.• Espirómetro.• Inhalador β2-agonista de corta duración y su cámara espaciadora.• Reloj o cronómetro.• Recipientes para recoger el esputo (normalmente frascos de recogida de orina estériles).• Calculadora y hoja de recogida de datos.• Refrigerador o nevera para almacenar las muestras hasta el procesado.• Material de limpieza.• Pinzas nasales.• Agua potable y vaso.• Pañuelos desechables.Para la inducción del esputo los nebulizadores ultrasónicos son los preferidos, ya que pro-

porcionan mayor éxito a pesar, incluso, de utilizar un flujo menor (entre 0,87-2,� ml/min) que los nebulizadores tipo jet. Se han objetivado importantes diferencias entre los nebulizadores ultrasónicos, y por ello es recomendable que cada grupo seleccione un nebulizador de reco-nocidas características y procure utilizar siempre el mismo. El nebulizador ideal debería propor-cionar un flujo estable de alrededor de 1 ml/min de solución nebulizada con un tamaño de partícula medio (AMMD) de entre 2-� μm para que la penetración y depósito bronquial sean idóneos. Los nebulizadores más utilizados en la literatura han sido Fisoneb (ahora llamado nebulizador electrónico Medix, comercializado por Clement Clarke International Ltd) y el DeVil-biss Ultra-Neb 99 y el Ultra-Neb 2000, cuyo flujo es regulable. Otras alternativas en nuestro medio incluyen el nebulizador OMRON, PARI, Trudell, etc. Algunas direcciones de interés son:

• PARI®. Laboriser (Lepanto, 328. Barcelona. Tel.: 933473408).• OMRON®. Peróxidos Farmacéuticos, SA (Gran Via de les Corts Catalanes, �33, pral.

Barcelona. Tel.: 934�17878).• DeVilbiss®. Guido Rayos X, SA (Aragó, 48�. Barcelona. Tel.: 9324��39�).De la misma forma, la solución salina hipertónica es más efectiva que la isotónica, pero

puede causar broncoconstricción. Ésta se evita con la administración previa de un β2-adrenér-gico. En pacientes en los que se utilice una solución salina hipertónica se utilizarán concen-traciones crecientes para evitar o controlar su efecto broncoconstrictor. La inducción con un aerosol de solución salina isotónica (0,9%), dada con precaución y periodos de tiempo más cortos, también puede ser segura en pacientes con una exacerbación intensa de asma o con una limitación importante al flujo aéreo.

Equipos y material2.4.

10


Para la obtención del esputo se recomienda una enfermera; un técnico, biólogo, o similar para su procesado. Éstos deben tener la suficiente preparación para conseguir una muestra de calidad, en las mejores condiciones posibles, poder realizar un co-rrecto procesado y recuento final.

Personal2.5.


11

• Utilizar la solución salina a las distintas concentraciones a temperatura ambiente. Antes de utilizarla comprobar la fecha de caducidad, que normalmente se reduce a 3 meses, para evitar contaminaciones.

• Informar al paciente de la intención de la prueba y de cómo será realizada. Ob-tener un consentimiento informado.

• Usar una hoja de recogida de datos para el esputo inducido.• Realizar una espirometría registrando el FEV1 como parámetro de control.• Administrar al paciente la dosis habitual de agonista β2 de corta duración.• Esperar 10 min y medir de nuevo el FEV1. Usar el mejor FEV1 para calcular

cualquier descenso posterior.• Si el FEV1 posbroncodilatador es 1,� l o menor, no continuar la prueba excep-

to bajo supervisión médica. Nunca comenzar la prueba si el FEV1 es menor de 1 l.

• Explicar al paciente cómo obtener esputo desde sus pulmones por medio de la tos y el carraspeo profundos.

• Teniendo en cuenta el débito de flujo del nebulizador seleccionado, colocar una cantidad de solución salina suficiente para que sobre un poco tras 7 min de in-halación (entre 9-2� cc). Conectar el nebulizador siguiendo las instrucciones del fabricante para obtener el flujo deseado (preferible alrededor de 1 ml/min). Co-nectar el paciente a la boquilla del nebulizador y mantenerlo inhalando el aerosol durante 7 min. No es preciso usar pinzas nasales. La inhalación se parará si aparece tos persistente, tirantez torácica, sibilancias o disnea. Otros efectos secundarios de menor importancia que pueden aparecer son atragantamiento, picor o quemazón faríngeos, etc.

• Pedir al paciente que de nuevo se suene la nariz, se enjuague la boca y que intente expectorar esputo que proceda de sus bronquios en el recipiente, evitan-do la contaminación por secreción posnasal o saliva.

• Realizar una nueva espirometría para obtener el FEV1.• Si el FEV1 no disminuye más del 10% repetir los pasos 10-12 con solución sa-

lina al 4% durante otros 7 min, y, posteriormente, continuar con la solución al �%.

• Si el FEV1 desciende entre 10-20%, no aumentar la concentración de la so-lución salina. Repetir los pasos 10-12 con la misma concentración de solución salina hasta hacer 3 series de 7 min (21 min), o el FEV1 descenderá más del 20%.

Procedimiento2.6.

12


• Si el FEV1 desciende más del 20% o apareciesen síntomas preocupantes, parar la prueba y dar tratamiento con un adrenérgico β2.

• Procesar el esputo tan rápido como sea posible. Si hay algún retraso, mantener-lo en la nevera y procesarlo antes de 2 h.

• Limpiar el nebulizador de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.


13

La inhalación de un aerosol de solución salina hipertónica puede causar bronco-constricción31. Esto es evitado con el pretratamiento con salbutamol. Sin embargo, el grado de protección dependerá de varios factores como las características del sujeto, la cantidad de solución inhalada y la cantidad de β2-agonista usada recientemente. La inducción del esputo con solución salina hipertónica en concentraciones crecien-tes es segura en sujetos con asma leve o moderadamente exacerbada. La inducción con un aerosol de solución salina isotónica (0,9%), dada con precaución y periodos de tiempo más cortos, también puede ser segura en pacientes con una exacerbación grave de asma32 o con una limitación intensa al flujo aéreo33,34.

Seguridad2.7.

14


• Si el paciente desea expectorar en cualquier momento del periodo de inhalación, apagar el nebulizador y el reloj e intentar que frene la maniobra para que se enjuague la boca y recogerlo posteriormente.

• Si el paciente indica que no tiene ninguna secreción y su tos suena muy seca con las inhalaciones iniciales, sugerirle que realice una respiración profunda y que tosa una o dos veces, entonces continuar con la siguiente inhalación para no cansar al paciente y producirle picor de garganta. A veces, si el paciente no tose espontáneamente al acabar la inhalación, es conveniente dejarle descansar durante 1-2 min y entonces que intente toser de nuevo.

• Recordar al paciente que expulse las secreciones de su garganta usando los mús-culos cervicales y faríngeos. Es importante indicarles que no deglutan el esputo.

• Escuchar cómo tose el paciente para asegurarse de que la muestra proviene de los pulmones y no son secreciones posnasales.

• Si el primer intento de inducción no tiene éxito, considerar repetirlo otro día.

Recomendaciones2.8.


1�

Una limpieza y secado cuidadosos son esenciales para un buen mantenimiento higiénico del equipo. Hay que llevarlo a cabo siguiendo las instrucciones del fabrican-te del nebulizador. Procurar limpiar todos los elementos con agua corriente y, sobre todo, evitar restos de sal en el aparato, ya que la producción de cal podría dañarlo seriamente.

Consiste en desconectar la tubuladura que une al paciente con el nebulizador ultra-sónico, así como sacar el reservorio donde se han depositado las sales junto con agua destilada, más las partes de plástico que sujetan el reservorio al nebulizador. Se lavan todas las piezas con una esponja y jabón, aclarándolas con abundante agua.

La limpieza asegura que los microorganismos adheridos al material utilizado sean eliminados junto con la materia orgánica.

1. DESINFECCIóN

El glutaldehído-fenolato ha sido considerado como el desinfectante de alto nivel de referencia a una dilución 1/16, durante 10 min a temperatura ambiente y con una estabilidad de 30 días. También se ha demostrado que es compatible con diferentes tipos de materiales (plásticos, gomas sintéticas de silicona, cristal, aluminio y com-puestos de silicona para sellar), siendo especialmente respetuoso con ellos.

2. Procesado del esputo

2.1. Equipo y material

• Reactivos. − Agua destilada. − Solución salina de Dulbecco tamponada con fosfatos (PBS). − Metanol (Cat. Ref. 1.06012.0�00). Merck Farma y Química, SA (Buenaventura

Muñoz, 10 bis. 08018 Barcelona. Tel.: 9348�06�9). − Reactivo Sputolysin® Reagent (solución stock de DTT concentrado 0,906�%)

(Cat. Ref. �60000). Calbiochem-Novabiochem Corporation, La Jolla, CA, USA. Distribuido por Merck Farma y Química, SA. Bionova Científica, SL (Abtao, �, oficina 3. 28007 Madrid. Tel.: 914334�4�) e Itisa Biomedicina, SA (Edif. Euro-pa, 1-2-1, Ctra. Fuencarral-Alcobendas km 1�.700. Alcobendas. 28108 Madrid. Tel.: 916�72393).

− Tinción de Wright modificada (Wright-Giemsa) o, en su defecto, de May-Grünwald-Giemsa (May-Grünwald modificada). También servirían sus equiva-

Limpieza del equipo2.9.

16


lentes rápidos (tinción rápida de Grifols, Diff-Quick®, etc.). Distribuidos por Merck y Grifols (Grifols, Movaco, SA) (Jesús i Maria, 6. 08022 Barcelona. Tel.: 93�7104�0).

− Azul de tripano 0,4% (trypan blue solution 0.4%. Cat. Ref. T-81�4). Sigma-Al-drich Química, SA (Apdo. 161. Alcobendas. 28100 Madrid. Tel.: 900101376).

• Equipo y otros materiales. − Discos de cultivo de Petri. − Pinzas de punta fina. − Tubos de Eppendorf de 2 ml. − Balanza de precisión. − Mezclador de líquidos para tubos (Vortex® o similar). − Pipetas de Pasteur de 3,� ml desechables. − Banco mecedor de tubos de sobremesa. − Filtro de nylon con poros de 48 μm. − Embudo de polipropileno (plástico) o cristal de unos �,� cm de diámetro. − Tubos cónicos de poliestireno (plástico) de 10 ml. − Cronómetro o reloj de laboratorio. − Hojas absorbentes. − Cámara de recuento de Neubauer (citométro). − Portaobjetos para citología. − Recipientes de citocentrífuga. − Centrifugadora con adaptadores para tubos y posibilidad de cytospins (Hettich),

o citocentrifugadora (p. ej. Shandon III). Distribuido entre otros por: Grifols (véase arriba), Pacisa (Pacisa-Giralt) (Diputació, 119-121, 2.a planta. 0801� Barcelona. Tel.: 934�13000) o Nirco (Nirco, SA, Polígono Industrial Salvatella) (Avda. Salvatella, 4. Barberà del Vallès. 08210 Barcelona. Tel.: 937180808).

− Microscopio óptico (con objetivos de 4×, 10×, 40× y 100× y ocular 10×), pre-feriblemente de los denominados de contraste de fases. Se basa en las mo-dificaciones de la trayectoria de los rayos de luz, los cuales producen contras-tes notables en la preparación que son especialmente útiles para el recuento en fresco con la cámara de Neubauer.

