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LUCAS DE LUCENA SIMÕES E SILVA

Efeito do treinamento físico na doença hepática gordurosa não alcoólica

(DHGNA) em camundongos obesos: aspectos relacionados com a

inflamação e resistência insulínica

Dissertação apresentada à Faculdade de

Medicina da Universidade de São Paulo para

obtenção do título de Mestre em Ciências

Programa de Ciências em Gastroenterologia

Orientador: Prof. Dr. José Jukemura

São Paulo

2020

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)

Preparada pela Biblioteca daFaculdade de Medicina da Universidade de São Paulo

©reprodução autorizada pelo autor

Responsável: Erinalva da Conceição Batista, CRB-8 6755

Silva, Lucas de Lucena Simões e Efeito do treinamento físico na doença hepáticagordurosa não alcoólica (DHGNA) em camundongosobesos : aspectos relacionados com a inflamação eresistência insulínica / Lucas de Lucena Simões eSilva. -- São Paulo, 2019. Dissertação(mestrado)--Faculdade de Medicina daUniversidade de São Paulo. Programa de Ciências em Gastroenterologia. Orientador: José Jukemura.

Descritores: 1.Fígado gorduroso 2.Exercício3.Camundongos obesos 4.Resistência à insulina5.Inflamação 6.Fígado 7.Pâncreas

USP/FM/DBD-275/19

A todos aqueles qυе dе alguma forma

estiveram е estão próximos dе mim, fazendo

esta vida valer cada vеz mais а pena.

Agradecimentos

É chegado então o momento de expressar os mais sinceros agradecimentos a

muitos e tantos adorados familiares, amigos e colegas de trabalho.

Ao meu orientador, Prof. José Jukemura, por suas orientações, pelo seu

otimismo e senso de humor para enfrentar os momentos de dificuldades durante

esta jornada e que no alto de sua sabedoria, soube ser tão humilde ao repassar

todo o seu conhecimento e que esteve comigo até a sua completa conclusão.

À Prof.ª Claudia Oliveira pela sua diferenciada visão e perspectiva com as

diferentes áreas da saúde, por me acolher em seu grupo de pesquisa quando

ainda estava na graduação e ter dedicado um pouco da sua rotina agitada para

ouvir minhas ideias, além de suas orientações e contribuições não só para o

trabalho mas também para vida.

Ao Prof. Stefano Tadeu pelas boas e descontraídas conversas durante aquelas

tardes no laboratório, além de compartilhar seus conselhos e experiências de

vida para engrandecimento profissional e principalmente pessoal.

À Prof. Márcia Kubrusly, por suas orientações e experiências de vida, além de

conselhos e experiências de laboratório, por sempre estar me motivando a

continuar em frente de cabeça erguida principalmente nos momentos de

dificuldades.

Ao meu colega de mestrado e amigo Matheus Santos, por estar no dia-a-dia na

pesquisa ao meu lado, sempre visando o sucesso profissional e pessoal.

A todos os integrantes do grupo de pesquisa em NASH da prof.ª Claudia, em

especial ao Mauro Duarte por compartilhar um pouco de sua rotina não só no

grupo mas também suas experiências na USP, reforçando ainda mais a

importância e o papel das diversas áreas da saúde no tratamento multidisciplinar.

Aos integrantes do grupo de pesquisa da EACH e em especial a Fabiana

Evangelista por dividir seus conhecimentos profissionais e vivências de

laboratório para o treinamento dos animais.

À Vilma por sua disposição e sua paciência, por sempre me atender com aquele

sorriso descontraído e alegre mesmo em momentos corridos.

A todos os professores que contribuíram diariamente com seu conhecimento e

dedicação e que foram importantes na minha jornada acadêmica.

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo

apoio financeiro.

À Deus, por permitir que tudo isso acontecesse e pelo imenso prazer que é viver

amparado por suas mãos, por sua proteção e suas bênçãos.

À meus queridos pais e familiares por suas sábias lições de vida e de esperança,

sempre alimentando meus sonhos e me enchendo de amor e carinho,

depositando a confiança necessária para realizar meus sonhos.

À minha querida noiva Eline Autran por estar comigo desde o início desta jornada

sempre me dando forças e depositando suas esperanças, por me aguentar nos

momentos de raiva e angústia, por respeitar minhas vontades e necessidades

durante este processo, por sua compreensão, força de motivação e apoio moral

para a execução deste trabalho.

Há muito mais a quem agradecer. A todos aqueles que, embora não nomeados,

me brindaram com seus inestimáveis apoios em distintos momentos e por suas

presenças afetivas e inesquecíveis, o meu reconhecido e carinhoso muito

obrigado!

Todos vocês foram partes fundamentais para execução deste trabalho!

Sumário:

Lista de Abreviaturas

Lista de Símbolos

Lista de Siglas

Lista de Tabelas

Lista de Figuras

Resumo

Abstract

1.0 – INTRODUÇÃO: ....................................................................................... 19

2.0 – OBJETIVOS: ........................................................................................... 25

2.1 – Objetivo Geral: ..................................................................................... 25

2.2 – Objetivos Específicos: .......................................................................... 25

3.0 – MATERIAIS E MÉTODOS: ..................................................................... 27

3.1 – Local: ................................................................................................... 27

3.2 – Aspectos Éticos: .................................................................................. 27

3.3 – Procedimentos experimentais e delineamento do estudo:................... 27

3.3.1 – Modelo experimental: .................................................................... 27

3.3.2 – Delineamento experimental: .......................................................... 27

3.4 – Avaliações metabólicas ....................................................................... 28

3.5 – Teste de esforço físico máximo ........................................................... 28

3.6 – Protocolo de treinamento físico ........................................................... 28

3.7 – Eutanásia e Coleta de materiais para análise: ..................................... 29

3.8 – Avaliação Histológica ........................................................................... 29

3.9 – Extração do RNA Tecidual ................................................................... 30

3.10 – Quantificação e Análise da Integridade do RNA Total ....................... 31

3.11 – PCR quantitativo em tempo real (RT-qPCR): .................................... 31

3.12 – Método de análise da expressão gênica............................................ 32

3.13 – Análises Estatísticas: ......................................................................... 33

4.0 – RESULTADOS ........................................................................................ 35

4.1 – Avaliações metabólicas: ...................................................................... 35


4.3 – Histologia Hepática: ............................................................................. 40

4.4 – Histologia Pancreática: ........................................................................ 40

4.5 – Expressão genica: ............................................................................... 45

5.0 – DISCUSSÃO: .......................................................................................... 50

6.0 – CONCLUSÃO: ......................................................................................... 60

REFERÊNCIAS

Lista de Abreviaturas:

ad libitum à vontade

AKT Proteína quinase B

DHGNA Doença Hepática Gordurosa Não Alcoólica

E. coli Escherichia coli

EHNA Esteato Hepatite Não Alcoólica

et.al. e outros

EUA Estados Unidos da América

Fig Figura

foz/foz fat aussie

GLUT-2 Transportador de Glicose 2

gr Gramas

IL-10 Interleucina 10

IL-1b Interleucina 1 beta

IL-6 Interleucina 6

IRS-1 Receptor Substrato de Insulina 1


m Metros

máx Máximo

mín Mínimo

min Minutos

mRNA Ácido ribonucleico mensageiro

ob/ob obeso/obeso

OT-NP cardiac oxytocin natriuretic peptide

RNA Ácido Ribonucleico

SED Sedentário

seg Segundos

TF Treinados

TLR Receptores do Tipo Toll

TNF-a Fator de Necrose Tumoral alfa

Lista de Símbolos:

km/h Quilômetros por hora

% Porcentagem

mL/kg Mililitros por quilograma

µL Microlitros

® Marca Registrada

™ Trade Mark

ºC Graus Celsius

β Beta

ΔCt Delta Ct

ΔΔCt Delta Delta Ct

p Nível de Significância

< Menor que

Lista de Siglas:

ACSM American College of Sports Medicine

CEUA Comissão Ética do Uso de Animais

DP Desvio Padrão

EACH – USP Escola de Artes, Ciências e Humanidades da

Univesidade de São Paulo

FMUSP Faculdade de Medicina da Universidade de São

Paulo

HC – FMUSP Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da

Universidade de São Paulo

HE Hematoxilina – Eosina

LIM – 07 Laboratório de Investigação Médica 07 (Laboratório

de Gastroenterologia Clínica e Experimental)


de Transplante e Cirurgia do Fígado)

QR Quantificação Relativa

rpm Rotações por minuto

RT – qPCR Real Time quantitative Polymerase Chain Reaction

Lista de Tabelas:

Tabela 1 – Ganho de peso corporal e consumos ao final do protocolo

experimental ..................................................................................................... 37

Tabela 2 – Peso dos órgãos e tecidos adiposos de camundongos ob/ob de

ambos os grupos ao final do protocolo de treinamento físico (peso absoluto e

peso relativo) .................................................................................................... 38

Tabela 3 – Tabela de caraterísticas histológicas do tecido hepático de

camundongos obesos (ob/ob) .......................................................................... 40

Tabela 4 – Tabela de descrição da análise histológica pancreática realizada em

ambos os grupos de estudo após o procotolo de treinamento físico ................ 41

Lista de Figuras:

Fig 1: Gráficos de comparação da média de peso corporal entre os grupos e de

evolução de peso corporal dos grupos de estudo frente ao protocolo de

treinamento físico aeróbio de 8 semanas. ........................................................ 36

Fig 2: Gráficos de consumo de água e ração de ambos os grupos de estudo

frente ao protocolo de treinamento aeróbio de 8 semanas .............................. 37

Fig 3: Resultados de ambos os grupos de estudo obtidos através do teste de

esforço físico máximo frente às variáveis ligadas ao protocolo de treinamento

físico aeróbio .................................................................................................... 39

Fig 4 Histologia pancreática de camundongos ob/ob: Gordura Visceral

adjacente (ampliação original X 10) ................................................................. 42

Fig 5 Histologia pancreática de camundongos ob/ob (ampliação original X 20)

......................................................................................................................... 42

Fig 7: Gráfico de comparação entre os animais sedentários e treinados frente

as análises de resistência à insulina no tecido hepático .................................. 45

Fig 8: Gráfico de comparação entre os animais sedentários e treinados

referente as análises de expressão gênica referentes à inflamação no tecido

hepático ............................................................................................................ 46

Fig 9: Gráfico de comparação dos grupos de estudo frente as análises de

expressão gênica referentes à resistência insulínica no tecido pancreático .... 47


expressão gênica referentes à inflamação no tecido pancreático .................... 48

RESUMO

Silva LLS. Efeito do treinamento físico na doença hepática gordurosa não

alcoólica (DHGNA) em camundongos obesos: aspectos relacionados com a

inflamação e resistência insulínica [dissertação]. São Paulo: Faculdade de

Medicina, Universidade de São Paulo; 2019.

A Doença Hepática Gordurosa Não Alcoólica (DHGNA), compreende um amplo

espectro de condições que variam desde uma esteatose simples, às condições

mais graves como Esteatohepatite Não Alcoólica (EHNA) fibrose hepática e

cirrose. Entre os fatores relacionados a progressão da doença, a inflamação e a

resistência à insulina são apontados como fundamentais. Além disso, o recente

aumento considerável no número de casos desta doença se deve em parte, ao

comportamento sedentário e reduções drásticas no nível de atividade física.

Mudanças nos hábitos de vida são essenciais para prevenção e controle da

DHGNA. Objetivo: Avaliar o efeito do treinamento físico aeróbio de 8 semanas

em aspectos relacionados com a resistência à insulina e resposta inflamatória

em camundongos obesos com DHGNA Métodos: Foram utilizados 14

camundongos ob/ob com 6 semanas de vida divididos em dois grupos de estudo:

sedentário e treinado. Os animais do grupo treinado realizaram 5 sessões

semanais de 60 minutos de treinamento físico em esteira rolante com

intensidade constante de 60% da velocidade máxima obtida através do teste de

esforço físico. Os animais do grupo sedentário não realizavam o treinamento

físico. Após o período de 8 semanas, os animais foram submetidos a eutanásia

e amostras de tecido hepático e pancreático, foram coletadas para verificar

características histológicas, avaliação dos genes relacionados com a resposta

inflamatória e resistência à insulina. Foram coletados os tecidos adiposos para

verificar a diferença na quantidade de gordura encontrada em cada região do

animal. Para obtenção do material genético, foi realizado a extração do RNA por

TRIzol® e após a verificação de quantidade e integridade do material, foi

realizado a reação em cadeia polimerase, através do equipamento Rotor Gene

RG – 3000. Foi utilizado o teste-t, ANOVA one way e pós teste de Bonferroni de

comparações múltiplas para os dados paramétricos e testes de Mann-Whitney

com pós-teste Dunn's de comparações múltiplas para dados não paramétricos.

Em relação aos escores histológicos foi utilizado o teste Qui-quadrado com exato

de Fisher. Foram consideradas variáveis significativas quando o p< 0,05. Todos

os cálculos e análises foram realizados com o software GraphPad Prism V6.0

(GraphPad Software Inc). Resultados: Foram observadas diferenças

significantes para peso corporal (p=0.008), evolução de peso (p=0.03), consumo

de ração (p<0.0001) além de diminuição no conteúdo de gordura da região

retroperitonial (p=0.03). Além disso, foram observadas diferenças significantes

para velocidade pico (p=0.03), distância (p=0.01) e tempo (p=0.006). A análise

histológica não mostrou diferenças estatísticas entre os grupos em ambos os

órgãos. Nas análises de expressão gênica, foram observadas diferenças

significantes nos genes de GLUT-2 (p=0.03), IL-6 (p= 0.01) e IL-10 (p=0.03)

hepáticos. Em relação ao pâncreas, foi observada diferença significante para os

genes de IRS-2 (p=0.004), GLUT-2 (p=0.03), IL-6 (p=0.002) e IL-10 (p=0.008).

Conclusão: Um protocolo de treinamento físico de 8 semanas foi capaz de

atenuar o ganho de peso corporal, consumo alimentar e gerar efeitos positivos

na expressão de genes relacionados com resistência à insulina e inflamação no

fígado e pâncreas de camundongos ob-ob.

Descritores: Fígado gorduroso; Exercício; Camundongos obesos; Resistência

à insulina; Inflamação; Fígado; Pâncreas.

ABSTRACT

Silva LLS. Physical training effect in obese mice with non-alcoholic fatty liver

disease: aspects related to insulin resistance and inflammation (dissertation).

São Paulo: “Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo”; 2019.

Non-alcoholic Fatty Liver Disease (NAFLD) encompasses a wide spectrum of

pathologies from hepatic steatosis, nonalcoholic steatohepatitis (NASH), fibrosis

and cirrhosis. Insulin resistance and inflammation are reported as the main

factors for disease progression. Moreover, the increase in the number of new

cases of NAFLD can be explained by sedentary behavior and drastic reductions

in physical activity levels, therefore, lifestyle modifications are essencial for

prevention and control of the disease. Objective: Evaluate the effect of 8 weeks

of aerobic training on insulin resistance and inflammatory response in obese mice

(ob/ob) with NAFLD. Methods: Male ob/ob mice were randomly divided into

sedentary (n=7) and trained (n=7) groups. Aerobic training consisted of 5 weekly

sessions, 60 min per session at 60% of the maximum speed of the running test.

Hepatic and pancreatic samples were collected to evaluate histological features

and gene expression associated with insulin resistance and inflammatory

response after 8 week experiment protocol. RNA was performed by TRIzol®.

