manual de laboratorio micro gral

PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO

Cdigo de control: AMB-TE-IAM 305 - 06

Rev. 1 Laboratorio Ambiental Hoja 1 de 5

Asignatura: Microbiologa Ambiental

Revisa: Responsable del laboratorio

Aprueba: Representante de la direccin

Documento ORIGINAL controlado. No fotocopiar en color

Realiz: Dra. Ma. Lorena Luna Guevara

1. OBJETIVO: Conocer el procedimiento para la preparacin de los distintos medios de cultivos para el aislamiento e identificacin de microorganismos cepas. 2. INTRODUCCIN: Un medio de cultivo es un sustrato que proporciona los nutrientes necesarios para el desarrollo del microorganismo a probar. Los microorganismos presentan grandes diferencias en sus requerimientos nutricionales que son reflejo de la extrema diversidad bioqumica y fisiolgica. El agua, sales inorgnicas, fuentes de carbono y fuentes de nitrgeno, metales son necesarios para todos. Existen bacterias que requieren la presencia de determinado nutriente, sin el cual no pueden desarrollarse, este nutriente se denomina: FACTOR DE CRECIMIENTO y las bacterias que necesitan de ellos se llaman: Auxtrofo. Los medios de cultivo pueden ser: lquidos, semislidos y slidos, los lquidos son aquellos medios que carecen de material gelificante. En la microbiologa el material gelificante es el agar qumicamente es un polisacrido obtenido a partir de algas marinas presentando entre sus ventajas que la mayora de los microorganismos no lo utilizan como nutrientes. La presencia y cantidad de ste permite diferenciar los medios semislidos que presentan una concentracin de 0.5 1% de los slidos con una concentracin mayor del 2 % (se emplean los trminos slido y semislido pero recordemos que se tratan de geles). Dependiendo de su composicin y su empleo pueden ser: diferenciales, selectivos, de transporte, enriquecidos. etc.








Los medios de cultivo en microbiologa se fabrican o bien en forma de polvo o bien en forma granulada ambas presentaciones son higroscpicas por lo que deben mantenerse en lugares cerrados y ambiente secos. 3. MATERIAL:

10 cajas de petri estriles 1 matraz erlenmeyer pipetas mechero autoclave.

4. PROCEDIMIENTO: Las formas de preparacin vienen indicadas en cada etiqueta y dependen del fabricante. Se recomienda la siguiente tcnica

1. Utilizar un recipiente de volumen 2.5 veces mayor al que se prepara 2. Se agrega aproximadamente la mitad del agua total al medio y se deja reposar unos

15 minutos. 3. Si es necesario calentar, el calentamiento debe ser paulatino y agitando

continuamente, evitar el calentamiento prolongado. ESTERILIZACIN:

1. Autoclave durante 15 min a 121 C ( 15 lbs) 2. Deben incluirse controladores de autoclave. 3. No introducir en la autoclave ingredientes termolbiles p.e las soluciones de

carbohidratos, que deben esterilizarse por filtracin. CONTROL DE ESTERILIDAD: Medios preparados (en tubo, matraces en placa) deben ser sometidos a prueba de esterilidad (antes de usarse) incubando de 18 24 horas a temperaturas de 37 C si observamos crecimiento deseche el material.








Ejemplo de Preparacin de los medios de cultivo: AGAR PAPA DEXTROSA Tabla 1: Frmula aproximada para 1000 ml de agua purificada. Infusin de papa (slidos) 4.0 g Dextrosa 20.0 g Agar 15.0 g pH final 5.6 0.2 Mtodo de preparacin: Suspender 39 gramos del polvo en un litro de agua purificada. Mezclar perfectamente, calentar con agitacin frecuente y hervir durante un minuto hasta disolucin completa. Distribuir y esterilizar a 121C por 15 minutos. AGAR NUTRITIVO Tabla 2: Frmula aproximada para 1000 ml de agua purificada Peptona de gelatina 5.0 g Extracto de carne 3.0 g Agar 15.0 g pH final 6.8 0.2

Mtodo de preparacin: Suspender 23 gramos de polvo en un litro de agua purificada. Mezclar perfectamente, calentar con agitacin frecuente y hervir durante 1 a 2 minutos hasta disolucin. Esterilizar a 121 C durante 15 minutos.








AGAR MAC CONKEY Tabla 3: Frmula aproximada para 1000 ml de agua purificada. Peptona de casena 1.5 g Peptona de gelatina 17.0 g Peptona de carne 1.5 g Lactosa 10.0 g Sales biliares 1.5 g Cloruro de sodio 5.0 g Agar 13.5 g Rojo neutro 0.03 g Cristal violeta 0.001 g pH final 7.1 0.2 Mtodo de preparacin: Suspender 50 gramos del medio en un litro de agua purificada. Mezclar bien hasta que se obtenga una suspensin uniforme. Dejar reposar de 10 a 15 minutos. Calentar suavemente agitando frecuentemente y hervir durante 1 minuto. Esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos.

5. CUESTIONARIO: 1.- Diga usted que entiende por: esterilidad, sptico y antisptico. 2.- Mencione 3 mtodos de esterilizacin. 3.- Defina es un medio enriquecido, selectivo y diferencial. 4.- Por qu se utilizan algodn para tapones? 5.- Qu ventajas presenta el agar?








6.- A quin se debe el empleo del agar en laboratorios? 7.- Qu alteraciones se presenta en los medios por exceso de esterilizacin? 8.- Qu otros mtodos conoce para el control en la esterilidad por autoclave? 6. BIBLIOGRAFA: Zinsser 1994, Microbiologa. Ed. Panameriacana. Veinteaba edicin. Tortora G., J.,2007, Introduccin a la Microbiologa, Ed Mdica Panamricana. Manual de Medios de Cultivo. Bioxon 7. CAMBIOS

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Nivel de revisin Fecha de la emisin Razn de cambio

1 13 Oct. 2011 Generacin de documento

AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS








1. OBJETIVOS:

Desarrollar y practicar el mtodo de aislamiento por estra cruzada. Aprender a leer la morfologa colonial.

INTRODUCCIN: El cultivo de m.o. son los medios a travs de los cuales en forma intencional se obtiene

crecimiento en los llamados medios de cultivo. Si el cultivo tiene un solo tipo de m.o. se

denomina cultivo puro o axnico, cuando encontramos ms de un tipo de m.o. se denomina

cultivo mixto.

El proceso mediante cual se separan los m.o. se denomina aislamiento y el m.o. separado

aislado.

La forma de sembrar la muestra depende del tipo de medio de cultivo.

a) Medio lquido; la inoculacin se efecta con el asa, pipeta o hisopo.

b) Medio slido; sea en caja o en forma inclinada, la forma de inoculacin se efecta por

estra picadura.

c) Agar semislido; se inocula por picadura, esto se hace generalmente con asa recta.

2. PROCEDIMIENTO I.- Aislamiento por el mtodo de estra. 1) Flamee el asa bacteriolgica hasta llevarla al rojo vivo. 2) Deje enfriar el asa.








3) Tome una gota de cultivo. 4) Siga los esquemas proporcionados: Hay que tener en cuenta las siguientes precauciones para el esquema de estra cruzada. a).-Marcar las cajas antes de empezar a trabajar y no hablar durante el proceso para evitar contaminacin. b).- Flamear el asa antes de cada serie de estras y enfriarla en una orilla de la placa. c).- Con la ltima serie de estras no volver a tocar la primera serie de estras. (Fig. 1 y Fig.2)

Fig. 1. Secuencia para la tcnica de aislamiento por estra cruzada.








Fig. 2. Tipos de aislamientos 3. CUESTIONARIO 1.- Cual es la importancia de un buen aislamiento? 2.- Menciona dos tipos de aislamiento aparte de la estra cruzada 3.-Cul es la coloracin de las colonias aisladas y a que se debe? 4. BILBLIOGRAFA

Prescott. L. M., Harley, 1999, Microbiologa. Cuarta Edicin. Graw Hill. Interamericana, Mxico.

Zinsser 1994, Microbiologa. Ed. Panameriacana. Veinteaba edicin.








