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aa
Liposomas de PC-PEG-TRAVAPROST para el
tratamiento sostenido de la presión intraocular en
la enfermedad de glaucoma
Tesis que como requisito para obtener el grado
de
MAESTRO EN CIENCIA DE MATERIALES
Presenta:
Q.B. Alejandra López Millán
Hermosillo, Sonora.
CENTRO DE INVESTIGACIÓN EN MATERIALES
AVANZADOS, S. C.
POSGRADO
i
Forma de aprobación
ii
Agradecimientos
Al Dr. Juan Antonio Noriega, por su apoyo durante los estudios de encapsulación
de fármacos. Gracias por sus enseñanzas.
Al Dr. Ramón Acuña y la Dra. Judith Tanori por su apoyo durante los estudios de
microscopía electrónica de transmisión.
A los miembros del comité y directores de tesis: Dr. Ricardo López Esparza, Dra.
María Antonia Luna, Dr. Armando Zaragoza y Dra. Claudia Berlanga por el tiempo
dedicado para la revisión de este trabajo.
A los profesores del posgrado. Al Dr. Jesús Jiménez Román y al Dr. Ricardo
López Esparza por creer en mí y por el apoyo recibido para la terminación de esta
tesis. Mi más sincero agradecimiento.
Finalmente quiero agradecer a todas aquellas personas que de una u otra manera
me ayudaron durante mis estudios en el posgrado y durante la elaboración de esta
tesis. A todos gracias.
iii
Dedicatoria
Este trabajo está dedicado a mi familia, a mi mamá por su paciencia y amor
durante toda mi vida.
A mi hermano.
A mi esposo por su amistad, paciencia y apoyo.
A mi hijo, que es mi luz para seguir adelante.
iv
Contenido
Agradecimientos .................................................................................................................... ii
Dedicatoria ........................................................................................................................... iii
Índice de tablas .................................................................................................................... vii
Índice de Figuras ................................................................................................................. viii
RESÚMEN .............................................................................................................................. x
SUMARY ............................................................................................................................... xii
INTRODUCCIÓN ..................................................................................................................... 1
OBJETIVO GENERAL ............................................................................................................... 8
OBJETIVOS ESPECÍFICOS .................................................................................................... 8
CAPÍTULO I ........................................................................................................................... 10
ANTECEDENTES ................................................................................................................ 10
I.1 GLAUCOMA ............................................................................................................. 10
I.1.2 Tratamientos del glaucoma .................................................................................. 13
I.2 Nanotecnología aplicada en Oftalmología .............................................................. 15
I.2.1 Liposomas en enfermedades oculares ................................................................. 16
I.2.1.1 Liposomas ......................................................................................................... 19
I.3 Clasificación de los liposomas. ................................................................................ 28
I.4 Liposomas como sistemas de liberación controlada de fármacos. ......................... 31
v
I.5 Métodos de preparación de liposomas ................................................................... 35
CAPÍTULO II .......................................................................................................................... 40
MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................................................ 40
II.1 Materiales .............................................................................................................. 40
II.1.1 Moléculas y Materiales utilizados ....................................................................... 40
II.2 Preparación de los liposomas ................................................................................. 43
II.3 Técnicas experimentales ........................................................................................ 44
II.3.3 Potencial Zeta ...................................................................................................... 49
II.3.4 Microscopía Electrónica de Transmisión (TEM). ................................................. 51
II.3.4.1 Tinción negativa ............................................................................................... 54
II.3.5 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN ............................................. 56
. .................................................................................................................................... 56
CAPITULO III ......................................................................................................................... 60
RESULTADOS Y DISCUSIÓN .............................................................................................. 60
III.1 Microscopía diferencial de contraste de interferencia (DIC) ................................ 61
III.3 Potencial Zeta ........................................................................................................ 69
III.4 Estabilidad de los liposomas ................................................................................. 74
III.5 Eficiencia de encapsulación del fármaco en los liposomas ................................... 76
vi
III.6 Microscopía Electrónica de Transmisión por Tinción Negativa. ............................ 79
CAPÍTULO IV ........................................................................................................................ 84
CONCLUSIONES ................................................................................................................ 84
BIBLIOGRAFIA ...................................................................................................................... 86
vii
Índice de tablas
Tabla1. Fármacos: Propiedades no ideales y sus implicaciones terapéuticas ……………....... 2
Tabla 2. Nanosistemas frecuentemente utilizados en biología y medicina ……………………..4
Tabla 3. Medicamentos utilizados para disminuir la presión intraocular (IOP)….........................14
Tabla 4. Grupos salientes más comunes en la naturaleza, con los nombres de los fosfolípidos
correspondientes............................………………………………………………………….. 23
Tabla 5. Composición en ácidos grasos de la fosfatidilcolina de soya (SPC) y de huevo
(EPC)………..……………………………………………………………………………...24
Tabla 6. Clasificación de liposomas según su estructura…………….……………………...28
Tabla 7. Tamaño, potencial zeta de liposomas de PC rehidratados con solución buffer PBS
0.001M a diferente concentración de PC luego de extrusión………………………….……….69
Tabla 8. Evaluación de tamaño y potencial zeta de liposomas-PEG a diferentes concentración %
de PEG luego de extrusión………………………..…………………………….…………...70
Tabla 9. Diámetro de liposomas (PC-PEG-Travoprost) en función del tiempo de almacenaje a
4°C durante 4 semanas…………………………………………………………………………………….75
Tabla 10. Evaluación de Tamaño, potencial zeta, y eficiencia de unión del fármaco.………...78
viii
Índice de Figuras
Figura 1.1 Estructuras formadas a partir de fosfolípidos…………………………………...18
Figura 1.2. Estructura química de la fosfatidilcolina…………………………………………………22
Figura 1.3. Liposoma pegilado……………………………………………………………………………32
Figura 1.4 Preparación de soluciones de liposomas………………………………………38
Figura 2.1 Molécula de fosfatidilcolina…………………………………………………….41
Figura 2.2 Estructura de polietilenglicol…………………………………………………...42
Figura 2.3 Estructura química del fármaco (Travoprost) utilizado…………………………………43
Figura 2.4. Componentes ópticos para Microscopía de Contraste de Interferencia Diferencial
(DIC)………………………………………………………………………………………………………….46
Figura 2.5 Representación esquemática de la técnica de Dispersión Dinámica de la Luz…….47
Figura 2.6. Esquema representativo de la técnica de DLS………………………………… 48
Figura 2.7 Dibujo para interpretar el concepto de Potencial zeta…………………………... 50
Figura 2.8 Microscopio Electrónico de Transmisión (JEOL 2010T) utilizado en este trabajo.….53
Figura 2.9 Diagrama esquemático de un cromatógrafo de líquidos de alta resolución……..…57
Figura 2.10 Representación de la separación de dos componentes A y B……………………….57
Figura 3.1 Extrusión de una muestra con liposomas a través de membranas porosas…………61
Figura 3.2 Liposomas de fosfatidilcolina en ausencia de PEG y/o Travoprost…………….....62
Figura 3.3 Liposomas de PC (10 mM) con PEG2000 (0.5 mM)……………………………...64
Figura 3.4 Imagen obtenida por DIC para liposomas de fosfatidilcolina - PEG-Travoprost
(0.04mg/ml)………………………………………………………………………………………………….65
ix
Figura 3.5 Imagen obtenida por DIC para liposomas de fosfatidilcolina - PEG-Travoprost
(0.1mg/ml)……………………………………………………………………………………………………66
Figura 3.6 Imagen obtenida por DIC para liposomas de fosfatidilcolina - PEG-Travoprost
(0.18mg/ml)………………………………………………………………………………………………….67
Figura 3.7 Función de correlación obtenida para liposomas de PC Travoprost para la relación
molar 0.04 a una temperatura de 25°C………………………………………………………..68
Figura 3.8 Concentración del fármaco unido a liposoma. Concentración en µg/ml……………72
Figura 3.9 Distribución de tamaños obtenidos por DLS para liposomas de PC-PEG-Travoprost
para las relaciones molares de 0.04, 0.1 y 0.18 µg/ml…………………………………………73
Figura 3.10 Potencial zeta de liposomas de PC-PEG-Travoprost para las relaciones molares de
0.04, 0.1 y 0.18 µg/ml………………………………………………………………………..76
Figura 3.11 Diámetro de liposomas (PC-PEG-Travoprost) en función del tiempo de almacenaje a
4°C durante 4 semanas………………………………………………………………………77
Figura 3.12 Liposomas de PC-PEG-Travoprost. Análisis por TEM por tinción negativa……...80
Figura 3.13 Liposomas de PC-PEG-Travoprost. Análisis por TEM por tinción negativa………..81
Figura 3.14 Liposomas de PC-PEG-Travoprost. Análisis por TEM por tinción negativa……...82
x
RESUMEN
La medicación tópica continúa siendo la primera línea de tratamiento para
glaucoma, sin embargo, la liberación sostenida de fármacos por vía tópica es difícil
de lograr. La mayoría de los fármacos tienen pobre penetración de la córnea y son
degradados rápidamente. En cambio, la administración de fármacos de manera
sostenida mediante el uso de estructuras como liposomas, puede proveer al
paciente una dosis óptima de fármaco, con una mínima toxicidad local y evitar
inconvenientes como alergias debidas a la administración diaria del fármaco.
Este proyecto de tesis se centró en la obtención de liposomas de fosfatidilcolina
(PC) con polietilenglicol (PEG) y Travoprost (fármaco) por la técnica de
rehidratación seguida de extrusión. Para lo cual se evaluaron tres relaciones
molares (fármaco/fosfolípido) de 0.04, 0.1 y 0.18 en la obtención de los
liposomas. Así mismo re realizó las caracterización de los liposomas pegilados
(morfología, tamaño, carga de superficie, estabilidad y eficiencia de encapsulación
del fármaco) mediante el usos de las técnicas experimentales como Microscopía
Óptica de Contraste de Interferencia Diferencial (DIC), Microscopía Electrónica de
Transmisión (TEM) con tinción negativa, Dispersión Dinámica de la Luz (DLS),
velocimetría Doppler (potencial Z) y Cromatografía líquida de alta resolución
(HPLC).
En base a los resultados se notó que la técnica de obtención de los
liposomas (rehidratación–extrusión) permite controlar el tamaño de éstos. También
se observó que la incorporación de PEG (peso molecular de 2000 g/mol) estabiliza
xi
el sistema liposoma-Travoprost, permitiendo que su tamaño y forma permanezcan
sin cambios significativos durante un periodo de 4 semanas. Así mismo se logró
un porcentaje promedio de incorporación del fármaco (Travoprost) del 90% (en
base al inicial) en la membrana del liposoma pegilado. La relación molar
fármaco/fosfolípido de 0.1 fue la más estable y se propone ésta para la obtención
de liposomas para estudios posteriores en modelos animales.
xii
SUMMARY
Topical medication is still one of first line for glaucoma treatment, however, the
sustained release of drugs via topical is difficult to achieve. Most drugs have poor
cornea penetration and they are rapidly degraded. Differently, the administration of
drugs in a sustained manner by the use of structures such as liposomes, has
shown to provide an optimal dose of the drug with minimal local toxicity to patients
and avoiding allergy problems due to daily drug administration.
The main goal of this thesis project was focused on obtaining liposomes of
phosphatidylcholine (PC ) with poly-ethylene glycol (PEG) and Travoprost (drug)
through the use of the rehydration technique followed by extrusion. For that, three
molar ratios (drug/phospholipid) of 0.04 , 0.1 and 0.18 were evaluated. The
characterization of the pegylated liposomes (morphology , size, surface charge,
stability and drug encapsulation efficiency) was performed using proper
experimental techniques such as Optical Microscopy with differential interference
contrast (DIC ), Transmision Electron Microscopy (TEM ) with negative stainning,
Dynamic Light Scattering (DLS), Doppler velocimetry (z potential) and High
Performance liquid chromatography (HPLC ).
Based on the results, It was noted that the technique used to obtain the
liposomes (rehydration-extrusion) allows controlling their size. Also, it was found
that the incorporation of PEG (MW 2000 g/mol) stabilizes the liposome-Travoprost
system, maintaining their size without significant changes during a period of 4
xiii
weeks. Additionally, the incoporation percentage values of the Travoprost drug in
pegylated liposomes was of 90%. The drug/phospholipid molar ratio of 0.1
generated the most stable liposomes, then, this ratio is proposed for further studies
using animal models.
1
INTRODUCCIÓN
La nanotecnología tiene un impacto en todas las áreas de la tecnología,
incluyendo la manufactura de semiconductores y biotecnología. Las herramientas
de la nanotecnología proveen la capacidad de caracterizar y manipular materiales
al nivel de nanoescala, lo que ha permitido a investigadores y desarrolladores la
capacidad de fabricar nuevos materiales y estructuras. Uno de los impactos
sociales más prometedores de la nanotecnología es el área de la nanomedicina.
En esta, el empleo de sistemas de transporte de medicamentos con alta
especificidad, actividad en el sitio de aplicación y biocompatibilidad, es un modelo
ideal que se procura alcanzar mediante numerosas investigaciones.
Muchas de las propiedades farmacológicas de los medicamentos
convencionales se pueden mejorar mediante el uso de sistemas de administración
de fármacos (DDS), a base de transportadores, como compuestos de lípidos y / o
polímeros, y sus terapéuticos asociados. Los DDS están diseñados para alterar la
farmacocinética (PK) y la biodistribución (BD) de sus medicamentos asociados, o
para funcionar como reservorios de drogas (es decir, como sistemas de liberación
sostenida), o ambos. La Tabla 1 presenta ejemplos de los problemas exhibidos
por los fármacos libres que pueden ser mejoradas por el uso de DDS.
2
Tabla1. Fármacos: Propiedades no ideales y sus implicaciones terapéuticas.
PROBLEMA IMPLICACIÓN EFECTO DEL DDS
Pobre solubilidad El uso de algunos excipientes
esta asociado a toxicidad.
Los liposomas proveen ambientes
hidrófobos e hidrófilos mejorando la
solubilidad de la droga.
Daño tisular en
extravasación
La extravasación inadvertida de
drogas citotóxicas provocan
daño tisular como la necrosis
tisular.
Regulan la liberación de la droga y
reducen o eliminar el daño tisular o
la extravasación accidental.
Ruptura estructural del
fármaco
Pérdida de la actividad de la
droga luego de la
administración.
Protegen a la droga de la
degradación prematura y
proporciona un sistema de
liberación controlada de la droga.
Bajas cantidades de la droga son
utilizadas.
Biodistribución La biodistribución grande en el
cuerpo puede resultar en efectos
adversos.
