manual de inmunología 2013

1

BENÉMERITA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE PUEBLA

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

LICENCIATURA: QUÍMICO FARMACOBIÓLOGO

DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA

MANUAL DE LABORATORIO DE

INMUNOLOGÍA

2

INDICE

Bibliografía 36




NÚMERO DE LA

PRÁCTICA

TITULO DE LA PRÁCTICA PÁGINA

Práctica 1

Diluciones 3

Práctica 2

Toma de muestra 7

Práctica 3

Observación de leucocitos (cuenta diferencial) 10

Práctica 4 Determinación de grupo sanguíneo 12

Práctica 5 Determinación del título de anticuerpos ABO del

suero.

15

Práctica 6

Pruebas cruzadas 17

Práctica 7 Diagnóstico serológico de infecciones bacterianas

(Reacciones febriles)

20

Práctica 8 Diagnóstico serológico de sífilis

23

Práctica 9

Factor reumatoide

27

Práctica 10

Proteína C reactiva 29

Práctica 11

Determinación de antiestreptolisinas

31

Práctica 12 Determinación de la hormona gonadotropina

coriónica humana

34

3


PRÁCTICA No. 1

DILUCIONES

Introducción

Se les llama diluciones a las soluciones con concentración menor obtenidas al agregar

volúmenes conocidos de diluyente a una solución de concentración conocida. Las diluciones

se expresan en forma de una proporción, por ejemplo 1/10 (1:10) donde la primera cifra o

numerador (1) corresponde al volumen de lo que se está diluyendo y la segunda cifra o

denominador (10) al volumen total en que se encuentra.

Objetivo

Aprenderá a calcular diluciones en forma directa o en serie.

Desarrollo

Así, una dilución 1/10 indica que se tiene un volumen de la solución original contenido o

diluido en 10 volúmenes totales, de los cuales 9 corresponden al diluyente. Dado que en una

dilución lo que se indica es la relación entre el volumen de la solución original y el volumen

total en que se encuentra, una dilución 1/10 puede prepararse de diferentes maneras:

Por ejemplo:

1 mL de muestra en 9 mL de diluyente

0.1 mL de muestra en 0.9 mL de diluyente

0.5 mL de muestra en 4.5 mL de diluyente

En la práctica el cálculo de las diluciones se puede efectuar de dos maneras diferentes

que cumplen ciertas expectativas, la dilución directa y la dilución en serie.

4

Dilución directa.

Para realizar una dilución directa se puede hacer uso de la siguiente expresión:

1/d=Vm/Vt donde 1/d= dilución

Vm= volumen de muestra

Vt= volumen total (volumen de diluyente + volumen de muestra)

Ejemplo N°1

Lleve 5 mL de muestra a una dilución 1/10.

Sustituyendo los valores conocidos tenemos:

1/d=1/10

Vm=5 mL

Vt= ?

Así:

1/10=5 mL/Vt

despejando Vt tenemos que Vt=10 x 5/1=50 mL

volumen de diluyente = volumen total-volumen de muestra

volumen de muestra = 50-5 = 45 mL

Ejemplo N°2

Prepare exactamente 200 mL de una dilución 1/50.

Sustituyendo los valores conocidos tenemos:

1/d=1/50

Vm=?

Vt= 200 mL

Así:

1/50=Vm/200

Despejando Vm tenemos que Vm=200 x 1/50=4 mL

Volumen de diluyente = volumen total-volumen de muestra

Volumen de diluyente = 200-4=196 mL

5

Sin embargo, las diluciones directas tienen el inconveniente de que cuando es

necesario hacer una dilución alta por ejemplo 1/ 10 000, se desperdicia mucho reactivo o se

incurre en un error de medición. Así, una dilución 1/ 10 000 se prepararía con 1 mL de

muestra y 9 999 mL de diluyente o bien 9.999 mL de diluyente y 0.001 mL de muestra.

Dilución seriada

Este tipo de dilución soluciona los inconvenientes que presenta el cálculo directo de

las diluciones altas. Además, en microbiología permite el cálculo de la población microbiana

en la muestra de estudio, de la cual se toma una alícuota que se diluye en varios tubos y se

siembra por vertido en placa (ver figura 1). La diferencia entre la dilución de dos tubos

consecutivo se conoce como factor de dilución, siendo 2, 4 y 10 los más usados. En el

ejemplo de la dilución 1/ 10 000, la muestra se puede diluir 1/ 100 (Vm= 0.1 mL + 9.9 de

diluyente Vt= 10 mL) en un primer tubo y colocar 0.1 mL de esta dilución en un segundo

tubo con 9.9 de diluyente. El segundo tubo tendrá una dilución 1/ 100, sin embargo como la

muestra ya se encuentra diluida previamente 1/ 100, multiplicando sus denominadores

tenemos:

1/ 100 x 1/ 100= 1/ 10 000

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Figura 1.Esquema e diluciones seriadas

En este caso el factor de dilución es de 100. Debe insistirse en que solo el primer tubo

lleva la alícuota de la muestra sin diluir, los demás tubos toman la alícuota ya diluida del tubo

previo. El número de tubos y las diluciones intermedias se plantean considerando el volumen

de los tubos así como el volumen mínimo que se puede medir fácil y exactamente con las

pipetas disponibles.

Cuestionario

1. ¿Cómo lograr exactamente 40 mL de una dilución 1:40000?

2. Obtener 60 mL de una dilución 108

3. Prepara 5 mL de una dilución 1:100000, utilizando diluciones seriadas

4. ¿Qué dilución se obtendrá si mezclo 2 mL de muestra en 58 mL de diluyente?