− Archivador.• Equipo opcional. − Microscopio óptico invertido (alternativa al de contraste de fases que también

resalta las células en fresco) con objetivo de 10× o lupa binocular.

2.2. Procedimiento

• Protocolo de procesado para obtener una solución de células sin moco. − Preparar 10 ml de solución de trabajo de DTT añadiendo 9 ml de agua destilada

a 1 ml de la solución de stock de DTT (Sputolysin®). Mezclar durante 1� s. Esta solución de trabajo debe ser preparada cada día y desechado el sobrante.


17

− Depositar la muestra entera de esputo en el disco de Petri, desde el reci-piente de recogida, y anotar la apariencia macroscópica del esputo en la hoja de datos.

− Con unas pinzas finas, seleccionar los tapones de esputo que se observen hasta conseguir un peso entre 100-800 mg. En general, recoger todos los tapones que se pueda, pero siempre procurando que no haya contaminación salivar. La técnica es personal, pero consiste en capturar cada tapón del ex-pectorado, y sobre una zona del disco de Petri donde no haya expectorado (seca) se frota la muestra tantas veces como creamos necesario hasta que la muestra esté «libre» de saliva.

− En ocasiones, no es fácil distinguir los tapones de moco bronquial de los res-tos de alimentos u otros productos. Utilizar el microscopio invertido o la lupa binocular para identificar las piezas celulares.

− Depositar la muestra seleccionada sobre un tubo de 2 ml (o 10 ml, si pesase más de 2�0 mg) con tapón (previamente pesado [A]) y pesar el conjunto, anotando el peso (B) en gramos en la hoja de datos. El peso del esputo (C) será la diferencia entre ambos (A – B = C).

− Añadir un volumen de solución de trabajo de DTT (en ml) igual a 4 veces el peso del esputo (en gramos) (4 × C = D ml de DTT).

− Agitar en el mezclador durante 10-1� s a velocidad media. Si no hay mezcla-dor, agitar manualmente el tubo girándolo e invirtiéndolo.

− Aspirar y tirar suavemente con una pipeta de Pasteur desechable de �-10 veces. Asegurarse visualmente que la muestra está adecuadamente mezclada. Si no lo estuviese, repetir el proceso �-10 veces más.

− Agitar de nuevo en el mezclador durante 10 s a velocidad media. − Tapar el tubo de forma segura y colocarlo en el banco mecedor durante

1� min. − Añadir un volumen de PBS igual al de la solución de trabajo de DTT emplea-

da (D ml de PBS). − Agitar en el mezclador durante 10-1� s a velocidad media. − Filtrar la solución resultante con una pieza de 2 × 2 cm de gasa de nylon de

48 μm (empapar antes levemente el tejido con PBS) que estará depositada sobre el embudo con un nuevo tubo de 2 ml. Otra posibilidad para muestras pequeñas (< 2�0 mg) es disponer el filtro entre una aguja gruesa y una jerin-ga de 10 ml, depositar la solución de esputo en el émbolo abierto de la jeringa y colocar el pistón con cuidado. Presionando suavemente, hacer pasar el es-puto al tubo de 2 ml a través del filtro y la aguja.

• Protocolo para el recuento celular total (TCC) y viabilidad. − Aspirar con una micropipeta una alícuota de 20 μl de la suspensión celular

filtrada en el tubo de la citocentrífuga y combinar con 20 μl de una solución al 0,4% de azul de tripano y agitar suavemente. Dejar reposar 2 min.

18


− Llenar la cámara de recuento de Neubauer con 10 μl de esta nueva solución teñida.

− Contar todas las células (incluidas las escamosas) presentes en cada cuadro de esquina de 1 × 1 mm y en las cuatro esquinas de la cámara (cada uno de ellos tiene 16 cuadraditos de 0,2� × 0,2� mm).

− Clasificar las células como viables (V) o no viables (NV) cuando se realiza el recuento y las células escamosas (CE) independientemente de su viabilidad. La tinción del azul de tripano, también llamada método de exclusión del azul de tripano, colorea aquellas células cuya membrana celular no está intacta, excluyendo (de ahí el nombre) aquellas que están intactas, sanas o viables. Por lo tanto, distingue como células viables aquellas que no tiñen de azul, y como no viables aquellas que sí tiñen de azul.

− Anotar el recuento total (E) en la hoja de datos. El recuento celular total (RCT) será el total (E) menos las células escamosas contaminantes (CE) (E – CE = RCT). El porcentaje de células contaminantes será CE/E × 100 = %CE.

− Calcular el porcentaje de células viables o viabilidad dividiendo el número de células encontradas viables (V) por el recuento celular total (RCT) de células no escamosas encontradas (viables más no viables) (V/RCT × 100 = %V).

• Protocolo de preparación de cytospins y recolección del sobrenadante. − Calcular la concentración de cel/ml de la suspensión celular filtrada y ajustar

con PBS para obtener una concentración teórica de alrededor de 1 × 106 cel/ml. Concentración considerada ideal para el recuento celular con cytospins.

− Preparar las cytospins en la citocentrífuga añadiendo 60 μl de suspensión ce-lular y centrifugando a aproximadamente 300 g (4�0 rpm en una Shandon III) durante 6 min.

− Dejar la cytospin secarse completamente a temperatura ambiente y teñirla con la tinción que usemos (Wright modificada o May-Grünwald-Giemsa).

− Centrifugar el resto de la solución celular en un tubo de Eppendorf a 3.000 rpm (alrededor de 7�0 g durante 4 min).

− Aspirar el sobrenadante respetando el sedimento celular. − Repartir y depositar el sobrenadante en tubos de Eppendorf y almacenarlos

a –70 °C hasta análisis. Esta temperatura es ideal para largas conservaciones o sustancias muy sensibles, pero el almacenado a –20 °C por cortos periodos (días, semanas) también es factible.

• Protocolo de preparación de extensiones y recolección del sobrenadante. Este procedimiento es alternativo al recomendado con cytospins y está indicado

en el caso de carecer de una citocentrífuga. Ha sido probado en nuestro labora-torio con buenos resultados.

− Centrifugar la solución celular filtrada en un tubo de Eppendorf a 3.000 rpm (alrededor de 7�0 g durante 4 min).

− Aspirar el sobrenadante respetando el sedimento celular.


19

− Repartir y depositar el sobrenadante en tubos de Eppendorf y almacenarlos a –70 °C hasta análisis. Esta temperatura es ideal para largas conservaciones o sustancias muy sensibles, pero el almacenado a –20 °C durante cortos perio-dos (días, semanas) también es factible.

− Reconstituir el sedimento celular con �0 μl de PBS. Aspirar y expulsar varias veces para distribuir bien el sedimento celular.

− Preparar las extensiones depositando una o dos gotas de esta suspensión celular sobre un portaobjetos y extender suavemente formando un círculo.

− Dejar la extensión secarse completamente a temperatura ambiente y teñirla con la tinción que usemos (Wright modificada o May-Grünwald-Giemsa).

Brevemente, la tinción de May-Grünwald-Giemsa se obtiene de la siguiente forma en nuestro laboratorio: el portaobjetos con la extensión o el cytospin se dejan secar bien al aire, se prepara un buffer (Na2HPO4 0,1192 g + KH2PO4 0,0907 g + 10 ml agua), se fija la muestra en metanol durante 3 min, se tiñe en cubeta con el May-Grünwald � ml + buffer � ml durante 3 min, se lava con agua bidestilada, se tiñe con Giemsa 0,7� ml + buffer 4,2� ml durante 7 min y, finalmente, se lava en agua bidestilada y se deja secar.

− Otras tinciones son posibles dependiendo de nuestro interés. Las más usadas son el aceite O rojo para el estudio de las inclusiones lipídicas en los macró-fagos, y el azul de Prusia para los hemosiderofágos. Igualmente, las tinciones de inmunocitoquímica son posibles. Para una completa referencia de estos procedimientos es preciso dirigirse a textos especializados.

20


Hay tres pasos decisivos en el proceso de diagnóstico citopatológico aplicado al esputo (inducido o no) para su aplicación en el seguimiento y control de procesos in-flamatorios de vías aéreas: 1) la recolección de una muestra que contenga células representativas de la enfermedad que pretendemos estudiar; 2) la preparación y re-cuento de dicha muestra de tal forma que no se pierdan células aunque preservando sus características morfológicas para identificarlas, y 3) que se cuantifiquen de la ma-nera más exacta posible. Este tercer punto es de vital importancia para la aplicación clínica de la técnica. La toma de decisiones clínicas (supresión o inicio de un tratamien-to corticoideo...) está basado en la comparación de la distribución celular obtenida en el esputo del enfermo, con una distribución celular de referencia obtenida de esputos de sujetos sanos. Por ejemplo, la célula de mayor importancia, el eosinófilo, supone en su-jetos normales menos del 2% del total de células inflamatorias presentes en la muestra. Con márgenes tan estrechos debe asegurarse un recuento lo más exacto posible. Esto motiva que el personal encargado esté familiarizado y bien entrenado en el reconoci-miento celular. En muchos hospitales, dada la proverbial dificultad de que los anatomo-patólogos cuantifiquen una muestra, los hematólogos suelen ser un buen aliado para obtener un recuento fiable, o bien nos ayuden a la formación de nuestro personal.

La metodología para realizar este recuento es clásica, y ha sido establecida para su uso con el esputo de la siguiente forma:

• Utilizando 40 aumentos (objetivo de 4× y visor de 10×) se realiza una pasada rápida por toda la preparación para identificar las zonas donde haya una distri-bución homogénea de las células.

• El recuento se realiza centrando el microscopio sobre una zona adecuada de la misma (elegida al azar), y desde una de sus esquinas se cuentan todas las células que aparezcan en el campo. Una vez contadas, se cambia a otro campo siguiendo un camino helicoidal (de arriba hacia abajo y desde ahí hacia la derecha, y de nue-vo desde abajo hacia arriba y luego a la derecha, etc.). Se continúa hasta cubrir un mínimo de 400 células inflamatorias. Es importante contar al menos 400 células, ya que de otra forma la reproducibilidad de los recuentos se resentiría.

• El recuento se realiza a 400 aumentos (objetivo de 40× y visor de 10×) y los porcentajes relativos se obtienen a partir de estas 400 células. No deben incluir-se células epiteliales de vías altas.

• En el caso de que hayan pocas células se intentará cubrir el mayor número de campos (incluso toda la preparación) posible para asegurarse un mínimo de 100 recuentos.

Procedimiento de recuento celular para las preparaciones de esputo y otras muestras biológicas respiratorias2.10.


21

La interpretación del recuento celular debe tener en cuenta la viabilidad celular, el grado de degeneración celular y el grado de contaminación escamosa celular como indicadores de buena calidad, pero se basa en los recuentos total y diferencial de eosinófilos, neutrófilos, basófilos, macrófagos/monocitos, linfocitos y células bronquia-les epiteliales.

1. CALIDAD DE LA MUESTRA

Si la viabilidad celular es baja con un alto grado degeneración celular, el recuento celular total puede ser artificialmente bajo y el recuento diferencial puede ser inexac-to. Si la contaminación escamosa es alta, se asume que la cantidad de esputo pro-cedente del tracto respiratorio inferior es baja en la muestra procesada. Cantidades excesivas de contaminación escamosa pueden producir menor fiabilidad en el re-cuento diferencial celular al dificultar la identificación de otras células por yuxtapo-sición (son células muy grandes) y, además, supone una muestra de dudosa represen-tabilidad del tracto respiratorio inferior. La presencia de macrófagos indica que la muestra es del tracto respiratorio inferior y, aunque también pueden observarse mo-nocitos, éstos suelen aparecer en las secreciones del tracto respiratorio superior (se-creción nasal) donde no hay macrófagos. Por lo tanto, en las muestras con una pro-porción excesiva de monocitos (> 10%) debe sospecharse gran contaminación nasal.