Los liposomas disminuyen el
volumen de la distribución y los
efectos secundarios.
Falta de selectividad. Puede resultar en efectos
terapéuticos no óptimos.
Los liposomas pueden proveer
especificidad.
Theresa M. Allen and Pieter R. Cullis. 2004. Drug Delivery Systems: Entering the
Mainstream. SCIENCE. VOL 303.1818-22.
3
En el tratamiento de un proceso fisiopatológico, es deseable que la
administración de medicamentos se realice de tal forma que el fármaco alcance su
lugar de acción (biofase) a una determinada concentración, dentro de un rango de
dosis terapéutica efectiva. Dicha administración se puede ver limitada por
resistencias al fármaco, captura del medicamento por otras células del organismo,
incapacidad del fármaco para penetrar en las células o tejidos en tratamiento o
por carecer de un tropismo (capacidad de llegar selectivamente a determinadas
poblaciones celulares en un órgano en particular) específico, distribuyéndose
por el organismo y dirigiéndose no solo a la biofase, sino también al resto de las
células y tejidos. En consecuencia, para obtener una concentración suficiente a
nivel de las células blanco, es necesario administrar dosis relativamente elevadas,
que conducen a efectos toxicológicos e inmunológicos indeseables (Puisieux y
Poly, 1985).
En este sentido, uno de los enfoques de investigación en el área de la
farmacéutica en las últimas décadas, ha consistido en el desarrollo de sistemas
que liberan selectivamente al principio activo a nivel del órgano dañado, sin
producir alteraciones en los tejidos sanos (Puisieux, 1983).
Los nuevos nanosistemas de transporte y liberación de fármacos
desarrollados permiten controlar la absorción, las concentraciones plasmáticas, la
distribución tisular, así como la captación celular de agentes farmacológicamente
activos (Juliano, 1980). Además entre las multiples ventajas aportadas por estos
4
nanosistemas caben señalar las siguientes: protección de la sustancia activa
contra la inactivación (química, enzimática o inmunológica), desde el lugar de
administración hasta la biofase, mejora del transporte del principio activo hasta
lugares de difícil acceso al fármaco, entre otras.
Algunos nanosistemas con claras aplicaciones biológicas y médicas se
incluyen en la Tabla 2. Estos, permiten el desarrollo de novedosas posibilidades
en el diagnóstico y tratamiento médico.
Tabla 2. Nanosistemas frecuentemente utilizados en aplicaciones de biología y
medicina.
Nanosistema Descripción Aplicaciones más comunes
Liposomas
Vesículas formadas por membranas
fosfolipídica similares a la membrana
celular.
Acarreadores de medicamentos,
agentes de contraste y radiofármacos.
Nanoesferas
Sistemas gel y coloidales. La sustancia
activa es adsorbida en la superficie o
disuelta en el interior de la partícula.
Acarreadores de medicamentos.
Agentes de contraste para imagen.
Nanocápsulas
Sistemas vesiculares formados por
membranas poliméricas. La sustancia
activa está confinada en un núcleo.
Acarreadores de medicamentos.
Agentes de contraste.
Moléculas esféricas poliméricas Agentes de contraste para imagen.
5
Dendrímeros altamente ramificadas, compuestas por
un núcleo central y capas alternantes de
monómeros.
Acarreadores de medicamentos, entre
otros
Nanocubiertas
Estructuras ópticamente activas,
formadas por un núcleo de silicio
rodeado por una delgada capa metálica,
generalmente de oro.
Detección de cambios celulares
específicos. Tratamiento de cáncer.
Nanotubos
Átomos de carbono en disposición
cilíndrica que pueden funcionalizarse en
su superficie.
Sistema liberador de agentes de
contraste y medicamentos. Sustrato
para crecimiento celular y
regeneración de tejidos.
Clavijo Gimaldi D., Alfonso García G., Alfonso Casadiego C. 2008. Nanotecnología en el
diagnóstico y tratamiento médico. Univ. Méd. Bogotá (Colombia), 49 (3): 388-398.
En este sentido, la plataforma más nueva e interesante para traducir los
avances en las ciencias básicas a la terapéutica para las enfermedades oftálmicas
es la nanotecnología ya que se aprovechan las propiedades específicas de las
partículas en la escala nanométrica para enfocarlas en la administración de
fármacos, la terapia génica y la ingeniería celular y tisular. Las aplicaciones de la
nanomedicina para los tratamientos de córnea, uveítis, glaucoma y reparación de
la retina se están acercando rápidamente al uso clínico.
En este sentido, los liposomas (Volkmar Weissig, 2010) son un medio
alternativo como nanotransportadores para uso ocular, debido a su
6
biocompatibilidad. Los liposomas son usados preferencialmente como vectores de
drogas con características hidrofílicas, aunque si el solvente es aceite, se pueden
encapsular drogas con características hidrofóbicas. Las drogas hidrofílicas son
encapsuladas dentro del volumen acuoso interno del liposoma protegido por la
bicapa lipídica, para después ser liberadas en el organismo. En contraste, si las
drogas son lipofílicas, pueden encapsularse dentro del volumen interno aceitoso
del liposoma, en la región hidrofóbica de la bicapa o añadiendo un polímero. La
encapsulación liposomal protege a las drogas de hidrólisis enzimática en el medio
ambiente fisiológico mientras están en circulación y así incrementa su estabilidad.
Estudios del efecto de la carga tanto en liposomas como en nanocápsulas en
soluciones coloidales para el tratamiento de glaucoma, sugieren que los liposomas
neutros incrementan el tiempo de residencia de la droga y reducen la presión
intraocular (De Campos, 2003). Por otra parte, experimentos realizados con
nanocápsulas de polímeros anfifílicos, que consisten de un componente hidrofílico
(polietilenglicol) y un componente hidrofóbico (polycaprolactona) sugieren que este
tipo de nanocápsulas poliméricas, liberan su carga de droga muy rápidamente o
se fusionan con la membrana celular (Uchida, 1988). Lo anterior sugiere el uso
combinado de liposomas de fosfolípido y polímeros para incrementar el tiempo de
residencia con la adecuada elección de un polímero biocompatible que permita el
encapsulado de Travoprost. Por esta razón se evaluara el sistema combinado en
la encapsulación de Travoprost para su aplicación como tratamiento de la presión
intraocular.
7
En el capítulo I de esta tesis, se presentan algunos antecedentes sobre la
enfermedad de glaucoma y su tratamiento mediante nanomateriales como
vectores de medicamentos. De igual manera, se describen algunos aspectos de
los liposomas como su uso, características fisicoquímicas y métodos de
preparación. En el capítulo II se describen los materiales utilizados, el método de
síntesis de liposomas empleado así como las técnicas experimentales de
caracterización. En el capítulo III se presentan los resultados experimentales
obtenidos de la síntesis y caracterización de los liposomas, el porcentaje de
encapsulación del fármaco, así como la discusión de los resultados. Finalmente
se presentan las conclusiones y perspectivas del trabajo de tesis realizado.
8
OBJETIVO GENERAL
Elaborar liposomas de fosfatidilcolina con polietilenglicol como vehículo de
Travoprost, aplicables en el tratamiento sostenido de la presión intraocular (IOP,
por sus siglas en inglés).
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Evaluar el efecto de diferentes concentraciones de los componentes de los
liposomas (fosfatidilcolina, polietilenglicol y fármaco) en la morfología,
tamaño, carga y estabilidad de éstos (a temperatura y pH constantes).
• Evaluar la estabilidad de liposomas pegilados (con tres relaciones molares
fármaco/fosfolípido) con respecto al tiempo (almacenados a 4°C).
• Cuantificar la eficiencia de unión del fármaco en los liposomas PC-PEG, por
medio de HPLC de fase reversa.
9
HIPÓTESIS
Liposomas de fosfatidilcolina cubiertos con polímero neutro como PEG de bajo
peso molecular pueden mejorar la liberación de Travoprost a través del epitelio de
la córnea. La interacción de PEG con membranas modelo sugiere que es un buen
candidato para combinar con liposomas.
10
CAPÍTULO I
ANTECEDENTES
I.1 GLAUCOMA
El glaucoma es una enfermedad reconocida, como un problema de salud
pública mundial. Los esfuerzos para su diagnóstico y control, así como la
repercusión en la productividad representan erogaciones millonarias en todas las
sociedades del mundo. La prevalencia de la enfermedad aumenta
exponencialmente conforme la expectativa de vida se incrementa. Diferentes
aspectos que conforman la fisiopatogenia de la enfermedad, no son claramente
entendidos, sin embargo el mayor conocimiento de otros aspectos como el
aumento de la presión intraocular, crean expectativas y oportunidades de
investigación que pueden culminar en terapias más allá del control de la presión
intraocular (IOP). El incremento del padecimiento de la IOP, se reconoce y estudia
ampliamente como uno de los elementos fundamentales en el diagnóstico y
seguimiento del glaucoma. Aunque es de enfatizarse que hay otros factores que
deben de considerarse hoy en día para establecer su diagnóstico y mantener una
vigilancia más acorde en el control de la enfermedad.
I.1.1 Definición de glaucoma
El glaucoma es un grupo de enfermedades que se caracteriza por ser una
neuropatía óptica progresiva (pérdida de la capa de las fibras nerviosas del nervio
11
óptico), con la consecuente reducción del campo visual y cuyo principal factor de
riesgo es la hipertensión ocular, la cual en un inicio fue considerada como el signo
pivote del glaucoma.
I.1.1.1 Clasificación de glaucoma
Se han descrito numerosas clasificaciones del glaucoma con base en las
diferentes causas y en los mecanismos primarios o secundarios de bloqueo al
drenaje de salida del humor acuoso. Una clasificación útil está basada en la
diferenciación entre glaucoma de ángulo cerrado (GAC) o glaucoma de ángulo
abierto (GAA), aunque los cambios funcionales y estructurales a nivel del nervio
óptico, son similares en todos los casos de glaucoma.
El glaucoma más común es el denominado glaucoma primario de ángulo
abierto (GPAA), el cual constituye hasta el 70 % de los tipos de glaucoma. Los
factores de riesgo mayormente relacionados con este padecimiento son: Presión
intraocular (IOP) elevada, alteraciones estructurales en la cabeza de nervio óptico,
antecedentes familiares de glaucoma, edad mayor de 40 años, alteraciones
vasculares (Diabetes mellitus, Hipertensión arterial, vasoespasmo local y sistémico
etc.), miopía elevada, uso prolongado de esteroides, antecedente de trauma
ocular (receso angular de 180 grados), entre otros.
12
I.1.1.2 Epidemiología del glaucoma
El glaucoma es una de las principales causas de ceguera y la principal causa de
ceguera irreversible a nivel mundial. Se calcula que hasta el año 2000, existían
aproximadamente 6.7 millones de personas ciegas en el mundo, relacionadas a
glaucoma (Ortiz et al, 1999; Labrada Rodríguez, 2002).
La prevalencia del glaucoma en la población mundial varía de acuerdo al
grupo étnico estudiado y al grupo de edad. Existen reportes que demuestran una
incidencia entre 0.28% a 0.43% en la población caucásica de Estados Unidos de
América y un 0.64% en el Reino Unido. Sin embargo la prevalencia se incrementa
dramáticamente a un 2.0% más en personas de 70 a 74 años de edad. Las
personas de raza negra en comparación con personas caucásicas desarrollan
más frecuentemente glaucoma, requiriendo con mayor frecuencia procedimientos
quirúrgicos para su control. Esta diferencia racial solo es presente en glaucoma,
ya que no se ha encontrado en otras patologías tales como la degeneración
macular senil y en la retinopatía diabética (Rieger-Reyes C. y Rubio-Galán FJ.,
2012).
En Estados Unidos de América el glaucoma es la principal causa de
ceguera dentro de la población de raza negra. En México no existen estudios
epidemiológicos respecto a la incidencia y prevalencia de la enfermedad de
glaucoma, sin embargo en 2009 se realizaron dos estudios: el estudio LALES (Los
Ángeles Latino Eye Study) y el proyecto VER. Estos estudios epidemiológicos son
los más importantes realizados entre el Consenso Nacional para el Diagnóstico y
13
Tratamiento del Glaucoma México población latinoamericana. Estos estudios han
demostrado la alta tasa de prevalencia de glaucoma dentro de este grupo racial,
que es comparable con la existente de la raza negra.
El Glaucoma es una enfermedad que ocupa en promedio el 8.5% de las
visitas de los pacientes a una consulta oftalmológica. Aunque no existen
suficientes datos de la población en México, se estima que el glaucoma afecta del
2 al 4% de la población (600 mil a un millón 250 mil de personas) y 50% de ellos lo
desconoce. Al igual que en el resto del mundo, este padecimiento se considera
una de las primeras causas de ceguera irreversible, lo cual trae consigo
numerosas consecuencias en el ámbito económico-laboral y en la calidad de vida
de los pacientes. Por lo anterior, se considera indispensable que la población
mayor de 40 años de edad acuda a revisiones periódicas anuales con el fin de
detectar tempranamente la enfermedad.
Los hombres son 3 veces más susceptibles en relación con las mujeres a
desarrollar glaucoma y es mayor el riesgo de padecer glaucoma en pacientes con
historia familiar de primera línea.
I.1.2 Tratamientos del glaucoma
Un buen porcentaje de personas que padecen glaucoma se tratarán primero con
medicamentos. Existen muchos tipos de medicamentos (con diferentes nombres
comerciales) para tratar el glaucoma (tabla 3). La mayoría de los medicamentos
son gotas que se aplican en los ojos (gotas oftálmicas) una o más veces al día.
14
Algunos oftalmólogos pueden sugerir medicamentos para el glaucoma que se
toman en pastillas, pero esto es mucho menos común, debido a sus efectos
secundarios.
Tabla 3. Medicamentos utilizados para disminuir la presión Intraocular (IOP)
Tipo de medicamento
Nombre comercial
Nombre del medicamento
Modo de Administración
Cada cuánto se
toma
Travatan Z® Travoprost
Xalatan® Latanoprost
Antagonistas beta-adrenérgicos
Betagan® Levobunolol
Gotas oftálmicas
Dos veces al día
Betoptic S® Betaxolol
Ocupress® Carteolol
Timoptic® Timolol
Inhibidores de la anhidrasa carbónica
Azopt® Brinzolamida Gotas
Oftálmicas
Tres veces al
día Trusopt® Dorzolamida
Diamox® Acetazolamida Pastillas Dos veces
al día Neptazane®* Metazolamida
Agonistas alfa-adrenérgicos Alphagan® P Brimonidina Gotas Oftálmicas
Tres veces al
día
Mióticos
Isopto® Pilocarpina Gotas oftálmicas 4 veces al
día Carpine*
Medicamentos en combinación Combigan® Brimonidina y
timolol Gotas oftálmicas Dos veces al día
Treatment for Glaucoma: Comparative Effectiveness. April 2012. Informe
producido por el Johns Hopkins University Evidence-based Practice Center.