5. Para realizar diferentes pruebas de diagnóstico, usted requiere 500 µl de una dilución

1:30 000 de una muestra de suero y solamente cuenta con 4 mL de solvente.

Utilizando diluciones seriadas indique como obtendría dicha dilución.

7





PRÁCTICA No. 2

TOMA DE MUESTRA

Introducción

En el laboratorio de inmunología la muestra a estudiar es principalmente sangre y sus

derivados suero o plasma. En el plasma o suero se determina principalmente la presencia de

anticuerpos, los cuales desde el descubrimiento de la alta especificidad de las reacciones

antígeno-anticuerpo (Ag-Ac), se comprueban con propósitos de diagnóstico

(inmunodiagnóstico).

Inicialmente los investigadores se dedicaron a la detección de anticuerpos en el suero

del paciente como un signo de infección y así a la identificación serológica del

microorganismo. Sin embargo, hoy en día la sensibilidad y especificidad de los

inmunoensayos permiten no solo la detección de anticuerpos contra una amplia variedad de

organismos infecciosos incluyendo bacterias, parásitos, hongos y virus sino a la identificación

del propio microorganismo.

Aún más, proporcionan un medio para la detección y cuantificación de antígenos no

infecciosos y anticuerpos de importancia clínica tales como la determinación del grupo

sanguíneo, el VDRL, la determinación de la proteína C-reactiva, una prueba que señala un

proceso inflamatorio agudo, la detección de antígenos asociados a tumores y la demostración

de la hormona gonadotropina coriónica, una prueba diagnóstica del embarazo.

Objetivo

Aprender el procedimiento apropiado para la obtención de sangre venosa de las venas del

dobles del codo.

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Desarrollo

Obtención de muestra de sangre. Para efectuar análisis serológicos, las muestras de sangre

pueden ser de sangre capilar o periférica y de sangre venosa. Sangre capilar o periférica. La

sangre capilar o periférica es la que fluye después de aplicar una punción superficial cutánea.

Se puede obtener de la yema del dedo. Algunas pruebas pueden realizarse con sangre capilar

o periférica y se aconseja cuando no es posible obtener una muestra de sangre venosa o no se

desea puncionar la vena.

Sangre venosa. Esta muestra se obtiene por punción de una de las tres venas del

pliegue del codo: la basílica, la cefálica o la mediana cubital. Se emplean jeringas desechables

con agujas de tipo 21x32, 20x32 o el sistema para la extracción de sangre intravenosa al vacío

Vacuntainer . Previamente se realiza la limpieza del área elegida con torunda y alcohol.

Antes de puncionar se coloca el torniquete aproximadamente a 8 cm de distancia arriba del

pliegue del codo. No debe olvidar soltarlo tan pronto empiece a obtenerse la muestra. La

cantidad máxima de sangre a extraer será estrictamente la necesaria para las pruebas.

Anticoagulantes. Los anticoagulantes más usados son el citrato de sodio, oxalato de

sodio y EDTA. El citrato de sodio se emplea al 3.8% y el oxalato de sodio al 1.4%. Se usan en

relación de una parte de anticoagulante por cada nueve partes de sangre, habitualmente se

usan 0.25mL de la solución para completar a 2.5mL de volumen total con la muestra de

sangre. El EDTA (ácido etilen-diamino-tetra-acético) se utiliza al 10% y es uno de los

anticoagulantes de elección para el trabajo de rutina (ver figura 2).

Manejo y conservación de la muestra. La muestra debe rotularse correctamente y

separase según el caso en plasma o suero, y dependiendo del tipo de análisis debe analizarse

inmediatamente o puede conservarse adecuadamente refrigerada entre 4 y 8ºC para el

análisis posterior.

http://www.monografias.com/trabajos11/metods/metods.shtml#ANALIT

http://www.monografias.com/trabajos/alcoholismo/alcoholismo.shtml

http://www.monografias.com/trabajos5/volfi/volfi.shtml

http://www.monografias.com/trabajos/fintrabajo/fintrabajo.shtml

9

Figura 2. Tubos del sistema vacutainer

Cuestionario

1. Explique la diferencia entre suero y plasma.

2. ¿Es importante solicitarle al paciente que se presente en condiciones de ayuno para la

realización de pruebas diagnósticas no metabólicas?

3. Mencione pruebas de laboratorio en donde se utilice plasma y en donde se requiera de

suero.

4. ¿Qué concentración de NaCl se usa en la preparación de solución salina isotónica?

5. Mencione los factores que pueden causar hemólisis en las muestras.

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PRÁCTICA No. 3

CUENTA DIFERENCIAL DE LEUCOCITOS

Introducción

Los cinco principales tipos de leucocitos son los neutrófilos (50-70%), los eosinófilos (1-5%),

basófilos (0.5-1.0%), linfocitos (20-30%), y monocitos (2 –6%). Por cuenta diferencial se

entiende la determinación del porcentaje relativo de cada tipo de leucocito en una muestra de

sangre. Se realiza en extendidos (frotis) preparados cuidadosamente y teñidos con colorantes

tales como Wright, el cual tiñe el núcleo de los leucocitos de un color púrpura que facilita la

diferenciación (ver figura 3).

Figura 3. Tipos de leucocitos

Objetivo

Identificar los diferentes tipos de leucocitos en un frote teñido

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Material y equipo

Portaobjetos

Lancetas desechables

Algodón

Colorante de Wright

Solución reguladora pH 6.4

Microscopio

Desarrollo

1. A partir de la muestra de sangre preparar 2 extendidos (frotis) siguiendo las

indicaciones del instructor.