PCR experiments were performed using the Rotor Gene RG – 3000. Parametric

data were assessed by t-test, ANOVA one way and Bonferroni test for multiple

comparisons. Non-parametric data were assessed by the Mann-Whitney tests

with Dunn's post-test of multiple comparisons. Histological analysis was

assessed by chi-square test with Fisher's exact test. Significant variables were

considered when p <0.05. All the analyzes were performed by GraphPad Prism

V6.0 software (GraphPad Software Inc). Results: Reductions in body weight (p

= 0.008), weight evolution (p = 0.03), food intake (p <0.0001) and fat content were

observed in trained group. Moreover, the trained group showed better results in

peak velocity (p=0.03) physical effort tolerance (p=0.006) and distance (p=0.01).

Histological analysis showed no statistical differences between groups in both

organs. Gene expression showed differences in IL-6 (p= 0.01), IL-10 (p=0.03)

and GLUT-2 (p=0.03) in hepatic analysis, between groups. Pancreatic gene

expression showed difference between groups in IRS-2 (p=0.004), GLUT-2

(p=0.03), IL-6 (p=0.002) and IL-10 (p=0.008) analysis. Conclusions: An 8-week

physical training protocol was able to attenuate body weight gain, food intake and

generate positive effects on gene expression related to insulin resistance and

inflammation in both liver and pancreas of ob/ob mice.

Descriptors: Fatty liver; Exercise; Mice, Obese; Insulin resistance; Inflammation;

Liver; Pancreas.

INTRODUÇÃO

19

1.0 – INTRODUÇÃO:

A Doença Hepática Gordurosa Não Alcoólica (DHGNA) engloba um

espectro de modificações hepáticas que vão desde um simples depósito de

gordura no interior do hepatócito, sem inflamação ou fibrose, o que caracteriza

um processo de esteatose simples, até casos de esteatohepatite não alcoólica

(EHNA), cirrose e, carcinoma hepatocelular em pacientes sem histórico de

etilismo. Atualmente é considerada uma das formas mais frequentes de

manifestação hepática, geralmente associada a quadros clínicos de obesidade,

resistência à insulina e diabetes mellitus tipo ll [1].

A real prevalência da DHGNA é desconhecida, pois a maioria dos

indivíduos acometidos por esta doença, mesmo aqueles com diabetes,

apresentam aminotransferases hepáticas normais e os médicos não suspeitam

da possível presença de DHGNA [2]. Estima-se que a prevalência global da

doença seja em torno de 24%, sendo a população obesa a mais afetada,

podendo variar entre 70 – 90% [3]. Em todos os continentes, é possível observar

um número considerável de indivíduos afetados por esta doença sendo as

maiores taxas reportadas na América do Sul (31%) e no Oriente Médio (32%),

seguidas pela Ásia (27%), EUA (24%) e Europa (23%), enquanto que o

continente Africano apresenta a menor prevalência (14%) [4]. No Brasil, cerca

de 30% da população é afetada pela doença, no entanto, este número pode

variar devido ao método de avaliação utilizado e pela grande diversidade étnica

da população brasileira [5 6].

A DHGNA tem se tornado cada vez mais comum em todas as populações,

principalmente no ocidente, devido ao processo de industrialização e mudanças

inadequadas no estilo de vida. Além disso, espera-se que o número de

indivíduos afetados aumente nos próximos anos, em consonância com o

aumento da obesidade devido à adoção de uma dieta rica em gordura e

inatividade física. Nos EUA, tornou-se a segunda causa mais comum de

transplante hepático e provavelmente se tornará a principal causa nos próximos

10 anos [7].

20

Os princípios fisiopatológicos da DHGNA, principalmente os fatores que

contribuem para sua progressão, evoluíram significativamente ao longo dos

anos, fazendo com que a teoria dos “múltiplos hits” [8] se tornasse obsoleta.

Vários eventos podem resultar na esteatose hepática. O desenvolvimento desta

condição é dependente do fluxo de ácidos graxos livres (AGL), que podem ser

derivados da lipólise periférica, ou seja, ácidos graxos liberados do tecido

adiposo, diminuição da oxidação de AGL, aumento da de novo lipogênese (DNL)

e diminuição da exportação de lipídios hepáticos via lipoproteínas de densidade

muito baixa (VLDL), além de fatores externos como dietas hiperlipídicas e / ou

consumo exacerbado de alimentos ricos em açúcares simples [9]. Dentre os

fatores que contribuem para a progressão e gravidade da doença, a resistência

à insulina tem sido caracterizada como o fator fisiopatológico crucial na DHGNA

[10]. Tanto a resistência à insulina hepática quanto a periférica, apresentam

estreita correlação com a DHGNA, independente da gravidade da doença [11].

A resistência à insulina é um fator fundamental para o desenvolvimento e

progressão da DHGNA. O excesso de ácidos graxos, cuja produção é induzida

pela lipogênese e síntese de ácidos graxos, assim como pelos ácidos graxos

oxidados, circula nos tecidos periféricos, incluindo o fígado e o tecido adiposo,

onde se acumulam, resultando em resistência à insulina [12]. O tecido adiposo

é um mediador do armazenamento sistêmico de lipídeos, além de ser um órgão

endócrino que secreta hormônios e o grupo de citocinas conhecidas como

adipocinas, como adiponectina e leptina. Na condição de DHGNA, o excesso de

lipídios intrahepáticos é responsável por mudanças na atividade macrofágica,

que por sua vez, secretam mediadores inflamatórios como fator de necrose

tumoral alfa (TNF-a), e interleucina 1 beta (IL-1b), levando a resistência à insulina

sistêmica e progressão para EHNA.

No fígado, a resistência à insulina é definida pela supressão na produção

de glicose, mediada pelo comprometimento da insulina, resultando no aumento

da gliconeogênese e diminuição da síntese hepática de glicogênio. A síntese de

glicogênio hepático estimulada por insulina, por sua vez, correlaciona-se

negativamente com o conteúdo de gordura no fígado [13]. Em pacientes obesos

e portadores de DM2, a presença de DHGNA está associada a hiperinsulinemia,

dislipidemia e resistência insulínica mais graves no tecido hepático e adiposo do

21

que em pacientes sem DHGNA [14]. Vários conceitos podem explicar a

associação entre DHGNA e resistência à insulina: o acúmulo de gordura no

fígado pode ter origem na resistência à insulina e hiperinsulinemia [15] ou

diretamente na disponibilidade excessiva de lipídios.

Outro fator que contribui não só para o aumento da resistência à insulina,

mas também para a fisiopatogênese e progressão da DHGNA é o processo

inflamatório e suas vias. As vias inflamatórias têm sido cada vez mais

reconhecidas como criticamente envolvidas no desenvolvimento da resistência

à insulina [16 17]. No entanto, a etiologia da resistência à insulina é complexa e

envolve muitas vias diferentes além da inflamação [18]. Atualmente, ainda não

está claro em quais locais os processos inflamatórios são iniciados. Além do

tecido adiposo, o trato gastrointestinal, com sua microbiota marcadamente

alterada, pode refletir um dos primeiros eventos na evolução da resistência à

insulina e da DHGNA [19].

Estudos em camundongos com depleção hepática de AKT e FOXO1, que

adaptam seus fluxos de glicose adequadamente a jejum e alimentação [20],

revelaram que a IL-6, liberada dos macrófagos do tecido adiposo, inibe a lipólise

mediada pela insulina no tecido adiposo branco e leva a maior entrega de AGL

e glicerol para o fígado [21]. Como resultado, as concentrações hepáticas de

acetil-CoA são elevadas, devido ao aumento da β-oxidação dos ácidos graxos,

que estimula a gliconeogênese hepática através da ativação alostérica da

piruvato carboxilase mitocondrial. Da mesma forma, os adolescentes que são

obesos e resistentes à insulina apresentam maiores concentrações de IL-6

derivadas do tecido adiposo em comparação a indivíduos magros [21]. A rápida

redução mediada por insulina na produção de glicose hepática [22] e a falta de

qualquer relação entre a expressão hepática de proteínas gliconeogênicas e

hiperglicemia de jejum em indivíduos obesos, com ou sem DM2 [23], corroboram

a relevância clínica deste mecanismo.

Atualmente, os estudos que avaliam os processos fisiopatológicos da

DHGNA mostram que outros órgãos e sistemas também estão envolvidos,

dentre eles o pâncreas. Similar a condição do fígado, o acúmulo excessivo de

gordura ectópica no pâncreas é referido como esteatose pancreática ou doença

22

pancreática gordurosa não alcoólica (DPGNA) [24]. Nos últimos anos, tornou-se

uma condição cada vez mais reconhecida, estando presente em cerca de 67%

dos pacientes com DHGNA [25]. Além disso, a DPGNA está associada a outros

fatores de risco como resistência à insulina, diabetes, hiperlipidemia, síndrome

metabólica e obesidade [26 27].

Estudos com ratos demonstram que a exposição a longo prazo a uma dieta

hiperlipídica induz acúmulo de gordura interlobular e intralobular, infiltração de

células inflamatórias e fibrose no pâncreas, danificando a morfologia das ilhotas

pancreáticas [28]. Da mesma forma, camundongos C57BL/6 expostos a dieta

rica em gordura desenvolveram obesidade e resistência à insulina,

acompanhados por características da DHGNA e da DPGNA [29 30]. Além disso,

é visto também que uma maior duração da dieta rica em gordura aumentou o

conteúdo de triglicerídios no pâncreas, mas não no fígado, sugerindo que o

pâncreas é particularmente susceptível à deposição de gordura ectópica [31].

Mudanças dos hábitos de vida têm sido utilizadas no combate da DHGNA

e dos processos fisiopatológicos associados, tais como diabetes mellitus,

obesidade, hiperglicemia, hipercolesterolemia e síndrome metabólica. Assim,

dentre as recomendações instituídas, o exercício físico e a diminuição do peso

corporal são eficazes para promover melhora na qualidade de vida dos

indivíduos [32]. Parte dos benefícios gerados pela prática regular de exercício

físico é decorrente do aumento da oxidação de ácidos graxos livres (AGL),

contribuindo diretamente para melhorar o fenótipo metabólico hepático na

DHGNA [33].

Rector et al [34], demostraram, que a prática de atividade física aeróbia

com intensidade de 85% do volume de oxigênio máximo por 12 semanas, foi

capaz de melhorar os níveis de triglicerídeos intra-hepáticos, tendo a quantidade

de gordura visceral medida por ressonância magnética em pacientes com

DHGNA. Além disso o mesmo artigo demonstra que é possível obter

modificações positivas causadas pela atividade física nos níveis de lipídios intra-

hepáticos, sensibilidade e resistência à insulina, mesmo sem mudanças no peso

corporal dos indivíduos, mas quando a prática regular de atividade física gera

perda de peso, os benefícios são duplamente potencializados. Apesar dos

23

estudos demonstrarem efeitos positivos da prática regular de atividade física,

uma das principais limitações para novos estudos com humanos está ligada a

falta de adesão e a ausência de programas de promoção à saúde e prevenção

de doenças.

Com isso estudos em modelo experimental aparecem como alternativa,

pois apresentam a possibilidade de controlar variáveis fisiológicas e ambientais,

além disso este modelo possui um custo menor e, é capaz de mimetizar

condições humanas. O modelo experimental com camundongos obesos (ob/ob)

que foi descoberto em 1949 em Roscoe B. Jackson Memorial Laboratory, no

estado de Maine, EUA, se caracteriza, por um consumo excessivo de nutrientes

e por sua deficiência à leptina, que por sua vez, atua nesses animais na

determinação do fenótipo da obesidade, hiperglicemia e hiperinsulinemia [35 36].

Estes camundongos são utilizados em modelos para diversos tipos de estudo

com doenças e condições fisiopatológicas como: diabetes, obesidade, resposta

inflamatória e resistência à insulina.

A condição metabólica dos camundongos ob/ob provocam uma

redistribuição no armazenamento de gordura corporal, hepática e de outros

tecidos não-adiposos. Este aumento da captação de lipídios induz ao dano e

apoptose celular. Haczeyni et al., [37] demonstraram que o exercício físico

aeróbico realizado na roda, resulta em um efeito metabólico protetor, aumento

da fosforilação de proteina kinase B (AKT) em nível muscular, além de oferecer

efeito de prevenção sobre a resposta inflamatória, obesidade e diabetes em

camundongos obesos foz/foz. Outro achado importante deste estudo encontra-

se na modulação realizada pelo exercício físico aeróbio sobre a morfometria de

adipócitos, tal fenômeno diminui o tamanho destas células, sua hipertrofia e

conteúdo. Apesar dos estudos demonstrarem efeitos positivos oriundos do

exercício físico, e de haver um amplo campo de investigações acerca da

DHGNA, os mecanismos subjacentes associados a progressão da doença não

estão totalmente esclarecidos. Além disso, os dados encontrados na literatura

acerca da deposição de gordura pancreática, seus mecanismos fisiopatológicos

e a relevância clínica da esteatose pancreática não estão bem elucidados.

24

OBJETIVOS

25

2.0 – OBJETIVOS:

2.1 – Objetivo Geral:

• Avaliar o efeito do treinamento físico sobre marcadores de resposta

inflamatória e resistência à insulina em modelo DHGNA de

camundongos ob/ob.

2.2 – Objetivos Específicos:

• Avaliar o efeito do treinamento físico aeróbio em marcadores de

inflamação (IL-6; TNF-α; IL-10) em amostras de tecido hepático e

pancreático.

• Avaliar o efeito do treinamento físico aeróbio em marcadores

relacionados com a resistência à insulina (IRS-2; GLUT-2) em

amostras de tecido hepático e pancreático.

• Avaliar o efeito do treinamento físico aeróbio sob as variáveis ligadas

ao treinamento físico, peso corporal e consumo alimentar.

26

MATERIAIS E MÉTODOS

27

3.0 – MATERIAIS E MÉTODOS:

3.1 – Local:

O estudo foi desenvolvido nos Laboratórios de Gastroenterologia Clínica

e Experimental (LIM-07), Laboratório de Transplante e Cirurgia do Fígado (LIM-

37) do Departamento de Gastroenterologia da Faculdade de Medicina da

Universidade de São Paulo (FMUSP) e no Laboratório de Biomedicina da Escola

de Artes, Ciências e Humanidades da USP (EACH-USP).

3.2 – Aspectos Éticos:

Esse estudo seguiu as orientações recomendadas da Declaração de

Helsinki de 1975 (publicada por "US National Institute of Health-Guide for care

and use of laboratory animals" (NIH Publication, n° 85-23, revisada em 1996)) e

do Serviço de Experimentação em animais da Faculdade de Medicina da

Universidade de São Paulo. O estudo foi submetido à Comissão de Ética para

Análise de Projetos de Pesquisa da Faculdade de Medicina da Universidade de

São Paulo (FMUSP) aprovado com número 930/17 pela Comissão de Ética no

Uso de Animais (CEUA).

3.3 – Procedimentos experimentais e delineamento do estudo:

3.3.1 – Modelo experimental:

Foram utilizados camundongos ob/ob, machos, com 6 semanas de vida,

provenientes do Biotério do Laboratório de Gastroenterologia Clínica e

Experimental (LIM-07) da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo

(FMUSP). Os animais foram mantidos no Biotério da EACH-USP durante todo o

protocolo experimental, com temperatura e ventilação controladas, com ciclos de

luz / escuro de 12 horas. Além disso, os animais tiveram livre acesso à água e

ração ad libitum. Foi utilizada dieta padrão e ração da marca Nuvilab CR1.