2. VALORES DE REFERENCIA y CARACTERíSTICAS DE CIERTOS GRUPOS

Los valores de referencia para el recuento celular total y diferencial en sujetos sanos pueden consultarse en las tablas I y II. El recuento celular total se incrementa en muchas enfermedades respiratorias como la EPOC, el asma no controlada, fuma-dores y, particularmente, en las infecciones. El recuento celular total alcanza sus valores máximos en la infección bacteriana. La proporción de neutrófilos es mayor en los fumadores con LCFA que en aquellos que no tienen LCFA, y es la máxima ob-servable cuando presentan exacerbaciones infecciosas.

3. EOSINóFILOS

En sujetos sanos aparecen muy pocos eosinófilos (cercano al 0%). Se consideran anormales valores por encima del 3%. Un aumento de los eosinófilos en el esputo se observa en la bronquitis eosinofílica con o sin las características de asma. La bronquitis eosinofílica sin asma suele asociarse con tos crónica productiva o no, y su

Interpretación de los resultados del recuento celular2.11.

22


Tabla IRecuento celular total y diferencial (absolutos, ×106 cels/g) en esputo

Media (SD) Rango normal Mediana (IQR)

Percentiles

Media−2 SD

Media+2 SD

10 90

Recuento celular total 4,129 (4,814) −4,599 13,757 2,400 (3,188) 0,672 9,732

Eosinófilos 0,013 (0,037) −0,061 0,087 0,000 (0,008) 0,000 0,042

Neutrófilos 1,962 (3,027) −4,092 8,016 0,865 (1,959) 0,098 4,860

Macrófagos 2,126 (2,027) −1,928 6,18 1,644 (1,873) 0,296 4,859

Linfocitos 0,043 (0,069) −0,095 0,181 0,018 (0,048) 0,009 0,086

Células metacromáticas 0,000 (0,001) −0,002 0,002 0,000 (0,000) 0,000 0,001

Células bronquiales epiteliales

0,014 (0,037) −0,06 0,088 0,006 (0,010) 0,000 0,031

(Belda J, et al. Am J Respir Crit Care Med 2000;161[2 Pt 1]:475-8).

Tabla II Recuento diferencial celular (porcentajes) en esputo

Media (SD) Rango normal Mediana(IQR)

Percentiles

Media−2 SD

Media+2 SD

10 90

Eosinófilos 0,4 (0,9) −1,4 2,2 0,0 (0,3) 0,00 1,1

Neutrófilos 37,5 (20,1) −2,7 77,7 36,7 (29,5) 11,0 64,4

Macrófagos 58,8 (21,0) 16,8 100,8 60,8 (28,9) 33,0 86,1

Linfocitos 1,0 (1,1) −1,2 3,2 0,5 (1,8) 0,01 2,6

Células metacromáticas 0,0 (0,04) −0,1 0,1 0,0 (0,0) 0,00 0,04

Células bronquiales epiteliales

1,6 (3,9) −6,2 9,4 0,3 (1,3) 0,00 4,4

(Belda J, et al. Am J Respir Crit Care Med 2000;161[2 Pt 1]:475-8).


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diagnóstico es imposible sin un recuento de eosinófilos en secreción respiratoria del tracto inferior. Un descenso en el número de eosinófilos también se ha asociado con el efecto beneficioso de añadir corticosteroides, siendo un factor predictivo del éxito del tratamiento23.

4. NEUTRóFILOS

Como se ha mencionado, los neutrófilos aparecen aumentados en los fumadores respecto a no fumadores, y en población urbana respecto a la rural. Su valoración se hace considerando el recuento celular total. La presencia de neutrofilias mayores del 60% con RCT superiores a 1� millones/ml indica infección en asmáticos, y si el RCT es superior a 2� millones/ml es muy sugestivo de infección bacteriana, al igual que neutrofilias superiores al 80%. Su valor en la EPOC está menos establecido.

5. OTRAS CéLULAS

Los linfocitos son difíciles de identificar de forma exacta, por lo que tienden a in-cluirse entre los macrófagos/monocitos, obteniéndose valores muy bajos. Actualmente, su recuento tiene escasa utilidad práctica, excepto cuando hay un aumento de linfoci-tos acompañado de un moderado incremento del recuento celular total, y de neutró-filos, que es altamente sugestivo de infección virica.

La presencia de abundantes células bronquiales suele verse en las viriasis y en la recuperación de exacerbaciones asmáticas. Su presencia fuera de esas circunstan-cias es de significado desconocido.

El valor del recuento simple de macrófagos no tiene valor clínico reconocido. Sin embargo, el estudio de su inmunofenotipo por citometría de flujo se ha descrito para el estudio de enfermedad intersticial, tuberculosis y otras enfermedades. Igualmente, el análisis de las inclusiones citoplasmáticas de los macrófagos puede aportar informa-ción interesante para el estudio de las broncoaspiraciones (inclusiones lipídicas), hemorragias alveolares o fallo cardíaco izquierdo (hemosiderófagos), cuerpos extra-ños por exposición laboral o viriasis.

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Medición de óxido nítrico en aire espirado

27


Introducción

Ana M.a Fortuna Núria Calaf

Teresa Feixas Mercedes González

Pere CasanUnidad de Función Pulmonar. Departamento de Neumología.

Hospital de la Santa Creu i Sant Pau. Facultat de Medicina. UAB. Barcelona

El óxido nítrico (NO) es una molécula cuya historia va unida a un Premio Nobel. En el año 1998, los investigadores R.F. Furchgott, L.J. Ignarro y F. Murad alcanzaron este preciado galardón gracias a sus descubrimientos relacionados con este com-puesto. Se trata de un gas incoloro, poco soluble en agua, altamente inestable en el aire, donde se oxida rápidamente, y por cuya razón se clasifica dentro de los radica-les libres. El NO no debe confundirse con otros compuestos de oxígeno y nitrógeno (N2O: óxido nitroso; NO2: dióxido de nitrógeno, o N2O2: dióxido de dinitrógeno).

El organismo produce una mínima cantidad de NO a partir del metabolismo del aminoácido arginina. Esta sustancia se trata de un potente mediador celular a la vez que un activo agente vasodilatador. La síntesis de NO se produce a partir de la acción de una enzima, la óxido nítrico sintetasa (NOS), de la que se conocen tres variantes, una de ellas inducible, no dependiente del calcio y que se expresa muy débilmente en situación fisiológica. Por el contrario, en determinadas situaciones donde existe un incremento de actividad inflamatoria (endotelial o epitelial), o una acumulación de células sanguíneas (eosinófilos) se produce un aumento de su actividad y la concen-tración de NO en el medio aumenta. Este hecho convierte a la determinación de la concentración de NO en el aire espirado (FENO) en un potencial marcador de la ac-tividad inflamatoria local.

En los últimos años hemos asistido a una amplia proliferación de equipos analiza-dores de esta concentración de NO, a la vez que se han publicado numerosos tra-bajos en los que se intenta relacionar este marcador de actividad inflamatoria con

3

3.1.

28


diferentes aspectos de varias enfermedades respiratorias, especialmente en el asma. Subyace en la mayoría de ellos la necesidad de disponer de marcadores biológicos de las enfermedades que permitan una facilidad diagnóstica (especialmente útil en pediatría), a la vez que una actitud pronóstica y una manera cómoda de regular el tratamiento y aumentar su relación beneficio/riesgo. En las páginas siguientes se presentan aquellos aspectos más determinantes para la perfecta utilización de la [FENO] como marcador de enfermedades respiratorias.


29

Tal como se comentaba, el NO es un radical libre que se sintetiza a partir de la L-arginina mediante la enzima NO-sintetasa. Existen tres isoformas de esta enzima: la NO-sintetasa neuronal (NOS1 o nNOS), presente en células neuronales; la NO-sintetasa inducible (NOS2 o iNOS), que presenta gran actividad, es inducida por ci-tocinas inflamatorias, macrófagos y endotoxinas y cuya expresión aumenta en diver-sas enfermedades inflamatorias; por último, la NO-sintetasa endotelial (NOS3 o eNOS), que se expresa sobre todo en las células endoteliales. Las funciones del NO en el organismo son muy diversas, de las que cabe destacar su intervención en procesos inflamatorios y su función como potente vasodilatador endotelial.

La producción de NO en la vía aérea sigue un modelo bicompartimental en el que la liberación de NO en la luz bronquial será proporcional a la diferencia entre la con-centración de la luz y la concentración de la pared bronquial (ley de Fick) y, por lo tanto, dependerá del flujo de aire y de la capacidad de difusión del NO desde la pared bronquial hacia la luz. A su vez, la difusión dependerá de la concentración de NO en la pared del bronquio. Por lo tanto, la concentración final de NO en la vía aérea será la suma del transporte longitudinal desde la luz alveolar y la concentración del trans-porte transversal (difusión lateral de NO) de toda la vía aérea1.

Hay evidencia científica de la existencia de alteraciones de la concentración de NO en la vía aérea de pacientes con enfermedades respiratorias con componente infla-matorio como el asma. Por ello, en los últimos años se ha desarrollo un método no invasivo para cuantificar la concentración de NO en la vía aérea como un marcador in-flamatorio: determinación de NO en el aire espirado. Cuando se realiza una espira-ción, el óxido nítrico reacciona con el ozono produciéndose NO2, que, al estabilizar-se, permite ser medido por quimioluminiscencia, emitiendo una radiación lumínica proporcional a la concentración de NO en el aire espirado. En la determinación de NO en el aire espirado y siguiendo el modelo bicompartimental antes comentado se pueden cuantificar dos concentraciones: la fracción de NO bronquial (FENO) y la con-centración de NO del compartimento alveolar (Calv). En este manual se desarrollará la determinación de FENO como marcador de inflamación en pacientes con enferme-dad respiratoria inflamatoria (sobre todo asma). La determinación del componente alveolar de NO (Calv) está aún en fase de investigación1.

Fundamentos3.2.

30


1. INDICACIONES

1.1. El asma se caracteriza por presentar como mecanismo fundamental inflama-ción crónica de las vías aéreas responsable, en último término, de la hiperrespuesta bronquial y de la obstrucción al flujo aéreo reversible. Diferentes estudios han obje-tivado la existencia de un aumento de la síntesis de NO en las células epiteliales bronquiales interviniendo en el proceso inflamatorio del asma2. La utilidad de la de-terminación de FENO en el asma tendría las siguientes indicaciones:

• Diagnóstico de asma. Se ha demostrado que la determinación de FENO presen-ta buena sensibilidad y especificidad en el diagnóstico de asma así como una mayor capacidad diagnóstica que los parámetros habitualmente utilizados, por ejemplo la función pulmonar3.

• Detectar inflamación de la vía aérea. La determinación de FENO presenta buena correlación con el esputo inducido con la ventaja de ser más sencillo y menos invasivo que éste4.

• Monitorización del tratamiento antiinflamatorio. Los niveles de NO disminuyen después del tratamiento antiinflamatorio con corticoides. La determinación de FENO es útil para valorar la introducción de tratamiento corticoideo, así como la modifi-cación de la dosis y de la duración del mismo según los valores de FENO

�,6. • Evaluar la adherencia al tratamiento. En aquellos pacientes en que se sospecha

un mal cumplimiento del tratamiento como causa de la ausencia de control de la enfermedad.