5. CAMBIOS

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OBSERVACIN DE MICROORGANISMOS DEL

AMBIENTE








1. OBJETIVOS:

Poner en evidencia la presencia de los microorganismos existentes en el ambiente. Aprender a diferenciar los tipos de morfologas colonial obtenidas en muestras de

ambiente. INTRODUCCIN Los microorganismos se encuentran presentes en todos los ambientes: en el aire, agua,

suelo, superficies e incluso sobre nuestra piel.

Especficamente el aire, adems de partculas en suspensin, es portador de bacterias en

forma vegetativa o esporuladas. La poblacin microbiana del aire est compuesta

principalmente por esporas de hongos, especialmente de hongos imperfectos Cladosporium

spp.y basidiosporas, por bacterias como Bacillus spp, Micrococcus spp. y Clostridium .

Existen distintos mtodos para el anlisis del aire: sedimentacin, filtracin y precipitacin

electrosttica, entre otros.

El mtodo de sedimentacin es uno de los ms sencillos para la determinacin de

microorganismos del aire. A pesar de ello, los resultados obtenidos son orientativos de las

cifras de microorganismos presentes en el aire, ya que estos niveles varan en funcin de las

corrientes de aire y del tamao de las partculas en suspensin.


AMBIENTE







2. MATERIALES. Mechero Cajas Petri con medios de cultivo:

Papa dextrosa, Mac Conkey Agar Nutritivo

3. PROCEDIMIENTO 1) Destapar las placas con agar Papa Dextrosa (PDA), Agar nutritivo y Agar Mac Conkey, en

un lugar cuyo nivel de contaminacin se desee examinar, durante diferentes intervalos de

tiempo: 30 minutos, 1 hora y 1 hora. Es decir se pondrn simultneamente las placas de

agares para observar sus diferencias con respecto a su selectividad. Tapar las placas de

Agar Nutritivo y Agar Mac Conkey e incubar durante 24-48 horas a 37 C. Mientras que las

placas de Agar Papa Dextrosa sern incubadas durante 5 das a 28C.

2) Sin lavarse las manos, un integrante del grupo, har una impresin con el dedo pulgar

sobre la superficie de una placa con agar nutritivo y con agar Agar Papa Dextrosa (PDA),

Agar nutritivo y Agar Mac Conkey. Las placas de Agar Nutritivo y Agar Mac Conkey e incubar

durante 24-48 horas a 37 C. Mientras que las placas de Agar Papa Dextrosa sern

incubadas durante 5 das a 28C.

3) En otra placa con agar nutritivo colocar un cabello incubar durante 24 horas a 37 C 4) Leer las morfologas utilizando la hoja de reporte.


AMBIENTE







Tabla 1: Reporte de Morfologa Colonial.

Colonia 1 Colonia 2 Colonia 3 1.-Tamao (mm.). 2.- Color. 3.- Forma; puntiforme. circular. irregular. 4.- Elevacin: Plana Elevada Convexa Pulvinada Umbonada 5.- Superficie: Lisa Rugosa 6.- Aspecto:

hmedo. seco. 7.- Bordes: enteros. irregulares. filamentosos. 8.- Luz reflejada: brillante. mate. 9.-Luz transmitida: opaca. traslcida. transparente. 10.- Consistencia: suave: butirosa suave: mucoide suave: friable Dura


AMBIENTE







Fig. 1 Forma y bordes 4. CUESTIONARIO 1.- Por qu es importante leer la morfologa colonial? 2.- Qu tipo de microorganismos pueden ser aislados con el medio Papa Dextrosa? 3.- Qu tipo de microorganismos pueden ser aislados en los medios Agar Nutritivo y MacConkey?


AMBIENTE







5. BIBLIOGRAFA Daz, R.,Gamazo C., Lpez-Goi, I.. 1999. Manual Prctico de Microbiologa. Cap. 32: Cultivos de microorganismos del ambiente. 2 Ed. Editorial Masson S.A. Barcelona, Espaa. 151 pp.

6. CAMBIOS

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MICROSCOPIA







Realiz: Dra. Ma. Lorena Luna Guevara 1. OBJETIVOS:

Identificar las partes y funcionamiento de un microscopio. Conocer el cuidado, manejo y utilidad del microscopio.

2. INTRODUCCIN: Casi la totalidad de los organismos unicelulares son imperceptibles para el ojo humano y

para observarlos es esencial el microscopio. El uso de este dispositivo es indispensable en el

laboratorio de microbiologa para el estudio de la morfologa y estructura de los

microorganismos, as como su reaccin a diferentes colorantes, lo cual junto con otros

criterios, permitir su identificacin, por lo tanto, es importante conocer su adecuado manejo.

Adems de la ampliacin de la imagen hay que tener en cuenta dos factores ms: el

contraste y la resolucin. Los objetos deben poseer cierto grado de contraste con su medio

circundante para poder ser percibidos a travs del microscopio. Por otra parte, el grado de

resolucin depende de las caractersticas del sistema de lentes que posea el microscopio.

Este se encuentra limitado por la longitud de onda de la luz emitida, el ndice de refraccin

del medio en el que se realiza la visualizacin y la apertura numrica del objetivo.

PARTES DEL MICROSCOPIO

El microscopio compuesto es aquel que dispone de dos o ms lentes de aumento. Un

microscopio se divide en dos partes: el soporte y el sistema ptico (Fig 4)

MICROSCOPIA







1) Soporte. Es la pieza fija en la que slo la platina y el condensador tienen un cierto movimiento. Sus principales partes son:

a) Base. Normalmente alberga la fuente de iluminacin, en determinados modelos incorpora adems, un sistema portafiltros con varios filtros y un diafragma de campo luminoso.

b) Brazo. Soporta todo el sistema ptico, el cabezal porta oculares y el revlver porta objetivos. En l se dispone tambin un sistema de anclaje de la platina (movimiento de

enfocado de la preparacin).

c) Platina. Es la pieza donde se coloca la preparacin microscpica para su observacin.

d) El Macromtrico y el Micromtrico. Ambos permiten enfocar la preparacin. El primero se emplea para un enfoque rpido cuando se trabaja con objetivo de menor aumento (x10),

mientras que el segundo permite fijar el enfoque cuando se utilizan los objetivos de mayor

aumento (x40, x100).

2) Sistema ptico. Est formado por un cuerpo tubular donde se instalan las lentes: los oculares en un extremo y los objetivos en el extremo opuesto.

MICROSCOPIA







Fig. 1 Partes de un microscopio compuesto

MICROSCOPIA







3. MATERIAL

Microscopio ptico

4. PROCEDIMIENTO

1) Compruebe que las lentes del ocular y de los objetivos estn limpias: de no ser as, lmpielas cuidadosamente con papel especial para ptica. No tocar las lentes con los dedos.

2) Coloque la preparacin (sin cubreobjetos y con la muestra en la parte superior) sobre la platina sujetndola con el dispositivo mvil. Compruebe previamente, que el objetivo de menor aumento est en posicin de empleo.

3) Ajuste los binoculares a la distancia interpupilar y ajuste el foco de cada ocular si el microscopio lo permite.

4) Coloque el objetivo de 10 aumentos (10 x) y enfocar: a) Acerque al mximo la lente del objetivo a la preparacin, empleando para ello el macro mtrico. No realizar dicha operacin mirando por el ocular, pues correra el riesgo de clavar el objetivo en la preparacin con el consiguiente destrozo de ambos. b) Enfoque con el micromtrico observando por el ocular hasta obtener un enfoque ntido

5) Pase al objetivo de 40 aumentos (40 x )Suba ligeramente el condensador. La imagen debe estar casi enfocada, afine el foco con el micromtrico. Si la imagen no est ni medianamente enfocada, es preferible volver a un enfoque con el objetivo de 10 x. El objetivo de 40 x trabaja muy cerca de la preparacin y por ello es susceptible de dos tipos de accidentes: ser clavado en la preparacin y resultar manchado con aceite de inmersin si se observa la preparacin ya usada con ste ltimo.