3.3.2 – Delineamento experimental:

Os animais foram distribuídos de forma aleatória em dois grupos:

Grupo sedentário (SED): constituído por sete animais machos

que não foram submetidos ao treinamento físico.

28

Grupo treinado (TF): constituído por sete animais machos que

foram submetidos ao treinamento físico

3.4 – Avaliações metabólicas

Ao longo de todo protocolo experimental, a pesagem corporal foi realizada

semanalmente em balança digital (Gehaka/modelo BG4001, São Paulo, Brasil),

no mesmo dia e horário. Além da evolução, foi calculado o ganho de peso

através da diferença entre o peso corporal final (semana 8) e o peso corporal

inicial (semana pré-treinamento). O consumo de ração foi avaliado em grupos de

animais mantidos na mesma gaiola ao longo de todo protocolo experimental,

durante períodos de 24 horas, por 3 dias consecutivos de cada semana. Foi

utilizado a média dos 3 dias avaliados para determinar o consumo de ração

semanal e após a obtenção deste resultado, o valor foi dividido pela quantidade

de animais por caixa para obter o consumo médio por animal.

3.5 – Teste de esforço físico máximo

A capacidade máxima de execução de exercício físico foi avaliada no

momento pré treinamento, na semana 4 e após o treinamento físico através de

um teste progressivo até a exaustão em esteira rolante. Foram mensuradas as

seguintes variáveis de treinamento: tempo máximo de execução do teste,

velocidade máxima atingida no pico do exercício e a distância total percorrida. A

velocidade inicial da esteira foi de 0,2 km/h sem haver inclinação da mesma. A

cada três minutos, a velocidade da esteira foi aumentada em 0,2 km/h até serem

observados sinais de exaustão do animal. O teste é finalizado quando o

camundongo entrar em fadiga, ou seja, não conseguir manter o padrão de

marcha. Na semana 4, foi realizado o teste somente nos animais treinados para

reajuste da velocidade do treinamento físico.

3.6 – Protocolo de treinamento físico

O protocolo de treinamento físico foi realizado em esteira rolante, 5 vezes

por semana, durante 8 semanas. Todas as sessões de treinamento tiveram

intensidades estabelecidas de 60% da velocidade máxima atingida no teste de

tolerância ao esforço físico, com o tempo sendo progressivamente aumentado,

iniciando com 30 minutos na primeira semana e atingindo 60 minutos na quarta

29

semana, conforme descrito por Ferreira et al. [38]. Após a quarta semana de

treinamento, o tempo de 60 minutos foi mantido até o término do protocolo. Os

camundongos sedentários foram submetidos à caminhada na esteira, 1 vez por

semana, durante 10 minutos. Esse procedimento se faz necessário para evitar

qualquer interferência do estresse gerado pela esteira no momento da realização

do teste de tolerância ao esforço físico.

3.7 – Eutanásia e Coleta de materiais para análise:

Após período de 8 semanas de treinamento físico, os animais foram

anestesiados utilizando-se cloridrato de cetamina (0,1mL/Kg) intraperitoneal.

Após a administração do anestésico, foram retirados os órgãos de cada animal

para as análises propostas. Amostras de tecido hepático e pancreático foram

coletados para verificar possíveis diferenças no peso de cada órgão, avaliação

histológica, avaliação dos genes relacionados com a resposta inflamatória (TNF-

a, IL-6, IL-10), resistência à insulina (IRS-1, IRS-2, GLUT-2) e análise do

conteúdo de mRNA dos genes citados anteriormente. Também foram coletados

os tecidos adiposos nos diferentes compartimentos de cada animal apenas para

comparar a diferença na quantidade de gordura encontrada em cada grupo de

estudo. Foram coletados tecidos adiposos da região retroperitoneal, inguinal e

periepididimal. Após a coleta de todos os materiais, as carcaças dos animais

foram enviadas para incineração, conforme às normas de descarte da FMUSP.

3.8 – Avaliação Histológica

Após a remoção do fígado, foram coletadas amostras de tecidos referentes

aos segmentos II e III do lobo esquerdo, o qual está mais relacionado com o

surgimento e progressão da DHGNA [39 40]. Para análises de histologia no

pâncreas, foi removido o tecido pancreático das porções próximas ao duodeno.

Os fragmentos coletados de cada tecido, foram fixados em solução de

formol a 4%, processados e submetidos às colorações de hematoxilina-eosina

(HE) segundo a rotina adotada na divisão de Anatomia Patológica do HC-

FMUSP. As lâminas histológicas de cada tecido foram avaliadas de maneira

“cega” por um patologista experiente. Em relação a avaliação histológica, no

fígado, foi utilizado um sistema modificado para roedores proposto por Liang et

30

al. [41]. As variáveis histológicas presentes neste sistema são: esteatose

macrovesicular (0-3), esteatose microvesicular (0-3), hipertrofia hepatocelular (0-

3) e focos de inflamação (0-3). A soma para esteatose varia entre 0-9. Para o

diagnóstico da DHGNA é necessário que o valor para esteatose seja entre 1-9 e

ausência de focos inflamatórios. Caso haja presença de focos inflamatórios,

independente do valor de esteatose encontrado, é feito o diagnóstico para

esteatohepatite não alcoólica (EHNA). Este sistema de pontuação não inclui a

fibrose em sua análise, pois não é requisito para diagnóstico da EHNA, embora

seja frequente nesta população. Além disso, este modelo animal não apresenta

fibrose, sendo o escore bastante adequado para comparação entre os grupos.

No pâncreas, foi utilizado um sistema de avaliação semelhante ao trabalho

de Van Geenem et al. [42]. As variáveis histológicas utilizadas neste sistema

foram: gordura interlobular, gordura intralobular, fibrose, edema, necrose acinar,

infiltrado inflamatório, hemorragia e necrose de gordura.

3.9 – Extração do RNA Tecidual

O material recebido em nitrogênio líquido foi fragmentado manualmente

utilizando-se almofariz e pistilo. Após a fragmentação, foi adicionado 1,0 mL de

TRIzol® (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA), e essa mistura foi

incubada por 5 min à temperatura ambiente em tubos de microcentrífuga de 1,5

mL. Foram adicionados 200 µL de clorofórmio (Merck), sob agitação vigorosa

por 15 seg, seguido por um período incubatório de 5 min à temperatura ambiente

e centrifugada a, 12.000 rpm, por 15 minutos e temperatura de 4 ºC. Em seguida,

o sobrenadante foi transferido para um novo tubo estéril de 1,5 mL e o RNA foi

precipitado com 500 µL de isopropanol (Merck). A mistura foi deixada em

repouso durante 10 min e centrifugada por 15 min, 12.000 rpm, a 4 ºC. O

sobrenadante foi removido e o pellet de RNA lavado com 1,0 mL de etanol

(Merck) 75%, centrifugado novamente e ressuspendido em volume apropriado

de água estéril (UltraPure™ DNase/RNase-Free Distilled Water (Invitrogen Life

Technologies, Carlsbad, CA, USA)).

31

3.10 – Quantificação e Análise da Integridade do RNA Total

A concentração dos RNAs totais extraídos foi determinada por

espectrofotometria (NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies, Wilmington,

DE, USA)). A preparação do RNA é considerada livre de contaminantes

(proteínas e fenol) quando a relação A260/280 encontra-se entre 1,8 e 2,0. Para

as amostras que não atingiram estes valores, foram realizadas purificações

utilizando-se o kit RNeasy® Mini Kit (Qiagen, Hilden, Alemanha). A integridade

e a pureza dos RNAs foram analisadas por eletroforese em gel de agarose 1%.

Somente foram utilizadas as amostras cujas bandas correspondentes ao RNA

ribossomal 18 e 28 S mostraram-se íntegras à analise sob luz ultravioleta. Os

RNAs foram mantidos a -80 °C até sua utilização.

3.11 – PCR quantitativo em tempo real (RT-qPCR):

As reações de RT-qPCR foram realizadas no equipamento Rotor-Gene

RG-3000 (Corbett Research, Sidney, Austrália), utilizando-se reagentes

SuperScript™ III Platinum® One-Step Quantitative RT-PCR System (Invitrogen

Life Technologies, Carlsbad, EUA), conforme recomendação do fabricante. A

intensidade de expressão de cada gene foi obtida pelo valor de limiar do ciclo,

no qual o aumento no sinal associado à fase exponencial de amplificação do

fragmento começa a ser detectada. A reação para cada gene analisado foi

cuidadosamente padronizada com a finalidade de evitar qualquer amplificação

inespecífica. A temperatura de anelamento para a amplificação dos genes IRS-

2, GLUT-2 IL-6 e IL-10 foi 55 ºC, enquanto que para o gene de TNF-a foi de 57

ºC. Todas as reações de RT-q PCR foram realizadas em duplicata para cada

amostra de tecidos hepático e pancreático tanto para o gene alvo quanto para o

controle endógeno (β-actina).

32

Sequência dos primers (forward/reverse) utilizados na reação de qRT-PCR

para cada gene estudado

Genes Sequência

IRS-2 F: CGG CTG GAG TAC TAC GAG AG

R: CGC GCT TGT TGA TGT TCA GA

GLUT-2 F: TCA GAA GAC AGG GTA CAG CGA

R:TCC AGT GCC AGC GTA TAA GT

TNF-α F: CCA CCA CGC TCT TCT GTC TA

R: TCC TTC TTG CCC TCC TAA CC

IL-6 F: TTC TTG GGA CTG ATG CTG GT

R: CAG GTC TGT TGG GAG TGG TA

IL-10 F: TGC TGC TCC TCC CCT ATT TC

R: TTC GGA TGT GCC TGG GTT TA

Β-actina F: TGT CAC CAA CTG GGA CGA TA

R: GGG GTG TTG AAG GTC TCA AA

F= forward; R= reverse

3.12 – Método de análise da expressão gênica

Para o cálculo do nível de expressão de cada gene alvo, utilizou-se o

método 2-delta delta Ct para a quantificação relativa [43], onde Ct (“threshold

cycle”) é o ciclo da PCR em tempo real, no qual a amplificação atinge a fase

logarítmica, onde delta Ct é a diferença de expressão entre gene alvo e controle

endógeno de uma determinada amostra e delta delta Ct corresponde à diferença

entre o delta Ct da amostra e o delta Ct do controle.

A fórmula utilizada para a quantificação relativa (QR):

QR= 2-ΔCt

ΔCt= Ct gene alvo-Ct gene referência

ΔΔCt= ΔCt amostra-ΔCt controle

33

3.13 – Análises Estatísticas:

Todos os dados foram expressos como média ou mediana (dependendo

do padrão de distribuição das variáveis) e seus respectivos valores mínimos

(min), máximos (máx) e de desvio padrão (DP). Para variáveis de distribuição

paramétrica foram utilizados teste-t, one-way ANOVA e o pós-teste Bonferroni

de múltiplas comparações. Para variáveis de distribuição não-paramétrica foram

utilizados os testes de Mann-Whitney, Kruskal-Wallis e o pós-teste Dunn's de

comparações múltiplas. Para comparação dos escores histológicos entre os

grupos foram utilizados os testes de Qui-quadrado com exato de Fisher. Foram

consideradas variáveis significativas aquelas em que o p<0,05. Todos os

cálculos e análises foram realizados com o software GraphPad Prism V6.0

(GraphPad Software Inc).

34

RESULTADOS

35

4.0 – RESULTADOS

4.1 – Avaliações metabólicas:

4.1.1 – Peso corporal:

No momento inicial do protocolo de treinamento, não foram observadas

diferenças significativas entre os grupos de estudo, porém, ao final do protocolo,

foram observadas diferenças significativas da média de peso corporal do grupo

treinado em comparação ao grupo sedentário (12.9±2.9 VS 9.6±2.1 p= 0.008). Em

relação a evolução de peso corporal, a partir da terceira semana de treinamento,

foram observadas diferenças estatísticas entre os grupos sedentário e treinado

(Figura 1). Ainda sobre este resultado, os animais sedentários obtiveram um

ganho de peso médio de 35% durante todo o protocolo experimental enquanto

que os animais submetidos ao treinamento aeróbio obtiveram um ganho médio

de 26%.

P e s o C o r p o r a l

Gra

ma

s (

gr)

SE

DT

F

0

5

1 0

1 5

2 0

p = 0 .0 0 8

* *

36

E v o lu ç ã o d e P e s o C o r p o r a l

S e m a n a s

Pe

so

Co

rp

ora

l (g

r)

0 1 2 3 4 5 6 7 8

3 0

3 5

4 0

4 5

5 0

5 5

S E D

TF

p = 0 .0 0 0 3

******

Fig 1: Gráficos de comparação da média de peso corporal entre os grupos e de evolução de peso corporal dos grupos de estudo frente ao protocolo de treinamento físico aeróbio de 8 semanas.

4.1.2 – Consumo alimentar:

Em relação ao consumo de água e ração, foram encontradas diferenças

significativas do grupo sedentário em comparação ao grupo de animais treinados

(Figura 2). Em ambas as variáveis, os animais sedentários apresentaram

maiores valores em comparação aos animais treinados (Tabela 1).

C o n s u m o d e Á g u a

mL

/an

ima

l/2

4h

SE

DT

F

0

2

4

6

8

1 0

p = 0 .0 0 1

**

37

C o n s u m o d e R a ç ã o

gr/a

nim

al/

24

h

SE

DT

F

0

2

4

6

8

1 0

p < 0 .0 0 0 1* * * *

S E D

T F

Fig 2: Gráficos de consumo de água e ração de ambos os grupos de estudo frente ao protocolo de treinamento aeróbio de 8 semanas

Tabela 1 – Ganho de peso corporal e consumo alimentar ao final do protocolo experimental

Sedentários

(n=7) Treinados

(n=7) P

Ganho de peso corporal (g)

12.9±2.9 9.6±2.1 0.008

Ganho de peso (%) 35.6±10.1 26.8±6.5 0.03

Consumo de Água 6.6±1.5 4.9±1.2 0.001

Consumo de Ração 5.6±1.1 4.4±0.9 < 0.0001

p<0,05

4.1.3 – Tecidos Adiposos e Peso Hepático:

Em relação aos tecidos adiposos foram observadas diferenças para o

tecido retroperitoneal sendo os menores valores encontrados nos animais

pertencentes ao grupo TF (Tabela 2). No fígado foram encontradas diferenças

estatísticas sendo o grupo treinado com os menores valores em comparação aos

sedentários. Em relação aos outros tecidos foram encontradas diferenças

significativas no peso absoluto e peso relativo do fígado do grupo treinado em

comparação ao grupo sedentário.

38

Tabela 2 – Peso dos órgãos e tecidos adiposos de camundongos ob/ob de ambos os grupos ao final do protocolo de treinamento físico (peso absoluto e peso relativo)

Sedentários (n=7)

Treinados (n=7)

p

Peso absoluto

Fígado (gr) 2.5±0.3 2.2±0.2 0.04

T. adiposo peritonial (gr) 2.5 (2.0–5.5) 1.5 (1.5–4.0) 0.03

T. adiposo inguinal (gr) 2.4±0.6 1.8±0.8 0.10

T. adiposo periepididimal (gr) 3.0±1.3 2.9±0.9 0.87

Peso relativo

Fígado (mg) 54.0±4.8 50.3±5.3 0.04

T. adiposo peritonial (mg) 59.5 (40.0–103.1) 36.1 (32.6–93.0) 0.04

T. adiposo inguinal (mg) 51.5±15.9 42.5±20.1 0.49

T. adiposo periepididimal (mg) 64.4±32.1 66.4±18.9 0.88

p<0,05


No que diz respeito às variáveis ligadas ao treinamento físico, no momento

pré treinamento não foram observadas diferenças significativas para velocidade

pico, distância percorrida e tempo de exposição ao teste de esforço entre os

grupos de estudo, no entanto, ao final do protocolo foram observadas diferenças

significativas dos animais treinados no momento pré treinamento em

comparação ao momento pós treinamento do grupo sedentário (Fig 3).