• Predicción de exacerbaciones. El aumento de la concentración de FENO en una agudización asmática se produce precoz y previamente a la presencia de sínto-mas y a la alteración de la función pulmonar del paciente, permitiendo el control y tratamiento de la agudización de forma precoz7.

1.2. Diagnóstico diferencial. La determinación de FENO permite descartar el diag-nóstico de asma y realizar el diagnóstico de otras enfermedades (pacientes con atopia, tos crónica, etc.).

1.3. Monitorización de otras enfermedades respiratorias (neumopatía intersticial, EPOC, hipertensión arterial pulmonar, etc.).

1.4. Ensayos clínicos farmacológicos.

2. LIMITACIONES

• Falta de comprensión o de colaboración del paciente.• Traqueostomía.

Indicaciones, limitaciones, complicaciones y contraindicaciones3.3.


31

3. NO SE hAN DESCRITO COMPLICACIONES NI CONTRAINDICACIONES

4. ESPACIO FíSICO

Se recomienda un espacio físico amplio para la incorporación del equipo de qui-mioluminiscencia, que suele presentar grandes dimensiones, las herramientas com-plementarias necesarias, bombonas de CO2 y de NO y el personal sanitario reque-rido. Debe ser un espacio individualizado y aislado acústicamente, puesto que el paciente requerirá concentración para controlar a la perfección su flujo espiratorio durante el procedimiento y para que el personal sanitario pueda realizar las indica-ciones de forma individual y dirigida al paciente.

32


1. hOSPITAL

• El ámbito habitual para realizar la determinación de FENO es el hospitalario en el contexto de un servicio de neumología, ya sea el laboratorio de función pul-monar o el hospital de día.

• Pediatría y neumología pediátrica. La utilización de la determinación de FENO es muy útil en la edad pediátrica por ser un método rápido, sencillo y factible en niños menores de 12 años, edad en la que la realización de espirometría o pruebas de provocación bronquial presentan dificultad.

2. AMBULATORIO y DOMICILIO

La incorporación de equipos portátiles y muy sencillos permite la determinación de FENO en el contexto hospitalario agudo (sala de hospitalización, unidad de críticos), ambulatorio (consulta externa) y en el domicilio del paciente.

Ámbitos de realización3.4.


33

• Titulación académica de diplomado de enfermería. • Experiencia en la realización de técnicas de medición de función pulmonar. • Experiencia en calibración de equipos y representación gráfica de señales.• Entrenamiento previo en un centro con experiencia.• Conocimiento de indicaciones y limitaciones de la técnica.• Habilidades comunicativas y experiencia en el trato con enfermos.• Capacidad para solucionar problemas técnicos.• Iniciativa en la toma de decisiones.

Personal: cualificación y preparación3.5.

34


1. SENSOR DE QUIMIOLUMINISCENCIA8,9

Es el equipo más ampliamente introducido y utilizado en la práctica clínica. Es de grandes dimensiones y de uso hospitalario. Existen diferentes modelos en el merca-do (SIR N-6008®, LR 2000 analyser®, NIOX® Aerocrine), sin embargo todos los equipos comparten los requerimientos fundamentales necesarios para la realización de la técnica con diferencias en detalles complementarios (Figs. 1 y 2).

1.1. Componentes del equipo

• Analizador de óxido nítrico basado en el principio de quimioluminiscencia.• Tubuladura y pieza bucal para realizar la maniobra de espiración. En los equipos

en los que la inspiración previa se realiza desde el aire ambiente (p. ej. SIR N-6008®) se utilizará una boquilla adaptada a la pieza en T espiratoria. En los equipos en los que la inspiración previa se realice desde el interior del equipo (NIOX® Aerocrine), éste cuenta con un filtro incluido en el interior del tubo de espiración, además de un filtro antiviral y antibacteriano individual a través del cual el paciente realiza las maniobras respiratorias.

• Instrumentación para la realización de la medición de la presión bucal.• Instrumentación para la restricción del flujo bucal.• Módulo visualizador de biorretroalimentación.• Ordenador que incluye un software visual que facilita al paciente el procedimien-

to mediante un dibujo, sonido, luces, etc.• Impresora. Se recomienda la impresión de los resultados: valores de FENO, pre-

sión bucal, concentración de CO2 espirado, y sus gráficas correspondientes.

1.2. Precisión del equipo y margen de lectura

La precisión de la mayoría de los equipos es de ± 1% y el margen de lectura varía entre 0-�00 ppb.

1.3. Mantenimiento del equipo

Se realizará siguiendo las instrucciones del fabricante.• Limpieza del tubo de espiración.• Comprobación diaria de circuitos.• Los filtros y boquillas que no sean desechables deben lavarse con agua y jabón

y luego esterilizarse con métodos químicos.

Equipos 3.6.


3�

Figura 1. Sensor de quimioluminiscencia SIR N-6008.

Figura 2. Sensor de quimioluminiscencia NIOX® Aerocrine.

• Recambio de filtros. Los filtros PFTE de � μ previenen la entrada de bac-terias o partículas al equipo y deben sustituirse una vez cada 3 meses.

• Carbón activo. Sirve para eliminar el ozono resultante antes de su salida al ambiente. Se recomienda sustituir-lo una vez al año.

• Bomba. Sustitución de membranas de la bomba cada 2 años.

• En los equipos que contengan esta-bilizadores (DRIERITE) se reco-mienda el control y recambio cada 1�-30 días, según el cambio de co-loración del estabilizador (de azul original a rosa).

• El depurador de NO se deberá cam-biar cada 6 meses.

1.4. Sistemas de calibración

La calibración se realizará según las instrucciones del fabricante para cada equipo.

• La periodicidad de calibración varía entre los diferentes modelos. Puede ser semanal o quincenal.

• Se requerirá una bombona de óxido nítrico de una concentración conoci-da entre 100-200 ppb. El equipo rea-liza la calibración generando un his-tórico de NO para nuestro posterior control de calidad.

1.5. Control de calidad

• Calibración de NO a «0» antes de cada prueba.

• Comprobación diaria de circuitos.• Filtros y controles bacteriológicos.• Prueba personal del laboratorio

diaria.

36


• Calibración bombona NO cada 2-3 días.• Linealidad del analizador cada 3-4 meses.

2. SENSOR ELECTROQUíMICO10

En los últimos años ha aparecido en el mercado un nuevo equipo portátil que permite la medición de FENO ambulatorio y en el domicilio del paciente. Es de peque-ñas dimensiones y permite su utilización individual por el mismo paciente (Fig. 3).

2.1. Componentes del equipo

• Analizador de óxido nítrico a partir de una reacción electroquímica (a diferencia del resto de equipos que lo hacen mediante quimioluminiscencia).

• Es ligero, de pequeñas dimensiones (24 × 13 × 10 cm; 800 g) y portátil. Permite la realización de la maniobra por parte del paciente una vez instruido por el personal sanitario.

• Sensor lumínico y acústico para facilitar y asegurar el flujo espiratorio.• La maniobra de inspiración previa a

la espiración se realiza desde el in-terior del equipo.

• Requiere un filtro antiviral y antibac-teriano mediante el cual se realiza la maniobra.

• El resultado aparece de forma digital en un display visible por el paciente (no facilita representación gráfica).

• Una tarjeta digital guarda los resulta-dos de las determinaciones del pa-ciente, facilitando así el seguimiento de los valores de FENO.

2.2. Precisión y margen de lectura

El equipo tiene una precisión inferior al 3% en determinaciones de menos de 30 ppb e inferior al 10% en valores mayores de 30 ppb. El margen de lectura es entre �-300 ppb.

2.3. Mantenimiento y calibración

El mantenimiento es mínimo. No re-quiere calibración.

Figura 3. Sensor electroquímico portátil NIOX MINO® Aerocrine.


37

1. RECOMENDACIONES PREVIAS

• Evitar la toma de tratamiento broncodilatador inhalado y corticoide inhalado y/o sistémico previamente a la medición. En los pacientes que están en tratamiento y la realización de FENO se utiliza para modificar el tratamiento según sus resul-tados, el paciente realizará el tratamiento habitual y se recogerá el nombre del fármaco, la dosis y la hora.

• Realizar la medición al menos 2 h después de la última ingesta.• Evitar la ingesta de alimentos ricos en nitratos (verduras como lechuga y espi-

nacas), así como la ingesta de bebidas estimulantes (café, té, alcohol) en las horas previas a la medición.

• Realizar la medición de FENO previamente a la realización de otras pruebas respiratorias como espirometría y esputo inducido.

• Evitar la realización de ejercicio físico en la hora previa a la medición.• Recoger en la historia clínica la presencia de un proceso respiratorio infeccioso

agudo.

2. PREPARACIóN DEL PACIENTE

• Observar las condiciones físicas del paciente para realizar la prueba.• Comprobar que las recomendaciones requeridas se cumplen. • Recoger en la historia clínica antecedentes de enfermedades infecciosas: hepa-

titis aguda, infección por VIH, tuberculosis pulmonar aguda, etc.• Acomodar al paciente y explicar el procedimiento.

3. PREPARACIóN DEL EQUIPO

• El equipo debe estar calibrado y preparado para su utilización.• Recoger en la hoja de datos los datos personales del paciente y la concentración

de NO ambiental.• Colocar la boquilla o el filtro en el tubo de la espiración.

4. DETERMINACIóN DE FENO

4.1. Técnica. hay dos técnicas para la determinación de FENO

• Técnica on line: la determinación de FENO se realiza directamente en el aire espirado.

Procedimiento 3.7.

38


Figura 4. Realización de determinación de FENO mediante el sensor SIR N-6008.

Figura 5. Realización de determinación de FENO mediante el sensor NIOX® Aerocrine.

• Técnica off line: el aire espirado se almacena y la determinación de FENO se realiza posteriormente.

Las dos técnicas están internacionalmente estandarizadas8,9, sin embargo la téc-nica on line es la utilizada habitualmente en la práctica clínica y, por lo tanto, será la que se desarrolle en este manual. Para más información sobre la determinación mediante la técnica off line se recomiendan las guías internacionales8,9. El proce-dimiento de la técnica on line es el siguiente:


39

• Acomodar al paciente en una silla con la espalda recta. En esta posi-ción se consigue un volumen de es-pacio muerto inferior a 10 ml, con lo que se garantiza la rápida recogida de muestra respiratoria útil.

• Explicar el procedimiento al paciente.• No es necesario utilizar pinza nasal.

El equipo realiza una resistencia bu-cal entre �-20 cm H2O que asegura el cierre del velo del paladar y evita la contaminación con el óxido nítrico procedente de las fosas nasales.

• El paciente realiza una inspiración hasta capacidad pulmonar total. De-pendiendo del equipo, la inspiración se realiza o bien desde el aire am-biente (SIR N-6008®) o bien desde el interior del equipo (NIOX® Aerocri-ne y NIOX MINO® portátil).

• Desde capacidad pulmonar total se realiza una espiración a un flujo constante de �0 ml/s durante 10 s. Durante la espiración un marcador visual ofrecido por el software del equipo ayudará al paciente a mantener la espiración al flujo re-querido (�0 ml/s) (Figs. 4 y �).

• Es necesario realizar tres determinaciones correctas y la determinación de FENO final será el promedio de las tres maniobras aceptables. Una maniobra correcta no debe diferir de la anterior (bien realizada) en ± 2,� ppb o un 10%. No es conveniente realizar más de seis maniobras.