15
Los medicamentos suelen ser el primer tratamiento para el glaucoma y funcionan
en una de dos formas:
• Hacen que los ojos produzcan menos líquido
• Aumentan la salida del líquido del interior de los ojos
I.1.2.1 Prostaglandinas
Las prostaglandinas son una familia de ácidos grasos de origen natural. Se
encuentran en todo el organismo y producen un gran número de efectos
fisiológicos y farmacológicos al actuar sobre diversos receptores prostanoides del
organismo. Recientemente, diversos estudios han demostrado que algunas
funciones oculares están mediadas por la activación de un receptor prostanoide
específico llamado receptor FP. Se ha demostrado que cuando la prostaglandina
F2alfa o sus análogos se aplican en el ojo, reducen la IOP de modo efectivo al
unirse a receptores FP. Se cree que con esta unión se inicia una respuesta
biológica que abre la vía uveoescleral y facilita el flujo de salida del humor acuoso.
Los estudios han propiciado el desarrollo de análogos de prostaglandina,
especialmente agonistas del receptor prostanoide FP, la clase de fármacos más
recientemente aprobada para reducir la IOP.
I.2 Nanotecnología aplicada en Oftalmología
La deficiente biodisponibilidad de los fármacos que se obtiene con las
formas farmacéuticas de administración ocular (en particular si son de
16
administración tópica), es consecuencia de todas las vías de pérdida
características de este lugar anatómico, así como también de la impermeabilidad
del epitelio corneal y de la absorción no productiva a través de la conjuntiva y la
esclera; como consecuencia, con las formas de dosificación convencionales
(soluciones, suspensiones o pomadas oftálmicas), no se consiguen niveles
terapéuticos suficientemente altos como para poder tratar determinadas
enfermedades oculares (Kaur, I.P. et al, 2004).
Las inyecciones intravítreas son la alternativa habitual para tratar las
patologías que afectan al segmento posterior del ojo, pero estas conllevan un
considerable riesgo en producir complicaciones, particularmente en aquellos casos
en los que se requieran inyecciones repetidas.
I.2.1 Liposomas en enfermedades oculares
Una de las tendencias actuales en terapéutica ocular sugiere la
conveniencia de reemplazar las formas de administración ocular convencionales,
por nuevos sistemas de administración de fármacos con propiedades
biofarmacéuticas mejoradas y con capacidad para liberar el agente terapéutico de
una forma mucho más precisa en el lugar diana en el ojo y, si es posible, de una
manera predecible (Reddy, I.K. y Ganesan, M.G., 1996). Entre estos nuevos
sistemas, sin duda los sistemas coloidales como liposomas, niosomas,
nanoemulsiones o nanopartículas, ofrecen expectativas muy prometedoras
(Sanchez, A. y Alonso, M.J., 2006). Los liposomas en administración ocular
17
ofrecen numerosas ventajas ya que además de ser biodegradables y
relativamente no tóxicos, facilitan un contacto íntimo con las superficies de la
córnea y conjuntiva y por tanto incrementa la posibilidad de absorción ocular del
fármaco encapsulado. Esta absorción tiene especial importancia en el caso de
fármacos que presenten un coeficiente de reparto reducido y solubilidad deficiente
así como en aquellos de peso molecular medio o elevado (Al-Muhammed, J.et al.,
1996; Ebrain, S. et al., 2005).
Estudios recientes demuestran que el comportamiento favorable de los
liposomas en administración ocular está ligado a la presencia de carga eléctrica
positiva en la superficie de los liposomas (Kaur, I.P., et al, 2004), lo que favorece
su interacción electrostática con el epitelio corneal, el cual está cargado
negativamente. Muy recientemente, los liposomas se han estudiado como
vehículos capaces de incorporar anticuerpos de reconocimiento celular específico
y también de material genético (Ebrain, S.et al., 2005). De igual manera, es
posible dirigirlos al núcleo de las células corneales después de su administración
tópica (Dean, D.A. et al. 1999) e intravítrea (Bochot, A. et al. 2000).
Cuando se utilizan como un sistema de administración de fármacos
oculares (DDS), los nanoliposomas pueden entrar en contacto directo con las
células epiteliales de la córnea y de la conjuntiva, facilitando la absorción del
fármaco. El objetivo principal de este tipo de medicación farmacológica es reducir
los efectos secundarios ya que los liposomas no son tomados generalmente por el
tejido sano como invasores como sucede con el fármaco libre (Fenwick y Cullis,
18
2008). El desarrollo de este tipo de sistemas lipídicos puede ser capaz de tratar
con eficacia dos causas principales de la ceguera - la degeneración macular y el
glaucoma. Como regla general, entre menos moléculas pueda contener el
acarreador (es decir, cuanto menor sea la relación de fármaco/portador), más
potente debe ser el fármaco con el fin de entregar cantidades terapéuticamente
relevantes de drogas. Para algunos tipos de DDS se requieren sólo unas pocas
moléculas del medicamento (como inmunotoxinas e inmunoconjugados) o
unas decenas de moléculas (tales como polímeros conjugados). El uso de
cantidades indebidamente altas del portador puede conducir a problemas de
toxicidad, cambios metabólicos, eliminación o biodegradabilidad. Debido a que
cada liposoma puede atrapar hasta decenas de miles de moléculas de la droga, la
potencia del fármaco generalmente no es problema.
Figura 1.1 Estructuras formadas a partir de fosfolípidos
ESTRUCTURAS FORMADAS A PARTIR DE FOSFOLÍPIDOS
CABEZA POLAR HIDROFILA
COLA NO POLAR HIDROFOBA
COLAS
BICAPA LIPIDICA MICELA LIPOSOMA
19
I.2.1.1 Liposomas
Los liposomas fueron descubiertos en el año 1965 por Bangham y colaboradores
(Bangham, A.D., Standish, M.M. & Watkins, J.C. 1965), quienes constataron que
ciertos lípidos pueden formar estructuras membranosas artificiales cuando están
en presencia de un exceso de agua. Estas estructuras vesiculares, altamente
organizadas, están constituidas por una pared formada por lamelas o bicapas
lipídicas concéntricas que están separadas por un número igual de espacios de
contenido acuoso (Figura 1.1).
Las bicapas lipídicas vesiculares se definen básicamente como "liposomas",
que pueden contener uno o más compartimientos acuosos. Dependiendo del
número de bicapas, estas estructuras globulares se pueden clasificar en vesículas
multilamelares y unilamelares. Las vesículas unilamelares a su vez pueden ser
pequeñas (SUV) o grandes (LUV).
Para la elaboración de los liposomas habitualmente se utilizan fosfolípidos,
con o sin la incorporación de colesterol o de otros materiales que se introducen en
la pared de los liposomas con el fin de dotar a las vesículas de alguna propiedad
particular (carga superficial, por ejemplo). Inicialmente estas vesículas se utilizaron
como modelo de membranas biológicas, dada la similitud que presentan con ese
tipo de estructuras. Posteriormente estas estructuras se plantearon como
acarreadores de fármacos debido a su versatilidad estructural, su carácter
biodegradable y biocompatible. Gregoriadis inició el estudio sobre el potencial que
20
presentan como sistemas de liberación de fármacos y otras moléculas bioactivas
(Perrie, Y., 2008). Presentándose un gran número de trabajos publicados sobre la
utilización de liposomas en este campo desde los años 70’s.
La versatilidad de los liposomas (Fenske, D.B. et al., 2008) se refleja en
primer lugar, en el hecho de que son capaces de incorporar a su estructura
moléculas hidrofílicas, hidrofóbicas y también de carácter anfifílico. En función de
las características de solubilidad de las moléculas (fármacos o drogas), éstas
pueden ser atrapadas en la bicapa lipídica o en el compartimento acuoso de los
liposomas (Fenwick y Cullis, 2008).
Además, las propiedades físicas de los liposomas, como la carga
superficial, el tamaño, la permeabilidad, rigidez de la pared o su capacidad de
carga pueden ser fácilmente modulables. Por último, utilizando lípidos
funcionalizados, se pueden unir anticuerpos u otros ligandos a la superficie de
estas vesículas, que se convierten en sistemas de transporte con capacidad para
acceder por ejemplo, específicamente a un determinado tejido o célula tumoral
(site-specific targeting), de forma similar a la “bala mágica” de Paul Ehrilch
(Ehrlich, P., 1906).
Como consecuencia, la mayor parte de los trabajos publicados sobre
liposomas en sistemas de liberación, se refieren a su utilización por vías de
administración parenterales, como la intravenosa, subcutánea, intramuscular o
intraperitoneal (Maurer, N. et al., 2001; Simard, P. et al., 2007; además de un
grupo importante dedicado a explorar el interés que pueden tener como vehículos
21
para la administración tópica cutánea y para la administración transdérmica (El
Magharaby, G.M. et al., 2008; Cevc, G., 1996). Más recientemente, se ha
estudiado la posibilidad de administrar liposomas en forma de aerosol por vía
pulmonar tanto para el tratamiento de enfermedades que cursan a nivel pulmonar
(ej. asma, EPOC, fibrosis quística o tuberculosis), como para la administración de
fármacos que actúan a nivel sistémico (Azarmi, S. et al., 2008; Lian, T. y Ho, R.,
2001).
I.2.1.2 Fosfolípidos: Unidad estructural de los liposomas.
Los fosfolípidos son los componentes principales de las membranas
celulares de los seres vivos. Estructuralmente están compuestos por una molécula
de glicerol que está esterificada en los carbonos C1 y C2 con dos cadenas de
ácidos grasos, y un grupo fosfato en la posición C3, que puede o no estar unido a
un grupo saliente. El grupo saliente más común en la naturaleza es la colina, y el
fosfolípido obtenido se denomina fosfatidilcolina (PC), que es el más abundante en
las membranas biológicas. En la Figura 1.2 puede verse la estructura química de
la PC y un esquema de un fosfolípido del tipo PC, con su cabeza polar (glicerol +
fosfato + grupo saliente) y sus colas hidrocarbonadas.
22
Figura 1.2. Estructura química de la fosfatidilcolina. Se indican la cabeza polar y la
doble cadena hidrocarbonada.
Estrictamente un fosfolípido posee un dominio no polar, representado por
las cadenas hidrocarbonadas de ácidos grasos de más de 12 átomos de carbono,
un dominio de polaridad intermedia que corresponde al glicerol y sus ésteres, y
una zona de alta polaridad representada por el fosfato unido al grupo saliente
(moléculas anfifílicas).
La nomenclatura de los fosfolípidos está dada por la naturaleza del grupo
saliente unido al fosfato. Este dominio hidrofílico también determina si el
fosfolípido en cuestión tiene carga neta negativa, positiva, o se trata de un anfífilo
con carga neta nula (Tabla 4). Como puede observarse, los fosfolípidos más
abundantes presentan carga negativa a pH fisiológico a excepción de la PC y la
fosfatidiletanolamina (PE), las cuales son anfífilos con carga neutra.
23
Tabla 4. Grupos salientes más comunes en la naturaleza, con los nombres de los
fosfolípidos correspondientes. El asterisco (*) indica que se trata de la carga a pH
fisiológico. Fuente: www.analesranf.com/index.php/mono/article/viewFile/991/1025
Es importante remarcar que cuando se habla de fosfolípidos de origen
natural, no se hace referencia a una sustancia única. Así, por ejemplo, el término
fosfatidilcolina incluye una familia de moléculas que tienen en común el grupo
fosfato unido a colina. Sin embargo la composición de ácidos grasos es variable y
depende de la fuente del fosfolípido. En la Tabla 5 se observa la abundancia
relativa de los ácidos grasos que componen la fosfatidilcolina proveniente de soya
y de huevo (SPC y EPC respectivamente). En comparación, mientras que solo un
20% de los ácidos grasos de la SPC no presentan dobles enlaces, en la EPC el
porcentaje de ácidos grasos saturados llega al hasta un 50%. Cabe aclarar que la
abreviatura empleada es la convencional para ácidos grasos, en la cual el primer
24
número indica el número de carbonos y el segundo el número de insaturaciones.
Por ejemplo, 18:1 representa un ácido graso de 18 átomos de carbono con 1 doble
enlace o instauración, como el oleico.
Tabla 5. Composición en ácidos grasos de la fosfatidilcolina de soya (SPC)
y de huevo (EPC).
Recuperado de http://www.analesranf.com/index.php/mono/article/viewFile/991/1025.
En los ácidos grasos de origen natural, todas las insaturaciones tienen
geometría cys y no presentan conjugación, el número y la geometría de las
insaturaciones tienen influencia en el tipo de ensamblajes que se formen en
solución acuosa y en el estado físico de los mismos a una cierta temperatura.
Así mismo, los fosfolípidos que poseen menor número de dobles enlaces
resultan tener mayor estabilidad química. Como es sabido, los alquenos son
susceptibles a las reacciones de radicales libres en presencia de oxígeno y/o
radiación UV, obteniéndose productos de degradación no deseados. Es por esto
25
que frecuentemente se emplean fosfolípidos saturados, obtenidos a partir de los
naturales mediante hidrogenaciones catalíticas, como es el caso de la
fosfatidilcolina de soya hidrogenada (HSPC). Estos productos resultan menos
susceptibles a la oxidación que los productos insaturados.
Los fosfolípidos sintéticos con una composición definida de ácidos grasos,
como la dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) o la dioctanoilfosfatidilcolina (DOPE), se
utilizan frecuentemente en la caracterización del comportamiento in vitro o in vivo
de una formulación de liposomas. Los fosfolípidos sintéticos también suelen
emplearse cuando la administración es parenteral, para evitar la presencia de
trazas de alérgenos y/o pirógenos, que podrían estar presentes en los de origen
natural. También pueden adquirirse fosfolípidos asimétricos, es decir con distintos
ácidos grasos en las posiciones C1 y C2. Se trata de materias primas
generalmente más costosas que se emplean en la preparación de sistemas cuya
composición es muy crítica.