39

V e lo c id a d e P ic o (k m /h )

Ve

loc

ida

de

(k

m/h

)

S E D P ré T F P ré S E D P ó s T F P ó s

0 .0

0 .5

1 .0

1 .5

2 .0S E D P ré

T F P ré

S E D P ó s

T F P ó s

p = 0 .0 3 1 0

*

D is tâ n c ia (k m )

Dis

tân

cia

(k

m)


0 .0

0 .1

0 .2

0 .3

0 .4

0 .5

S E D P ré

T F P ré

S E D P ó s

T F P ó s

*

p = 0 .0 4 5 5

T e m p o (m in )

Te

mp

o (

min

)


0

5

1 0

1 5

2 0

2 5S E D P ré

T F P ré

S E D P ó s

T F P ó s

p = 0 .0 0 6 9

*

Fig 3: Resultados de ambos os grupos de estudo obtidos através do teste de esforço físico máximo frente às variáveis ligadas ao protocolo de treinamento físico aeróbio

40

4.3 – Histologia Hepática:

Para as análises de avaliação histológica no fígado, não foram encontradas

diferenças significativas para esteatose macrovesicular, esteatose

microvesicular, hipertrofia hepatocelular e focos inflamatórios.

Tabela 3 – Tabela de características histológicas do tecido hepático de camundongos obesos (ob/ob)

Sedentários* Treinados* P

1 2 3 4 5 6 7 8

Esteatose

macrovesicular (0–3) 0 2 1 2 1 2 2 0

0.965

Esteatose

microvesicular (0 – 3) 0 3 2 3 2 3 2 3

Hipertrofia

hepatocelular (0 – 3) 0 2 2 2 1 2 1 2

Focos inflamatórios

(0 – 3) 0 2 3 3 2 2 3 0

*Identificação realizada por microchip;

4.4 – Histologia Pancreática:

Em relação ao pâncreas, devido à ausência de um escore específico para

este órgão, o grupo realizou uma tabela descritiva no qual foram analisadas as

seguintes variáveis: gordura interlobular, gordura intralobular, fibrose, edema,

necrose acinar, infiltrado inflamatório, hemorragia, e necrose de gordura. A

tabela a seguir descreve as características de cada animal avaliado.

41

Tabela 4 – Tabela de descrição da análise histológica pancreática realizada em ambos os grupos de estudo após o procotolo de treinamento físico

ID Gordura

interlobular

Gordura

Intralobular Fibrose Edema

Necrose

Acinar

Infiltrado

Inflamatório Hemorragia

Necrose

de

Gordura

Escore

Final

Grupo

Sedentário

0354 0 (5%) 0 0 0 0 0 0 0 0

1010 3 (40%) 0 0 0 0 11 – 15

pmn 0 0 0

0493 3 (40%) 0 0 0 0 0 0 0 0

1840 0 (5%) 0 0 0 0 11 – 15

pmn 0 0 0

0253 0 (5%) 0 0 0 0 0 – 1 pmn 0 0 2

1053 0 (5%) 0 0 0 0 0 – 1 pmn 0 0 0

2118 0 (2%) 0 0 0 0 0 – 1 pmn 0 0 0

Grupo

Treinado

0370 0 (0%) 0 0 0 0 0 0 0 0

0678 1 (10%) 0 0 0 0 0 0 0 1

0957 0 (0%) 0 0 0 0 0 0 0 0

0420 – – – – – – – – –

0529 1 (10%) 0 0 0 0 0 – 1 pmn 0 0 1

1581 3 (40%) 0 0 0 0 0 – 1 pmn 0 0 0

7796 3 (40%) 0 0 0 0 2 – 5 pmn 1 0 –

Identificação realizada por microchip

42

Fig 4 Histologia pancreática de camundongo ob/ob sedentário sem infiltração de gordura. 1= Ilhota de Langerhans; 2= vaso sanguíneo (ampliação original X 40)

Fig 5 Ácino pancreático de camundongo ob/ob sedentário. Presença de raros linfócitos (seta) em tecido frouxo periacinar. (ampliação original X 40)

43

Fig 6: Pâncreas de camundongo ob/ob treinado com gordura visceral adjacente (seta) ao parênquima pancreático sem sinais de infiltração lobular. (ampliação original X 5)

Fig 7: Visão panorâmica do pâncreas de camundongo ob/ob sedentário com morfologia e tecido preservados. (ampliação original X 20)

44

Fig 8: Histologia hepática de camundongos ob/ob. A e B: Histologia hepática de animais sedentários (Escala de 100 µm). C e D: Histologia hepática de animais treinados (Escala de 100 µm)

45

4.5 – Expressão genica:

4.5.1 – No tecido hepático:

Em relação a expressão gênica no tecido hepático, para os genes

relacionados com a resistência à insulina (Fig 9), foram observadas diferenças

significativas para o gene GLUT-2 (1.5±0.6 VS 0.7±0.3), e em relação aos genes

relacionados com inflamação foram encontradas diferenças signficativas para IL-

6 (1.1(0.3–1.9) VS 3.6 (0.7–5.3)) e IL-10 (0.7 (0.2–2.7) VS 1.3 (0.6–3.6)). Para

os outros genes do estudo, não foram observadas diferenças significativas.

IR S 2

F íg a d o

Un

ida

de

s A

rb

itrá

ria

s

SE

D TF

0 .0

0 .5

1 .0

1 .5

2 .0

2 .5

S E D

T F

p = 0 .0 8 1 9

G L U T 2

F íg a d o

Un

ida

de

s A

rb

itrá

ria

s

SE

D TF

0 .0

0 .5

1 .0

1 .5

2 .0

2 .5

S E D

T F

p = 0 .0 3 3 6

*

Fig 9: Gráfico de comparação entre os animais sedentários e treinados frente as análises de resistência à insulina no tecido hepático

46

T N F -a

F íg a d o

Un

ida

de

s A

rb

itrá

ria

s

SE

D

TF

0

2

4

6

8

S E D

T F

p = 0 .6 4 2 9

IL -6

F íg a d o

Un

ida

de

s A

rb

itrá

ria

s

SE

D TF

0

2

4

6

S E D

T F

p = 0 .0 1 4 0

*

IL -10

F íg a d o

Un

ida

de

s A

rb

itrá

ria

s

SE

D TF

0

1

2

3

4

S E D

T F

p = 0 .0 3 5 5

*

Fig 10: Gráfico de comparação entre os animais sedentários e treinados referente as análises de expressão gênica de inflamação no tecido hepático

47

4.5.2 – No tecido pancreático:

No pâncreas, para os genes relacionados com a resistência à insulina

foram encontradas diferenças significativas para IRS-2 (0.3 (0.1–0.9) VS 1.7

(0.7–5.2)) e GLUT-2 (0.5±0.3 VS 1.8±1.3). Para os genes relacionados com a

resposta inflamatória, foram encontradas diferenças significativas para IL-6 (0.07

(0.04–0.10) VS 3.1 (0.9–3.9)) e IL-10 (0.7 (0.4–1.7) VS 6.1 (1.1–14.3)). Não

foram observadas diferenças significativas para análise de TNF-a.

IR S 2

P â n c re a s

Un

ida

de

s A

rb

itrá

ria

s

SE

D TF

0

2

4

6

S E D

T F

p = 0 .0 0 4 1

**

G L U T 2

P â n c re a s

Un

ida

de

s A

rb

itrá

ria

s

SE

D TF

0

1

2

3

4

5

S E D

T F

p = 0 .0 3 1 4

*

Fig 11: Gráfico de comparação dos grupos de estudo frente as análises de expressão gênica referentes à resistência insulínica no tecido pancreático

48

‘

T N F -a

P â n c re a s

Un

ida

de

s A

rb

itrá

ria

s

SE

D TF

0

2

4

6

8

1 0

S E D

T F

p = 0 .8 1 3 5

IL -6

P â n c re a s

Un

ida

de

s A

rb

itrá

ria

s

SE

D TF

0

1

2

3

4

5

S E D

T F

p = 0 .0 0 2 2

**

IL - 10

P â n c re a s

Un

ida

de

s A

rb

itrá

ria

s

SE

D

TF

0

5

1 0

1 5

2 0

S E D

T F

p = 0 .0 0 8 7

**

Fig 12: Gráfico de comparação dos grupos de estudo frente as análises de expressão gênica referentes à inflamação no tecido pancreático

49

DISCUSSÃO

50

5.0 – DISCUSSÃO:

O exercício físico tem sido empregado como uma das principais estratégias

profiláticas e terapêuticas no tratamento de diversos agravos a saúde e também

no tratamento e prevenção de doenças crônicas. Em muitos casos, o

treinamento físico pode incrementar o limiar de tolerância fisiológica além das

variáveis ligadas ao treinamento como melhoria da aptidão cardiorrespiratória,

aumento da velocidade pico e maior tolerância ao esforço físico. Além disso, o

treinamento físico é capaz de modular a dinâmica dos ácidos graxos intra e

extracelulares que são utilizados na produção de energia de acordo com o

estado nutricional e a aptidão física do praticante, além da intensidade e duração

do exercício. A quantidade de ácido graxo usada durante o exercício leve ou

moderado aumenta exponencialmente quando comparado em condições de

repouso [44 45]. Portanto, o exercício físico é uma ferramenta importante para o

controle e redução de peso corporal e tecido adiposo. No presente estudo, o

treinamento físico atenuou a evolução no ganho de peso corporal dos animais

treinados a partir da 3ª semana mostrando um importante impacto metabólico

nestes animais. Além disso, ao final do protocolo, os animais sedentários

apresentaram um percentual de 35% de ganho de peso enquanto os animais

treinados apresentaram um percentual de 26%, ou seja, uma diferença na

evolução do ganho de peso de 9%, mostrando que o treinamento físico é capaz

de estabilizar o ganho de peso em camundongos ob/ob.

Em um estudo realizado por Evangelista et al. [33] foi observado que o

treinamento físico foi capaz de melhorar aspectos relacionados ao controle de

peso corporal e equilíbrio energético em camundongos ob/ob, mostrando que os

animais treinados obtiveram um aumento no ganho de peso de 23% enquanto

os animais sedentários 41%. Em estudos realizados anteriormente pelo grupo,

foi observado que o treinamento físico foi capaz de controlar o ganho de peso

corporal em camundongos selvagens e em animais alimentados com dietas de

lanchonetes e com alto teor de gordura [46 47].

Gollisch et al. [48] mostraram em seu estudo que o exercício físico foi capaz

de melhorar a resistência à insulina, causar mudanças positivas no metabolismo

de lipídios e gerar uma maior tolerância ao esforço físico. Além disso, este

51

estudo, fornece novos dados e perspectivas sobre as respostas da gordura

subcutânea e visceral para dieta rica em gordura e treinamento físico neste

modelo animal, e que a obesidade induzida por dieta hiperlipídica e a resistência

à insulina podem ocorrer sem inflamação detectável.

Embora as reduções no ganho de peso corporal possam melhorar a

qualidade de vida e prevenir o desenvolvimento de complicações relacionadas à

obesidade, como resistência à insulina, diabetes tipo 2 e hipertensão, Broderick

et al. [49] mostraram que houve atenuação no ganho de peso corporal.

Entretanto, a atividade física voluntária não resultou na ativação do sistema

cardioprotetor peptídeo natriurético de ocitocina cardíaca (OT-NP) no modelo

ob/ob de obesidade e camundongos db/db, predispondo a fatores de risco para

doença cardiovascular. No entanto, este resultado é questionável, pois durante

o protocolo de exercício, os camundongos ob/ob, apesar de atingirem a

recomendação mínima de tempo exigida pelo American College of Sports

Medicine (ACSM) [50-52] , não foi possível verificar em que intensidade estes

animais atingiam durante as sessões diárias.

A diferença entre o consumo de energia e gasto energético são fatores

determinantes para o controle do peso corporal, e que quando há uma exposição

ao exercício físico de forma contínua, o organismo começa a responder de

maneira a obter mais energia com a finalidade de compensar os gastos

energéticos, visando a manutenção do metabolismo do praticante [53 54].

Portanto, é esperado observar um aumento compensatório na ingestão de

alimentos [55]. Além disso, os camudongos ob/ob são conhecidos pela sua

deficiência na produção de leptina funcional, consequentemente, levando ao

desenvolvimento acelerado da obesidade, aumento no consumo alimentar

(hiperfagia), hiperglicemia e hiperinsulinemia [56 57]. Em relação ao consumo

médio de água e ração por animal, esperávamos encontrar um aumento no

consumo alimentar dos animais submetidos ao treinamento físico, no entanto, foi

visto que os animais treinados obtiveram valores significativamente menores em

comparação aos animais sedentários. Uma das possíveis explicações para este

fenômeno pode ser o impacto que o exercício físico contínuo causa nos

processos fisiológicos. Como o exercício produz ajustes no fluxo sanguíneo, na

resposta hormonal gastrointestinal, no esvaziamento gástrico, no metabolismo

52

celular muscular, na bioquímica do tecido adiposo e na atividade cerebral, esta

mudança pode ter causado uma interferência em alguns dos mecanismos

envolvidos no controle do apetite [58 59]. Além disso, acreditamos que o

exercício físico, pode ter causado mudanças positivas na produção de leptina

funcional, gerando um menor consumo alimentar devido a esta melhoria. No

entanto, mais estudos são necessários para confirmar tal hipótese, pois os

mecanismos entre a prática regular de exercício físico, produção e manutenção

de leptina ainda não estão bem elucidados.

Em relação à velocidade pico, distância percorrida e tempo de tolerância

ao esforço, esperávamos encontrar uma diferença significativa no momento pré

treinamento do grupo sedentário em comparação ao momento pós treinamento

do grupo treinado. Apesar de não ter sido encontrado tais diferenças

significativas, a média de valores dos animais treinados para estas variáveis

foram maiores em relação aos sedentários, e que os animais do grupo sedentário

tiveram um decréscimo em relação ao teste de esforço físico. Baseado neste

resultado, podemos afirmar que o comportamento sedentário causa um

descréscimo em relação a velocidade pico, distância percorrida e tempo de

tolerância ao esforço, contribuindo para a progressão e gravidade da doença,

além de baixa aptidão cardiovascular, que por sua vez apresenta uma alta

prevalência em pacientes acometidos por esta doença [60]. Apesar de não terem

sido encontradas diferenças significativas do momento pré e pós treinamento no

grupo treinado, recomenda-se que a prática regular de exercício físico seja

encorajada para a população acometida pela DHGNA.