• Con el sensor electroquímico portátil la técnica es la misma, pero sólo requiere una determinación válida. Sus dimensiones y el sensor lumínico sonoro que in-forma al paciente para que mantenga la espiración constante en el tiempo son sus características diferenciales (Fig. 6).

• El análisis de los resultados en algunos equipos es manual (SIR N-6008®) y en otros es automático (NIOX® Aerocrine).

4.2. Errores frecuentes

• Imposibilidad por parte del paciente para mantener el flujo a �0 ml/s de forma constante.

• Imposibilidad por parte del paciente para mantener la espiración durante 10 s.• Humedad y oclusión del tubo de espiración.

Figura 6. Realización de determinación de FENO mediante el sensor portátil NIOX MINO® Aerocrine.

40


1. ExPRESIóN

La concentración de NO en aire espirado (FENO) se expresa en partes por billón (ppb).

2. CÁLCULO y REPRESENTACIóN DEL RESULTADO

• El trazador del sensor desestima el pico inicial de espiración y mide un plateau válido, considerado como aquella meseta estable de al menos 3 s y que presen-ta un gradiente de variabilidad inferior a 10% (Fig. 7).

• El resultado final es el promedio de las tres determinaciones válidas según los criterios mencionados.

• El equipo facilita una gráfica que representa el resultado de FENO (ppb) respec-to al tiempo (s) (Fig. 7).

• El equipo electroquímico portátil sólo requiere una determinación válida. No realiza una representación gráfica del resultado. El equipo facilita mediante un display la determinación de FENO (ppb) única requerida en números digitales y la posibilidad de guardarlo en una tarjeta digital para comparar con las sucesivas determinaciones.

3. VALORES DE REFERENCIA

La existencia de múltiples modelos de equipos de determinación de FENO hace necesaria la realización de valores de re-ferencia según los cuales se puedan to-mar conclusiones diagnósticas y terapéu-ticas. El valor de FENO no es definitorio por sí mismo de un diagnóstico o de un tratamiento. Se debe tener en cuenta la historia clínica del paciente en el momen-to de la realización de la medida y su función pulmonar, y así, en conjunto, to-mar conclusiones diagnosticoterapéuti-cas. La utilidad de la FENO es comple-mentaria. Para ello, se han establecido los siguientes valores de referencia11,12.

Resultados3.8.

Figura 7. Representación gráfica del resul-tado de FENO.


41

3.1. Sensor de quimioluminiscencia

• LosvaloresdereferenciaestablecidosporlasrecomendacionesinternacionalesparalaconcentracióndeFENOenvoluntariossanosseencuentranenunrangoentre10-20ppb.ElestudioenpoblaciónespañoladeCalafN,etal.13establecióqueunaconcentracióndeFENOinferiora20ppbseencuentradentrodelmargendereferencia.

• ValoresdeFENO≥20ppb: − Eneldiagnósticodeasma.LatablaIresumelarelaciónentrelosvaloresde

FENOyeldiagnósticodeasma. − Enelcontroldelaenfermedadasmática.Enprincipio,enunpacienteasmá-

tico en tratamiento corticoideo que presente valores de FENO ≥ 20 ppb serecomiendadescartar:

– Faltadecumplimientodeltratamiento. – Realizaciónincorrectadeltratamiento. – Sospecharundiagnósticodiferentedeasma. – Situaciónpreviaaunaagudización. – Agudizaciónasmáticaaguda. – Resistenciaacorticoides.ExistenvariosestudiosqueintentanestablecervaloresdeFENOsegúnloscuales

realizar el control y monitorización del tratamiento de un paciente asmático6,7. Sinembargo,noexisteunarelaciónestandarizadaentrelosvaloresdeFENOylaactitudterapéutica a tomar que se pueda utilizar hoy día en la práctica clínica de formasistemática.

Tabla IValores de referencia de FENO en el diagnóstico

de asma (sensor de quimioluminiscencia)

FENO Adultos. FENO (ppb) Significado Niños (< 12 años)FENO (ppb)

Bajo <5 DescartaasmaValorarotrosdiagnósticos

<5

Normal 5-20 Individuosano 5-15

Normal-alto 20-35 SugestivoConfirmarconlahistoriaclínica

15-25

Muy alto >35 Diagnóstico >25

42


Tabla IIValores de referencia de FENO. Sensor de quimioluminiscencia

y sensor electroquímico portátil (NIOX MINO®)14

Sensor dequimioluminiscencia

Significado clínicosegún los valoresde FENO

Sensor electroquímico portátil

FENO (ppb) FENO (ppb)

5-20 ValoresdentrodelmargendereferenciaIndividuossanos

10-35

>20 Nivelesaltos:valorareldiagnósticodeasma;modificacióndeltratamiento

>35

Lomásimportanteesestablecervaloresdereferenciaennuestrapoblación,quecumplan los rangos establecidos por los resultados estandarizados y utilizar estosvaloresenlaprácticaclínica.Serecomienda:

• Realizareldiagnósticoenlaprime-ra visita: historia clínica, síntomas,función pulmonar y determinacióndeFENO.

• MediantelarealizacióndeFENOenlaprimeravisitaseestableceráelvalorde FENO de ese paciente previa altratamientoysedecidiráeltratamien-tobasándoseenelresultadoyelcon-texto clínico (según los valores dereferenciaestablecidos).

• Realizar la determinación de FENOencadavisitadelpaciente.

• RealizarunatarjetaderecogidadevaloresdeFENOdelpacienteyano-tar en ella los valores correspon-dientesaladeterminacióndecadavisita.

• Modificar el tratamiento de acuerdocon losvaloresdeFENOy laclínicadelpacienteencadavisita.

Figura 8. Comparación de los valores de FENO entre el sensor de quimiolu-miniscencia y el sensor electro-químico portátil14.

40

30

20

10

N-6008: 7 ± 5 ppbNIOX-MINO 20 ± 8 ppb

N-6008

NO

(pp

b)

NIOX-MINO


43

3.2. Sensor electroquímico portátil

La determinación de FENO con el sensor electroquímico portátil presenta valores deFENOsuperioresycorrelacionadosconlosvaloresobtenidosconequiposdequimiolumi-niscencia14.Si sedisponedelequipoportátilNIOXMINO®es recomendableutilizar losvaloresdereferenciaestablecidosrecientemente14.

• FENO<35ppb:individuosano.• FENO≥35ppb:valorpatológico.Realizaractituddiagnosticoterapéuticacomentada

anteriormenteparaelequipodequimioluminiscencia,peroutilizando35ppbenvezde20ppbcomovalordereferencia(TablaII).

• Sisecomparacon losvaloresobtenidosconunsensordequimioluminiscenciaseutilizaráel factordecorrección:FENO(NIOXMINO®)=1,5×10(valordeFENOconelsensordequimioluminiscencia)14(Fig.8).

3.3. Factores y enfermedades que modifican la concentración de FENO

Existendiferentesfactores,fármacosyenfermedadesquecursanconalteraciónenladeterminacióndeFENOyquedebentenerseencuentaenelmomentode interpretarelresultadojuntoconlahistoriaclínicadelpaciente(TablasIIIyIV).

Tabla III Factores que modifican la concentración de FENO

Aumento de FENO Disminución de FENO

Dietaricaennitratos Espirometría

Fármacos(IECA) Ejerciciofísico

Infecciónviral Hábitotabáquico

Rinitisalérgica Ingestadebebidasestimulantes

NOambiental

44


Tabla IVEnfermedades respiratorias que presentan alteraciones

de la concentración de FENO

Aumento de FENO Disminución de FENO

Asma Discinesia ciliar

Rinitis alérgica Fibrosis quística

Neumopatía intersticial Hipertensión pulmonar

Cáncer de pulmón EPOC (variable)

Bronquiectasias

Tuberculosis pulmonar

EPOC (variable)

Además, existen enfermedades no respiratorias que presentan alteraciones en la sín-tesis de óxido nítrico y, por lo tanto, la determinación de FENO pudiera presentar valores fuera del rango de de referencia (enfermedades renales [glomerulonefritis crónica, insufi-ciencia renal crónica], cirrosis hepática y síndrome hepatopulmonar, entre otras).

Una de las especialidades médicas donde la determinación de NO espirado tiene mayor interés es en pediatría. Recientemente, Cobos Barroso N, et al.15 han revisado su utilización y proponen su uso como elemento para monitorizar la inflamación de las vías aéreas en niños.


4�

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13. Calaf N, De Lerma JB, Feixas T, et al. Exhaled nitric oxide: reference values in healthy adults. Arch Bronconeumol 2004;40 Suppl 2:66.

46


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Condensado exhalado

47

Condensado exhalado

Introducción

yolanda Torralba GarcíaFederico P. Gómez yerón

Servicio de Neumología (ICT). Hospital Clínic de Barcelona - IDIBAPS

El estudio de las enfermedades pulmonares inflamatorias mediante biomarcadores representativos de los procesos patológicos subyacentes es un campo de creciente expansión que puede contribuir a una mejor caracterización clínica y patogénica de estas enfermedades y a una adecuada monitorización. Asimismo, el empleo de biomarca-dores que puedan obtenerse en un número elevado de sujetos constituye una herra-mienta de gran utilidad en estudios epidemiológicos. El análisis de los constituyentes del aire exhalado como herramienta no invasiva de diagnóstico y monitorización de enfermedades pulmonares ha avanzado rápidamente en los últimos años. Mediante técnicas de enfriamiento del aire exhalado es posible capturar una fase acuosa, lo que se conoce como condensado exhalado (CE). El CE reflejaría la composición del fluido de revestimiento de las vías aéreas conteniendo numerosos compuestos volá-tiles y no volátiles endógenos. Múltiples marcadores de inflamación y de estrés oxi-dativo han sido detectados en pacientes con diferentes enfermedades respiratorias. Procesos como el asma, la EPOC, la fibrosis pulmonar idiopática, las bronquiectasias, la fibrosis quística o la lesión pulmonar aguda han sido investigados empleando el CE como herramienta de evaluación fisiopatológica. La lista de sustancias analizadas incluye eicosanoides (isoprostanos, leucotrienos y prostaglandinas), citocinas, pro-ductos de peroxidación lipídica y otros marcadores de estrés oxidativo, aminas vaso-activas y diversos óxidos de nitrógeno, entre otros biomarcadores. En la actualidad, aún quedan por resolver diversos aspectos de estandarización metodológica y de validación de técnicas analíticas de medición. Es necesario completar este proceso para que este método pueda emplearse de forma generalizada en la práctica clínica. Con estas limitaciones en mente, el presente manual pretende describir el estado actual de los conocimientos en este terreno y contribuir a su divulgación.

4

4.1.

48


1. EL «AIRE» ExhALADO

El «aire» exhalado contiene valiosa información de los procesos fisiológicos y biopatológicos que afectan a las vías aéreas y el parénquima pulmonar, así como de otros procesos de sistemas orgánicos distantes del pulmón. Recientemente, ha emer-gido un concepto ambicioso que podría denominarse exhalomica para referirse al estudio de biomarcadores exhalados y que hace hincapié en la relevancia de este campo de estudio biomédico.

El exhalado está constituido por una fase gaseosa y una fase acuosa. En la fase gaseosa se encuentran los gases fisiológicos (O2, CO2, N2, vapor de agua) así como otros compuestos volátiles endógenos tales como óxido nítrico (NO), monóxido de carbono (CO) o hidrocarburos (etano, pentano), entre muchos otros. La fase acuosa está constituida por una suspensión de diminutas gotas que provienen de la aeroso-lización del fluido de recubrimiento epitelial. Se considera que la fracción del fluido de revestimiento epitelial contenida en el CE es representativa del microambiente extracelular pulmonar (principalmente las vías aéreas), con sus distintos compuestos y mediadores biológicos. A diferencia de otros métodos de obtención de muestras respiratorias, la recolección del aire exhalado es extremadamente sencilla y segura, puede realizarse de forma repetida y sin que se alteren las condiciones del sujeto1.