Por el contrario, para formulaciones que se administraran por otras vías,
como por ejemplo la vía oral, es interesante partir de fosfolípidos naturales, que
resultan más económicos y en los cuales la composición de ácidos grasos podría
no ser crítica para su comportamiento in vivo. Debe tenerse en cuenta que hoy en
día existen en el mercado fosfolípidos de origen natural altamente purificados y
caracterizados adecuadamente. Cabe mencionar que suele haber bastante
confusión a la hora de elegir una materia prima de origen natural. El término
“lecitina” puede tener distintas acepciones: en algunos casos se emplea como
26
sinónimo de fosfatidilcolina, pero también está difundido su uso para extractos
lipídicos de soya u otras fuentes, con contenidos de fosfatidilcolina que pueden ser
tan bajos como un 30%. Se trata de productos parcialmente purificados, con altos
contenidos de triglicéridos, de otros fosfolípidos (PE, PI, etc.) y de glicolípidos. El
tipo de estructuras que se obtienen a partir de estas mezclas de sustancias
generalmente no son de fácil caracterización, y los sistemas obtenidos no tendrán
el comportamiento que se esperaría para vesículas de PC pura, lo cual podría
llevar a conclusiones erróneas.
1.2.1.3 Sistemas fosfolípido - agua
Estructuras y fases
Los fosfolípidos presentan una solubilidad muy baja en agua, menor a una
concentración de 1x10-7 M. Por encima de este valor, las moléculas se organizan
formando estructuras que dependen no solo de la concentración y de la
temperatura, sino de la geometría de la molécula determinada por su estructura
química. En la Figura1.3 se observa cómo la forma molecular es clave para la
formación de estructuras complejas estables en solución.
Por razones prácticas, se define el parámetro de empaquetamiento (P):
𝑃 =𝑉𝑎×𝑙
27
donde V es el volumen molecular, 𝑎 es el área transversal de la cabeza polar y 𝑙
es la longitud de la cadena hidrocarbonada. El producto 𝑎×𝑙, es el volumen del
cilindro que se obtendría a partir del área que cubre la cabeza polar. En el caso
de la fosfatidilcolina, P es cercano a la unidad, ya que su geometría es
aproximadamente cilíndrica. En una forma lisa, la pérdida de una cadena
hidrocarbonada resultará en una disminución del volumen molecular respecto al
cilindro calculado, resultando en valores de P menores a la unidad. En algunos
casos, como con los fosfolípidos con dobles enlaces (geometría cys), las cadenas
hidrocarbonadas pueden apartarse entre sí, dando lugar a cilindros ensanchados
en su base o a áreas transversales menores (P>1). Cada una de estas formas
moleculares origina una organización característica.
Así, los fosfolípidos del tipo PC, cuando se mezclan con agua en
concentraciones entre el 5 y 45% p/v, éstos se alinean en bicapas planas para
minimizar las interacciones entre el medio acuoso y las cadenas hidrocarbonadas,
formando fases lamelares. Por encima del 45%, las bicapas se cierran y forman
liposomas, secuestrando parte del medio acuoso. El resultado es un sistema
disperso del tipo suspensión, constituido por un medio acuoso interno limitado por
las bicapas y un medio acuoso externo. Además, dependiendo del tipo de
fosfolípido, la proporción de agua y la temperatura, se formará un tipo determinado
de organización. En el caso de la PE (fosfatidil etalonamina) insaturada, se forman
micelas a temperaturas medias (ambiente) y también se pueden formar
estructuras lamelares a temperaturas lo suficientemente bajas.
28
I.3 Clasificación de los liposomas.
Para referirse a los distintos tipos de liposomas se puede recurrir al criterio que
toma en cuenta su tamaño y el número de bicapas o lamelas que conforman la
pared de la estructura vesicular. Otras alternativas de clasificación son el
procedimiento de obtención de los liposomas, polidispersidad, tipo de carga
eléctrica y tamaño. La clasificación más utilizada es según su estructura
(lamelaridad) como se indica en la Tabla 6.
Tabla 6. Clasificación de liposomas según su estructura.
Fuente: http://www.dfarmacia.com/farma/ctl_servlet?_f=37&id=13038745
29
Además de la clasificación habitual de los liposomas atendiendo a sus
características fisicoquímicas o al proceso de obtención, es posible realizar otra
clasificación teniendo en cuenta el comportamiento que previsiblemente tendrán
los liposomas como consecuencia de las modificaciones que se hayan introducido
en su estructura para diferentes fines. Desde este punto de vista, se podrían
distinguir los tipos de liposomas que se describen a continuación:
Liposomas convencionales
Son los liposomas clásicos de superficie hidrofóbica, constituidos, por
ejemplo, por fosfatidilcolina y colesterol, que tras su administración I.V., son
rápidamente recubiertos por las proteínas plasmáticas y posteriormente son
eliminados de la circulación a través de fagocitosis por células del sistema retículo
endotelial (RES) (Storm, G. and Crommelin, D.J.A. 1998).
Liposomas de circulación prolongada (Stealth liposomes)
Generalmente son aquellos que tienen PEG en la superficie, lo que
incrementa su hidrofilia, dando lugar a una reducción en la interacción con
proteínas plasmáticas y lipoproteínas (Klibanov, A.L. et al., L.1990; Senior, J. et
al., 1991). Esta modificación de los liposomas con el material utilizado (PEG) se
le llama generalmente pegilación y sirve para conseguir dos funciones muy
importantes: la primera, un incremento en la biodisponibilidad de los fármacos
30
encapsulados, y la segunda, que el proceso de liberación sea más lento y que se
minimice la toxicidad y los efectos secundarios (Immordino, M.L. et al., 2006).
Además del PEG, otros polímeros como la poliacrilamida, el alcohol polivinílico o
la poli-vinilpirrolidona, han sido utilizados para lograr los mismos objetivos
(Torchilin, V.P. et al., 1995). Algo muy destacable en el comportamiento de estos
liposomas pegilados, es su capacidad para experimentar un proceso de
extravasación en determinados lugares en los que se produce un incremento en la
permeabilidad de la pared de los vasos sanguíneos, como puede ocurrir por
ejemplo en zonas en las que hay un proceso infeccioso o una inflamación (Storm,
G. y Crommelin, D.J.A., 1998).
Liposomas catiónicos
Su principal aplicación es la vehiculización de material genético (Lasic, D.D.
y Templeton, N.S., 1996). Los lípidos catiónicos constitutivos de estos liposomas
neutralizan la carga negativa del DNA, formando así una estructura compacta
diferente de la estructura vesicular típica de los liposomas. Estos complejos
resultantes (DNA-lípidos catiónicos) proporcionan una protección al material
genético y promueven la internalización y la expresión del plásmido en el interior
celular (Storm, G. y Crommelin, D.J.A., 1998).
Inmunoliposomas
Estos liposomas tiene la capacidad de dirigirse específicamente y reconocer
algunas células y órganos del cuerpo, gracias a la presencia de determinados
31
elementos introducidos en el diseño de su estructura, como pueden ser
anticuerpos o fragmentos de anticuerpos unidos a la superficie de los liposomas
(Torchilin, V.P., 2006). La elección del antígeno diana, la función del anticuerpo y
el tipo del puente de unión utilizado para lograr su unión a la superficie (p. ej.
PEG), son factores que requieren un análisis exhaustivo en el diseño de este tipo
de liposomas (Schnyder, A. et al., 2004).
I.4 Liposomas como sistemas de liberación controlada de fármacos.
A fines de los 80, se incrementaron los esfuerzos para diseñar liposomas que
pudieran circular en el torrente sanguíneo el tiempo necesario para extravasar
hacia los tejidos que presentaran un aumento localizado de la permeabilidad
vascular. La estrategia de estabilización más exitosa desarrollada en ese
momento fue por medio de la unión covalentemente de un polímero hidrofílico
como el polietilenglicol (PEG) a algunos fosfolípidos constituyentes de los
liposomas, para dar lugar a los liposomas “pegilados”, “Stealth”, o “estéricamente
estabilizados” (ver Fig.1.3). El nombre Stealth, que puede traducirse al castellano
como “oculto”, se refiere a su capacidad de evadir el sistema inmune, mientras
que su identificación como “estéricamente estabilizados” se refiere al mecanismo
por el cual pueden permanecer tiempos largos en el torrente sanguíneo. Su
prolongada circulación se debe a la presencia de la cadena hidrofílica del PEG,
que dificulta la adsorción de las proteínas plasmáticas. Por lo tanto, se minimiza la
32
desestabilización estructural por parte de las moléculas de colesterol de baja
densidad (LDL) así como la captación por el RES mediada por las opsoninas.
Generalmente se ha empleado PEG 2000 (2000 Da de peso molecular) unido a
fosfolípidos como diesteroilfosfatidiletanolamina (DSPE) o dipalmitoiletanolamina
(DPPE), incorporados en la bicapa a una concentración media del 5% molar
(Klibanov et al., 1990; Allen et al., 1991; Woodle and Lasic, 1992). También han
podido obtenerse otros fosfolípidos pegilados, con los cuales se obtuvieron
vesículas con carga negativa, positiva o neutra (Webb et al., 1998). Por otro lado
se estableció que el agregado de altas concentraciones de colesterol (por encima
de 30% molar) era sinérgica a la acción del PEG, observándose vidas medias tan
altas como 45 horas en humanos (Bedu-Addo et al., 1996).
Figura 1.3. Liposoma pegilado
33
Esta tecnología ha dado lugar a productos comercializados, el primero fue
la doxorubicina liposomal. La doxorubicina es una antraciclina citotóxica de alta
efectividad para el tratamiento de tumores sólidos y leucemias, incluso forma parte
del protocolo para el tratamiento del Sarcoma de Kapossi asociado al SIDA. Sin
embargo, cuando es administrada como fármaco libre, tiene numerosos efectos
colaterales, siendo la cardiotoxicidad el más riesgoso. Este efecto sobre el
músculo cardíaco fue estudiado por primera vez hace unos 30 años (Guthrie y
Gibson, 1977; Chlebowski, 1979) y desde ese momento se multiplicaron las
estrategias para tratar de minimizar los efectos de cardiotoxicidad mediante la
incorporación en liposomas convencionales (Rahman et al., 1982), cambios en los
protocolos de administración (Lum et al., 1985), síntesis de derivados con menor
toxicidad (Danesi et al., 1993) o el empleo de sustancias auxiliares protectoras
(Seifert et al., 1994).
Los liposomas de larga circulación fueron finalmente aprobados para su uso
en humanos dado que existen evidencias farmacológicas y clínicas sobre su
contribución en mayor eficiencia antitumoral y menor cardiotoxicidad (Orditura et
al., 2004). La tecnología Stealth también se ha empleado para la estabilización de
inmunoliposomas (Allen et al., 1995), sin embargo las evidencias de
inmunogenicidad de estas vesículas limita su aplicación (Harding et al., 1997).
A pesar de todas las ventajas de la tecnología Stealth, está demostrado
que el PEG no es biodegradable, por lo cual su acumulación en los tejidos debido
34
a administraciones crónicas de liposomas pegilados puede resultar tóxica. En
efecto, se ha descrito el “síndrome de pies y manos”, que consiste en la aparición
de úlceras y/o erupciones en las extremidades (Gordon et al., 1995).
Teniendo en cuenta esta limitación de la tecnología Stealth, surge otra
estrategia de estabilización que fue registrada como tecnología Polyxen ® y que
consiste en el empleo de ácido siálico como polímero protector de los liposomas.
Este polímero es un constituyente natural del organismo y es completamente
biodegradable y no-inmunogénico aun cuando se une a proteínas (Gregoriadis et
al., 2000).
También se ha estudiado la estabilización empleando otros ligandos, como
por ejemplo palmitoilpululano, alcohol polivinílico, poloxamer y polivinilpirrolidona
(Takeuchi et al., 1998). Recientemente se han desarrollado formulaciones de
liposomas no pegilados con una gran estabilidad plasmática evidenciada por sus
altos tiempos de circulación (Daftary, 2004).
Curiosamente se trata de liposomas convencionales, compuestos por
HSPC, DPPC o DSPC con el agregado de colesterol en una relación 1:0.7 molar
respectivamente, preparados con altas concentraciones de lípidos (suspensiones
de 10 ml de hasta 1 mM lípidos, equivalente a 75 mg/ml). Según sugiere la
patente, su composición lipídica los convierte en vesículas de elevada rigidez y
baja permeabilidad. Cuando se aplicaron para la administración intravenosa de
doxorubicina, estos liposomas fueron más eficientes en disminuir el tamaño de
35
tumores mamarios implantados en ratones, que el producto comercial Caelyx ®.
También se verificó su menor toxicidad respecto a los liposomas pegilados.
I.5 Métodos de preparación de liposomas
Como ya se ha visto los liposomas se forman espontáneamente cuando los
fosfolípidos se dispersan en un medio acuoso, como una forma de minimizar las
interacciones de las cadenas hidrocarbonadas con el agua. El desafío de preparar
liposomas no radica en el ensamblaje propiamente dicho, sino en conseguir
vesículas de un tamaño y estructura determinada, que incorporen sustancias con
alta eficiencia y que además permanezcan encapsuladas hasta llegar al sitio
adecuado.
I.5.1 Re-hidratación
El método más sencillo y empleado frecuentemente en trabajos
experimentales, es el de re-hidratación. En este método se disuelven los lípidos en
un solvente adecuado, como cloroformo o mezclas metanol-cloroformo, y luego se
evapora el solvente hasta obtener una película fina y homogénea sobre un soporte
sólido. En algunos casos, en esta etapa se liofiliza para eliminar las trazas de
solvente residual.
Luego se agrega la solución acuosa y se agita en forma mecánica para la
formación de los liposomas. El resultado es una mezcla de vesículas
multilamelares (MLVs), con una distribución de tamaños polidispersa que suele
36
emplearse como punto de partida para obtener otras suspensiones con tamaños
más homogéneos. Hoy en día se cuenta con fosfolípidos sólidos que pueden
agregarse directamente sobre una solución acuosa y evitarse así el uso de
solventes tóxicos. Sin embargo, las mezclas de fosfolípidos entre sí, o con otros
lípidos como el colesterol suelen requerir de solventes para asegurar una buena
mezcla inicial entre los lípidos, que permita su distribución homogénea en la
bicapa.
La sustancia a incorporar en los liposomas es agregada en el medio
acuoso, si se trata de un compuesto hidrosoluble, o bien se disuelve en el solvente
de disolución de los fosfolípidos, si se trata de un compuesto liposoluble. En este
último caso, en ocasiones puede añadirse a las vesículas ya formadas, un
pequeño volumen de una disolución de la molécula hidrofóbica en un medio
orgánico.