Sabe-se que o excesso de tecido adiposo visceral e hepático está

independentemente associado ao risco cardiometabólico, além de serem fatores

agravantes não só em relação a parâmetros da doença, mas tambem o

comprometimento da atividade de outros órgãos. Devido a alta variabilidade no

que diz respeito ao que se chama de histórico natural da DHGNA e apesar dos

avanços tecnológicos na área clínica contribuirem para um melhor tratamento da

doença, não há uma metodologia precisa para a prevenção das condições mais

severas como EHNA, fibrose, cirrose e carcinoma hepatocelular (CHC). A perda

de peso através de modificações no estilo de vida pode reduzir tanto o tecido

adiposo visceral como a gordura do fígado, mas a perda de peso de 5 a 15% é

53

desejável para reduções clinicamente significativas no tecido adiposo visceral

[50] e para melhorias histológicas no fígado (65% de melhoria na pontuação do

NAS com perda de peso > 10%) [61 62]. Em nosso estudo, acreditamos que a

não visualização de diferenças significativas para as análises de histologia

hepática e pancreática entre os grupos, foi devido ao fato destes animais não

apresentarem perdas de peso ao longo do protocolo de treinamento físico, sendo

observado apenas a atenuação de peso corporal dos animais treinados. É

necessário mais estudos relacionando o comportamento de diferentes

intensidades, duração e volume do treinamento físico com aspectos ligados a

histologia destes órgãos, visto que este campo de pesquisa, não está

completamente elucidado. Os camundongos ob/ob, apresentam um fenótipo da

obesidade bastante agressivo no que diz respeito as características físicas e

histológicas, sendo difícil de observar perdas de peso significativas, no entanto,

alguns estudos apontam que apesar de não haver perdas de peso através do

exercício físico, é possivel observar efeitos positivos em características da

DHGNA [63-65]. Apesar dos animais do grupo treinado apresentarem mudanças

positivas nas variáveis de treinamento físico, em relação à histologia hepática,

não foram observadas diferenças significativas entre os grupos de estudo, sendo

os resultados encontrados semelhantes em todas as variáveis analisadas, ou

seja, em nosso estudo, 8 semanas de treinamento físico aeróbio em intensidade

moderada não foi capaz de atenuar os escores histológicos do fígado, em

camundongos ob/ob treinados.

Em relação histologia pancreática, devido à ausência de um escore

específico para este órgão, o grupo realizou uma tabela descritiva dos dados

analisados visto que os estudos envolvendo a infiltração de gordura pancreática

e aspectos da DHGNA, são escassos. Além disso, trata-se de uma área

relativamente nova, se comparada com o campo de investigação das doenças

hepáticas. Um estudo realizado por Mathur et al. [66] comparou as diferenças

entre as características pancreáticas de camundongos ob/ob e seu simliar

C57BL/6J (modelo magro). Nos resultados histopatológicos, apesar de não ter

sido encontrada diferenças significativas para as análises de gordura interlobular

e outros aspectos, foi visto que os animais obesos apresentaram maiores valores

no conteúdo de gordura pancreática. Baseado nos achados de Mathur e de Van

54

Geenen [42 66], esperávamos encontrar características semelhantes em nosso

estudo, no entanto, tanto os animais sedentários quanto os animais treinados

apresentaram valores semelhantes. Além disso, estudos com intervenções

ligadas a prática regular de atividade fisica e exercício físico relacionados com

histologia pancreática são escassos. Mais estudos investigativos são

necessários para melhor compreensão da infiltração de gordura pancreática e

sua relação com a DHGNA, neste modelo animal.

Sabe-se que tanto a resistência à insulina, quanto a inflamação são

elementos chave para a progressão da DHGNA e surgimento da EHNA. A

insulina possui um papel importante na regulação da homeostase de glicose em

vários níveis, reduzindo a produção hepática de glicose (via diminuição da

gliconeogênese e glicogenólise) e aumentando a captação periférica de glicose,

principalmente nos tecidos muscular e adiposo. Geralmente as membranas

celulares não são permeáveis a glicose, com isso, é necessário que haja

estruturas especializadas no transporte deste substrato para dentro da célula,

sendo denominado de transportadores de glicose (GLUT’s). O GLUT-2 é

expresso predominantemente no fígado, rim e pâncreas e desempenha um

papel importante na homeostase da glicose [67 68]. A insulina é secretada pelas

células-beta pancreáticas em resposta a níveis aumentados de glicose na

circulação sanguínea, sendo transportada para as células β através deste

transportador. Portanto, o GLUT-2 pode ser usado como um marcador para

avaliar a eficiência da atividade de glicose, e a diminuição da expressão está

associada à disfunção secretora de células β [69]. Sabe-se que quando há uma

exposição ao treinamento físico, independente de modalidade, há uma melhoria

nos aspectos relacionados a este hormônio [70]. De fato, nosso grupo encontrou

diferenças significativas na expressão dos genes IRS-2 e GLUT-2 no pâncreas,

ou seja, a exposição ao exercício físico foi capaz de aumentar a expressão de

tais genes, gerando melhorias tanto nos receptores quanto na captação e

utilização da glicose.

Por outro lado, o aumento na expressão de IRS-2 e GLUT-2 no fígado,

podem ter significados diferentes quando comparados ao pâncreas. Foi relatado

em estudos com ratos que a expressão de GLUT-2 é aumentada em resposta à

hiperglicemia [71 72] ] e diminuída pela hiperinsulinemia [73]. Em ratos Wistar

55

com diabetes, foi observado um aumento do RNAm do GLUT2 hepático, e esta

alteração era restaurada pela correção da glicemia por florizina, vanádio ou

insulina [74 75]. Outros estudos realizados em fígado de ratos, mostraram que a

proteína e o RNAm do GLUT-2 aumentaram 1,6 e 2 vezes, respectivamente,

após 3 semanas de diabetes [76 77] sendo este quadro revertido quando os

animais eram expostos ao tratamento com insulina por 5 dias apresentando

níveis de do gene semelhantes a animais não diabéticos [77].

Em um estudo realizado por Silva et al. 2011 [76], após 20 dias de

tratamento com aloxana, os ratos Wistar mostraram um ganho de peso inferior

ao grupo controle, o que está relacionado ao quadro catabólico decorrente da

hipoinsulinemia. No tecido hepático, o diabetes também promoveu aumento da

expressão do GLUT-2, sendo este quadro revertido com a administração de

insulina. Em nosso estudo, o grupo treinado apresentou menores valores da

expressão de GLUT-2 em comparação ao grupo sedentário, resultando em

valores de expressão deste gene semelhantes a condições de não diabetes.

Além disso, tais resultados corroboram com os achados de Silva et al.,

mostrando que a prática regular de exercício físico, apesar de não ter

apresentado melhorias significativas na histologia hepática, atua neste órgão

com o mesmo efeito da insulina sintética, contribuindo, a longo prazo para

melhorias em aspectos da DHGNA tanto no fígado quanto no pâncreas.

O exercício regular tem sido considerado uma poderosa ferramenta anti-

inflamatória quando realizado em intensidades controladas [78 79]. Na DHGNA,

a prática regular do exercício físico está associada à redução de citocinas pró-

inflamatórias, adipocinas e outros marcadores relacionados a lesões hepáticas

[80 81] , sendo observado um crescimento relevante no campo de investigações

acerca da inflamação e exercício físico na última década [82]. O treinamento

físico de intensidade moderada a alta induz a ativação de vias anti-inflamatórias

através de vários mecanismos, incluindo a supressão de citocinas pró-

inflamatórias [83], melhoria do estado anti-inflamatório do endotélio [84], e

melhorias na expressão de toll-like receptors (TLR’s) [85]. Os efeitos anti-

inflamatórios do exercício não são apenas mediados pela redução da gordura

visceral, mas também pela indução da cascata anti-inflamatória após cada

sessão de exercício [86 87].

56

A IL-6 é uma importante citocina pró-inflamatória secretada pelos

adipócitos sendo o tecido adiposo branco, o principal contribuinte com os níveis

circulantes desta citocina e está associada a condições como obesidade,

resistência à insulina, e um fator preditivo para diabetes mellitus tipo ll. No fígado

esta citocina apresenta um papel protetor, sendo capaz de suprimir a reação de

estresse oxidativo e prevenir a disfunção mitocondrial. No entanto, uma

exposição prolongada à IL-6 pode sensibilizar o fígado a lesões e contribuir para

a inflamação [88]. Os níveis circulantes de IL-6 estão aumentados em pacientes

com DHGNA comparados aos grupos controle, e níveis elevados de IL-6 estão

associados aos achados histopatológicos avançados [88]. Dessa forma, a IL-6

pode ser útil como único biomarcador não invasivo para distinguir a EHNA de

esteatose simples.

Durante o exercício físico, a IL-6 é uma das primeiras citocinas detectáveis

liberada através da contração muscular e liberada na corrente sanguínea. A IL-

6 derivada desta contração muscular aumenta a medida que o indivíduo é

exposto ao exercício de maneira frequente ou por longos períodos de tempo, no

entanto, a grande diferença entre a endotoxemia e a produção de citocinas

induzida pelo exercício é a ausência no aumento de outras citocinas como TNF-

a e IL-1b. Tal fenômeno foi observado no estudo de Starkie et al. [89] em que foi

administrado uma dose de E. coli para induzir um aumento nas concentrações

plasmáticas de TNF-a em indivíduos saudáveis, que foram randomizados para

repouso ou exercício antes a administração desta endotoxina. Em seus

resultados, a endotoxina foi responsável pelo aumento nos níveis circulantes de

TNF-a. No entanto, os participantes do grupo exercício conseguiram diminuir

totalmente os níveis de TNF-a, mostrando que os efeitos da prática regular de

exercício físico foram semelhantes ao tratamento com infusão de IL-6 para

supressão de TNF-a induzida por endotoxina.

O treinamento físico regular reduz a produção basal de IL-6, bem como a

magnitude da resposta aguda à IL-6, equilibrando vários estímulos potenciais da

IL-6. Portanto, é possível afirmar que uma das adaptações ao exercício físico

seria a redução na produção basal desta citocina, bem como a magnitude da

resposta aguda à IL-6 [90]. Além disso, enquanto que as concentrações

plasmáticas de IL-6 diminuem com a adaptação ao treinamento físico, os níveis

57

de expressão do seu receptor parecem estar aumentado, sugerindo que a

sinalização de IL-6 pode ser aumentada em indivíduos treinados [91]. Em nosso

estudo, os resultados encontrados para IL-6 em ambos os órgãos estavam

aumentados em comparação aos animais sedentários. Acreditamos que este

aumento foi devido a exposição ao exercício físico. Além disso, os resultados

encontrados de TNF-a dos animais treinados, em ambos os órgãos, foram

menores em relação aos sedentários, apesar de não terem sidos evidenciadas

diferenças signifcativas. Acreditamos que o aumento na expressão de IL-6 foi

responsável por estimular a atividade de IL-10, que por sua vez, é capaz de inibir

a produção exarcebada de TNF-a circulante. No entanto, esta hipótese não pode

ser comprovada por não ter sido objetivo do presente estudo. Além disso, não

foram realizadas dosagens de IL-6 no momento pré exercício para verificar se

houve alguma diferença antes e após a exposição ao porotoclo de treinamento,

portanto, não sabemos ao certo se este aumento no grupo treinado se deve ao

fato da exposição ao exercício físico ou aos achados histopatológicos destes

animais.

A IL-10 é uma citocina imunomoduladora potente cujo papel na DHGNA

não foi completamente elucidado [92 93]. Em camundongos exibindo doença

hepática gordurosa induzida por dieta, a inibição seletiva de IL-10 foi associada

com lipogênese aumentada, bem como aumento na expressão de TNF-a e

comprometimento da sensibilidade à insulina no fígado [94]. Além disso, estudos

adicionais em roedores alimentados com dieta hiperlipídica demonstraram que

a presença de DHGNA e hiperglicemia é acompanhada por baixos níveis

sistêmicos de IL-10, o que levou a propor que a IL-10 pode ter a capacidade de

prevenir a esteatose hepática e outras anormalidades metabólicas [95].

Estudos apontam efeitos benéficos da prática regular de exercício físico em

parâmetros não só da DHGNA mas também de doenças crônicas não

transmissíveis. No estudo de Batista et a. [96], a IL-10 parece responder de

maneira positiva à prática regular do exercício físico aeróbio, podendo atuar

como fator central na atenuação e/ou modulação da resposta inflamatória. Além

do aumento local na produção de IL-10, esse efeito poderia ter impacto

sistêmico, reduzindo, ou até mesmo evitando, o aumento de citocinas pró-

inflamatórias, como TNF-a, condição que, no caso da DHGNA está relacionada

58

à maior severidade dessa doença. Speretta et al. [97] avaliou o efeito de oito

semanas de treinamento de força de alta intensidade/curta duração e do

treinamento aeróbio de moderada intensidade/longa duração sobre a expressão

gênica de TNF-a e IL-10, e perfil lipídico. Independente de modalidade de

exercício, os animais submetidos ao treinamento físico apresentaram melhorias

significativas tanto na expressão de TNF-a, IL-10, além de melhorias no perfil

lipídico e conteúdo de gordura visceral em seus diferentes compartimentos. Tais

achados reforçam a ideia que a prática regular de exercício físico gera potenciais

benefícios no controle e manutenção não apenas do perfil lipídico, mas também

na melhoria da expressão de IL-10 e inibição na expressão de TNF-a.

Em nosso estudo, os animais treinados apresentaram níveis de expressão

de IL-10 maiores em comparação aos sedentários, corroborando com os

achados de Batista e Speretta. Além disso, os animais treinados apresentaram

menores valores na expressão de TNF-a em comparação ao grupo sedentário,

apesar de não ter sido evidenciado diferenças significativas. Baseado nos

achados da literatura, acreditamos que tal resultado poder ter sido influenciado

pela melhoria da citocina IL-10, visto que possui um papel importante na inibição

e controle da expressão de citocinas pró-inflamatórias. A partir dos resultados

encontrados em nosso estudo e nos achados da literatura, é possível afirmar

que o protocolo de treinamento físico aeróbio gerou efeitos positivos na resposta

anti-inflamatória, principalmente no pâncreas de animais ob/ob treinados e

consequentemente, a melhoria na expressão de IL-10 nestes animais também

favoreceu para a melhoria e manutenção da sensibilidade à insulina, visto que

esta citocina apresenta forte relação com tal fenômeno.

59

CONCLUSÃO

60

6.0 – CONCLUSÃO:

Na condição em que o estudo foi realizado, podemos concluir que:

• O protocolo de treinamento físico aeróbio realizado por 8 semanas foi

capaz de promover modificações positivas nos genes IRS-2 e GLUT-2

tanto no fígado quanto no pâncreas, além de melhorias na expressão de

citocinas anti-inflamatórias, conferindo um fator protetor em ambos os

órgãos.

• O estudo também mostrou que através deste protocolo, houve atenuação

no ganho de peso corporal de camundongos obesos, melhorias no

consumo alimentar e aumento da tolerância ao exercício físico.

• Quanto às características histopatológicas, não foi possível observar

diminuição nos escores para fígado enquanto que no pâncreas, apesar

de não ter sido evidenciada diferenças estatísticas, os camundongos

submetidos ao protocolo de treinamento aeróbio apresentaram menores

valores histológicos, principalmente em aspectos de infiltrado inflamatório.

61

REFERÊNCIAS

62

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Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)

Preparada pela Biblioteca daFaculdade de Medicina da Universidade de São Paulo

©reprodução autorizada pelo autor

Responsável: Erinalva da Conceição Batista, CRB-8 6755

Silva, Lucas de Lucena Simões e Efeito do treinamento físico na doença hepáticagordurosa não alcoólica (DHGNA) em camundongosobesos : aspectos relacionados com a inflamação eresistência insulínica / Lucas de Lucena Simões eSilva. -- São Paulo, 2019. Dissertação(mestrado)--Faculdade de Medicina daUniversidade de São Paulo. Programa de Ciências em Gastroenterologia. Orientador: José Jukemura.