En la actualidad, el empleo del condensado exhalado como herramienta de inves-tigación de enfermedades respiratorias se extiende rápidamente2. Sin embargo, a pesar de lo promisorio y atractivo de esta metodología, aún persiste un gran número de incertidumbres que no han permitido un uso extensivo de esta metodología que aún se ubica preferentemente en el campo experimental.

2. MECANISMO DE PRODUCCIóN y ORIGEN DEL CONDENSADO ExhALADO

Cuando el aire exhalado, saturado en agua, atraviesa un entorno a bajas tempe-raturas se produce la condensación del vapor de agua provocando que las pequeñas gotas en suspensión, provenientes de la aerosolización del fluido de revestimiento epitelial que se encuentran en el aire exhalado, incrementen su volumen y precipiten sobre la superficie de un sistema condensador especialmente diseñado. El mecanis-mo por el cual pequeñas cantidades del fluido de revestimiento epitelial es aerosoli-zado durante la respiración no es del todo conocido. Se cree que la turbulencia del flujo aéreo en ciertos sectores del árbol traqueobronquial, junto con la apertura sú-bita de bronquíolos respiratorios y alvéolos durante la inspiración, son los principales

Fundamentos4.2.

Condensado exhalado

49

factores involucrados en este fenómeno1. Sin embargo, dado que el CE se obtiene a través de la boca, no se ha dilucidado con certeza la contribución regional de los diferentes sectores de las vías aéreas (cavidad oral, orofaringe, tráquea, vías aéreas, alvéolos). Los niveles de algunos biomarcadores han sido comparados en muestras obtenidas directamente de la vía aérea inferior a través de traqueotomías con mues-tras recogidas a través de la boca en los mismos sujetos. La concentración de ade-nosina y tromboxano B2 y el pH fueron significativamente diferentes entre estas muestras3,4. Resultados semejantes fueron observados con H2O2 y 8-isoprostano3,�-7, sugiriendo que estos mediadores se agregan al CE a nivel de la vía aérea inferior. En contraste, la concentración de amonio es sustancialmente mayor en el CE prove-niente de la vía aérea superior, sugiriendo que se origina en la cavidad oral8. El efecto potencial de enfermedades bucodentales (p. ej. periodontitis, gingivitis, etc.) o faríngeas (síndrome de apnea obstructiva del sueño, roncopatías) sobre los consti-tuyentes del CE no han sido aún investigados suficientemente.

�0


Procedimiento

1. ESPACIO FíSICO

Dentro del laboratorio pulmonar, es recomendable un espacio físico relativamente amplio, con una superficie mínima capaz de reunir a dos personas, el equipo conden-sador y las herramientas accesorias necesarias así como los materiales para el pro-cesamiento inicial de las muestras de CE obtenidas (pipeta, tubos, rotuladores, etc.).

La mayor parte de equipos condensadores disponibles se encuentran montados sobre dispositivos de ruedas que permiten su traslado fuera del ámbito del laborato-rio pulmonar. Por lo tanto, la obtención del CE puede realizarse en casi cualquier otro entorno hospitalario (salas de hospitalización, sala de cuidados intensivos, consulta ambulatoria, etc.).

En estudios epidemiológicos se han incorporado equipos condensadores a unida-des sanitarias móviles, lo que ha permitido la obtención de CE en sitios muy remotos y distantes del ámbito hospitalario. La incorporación de equipos portátiles permite obtener CE desde el propio domicilio.

2. EQUIPOS

2.1. Condensadores artesanales

Los primeros dispositivos de condensación del exhalado fueron diseñados de forma artesanal, como se muestra en la figura 1. Se emplean serpentinas de un material inerte (teflón) que se introducen en un recipiente que contiene hielo o nitrógeno líquido (N2), y en el extremo distal se coloca un tubo de polipropileno para recoger el CE así obtenido. Al igual que otros sistemas, la eficacia para obtener CE depende de la super-ficie de contacto (largo del tubo de teflón) y la temperatura de enfriamiento alcanzada.

2.2. Condensadores comerciales

En la actualidad pueden encontrarse diversos dispositivos comerciales. Está fuera del alcance de este manual extenderse en detalles técnicos o especificaciones con-cretas sobre el funcionamiento de estos equipos.

Entre los sistemas más populares en nuestro entorno destacamos los equipos EcoScreen® (Fig. 2) y ANACON® (Fig. 3). En ambos casos se trata de un sistema de refrigeración eléctrico, con una cámara refrigerada donde se inserta un dispositivo condensador (teflón o cristal) en cuyo extremo distal se encuentra un tubo plástico donde se deposita el CE.

4.3.

Condensado exhalado

�1

Figura 1. Esquema de sistema artesano.

El sujeto respirapor aquí

Tubo de teflón

Tubo de polipropileno

Condensado

Hielo o N2 líquido

Contenedor de hielo

Figura 2. Esquema del sistema EcoScreen®.

Paciente

Válvulaunidireccional

Cámara deenfriamiento

Condensador

Condensadoexhalado

52


Figura 3. Esquema del sistema ANACON®.

Figura 4. Esquema del sistema EcoScreen II®.

Colector 2

Salida 1

Colector 1

Salida 2

Válvula 2

Boquilla

Válvula 0

Neumotacógrafo

Válvula 1

Estos equipos disponen de un sistema de válvulas que permite el flujo unidirec-cional que permite separar el aire inhala-do (ambiental) del exhalado, el cual, an-tes de ser devuelto a la atmósfera, atraviesa el sistema de enfriamiento.

La monitorización del patrón ventilato-rio durante la recolección del CE puede hacerse mediante instrumentos manua-les (espirómetro de Wrigth) o electrónicos (EcoVent®) conectados a la rama expira-toria de la válvula. En la actualidad estos sistemas de monitorización no permiten un registro continuo de la maniobra, por lo que es necesario apuntar manualmen-te los valores obtenidos cada periodo de tiempo determinado.

Entre los dispositivos portátiles cabe mencionar el R-Tube®, que utiliza como

Condensado exhalado

�3

fuente de enfriamiento un cilindro de aluminio que debe ser precongelado en un fri-gorífico estándar y el sistema eléctrico EcoScreen Turbo®.

Recientemente se ha comercializado el sistema EcoScreen II® (Fig. 4) que incorpo-ra una doble cámara de enfriamiento por donde transcurre el aire exhalado. Esto per-mitiría la separación del CE proveniente de las vías aéreas superiores del CE prove-niente de las vías aéreas inferiores.

3. RECOMENDACIONES PREVIAS

Debido a su naturaleza no invasiva, la obtención de CE es una metodología que puede ser empleada en múltiples circunstancias y no es necesario ningún tipo de preparación o premedicación. Sin embargo, en el contexto de un estudio en particu-lar puede ser necesario algún tipo de recomendación previa.

Un aspecto muy importante es el referente a la posibilidad de contaminación del material obtenido con compuestos provenientes de las vías aéreas superiores, y especialmente de la cavidad oral. Por este motivo, se recomienda realizar un enjua-gue bucal antes de iniciar la recolección. Asimismo, para evitar la aparición de tos o esputo durante la recolección se recomienda solicitar a los sujetos expectorar y ex-pulsar secreciones nasales y/o bronquiales antes de comenzar.

La obtención de CE no altera las condiciones basales de los sujetos, mientras que algunas pruebas pueden alterar la composición del CE. Por este motivo se recomien-da realizar la obtención de CE en condiciones basales y antes de otros procedimien-tos tales como espirometrías o pruebas de ejercicio, y en particular realizarlo siempre antes de obtención de esputo inducido o pruebas de broncoprovocación.

De la misma manera, para evitar cambios en el patrón respiratorio debe evitarse la realización de otras exploraciones durante la obtención de CE (p. ej. prick test, gasometría o analítica venosa).

Deberán ser registradas las condiciones clínicas, así como la medicación recibida y las dosis y horarios previos a la recolección del CE.

4. PREPARACIóN DEL PACIENTE

Dado que en la actualidad se trata de una metodología que se emplea exclusiva-mente en el marco de la investigación biomédica, la preparación del paciente depen-derá del contexto del protocolo de investigación que se lleve a cabo.

En términos generales, es aconsejable dar a los sujetos una explicación adecuada de la metodología, el tiempo necesario para completar la recolección, y las instruc-ciones en caso de alguna molestia o incomodidad.

5. PREPARACIóN DEL MATERIAL

El equipo condensador se conectará a la red eléctrica y se pondrá en funciona-miento el tiempo necesario para que alcance la temperatura óptima de recolección, habitualmente 10-1� min antes de iniciar la recolección.

�4


Si se utiliza monitorización ventilatoria mediante neumotacógrafo, éste deberá ser calibrado según las instrucciones del fabricante.

Se prepararán los materiales y accesorios necesarios, que incluyen boquillas (des-echables o bien en condiciones óptimas de higiene), pinzas nasales, un vaso de agua para enjuagues, pañuelos desechables, asiento cómodo.

Para el almacenamiento de la muestra se deberá tener disponible una pipeta gra-duada, puntas de pipeta desechables y tubos para separar alícuotas que se escoge-rán de acuerdo con las necesidades del estudio. Habitualmente, se emplean tubos de polipropileno de 1-2 ml de capacidad.

De forma opcional se puede utilizar una centrífuga refrigerada para optimizar la recuperación del CE que queda retenido en las paredes del sistema condensador. En el caso del equipo EcoScreen® la centrifugación del condensador puede incre-mentar 20-30% el volumen de CE obtenido.

Es aconsejable llevar un registro de la actividad en formularios o dietarios donde se apuntarán datos clínicos del sujeto, las características de la recolección (fecha, parámetros respiratorios, volumen de CE, etc.) y los datos de almacenamiento (có-digos de numeración, localización en el congelador y temperatura de conservación (habitualmente –80°).

6. MANIOBRA DE RECOLECCIóN

La recolección del CE se realiza con el sujeto sentado o semisentado (cabecera a 4�-60°) y en condiciones de reposo. En la medida de lo posible, la recolección del condensado exhalado se realizará antes de cualquier otra prueba respiratoria (inclu-so antes de la espirometría). Se recomienda que los sujetos no hayan realizado un esfuerzo físico importante ni haber ingerido comidas importantes en las 2 h previas.

Se solicita a los sujetos que respiren de forma tranquila a través de la válvula adosada al equipo condensador y empleando pinzas nasales.

Se indicará que continúen con la recolección hasta alcanzar un volumen exhalado acumulado de 1�0 l (medido en la rama espiratoria de la válvula, asumiendo una temperatura de 10 °C) o tras un periodo de 1�-20 min.

Empleando un equipo EcoScreen®, se estima que se obtendrán aproximadamente 3 ml de CE siguiendo las recomendaciones previas.

Es importante estimular al paciente en mantener una ventilación/minuto estable y a un ritmo reposado (aprox. 6-8 l/min).

Antes de comenzar con el procedimiento es importante que el sujeto beba agua y expulse flemas y mucosidades nasales para evitar la contaminación del CE.