6) Empleo del objetivo de inmersin:

MICROSCOPIA







a) Gire el revlver hacia el objetivo de inmersin dejndolo a medio camino entre ste y el objetivo de 40 x. b) Coloque una gota de aceite de inmersin sobre el punto de la luz. c) Termine de girar el revlver hasta la posicin del objeto de inmersin, asegurndose de que ste no toca la preparacin, pero s la gota de aceite.

d) Enfoque cuidadosamente con el micromtrico. Recuerde que la distancia entre el objetivo y la preparacin es mnima. e) Una vez que ya ha puesto aceite de inmersin sobre la preparacin ya no puede volverse a colocar los objetivos de 10 x y de 40 x sobre ese campo. Por lo tanto, si desea enfocar otro campo, debe retirar el objetivo de inmersin girando el revlver hacia el objetivo de menor aumento (x10), seleccionando otro campo y empezando a enfocar desde ste ltimo. f) Finalizada la observacin de una preparacin, y antes de retirarla de la platina, se colocar el objetivo de menor aumento girando el revlver en el sentido hacia la lupa. Nunca retire la preparacin con el objetivo de inmersin en posicin de observacin. g) Retire la preparacin y limpie el objetivo de inmersin cuidadosamente con un papel especial para ptica. Compruebe tambin que el objetivo de 40 x est limpio.

5. RESULTADOS Siguiendo las indicaciones para el manejo del microscopio: a) Observar un examen en fresco de microorganismos b) Observar preparaciones coloreadas suministradas por la ctedra.

MICROSCOPIA







2) Dibujar lo observado

Examen en Fresco Preparacin Colorea

6. CUESTIONARIO:

1.- Menciona tres tipos de tinciones diferenciales a parte de la T. de Gram 2.- Cul es la funcin del aceite de Inmersin? 3.- Menciona otros dos tipos de microscopios a parte del Optico para la observacin de bacterias e incluso virus:

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7. BIBLIOGRAFA

Manacorda M. A., Manual de Prcticas de Microbiologa General, Unidad Acadmica: E.S.S.A.

8. CAMBIOS

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TCNICA DE TINCIN DE GRAM








1. OBJETIVO: Conocer y manejar la tcnica de tincin de Gram de acuerdo con la estructura celular de las bacterias Gram (+) y Gram (-). 2. INTRODUCCIN: La mayora de los microorganismos son incoloros y presentan poco contraste cuando se

observan directamente al microscopio. Cuando los microorganismos son teidos antes de

observarlos, aumenta grandemente el contraste de las clulas y su medio.

Antes de teir es necesario hacer un frote y fijarlo. Un frote es una delgada capa de clulas

que cubre un rea de un portaobjetos, este frote debe ser secado al aire y fijado por calor o

qumicamente por alcohol. La fijacin se da como resultado de la coagulacin del

protoplasma y adherencia al portaobjetos. As los frotes no fijados son lavados en el

proceso de tincin.

Son varias las tcnicas usadas en microbiologa para la observacin de los microorganismos:

simple (directa), diferencial, tincin de estructuras, negativas y tincin de material de reserva.

La tincin ms usada en microbiologa es la de Gram y se considera una tincin diferencial.

Los microorganismos difieren entre s desde el punto de vista qumico y fsico por lo que

reaccionan de manera diferente a los colorantes. Las tinciones diferenciales ocupan dos

colorantes: el primero (cristal violeta) y uno de contraste (safranina) y clasifica a los m.o.

segn su capacidad de retener el colorante primario Gram (+) el colorante de contraste

secundario Gram (-).








3. MATERIAL:

Cepas ( proporcionadas por el profesor) Mechero Bunsen. Portaobjetos. Cubreobjetos. Microscopio.

REACTIVOS: Cristal violeta. Lugol. Alcohol- Acetona. Safranina. PREPARACION DE REACTIVOS CRISTAL VIOLETA 1 gr cristal violeta 100 mL alcohol LUGOL 2 gr KI + 1 gr I metlico 300 mL alcohol ALCOHOL CETONA 80 ml alcohol + 20 cetona SAFRANINA 1 gr safranina 100mL alcohol








4. PROCEDIMIENTO: I) Tcnica de tincin de Gram.

1.- Hacer un frotis de cada uno de los m.o. y dejarlos secar al aire.

2.- Fijar los brotes al calor.

3.- Cubrir los frotis con cristal violeta y dejarlos actuar durante un minuto. Escurrir el colorante

y lavar con chorro suave de agua corriente.

4.- Cubrir los frotis con lugol, dejarlos un minuto, escurrir y lavar.

5.- Decolora con alcohol-cetona (proporcin de 50% cada uno) de 5-30 seg. escurrir y lavar

con chorro suave de agua corriente.

6.- Cubrir los frotis con safranina y dejarla durante 10 seg. escurrir y lavar con chorro suave

de agua corriente.

7.- Dejar secar al aire.

8.- Observar los frotis con el objetivo de inmersin.

9.- Hacer anotaciones y dibujos a colores de las observaciones que efecte.

II) Observacin de la tcnica de Gram en cada uno de sus pasos.

1.- Hacer 4 frotis con las cepas proporcionadas y fijarlos al calor.

2.- Teir los frotes segn la tcnica de Gram, detenindose en cada uno de los pasos

importantes, de tal manera que tenga un frotis teido hasta el paso 3, 4, 5, 6.

3.- Examinar a inmersin cada uno de los frotis

III) Haga los esquemas a colores de cada una de las preparaciones observadas.








IV) Llene la siguiente tabla: Reactivo. Morfologa. Color observado.

Cristal Violeta.

Lugol.

Alcohol -acetona.

Safranina.

5. CUESTIONARIO 1.- Qu importancia tiene la tcnica de Gram? 2.- Escribe 4 ejemplos de bacterias Gram (+) y 4 Gram (-).

3- Cite tres razones por lo cual los microorganismos deben teirse.

4.- Porqu las bacterias Gram (-) se tien rojas y las Gram positivas azules? 6. BIBLIOGRAFA:










7. CAMBIOS

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PRUEBAS BIOQUMICAS








1. OBJETIVOS

Sembrar, leer e interpretar algunas pruebas bioqumicas tiles en la identificacin de bacterias bacilares Gram negativas.

Identificar el gnero y especie de la cepa problema.

2. INTRODUCCIN Las pruebas bioqumicas se basan en la determinacin de la presencia o ausencia de

diferentes enzimas codificadas por el material gentico del cromosoma bacteriano. Estas

enzimas (catalasa, coagulasas, descarboxilasas, deaminasas, ureasas, peroxidasas, etc.)

involucradas en el metabolismo bacteriano pueden ser evidenciadas en medios de cultivo

especiales que contienen los substratos (hidratos de carbono, aminocidos, etc.) sobre los

cuales ellas actan, junto con un sistema indicador que va a poner de manifiesto la

degradacin del substrato o la presencia de un metabolito especfico (cido frmico, cido

lctico, cido succnico, indol, etc.).

Las pruebas bioqumicas tambin evalan la capacidad de reducir ciertos iones (ferroso a

frrico), la presencia o ausencia de flagelos (prueba de movilidad), la produccin o no de

hemolisinas, el requerimiento de algunos factores especiales (protenas), la produccin de

algunas toxinas con capacidad virulenta (toxina diftrica, toxina botulnica, etc.).

3. MATERIAL

Cepas bacterianas (Propuestas por el profesor) Agar TSI (triple azcar hierro) Agar LIA (lisina hierro agar)

PRUEBAS BIOQUMICAS







Agar UREA Agar CITARTO DE SIMMONS Caldo MR- VP Agar MIO

4. PROCEDIMIENTO a) Siembra: Sembrar la cepa problema en toda la bacteria disponible de acuerdo a la siguiente instruccin:

1. AGAR TSI:

Siembra: Estra en superficie y la picadura central hasta el fondo del tubo. Fundamento: En TSI se determina la capacidad de un microorganismo para utilizar los hidratos de carbono GLUCOSA, LACTOSA y/o SACAROSA, con produccin o no de gases (CO 2 , H 2 ) junto con la produccin o de cido sulf (H 2 S).

Interpretacin: La lectura se efecta despus de 18 a 24 horas de incubacin a 37 C. Se lee una fraccin, la reaccin ocurrida en la superficie del medio corresponde al numerador (parte aerobia) y la reaccin ocurrida en la profundidad del medio corresponde al denominador (parte anaerobia). La acidez se denomina con la letra A (color amarillo) y la alcalinidad con la letra K (color rojo). En este medio se leen las siguientes reacciones bioqumicas: Fermentacin de la glucosa (K/A), fermentacin de la glucosa, lactosa y/o sacarosa (A/A). No fermentacin de los carbohidratos (K/K), la bacteria no utiliza los hidratos de carbono, produciendo aminas que alcalinizan el fondo y la superficie del medio. Algunas bacterias no fermentadoras solamente atacan la peptona aerbicamente dando un TSI: K/N, es decir no hay cambio en el fondo del tubo, Produccin de gas: ruptura del medio, Produccin de H 2 S ennegrecimiento del medio. El agar TSI contiene tres azcares: glucosa (1g/L), lactosa (10g/L), sacarosa (10g/L).