I.5.2 Extrusión
A partir de los MLVs, el tamaño y el número de lamelas pueden modificarse
mediante sonicación y extrusión, entre otros métodos. La sonicación consiste en
impartir energía ultrasónica a la suspensión para reducir el tamaño de las
vesículas, pudiendo en determinadas condiciones obtenerse SUVs (vesículas
unilamelares pequeñas). La técnica es efectiva pero no escalable, por lo cual se
descarta para aplicaciones industriales. La extrusión de MLVs consiste en forzar el
pasaje de la suspensión de MLVs a través de membranas de policarbonato de
37
tamaño de poro definido, siendo posible obtener liposomas con diámetros medios
entre 50 y 800 nm según el diámetro de poro empleado (Olson et al., 1979). En
algunos casos se requiere una extrusión a alta temperatura para fluidizar las
bicapas. Las vesículas pueden forzarse a atravesar la membrana mediante
extrusores manuales o neumáticos. También existen homogeneizadores de alta
presión que se proveen con extrusores antes del colector de la muestra, con lo
cual esta metodología puede formar parte de una obtención a escala piloto o
industrial.
I.5.3 Método de deshidratación-rehidratación.
Cuando se preparan liposomas con una mezcla de lípidos en su
composición, los lípidos deben ser primeramente disueltos y mezclados en un
solvente orgánico para asegurar una mezcla homogénea de lípidos. Usualmente
en este proceso se usa cloroformo o una mezcla de cloroformo: metanol. El
objetivo es obtener una solución lipídica limpia para completar el mezclado de
lípidos. Típicamente las soluciones de lípidos son preparadas a una concentración
de 10–20 mg/ml de lípido en el solvente orgánico; o bien concentraciones más
altas si la solubilidad del lípido y la mezcla son aceptables (Figura 1.4). Una vez
que los lípidos se mezclan con el solvente orgánico, el solvente es removido con la
ayuda de un desecador a vacío, al cual está expuesto durante 3 horas, para
formar una película de lípidos. Para volúmenes pequeños de solvente orgánico
(<1 ml), el solvente se puede evaporar usando una atmósfera de nitrógeno o
38
argón. Para volúmenes grandes, el solvente orgánico puede ser removido por
evaporación rotatoria para formar una película delgada de lípido en el interior de
un recipiente. La película de lípido se obtiene removiendo el residuo de solvente
orgánico colocando el vial o recipiente en una bomba a vacío durante la noche. Si
el uso de cloroformo no es posible, un solvente alternativo, es butanol terciario o
ciclohexano para disolver los lípidos. La solución de lípido es transferida a un
contenedor y se enfría colocando este en un refrigerador o congelador. Después la
película de lípido es congelada y liofilizada hasta secarse. El grosor de la película
de lípido no debe ser mayor al diámetro del contenedor usado para la liofilización.
Una vez que las películas de lípido están secas, el contenedor se debe cerrar
herméticamente, y almacenarse en el congelador hasta que se requiera hidratar.
La hidratación de la película de lípido seca es lograda añadiendo un medio acuoso
al contenedor y agitando levemente.
Figura 1.4 Preparación de soluciones de liposomas: Al final del proceso de
hidratación se obtienen soluciones con liposomas de diferentes tamaños; el
39
proceso de extrusión permite obtener soluciones de liposomas con tamaños
nanométricos definidos por la membrana utilizada en el proceso (Marco V. Bayas
fabricación de liposomas para el encapsulamiento de drogas de uso veterinario).
I.5.4 Electroformación
La electroformación es un método que consiste en la producción de
vesículas debido a la influencia de un campo eléctrico, el cual permite controlar el
tamaño de las vesículas obtenidas y la lamelaridad a partir de la película inicial de
lípido. Esta técnica es útil para elaborar vesículas unilamelares gigantes para
estudios que involucran vesículas individuales. Estas vesículas se encuentran
entre 5-200 µm de diámetro, dependiendo de la composición del lípido, el medio y
los parámetros del campo de corriente alterna generadora del campo eléctrico.
Las vesículas obtenidas mediante el método de electroformación son modelos
ideales para realizar observaciones de macromanipulación y microinyección local
[Angelova, 2000].
40
CAPÍTULO II
MATERIALES Y MÉTODOS
II.1 Materiales
En este capítulo se describen los materiales utilizados para la preparación
de liposomas y el medicamento (Travoprost) que se integró en los liposomas. De
igual manera, se detallAn las diferentes técnicas experimentales que se utilizaron
para la caracterizacion de los liposomas en presencia de polietilenglicol y/o
fármaco.
II.1.1 Moléculas y Materiales utilizados
II.1.1.1 Fosfolípidos
El fosfolípido utilizado para la formación de los liposomas es fosfatidilcolina
a partir de lecitina de soya, >98% PC (Figura 2.1), el cual es un fosfolípido natural
comprado en Shenyang Tianfeng Biological Pharmaceutical Co., LTD y provisto
por el Dr. Juan Antonio Noriega Rodríguez del Depto. de Ingeniería Química de la
Universidad de Sonora. El peso molecular de PC es de 812.05 gr/mol con una
pureza mayor al 98%. Antes de preparar los liposomas por el método de re-
hidratación, se diluyó la lecitina de soya en cloroformo para tener una
concentración de 0.1251 mol/l de fosfolípido.
41
Figura 2.1 Molécula de fosfatidilcolina
II.1.1.2 Agua, glucosa y sacarosa
El agua utilizada para la preparación de las soluciones fue de calidad
ultrapura (tipo millipore Milli-Q) con una conductividad de 18.2 MΩ-cm. Para tener
contraste óptico en la observación mediante microscopía óptica se utilizó glucosa
y sacarosa a concentraciones de 200 mOms para ambos azucares.
II.1.2.3 Buffer (tampón fosfato)
El tampón fosfato o buffer PBS (fosfato 0,01 M, NaCl 0,138 M, KCl 0,0027
M) fue adquirido en Sigma-Aldrich. Este buffer mantiene un pH de 7,4 en agua
desionizada (la utilizada en este trabajo) a una temperatura de 25 ° C.
CH2(R)CH(R´)CH2OPO(OH)O(CH2)2N(OH)(CH3)3
42
II.1.2.3 Polímero neutro, polietilenglicol.
El polietilenglicol (C2H4O)n.H2O) (Figura 2.2) es un polímero cristalino, neutro, con
alta solubilidad en agua y disolventes orgánicos. A temperatura ambiente, su
solubilidad en agua se dice que es ilimitada para todos los grados de
polimerización. El PEG utilizado es este trabajo tiene un peso molecular de 2000
gr/mol y se compró en Fluka. Para las concentraciones de PEG2000 trabajadas se
tiene el polímero en un régimen de buen solvente y no existieron cambios
apreciables en la viscosidad.
Figura 2.2 Estructura química del polietilenglicol
II.1.2.4 Fármaco (Travoprost)
Travoprost es el nombre comercial de la molécula de isopropil(Z)-7-
[(1R,2R,3R,5S)-3,5-dihidroxi-2-[(1E,3R)-3-hidroxi-4-[(α,α,α,-trifluoro-m-tolilo)oxi]-1-
butenil]ciclopentil]-5-heptenoato (C26H35F3O6) (Figura 2.3) que distribuye la
compañía Alcon. Éste fármaco es un análogo de las prostaglandinas y es utilizado
como un medicamento hipotensor ocular como un potente agonista altamente
selectivo para el receptor prostanoide FP. Travoprost es prácticamente insoluble
en agua, pero muy soluble en acetonitrilo, metanol, octanol, y cloroformo. El
43
Travoprost utilizado en esta investigación es de un peso molecular de 500.6 gr/mol
con una pureza mayor al 95%. Este fármaco fue proporcionado por el Dr. Jesús
Jiménez Román del laboratorio de Glaucoma de la Asociación para Evitar la
Ceguera en México (APEC, http://apec.org.mx/?mod=home).
Figura 2.3 Estructura química del fármaco (Travoprost).
II.2 Preparación de los liposomas
El método utilizado para la formación de liposomas fue el de re-hidratación de una
película de fosfolípido y su posterior extrusión. Para lo cual, inicialmente se
colocaron 8 µl de PC en un vial, el cual se llevó a un desecador al vacío durante
aproximadamente 3 h, para obtener una película de fosfolípido seca.
Posteriormente, se hidrató la película de fosfolípido con 100 µl de glucosa 200
mOsm/kg y 100 µl de sacarosa 200 mOsm/kg, agitando solo un poco. Una vez
rehidratada la película, se guardó a 4°C por 24 h para su posterior análisis.
44
En la preparación de los liposomas con polietilenglicol (PEG2000), este
último se disolvió en el buffer antes de re-hidratar el fosfolípido seco (secado al
vacío). Para la inclusión de Travoprost en los liposomas, las soluciones del
fármaco (en etanol) y la PC (en cloroformo) se mezclaron y después se
evaporaron los disolventes en una campana de vacío durante 3 horas.
Posteriormente se re-hidrató la mezcla seca con PBS sin o con PEG. Cada una de
las muestras fue refrigerada un tiempo mínimo de 24 h a 4°C.
Al término de las 24 h, se tomaron 30 µl de cada muestra y se colocaron en
un portaobjetos el cual enseguida se cubrió con un cubreobjetos para observarse
en el microscopio óptico y confirmar la presencia de vesículas. Una vez
confirmada la presencia de liposomas se procedió a realizar la extrusión de las
muestras. A continuación se detallan los diferentes análisis de los liposomas por
técnicas de microscopía óptica. Así como el análisis de tamaño hidrodinámico,
carga en la superficie de los liposomas y tamaño y morfología mediante técnicas
de microscopía electrónica de transmisión (en su modalidad de Tinción Negativa).
II.3 Técnicas experimentales
II.3.1 Microscopía de Contraste de Interferencia Diferencial (DIC).
Un tipo de interferencia óptica, llamada Contraste de Interferencia Diferencial
(DIC) o interferencia de Nomarski por su descubridor, suministra una imagen
aparentemente tridimensional. En la microscopia DIC, el contraste depende de la
45
tasa de cambio del índice de refracción a través de la muestra. Los bordes de la
estructura, donde el índice de refracción varía en una distancia pequeña, se
observan satisfactoriamente con contraste. En otras palabras, con la microscopía
de contraste de interferencia diferencial (DIC) según Nomarski, se obtienen
imágenes con sensación de relieve. Combina la técnica de polarización con la
utilización de unos prismas especiales birrefringentes (prismas de Wollaston).
II.3.1.2 Aplicaciones de DIC
El contraste en las imágenes DIC es producido exclusivamente a través de un
efecto óptico. Esta técnica por lo tanto, es ideal para especímenes vivos sin teñir
(por ejemplo, cultivos celulares, embriones, frotis sanguíneos, diatomeas,
protozoarios). El DIC brinda información morfológica sin la necesidad de usar
tintes potencialmente tóxicos y fluoróforos. Sin embargo el DIC se usa con
frecuencia en asociación con fluorescencia para revelar características
morfológicas del espécimen. También es usado para examinar polímeros y otros
materiales.
II.3.2 Configuración del Microscopio.
La imagen DIC requiere de varios componentes ópticos: un polarizador, prisma y
condensador especial (Figura 2.4). El ensamble correcto y la alineación de estos
componentes es clave para la exitosa obtención de imágenes DIC. Este sistema
se puede instalar en casi cualquier microscopio de campo claro con iluminación
transmitida, reflejada, vertical o invertido.
46
Figura 2.4. Componentes ópticos para Microscopía DIC.
II.3.2 Dispersión de Luz Dinámica (DLS).
La Dispersión Dinámica de la Luz (DLS) es una de las técnicas más
usadas para determinar el coeficiente de difusión, radio hidrodinámico, radio de
giro y polidispersión de partículas o agregados en suspensión [Pécora, R., 1985].
La dispersión de la luz puede ser medida en estado estacionario en un
espectrofluorímetro, o de forma dinámica en un instrumento equipado con un
láser.
La técnica DLS se basa en hacer incidir un haz de radiación de longitud de
onda λ y vector de onda sobre una muestra con partículas en movimiento.
Al interactuar la radiación con las partículas una parte de la energía es absorbida,
2 nk πλ
=
47
otra es transmitida sin modificación del vector de onda incidente y otra es
dispersada con vector de dispersión kd en todo el espacio (Figura 2.5).
Figura 2.5 Esquema de la dispersión de luz durante su Interacción con partículas
en técnica DLS.
La luz dispersada a un cierto ángulo θ es colectada por un detector
(fotomultiplicador). Estudiando la dispersión de la muestra en función del vector de
onda de difusión (suponiendo que la energía incidente es igual
a la energía transmitida) y correlacionando las intensidades de dispersión a
diferentes tiempos se puede construir la función de correlación. La función de
correlación puede ser ajustada por un modelo físico acorde al tipo de partículas o
estructuras presentes en la muestra para determinar el coeficiente de difusión, la
distribución de tamaños y la polidispersión. En términos generales todos los
equipos de dispersión de luz contienen los mismos componentes como son: una
4 ( / 2)nq senπθ
λ=
48
fuente de radiación, un detector situado al ángulo de dispersión y un correlador
(Figura 2.6).
Figura 2.6. Esquema representativo de los componentes en un equipo de DLS
En el análisis de dispersión de luz dinámica el movimiento browniano de las
partículas induce un ensanchamiento del espectro lo que se relaciona con la forma
y tamaño de las partículas. La dispersión de luz dinámica es uno de los métodos
más empleados para estimar el radio hidrodinámico promedio de partículas
en suspensión y su índice de polidispersidad, cubriendo un rango desde unos
pocos nanómetros hasta µm.
La determinación del tamaño hidrodinámico en las muestras de los
liposomas se realizaron en un equipo Zetasizer nano Malvern que utiliza un láser
de He –Ne a una longitud de onda de 633 nm. El equipo está configurado para
49
medir la radiación dispersada a un ángulo fijo de 175°. El rango de medida del
Zetasizer es de 0.3 nm – 10 µm. El volumen mínimo de la muestra es de 12 µl y se
utilizó un volumen de muestra de 1mL para el análisis.
II.3.3 Potencial Zeta
El potencial zeta indica la carga neta que hay en la superficie de una
partícula. El desarrollo de la carga neta en la superficie de una partícula afecta a la
distribución de los iones en la región interfacial que rodea, lo que resulta en un
aumento de la concentración de iones (iones de carga opuesta a la de la partícula)
cerca de la superficie. Por lo tanto existe una capa doble eléctrica alrededor de
cada partícula.
La capa de líquido que rodea la partícula se divide dos regiones, una
llamada capa de Stern, donde los iones están fuertemente unidos y una región
exterior difusa en la que están sujetos con menos firmeza. Dentro de la capa
difusa hay un límite teórico en el cual los iones y partículas forman una entidad
estable. Cuando una partícula se mueve (debido a la gravedad), los iones dentro
de los límites se mueven con él, pero los iones más allá de la frontera no viajan
con la partícula. Este límite se denomina superficie de cizallamiento hidrodinámico.