2. Dejar secar completamente los frotis, colocar en un puente de tinción y cubrirlos

(contar el número de gotas) con colorante de Wright. Dejar el colorante 1 minuto y

añadir el mismo número de gotas de solución reguladora pH 6.4 durante 8 minutos.

3. Lavar suavemente la preparación por 30 segundos y secar el exceso de agua.

4. Cuando la preparación esté completamente seca, colocar una gota de aceite de

inmersión y observar al microscopio.

5. Para facilitar la identificación consultar las láminas a color que ilustran los diferentes

leucocitos.

Cuestionario

1. Elabore una tabla que muestre la principal participación en la respuesta inmunitaria de

cada una de las células blancas.

2. Investigue otra técnica de tinción diferente a la de Wright.

3. Señale los porcentajes normales de los diferentes tipos de leucocitos que se encuentran

en sangre.

4. Indique cual es la población de leucocitos que predominantemente aumenta en el caso

de infecciones causadas por bacterias, parásitos, hongos, virus.

5. ¿Qué indicaría una neutrofilia en un paciente?

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PRÁCTICA No. 4

DETERMINACIÓN DEL GRUPO SANGUÍNEO

Introducción

Alrededor de 1900 Karl Landsteiner descubrió que en el humano existen cuatro tipos de

sangres con respecto a la presencia o ausencia de dos antígenos específicos denominados A y

B. Estos cuatro grupos se conocen actualmente como tipos A, B, AB y O. Este último se

caracteriza por la ausencia de los antígenos A y B. En 1940 Landsteiner y Wiener reportaron

que el suero de conejo producido contra eritrocitos de mono Rhesus podía aglutinar los

eritrocitos del 85% de una población caucásica. Este antígeno se designó inicialmente como

factor Rh, posteriormente se encontró que existe como seis antígenos a los cuales Fisher y

Race designaron con letras C, D, E, c, d, e. Uno de estos antígenos, el D es responsable de la

condición Rh positivo. La tipificación de eritrocitos en el laboratorio se realiza con antisueros

específicos contra los antígenos A, B y D, y puede realizarse por métodos en tubo o en

portaobjetos (ver figura 4).

Figura 4. Sistema ABO

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Objetivo

Demostrar por medio de una reacción de aglutinación la presencia de los Ag eritrocitarios A,

B y D.

Materiales y equipo

Muestras de sangre con anticoagulante

Pipetas graduadas de 1 y 5 mL

Tubos de ensayo de 10 X 75 mm

Solución salina isotónica


Aplicadores de madera o palillos

Sueros tipificadores anti-A

anti-B

anti-D (Rh)

Placa oscilatoria

Desarrollo

Método en tubo

1. Se obtiene aproximadamente 5 mL de sangre venosa y se colocan en un tubo con

EDTA (0.1 mL de EDTA al 1% por cada mL de sangre). Se centrífuga por 2 min. a

2000 r.p.m. para separar el plasma del paquete celular.

2. Se toman 0.1 mL del paquete celular y se resuspenden en 1.9 mL de solución salina

para una suspensión aproximada del 5%.

3. Se marcan tres tubos de la siguiente manera: anti-A, anti-B y anti-D, y se agrega una

gota del suero tipificador según corresponda.

4. Se agregan 4 gotas de la suspensión de eritrocitos a cada tubo y se agitan suavemente.

5. Los tubos se centrifugan 1 min a 2000 r.p.m.

6. Se busca la presencia de aglutinación agitando suavemente los tubos. La aglutinación

se reconoce por la formación de grumos.

7. Si la prueba en el tubo anti-D es negativa se realiza el siguiente procedimiento.

8. Se incuba a 37°C por 30 minutos, se centrífuga y se busca la aglutinación.

9. Si persiste la negatividad se lavan los eritrocitos 3 veces con 0.5 mL de solución salina

y se elimina perfectamente el sobrenadante.

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10. Se agrega una gota del suero de Coombs y se agita suavemente, se centrífuga y se

busca la aglutinación

Interpretación:

Si aglutina en el paso 6 es Rh positivo

Si aglutina en el paso 10 es Du

Si persiste la negatividad es Rh negativo.

Método en portaobjetos

1. Depositar 2 gotas de sangre en tres diferentes divisiones de un portaobjetos.

2. Agregar de izquierda a derecha una gota del antisuero anti-A, una gota de anti-B y

una gota de anti-D respectivamente.

3. Mezclar los reactivos con un aplicador de madera diferente para cada gota.

4. Agitar suavemente en la placa oscilatoria.

5. Buscar la presencia de aglutinación.

Cuestionario

1. ¿Cuántos sistemas existen para clasificar a la sangre?

2. ¿Cómo defines aglutinación y cuáles son sus ventajas y desventajas?

3. ¿Puede una persona de grupo A y una B tener como descendencia a un hijo de grupo

O? Explique

4. Mencione las ventajas y desventajas de determinar el grupo sanguíneo por los dos

métodos empleados en la práctica.

5. ¿Qué es el factor Du y qué función tiene el suero de Coombs?

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PRÁCTICA No. 5

DETERMINACIÓN DEL TITULO DE ANTICUERPOS ABO DEL

SUERO.

Introducción

El sistema de grupo sanguíneo ABO posee una característica única; la presencia de

anticuerpos fuertemente reactivos en el suero de los que carecen de los antígenos

correspondientes. Estos anticuerpos pertenecen a la clase IgM y son producidos en respuesta

a una inmunización. Se dice que estos anticuerpos se producen de manera “natural” en base

a que los inmunógenos son probablemente de origen bacteriano, dado que algunas bacterias

presentan sustancias similares a los antígenos A o B.