PRUEBAS BIOQUMICAS







Como indicador de pH tiene Rojo de Fenol el cual vira de color amarillo en presencia de acidez y al color rojo en presencia de alcalinidad. Tiene como fuente de azufre el TIOSULFATO DE SODIO, necesario para que las bacterias puedan producir H 2 S y como indicador de H 2 S SULFATO FERROSO el cual reacciona con el H 2 S produciendo un precitado negro e insoluble de sulfato ferroso.

2.- AGAR LIA:

Siembra: Doble picadura hasta el fondo del tubo y siembra en superficie. Fundamento: En agar LIA se determina la capacidad de un microorganismo para utilizar el aminocido Lisina descarboxilndolo o desaminndolo, la fermentacin de glucosa, la produccin o no de gases (CO 2 ), junto con la produccin o no de cido sulfhdrico (H 2 S). Se

efecta despus de 18 a 24 horas de incubacin (48 horas si es necesario) a 37C. Se lee la acidez misma que se denomina con la letra A (color amarillo) y la alcalinidad con la letra K (color prpura.) El indicador del pH del medio es PRPURA DE BROMOCRESOL, el cual en acidez vira al color amarillo y en alcalinidad al color prpura. Por contener pequea cantidad de Glucosa (1g/L) al ser fermentada al fondo del tubo es amarillo y la superficie alcalina. Interpretacin: En este medio se leen las siguientes reacciones bioqumicas:

a. Fermentacin de la glucosa (K/A), la bacteria no utiliza al aminocido solo fermenta la glucosa.

b. Descarboxilacin de lisina (K/K). c. Desaminacin de la lisina (R/A) rojo/amarillo. d. Produccin de gas: ruptura del medio. e. Produccin de H 2 S ennegrecimiento del medio.

3.- AGAR CITARTO DE SIMMONS:

Siembra: En superficie nicamente. Fundamento: En agar CITARTO DE SIMMONS se determina la capacidad de un microorganismo de emplear el citrato como nica fuente de carbono en ausencia de

PRUEBAS BIOQUMICAS







fermentacin de azcares o de produccin de cido lctico. Se efecta despus de 18 a 24 horas de incubacin (48 horas si es necesario) a 37C. Normalmente el metabolismo del citrato comprende una condensacin de acetilo con la coenzima A y oxalacetato para entrar en el ciclo de Krebs. El medio utilizado contiene tambin sales de amonio inorgnicas. Un organismo capaz de utilizar el citrato como nica fuente de carbono tambin es capaz de utilizar sales de amonio como nica fuente de nitrgeno. Las sales de amonio se desdoblan en amoniaco (NH) con la consiguiente alcalinidad del medio. Interpretacin: El indicador de pH es AZUL DE BROMOTIMOL el cual en presencia de alcalinidad vira al color azul indicando que la prueba es POSITIVA. Cuando no hay cambio de color ni crecimiento se dice que la prueba es NEGATIVA. Si no hay cambio de color, pero s hay crecimiento la prueba es DUDOSA.

4.- AGAR UREA: Siembra: Superficie, solamente. Fundamento: En agar UREA se determina la capacidad de un microorganismo de producir UREASA y desdoblar la urea, formando 2 molculas de amoniaco. La lectura se efecta despus de 18 a 24 horas de incubacin a 37C. El sustrato UREA es un a diamina del cido carbnico, denominado carbamida. Todas las amidas (RCO-NH 2 ) son rpidamente hidrolizadas. La ureasa es una enzima constitutiva ya que la sintetizan ciertas bacterias sin tener en cuenta si hay o no el sustrato urea. Interpretacin: El indicador de pH es rojo de Fenol, el cual en alcalinidad vira en color violeta indicando una prueba POSITIVA. Si el color es amarillo indica una prueba NEGATIVA.

5.- CALDOS MR-VP:

Siembra: En cada caldo con asa recta. Fundamento: En el caldo MR- VP se determina la va metablica por la cual la bacteria es capaz de fermentar la glucosa.

PRUEBAS BIOQUMICAS







Interpretacin: La lectura se efecta despus de 48 horas de incubacin a 37C, agregar 10 gotas de ROJO DE METILO al tubo MR, la aparicin inmediata de un color rojo indica que la prueba es positiva y un color amarillo indica que la prueba es negativa. La lectura del VP se efecta despus de 48 horas de incubacin a 37C agregar al tubo 10 gotas de KOH al 40% y 5 gotas de ALFA NAFTOL al 5% mezclar fuerte despus de la adicin de cada reactivo, esperar 15 minutos y leer la aparicin de un color rojo indica una prueba de VP POSITIVA, la aparicin de un color amarillo o caf indica una prueba de VP NEGATIVA. La bioqumica de la fermentacin de la glucosa hace muy poco probable encontrar cultivos MR y VP POSITIVOS. Lo que s es probable encontrar las 2 pruebas negativas en el caso de bacterias no fermentadoras. 6. AGAR MIO Siembra: Por picadura. Fundamento: Podemos observar si el microorganismo es mvil, si puede descarboxilar la ornitina y degradar el triptfano para producir indol, a travs de la enzima triptofanasa. Interpretacin: La movilidad se demuestra por un enturbiamiento del medio o por crecimiento que se difunde ms all de la lnea de inoculacin. La reaccin positiva a la ornitina est dada por un color prpura del medio. Por decarboxilacin, se alcaliniza el medio, con el consecuente viraje del indicador hacia el color prpura. Debido a la fermentacin de la glucosa se reduce el pH produciendo una condicin cida y originando que el indicador de pH prpura de bromocresol vire al amarillo. El indol, es producido a partir del triptfano por los microorganismos que contienen la enzima triptofanasa. El desarrollo de un color rojo luego de agregar unas gotas de reactivo de Kovacs o de Erlich, indica un resultado positivo. 5. CUESTIONARIO 1.- Cul es la finalidad de realizar pruebas bioqumicas? 2.- Qu otras pruebas bioqumicas existen aparte de las mencionadas en esta prctica y cul es su fundamento? 3.- En qu consisten las pruebas API?

PRUEBAS BIOQUMICAS







6. BIBLIOGRAFA -Koneman Elemer W. 1997.The Entereobacteriaceae in Diagnostic Microbiology Quinta edicin Washington Square: Lippincott-Raven Publishers: 173-203. -Mac Faddin J. 1980, .Pruebas bioqumicas para la identificacin de bacterias de importancia clnica, Panamericana.

7. CAMBIOS

Control de cambios



CURVA DE CRECIMIENTO BACTERIANO








1. OBJETIVOS:

Identificar las fases de una curva de crecimiento a partir de un cultivo bacteriano. Conocer los mtodos de medicin del crecimiento microbiano y los parmetros

cinticos (, td

).

2. INTRODUCCIN El crecimiento y la viabilidad de los microorganismos estn determinados por factores

nutricionales, ambientales y condiciones de laboratorio ptimas. En general las bacterias

crecen con mayor rapidez que los microorganismos eucariticos y es posible predecir una

curva de crecimiento caracterstica de cada especie microbiana.

Cuando una bacteria es inoculada a un medio de cultivo lquido fresco, experimentar un

periodo de adaptacin al medio y posteriormente se dividir en forma exponencial, dando

lugar a una curva de tipo sigmoidea que se acostumbra a dividir en 4 fases:

A) Fase de retardo, de adaptacin o fase lag: no hay divisin celular y la clula est sintetizando nuevos componentes.

B) Fase de crecimiento exponencial o fase log: los microorganismos se dividen por fisin binaria y lo hacen a intervalos regulares.

C) Fase estacionaria: el crecimiento disminuye debido al agotamiento de nutrimentos o la acumulacin de productos residuales txicos.








D) Fase de declinacin o muerte.