El potencial que existe en este límite se conoce como potencial Zeta, que es la
carga global que adquiere una partícula en un medio particular (Figura 2.7).
50
Figura 2.7 Dibujo para interpretar el concepto de Potencial zeta.
La magnitud del potencial zeta da una indicación de la estabilidad potencial
del sistema coloidal. Un sistema coloidal estable es cuando uno de los tres
estados de la materia: gaseoso, líquido y sólido, están finamente disperso en una
de las otras.
Entre mayor es el valor absoluto del valor del potencial zeta (cargas
negativas o positivas), las partículas en suspensión tienden a repelerse entre sí y
no hay tendencia a agregarse y flocular. En cambio, si las partículas tienen valores
de potencial zeta bajos, no hay fuerzas de atracción para impedir que las
partículas se unan y entonces se agregan y floculan. Generalmente un sistema
51
coloidal se considera estable cuando los valores de potencial zeta absolutos
superan 30 mV.
El conocimiento del potencial zeta de una preparación de liposomas puede
ayudar a predecir el destino de los liposomas en vivo. Cualquier modificación
posterior de la superficie de los liposomas también se puede controlar mediante la
medición del potencial zeta. Las mediciones de potencial Z en las muestras de los
liposomas se realizaron en el mismo equipo malvern indicado anteriormente.
Solamente que para medir potencial z, se basa en estimar la movilidad
electroforética por medio de velocimetría laser doppler. Básicamente el sistema de
medición es por medio de micro-electroforesis clásica es una celda con electrodos
en cada extremo al que se aplica un potencial eléctrico para desplazar las
partículas hacia el electrodo de carga opuesta y su velocidad se mide y se expresa
en unidad de intensidad de campo. El factor más importante que afecta los valores
de potencial zeta, es el pH.
II.3.4 Microscopía Electrónica de Transmisión (TEM).
La técnica TEM proporcionar información sobre la topografía
(características de la superficie de un objeto), la morfología (forma y tamaño de las
partículas que componen el objeto), composición (los elementos y compuestos
que se compone el objeto y de las cantidades relativas de ellos) e información
cristalográfica (cómo están dispuestos los átomos en el objeto).
52
El microscopio electrónico es un instrumento que utiliza un haz de
electrones de alta energía para examinar objetos en una escala muy fina.
Básicamente el análisis de las muestras por TEM consta de formar una corriente
de electrones al alto vacío (por cañones de electrones). Esta corriente se acelera
hacia la muestra (con un potencial eléctrico positivo), mientras que se limita y se
centra con aberturas de metal y lentes magnéticas en un haz monocromático
delgado. La muestra es irradiada por el haz y las interacciones se producen dentro
de la muestra irradiada, lo que afecta el haz de electrones. Estos detectan
interacciones y transforman la señal en una imagen. El Microscopio Electrónico de
Transmisión utilizado fue un JEOL 2010T (Figura 2.8) que se encuentra en el
Departamento de Física de la Universidad de Sonora y es operado por el Dr.
Ramón Iñiguez Palomares quien realizó los experimentos de TEM con tinción
negativa.
53
Figura 2.8 Microscopio Electrónico de Transmisión (JEOL 2010T) utilizado en el
análisis de las muestras.
54
II.3.4.1 Tinción negativa
La TEM con tinción negativa brinda una visión directa de la distribución del
tamaño de las partículas (asumiendo que no hay artefactos debido al pH, iones y
osmolaridad), aunque son difíciles de evaluar la lamelaridad y morfología.
La técnica de tinción negativa es un método sencillo, rápido y cualitativo
para examinar estructuras, macromoléculas individuales, virus, etc., a nivel de
Microscopía Electrónica. Debido a que la tinción negativa implica la deposición de
átomos pesados, es común el aplanamiento de las estructuras esféricas o
cilíndricas. Idealmente, la tinción negativa no debe reaccionar con la muestra
como en la 'tinción positiva' (es decir, no debe unirse a la muestra). Sin embargo,
los iones de uranilo se unirán a las proteínas y los grupos carboxilo de ácido
siálico y a grupos fosfato de ácido nucleico y lípidos. Un efecto de esto es para
inducir la agregación del material.
Preparación de las muestras
Las muestras deben ser suspendidas en un tampón adecuado.
Procedimiento tinción negativa: Soluciones.
Se requieren las siguientes soluciones para la tinción negativa.
1. Muestra solución ~ suspensión.
2. Agua desionizada o, agua doblemente destilada.
3. Tinción negativa, es decir, la solución de metales pesados: Formato de uranilo.
55
Preparación de la solución de tinción negativa
Preparación de formato de uranilo.
Se pesó formato de uranilo para obtener una concentración final de 0,75%
(es decir, 7,5 mg / ml). Se vertió agua hirviendo en un pequeño vaso que contenía
el formato de uranilo pesado. Se agitó lentamente durante 5-10 min en la
oscuridad.
Se filtró la solución a través de una membrana de 0,2 ~ m. Se ajustó el pH
a 4,25 mediante la adición de NaOH 10 N. Se agitó durante otros 5 minutos en la
oscuridad. Se protegió la tinción de la oscuridad.
Procedimiento de Tinción de la muestra
En la rejilla de soporte para la muestra, se colocan una gota de 5 micro
litros de la solución / suspensión de la muestra se deja absorber durante 30-60s, y
se elimina el exceso. A continuación, se lava la rejilla de la muestra en una gota
de agua bidestilada. Después de 1s, se debe quitar cuidadosamente la gota de
agua de la rejilla. Por último, se tiñe la muestra por 1s mediante la reducción de la
rejilla con la muestra sobre una gota de solución de tinción negativa y a
continuación, se seca la rejilla. Se repite este paso una vez, esta vez, sin
embargo, se deja la tinción por 10-15s antes de secar.
56
II.3.5 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN.
La cromatografía líquida permite separar componentes en una fase líquida
a través de su paso en una fase estacionaria (columnas de separación) a un flujo
controlado y dependiendo del tipo de compuestos estos se pueden detectar ya se
por UV/visible, fluorescencia, conductividad eléctrica y electroquímica. En esta
técnica la fase móvil (líquido, o fluido supercrítico) arrastra la muestra con un flujo
constante de presión proporcionado por una bomba, hasta llegar al punto donde
se introduce la muestra. Siguiendo el flujo de presión la muestra de lleva a una
columna donde se encuentra la fase estacionaria que se trata de un sólido o un
líquido fijado en un sólido. Los componentes de la mezcla interaccionan de distinta
forma con la fase estacionaria y con la fase móvil. De este modo, los componentes
atraviesan la fase estacionaria a distintas velocidades y se van separando para
posteriormente pasar por un detector que genera una señal que puede depender
de la concentración y del tipo del compuesto (figura 2.9).
En el proceso de separación, las muestras se disuelven en una fase móvil
(FM) líquida que se hace pasar a través de una fase estacionaria (FE) inmiscible,
la cual se mantiene fija en una columna o lecho cromatográfico. Los componentes
de la muestra se distribuyen de modo distinto entre la FM y FE dependiendo de la
afinidad por ambas fases, desplazándose a velocidad distinta. Lo que genera la
separación de los componentes en bandas discriminadas que pueden analizarse
cualitativamente y/o cuantitativamente (figura 2.10).
57
Figura 2.9 Diagrama esquemático de un cromatógrafo de líquidos de alta
resolución.
Figura 2.10 Representación de la separación de dos componentes A y B.
58
II.3.5.1. HPLC de Fase Reversa
En una mezcla de componentes que van a ser separados, los analitos
relativamente menos polares serán retenidos por la fase estacionaria no polar por
más tiempo que los analitos que son relativamente más polares. Por esto, el
componente más polar es el que eluye primero (Oona Mcpoli, 2009).
II.3.5.2. Estimación de la concentración de Travoprost en los liposomas.
La concentración de Travoprost se estimó utilizando un sistema HPLC
(Varian ProStar 310). La separación cromatografica se llevó a cabo en fase
reversa en una columna C18 (5µm, 250 x 3.2mm) utilizando como fase móvil
acetonitrilo (ACN):agua 70.30 (v/v), un flujo de 1ml/min y se utilizó una longitud de
onda 220nm (detector UV). El tiempo de retención fue 3.5 min y la temperatura
de la columna se mantuvo a 30°C. La concentración de Travoprost liberada fue
estimada directamente de las muestras a pH constante de 7.4
Para calcular la concentración total de Travoprost, primero se centrifugaron
las muestras a 700 gravedades por 30 minutos para precipitar los liposomas. El
sobrenadante fue separado y el precipitado fue resuspendido en 1ml de buffer
PBS. Posteriormente, se estimó la concentración del fármaco liberado por el
rompiendo de los liposomas en alcohol isopropílico en una relación en volumen de
1:4.
59
A continuación, la masa de los lípidos rotos se centrifugó y aisló del resto
de la solución por ultra-centrifugación a 13.000 rpm durante 30 minutos. El
sobrenadante se diluyó 10 veces con PBS con pH 7,4 y se analizó para la
concentración total de Travoprost. Los valores totales y liberados de Travoprost
se estimaron en comparación con una curva de calibración estándar de este en
PBS, pH 7,4. La eficiencia de carga de fármaco se calculó como se indica a
continuación:
Eficiencia de unión del fármaco (EUF) = 100 x (Cantidad de fármaco retenida
(FR)/cantidad de fármaco inicial (FI))
60
CAPITULO III
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
En este capítulo se presentarán los resultados de la obtención de los liposomas,
su caracterización y la capacidad de encapsulación del fármaco (travoprost) en los
liposomas. Primeramente se mostrarán los resultados de microscopia óptica DIC.
Después se presentarán los resultados de tamaño hidrodinámico y carga en la
superficie de los liposomas, obtenidos mediante DLS y velocimetría doppler,
respectivamente. Enseguida se mostrarán los resultados de tamaño y morfología
observados por la técnica TEM (Tinción Negativa) y finalmente se presentará la
capacidad de encapsulación de Travoprost en los liposomas, lo cual se determinó
a través de HPLC.
Antes de realizar los análisis de microscopía DIC, se observó la apariencia
de las muestras justo después de dejarlas en refrigeración por un periodo mínimo
de 24 h, notándose que todas las muestras presentaban opacidad lo que sugiere
la presencia de liposomas grandes. Para reducir el tamaño de los liposomas
(micras a nanómetros) se realizó la extrusión de las muestras (Figura 3.1) a través
de membranas de policarbonato de tamaño de poro de 50 nm (Avanti Polar
Lipids).
61
Figura 3.1 Extrusión de una muestra con liposomas a través de membranas
porosas.
Cuando el tamaño de los liposomas es del orden nanométrico, la solución es
transparente o semitransparente, dependiendo de la concentración de fosfolípidos.
Por lo que la apariencia de las soluciones de los liposomas fue un indicador de
cuantas veces había que realizar la extrusión (aproximadamente once veces).
III.1 Microscopía diferencial de contraste de interferencia (DIC)
En análisis de microscopía DIC se realizó en las soluciones de los liposomas
antes de realizar el proceso de extrusión y para cada una de las variantes de
liposomas obtenidos: PC, PC-PEG, y PC-PEG-Travoprost. Los liposomas con
Travoprost se analizaron a diferentes relaciones molares fármaco / lípido (0.04,
0.1 y 0.18). Todas las muestras se observaron a través un objetivo 60x. A
continuación se presentan los resultados DIC de los liposomas con las diferentes
combinaciones de los componentes.
62
III.1.1 Liposomas de PC
La figura 3.2 presenta una imagen representativa de DIC obtenida para liposomas
de PC en ausencia de PEG y Travoprost. En esta se observa una alta
polidispersión en el tamaño de los liposomas, una forma esférica y prevalecen
tamaños menores a 5 µm. Igualmente se alcanzan a observar liposomas
cilíndricos y pocos agregados.
Figura 3.2 Imagen DIC de Liposomas de fosfatidilcolina en ausencia de PEG y/o
Travoprost. La escala corresponde a 100 µm. Las muestras se analizaron antes
de su extrusión.
63
IIII.1.2 Fosfatidilcolina –Polietilenglicol.
Para examinar el efecto de polietilenglicol 2000 en la membrana de los liposomas
de PC, se prepararon liposomas con dos concentraciones diferentes de fosfolípido
(10 mM y 5 mM) y diferentes concentraciones de PEG2000 (0.5 mM, 0.253 mM y
0.125 mM). La figura 3.3 muestra una imagen representativa obtenida de una de
las combinaciones de las concentraciones evaluadas (PC 10 mM con PEG2000
0.5 mM). Como puede observarse en la imagen, aparecen liposomas de varias
formas y tamaños. Entre las que predominan la de forma esférica y de tamaño
variable. Estos liposomas esféricos aparecen igualmente formando agregados
como parte de algunos liposomas de mayor tamaño pero en forma de “rosario” o
“anillo”. Aunque menores en número, es notable igualmente, la presencia de
liposomas cilíndricos o tipo “bastón” de algunas micras de longitud. No se
observaron liposomas tipo “trenzas”.
64
Figura 3.3 Imagen DIC de Liposomas de PC (10 mM) con PEG2000 (0.5 mM). La
escala corresponde a 100 µm. Las muestras se analizaron antes de su extrusión.
III.1.3 Fosfatidilcolina - PEG-Travoprost
Los ensayos de encapsulación del Travoprost se realizaron con los liposomas PC-
PEG2000 en concentraciones de 10 mM y 0.125 mM para el fosfolípido y
polímero, respectivamente. En esas condiciones, se evaluaron diferentes
concentraciones del fármaco para su encapsulación (0.04, 0.1 y 0.18 de
Travoprost) y las imágenes DIC obtenidas se detallan a continuación.
III.1.3.1 Liposomas PC-PEG2000-Travoprost (0.04)
La imagen DIC correspondiente a las muestras de liposomas con una
concentración de Travoprost de 0.04 se muestra en la figura 3.4. El tamaño de
65
algunos liposomas son más grandes que los tamaños observados en los
liposomas de PC con o sin PEG2000. En la imagen se observan varios liposomas
esféricos de diámetros cercanos a 20 µm con poca presencia de liposomas
cilíndricos.
Figura 3.4 Imagen DIC obtenida para liposomas de fosfatidilcolina - PEG-
Travoprost (0.04). La escala corresponde a 100 µm Las muestras se analizaron
antes de su extrusión.