Durante la recolección, se indicará al sujeto que puede desconectarse en cualquier momento y la cantidad de veces que desee para sentirse confortable. Además, se indicará que es obligatorio que se desconecte de la boquilla siempre que tenga que tragar saliva, toser, estornudar, eructar o hablar.

Condensado exhalado

��

Inmediatamente después continuará con normalidad, hasta alcanzar los 1�0 l de volumen espirado acumulativo o transcurridos 1�-20 min de recolección efectiva.

7. PUNTOS CLAVE

Tabla I Puntos clave

Antes de la recolección Durante la recolección Después de la recolección

Realizar antes de cualquier otra prueba respiratoria

Sentado cómodamente Colocar pinzas nasales

Mantener estrictamente la cadena de frío

Apuntar la medicación habitual y la hora de la última adminis-tración

Respirar tranquilo a volumen corriente evitando toser, hiperventilar o suspirar

Colocar el CE en alícuotas siguiendo estrictamente los volúmenes requeridos utilizando una pipeta bien calibrada

No haber realizado un esfuerzo físico ni comidas importantes en las 2 h previas (no excluyente)

Desconectarse cuantas veces quiera para toser, tragar saliva, eructar, estornudar, hablar, etc.

Completar el formulario

No haber fumado en las 2 h previas (no excluyente)

Monitorizar tiempo total (T), volumen total (V), volumen corriente (VT), ventilación/minuto (VE) y frecuencia. respiratoria (FR)

Identificar las alícuotas

Limpiar flemas nasales y expectorar. Enjuagar la boca y beber agua

Insistir en mantener: VE ~ 6-8 l/min FR ~ 10-1� resp/min

Almacenar las alícuotas a −80°C

Iniciar la recolección tras varios minutos de reposo (10-20 min)

Continuar hasta alcanzar 1�0 l de volumen espirado acumulativo medido en la rama espiratoria o 1�-20 min de recolección efectiva

Evitar en todo momento la posibilidad de contaminación por productos del propio sujeto o del responsable de la recolección (saliva, expectorado, etc.) o de otras fuentes externas

�6


8. FORMULARIO

Ejemplo de formulario de obtención de condensado exhalado:

Tabla II Formulario

Fecha: / / NUMID:

Temperatura ambiente: humedad: PB:

Medicación que ha recibido hoy:

1 .............................................2 .............................................3 .............................................4 .............................................

� .............................................6 .............................................7 .............................................8 .............................................

Diagnóstico: RECOLECCIÓN

Hora de inicio / Hora de finalización /

Utilizando el volumen espirado acumulativo registrar los parámetros ventilatorios a los:

10-20 l 50-60 l 90-100 l 140-150 lVolumen espirado acumulado (V)

Tiempo (T)

Volumen corriente (VT)

Ventilación/minuto (VE)

Frecuencia respiratoria (BF)

ALíCUOTAS

N.o Biomarcador Volumen Código1 CBA: 2.000 μl

2 8-isoprostano: 400 μl

3 H2O2: 200 μl

4

3.1.1 Dificultades o incidencias durante la recogida® No ® Sí (especificar). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Condensado exhalado

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Cualificación académica de Diplomado de Enfermería o Técnico de Laboratorio.Habilidad en el trato con enfermos.Conocimientos en manipulación de materiales biológicos. Responsabilidad, hábito de toma de decisiones, capacidad de resolver problemas

técnicos.Mínimo de 6 meses de entrenamiento en un centro reconocido.

Personal: cualificación y preparación4.4.

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1. INDICACIONES

En la actualidad el uso de esta metodología se halla restringido al ámbito de la investigación clínica o epidemiológica.

Se emplea fundamentalmente para la evaluación de biomarcadores representativos del proceso inflamatorio o el estrés oxidativo que afectan a las vías aéreas o inferio-res o el parénquima pulmonar.

Evaluación del compromiso inflamatorio o el estrés oxidativo que afectan a las vías aéreas superiores.

Eventualmente podría emplearse para valorar el impacto respiratorio de las enfer-medades de otros órganos o sistemas (enfermedad cardíaca, renal, hepática, neu-romuscular, etc.) aunque los conocimientos actuales en este terreno son muy limitados.

Valorar la respuesta terapéutica frente a diferentes fármacos o en ensayos clínicos farmacológicos.

2. CONTRAINDICACIONES

Al tratarse de una metodología completamente no invasiva e incruenta no se han descrito contraindicaciones.

Sin embargo, el uso de esta metodología no es aconsejable en situaciones de alteraciones de la conciencia o de incapacidad de mantener una respiración tranquila.

3. COMPLICACIONES

No se han descrito complicaciones en relación con esta metodología.

Indicaciones y complicaciones4.5.

Condensado exhalado

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Estandarización4.6.

Es de suma trascendencia que todos los procedimientos relacionados con la ob-tención y el análisis de biomarcadores en el condensado exhalado se encuentren muy bien estandarizados, de manera de reducir las potenciales fuentes de variabilidad y contribuir a una correcta interpretación de los resultados. A continuación se descri-ben los puntos clave de la estandarización.

1. Generalidades

recomendaciones análisis razonado y comentarios

Estandarización de la obtención de muestras, almacenamiento y análisis

Es altamente recomendado seguir un procedimiento muy bien estandarizado y uniforme durante todo el proceso de recolec-ción, almacenamiento y análisis del CE. Se recomienda identificar los potenciales elementos de confusión para poder controlar-los. Si usamos diferentes dispositivos dentro de un mismo estudio, debería efectuarse una evaluación comparativa para asegurar que diferencias de temperatura, colectores, método de limpieza de equipos, recolección de saliva, duración de recolección y otras características no provoca diferencias en los niveles de biomarcadores

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2. estandarización de la recolección: aspectos esenciales


Metodología: debe estar bien detallada y protocolizada

Debe ser lo suficientemente detallada como para poder asegurar que la técnica es reproducible

equipo: debe indicarse claramente el equipo utilizado para la recolección, incluyendo nombre, modelo, fabricante y especificar las modificaciones. El equipo debe venir acom-pañado de un manual detallado que permita la correcta utilización del mismo

En las condiciones actuales del conocimiento estos detalles son necesarios para ayudar a determinar qué factores pueden incidir de forma relevante para cada uno de los biomarcadores analizados. La mayoría de la información para los dispositivos comerciales está fácilmente disponible

Materiales: El protocolo debe detallar los materiales utilizados, en particular los que estarán en contacto directo con el CE

Esta información permitirá incrementar el conocimiento de los materiales óptimos para la determinación de los diferentes biomarca-dores. Los biomarcadores pueden mostrar diferente tolerancia y estabilidad a los materiales de que están compuestos los condensadores. Los materiales en sí mismos, o los productos que se utilizan para su limpieza, pueden contaminar la muestra. Es conveniente que esto sea investigado para cada biomarcador

temperatura: especificar la temperatura de funcionamiento del equipo y el rango

Sigue siendo confuso para muchos biomarca-dores cuál es la temperatura óptima de su recolección. Se presume que la recolección en frío es mejor para los mediadores más inestables, aunque, por otra parte, esto no ha sido demostrado fehacientemente y no es necesariamente correcto. La temperatura de recolección debe ser registrada al inicio de la misma

trampa de saliva: recomendado La contaminación masiva por saliva, cierta-mente, es muy infrecuente. Algunos sujetos presentan una salivación profusa. Una forma clara de prevenir esta contaminación de la muestra es un sistema de recolección que impida la mezcla de fluidos

duración del muestreo: la duración de la recolección debe ser registrada

El volumen de la muestra, la ventilación/minuto y la duración de la recolección son tres valores interrelacionados que deben estar bien estandarizados y registrados.

Condensado exhalado

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(Continuacuón)

Recomendaciones Análisis razonado y comentarios

El volumen de la muestra es difícil de medir durante la recolección en la mayoría de sistemas. La ventilación/minuto durante la recolección puede ser fácilmente medida, así como la duración de la recolección. Si bien se cree que la concentración de la mayoría de los biomarcadores es independiente de estos tres valores, es preciso que la posible influencia de estos factores sea establecido para un estudio/marcador en particular

Pinzas nasales: probablemente deban ser empleadas durante la recolección del CE

Existen dos razones para la utilización de pinzas nasales: la primera es minimizar la cantidad de fluidos nasales que penetren en la muestra durante la inhalación; la segunda es mantener todo el aire exhalado en la boca y no en la nariz. La contaminación nasal es notablemente diferente que para el NO exhalado, en el cual ocurre durante manio-bras de exhalación única. La principal razón para no usar la pinza nasal es la incomodidad

Contaminación: probar todos los materiales que entran en contacto con el CE y contar con los controles necesarios en cada sitio en que se realice la recolección del CE

Los óxidos de nitrógeno (NOx) son contami-nantes habituales de superficie en los laboratorios, y es necesario mantener rigurosos métodos para evitar la contamina-ción del equipo de recolección, pipetas o tubos de almacenamiento. Algunos tubos generan pérdidas de NOx, por lo que es recomendable el análisis tan pronto como sea posible después de la recolección. El pH o la concentración de solutos (conductividad) del CE pueden alterarse por contaminación. Debe evaluarse y evitarse las posibles vías de contaminación

Almacenamiento: a menos que se demues-tre innecesario, almacenar las muestras a la menor temperatura posible

Esto parece una precaución razonable, pues es probable que la congelación no altere los niveles en los biomarcadores en CE

Estabilidad: la estabilidad de un biomarca-dor en una muestra almacenada de CE debería ser conocida. Pueden realizarse pruebas específicas o considerar datos en publicacio nes que reflejan la estabilidad de los marcadores específicos

La pérdida de biomarcadores por sobrepasar el tiempo de almacenamiento o incluso un breve retraso pueden ocasionar errores del tipo II, y puede ser una causa de las amplias gamas de valores observados para un biomarcador entre publicaciones

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3. estandarización del análisis: aspectos esenciales


estabilización de los marcadores: esto puede ser realizado siempre que sea posible

Añadir una proteína libre de biomarcador a una muestra de CE puede incrementar la concentración o disminuir la pérdida de un biomarcador inestable. También puede permitir retrasar el análisis. Debe determinar-se el mejor sistema para cada biomarcador de forma independiente

análisis: en todos los casos se deben utilizar sistemas de análisis suficientemente sensibles y específicos

La sensibilidad y la especificidad de los métodos analíticos son de suma importancia cuando hablamos del CE. Se considera que probablemente la mayor parte de la variabili-dad objetivada entre los estudios está basada en las dificultades con los análisis

Momento de análisis: los análisis deben ser realizados lo más pronto posible para evitar la pérdida de biomarcadores o contaminación con agentes exógenos

Esta es una precaución razonable, ya que existen muchos marcadores que no son estables. Sin embargo, esta precaución debe equilibrarse con la necesidad de mantener la factibilidad del diseño del estudio. De todas formas, el efecto del tiempo de almacenamien-to (tiempo que pasa hasta su análisis) sobre el biomarcador de interés debe ser determinado

Validación: los sistemas de análisis deben probar su utilidad en el CE

La mayoría de los sistemas de análisis empleados no han sido diseñados para su uso en CE. El CE es un fluido muy diluido, pobre en proteínas y tampones (buffers)

inmunoanálisis: debe asegurarse que no se produzcan uniones inespecíficas y que se han realizado los controles adecuados en todos los casos