La forma de cada porcin de la curva y el tiempo de duracin de cada fase depender de:

la especie de microorganismo, la preparacin del inoculo, la composicin qumica del

medio de cultivo y las condiciones ambientales de la incubacin. 3. MATERIAL

- 1 matraz Erlenmeyer de 250 ml. con 100 ml de medio liquido(Caldo Nutritivo o TSA) - 2 matraces Erlenmeyer de 125 ml con 99 ml de solucin salina isotnica estril - 6 pipetas de 10 ml estriles - 16 pipetas de 1 ml estriles - 1 mechero Fisher - 1 espectrofotmetro y celdas - 1 gradilla - 16 tubos con 9 ml de diluyente - 1 varilla doblada en L - 12 cajas petri con agar nutritivo

4. PROCEDIMIENTO

- El profesor inoculara en un matraz erlenmeyer con medio lquido (caldo nutritivo) 12

horas antes de iniciar la prctica, que se utilizara como inoculo y para el re-siembre.

- Inocular en condiciones estriles un matraz erlenmeyer de 250 ml con 100 ml de caldo

nutritivo con 10 ml del microorganismo en estudio.

- Homogeneizar cuidadosamente agitando el matraz e inmediatamente tomar una

muestra de 5 ml con una pipeta estril y vaciarla en una celda del espectrofotmetro.

Esta muestra corresponder al tiempo cero, de la misma manera se tomaran muestras

a las 0.5, 1, 2, 3, y 4 horas, para el tiempo de 6 horas de incubacin se tomaran 6 ml.

- Colocar el cultivo en incubadora con agitacin (150 rpm) a 35 C








- Determinar la turbidez de las muestras en un espectrofotmetro a 560 nm y leer el

valor de la densidad ptica.

- En la muestra de 6 horas adems de evaluar la turbidez se deber poner 1 ml de

cultivo en un matraz erlenmeyer con 99 ml de diluyente, del matraz con la muestra

diluida, hacer una serie de diluciones en tubos con 9 ml de diluyente hasta 108.

- Enseguida inocular 0.1 ml de las ltimas 3 diluciones en 2 cajas de petri con agar

nutritivo y distribuir la muestra con una varilla de vidrio doblada en L

Cuidando de homogeneizar las muestras cada vez que se haga una nueva dilucin.

- Dejar reposar las cajas unos minutos y posteriormente incubarlas en forma invertida

durante 24- 48 horas.

- Cuantificar el nmero de UFC/ mL

5. RESULTADOS: Registrar las absorbancias y las UFC/mL (Unidades Formadoras de Colonias por mililitro) en la siguiente tabla: Tiempo de muestreo (h) Turbidez DO. O ABS UFC/mL 0 0.5 1 2 3 4 6








6. CUESTIONARIO

1. Cmo se define el crecimiento microbiano y cules son los eventos a nivel celular que ocurren en cada una de las etapas de crecimiento?

2. Qu condiciones ambientales y nutrimentales causaran una disminucin o eliminacin de la fase lag en la curva de crecimiento? Y Qu condiciones la incrementara?

3. Cmo se define el tiempo de duplicacin? Cmo se relaciona con la tasa de crecimiento especfica ()?

7. BIBLIOGRAFA.

Stainer, R.Y., Doudoroff, M. y Adelberg, E.A. Microbiologa. Ed. Aguilar. 8. CAMBIOS

Control de cambios



CURVA DE CRECIMIENTO DE HONGOS








1. OBJETIVO Evaluar en medios slidos de laboratorio, curvas de crecimiento para Aspergilus parasiticus a diferentes temperaturas (37,22.5 y 5C) y pH (5.0, 3.5 y 2.0). 2. INTRODUCCIN Una gran variedad de hongos microscpicos pueden contaminar y desarrollarse en alimentos o

simplemente permanecer en ellos y adquirir un especial significado desde el punto de vista

econmico o sanitario. Las consecuencias de su actividad en los alimentos se manifiestan en

dos sentidos: la produccin en ciertos casos de sustancias toxicas para el hombre y animales y

la descomposicin o apariciones en el alimento. El grupo de los hongos comparte caractersticas

entre sus miembros que los distinguen notoriamente de las bacterias. Algunas especies exhiben

una gran diversidad en su de capacidad metablica y de adaptacin a numerosas sustratos.

Las caractersticas que definen a los principales hongos son: tipo de micelio, esporas,

esporangio, ciclo de vida y presencia o ausencia de reproduccin sexual.

La clasificacin abarca los siguientes grupos: phylomicetos, ascomicetos, basidomicetos,

deuteromicetos u hongos imperfectos.

3. MATERIAL

Medio de cultivo agar papa-dextrosa PDA cido ctrico estril al 30% (p/v) Cajas petri chicas Jeringa de Insulina Lavado de esporas








4. PROCEDIMIENTO

1. Se hacen crecer cuas del moho Aspergilus parasiticus en agar papa- dextrosa PDA, durante 10 das a 25 C. A partir de las cuas se realizaron los lavados de esporas correspondientes utilizando 5mL de agua estril.

2. Se preparan los sistemas con pH ajustado con PDA acidificado con cido al ctrico estril al 30% de acuerdo con la Tabla 1.

3. Los medios correspondientes a cada sistema y a su rplica se inoculan con 50 L del lavado de esporas.

4. Todos los sistemas se incuban a diferentes temperaturas (37,22.5 y 10C) durante cuatro das, de acuerdo con la Tabla 2.

5. Se realizan determinaciones del dimetro de las colonias con ayuda de un vernier, diariamente durante cuatro das.

6. Se elaboran curvas de crecimiento en donde se relacionan los dimetros de las colonias (milmetros) en funcin del tiempo (horas). Se realizan regresiones que permiten obtener las pendientes, las cuales representan las velocidades de crecimiento radial (VCR, mm/h) para cada condicin y para cada rplica.

TABLA 1 Cantidades de ac. ctrico necesario para ajuste de pH TABLA 2 Diseo experimental con las variables pH y temperatura

pH T(C) 2.0 10 22.5 37 3.5 10 22.5 37 5.0 10

pH mL de ac. Ctrico/ 50 mL de PDA 2.0 3.5 5.0








22.5 37

Complete el cuadro siguiente, anotando las medidas del dimetro de la colonia del hongo.

Tiempo de incubacin (hrs) Dimetro (mm) 0

24 48 72 96

5. CUESTIONARIO 1. En qu consisten las distintas fases que componen la curva de crecimiento

microbiano? 2. De acuerdo con los resultados obtenidos en la VCR Cules son las condiciones de

crecimiento que favorecen a Aspergilus parasiticus? 3. De acuerdo con los resultados obtenidos en las fase lag Cules son las condiciones

de crecimiento que retardan el desarrollo de Aspergilus parasiticus? 4. Menciona las tcnicas utilizadas para la medicin del crecimiento microbiano.

6. BIBLIOGRAFA

Stainer, R.Y., Doudoroff, M. y Adelberg, E.A. Microbiologa. Ed. Aguilar. Jay J. M., 1994. Microbiologa Moderna de Alimentos. Tercera Edicin. Ed. Acribia.








7. CAMBIOS

Control de cambios



EFECTO DE LOS FACTORES FSICOS SOBRE CRECIMIENTO DE LOS MICROORGANISMOS








1. OBJETIVOS:

Conocer y determinar la temperatura optima, pH y concentracin de sales ptimas para el crecimiento de microorganismos.

Determinar las diferencias en los parmetros anteriores en funcin del grupo microbiano.

2. INTRODUCCIN: Los organismos para ser obtenidos en el laboratorio se debe garantizar que sus requerimientos nutricionales sean satisfechos (medios apropiados con los componentes que den el aporte y estn preparados correctamente para evitar deterioro de sus ingredientes). Las condiciones fsicas son importantes para obtener un satisfactorio crecimiento celular: Estas condiciones incluyen control de:

1. temperatura 2. pH 3. concentracin de azcares 4. luz 5. concentracin de sales

Temperatura.- las reacciones metablicas estn influenciadas por la temperatura cada especie de microorganismo crece a cierta temperatura y este rango permite caracterizar a ese grupo. Los organismos que crecen a temperaturas menores a 20 C se denominan psicroflicos. Otros microorganismos crecen a temperaturas mayores a 45 C y se les denomina termfilos y los que crecen en rangos de 20 a 45C se les llaman mesoflicos. Aunque presentan un rango de temperatura existente a la que el crecimiento es el ptimo: Temperatura optima de crecimiento

siendo los extremos superior e inferior las temperaturas mxima y mnima de crecimiento.








pH.- los organismos presentan un pH ptimo, mnimo y mximo de crecimiento dependiendo del grupo microbiano estudiado. Sales y azcares.- existen organismos que necesitan para su crecimiento altas concentraciones de sales denominados: Haloflicos

.