III.1.3.2 Liposomas PEG2000 – Travoprost (0.1)
En los ensayos de obtención de liposomas donde se aumentó la concentración de
Travoprost a 0.1, se mantuvo la forma esférica con diámetros más pequeños
(entre 1–3 µm) que en los liposomas donde se adicionó 0.04 del fármaco. En este
66
caso se observó poca presencia de liposomas cilíndricos o tipo “rosario” como se
muestra en la figura 3.5. Por otra parte, la diferencia aparente es la presencia de
agregados de liposomas.
Figura 3.5 Imagen obtenida por DIC para liposomas de fosfatidilcolina - PEG-
Travoprost (0.1). La escala corresponde a 100 µm. Las muestras se analizaron
antes de su extrusión.
III.1.3.3 Liposomas PEG2000 – Travoprost (0.18)
En la obtención de liposomas PC-PEG con esta concentración de Travoprost, es
notoria la presencia de agregados de liposomas esféricos de diferentes tamaños.
De igual manera, se observaron liposomas cilíndricos de longitudes cercanas a los
100 µm. Prevalece la presencia de liposomas esféricos de diámetros cercanos a
1–3 µm con presencia de liposomas cilíndricos o tipo “rosario” como se muestra en
67
la figura 3.6. Los liposomas gigantes que se presentan en la imagen, parecen
contener otros liposomas en su interior.
Figura 3.6 Imagen obtenida por DIC para liposomas de fosfatidilcolina-PEG-
Travoprost (0.18). La escala corresponde a 100 µm. Las muestras se analizaron
antes de su extrusión.
III.2 Carga y tamaño hidrodinámico de los liposomas
La carga eléctrica y tamaño hidrodinámico se realizó en liposomas obtenidos con
los distintos componentes que se utilizaron en el proceso de encapsulación del
fármaco, esto con el fin de determinar los cambios de carga en el proceso de
encapsulación y establecer la estabilidad de los liposomas. Es decir, se midió el
tamaño y carga en liposomas elaborados a partir de PC (1 y 5 mM), liposomas
68
(PC)-PEG (0.5, 0.25 y 0.125 mM de PEG). A continuación se mostrarán los
resultados de tamaño hidrodinámico y potencial z de los liposomas obtenidos bajo
las condiciones indicadas.
Las funciones de correlación obtenidas para los diferentes sistemas
liposomales presentan una razón señal/ruido aceptable, de modo que la línea
base de la correlación se encuentra bien definida (Figura 3.7) y en buenas
condiciones para los análisis de tamaño hidrodinámico y carga.
Figura 3.7 Función de correlación obtenida de liposomas de PC-PEG-Travoprost
para la relación molar 0.04 (PC-Travosprost) a una temperatura de 25°C. Las
muestras se analizaron después de su extrusión.
69
III.3 Potencial Zeta
El potencial zeta puede jugar un papel importante en el comportamiento de los
liposomas in vivo e in vitro. Generalmente, los valores de la carga en valor
absoluto (mayores a 20 mV) en la superficie de partículas se relaciona con su
estabilidad en sistemas acuosos. Por lo que los liposomas más estables frente a
la agregación y fusión se presentan cuando estos están suficientemente cargados.
En la tabla 7 se muestran los valores promedio de tamaño hidrodinámico y carga
en la superficie de los liposomas obtenidos con dos concentraciones diferentes de
PC (1 y 5 mM). Como se nota en la tabla, no hubo un cambio aparente en el
tamaño con respecto a la concentración de fosfatidilcolina (PC). Sin embargo, si
se obtuvieron cambios significativos en los valores de potencial zeta, observando
que a menor concentración de PC la carga negativa aumenta significativamente.
Tabla 7. Valores promedio de tamaño hidrodinámico y potencial zeta de liposomas
rehidratados obtenidos con diferentes concentraciones de PC.
Liposomas PC* Tamaño
d. nm
Potencial Zeta
mV
1 mM PC 107.9 ± 0.4 -23.3 ± 0.4
5 mM PC 106.7 ± 0.4 - 7.5 ± 0.04
Liposomas rehidratados con solución buffer PBS 0.001M. Mediciones después del proceso de
extrusión.
70
El tamaño hidrodinámico y potencial Z también se evaluó en liposomas de
PC con PEG a diferentes concentraciones de este polímero (0.5, 0.25 y 0.125
mM). Los resultados se muestran en la tabla 8, donde se nota que los tamaños de
liposomas fueron muy similares a concentraciones de PEG 0.5 y 0.25 mM. En
cambio los liposomas obtenidos con PEG al 0.125 mM mostraron un tamaño
significativamente menor comparado con el obtenido con las otras dos
concentraciones de PEG. Con respecto a los valores de potencial zeta, se notó
que éstos aumentaron (-26 mV) a medida que se incrementó la cantidad de PEG,
lo que es consistente con lo reportado por Malvern Instruments (malverns
application notes. The use of zeta potential measurements to study sterically
stabilized liposomes.)
Tabla 8. Evaluación de tamaño y potencial zeta de liposomas-PEG a diferentes
concentración mM de PEG luego de extrusión.
Liposomas-
PEG
Tamaño
d. nm
Potencial Zeta
Mv
0.5mM 132.93 ± 0.15 -6.16 ± 0.04
0.25Mm 139.2 ± 0.45 -18.36 ± 0.12
0.125mM 105.53 ± 0.1 -26.76 ± 0.94
71
A continuación se muestran algunos diagramas de distribución de tamaño y
diagramas de distribución de potencial zeta correspondientes a liposomas (PC-
PEG-Travoprost) con diferentes concentraciones del fármaco (0.04, 0.1 y 0.18),
obtenidos en la primera parte del estudio y a los cuales se les realizó el proceso
de extrusión (Figuras 3.8 y 3.9). Como se observa en los diagramas, no hay
diferencia significativa en el tamaño hidrodinámico de los liposomas con diferentes
concentraciones de Travoprost. Antes de realizar el proceso de extrusión, las
muestras mostraron tamaños heterogéneos, y los tamaños homogéneos obtenidos
después del proceso de extrusión indican que el proceso fue efectivo, el tamaño
obtenido de las mediciones realizadas fue mayor al del tamaño de poro de la
membrana utilizada durante la extrusión, quizá debido a un proceso de
percolación de los liposomas
Tampoco se observó ningún cambio en la carga de superficie de los
liposomas con las diferentes concentraciones del fármaco, lo que indica que el
fármaco no está adicionando carga a los liposomas.
72
Figura 3.8 Distribución de tamaños obtenidos por DLS para liposomas de PC-
PEG-Travoprost para las relaciones molares de 0.04, 0.1 y 0.18 del fármaco. El
análisis se realizó en liposomas después de la extrusión.
PC- Travopost 0.04
PC- Travoprost 0.1
PC-Travoprost 0.18
73
Figura 3.9 Potencial zeta de liposomas PC-PEG-Travoprost para las relaciones
molares de 0.04, 0.1 y 0.18 del fármaco. El análisis se realizó en liposomas
después de la extrusión.
74
III.4 Estabilidad de los liposomas
La estabilidad de los liposomas se confirmó a través de la medición del tamaño
hidrodinámico con respecto al tiempo, en muestras almacenadas a temperatura de
4 °C (refrigeración). Las mediciones de tamaño en diferentes intervalos de tiempo,
S0 (Semana uno), S1 (semana dos), S2 (semana tres), S3 (semana cuatro) se
realizaron en un equipo Zetasizer nano de Malvern.
Los valores promedio del tamaño hidrodinámico de los liposomas (PC-PEG-
Travoprost) con diferentes relaciones molares del fármaco (0.04, 0.1 y 0.18) y con
respecto al tiempo (a 4 °C), se muestran en la Tabla 9. En base a los valores
promedio, se puede observar que no hay cambios considerables con respecto al
tiempo (hasta 4 semanas) en el tamaño hidrodinámico de los liposomas con
diferentes relaciones molares del fármaco y almacenados a 4 °C, éstos se
mantienen en un rango de tamaño 112-121 nm. Destacándose que en los
liposomas con una relación molar fármaco/lípido de 0.1, se mantiene
prácticamente el mismo valor del tamaño hidrodinámico (11-113 nm) durante las 4
semanas de almacenamiento a 4 °C. Por lo que los liposomas PC-PEG-
Travoprost con una relación molar fármaco/lípido de 0.1 son muy estables durante
su almacenamiento a 4°C.
El efecto de la desestabilización de vesículas se observó cuando la relación molar
fármaco/lípido superó 0,1 (figura 3.10). Esto se esperaba debido que al aumentar
75
la concentración del fármaco se perturbaría la estructura de la bicapa, con
distorsión de la forma, como se informó de otro fármaco lipofílico en una vesícula
similar por Mehnert (Mehnert W, Ma der K 2001) y como fue observado por
Natarajan y cols (Natarajan et al. 2011).
Tabla 9. Diámetro de liposomas (PC-PEG-Travoprost) en función del tiempo de
almacenaje a 4°C durante 4 semanas.
Diámetro de la formulación de liposomas con diferente relación molar fármaco/lípido (D/L) durante el almacenamiento a 4°C
D/L moles/moles Semana 0 Semana 1 Semana 2 Semana 3
0.04 112.5 ± 0.152 115.5 ± 0.07 117.3 ± 0.75 121.7 ± 0.30
0.1 111.3 ± 0.23 112.8 ± 0.20 113.9 ± 0.070 111.3 ± 0.28
0.18 103.1 ± 0.435 119.7 ± 0.90 113.1 ± 0.70 112.7 ± 0.68
76
Figura 3.10 Diámetro de liposomas (PC-PEG-Travoprost) con diferentes
relaciones molares droga/lípido en función del tiempo de almacenaje a 4°C
durante 4 semanas.
III.5 Eficiencia de encapsulación del fármaco en los liposomas
La eficiencia de encapsulación del fármaco en los liposomas se evaluó mediante
la determinación de la cantidad del fármaco liberado después de su rompimiento
en alcohol isopropílico en una relación alcohol:liposomas 1:4 v:v. La concentración
77
de Travoprost liberada se estimó directamente de las muestras a pH constante de
7.4 (en PBS). La cuantificación del fármaco en las muestras se realizó a través de
la técnica analítica HPLC acoplada a un detector UV/Vis a 220 nm. Los valores
totales de Travoprost liberados de los liposomas se estimaron en base a una
curva de calibración con concentraciones conocidas del fármaco (1, 2, 3, 4 y 5
µg/ml) en PBS a pH 7.4, como se indica en la Figura 3.11. Tanto los controles
como las muestras se analizaron por duplicado.
Figura 3.11 Concentración del fármaco unido a liposoma. Concentración en µg/ml
(obtenidas a partir del área respectiva de los cromatogramas corresondientes a
concentraciones conocidas del fármaco).
78
En base a los valores de la cantidad de fármaco en las muestras de
liposomas con las diferentes relaciones molares de éste (Travoprost), se obtuvo
que el porcentaje de encapsulación del fármaco fue en el rango de 85-90 %
del total del fármaco adicionado en las diversas formulaciones, como se indica en
la Tabla 10. Notándose que en la relación molar más alta de fármaco/Lípido (D/L)
(0.18) se obtuvo una eficiencia de encapsulación del 93%, la cual fue casi 5.3
veces más alta que la que se reportó para el ibuprofeno por Muhammed et al en
1998. Además, esta carga muy alta de Travoprost aparentemente no afectó la
estabilidad de las vesículas.
Tabla 10. Evaluación de tamaño, índice de polidispersión (IPD), potencial zeta, y
eficiencia de unión del fármaco
PC-Fármaco-
PEG
D/L
moles/moles
Tamaño
d. Nm
IPD Potencial
Zeta
mV
Eficiencia de
Unión del
Fármaco
0.04 112.4 ± 01 0.160 -25.5 ± 0.2 85%
0.1 111.3 ± 0.2 0.140 -21.3 ±0.1 90%
0.18 113.0 ± 0.1 0.12 -17.3 ± 0.07 93%
79
III.6 Microscopía Electrónica de Transmisión por Tinción Negativa.
Las imágenes TEM por tinción negativa se tomaron con muestras de liposomas
(PC-PEG-Travoprost (relación molar 0.1) después de su extrusión. En las
imágenes se observan partículas de alrededor de 400 y 440 nm, redondeadas, de
contornos definidos y se pueden ver aisladas y agrupadas. El tamaño obtenido
por TEM, es un poco más grande en relación al tamaño hidrodinámico de las
partículas obtenidos por DLS y debido. Esto podría deberse a que las partículas
se encontraban aglomeradas al momento de la medición como resultado del
proceso de deshidratación de las muestras para su tinción. También se observó
que después del proceso de deshidratación de los liposomas y de la adición de la
solución de tinción, hubo un aumento de tamaño y deformación de la estructura.
Sin embargo, la apariencia de las imágenes TEM obtenidas (figura 3.12) son
semejantes a los encontrados por Grazia Sessa y Gerald Weissman en1968,
quienes reportaron que al realizar estudios con TEM de tinción negativa en
muestras de liposomas, estas se observaban como figuras de mielinas. (Figura
3.12, 3.13 y 3.14).
80
Figura 3.12 Liposomas de PC-PEG-Travoprost. Análisis por TEM por tinción
negativa. Las imágenes muestran partículas de alrededor de 100 y 200 nm.
Figura de mielina
81
Figura 3.13 Liposomas de PC-PEG-Travoprost. Análisis por TEM por tinción
negativa.
82
Figura 3.14 Liposomas de PC-PEG-Travoprost. Análisis por TEM por tinción
negativa. Los liposomas se observan como partículas unilamelares esféricas u
ovalada de tamaño uniforme con poca aglutinación o adhesión. Después de que
los liposomas se deshidrataron y se les agrego la solución de tinción, se observó
un aumento de tamaño y deformación de la estructura.
83
84
CAPÍTULO IV
CONCLUSIONES
Se constató la formulación de liposomas huecos, liposomas-PEG y
liposomas portadores de Travoprost en las tres formulaciones ensayadas
mediante microscopía de contraste de interferencia diferencial (DIC).
Los liposomas con PC 1 mM y PEG 0.5 mM fueron los más estables
comparados con los liposomas que se formularon utilizando otras concentraciones
de lípidos y PEG. EL aumento de la carga en la superficie de liposomas pegilados
comparado con liposomas no pegilados, indica la incorporación de PEG en las
superficie de los liposomas. En las tres relaciones molares estudiadas
(Fármaco/Fosfolípido) se obtuvieron porcentajes de encapsulación altos (>90%),
correspondiendo el valor más alto para la molar de 0.18 fármaco/lípido. En cuanto
a la estabilidad de almacenamiento (30 d a 4°C) no fue la mejor en esa relación
molar. Los liposomas más estables correspondieron a la relación de 0.1
fármaco/lípido.