Descritores: 1.Fígado gorduroso 2.Exercício3.Camundongos obesos 4.Resistência à insulina5.Inflamação 6.Fígado 7.Pâncreas

USP/FM/DBD-275/19

A todos aqueles qυе dе alguma forma

estiveram е estão próximos dе mim, fazendo

esta vida valer cada vеz mais а pena.

Agradecimentos

É chegado então o momento de expressar os mais sinceros agradecimentos a

muitos e tantos adorados familiares, amigos e colegas de trabalho.

Ao meu orientador, Prof. José Jukemura, por suas orientações, pelo seu

otimismo e senso de humor para enfrentar os momentos de dificuldades durante

esta jornada e que no alto de sua sabedoria, soube ser tão humilde ao repassar

todo o seu conhecimento e que esteve comigo até a sua completa conclusão.

À Prof.ª Claudia Oliveira pela sua diferenciada visão e perspectiva com as

diferentes áreas da saúde, por me acolher em seu grupo de pesquisa quando

ainda estava na graduação e ter dedicado um pouco da sua rotina agitada para

ouvir minhas ideias, além de suas orientações e contribuições não só para o

trabalho mas também para vida.

Ao Prof. Stefano Tadeu pelas boas e descontraídas conversas durante aquelas

tardes no laboratório, além de compartilhar seus conselhos e experiências de

vida para engrandecimento profissional e principalmente pessoal.

À Prof. Márcia Kubrusly, por suas orientações e experiências de vida, além de

conselhos e experiências de laboratório, por sempre estar me motivando a

continuar em frente de cabeça erguida principalmente nos momentos de

dificuldades.

Ao meu colega de mestrado e amigo Matheus Santos, por estar no dia-a-dia na

pesquisa ao meu lado, sempre visando o sucesso profissional e pessoal.

A todos os integrantes do grupo de pesquisa em NASH da prof.ª Claudia, em

especial ao Mauro Duarte por compartilhar um pouco de sua rotina não só no

grupo mas também suas experiências na USP, reforçando ainda mais a

importância e o papel das diversas áreas da saúde no tratamento multidisciplinar.

Aos integrantes do grupo de pesquisa da EACH e em especial a Fabiana

Evangelista por dividir seus conhecimentos profissionais e vivências de

laboratório para o treinamento dos animais.

À Vilma por sua disposição e sua paciência, por sempre me atender com aquele

sorriso descontraído e alegre mesmo em momentos corridos.

A todos os professores que contribuíram diariamente com seu conhecimento e

dedicação e que foram importantes na minha jornada acadêmica.

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo

apoio financeiro.

À Deus, por permitir que tudo isso acontecesse e pelo imenso prazer que é viver

amparado por suas mãos, por sua proteção e suas bênçãos.

À meus queridos pais e familiares por suas sábias lições de vida e de esperança,

sempre alimentando meus sonhos e me enchendo de amor e carinho,

depositando a confiança necessária para realizar meus sonhos.

À minha querida noiva Eline Autran por estar comigo desde o início desta jornada

sempre me dando forças e depositando suas esperanças, por me aguentar nos

momentos de raiva e angústia, por respeitar minhas vontades e necessidades

durante este processo, por sua compreensão, força de motivação e apoio moral

para a execução deste trabalho.

Há muito mais a quem agradecer. A todos aqueles que, embora não nomeados,

me brindaram com seus inestimáveis apoios em distintos momentos e por suas

presenças afetivas e inesquecíveis, o meu reconhecido e carinhoso muito

obrigado!

Todos vocês foram partes fundamentais para execução deste trabalho!

Sumário:

Lista de Abreviaturas

Lista de Símbolos

Lista de Siglas

Lista de Tabelas

Lista de Figuras

Resumo

Abstract

1.0 – INTRODUÇÃO: ....................................................................................... 19

2.0 – OBJETIVOS: ........................................................................................... 25

2.1 – Objetivo Geral: ..................................................................................... 25

2.2 – Objetivos Específicos: .......................................................................... 25

3.0 – MATERIAIS E MÉTODOS: ..................................................................... 27

3.1 – Local: ................................................................................................... 27

3.2 – Aspectos Éticos: .................................................................................. 27

3.3 – Procedimentos experimentais e delineamento do estudo:................... 27

3.3.1 – Modelo experimental: .................................................................... 27

3.3.2 – Delineamento experimental: .......................................................... 27

3.4 – Avaliações metabólicas ....................................................................... 28


3.6 – Protocolo de treinamento físico ........................................................... 28

3.7 – Eutanásia e Coleta de materiais para análise: ..................................... 29

3.8 – Avaliação Histológica ........................................................................... 29

3.9 – Extração do RNA Tecidual ................................................................... 30

3.10 – Quantificação e Análise da Integridade do RNA Total ....................... 31

3.11 – PCR quantitativo em tempo real (RT-qPCR): .................................... 31

3.12 – Método de análise da expressão gênica............................................ 32

3.13 – Análises Estatísticas: ......................................................................... 33

4.0 – RESULTADOS ........................................................................................ 35

4.1 – Avaliações metabólicas: ...................................................................... 35


4.3 – Histologia Hepática: ............................................................................. 40

4.4 – Histologia Pancreática: ........................................................................ 40

4.5 – Expressão genica: ............................................................................... 45

5.0 – DISCUSSÃO: .......................................................................................... 50

6.0 – CONCLUSÃO: ......................................................................................... 60

REFERÊNCIAS

Lista de Abreviaturas:

ad libitum à vontade

AKT Proteína quinase B

DHGNA Doença Hepática Gordurosa Não Alcoólica

E. coli Escherichia coli

EHNA Esteato Hepatite Não Alcoólica

et.al. e outros

EUA Estados Unidos da América

Fig Figura

foz/foz fat aussie

GLUT-2 Transportador de Glicose 2

gr Gramas

IL-10 Interleucina 10

IL-1b Interleucina 1 beta

IL-6 Interleucina 6



m Metros

máx Máximo

mín Mínimo

min Minutos

mRNA Ácido ribonucleico mensageiro

ob/ob obeso/obeso

OT-NP cardiac oxytocin natriuretic peptide

RNA Ácido Ribonucleico

SED Sedentário

seg Segundos

TF Treinados

TLR Receptores do Tipo Toll

TNF-a Fator de Necrose Tumoral alfa

Lista de Símbolos:

km/h Quilômetros por hora

% Porcentagem

mL/kg Mililitros por quilograma

µL Microlitros

® Marca Registrada

™ Trade Mark

ºC Graus Celsius

β Beta

ΔCt Delta Ct

ΔΔCt Delta Delta Ct

p Nível de Significância

< Menor que

Lista de Siglas:

ACSM American College of Sports Medicine

CEUA Comissão Ética do Uso de Animais

DP Desvio Padrão

EACH – USP Escola de Artes, Ciências e Humanidades da

Univesidade de São Paulo

FMUSP Faculdade de Medicina da Universidade de São

Paulo

HC – FMUSP Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da

Universidade de São Paulo

HE Hematoxilina – Eosina


de Gastroenterologia Clínica e Experimental)


de Transplante e Cirurgia do Fígado)

QR Quantificação Relativa

rpm Rotações por minuto

RT – qPCR Real Time quantitative Polymerase Chain Reaction

Lista de Tabelas:

Tabela 1 – Ganho de peso corporal e consumos ao final do protocolo

experimental ..................................................................................................... 37

Tabela 2 – Peso dos órgãos e tecidos adiposos de camundongos ob/ob de

ambos os grupos ao final do protocolo de treinamento físico (peso absoluto e

peso relativo) .................................................................................................... 38

Tabela 3 – Tabela de caraterísticas histológicas do tecido hepático de

camundongos obesos (ob/ob) .......................................................................... 40

Tabela 4 – Tabela de descrição da análise histológica pancreática realizada em

ambos os grupos de estudo após o procotolo de treinamento físico ................ 41

Lista de Figuras:

Fig 1: Gráficos de comparação da média de peso corporal entre os grupos e de

evolução de peso corporal dos grupos de estudo frente ao protocolo de

treinamento físico aeróbio de 8 semanas. ........................................................ 36

Fig 2: Gráficos de consumo de água e ração de ambos os grupos de estudo

frente ao protocolo de treinamento aeróbio de 8 semanas .............................. 37

Fig 3: Resultados de ambos os grupos de estudo obtidos através do teste de

esforço físico máximo frente às variáveis ligadas ao protocolo de treinamento

físico aeróbio .................................................................................................... 39

Fig 4 Histologia pancreática de camundongos ob/ob: Gordura Visceral

adjacente (ampliação original X 10) ................................................................. 42

Fig 5 Histologia pancreática de camundongos ob/ob (ampliação original X 20)

......................................................................................................................... 42

Fig 7: Gráfico de comparação entre os animais sedentários e treinados frente

as análises de resistência à insulina no tecido hepático .................................. 45

Fig 8: Gráfico de comparação entre os animais sedentários e treinados

referente as análises de expressão gênica referentes à inflamação no tecido

hepático ............................................................................................................ 46


expressão gênica referentes à resistência insulínica no tecido pancreático .... 47


expressão gênica referentes à inflamação no tecido pancreático .................... 48

RESUMO

Silva LLS. Efeito do treinamento físico na doença hepática gordurosa não

alcoólica (DHGNA) em camundongos obesos: aspectos relacionados com a

inflamação e resistência insulínica [dissertação]. São Paulo: Faculdade de

Medicina, Universidade de São Paulo; 2019.

A Doença Hepática Gordurosa Não Alcoólica (DHGNA), compreende um amplo

espectro de condições que variam desde uma esteatose simples, às condições

mais graves como Esteatohepatite Não Alcoólica (EHNA) fibrose hepática e

cirrose. Entre os fatores relacionados a progressão da doença, a inflamação e a

resistência à insulina são apontados como fundamentais. Além disso, o recente

aumento considerável no número de casos desta doença se deve em parte, ao

comportamento sedentário e reduções drásticas no nível de atividade física.

Mudanças nos hábitos de vida são essenciais para prevenção e controle da

DHGNA. Objetivo: Avaliar o efeito do treinamento físico aeróbio de 8 semanas

em aspectos relacionados com a resistência à insulina e resposta inflamatória

em camundongos obesos com DHGNA Métodos: Foram utilizados 14

camundongos ob/ob com 6 semanas de vida divididos em dois grupos de estudo:

sedentário e treinado. Os animais do grupo treinado realizaram 5 sessões

semanais de 60 minutos de treinamento físico em esteira rolante com

intensidade constante de 60% da velocidade máxima obtida através do teste de

esforço físico. Os animais do grupo sedentário não realizavam o treinamento

físico. Após o período de 8 semanas, os animais foram submetidos a eutanásia

e amostras de tecido hepático e pancreático, foram coletadas para verificar

características histológicas, avaliação dos genes relacionados com a resposta

inflamatória e resistência à insulina. Foram coletados os tecidos adiposos para

verificar a diferença na quantidade de gordura encontrada em cada região do

animal. Para obtenção do material genético, foi realizado a extração do RNA por

TRIzol® e após a verificação de quantidade e integridade do material, foi

realizado a reação em cadeia polimerase, através do equipamento Rotor Gene

RG – 3000. Foi utilizado o teste-t, ANOVA one way e pós teste de Bonferroni de

comparações múltiplas para os dados paramétricos e testes de Mann-Whitney

com pós-teste Dunn's de comparações múltiplas para dados não paramétricos.

Em relação aos escores histológicos foi utilizado o teste Qui-quadrado com exato

de Fisher. Foram consideradas variáveis significativas quando o p< 0,05. Todos

os cálculos e análises foram realizados com o software GraphPad Prism V6.0

(GraphPad Software Inc). Resultados: Foram observadas diferenças

significantes para peso corporal (p=0.008), evolução de peso (p=0.03), consumo

de ração (p<0.0001) além de diminuição no conteúdo de gordura da região

retroperitonial (p=0.03). Além disso, foram observadas diferenças significantes

para velocidade pico (p=0.03), distância (p=0.01) e tempo (p=0.006). A análise

histológica não mostrou diferenças estatísticas entre os grupos em ambos os

órgãos. Nas análises de expressão gênica, foram observadas diferenças

significantes nos genes de GLUT-2 (p=0.03), IL-6 (p= 0.01) e IL-10 (p=0.03)

hepáticos. Em relação ao pâncreas, foi observada diferença significante para os

genes de IRS-2 (p=0.004), GLUT-2 (p=0.03), IL-6 (p=0.002) e IL-10 (p=0.008).

Conclusão: Um protocolo de treinamento físico de 8 semanas foi capaz de

atenuar o ganho de peso corporal, consumo alimentar e gerar efeitos positivos

na expressão de genes relacionados com resistência à insulina e inflamação no

fígado e pâncreas de camundongos ob-ob.

Descritores: Fígado gorduroso; Exercício; Camundongos obesos; Resistência

à insulina; Inflamação; Fígado; Pâncreas.

ABSTRACT

Silva LLS. Physical training effect in obese mice with non-alcoholic fatty liver

disease: aspects related to insulin resistance and inflammation (dissertation).

São Paulo: “Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo”; 2019.

Non-alcoholic Fatty Liver Disease (NAFLD) encompasses a wide spectrum of

pathologies from hepatic steatosis, nonalcoholic steatohepatitis (NASH), fibrosis

and cirrhosis. Insulin resistance and inflammation are reported as the main

factors for disease progression. Moreover, the increase in the number of new

cases of NAFLD can be explained by sedentary behavior and drastic reductions

in physical activity levels, therefore, lifestyle modifications are essencial for

prevention and control of the disease. Objective: Evaluate the effect of 8 weeks

of aerobic training on insulin resistance and inflammatory response in obese mice

(ob/ob) with NAFLD. Methods: Male ob/ob mice were randomly divided into

sedentary (n=7) and trained (n=7) groups. Aerobic training consisted of 5 weekly

sessions, 60 min per session at 60% of the maximum speed of the running test.

Hepatic and pancreatic samples were collected to evaluate histological features

and gene expression associated with insulin resistance and inflammatory

response after 8 week experiment protocol. RNA was performed by TRIzol®.

PCR experiments were performed using the Rotor Gene RG – 3000. Parametric

data were assessed by t-test, ANOVA one way and Bonferroni test for multiple

comparisons. Non-parametric data were assessed by the Mann-Whitney tests

with Dunn's post-test of multiple comparisons. Histological analysis was

assessed by chi-square test with Fisher's exact test. Significant variables were

considered when p <0.05. All the analyzes were performed by GraphPad Prism

V6.0 software (GraphPad Software Inc). Results: Reductions in body weight (p

= 0.008), weight evolution (p = 0.03), food intake (p <0.0001) and fat content were

observed in trained group. Moreover, the trained group showed better results in

peak velocity (p=0.03) physical effort tolerance (p=0.006) and distance (p=0.01).

Histological analysis showed no statistical differences between groups in both

organs. Gene expression showed differences in IL-6 (p= 0.01), IL-10 (p=0.03)

and GLUT-2 (p=0.03) in hepatic analysis, between groups. Pancreatic gene

expression showed difference between groups in IRS-2 (p=0.004), GLUT-2

(p=0.03), IL-6 (p=0.002) and IL-10 (p=0.008) analysis. Conclusions: An 8-week

physical training protocol was able to attenuate body weight gain, food intake and

generate positive effects on gene expression related to insulin resistance and

inflammation in both liver and pancreas of ob/ob mice.