Los microorganismos que toleran y crecen en altas concentraciones de azcares son conocidos como osmfilos. 3. MATERIAL: Cepas: Proporcionadas por el Profesor Tubos de ensaye con Caldo Nutritivo. 4. PROCEDIMIENTO: 1.- Efectos de temperatura

1. sembrar una asada de cada uno de los m.o en tubos con caldo nutritivo. 2. incubar cada m.o. a las siguientes temperaturas : 4, 28, 37 y 45 C durante 24 horas.

microorganismo 4C 28C 37C 45C Nota

: el cuadro anterior se llenar mediante el mtodo de las cruces.

2.- Efectos del pH

1. siembre las cepas en los tubos proporcionados con los pH indicados. 2. incube los tubos a 37 C 3. reporte en un cuadro.








microorganismos 4 5 7 12 Nota:

siga el mtodo de las cruces

3.- Cultivo de los organismos haloflicos a.- sembrar cada uno de los microorganismos de trabajo en tubos de Caldo nutritivo+ NaCl ( 5.0 , 7.0 y 10.0 %) b.- incube a 37 C 4.- Cultivo de organismos sacaroflicos. a.- Siembre cada uno de los m.o. en tubos de Caldo nutritivo+ Sacarosa ( 2.5 %, 5.5, 10 y 20 %) b.- incube a 37 C 5. CUESTIONARIO: 1.- Con respeto a los microorganismos, diga qu son las temperaturas cardinales. 2.- Diga si crecieron igual los diferentes microorganismos en todos los valores de pH usados. Explique a que cree que se deba las diferencias si las hay. 3.- Llene los siguientes cuadros. Organismo pH ptimo pH mnimo pH mximo Bacterias Levaduras Hongos fil.








4.- Por sus requerimientos gaseosos Cmo se clasifican los organismos? 5.- A nivel de laboratorio Cmo se pueden cultivar los organismos anaerbicos?

6. BIBLIOGRAFIA

Jay J. M., 1994. Microbiologa Moderna de Alimentos. Tercera Edicin. Ed. Acribia. 7. CAMBIOS

Control de cambios



EFECTO DE LOS AGENTES QUMICOS SOBRE EL

CRECIMIENTO DE LOS MICROORGANISMOS







Realiz: Dra. Ma. Lorena Luna Guevara 1. OBJETIVO:

Evaluar la eficacia de los agentes qumicos mediante ensayos de inhibicin bacteriana.

2. INTRODUCCION Los agentes antimicrobianos son substancias qumicas naturales, (sintetizadas por hongos o bacterias) sintticas o semisintticas que son capaces de inhibir el desarrollo o de destruir los microorganismos patgenos infectantes. Los antibiticos son agentes antimicrobianos de uso sistmico que pueden reducir y controlar la presencia de microorganismos contaminantes del husped y son administrados por ingestin oral, uso tpico: absorbidos por la piel o inyectados. El espectro de actividad del agente antimicrobiano puede ser: Reducido: afecta a un nmero pequeo de especies bacterianas; Limitado: afecta a un nmero moderado y limitado de especies bacterianas y Amplio espectro afecta a un gran nmero de especies bacterianas sean ellas Gram (+) o Gram (-). Se define resistencia: capacidad de los microorganismos de modificar su estructura gentica para evitar ser daados por ciertos antibiticos. Estos mecanismos bioqumicos de resistencia se hallan codificados en el ADN cromosomal o de los plsmidos, y se traducen en: Disminucin de la permeabilidad celular que impide al antibitico penetrar en la clula. Inactivacin enzimtica de los antibiticos por fabricacin de enzimas que producen cambios estructurales en la configuracin molecular de los agentes antimicrobianos. Modificacin del sitio donde acta el antibitico por la alteracin de la configuracin estructural de los sitios activos, produciendo una prdida de la afinidad entre el sitio activo y el antibitico.









Pruebas de sensibilidad Se efectan para determinar la resistencia de las bacterias a los antibiticos y a la vez medir la actividad in vitro de un agente frente a una cepa determinada considerando una concentracin inhibitoria mnima (menor concentracin de antimicrobiano capaz de inhibir el crecimiento bacteriano). Estas pruebas pueden efectuarse por dilucin, difusin en agar, gradiente de agar y mtodos automatizados. 3. MATERIAL:

Cepas (proporcionados por el profesor) Antimicrobianos Hisopos estriles Pinzas Mechero Bunsen Papel filtro Cajas petri con medio de cultivo

4. PROCEDIMIENTO: 1.- Usando hisopos estriles o asa de cultivo, sembrar masivamente 3 placas de agar nutritivo con cada uno de los microorganismos. 2.- Colocar adecuadamente los sendiscos (discos de papel filtro impregnados con las substancias antimicrobianas) con pinzas estriles sobre las placas de agar nutritivo sembradas. Substancias antimicrobianas que se usarn:

I) Agentes tenso-depresores. a) Jabones. b) Detergentes. c) Sales biliares.









II) Metales pesados. III) Desinfectantes.

IV) Antibiticos y sulfas.

3.- Incubar las cajas a 37C.

5. RESULTADOS Medir en milmetros el dimetro de los halos de inhibicin producidos por cada uno de los agentes antimicrobianos. Con los resultados obtenidos llenar la siguiente tabla.

Antimicrobiano

Halo de inhibicin (mm)









6. CUESTIONARIO

1. Menciona 3 ejemplos de Agentes Antimicrobianos contra bacterias Gram (-)

2. Explica el fundamento de las pruebas conocidas como Antibiogramas

3. Explica los efectos antimicrobiano de los siguientes agentes a nivel celular:

Agentes tensodepresores, Jabones, Sales biliares, Metales pesados, Desinfectantes Antibiticos y sulfas. 4.- Actualmente se estn estudiando los efectos antimicrobianos de los aceites esenciales, busca 3 ejemplos.

7. BIBLIOGRAFA



8. CAMBIOS

Control de cambios



RECUENTO DE COLIFORMES: TCNICA DEL

NMERO MS PROBABLE (NMP)







Realiz: Dra. Ma. Lorena Luna Guevara 1. OBJETIVO: Evaluar el contenido de organismos coliformes mediante la tcnica del Nmero Ms Probable. 2. INTRODUCCION

Los microorganismos coliformes constituyen un grupo heterogneo con hbitat

primordialmente intestinal , las bacterias coliformes totales comprende todos los bacilos

Gram negativos aerobios o anaerobios facultativos, no esporulados, que fermentan la lactosa

con produccin de gas en un lapso mximo de 48 h. a 35C 1C. El grupo de coliformes

fecales est conformado por 4 gneros principalmente: Enterobacter, Escherichia,

Citrobacter y Klebsiella, los cuales son capaces de fermentar la lactosa con produccin de

gas a las 48 h. de incubacin a

44.5 0.1C. Este grupo no incluye una especie determinada, sin embargo la ms

prominente es Escherichia coli.

La determinacin de microorganismos coliformes totales por el mtodo del Nmero ms

Probable (NMP), se fundamenta en la capacidad de este grupo microbiano de fermentar la

lactosa con produccin de cido y gas al incubarlos a

35C 1C durante 48 h., utilizando un medio de cultivo que contenga sales biliares. Esta

determinacin consta de dos fases, la fase presuntiva y la fase confirmativa. En la fase

presuntiva el medio de cultivo que se utiliza es el caldo lauril sulfato de sodio el cual permite

la recuperacin de los microorganismos daados que se encuentren presentes en la muestra

y que sean capaces de utilizar a la lactosa como fuente de carbono. Durante la fase









confirmativa se emplea como medio de cultivo caldo lactosado bilis verde brillante el cual es

selectivo y solo permite el desarrollo de aquellos microorganismos capaces de tolerar tanto

las sales biliares como el verde brillante.

La determinacin del nmero ms probable de microorganismos coliformes fecales se realiza

a partir de los tubos positivos de la prueba presuntiva y se fundamenta en la capacidad de

las bacterias para fermentar la lactosa y producir

gas cuando son incubados a una temperatura de 44.5 0.1C por un periodo de

24 a 48 h.