El “título” es una medida relativa de anticuerpos o antígenos en una reacción

serológica. Se determina realizando a partir del suero problema diluciones seriadas. El título

de anticuerpos A o B del suero se reporta como el recíproco de la máxima dilución en la cual

es posible observar eritrocitos aglutinados.

Objetivo

Establecer a través de diluciones seriadas el concepto de título aplicado en las reacciones

serológicas

Material

Suspensión de eritrocitos de grupo A o B al 5 % en SSI

Suero (plasma) de grupo O

Pipetas graduadas de 1 y 5 mL

Tubos de ensayo de 10 X 75 mm



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Sueros tipificadores anti-A

anti-B

Desarrollo

1. Colocar en una gradilla una serie de 6 tubos rotulados del 1 al 6 y se agregar 0.1 mL

de solución salina cada uno de ellos.

2. Agregar 0.1 mL del suero problema al tubo n° 1, mezclar bien y transferir 0.1 mL al

tubo n° 2 y así sucesivamente hasta el tubo n° 6 del cual se desechan 0.1 mL.

3. Agregar 4 gotas de la suspensión de eritrocitos a cada tubo y mezclar.

4. Incubar a 37°C por 15 minutos, mezclan suavemente y centrifugar a 1000 r.p.m.

durante 1 minuto.

5. Desprender el botón suavemente y buscar la presencia de aglutinación.

Interpretación

1. El título de anticuerpos en el suero problema se determina como el recíproco de la

dilución máxima en la que se observa aglutinación.

2. Además de la aglutinación se puede observar hemólisis, por lo que se debe comprobar

la presencia de hemoglobina libre

Cuestionario

1. ¿Cuál es la dilución utilizada en cada uno de los tubos?

2. Explique porqué puede variar el título de Ac en la muestra para cada paciente

3. ¿Qué es lo que se diluye en cada uno de los tubos para la cuantificación, los Ac o los

eritrocitos?

4. Porque es importante determinar el título de anticuerpos en una muestra serológica.

5. Cite tres ejemplos de pruebas serológicas donde la determinación del título de

anticuerpos ayude en el diagnóstico y vigilancia de una determinada enfermedad.

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PRÁCTICA No. 6

PRUEBAS CRUZADAS

Introducción

El objetivo de una transfusión es el proporcionar al paciente (receptor) el tipo preciso de

sangre. Por supuesto este objetivo es difícil de lograr, pero es posible aproximarse mucho si

se realizan las pruebas correctas de hemaglutinación. En primer lugar, deben determinarse con

exactitud los anfígenos de los grupos sanguíneos principales: el grupo ABO y el Rh del

paciente, sobre la base de estos grupos se selecciona la unidad de sangre de grupo ABO y Rh

compatible y se procede a efectuar las denominadas pruebas cruzadas mayor y menor.

La prueba cruzada mayor, denominada prueba de compatibilidad, se realiza mezclando

el suero del receptor con los eritrocitos del donador. Si se produce hemaglutinación, esta

sangre no puede darse al receptor porque tiene anticuerpos capaces de reaccionar y destruir la

sangre administrada. En la prueba cruzada menor, los eritrocitos del receptor son incubados

con suero del donador y se observa si hay aglutinación. Si se produce hemaglutinación, la

sangre del donador no debe administrase (ver figura 5).

En ambas pruebas una suspensión de los eritrocitos respectivos se mezclan con el

suero y la mezcla se incuba a 37°C durante unos 30-60 minutos. Después del periodo de

incubación los eritrocitos se lavan para eliminar los anticuerpos que no se han fijado a los

eritrocitos, y se añade el reactivo de Coombs (anti-globulina).

Objetivo

Realizar las pruebas de compatibilidad sanguínea denominadas “Pruebas Cruzadas”

Material

Muestras de sangre con y sin anticoagulante

Pipetas graduadas de 1 mL y 5 mL

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8 tubos de ensaye de 10 X 75 mm

Solución salina isotónica.

Baño serológico

Centrífuga

Solución de albúmina bovina al 10%

Desarrollo

1. Se obtiene una muestra de sangre del donador y receptor .

2. Se disponen 4 tubos etiquetados como sigue:

PM/S =Prueba Mayor en solución salina

pm/s =Prueba Menor en solución salina

PM/A =Prueba Mayor en albúmina

pm/a =Prueba Menor en albúmina

3. Se agregan a cada tubo los siguientes reactivos en el orden indicado:

PM/S. 2 gotas del suero del receptor + 4 gotas de eritrocitos (al 5%) del donador

pm/s. 2 gotas del suero del donador + 4 gotas de eritrocitos (al 5%) del receptor

PM/A. 2 gotas del suero del receptor + 4 gotas de albúmina + 1 gota de eritrocitos (al

5%) del donador

pm/a. 2 gotas del suero del donador + 4 gotas de albúmina + 1 gota de eritrocitos (al

5%) del receptor

4. Se mezclan bien y se incuban a 37°C por 30 minutos.

5. Se centrifugan 1 minuto a 2000 r.p.m. y se busca la presencia de aglutinación.

6. En caso de que no se presente la aglutinación, los tubos se centrifugan nuevamente y

se descarta el sobrenadante. Se lava el paquete celular de cada tubo con 1 mL de

solución salina y se centrifuga nuevamente descartando el sobrenadante. Repetir el

lavado 2 veces.

7. Al paquete celular se le agrega una gota del suero de Coombs

8. Se centrifugan 1 minuto a 2000 r.p.m. y se busca la presencia de hemaglutinación

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Figura 5. Compatibilidad entre grupos sanguíneos

Interpretación:

Si hay aglutinación en cualquiera de los tubos, será indicativo de que hay

incompatibilidad entre el posible donador y el receptor (paciente). Si no la hay, las sangres

son compatibles.