Descriptors: Fatty liver; Exercise; Mice, Obese; Insulin resistance; Inflammation;

Liver; Pancreas.

INTRODUÇÃO

19

1.0 – INTRODUÇÃO:

A Doença Hepática Gordurosa Não Alcoólica (DHGNA) engloba um

espectro de modificações hepáticas que vão desde um simples depósito de

gordura no interior do hepatócito, sem inflamação ou fibrose, o que caracteriza

um processo de esteatose simples, até casos de esteatohepatite não alcoólica

(EHNA), cirrose e, carcinoma hepatocelular em pacientes sem histórico de

etilismo. Atualmente é considerada uma das formas mais frequentes de

manifestação hepática, geralmente associada a quadros clínicos de obesidade,

resistência à insulina e diabetes mellitus tipo ll [1].

A real prevalência da DHGNA é desconhecida, pois a maioria dos

indivíduos acometidos por esta doença, mesmo aqueles com diabetes,

apresentam aminotransferases hepáticas normais e os médicos não suspeitam

da possível presença de DHGNA [2]. Estima-se que a prevalência global da

doença seja em torno de 24%, sendo a população obesa a mais afetada,

podendo variar entre 70 – 90% [3]. Em todos os continentes, é possível observar

um número considerável de indivíduos afetados por esta doença sendo as

maiores taxas reportadas na América do Sul (31%) e no Oriente Médio (32%),

seguidas pela Ásia (27%), EUA (24%) e Europa (23%), enquanto que o

continente Africano apresenta a menor prevalência (14%) [4]. No Brasil, cerca

de 30% da população é afetada pela doença, no entanto, este número pode

variar devido ao método de avaliação utilizado e pela grande diversidade étnica

da população brasileira [5 6].

A DHGNA tem se tornado cada vez mais comum em todas as populações,

principalmente no ocidente, devido ao processo de industrialização e mudanças

inadequadas no estilo de vida. Além disso, espera-se que o número de

indivíduos afetados aumente nos próximos anos, em consonância com o

aumento da obesidade devido à adoção de uma dieta rica em gordura e

inatividade física. Nos EUA, tornou-se a segunda causa mais comum de

transplante hepático e provavelmente se tornará a principal causa nos próximos

10 anos [7].

20

Os princípios fisiopatológicos da DHGNA, principalmente os fatores que

contribuem para sua progressão, evoluíram significativamente ao longo dos

anos, fazendo com que a teoria dos “múltiplos hits” [8] se tornasse obsoleta.

Vários eventos podem resultar na esteatose hepática. O desenvolvimento desta

condição é dependente do fluxo de ácidos graxos livres (AGL), que podem ser

derivados da lipólise periférica, ou seja, ácidos graxos liberados do tecido

adiposo, diminuição da oxidação de AGL, aumento da de novo lipogênese (DNL)

e diminuição da exportação de lipídios hepáticos via lipoproteínas de densidade

muito baixa (VLDL), além de fatores externos como dietas hiperlipídicas e / ou

consumo exacerbado de alimentos ricos em açúcares simples [9]. Dentre os

fatores que contribuem para a progressão e gravidade da doença, a resistência

à insulina tem sido caracterizada como o fator fisiopatológico crucial na DHGNA

[10]. Tanto a resistência à insulina hepática quanto a periférica, apresentam

estreita correlação com a DHGNA, independente da gravidade da doença [11].

A resistência à insulina é um fator fundamental para o desenvolvimento e

progressão da DHGNA. O excesso de ácidos graxos, cuja produção é induzida

pela lipogênese e síntese de ácidos graxos, assim como pelos ácidos graxos

oxidados, circula nos tecidos periféricos, incluindo o fígado e o tecido adiposo,

onde se acumulam, resultando em resistência à insulina [12]. O tecido adiposo

é um mediador do armazenamento sistêmico de lipídeos, além de ser um órgão

endócrino que secreta hormônios e o grupo de citocinas conhecidas como

adipocinas, como adiponectina e leptina. Na condição de DHGNA, o excesso de

lipídios intrahepáticos é responsável por mudanças na atividade macrofágica,

que por sua vez, secretam mediadores inflamatórios como fator de necrose

tumoral alfa (TNF-a), e interleucina 1 beta (IL-1b), levando a resistência à insulina

sistêmica e progressão para EHNA.

No fígado, a resistência à insulina é definida pela supressão na produção

de glicose, mediada pelo comprometimento da insulina, resultando no aumento

da gliconeogênese e diminuição da síntese hepática de glicogênio. A síntese de

glicogênio hepático estimulada por insulina, por sua vez, correlaciona-se

negativamente com o conteúdo de gordura no fígado [13]. Em pacientes obesos

e portadores de DM2, a presença de DHGNA está associada a hiperinsulinemia,

dislipidemia e resistência insulínica mais graves no tecido hepático e adiposo do

21

que em pacientes sem DHGNA [14]. Vários conceitos podem explicar a

associação entre DHGNA e resistência à insulina: o acúmulo de gordura no

fígado pode ter origem na resistência à insulina e hiperinsulinemia [15] ou

diretamente na disponibilidade excessiva de lipídios.

Outro fator que contribui não só para o aumento da resistência à insulina,

mas também para a fisiopatogênese e progressão da DHGNA é o processo

inflamatório e suas vias. As vias inflamatórias têm sido cada vez mais

reconhecidas como criticamente envolvidas no desenvolvimento da resistência

à insulina [16 17]. No entanto, a etiologia da resistência à insulina é complexa e

envolve muitas vias diferentes além da inflamação [18]. Atualmente, ainda não

está claro em quais locais os processos inflamatórios são iniciados. Além do

tecido adiposo, o trato gastrointestinal, com sua microbiota marcadamente

alterada, pode refletir um dos primeiros eventos na evolução da resistência à

insulina e da DHGNA [19].

Estudos em camundongos com depleção hepática de AKT e FOXO1, que

adaptam seus fluxos de glicose adequadamente a jejum e alimentação [20],

revelaram que a IL-6, liberada dos macrófagos do tecido adiposo, inibe a lipólise

mediada pela insulina no tecido adiposo branco e leva a maior entrega de AGL

e glicerol para o fígado [21]. Como resultado, as concentrações hepáticas de

acetil-CoA são elevadas, devido ao aumento da β-oxidação dos ácidos graxos,

que estimula a gliconeogênese hepática através da ativação alostérica da

piruvato carboxilase mitocondrial. Da mesma forma, os adolescentes que são

obesos e resistentes à insulina apresentam maiores concentrações de IL-6

derivadas do tecido adiposo em comparação a indivíduos magros [21]. A rápida

redução mediada por insulina na produção de glicose hepática [22] e a falta de

qualquer relação entre a expressão hepática de proteínas gliconeogênicas e

hiperglicemia de jejum em indivíduos obesos, com ou sem DM2 [23], corroboram

a relevância clínica deste mecanismo.

Atualmente, os estudos que avaliam os processos fisiopatológicos da

DHGNA mostram que outros órgãos e sistemas também estão envolvidos,

dentre eles o pâncreas. Similar a condição do fígado, o acúmulo excessivo de

gordura ectópica no pâncreas é referido como esteatose pancreática ou doença

22

pancreática gordurosa não alcoólica (DPGNA) [24]. Nos últimos anos, tornou-se

uma condição cada vez mais reconhecida, estando presente em cerca de 67%

dos pacientes com DHGNA [25]. Além disso, a DPGNA está associada a outros

fatores de risco como resistência à insulina, diabetes, hiperlipidemia, síndrome

metabólica e obesidade [26 27].

Estudos com ratos demonstram que a exposição a longo prazo a uma dieta

hiperlipídica induz acúmulo de gordura interlobular e intralobular, infiltração de

células inflamatórias e fibrose no pâncreas, danificando a morfologia das ilhotas

pancreáticas [28]. Da mesma forma, camundongos C57BL/6 expostos a dieta

rica em gordura desenvolveram obesidade e resistência à insulina,

acompanhados por características da DHGNA e da DPGNA [29 30]. Além disso,

é visto também que uma maior duração da dieta rica em gordura aumentou o

conteúdo de triglicerídios no pâncreas, mas não no fígado, sugerindo que o

pâncreas é particularmente susceptível à deposição de gordura ectópica [31].

Mudanças dos hábitos de vida têm sido utilizadas no combate da DHGNA

e dos processos fisiopatológicos associados, tais como diabetes mellitus,

obesidade, hiperglicemia, hipercolesterolemia e síndrome metabólica. Assim,

dentre as recomendações instituídas, o exercício físico e a diminuição do peso

corporal são eficazes para promover melhora na qualidade de vida dos

indivíduos [32]. Parte dos benefícios gerados pela prática regular de exercício

físico é decorrente do aumento da oxidação de ácidos graxos livres (AGL),

contribuindo diretamente para melhorar o fenótipo metabólico hepático na

DHGNA [33].

Rector et al [34], demostraram, que a prática de atividade física aeróbia

com intensidade de 85% do volume de oxigênio máximo por 12 semanas, foi

capaz de melhorar os níveis de triglicerídeos intra-hepáticos, tendo a quantidade

de gordura visceral medida por ressonância magnética em pacientes com

DHGNA. Além disso o mesmo artigo demonstra que é possível obter

modificações positivas causadas pela atividade física nos níveis de lipídios intra-

hepáticos, sensibilidade e resistência à insulina, mesmo sem mudanças no peso

corporal dos indivíduos, mas quando a prática regular de atividade física gera

perda de peso, os benefícios são duplamente potencializados. Apesar dos

23

estudos demonstrarem efeitos positivos da prática regular de atividade física,

uma das principais limitações para novos estudos com humanos está ligada a

falta de adesão e a ausência de programas de promoção à saúde e prevenção

de doenças.

Com isso estudos em modelo experimental aparecem como alternativa,

pois apresentam a possibilidade de controlar variáveis fisiológicas e ambientais,

além disso este modelo possui um custo menor e, é capaz de mimetizar

condições humanas. O modelo experimental com camundongos obesos (ob/ob)

que foi descoberto em 1949 em Roscoe B. Jackson Memorial Laboratory, no

estado de Maine, EUA, se caracteriza, por um consumo excessivo de nutrientes

e por sua deficiência à leptina, que por sua vez, atua nesses animais na

determinação do fenótipo da obesidade, hiperglicemia e hiperinsulinemia [35 36].

Estes camundongos são utilizados em modelos para diversos tipos de estudo

com doenças e condições fisiopatológicas como: diabetes, obesidade, resposta

inflamatória e resistência à insulina.

A condição metabólica dos camundongos ob/ob provocam uma

redistribuição no armazenamento de gordura corporal, hepática e de outros

tecidos não-adiposos. Este aumento da captação de lipídios induz ao dano e

apoptose celular. Haczeyni et al., [37] demonstraram que o exercício físico

aeróbico realizado na roda, resulta em um efeito metabólico protetor, aumento

da fosforilação de proteina kinase B (AKT) em nível muscular, além de oferecer

efeito de prevenção sobre a resposta inflamatória, obesidade e diabetes em

camundongos obesos foz/foz. Outro achado importante deste estudo encontra-

se na modulação realizada pelo exercício físico aeróbio sobre a morfometria de

adipócitos, tal fenômeno diminui o tamanho destas células, sua hipertrofia e

conteúdo. Apesar dos estudos demonstrarem efeitos positivos oriundos do

exercício físico, e de haver um amplo campo de investigações acerca da

DHGNA, os mecanismos subjacentes associados a progressão da doença não

estão totalmente esclarecidos. Além disso, os dados encontrados na literatura

acerca da deposição de gordura pancreática, seus mecanismos fisiopatológicos

e a relevância clínica da esteatose pancreática não estão bem elucidados.

24

OBJETIVOS

25

2.0 – OBJETIVOS:

2.1 – Objetivo Geral:

• Avaliar o efeito do treinamento físico sobre marcadores de resposta

inflamatória e resistência à insulina em modelo DHGNA de

camundongos ob/ob.

2.2 – Objetivos Específicos:

• Avaliar o efeito do treinamento físico aeróbio em marcadores de

inflamação (IL-6; TNF-α; IL-10) em amostras de tecido hepático e

pancreático.

• Avaliar o efeito do treinamento físico aeróbio em marcadores

relacionados com a resistência à insulina (IRS-2; GLUT-2) em

amostras de tecido hepático e pancreático.

• Avaliar o efeito do treinamento físico aeróbio sob as variáveis ligadas

ao treinamento físico, peso corporal e consumo alimentar.

26

MATERIAIS E MÉTODOS

27

3.0 – MATERIAIS E MÉTODOS:

3.1 – Local:

O estudo foi desenvolvido nos Laboratórios de Gastroenterologia Clínica

e Experimental (LIM-07), Laboratório de Transplante e Cirurgia do Fígado (LIM-

37) do Departamento de Gastroenterologia da Faculdade de Medicina da

Universidade de São Paulo (FMUSP) e no Laboratório de Biomedicina da Escola

de Artes, Ciências e Humanidades da USP (EACH-USP).

3.2 – Aspectos Éticos:

Esse estudo seguiu as orientações recomendadas da Declaração de

Helsinki de 1975 (publicada por "US National Institute of Health-Guide for care

and use of laboratory animals" (NIH Publication, n° 85-23, revisada em 1996)) e

do Serviço de Experimentação em animais da Faculdade de Medicina da

Universidade de São Paulo. O estudo foi submetido à Comissão de Ética para

Análise de Projetos de Pesquisa da Faculdade de Medicina da Universidade de

São Paulo (FMUSP) aprovado com número 930/17 pela Comissão de Ética no

Uso de Animais (CEUA).

3.3 – Procedimentos experimentais e delineamento do estudo:

3.3.1 – Modelo experimental:

Foram utilizados camundongos ob/ob, machos, com 6 semanas de vida,

provenientes do Biotério do Laboratório de Gastroenterologia Clínica e

Experimental (LIM-07) da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo

(FMUSP). Os animais foram mantidos no Biotério da EACH-USP durante todo o

protocolo experimental, com temperatura e ventilação controladas, com ciclos de

luz / escuro de 12 horas. Além disso, os animais tiveram livre acesso à água e

ração ad libitum. Foi utilizada dieta padrão e ração da marca Nuvilab CR1.

3.3.2 – Delineamento experimental:

Os animais foram distribuídos de forma aleatória em dois grupos:

Grupo sedentário (SED): constituído por sete animais machos

que não foram submetidos ao treinamento físico.

28

Grupo treinado (TF): constituído por sete animais machos que

foram submetidos ao treinamento físico

3.4 – Avaliações metabólicas

Ao longo de todo protocolo experimental, a pesagem corporal foi realizada

semanalmente em balança digital (Gehaka/modelo BG4001, São Paulo, Brasil),

no mesmo dia e horário. Além da evolução, foi calculado o ganho de peso

através da diferença entre o peso corporal final (semana 8) e o peso corporal

inicial (semana pré-treinamento). O consumo de ração foi avaliado em grupos de

animais mantidos na mesma gaiola ao longo de todo protocolo experimental,

durante períodos de 24 horas, por 3 dias consecutivos de cada semana. Foi

utilizado a média dos 3 dias avaliados para determinar o consumo de ração

semanal e após a obtenção deste resultado, o valor foi dividido pela quantidade

de animais por caixa para obter o consumo médio por animal.