3. MATERIAL

Estufa de incubacin Pipetas Asa bacteriolgica Tubos con caldo lactosado

4. PROCEDIMIENTO

1. Preparacin de la muestra por el mtodo seleccionado por el profesor.

2. Pipetear 1 ml de cada dilucin en tubos de caldo lactosado, utilizando tres tubos por cada dilucin. Incubar los tubos 35-37 C, durante 24 y 48 hrs.

3. Pasadas las primeras 24 hrs, anotar los tubos que muestren produccin de gas. Volver a la estufa los tubos negativos para su incubacin durante 24 hrs ms.

4. Pasadas las 48 hrs, anotar los tubos que presenten produccin de gas. Elegir la dilucin ms alta en la que sean positivos de formacin de gas los tres tubos y las diluciones ms prximas. Nota utilizar la tabla.

5. Confirmar los tubos de caldo seleccionado en el paso anterior que son positivos, transfiriendo por sembrado por estra en placas de agar eosina azul de metileno. Observar los medios slidos de confirmacin para ver si existen colonias tpicas de coliformes despus de 24 y 48 horas de incubacin a 35-37 C. La formacin en el agar eosina azul de metileno de colonias negras o con el centro negro, o bien de









colonias mucoides de color rosa-naranja confirman la presencia de organismos fecales.

6. Anotar el nmero de tubos confirmados como positivos de organismos coliformes en cada dilucin.

7. Para obtener el NMP, proceder de la forma siguiente. Ver en cada de las tres diluciones seleccionadas el nmero de tubos en los que se confirm la presencia de coliformes. Buscar en la tabla del NMP y anotar que el nmero de tubos positivos de cada dilucin.

Para calcular el NMP de organismos coliformes de acuerdo con la tabla 1 Tabla 1 Nmero ms probable (NMP) de bacterias; tres tubos por cada dilucin Numero de tubos positivos en cada dilucin

Lmites de confianza

Dilucin 10

Dilucin -1 10

Dilucin -2 10

NMP por gramo -3 99 %

95%

0 1 0 3









5. CUESTIONARIO

1. En qu consiste la tcnica de diluciones para el sembrado de distintos tipos de muestras.

2. Cules son los mtodos alternativos que se pueden utilizar para la identificacin y cuantificaciones de los coliformes fecales?

3. Importancia de los coliformes fecales como un grupo indicador de la calidad sanitaria de los alimentos

4. A qu se debe la formacin de gas en la campana de Durham? 5. Cul es el valor permisible de organismos coliformes fecales en aguas y bebidas de

acuerdo al estipulado SSA? 6. BIBLIOGRAFA.

Jay J. M., 1994. Microbiologa Moderna de Alimentos. Tercera Edicin. Ed. Acribia. 7. CAMBIOS

Control de cambios



AMB-TE-IAM 305-061. OBJETIVO:2. INTRODUCCIN:Los medios de cultivo pueden ser: lquidos, semislidos y slidos, los lquidos son aquellos medios que carecen de material gelificante.3. MATERIAL:4. PROCEDIMIENTO:ESTERILIZACIN:CONTROL DE ESTERILIDAD:AGAR PAPA DEXTROSATabla 1: Frmula aproximada para 1000 ml de agua purificada.pH final 5.6 0.2Mtodo de preparacin:Suspender 39 gramos del polvo en un litro de agua purificada. Mezclar perfectamente, calentar con agitacin frecuente y hervir durante un minuto hasta disolucin completa. Distribuir y esterilizar a 121 C por 15 minutos.AGAR NUTRITIVOTabla 2: Frmula aproximada para 1000 ml de agua purificadapH final 6.8 0.2Mtodo de preparacin:Suspender 23 gramos de polvo en un litro de agua purificada. Mezclar perfectamente, calentar con agitacin frecuente y hervir durante 1 a 2 minutos hasta disolucin. Esterilizar a 121 C durante 15 minutos.AGAR MAC CONKEYTabla 3: Frmula aproximada para 1000 ml de agua purificada.pH final 7.1 0.2Mtodo de preparacin:Suspender 50 gramos del medio en un litro de agua purificada. Mezclar bien hasta que se obtenga una suspensin uniforme. Dejar reposar de 10 a 15 minutos. Calentar suavemente agitando frecuentemente y hervir durante 1 minuto. Esterilizar en autoclave ...5. CUESTIONARIO:

AMB-TE-IAM 305-071. OBJETIVOS: Desarrollar y practicar el mtodo de aislamiento por estra cruzada.INTRODUCCIN:I.- Aislamiento por el mtodo de estra.4. Bilbliografa Prescott. L. M., Harley, 1999, Microbiologa. Cuarta Edicin. Graw Hill. Interamericana, Mxico.

AMB-TE-IAM 305-081. OBJETIVOS:Fig. 1 Forma y bordes

AMB-TE-IAM 305-096. Cuestionario:1.- Menciona tres tipos de tinciones diferenciales a parte de la T. de Gram2.- Cul es la funcin del aceite de Inmersin?3.- Menciona otros dos tipos de microscopios a parte del Optico para la observacin de bacterias e incluso virus:7. Bibliografa

AMB-TE-IAM 305-101. OBJETIVO:2. INTRODUCCIN:3. MATERIAL:REACTIVOS:PREPARACION DE REACTIVOSCRISTAL VIOLETA1 gr cristal violeta 100 mL alcoholLUGOL2 gr KI + 1 gr I metlico 300 mL alcoholALCOHOL CETONA80 ml alcohol + 20 cetonaSAFRANINA1 gr safranina 100mL alcohol4. PROCEDIMIENTO:5. CUESTIONARIO Prescott. L. M., Harley, 1999, Microbiologa. Cuarta Edicin. Graw Hill. Interamericana, Mxico.