Cuestionario

1. ¿Qué significa una prueba cruzada positiva y una negativa?

2. ¿Qué factores pueden interferir en los resultados de una prueba cruzada?

3. ¿Qué características debe tener un donador sanguíneo ideal?

4. ¿Cuál es el objetivo de utilizar a la albúmina?

5. ¿Porque a las personas con grupo O Rh positivo se les conoce como donadores

universales? ¿Esto es correcto?

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PRÁCTICA No. 7

DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE INFECCIÓNES BACTERIANAS

(REACCIONES FEBRILES)

Introducción

La aglutinación de células bacterianas con antisueros es una de las pruebas serológicas más

antiguas de la inmunología práctica. Se inició como un método para el diagnóstico de las

infecciones bacterianas y fue propuesta por Widal en 1896. La pruebas de aglutinación

bacteriana tienen dos aplicaciones principales en el diagnóstico; las células bacterianas

desconocidas pueden identificarse por medio de anticuerpos conocidos, o bien utilizando

bacterias conocidas pueden identificarse los anticuerpos en el suero del paciente.

La identificación bacteriológica completa del agente patógeno es un proceso que lleva

tiempo (3 o más días), mientras se intenta el reconocimiento del agente es posible la

identificación serológica. En la aglutinación de los antígenos bacterianos con sus anticuerpos

portaobjetos produce un agregado macroscópico (ver figura 6).

Objetivo

Demostrar en el suero problema anticuerpos contra los antígenos bacterianos.

Material

Muestras de sueros problema

Placa de vidrio marcada en 6 cuadros

Pipetas graduadas de 1 y 0.2 mL

Pipeta Pasteur

Placa oscilatoria

Equipo con antígenos:

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“O” de Salmonella typhi

“H” de Salmonella typhi

“H” de Salmonella enteritidis Paratyphi A

“H” de Salmonella enteritidis Paratyphi B

Brucella abortus

Proteus OX-19

Figura 6. Aglutinación en placa

Desarrollo:

1. En una placa de vidrio perfectamente limpia se depositan 0.08 mL del suero problema

en cada una de las seis divisiones.

2. Se agrega una gota de cada antígeno comenzando por la izquierda arriba, respetando el

orden establecido.

3. Se mezclan las gotas con palillos diferentes y se agita suavemente en la placa de

rotación durante dos minutos.

4. La lectura se hace observando la aglutinación macroscópica.

5. Si aparece aglutinación con alguno de los antígenos, continuar con el siguiente paso.

6. Se toma otra placa y se depositan 0.08, 0.04, 0.02, 0.01, y 0.005 mL del suero

problema.

7. Se agrega una gota del antígeno seleccionado, se mezclan con un palillo y se revisa la

presencia de aglutinación.

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Interpretación:

1. Los volúmenes de suero empleados corresponden respectivamente a diluciones 1/20,

1/40, 1/80, 1/160 y 1/320.

2. El título de anticuerpos del suero problema se reporta como el recíproco de la máxima

dilución que muestra aglutinación.

3. La mayoría de los títulos mayores de 160 son presuntivos de infección.

4. La mejor indicación de una infección activa es un aumento en el título de dos

determinaciones sucesivas con una diferencia de 5-7 días concomitantes a la

infección.

Cuestionario

1. ¿Cuál es el fundamento del método para la determinación de las reacciones febriles y

mencione 3 enfermedades que se diagnostiquen por este método?

2. ¿Cuál sería un título clínicamente significativo en las reacciones febriles y como se

interpretaría?

3. ¿Cuál es la razón de utilizar una suspensión de Proteus OX-19 para el diagnóstico de

tifo?

4. ¿Por qué se dice que es un método cuantitativo?

5. Además de las reacciones febriles, que otras pruebas de laboratorio de deben realizar

para diagnosticar Salmonelosis y Brucelosis.

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PRÁCTICA No. 8

DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE SIFILIS

(Prueba Rápida de Reagina, RPR)

Introducción

La prueba de RPR es una prueba de floculación no treponémica macroscópica que es utilizada

para detectar y cuantificar reaginas, un anticuerpo anti-lipídico encontrado en el suero o

plasma de personas con sífilis y ocasionalmente en personas con infecciones agudas o

crónicas en otras condiciones aparte de la sífilis.

El antígeno utilizado en el equipo es una modificación del antígeno VDRL que

contiene micropartículas de carbón para realzar la diferencia entre un resultado positivo y

negativo. Si una muestra contiene reaginas, ocurre la floculación con las partículas de carbón

contenidas en la suspensión del antígeno, la cual aparece como un cúmulo negro. Las

muestras no reactivas se observan con un ligero color gris.

Objetivo

Demostrar en el suero problema anticuerpos anti-lipídicos de personas con sífilis.

Material

Muestras de sueros problema

Tarjetas de Prueba (círculos de aproximadamente de 18 mm)


Equipo con antígeno: Suspensión de Antígeno RPR conteniendo micropartículas de carbón

activado.

Control Positivo RPR.

Control Negativo RPR.

Rotador mecánico

Lámpara

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Desarrollo

Procedimiento cualitativo

1. Lleve a temperatura ambiente la suspensión del antígeno de RPR, los controles y las

muestras.

2. Tome la pipeta/agitador del extremo sellado. Al tiempo que oprime y mantiene

presionado dicho extremo, coloque la pipeta dentro de la muestra. Suelte para permitir

que la pipeta aspire un poco de muestra.

3. Sostenga en posición vertical la pipeta/agitador directamente sobre un círculo de la

tarjeta de prueba y coloque una gota de muestra sobre esta área.