Los inmunoanálisis de CE pobre en proteínas pueden conducir a falsos valores elevados. Esto puede ser el resultado de inadecuado desbloqueo del inmunoanálisis debido al grado de dilución y acidez potencial del CE. Pruebas agregando de forma exógena pequeñas cantidades del biomarcador en el CE pueden ser útiles para asegurar la funcionalidad del análisis. Debe considerarse realizar curvas patrón en un medio acuoso en lugar proteico. También puede considerar-se la adición de proteína al CE. La concen-tración de las muestras de CE mediante liofilización y resuspensión a proporciones ≤ 1/10 del volumen inicial puede ser útil para analizar biomarcadores en el rango de confianza de los inmunoanálisis

Condensado exhalado

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(Continuacuón)


óxidos de nitrógeno: no se debe usar el término óxido de nitrógeno (NOx) sin especificar con exactitud lo que se está midiendo

Muchos trabajos que analizan NOx no son específicos para un componente. Los análisis pueden ser para nitritos, nitratos, nitrosothio-les, nitrotiroxina, NO y otros óxidos mayores del nitrógeno. El análisis por quimioluminis-cencia, después de reducción por varios métodos, proporciona suficiente sensibilidad para la mayor parte del NOx en CE no concentrado. Los tests por espectrometría son menos sensibles, y NOx están frecuente-mente en los límites de detectabilidad, especialmente los nitritos y los nitrosothioles. Conocer la contaminación de las superficies del laboratorio es muy importante

pH: debe especificarse si se ha desaireado la muestra de CE o, en caso contrario, debe especificarse el tiempo transcurrido desde la recolección hasta la medición

El análisis del pH en el CE ha sido analizado tanto en muestras no desaireadas como desaireadas. La medición del pH en muestras desaireadas es probablemente el método mejor validado. Seguramente, «desaireado» es un término poco apropiado; el mejor término sería «gas estandarizado», pero la completa sustitución del CO2 por el gas estandarizado no queda suficientemente claro. El pH medido en el CE «gas estandari-zado» no es una medida directa del pH del fluido de revestimiento de las vías aéreas, pero al parecer refleja la captura de ácidos volatilizados. El CO2 no es más volátil en fluidos con pH bajo y, por lo tanto, no interesa su contenido en el CE cuando se intenta identificar la acidificación de las vías aéreas. El pH del CE se verá sustancialmen-te afectado por el contenido de CO2 si no es extraído. Muchos investigadores consideran que el CO2 constituye una sustancial interferencia. Otros no lo consideran relevan-te y creen que el proceso de desaireación es innecesario

espectrometría y otros análisis: asegurar suficientes controles y que los análisis estén en el rango

Muchos análisis mediante espectrometría identifican biomarcadores a niveles cercanos a su límite de detección. A niveles cercanos a los límites de detección, en general, existe

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(Continuacuón)


una alta variabilidad. En realidad, la variabili-dad en los resultados analíticos en las muestras de CE depende más del sistema de análisis que de las variaciones en aspectos de recolección

dilución: hay que tomar con prudencia las conclusiones de la presencia de compuestos no volátiles en ausencia de un factor de corrección por el grado de dilución

Las sustancias no volátiles provienen de partículas aerosolizadas del fluido de revestimiento de las vías aéreas, o de modificaciones químicas que transforman una molécula volátil en una no volátil. Conside-rando que el fluido de revestimiento de las vías aéreas contenido en el CE se encuentra diluido en vapor de agua, hay que tener en cuenta un factor de dilución para determinar con seguridad la concentración absoluta en las vías aéreas. Se ha propuesto expresar los resultados de un biomarcador en proporción al contenido de proteína, urea o conductividad. Si bien la utilidad de estos factores de corrección de la dilución son prometedores, aún no han sido aplicados de forma extensiva. El análisis de componentes volátiles no se encontraría tan afectado por el grado de dilución. Hay que considerar la posibilidad de que un marcador volátil (como el NO) reaccione con la solución y se convierta en un no volátil (nitrato)

nuevos biomarcadores: considerar de forma escéptica la sensibilidad y especifici-dad de los sistemas de medición de nuevos biomarcadores. Determinar la posibilidad de contaminación

En todos los casos, cuidadosas investigacio-nes científicas deben ser emprendidas para los nuevos (y los viejos) biomarcadores identificados en CE

(Adaptado de: Eur Respir J 2005;26:523-48).

Condensado exhalado

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1. MANTENIMIENTO

Se realizará de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

2. LIMPIEzA

Las partes expuestas a la respiración del paciente deben poder lavarse con agua y jabón y esterilizarse con métodos físicos o químicos.

Es importante realizar un aclarado final con agua destilada de todos los compo-nentes que están en contacto con el CE para evitar la contaminación con solutos, en particular cuando se considere medir la concentración de solutos por conductividad para estimar el grado de dilución.

A ser posible, las boquillas serán desechables.Los codos, boquillas de plástico, condensadores y recipientes de recolección de-

berán lavarse con agua y jabón neutro. El aclarado debe realizarse con agua desti-lada abundante. Para evitar contaminación será muy importante que todos los com-ponentes del equipo estén completamente secos antes de su utilización. Cualquier resto acuoso procedente de su limpieza supondría una grave interferencia en análisis posteriores.

La parte del aparato más pesada se limpiará con un trapo húmedo, utilizándose jabón sólo si fuera preciso. Se ha de tener en cuenta que la acumulación de hielo en la cavi-dad donde se inserta el condensador lamelar (Ecovent®) puede dificultar la correcta manipulación de los componentes del mismo, pudiendo provocar daños en el equipo, por lo que será preciso mantenerlo limpio y seco después de cada exploración.

Mantenimiento y limpieza de equipos4.7.

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El consenso internacional en lengua inglesa recomienda el uso del término exha-led breath condensate (EBC). Dado que partículas provenientes de las vías aéreas del exhalado pueden analizarse mediante otras técnicas, el término EBC se refiere exclusivamente a las muestras obtenidas mediante enfriamiento del exhalado.

En lengua castellana, se han empleado términos como «condensado del aire ex-halado» (CAE) o «condensado del exhalado respiratorio» (CER), entre otros.

Los autores del presente manual de procedimientos preferimos el término «con-densado exhalado» (CE) por su mayor simplicidad.

Símbolos y unidades de medida4.8.

Condensado exhalado

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BIBLIOGRAFíA

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8. Effros RM, Hoagland KW, Bosbous M, et al. Dilution of respiratory solutes in exhaled condensates. Am J Respir Crit Care Med 2002;16�:663-9.

C1

"

Preguntas de formación continuada

CUESTIONARIO

1. ¿En cuál de las siguientes observaciones ha demostrado mayor utilidad la determinación del NO en el aire espirado?a. Diagnóstico de asma.b. Evaluar el cumplimiento terapéutico en el asma.c. Diagnóstico diferencial entre asma y EPOC.d. Monitorización de la evolución de la fibrosis pulmonar.e. Marcar la gravedad de la inflamación bronquial.

2. Los sensores más habitualmente utilizados para determinar la concentración de NO en el aire espirado son del tipo:a. Espectrotelemetría.b. Electroquímicos.c. Quimioluminiscencia.d. Difracción de rayos γ.e. Solución en ClNa.

3. El flujo del aire espirado para determinar la concentración de NO debe ser de:a. < 1 ml/s.b. 10 ml/s.c. 20 ml/s.d. 40 ml/s.e. �0 ml/s.

4. La concentración de NO en el aire espirado se expresa en:a. mg/ml.b. ng.c. Partes por millón (ppm).d. Partes por billón (ppb).e. Unidades γ.

5. Los equipos portátiles para determinar el NO espirado (sensores electroquímicos) requieren realizar ....... determinaciones para comprobar su correcta medición:a. 1.b. 2.c. 3.d. 4.e. �.

6. En un paciente asmático, el examen del esputo inducido nos permite:a. Diferenciar el tipo de inflamación.b. Ajustar la dosis de corticoides.

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"

c. Valorar la existencia de reflujo esofágico.d. Todas las anteriores.e. Ninguna de las anteriores.

7. ¿Cuál es el tipo de nebulizador «ideal» para realizar el procedimiento de obtención de esputo?a. Ultrasónico.b. Tipo jet.c. Tipo Venturi.d. Con bombona de oxígeno.e. De fina gota.

8. Una de las siguientes expresiones no es adecuada para el recuento celular del esputo in-ducido. ¿Cuál?a. Contar todas las células presentes en cada cuadro.b. Clasificar las células en «viables» o «no viables».c. Restar las células escamosas contaminantes.d. Establecer las proporciones celulares en función de las células totales.e. Presentar datos aproximados.

9. La interpretación de los resultados del recuento celular en el esputo inducido requiere tener en cuenta:a. La viabilidad celular.b. El grado de degeneración celular.c. El grado de contaminación por células escamosas.d. Un recuento adecuado.e. Todos los anteriores.

10. ¿Cómo debemos indicarle al paciente que respire para obtener una buena muestra (canti-dad/calidad)?a. Cualquier paciente en 20 min produce una buena muestra.b. Tiene que conseguir un gran volumen (> 180 l, respirando rápido y profundo).c. Respiraciones superficiales y rápidas para obtener sólo una muestra representativa de

las vías aéreas altas.d. Le indicaremos que respire de forma tranquila, manteniendo una ventilación/minuto es-

table y a un ritmo entre 6-8 l/min.

11. ¿Cómo debe prepararse al paciente para la prueba?a. No necesita ninguna preparación ya que la prueba es muy sencilla.b. Debe recomendarse que se lave los dientes antes de la visita y enjuagarse la boca con

suero salino isotónico para no contaminar la muestra.c. El sujeto debe hacer gárgaras con agua, expulsar flemas, sonarse la nariz, y beber un

poco de agua.d. Debe tragar saliva, toser y estornudar (si precisa) y hablar todo lo que tenga que decir

hasta el final de la prueba.

12. ¿Cuál sería la primera prueba a realizar por un paciente en la misma jornada: espirometría, 6 min de marcha o CE?a. La prueba de 6 min de marcha, porque, depende de los metros recorridos, procederemos

o no a realizar el CE (por debajo de 200 m está contraindicado).

Preguntas de auto-evaluación

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b. El CE, para no irritar la vía aérea y mantenerla «intacta» para la prueba.c. Da lo mismo, lo importante es que el paciente descanse entre prueba y prueba.d. La espirometría, para saber el grado de gravedad del paciente y qué enfermedad tiene,

y así utilizar la muestra para analizar sólo los marcadores más útiles.

13. ¿Dónde conservaremos la muestra una vez obtenida?a. Generalmente la repartiremos en alícuotas de polipropileno de aproximadamente 1 ml y la

guardaremos rápidamente en un congelador de –80 °C hasta el momento de su análisis.b. La podemos conservar en nevera 4-8 °C repartida en tubos de polipropileno de 1 ml

hasta su posterior análisis.c. Por norma, se podrá guardar a temperatura ambiente, y únicamente la muestra de los

pacientes asmáticos se guardará en nevera para conservar el nivel de 8-isoprostano.d. La llevaremos, dentro de las siguientes 24 h, al laboratorio de referencia para su aná-

lisis inmediato, dentro del recipiente recolector del equipo, tapado con biofilm preser-vado de la luz.

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Provenza, 108, bjos. 2.a

080029 Barcelona – EspañaTel.: 934 878 565Fax: 934 878 509

E-mail: [email protected]

SOCIEDAD ESPAÑOLADE NEUMOLOGIAY CIRUGIA TORACICA(SEPAR)

Para obtener la acreditación deben enviar el cuestionario contestado a la siguiente dirección:

Provenza, 108 bjos. 2.a 08029 Barcelona - España Tel.: 934 878 565Fax: 934 107 120E-mail: [email protected]

manual de procedimientos separ, 11

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