A capacidade máxima de execução de exercício físico foi avaliada no

momento pré treinamento, na semana 4 e após o treinamento físico através de

um teste progressivo até a exaustão em esteira rolante. Foram mensuradas as

seguintes variáveis de treinamento: tempo máximo de execução do teste,

velocidade máxima atingida no pico do exercício e a distância total percorrida. A

velocidade inicial da esteira foi de 0,2 km/h sem haver inclinação da mesma. A

cada três minutos, a velocidade da esteira foi aumentada em 0,2 km/h até serem

observados sinais de exaustão do animal. O teste é finalizado quando o

camundongo entrar em fadiga, ou seja, não conseguir manter o padrão de

marcha. Na semana 4, foi realizado o teste somente nos animais treinados para

reajuste da velocidade do treinamento físico.

3.6 – Protocolo de treinamento físico

O protocolo de treinamento físico foi realizado em esteira rolante, 5 vezes

por semana, durante 8 semanas. Todas as sessões de treinamento tiveram

intensidades estabelecidas de 60% da velocidade máxima atingida no teste de

tolerância ao esforço físico, com o tempo sendo progressivamente aumentado,

iniciando com 30 minutos na primeira semana e atingindo 60 minutos na quarta

29

semana, conforme descrito por Ferreira et al. [38]. Após a quarta semana de

treinamento, o tempo de 60 minutos foi mantido até o término do protocolo. Os

camundongos sedentários foram submetidos à caminhada na esteira, 1 vez por

semana, durante 10 minutos. Esse procedimento se faz necessário para evitar

qualquer interferência do estresse gerado pela esteira no momento da realização

do teste de tolerância ao esforço físico.

3.7 – Eutanásia e Coleta de materiais para análise:

Após período de 8 semanas de treinamento físico, os animais foram

anestesiados utilizando-se cloridrato de cetamina (0,1mL/Kg) intraperitoneal.

Após a administração do anestésico, foram retirados os órgãos de cada animal

para as análises propostas. Amostras de tecido hepático e pancreático foram

coletados para verificar possíveis diferenças no peso de cada órgão, avaliação

histológica, avaliação dos genes relacionados com a resposta inflamatória (TNF-

a, IL-6, IL-10), resistência à insulina (IRS-1, IRS-2, GLUT-2) e análise do

conteúdo de mRNA dos genes citados anteriormente. Também foram coletados

os tecidos adiposos nos diferentes compartimentos de cada animal apenas para

comparar a diferença na quantidade de gordura encontrada em cada grupo de

estudo. Foram coletados tecidos adiposos da região retroperitoneal, inguinal e

periepididimal. Após a coleta de todos os materiais, as carcaças dos animais

foram enviadas para incineração, conforme às normas de descarte da FMUSP.

3.8 – Avaliação Histológica

Após a remoção do fígado, foram coletadas amostras de tecidos referentes

aos segmentos II e III do lobo esquerdo, o qual está mais relacionado com o

surgimento e progressão da DHGNA [39 40]. Para análises de histologia no

pâncreas, foi removido o tecido pancreático das porções próximas ao duodeno.

Os fragmentos coletados de cada tecido, foram fixados em solução de

formol a 4%, processados e submetidos às colorações de hematoxilina-eosina

(HE) segundo a rotina adotada na divisão de Anatomia Patológica do HC-

FMUSP. As lâminas histológicas de cada tecido foram avaliadas de maneira

“cega” por um patologista experiente. Em relação a avaliação histológica, no

fígado, foi utilizado um sistema modificado para roedores proposto por Liang et

30

al. [41]. As variáveis histológicas presentes neste sistema são: esteatose

macrovesicular (0-3), esteatose microvesicular (0-3), hipertrofia hepatocelular (0-

3) e focos de inflamação (0-3). A soma para esteatose varia entre 0-9. Para o

diagnóstico da DHGNA é necessário que o valor para esteatose seja entre 1-9 e

ausência de focos inflamatórios. Caso haja presença de focos inflamatórios,

independente do valor de esteatose encontrado, é feito o diagnóstico para

esteatohepatite não alcoólica (EHNA). Este sistema de pontuação não inclui a

fibrose em sua análise, pois não é requisito para diagnóstico da EHNA, embora

seja frequente nesta população. Além disso, este modelo animal não apresenta

fibrose, sendo o escore bastante adequado para comparação entre os grupos.

No pâncreas, foi utilizado um sistema de avaliação semelhante ao trabalho

de Van Geenem et al. [42]. As variáveis histológicas utilizadas neste sistema

foram: gordura interlobular, gordura intralobular, fibrose, edema, necrose acinar,

infiltrado inflamatório, hemorragia e necrose de gordura.

3.9 – Extração do RNA Tecidual

O material recebido em nitrogênio líquido foi fragmentado manualmente

utilizando-se almofariz e pistilo. Após a fragmentação, foi adicionado 1,0 mL de

TRIzol® (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA), e essa mistura foi

incubada por 5 min à temperatura ambiente em tubos de microcentrífuga de 1,5

mL. Foram adicionados 200 µL de clorofórmio (Merck), sob agitação vigorosa

por 15 seg, seguido por um período incubatório de 5 min à temperatura ambiente

e centrifugada a, 12.000 rpm, por 15 minutos e temperatura de 4 ºC. Em seguida,

o sobrenadante foi transferido para um novo tubo estéril de 1,5 mL e o RNA foi

precipitado com 500 µL de isopropanol (Merck). A mistura foi deixada em

repouso durante 10 min e centrifugada por 15 min, 12.000 rpm, a 4 ºC. O

sobrenadante foi removido e o pellet de RNA lavado com 1,0 mL de etanol

(Merck) 75%, centrifugado novamente e ressuspendido em volume apropriado

de água estéril (UltraPure™ DNase/RNase-Free Distilled Water (Invitrogen Life

Technologies, Carlsbad, CA, USA)).

31

3.10 – Quantificação e Análise da Integridade do RNA Total

A concentração dos RNAs totais extraídos foi determinada por

espectrofotometria (NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies, Wilmington,

DE, USA)). A preparação do RNA é considerada livre de contaminantes

(proteínas e fenol) quando a relação A260/280 encontra-se entre 1,8 e 2,0. Para

as amostras que não atingiram estes valores, foram realizadas purificações

utilizando-se o kit RNeasy® Mini Kit (Qiagen, Hilden, Alemanha). A integridade

e a pureza dos RNAs foram analisadas por eletroforese em gel de agarose 1%.

Somente foram utilizadas as amostras cujas bandas correspondentes ao RNA

ribossomal 18 e 28 S mostraram-se íntegras à analise sob luz ultravioleta. Os

RNAs foram mantidos a -80 °C até sua utilização.

3.11 – PCR quantitativo em tempo real (RT-qPCR):

As reações de RT-qPCR foram realizadas no equipamento Rotor-Gene

RG-3000 (Corbett Research, Sidney, Austrália), utilizando-se reagentes

SuperScript™ III Platinum® One-Step Quantitative RT-PCR System (Invitrogen

Life Technologies, Carlsbad, EUA), conforme recomendação do fabricante. A

intensidade de expressão de cada gene foi obtida pelo valor de limiar do ciclo,

no qual o aumento no sinal associado à fase exponencial de amplificação do

fragmento começa a ser detectada. A reação para cada gene analisado foi

cuidadosamente padronizada com a finalidade de evitar qualquer amplificação

inespecífica. A temperatura de anelamento para a amplificação dos genes IRS-

2, GLUT-2 IL-6 e IL-10 foi 55 ºC, enquanto que para o gene de TNF-a foi de 57

ºC. Todas as reações de RT-q PCR foram realizadas em duplicata para cada

amostra de tecidos hepático e pancreático tanto para o gene alvo quanto para o

controle endógeno (β-actina).

32

Sequência dos primers (forward/reverse) utilizados na reação de qRT-PCR

para cada gene estudado

Genes Sequência

IRS-2 F: CGG CTG GAG TAC TAC GAG AG

R: CGC GCT TGT TGA TGT TCA GA

GLUT-2 F: TCA GAA GAC AGG GTA CAG CGA

R:TCC AGT GCC AGC GTA TAA GT

TNF-α F: CCA CCA CGC TCT TCT GTC TA

R: TCC TTC TTG CCC TCC TAA CC

IL-6 F: TTC TTG GGA CTG ATG CTG GT

R: CAG GTC TGT TGG GAG TGG TA

IL-10 F: TGC TGC TCC TCC CCT ATT TC

R: TTC GGA TGT GCC TGG GTT TA

Β-actina F: TGT CAC CAA CTG GGA CGA TA

R: GGG GTG TTG AAG GTC TCA AA

F= forward; R= reverse

3.12 – Método de análise da expressão gênica

Para o cálculo do nível de expressão de cada gene alvo, utilizou-se o

método 2-delta delta Ct para a quantificação relativa [43], onde Ct (“threshold

cycle”) é o ciclo da PCR em tempo real, no qual a amplificação atinge a fase

logarítmica, onde delta Ct é a diferença de expressão entre gene alvo e controle

endógeno de uma determinada amostra e delta delta Ct corresponde à diferença

entre o delta Ct da amostra e o delta Ct do controle.

A fórmula utilizada para a quantificação relativa (QR):

QR= 2-ΔCt

ΔCt= Ct gene alvo-Ct gene referência

ΔΔCt= ΔCt amostra-ΔCt controle

33

3.13 – Análises Estatísticas:

Todos os dados foram expressos como média ou mediana (dependendo

do padrão de distribuição das variáveis) e seus respectivos valores mínimos

(min), máximos (máx) e de desvio padrão (DP). Para variáveis de distribuição

paramétrica foram utilizados teste-t, one-way ANOVA e o pós-teste Bonferroni

de múltiplas comparações. Para variáveis de distribuição não-paramétrica foram

utilizados os testes de Mann-Whitney, Kruskal-Wallis e o pós-teste Dunn's de

comparações múltiplas. Para comparação dos escores histológicos entre os

grupos foram utilizados os testes de Qui-quadrado com exato de Fisher. Foram

consideradas variáveis significativas aquelas em que o p<0,05. Todos os

cálculos e análises foram realizados com o software GraphPad Prism V6.0

(GraphPad Software Inc).

34

RESULTADOS

35

4.0 – RESULTADOS

4.1 – Avaliações metabólicas:

4.1.1 – Peso corporal:

No momento inicial do protocolo de treinamento, não foram observadas

diferenças significativas entre os grupos de estudo, porém, ao final do protocolo,

foram observadas diferenças significativas da média de peso corporal do grupo

treinado em comparação ao grupo sedentário (12.9±2.9 VS 9.6±2.1 p= 0.008). Em

relação a evolução de peso corporal, a partir da terceira semana de treinamento,

foram observadas diferenças estatísticas entre os grupos sedentário e treinado

(Figura 1). Ainda sobre este resultado, os animais sedentários obtiveram um

ganho de peso médio de 35% durante todo o protocolo experimental enquanto

que os animais submetidos ao treinamento aeróbio obtiveram um ganho médio

de 26%.

P e s o C o r p o r a l

Gra

ma

s (

gr)

SE

DT

F

0

5

1 0

1 5

2 0

p = 0 .0 0 8

* *

36

E v o lu ç ã o d e P e s o C o r p o r a l

S e m a n a s

Pe

so

Co

rp

ora

l (g

r)

0 1 2 3 4 5 6 7 8

3 0

3 5

4 0

4 5

5 0

5 5

S E D

TF

p = 0 .0 0 0 3

******

Fig 1: Gráficos de comparação da média de peso corporal entre os grupos e de evolução de peso corporal dos grupos de estudo frente ao protocolo de treinamento físico aeróbio de 8 semanas.

4.1.2 – Consumo alimentar:

Em relação ao consumo de água e ração, foram encontradas diferenças

significativas do grupo sedentário em comparação ao grupo de animais treinados

(Figura 2). Em ambas as variáveis, os animais sedentários apresentaram

maiores valores em comparação aos animais treinados (Tabela 1).

C o n s u m o d e Á g u a

mL

/an

ima

l/2

4h

SE

DT

F

0

2

4

6

8

1 0

p = 0 .0 0 1

**

37

C o n s u m o d e R a ç ã o

gr/a

nim

al/

24

h

SE

DT

F

0

2

4

6

8

1 0

p < 0 .0 0 0 1* * * *

S E D

T F

Fig 2: Gráficos de consumo de água e ração de ambos os grupos de estudo frente ao protocolo de treinamento aeróbio de 8 semanas

Tabela 1 – Ganho de peso corporal e consumo alimentar ao final do protocolo experimental

Sedentários

(n=7) Treinados

(n=7) P

Ganho de peso corporal (g)

12.9±2.9 9.6±2.1 0.008

Ganho de peso (%) 35.6±10.1 26.8±6.5 0.03

Consumo de Água 6.6±1.5 4.9±1.2 0.001

Consumo de Ração 5.6±1.1 4.4±0.9 < 0.0001

p<0,05

4.1.3 – Tecidos Adiposos e Peso Hepático:

Em relação aos tecidos adiposos foram observadas diferenças para o

tecido retroperitoneal sendo os menores valores encontrados nos animais

pertencentes ao grupo TF (Tabela 2). No fígado foram encontradas diferenças

estatísticas sendo o grupo treinado com os menores valores em comparação aos

sedentários. Em relação aos outros tecidos foram encontradas diferenças

significativas no peso absoluto e peso relativo do fígado do grupo treinado em

comparação ao grupo sedentário.

38

Tabela 2 – Peso dos órgãos e tecidos adiposos de camundongos ob/ob de ambos os grupos ao final do protocolo de treinamento físico (peso absoluto e peso relativo)

Sedentários (n=7)

Treinados (n=7)

p

Peso absoluto

Fígado (gr) 2.5±0.3 2.2±0.2 0.04

T. adiposo peritonial (gr) 2.5 (2.0–5.5) 1.5 (1.5–4.0) 0.03

T. adiposo inguinal (gr) 2.4±0.6 1.8±0.8 0.10

T. adiposo periepididimal (gr) 3.0±1.3 2.9±0.9 0.87

Peso relativo

Fígado (mg) 54.0±4.8 50.3±5.3 0.04

T. adiposo peritonial (mg) 59.5 (40.0–103.1) 36.1 (32.6–93.0) 0.04

T. adiposo inguinal (mg) 51.5±15.9 42.5±20.1 0.49

T. adiposo periepididimal (mg) 64.4±32.1 66.4±18.9 0.88

p<0,05


No que diz respeito às variáveis ligadas ao treinamento físico, no momento

pré treinamento não foram observadas diferenças significativas para velocidade

pico, distância percorrida e tempo de exposição ao teste de esforço entre os

grupos de estudo, no entanto, ao final do protocolo foram observadas diferenças

significativas dos animais treinados no momento pré treinamento em

comparação ao momento pós treinamento do grupo sedentário (Fig 3).

39

V e lo c id a d e P ic o (k m /h )

Ve

loc

ida

de

(k

m/h

)


0 .0

0 .5

1 .0

1 .5

2 .0S E D P ré

T F P ré

S E D P ó s

T F P ó s

p = 0 .0 3 1 0

*

D is tâ n c ia (k m )

Dis

tân

cia

(k

m)


0 .0

0 .1

0 .2

0 .3

0 .4

0 .5

S E D P ré

T F P ré

S E D P ó s

T F P ó s

*

p = 0 .0 4 5 5

T e m p o (m in )

Te

mp

o (

min

)


0

5

1 0

1 5

2 0

2 5S E D P ré

T F P ré

S E D P ó s

T F P ó s

p = 0 .0 0 6 9

*

Fig 3: Resultados de ambos os grupos de estudo obtidos através do teste de esforço físico máximo frente às variáveis ligadas ao protocolo de treinamento físico aeróbio