4. Utilizando el extremo plano de la pipeta/agitador, extienda la muestra para cubrir el

total de la superficie del círculo. Deseche la pipeta/agitador. Repita el mismo

procedimiento para cada muestra.

5. Agite el frasco de la suspensión del antígeno antes de utilizarlo. Sosténgalo en

posición vertical y dispense varias gotas en la tapa del frasco para asegurarse de que el

paso por la aguja es correcto. No limpie la aguja. Coloque una gota de la suspensión

del antígeno sobre cada muestra. NO EXTIENDA!

6. Agite por 8 min a 100 rpm en un rotador mecánico.

7. Transcurrido este tiempo retire la tarjeta del rotador y agítela breve y suavemente.

8. Lea macroscópicamente bajo una lámpara de luz intensa.

Interpretación

Reactivo: Presencia de flóculos grandes o pequeños en el centro o la periferia del

círculo de prueba.

Débil reactivo: Presencia de flóculos pequeños pero definidos.

No reactivo: Apariencia lisa, uniforme pero sin flóculos visibles.

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Los resultados positivos deben ser confirmados mediante pruebas de las muestras

utilizando procedimientos cuantitativos. Se recomiendan pruebas serológicas confirmativas

como el ensayo de microhemaglutinación para anticuerpos treponémicos (MHA-TP). El

diagnóstico final debe estar en base a la correlación de los resultados de prueba junto con

otros hallazgos clínicos.

Procedimiento cuantitativo

1. Seleccione los sueros positivos obtenidos en la prueba cualitativa.

2. Colocar en una gradilla cuatro tubos 12 x 75 mm y numerarlos.

3. Agregar a cada uno de ellos 0.5 mL de solución salina.

4. Depositar 0.5 mL de suero problema en el tubo No. 1 y mezclar.

5. Pasar 0.5 mL del tubo No. 1 al tubo No. 2 y mezclar.

6. Continuar esta operación hasta el tubo No. 4.

7. Depositar 0.05 mL de cada una de las diluciones sobre anillos diferentes de la placa de

reacción. Extienda sobre el total de la superficie de cada círculo donde se colocaron

las diluciones.

8. Añadir una gota de la suspensión del antígeno previamente resuspendido, exactamente

sobre cada una de las gotas de las diluciones anteriores utilizando el frasco gotero al

cual se le ha insertado la aguja No. 18 sin bisel.

9. Agite por 8 min a 100 rpm en un rotador mecánico.

10. Transcurrido este tiempo retire la tarjeta del rotador y agítela breve y suavemente.

11. Leer el resultado macroscópicamente.

Interpretación

La última dilución que contenga agregados macroscópicos indica el título de la muestra (ver

tabla 1).

Tabla 1. Ejemplo de lectura para obtener el título

Número de tubo Dilución del suero Resultado

1 1:2 Positivo

2 1:4 Positivo

3 1:8 Positivo

4 1:16 Negativo

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El título del suero problema será: 1:8.

Limitaciones de la prueba

El diagnóstico de la sífilis no debe ser hecho basado en un resultado positivo único de

una prueba no treponémica, sin el soporte de una historia positiva o evidencia clínica. Las

muestras de suero que son reactivas en pruebas cualitativas deben ser cuantificadas para

establecer un tratamiento en el cual los cambios de título puedan ser determinados como un

indicador de la respuesta al mismo. Las muestras de plasma no deben ser utilizadas para

pruebas cuantitativas. Las muestras que son no-reactivas pero dudosas, se deben de repetir y

cuantificar ya que se pueden detectar reacciones poco frecuentes de prozona.

Cuestionario

1. Menciona al agente etiológico de la sífilis y menciona las características de la

enfermedad, tomando en cuenta signos y síntomas del paciente

2. ¿Porque se han clasificado las pruebas para el diagnóstico de sífilis en treponémicas y

no treponémicas?, menciona una de cada una

3. Menciona el fundamento del VDRL e indica algún caso en donde sea solicitada la

prueba 4.- ¿Qué ventajas tiene la prueba de RPR sobre el VDRL?

4. ¿Qué enfermedades pueden dar resultados falsos positivos en las pruebas no

treponémicas.?

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PRÁCTICA No. 9

FACTOR REUMATOIDE

Introducción.

Los factores reumatoides son anticuerpos dirigidos contra los determinantes antigénicos de la

región Fc de las IgG. En personas sanas, estos anticuerpos pueden hallarse en baja

concentración, sin embargo se encuentra aumentado en la mayoría de los pacientes con artritis

reumatoide. La determinación del factor reumatoide se lleva a cabo con partículas de latex

cubiertas de IgG.

Objetivo

Realizar la determinación del Factor Reumatoide por aglutinación en placa.

Material y equipo

Muestras de sueros

Placa de vidrio oscuro marcada



Pipeta Pasteur

Reactivo de latex-FR

Solución amortiguadora de glicina-cloruro de sodio pH 8.2


Placa rotatoria

Desarrollo

Factor Reumatoide (FR). Por el método de aglutinación en látex en placa, utiliza una

suspensión estabilizada de partículas de látex sensibilizadas con IgG humana.

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1. El suero se diluye 1:20 con amortiguador de glicina-cloruro de sodio colocando 0.1

mL de suero y 1.9 mL del amortiguador.

2. Se coloca una gota de la dilución en la placa de vidrio oscura y se añade una gota del

reactivo látex-FR.