AMB-TE-IAM 305-111. OBJETIVOS Sembrar, leer e interpretar algunas pruebas bioqumicas tiles en la identificacin de bacterias bacilares Gram negativas. Identificar el gnero y especie de la cepa problema.2. INTRODUCCINLas pruebas bioqumicas se basan en la determinacin de la presencia o ausencia de diferentes enzimas codificadas por el material gentico del cromosoma bacteriano. Estas enzimas (catalasa, coagulasas, descarboxilasas, deaminasas, ureasas, peroxidasas...Las pruebas bioqumicas tambin evalan la capacidad de reducir ciertos iones (ferroso a frrico), la presencia o ausencia de flagelos (prueba de movilidad), la produccin o no de hemolisinas, el requerimiento de algunos factores especiales (protenas...3. MATERIAL Cepas bacterianas (Propuestas por el profesor) Agar TSI (triple azcar hierro) Agar LIA (lisina hierro agar) Agar UREA Agar CITARTO DE SIMMONS Caldo MR- VP Agar MIO4. PROCEDIMIENTOa) Siembra:Sembrar la cepa problema en toda la bacteria disponible de acuerdo a la siguiente instruccin:1. AGAR TSI:Siembra: Estra en superficie y la picadura central hasta el fondo del tubo.Fundamento: En TSI se determina la capacidad de un microorganismo para utilizar los hidratos de carbono GLUCOSA, LACTOSA y/o SACAROSA, con produccin o no de gases (CO , H ) junto con la produccin o de cido sulf (H S).Interpretacin: La lectura se efecta despus de 18 a 24 horas de incubacin a 37 C. Se lee una fraccin, la reaccin ocurrida en la superficie del medio corresponde al numerador (parte aerobia) y la reaccin ocurrida en la profundidad del medio cor...En este medio se leen las siguientes reacciones bioqumicas: Fermentacin de la glucosa (K/A), fermentacin de la glucosa, lactosa y/o sacarosa (A/A). No fermentacin de los carbohidratos (K/K), la bacteria no utiliza los hidratos de carbono, producie...Algunas bacterias no fermentadoras solamente atacan la peptona aerbicamente dando un TSI: K/N, es decir no hay cambio en el fondo del tubo, Produccin de gas: ruptura del medio, Produccin de H S ennegrecimiento del medio.El agar TSI contiene tres azcares: glucosa (1g/L), lactosa (10g/L), sacarosa (10g/L).Como indicador de pH tiene Rojo de Fenol el cual vira de color amarillo en presencia de acidez y al color rojo en presencia de alcalinidad.Tiene como fuente de azufre el TIOSULFATO DE SODIO, necesario para que las bacterias puedan producir H S y como indicador de H S SULFATO FERROSO el cual reacciona con el H S produciendo un precitado negro e insoluble de sulfato ferroso.2.- AGAR LIA:Siembra: Doble picadura hasta el fondo del tubo y siembra en superficie.Interpretacin:En este medio se leen las siguientes reacciones bioqumicas:a. Fermentacin de la glucosa (K/A), la bacteria no utiliza al aminocido solo fermenta la glucosa.b. Descarboxilacin de lisina (K/K).c. Desaminacin de la lisina (R/A) rojo/amarillo.d. Produccin de gas: ruptura del medio.e. Produccin de H S ennegrecimiento del medio.3.- AGAR CITARTO DE SIMMONS:Siembra: En superficie nicamente.Fundamento: En agar CITARTO DE SIMMONS se determina la capacidad de un microorganismo de emplear el citrato como nica fuente de carbono en ausencia de fermentacin de azcares o de produccin de cido lctico. Se efecta despus de 18 a 24 horas de i...Normalmente el metabolismo del citrato comprende una condensacin de acetilo con la coenzima A y oxalacetato para entrar en el ciclo de Krebs. El medio utilizado contiene tambin sales de amonio inorgnicas. Un organismo capaz de utilizar el citrato c...Interpretacin: El indicador de pH es AZUL DE BROMOTIMOL el cual en presencia de alcalinidad vira al color azul indicando que la prueba es POSITIVA.Cuando no hay cambio de color ni crecimiento se dice que la prueba es NEGATIVA.Si no hay cambio de color, pero s hay crecimiento la prueba es DUDOSA.4.- AGAR UREA:Siembra: Superficie, solamente.Fundamento: En agar UREA se determina la capacidad de un microorganismo de producir UREASA y desdoblar la urea, formando 2 molculas de amoniaco. La lectura se efecta despus de 18 a 24 horas de incubacin a 37 C. El sustrato UREA es un a diamina del...Interpretacin: El indicador de pH es rojo de Fenol, el cual en alcalinidad vira en color violeta indicando una prueba POSITIVA. Si el color es amarillo indica una prueba NEGATIVA.5.- CALDOS MR-VP:Siembra: En cada caldo con asa recta.Fundamento: En el caldo MR- VP se determina la va metablica por la cual la bacteria es capaz de fermentar la glucosa.Interpretacin: La lectura se efecta despus de 48 horas de incubacin a 37 C, agregar 10 gotas de ROJO DE METILO al tubo MR, la aparicin inmediata de un color rojo indica que la prueba es positiva y un color amarillo indica que la prueba es negativa.La lectura del VP se efecta despus de 48 horas de incubacin a 37 C agregar al tubo 10 gotas de KOH al 40% y 5 gotas de ALFA NAFTOL al 5% mezclar fuerte despus de la adicin de cada reactivo, esperar 15 minutos y leer la aparicin de un color ro...La bioqumica de la fermentacin de la glucosa hace muy poco probable encontrar cultivos MR y VP POSITIVOS. Lo que s es probable encontrar las 2 pruebas negativas en el caso de bacterias no fermentadoras.6. AGAR MIOSiembra: Por picadura.Fundamento: Podemos observar si el microorganismo es mvil, si puede descarboxilar la ornitina y degradar el triptfano para producir indol, a travs de la enzima triptofanasa.Interpretacin: La movilidad se demuestra por un enturbiamiento del medio o por crecimiento que se difunde ms all de la lnea de inoculacin. La reaccin positiva a la ornitina est dada por un color prpura del medio. Por decarboxilacin, se alcali...5. Cuestionario1.- Cul es la finalidad de realizar pruebas bioqumicas?2.- Qu otras pruebas bioqumicas existen aparte de las mencionadas en esta prctica y cul es su fundamento?3.- En qu consisten las pruebas API?6. BIBLIOGRAFA-Koneman Elemer W. 1997.The Entereobacteriaceae in Diagnostic Microbiology Quinta edicin Washington Square: Lippincott-Raven Publishers: 173-203.-Mac Faddin J. 1980, .Pruebas bioqumicas para la identificacin de bacterias de importancia clnica, Panamericana.

AMB-TE-IAM 305-121. OBJETIVOS:El crecimiento y la viabilidad de los microorganismos estn determinados por factores nutricionales, ambientales y condiciones de laboratorio ptimas. En general las bacterias crecen con mayor rapidez que los microorganismos eucariticos y es posible ...Cuando una bacteria es inoculada a un medio de cultivo lquido fresco, experimentar un periodo de adaptacin al medio y posteriormente se dividir en forma exponencial, dando lugar a una curva de tipo sigmoidea que se acostumbra a dividir en 4 fases:A) Fase de retardo, de adaptacin o fase lag: no hay divisin celular y la clula est sintetizando nuevos componentes.B) Fase de crecimiento exponencial o fase log: los microorganismos se dividen por fisin binaria y lo hacen a intervalos regulares.C) Fase estacionaria: el crecimiento disminuye debido al agotamiento de nutrimentos o la acumulacin de productos residuales txicos.D) Fase de declinacin o muerte.La forma de cada porcin de la curva y el tiempo de duracin de cada fase depender de: la especie de microorganismo, la preparacin del inoculo, la composicin qumica del medio de cultivo y las condiciones ambientales de la incubacin.3. MATERIAL4. PROCEDIMIENTO- El profesor inoculara en un matraz erlenmeyer con medio lquido (caldo nutritivo) 12 horas antes de iniciar la prctica, que se utilizara como inoculo y para el re-siembre.- Inocular en condiciones estriles un matraz erlenmeyer de 250 ml con 100 ml de caldo nutritivo con 10 ml del microorganismo en estudio.- Homogeneizar cuidadosamente agitando el matraz e inmediatamente tomar una muestra de 5 ml con una pipeta estril y vaciarla en una celda del espectrofotmetro. Esta muestra corresponder al tiempo cero, de la misma manera se tomaran muestras a las 0.5, 1- Colocar el cultivo en incubadora con agitacin (150 rpm) a 35 C- Determinar la turbidez de las muestras en un espectrofotmetro a 560 nm y leer el valor de la densidad ptica.- En la muestra de 6 horas adems de evaluar la turbidez se deber poner 1 ml de cultivo en un matraz erlenmeyer con 99 ml de diluyente, del matraz con la muestra diluida, hacer una serie de diluciones en tubos con 9 ml de diluyente hasta 10P8.P Cuidando d- Enseguida inocular 0.1 ml de las ltimas 3 diluciones en 2 cajas de petri con agar nutritivo y distribuir la muestra con una varilla de vidrio doblada en L- Dejar reposar las cajas unos minutos y posteriormente incubarlas en forma invertida durante 24- 48 horas.- Cuantificar el nmero de UFC/ mL5. RESULTADOS:Registrar las absorbancias y las UFC/mL (Unidades Formadoras de Colonias por mililitro) en la siguiente tabla:6. CUESTIONARIO

AMB-TE-IAM 305-131. OBJETIVO2. INTRODUCCIN3. MATERIAL4. PROCEDIMIENTO5. CUESTIONARIO

AMB-TE-IAM 305-141. OBJETIVOS:2. INTRODUCCIN:3. MATERIAL:4. PROCEDIMIENTO:UNotaU: el cuadro anterior se llenar mediante el mtodo de las cruces.UNota: Usiga el mtodo de las cruces5. CUESTIONARIO:6. BIBLIOGRAFIA

AMB-TE-IAM 305-151. OBJETIVO: Evaluar la eficacia de los agentes qumicos mediante ensayos de inhibicin bacteriana.2. INTRODUCCION3. MATERIAL:4. PROCEDIMIENTO:5. RESULTADOS6. CUESTIONARIO Prescott. L. M., Harley, 1999, Microbiologa. Cuarta Edicin. Graw Hill. Interamericana, Mxico.

AMB-TE-IAM 305-161. OBJETIVO:Evaluar el contenido de organismos coliformes mediante la tcnica del Nmero Ms Probable.2. INTRODUCCION3. MATERIAL4. PROCEDIMIENTOTabla 1 Nmero ms probable (NMP) de bacterias; tres tubos por cada dilucin5. CUESTIONARIO

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