Los liposomas con relación molar de 0.1 tienen un porcentaje de
encapsulación muy bueno (90%) y los estudios de estabilidad fueron favorables,
esto sugiere que es esta formulación es la que idealmente se propondría para
estudios clínicos de fase uno. Las estructuras más comunes observadas por TEM
(tinción negativa), son esférulas o figuras de mielina, que comúnmente consisten
en varias capas de lípidos separados por compartimentos acuosos. Los resultados
85
de microscopía óptica, por contraste de interferencia diferencia y TEM, fueron los
esperados según lo reportado en la bibliografía revisada, y dado que tanto las
técnicas de caracterización como la técnica de síntesis se realizaron por triplicado,
la metodología es confiable y reproducible.
86
BIBLIOGRAFIA
• Allen C. Simard P., Leroux J.C., Meyer O. (2007) Liposomes for Drug
Delivery. Nanoparticles for Pharmaceutical Applications. Published by
American Scientific Publishers, pg. 1-62.
• Allen TM, Austin GA, Chonn A, Lin L, Lee KC. (1991a) Uptake of liposomes
by cultured mouse bone marrow macrophages: influence of liposome
composition and size. Biochim Biophys Acta 1061:56–64.
• Allen TM, Newman MS, Woodle MC, Mayhew E, Uster PS (1995)
Pharmacokinetics and anti-tumor activity of vincristine encapsulated in
sterically stabilized liposomes. Int J Cancer 62:199–204.
• Allen, T.M. & Cullis, P.R. 2004. Drug delivery systems: entering the
mainstream. Science. 303: 1818-1822.
87
• Azarmi, S., Roa, W.H. & Lobenberg, R. (2008) Targeted delivery of
nanoparticles for the treatment of lung diseases. Adv. Drug Deliv. Rev. 60:
863-875.
• Bangham, A.D., Standish, M.M & Watkins, J.C. (1965) Diffusion of
univalentions across lamellae of swollen phospholipids. J. Mol. Biol. 13:
238-252.
• Bedu-Addo FK, Huang L. (1996). Effect of matrix lipid chain length on
liposomes containing cholesterol and ganglioside GM1: implications in drug
delivery. J Pharm Sci 85:714–719.
• Bochot, A., Couvreur, P. & Fattal, E. (2000) Intravitreal administration of
anti-sense oligonucleotides: potential of lipomal delivery. Prog. Retin. Eye
Res.19:131-147.
• Cevc, G., 1996. Transfersomes, liposomes and other lipid suspensions on
the skin: permeation enhancement, vesicle penetration, and transdermal
drug delivery. Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Sys. 13, 257–388.
88
• Clavijo Gimaldi D., Alfonso García G., Alfonso Casadiego C. 2008.
Nanotecnología en el diagnóstico y tratamiento médico. Univ. Méd. Bogotá
(Colombia), 49 (3): 388-398, julio-septiembre de 2008.
• D.B. Fenske, A. Chonn and P.R. Cullis. (2008). Liposomal Nanomedicines:
An Emerging Field. Toxicologic Pathology; 36: 21-29.
• Dean, D.A., Byrd, J.N. & Dean, B.S. (1999) Nuclear targeting of plasmid
DNA in human corneals cells. Curr. Eye Res. 19: 66-75.
• Ebrain, S., Peyman, G.A. & Lee, P.J. (2005) Applications of liposomes in
ophthalmology. Surv. Ophthalmol. 50: 167-182.
• Ehrlich, P. (1906) Collected studies on Immunology. John Wiley, New York,
pp 442-447.
• El Magharaby, G.M., Barry, B.W. & Williams, A.C. (2008) Liposomes and
skin: from drug delivery to model membranes. Eur. J. Pharm. Sci. 34: 203-
222.
• El Maghraby GM, Barry BW, Williams AC. Liposomes and skin: from drug
delivery to model membranes. Eur J Pharm Sci. 2008 Aug 7;34(4-5):203-22.
89
• Fenske, D.B., Chonn, A. & Cullis, P.R. (2008) Liposomes Nanomedicines:
anemerging field. Toxicologic Pathology.36: 21-29.
• Fenwick BW and Cullis PR . 2008. Liposomal Nanomedicines. Expert Opin
Drug Deliv, 5(1), 25-44.
• Giomini, M., Giuliani, A. M., Gattengo, D. y Conti, F. (1979). Un Nuovo Tipo
di Transportadori di Sostanze Biologicamente Active: I Liposomi. II farmaco
ed. Pr., 34. 3-14.
• Gordon, R. E., Mayer, P. R. y Kildsig, D. O. (1982) Lyophilization a means
of increasing shelf-life phospholipid bilayer vesicles. Drug Dev. Indust.
Pharm., 8,465-473.
• Gregoriadis, G. (1973). Drug entrapment in liposomes. FEBS Lett., 36 292-
296
• Gregoriadis, G. (1976). The carrier Potencial of Liposomes in Biology and
Medicine. New Engl. J. Med. 295, 704-710.
90
• H. Takeuchi, Y. Matsui, H. Sugihara, H. Yamamoto, and Y. Kawashima,
“Effectiveness of submicron-sized, chitosan-coated liposomes in oral
administration of peptide drugs,” International Journal of Pharmaceutics, vol.
303, no. 1-2, pp. 160–170, 2005.
• Harding JA, Engbers CM, Newman MS, Goldstein NI, and Zalipsky S (1997)
Immunogenicity and pharmacokinetic attributes of poly(ethylene glycol)-
grafted immunoliposomes. Biochim Biophys Acta 1327: 181–192.
• Holgado, M.A., Fernandez-Arevalo, M. y Rabasco, A. M. (1990). Sistemas
de liberación controlada (II). Métodos de obtención farmacocinéticos. Ind.
Farm. V (2); 67-79.
• Huang, Y.Y. & Wang, C.H. (2006) Pulmonary delivery of insulin by liposomal
carriers. J. Control Release.113: 9-14.
• Hunt, C. A. y Tsang, S. α-tocopherol Retards Autoxidation and Prolongs the
Shelf life of liposomes. Int. J. Pharm., 8 101-110
• Immordino, M.L., Dosio, F. & Cattel, L. (2006) Stealth liposomes: review of
the basic science, rationale and clinical applications; existing and potential.
Int. J. Nanomed. 1: 297-315.
91
• Kaur, I.P., Garg, A., Singla, A.K. & Aggarwal, D. (2004) Vesicular systems in
ocular drug delivery: an overview. Int. J. Pharm. 269: 1-14
• Kirby, C. & Gregoriadis, G. (1984) Dehydration-rehydration vesicles: A
simple method for high yield drug entrapment in liposomes. Biotechnology.
2: 979-984.
• Klibanov AL, Maruyama K, Torchilin VP, Huang L. (1990). Amphipathic
polyethyleneglycol effectively prolong the circulation time of liposomes.
FEBS Lett 268:235–237.
• Klibanov, A.L., Maruyama, K., Beckerleg, A.M., Torchilin, V.P. & Huang, L.
(1990) Amphipatic polyethyleneglycols effectively prolong circulation time in
liposomes. FEBS Lett. 268: 235-237.
• Kremer, J.M.H., Van de Esker, M.W.J., Pathmamanoharan, C. & Wiersema,
P.H. (1977) Vesicles of variable diameter prepared by a modified injection
method. Bio-chemistry. 16: 3932-35.
• Labrada Rodríguez YH. Genética del glaucoma primario de ángulo abierto.
Rev Cub Oftalmol [revista en Internet]. 2002[ cited 11 Abr 2009]; 15(2):
92
[aprox. 7p]. Avaidable from: http://bases.bireme.br/cgi-
bin/wxislind.exe/iah/online/?IsisScript=iah/iah.xis&src=google&base=LILAC
S&lang=p&nextAction=lnk&exprSearch=349361&indexSearch=ID
• Lasic, D.D. & Templeton, N.S. (1996) Liposomes in gene therapy. Adv. Drug
De-liv, Rev. 20: 221-266.
• Li, C. & Deng, Y. (2004) A novel method for the preparation of liposomes:
freeze drying of monophase solutions. J. Pharm. Sci. 93: 1403-1414.
• Lian, T. & Ho, R. (2001) Trends and developments in liposome drug delivery
systems. J. Pharm. Sci. 90: 667-680.
• Maurer, N., Fenske, D.B. & Cullis, P.R. (2001) Developments in liposomal
drug delivery systems. Expert Opin. Biol. Ther. 1: 923-947.
• N. Maurer, D.B.Fenske, & P.R.Cullis. (2001). Developments in liposomal
drug delivery systems. Expert Opin. Biol.Ther; 1:923-947.
• Omidi Y. Barar J, Javadzadeh AR. Ocular novel drug delivery: impacts of
membranes and barriers. Expert Opin Drug Deliv. 2008;
93
• Orditura M, Quaglia F, Morgillo F, Martinelli E, Lieto E, De Rosa G,
Comunale D, Diadema MR, Ciardiello F, Catalano G, et al. (2004) Pegylated
liposomal doxorubicin: pharmacologic and clinical evidence of potent
antitumor activity with reduced anthracycline-induced cardiotoxicity. Oncol
Rep 12: 549-556.
• Ortiz González E, Miqueli Rodríguez M, González García AO, Lantigua
Cruz A. Avances en la genética de los glaucomas. Rev Cubana de Oftalmol.
1999; 12(2):77-83.
• Perrie, Y. (2008) Gregory Gregoriadis: Introducing liposomes to drug
delivery. J. Drug Targ. 16: 518-519.
• Portney, N.G. & Ozkan, M. (2006) Nano-oncology: drug delivery, imaging
and sensing. Annal. Bioanal. Chem. 384: 620-630.
• Puisieux, F. y Poly, P. A. (1985) Problemes technologiques posés par
l’utilisation des liposomes comme vecteurs de substances
médicamenteuses, encapsulation, stérilisation, conservation In “Les
liposomes, applications thérapeutiques” Puisieux F. y Delattre J. (Eds).
Technique et Documentation, Paris.
94
• Reddy, I.K. & Ganesan, M.G. (1996) Ocular therapeutics and drug delivery:
a multidisciplinary approach. Technomic Publishing Company.
• Rieger-Reyes C, Rubio-Galán FJ. Glaucoma: implicaciones
farmacológicas. Semergen. 2012).
• Sanchez, A. & Alonso, M.J. (2006) Nanoparticular carriers for ocular drug
deli-very. En: Nanoparticulates as drug carriers. Wei K (ed). World Scientific
Imperial College Press.
• Saunders, L., Perrin, J. & Gammack, D.B. (1962) Ultrasonic irradiation of
some phospholipid solutions. J. Pharm. Pharmacol. 14: 576-572.
• Schnyder, A., Krahenbuhl, S., Torok, M., Drewe, J. & Huwyler, J. (2004)
Targeting of skeletal muscle in vitro using biotinylated immunoliposomes.
Biochim. J.377: 61-67.
• Senior, J., Delgado, C., Fisher, D., Tilcock, C. & Gregoriadis, G. (1991)
Influence of surface hydrophilicity of liposomes on their interaction with
95
plasma proteins and clearance from the circulation: studies with
polyethyleneglycol-coated vesicles. Biochim. Biophys. Acta.1062: 77-82.
• Simard, P., Leroux, J.C., Allen, C. & Meyer, O. (2007) Liposomes for drug
delivery. En Nanoparticles for Pharmaceutical Applications. Domb AJ,
Tabata Y, Ravi Kumar. MNV (eds). American Scientific Publishers,
Stevenson Ranch California, pp 1-62.
• Storm, G. & Crommelin, D.J.A. (1998) Liposomes: quo vadis? Pharm. Sci.
Technol. Today. 1: 19-31.
• Szoka, F. & Papahadjopoulos, D. (1980) Comparative properties and
methods of preparation of lipid vesicles (liposomes). Ann. Rev. Biophys.
Bioeng. 9: 467-508.
• Szoka, F., Olson, F., Heath, T., Vail, W., Mayhew, E. & Papahadjopoulos, D.
(1980) Preparation of unilamellar liposomes of intermediate size (0.1-0.2
microns) by a combination of reverse phase evaporation and extrusion
through polycarbonatemembranes. Biochim. Biphys. Acta.601: 559-571.
96
• Takeuchi, H., Matsui, Y., Sugihara, H., Yamamoto, H. & Kawashima, Y.
(2005) Effectiveness of submicron-sized chitosan-coated liposomes in oral
administrationof peptide drugs. Int. J. Pharm. 303: 160-170.
• Talsma, H., Ozer, A.Y., Van Bloois, L. & Crommelin, D.J. (1989) The size
reduction of liposome with a high pressure homogenizer (Microfluidizer):
characterization of prepared dispersions and comparison with conventional
methods. Drug Dev. Ind. Pharm. 15: 197-207.
• Theresa M. Allen and Pieter R. Cullis. 2004. Drug Delivery Systems:
Entering the Mainstream. SCIENCE. VOL 303.1818-22.
• Torchilin, V.P. (2005) Recent advances with lipomes as pharmaceutical
carriers.Nat. Rev. Drug Discovery. 4: 145-160.
• Torchilin, V.P. (2006) Recent approaches to intracellular delivery of drugs
and DNA and organelle targeting. Annu. Rev. Biomed. Eng. 8: 343-375.
• Torchilin, V.P., Trubetskoy, V.S., Whitemen, K.R., Calceti, P., Feruti, P. &
Veronese, F.M. (1995) New synthetic amphiphilic polymers for the steric
protection of liposomes in vivo. J. Pharm. Sci. 84: 1049-1053.
97
• Webb MS, Saxon D, Wong FMP, Lim HJ, Wang Z, Bally MB, Choi LSL,
Cullis PR, Mayer LD. (1998). Comparison of different hydrophobic anchors
conjugated to poly(ethylene glycol): effects on the pharmacokinetics of
liposomal vincristine. Biochim Biophys Acta 1372:272–282.
• Woodle MC, Lasic DD. (1992) Sterically stabilized liposomes. Biochim
Biophys Acta 1113:171–199.
• Wu ZH, Ping QN, Lai JM, Wei Y. 2003. Hypoglycemic effect of
polysaccharide-coated insulin liposomes after oral administration in mice.
Yao Xue Xue Bao. Feb;38(2):138-42.
• Wu, Z.H., Ping, Q.N., Wei, Y. & Lai, J.M. (2004) Hypoglycemic efficacy of
chi-tosancoated insulin liposmes afeter oral administration in mice. Acta
Pharmacol.Sin. 25: 966-972.