3. Se mezcla y se agita suavemente en la placa rotatoria durante dos minutos.

4. Se busca la aglutinación macroscópica.

5. La prueba semicuantitativa utiliza diluciones del suero 1/20, 1/40, 1/80, 1/160, 1/320 y

1/640, las cuales se preparan con 0.5 mL de la dilución 1/20 en 0.5 mL del

amortiguador para una dilución 1/40 y así consecutivamente.

Cuestionario

1. ¿Qué es el factor reumatoide y explique el fundamento de la prueba?

2. Indique de que están hechos los controles positivos y negativos para la prueba de FR

3. Explique cómo se calcula el título para factor reumatoide y explique el significado

clínico de una prueba FR positiva

4. Además de la artritis reumatoide, que otras enfermedades dan un resultado positivo de

este factor.

5. ¿Un resultado negativo del factor reumatoide descarta el diagnóstico de artritis

reumatoide?

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PRÁCTICA No. 10

PROTEINA C REACTIVA

Introducción

La Proteína C reactiva forma parte de las proteínas de fase aguda, un conjunto de proteínas

del suero cuya concentración aumenta de manera drástica durante el daño tisular, la infección

o el estrés. No es específica de una enfermedad sino que es un indicador del proceso

inflamatorio.

Objetivo: Realizar la determinación de la Proteína C reactiva por aglutinación en placa.

Material

Muestras de sueros

Placa de vidrio oscuro marcada



Pipeta Pasteur

Reactivo de látex- Proteína C reactiva

Solución amortiguadora de glicina-cloruro de sodio pH 8.2


Placa rotatoria

Desarrollo

Proteína C reactiva (PCR). Por el método de aglutinación en látex en placa. Utiliza una

suspensión acuosa de partículas de látex recubiertas de anticuerpos específicos anti- Proteína

C reactiva.

1. El suero problema se diluye 1/20, con amortiguador de glicina- cloruro de sodio y se

coloca una gota de la dilución en una placa de vidrio oscuro.

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2. Se añade una gota del reactivo latex-PCR se mezcla bien y se agita suavemente en la

placa rotatoria por 3 min.

3. Se busca la aglutinación macroscópica.

4. La prueba semicuantitativa utiliza diluciones del suero a partir de 1/80.

Cuestionario

1. ¿Qué es la proteína C reactiva y explique el fundamento de la prueba?

2. Indique de que están hechos los controles positivos y negativos para la prueba de

proteína C reactiva

3. Explique cómo se calcula el título para PCR

4. Explique el significado clínico de una prueba PCR positiva

5. ¿Cuál es el valor diagnóstico de la Proteína C reactiva?

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PRÁCTICA No. 11

DETERMINACIÓN DE ANTIESTREPTOLISINAS

Introducción

Las estreptolisinas son enzimas hemolíticas producidas por la mayoría de los estreptococos

del grupo A, destruyen la membrana de los eritrocitos ocasionando la hemólisis. Este

producto bacteriano es una de las muchas toxinas extracelulares y enzimas producidas por los

estreptococos.

En particular, la estreptolisina O recibe este nombre debido a que sensible al oxígeno,

solo posee actividad en estado reducido, razón por la cual se le incorpora un reductor (el

hidrosulfito de sodio) inmediatamente antes de usarla. En el laboratorio las ASO pueden

determinarse por una reacción serológica de neutralización, en la cual si el suero del paciente

contiene anticuerpos contra la enzima (antiestreptolisinas) neutralizarán su capacidad

hemolítica y ocurrirá inhibición de la hemólisis.

Objetivo

Determinar el título de anticuerpos contra la estreptolisina “O” en el suero problema

Material

Muestras de suero

Suspensión de eritrocitos al 5%

Amortiguador para ASO (fosfatos pH 6.5)

Estreptolisina O

Baño serológico

Centrífuga

Pipetas graduadas de 1 mL y 5 mL

15 tubos de ensaye de 10 X 75 mm

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Desarrollo

1. Preparar a partir del suero problema las siguientes diluciones iniciales:

a) 1:10 con 0.2 mL del suero problema + 1.8 mL de solución amortiguadora

b) 1:100 con 0.3 mL de la dilución 1:10 + 2.7 mL de solución amortiguadora

c) 1:500 con 0.6 mL de la dilución 1:100 + 2.4 mL de solución amortiguadora

2. Rotular los tubos de ensaye con números del 1 al 12 y dos más como control (+) y

control (-).

3. Preparar diluciones secundarias añadiendo primero el volumen de solución

amortiguadora y posteriormente el volumen del suero diluido según se indica en la

tabla 2.

Tabla 2. Diluciones para la prueba de antiestreptolisinas

Tubos N° 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 (+) (-)

mL amortiguador 0.1 0.4 --- 0.1 0.2 0.3 0.35 --- 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.75

Dilución 1:10 1:100 1:500

mL suero diluido 0.4 0.1 0.5 0.4 0.3 0.2 0.15 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 --- ---

Unidades Todd 12 50 100 125 166 250 333 500 625 833 1250 2500

4. Mezclar suavemente y añadir a cada tubo 0.25 mL de estreptolisina, EXCEPTO al

tubo control (-).

5. Mezclar por agitación e incubar a 37°C por 15 min.

6. Añadir a cada tubo 0.25 mL de una suspensión de eritrocitos al 5%., mezclar e incubar

a 37°C por 30 min.

7. Centrifugar los tubos a 2500 rpm por 2 min.

8. Comprobar la presencia de hemólisis completa en el tubo control (+) y la ausencia de

hemólisis en el tubo control (-)

9. Determinar el título de antiestreptolisinas (unidades Todd) como el de la máxima

dilución que no presenta hemólisis.

Cuestionario

1. ¿Qué son las antiestreptolisinas e indica el fundamento de la prueba?

2. Menciona dos motivos para montar el control negativo y dos motivos para montar el

control positivo

3. ¿Por qué la enzima estreptolisina se tiene que activar en el momento de utilizarla?

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4. ¿A partir de qué dilución, un suero positivo se considera sugestivo de infección por

Streptococcus?

5. ¿Qué complicaciones pueden presentarse debido a una infección por Streptococcus

pyogenes?

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PRÁCTICA No. 12

DETERMINACIÓN DE LA HORMONA GONADOTROPINA

CORIONICA HUMANA

Introducción

Las pruebas de laboratorio para el diagnóstico del embarazo se basan en la determinación de

la gonadotropina coriónica humana (hGC), hormona producida por la placenta y que puede

detectarse tanto en el suero como en la orina. La excreción de hGC alcanza su máximo

durante la duodécima a decimocuarta semana de gestación y a partir de entonces desciende de

nivel. Hasta los años 60, las pruebas de embarazo eran bioensayos en los cuales la presencia

de la hGC en el suero o en la orina se demostraba por su efecto en animales.

Las primeras pruebas utilizaban ratones y conejos, las pruebas ulteriores ratas hembra

o ranas. Actualmente estas pruebas han sido sustituidas por pruebas inmunológicas. Las

pruebas inmunológicas dependen del anticuerpo anti-hGC. La presencia de hGC en el suero u

orina se demuestra por un sistema indicador.

Los ensayo de aglutinación denominados de “inhibición de la aglutinación” consisten de

eritrocitos de conejo o partículas de látex recubiertas con hGC. Cuando se realiza la prueba,

el suero u orina de la paciente se incuban con el anticuerpo. Si existe hGC en la muestra, el

anticuerpo es inactivado y los eritrocitos o partículas de látex no aglutinan. Si la muestra no

contiene hGC, el anticuerpo permanece activo y se produce la aglutinación.

Además de la aglutinación, existen otras técnicas inmunológicas para la

determinación de la hGC, tales como los inmunoensayos enzimáticos (ELISA) y el

radioinmunoanálisis (RIA), el cual requiere de equipo especial para su realización. Esta

técnicas varían en su sensibilidad, esto es las pruebas inmunológicas son, más sensibles al

35

detectar concentraciones menores de hGC, por ejemplo las pruebas con eritrocitos tienden a

ser más sensibles que la que emplean partículas de látex.

Objetivo

Determinar la presencia de la hormona Gonadotropina Coriónica Humana en una muestra de

orina.

Material

Muestra de Orina (10 mL)

Muestra de suero

Equipo de diagnóstico de hGC

Desarrollo

El método que se utilizará en esta práctica es un inmunoensayo de flujo lateral. (STICK

hGC). El método utiliza una combinación única de conjugado anticuerpo monoclonal y

anticuerpos policlonales en fase sólida. La sensibilidad del método es de 10 mIU/mL. El

método consiste en introducir la tira reactiva en la orina centrifugada hasta la marca,

esperando a que migre hasta la marca superior por medio de capilaridad. El conjugado

anticuerpo-colorante se une a la hGC formando un complejo anticuerpo-antígeno. Este

complejo se une al Anti-hGC que se encuentra fijo en la zona de prueba generando una banda

color rosa. En ausencia de la hormona no se forma este complejo. La mezcla de reacción

continúa migrando a lo largo de la tira hasta la zona control. El conjugado libre aún, se une a

los anticuerpos fijos contra la fracción FC de los anti-hGC dando lugar a una banda rosa,

demostrando que el reactivo está funcionando correctamente y que migro por toda la tira (ver

figura 7).

1. Atemperar la muestra y las tiras reactivas

2. Colocar 0.5 mL de orina o suero en un tubo pequeño

3. Introducir verticalmente la tira hGC en la muestra durante 10-15 segundos. No

sobrepasar la marca MAX.

4. Leer la tira en los 3 minutos siguientes para orina y en los 5 minutos siguientes

para suero.

Interpretación

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Prueba negativa: Si solo aparece una banda coloreada transversal en la zona control.

Prueba positiva: Además de la banda en la zona control debe aparecer una segunda banda

en la zona prueba de la tira.

No válido: Si no aparece la banda en la zona control

Cuestionario

1. Mencione otros métodos serológicos para determinar la hormona hGC

2. Investigue que tipo de sustancias presentes en la orina de la paciente pueden interferir

y dar un resultado falsamente positivo

3. Indique la diferencia en determinar la hormona, en una muestra de orina o en una

muestra de suero

4. ¿Cuál es la estructura de la hGC y hacia qué subunidad están dirigidas las pruebas de

embarazo?

5. En qué casos diferentes a embarazo la hGC podrá resultar positiva

NEGATIVO POSITIVO

Figura 7. Interpretación de la tira reactiva

Zona control

Zona prueba

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BIBLIOGRAFÍA

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Edición. Interamericana- Mc Graw-Hill.

2. Janeway, C. A. and Travers P. 1996. Immunobiology the immune system in health and

disease. 2ª Edición. Current Biology-Garland..

3. Goldsby, R. A., Kindt, T. J., Osborne, B. A., Kuby, J. 2003. Inmunología. 5a Edición.

Mc Graw- Hill

4. Regueiro, J.R. y López L. C. 1998. Inmunología biología y patología del sistema

inmune. 2ª Edición. Editorial Médica Panamericana

5. Roitt, I. 1998. Inmunología fundamentos. 9ª Edición. Editorial Médica Panamericana.

6. Roitt, I., Brostoff, J. and Male D. 2000. Inmunología 5ª edición. Ediciones Harcourt.

España

manual de inmunología 2013

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